KR20070101227A - 폰 빌레브란트 인자에 대한 앱타머 및 이의 혈전증치료제로서의 용도 - Google Patents

폰 빌레브란트 인자에 대한 앱타머 및 이의 혈전증치료제로서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 핵산, 보다 구체적으로는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor) 매개 혈소판 응집과 관련된 혈전증 및/또는 기타 질병 또는 질환의 치료제로서, 그리고 진단제로서 유용한, 폰 빌레브란트 인자에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폰 빌레브란트 인자에 결합할 수 있는 앱타머 투여용 물질 및 방법에 관한 것이다.

Description

폰 빌레브란트 인자에 대한 앱타머 및 이의 혈전증 치료제로서의 용도{APTAMERS TO VON WILLEBRAND FACTOR AND THEIR USE AS THROMBOTIC DISEASE THERAPEUTICS}
본 발명은 일반적으로 핵산, 보다 구체적으로는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor) 매개 혈소판 응집과 관련된 혈전증 및/또는 기타 질병 또는 질환의 치료제로서, 그리고 진단제로서 유용한, 폰 빌레브란트 인자에 결합할 수 있는 앱타머(aptamer)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폰 빌레브란트 인자에 결합할 수 있는 앱타머 투여용 물질 및 방법에 관한 것이다.
앱타머는 고전적인 왓슨-크릭 염기 쌍 형성 이외의 상호 작용을 통하여 분자에 특이적으로 결합하는 친화성을 보유하는 핵산 분자이다.
파아지 전시 또는 모노클로날 항체("mAb")에 의하여 생성된 펩티드와 같이, 앱타머는 선별된 표적에 특이적으로 결합하여 예를 들어, 이 앱타머의 표적에 결합함으로써 표적이 기능을 하지 못하도록 만듦으로써, 표적의 활성 또는 결합 상호 작용을 조정할 수 있다. 랜덤한 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 시험관 내 선별 과정을 통하여, 앱타머는 130개 이상의 단백질 예를 들어, 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역 글로불린 및 수용체에 대해서 생성된다는 사실을 알 수 있었 다. 통상적으로 앱타머는 그 크기가 10∼15 kDa(20∼45 뉴클레오티드)으로서, 나노 몰∼나노 몰 이하의 친화도로 표적에 결합하며, 밀접하게 관련된 표적들을 구별할 수 있다[예를 들어, 앱타머는 통상적으로 동일한 유전자 군에 속하는 다른 단백질에는 결합하지 않을 것이다]. 일련의 구조 연구 결과에 따르면, 이 앱타머는 항체-항원 복합체에 있어서 친화성과 특이성을 부여하는 동일한 유형의 결합 상호 작용(예를 들어, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))를 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
앱타머는 치료제 및 진단제로서 사용하기에 바람직한 다수의 특성 예를 들어, 고 특이성 및 친화성, 생물학적 효능 및 우수한 약동학적 특성을 보유한다. 뿐만 아니라, 앱타머는 항체 및 기타 생물학적 단백질에 비하여 예를 들어, 다음과 같이 특이적인 경쟁적 이점을 제공한다:
1) 속도 및 제어: 앱타머는 전적으로 초기에 반응을 신속하게 리드할 수 있도록 만드는(예를 들어, 치료 과정을 신속하게 리드할 수 있도록 하는) 시험관 내 방법을 통해서 생산된다. 시험관 내 선별은 앱타머의 특이성 및 친화성을 엄격하게 제어할 수 있고, 예를 들어, 독성 및 비 면역원성 표적 둘 다를 리드 할 수 있도록 만든다.
2) 독성 및 면역원성: 앱타머 군은 치료학적으로 허용 가능한 독성을 나타내지만, 면역원성은 흠결되어 있다. 다수의 모노클로날 항체 효능은 항체 자체에 대한 면역 반응에 의하여 엄격하게 제한될 수 있는 반면에, 앱타머에 대하여 항체를 유도하는 것은 매우 어려운데, 그 이유는 이 앱타머가 MHC를 통해 T-세포에 의해 제시될 수 없고, 면역 반응은 일반적으로 핵산 단편을 인지하지 못하도록 적응되어 있기 때문이다.
3) 투여: 현재 승인된 항체 치료제의 대부분은 정맥 내 주입(통상적으로 2∼4 시간에 걸침)에 의해 투여되는 반면에, 앱타머는 피하 주입에 의해 투여될 수 있다[원숭이를 이용한 연구 결과, 피하 투여에 의한 앱타머의 생체 적합성은 >80%이었다(Tucker외 다수, J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)]. 용해도가 양호하고(>150 ㎎/㎖) 분자량이 비교적 낮기 때문에(앱타머:10∼50 kDa; 항체:150 kDa), 앱타머는 0.5 ㎖ 미만의 부피를 매주 주입하여 투여될 수 있다. 뿐만 아니라, 작은 크기의 앱타머는 항체 또는 항체 단편이 침투할 수 없는, 형태상 협착증이 발생한 부위로 침투할 수 있기 때문에, 앱타머계 치료법 또는 예방법에 또 다른 이점을 제공한다.
4) 확장성( scalability ) 및 비용: 치료용 앱타머는 화학적으로 합성되어 생산 조건에 충족되도록 필요에 따라서 용이하게 확장 생산될 수 있다. 확장 생산시 난점이 몇몇 생물학적 물질의 생체 적합성을 제한하고 거대 규모 단백질 생산 공정에 드는 자본이 엄청난 것에 반하여, 단일의 거대 규모 올리고뉴클레오티드 합성기는 매년 100 ㎏씩 증량 생산할 수 있으므로 초기 투자 비용은 비교적 적게 드는 편이다. 현재 앱타머 합성(㎏ 규모)에 들어가는 비용은 1 g 당 약 $500이며, 이는 상당히 최적화된 항체의 생산에 드는 비용과 거의 비슷한 수준이다. 공정 개발에 계속적인 발전이 있다면, 제품 생산 비용은 5년 이내에 $100 미만으로 줄어들 것으로 예상된다.
5) 안정성: 치료용 앱타머는 화학적으로 견고하다. 이 앱타머는 본질적으로 인자 예를 들어, 열과 변성제에 노출되었을 때 활성을 다시 찾도록 적응되어 있기 때문에, 동결 건조된 분말로서 존재할 경우에는 실온에서 오랜 기간 동안(1년 이상) 보관 가능하다.
혈전증
정상적인 지혈 제어 과정에서, 혈소판은 건강한 혈관에는 부착되지 않고, 통상적으로 손상된 혈관 하층 내피에 부착된다. 혈소판이 부착됨으로써 최종적으로 혈전을 형성하고 출혈 중지시키는 일련의 혈소판 활성화 과정이 촉진된다. 폰 빌레브란트 인자("vWF")는 혈관 손상 위치에 혈소판이 부착되게 만드는 매개 인자이다. vWF는 주로 혈관 내피 세포에 의하여 생산되는 거대한 다중 서브유닛의 가용성 다량체 인자이다. 폰 빌레브란트 인자는 폰 빌레브란트 인자 도메인인 A3와 노출되어 있는 콜라겐 사이의 상호 작용을 통해서 혈관 벽에 고정된다. 혈소판-수용체 당단백질 Ib("이하 GPIb라 칭함")와 고정된 폰 빌레브란트 인자의 A1 도메인 사이의 일시적인 상호 작용은 혈관 손상 위치에 혈소판이 부착하여 활성화되는 것을 촉진한다[E.G. Huizinga외 다수, Science, 297, 1176 (2002)]. 그러므로, 상기 폰 빌레브란트 인자는 부혈전성(pro-thrombotic)으로서, 혈관 손상 부위에 혈전이 형성되는 것을 촉진하는 지혈 작용에 있어서 중요한 역할을 한다.
이와는 반대로, 폰 빌레브란트 인자는 또한 동일한 기작으로 병원성 병상 예를 들어, 혈소판 응집 및 혈전 형성과 관련된 심혈관 질환에 있어서도 중요한 역할을 한다. 비록 현재 항 혈전 치료법이 사용되고 있지만, 부가의 치료법에 대한 필 요성이 절실히 요구되고 있다. 미국 심장학회에 따르면, 6 천만 명 이상의 미국인들은 한가지 이상의 종류의 심혈관 질환을 앓고 있으며, 심혈관 질환 환자의 대부분이 동맥 혈전증의 발병 위험에 심각하게 노출되어 있다고 한다[S.P. Jackson and S.M. Schoenwaelder, Nature Reviews, 2, 1-12 (2003)].
현재 사용되고 있는 치료법에 따른 심각한 문제점은 효능을 개선시키면 안전성이 떨어진다는 점이다[S.P. Jackson and S.M. Schoenwaelder, Nature Reviews, 2, 1-12 (2003)]. 그러므로, 출혈과 같은 부작용을 최소화시키면서 혈관 내 혈소판이 응집되는 것을 막음으로써 혈전증을 치료 또는 예방하는 것이 유리할 것이다. 본 발명은 상기 및 기타 요망 사항을 충족시키는 물질 및 방법을 제공한다.
도 1은 랜덤한 올리고뉴클레오티드 서열 풀로부터 앱타머를 선별하는 시험관 내 앱타머 선별 방법(셀렉스(SELEX™))을 나타내는 모식도이다.
도 2는 표준적인 모노-PEG화, 다중 PEG화 및 PEG화를 통한 올리고머 형성 과정을 나타내는 다양한 PEG화 기술을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실험에 사용되는 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 단백질의 아미노산 서열을 나열한 표이다.
도 4는 본 발명의 실험에 사용된 전장 인간 폰 빌레브란트 인자 단백질의 아미노산 서열을 나열한 표이다.
도 5는 ARC1029(서열 번호 214)의 2차 구조를 제시한 모식도이다.
도 6은 ARC1029(서열 번호 214)의 전장 vWF 및 토끼 vWF 도메인 A1에 대한 닷 블럿(dot blot) 결합 곡선 그래프이다. 본 그래프에서 검정색 박스(-■-)는 결실되었음을 나타내는 것이다.
도 7은 ARC1029(서열 번호 214)가 인간 vWF 및 토끼 vWF A1 도메인이 동결 건조된 인간의 혈소판에 결합하는 것을 억제함을 보여주는 FACS 데이터 그래프이다.
도 8은 ARC1029(서열 번호 214)가 경시적으로 보트로세틴(botrocetin) 유도성 혈소판 응집을 억제함을 보여주는 응집 측정기 추적 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 ARC1029(서열 번호 214)가 보트로세틴 유도 혈소판 응집을 억제하는 것을 보여주는 그래프를 나타내는 것이다.
도 10은 서열 번호 217에 대한 추정 2차 구조[여기서, C는 fC이고, T는 fU이며, N은 쌍(왓슨-크릭 염기 쌍이라 가정)을 이룬 임의의 뉴클레오티드이고, X는 1∼4개의 뉴클레오티드 즉, PEG 스페이서와 치환될 수 있는 Nx-Nx-Nx-Nx임]를 나타내는 모식도를 나타내는 것이다.
도 11은 vWF rRdY 셀렉스™(SELEX™) 제1군에 속하는 3개의 앱타머에 대한 서열 정렬 결과를 나타내는 것이다.
도 12는 서열 번호 218에 대한 추정 2차 구조를 나타내는 모식도이다.
도 13은 서열 번호 219에 대한 추정 2차 구조를 나타내는 모식도이다.
도 14는 vWF DNA 셀렉스™2(SELEX™2) 제1 군에 속하는 26개의 앱타머에 대한 서열 정렬 결과를 나타내는 것이다. 정렬의 상부에 표시된 검정색 선은 폰 빌레 브란트 인자 표적에 결합하는데 필요한 추정 중심 핵산 결합 서열을 나타내는 것이다.
도 15는 서열 번호 220에 대한 추정 2차 구조를 나타내는 것이다. 도 15b는 ARC1172(서열 번호 222)의 2차 구조를 도시한 것으로서, 그 잔기는 2'-OMe 치환에 대하여 묵인성(tolerant)이다.
도 16은 핵산 서열 예를 들어, ARC1029(서열 번호 214), ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222) 및 ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1243(서열 번호 272)의 임의의 변형체를 나타내는 표이다.
도 17은 핵산 서열 예를 들어, ARC1172(서열 번호 222), ARC1338(서열 번호273)∼ARC1348(서열 번호 283) 및 ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304)의 임의의 변형체를 나타내는 표이다. 본 표에 있어서 검정 색 블럭(■ 부분)은 결실부를 나타내는 것이다. 뉴클레오티드 표시의 앞에 붙은 "s"(예를 들어, T 또는 dA)는 표시된 뉴클레오티드에 대하여 포스페이트 골격 5'에 포스포로티오에이트 치환이 일어났음을 나타낸다.
도 18은 핵산 서열 예를 들어, ARC1172(서열 번호 222), ARC1524(서열 번호 305)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317) 및 ARC1759(서열 번호 318)의 임의의 변형체를 나타내는 표이다. 본 표에서 검정 색 블럭(■ 부분)은 결실부를 나타내는 것이다.
도 19는 ARC1368(서열 번호 291) 및 ARC1534(서열 번호 315)의 2차 구조를 나타내는 것이다.
도 20은 PFA-100 검정법에서, ARC1368(서열 번호 291) 또는 ARC1525(서열 번호 306)으로 처리된 인간의 전혈에 대한 응고 시간을 앱타머 농도에 대한 함수로서 나타내는 그래프이다.
도 21은 PFA-100 검정법에서, 인테그릴린™(Integrilin™), 레오프로™(ReoPro™) 또는 ARC1368(서열 번호 291)로 처리된 인간의 전혈에 대한 폐색 시간을 약물 농도에 대한 함수로서 나타내는 그래프이다.
도 22는 BIPA에 있어서, 인테그릴린™, 레오프로™ 또는 ARC1368(서열 번호 291)로 처리된 인간 PRP의 억제%를 약물 농도에 대한 함수로서 나타내는 그래프이다.
도 23은 AIPA에 있어서, 인테그릴린™, 레오프로™ 또는 ARC1368(서열 번호 291)로 처리된 인간 PRP의 억제%를 약물 농도에 대한 함수로서 나타내는 그래프이다.
도 24는 인간의 혈장에서 검출된 전장 ARC1172(서열 번호 222) 또는 ARC1368(서열 번호 291)의 %를 시간에 대한 함수로서 나타내는 것이다.
도 25는 ARC1368(서열 번호 291), ARC1779(서열 번호 320) 또는 ARC1780(서열 번호 321) 투여 후, 영장류 혈장 내 앱타머 농도(올리그린(Oligreen) 분석법으로 측정)를 시간에 대한 함수로서 나타내는 그래프이다.
도 26은 3마리의 짧은 꼬리 원숭이(cynomolgus macaques)로부터 채혈한 실험용 혈액을 분석한 결과를 나타내는 것으로서, 가로축은 시점을 나타내고, 제일 위에 있는 그래프의 세로축은 ARC1779(서열 번호 320) 혈장 농도(nM)를, 가운데 그래 프의 세로축은 PFA-100 폐색 시간(초)을, 그리고 제일 밑에 있는 그래프의 세로축은 주형 또는 피부 출혈 시간(분)을 나타낸다. 3마리의 실험 동물로부터 얻은 평균 값 즉, 혈장 앱타머 농도, RFA-100 폐색 시간 및 피부 출혈 시간에 대한 평균 값을 각각 상부 그래프, 중간 그래프 및 하부 그래프에 도시하였다.
도 27은 피부 출혈 시간(CBT)을 분 단위로 나타낸 표로서, 컬럼 1에는 3 마리의 상이한 짧은 꼬리 원숭이에 ARC1779(서열 번호 320)를 다양한 시점에서 투여하였을 때 처리 전 BIPA 데이터와 RFA-100 폐색 시간(초)을 나타내었다.
도 28은 짧은 꼬리 원숭이에 ARC1779(서열 번호 320)를 투여한 후 다양한 시점에서의 평균 PFA-100 폐색 시간을 나타내는 그래프이다.
도 29는 투여 후 다양한 시점에서 취한 3마리의 ARC1779(서열 번호 320) 처리된 짧은 꼬리 원숭이의 평균 출혈 시간을 나타내는 그래프이다.
도 30은 ARC1779(서열 번호 320) 처리된 짧은 꼬리 원숭이(좌측 세로축)의 평균 출혈 시간과 PFA-100 폐색 시간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 31은 짧은 꼬리 원숭이 전리 혈전증 모델에서 ARC1779(서열 번호 320)의 평가에 사용된 혈액 시료 채취 스케쥴을 나타내는 모식도이다.
도 32는 전리 혈전증 모델에서 시험된 각각의 짧은 꼬리 원숭이 제3 처리 군 에 있어서 ARC1779(서열 번호 320)의 혈장 내 농도(세로 축)를 시간에 따른 함수로 나타내는 그래프이다.
도 33은 짧은 꼬리 원숭이 전리 혈전증 모델에서 시험된 각각의 처리 군에 속하는 각각의 짧은 꼬리 원숭이의 우측 경동맥(빗금 친 막대) 또는 좌측 경동맥 (무늬 없는 막대)의 폐색 시간을 나타내는 그래프이다. 1번, 8번 및 9번 막대 쌍은 제1 처리 군을 나타낸다(비이클만으로 처리). 2번, 10번, 11번, 12번 및 13번 막대 쌍은 제2 처리 군 및 제4 처리 군을 나타낸다(레오프로 처리). 3∼7번 막대 쌍은 제3 처리 군을 나타낸다(1000 nM 앱타머 혈장 농도 표적 군). 20번, 22번, 16번 및 18번 막대 쌍은 제7 처리 군을 나타낸다(75 nM 혈장 앱타머 농도 표적 군). 19번, 21번, 23번 및 24번 막대 쌍은 제6 처리 군을 나타낸다(500 nM 혈장 앱타머 농도 표적 군). 5번 및 17번 막대 쌍은 제5 처리 군을 나타낸다(300 nM 혈장 앱타머 농도 표적 군).
도 34는 가로 축에 나타낸 시점에서 취한 전기적 손상 모델에 해당하는 다양한 짧은 꼬리 원숭이 처리 군의 피부 출혈 시간(분, 세로 축)을 나타내는 그래프이다.
발명의 개요
본 발명은 폰 빌레브란트 인자 매개 혈소판 응집과 관련된 혈전증의 치료용 물질 및 방법을 제공한다.
본 발명은 폰 빌레브란트 인자 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 폰 빌레브란트 인자 표적은 인간의 폰 빌레브란트 인자이다. 몇몇 구체예에서, 상기 폰 빌레브란트 인자 표적은 인간의 폰 빌레브란트 인자의 기능과 본질적으로 동일한 생물학적 기능을 수행하는 인간 폰 빌레브란트 인자의 변이체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 폰 빌레브란트 인자 표적 또는 이의 변이체의 생물학적 기능은 혈소판 응집을 매개하는 것이다. 몇몇 구체예에서, 인간 폰 빌레브란트 인자 표적의 변이체는 인간 폰 빌레브란트 인자와 실질적으로 동일한 구조와 실질적으로 동일한 능력 즉, 본 발명의 앱타머와 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 구체예에서, vWF 표적은 인간의 것이 아닌 폰 빌레브란트 인자이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 7과의 동일성이 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상인 아미노산 서열을 포함하는 폰 빌레브란트 인자 표적 또는 이의 변이체에 결합한다(도 4). 하나의 구체예에서, 상기 폰 빌레브란트 인자 표적은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 2 이상의 핵산 또는 단백질 서열 중 "서열 동일성" 또는 "% 동일성"이란 용어는, 이하와 같은 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 눈으로 관찰함으로써 측정되는 최대 상응성(maximum correspondence)에 대하여 비교 및 정렬하였을 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 상호 간 동일성 %가 동일하거나 또는 특정되어 있는 2 이상의 서열 또는 종속 서열을 의미하는 것이다. 서열 비교에 있어서, 통상적으로 하나의 서열은 참고 서열(reference sequence) 즉, 시험 서열이 비교되는 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라서 종속 서열의 좌표와 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수를 지정한다. 이후 서열 비교 알고리즘에 따라서, 지정된 프로그램 매개 변수를 바탕으로 하여 참고 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 %를 계산한다. 비교용 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 스미스 & 워터맨의 국소 동일성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), 니들맨 & 운치의 동일성 정렬 알고리즘(J Mol. Biol. 48: 443 (1970)), 피어슨 & 립맨의 유사도 탐색법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)), 알고리즘들의 전산화된 실행법(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 시각적 관찰(일반적으로, Ausubel, F. M.외 다수, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. 및 Wiley-Interscience (1987) 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 %를 측정하는데 적당한 알고리즘의 일례로서는 기본적 국소 정렬 탐색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)(이하 "BLAST"라 칭함)에 사용되는 알고리즘이 있다[예를 들어, Altschul외 다수, J Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) 및 Altschul외 다수, Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402 (1997)]. BLAST 분석법을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터(이하 "NCBI"라 칭함)를 통하여 공중이 이용 가능하다. NCBI로부터 입수할 수 있는 소프트웨어 예를 들어, BLASTN(뉴클레오티드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용)를 이용하여 서열 동일성을 측정하는데에 사용되는 디폴트 매개 변수에 관하여는 문헌[McGinnis외 다수, Nucleic Acids Res., 32: W20-W25 (2004)]에 개시되어 있다. 바람직한 구체예에서, 동일성%는 문헌[Altschul외 다수]에 개시된 BLAST 실행 알고리즘과 문헌[McGinnis외 다수]에 개시된 디폴트 매개 변수를 이용하여 측정되며, 본원에 있어서는 이를 BLAST 동일성%라 칭할 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 vWF 앱타머는 인간 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 변이체에 대한 해리 상수가 약 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 바람직하게는 10 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 및 더욱 바람직하게는 500 pM 이하이다. 해리 상수는 이하 실시예 1에 기술된 바와 같이 다중점 적정법(multi-point titration)을 이용하고 등식 "y = (max/(1 × K/단백질))+ yint을 적용하여 닷 블럿 검정법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 상기 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 인간 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적이다. 몇몇 구체예에서, 인간의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 본질적으로 인간 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1의 기능과 동일한 생물학적 기능을 수행하는 인간의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1의 변이체이다. 몇몇 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 또는 이의 변이체의 생물학적 기능은 혈소판에 부착되는 것이다. 몇몇 구체예에서, 인간 폰 빌레브란트 인자 도메인 표적의 변이체는 인간의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1과 구조 및 앱타머에 결합하는 능력이 실질적으로 동일하다. 다른 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 인간이 아닌 것의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적으로서, 예를 들어, 토끼 또는 인간 이외의 영장류의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 서열 번호 4∼서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 임의의 하나와 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 서열 번호 4∼서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함한다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 vWF 앱타머는 인간 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 또는 이의 변이체에 대한 해리 상수가 약 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 바람직하게는 10 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 및 더욱 바람직하게는 500 pM 이하이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 인간 이외의 것의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 또는 이의 변이체에 대한 해리 상수가 약 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 바람직하게는 10 nM 이하, 바람직하게는 5 nM 이하, 바람직하게는 1 nM 이하, 및 더욱 바람직하게는 500 pM 이하이다. 해리 상수는 이하 실시예 1에 기술된 바와 같이 다중점 적정법을 이용하고 등식 "y = (max/(1 × K/단백질))+ yint을 적용하여 닷 블럿 검정법을 통해 측정될 수 있다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 폰 빌레브란트 인자 전장 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명은 폰 빌레브란트 인자 전장 표적 및 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 몇몇 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 전장 표적은 인간의 폰 빌레브란트 표적이거나 이의 변이체이다. 다른 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 전장 표적은 인간 이외의 것의 폰 빌레브란트 표적 또는 이의 변이체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 인간 이외의 것의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 또는 이의 변이체이다. 다른 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 인간의 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 또는 이의 변이체이다. 몇몇 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자 전장 표적 또는 도메인 A1 표적은 토끼, 기니아 피그, 원숭이, 개, 양, 마우스 및 래트의 폰 빌레브란트 인자 전장 또는 도메인 A1 표적으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머가 특이적으로 결합하는 폰 빌레브란트 인자 전장 표적 및 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 상이한 종으로부터 유래된다.
본 발명은 리보핵산 또는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산과 데옥시리보핵산의 혼합체인 폰 빌레브란트 인자 표적에 대한 앱타머를 제공한다. 본 발명의 앱타머는 단일 사슬 리보핵산이거나 데옥시리보핵산 또는 이 리보핵산과 데옥시리보핵산의 혼합체이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 하나 이상의 화학 변형을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 화학 변형은 핵산의 당 위치에서의 화학적 치환; 인산염 위치에서의 화학적 치환; 및 염기 위치에서의 화학적 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 화학 변형은 변형 뉴클레오티드의 통합, 3' 캡핑, 고분자량의 비 면역원성 화합물에 대한 컨쥬게이트화, 친지성 화합물에 대한 컨쥬게이트화 및 포스포로티오에이트의 인산염 골격으로의 통합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 비 면역원성이고 고분자량인 화합물로서는 폴리알킬렌 글리콜이 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머 예를 들어, 폰 빌레브란트 인자 앱타머가 제공되며, 이때 상기 앱타머는 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 포스포로티오에이트 골격 변형이 발생하였으며, 또한 상기 앱타머는 표적에 대한 결합 친화성[여기서, 결합 친화성은 뉴클레오티드 서열은 동일하나, 포스포로티오에이트 골격 변형은 발생하지 않은 제2 앱타머에 비하여 증가됨]을 보유한다. 몇몇 구체예에서, 표적은 공지의 핵산 결합 능을 보유하지 않는 단백질 또는 펩티드이고, 구체적으로는 공지의 1차적 핵산 결합 능을 보유하지 않는 단백질 또는 펩티드이다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 및 이들 표적 중 어느 하나의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 임의의 하나의 기능을 조정한다. 몇몇 구체예에서, 조정된 기능은 혈소판 응집 매개 기능이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 생체 내 폰 빌레브란트 인자 매개 혈소판 응집을 억제한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 임의의 하나가 혈소판에 결합하는 것을 막는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 및 이들 표적 중 어느 하나의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 임의의 하나가 혈소판 수용체 단백질에 결합하는 것을 막는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 및 이들 표적 중 어느 하나의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것 중 임의의 하나가 혈소판 수용체 단백질 GPIb에 결합하는 것을 막는다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 출혈 시간을 거의 증가시키지 않고서도 vWF 인자 매개 혈소판 응집 현상을 막는다. 몇몇 구체예에서, 출혈 시간은 기껏해야 15분 미만, 바람직하게는 10분 미만, 더욱 바람직하게는 5분 미만 증가하고, 몇몇 구체예에서는 본 발명의 앱타머로 처리되지 않은 개체의 출혈 시간에 비하여는 3분 미만 증가한다. 몇몇 구체예에서, 출혈 시간은 피부(또는 주형(template)) 출혈 시간)에 의해 측정된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 및 이의 변이체로 이루어진 군의 임의의 하나에 결합하는 능력이 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212∼214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택되는 앱타머와 실질적으로 동일하다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적 및 이의 변이체로 이루어진 군의 임의의 하나와 결합하는 능력 및 구조가 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 서열 군으로부터 선택되는 앱타머와 실질적으로 동일하다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 ARC1172(서열 번호 222) 또는 ARC1115(서열 번호 221) 또는 ARC1029(서열 번호 214) 또는 서열 번호 220의 1차 핵산 서열을 포함하며, 6∼9번, 20번, 22번, 24∼27번, 30번 또는 32∼33번 위치에 2'-O-Me 치환된 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 ARC1172(서열 번호 222) 또는 ARC1115(서열 번호 221) 또는 ARC1029(서열 번호 214) 또는 서열 번호 220의 핵산 서열을 포함하며, 하나 이상 즉, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상 또는 20개 이상의 위치에 2'-O-Me 치환된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 ARC1172(서열 번호 222) 또는 ARC1115(서열 번호 221) 또는 ARC1029(서열 번호 214) 또는 서열 번호 220의 핵산 서열을 포함하며, 1∼5번 위치, 10∼19번 위치, 21번 위치, 23번 위치, 28∼29번 위치 및 34∼41번 위치[여기서, 상기 위치 번호는 핵산 서열의 5' 말단으로부터 시작하여 메겨짐]로 이루어진 군으로부터 선택되는 모든 위치에 2'-O-Me 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 서열 번호 95∼97 및 서열 번호 217∼219[여기서, Y는 C 또는 T/U이고, R은 A 또는 G이며, N은 임의의 뉴클레오티드로서, 왓슨/크릭 염기 쌍을 형성할 것으로 가정되는 쌍 형성 부위이고, X는 1∼4임]로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머가 제공된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 217 및 서열 번호 220으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서, Nx-Nx-Nx-Nx-, 또는 N(3-10)은 PEG 링커로 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 325∼327[여기서, Y는 C 또는 T이고, R은 A 또는 G임]로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 앱타머는 도 15에 도시된 바와 같은 서열 번호 220의 공통 서열 구조를 보유하는 3가지 종류의 나선형 접합부 2차 구조 모티프를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 3가지 종류의 나선형 접합부를 보유하는 앱타머는 도 19a(ARC1368(서열 번호 291))에 도시된 공통 구조를 포함한다. 반면에, 다른 구체예에서, 3가지 종류의 나선형 접합부를 보유하는 앱타머는 도 19b(ARC1534(서열 번호 315))에 도시된 공통 구조를 포함한다.
다른 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 앱타머는 도 10에 도시된 서열 번호 217의 공통 서열 구조를 보유하는 줄기(stem)-루프(loop)-줄기-루프의 2차 구조 모티프를 포함한다. 다른 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 앱타머는 도 12에 도시된 서열 번호 218의 공통 서열 구조를 보유하는 줄기-루프-루프의 2차 구조 모티프를 포함한다. 다른 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 앱타머는 도 13에 도시된 바와 같이 서열 번호 19로 된 2개의 나선형 줄기 및 줄기-루프가 존재하는 3가지 종류의 접합부를 보유하는 2차 구조 모티프를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머의 2차 구조 모티프는 "RNA 구조"(4.1 판)[Mathews, D.H.; Disney, M.D.; Childs, J.L.; Schroeder, S.J.; Zuker, M.; 및 Turner, D.H., "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure", 2004, Proceedings of the National Academy of Sciences, US, 101, 7287-7292]에 의해 예측된다.
바람직한 구체예에서, 인간의 폰 빌레브란트 인자 표적과 인간 이외의 것의 폰 빌레브란트 인자 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머가 제공된다.
하나의 구체예에서, 다음과 같은 구조를 포함하는 앱타머 또는 이의 염이 제공되며, 이 때의 앱타머는 본 발명의 항-vWF 앱타머이다:
Figure 112007026846805-PCT00001
[식 중, n은 약 454개의 산화에틸렌 단위(PEG = 20 kDa)이고,
Figure 112007026846805-PCT00002
는 링커임]
특정 구체예에서, 앱타머는 다음과 같은 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함한다:mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(서열 번호 291)
[상기 서열 중, "m"은 2'-0Me 치환을 의미하고, "d"는 데옥시 뉴클레오티드를 의미하며, "s"는 포스포로티오에이트 치환을 의미하고, "3T"는 역전된(inverted) 데옥시 티미딘을 의미함]
다른 구체예에서, 앱타머는 다음과 같은 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함한다:dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdGdGdCdCdGdTdGdCdGdGdTdGdCdCdTdC dCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T(서열 번호 323)
[상기 서열 중, "d"는 데옥시 뉴클레오티드를 의미하고, "3T"는 역전된 데옥시티미딘을 의미함]
본 발명의 이러한 측면에 대한 몇몇 구체예에서, 링커는 알킬 링커이다. 특정 구체예에서, 알킬 링커는 2∼18개의 연속 CH2기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 알킬 링커는 2∼12개의 연속 CH2기를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 알킬 링커는 3∼6개의 연속 CH2기를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 다음과 같은 구조를 보유하며, 이때의 앱타머 핵산 서열은 본 발명의 항-vWF 앱타머이다:
Figure 112007026846805-PCT00003
[상기 식 중, n은 약 454개의 산화 에틸렌 단위임(PEG = 20 kDa)]
특정 구체예에서, 앱타머는 다음과 같은 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함한다:mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s- dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(서열 번호 291)
[상기 서열 중, "m"은 2'-0Me 치환을 의미하고, "d"는 데옥시 뉴클레오티드를 의미하며, "s"는 포스포로티오에이트 치환을 의미하고, "3T"는 역전된 데옥시 티미딘을 의미함]
다른 구체예에서, 앱타머는 다음과 같은 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함한다:dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCdTdTdCdGdGdCdCdGdTdGdCdGdGdTdGdCdCdTdC dCdGdTdCdAdCdGdCdC-3T(서열 번호 323)
[상기 서열 중, "d"는 데옥시 뉴클레오티드를 의미하고, "3T"는 역전된 데옥시티미딘을 의미함]
다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머의 염이 제공된다. 특히 바람직한 구체예에서, 앱타머의 다음과 같은 염이 제공된다:
N-(메톡시-폴리에틸렌글리콜)-6-아미노헥실릴-(1'→5')-2'-OMe-구아닐릴-
(3'→5')-2'-OMe-시티딜릴-(3→5')-2'-OMe-구아닐릴-(3'→5')-2'-OMe-우라실릴
-(3'→5')-2'-데옥시구아닐릴-(3'→5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5')-2'-데옥시아데닐릴-
(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-(3'→5')-2'-OMe-우라실릴-(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-
(3'→5')-2'-OMe-시티딜릴-(3'→5')-2'-OMe-시티딜릴-(3'→5')-2'-OMe-우라실릴-
(3'→5')-2'-OMe-우라실릴-(3'→5')-2'-OMe-시티딜릴-(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-
(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-(3'→5')-2'-OMe-시티딜릴-(3'→5')-2'-데옥시시티딜릴-
(3'→5')-2'-OMe-P-티오구아닐릴-(3'→5')-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-(3'→5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5')-2'-데옥시구아닐릴-(3'→5')-2'
-데옥시구아닐릴-(3'→5')-2'-데옥시티미딜릴-(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-(3'→5')-2'-
OMe-시티딜릴-(3'→5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5')-2'-OMe-우라실릴-(3→5')-2'-
데옥시시티딜릴-(3'→5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-(3'→5')-2'-
OMe-우라실릴-(3'→5')-2'-데옥시시티딜릴-(3'→5')-2'-OMe-아데닐릴-(3'→5')-2'-
OMe-시티딜릴-(3'→5')-2'-OMe-구아닐릴-(3'→5')-2'-OMe-시티딜릴-(3'→5')-
(3'→3')-2'-데옥시티미딘, 40-나트륨 염
[여기서, 메톡시 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 20 kDa임]
또 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머 중 임의의 하나 또는 이의 염, 그리고 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 치료학적 유효량 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 ARC1779를 포함한다. 보다 특정한 구체예에서, 약학 조성물은 다음의 구조를 갖는 앱타머 또는 이의 염을 포함하며, 이때의 앱타머는 다음과 같은 핵산 서열 또는 이의 단편을 포함한다:
Figure 112007026846805-PCT00004
[식 중, n은 약 454개의 산화 에틸렌 단위임(PEG = 20 kDa)]
mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s-dTmGdCdGdGTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T(서열 번호 291)
[식 중, "m"은 2'-0Me 치환을 의미하고, "d"는 데옥시 뉴클레오티드를 의미하며, "s"는 포스포로티오에이트 치환을 의미하고, "3T"는 역전된 데옥시 티미딘을 의미함]
본 발명은 폰 빌레브란트 인자에 의하여 매개되는 질병의 치료, 예방 또는 완화 방법을 제공하며, 이 방법은 본 발명의 앱타머 또는 약학 조성물을 척추 동물 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 인간에게 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 치료, 예방 또는 완화될 질병으로서는 본태성 혈소판 감소증(essential thrombocytopenia), 혈전성 혈소판감소성 자반증("TTP"), IIb형 폰 빌레브란트병, 의사 폰 빌레브란트병, 말초 동맥 질환 예를 들어, 말초 동맥 폐색성 질환, 불안정형 협심증, 협심증, 동맥 혈전증, 동맥 경화증, 심근 경색, 급성 관상 동맥 증후군, 심방 세동, 경동맥 협착증, 뇌 경색, 뇌 혈전증, 허혈성 뇌졸중 및 일과성 뇌 허혈 발작증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 투석, CABG 수술, 관상 동맥 중재술 또는 심장 판막 치환술 실시 이전, 실시중 및/또는 실시 후에 투여된다.
본 발명의 앱타머의 생체 내 반감기의 길이는 치료, 완화 및/또는 예방될 질병에 따라서 달라질 수 있다. 예를 들어, 치료, 완화 및/또는 예방될 질병의 특성으로 인하여 장기적인 앱타머 투여가 바람직한 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 비교적 긴 반감기 예를 들어, 인간의 경우에는 5 시간 이상의 반감기를 나타낼 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 바람직한 작용 반감기(functional hailf-life) 또는 효과 지속 기간을 나타낼 수 있다. 작용 반감기 또는 효과 지속 기간은 앱타머의 약물 동력학적 반감기와 약동학적 활성에 대한 함수이다. 몇몇 구체예에서, 항-vWF 치료용 앱타머에 대하여 바람직한 인간의 작용 반감기 또는 효과 지속 기간은 PCI 및 ACS에 대해 선택적으로 제시되는 지표에 있어서 1∼5 시간에 해당된다. 이러한 역학적 특성을 갖는 앱타머는 (1) 총 앱타머 투여량의 최소화(반감기가 보다 길면 실현 가능함) 및 (2) 치료 중지후 혈소판 기능의 신속한 정상화(반감기가 보다 짧으면 실현 가능함)와 같이 2개의 목표 간에 균형을 맞출 수 있다. 몇몇 구체예에서, 혈소판 기능의 신속한 정상화는 치료에 따른 환자의 반응을 안정화시킬 수 없게 만드는 급속 중재술(예를 들어, CABG)을 임상학자들이 선택할 수 있도록 만들어 주기 때문에 중요하다.
그러므로, 몇몇 구체예에서, 본 발명의 치료 방법 및/또는 약학 조성물에 사용되는 앱타머는 비교적 짧은 작용 반감기 예를 들어, 인간의 경우에는 약 1∼5 시간의 작용 반감기를 나타낸다. 몇몇 구체예에서, 인간에 있어서의 작용 반감기는 1 시간 이상, 2 시간 이상, 3 시간 이상, 4 시간 이상이며, 약 5 시간을 넘지는 않는다. 몇몇 구체예에서, 작용 반감기 또는 효과 지속 기간은 앱타머의 분배 반감기(distribution half-life) T1 /2α와 거의 동일하다.
