KR101622490B1 - 보체-관련 질환의 치료에 유용한 압타머 치료제 - Google Patents

보체-관련 질환의 치료에 유용한 압타머 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 치료제, 및 보체-관련 질환의 치료에서 그러한 핵산 치료제를 이용하는 방법을 제공한다.

Description

보체-관련 질환의 치료에 유용한 압타머 치료제{APTAMER THERAPEUTICS USEFUL IN THE TREATMENT OF COMPLEMENT-RELATED DISORDERS}
본 발명은 보체-관련 심장, 염증 및 자가면역 질환, 허혈성 재관류 손상(ischemic reperfusion injury) 및/또는 C5 매개 보체 활성화가 연관된 기타 질병 또는 질환의 치료제 및 진단제로서 유용한, 일반적으로 보체 시스템의 C5 단백질에 결합할 수 있는 핵산, 더 구체적으로 압타머(aptamer)의 기술분야에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 C5 보체 시스템 단백질에 결합할 수 있는 압타머를 투여하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.
압타머는 전형적인 왓슨-크릭 염기 페어링(Watson-Crick base pairing)을 제외한 상호작용을 통해 분자에 대한 특정한 결합 친화성을 갖는 핵산 분자이다.
압타머는, 파지 디스플레이(phage display) 또는 단일 클론 항체(monoclonal antibodies, "MAbs")에 의해 생성되는 펩티드와 같은 것으로서, 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있으며, 그리고 표적의 활성을 조절할 수 있으며, 예컨대, 결합을 통해 압타머가 기능에 대한 표적의 능력을 차단할 수 있다. 불규칙 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 시험관내 선택 프로세스에 의해 생성된 것으로서, 압타머는 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린, 및 수용체를 포함하는 100 이상의 단백질에 걸쳐 생성된 것이다. 전형적인 압타머는 크기가 10-15 kDa(30-45개의 뉴클레오티드)이며, 나노몰 이하(sub-nanomolar)의 친화성으로 그 표적에 결합하며, 그리고 밀접하게 관련된 표적들로부터 구분된다(예컨대, 압타머는 동일한 유전자 패밀리로부터의 다른 단백질과는 전형적으로 결합하지 않는다). 일련의 구조 연구에서는 압타머가 친화성을 유도하는 동일한 유형의 결합 상호작용(예컨대, 수소 결합, 정전기적 상보성, 소수성 접촉, 입체적 배제(steric exclusion))과 항체-항원 복합체에서의 특이성을 사용할 수 있다는 것을 보여주었다.
압타머는 고 특이성 및 친화성, 생물학적 효능, 및 뛰어난 약물동력학적 성질을 비롯하여 치료제 및 진단제로서 사용하기에 바람직한 다수의 특성을 가진다. 추가로, 압타머는 항체 및 기타 단백질 생물학에 비하여 특이적인 경쟁적 장점을 제공한다. 예를 들면, 다음과 같다.
1) 속도와 조절( Speed and control ). 압타머는 시험관내 프로세스에 의해, 치료용 리드(leads)를 포함하는 초기 리드의 신속한 생성을 허용하면서 전적으로 생성된다. 시험관내 선택은 압타머의 특이성 및 친화성을 엄격하게 조절하는 것을 허용하며, 독성 표적과 비-면역원성 표적 둘 다에 대한 리드를 포함하여 리드의 생성을 허용한다.
2) 독성과 면역원성. 클래스로서의 압타머는 독성 또는 면역원성을 거의 나타내지 않거나 또는 나타내지 않는다. 압타머 고 수치(매일 10 mg/kg씩 90 일)를 래트와 맘모트(woodchuck)에게 장기간 투여한 경우, 임상학적 측정, 세포적 측정, 또는 생화학적 측정 어느것에서도 독성이 관찰되지 않았다. 많은 단일 클론 항체들의 효능이 항체 자체의 면역 반응에 의해 심각하게 제한되는 반면, 확실하게 압타머는 MHC를 경유하는 T-세포에 의해 생성될 수 없기 때문에, 그리고 그 면역 반응은 일반적으로 핵산 단편을 인식하지 않도록 훈련된 것이기 때문에, 압타머에 대한 항체를 유발시키는 것은 극적으로 어렵다.
3) 투여( administration ). 대부분의 현재 허가된 항체 치료제는 정맥내 인퓨전(infusion)으로 투여하고(통상적으로 2-4 시간에 걸쳐), 반면 압타머는 피하 주사에 의해 투여할 수 있다(멍키 연구에서 피하 투여를 통한 압타머 생체이용률은 ＞80%이다(Tucker et al, J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999)). 이 차이는 원래 상대적으로 낮은 용해도와 그로 인해 대부분의 치료용 MAb에 대해 대량 부피가 필요하기 때문에 의한 것이다. 우수한 용해도(＞150 mg/mL)와 상대적으로 낮은 분자량(압타머: 10-50 kDa; 항체: 150 kDa)으로, 0.5 mL 이하의 부피로 주사에 의해 주간 투여로 압타머를 운반시킬 수 있다. 게다가, 작은 크기의 압타머는 그들로 하여금 형태배열(conformational) 제한이 되는 영역 내로의 침투를 허용하지만 항체 또는 항체 단편은 침투할 수 없으며, 이런 것이 여전히 압타머에 기초한 치료 또는 예방의 다른 장점을 제공하게 되는 것이다.