몇몇 구체예에서, 인간에서의 작용 반감기가 짧은 본 발명의 앱타머는 잠재적으로 수술적 개입이 필요할 수 있는 질병 예를 들어, 급성 관상 동맥 증후군의 치료, 완화 또는 예방 방법과 이를 위한 조성물에 사용된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 이러한 측면에 따른, 인간에서의 작용 반감기가 짧은 앱타머는 PEG 예를 들어, 5, 10 또는 20 kDa의 PEG에 컨쥬게이트화된다. 몇몇 구체예에서, 인간에서의 작용 반감기가 짧은 본 발명의 이러한 측면에 따른 앱타머로서는 ARC1779가 있다.
본 발명은 또한 폰 빌레브란트 인자, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 또는 이의 변이체를 포함하는 것으로 의심되는 조성물과 본 발명의 앱타머를 접촉시키는 단계 및 폰 빌레브란트 인자, 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 또는 이의 변이체의 존부를 확인하는 단계를 포함하는 진단 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 진단 방법은 시험관 내에서 실행될 수도 있으며, 다른 구체예에서 본 발명의 진단 방법은 생체 내에서도 실행될 수 있다.
본 발명은 또한 생체 내 생물학적 기능을 차단하는 앱타머를 확인하는 방법을 제공하며, 이 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:
a) 단일-가닥 핵산의 후보 혼합물을 제조하는 단계;
b) 후보 혼합물을 전장 단백질 표적과 이 전장 단백질 표적의 도메인 모두와 접촉시키는 단계;
c) 전장 단백질 표적 또는 이 단백질 표적 도메인에 대한 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계; 및
d) 친화성이 증가된 핵산을 시험관 내에서 증폭시켜, 단백질 표적에 특이적인 농축 앱타머 혼합물을 생성하는 단계.
몇몇 구체예에서, 확인 방법은 추가로 다음과 같은 단계들을 포함한다:
e) 표적에 특이적인 농축 앱타머 혼합물과 전장 단백질 표적을 접촉시키는 단계;
f) 전장 단백질 표적에 대한 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계;
g) 친화성이 증가된 핵산을 시험관 내에서 증폭시켜 표적에 특이적인 농축 앱타머 혼합물을 생성하는 단계;
h) 표적에 특이적인 농축 앱타머 혼합물과 단백질 표적 도메인을 접촉시키는 단계;
i) 단백질 표적 도메인에 대한 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계; 및
j) 친화성이 증가된 핵산을 시험관 내에서 증폭시켜, 단백질 표적 특이적 농축 앱타머 혼합물을 생성하는 단계.
몇몇 구체예에서, 확인 방법은 생체 내에서 전장 단백질 표적의 생물학적 기능을 차단하는 앱타머를 선별하는 과정을 추가로 포함하며, 또한 다른 구체예에서, 상기 확인 방법은 생체 내에서 단백질 표적 도메인의 생물학적 기능을 차단하는 앱타머를 선별하는 과정을 추가로 포함한다. 본 발명의 확인 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 전장 단백질 표적은 제1 종으로부터 유래되며, 단백질 표적 도메인은 제2 종으로부터 유래된다. 본 발명의 확인 방법에 관한 추가의 구체예에서, 이 방법은 제1 종과 제2 종 모두의 단백질 표적 모두에 결합할 수 있는 앱타머를 선별하는 단계, 바람직하게는 제1 종과 제2 종 모두에 있어서 단백질 표적의 생물학적 기능을 차단하는 앱타머를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 확인 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 전장 표적 단백질 표적은 폰 빌레브란트 인자이다. 본 발명의 확인 방법에 관한 몇몇 구체예에서, 전장 표적 단백질 표적은 폰 빌레브란트 인자로서, 여기서 선별된 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈소판 응집을 차단하는 것이 바람직하다. 몇몇 구체예에서, 단백질 표적 도메인은 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1이다. 본 발명은 또한 본 발명의 확인 방법에 의하여 확인되는 앱타머를 제공한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 또한 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공하는데, 이 앱타머는 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된 1차 핵산 서열 중 임의의 하나와 80% 이상, 특히 90% 이상, 및 더욱 구체적으로 95% 이상 동일성을 갖는 1차 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머의 서열 동일성 %는 BLAST 서열 동일성이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 화학 변형을 보유한 핵산 서열을 포함하며 화학 변형을 포함하는 것은 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열 중 임의의 하나와 80% 이상, 특히, 90% 이상, 및 더욱 구체적으로 95% 이상 동일성을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 폰 빌레브란트 인자 표적에 결합함에 따라서 폰 빌레브란트 인자의 기능을 바람직하게는 생체 내에서 조정하고, 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 중 임의의 하나에 포함된 30개의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열과 동일성을 갖는 30개의 연속적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적에 결합함에 따라서 폰 빌레브란트 인자의 기능을 바람직하게는 생체 내에서 조정하고, 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된 앱타머 중 임의의 하나를 이루는 유일한 서열 부위 내에 존재하는 20개의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열과 동일성을 갖는 20개의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적에 결합함에 따라서 폰 빌레브란트 인자의 기능을 바람직하게는 생체 내에서 조정하고, 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된 앱타머 중 임의의 하나를 이루는 유일한 서열 부위 내에 존재하는 8개의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열과 동일성을 갖는 8개의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 표적에 결합함에 따라서 폰 빌레브란트 인자의 기능을 바람직하게는 생체 내에서 조정하고, 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된 앱타머 중 임의의 하나를 이루는 유일한 서열 부위 내에 존재하는 4개의 연속적 뉴클레오티드로 이루어진 서열과 동일성을 갖는 4개의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 상세한 설명
이하 본 발명의 상세한 설명을 통하여, 본 발명의 하나 이상의 구체예에 관해서, 보다 상세히 설명하고자 한다. 본 발명을 실시 또는 시험함에 있어서, 본원에 개시된 방법과 재료와 유사하거나 또는 균등한 범위에 속하는 임의의 방법 및 재료를 사용할 수 있으며, 또한 이하에는 바람직한 방법 및 재료에 관하여도 기술되어 있다. 본 발명의 기타 특징, 목적 및 이점은 본 상세한 설명을 통하여 파악하게 될 것이다. 본 명세서에서 달리 분명하게 특정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 복수 형태의 용어를 포함한다. 달리 규정하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분쟁이 일어날 경우, 그 문제는 본 발명의 명세서에 의해 해결될 것이다.
셀렉스 ™( SELEX ™) 방법
앱타머 제조에 적당한 방법으로서는, 일반적으로 도 1에 도시된 "지수적 증폭에 의한 리간드의 체계적 진화(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment"("SELEX™")라는 방법을 이용하는 것이 있다. 상기 셀렉스™ 방법은 표적 분자에 매우 특이적으로 결합하는 핵산 분자의 시험관 내 진화 방법으로서, 이에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 출원 제07/536,428호(1990년 6월 11일 출원; 현재 포기), 미국 특허 제5,475,096호(발명의 명칭 "Nucleic Acid Ligands") 및 미국 특허 제5,270,163호(WO 91/19813 참조)(발명의 명칭 "Nucleic Acid Ligands")에 개시되어 있다. 각각의 셀렉스™-확인 핵산 리간드 즉, 앱타머는 각각 소정의 표적 화합물 또는 분자의 특이적 리간드이다. 상기 셀렉스™ 방법은, 핵산이 다양한 2차원 및 3차원 구조를 형성하기에 충분한 능력을 갖고, 핵산이 단량체일 때 실질적으로 임의의 화학적 화합물과 함께 (단량체의 형태로서든 또는 중합체의 형태로서든) 리간드로서 작용할 수 있는(즉, 특이적 결합 쌍을 형성할 수 있는) 충분한 화학적 다기능성(chemical versatility)을 보유한다는 독특한 관찰 결과를 바탕으로 한다. 임의의 크기 또는 조성을 갖는 분자가 표적으로 사용될 수 있다.
셀렉스™ 실행의 출발 단계는 랜덤화된 서열을 포함하는 단일 사슬 올리고뉴클레오티드 풀 또는 거대한 라이브러리에 의존성이다. 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 변형되지 않은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 풀은 100% 랜덤하거나 또는 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 풀은 하나 이상의 고정된 서열을 함유하는 랜덤하거나 또는 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드 및/또는 이 랜덤화된 서열 내에 통합된 보존적 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 풀은 5' 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 고정 서열(fixed sequence) 및/또는 보존적 서열(conserved sequence)을 함유하는 랜덤하거나 부분적으로 랜덤한 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이 고정 서열 및/또는 보존적 서열은 올리고뉴클레오티드 풀의 모든 분자가 공유하는 서열을 포함할 수 있다. 고정 서열은 예비 선별용으로 통합된 풀에 존재하는 올리고뉴클레오티드에 공통된 서열로서, 예를 들어, 이하에 추가로 기술되어 있는 CpG 모티프, PCR 프라이머에 대한 혼성화 위치, RNA 중합 효소(예를 들어, T3, T4, T7 및 SP6)에 대한 프로모터 서열, 제한 위치 또는 상동 중합체 서열 예를 들어, 폴리 A 또는 폴리 T 부위, 촉매 중심부, 친화성 컬럼에 선별적으로 결합하는 위치 및 목적 올리고뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 서열 결정을 촉진하는 기타 서열이 있다. 보존적 서열이란, 이미 기술된 고정 서열 이외에 동일한 표적에 결합하는 다수의 앱타머가 공유하는 서열을 말한다.
풀에 속하는 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 효율적으로 증폭되는데에 필요한 랜덤화된 서열 부분과 고정된 서열을 포함한다. 통상적으로, 상기 출발 풀의 올리고뉴클레오티드는 30∼50개의 랜덤한 뉴클레오티드로 이루어진 내부 부위에 측접하는 고정 5' 및 3' 말단 서열을 함유한다. 상기 랜덤화된 뉴클레오티드는 다수의 방법 예를 들어, 화학적 합성법 및 랜덤하게 절단된 세포내 핵산을 크기별로 선별하는 방법으로 생산될 수 있다. 시험 핵산 내 서열 변이는 또한 선별/증폭 과정을 반복 실시하기 이전 또는 실시 중에 돌연 변이 유발법으로 도입되거나 또는 증가될 수도 있다.
올리고뉴클레오티드의 랜덤한 서열 부분은 임의의 길이를 가질 수 있으며, 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한 변형 또는 인공적 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,660,985호; 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,698,687호; 미국 특허 제5,817,635호; 미국 특허 제5,672,695호 및 PCT 공보 WO 92/07065를 참조하시오. 랜덤한 올리고뉴클레오티드는 당 업계에 널리 공지된 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 포스포디에스테르-결합 뉴클레오티드로부터 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Froehler외 다수, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) 및 Froehler외 다수, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)]을 참조하시오. 랜덤한 올리고뉴클레오티드는 또한 용액 상 방법 예를 들어, 트리에스테르 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sood외 다수, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 및 Hirose외 다수, Tet. Lett., 28:2449 (1978)]을 참조하시오. 자동화된 DNA 합성 장치를 통하여 수행된 통상의 합성법은 1014∼1016 개(대부분의 셀렉스™ 실험에 사용하기에 충분한 수)의 분자를 생산한다. 서열 디자인에 있어서 랜덤한 서열의 충분히 거대한 부위는 각각의 합성 분자가 독특한 서열을 나타낼 가능성을 높여준다.
올리고뉴클레오티드의 출발 라이브러리는 DNA 합성기 상에서 자동화된 화학적 합성법으로 생산될 수 있다. 랜덤화된 서열을 합성하기 위하여, 4가지 종류의 뉴클레오티드 모두의 혼합물을 합성 과정 중의 각 뉴클레오티드 첨가 단계에 가하여, 뉴클레오티드가 랜덤하게 통합될 수 있도록 한다. 전술한 바와 같이, 하나의 구체예에서, 랜덤한 올리고뉴클레오티드는 전부 랜덤한 서열을 포함하지만; 다른 구체예에서, 랜덤한 올리고뉴클레오티드는 랜덤하지 않거나 또는 부분적으로 랜덤한 서열 부분을 포함할 수 있다. 부분적으로 랜덤한 서열은 각각의 첨가 단계에서 상이한 몰비로 4가지 뉴클레오티드를 첨가함으로써 제조될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 출발 라이브러리는 RNA 또는 DNA일 수 있거나, 또는 치환된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 이러한 예에서, RNA 라이브러리가 출발 라이브러리로 사용될 경우에는 통상적으로 DNA 라이브러리를 임의로는 PCR 증폭에 의해 합성한 후, 이 DNA 라이브러리를 T7 RNA 중합 효소 또는 변형된 T7 RNA 중합 효소로 전사시켜, 이 전사된 라이브러리를 정제함으로써 생산된다. 이후 RNA 또는 DNA 라이브러리는 결합에 유리한 조건 하에서 표적과 혼합되어, 동일한 일반 선별 과정을 이용하여 결합→분획화→증폭을 단계적으로 반복 수행함으로써, 결합 친화성 및 선별성에 관하여 실질적으로 바람직한 임의의 기준을 확립한다. 더욱 구체적으로, 핵산의 출발 풀을 함유하는 혼합물로 출발하는, 셀렉스™ 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다: (a) 결합에 유리한 조건 하에서 표적과 혼합물을 접촉시키는 단계; (b) 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 미결합 핵산을 분획화하는 단계; (c) 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계; (d) 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 증폭시켜 핵산의 리간드-농축 혼합물을 얻는 단계; 및 (e) 표적 분자에 대하여 고도로 특이적이고, 고도로 친화성인 핵산 리간드를 얻을 수 있을 정도로 많이 결합, 분획화, 해리 및 증폭 단계를 반복 수행하는 단계. 상기와 같은 경우, RNA 앱타머가 선별되면, 셀렉스™ 방법은 다음과 같은 단계들을 추가로 포함하게 된다: (i) 상기 (d) 단계에서 증폭되기 이전에 핵산-표적 복합체로부터 해리된 핵산을 역전사시키는 단계; 및 (ii) 본 방법을 다시 개시하기 이전에 상기 (d) 단계로부터 유래된 증폭 핵산을 전사시키는 단계.
다수의 가능한 서열 및 구조를 포함하는 핵산 혼합물 중에 있어서, 소정의 표적에 대한 결합 친화성은 다양하다. 예를 들어, 20개의 뉴클레오티드 랜덤화 절편을 포함하는 핵산 혼합물이 후보 물질이 될 가능성은 420 가지이다. 표적에 대한 친화성이 보다 큰(해리 상수가 보다 작은) 핵산은 대부분 표적에 결합하게 될 것이다. 분획화, 해리 및 증폭 이후, 친화성이 보다 큰 후보 핵산이 증폭된 제2 핵산 혼합물이 생성된다. 선별 라운드를 부가적으로 실시하면, 생성된 핵산 혼합물이 하나 또는 소수의 서열을 다량 포함하게 될 때까지 이 선별 과정은 최선의 리간드를 선호하게 된다. 이후 리간드는 클로닝, 서열 결정되어 각각 얼마나 순수한 리간드인지 즉, 얼마나 순수한 앱타머인지 결합 친화성에 대해 시험될 수 있다.
선별 및 증폭 주기는 원하는 목적을 이루게 될 때까지 반복 수행된다. 가장 일반적인 경우에 있어서, 주기의 반복 수행시 결합 세기가 그다지 크게 증가되지 않을 때까지 선별/증폭 과정은 계속 수행된다. 이 방법은 통상적으로 대략 1014개의 상이한 핵산 종을 얻을 수 있을 때까지 수행되지만, 약 1018개의 상이한 핵산 종을 얻을 수 있을 때까지도 사용될 수 있다. 일반적으로, 핵산 앱타머 분자는 5∼20 주기 반복 수행시 선별된다. 하나의 구체예에서, 이종성은 초기의 선별 단계에서만 도입되며, 방법을 반복 수행하는 동안에는 나타나지 않는다.
셀렉스™의 하나의 구체예에서, 선별 과정은 선별된 표적에 매우 강하게 결합하는 핵산 리간드를 분리하는 데에 매우 효율적이어서, 선별 및 증폭 과정은 단지 1회 순환만으로도 충분하다. 이와 같이 효율적인 선별은 예를 들어, 크로마토그래피와 같은 방법에서 이루어질 수 있는데, 이때 핵산이 컬럼에 결합된 표적과 결합할 수 있는 능력은, 컬럼이 친화성이 가장 큰 핵산 리간드를 충분히 분리 및 선별할 수 있는 방식으로 발휘된다.
다수의 경우, 단일의 핵산 리간드가 확인될 때까지 셀렉스™ 단계들을 반복 수행하는 것이 반드시 바람직하다고는 할 수 없다. 표적-특이적 핵산 리간드 용액은 다수의 보존적 서열과 다수의 서열 즉, 핵산 리간드의 표적에 대한 친화성에 거의 영향을 미치지 않도록 치환 또는 부가될 수 있는 다수의 서열을 보유하는 핵산 구조 또는 모티프 군을 포함할 수 있다. 셀렉스™ 과정이 완결되기 이전에 종료함으로써, 핵산 리간드 용액 군에 속하는 일원에 해당하는 서열을 다수 결정할 수 있다.
다양한 핵산의 1차, 2차 및 3차 구조가 존재하는 것으로 공지되어 있다. 비 왓슨-크릭형 상호 작용에 가장 일반적으로 관여하는 것으로 규명된 구조 또는 모티프를 헤어핀 루프, 대칭 및 비대칭 돌출부(bulge), 슈도노트(pseudoknot) 구조 및 이들의 여러가지 조합 구조라 칭한다. 이러한 모티프 중 공지된 것의 거의 대부분은 30개 이하의 뉴클레오티드로 이루어진 핵산 서열로서 형성될 수 있다고 한다. 이러한 이유로, 약 20∼약 50개의 뉴클레오티드로 이루어진 랜덤화 절편과, 몇몇 경우에 있어서는 약 30∼약 40개의 뉴클레오티드로 이루어진 랜덤화 절편을 함유하는 핵산 서열로 시작되는 연속 랜덤화 절편을 이용하는 셀렉스™ 방법을 사용하는 것이 종종 바람직하다. 하나의 실시예에서, 5'-고정:랜덤:3'-고정 서열은 약 30∼약 50개의 뉴클레오티드로 이루어진 랜덤한 서열을 포함한다.
중심(core) 셀렉스™ 방법은 변형되어 다수의 구체적 목적을 달성해 오고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,707,796호에는 셀렉스™를 겔 전기 영동법과 함께 병용함으로써 특이한 구조적 특성을 갖는 핵산 분자 예를 들어, 만곡형 DNA(bent DNA)를 선별하는 것에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제5,763,177호에는 표적 분자에 결합 및/또는 광가교되고/되거나 이 표적 분자를 광불활성화시킬 수 있는 광반응성 기를 함유하는 핵산 리간드를 선별하는데에 사용되는 셀렉스™계 방법에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제5,567,588호 및 동 제5,861,254호에는 표적 분자에 대한 친화성이 높고 낮은 올리고뉴클레오티드를 매우 효율적으로 분획화할 수 있는 셀렉스™계 방법에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제5,496,938호에는 셀렉스™ 방법을 수행한 이후에 개질된 핵산 리간드를 얻는 방법에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제5,705,337호에는 표적에 리간드를 공유 결합시키는 방법에 관하여 기술되어 있다.
셀렉스™은 또한 표적 분자 상 하나 이상의 위치에 결합하는 핵산 리간드를 얻고, 표적 상에 존재하는 특정 위치에 결합하는 비 핵산 종을 포함하는 핵산 리간드를 얻는데에 사용될 수도 있다. 셀렉스™은 임의의 상상 가능한 표적 예를 들어, 큰 생물 분자 및 작은 생물 분자 예를 들어, 핵산-결합 단백질 및 생물학적 기능을 갖는 분자의 일부와 보조 인자로서 핵산에 결합하는 것으로 공지되어 있지 않은 단백질, 그리고 기타 작은 분자에 결합하는 핵산 리간드를 분리 및 확인하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,580,737호에는 카페인 및 이와 밀접한 관련이 있는 유사체인 테오필린에 고도의 친화성으로 결합할 수 있는 핵산 서열을 셀렉스™를 통하여 확인하는 것에 관하여 개시되어 있다.
카운터-셀렉스™는 하나 이상의 비 표적 분자에 대한 가교 반응성을 갖는 핵산 리간드 서열을 제거함으로써 표적 분자에 대한 핵산 리간드의 특이성을 개선시키는 방법이다. 카운터-셀렉스™는 다음의 단계들로 이루어져 있다: (a) 핵산의 후보 혼합물을 제조하는 단계; (b) 후보 혼합물과 표적을 접촉시키는 단계로서, 후보 혼합물에 비하여 표적에 대한 친화성이 증가된 핵산을 나머지 후보 혼합물로부터 분획화할 수 있는 것인 단계; (c) 나머지 후보 혼합물로부터 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계; (d) 표적으로부터 친화성이 증가된 핵산을 해리시키는 단계; (e) 친화성이 증가된 핵산과 하나 이상의 비 표적 분자들을 접촉시켜, 비 표적 분자(들)에 대한 특이적 친화성을 갖는 핵산 리간드를 제거하는 단계; 및 (f) 표적 분자에 대하여만 특이적 친화성을 갖는 핵산을 증폭시켜, 표적 분자에 대한 결합 친화성 및 특이성이 비교적 큰 핵산 서열이 농축된 핵산 혼합물을 얻는 단계. 상기 셀렉스™에 관하여 기술된 바와 같이, 선별 및 증폭 주기는 의도로 하는 목적을 이룰 때까지 필요에 따라서 반복 수행된다.
핵산을 치료제 및 백신으로 사용함에 있어서 당면할 수 있는 문제점 중 하나는 포스포디에스테르 형인 올리고뉴클레오티드가 세포 내 효소 및 세포 외 효소 예를 들어, 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의해 목적으로 하는 효과를 얻기 이전에 체액 중에서 급속하게 분해될 수 있다는 점이다. 그러므로, 셀렉스™ 방법은 리간드에 개선된 특성 예를 들어, 개선된 생체 내 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변형 뉴클레오티드를 함유하는 고-친화성 핵산 리간드를 확인하는 단계를 포함한다. 이러한 변형의 예로서는 당 및/또는 인산염 및/또는 염기 부위에서 일어나는 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 셀렉스™-확인 핵산 리간드에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제5,660,985호[리보즈의 2번 위치, 피리미딘의 5번 위치 및 퓨린의 8번 위치가 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체 함유 올리고뉴클레오티드에 관하여 개시], 미국 특허 제5,756,703호[다양한 2'-변형 피리미딘 함유 올리고뉴클레오티드에 관하여 개시] 및 미국 특허 제5,580,737호[2'-아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F) 및/또는 2'-OMe 치환체로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 고도로 특이적인 핵산 리간드에 관하여 개시]에 기술되어 있다.
본 발명에 고려되는 핵산 리간드의 변형으로서는 핵산 리간드 염기 또는 전체 핵산 리간드에 부가 하전, 분극률, 소수성, 수소 결합, 정전기적 상호 작용 및 유동성을 부여하는 기타 화학 기를 제공하는 변형을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뉴클레아제에 내성인 올리고뉴클레오티드 군집을 생산하는 변형은 또한 하나 이상의 치환 뉴클레오티드 간 결합, 변형된 당, 변형된 염기 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 이러한 변형으로서는 2'-위치 당 변형, 5'-위치 피리미딘 변형, 8'-위치 퓨린 변형, 환외 아민(exocyclic amine)의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요도-우라실의 치환, 골격 변형, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변형, 메틸화 및 비정상적 염기-쌍 형성 조합 예를 들어, 이소염기(isobase)인 이소시티딘과 이소구아니딘의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형은 또한 3' 및 5' 변형 예를 들어, 캡핑을 포함할 수도 있다.
하나의 구체예에서, P(O)O기가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), P(O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포름아세탈") 또는 3 '-아민(-NH-CH2-CH2-)[식 중, R 또는 R'는 각각 독립적으로 H이거나 치환 또는 비치환 알킬임]로 치환되는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 결합기는 -O-, -N- 또는 -S- 결합을 통하여 인접한 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 내 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 본원에 사용된 포스포로티오에이트란 용어는 하나 이상의 황 원자로 치환된 포스포디에스테르 결합 내에 하나 이상의 비-가교성 산소 원자를 포함하는 경우를 의미하는 것이다.
추가의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 기를 포함하는데, 예를 들어, 히드록실기 중 하나 이상은 할로겐 또는 지방족 기로 치환되거나, 또는 에테르나 아민으로 작용기화된다. 하나의 구체예에서, 푸라노즈 잔기의 2'-위치는 O-메틸, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 또는 할로 기 중 임의의 것으로 치환된다. 2'-변형 당의 합성 방법에 관하여는 예를 들어, 문헌[Sproat외 다수, Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Cotten외 다수, Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); 및 Hobbs외 다수, Biochemistry 12:5138-5145 (1973)]에 개시되어 있다. 기타 변형도 당 업자에게 공지되어 있다. 이러한 변형은 예비-셀렉스™ 변형 방법 또는 사후-셀렉스™ 변형 방법(이미 확인된 비변형 리간드의 변형법)일 수 있거나, 또는 셀렉스™ 방법 중 하나의 과정으로서 통합될 수도 있다.
예비-셀렉스™ 변형 방법 또는 셀렉스™ 방법에 통합되어 수행되는 변형 방법을 통하여, 셀렉스™ 표적에 대한 특이성과 개선된 안정성 예를 들어, 생체 내 아정성 모두를 갖는 핵산 리간드를 얻을 수 있다. 핵산 리간드에 적용된 사후-셀렉스™ 변형 방법을 통하여, 핵산 리간드의 결합능에 악영향을 미치지 않고서 개선된 안정성 예를 들어, 개선된 생체 내 안정성을 얻을 수 있다.
셀렉스™ 방법은 미국 특허 제5,637,459호 및 동 제5,683,867호에 개시된 바와 같이, 선별된 올리고뉴클레오티드를 기타 선별된 올리고뉴클레오티드 및 비-올리고뉴클레오티드 작용 단위와 함께 화합하는 것을 포함한다. 셀렉스™ 방법은 또한 예를 들어, 미국 특허 제6,011,020호, 동 제6,051,698호 및 PCT 공보 WO 98/18480에 개시된 바와 같이, 진단용 또는 치료용 복합체 중의 친지성 또는 비-면역원성 고분자량 화합물을 선별된 핵산 리간드와 화합하는 것을 추가로 포함한다. 상기 특허 및 출원들은, 형태의 광범위한 어레이와 기타 특성들을, 올리고뉴클레오티드의 효율적인 증폭 및 복제 특성, 그리고 기타 분자의 바람직한 특성과 조합하는 것에 관하여 교시하고 있다.
셀렉스™ 방법을 통하여, 작고 가요성인 펩티드에 대한 핵산 리간드를 확인하는 방법도 개발되었다. 작은 펩티드는 가요성 구조를 보유하며, 일반적으로 다수의 이형태체(conformer)가 평형을 이루고 있는 용액 중에 존재하므로, 처음에는 가요성 펩티드가 결합할 때 형태 엔트로피(conformational entropy)가 소실됨에 따라서 결합 친화성이 제한될 수 있는 것으로 추정되었다. 그러나, 용액 중 작은 펩티드에 대한 핵산 리간드를 확인하는 방법의 실행 가능성에 관하여는 미국 특허 제5,648,214호[물질 P에 대한 고 친화성 RNA 핵산 리간드인, 11개의 아미노산 펩티드를 확인하는 것에 관한 발명]에 입증되어 있다.
본 발명의 표적(들)에 대한 특이성 및 결합 친화성을 갖는 앱타머는 통상적으로 본원에 기술된 바와 같이 셀렉스™ 방법에 의해 선별된다. 셀렉스™ 방법의 일환으로서, 표적에 결합하는 것으로 선별된 서열은 이후 임의로 최소화되어 목적으로 하는 결합 친화성을 보유하는 최소한의 서열을 결정할 수 있다. 선별된 앱타머 서열 및/또는 최소화된 앱타머 서열은 결합 친화성을 증가시키거나 또는 서열 내 어느 위치가 결합 활성에 필수적인지를 결정하기 위하여, 서열의 랜덤하거나 또는 유도된 돌연 변이 유발법을 수행함으로써 최적화될 수도 있다. 예를 들어, "도핑 재선별법(doped reselection)"은 앱타머 내 서열 요건을 연구하는데 사용될 수 있다. 도핑 재선별법 수행 동안에, 선별은 단일 서열을 바탕으로 하여 디자인된 합성 축퇴성 풀로써 수행된다. 축퇴성의 정도는 일반적으로 야생형 뉴클레오티드의 70∼85%로 다양하다. 일반적으로, 도핑 재선별법 수행 후 중립 돌연 변이가 관찰되지만, 몇몇 경우에 있어서는 서열 변화가 친화성을 개선시킬 수도 있다. 뿐만 아니라, 선별은 변형 서열에 통합되어 생체 내 앱타머 분자가 분해되지 않도록 안정화된 서열을 이용하여 수행될 수 있다.
2'-변형 셀렉스 ™
앱타머를 치료제로서 사용하기에 적합하도록 만들기 위해서는, 합성 비용이 적게 들고, 생체 내에서 안전하며 안정한 앱타머가 바람직하다. 야생형 RNA 및 DNA 앱타머는 뉴클레아제에 의한 분해에 민감하기 때문에 통상적으로 생체 내에서 불안정하다. 뉴클레아제 분해에 대한 내성은, 필요할 경우, 2'-위치에 변형 기를 통합함으로써 상당히 증가될 수 있다.
2'-플루오로 및 2'-아미노 기는 최종적으로 앱타머가 선별되는 올리고뉴클레오티드 라이브러리에 성공적으로 통합되었다. 그러나, 이러한 변형을 수행함에 있어서는, 결과로 생성되는 앱타머의 합성시 상당한 비용이 들어가며, 변형된 뉴클레오티드가 분해되고 궁극적으로는 이 뉴클레오티드가 DNA 합성에 대한 기질로서 사용되어, 숙주 DNA로 재활용될 수 있는 가능성으로 인해, 몇몇 경우에 있어서는 안전성에 관한 문제점도 무시할 수 없을 것이다.
본원의 몇몇 구체예에 제공된 바와 같이, 2'-O-메틸("2'-OMe") 뉴클레오티드를 함유하는 앱타머는 이와 같은 다수의 결점들을 극복한 것이다. 2'-OMe 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제-내성이며, 합성 비용이 저렴하다. 비록 2'-OMe 뉴클레오티드가 생물계에 널리 존재하고 있지만, 천연 생성 중합 효소는 생리적 조건 하에서는 기질로서 2'-OMe NTP를 받아들이지 않기 때문에, 2'-OMe 뉴클레오티드가 숙주 DNA로 재활용되는 것과 관련한 안전성의 문제점은 발생하지 않는다. 2'-변형된 앱타머를 생산하는 데에 사용되는 셀렉스™ 방법에 관하여는 예를 들어, 미국 가명세서 특허 출원 제60/430,761호(2002년 12월 3일 출원), 미국 가명세서 특허 출원 제60/487,474호(2003년 7월 15일 출원), 미국 가명세서 특허 출원 제60/517,039호(2003년 11월 4일 출원), 미국 특허 출원 제10/729,581호(2003년 12월 3일 출원), 미국 특허 출원 제10/873,856호(2004년 6월 21일 출원; 발명의 명칭 "Method for in vitro Selection of 2'-OMe Substituted Nucleic Acids"), 및 미국 가명세서 특허 출원 제60/696,295호(2005년 6월 30일 출원; 발명의 명칭 "Improved Materials and Methods for the Generation of Fully 2'-Modified Containing Nucleic Acid Transcripts")에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드를 비 변형 올리고뉴클레오티드에 비하여 효소 및 화학 분해, 그리고 열 및 물리적 분해에 보다 안정적으로 만드는 변형 뉴클레오티드(예를 들어, 2' 위치가 변형된 뉴클레오티드)를 함유하는 폰 빌레브란트 인자에 결합하여 이의 기능을 조정하는 앱타머를 포함한다. 비록, 문헌[예를 들어, Ruckman외 다수, J.Biol.Chem, 1998 273, 20556-20567-695]에 2'-OMe를 함유하는 앱타머의 몇몇 예에 관하여 개시되어 있지만, 이러한 앱타머는 C 및 U 잔기가 2'-플루오로(2'-F) 치환되었고, A 및 G 잔기가 2'-OH인 변형 전사체 라이브러리를 시험관 내 선별함으로써 생산되었다. 일단 기능성 서열이 확인되면, A 및 G 잔기는 각각 2'-OMe 치환에 대한 내성에 관하여 시험되고, 이 앱타머 즉, 모든 A 및 G 잔기가 2'-OMe 치환을 2'-OMe 잔기로 묵인하는 앱타머는 재합성되었다. 이와 같은 2-단계 방식으로 합성된 앱타머 중 대부분의 A 및 G 잔기는 2'-OMe 잔기와의 치환을 묵인한다[평균적으로 약 20%는 그러하지 않음]. 결과적으로 이 방법을 이용하여 합성된 앱타머는 2∼4개의 2'-OH 잔기를 함유하는 경향이 있으며, 안정성 및 합성 비용 면에서는 결과적으로 차이가 나지 않는다. 앱타머가 선별되는 올리고뉴클레오티드 라이브러리에 사용되어 셀렉스™(및/또는 본원에 기술된 것을 포함하는 변법 및 개선된 방법 중 임의의 방법)에 의해 증폭되는, 안정화된 올리고뉴클레오티드를 생산하는 전사 반응에 변형된 뉴클레오티드를 도입시킴으로써, 본 발명의 방법은 (예를 들어, 앱타머 올리고뉴클레오티드를 변형된 뉴클레오티드로 재합성함으로써) 선별된 앱타머 올리고뉴클레오티드를 안정화시킬 필요성이 없어진다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시 및 2'-0Me 변형을 조합하여 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-0Me, 2'-NH2 및 2'-메톡시에틸 변형을 조합하여 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-0Me, 2'-NH2 및 2'-메톡시에틸 변형을 56가지 조합하여 포함하는 앱타머를 제공한다.
본 발명의 몇몇 구체예의 2'-변형 앱타머는 변형 중합 효소 예를 들어, 변형 T7 중합 효소[푸라노즈 2' 위치에 벌키한 치환기를 보유하는 변형 뉴클레오티드를 통합하는 비율이 야생형 중합 효소의 경우보다 더욱 큰 중합 효소]를 사용하여 생산된다. 예를 들어, 639번 위치에 존재하는 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 변경된 단일의 돌연 변이 T7 중합 효소(Y639F)는 2'데옥시, 2'아미노- 및 2'플루오로-뉴클레오티드 트리포스페이트(NTPs)를 기질로서 용이하게 이용하므로, 이는 다양한 분야에서 변형 RNA를 합성하는데에 광범위하게 사용되어 오고 있다. 그러나, 이 돌연 변이 T7 중합 효소는 벌키한 2'-치환기 예를 들어, 2'-OMe 또는 2'-아지도(2'-N3) 치환기를 보유하는 NTP를 용이하게 이용(즉, 통합)할 수 없다. 벌키한 2'-치환기를 통합시키기 위해서는, 784번 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변경되었을 뿐만 아니라, Y639F 돌연 변이도 발생한, 이중 T7 중합 효소 돌연 변이체(Y639F/H784A)는 제한된 환경 하에서 변형 피리미딘 NTP를 통합하는데에 사용된다고 개시된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138]을 참조하시오. Y639F/H784A/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소는 제한된 환경 하에서 변형된 퓨린 및 피리미딘 NTP 예를 들어, 2'-0Me NPT를 통합하는데에 사용되었지만, 이 경우 전사를 위해서는 2'-OH GTP의 스파이크(spike)가 필요하다. 문헌[Burmeister외 다수, Chemistry and Biology, 2005, 12: 25-33]을 참조하시오. 784번 위치의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변경된 단일 돌연 변이 T7 중합 효소(H784A)에 관하여도 개시되어 있다[Padilla외 다수, Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138]. Y639F/H784A 이중 돌연 변이 T7 중합 효소 및 H784A 단일 돌연 변이 T7 중합 효소 둘 다에 있어서, 보다 작은 아미노산 잔기 예를 들어, 알라닌으로 변경되면, 더욱 벌키한 뉴클레오티드 기질 예를 들어, 2'-O 메틸 치환 뉴클레오티드를 통합할 수 있다[Chelliserry, K. and Ellington, A.D., Nature Biotech, 2004, 9:1155-60 참조]. 부가의 T7 RNA 중합 효소 예를 들어, 639번 위치의 티로신 잔기가 루신으로 변경된 단일 T7 돌연 변이 RNA 중합 효소(Y639L)는 T7 RNA 중합 효소 활성화 위치에 돌연 변이가 일어나서 벌키한 2'-변형 기질을 보다 용이하게 통합할 수 있다고 개시되어 있다. 그러나, 활성은 종종 이러한 돌연 변이로 부여된 기질 특이성이 증가함에 따라서 없어지기도 하며, 결국에는 전사 수율도 낮아지게 된다[Padilla R and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 1999, 27(6): 1561].
일반적으로, 본원에 개시된 조건 하에서, Y693F 단일 돌연 변이체는 모든 2'-OMe 치환 NTP(GTP 제외)를 통합하는데에 사용될 수 있으며, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L/H784A 및 Y639L/H784A/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소는 모든 2'-OMe 치환 NTP(GTP 포함)를 통합하는데에 사용될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. H784A 단일 돌연 변이체는 본원에 개시된 조건 하에서 사용될 때, Y639F 및 Y639F/H784A 돌연 변이체와 유사한 특성을 보유할 것으로 예측된다.
2'-변형된 올리고뉴클레오티드는 전체가 변형된 뉴클레오티드로 이루어지도록 합성될 수 있거나, 또는 변형된 뉴클레오티드의 하위 세트를 포함하도록 합성될 수 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있으며, 또한 동일한 변형을 포함할 수도 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있지만, 상이한 변형을 포함할 수도 있는데, 예를 들어, 동일한 염기를 함유하는 모든 뉴클레오티드는 변형의 한 형태를 보유할 수 있는 반면에, 다른 염기를 함유하는 뉴클레오티드는 상이한 유형의 변형을 보유할 수 있다. 모든 퓨린 뉴클레오티드는 한 가지 유형의 변형을 보유할 수 있는 반면에(또는 변형되지 않는 반면에), 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 기타 상이한 유형의 변형을 보유한다(또는 변형되지 않는다). 이러한 방식으로, 전사체 또는 전사체 라이브러리는 예를 들어, 리보뉴클레오티드(2'-OH), 데옥시리보뉴클레오티드(2'-데옥시), 2'-F 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 변형을 조합 적용함으로써 생산된다. 2'-0Me C 및 U와 2'-OH A 및 G를 함유하는 전사 혼합물을 "rRmY" 혼합물이라 칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "rRmY" 앱타머라 칭한다. 데옥시 A 및 G와 2'-0Me U 및 C를 함유하는 전사 혼합물을 "dRmY" 혼합물이라 칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "dRmY" 앱타머라 칭한다. 2'-0Me A, C 및 U와, 2'-OH G를 함유하는 전사 혼합물을 "rGmH" 혼합물이라 칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "rGmH" 앱타머라 칭한다. 2'-0Me A, C, U 및 G와, 2'-0Me A, U 및 C, 그리고 2'-F G를 함유하는 전사 혼합물을 "대안적 혼합물(alternating mixture)"이라 칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "대안적 혼합물" 앱타머라 칭한다. 2'-0Me A, U, C 및 G를 함유하는 전사 혼합물[G의 10% 이하가 리보뉴클레오티드인 혼합물]을 "r/mGmH" 혼합물이라 칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "r/mGmH" 앱타머라 칭한다. 2'-0Me A, U 및 C와, 2'-F G를 함유하는 전사 혼합물을 "fGmH" 혼합물이라 칭하고 이로부터 선별된 앱타머를 "fGmH" 앱타머라 칭한다. 2'-0Me A, U 및 C와, 데옥시 G를 함유하는 전사 혼합물을 "dGmH" 혼합물이라 칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "dGmH" 앱타머라 칭한다. 데옥시 A 및 2'-0Me C, G 및 U를 함유하는 전사 혼합물을 "dAmB" 혼합물이라 칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "dAmB" 앱타머라 칭하며, 모든 2'-OH 뉴클레오티드를 함유하는 전사 혼합물을 "rN" 혼합물이라 칭하고, 이로부터 선별된 앱타머를 "rN", "rRrY" 또는 "RNA" 앱타머라 칭한다. 2'-OH 아데노신 트리포스페이트 및 구아노신 트리포스페이트와, 데옥시 시티딘 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트를 함유하는 전사 혼합물을 rRdY 혼합물이라 칭하며, 이로부터 선별된 앱타머를 "rRdY" 앱타머라 칭한다. "mRmY" 앱타머는 2'-히드록시를 함유하는 출발 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-OMe 뉴클레오티드만을 함유하는 앱타머이다.
바람직한 구체예는 2'-OH, 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 임의로 조합하여 포함한다. 다른 구체예는 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 임의로 조합하여 포함한다. 또 다른 구체예는 피리미딘이 2'-0Me인 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드를 임의로 조합하여 포함한다(예를 들어, dRmY, mRmY 또는 dGmH).
본 발명의 앱타머에 변형된 뉴클레오티드를 통합하는 것은 (예비적) 선별 방법 예를 들어, 예비-셀렉스™ 변형법) 수행 이전에 이루어질 수 있다. 임의로, 변형 뉴클레오티드가 예비-셀렉스™ 변형법에 의해 통합된 본 발명의 앱타머는 또한 사후-셀렉스™ 변형법[즉,예비-셀렉스™ 변형법 이후 수행되는 사후-셀렉스™ 변형법]에 의해 변형될 수도 있다. 예비-셀렉스™ 변형법은 셀렉스™ 표적에 대한 특이성을 갖고 생체 내 안정성이 개선된 변형 핵산 리간드를 생성한다. 사후-셀렉스™ 변형법 즉, 변형(예를 들어, 예비-셀렉스™ 변형법에 의해 뉴클레오티드가 통합되어 있는, 이미 동정된 리간드의 절단, 결실, 치환 또는 부가적 뉴클레오티드 변형)을 통하여, 예비-셀렉스™ 변형법으로 뉴클레오티드가 통합된 핵산 리간드의 결합능에 악영향을 미치지 않고 생체 내 안정성을 추가로 개선시킬 수도 있다.
중합 효소가 2'-변형 NTP를 수용하는 조건 하에서, 2'-변형(예를 들어, 2'-0Me) RNA 전사체의 풀을 생성하기 위해서는, Y693F, Y693F/K378R, Y693F/H784A, Y693F/H784A/K378R, Y693L/H784A, Y693L/H784A/K378R Y639L 또는 Y639L/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소를 사용할 수 있다. 바람직한 중합 효소로서는 Y639L/H784A 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소가 있다. 기타 바람직한 중합 효소로서는 Y639L/H784A/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소가 있다. 기타 T7 RNA 중합 효소, 구체적으로, 벌키한 2'-치환기에 대한 묵인성(tolerance)이 강한 중합 효소도 본 발명에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 조건을 이용하여 주형-유도성 중합에 사용될 경우, Y639L/H784A 또는 Y639L/H784A/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소는 모든 2'-0Me NTP(GTP 포함)를, Y639F, Y639F/K378R, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L, 또는 Y639L/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소를 사용하였을 때보다 높은 전사 수율로써 통합하는데에 사용될 수 있다. Y639L/H784A 및 Y639L/H784A/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소는 2'-변형 예를 들어, 2'-OMe 함유 올리고뉴클레오티드를 고 수율로 얻기 위해서 2'-OH GTP와 함께 사용될 수 있지만, 이것을 반드시 필요로 하는 것은 아니다.
다수의 요인들이 본원에 개시된 방법에 유용한 전사 조건에 중요한 것으로 판단되었다. 예를 들어, 리더 서열이 DNA 전사 주형의 5' 말단부에 통합되면 변형 전사체의 수율이 증가되는 것을 볼 수 있다. 리더 서열은 통상적으로 길이가 6∼15 뉴클레오티드인 서열로서, 퓨린 모두와, 퓨린과 피리미딘 뉴클레오티드의 혼합체일 수 있다.
전사는 2가지 단계로 구분될 수 있다: 제1 단계는 NTP가 GTP의 3'-히드록실 말단부(또는 기타 치환 구아노신)에 부가되어, 추후 약 10∼12개의 뉴클레오티드에 까지 연장되는 디뉴클레오티드를 생성하는 개시 단계이고; 제2 단계는 처음 약 10∼12개의 뉴클레오티드가 부가되어 이후로 전사가 진행되는 연장 단계이다. 과량의 2'-0Me GTP를 함유하는 전사 혼합물에 가하여진 소량의 2'-OH GTP는 중합 효소가 2'-OH GTP를 이용하여 전사를 개시할 수 있도록 만드는데에 충분하지만, 일단 전사가 연장 단계에 돌입하게 되면 2'-0Me GTP 및 2'-OH GTP 사이의 구별능이 감소하고, 2'-OH GTP에 비해 2'-0Me GTP가 과량으로 존재하게 되면 주로 2'-0Me GTP를 통합할 수 있게 된다.
2'-OMe 치환 뉴클레오티드를 전사체에 통합하는데에 있어서 또 다른 중요한 요인은, 전사 혼합물 중에 2가의 마그네슘 및 망간을 사용하는 것이다. 염화 마그네슘 및 염화망간의 농도를 상이하게 조합하면, 2'-O-메틸화 전사체의 수율에 영향을 미치는 것으로 파악되는데, 이때 염화마그네슘 및 염화망간의 최적 농도는 2가 금속 이온을 복합체화시키는 NTP의 전사 반응 혼합물 중의 농도에 따라 달라진다. 최대로 2'-O-메틸화된 전사체[즉, 모든 2'-OMe A, C 및 U와 약 90%의 G 뉴클레오티드]의 수율을 최대로 높이기 위해서, 각각의 NTP가 0.5 mM의 농도로 존재할 때 염화마그네슘의 농도는 약 5 mM이고, 염화망간의 농도는 약 1.5 mM인 것이 바람직하다. 각각의 NTP 농도가 1.0 mM일 때, 염화마그네슘의 농도는 약 6.5 mM이고, 염화망간의 농도는 약 2.0 mM인 것이 바람직하다. 각각의 NTP 농도가 2.0 mM일 때, 염화마그네슘의 농도는 약 9.5 mM이고, 염화망간의 농도는 약 3.0 mM인 것이 바람직하다. 임의의 경우에 있어서, 상기 농도들을 2배 이하로 조절하면, 변형 전사체의 양은 상당히 증가하게 될 것이다.
GMP 또는 구아노신 또는 기타 비-2'-OMe 비-트리포스페이트로 전사를 프라이밍(priming)시키는 것도 중요하다. 이러한 효과는 개시 뉴클레오티드에 대한 중합 효소의 특이성으로 인한 결과이다. 결과적으로, 이러한 방식으로 생성된 임의의 전사체의 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-OH G일 것이다. GMP(또는 구아노신)의 바람직한 농도는 0.5 mM이고, 더욱 바람직하게는 1 mM이다. 뿐만 아니라, PEG 바람직하게는 PEG-8000을 포함하여, 전사 반응물에서는 변형 뉴클레오티드를 최대한 통합시키는 것이 유용하다.
2'-0Me ATP(100%), UTP(100%), CTP(100%) 및 GTP(약 90%)("r/mGmH")를 전사체에 최대한 통합함에 있어서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01% (w/v), MgCl2 5 mM(각각의 2'-OMe NTP 농도가 1.0 mM인 경우에는 6.5 mM), MnCl2 1.5 mM(각각의 2'-OMe NTP 농도가 1.0 mM인 경우에는 2.0 mM), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더욱 바람직하게는, 1.0 mM), 2'-OH GTP 30 μM, 2'-OH GMP 500 μM, pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 중합 효소 200 nM, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 및 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열(길이 = 8 뉴클레오티드 이상). 본원에 사용된 Y639F/H784A 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소(또는 본원에 특정된 임의의 기타 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소) 1 유닛은, r/mGmH 조건 하에서 2'-OMe NTP 1nmole을 전사체에 통합하는데 필요한 효소의 양으로서 정의된다. 본원에 사용된, 무기 피로포스페이트 1 유닛은 pH 7.2 및 25℃에서 1 분당 무기 오르토포스파타제를 1.0 몰 방출시킬 효소의 양으로서 정의된다.
2'-OMe ATP, UTP 및 CTP("rGmH")를 전사체에 최대한(100%) 통합함에 있어서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(각각의 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM인 경우에는 9.5 mM), MnCl2 1.5 mM(각각의 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM인 경우에는 3.0 mM), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더욱 바람직하게는, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합 효소 200 nM, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖ 및 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열(길이 = 8 뉴클레오티드 이상).
2'-0Me ATP, 2'-0Me UTP, 2'-OMe CTP 및 2'-0Me GTP("mRmY")를 전사체에 최대한(각각 100%) 통합함에 있어서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-1OO 0.01% (w/v), MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, 2'-OMe NTP(각각) 1.5 mM, 2'-OH GMP 1 mM, pH 7.5, Y639L/H784A/K378R 돌연 변이 T7 RNA 중합 효소 20OnM, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 그리고 유도 전사 조건 하에서 전사 수율을 증가시키는 리더 서열. 하나의 구체예에서, 리더 서열은 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열이다. 다른 구체예에서, 리더 서열은 퓨린과 피리미딘의 혼합체이다. 본원에 사용된 무기 피로포스파타제 1 유닛은 pH 7.2 및 25℃에서 1분당 무기 오르토포스페이트를 1.0 몰 방출시킬 효소의 양으로서 정의된다.
2'-0Me UTP 및 CTP("rRmY")를 전사체로 최대한(100%) 통합함에 있어서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(각각의 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM인 경우에는 9.5 mM), MnCl2 1.5 mM(각각의 2'-OMe NTP 농도가 2.0 mM인 경우에는 3.0 mM), 2'-0Me NTP(각각) 500μM (더욱 바람직하게는, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 중합 효소 200 nM, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 그리고 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열(길이 = 8 뉴클레오티드 이상).
데옥시 ATP 및 GTP, 그리고 2'-0Me UTP 및 CTP("dRmY")를 전사체에 최대한(100%) 통합함에 있어서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.5 mM, MnCl2 3.0 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합 효소 200 nM, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 그리고 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열(길이 = 8 뉴클레오티드 이상).
2'-OMe ATP, UTP 및 CTP와, 2'-F GTP("fGmH")를 전사체에 최대한(100%) 통합함에 있어서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.5 mM, MnCl2 3.0 mM, 2'-0Me NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합 효소 200 nM, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 그리고 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열(길이 = 8 뉴클레오티드 이상).
데옥시 ATP 및 2'-OMe UTP, GTP 및 CTP ("dAmB")를 전사체에 최대한(100%) 통합함에 있어서는 다음과 같은 조건들이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.5 mM, MnCl2 3.0 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 중합 효소 200 nM, 무기 피로포스파타제 5 유닛/㎖, 그리고 전부 퓨린으로 이루어진 리더 서열( 길이 = 8 뉴클레오티드 이상).
상기 각각의 조건에 있어서, (a) 약 20∼약 50℃, 바람직하게는 약 30∼45℃ 및 더욱 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 2 시간 이상 동안 전사를 수행하는 것이 바람직하며, (b) 50∼300 nM의 이중 사슬 DNA 전사 주형이 사용되고[200 nM의 주형은 제1 라운드에 사용되어 다양성을 증가시킴(300 nM의 주형은 dRmY 전사에 사용됨)], 또한 추후의 라운드[약 50 nM, 1/10배 희석된 최적화 PCR 반응물(본원에 기술된 조건 이용)]가 수행된다. 바람직한 DNA 전사 주형을 이하에 나타내었다[ARC254 및 ARC256이 모든 2'-OMe 조건하에서 전사되는 경우와 ARC255가 rRmY 조건 하에서 전사되는 경우].
Figure 112007026846805-PCT00005
본 발명의 rN 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2'-OH 구아노신 트리포스페이트(GTP), 2'-OH 시티딘 트리포스페이트(CTP) 및 2'-OH 우리딘 트리포스페이트(UTP)를 포함한다. 본 발명의 rN 전사 혼합물을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-OH 시티딘 및 2'-OH 우리딘을 모두 포함한다. 바람직한 구체예에서, rN 전사로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 rN 전사에 있어서, 결과로 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 rN 전사에 있어서, 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트, 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-0Me 시티딘 트리포스페이트 및 2'-0Me 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rRmY 전사 혼합물을 사용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-0Me 시티딘 및 2'-0Me 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 우리딘인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 dRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-데옥시 구아노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dRmY 전사 조건을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-데옥시 아데노신, 2'-데옥시 구아노신, 2'-0-메틸 시티딘 및 2'-0-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 결과로 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-0-메틸 아데노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rGmH 전사 혼합물을 사용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-0-메틸 우리딘 및 2'-0-메틸 아데노신을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 아데노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시키딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 아데노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 r/mGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-0-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 구아노신 트리포스페이트 및 2'-0 메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-OH 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 r/mGmH 전사 혼합물을 사용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-0-메틸 아데노신, 2'-0-메틸 시티딘, 2'-0-메틸 구아노신 및 2'-0 메틸 우리딘을 포함하며, 이때 구아노신 뉴클레오티드 군집은 최대 약 10%의 2'-OH 구아노신을 보유한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 r/mGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90%가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 mRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-0-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 구아노신 트리포스페이트 및 2'-0 메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 mRmY 전사 혼합물을 사용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 fGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-0-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-F 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 fGmH 전사 조건을 이용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-0-메틸 아데노신, 2'-0-메틸 우리딘, 2'-0-메틸 시티딘 및 2'-F 구아노신을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 dAmB 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-0-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-0-메틸 구아노신 트리포스페이트 및 2'-0-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dAmB 전사 혼합물을 사용하여 생산된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-데옥시 아데노신, 2'-0-메틸 시티딘, 2'-0-메틸 구아노신 및 2'-0 메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 결과로 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
각각의 경우에, 전사 생성물은 이후 셀렉스™ 방법에 도입되어 앱타머를 동정하고/동정하거나 소정의 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 보존적 서열을 결정하는데에 사용될 수 있다. 결과의 서열은 이미 부분적으로 안정화되어 있으므로, 사후-셀렉스™ 방법으로부터 이 단계를 빼면 최적화된 앱타머 서열이 얻어지고, 또한 그 결과, 보다 안정화된 앱타머를 얻을 수 있게 된다. 2'-OMe 셀렉스™ 방법의 또 다른 이점은 결과로 생성된 서열이 서열 내에 필요한 2'-OH 뉴클레오티드보다 소수의 2'-OH 뉴클레오티드를 보유하고, 아예 보유하지 않을 수도 있다는 점이다. 어느 정도 2'-OH 뉴클레오티드가 잔류하게 되면, 이 2'-OH 뉴클레오티드는 사후-셀렉스™ 변형 방법을 수행함으로써 제거될 수 있다.
전술한 바와 같이, 2'-치환 뉴클레오티드를 전부 통합한 전사체의 낮지만 여전히 유용한 정도의 수율은 전술한 최적화 조건 이외의 조건하에서도 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 전사 조건을 변형시킨 조건으로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:
HEPES 완충액 농도는 0∼1 M일 수 있다. 본 발명은 또한 pKa 값이 5∼10인 기타 완충제 예를 들어, Tris-히드록시메틸-아미노메탄을 사용하는 것을 고려한다.
DTT 농도는 0∼400 mM일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 환원제 예를 들어, 머캅토에탄올을 사용한다.
스퍼미딘 및/또는 스퍼민의 농도는 0∼20 mM일 수 있다.
PEG-8000의 농도는 0∼50 %(w/v)일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 기타 친수성 중합체 예를 들어, 기타 분자량을 갖는 PEG 또는 기타 폴리알킬렌 글리콜을 사용한다.
Triton X-100의 농도는 0∼0.1%(w/v)일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 기타 비-이온계 세제 예를 들어, 기타 세제 예를 들어, 기타 Triton-X 세제를 사용한다.
MgCl2의 농도는 0.5∼50 mM일 수 있다. MnCl2의 농도는 0.15∼15 mM일 수 있다. MgCl2 및 MnCl2는 기술된 범위 내에 존재할 수 있으며, 바람직한 구체예에서 MgCl2:MnCl2의 비율은 약 10:3, 바람직하게 상기 비율은 약 3∼5:1, 더욱 바람직하게 상기 비율은 약 3∼4:1이다.
2'-0Me NTP 농도(각각의 NTP)는 5 μM∼5 mM일 수 있다.
2'-OH GTP 농도는 0∼300 μM일 수 있다.
2'-OH GMP 농도는 0∼5 mM일 수 있다.
pH는 pH 6∼9일 수 있다. 본 발명의 방법은 변형된 뉴클레오티드를 통합하는 대부분의 중합 효소의 활성을 갖도록 하는 pH 범위 내에서 실시될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법은 전사 반응 조건 하에서 킬레이트화제 예를 들어, EDTA, EGTA 및 DTT를 사용할 수도 있다.
앱타머 의약 화학
앱타머 의약 화학은 변이체 앱타머 세트가 화학적으로 합성되는 앱타머 개량기술이다. 이와 같은 변이체 세트는 통상적으로 단일 치환기가 도입되었다는 점에서 근원 앱타머와 상이하며, 이 치환기의 위치에 따라서 서로 상이하다. 이후 이 변이체는 상호 간 그리고 근원 앱타머와 비교된다. 단일 치환기의 통합이 특정 치료 기준에 부합시키는데에 반드시 필요하다는 점에서, 앱타머의 특성을 개선시키는 것은 중요하다고 해도 과언이 아니다.
대안적으로, 단일의 변이체 세트로부터 수집된 정보는 하나 이상의 치환기가 일제히 도입된 변이체 세트를 추가로 디자인하는데에 사용될 수 있다. 하나의 디자인 기법에 있어서, 단일 치환기 변이체 모두에 순위를 메겨, 상위 4개에 해당하는 것들을 골라서, 이 4개의 단일 치환기 변이체의 가능한 모든 이중(6) 조합체, 삼중(4) 조합체 및 4중(1) 조합체를 합성 및 검정한다. 제2의 디자인 기법에 있어서는, 최선의 단일 치환기 변이체는 새로운 근원으로서 간주되며, 가장 최상위에 해당하는 단일 치환기 변이체를 포함하는 가능한 모든 이중 치환기 변이체를 합성 및 검정한다. 기타 기법이 사용될 수 있으며, 이러한 기법은 반복적으로 적용되어 치환기의 수가 점차적으로 증가하게 되고, 이러면서 더욱 개선된 변이체를 계속해서 동정할 수 있다.
앱타머 의약 화학은 특히, 치환기의 광범위한 도입보다는 국소적 도입을 연구하는 방법으로서 사용될 수 있다. 앱타머는 전사에 의해 생성된 라이브러리 내에서 발견되기 때문에, 셀렉스™ 방법 수행 중에 도입된 임의의 치환기는 광범위하게 도입되는 것이 틀림없다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합이 뉴클레오티드 간에 도입되는 것이 바람직하면, 이 결합은 오직 A(또는 G, C, T, U 등)가 존재하는 위치마다 도입될 수 있다(광범위 치환). 포스포로티오에이트가 일부 A 위치(또는 일부 G, C, T, U 등의 위치)에 존재하여야 하되(국소 치환되되) 다른 A 위치에는 존재하여서는 안 되는 앱타머는 이 방법을 통해서는 용이하게 발견될 수 없다.
앱타머 의약 화학적 방법에 의하여 이용될 수 있는 치환기의 종류는, 치환기가 고상 합성 시약으로서 생산될 수 있는 능력과, 이 치환기가 올리고머 합성 과정에 도입될 수 있는 능력에 따라서만 달라진다. 이러한 방법은 분명 뉴클레오티드에만 국한되는 것이 아니다. 앱타머 의약 화학적 방법은 입체 부피(steric bulk), 소수성, 친수성, 친지성, 소지성(lipophobicity), 양전하, 음전하, 중성 전하, 양쪽성 이온, 분극성, 뉴클레아제-내성, 형태적 강성(conformational rigidity), 형태적 가요성(conformational flexibility), 단백질-결합 특성, 질량 등을 갖도록 만드는 치환기를 포함할 수 있다. 앱타머 의약 화학적 방법은 염기-변형, 당-변형 또는 포스포디에스테르 결합-변형을 포함할 수 있다.
치료용 앱타머 내부에 있어서 유리할 것 같은 치환기의 종류를 고려할 때, 다음과 같은 카테고리 중 하나 이상에 속하는 치환기를 도입하는 것이 바람직할 수 있다:
(1) 체 내에 이미 존재하는 치환기 예를 들어, 2'-데옥시, 2'-리보, 2'-O-메틸 퓨린 또는 피리미딘 또는 5-메틸 시토신.
(2) 이미 승인된 치료제의 일부인 치환기 예를 들어, 포스포로티오에이트-결합 올리고뉴클레오티드.
(3) 상기 2개의 카테고리 중 하나를 가수 분해 또는 분해하는 치환기 예를 들어, 메틸포스포네이트-결합 올리고뉴클레오티드.
본 발명의 vWF 앱타머는 본원에 기술된 바와 같은 앱타머 의약 화학적 방법을 통하여 개발된 앱타머를 포함한다.
폰 빌레브란트 인자 특이적 결합 앱타머
본 발명의 물질은 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는, 길이 29∼76 뉴클레오티드인 일련의 핵산 앱타머를 포함한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 물질은 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하고, 폰 빌레브란트 인자의 활성을 생체 내 및/또는 세포계 검정법에서 기능적으로 조정 예를 들어, 차단하는, 길이 29∼76 뉴클레오티드인 일련의 핵산 앱타머를 포함한다.
전장 폰 빌레브란트 인자 및/또는 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1과 특이적으로 결합하여 이를 조정할 수 있는 앱타머가 본원에 제시되어 있다. 이러한 앱타머는 독성이 약하고, 안전하며, 심혈관 질병 또는 질환을 치료 및/또는 예방하는 양상이 효과적이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈소판 응집에 의하여 유발되거나 또는 이와 관련되어 있다고 공지되어 있는 관상 동맥 질환 예를 들어, 동맥 혈전증 및 급성 관상 동맥 증후군 예를 들어, 불안정 협심증 및 심근 경색증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 중 임의의 하나를 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈소판 응집에 의하여 유발되거나 또는 이와 관련되어 있다고 공지되어 있는 관상 동맥 질환 예를 들어, 동맥 혈전증 및 급성 관상 동맥 증후군 예를 들어, 불안정 협심증 및 심근 경색증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 중 임의의 하나를, 출혈 부작용을 최소화시켜 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈소판 응집에 의하여 유발되거나 또는 이와 관련되어 있다고 공지되어 있는 말초 혈관계 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈소판 응집에 의하여 유발되거나 또는 이와 관련되어 있다고 공지되어 있는 말초 혈관계 질병을, 바람직하게는 출혈 부작용을 최소화시켜 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는, 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈소판 응집에 의하여 유발되거나 또는 이와 관련되어 있다고 공지되어 있는 일괄성 허혈 발작, 뇌졸중 및 경동맥 협착증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 중 임의의 하나를 포함하여 뇌혈관 질환을, 바람직하게는 출혈 부작용을 최소화시켜 치료 및/또는 예방하는데에 사용된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 앱타머는, 개체가 관상 동맥 중재 시술 예를 들어, 혈관 확장술, 혈전 용해 처리 또는 관상 동맥 우회로 수술의 수행 이전, 수행 중 및/또는 수행 후 개체에서 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈소판 응집을 억제하는데에 유용하다. 본 발명의 앱타머는 또한 관상 동맥 우회로 수술의 수행 이전, 수행 중 및/또는 수행 후 개체에서 혈관 개통률을 유지시키는데에 유용하다. 본 발명의 앱타머는 또한 투석을 실시하는 환자를 치료하는데에도 유용하다. 본 발명의 앱타머는 또한 개체 내에서 폰 빌레브란트 인자 매개성 혈전증을, 바람직하게는 출혈 부작용을 최소화시키면서 억제하는데에 유용하다. 치료 및/또는 억제될 혈전증은 염증 반응과 관련될 수 있다.
하나의 구체예에서, 치료제 및/또는 진단제로 사용되는 폰 빌레브란트 인자 특이적 결합 앱타머는, 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212∼214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635, ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구체예에서, 치료제 및/또는 진단제로 사용되는 폰 빌레브란트 인자 특이적 결합 앱타머는 다음과 같은 서열들 중 임의의 하나를 포함한다: 서열 번호 23, 서열 번호 44, 서열 번호 49, 서열 번호 98∼100, 서열 번호 106, 서열 번호 109, 서열 번호 114∼115, 서열 번호 118, 서열 번호 127, 서열 번호 134, 서열 번호 164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 208 및 서열 번호 212∼214. 몇몇 구체예에서, 치료제 및/또는 진단제로 사용되는 폰 빌레브란트 인자 특이적 결합 앱타머는 다음과 같은 서열들 중 임의의 하나를 포함한다: ARC1029(서열 번호 214), ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284), ARC1368(서열 번호 291), ARC1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320), ARC1780(서열 번호 321), ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323).
폰 빌레브란트 인자에 결합하는 본 발명의 기타 앱타머에 관하여는 이하 실시예 1 및 실시예 2에 기술되어 있다.
이와 같은 앱타머는 본원에 기술된 바와 같은 변형 예를 들어, 친지성 또는 고분자량 화합물(예를 들어, PEG)에의 컨쥬게이트화, 캡핑부의 통합, 변형된 뉴클레오티드의 통합 및 포스페이트 골격 변형(포스포로티오에이트의 포스페이트 골격으로의 통합 포함)이 일어날 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 폰 빌레브란트 인자와 결합하는 분리된, 비 천연 생성 앱타머가 제공된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자의 기능을 조정한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자의 기능을 억제하는 한편, 다른 구체예에서 앱타머는 폰 빌레브란트 인자의 기능을 촉진한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 변이체와 결합하고/결합하거나 이의 기능을 조정한다. 본원에 사용된 폰 빌레브란트 인자 변이체는 폰 빌레브란트 인자의 기능과 본질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체를 포함하며, 바람직하게는 인간의 폰 빌레브란트 인자의 아미노산 서열과 그 구조가 실질적으로 동일하고, 몇몇 구체예에서는 바람직하게 인간의 폰 빌레브란트 인자의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 및 더욱 바람직하게는 95% 이상이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 앱타머는 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115, ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635, ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323) 중 임의의 하나를 포함하는 앱타머가 폰 빌레브란트 인자에 결합하는 능력과 실질적으로 동일한 능력을 보유한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 앱타머는 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212∼214, ARC1115, ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635, ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323) 중 임의의 하나를 포함하는 앱타머가 폰 빌레브란트 인자에 결합하는 능력과 실질적으로 동일한 능력 및 이 앱타머와 실질적으로 동일한 구조를 보유한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-213, ARC1115, ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635, ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323) 중 임의의 하나에 의한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212∼214, ARC1115, ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635, ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323) 중 임의의 하나에 해당하는 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 그리고 몇몇 구체예에서는 95% 이상 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하고, 서열 번호 11∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 165, 서열 번호 169, 서열 번호 172, 서열 번호 174, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212∼214, ARC1115, ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1635, ARC1759(서열 번호 318), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택된 앱타머 중 임의의 하나에 존재하는 30개의 연속 뉴클레오티드와 동일성을 갖는 30개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 약학 조성물에 있어서 활성 성분으로서 사용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머 또는 본 발명의 앱타머를 포함하는 조성물은 혈전성 질환 예를 들어, 심혈관 질환, 예를 들어, 급성 관상 동맥 증후군; 말초 경동맥 질환; 및 뇌혈관 질환 예를 들어, 뇌졸중을 치료하는데에 사용된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머 또는 본 발명의 앱타머를 포함하는 조성물은 본태성 혈소판 감소증, 혈전성 혈소판감소성 자반증("TTP"), IIb형 폰 빌레브란트병, 의사 폰 빌레브란트병, 말초 동맥 질환 예를 들어, 말초 동맥 폐색성 질환, 불안정형 협심증, 협심증, 동맥 혈전증, 동맥 경화증, 심근 경색, 급성 관상 동맥 증후군, 심방 세동, 경동맥 협착증, 뇌 경색, 뇌 혈전증, 허혈성 뇌졸중 및 일과성 뇌 허혈 발작증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 치료, 예방 또는 완화시키는데에 사용된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 투석, CABG 수술, 관상 동맥 중재술 또는 심장 판막 치환술 실시 이전, 실시중 및/또는 실시 후에 투여된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머 치료제는 이것의 표적에 대한 친화성과 특이성이 매우 클 뿐만 아니라, 이 앱타머 치료제가 환자 또는 개체의 체 내에서 분해될 경우 비-천연 생성 뉴클레오티드 치환이 발생함에 따른 유해한 부작용을 줄일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 앱타머 치료제를 함유하는 치료용 조성물은 플루오르화된 뉴클레오티드가 포함되어 있지 않거나 또는 소량 포함한다.
본 발명의 앱타머는 당 업계에 공지된 임의의 올리고뉴클레오티드 합성 기술 예를 들어, 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술[예를 들어, Froehler외 다수, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) 및 Froehler외 다수, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)] 및 용액 상 방법 예를 들어, 트리에스테르 합성 방법[예를 들어, Sood외 다수, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 및 Hirose외 다수, Tet. Lett, 28:2449 (1978)][상기 기술은 둘 다, 당 업계에 널리 공지되어 있음]을 이용하여 합성될 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 폰 빌레브란트 인자에 결합하는 앱타머 분자를 함유하는 약학 조성물을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 본 조성물은 내복용으로 적당하고, 유효량만큼의 본 발명의 약리학적 활성 화합물만을 포함하거나, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함한다. 본 화합물은, 만약 독성이 있다고 하더라도 매우 약하기 때문에 특히 유용하다.
본 발명의 조성물은 병상 예를 들어, 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하거나, 또는 그러한 질병 또는 질환의 증상을 나타내는 환자에 있어서 이 증상을 완화시키는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 혈소판 응집과 관련된 병상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 치료, 예방 또는 완화될 질병은 본태성 혈소판 감소증, 혈전성 혈소판감소성 자반증("TTP"), IIb형 폰 빌레브란트병, 의사 폰 빌레브란트병, 말초 동맥 질환 예를 들어, 말초 동맥 폐색성 질환, 불안정형 협심증, 협심증, 동맥 혈전증, 동맥 경화증, 심근 경색, 급성 관상 동맥 증후군, 심방 세동, 경동맥 협착증, 뇌 경색, 뇌 혈전증, 허혈성 뇌졸중 및 일과성 뇌 허혈 발작증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 투석, CABG 수술, 관상 동맥 중재술 또는 심장 판막 치환술 실시 이전, 실시중 및/또는 실시 후에 투여된다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 앱타머가 특이적으로 결합하는 표적과 관련되어 있거나 또는 그 표적으로부터 유래된 질병 또는 질환이 발병하였거나, 또는 소인이 있는 개체에 투여하는데에 유용하다.
본 발명의 조성물은 병상을 나타내는 환자 또는 개체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 본 방법은 이 병상과 관련된 폰 빌레브란트 인자에 결합하는 앱타머 또는 이 앱타머를 포함하는 조성물을 환자 또는 개체에 투여하여, 표적에 앱타머가 결합함으로써 폰 빌레브란트 인자의 생물학적 기능을 변경시키고, 이로써 그 병상을 치료하는 단계를 포함한다.
병상을 나타내는 환자 또는 개체 즉, 본 발명의 방법에 의하여 치료되는 환자 또는 개체는 포유 동물, 더욱 구체적으로는 척추 동물 또는 더욱 구체적으로는 인간일 수 있다.
실제로, 앱타머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 이의 바람직한 생물학적 활성을 나타내기에 충분할 양 예를 들어, vWF 의존성 혈소판 응집을 예방하는데에 충분한 양으로 투여된다.
본 발명의 하나의 측면은 본 발명의 앱타머 조성물과 함께 기타 혈전 관련 질환용 치료제를 포함한다. 본 발명의 앱타머 조성물은 예를 들어, 하나 이상의 앱타머 예를 들어, 항-트롬빈 앱타머 및 항-vWF 앱타머를 함유할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 본 발명의 하나 이상의 앱타머를 함유하는 본 발명의 앱타머 조성물은 기타 유용한 조성물 예를 들어, 항염증제, 면역 억제제, 항바이러스제 등과 함께 투여된다. 일반적으로, 이와 같이 병용되는 공지의 치료제의 현재 사용 가능한 투여형이 적당할 것이다.
"병행 요법(combinational therapy)"(또는 "공동 요법(co-therapy)")은, 본 발명의 앱타머 조성물과, 특정 치료 요법 즉, 치료제들이 공동 작용함으로써 유리한 효과를 제공하는 치료 요법의 일환으로서, 최소한의 제2의 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같이 병용함으로써 얻을 수 있는 유리한 효과로서는, 치료제를 함께 조합하여 사용함으로써 얻어지는 약동학적 또는 약물 동력학적 공동 작용 효과를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 통상적으로 이러한 치료제의 공동 투여는 한정된 시간(일반적으로, 선별된 병행 투여 형태에 따라서 수분, 수 시간, 수일 또는 수주)에 걸쳐서 수행된다.
"병행 요법(combination therapy)"이란, 부수적이고 독단적으로 본 발명을 병행 실시하게 되는, 개별 단독 요법들의 일환으로서 2개 이상의 치료제를 투여하는 것을 포함하는 의미일 수 있으나, 그것이 일반적인 것은 아니다. "병행 요법"은 상기와 같이 치료제를 연속적인 방식으로 투여하는 것 즉, 각각의 치료제를 상이한 시간에 투여하는 것뿐만 아니라, 이 치료제들 모두 또는 2가지 이상을 실질적으로 동시에 투여하는 것을 포함하는 의미이다. 실질적으로 동시에 투여하는 방법은 예를 들어, 개체에 각 치료제가 일정 비율로 들어있는 단일 캡슐을 투여하거나, 또는 각각의 치료제가 들어있는 각각의 캡슐들을 복수회 투여함으로써 이루어질 수 있다.
각각의 치료제를 연속적으로 투여하거나 또는 실질적으로 동시에 투여하는 방법은 임의의 적당한 경로 예를 들어, 국소, 경구, 정맥 내, 근육 내 투여 경로와, 점막 조직을 통한 직접적 흡착을 통하여 이루어질 수 있다. 치료제는 동일하거나 또는 상이한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료제의 제1 조합 투여형은 주사에 의해 투여될 수 있는 반면에, 치료제의 다른 조합 투여형은 국소 투여될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 모든 치료제는 국소적으로 투여될 수 있으며, 모든 치료제는 주사에 의해 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 달리 언급이 없는 한 그다지 중요한 문제는 아니다. "병행 요법"이란, 전술한 바와 같이 치료제들을 또 다른 생물학적 활성 성분들과 함께 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 이와 같이 병행 요법은 비-약물 치료법을 포함하며, 이 비-약물 치료법은 치료제 투여와 비-약물 치료법을 병행할 경우 공동 작용에 의해 유리한 효과를 얻을 수 있는 한, 임의의 적당한 시간에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적당한 경우 상기와 같은 유리한 효과는 일시적으로 비-약물 요법이 생략될 때(예를 들어, 수일 또는 수주 동안)애도 얻을 수 있다.
본 발명의 치료용 조성물 또는 약리 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용 가능한 매질 중에 용해 또는 분산된 유효량의 치료용 활성 성분을 포함할 것이다. 약학적으로 허용 가능한 매질 또는 담체는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 피복제, 항 박테리아 및 항진균 제제, 등장제 및 흡착 지연제 등을 포함한다. 이러한 매질 및 제제의 약학적 활성 물질로서의 용도는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 보충 활성 성분도 또한 본 발명의 치료용 조성물에 통합될 수도 있다.
약학 조성물 또는 약리 조성물의 제조 방법은 본 발명에 개시된 사항을 참고로 하였을 때, 당 업자가 이해할 수 있을 것이다. 통상적으로 이러한 조성물은 액상 용액 또는 현탁액; 주사 전에 액체 중 용액 또는 현탁액으로서 적당한 고체형; 경구 투여용 정제 또는 기타 고체; 경시적 방출형 캡슐; 또는 현재 사용되는 임의의 형태 예를 들어, 점안 액, 크림, 로션, 연고 및 흡입제 등으로서 주사 가능하도록 제조될 수 있다. 멸균용 제제 예를 들어, 염수 계 세척액도 또한 외과 의사, 내과 의사 또는 의료업계 종사자가 수술장에서 특정 부위에 처리하는데에 특히 유용하다. 조성물은 또한 마이크로 장치, 미소 입자 또는 스폰지를 통해 전달될 수도 있다.
제형에 있어서, 치료제는 투여형에 맞는 방식과 약리학적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투여형으로서 용이하게 투여된다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 전술한 바와 같이 주사 가능한 용액으로서 제형화되지만, 약물 방출형 캡슐 등도 사용될 수 있다.
본 발명 중 투여될 조성물의 부피와 활성 성분의 양은 치료될 숙주 동물에 따라 다르다. 투여에 필요한 활성 화합물의 정확한 양은 실시자의 판단에 따라 다르며, 개개인에 따라서도 다르다.
활성 화합물을 분산시키는데에 필요한 조성물은 통상적으로 최소 부피만큼 사용된다. 적당한 투여 방식도 물론 여러 가지일 수 있지만, 이 방식은 우선, 상기 화합물을 투여하고, 그에 다른 효과를 관찰한 다음, 지속적으로 투여량을 조절하면서 투여하는 것으로서 대표된다. 본 발명의 항-vWF 앱타머의 투여 효과는 이하 실시예 3에 기술된 바와 같이 PFA-100 기구를 이용하여 혈소판 응집체 형성 여부를 측정함으로써, 예를 들어, 보트로세틴(botrocetin) 유도성 혈소판 응집("BIPA") 및/또는 전단력 유도성 혈소판 마게(hemostatic plug) 형성 여부를 측정함으로써 관찰될 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐(예를 들어, 젤라틴 캡슐) 형태의 경구 투여에 있어서, 약물의 활성 성분은 경구용이고, 무독성이며, 약학적으로 허용 가능한 비활성 담체 예를 들어, 에탄올, 글리세롤 및 물 등과 함께 제형화될 수 있다. 뿐만 아니라, 의도 또는 필요에 따라서, 적당한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제도 혼합물에 통합될 수 있다. 적당한 결합제로서는 전분, 규산알루민산마그네슘, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈나트륨 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 생성 당 예를 들어, 글루코즈 또는 베타-락토즈, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 고무 예를 들어, 아카시아, 트래거칸트 또는 알긴산나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 및 왁스 등을 포함한다. 이러한 투여형에 사용되는 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 활석, 스테아르산, 이의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제로서는 예를 들어, 전분, 메틸 셀룰로즈, 아가, 벤토나이트, 잔탄 고무 전분, 아가, 알긴산 또는 이의 나트륨 염, 또는 비등성 혼합물 등을 포함한다. 희석제로서는 예를 들어, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신을 포함한다.
주사 가능한 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하며, 좌제는 지방질 유액 또는 현탁액으로부터 유리하게 제조된다. 조성물은 멸균된 것일 수 있으며/있거나 애쥬반트 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 프로모터(solution promoter), 삼투압 조절용 염 및/또는 완충액을 함유할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 조성물은 또한 기타 치료학적으로 중요한 물질을 함유할 수도 있다. 조성물은 통상의 혼합, 과립화 또는 피복 방법을 통하여 각각 제조되며, 이 조성물은 통상적으로 활성 성분을 약 0.1∼75%, 바람직하게는 약 1∼50% 함유한다.
본 발명의 화합물은 또한 경시적 방출형 및 지연 방출형 정제 또는 캡슐, 알약, 분말, 과립, 엘릭시르, 팅처, 현탁액, 시럽 및 유액과 같이 경구 투여형으로서 투여될 수도 있다.
액체 특히, 주사 가능한 조성물은 예를 들어, 용해 및 분산 등의 방법으로 제조될 수 있다. 활성 화합물은 약학적으로 순수한 용매 예를 들어, 물, 염수, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등에 용해되거나 또는 이와 혼합되어, 주사 가능한 용액 또는 현탁액을 생성하게 된다. 뿐만 아니라, 주사 전에 액체 중에 용해되는데 적당한 고체 형으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물은 정맥 내(환약 및 주입물), 복강 내, 피하 또는 근육 내 투여형으로서 투여될 수 있으며, 이와 같이 모든 투여형은 제약업계의 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 주사제는 통상의 형태 즉, 액상 용액 또는 현탁액의 형태로서 제조될 수 있다.
비경구 주사 투여형은 일반적으로 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사 및 주입시 사용된다. 뿐만 아니라, 비경구 투여에 관한 한 가지 연구에 있어서는, 서방형 또는 지연 방출형 시스템의 이식법(implantation)을 사용하는데, 본원에 참고용으로 인용되어 있는 미국 특허 제3,710,795호에 따르면, 이와 같은 이식법은 투여 수준을 일정하게 유지시킬 수 있다고 한다.
또한, 본 발명의 바람직한 화합물은 적당한 비강 내 비이클을 통한 비강 내 국소 투여형, 흡입제, 또는 당 업자에게 널리 공지된 경피적 피부 패취제의 형태를 띠는 경피 투여 경로와 같은 투여 방식으로 투여될 수 있다. 경피 전달형 시스템의 형태로 투여됨에 있어서, 투여형은 투여 과정 동안 간헐적으로 투여된다기보다는 연속적으로 투여될 것이다. 기타 바람직한 국소 투여 제형으로서는 크림, 연고, 로션, 에어로졸 스프레이 및 겔을 포함하며, 이때 활성 성분의 농도는 통상적으로 0.01∼15%(w/w 또는 w/v)이다.
고형 조성물에 있어서, 부형제로서는 약학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로즈, 글루코즈, 수크로즈, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 상기 정의된 활성 화합물은 또한 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 예를 들어, 프로필렌 글리콜을 담체로 사용하는 좌제의 형태로서 제형화될 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 좌제는 지방질의 유액 또는 현탁액으로 제조되는 것이 유리하다.
본 발명의 화합물은 또한 리포좀 전달 시스템 예를 들어, 작은 단일 라멜라 비이클(unilamellar vehicle), 큰 단일 라멜라 비이클 및 다중 라멜라 비이클(multilamellar vehicle)의 형태로 투여될 수도 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 함유하는 다양한 형태의 인지질로 형성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 지질 성분 막은 약물의 수용액으로 수화되어, 이 약물을 감싸는 지질층을 형성한다[미국 특허 제5,262,564호]. 예를 들어, 본원에 개시된 앱타머 분자는 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 구성된, 친지성 화합물 또는 비-면역원성이고 고 분자량인 화합물과의 복합체로서 제공될 수 있다. 뿐만 아니라, 리포좀은 그 표면에 내부적으로 세포 사멸을 매개하는 세포 독성 제제를 표적화하여 운반하기 위한 앱타머를 보유할 수 있다. 핵산 관련 복합체의 예에 관하여는 미국 특허 제6,011,020호에 제공되어 있다.
본 발명의 화합물은 또한 표적화 가능한 약물 담체로서 가용성 중합체와 커플링될 수도 있다. 이러한 중합체로서는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리히드록시에틸아스파나미드페놀 또는 폴리에틸렌옥시드폴리리신을 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 화합물은 약물을 제어 방출시키는데에 유용한 생분해성 중합체 군 예를 들어, 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 히드로겔의 가교형 또는 양친매성 블록 공중합체에 커플링될 수 있다.
원하는 경우, 투여될 약학 조성물은 소량의 무독성 보조 물질 예를 들어, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및 기타 물질 예를 들어, 아세트산나트륨 및 올레산트리에탄올아민을 함유할 수도 있다.
앱타머를 이용하는 투여 방식은 다양한 요인 예를 들어, 환자의 유형, 종, 나이, 체중, 성별 및 의학적 증상; 치료될 증상의 심각성; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 그리고 사용된 특정 앱타머 또는 이의 염에 따라서 선택된다. 통상의 숙련된 내과의 또는 수의사는 병상의 진행을 막거나, 후퇴시키거나 또는 지연시키는데 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 조성물의 경구 투여형은, 1일 경구 투여시 약 0.05∼7500 ㎎ 복용할 경우, 목적으로 하는 효과를 얻을 수 있을 것이다. 본 발명의 조성물은 분할선이 있는 정제(scored tablet)의 형태로서 제공되는 것이 바람직하며, 이때 상기 정제는 활성 성분을 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 및 1000.0 ㎎ 함유한다. 주입 투여형, 비강 내 투여형 및 경피용 투여형의 투여량은 하루에 0.05∼7500 ㎎일 것이다. 피하, 정맥 내 및 복강 내 투여형의 투여량은 하루에 0.05∼3800 ㎎일 것이다.
본 발명의 화합물은 매일 1회 투여될 수 있거나, 또는 1일 총 투여량을 하루에 2회, 3회 또는 4회로 나누어서 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물의 혈장 내 유효 수준은 0.002∼50 ㎎/㎖이다. 본 발명의 투여형에 있어서, 질량이란, PEG 컨쥬게이트화에 의해 부여되는 질량과는 상관 없이, 앱타머의 올리고뉴클레오티드 부분의 분자량만을 의미한다.
앱타머 치료제의 약물 동력학 및 생체 내 분배( biodistribution ) 양상
앱타머를 포함하여 모든 올리고뉴클레오티드계 치료제의 약물 동력학적 특성은 의도로 하는 약학적 용도에 부합되도록 조정하는 것이 중요하다. 세포 외 표적에 대하여 유도된 앱타머는 세포 내 전달과 관련한 문제점을 안고 있지 않지만(안티센스 및 RNAi-계 치료제의 경우와 마찬가지로), 그러한 앱타머는 표적 기관 및 조직에 분배되어, 의도로 하는 투여 방식에 부합하는 시간 동안 체내에 (변형되지 않은 상태로) 남아있을 수 있을 것이다.
그러므로, 본 발명은 앱타머 조성물의 약물 동력학적 성질, 구체적으로 앱타머의 약물 동력학을 조율하는 능력에 영향을 미치는 물질과 방법을 제공한다. 앱타머의 약물 동력학적 특성의 조율 가능성(tunability)(즉, 조정 능력)은, 변형부(예를 들어, PEG 중합체)의 앱타머에의 컨쥬게이트화 및/또는 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸)의 통합을 통하여 얻어질 수 있으며, 그 결과 핵산의 화학 조성이 바뀌게 된다. 앱타머의 약물 동력학적 특성을 조율하는 능력은 현존하는 치료 방법을 개선하거나, 또는 새로운 치료 방법을 개발하는데에 사용된다. 예를 들어, 일부 치료 방법 예를 들어, 약물의 제거 또는 기능 소진이 신속하게 이루어지는 것이 바람직한 항-신생물 또는 응급 요양 환경의 경우, 혈류 내 앱타머 체류 시간을 단축하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 다른 치료 방법 예를 들어, 치료제의 전신 순환이 바람직한 유지 요법(maintenance therapy)에 있어서는, 혈류 내 앱타머의 체류 시간을 늘리는 것이 바람직할 수 있다.
뿐만 아니라, 앱타머 약물 동력학적 특성의 조율 가능성은 개체 내 앱타머 치료제의 생체 내 분배를 변형시키는데에 사용된다. 예를 들어, 일부 치료 방법에 있어서, 조직 또는 특정 기관(또는 기관 군)의 구체적 유형을 표적화하기 위해서는 앱타머 치료제의 생체 내 분배를 바꾸는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 앱타머 치료제는 특정 조직 또는 기관(들)에 축적되는 것이 바람직하다. 다른 치료 방법에 있어서는, 소정의 질병, 세포 손상 또는 기타 비정상적 병상과 관련된 증상 또는 세포 마커를 전시하는 조직을 표적화하여, 앱타머 치료제를 발병 조직에 축적시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 공동 계류 가명세서 출원인 미국 특허 출원 제60/550,790호(2004년 3월 5일 출원)(발명의 명칭 "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics")에 개시되어 있는 바와 같이, 앱타머 치료제를 PEG화(예를 들어, 20 kDa PEG 중합체를 이용한 PEG화)시키면 염증이 일어난 조직을 표적화하여, 이 PEG화된 앱타머 치료제가 이 염증이 일어난 조직에 선호적으로 축적된다.
앱타머 치료제(예를 들어, 앱타머 컨쥬게이트 또는 화학적 특성이 변형된 앱타머 예를 들어, 변형 뉴클레오티드)의 약물 동력학적 프로필 및 생체 내 분배 프로필을 측정하기 위해서는 다양한 매개 변수를 관찰한다. 이러한 매개 변수로서는 예를 들어, 반감기(t1 /2), 혈장 내 소멸률(plasma clearance; CL), 분배 부피(Vss), 농도-시간 곡선 아래의 표면적(AUC), 혈청 또는 혈장 내 농도의 최대 관측치(Cmax), 및 앱타머 조성물의 평균 체류 시간(MRT)를 포함한다. 본원에 있어서, "AUC"란 용어는, 앱타머 치료제의 혈장 내 농도 대 앱타머 투여 후 경과 시간의 그래프 아래 부분의 표면적을 의미한다. AUC 값은 소정의 앱타머 치료제의 생체 적합성(즉, 앱타머 투여 후 혈류 내 존재하는, 투여 앱타머 치료제의 비율) 및/또는 총 소멸률(CL)(즉, 혈류로부터 앱타머 치료제가 제거되는 비율)을 측정하는데에 사용된다. 분포 부피는 체 내에 존재하는 앱타머의 양에 대한 앱타머 치료제의 혈장 내 농도와 관련되어 있다. Vss가 클수록, 앱타머는 혈장 외에서 더 많이 발견된다(즉, 더 많이 침윤됨).
본 발명은 조정부(modulation moiety) 예를 들어, 소분자, 펩티드 또는 중합체 말단기에 앱타머를 컨쥬게이트화시키거나, 또는 앱타머에 변형된 뉴클레오티드를 통합함으로써, 생체 내에서 안정화된 앱타머 조성물의 약물 동력학적 특성 및 생체 내 분배를 (제어 가능한 방식으로) 조정하는 물질 및 방법을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같이, 변형부 및/또는 변경 뉴클레오티드(들) 화학 조성물의 컨쥬게이트화를 통하여, 혈류 내 앱타머 체류 시간과 조직으로의 분배와 관련된 근본적인 양상을 바꿀 수 있다.
뉴클레아제에 의한 제거 이외에도, 올리고뉴클레오티드 치료제는 신장을 통한 여과로써 제거된다. 이와 같이 신장에 의한 여과가 이루어질 수 없다면, 정맥 내 투여된 뉴클레아제-내성 올리고뉴클레오티드의 생체 내 반감기는 통상적으로 10 분 미만이다. 이는 혈류를 빠져 나와서 조직으로 신속하게 분배되는 것을 촉진하거나, 또는 사구체가 걸러내기에 효과적인 크기 이상인 올리고뉴클레오티드의 겉보기 분자량을 증가시킴으로써 이루어질 수 있다. 크기가 작은 치료제를 PEG 중합체로 컨쥬게이트화시키는 것(PEG화)은, 이하에 기술된 바와 같이, 혈류 내 앱타머의 체류 시간을 극적으로 연장시킬 수 있고, 이로써 투여 횟수를 줄이고 혈관 표적에 대한 효능을 강화할 수 있다.
앱타머는 다양한 변형부 예를 들어, 고분자량 중합체 예를 들어, PEG; 펩티드 예를 들어, Tat(HIV Tat 단백질의 13-아미노산 단편(Vives외 다수, (1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant(드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 호메오 단백질(homeotic protein)의 세번째 나선 구조로부터 유래된 16-아미노산 서열(Pietersz외 다수, (2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) 및 Arg7(폴리아르기닌(Arg7)으로 이루어진, 짧고 양으로 하전된 세포 투과성 펩티드 (Rothbard외 다수, (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J외 다수, (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); 및 소분자 예를 들어, 친지성 화합물 예를 들어, 콜레스테롤에 컨쥬게이트화될 수 있다. 본원에 기술된 여러 가지 컨쥬게이트 중에서, 앱타머의 생체 내 특성은 PEG기와 복합체화함으로써 가장 많이 변하게 된다. 예를 들어, 혼합형 2'-F 및 2'-OMe 변형 앱타머 치료제(20 kDa PEG 중합체 보유)의 복합체화로 인해서, 신장에 의한 여과가 방해되고 건강한 조직과 염증이 발생한 조직 모두에 앱타머가 분배되는 것이 촉진된다. 뿐만 아니라, 20 kDa PEG 중합체-앱타머 컨쥬게이트는, 앱타머의 신장을 통한 여과를 막아주는 데에 유효한 40 kDa PEG 중합체인 것으로 파악된다. PEG화로 인한 한 가지 효과는 앱타머 제거에 관한 것인데, 20 kDa 부분이 존재함으로 인하여 몸 전체에 노출되는 시간이 길어질 수 있으면, 앱타머는 조직, 구체적으로 심하게 관류된 기관의 조직과 염증이 발생한 위치의 조직에 분배되는 것을 촉진하게 된다. 앱타머-20 kDa PEG 중합체 컨쥬게이트는 앱타머를 염증이 일어난 위치에 분배하고, 이로써 PEG화된 앱타머는 염증이 일어난 조직에 선호적으로 축적된다. 일부의 경우, 상기 20 kDa PEG화 앱타머 컨쥬게이트는 세포 내부 예를 들어, 신장 세포의 내부에 접근할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드는 또한 앱타머의 혈장 내 소멸률을 조정하는데에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 2'-F 및 2'-OMe 안정화 화학 기가 통합되어 있고, 시험관 내 및 생체 내에서 뉴클레아제에 대한 안정성이 큰, 본 발명의 방법에 의해 제조된 앱타머의 일례인, 컨쥬게이트화되지 않은 앱타머는, 변형되지 않은 앱타머에 비하여 혈장 내에서 신속하게 사라지며(즉, 신속 혈장 소멸률), 조직, 주로 신장에 신속하게 분배된다.
PEG - 유도체화 핵산
전술한 바와 같이, 고분자량의 비-면역원성 중합체로 핵산을 유도체화하면, 핵산의 약물 동력학적 특성 및 약동학적 특성을 변화시켜, 이 핵산이 보다 효과적인 치료제로서의 역할을 할 수 있도록 만든다. 바람직한 활성의 변화로서는 뉴클레아제 분해에 대한 내성 증가, 신장을 통한 여과의 감소, 면역계에의 노출 감소 및 치료제의 전신 분배 변화를 포함할 수 있다.
본 발명의 앱타머 조성물은 폴리알킬렌 글리콜(PAG) 부분으로 유도체화될 수 있다. PAG-유도체화 핵산의 예에 관하여는 미국 특허 출원 제10/718,833호(2003년 11월 21일 출원)(본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)에 개시되어 있다. 본 발명에 사용되는 통상의 중합체로서는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)[산화폴리에틸렌(PEO)라고도 칭함] 및 폴리프로필렌 글리콜(폴리 이소프로필렌 글리콜 포함)을 포함한다. 뿐만 아니라, 상이한 알킬렌 산화물(예를 들어, 산화에틸렌 및 산화프로필렌)의 랜덤 또는 블록 공중합체도 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 상기 산화물의 가장 흔한 형태 중, 폴리알킬렌 글리콜 예를 들어, PEG는 각각의 말단부가 히드록실기로 종결되는 선형 중합체이다[즉, HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH]. 이러한 중합체, 알파-, 오메가-디히드록실폴리(에틸렌 글리콜)은 또한 HO-PEG-OH로도 나타낼 수 있는데, 여기서 기호 -PEG는 다음과 같은 구조 단위를 나타낸다는 것을 이해할 수 있다: -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-[식중, n은 통상적으로 약 4∼약 10,000임].
전술한 바와 같이, PEG 분자는 이중-작용성이며, 종종 "PEG 디올"이라고도 불린다. PEG 분자의 말단부는 비교적 비-반응성인 히드록실 부분이고, 여기서 -OH기는 다른 화합물의 반응 위치에 PEG를 부착시키기 위한 작용부로 활성화 또는 전환될 수 있다. 이와 같이 활성화된 PEG 디올은 본원에서 이중-활성화 PEG라 불린다. 예를 들어, PEG 디올의 말단부는 비교적 비 반응성인 히드록실 부분 즉, -OH를 N-히드록시 숙신이미드로부터 유래된 숙신이미딜 활성 에스테르 부분으로 치환함으로써 아미노 부분과 선택적으로 반응하는 활성 카보네이트 에스테르로서 작용기화된다.
다수의 방법에 있어서, PEG 분자의 한쪽 말단부를 본질적으로 비-반응성인 부분으로 캡핑시켜, PEG 분자를 단일-작용성으로 만드는 것이(즉, 단일-활성화 시키는 것이) 바람직하다. 일반적으로 활성화 PEG에 대한 반응 부위가 다수 존재하는 단백질 치료제의 경우, 이중-작용성 활성화 PEG는과도하게 가교 결합하여 작용성이 떨어지는 응집체를 생성하게 된다. 단일-활성화 PEG를 생성하기 위하여, PEG 디올 분자의 말단부 상에 존재하는 하나의 히드록실 부분을 통상적으로 비-반응성인 메톡시 말단부 즉, -OCH3로 치환한다. 나머지 캡핑되지 않은 PEG 분자의 말단부는 통상적으로 표면 또는 분자 예를 들어, 단백질 상의 반응 위치에 부착되도록 활성화될 수 있는 반응성 말단부로 전환된다.
PAG는 통상적으로 물과 다수의 유기 용매 중에서 가용성이고, 독성이 없으며, 면역원성도 없는 중합체이다. PAG의 용도 중 하나는 PAG-분자 "컨쥬게이트"를 가용성으로 만들기 위해 중합체를 불용성 분자에 공유 결합시키는 것이다. 예를 들어, 물에 불용성인 약품인 파클리탁셀은 PEG와 커플링될 때, 수용성이 된다는 것을 알 수 있었다[Greenwald외 다수, J. Org. Chem., 60:331-336 (1995)]. PAG 컨쥬게이트는 종종 용해도와 안정성을 강화시킬 뿐만 아니라, 분자의 혈류내 반감기도 연장시키는데에 사용된다.
본 발명의 폴리알킬화 화합물은 통상적으로 크기가 5∼80 kDa이지만, 임의의 크기의 것도 사용될 수 있으며, 그 크기의 선택은 앱타머와 용도에 따라 달라진다. 본 발명의 기타 PAG 화합물의 크기는 10∼80 kDa이다. 본 발명의 또 다른 PAG 화합물의 크기는 10∼60 kDa이다. 예를 들어, PAG 중합체의 크기는 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 80 kDa 이상일 수 있다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있다.
생물학적으로 발현된 단백질 치료제와는 대조적으로, 핵산 치료제는 통상 활성화된 단량체 뉴클레오티드로부터 화학 합성된다. PEG-핵산 컨쥬게이트는 동일한 단량체 합성법을 반복 수행하여 PEG를 통합시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 포스포로아미다이트형으로 전환됨으로써 활성화된 PEG는 고상 올리고뉴클레오티드 합성법에 통합될 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 반응성 PEG 결합 위치를 위치-특이적으로 통합함으로써 종결될 수 있다. 가장 일반적으로는, (고상 합성법의 마지막 커플링 단계에 개질제인 포스포로아미다이트를 사용하여 통합된) 5'-말단부에 유리 1차 아민을 첨가함으로써 실현된다. 이러한 방법을 사용하면, 반응성 PEG(예를 들어, 활성화되어 아민과 반응하여 결합을 형성한 PEG)는 정제된 올리고뉴클레오티드와 화합되고, 커플링 반응은 용액 중에서 진행된다.
PEG 컨쥬게이트화가 치료제의 생체 내 분배를 변경시키는 능력은 다수의 인자 예를 들어, 컨쥬게이트의 겉보기 크기(예를 들어, 유체 역학적 반지름의 관점에서 측정)와 관련되어 있다. 더욱 큰 컨쥬게이트(> 10 kDa)는 신장을 통한 여과를 보다 효과적으로 차단하여, 결과적으로 크기가 비교적 작은 거대분자(예를 들어, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 혈청내 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다. PEG 컨쥬게이트가 여과를 차단하는 능력은 PEG의 크기가 약 50 kDa 이하일 때에 증가하는 것으로 파악된다[반감기는 신장을 통한 소멸에 의하기보다는 대식 세포-매개성 대사에 의해 제한되므로, PEG의 크기가 더 커지면 유리한 효과가 최소화됨].
고분자량 PEG(> 10 kDa)를 생산하는 것은 힘들고, 비효율적이며 또한 고비용일 수 있다. 통상적으로 고분자량 PEG-핵산 컨쥬게이트의 합성에 관한 연구에 있어서, 이전의 연구는 고분자량 활성화 PEG의 생산에 초점을 맞추어왔다. 이러한 분자를 생산하는 한가지 방법은, 2개 이상의 PEG가 활성화 기를 운반하는 중앙의 중심부에 결합되어 있는 분지형의 활성화된 PEG를 형성시키는 것을 포함한다. 이러한 고분자량 PEG 분자의 말단부 즉, 비교적 비-반응성인 히드록실(-OH) 부분은 활성화되거나 또는 작용성 부분으로 전환되어, 다른 화합물 상에 존재하는 반응성 위치에서 이 화합물에 하나 이상의 PEG를 부착시킨다. 분자형의 활성화 PEG는 2개 이상의 말단부를 보유할 것이며, 2 이상의 말단부가 활성화되는 경우, 이와 같이 활성화된 고분자량의 PEG 분자를 본원에서는 다중-활성화 PEG(multi-activated PEG)라 부른다. 몇몇 경우에 있어서, 분지형 PEG 분자의 말단부가 모두 활성화되는 것은 아니다. 분지형 PEG 분자 중 2개의 임의 말단부가 활성화될 경우, 이러한 PEG 분자를 이중-활성화 PEG라 부른다. 분지형 PEG 분자 중 하나의 말단부만이 활성화되는 몇몇 경우에 있어서, 이러한 PEG 분자를 단일-활성화되었다고 한다. 이러한 연구의 일례로서, 궁극적으로 반응을 위해 활성화되는 리신 중심부에 2개의 모노메톡시 PEG를 부착시킴으로써 제조된 활성화 PEG에 관하여는 이미 개시되어 있다[Harris외 다수, Nature, vol.2: 214-221, 2003].
본 발명은 다중 PEG화 핵산을 포함하는 고분자량 PEG-핵산(바람직하게는, 앱타머) 컨쥬게이트의 비용 효율적인 다른 합성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 PEG-결합 다량체 올리고뉴클레오티드 예를 들어, 이량체화 앱타머를 포함한다. 본 발명은 또한 PEG 안정화 부분이 링커(앱타머의 상이한 부분들을 구분하는 링커)인 고분자량의 조성물에 관한 것이기도 한데, 예를 들어, PEG가 단일의 앱타머 서열 내에 컨쥬게이트화되어, 고분자량의 앱타머 조성물의 선형 배치(linear arrangement)가 예를 들어, 핵산-PEG-핵산(-PEG-핵산)n[식중, n은 1 이상임]인 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 고분자량 조성물은 분자량이 10 kDa 이상인 것들을 포함한다. 조성물은 통상적으로 분자량의 크기가 10∼80 kDa 이다. 본 발명의 고분자량 조성물의 크기는 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 80 kDa 이상이다.
안정화 부분은 본 발명의 고분자량 앱타머 조성물의 약물 동력학적 특성 및 약동학적 특성을 개선시키는 분자 또는 이 분자의 일부이다. 몇몇 경우에 있어서, 안정화 부분은 2개 이상의 앱타머 또는 앱타머 도메인을 근접하게 배치하거나, 또는 본 발명의 고분자량 앱타머 조성물의 전체 회전 운동 자유도(overall rotational freedom)을 감소시키는 분자 또는 이 분자의 일부이다. 안정화 부분은 폴리알킬렌 글리콜일 수 있으며, 이러한 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형의 동종 중합체 또는 이종 중합체일 수 있다. 기타 안정화 부분은 중합체 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 안정화 부분일 수도 있으며: 이러한 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 및/또는 변형된 결합 예를 들어, 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 안정화 부분은 앱타머 조성물의 필수적인 부분으로서, 앱타머에 공유 결합되어 있는 부분이다.
본 발명의 조성물은 2 이상의 핵산 부분이 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 부분에 공유적으로 컨쥬게이트화된 고분자량의 앱타머 조성물을 포함한다. 이러한 폴리알킬렌 글리콜 부분은 안정화 부분으로서 사용된다. 폴리알킬렌 글리콜 부분이 앱타머의 말단부 중 어느 한쪽에 공유적으로 결합되어, 폴리알킬렌 글리콜과 핵산 부분이 함께 하나의 분자를 이루고 있는 조성물에서, 폴리알킬렌 글리콜은 결합 부분이라 칭하여 진다. 이러한 조성물에서, 공유 분자의 1차 구조는 핵산-PAG-핵산의 선형 배치를 포함한다. 하나의 예로서는 핵산-PEG-핵산과 같은 1차 구조를 보유하는 조성물이 있다. 다른 예로서는 핵산-PEG-핵산-PEG-핵산과 같은 선형 배치가 있다.
핵산-PEG-핵산 컨쥬게이트를 제조하기 위하여, 핵산은 근본적으로 단일 반응 부위(예를 들어, 단일-활성화된 경우)를 보유하도록 합성된다. 바람직한 구체예에서, 이러한 반응 부위는 올리고뉴클레오티드의 고상 합성 과정의 마지막 단계로서 개질제인 포스포로아미다이트를 첨가함으로써, 5'-말단부에 도입된 아미노기이다. 이것은, 변형된 올리고뉴클레오티드를 탈보호 및 정제한 후, 활성화된 PEG의 자발적 가수 분해를 최소화하는 용액 중에서 고농도로 재구성한다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 1 mM이며, 재구성된 용액은 pH 8.3인 200 mM NaHCO3-완충액을 함유한다. 컨쥬게이트 합성법은 고순도의 이중-작용성 PEG를 서서히 단계적으로 첨가함으로써 개시된다. 바람직한 구체예에서, PEG 디올은 프로피온산 숙신이미딜로 유도체화되어, 양쪽 말단부가 활성화된다(이중-활성화). 반응 후, PEG-핵산 컨쥬게이트는 겔 전기 영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제되어, 완전히 컨쥬게이트화된 화학 종, 부분적으로 컨쥬게이트화된 화학 종 및 컨쥬게이트화되지 않은 화학 종으로 분리된다. (예를 들어, 랜덤 또는 블록 공중합체로서) 연결된 다중 PAG 분자 또는 보다 작은 PAG 사슬은 결합되어 다양한 길이의(또는 다양한 분자량을 갖는) 분자가 될 수 있다. 비-PAG 링커는 다양한 길이의 PAG 사슬 사이에 사용될 수 있다.
2'-O-메틸, 2'-플루오로 및 기타 변형된 뉴클레오티드의 변형은 앱타머를 뉴클레아제에 대하여 안정화시키고 이의 생체 내 반감기를 증가시킨다. 3'-3'-dT 캡은 또한 엑소뉴클레아제 내성을 증가시킬 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,674,685호; 동 제5,668,264호; 동 제6,207,816호; 및 동 제6,229,002호(이들 문헌은 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨)를 참조하시오.
반응성 핵산의 PAG - 유도체화
고분자량의 PAG-핵산-PAG 컨쥬게이트는 단일 작용성 활성화 PEG와 하나 이상의 반응 부위를 함유하는 핵산을 반응시켜 제조될 수 있다. 하나의 구체예에서, 핵산은 이중-반응성 또는 이중-활성화되어 있으며, 2개의 반응 위치[즉, 통상의 포스포라미다이트 합성법을 통하여 올리고뉴클레오티드에 도입된 5'-아미노기와 3'-아미노기]를 함유한다[예를 들어, 3'-5'-디-PEG화; 도 2 참조]. 대안적인 구체예에서, 반응 위치는 예를 들어, 피리미딘의 5번 위치, 퓨린의 8번 위치 또는 리보즈의 2번 위치(1차 아민 결합용 위치)를 사용하여 내부 위치에 도입될 수 있다. 이러한 구체예에서, 핵산은 몇몇 활성화 또는 반응성 위치를 보유할 수 있으며, 이러한 경우를 다중적으로 활성화되었다고 한다. 합성 및 정제 이후, 변형된 올리고뉴클레오티드는 자발적 가수 분해를 최소화함과 동시에 올리고뉴클레오티드 반응성 위치와의 선택적 반응을 촉진하는 조건 하에서 단일-활성화 PEG와 화합된다. 바람직한 구체예에서, 모노메톡시-PEG는 프로피온산 숙신이미딜로 활성화되며, 커플링 반응은 pH8.3에서 수행된다. 이중-치환 PEG를 합성시키기 위하여, 올리고뉴클레오티드에 비하여 화학 양론적으로 과량인 PEG가 제공된다. 반응 후, PEG-핵산 컨쥬게이트는 겔 전기 영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제되어, 완전히 컨쥬게이트화된 화학 종, 부분적으로 컨쥬게이트화된 화학 종 및 컨쥬게이트화되지 않은 화학 종으로 분리된다.
결합 도메인은 또한 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 부분이 부착되어 있을 수도 있다. 이러한 PAG는 그 길이가 다양할 수 있으며, 조성물의 목적 분자량을 얻기 위하여 적당히 조합 사용될 수도 있다.
특정 링커의 효능은 화학 조성 및 길이에 의하여 영향 받을 수 있다. 너무 길거나, 너무 짧거나, 또는 표적과 바람직하지 않은 입체적 상호 작용 및/또는 이온 상호 작용을 하는 링커는 앱타머와 표적이 서로 복합체를 형성하는 것을 막을 것이다. 핵산 간 거리를 연결하는데 필요한 길이보다 더욱 긴 링커는 리간드의 유효 농도를 감소시킴으로써 결합 안정성을 떨어뜨릴 수 있다. 그러므로, 링커 조성물 및 길이를 최적화하여, 앱타머의 표적에 대한 친화성을 최대화시키는 것이 필요할 경우도 종종 있다.
본원에 인용된 모든 공보 및 특허 문헌들은, 이러한 문헌들이 각각 본원에 참고용으로 인용되어 있다고 특정하여 개별적으로 기술되어 본원에 인용되어 있다. 공보 및 특허 문헌에 관한 인용은 임의의 문헌이 그것이 관련 선행 기술이라는 것을 인정하는 것은 아니며, 또한 이 문헌의 내용 또는 언급된 날짜가 선행 기술에 관한 것임을 인정하는 것도 아니다. 상세한 설명에 의하여 기술된 본 발명에 대하여, 당 업자는 본 발명이 다양한 구체예를 통하여 실시될 수 있으며, 전술한 상세한 설명 및 이하 기술된 실시예는 이하 첨부된 청구의 범위를 단지 예시하기 위한 것이지 이를 한정하고자 하는 것은 아니라는 사실을 이해할 것이다.
실시예 1: 앱타머 선별 및 서열
실시예 1A: rRfY vWF 도메인 A1 앱타머의 선별
2'-OH 퓨린 및 2'-F 피리미딘 뉴클레오티드(rRfY)로 이루어진 뉴클레오티드 풀을 사용하여 인간 또는 토끼 vWF A1 도메인에 결합하는 앱타머를 확인하기 위해 선별법을 수행하였다. 선별 기법을 통하여 소수성 평판 상에 고정된 인간 및 토끼 vWF A1 도메인에 특이적인 고친화성 앱타머를 얻었다.
풀 제조
ABI 엑스퍼다이트™(EXPEDITE™) DNA 합성기를 사용하여 5'-GGAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC 3'(서열 번호 8) 서열을 보유하는 DNA 주형을 합성하고, 표준적인 방법으로 탈보호하였다. DNA 주형(서열 번호 8) 중 일련의 N은 뉴클레오티드를 임의로 조합한 것으로서, 앱타머의 독특한 서열 부위를 구성한다. 주형을 프라이머인 5' -TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3'(서열 번호 9) 및 5'- GCTAGCAGAGAGGTCGAAA-3'(서열 번호 10)으로 증폭시키고, 이를 T7 RNA 중합 효소(Y639F)를 이용한 시험관 내 전사의 주형으로 사용하였다. 전사는 통상적으로 40 mM Tris pH 8.0, 40 mM DTT, 1 mM 스퍼미딘-HCl, 0.002% Triton X-100, 4%(w/v) PEG-8000, 12 mM MgCl2, 3 mM 2'-F-CTP, 3 mM 2'-F- UTP, 3 mM GTP, 3 mM ATP, 0.5X 무기 피로포스파타제 및 1X T7 중합 효소(Y639F), 그리고 약 0.5 μM의 주형 DNA를 사용하여 37℃에서 밤새도록 항온 처리하여 수행하였다.
선별
인간 vWF A1 도메인 선별을 위해, 처음 10 라운드는 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 4, 도 4) 24 pmole을, 1X 둘베코 PBS(Gibco BRL Cat.# 14040-133, Carlsbad, CA) 100 ㎕ 중 Nunc Maxisorp 소수성 평판(Nunc Cat.# 446612, Rochester, NY) 표면에 실온에서 1 시간 동안 고정화시킴으로써 시작하였다. 제11 라운드 및 제12 라운드에서, 전장 인간 vWF(서열 번호 7, 등록 번호 VWHU, Calbiochem Cat.# 681300, La Jolla, CA) 12 pmole을 소수성 평판에 고정하였다. 토끼의 vWF를 선별하기 위해서, 각 라운드는 인간 vWF A1 도메인의 경우와 동일한 조건 하에서 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6: 등록 번호 AAB51555, 도 3) 24 pmole을 고정함으로써 시작하였다.
모든 경우에 있어서, 단백질 고정화 이후 1 시간 경과시, 상청액을 제거하고 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 이후 단백질-고정 웰을 100uL의 블로킹 완충액(1% BSA 함유 1X 둘베코 PBS)으로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 제1 라운드에서, RNA 풀(pool RNA) 333 pmole(2 x 1014개의 특이 분자)을 BSA-블로킹 고정화 단백질 표적 함유 웰 내 100 ㎕의 1X 둘베코 PBS 중에서 1 시간 동안 항온 처리(실온)하였다. 이후 상청액을 제거하고, 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 후반 라운드에서, 추가로 세척하여 양 선별 단계(positive selection step)의 엄중도를 높였다(표 1 및 표 2 참조). 제2 라운드를 필두로 하여 이후 모든 라운드에서, 상기 양 선별 단계 이전에 2회의 음 선별 단계(negative selection step)를 추가 실시하였다. 우선, RNA 풀을 1 시간 동안 블로킹시키지 않은 웰 내에서 항온 처리하여(실온), 이 풀로부터 플라스틱에 결합한 임의의 서열을 제거하였다. 두 번째 음 선별 단계에서, RNA를 BSA 블로킹 웰(단백질 표적 함유하지 않음)로 옮겨 1 시간 동안 실온에 방치한 후, 양 선별 이전에 풀로부터 임의의 BSA 결합 서열을 제거하였다. 제2 라운드를 필두로 하여 이후의 모든 라운드에서, 0.1 ㎎/㎖의 tRNA와 0.1 ㎎/㎖의 연어 정자 DNA를 비-특이적 경쟁 물질로서 상기 양 선별 반응에 첨가하였다. 모든 경우에 있어서, 고정화된 단백질 표적에 결합한 RNA 풀은, 여기에 RT 혼합물[제1 라운드: 100 uL ; 제2 라운드(+): 50 uL; 3'-프라이머(서열 번호 10) 및 서모스크립트(Thermoscript) RT(Invitrogen Cat. # 11146-016, Carlsbad, CA) 함유]을 첨가한 후, 이를 65℃에서 1 시간 동안 항온 처리함으로써, 선별 평판에서 직접적으로 역전사되었다.
결과로 생성된 cDNA를 PCR 주형으로 사용하였다[제1 라운드 : 500 uL; 제2 라운드(+): 250 uL; 5'-프라이머(서열 번호 9), 3'-프라이머(서열 번호 10) 및 Taq 중합 효소(New England Biolabs Cat.# MO267L, Beverly, MA)]. PCR 반응은 다음과 같은 조건 하에서 수행하였다: a) 변성 단계: 94℃, 2분; b) 순환 단계(cycling steps): 94℃, 30초, 60℃, 30초, 72℃, 1분; c) 최종 증폭 단계: 72℃, 3분. 상기 주기는 PCR 생산물이 충분히 생성될 때까지 반복 수행하였다. PCR 생산물을 충분히 생성시키는데에 필요한 주기의 최소 횟수를 이하 표 1 및 표 2에서 "PCR 최소 수행 횟수(PCR Threshold)"로 나타내었다. 이후 증폭된 주형 DNA 풀을 이소프로판올로 침전시키고, PCR 생산물의 절반은 다음 선별의 라운드에서 RNA 풀을 전사시키기 위 한 주형으로서 사용하였다. 전사된 RNA 풀을 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 3라운드마다 한 번씩 겔 정제하였다. 겔 정제되지 않은 전사 RNA 풀은 2개의 센트리-스핀(Centri-Spin) 10 컬럼(Princeton Separations Cat. # CS-1Ol, Adelphia, NJ)으로 탈염하였다. 모든 경우에 있어서, 총 전사 생산물 당량의 10분의 1은 이후 선별 라운드에서 출발 풀로 사용하였다.
Figure 112007026846805-PCT00006
Figure 112007026846805-PCT00007
vWF 도메인 A1 결합 분석
샌드위치 필터 결합 검정법(sandwich filter binding assay)을 이용하여 선별 과정을 관찰하였다. 5'-32P-표지화된 RNA 풀(저 농도)을 0.1 ㎎/㎖ tRNA와, 0.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA(최종 부피 = 50 uL)를 함유하는 1X 둘베코 PBS 중 표적 단백질이 존재하지 않는 대조군, 100 nM 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 4) 또는 100 nM 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)와 함께 실온에서 30 분 동안 항온 처리하고, 이후 닷 블럿 장치(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 내 니트로셀룰로즈 및 나일론 필터 샌드위치에 묻혔다. 제6, 제9 및 제12 라운드 실시 후, 삼중점 스크리닝(three point screen)(100 nM 인간 vWF A1 도메인, 100 nM 토끼 vWF A1 도메인 및 표적이 없는 대조군)을 이용하여 니트로셀룰로즈에 결합한 RNA 풀의 %를 계산하였다. 풀의 결합 정도를 원래의 RNA 풀(제0 라운드)의 결합 정도와 비교하였다. rRfY 풀 결합 분석에 관한 결과를 이하 표 3에 나타내었다.
Figure 112007026846805-PCT00008
인간 또는 토끼 vWF A1 도메인 존재 하에서와 단백질 부재 하에서, RNA의 결합에 관한 유의적 양의 비를 살펴 보았을 때, 이 풀은 제조자의 지침에 따라서 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Cat.# 45-0641, Carlsbad, CA)를 사용하여 클로닝되었음을 알 수 있었다. 제 9 라운드 및 제12 라운드 주형 풀을 클로닝하여 서열 결정(총 125개의 서열)한 결과, 48개의 독특한 클론이 얻어졌다. 이 독특한 클론을 전사하여, 탈염시킨 후, 5'-32P-말단 표지화시켜, 삼중점 닷 블럿 스크리닝으로 검정하였다[단백질 표적이 없는 대조군, 100 nM 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5, 도 3) 또는 100 nM 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6, 도 3)]. 이와 관련된 데이터를, 표적 단백질의 존재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머 분율 : 표적 단백질 부재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머 분율의 비율로서 이하 표 4의 세 번째 및 네 번째 컬럼에 제시하였다.
이와 같은 초기 스크리닝을 바탕으로, 닷 블럿 검정법을 이용하여 vWF에 가장 많이 의존하는 결합 서열 중 12개에 대하여 KD를 측정하고, 이를 이하 표 4의 다섯번째 컬럼에 제공하였다. KD 측정에 있어서, 앱타머 전사체를 γ-32P ATP로 5' 말단 표지화하여 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하였다. 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5)을 8 중점 적정(8-point titration)하여 닷 블럿 검정법을 실시하고[1 uM, 300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0 nM], 칼라이다 그래프(KaleidaGraph; KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint을 적용시켜 KD 값을 계산하였다. 본원에 기술된 실시예에서 단일 클론 KD를 측정하는데에 사용되는 모든 닷 블럿 검정법에 있어서, 표적 단백질 예를 들어, 인간 vWF A1 도메인은 0.1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 1X 둘베코 PBS 완충액으로 희석되어, 여과 및 정량하기 이전에 24℃에서 30분 동안 표지화된 앱타머와 함께 항온 처리된다.
Figure 112007026846805-PCT00009
Figure 112007026846805-PCT00010
상기 표 4에 특성 규명되어 있는 rRfY 앱타머의 핵산 서열을 이하에 나타내었다. 이하 각 앱타머의 독특한 서열은 GGAGCGCACTCAGCCAC(서열 번호 221) 바로 다음에 오는 18번째 뉴클레오티드로 시작하여, 3' 말단의 고정된 핵산 서열인 TTTCGACCTCTCTGCTAGC(서열 번호 222)에 이를 때까지에 해당한다.
달리 언급하지 않는 한, 이하에 나열한 각각의 서열은 5'→3' 방향으로 나타낸 것이고, 퓨린(A 및 G)은 2'-OH이고(리보), 피리미딘(U 및 C)은 2'-플루오로인 rRfY 셀렉스™ 조건 하에서 선별하였다.
Figure 112007026846805-PCT00011
Figure 112007026846805-PCT00012
어떠한 이론에도 국한되지 않고, 상기 표 4에 제시한 결합 데이터와, 이하 표 21에 제시한 상기 셀렉스™ 선별법을 통해 얻어진 전장 앱타머와 최소화 앱타머 서열의 세포 분석법에서의 활성에 관한 데이터(이하 실시예 2a 참조)를 바탕으로 하여, 앱타머 선별 방법으로부터 얻어진, 본 발명의 모든 구체예에 있어서 vWF 표적에 결합하는데에 필요한 포괄적인 예측 2차 구조와 예측 중심 핵산 서열을 도 10에 나타내었다[서열 번호 217(RNAstructure, Version 4.1, Mathews, D.H.; Disney, M.D.; Childs, J.L.; Schroeder, S.J.; Zuker, M.; 및 Turner, D.H., "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure," 2004, Proceedings of the National Academy of Sciences, US, 101, 7287-7292)]. ARC840(서열 번호 23)은 도 10에 도시한 서열을 보유하는 앱타머의 일례로서, 상기 나열한 서열 중 굵은 글씨와 밑줄쳐서 나타낸 부위는 필수 염기를 나타내는 것이다.
실시예 1B: rRdY vWF 도메인 A1 앱타머의 선별
2'-OH 퓨린 및 데옥시-피리미딘 뉴클레오티드(rRdY)로 이루어진 뉴클레오티드 풀을 이용하여 (1) 인간 vWF A1 도메인, (2) 토끼 vWF A1 도메인 또는 (3) 인간 및 토끼 vWF A1 도메인에 결합하는 앱타머를 동정하기 위한 선별을 실시하였다. 선별 기법을 수행한 결과, 소수성 평판 상에 고정된 인간 및 토끼 vWF A1 도메인에 특이적인 고 친화성 앱타머를 얻었다.
풀 제조
서열 5'-GGAGCGCACTCAGCCACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNTTTCGACCTCTCTGCTAGC 3'(서열 번호 8)을 보유하는 DNA 주형을 ABI 엑스퍼다이트™ DNA 합성기를 사용하여 합성하고, 표준적 방법에 따라서 탈보호하였다. DNA 주형(서열 번호 8) 중 일련의 N은 뉴클레오티드를 임의로 조합한 것으로서, 앱타머의 독특한 서열 부위를 구성한다. 주형을 프라이머인 5' -TAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCAC-3'(서열 번호 9) 및 5'- GCTAGCAGAGAGGTCGAAA-3'(서열 번호 10)으로 증폭시키고, 이를 T7 RNA 중합 효소(Y639F)를 이용하는 시험관 내 전사의 주형으로 사용하였다. 전사는 통상적으로 40 mM Tris pH 8.0, 40 mM DTT, 1 mM 스퍼미딘-HCl, 0.002% Triton X-100, 4%(w/v) PEG-8000, 12 mM MgCl2, 3 mM dCTP, 3 mM dTTP, 3 mM rGTP, 3 mM rATP, 0.5X 무기 피로포스파타제 및 1X T7 중합 효소(Y639F), 그리고 약 0.5 μM의 주형 DNA를 사용하여 37℃에서 밤새도록 항온 처리하여 수행하였다.
선별
인간 vWF 선별을 위하여, 처음 10 라운드는 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 4) 24 pmole을, 1X 둘베코 PBS(Gibco BRL Cat.# 14040-133, Carlsbad, CA) 100 ㎕ 중 Nunc Maxisorp 소수성 평판(Nunc, Cat.# 446612, Rochester, NY) 표면상에 실온에서 1 시간 동안 고정화시킴으로써 시작하였다. 제11 라운드 및 제12 라운드에서, 전장 인간 vWF(서열 번호 7, 도 4) 12 pmole을 소수성 평판에 고정하였다. 토끼의 vWF를 선별하기 위해서, 각 라운드는 인간 vWF A1 도메인의 경우와 동일한 조건 하에서 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6) 24 pmole을 고정함으로써 시작하였다. 인간/토끼를 번갈아가며 선별하는 처음 2회 라운드에 있어서, 12 pmole의 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 4)과 12 pmole의 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)을 전술한 바와 같이 소수성 평판에 고정시켰다. 상기 교대 선별의 추후 라운드에 있어서, 단백질 표적은 매 라운드마다 인간과 토끼의 vWF A1 도메인(각각 서열 번호 4 및 서열 번호 5)과 번갈아 결합하였다[단, 제11 라운드에서는 인간 전장 vWF(서열 번호 7)가 사용됨].
모든 경우에 있어서, 단백질 고정 이후 1 시간 경과시, 상청액을 제거하고 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 이후 단백질-고정 웰을 100uL의 블로킹 완충액(1% BSA 함유 1X 둘베코 PBS)으로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 제1 라운드에서, RNA 풀 333 pmole(2 x 1014개의 특이 분자)을 BSA-블로킹 고정화 단백질 표적 함유 웰 내 100 ㎕의 1X 둘베코 PBS 중에서 1 시간 동안 항온 처리(실온)하였다. 이후 상청액을 제거하고, 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 후반 라운드에서, 추가로 세척하여 양 선별 단계의 엄중도를 높였다(표 5, 표 6 및 표 7 참조). 제2 라운드를 필두로 하여 이후 모든 라운드에서, 상기 양 선별 단계 이전에 2회의 음 선별 단계를 추가 실시하였다. 우선, RNA 풀을 1 시간 동안 블로킹시키지 않은 웰 내에서 항온 처리하여(실온), 이 풀로부터 플라스틱에 결합한 임의의 서열을 제거하였다. 두 번째 음 선별 단계에서, RNA를 1 시간 동안 실온에서 BSA 블로킹 웰(단백질 표적을 함유하지 않음)로 옮겨, 양 선별 이전에 풀로부터 임의의 BSA 결합 서열을 제거하였다. 제2 라운드를 필두로 하여 이후의 모든 라운드에서, 0.1 ㎎/㎖의 tRNA와 0.1 ㎎/㎖의 연어 정자 DNA를 비-특이적 경쟁 물질로서 상기 양 선별 반응에 첨가하였다.
모든 경우에 있어서, 고정화된 단백질 표적에 결합한 RNA 풀은, 여기에 RT 혼합물[제1 라운드: 100 uL ; 제2 라운드(+): 50 uL; 3'-프라이머(서열 번호 10) 및 서모스크립트 RT(Invitrogen Cat. # 11146-016, Carlsbad, CA) 함유]을 첨가한 후, 이를 65℃에서 1 시간 동안 항온 처리함으로써, 선별 평판에서 직접적으로 역전사되었다. 결과로 생성된 cDNA를 PCR 주형으로 사용하였다[제1 라운드 : 500 uL; 제2 라운드(+): 250 uL; 5'-프라이머(서열 번호 9), 3'-프라이머(서열 번호 10) 및 Taq 중합 효소(New England Biolabs Cat.# MO267L, Beverly, MA) 함유]. PCR 반응은 다음과 같은 조건 하에서 수행하였다: a) 변성 단계: 94℃, 2분; b) 순환 단계: 94℃, 30초, 60℃, 30초, 72℃, 1분; c) 최종 증폭 단계: 72℃, 3분. 상기 주기는 PCR 생산물이 충분히 생산될 때까지 반복 수행하였다. PCR 생산물을 충분히 생성시키는데에 필요한 주기의 최소 수행 횟수를 이하 표 5, 표 6 및 표 7에 "PCR 최소 수행 횟수"로 나타내었다. 이후 증폭된 주형 RNA 풀을 이소프로판올로 침전시키고, PCR 생산물의 절반은 다음 선별 라운드에서 RNA 풀을 전사시키기 위한 주형으로서 사용하였다. 전사된 RNA 풀을 10% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 2라운드마다 한 번씩 겔 정제하였다. 겔 정제되지 않은 전사 풀은 2개의 센트리-스핀 10 컬럼(Princeton Separations Cat. # CS-1O1, Adelphia, NJ)으로 탈염하였다. 모든 경우에 있어서, 총 전사 생산물 당량의 10분의 1은 이후 선별 라운드에서 출발 풀로 사용하였다.
Figure 112007026846805-PCT00013
Figure 112007026846805-PCT00014
Figure 112007026846805-PCT00015
Figure 112007026846805-PCT00016
vWF 결합 분석
샌드위치 필터 결합 검정법을 이용하여 선별 과정을 관찰하였다. 5'-32P-표지화된 RNA 풀(저 농도)을 0.1 ㎎/㎖ tRNA와, 0.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA(최종 부피 = 50 uL)를 함유하는 1X 둘베코 PBS 중 표적 단백질이 존재하지 않는 대조군, 100 nM 인간 vWF A1 도메인 또는 100 nM 토끼 vWF A1 도메인과 함께 실온에서 30 분 동안 항온 처리하고, 이후 닷 블럿 장치(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 내 니트로셀룰로즈 및 나일론 필터 샌드위치에 묻혔다. 제6, 제9 및 제12 라운드 실시 후, 삼중점 스크리닝(100 nM 인간 vWF A1 도메인, 100 nM 토끼 vWF A1 도메인 및 표적이 없는 대조군)을 이용하여 니트로셀룰로즈에 결합한 RNA 풀의 %를 계산하였다. 풀의 결합 정도를 원래의 RNA 풀(제0 라운드)의 결합 정도와 비교하였다. rRdY 풀 결합 분석에 관한 결과를 이하 표 8에 나타내었다.
Figure 112007026846805-PCT00017
인간 또는 토끼 vWF A1 도메인(각각 서열 번호 4 및 서열 번호 6) 존재 하에서와 단백질 부재 하에서, RNA의 결합에 관한 유의적 양의 비를 살펴 보았을 때, 이 풀은 제조자의 지침에 따라서 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Cat.# 45-0641, Carlsbad, CA)를 사용하여 클로닝되었음을 알 수 있었다. 제 9 라운드 및 제12 라운드 주형을 클로닝하여 서열 결정(총 185개의 서열)한 결과, 3개의 서열 군에 속하는 78개의 독특한 클론이 얻어졌다. 이 독특한 클론을 모두 전사하여, 탈염시킨 후, 5'-32P-말단 표지화시켜, 삼중점 닷 블럿 스크리닝으로 검정하였다[단백질 표적이 없는 대조군, 100 nM 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5) 또는 100 nM 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)]. 이와 관련된 데이터를, 표적 단백질의 존재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머 분율 : 표적 단백질 부재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머 분율의 비율로서 이하 표 9의 세 번째 및 네 번째 컬럼에 제시하였다. 상기 3개의 서열 군 중, 제1군 및 제2 군에 속하는 일원들과 2개의 개별 비 군집형 앱타머는 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5) 및 토끼 vWF A1 도메인(서열 6) 모두에 결합하였다.
이와 같은 초기 스크리닝을 바탕으로, 닷 블럿 검정법을 이용하여 vWF에 가장 많이 의존하는 결합 서열 중 16개에 대하여 KD를 측정하였다. KD 측정에 있어서, 앱타머 전사체를 γ-32P ATP로 5' 말단 표지화하여 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하였다. 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5)을 6 중점 단백질 적정하여(6-point protein titration), 0.1 ㎎/㎖ BSA 함유 1X DPBS 중 실온에서 30분 동안, 닷 블럿 검정법을 실시하였다[333 nM, 100 nM, 33 nM, 10 nM, 3 nM, 0 nM]. 칼라이다 그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint으로써 KD 값을 계산하였다.
단백질 결합에 관한 특성 규명 결과를 이하 표 9의 마지막 컬럼에 제시하였다.
Figure 112007026846805-PCT00018
Figure 112007026846805-PCT00019
상기 표 9에 특성 규명되어 있는 rRdY 앱타머의 핵산 서열을 이하에 나타내었다. 이하 각 앱타머의 독특한 서열은 GGAGCGCACTCAGCCAC(서열 번호 221) 바로 다음에 오는 18번째 뉴클레오티드로 시작하여, 3' 말단의 고정된 핵산 서열인 TTTCGACCTCTCTGCTAGC(서열 번호 222)에 이를 때까지에 해당한다.
달리 언급하지 않는 한, 이하에 나열한 각각의 서열은 5'→3' 방향으로 나타낸 것이고, 아데노신 트리포스페이트 및 구아노신 트리포스페이트는 2'-OH이고, 시티딘 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트는 데옥시인 rRdY 셀렉스™ 조건 하에서 선별하였다.
vWF rRdY 셀렉스 ™ 제1 군
vWF rRdY 제1 군에 대한 중심 표적 단백질 결합 모티프를 이하 서열에 굵은 글씨로 밑줄을 쳐서 나타내었다:
Figure 112007026846805-PCT00020
본 발명의 몇몇 구체예의 vWF 표적에 결합하는데에 필요한 예측 2차 구조와 중심 핵산 서열을 도 12에 서열 번호 218로서 도시하였다.
vWF rRdY 셀렉스 ™ 제2 군
Figure 112007026846805-PCT00021
Figure 112007026846805-PCT00022
vWF rRdY 셀렉스 ™ 단일 서열
서열 번호 49에 대한 예측 중심 핵산 결합 모티프를 이하에 굵은 글씨로 밑줄을 쳐서 나타내었다:
Figure 112007026846805-PCT00023
본 발명의 몇몇 구체예의 vWF 표적에 결합하는데에 필요한 예측 중심 핵산 서열 및 2차 구조를 도 13에 서열 번호 219로서 도시하였다.
실시예 1C: DNA vWF 도메인 A1 앱타머의 제1 선별
데옥시-뉴클레오티드(DNA)로 이루어진 뉴클레오티드 풀을 이용하여, (1) 인간 vWF A1 도메인, (2) 토끼 vWF A1 도메인 또는 (3) 인간 및 토끼 vWF A1 도메인에 결합하는 앱타머를 동정하기 위해 선별 방법을 수행하였다. 선별 기법을 통하여 소수성 평판 상에 고정된 인간 및 토끼 vWF A1 도메인에 특이적인 고 친화성의 앱타머를 얻었다.
풀 제조
서열 5'-CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC -3'(서열 번호 51)(ARC493)을 보유하는 DNA 주형을 ABI 엑스퍼다이트™ DNA 합성기를 사용하여 합성하고, 표준적 방법에 따라서 탈보호하였다. DNA 주형(서열 번호 51) 중 일련의 N은 뉴클레오티드를 임의로 조합한 것으로서, 이는 앱타머의 독특한 서열 부위를 구성한다. 표준적 조건 하에서 주형을 프라이머인 (5'-CTACCTACGATCTGACTAGC-3')(서열 번호 52) 및 (5'-AGGAACTACATGAGAGTAAGC(OH)-3')(서열 번호 53)으로 PCR 증폭시켰다. PCR 생산물을 알칼리 가수 분해(333 mM NaOH, 90℃ 및 15분)시킨 후, 침전시켰다. 이후 사슬들을 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 이동성이 작아 조금밖에 이동하지 않은 단일 사슬 DNA 풀을 겔로부터 잘라내어, 수동적으로 용리시키고, 이소프로판올로 침전시켰다.
선별
인간 vWF 선별을 위하여, 처음 10 라운드는 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 4) 24 pmole을, 1X 둘베코 PBS(Gibco BRL Cat.# 14040-133, Carlsbad, CA) 100 ㎕ 중 Nunc Maxisorp 소수성 평판(Nunc Cat.# 446612, Rochester, NY) 표면상에 실온에서 1 시간 동안 고정화시킴으로써 시작하였다. 제11 라운드 및 제12 라운드에서, 전장 인간 vWF(서열 번호 7) 12 pmole을 소수성 평판에 고정하였다. 토끼의 vWF를 선별하기 위해서, 각 라운드는 인간 vWF A1 도메인의 경우와 동일한 조건 하에서 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6) 24 pmole을 고정함으로써 시작하였다. 인간/토끼를 번갈아가며 선별하는 처음 2회 라운드에 있어서, 12 pmole의 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 4)과 12 pmole의 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)을 전술한 바와 같이 소수성 평판에 고정시켰다. 상기 교대 선별의 추후 라운드에 있어서, 단백질 표적은 매 라운드마다 인간과 토끼의 vWF A1 도메인과 번갈아 결합하였다[단, 제11 라운드에서는 인간 전장 vWF(서열 번호 7)가 사용됨].
모든 경우에 있어서, 단백질 고정 이후 1 시간 경과시, 상청액을 제거하고 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 이후 단백질-고정 웰을 100uL의 블로킹 완충액(1% BSA 함유 1X 둘베코 PBS)으로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 제1 라운드에서, DNA 풀 333 pmole(2 x 1014개의 특이 분자)을 BSA-블로킹 단백질 표적 함유 웰 내 100 ㎕의 1X 둘베코 PBS 중에서 1 시간 동안 항온 처리(실온)하였다. 이후 상청액을 제거하고, 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 후반 라운드에서, 추가로 세척하여 양 선별 단계의 엄중도를 높였다(표 10, 표 11 및 표 12 참조). 제2 라운드를 필두로 하여 이후 모든 라운드에서, 상기 양 선별 단계 이전에 2회의 음 선별 단계를 추가 실시하였다. 우선, DNA 풀을 1 시간 동안 블로킹시키지 않은 웰 내에서 항온 처리하여(실온), 이 풀로부터 플라스틱에 결합한 임의의 서열을 제거하였다. 두 번째 음 선별 단계에서, 1 시간 동안 실온에서 DNA를 BSA 블로킹 웰(단백질 표적을 함유하지 않음)로 옮겨, 양 선별 이전에 풀로부터 임의의 BSA 결합 서열을 제거하였다. 제2 라운드를 필두로 하여 이후의 모든 라운드에서, 0.1 ㎎/㎖의 tRNA와 0.1 ㎎/㎖의 연어 정자 DNA를 비-특이적 경쟁 물질로서 상기 양 선별 반응에 첨가하였다.
모든 경우에 있어서, 고정된 단백질 표적에 결합한 DNA 풀에 용리 완충액(90℃로 예열, 7M 우레아, 100 mM NaOAc, pH 5.3, 3 mM EDTA) 100 ㎕씩으로 5분 동안 2회 세척하였다. 상기 2회 세척 용리액을 풀링하고, 여기에 에탄올을 첨가하여 침전시킨 다음, 초기 PCR 반응에서 증폭시켰다[5'-프라이머(서열 번호 52), 3'-프라이머(서열 번호 53) 및 Taq 중합 효소(New England Biolabs Cat.# MO267L, Beverly, MA) 함유하는 100 ㎕의 반응물]. PCR 반응은 다음과 같은 조건 하에서 수행하였다: a) 변성 단계: 94℃, 2분; b) 순환 단계: 94℃, 30초, 52℃, 30초, 72℃, 1분; c) 최종 증폭 단계: 72℃, 3분. 상기 주기는 PCR 생산물이 충분히 생성될 때까지 반복 수행하였다. PCR 생산물을 충분히 생성시키는데에 필요한 주기의 최소 횟수를 이하 표 10, 표 11 및 표 12에서 "PCR 최소 수행 횟수"로 나타내었다. 분석용 PCR 반응(prep-scale PCR reaction)을 위해, PCR 생산물 10 ㎕을 다른 PCR 혼합물 300 ㎕에 첨가하였다. 상기 분석용 PCR 생산물을 에탄올 침전시키고, 이를 알칼리 가수 분해(333 mM NaOH, 90℃ 및 15분)시켰다. 이후 사슬들을 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 이동성이 작아 조금밖에 이동하지 않은 단일 사슬 DNA 풀을 겔로부터 잘라내어, 수동적으로 용리시키고, 이소프로판올로 침전시켰다. 모든 경우에 있어서, 총 단일 사슬 DNA 생산물 당량의 절반은 이후 선별 라운드에서 출발 풀로 사용하였다.
Figure 112007026846805-PCT00024
Figure 112007026846805-PCT00025
Figure 112007026846805-PCT00026
Figure 112007026846805-PCT00027
Figure 112007026846805-PCT00028
vWF 결합 분석
샌드위치 필터 결합 검정법을 이용하여 선별 과정을 관찰하였다. 5'-32P-표지화된 DNA 풀(저 농도)을 0.1 ㎎/㎖ tRNA와, 0.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA(최종 부피 = 50 uL)를 함유하는 1X 둘베코 PBS 중 표적 단백질이 존재하지 않는 대조군, 100 nM 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 4) 또는 100 nM 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)와 함께 실온에서 30 분 동안 항온 처리하고, 이후 닷 블럿 장치(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 내 니트로셀룰로즈 및 나일론 필터 샌드위치에 묻혔다. 제6, 제9 및 제12 라운드 실시 후, 삼중점 스크리닝(100 nM 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5), 100 nM 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6), 및 표적이 없는 대조군)을 수행하여 니트로셀룰로즈에 결합한 DNA 풀의 %를 계산하였다. 풀의 결합 정도를 원래의 DNA 풀(제0 라운드)의 결합 정도와 비교하였다. DNA 풀 결합 분석에 관한 결과를 이하 표 13에 나타내었다.
Figure 112007026846805-PCT00029
인간 또는 토끼 vWF A1 도메인 존재 하에서와 단백질 부재 하에서, DNA의 결합에 관한 유의적 양의 비를 살펴 보았을 때, 이 풀은 제조자의 지침에 따라서 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Cat.# 45-0641, Carlsbad, CA)를 사용하여 클로닝되었음을 알 수 있었다. 제 9 라운드 및 제12 라운드 주형을 클로닝하여 서열 결정(총 243개의 서열)한 결과, 8개의 서열 군에 속하는 106개의 독특한 클론이 얻어졌으며, 상기 vWF 표적에 결합한 것들 중 41개는 이하에 기술한 군에 속하는 것이었다.
독특한 클론들 모두를 삼중점 닷 블럿 스크리닝으로 분석하였다[단백질 표적이 없는 대조군, 100 nM 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5) 또는 100 nM 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)]. 이와 관련된 데이터를, 표적 단백질의 존재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머 분율 : 표적 단백질 부재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머의 분율의 비율로서 이하 표 14의 세 번째 및 네 번째 컬럼에 제시하였다.
이와 같은 초기 스크리닝 결과를 바탕으로 하여, vWF 의존성 결합 서열 중 10개에 대한 KD를 측정하였다. KD 측정에 있어서, γ-32P ATP로 앱타머의 5' 말단을 표지화하고, 1X DPBS + 0.1 ㎎/㎖ BSA 중 단백질 농도를 100 nM로 일정하게 유지시키면서, 8 군데의 지점(333 nM, 100 nM, 33 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 33 pM, 0 pM)에서 경쟁적 DNA로 냉각 적정하여 경쟁적 닷 블럿 검정법을 수행하였다(실온, 30분). 칼라이다 그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint을 적용시켜 KD 값을 계산하였다. 단백질 결합에 관한 특성 규명 결과를 이하 표 14에 제시하였다.
Figure 112007026846805-PCT00030
Figure 112007026846805-PCT00031
Figure 112007026846805-PCT00032
상기 표 14에 특성 규명되어 있는 DNA 앱타머의 핵산 서열을 이하에 나타내었다. 이하 각 앱타머의 독특한 서열은 CTACCTACGATCTGACTAGC(서열 번호 52) 바로 다음에 오는 21번째 뉴클레오티드로 시작하여, 3' 말단의 고정된 핵산 서열인 GCTTACTCTCATGTAGTTCC(서열 번호 223)에 이를 때까지에 해당한다.
달리 언급하지 않는 한, 이하에 나열한 각각의 서열은 5'→3' 방향으로 나타낸 것이고, 모든 뉴클레오티드가 데옥시인 DNA 셀렉스™ 조건 하에서 선별하였다.
DNA 셀렉스 ™ 1, 제1 군
DNA 셀렉스™ 1, 제1 군에 대한 예측 중심 핵산 결합 서열을 이하 앱타머 AMX199.B3(서열 번호 54) 및 공통 서열(서열 번호 95)에 대해 굵은 글씨로 밑줄쳐서 나타내었다:
Figure 112007026846805-PCT00033
Figure 112007026846805-PCT00034
DNA 셀렉스™1 제1 군에 대한 공통 서열은 다음과 같다:
서열 번호 95
Figure 112007026846805-PCT00035
[상기 서열 중 Y = C 또는 T이고, R = A 또는 G이며, H = A, C 또는 T임]
DNA 셀렉스 ™1 제2 군
Figure 112007026846805-PCT00036
DNA 셀렉스™ 제2 군에 대한 공통 서열은 다음과 같다:
서열 번호 96
Figure 112007026846805-PCT00037
[상기 서열 중 Y = C 또는 T이고, R = A 또는 G이며, H = A, C 또는 T임]
DNA 셀렉스 ™1, 제3 군
Figure 112007026846805-PCT00038
DNA 셀렉스 ™ 1, 제4 군
Figure 112007026846805-PCT00039
실시예 1D: DNA vWF 앱타머의 제2 선별
전장 인간 vWF 및 토끼 vWF 도메인 A1을 사용하여 하나의 DNA 선별 세트를 교차 선별하였다. 어떠한 이론에도 국한되지 않고, 이러한 선별에 있어서는 전장 vWF, 특히 A1 도메인에 결합하고, 인간과 토끼의 단백질 사이에서 상호 반응을 하는 앱타머를 성공적으로 선별하는 것이 필요할 것이라는 사실을 추론할 수 있다. 이와 같은 두 번째 DNA 선별 세트로부터 얻어진 우성 서열 군은, 전장 인간 vWF 및 토끼 vWF 도메인 A1에 결합하고, 또한 이하 실시예 3에 기술된 바와 같이 FACS 및 BIPA 생물 검정 둘 다에서 작용성이다.
전장 인간 vWF 및 토끼 vWF A1 도메인에 결합하는 앱타머를 동정하기 위해, 전장 인간 vWF/토끼 vWF A1 도메인 교대 선별법을 이용하여 선별을 수행하였다. 이 선별법은 데옥시뉴클레오티드(DNA)로 이루어진 뉴클레오티드 풀을 사용하였다. 선별 기법을 통하여, 소수성 평판 상에 고정된 전장 인간 vWF 및 토끼 vWF A1 도메인에 특이적인 고 친화성 앱타머를 얻었다.
풀 제조
서열 5'-CTACCTACGATCTGACTAGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNGCTTACTCTCATGTAGTTCC -3'(서열 번호 51)(ARC493)을 보유하는 DNA 주형을 ABI 엑스퍼다이트™ DNA 합성기를 사용하여 합성하고, 표준적 방법에 따라서 탈보호하였다. DNA 주형(서열 번호 51) 중 존재하는 일련의 N은 뉴클레오티드를 임의로 조합한 것으로서, 이는 앱타머의 독특한 서열 부위를 구성한다. 주형을 표준적 조건 하에서 프라이머인 (5'-CTACCTACGATCTGACTAGC-3')(서열 번호 52) 및 (5'-AGGAACTACATGAGAGTAAGC(OH)-3')(서열 번호 53)으로 PCR 증폭시켰다. PCR 생산물을 알칼리 가수 분해(333 mM NaOH, 90℃ 및 15분)시킨 후, 침전시켰다. 이후 사슬들을 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 이동성이 작아 조금밖에 이동하지 않은 단일 사슬 DNA 풀을 겔로부터 잘라내어, 수동적으로 용리시키고, 이소프로판올로 침전시켰다.
선별
전장 인간 vWF/토끼 vWF A1 도메인 교대 선별QJQ에 있어서 처음 3 라운드를 수행하기 위하여, 전장 인간 vWF(서열 번호 7) 24 pmole과 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6) 24 pmole을 고정하였다. 이후의 라운드에서, 단백질 표적은 매 라운드마다 전장 인간 vWF 및 토끼 vWF A1 도메인과 번갈아 결합하였다. 모든 경우에 있어서, 단백질 고정 이후 1 시간 경과시, 상청액을 제거하고 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 이후 단백질-고정 웰을 100uL의 블로킹 완충액(1% BSA 함유 1X 둘베코 PBS)으로 실온에서 1 시간 동안 블로킹하였다. 제1 라운드에서, DNA 풀 333 pmole(2 x 1014개의 특이 분자)을 BSA-블로킹 고정화 단백질 표적 함유 웰 내 100 ㎕의 1X 둘베코 PBS 중에서 1 시간 동안 항온 처리하였다(실온). 이후 상청액을 제거하고, 웰을 120 ㎕의 1X 둘베코 PBS로 4회 세척하였다. 후반 라운드에서, 추가로 세척하여 양 선별 단계의 엄중도를 높였다(표 15 참조). 제8 라운드에서는, 셀렉스™(1X 둘베코 PBS + 400 mM NaCl 사용)의 엄중도를 증가시킬 수 있는 수단으로서 고농도 염 세척 조건을 포함하도록 선별법을 두 가지의 경우로 나누었다(표 15 참조). 제2 라운드를 필두로 하여 이후 모든 라운드에서, 상기 양 선별 단계 이전에 2회의 음 선별 단계를 추가 실시하였다. 우선, DNA 풀을 1 시간 동안 블로킹시키지 않은 웰 내에서 항온 처리하여(실온), 이 풀로부터 플라스틱에 결합한 임의의 서열을 제거하였다. 두 번째 음 선별 단계에서, DNA를 BSA 블로킹 웰(단백질 표적을 함유하지 않음)로 옮겨 1 시간 동안 실온에 방치한 후, 양 선별 이전에 풀로부터 임의의 BSA 결합 서열을 제거하였다. 제2 라운드를 시초로 하여 이후의 모든 라운드에서, 0.1 ㎎/㎖의 tRNA와 0.1 ㎎/㎖의 연어 정자 DNA를 비-특이적 경쟁 물질로서 상기 양 선별 반응에 첨가하였다.
모든 경우에 있어서, 고정된 단백질 표적에 결합한 DNA 풀을 용리 완충액(90℃로 예열, 7M 우레아, 100 mM NaOAc, pH 5.3, 3 mM EDTA) 100 ㎕씩으로 5분 동안 2회 세척하였다. 상기 2회 세척 용리액을 풀링하고, 여기에 에탄올을 첨가하여 침전시킨 다음, 초기 PCR 반응에서 증폭시켰다[5'-프라이머(서열 번호 52), 3'-프라이머(서열 번호 53) 및 Taq 중합 효소(New England BioLabs Cat.# MO267L, Beverly, MA) 함유 반응물 100 ㎕]. PCR 반응은 다음과 같은 조건 하에서 수행하였다: a) 변성 단계: 94℃, 2분; b) 순환 단계: 94℃, 30초, 52℃, 30초, 72℃, 1분; c) 최종 증폭 단계: 72℃, 3분. 상기 주기는 PCR 생산물이 충분히 생성될 때까지 반복 수행하였다. PCR 생산물을 충분히 생성시키는데에 필요한 주기의 최소 횟수를 이하 표 15에서 "PCR 최소 수행 횟수"로 나타내었다. 분석용 PCR 반응을 위해, PCR 생산물 10 ㎕을 다른 PCR 혼합물 300 ㎕에 첨가하였다. 상기 분석용 PCR 생산물을 에탄올 침전시키고, 이를 알칼리 가수 분해(333 mM NaOH, 90℃ 및 15분)시켰다. 이후 사슬들을 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 이동성이 작아 조금밖에 이동하지 않은 단일 사슬 DNA 풀을 겔로부터 잘라내어, 수동적으로 용리시키고, 이소프로판올로 침전시켰다. 모든 경우에 있어서, 총 단일 사슬 DNA 생산물 양의 반에 해당하는 당량을 선별의 추후 라운드에 대해 출발 풀로서 사용하였다.
Figure 112007026846805-PCT00040
vWF 결합 분석법
샌드위치 필터 결합 분석법을 이용하여 선별 과정을 관찰하였다. 5'-32P-표지화된 DNA 풀(저 농도)을 0.1 ㎎/㎖ tRNA와 0.1 ㎎/㎖ 연어 정자 DNA, 그리고 0.1 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 1X 둘베코 PBS(최종 부피 = 50 uL) 중 표적 단백질이 존재하지 않는 대조군, 100 nM 전장 인간 vWF(Calbiochem Cat.# 681300, La Jolla, CA) 또는 100 nM 토끼 vWF A1 도메인과 함께 실온에서 30 분 동안 항온 처리하고, 이후 닷 블럿 장치(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 내 니트로셀룰로즈 및 나일론 필터 샌드위치에 묻혔다. 제7 라운드 및 제9 라운드 이후에, 단백질 표적이 존재하지 않는 대조구, 30 nM/100 nM 전장 인간 vWF(Calbiochem Cat.# 681300, La Jolla, CA) 그리고 30 nM/100 nM 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)으로 스크리닝하여, 니트로셀룰로즈에 결합한 DNA 풀의 비율을 계산하였다. 풀의 결합 여부를 원래 풀 DNA(제0 라운드)의 결합 여부와 비교하였다. DNA 풀 결합 분석 결과를 이하 표 16에 나타내었다.
Figure 112007026846805-PCT00041
인간 또는 토끼 vWF A1 도메인 존재 하에서와 단백질 부재 하에서, DNA의 결합에 관한 유의적 양의 비를 살펴 보았을 때, 이 풀은 제조자의 지침에 따라서 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Cat.# 45-0641, Carlsbad, CA)를 사용하여 클로닝 되었음을 알 수 있었다. 제7 라운드 및 제11 라운드 주형 풀을 클로닝하여 서열 결정(총 218개의 서열)한 결과, 146개의 독특한 클론[6개의 군에 속하는 서열이 vWF 표적 결합 활성을 나타내는, 12개의 서열 군에 속하는 클론]이 얻어졌다. 이 독특한 클론들 모두를 3 중점 닷 블럿 스크리닝[단백질 표적이 없는 대조군, 20 nM 전장 인간 vWF(Calbiochem Cat.# 681300, La Jolla, CA) 또는 20 nM 토끼 vWF A1 도메인]에서 2회 검정하였다. 이와 관련된 데이터를, 표적 단백질의 존재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머 분율 : 표적 단백질 부재 하에 니트로셀룰로즈에 결합한 앱타머 분율의 비율로서 이하 표 17의 세 번째 및 네 번째 컬럼에 제시하였다.
이와 같은 초기 스크리닝 결과를 바탕으로, 닷 블럿 검정법을 이용하여 vWF에 의존하는 결합 서열 중 3개에 대하여 KD를 측정하였다. KD 측정에 있어서, 앱타머를 γ-32P ATP로 5' 말단 표지화하고, 이를 전장 인간 vWF 및 토끼 vWF A1 도메인에 직접 결합하는지 여부에 대하여 시험하였다. 실온에서 30분 동안 1X DPBS + 0.1 ㎎/㎖ BSA 중 닷 블럿 검정법을 통하여 12 중점 단백질 적정을 실시하였다[300 nM, 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 10 pM, 3 pM, 0 pM]. 칼라이다 그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint을 적용시켜 KD 값을 계산하였다. 단백질 결합에 관한 특성 규명 결과를 이하 표 17에 제시하였다.
Figure 112007026846805-PCT00042
Figure 112007026846805-PCT00043
Figure 112007026846805-PCT00044
Figure 112007026846805-PCT00045
Figure 112007026846805-PCT00046
Figure 112007026846805-PCT00047
상기 표 17에 제시된 DNA 앱타머의 핵산 서열을 이하에 나타내었다. 이하 각 앱타머의 독특한 서열은 CTACCTACGATCTGACTAGC(서열 번호 52) 바로 다음에 오는 21번째 뉴클레오티드로 시작하여, 3' 말단의 고정된 핵산 서열인 GCTTACTCTCATGTAGTTCC(서열 번호 223)에 이를 때까지에 해당한다.
달리 언급하지 않는 한, 이하에 나열한 각각의 서열은 5'→3' 방향으로 나타낸 것이고, DNA 셀렉스™ 조건 하에서 선별하였으며, 이때 뉴클레오티드는 모두 데옥시이다.
vWF DNA 셀렉스 ™ 2, 제1.1 군
제1.1 군 및 제1.2 군은 ARC1029(서열 번호 214)의 근원을 이루었다. 표적인 폰 빌레브란트 인자에 대한 예측 중심 핵산 결합 서열을 밑줄쳐서 나타내었으며, 앱타머인 AMX237.E9(서열 번호 104) 및 AMX238.H5(서열 번호 118)는 굵은 글씨로 나타내었다.
Figure 112007026846805-PCT00048
vWF DNA 셀렉스 ™ 2, 제1.2 군
AMX238.H5(서열 번호 118)
Figure 112007026846805-PCT00049
Figure 112007026846805-PCT00050
본 앱타머 선별 군 중 제1 군에 포함되는 본 발명의 몇몇 구체예에 있어서 vWF 표적에 결합하는데에 필요한 예측 2차 구조 및 중심 핵산 서열을 도 15에 서열 220으로서 도시하였다.
vWF DNA 셀렉스 ™ 2, 제2 결합 군
Figure 112007026846805-PCT00051
Figure 112007026846805-PCT00052
DNA 셀렉스™ 2 제2 군에 대한 공통 서열은 다음과 같다:
서열 번호 325
Figure 112007026846805-PCT00053
[서열 중, Y = C 또는 T이고, R = A 또는 G이며, (Y/A) = C, T 또는 A임]
vWF DNA 셀렉스 ™ 2, 제3 결합 군
본 군은 전술한 vWF DNA 셀렉스™ 1, 제1 군과, 90% 이상의 서열 동일성을 갖는다는 점에서 균등한 것이다.
Figure 112007026846805-PCT00054
Figure 112007026846805-PCT00055
vWF DNA 셀렉스 ™ 2, 제4 결합 군
Figure 112007026846805-PCT00056
vWF DNA 셀렉스 ™ 2, 제5 군
Figure 112007026846805-PCT00057
DNA 셀렉스™ 2, 제5 군에 대한 공통 서열을 이하에 제시하였다:
서열 번호 326
제5.1 군 = 서열 번호 164 및 서열 번호 159
Figure 112007026846805-PCT00058
[서열 중, Y = C 또는 T임]
서열 번호 327
제5.2 군 = 서열 번호 161 및 서열 번호 160
Figure 112007026846805-PCT00059
[서열 중, Y = C 또는 T이고, R = A 또는 G임]
vWF DNA 셀렉스 ™ 2, 제6 군
Figure 112007026846805-PCT00060
실시예 2: 조성물 및 서열 최적화와 서열
실시예 2A: rRfY vWF 앱타머의 절단
전술한 실시예 1에 기술된 vWF 결합 분석 결과와 이하 실시예 3에 기술된 세포계 검정 데이터를 기초로 하여, 추가의 특성 규명을 위해 rRfY 선별법으로 앱타머 ARC840(AMX201.C8)(서열 번호 23)을 선별하였다.
vWF 결합에 필요한 중심 구조 요소를 확인하기 위하여, ARC840(AMX201.C8)(서열 번호 23)의 3'-경계부를 결정하였다. 전장 RNA 전사체의 5'- 말단에 γ-32P ATP와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 표지화하였다. 방사능 표지화된 리간드를 부분 알칼리 가수 분해시킨 후, 용액 중에서 인간 폰 빌레브란트 인자 A1 도메인(서열 번호 5)에 500 nM의 농도로 선택적으로 결합시킨 다음, 니트로셀룰로즈 필터를 통과시켰다. 잔류하는 올리고뉴클레오티드와 잔류하지 않는 올리고뉴클레오티드 둘다를 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 각각 분석하였다. vWF에 결합한 올리고뉴클레오티드 중 가장 작은 것을 3'-경계부로서 정하였다. 예측 군에 관한 경계 실험(boundary experiment)과 시각적 관찰을 기초로 하여, 최소화 서열의 패널을 디자인하였다. 로체스터 대학교로부터 다운로드 받은 RNAstructure(제4.1판)를 이용하여 본 발명의 모든 핵산 서열 군을 예측하였다. RNAstructure는 자유 에너지 최소화에 입각한 RNA의 2차 구조 예측에 대한 주커 알고리즘(Zuker algorithm)의 윈도우판이다[Mathews, D.H.; Disney, M.D.; Childs, J.L.; Schroeder, S.J.; Zuker, M.; 및 Turner D.H., "Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure," 2004. Proceedings of the National Academy of Sciences, US, 101, 7287-7292]. RNAstructure 4.1은 터너 실험팀이 가장 최근에 규명한 열역학적 매개 변수를 사용한다.
이하 기술된 최소화 rRfY 앱타머에 있어서, 퓨린은 2'-OH를 포함하고, 피리미딘은 2'-F 변형을 포함하며, 반면에 주형과 프라이머는 변형되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다.
최소화 rRfY 앱타머인 5'-GGAGCGCACUCAGCCACCCUCGCAAGCAUUUUAAGAAUGACUUGUGCCGCUGGCUG-3'(서열 번호 165)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-CAGCCAGCGGCACAAGTC-3'(서열 번호 167)을 사용하여 주형인 5'-TCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACCCTCGCAAGCATTTTAAGAATGACTTGTGCCGCTGGCTG-3'(서열 번호 168)을 증폭시켰다.
최소화 앱타머인 5'-GGACCACCCUCGCAAGCAUUUUAAGAAUGACUUGUGCCGCUGGUCC -3'(서열 번호 169)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGACCAGCGGCACAAGTC-3'(서열 번호 170)을 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCACCCTCGCAAGCATTTTAAGAATGA CTTGTGCCGCTGGTCC-3'(서열 번호 171)를 증폭시켰다.
최소화 앱타머인 5'-GGACCACCCUCGCAAGCAUUGAGAAAUGACUUGUGCCGCUGGUCC-3'(서열 번호 172)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGACCAGCGGCACAAGTC-3'(서열 번호 170)을 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCACCCTCGCAAGCATTGAGAAATGACTTGTGCCGCTGGTCC-3'(서열 번호 173)을 증폭시켰다.
최소화 앱타머인 5'-GGACCACCCUCGCAACGAGAGUUGUGCCGCUGGUCC-3'(서열 번호 174)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGACCAGCGGCACAACTC-3'(서열 번호 175)를 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGACCACCCTCGCAACGAGAGTTGTGCCGCTGGTCC-3'(서열 번호176)을 증폭시켰다.
상기 최소화 앱타머 서열 모두를 전사시키고, 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 겔-정제한 다음, γ32P ATP로 5'32P 말단 표지화한 다음, 2개의 센트리-스핀 10 컬럼(Princeton Separations Cat.# CS-101, Adelphia, NJ)을 사용하여 탈염시켰다. 이와 같은 최소체(minimer)들은 주로 이하 실시예 3에 기술된 세포 검정법에서 특성 규명하였다.
실시예 2B: rRdY vWF 앱타머의 절단
상기 실시예 1에 기술된 vWF 결합 분석 결과와 이하 실시예 3에 기술된 세포계 검정 데이터를 기초로 하여, 추가의 특성 규명을 위해 앱타머 AMX203.G9(서열 번호 44) 및 AMX205.F7(서열 번호 49)를 각각 확인하였다.
vWF 결합에 필요한 중심 구조 요소를 확인하기 위하여, 앱타머 AMX203.G9(서열 번호44) 및 AMX205.F7(서열 번호 49)의 3'-경계부를 결정하였다. 전장 RNA 전사체의 5'-말단에 γ-32P ATP와 T4 폴리뉴클레오티드 키나제로 표지화하였다. 방사능 표지화된 리간드를 부분 알칼리 가수 분해시킨 후, 용액 중에서 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5)에 500 nM의 농도로 선택적으로 결합시킨 다음, 니트로셀룰로즈 필터를 통과시켰다. 잔류하는 올리고뉴클레오티드를 8% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 각각 분석하였다. vWF에 결합한 올리고뉴클레오티드 중 가장 작은 것을 3'-경계 부로 정하였다. RNAstructure(제4.1 판)를 이용하는 예측 군에 관한 경계 실험과 시각적 관찰 결과를 기초로 하여, 최소화 서열의 패널을 디자인하였다.
이하 기술된 최소화 rRdY 앱타머에 있어서, 퓨린은 2'-OH 퓨린이고, 피리미딘은 데옥시-피리미딘이며, 반면에 주형과 프라이머는 변형되지 않은 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 이하 3개의 최소화 서열은 DL.159.87.70(서열 번호 44)로부터 유래된 것들이다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCT -3'(서열 번호 177)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호166) 및 3' PCR 프라이머 5'-AGCCACATACCCGCCGTC-3'(서열 번호 178)를 사용하여, 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACGGGGTGGGTAGA CGGCGGGTATGTGGCT-3'(서열 번호 179)를 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTCC-3'(서열 번호 180)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGAGCCACATACCCGCCG-3'(서열 번호 181)을 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTGGCTCC-3'(서열 번호 182)를 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGGACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTCCC-3'(서열 번호 183)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGGACATACCCGCCG-3'(서열 번호 184)를 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGGACGGGGTGGGTAGACGGCGGGTATGTCCC-3'(서열 번호 185)를 증폭시켰다.
다음과 같은 7개의 최소화 앱타머 서열은 서열 번호 49의 앱타머로부터 유래된 것이다:
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTG-3'(서열 번호 186)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-CAGCCATGCGTGGTAATT-3'(서열 번호 187)을 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCGCACTCAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTG-3'(서열 번호 188)을 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3'(서열 번호 189)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGAGCCATGCGTGG-3'(서열 번호 190)을 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3'(서열 번호 191)을 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-3'(서열 번호 192)에 있어서, 5' PCR 프라이머 b 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGAGCCATGCGTGG-3'(서열 번호 190)을 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-3'(서열 번호 193)을 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCCACACGACATTGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-3'(서열 번호 194)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGAGCCATGCGTGG-3'(서열 번호 190)을 사용하여, 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGAGAGCCACGCATGGCTCC-3'(서열 번호 195)를 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCCACACGAGAGTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3 '(서열 번호 196)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGAGCCATGCGTGG-3'(서열 번호 190)를 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGAGAGTGGCGGGTTGTAATTACCACGCATGGCTCC-3'(서열 번호 197)을 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCC-3'(서열 번호 198)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGCCATGCGTGGCTCTC-3'(서열 번호 199)를 사용하여, 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGCCACACGACATTGGCGGGCGAGAGCCACGCATGGCC-3'(서열 번호 200)을 증폭시켰다.
최소화 앱타머 서열인 5'-GGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGCATGGCTCC-3'(서열 번호 201)에 있어서, 5' PCR 프라이머 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATA-3'(서열 번호 166) 및 3' PCR 프라이머 5'-GGAGCCATGCGCTCTCG-3'(서열 번호 202)를 사용하여 주형인 5'-GATCGATCTAATACGACTCACTATAGGAGCCACACGACATTGGCGCGAGAGCGCATGGCTCC-3'(서열 번호 203)을 증폭시켰다.
rRdY vWF 최소체 결합
모든 최소체 서열들을 전사시키고, 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 겔-정제한 다음, 이를 γ 32P ATP로 5'-32P 말단 표지화시킨 다음, 2개의 센트리-스핀 10 컬럼(Princeton Separations Cat.# CS-101, Adelphia, NJ)을 사용하여 탈염시켰다. KD 측정을 위하여, 0.1 ㎎/㎖ BSA 함유 1X 둘베코 PBS(최종 부피 50 uL) 중에서 8 중점 단백질 적정을 수행하여[0∼300 nM; 3배 희석], 이 최소체의 전사체가 전장 인간 vWF(서열 번호 7), 인간 vWF A1 도메인(서열 번호 5) 및 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)에 직접 결합하는지 여부에 대하여 실온에서 30분 동안 시험한 다음, 이를 닷 블럿 장치(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 내 니트로셀룰로즈 및 나일론 필터 샌드위치에 묻혔다. 칼라이다 그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint을 적용시켜 KD 값을 계산하였다. 단백질 결합에 관한 특성 규명 결과를 이하 표 18에 제시하였다.
Figure 112007026846805-PCT00061
Figure 112007026846805-PCT00062
실시예 2C: 제1 DNA 셀렉스 ™의 vWF 앱타머 절단
상기 실시예 1에 기술된 vWF 결합 분석법과 예측 군들의 시각적 관찰 결과를 기초로 하였을 때, 최소화 서열 패널은 제1 군으로부터 유래된 결합체의 최선 군으로서 디자인되었다. 이 경우, 제1군으로부터 유래된 결합체 모두는 구조적으로 관련이 있으며, 분자의 5'-말단 및 3'-말단에 가하여진 염기 쌍 형성 제한에 의해 결정되는 바와 같이, 4개의 상호 독자적 군 중 하나에 속한다(RNAstructure 4.1에 의해 예측됨). 본 발명의 발명자들은 이러한 4개의 예측 군 각각을 합성하여 시험하였다. 합성된 최소화 DNA 앱타머 각각에 대한 서열은 다음과 같다:
서열 번호 204
5'-CCAGCGGAATGAGAATGCTGATGGATTGCTCAGGTCTGCTGG-3'
ARC845(서열 번호 205)
5' ATGAGAGTGCTGGTGGATTGCTCAGGTCTGCTGGCTGCTTACTCTCAT-3'
서열 번호 206
5'-CGATCTGACTAGCGGAATGAGAATGCTGGTGGATCG-3'
서열 번호 207
5'-GATCTGACTAGCGCAATGAGGATGCdTGATGGATTGCTCAGGTC-3'
모든 최소체 DNA 서열을 화학 합성하여, 이를 γ32P ATP로 5'-32P 말단 표지화시킨 후에, 2개의 센트리-스핀 10 컬럼(Princeton Separations Cat.# CS-101, Adelphia, NJ)을 사용하여 탈염시켰다. KD 측정을 위하여, 0.1 ㎎/㎖ BSA 함유 1X 둘베코 PBS(최종 부피 50 uL) 중에서 단백질 농도를 10 nM로 일정하게 유지시키는 한편, 12중 점 냉각 경쟁 DNA 적정시켜, 실온에서 30분 동안 경쟁적 닷 블럿 분석법을 수행하였다[3 uM, 1 uM, 333 nM, 100 nM, 33 nM, 10 nM, 3.3 nM, 1 nM, 333 pM, 100 pM, 33.3 pM, 0 pM]. 칼라이다 그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint을 적용시켜 KD 값을 계산하였다. 단백질 결합 특성 규명의 결과를 이하 표 19에 제시하였다. 제시된 바와 같이, 최소화 구조물 중 ARC845만이 인간 또는 토끼의 vWF A1 도메인에 결합하는 능력을 보유하였다.
Figure 112007026846805-PCT00063
상기 결합 결과를 기초로 하였을 때, ARC845(서열 번호 205)는 DNA 셀렉스™ 1, 제1 군 앱타머의 중심 핵산 결합 서열을 나타내는 것이다.
실시예 2D: DNA vWF 교대 선별 앱타머 최소화
전술한 실시예 1에 기술된 vWF 결합 분석 결과와 이하 실시예 3에 기술된 세포계 검정 데이터, 그리고 앱타머 AMX237.B11(서열 번호 109) 및 AMX236.A12(서열 번호 127)에 대한 예측 군의 시각적 관찰 결과를 기초로 하여, 일련의 최소화 서열을 디자인하였다. 뿐만 아니라, 앱타머 AMX237.G6(서열 번호 114), AMX238.E9(서열 번호 115), 및 AMX238.H5(서열 번호 118)이 세포 검정법에서 활성이 약간 더 컸다는 관찰 결과를 기초로 하여, 일련의 최소화 서열인 ARC1027∼1031(서열 번호 212∼216)를 합성하였다. 서열 번호 208 및 서열 번호 209에 따른 최소화 서열은 전장 앱타머인 AMX237.B11(서열 번호 109)로부터 예측된 2개의 상호 독자적인 군들을 나타낸다.
전술한 최소화 DNA 앱타머에 대한 핵산 서열은 다음과 같다:
(서열 번호 208)
5'-GGACGATCTGACTAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTCC-3'
(서열 번호 209)
5'-GGAGCTCCAGTGTTTTATCTAATAACCGTGCGGTGCCTCCGTGAGCTCC-3'
(서열 번호 210)
5'-GGAGCTGCGGTTTGGTCGACGTCAGCTCC-3'
(서열 번호 211)
5'-GGTAGCGACTCTGTGGAGCTGCGGTTTGG-3'
ARC1027(서열 번호 212)
5'-GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3'
ARC1028(서열 번호 213)
5'-dGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3'
ARC1029(서열 번호 214)
5'-GGCGTGCAGTGCC-[PEG]-GGCCGTGCGGTGCCTCCGTCACGCC-3T-3'
ARC1030(서열 번호 215)
5'-GGCGTGCAGTGCCTATTCTAGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T-3'
ARC1031(서열 번호 216)
5'-GGCGTGCAGTGCCT-[PEG]-AGGCCGTGCGG-[PEG]-CCGTCACGCC-3T-3'
상기 최소화 앱타머 모두를 화학 합성하고, 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 겔-정제한 다음, 표준적인 방법과 기술을 이용하여 2개의 센트리-스핀 10 컬럼(Princeton Separations Cat.# CS-1Ol, Adelphia, NJ)으로 탈염시켰다. 상기 최소화 서열들을 이하 실시예 3에 기술된 세포 검정법에서 특성 규명하였다.
처음 일련의 서열 번호 208∼서열 번호 211 중 서열 번호 208만이 세포 검정법에서 활성을 나타냈다(이하, 실시예 3 참조). 앱타머 서열들 즉, AMX237.B11(서열 번호 109) 및 AMX237.G6(서열 번호 114)와, AMX238.E9(서열 번호 115) 및AMX238.H5(서열 번호 118)를 비교한 결과, 상기 서열들은 밀접하게 관련되어 있으며, 최소화 앱타머(서열 번호 208)의 예측 2차 구조를 뒷받침해 준다는 사실을 알 수 있었다(도 14 및 도 15 참조). ARC1027∼1031(서열 번호 212∼216) 분자들을, 앱타머 AMX237.G6(서열 번호 114), AMX238.E9(서열 번호 115), 및 AMX238.H5(서열 번호 118)의 폴딩 및 2차 구조에 관한 가설에 대해 추가로 시험하였다[도 5, 도 14 및 도 15 참조].
KD 측정을 위하여, 이하 실시예 3에 기술된 바와 같이 세포 검정법에서 유효 활성을 나타내는 최소화 서열을 γ32P ATP로 5'-32P 말단을 표지화시킨 후에, 2개의 센트리-스핀 10 컬럼(Princeton Separations Cat.# CS-101, Adelphia, NJ)을 사용하여 탈염시켰다. 0.1 ㎎/㎖ BSA 함유 1X 둘베코 PBS(최종 부피 50 uL) 중에서 9중 점 단백질 적정법을 실온에서 30분 동안 수행하여[100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 30 pM, 0 pM](도 6 참조), 최소체가 전장 인간 vWF(서열 번호 7) 및 토끼 vWF A1 도메인(서열 번호 6)에 직접 결합하는지 여부에 대하여 시험한 후, 이를 닷 블럿 장치(Schleicher and Schuell, Keene, NH) 내 니트로셀룰로즈 및 나일론 필터 샌드위치에 묻혔다. 칼라이다 그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint을 적용시켜 KD 값을 계산하였다. 단백질 결합에 관한 특성 규명 결과를 이하 표 20에 제시하였다.
DNA 2 앱타머 최소체 결합 데이터로서, 세포 검정법에서 유효 활성을 나타내는 앱타머 최소체만이 결합 친화도가 측정됨(이하, 실시예 3 참조) ('ND' = 수행하지 않음)
번호 최소체 전장 인간 vWF KD (nM) 인간 vWF A1 도메인 KD (nM) 토끼 vWF A1 도메인 KD (nM)
1 서열 번호 208 ND ND ND
2 서열 번호 209 ND ND ND
3 서열 번호 210 ND ND ND
4 서열 번호 211 ND ND ND
5 ARC1027 (서열 번호 212) 0.8 ND 4.6
6 ARC1028 (서열 번호 213) 1.1 ND 3.8
7 ARC1029 (서열 번호 214) 1.4±0.2 ND 6.5±1.5
8 ARC1030 (서열 번호 215) 결합하지 않음 ND 결합하지 않음
9 ARC1031 (서열 번호 216) 결합하지 않음 ND 결합하지 않음
실시예 2E: 앱타머 의약 화학을 통한 ARC1029 최적화
ARC1029(서열 번호 214)의 매우 안정적이고 유효한 변이체를, 5개의 앱타머 합성 단계, 정제 단계 및 결합 활성 검정 단계로 이루어진 체계적 합성 변형 연구를 통하여 확인하였다. 앱타머 변형시 화학 합성법을 용이하게 하기 위하여, ARC1029의 PEG 스페이서(서열 번호 214)를 짧은 올리고뉴클레오티드 서열인 dTdTdC로 치환한 결과, 도 16과 이하 표 21에 나타낸 바와 같은 ARC1115(서열 번호 221)가 얻어졌다. 매우 안정화된 3'-역전 dT를 ARC1115(서열 번호 221)의 3가지 주요 말단부 상에서 합성한 결과, 도 16과 이하 표 21에 나타낸 바와 같이 ARC1172(서열 번호 222)이 얻어졌다. 일단 ARC1115(서열 번호 221)과 ARC1172(서열 번호 222) 둘 다가 인간 vWF에 결합하는 것으로 파악되면, ARC1172(서열 번호 222)는 이하 실시예에 기술한 바와 같이 변형에 기본이 되는 주형으로서 사용된 것이었다.
변형 방법 중 제1 단계에서, ARC1172(서열 번호 222) 내에 존재하는 각각의 잔기는 상응하는 2'-O 메틸 함유 잔기(달리 특정하지 않는 한, dT는 mU에 의해 치환됨)로 치환되었으며, 그 결과 이하 표 21과 도 16에 나타낸 바와 같이 ARC1194(서열 번호 223)∼ARC1234를 얻었다. 뿐만 아니라, 제1 단계에서, 일군의 복합 치환이 ARC1172(서열 번호 222)의 줄기 부위에서 이루어진 결과, 표 21과 도 16에 나타낸 바와 같이 ARC1235∼1243이 얻어졌다.
본원에 기술된 바와 같이(예를 들어, 실시예 1, 2 및 3 참조), ARC1029(서열 214)가 얻어지는 클론 스크리닝 및 절단 과정 중, 결합(닷-블럿), FACS 및 BIPA 검정법에 있어서 앱타머의 상대적 효능은 매우 근접하게 일치하였다. 따라서, 닷-블럿 검정 결합 분석법에서 측정된 전장 인간 vWF에 대한 친화도는 합성된 다수의 앱타머 시험 변이체의 상대적 친화도를 특성 규명하기 위해 사용되었다.
KD를 측정하기 위하여, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의해 화학적으로 합성된 앱타머를 정제하고, γ32P-ATP로 5' 말단을 표지화한 다음, 전장 인간 vWF(Calbiochem Cat.# 681300, La Jolla, CA)에 직접 결합하는지 여부에 대해 시험하였다. 8 중점 단백질 적정을, 0.1 BSA 함유 1X 둘베코 PBS(최종 부피 = 50 uL) 중의 닷 블럿 결합 검정법에서 수행하였다[10O nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 300 pM, 100 pM, 0 pM](실온, 30분). 칼라이다 그래프(KaleidaGraph v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 등식 y=(max/(1+K/단백질))+yint을 적용시켜 KD 값을 계산하였다. ARC1029(서열 번호 214) 서열 유도체를 합성하고, 정제한 다음, 전장 인간 vWF에 결합하는지 여부에 대해 검정하여, 단백질 결합 특성 규명 결과를 이하 표 21에 제시하였다. 결합 친화도(KD)는 표 21의 네 번째 컬럼에 나타내었으며, 앱타머가 100 nM의 vWF와 결합하는 정도는 표 21의 마지막 컬럼에 나타내었다.
Figure 112007026846805-PCT00064
Figure 112007026846805-PCT00065
Figure 112007026846805-PCT00066
Figure 112007026846805-PCT00067
Figure 112007026846805-PCT00068
Figure 112007026846805-PCT00069
상기 표 21의 결합 데이터로부터 살펴볼 수 있는 바와 같이, 2'-O 메틸 잔기에 대한 데옥시 잔기 치환을 가장 용이하게 묵인하는 위치는 도 15에 도시된 ARC1029(서열 번호 214)의 2차 구조에 맵핑된 서열 보존 위치와 밀접하게 상관되어 있으므로, 이 앱타머의 제안된 구조를 더욱 독보적으로 지지하는 것이다. 2'-O-Me 변형을 묵인하지 않는 ARC1172(서열 번호 222)의 위치와 이 변형을 묵인하는 위치를 도 15b에 나타내었다.
전술한 개별적이고 복합적인 데옥시-메톡시 앱타머에 대한 구조 활성 관계(SAR) 분석 결과(변형 방법의 제1 단계에서의 분석 결과)를 기초로 하여, 앱타머의 두 번째 시리즈를 디자인, 합성, 정제하여, vWF에 결합하는지 여부에 대해 시험하였다. 상기 및 모든 종속 서열 앱타머에 있어서, 친화도(KD)가 약 10 nM 이상이고, 100 nM의 vWF와 결합하는 정도가 35% 이상인 분자를 목표로 하였다. 도 17 및 표 21에 나타낸 바와 같이, ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1348(서열 번호 283)은 변형 과정 중 제2 단계에서 합성하였다. 변형법 중 제1 단계로부터 유래된 개별 묵인성 치환을 바탕으로 하여, ARC1342에 대한 ARC1338(서열 번호 273)을 블록 변형시켜 합성하였다. 상이한 인산 포스포로티오에이트 골격 변형법을 이용하여 ARC1343(서열 번호 278)∼ARC1345를 각각 합성하였다[도 17 및 이하 표 22 참조]. 마지막으로, ARC1346(서열 번호 281)∼ARC1348(서열 번호 283)을 합성하여 제1 줄기, 제2 줄기, 그리고 도 17 및 이하 표 22에 나타낸 바와 같은 ARC1342의 두 줄기로부터 단일 염기 쌍이 제거되었는지 여부를 시험하였다.
Figure 112007026846805-PCT00070
Figure 112007026846805-PCT00071
상기 표 22에서 살펴 볼 수 있는 바와 같이, 앱타머 변형법의 제2 단계에서 얻어진 결과를 통하여, ARC1346(서열 번호 281)은 지금까지 생성된 고도 치환 ARC1029(서열 번호 214) 유도성 앱타머들 중 가장 유효함을 알 수 있었다. ARC1347(서열 번호 282)와 ARC1348(서열 번호 283)으로 얻어진 결과에 있어서 놀라운 사실은, 제2 줄기로부터 염기 쌍을 제거하면, 상기와 같이 고도로 변형된 서열에 있어서 묵인되지 않는다는 사실이다.
표 23과 도 17에 나타낸 바와 같이, ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304)은 앱타머 변형 과정 중 제3 단계를 통하여 합성되었다. 6번 위치에서 일어난 치환(dG→mG)은 앱타머 변형법 중 제1 단계의 시험 변이체에 있어서의 묵인성이 떨어졌으며, 6번 위치의 구아노신이 36번 위치의 시티딘과 쌍을 형성한 ARC1346(서열 번호 281)은 36번 위치가 mC→dC로 변형되어 합성되었으며, 그 결과, 이하 표 23에 나타낸 바와 같은 ARC1361(서열 번호 284)이 생성되었다. ARC1361(서열 번호 284)은 이하 표 23에 나타낸 바와 같이, ARC1362→ARC1381(서열 번호 304)로 변형되는 단일 인산 포스포로티오에이트를 도입하기 위한 염기 서열로 사용되었다.
Figure 112007026846805-PCT00072
Figure 112007026846805-PCT00073
Figure 112007026846805-PCT00074
상기 표 23에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 제3 단계에서 시험된 대부분의 변형은 유리한 효과가 거의 나타나지 않았거나 또는 아예 나타나지 않았던 반면에, mG-20과 dT-21 사이에 단일 포스포로티오에이트 변형이 일어난 ARC1368(서열 번호 291)은 근원 화합물인 ARC1172(서열 번호 222)의 친화도와 동일한(실험 오차 이내) 친화도로 인간 vWF에 결합한다.
앱타머 변형법의 제4 단계 및 제5 단계에서, 도 18에 나타낸 바와 같은 ARC1524(서열 번호 305)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317) 및 ARC1759(서열 번호 318)이 합성되었다. 도 19에 도시된 바와 같이, 폐쇄된 제1 줄기 및 개방된 제2 줄기를 보유하는 서열의 환형 치환체가 합성되었다.
이하 표 24에 나타낸 바와 같이, 상기 앱타머 중 다수는 vWF에 결합하였으나, 어느 것도 ARC1368(서열 번호 291)만큼 유효하지는 않았다. 재미있는 점은, 앱타머 변형법의 제1 단계에서 생성된 SAR과 마찬가지로, 27번 위치에서 dT가 mT로 치환된 단일 치환만을 함유하는 ARC1525는 vWF와 전혀 결합하지 않았다. ARC1525는 다수의 생물학적 검정법[추후 ARC1368(서열 번호 291)을 시험함]에서 음성 대조구(negative control)로서 사용되었다. 뿐만 아니라, 앱타머 변형법의 제3 단계로부터 얻어진 SAR 데이터와 마찬가지로, 21번 위치의 G와 22번 위치의 T 사이에 단일의 포스포로티오에이트 치환이 일어났다는 점을 제외하고는 ARC1172(서열 번호 222)와 동일한, ARC1759(서열 번호 318)는 ARC1172(서열 번호 222)에 비하여 친화도가 상당히 개선되었음을 알 수 있었다.
Figure 112007026846805-PCT00075
Figure 112007026846805-PCT00076
Figure 112007026846805-PCT00077
실시예 2F: PEG 부분의 변형된 앱타머로의 컨쥬게이트화
아민 반응성 화학 반응을 통하여 폴리에틸렌 글리콜 부분을 ARC1368(서열 번호 291) 및 ARC1172(서열 번호 222)의 5' 말단에 컨쥬게이트화시켰다. 올리고뉴클레오티드 ARC1635인 NH2-mGmCmGmUdGdCdAmGmUmGmCmCmUmUmCmGmGmCdCmG-s- dTmGdCdGdGdTmGmCdCmUdCdCmGmUdCmAmCmGmC-3T[5' 헥실아민 변형된 ARC1368(서열 번호 291)] 및 ARC1884(서열 번호 322)인 NH2- dGdGdCdGdTdGdCdAdGdTdGdCdCTdTdCdGdGdCdCdGTdGdCdGdGTdGdCdCTdCdCdGTdCdAdCdGdCdC-3T[5' 헥실아민 변형된 ARC1172(서열 번호 222)]을 화학적으로 합성하였다.
이하 표 25에 나타낸 바와 같이, 합성 후에 아민-변형 앱타머를 상이한 PEG 부분에 컨쥬게이트화시켰다.
Figure 112007026846805-PCT00078
Figure 112007026846805-PCT00079
실시예 3 : 기능성 세포 검정법
생물학적 vWF 의존적 검정법
본 실시예에서는 몇몇 생물학적 검정법을 통하여 다양한 앱타머가 vWF 기능을 차단시키는 효율에 관하여 기술하고자 한다.
하나의 검정법에서는, 보트로세틴을 사용한다. 보트로세틴은 뱀 독에서 추출한 단백질로서, 살아있는 고정 혈소판 상에 존재하는 gpIb 수용체에 폰 빌레브란트 인자가 결합하도록 유도하는 단백질인 것으로 공지되어 있다. 이 반응은 vWF 다량체화를 통해 고정 혈소판 현탁액을 응집시킨다. 혈소판이 풍부한 혈장(이하 "PRP"라 칭함)을 제조함에 있어서, vWF/보트로세틴을 응집시킨 후, 혈소판의 대사 활성화에 의해 일어나는 혈소판 응집의 제2 단계를 수행한다. 이와 같은 2개의 단계 즉, 고정 혈소판에 vWF를 결합시키는 단계와 vWF 매개성 혈소판 응집 단계는 본 발명의 앱타머의 활성을 측정하는데에 사용될 수 있다.
고정 혈소판에 결합한 vWF의 양은 vWF에 대한 항체로 측정될 수 있다. 형광단 컨쥬게이트화 2차 항체와 함께 항온 처리된 결합 항체로부터 얻어지는 형광 시그널을 검출한 후 이를 유동 세포 분석법으로 정량화한다. 혈소판에 vWF가 결합하는 것을 차단하는 본 발명의 앱타머의 능력은, 형광 시그널 감소와 상관성이 있다.
보트로세틴은 vWF의 A1 도메인이 혈소판과 전장 단백질에 결합하는 것을 유도한다. 본 발명자는 6-히스티딘-태깅 토끼 A1 도메인 vWF 정제 단백질이 동결 건조 인간 혈소판과 보트로세틴이 결합하는 것을 유도할 수 있음을 알 수 있었다. 혈소판에 토끼 A1이 결합하는지 여부는 항-폴리-His 항체와 피코에리트린 컨쥬게이트화 2차 항체를 항온 처리함으로써 측정된다. 결합 정도는 유동 세포 분석법으로 정량화될 수 있다. 토끼 A1이 인간 고정 혈소판에 결합하는 것을 차단하는 앱타머의 능력은 형광 시그널의 감소와 상관성이 있었다.
신선한 인간의 혈액으로부터 분리한 혈소판 풍부 혈장 내에서, 보트로세틴은 vWF를 통한 혈소판 응집을 유도한다. 혈소판 응집체 형성 여부는, 크로놀로그 모델 490-4D 응집 측정기상에서의 광 투과도 %의 증가 여부를 통해 광학적으로 측정될 수 있다[혈소판이 응집되면 혈장이 투명해지기 때문임]. 본 발명의 앱타머는 인간의 혈액 중에서 보트로세틴 유도 혈소판 응집("BIPA")을 억제하는 능력에 대해 분석되었다. 본 발명의 앱타머는 만일 그것이 보트로세틴 첨가 후 6분 동안 응집체가 형성되는 것을 막을 수 있다면, 활성인 것으로 간주하였다.
본 실시예의 다른 검정법(PFA-100 기구 사용)으로서는, 이 PFA-100 기구를 사용하는, 작동제에는 독립적이되 vWF에는 의존적인 검정법이 있다[Harrison외 다수, Clin. Lab. Haem., v24, p225-32 (2002)]. 혈소판이 응집되어, 콜라겐과 에피네프린 또는 ADP로 코팅된 막에 존재하는 미세한 구멍을 통하여 구연산염 처리된 전혈(citrated whole blood)이 흐르는 것을 막는데에 필요한 시간을 기록함으로써, PFA-100은 생체 내 고 전단력이 가하여지는 조건 하에서 혈소판 마개가 형성되는 과정을 모의한다. 미세한 구멍을 통하여 혈액을 채취할 때에 유도되는 전단력으로 인해, 고 분자량의 vWF 다량체가 막 상에 고정되어 있는 콜라겐에 결합한 후 혈소판과 결합하여 이를 활성화시키는 것과 같은, 활성은 폰 빌레브란트 인자에 의존적이다. 그러므로 본 검정법은 vWF 의존적이라는 점에서 BIPA 및 FACS 검정법에 비하여 유리하지는 않지만, 이 방법은 vWF 작동제인 보트로세틴을 첨가할 필요가 없고 혈소판이 풍부한 혈장을 사용하는 대신에 전혈을 사용할 수 있다는 몇몇 이점을 갖는다.
본 실시예의 다른 검정법은 혈소판 응집을 유도하는 ADP를 사용하였다. 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)의 응집은 다수의 방식으로 유도될 수 있다. 뱀 독 단백질인 보트로세틴은 전술한 바와 같이 vWF에 대해 작용하여, 이것과 혈소판 수용체 gpIb와의 상호 작용을 안정화시키고, 그 결과 혈소판 응집을 유도한다. vWF가 gpIb에 결합하는 것은 혈소판 응집의 초기 단계에서 이루어지는 것이므로, 응집 과정 중 하류 성분(downstream component)을 차단하는 억제제[즉, IIbIIIa 길항제 인테그렐린™(Integrelin™) 및 레오프로™(ReoPro™)]는 보트로세틴 유도성 혈소판 응집을 막아줄 것이라고 예상된다. 그러나, 혈소판에 직접 작용하고 응집을 유도하는 작동제(예를 들어, ADP)의 경우, 작동제의 길항제 상류(antagonist upstream)는 비효율적인 반면에(예를 들어, 항-vWF 앱타머), 혈소판에 직접 작용하는 길항제(IIbIIIa 길항제)는 효능을 그대로 보유할 것으로 예상된다. IIbIIIa 길항제에 비하여 vWF 길항제의 특이성은 처리에 따른 출혈 시간을 단축함에 따라서 항-vWF 길항제의 안전성을 증가시킬 것이다. 협착 경동맥 내 죽상 경화성 플라크(atherosclerotic plaque)를 가지고 있는 환자에 있어서는, 혈소판이 이 플라크 표면상에 존재하는 콜라겐 고정 vWF와 결합함에 따라서 혈소판이 응집된다. 그러므로, vWF/gpIb 상호 작용을 억제하고 IIbIIIa 수용체가 피브린에 결합하는 것을 차단하면, 혈소판 응집을 막을 것이다. vWF를 표적화함으로써 부여되는 생물학적 특이성의 경우에서는 항-IIbIIIa 처리를 통해 부여되는 생물학적 특이성의 경우와는 달리, 혈소판 자체가 직접적으로 표적화되지 않으며, 이는 곧 상기 혈소판이 다른 수단에 의해 활성화될 수 있다는 것을 확증하는 것이고, 또한 항-혈소판 치료법과 관련된 잠재적 출혈로 인한 합병증을 줄여줄 수 있다는 것을 보증하는 것이다.
다음의 재료들은 이하 기술된 실시예 3A ∼ 3D에서 사용된 것들이다: 인간 폰 빌레브란트 인자(vWF)(서열 번호 7), 및 소 혈청 알부민은 칼바이오켐사社(Calbiochem)(캘리포니아주 라 졸라 소재)로부터 구입하였으며(Cat# 681300 및 #126593); 도메인 A1 토끼 vWF(서열 번호 6)은 표준적인 방법과 조건을 이용하여 발현 및 정제하였다. 동결 건조된 인간 혈소판(P/N 299-2), 큐베트(P/N 312), 교반 막대(P/N 311), 혈소판 응집 측정기(모델 490-4D), 그리고 AGGRO/LINK 소프트웨어는 크로놀로그(펜실베니아주 하버튼 소재)로부터 구입하였다. 보트로세틴(12201-100U-B)은 펜타팜(Pentapharm; 스위스 바젤 소재)에 의해 제조되었다. 신선한 혈액은 건강하고 비 스테로이드성 항염증 약물("NSAID")을 복용하지 않은 공여자로부터 얻었으며, 이 혈액은 5㎖들이 0.105 M 구연산나트륨 진공 시험관(Cat# 369714)(Becton Dickinson-뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)에 채혈하여 담아두었다. 생리 식염수는 알돈(Aldon)(Cat # 9420306)(뉴욕 아본 소재)에 의해 제조되었으며, 인산염 완충 염수(Cat # 21-040-CV)는 셀그로(Cellgro; 버지니아 헌돈 소재)로부터 구입하였다. 유동 세포 분석 실험은 BD 바이오사이언스 FACSCAN 기계 상에서 수행하였으며, 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(캘리포니아주 산 호세 소재)로 분석하였다. 항-폰 빌레브란트 인자 마우스 모노클로날 항체(Cat# GTI-V1A)는 GTI(위스콘신 워케셔 소재)로부터 구입하였다. 펜타-HIS-바이이오틴 컨쥬게이트 모노클로날 항체(Cat# 34440)는 퀴아젠(Qiagen; 독일 소재)으로부터 구입하였다. 항-마우스 IgG2a-FITC 컨쥬게이트(Cat# 553390)는 BD 바이오사이언시스(캘리포니아 샌 디에고 소재)로부터 구입하였다. 항-마우스 IgG-PE 컨쥬게이트 항체(Cat# 715-116-150)는 잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories; 펜실베니아 웨스트 그로브 소재)로부터 구입하였다.
실시예 3A: 전장 인간 폰 빌레브란트 인자 혈소판 결합 검정법
동결 건조된 혈소판에 인간 vWF가 결합하는 것을 막는 앱타머의 효능을 유동 세포 분석법으로 평가하였다. 실온에서 부피 50 uL의 FACS 완충액(PBS + 0.5% 소 혈청 알부민) 중 전장 인간 vWF 5 nM로써 간단하게 예비 항온 처리하여 앱타머 적정(0 nM, 0.1∼1000 nM)을 수행하였다. FACS 완충액 중 동결 건조된 혈소판 5 uL와 0.1 U/uL의 보트로세틴 1 uL을 함유하는 완충액 50 uL를 앱타머/vWF에 더 넣었다. FACS 완충액 200 uL를 첨가하여 이 반응을 37℃에서 15분 동안 진행시켰다. 1470 RCF에서 6분 동안 회전시켜 혈소판을 수집하고, 상청액은 폐기하였다. 이 펠렛을 항-vWF 항체의 1:100 희석액을 함유하는 FACS 완충액 100 uL에 재현탁시키고, 이를 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 200 uL의 FACS 완충액으로 희석시킨 후, 혈소판을 1470 RCF에서 6분 동안 회전시킨 후, 상청액은 폐기하였다. 펠렛을 항-IgG2a-FITC 항체의 1:100 용액 중에 재현탁시키고, 이를 실온의 암실에서 30분 동안 항온 처리하였다. 전체 100 uL를 200 uL의 FACS 완충액으로 희석시키고, FACSCAN으로 유동 세포 분석을 수행하여 그 즉시 분석하였다. 단일의 응집된 혈소판 군집 주위에 게이트를 내어, 오염 파편으로부터 얻어진 인위적 데이터를 분석에서 제외하였다. 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity; "MFI") 판독 결과를 유동 세포 분석법에 의해 분석된 각각의 시료에 대해 정량화하였다. 데이터가 얻어진 모든 지점으로부터 백그라운드 MFI(background MFI)를 공제하였다. 앱타머 부재하에 전장 인간 vWF가 혈소판과 결합하는 % 값에 대하여, 앱타머가 소정의 농도로 존재할 때 전장 인간 vWF가 혈소판과 결합하는 % 값을 계산하여 억제 %를 기록하였다(도 7 참조). 혈소판에 vWF가 결합하는 것을 억제하는 %(앱타머 농도에 대한 함수)를 다음과 같은 등식에 적용시켜 IC5O 값을 계산하였다:
억제 % = 최대 억제 % /(1+IC50/앱타머 농도)
보트로세틴 유도성 vWF 결합에 대한 특성 규명 결과를 이하 표 26에 나타내었다.
실시예 3B: 토끼 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 혈소판 결합 검정법
토끼 vWF 도메인 A1이 동결 건조된 혈소판에 결합하는 것을 차단하는 본 발명의 앱타머가의 능력도 유동 세포 분석법으로 평가하였다. 실온에서 부피 50 uL의 FACS 완충액(PBS + 0.5% 소 혈청 알부민) 중 토끼 A1 vWF 4 nM로써 간단하게 예비 항온 처리하여 앱타머 적정(0 nM, 0.1∼1000 nM)을 수행하였다. FACS 완충액 중 동결 건조된 혈소판 5 uL와 0.1 U/uL의 보트로세틴 1 uL을 함유하는 완충액 50 uL를 앱타머/vWF에 더 넣었다. FACS 완충액 200 uL를 첨가하여 이 반응을 37℃에서 15분 동안 진행시켰다. 1470 RCF에서 6분 동안 회전시켜 혈소판을 수집하고, 상청액은 폐기하였다. 이 펠렛을 항-Penta-HIS-바이오틴 컨쥬게이트 항체의 1:200 희석액을 함유하는 FACS 완충액 100 uL 중에 재현탁시키고, 이를 실온에서 30분 동안 항온 처리하였다. 200 uL의 FACS 완충액으로 희석시킨 후, 혈소판을 1470 RCF에서 6분 동안 회전시키고, 상청액은 폐기하였다. 이 펠렛을 항-IgG-PE 항체의 1:100 용액 중에 재현탁시키고, 이를 실온의 암실에서 30분 동안 항온 처리하였다. 전체 100 uL를 200 uL의 FACS 완충액으로 희석시키고, FACSCAN으로 유동 세포 분석을 수행하여 분석하였다. 단일의 응집된 혈소판 군집 주위에 게이트를 내고, 10,000회 실험을 수행하여 데이터를 수집하여, 오염 파편으로부터 얻어진 인위적 데이터는 분석에서 제외하였다. 중앙 형광 강도(median fluorescent intensity; "MedFI") 판독 결과[상기 실시예 3A에 기술된 MFI 판독 결과와 일반적으로 균등한 것으로서, 비교용임]를 유동 세포 분석법에 의해 분석된 각각의 시료에 대해 정량화하였다. 데이터가 얻어진 모든 지점으로부터 백그라운드 MedFI(background MedFI)를 공제하였다. 앱타머 부재하에 전장 인간 vWF가 혈소판과 결합하는 % 값에 대하여, 앱타머가 소정의 농도로 존재할 때 전장 인간 vWF가 혈소판과 결합하는 % 값을 계산하여 억제 %를 기록하였다(도 7 참조). 혈소판에 vWF가 결합하는 것을 억제하는 %(앱타머 농도에 대한 함수)를 다음과 같은 등식에 적용시켜 IC5O 값을 계산하였다:
억제 % = 최대 억제 % /(1+IC50/앱타머 농도)
보트로세틴 유도성 토끼 A1 vWF 결합에 대한 특성 규명 결과를 이하 표 26에 나타내었다.
Figure 112007026846805-PCT00080
Figure 112007026846805-PCT00081
Figure 112007026846805-PCT00082
실시예 3C: 보트로세틴 유도성 혈소판 응집 억제( BIPA 검정법)
살아있는 인간의 혈소판에 대한 앱타머의 활성을 측정하기 위하여, 혈소판이 풍부한 혈장을 갓 준비하고, 이를 사용하여 BIPA 검정법을 수행하였다. 5일 이상의 기간 동안 NSAIDS를 섭취하지 않은 건강한 공여자(사람)로부터 채혈하였다. 벡톤 디킨슨社의 213/4 게이지의 나비형 바늘(butterfly needle)(Cat# 367287)을 사용하여 혈액을 0.105 M의 구연산나트륨이 들어있는 진공 채혈관에 넣었다. 수집된 혈액을 15 ㎖ 들이 원추형 튜브 내에 넣고, 이를 200 g에서 20분 동안 회전시켰다. 이 튜브로부터 탁하고 황색을 띠며 혈소판이 풍부한 혈장 층("PRP")을 빼낸 후, 이를 풀링시켜, 실온에 놓아두었다. 나머지 혈액은 2500 g에서 10분 동안 회전시켰다. 혈장의 투명한 층(혈소판이 거의 존재하지 않는 혈장(platelet poor plasma)이라고 알려짐; "PPP")을 꺼내어, 이를 실온에 놓아두었다. PRP를 교반 막대가 있는 부피 470 uL 들이 큐벳에 분취하였다. PPP 시료 500 uL을 큐벳에 분취하여 넣고, 이를 혈소판 응집 측정기의 PPP 참조용 셀에 넣었다. PRP 시료를 혈소판 응집 측정기 내에서 37℃로 3∼5분 동안 예열한 후, 이를 BIPA 검정법에 사용하였다. 우선, 각각의 개별 공여자에 대하여 혈소판을 응집시키는데에 필요한 보트로세틴 농도를 적정법으로 측정하였다. 이 보트로세틴 농도는 추후 실험에도 적용되는 농도이다. 그 다음으로, 1분 동안 예열한 PRP에 앱타머를 적정하여 첨가한 후(0, 1∼1000 nM), 보트로세틴을 첨가하여 앱타머 분석을 수행하였다. 혈소판이 응집되자, 광 투과도가 증가함을 알 수 있었다(도 8). 6분 경과 후 혈소판 응집이 90% 이상 차단되는 농도를 표 26의 마지막 컬럼에 나타냈다. Aggro/LINK 소프트웨어를 사용하여 응집 측정기의 측정 결과로부터 곡선 아랫부분의 표면적("AUC")을 계산할 수 있으며, 이를 사용하여 보트로세틴 유도성 혈소판 응집에 있어서 소정 농도의 앱타머가 억제되는 %를 계산하였다[도 9 참조, 앱타머 ARC1029(서열 번호 214)].
실시예 3D: 일련의 생물학적 검정법에 있어서 선별된 변형 앱타머의 생물학적 활성
상기 실시예 2에 기술된 바와 같이, 의약 화학적 변형 방법에서 확인된 ARC1 172(서열 번호 222), ARC1346(서열 번호 281), ARC1368(서열 번호 291), ARC1525 (음성 대조구), ARC1779(서열 번호 320), ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1885(서열 번호 323)을 일련의 생물학적 검정법에서 시험하였다. 본 검정법은 FACS(실시예 3A 및 3B에 기술) 및 BIPA 검정법(실시예 3C에 기술), 그리고 혈소판 PFA-100 검정법(이하 기술)을 포함한다.
재료:
혈소판 기능 분석기(PFA)를 사용하는 검정법에서는 다음과 같은 재료들이 사용된다:
신선한 전혈은 건강하고 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)을 섭취하지 않은 공여자로부터 213/4 게이지의 나비형 바늘(Cat#367287, Becton Dickenson)로 채혈하여, 구연산나트륨 0.105 M을 함유하는 5 ㎖ 들이 튜브(Cat#369714, Becton Dickenson)에 넣었다. 건강하고 비-스테로이드성 항-염증 약물(NSAID)을 섭취하지 않은 짧은 꼬리 원숭이(cynomolgus macaques) 공여체로부터 신선한 전혈을 채혈하였다. 앱타머를 첨가물이 들어있지 않은 진공 채혈관(Cat#366434, Becton Dickenson) 내에서 알돈社의 생리 식염수(Cat#9420306)로 희석하였다. 시료를 PFA-100 기계(Dade Behring)에 사용되는 콜라겐/에피네프린 시험용 카트리지(Cat#B4170-2 OA, Dade Behring)상에 로딩하였다. 유발 용액(trigger solution)(Cat#B4170-50, Dade Behring)을 사용하여 자가-테스트를 실시하였으며, 이로써 시험 카트리지를 예비 습윤(pre-wet)시켰다. O-링 청결 패드(O-ring cleaning pads)(Cat#B4170-73, Dade Behring)를 사용하여 O-링 세척 과정에서 자가-테스트를 수행하였다.
PFA 검정법:
O-링 세척 과정에 포함된 자가-테스트(self-test)는 항상 PFA-100 기계에서 수행되는 과정으로서, 이 기계가 정확하게 작동하는지 여부를 확인하기 위해서 임의의 시료를 분석하기 이전에 수행되는 과정이다.
이하 표 27에 기술된 바와 같이, 3일 이상 NSAID를 섭취하지 않은 건강한 공여자(사람) 또는 짧은 꼬리 원숭이로부터 신선한 전혈을 채취하였다. 공여자(사람)로부터 채취한 혈액을 213/4 게이지의 나비형 바늘이 장착된, 0.105 M의 구연산나트륨을 함유하는 5㎖ 들이 튜브에 수집하고, 이 튜브를 천천히 3회 뒤집었다 세웠다 하여 구연산나트륨과 혈액이 잘 섞이도록 하였다. 전반적인 실험 과정 중에서, 전혈 튜브를 5분 마다 뒤집었다 세웠다 하여 시료가 침전되는 것을 막았다.
전혈 내에서 앱타머의 적정량을 검정하기 위해, 앱타머를 첨가물이 담겨있지 않은 진공 채혈관에 넣고, 생리 식염수를 사용하여 이를 목적 농도(예를 들어, O nM, 1∼100O nM)로 희석하여, 최종 부피가 60 ㎕가 되도록 만들었다. PFA-100으로 다음 시료 세트를 분석할 준비를 맞추었을 때, 전혈 1940 ㎕를 일정 농도의 앱타머가 담겨져 있는 튜브에 첨가하였다. 이 튜브를 천천히 3회 뒤집었다 세웠다 하여 앱타머와 혈액이 잘 섞이게 하였다. 시료를 2개로 나누어 PFA-100 기계에서 분석하였다. 이 혈액 혼합물 800 ㎕를 콜라겐/에피네프린 시험용 카트리지 상에 로딩하였다. 이 시험 카트리지를 PFA-100 기계에 장착하였다. 구멍이 폐색되는 시간을 PFA-100으로 측정하였으며, 이때 최대 300 초가 걸렸다. 이 검정법을 통하여, IC95는 폐색 시간을 300초까지 연장시키는 앱타머의 최소 농도에서의 흡광도임을 알 수 있었다.
도 20은 응혈 시간[ARC1368(서열 번호 291) 및 음성 대조구 ARC1525에 대한 PFA-100 검정법에서의 앱타머 농도에 관한 함수]을 도시하는 것이다. FACS, BIPA 및 PFA-100 검정 결과를 추가로 이하 표 27에 나타내었다.
FACS, BIPA 및 PFA-100 결과
ARC번호 FACS IC50 vs 인간 전장 vWF (nM) FACS IC50 vs 토끼 A1 도메인 (nM) 인간 혈소판이 풍부한 혈장을 이용하는 ~IC50 BIPA (nM) 구연산염 처리된 인간 전혈을 이용하는 ~IC50 PFA-100 (nM) 구연산염 처리된 짧은 꼬리 원숭이의 전혈을 이용하는 ~IC50 PFA-100 (nM)
ARC1172 (서열번호 222) 2 2 ~200 ~100 ND
ARC1346 50 180 > 1000 ND ND
ARC1368 2 4.0 ~200 ~100 ~100
ARC1525 ND ND 억제하지 않음 억제하지 않음 ND
ARC1779 ND ND ~100 ~100 ND
ARC1780 ND ND ~100 ~100 ND
ARC1885 ND ND ~50 ~100 ND
예상한 대로, 상기 실시예 2에 기술된 결합 검정법에서 vWF에 대한 앱타머의 친화도 관측치와 생물학적 검정법에서의 이 vWF에 대한 앱타머의 상대적 효능 사이에는 강한 상관 관계가 있었다. 비-결합형 음성 대조구 ARC1525는 그것이 시험된 임의의 검정법에서 활성을 나타내지 않았다.
실시예 3E: BIPA , PFA -100 및 AIPA 검정법에서의 ARC1368 , 인테그릴린 ™ 및 레오프로™
ARC1368(서열 번호 291), 인테그릴린™ 및 레오프로™의 효능을, PFA-100의 인간 전혈, BIPA(실시예 3D 및 3C에 각각 기술됨) 및 ADP 유도성 혈소판 응집(AIPA) 검정법의 인간 PRP에 대해서 평가하였다. 인간 PRP를 사용하여 상기 실시예 3C에 기술되어 있는 BIPA와 동일하게 AIPA를 실시하되, 다만, 보트로세틴을 첨가하는 대신에 10 마이크로몰의 ADP(크로놀로그: 펜실베니아 하버튼 소재)를 첨가하여 혈소판 응집을 유도하였다. PFA-100 결과를 도 21에 도시하였다. BIPA 결과는 도 22에 나타내었다. AIPA 결과는 도 23에 도시하였다. 도 21 및 22에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, ARC1368(서열 번호 291)은 PFA-100과 BIPA 검정법에서 레오프로™가 나타내는 효능과 거의 동일한 효능을 나타냈다. 전술한 vWF 의존성 기작과 마찬가지로, 항-vWF 앱타머는 AIPA를 차단하는 능력을 갖지 않았으며, 반면에 IIbIIIa 길항제는 이 검정법에서 도 23에 나타낸 바와 같은 효능을 나타냈다.
실시예 4: 약물 동력학적 연구
실시예 4 및 5에서, 질량계 농도 데이터는 모두 PEG 컨쥬게이트화에 의해 부여되는 질량과는 상관없이 앱타머의 올리고뉴클레오티드 부분의 분자량만을 의미하는 것이다.
실시예 4A: 인간 및 래트 혈장 중 항- vWF 앱타머의 안정성
ARC1172(서열 번호 222), ARC1346(서열 번호 281), ARC1368(서열 번호 291) 및 ARC1533을 인간 및 래트의 혈장 중 뉴클레아제 안정성에 대하여 검정하였다. 이하에 기술된 바와 같이, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 혈장 뉴클레아제 분해 여부를 측정하였다. 간단히 요약하면, 혈장 안정성을 측정하기 위하여, 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법으로 γ-32P ATP로 5'-말단이 표지화된 화학 합성 앱타머를 정제한 후, 다시 겔 정제하였다. 200 ㎕의 결합 반응액 중 95%의 인간 또는 래트 혈장 중에 100 nM 존재하는 표지화되지 않은 앱타머의 존재하에 미량의 32P 표지화된 앱타머를 항온 처리하였다. 동일한 성분[단, 혈장 대신 PBS 사용]을 사용하여 0시인 시점에서 반응을 별도 진행시켰다. 이로써 겔 상에 부하된 방사능과 양은 실험 간에 일치함을 알 수 있었다. 달리 특정하지 않는 한, 반응물을 37℃의 열 순환 반응기에서 1 시간, 3 시간, 10 시간, 30 시간 및 100 시간 동안 항온 처리하였다. 매 시점마다, 20 마이크로몰의 반응물을 분리하여, 이를 200 ㎕의 포름아미드 로딩 염료와 합하고, 액체 질소 중에서 급속 동결(flash frozen)시켜 이를 -20℃에 보관하였다. 마지막 시점에서 반응물을 취한 이후에는, 동결 시료들을 해동시키고, 각 시점에서의 반응물을 20 마이크로몰 씩 분리하였다. 이후 SDS를 소량의 시료에 최종 농도 0.1%가 되도록 첨가하였다. 이후 이 시료를 90℃에서 10∼15분 동안 항온 처리하고, 이를 15% 변성 PAGE 겔 상에 직접 로딩하여 35분 동안 12 W에서 전개시켰다. 겔 상에서 관찰되는 방사능은 스톰(Storm) 860 포스포로이미저 시스템을 사용하여 정량화하였다. 각 시점에서의 전장 앱타머 %는 전장 앱타머 밴드를 정량화하고 이를 래인 당 총 계수(count)로 나누어서 측정하였다. 이후 각 시점에서의 전장 앱타머 분율을 0시인 시점에서의 전장 앱타머 %로 정규화하였다. 시간의 함수인 전장 앱타머 분율은 다음의 등식을 적용하여 계산하였다:
m1*e^(-m2*m0)
[식 중, m1은 전장 앱타머의 최대 %이고(m1 = 100); m2는 분해율임]
앱타머의 반감기(T1 /2)는 (ln2)/m2이다.
인간 혈장에 대한 시료 데이터를 도 24에 나타내고, 시험된 앱타머에 관한 결과를 표 28에 요약하였다. 예상과 같이, 앱타머는 래트의 혈장에서보다 인간의 혈장에서 더욱 안정적이었으며, 2'-OMe 변형 수는 혈장내 안정성이 증가함에 따라서 증가하였다.
앱타머 혈장 안정성 반감기
ARC번호 인간 혈장의 T1 /2 (시간) 래트 혈장의 T1 /2 (시간)
ARC1172 (서열 번호 222) 17 3
ARC1346 수행하지 않음 19
ARC1368 63 21
ARC1533 93 수행하지 않음
실시예 4B: 짧은 꼬리 원숭이 내 ARC1368 의 PEG 화 유도체의 PK / PD
ARC1368(서열 번호 291), ARC1779(서열 번호 320) 및 ARC1780(서열 번호 321)[상기 실시예 2에 기술]을 3 ㎎/㎏의 투여량으로 짧은 꼬리 원숭이(그룹당 3마리)에 정맥 내 주사하였는데, 여기서 상기 투여량은 순간 혈장 농도를 3uM으로 만드는 것으로 예상되는 양으로서, 추정 유효량보다 약 30배 더 많은 양이다. 이후, 구연산염 처리된 혈액 시료를 정기적으로 수집하고, 이로부터 혈장을 추출하였다.
앱타머가 생체 내에서 약리학적으로 활성임을 입증하기 위하여, 앱타머를 (혈장의 최대 추정 농도만큼) 투여한 후 5분 동안 보트로세틴-유도성 혈소판 응집법(BIPA)을 수행하였다. 이때, 모든 동물에 있어서 BIPA 억제가 종결되었는데, 이는 곧, 앱타머가 생체 내 기능성임을 입증하는 것이다.
이후, 올리그린 검정법[Gray외 다수, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 7 (3):133-140 (1997)]을 이용하여 혈장 내 앱타머 농도를 측정하였다. 그 다음, WinNonlin 프로그램을 사용하여 이 데이터를 분석한 결과, 이하 표 29∼31에 나열된 바와 같은 약물 동력학적 매개 변수를 얻었다.
뿐만 아니라, 영장류의 혈장 앱타머 농도를 시간에 대한 함수로 나타내었다[도 25의 그래프 참조]. 올리그린™(OliGreen™) 검정 결과를 바탕으로 한 평균 농도-시간 프로필을 통하여, ARC1368(서열 번호 291), ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1779(서열 번호 320)의 약물 동력학적 프로필은 주로 단상(monophasic)임을 알 수 있었다. PEG화되지 않은 앱타머(ARC1368(서열 번호 291))은 ARC1779(서열 번호 320) 및 ARC1780(서열 번호 321)에 비하여 한곳에 집중되어 분포하였다. ARC1368(서열 번호 291)와는 달리, 40 kDa의 PEG 컨쥬게이트 ARC1780(서열 번호 321)은 ARC1779(서열 번호 320)에 비하여 널리 퍼져 고르게 분포하였다. ARC1779(20 kDa PEG)는 α-반감기 약 2 시간 간격으로 분포하였다.
Figure 112007026846805-PCT00083
Figure 112007026846805-PCT00084
Figure 112007026846805-PCT00085
올리그린 검정 분석법 수행 후, 유효 HPLC-계 검정법을 이용하여 ARC1779(서열 번호 320)가 투여된 동물에 대해서 혈장 앱타머 농도를 측정하였다. 비 구획 분석법(noncompartmental analysis) 및 2-구획 분석법(2-compartment analysis)(WinNonlin 프로그램을 사용)을 통하여 HPLC 데이터를 분석하였다. 보다 민감한 HPLC법으로 원숭이 시료를 다시 분석한 결과, ARC1779(서열 번호 320)의 농도-시간 프로필이 이중 상[분배상 및 소멸상]임을 알 수 있었다. 올리그린 검정법으로 관찰한 결과와 마찬가지로, HPLC를 바탕으로 한 결과를 통하여, ARC1779(서열 번호 320)에 대한 분배 반감기(distribution half-life)(t1 /2α)는 1.4 시간이며, 소멸 반감기(elimination half-life)(t1 /2β)는 12.9임을 알 수 있었다.
실시예 4C: 짧은 꼬리 원숭이에서 ARC1779 의 PK / PD
환약을 0.5 ㎎/㎏만큼 1회 정맥 내(IV) 투여한 후, ARC1779의 -PK/PD 상관 관계를 3마리의 짧은 꼬리 원숭이에 대해 평가하였다. 혈장 내 ARC1779 수치는 혈소판 기능을 억제하거나 또는 피부 출혈 시간(CBT)을 연장함에 있어서 ARC1779의 PD상 효능과 상관성이 있었다.
IV 투여 이후, PK 및 PD 분석을 위해 혈액을 앱타머 투여 후 다양한 시점에서 피부를 경유하여 수집하였다. ARC1779가 혈소판 기능에 미치는 PD 효능은 PFA-100 검정법으로 측정하였으며, 출혈에 미치는 ARC1779의 효능은 CBT 시간으로 측정하였다. 뿐만 아니라, 혈장 시료는 ARC1779 수치를 정량화하기 위해 HPLC로 분석하였다. PK 매개 변수 측정치는 2-분획 분석법으로 측정하였다. 그 결과를 도 26에 나타내었다.
각각의 원숭이로부터 얻어진 농도-시간 프로필을 통하여, ARC1779 약물 동력학적 주요 분배 상태를 알 수 있었다. 분배 반감기(t1 /2α)는 약 1 시간인 것으로 측정되었다. 소멸 반감기(t1 /2β)는 얻어진 데이터를 통해서는 정확히 파악되지 않았다.
PFA-100 검정법에 의해 측정된 혈소판 응집에 대한 ARC1779의 PD 효능을 도 26에 나타내었다. ARC1779의 혈장 내 농도가 300 nM을 초과할 때, PFA-100 기기로 평가되는 바와 같이, 혈소판 기능은 억제되었다. 그러나, 혈장 앱타머 농도가 약 77 nM로 감소하면, 혈소판 기능은 정상으로 회복되었다.
도 26에 나타낸 바와 같이, 본 연구에서 ARC1779가 출혈 시간 연장에 미치는 PD 효능은 최소임을 알 수 있었다.
이상을 요약하면, ARC1779는 혈장내 농도 약 300 nM로 생체 내 혈소판 기능을 억제하였다. 이와 같은 생체 내 농도는 시험관 내 혈소판 기능을 억제하는데에 필요한 앱타머의 측정 농도보다 3배 정도 높았다. 이와 반대로, 고 혈장 농도(1000 nM)에서, ARC1779는 이의 환약을 1회 투여한 이후에 있어서 피부 출혈 시간에 대한 효능은 최소였다.
실시예 5: 기능성 동물 검정법
본원에 기술된 실시예 4 및 5에 있어서, 질량계 농도 데이터는 모두, PEG 컨쥬게이트화에 의해 부여된 질량과는 상관 없이, 앱타머의 올리고뉴클레오티드 부분의 분자량만을 의미하는 것이다.
실시예 5A: 짧은 꼬리 원숭이에 있어서 ARC1779 에 대한 약동학
짧은 꼬리 원숭이(C.marcaques)에 ARC1779(서열 번호 320) 0.5 ㎎/㎏을 IV 환약 투여하였다. PFA-100 폐색 시간, BIPA 및 피부 출혈 시간("CBT")을 모두 연구 전반에 걸쳐 시간의 함수로 측정하였다. BIPA와 PFA-100 폐색 시간을 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 측정하였다. 이하에 기술된 바와 같이, 표준적 프로토콜에 따라서 피부 출혈 시간을 측정하였다.
테스트를 위해서 혈압 측정용 커프를 전박 이두근 부위에 착용하고, 압력이 40 mmHg로 일정하게 유지되도록 이를 팽창시켰다. 서지컷®(Surgicutt®) 자동화 절개 장치(ITC; 뉴저지주 에디슨 소재)를 사용하여, 전주 주름에서 멀리 떨어져 있는 전박의 손바닥 표면의 측면을 세로로 절개하였다. 절개함과 동시에 그때의 시간을 스톱 워치로 측정하였다. 절개 후 15∼30초 경과시, 서지컷® 출혈 시간 압지(Bleeding Time Blotting Paper)(ITC; 뉴저지주 에디슨 소재)에 혈액이 베어 나도록 만들어, 절개부가 직접 접촉하는 것을 피하였다. 15∼30초마다 상기 압지를 바꾸어 주어, 새 종이 위에 다시 블럿팅하였다. 혈액이 더 이상 종이에 베어 나지 않을 때까지, 아니면 30분 동안 상기 블럿팅 과정을 반복하였다. 혈액이 더 이상 종이에 베어 나지 않게 되었을 때로부터 30초 이내에 출혈 시간을 측정하였다.
도 27의 표는 3마리의 상이한 동물에 투여한 ARC1779(서열 번호 320)에 대한, 피부 출혈 시간(분)을 비롯하여 다양한 시점(첫 번째 컬럼)에서의 BIPA IC90(nM) 및 PFA IC95(nM)을 나타내는 것이다. 도 28은 투여 후 다양한 시점에서 ARC1779(서열 번호 320)를 투여한 3마리의 짧은 꼬리 원숭이 혈액의 평균 PFA-100 폐색 시간을 그래프로 나타낸 것이다. 도 29는 투여 후 다양한 시점에서 ARC1779(서열 번호 320)를 처리한 3마리의 짧은 꼬리 원숭이의 피부 출혈 시간을 그래프로 나타낸 것이다. 도 30은 PFA-100 폐색 시간(우측 세로 축)이 ARC1779(서열 번호 320)를 처리한 짧은 꼬리 원숭이(좌측 세로 축)에서의 평균 피부 출혈 시간과 상관 관계가 있음을 나타내는 것이다. 도 27∼도 30에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 2 시간 이하의 시점 즉, BIPA 및 PFA-100 폐색 시간이 최대한으로 억제되는 시점에 있어서, 피부 출혈 시간은 아주 약간 증가하였다. 세포 외 혈소판 응집을 유사하게 억제하는 농도로 항-gpIIbIIIa 길항제인 인테그릴린™을 투여하였을 때, 주형 또는 피부 출혈 시간은 20∼30분이었다. 예를 들어, 문헌[Phillips, D.R. 및 Scarborough, R.M., Am J Cardiol, 80(4A): 11B-20B (1997)]을 참조하시오. 어떠한 특정 이론에도 국한되지 않고, 상기 데이터는 가설 즉, 혈소판 기능을 억제하지 않고 또한 그로 인하여 피부 출혈 시간을 증가시키지 않고 혈관 손상 위치에 고정된 vWF에 혈소판이 결합하는 것을 억제함으로써, 항-vWF A1 도메인 앱타머 길항제가 생체 내 혈소판 활성을 억제할 것이라는 가설과 일치하였으며, 또한 이 가설을 뒷받침하였다.
실시예 5B: 짧은 꼬리 원숭이 전리 혈전증 모델에 있어서 ARC1779 의 평가
널리 입증된 인간 이외 영장류 전리 혈전증 모델을 통해서, ARC1779(서열 번호 320)가 동맥 내 혈전증을 억제하는 효능을 시험하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 예를 들어, 문헌[Rote외 다수, Stroke, 1994: 25, 1223-1233]을 참조하시오. 13 마리의 짧은 꼬리 원숭이를 4개의 군으로 나누고, 이하 표 30에 나타낸 바와 같은 방식으로 처리하였다.
전리 혈전증 연구 디자인
군 번호 동물 수 시험 약품 투여량 (㎎/㎏) 투여 방식 투여 부피 해부일
1 3 비이클 (염수) 제3 군에 대한 DVE 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일) ≤ 10 ㎖ 제0 일
2 1 레오프로™ (키메라 7E3) 0.25 ㎎/㎏ 전기 손상 개시 약 15분 전 (제0일에 1회) IV 환약 투여
3 5 ARC1779 환약 0.61 ㎎/㎏ + 0.0037 ㎎/㎏/분 주입 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일)
4 4 레오프로™ (키메라 7E3) 환약 0.25 ㎎/㎏ + 0.125 ㎍/㎏/분 주입 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일)
DVE = 투여 부피 당량; IV = 정맥 내
해부 전에 각 동물을 마취시키고, 각 동물에 관을 삽입하여 마취 상태를 유지시켰다[이소플루란 흡입 마취제 사용, 부피-조절 인공 호흡 장치를 통해 전달]. 정맥내 카테터도 말초 정맥에 꽂아 해부 중 유산염 처리된 링거 용액을 투여하였다.
동맥 혈압을 연속적으로 관찰하기 위해서 각 동물의 대퇴 동맥에 카테터를 꽂았다. 이와 유사하게, 혈액 시료를 채취하기 위해 대퇴 동맥에 카테터를 꽂았다. 각 경동맥에 유량계와 연결된 도플러 유량 프로브(Doppler flow probe)를 꽂았다. 동맥 내 전극이 삽입되어 협착이 일어난 부위 가까이에 존재하는 동맥 주위에 상기 유량 프로브를 두었다. 협착은 각각의 경동맥 주위에서 일어났으며, 평균 혈류에는 영향을 주지않고 그 혈류를 약 50∼60% 까지 감소시켰다. 경동맥 내 혈류를 관찰하고 관찰 기간 내내 이를 기록하였다.
경동맥 혈관 내에 전극을 꽂아줌으로써 각 경동맥 내막 표면에 전기적 손상을 가하였다. 각 전극을 정전류 장치의 양극과, 피하 부위에서 멀리 떨어져 있는 캐소드에 연결시켰다. 폐색이 종결된 후 3 시간 동안 아니면 30분 동안(상기 두 기간보다 짧은 기간 동안), 각 혈관에 직류를 인가하였다.
전극이 우측 경동맥("RCA") 상에 배치되면, 상기 표 32에 나열한 시험 약물을 동물에 투여하였다. 시험 약물을 투여하고 나서 약 15분 경과시, 전류를 100 μA로 인가하였다. 도 31에 도시한 혈액 시료 수집 스케쥴 중 지정된 시점에서 혈액 시료와 이의 CBT 측정치를 수집하였다. 혈류 시그널이 0 혈류[특정 위치에 폐색성 혈전이 발견되는 시점]일 때 안정하게 유지되도록 만든 후 약 30분 경과시에, 또는 전기 자극을 준 후 180분 경과시에 전류를 끊어주었다. 시험 약물이 투여된 후 약 195분 경과시, 좌측 경동맥("LCA")에는 상기 RCA에 관하여 기술된 바와 유사한 방식으로 전류가 인가되었다. 모든 수술 과정과 시료 수집을 마친 후, 각각의 동물을 안락사시켰다.
제3 치료군에 속하는 각 동물에 대한 경시적 ARC1779(서열 번호 320) 혈장 농도 변화(HPLC에 의해 측정)를 도 32에 도시하였다. 각 치료 군에 대하여 도플러 혈류계로 측정된 폐색 시간을 도 33에 나타내었다. 도 33에서 살펴볼 수 있는 바와 같이, 본 동물 혈전증 모델인 짧은 꼬리 원숭이의 경동맥에 180분 동안 연속으로 전기적 손상이 가하여지는 동안, ARC1779(서열 번호 320)는 혈전이 형성되는 것을 막아주었다.
실시예 5C: 짧은 꼬리 원숭이 전리 혈전증 모델에 ARC1779 를 여러 가지 경우의 수로 투여하였을 때의 평가 결과
실시예 5B에 기술된 연구를 확장시켜, 앱타머가 보다 낮은 투여량으로 투여될 때, ARC1779(서열 번호 320)가 인간 이외의 영장류 전리 혈전증 모델에 있어서 동맥 내 혈전증을 억제하는 효능을 시험하였다.
추가로 10 마리의 짧은 꼬리 원숭이(2.5∼3.5 ㎏)를 제5∼제7 치료 군으로 나누고, 이하 표 33에 기술된 바에 따른 방식으로 처리하였다.
연구 디자인
그룹 번호 동물의 수 시험 약물 투여 수치 투여 부피 투여 형태 해부일
1 3 비이클 (염수) 제3 군에 대한 DVE ≤10 ㎖ 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일) 제0 일
2 1 앱사이시맵 (Abciximab) (레오프로) 0.25 ㎎/㎏ ≤10 ㎖ 전기 손상 개시 약 15분 전 (제0일에 1회), IV 환약 투여 제0 일
4 5 앱사이시맵 (레오프로) 0.25 ㎎/㎏ 환약 및 0.125 ㎍/㎏/분 ≤10 ㎖ 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일) 제0 일
3 5 ARC1779 0.61 ㎎/㎏ 환약 및 0.0037 ㎎/㎏/분 주입 (1000 nM) ≤10 ㎖ 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일) 제0 일
5 2 ARC1779 0.123 ㎎/㎏ 환약 및 0.001 ㎎/㎏/분 주입 (300 nM) ≤10 ㎖ 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일) 제0 일
6 4 ARC1779 0.2 ㎎/㎏ 환약 및 0.00165 ㎎/㎏/분 주입 (500 nM) ≤10 ㎖ 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일) 제0 일
7 4 ARC1779 0.298 ㎎/㎏ 환약 및 0.00248 ㎎/㎏/분 주입 (750 nM) ≤10 ㎖ 전기 손상 개시 약 15분 전 IV 환약 투여 → 연속 주입 (제0일) 제0 일
실시예 5B의 동물에 관하여 제시된 바와 같이, 표 33의 각 치료 군에 대한 동물 실험을 수행하였다. 각 치료 군에 대하여 도플러 혈류계로 측정한 폐색 시간을 도 33에 나타내었다.
임의의 혈소판 길항제 치료법(대조군 동물)을 수행하지 않고서, 경동맥의 100%는 60분 이내에 혈전으로 폐색되었다. 이와는 반대로, 레오프로로 처리된 동물의 경우에는 동맥의 20%만이 혈전으로 폐색되었다. 점적(infusion rate)을 지속 혈장 수치(constant plasma level) 1000 nM, 750 nM, 500 nM 및 300 nM가 되도록 맞춘 ARC1779 치료 군에 있어서는, 경동맥의 0%, 25%, 63% 및 100%가 혈전으로 폐색되었다. 폐색성 혈전 형성 여부 이외에, 본 발명자들은 피부 출혈 시간에 미치는 ARC1779의 효과를 평가하였다(도 34 참조). 도 34에서 살펴 볼 수 있는 바와 같이, 본 동물 모델의 일부 투여량 및/또는 투여 시점에 있어서, CBT가 연장되었음을 알 수 있었으며, 다른 투여량 및 투여 시점에서는 CBT가 연장되지 않았음을 알 수 있었다.
발명의 상세한 설명과 실시예를 통하여 기술된 본 발명은 다양한 구체예로서 실시될 수 있으며, 전술한 상세한 설명과 실시예는 이하의 청구항을 예시하기 위한 것이지, 이를 한정하기 위한 목적으로 기술된 것은 아니라는 사실을 당 업자들은 알 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Archemix Corp., et al. <120> Aptamers to von Willebrand Factor And their Use As Thrombotic Disease Therapeutics <130> 23239-582-061 <150> 60/608,047 <151> 2004-09-07 <150> 60/661,950 <151> 2005-03-11 <150> 60/678,427 <151> 2005-05-06 <150> 60/690,231 <151> 2005-06-13 <160> 327 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n may be any nucleotide (A, T, C or G) <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60 cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93 <210> 2 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n may be any nucleotide (A, T, C or G) <400> 2 catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 3 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n may be any nucleotide (A, T, C or G) <400> 3 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 4 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <400> 4 Met Gly His His His His His His Glu Pro Pro Leu His Asp Phe Tyr 1 5 10 15 Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met 35 40 45 Met Glu Gln Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val 50 55 60 Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys 65 70 75 80 Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly 85 90 95 Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln 100 105 110 Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu 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nnnnnnnttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 9 taatacgact cactatagga gcgcactcag ccac 34 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 10 gctagcagag aggtcgaaa 19 <210> 11 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 11 ggagcgcacu cagccacaga gcccugagug uaugaucgcc uagaucuauc gaugcuuuuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 12 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 12 ggagcgcacu cagccacaac acuaaugggg aaaguucaag 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2'-fluoro <400> 18 ggagcgcacu cagccacacu gaggcuggau aucuacgaga ggaagugcug cuuggauuuc 60 gaccucucug cuagc 75 <210> 19 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 19 ggagcgcacu cagccacugg uccuuagcua guuguacuag cgacgcguuc aggugguuuc 60 gaccucucug cuagc 75 <210> 20 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 20 ggagcgcacu cagccacuaa cgguugaucu caggacuaau agucaacaag gaugcguuuc 60 gaccucucug cuagc 75 <210> 21 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 21 ggagcgcacu cagccacuaa cggcugaucu caggacuaaa uagucaacaa ggaugcguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 22 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 22 ggagcgcacu cagccacccu gucgucuuuu gguagucagc caaaagcuag uugguuguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 23 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 23 ggagcgcacu cagccacccu cgcaagcauu uuaagaauga cuugugccgc uggcuguuuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 24 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 24 ggagcgcacu cagccacuuu acggugaaag ucucucgggg uuccgaguua cggugcguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 25 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 25 ggagcgcacu cagccacggu aacauuguuu ccggcgauuc uuugaacgcc gucgugguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 26 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 26 ggagcgcacu cagccaccag uuaugcuggc uuuggucuuu gacugucuga guguucguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 27 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all pyrines (A and G) are 2'-OH; all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 27 ggagcgcacu cagccacugg ggcugaucuc gcacgauagu ucgugucaag gaugcguuuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 28 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <220> <221> modified_base <222> (1)..(75) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 28 ggagcgcacu cagccacgcc cacgucaaau uauagucuac uuugaugugc ccgugguuuc 60 gaccucucug cuagc 75 <210> 29 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(73) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 29 ggagcgcacu cagccacgcu guacacugau guuguaacau guacccccug gcuguuucga 60 ccucucugcu agc 73 <210> 30 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(76) <223> all purines (A and G) are 2'-OH (ribo); all pyrimidines (U and C) are 2'-fluoro <400> 30 ggagcgcacu cagccacuuc gacuuucaug ucugaagucc cugcagugcg agagacguuu 60 cgaccucucu gcuagc 76 <210> 31 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 31 ggagcgcact cagccacagt tctgtcggtg atgaattagc gcgagagctg tgggacgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 32 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 32 ggagcgcact cagccacaaa cggacggtga tggattaacg cgggtttatg gcaaggtttc 60 gacctctctg ctagc 75 <210> 33 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 33 ggagcgcact cagccacggc acgacggtga tggattagcg cggtgtcggt ggtgtcattt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 34 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 34 ggagcgcact cagccactca agggggtcgc gtggggacga agggttgcag tgtgtcgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 35 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 35 ggagcgcact cagccacggc acgacggtga tgaattagcg cggtgtcggt ggtgtcattt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 36 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 36 ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggctccgtg gtacacattt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 37 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 37 ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggttccgtg gtacaccttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 38 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 38 ggagcgcact cagccacggc atgacggtga tgaattagcg cggtgtcggt ggtgtcattt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 39 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 39 ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggctccgtg gtacgccttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 40 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 40 ggagcgcact cagccacgga gcgtcggtga tggattagcg cggctccgtg gtacaccttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 41 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 41 ggagcgcact cagccacggc acgacggtga tgaattagcg cggtgtcggt ggtgttattt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 42 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 42 ggagcgcact cagccaccac ggggacgggt agggcgggcg aggtggtggc attagcgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 43 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 43 ggagcgcact cagccacagt tctgtcggtg atgaattagc gcgggagctg tgggacgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 44 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 44 ggagcgcact cagccacggg gtgggtagac ggcgggtatg tggctggtgt cgaagggttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 45 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 45 ggagcgcact cagccacgac ggtgatggat tagcgcggtg gagaagatgc gctgttgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 46 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 46 ggagcgcact cagccacgac ggtgatggat tagcgcggtg gatcttaacg tgcgagtttc 60 gacctctctg ctagc 75 <210> 47 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 47 ggagcgcact cagccactga agggtaagga cgaggagggt atacagtgtg cgcgtgtatt 60 tcgacctctc tgctagc 77 <210> 48 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 48 ggagcgcact cagccacaac tggttgtcgg tgatggcatt aacgcggacc aggcatgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 49 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 49 ggagcgcact cagccacacg acattggcgg gttgtaatta ccacgcatgg ctgtttgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 50 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 50 ggagcgcact cagccactgt tgccgacggt gatgtattaa cgcgggcaac gttggtgttt 60 cgacctctct gctagc 76 <210> 51 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (21)..(60) <223> n may be any nucleotide (A, T, G, or C) <400> 51 ctacctacga tctgactagc nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 52 ctacctacga tctgactagc 20 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 53 aggaactaca tgagagtaag c 21 <210> 54 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 54 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 55 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 55 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 56 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 56 ctacctacga tctgactagc ggaacgagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 57 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 57 ctacctacga tctgactagc ggaataagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 58 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 58 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 59 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 59 ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 60 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 60 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 61 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 61 ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 62 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 62 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgttcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 63 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 63 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgctcaggt ctgctgactg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 64 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 64 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctgatgga ttgcccaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 65 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 65 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctggtgga ttgcccaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 66 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 66 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 67 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 67 ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 68 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 68 ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctgatgga ttgctcaggt ctactggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 69 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 69 ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctgatgga ttggtcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 70 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 70 ctacctacga tctgactagc gggatgagag tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 71 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemcially synthesized <400> 71 ctacctacga tctgactagc gcaatgagga tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 72 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 72 ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctgatgga ttgcacaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 73 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 73 ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctggtgga ttgctcaggt ctgttggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 74 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 74 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt ttccgttctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 75 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 75 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 76 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 76 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgccctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 77 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 77 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt ttctgctctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 78 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 78 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt ttccgctttg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 79 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 79 ctacctacga tctgactagc ggaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgttttg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 80 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 80 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctttg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 81 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 81 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctatg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 82 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 82 ctacctacga tctgactagc gaaacactag gttggttagg attggtgtgt tcccgctatg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 83 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 83 ctacctacga tctgactagc tgagtagtta gtaacttttt attatggttt ggtgggtctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 84 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 84 ctacctacga tctgactagc tgagtagtca gtaatttttt attatggttt ggtgggcctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 85 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 85 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggcacctctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 86 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 86 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggtacctccg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 87 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 87 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggcatcttcg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 88 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 88 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctc ggcacctttg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 89 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 89 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa ggctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 90 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 90 ctacctacga tctgactagc ggaatgagta tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 91 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 91 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa ggctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 92 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 92 ctacctacga tctgactagc ggaatgagag cgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 93 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 93 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctc ggcacttccg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 94 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 94 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctc ggcaccttcg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 95 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (29)..(57) <223> where Y is C or T; R is A or G; H is A, C, or T. <400> 95 ctacctacga tctgactagc ggaatgagra tgytgrtgga ttgchcaggt ctrytgrctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 96 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (22)..(58) <223> where Y is C or T; R is A or G; H is A, C, or T. <400> 96 ctacctacga tctgactagc graacactag gttggttagg rttggtgtgt tycygyyhgc 60 ttactctcat gtagttcc 78 <210> 97 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (49)..(59) <223> Where Y is C or T; R is A or G; H is A, C, or T. <400> 97 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgcty ggyayyyyyg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 98 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 98 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 99 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 99 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catccaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 100 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 100 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt cattcaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 101 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 101 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catttaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 102 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 102 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catctaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 103 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 103 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt catccaataa ccgtgcggtg cttccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 104 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 104 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tgtctaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 105 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 105 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatataataa ccgtgcggtg cctccgtgat 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 106 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 106 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tattcaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 107 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 107 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tattcaataa ccgtgcggtg cctccgtgat 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 108 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 108 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tattcaataa ccgtgcggtg tctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 109 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 109 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatctaataa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 110 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 110 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatctaataa ccgtgcggtg cctccgtgat 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 111 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 111 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaacaa ccgtgcggtg cctccgtgag 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 112 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 112 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaataa ccgtgcgggg cctccgtgat 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 113 ctacctacga tctgactagc tccagtgttt tatccaataa ccgtgcggtg cctccgtgat 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 114 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 114 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattccaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 115 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 115 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc catcttaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 116 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 116 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattttaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 117 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 117 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattttaggt cgtgcggggc ctccgtcacg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 118 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 118 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattctaggc cgtgcggtgc ctccgtcacg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 119 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 119 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tattctaggc cgtgcggtgc ctccgtcatg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 120 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 120 ctacctacga tctgactagc atgcagtgcc cattctaggc cgtgcggtgc ctccgtcatg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 121 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 121 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ttctgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 122 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 122 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ttttgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 123 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 123 ctacctacga tctgactagc ttggtagtga ctttgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 124 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 124 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc cattccaggc cgtgcggtat cctccgtcac 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 125 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 125 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tatcccaggc cgtgcggtag cctccgtcac 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 126 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 126 ctacctacga tctgactagc gtgcagtgcc tatctcaggc cgtgcggtat cctccgtcac 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 127 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 127 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctctgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 128 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 128 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctctgtggag ctgcggtctg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 129 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 129 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctctgtggag ctgcggtctg gccgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 130 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 130 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga cactgtggag ctgcggtttg gttgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 131 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 131 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ccctgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 132 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 132 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctccgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 133 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 133 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctcagaggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 134 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 134 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctttgtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 135 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 135 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctttgtggag ctgcggtttg gtcgacatca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 136 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 136 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga ctttgtggag atgcggtttg gttgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 137 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 137 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 138 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 138 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 139 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 139 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa gctggtggat tgctcaggtc tgctggctgc 60 ttactctcat gtagttcc 78 <210> 140 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 140 ctacctacga tctgactagc ggaatgagga tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 141 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 141 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgcaggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 142 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 142 ctacctacga tctgactagc ggaatgagaa tgcagatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 143 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 143 ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgttggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 144 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 144 ctacctacga tctgactagc ggaatgagag tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 145 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 145 ctacctacga tctgactagc ggaatgagta tgctggtgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 146 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 146 ctacctacga tctgactagc ggaatgagta tgctgatgga ttgctcaggt ctgctggctg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 147 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 147 ctacctacga tctgactagc ttgtcgcact tttggttggt ctggttggtt ctaagtgcgc 60 ttactctcat gtagttcc 78 <210> 148 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 148 ctacctacga tctgactagc ttgtcgcact tttggttggt ctggttggtt ttaagtgcgc 60 ttactctcat gtagttcc 78 <210> 149 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 149 ctacctacga tctgactagc ttggtagcga cacagtggag ctgcggtttg gtcgacgtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 150 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 150 ctacctacga tctgactagc tcaaagtatt acttattggc aataagtcgt ttactctata 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 151 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 151 ctacctacga tctgactagc tttcagtctt ccacatttat agggtttggc attgggtctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 152 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 152 ctacctacga tctgactagc tttcagtctt ctacatttat agggtttggc attgggtctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 153 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 153 ctacctacga tctgactagc tttcagtctt ccacgtttat agggtttggc attgggtctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 154 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 154 ctacctacga tctgactagc ttttagtctt ccacatttat agggtttggc attgggtctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 155 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 155 ctacctacga tctgactagc tttcagtctt tcacatttat agggtttggc attgggtctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 156 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 156 ctacctacga tctgactagc tttcagtctt tcatatttat agggtttggc attgggtctg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 157 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 157 ctacctacga tctgactagc cagttctggg aaaaattatt tttttatttc gatcgtatat 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 158 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 158 ctacctacga tctgactagc cagttctggg aaaaattatt tttttatttc gatcgtattt 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 159 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 159 ctacctacga tctgactagc ctcagattga ctccggccga cttgttttaa tcttctgagt 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 160 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 160 ctacctacga tctgactagc ccccacttat cgtgtacctt atgatatgtc gaatactctt 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 161 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 161 ctacctacga tctgactagc cttacctatt cccttctgcg gaatacgtcg agtactatgc 60 ttactctcat gtagttcc 78 <210> 162 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 162 ctacctacga tctgactagc cagttctggg aaaaatcatt ttttatttcg atcgtatttg 60 cttactctca tgtagttcc 79 <210> 163 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 163 ctacctacga tctgactagc aaggggattg gctccgggtc tggcgtgctt ggcatctttg 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 164 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 164 ctacctacga tctgactagc ctcagattga ctccggctga cttgttttaa tcttctgagt 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 165 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 165 ggagcgcact cagccaccct cgcaagcatt ttaagaatga cttgtgccgc tggctg 56 <210> 166 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 166 gatcgatcta atacgactca ctata 25 <210> 167 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 167 cagccagcgg cacaagtc 18 <210> 168 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 168 tcgatctaat acgactcact ataggagcgc actcagccac cctcgcaagc attttaagaa 60 tgacttgtgc cgctggctg 79 <210> 169 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 169 ggaccaccct cgcaagcatt ttaagaatga cttgtgccgc tggtcc 46 <210> 170 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 170 ggaccagcgg cacaagtc 18 <210> 171 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 171 gatcgatcta atacgactca ctataggacc accctcgcaa gcattttaag aatgacttgt 60 gccgctggtc c 71 <210> 172 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 172 ggaccaccct cgcaagcatt gagaaatgac ttgtgccgct ggtcc 45 <210> 173 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 173 gatcgatcta atacgactca ctataggacc accctcgcaa gcattgagaa atgacttgtg 60 ccgctggtcc 70 <210> 174 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 174 ggaccaccct cgcaacgaga gttgtgccgc tggtcc 36 <210> 175 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 175 ggaccagcgg cacaactc 18 <210> 176 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 176 gatcgatcta atacgactca ctataggacc accctcgcaa cgagagttgt gccgctggtc 60 c 61 <210> 177 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 177 ggagcgcact cagccacggg gtgggtagac ggcgggtatg tggct 45 <210> 178 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 178 agccacatac ccgccgtc 18 <210> 179 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 179 gatcgatcta atacgactca ctataggagc gcactcagcc acggggtggg tagacggcgg 60 gtatgtggct 70 <210> 180 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 180 ggagccacgg ggtgggtaga cggcgggtat gtggctcc 38 <210> 181 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 181 ggagccacat acccgccg 18 <210> 182 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 182 gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacggggtgg gtagacggcg ggtatgtggc 60 tcc 63 <210> 183 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 183 gggacggggt gggtagacgg cgggtatgtc cc 32 <210> 184 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 184 gggacatacc cgccg 15 <210> 185 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 185 gatcgatcta atacgactca ctatagggac ggggtgggta gacggcgggt atgtccc 57 <210> 186 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 186 ggagcgcact cagccacacg acattggcgg gttgtaatta ccacgcatgg ctg 53 <210> 187 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 187 cagccatgcg tggtaatt 18 <210> 188 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 188 gatcgatcta atacgactca ctataggagc gcactcagcc acacgacatt ggcgggttgt 60 aattaccacg catggctg 78 <210> 189 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 189 ggagccacac gacattggcg ggttgtaatt accacgcatg gctcc 45 <210> 190 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 190 ggagccatgc gtgg 14 <210> 191 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 191 gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgggttg taattaccac 60 gcatggctcc 70 <210> 192 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 192 ggagccacac gacattggcg ggcgagagcc acgcatggct cc 42 <210> 193 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 193 gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgggcga gagccacgca 60 tggctcc 67 <210> 194 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 194 ggagccacac gacattggcg agagccacgc atggctcc 38 <210> 195 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 195 gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgagagc cacgcatggc 60 tcc 63 <210> 196 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 196 ggagccacac gagagtggcg ggttgtaatt accacgcatg gctcc 45 <210> 197 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 197 gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgagag tggcgggttg taattaccac 60 gcatggctcc 70 <210> 198 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 198 ggccacacga cattggcggg cgagagccac gcatggcc 38 <210> 199 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 199 ggccatgcgt ggctctc 17 <210> 200 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 200 gatcgatcta atacgactca ctataggcca cacgacattg gcgggcgaga gccacgcatg 60 gcc 63 <210> 201 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 201 ggagccacac gacattggcg cgagagcgca tggctcc 37 <210> 202 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized primer <400> 202 ggagccatgc gctctcg 17 <210> 203 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 203 gatcgatcta atacgactca ctataggagc cacacgacat tggcgcgaga gcgcatggct 60 cc 62 <210> 204 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 204 ccagcggaat gagaatgctg atggattgct caggtctgct gg 42 <210> 205 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 205 atgagagtgc tggtggattg ctcaggtctg ctggctgctt actctcat 48 <210> 206 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 206 cgatctgact agcggaatga gaatgctggt ggatcg 36 <210> 207 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 207 gatctgacta gcgcaatgag gatgcdtgat ggattgctca ggtc 44 <210> 208 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 208 ggacgatctg actagctcca gtgttttatc taataaccgt cc 42 <210> 209 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 209 ggagctccag tgttttatct aataaccgtg cggtgcctcc gtgagctcc 49 <210> 210 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 210 ggagctgcgg tttggtcgac gtcagctcc 29 <210> 211 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 211 ggtagcgact ctgtggagct gcggtttgg 29 <210> 212 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> thymidine at position 46 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 212 ggcgtgcagt gcctattcta ggccgtgcgg tgcctccgtc acgcct 46 <210> 213 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> thymidine at position 13 is modified by a PEG and attached to the adenosine at position 14 <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 213 gcgtgcagtg cctaggccgt gcggtgcctc cgtcacgcct 40 <210> 214 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> cytidine at position 13 is modified by a PEG and attached to the the guanosine at position 14 <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 214 ggcgtgcagt gccggccgtg cggtgcctcc gtcacgcct 39 <210> 215 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> guanosine at position 30 is modified by a PEG and attached to the cytidine at position 31 <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> thymidine at position 41 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 215 ggcgtgcagt gcctattcta ggccgtgcgg ccgtcacgcc t 41 <210> 216 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> thymidine at position 14 is modified by a PEG and attached to the adenosine at position 15 <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> guanosine at position 25 is modified by a PEG and attached to the cytidine at position 26 <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> thymidine at position 36 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 216 ggcgtgcagt gcctaggccg tgcggccgtc acgcct 36 <210> 217 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, t, c or g <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is a, t, c or g <220> <221> misc_feature <222> (17)..(20) <223> n is a, t, c or g and represents 1 to 4 nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> n is a, t, c or g <220> <221> misc_feature <222> (33)..(36) <223> n is a, t, c or g <400> 217 nnnncaccct cgcannnnnn nntgtgccgc tgnnnn 36 <210> 218 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, t, c or g <220> <221> misc_feature <222> (28)..(32) <223> n is a, t, c or g <400> 218 nnnnnrggry rggtagacgg cgggyrtnnn nn 32 <210> 219 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> n is a, t, c or g <220> <221> misc_feature <222> (21)..(26) <223> n is a, t, c or g <220> <221> misc_feature <222> (37)..(38) <223> n is a, t, c or g <400> 219 nnccacacga cattggcggg nnnnnnccac gcatggnn 38 <210> 220 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is t, c, g or a <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is t, c, g or a <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is t, c, g or a and represents 3 to 10 nucleotides <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is t, c, g or a <220> <221> misc_feature <222> (33)..(37) <223> n is t, c, g or a <400> 220 nnnnncagtg nnnnnycgtg cggkryytcc gtnnnnn 37 <210> 221 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 221 ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc c 41 <210> 222 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> thymidine at position 42 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 222 ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct 42 <210> 223 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> guanosine at position 1 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> thymidine at position 42 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 223 ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct 42 <210> 224 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (2)..(2) <223> guanosine at position 2 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> thymidine at position 42 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 224 ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct 42 <210> 225 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (3)..(3) <223> cytidine at position 3 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> thymidine at position 42 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 225 ggcgtgcagt gccttcggcc gtgcggtgcc tccgtcacgc ct 42 <210> 226 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> 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<223> all residues at positions 32 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 282 ggcgugcagu gcuucgccgt gcggtgccuc cgucacgcct 40 <210> 283 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(16) <223> all residues at positions 8 to 16 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> the residue at position 18 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (25)..(26) <223> all residues at position 25 to 26 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (31)..(37) <223> all residues at positions 31 to 37 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> thymidine at position 38 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 283 gcgugcagug cuucgccgtg cggtgccucc gucacgct 38 <210> 284 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all the residues at postions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all the residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all the residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 284 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 285 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> uracil at position 4 is modified with a phosphorothioate and attached to the guanosine at position 5 <220> <221> modified_base <222> (7)..(18) <223> all residues at positions 7 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all the residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all of the residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all of the residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 285 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 286 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> guanosine at position 5 is modified by a phosphorothioate and attached to the cytidine at the 6 position <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all the residues at positions 27-28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all the residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 286 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 287 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> cytidine at position 6 is modified by a phosphorothioate and attached to the adenosine at position 7 <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 287 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 288 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> adenosine at position 7 is modified by a phosphorothioate and attached to the guanosine at position 8 <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 288 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 289 <211> 40 <212> 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2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 289 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 290 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (7)..(18) <223> all residues at positions 7 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> cytidine at position 19 is modified by a phosphorothioate and attached to the guanosine at the 20 position <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 290 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 291 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> guanosine at position 20 is modified by a phosphorothioate and attached to the thymidine at position 21 <220> <221> modified_base 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residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (21)..(22) <223> Thymidine at position 21 is modified by a phosphorothioate and attached to the guanosine at position 22 <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 292 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 293 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (22)..(23) <223> guanosine at position 22 is modified by a phosphorothioate and attached to the cytidine at position 23 <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' 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<220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 294 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 295 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> guanosine at position 24 is modified by a phosphorothioate and attached to the guanosine at position 25 <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 295 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 296 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> guanosine at position 25 is modified by phosphorothioate and attached to the guanosine at position 26 <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 296 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 297 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> thymidine at position 26 is modified by phosphorothioate and attached to the guanosine at position 27 <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 297 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 298 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (28)..(29) <223> cytidine at position 28 is modified by a phosphorothioate and attached to the cytidine at position 29 <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at position 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at position 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) 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residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (30)..(31) <223> uracil at position 30 is modified by a phosphorothioate and attached to the cytidine at position 31 <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 300 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 301 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> 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<221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(39) <223> all the residues at positions 33 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 307 gcgugcagug ccuuuggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 308 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (8)..(12) <223> all residues at positions 8 to 12 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> cytidine at position 12 is modified by a PEG and attached to the guanosine at position 13 <220> <221> modified_base <222> (13)..(15) <223> all residues at positions 13 to 15 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (17)..(17) <223> the residue at position 17 is 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> guanosine at position 17 is modified by a phosphorothioate and attached to the thymidine at position 18 <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> the residue at position 19 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (24)..(25) <223> all residues at positions 24 and 25 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> the residue at position 27 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(31) <223> all residues at positions 30 to 31 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(36) <223> all residues at positions 33 to 36 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> thymidine at position 37 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 308 gcgugcagug ccggccgtgc 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(3) <223> all residues at positions 1 to 3 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (7)..(11) <223> all residues at positions 7 to 11 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> cytidine at position 11 is modified by a PEG and attached to the guanosine at position 12 <220> <221> modified_base <222> (12)..(14) <223> all residues at positions 12 to 14 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(17) <223> guanosine at position 16 is modified by a phosphorothioate and attached to the thymidine at position 17 <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> the residue at position 16 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> the residue at position 18 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (23)..(24) <223> all residues at positions 23 to 24 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> the residue at position 26 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (29)..(34) <223> all residues at positions 29 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> thymidine at position 35 is 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 313 cgugcagugc cggccgtgcg gtgccuccgu cacgt 35 <210> 314 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> guanosine at position 6 is modified by a phosphorothioate and attached to the thymidine at position 7 <220> <221> modified_base <222> (6)..(6) <223> the residue at position 6 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) <223> all residues at positions 13 to 14 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> the residue at position 16 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (19)..(23) <223> all 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modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 319 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 320 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> the residue at position 1 is modified with a PEG <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> guanosine at position 20 is modified by a phosphorothioate and attached to the thymidine at position 21 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> all residues at positions 27 to 28 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> thymidine at position 40 is a 3' inverted deoxythymidine (3' to 3' linked) <400> 320 gcgugcagug ccuucggccg tgcggtgccu ccgucacgct 40 <210> 321 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> all residues at positions 1 to 4 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> the residue at position 1 is modified with a PEG <220> <221> modified_base <222> (8)..(18) <223> all residues at positions 8 to 18 are 2'-O-Methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> guanosine at position 20 is modified by phosphothioate and attached to the thymidine at position 21 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> the residue at position 20 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> the residue at position 22 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (27)..(28) <223> the residue at position 27 to 28 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> the residue at position 30 is 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (33)..(34) <223> all residues at positions 33 to 34 are 2'-O-Methyl <220> <221> modified_base <222> (36)..(39) <223> all residues at positions 36 to 39 are 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<212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 325 ctacctacga tctgactagc ttggtagyga yhyhgwggag mtgcggtytg gyygacrtca 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 326 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 326 ctacctacga tctgactagc ctcagattga ctccggcyga cttgttttaa tcttctgagt 60 gcttactctc atgtagttcc 80 <210> 327 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence: chemically synthesized <400> 327 ctacctacga tctgactagc cyyacytaty systwcykyr krataygtcg artactmtgc 60 ttactctcat gtagttcc 78

Claims (42)

  1. ARC1029(서열 번호 214), ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284), ARC1368(서열 번호 291), 서열 번호 1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318) 및 ARC1884(서열 번호 322)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 95% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 앱타머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 앱타머는 ARC1029(서열 번호 214), ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284), ARC1368(서열 번호 291), 서열 번호 1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318) 및 ARC1884(서열 번호 322)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1차 핵산 서열과 95% 동일성을 갖는 1차 핵산 서열을 포함하는 것인 앱타머.
  3. 제1항에 있어서, 상기 앱타머 핵산 서열은 화학적 변형을 포함하며, 상기 ㅎ핵산 서열은 화학 변형을 포함하고, C1029(서열 번호 214), ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284), ARC1368(서열 번호 291), 서열 번호 1635(서열 번호 319), ARC1759(서열 번호 318) 및 ARC1884(서열 번호 322)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 서열과 95% 동일성을 갖는 것인 앱타머.
  4. 제1항에 있어서, 상기 앱타머는 고 분자량이고 비-면역원성인 화합물, 또는 친지성 화합물에 컨쥬게이트화된 것인 앱타머.
  5. 제4항에 있어서, 상기 앱타머는 비-면역원성이고 고 분자량의 화합물인 폴리알킬렌 글리콜에 컨쥬게이트화된 것인 앱타머.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜인 것인 앱타머.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 5kDa, 10kDa, 2OkDa 및 40 kDa 으로 이루어진 군으로부터 선택된 분자량을 포함하는 것인 앱타머.
  8. 제7항에 있어서, 상기 앱타머는 ARC1779(서열 번호 320), ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 앱타머.
  9. 치료학적 유효량의 제1항의 앱타머 또는 이의 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  10. 제9항의 조성물을 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는, vWF에 의해 매개 되는 질병을 치료, 예방 또는 완화하는 방법.
  11. 제9항의 조성물을 이의 투여를 필요로 하는 환자에게 투석, CABG 수술, 관상 동맥 중재술 또는 심장 판막 치환술 실시 이전, 실시중 및/또는 실시 후에 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 치료 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 조성물은 20 kDa의 PEG에 컨쥬게이트화된 ARC1368(서열 번호 291) 또는 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조성물은 ARC1779(서열 번호 320)를 포함하는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 20 kDa의 PEG에 컨쥬게이트화된 ARC1368(서열 번호 291) 또는 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 ARC1779(서열 번호 320)를 포함하는 것인 방법.
  16. 치료학적 유효량의 제8항의 앱타머 또는 이의 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  17. 제16항의 조성물을 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, vWF에 의해 매개되는 질병을 치료, 예방 또는 완화하는 방법.
  18. 폰 빌레브란트 인자 표적에 특이적으로 결합하는 앱타머.
  19. 제18항에 있어서, 상기 폰 빌레브란트 인자 표적은 인간의 폰 빌레브란트 인자인 것인 앱타머.
  20. 제18항에 있어서, 상기 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 매개 혈소판 응집을 조정하는 것인 앱타머.
  21. 제18항에 있어서, 상기 앱타머는 폰 빌레브란트 인자 전장 표적 및 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적에 특이적으로 결합하는 것인 앱타머.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폰 빌레브란트 인자 전장 표적 및 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 표적은 상이한 종으로부터 유래되는 것인 앱타머.
  23. 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 변이체를 포함하는 것으로 의심되는 조성물과 제18항의 앱타머를 접촉시키는 단계 및 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 변이체의 존 부를 확인하는 단계를 포함하는 진단 방법.
  24. a) 단일-가닥 핵산의 후보 혼합물을 제조하는 단계;
    b) 후보 혼합물을 전장 단백질 표적과 이 전장 단백질 표적의 도메인 모두와 접촉시키는 단계;
    c) 전장 단백질 표적 또는 이 단백질 표적 도메인에 대한 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계; 및
    d) 친화성이 증가된 핵산을 시험관 내에서 증폭시켜, 단백질 표적에 특이적인 앱타머 농축 혼합물을 생성하는 단계
    를 포함하는, 앱타머 표적의 생물학적 기능을 조정하는 앱타머를 동정하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    e) 표적에 특이적인 앱타머 농축 혼합물과 전장 단백질 표적을 접촉시키는 단계;
    f) 전장 단백질 표적에 대한 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계;
    g) 친화성이 증가된 핵산을 시험관 내에서 증폭시켜, 표적에 특이적인 앱타머 농축 혼합물을 생성하는 단계;
    h) 표적에 특이적인 앱타머 농축 혼합물과 단백질 표적 도메인을 접촉시키는 단계;
    i) 단백질 표적 도메인에 대한 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계; 및
    j) 친화성이 증가된 핵산을 시험관 내에서 증폭시켜, 단백질 표적 특이적 앱타머 농축 혼합물을 생성하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방법은 생체 내에서 전장 단백질 표적의 생물학적 기능을 차단하는 앱타머를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 전장 단백질 표적은 제1 종으로부터 유래하는 것이고, 단백질 표적 도메인은 제2 종으로부터 유래하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제1 종 및 제2 종 둘 다의 단백질 표적에 결합할 수 있는 앱타머를 선별하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  29. 제26항의 방법으로 동정된 앱타머.
  30. 서열 번호 31∼50, 서열 번호 54∼94, 서열 번호 98∼164, 서열 번호 177, 서열 번호 180, 서열 번호 183, 서열 번호 186, 서열 번호 189, 서열 번호 192, 서열 번호 198, 서열 번호 201, 서열 번호 205, 서열 번호 208, 서열 번호 212-214, ARC1115(서열 번호 221), ARC1172(서열 번호 222), ARC1194(서열 번호 223)∼ ARC1240(서열 번호 269), ARC1338(서열 번호 273)∼ARC1346(서열 번호 281), ARC1361(서열 번호 284)∼ARC1381(서열 번호 304), ARC1524(서열 번호 305), ARC1526(서열 번호 307)∼ARC1535(서열 번호 316), ARC1546(서열 번호 317), ARC1759(서열 번호 318), ARC1635(서열 번호 319), ARC1779(서열 번호 320)∼ARC1780(서열 번호 321) 및 ARC1884(서열 번호 322)∼ARC1885(서열 번호 323)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1차 핵산 서열 중 임의의 것과 95% 이상 동일성을 갖는 1차 핵산 서열을 포함하고, 폰 빌레브란트 인자에 특이적으로 결합하는 앱타머.
  31. 치료학적 유효량의 제30항의 앱타머 또는 이의 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
  32. 제31항의 조성물을 포유 동물에 투여하는 단계를 포함하는, vWF에 의해 매개되는 질병을 치료, 예방 또는 완화하는 방법.
  33. 제31항의 조성물을 이의 투여를 필요로 하는 환자에게 투석, CABG 수술, 관상 동맥 중재술 또는 심장 판막 치환술 실시 이전, 실시중 및/또는 실시 후에 투여하는 단계를 포함하는, 환자의 치료 방법.
  34. 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 변이체를 포함하는 것으로 의심되는 조성물과 제30항의 앱타머를 접촉시키는 단계 및 폰 빌레브란트 인자 또는 이의 변이체의 존 부를 확인하는 단계를 포함하는 진단 방법.
  35. 제30항에 있어서, 시험관 내 진단제로서 사용되는 것인 앱타머.
  36. 제30항에 있어서, 생체 내 진단제로서 사용되는 것인 앱타머.
  37. 제24항에 있어서, 상기 앱타머 표적은 폰 빌레브란트 인자인 것인 방법.
  38. 제24항에 있어서, 상기 전장 단백질 표적의 도메인은 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1인 것인 방법.
  39. 제25항에 있어서, 상기 전장 단백질 표적은 폰 빌레브란트 인자인 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 단백질 표적 도메인은 폰 빌레브란트 인자 도메인 A1 인 것인 방법.
  41. 제28항에 있어서, 제1 종 및 제2 종의 단백질 표적은 폰 빌레브란트 인자 표적인 것인 방법.
  42. 제41항의 방법으로 동정된 앱타머.
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