4) 양산성( Scalability )과 비용. 치료용 압타머는 화학적으로 합성하며 따라서 그리고 생산 요구량을 맞추는데 필요한 만큼 용이하게 스케일링(scaling)할 수 있다. 스케일링 생산에서의 어려움이 현재는 일부 생물학의 유용성을 제한하며 양산-규모 단백질 생산 플랜트(plant)의 자본 비용이 엄청난 반면, 단일 대량-규모 올리고뉴클레오티드 합성기(synthesizer)는 100 kg/year를 상향해서 생산해낼 수 있으며 그리고 상대적으로 높지 않은 초기 투자를 요구한다. 킬로그램 규모에서의 압타머 합성에 대한 자원의 현재 비용은 $500/g으로 추정되며, 이는 상당히 최적화된 항체에 대한 것과 비교할 만하다. 프로세스 개발에서의 지속적인 향상으로 자원의 비용을 5년 내에 ＜ $100/g으로 하향시킬 것으로 기대된다.
5) 안정성( Stability ). 치료용 압타머는 화학적으로 탄탄하다. 그들은 열이나 변성제와 같은 인자에 노출된 이후 활성을 회복하는데 본질적으로 적응되어 있으며 그리고 실온에서 동결건조 분말로서 연장된 기간(＞1 yr) 동안 보관시킬 수 있다.
보체 시스템( Complement System )
보체 시스템은 병원체(예컨대, 박테리아)의 세포밖 형태를 공격하는 조절된 캐스케이드(cascade) 시스템 중에서 함께 활동하는 적어도 20개의 혈장 및 멤브레인 단백질의 세트를 포함한다. 보체 시스템은, 전형적인 경로와 대안적인 경로(도 1)의 2개의 구분되는 효소 활성화 캐스케이드, 및 멤브레인 공격 경로로서 알려진 비-효소 경로를 포함한다.
제1 효소 활성화 캐스케이드는, 전통 경로로서 알려진 것으로서, 몇개의 성분, C1, C4, C2, C3 및 C5를 포함한다(경로 중에서의 순서에 의해 나열함). 보체 시스템의 전통적 경로의 개시는 면역 활성화 인자와 비-면역 활성화 인자 둘 다에 의해 제1 보체 성분(C1)의 결합과 활성화에 이어 발생한다. C1은 성분 C1q, C1r 및 C1s의 칼슘-의존성 복합체를 포함하며, 그리고 C1q 성분의 결합을 통해 활성화된다. C1q는 6개의 동일한 서브유닛(subunit)을 포함하며 각각의 서브유닛은 3개의 체인을 포함한다(A, B 및 C 체인). 각각의 체인은 콜라겐-유사 테일(tail)에 연결된 것인 구형 헤드(head) 영역을 가진다. 항원-항체 복합체에 의한 C1q의 결합과 활성화는 C1q 헤드 그룹 영역을 통해 이루어진다. 다수의 비- 항체 C1q 활성화 인자는, 단백질, 지질 및 핵산을 포함하며, 콜라겐-유사 줄기(stalk) 영역 상에서 명백한 위치를 통해 C1q와 결합하고 C1q를 활성화시킨다. C1qrs 복합체가 이후 보체 성분 C4와 C2의 활성화를 촉매하고, C3 컨버타제(convertase)로서 기능하는 C4bC2a 복합체를 생성시키게 된다.
제2 효소 활성화 캐스케이드는, 대안적인 경로로서 알려진 것으로서, 신속하며, 보체 시스템 활성화와 증폭에 대해 항체-의존성 경로이다. 대안적인 경로는 몇가지 성분들, C3, 팩터(factor) B, 및 팩터 D(경로 중에서의 순서에 따라 나열함)를 포함한다. C3의 단백분해성 절단형이 박테리아와 같은 표면 시약을 활성화시키는 경우, 대체 경로의 활성화가 일어나게 된다. 이후 팩터 B가 C3b에 결합하며, 그리고 팩터 D에 의해 절단되어 활성 효소 Ba를 생성시키게 된다. 이후 효소 Ba는 추가의 C3를 절단하여 추가의 C3b를 생성시키며, 활성화시킨 표면 상에서의 C3b-Ba 복합체의 광범위한 침착(deposition)을 생성시키게 된다.
따라서, 전형적인 보체 경로와 대안적인 보체 경로는 둘 다 C3를 C3a와 C3b로 분할시키는 C3 컨버타제를 생성한다. 이 점에서, 두 C3 컨버타제는 추가로 C5 컨버타제로 합해진다(C4b2a3b 및 C3b3bBb). 이들 복합체는 뒤이어 보체 성분 C5를 2개의 성분: C5a 폴리펩티드(9 KDa) 및 C5b 폴리펩티드(170 kDa)로 절단한다. C5a 폴리펩티드는 7개의 트랜스멤브레인(transmembrane) G-단백질 커플링된 수용체에 결합하며, 이는 원래 백혈구(leukocyte)와 관련된 것이었으며 그리고 지금은 간세포(hepatocyte)와 뉴런(neuron)을 포함하는 다양한 조직 상에서 발현되는 것으로 알려져 있다. C5a 분자는 인간의 보체 시스템 중 1차적인 화학주성(chemotactic) 성분이며 그리고 백혈구 화학주성(chemotaxis), 평활근 수축, 세포내 신호 전달 경로의 활성화, 호중구(neutrophil)-내피(endothelial) 부착, 사이토카인(cytokine) 및 지질 매개인자 방출과 옥시던트(oxidant) 생성을 포함하는 다양한 생물학적 반응을 촉발시킬 수 있다.
더 큰 C5b 단편은 보체 캐스케이드의 후발 성분들, C6, C7, C8 및 C9와 순차적으로 결합하여 C5b-9 멤브레인 공격 복합체(membrane attack complex, "MAC")를 생성하게 된다. C5b-9 MAC은 직접적으로 적혈구를 용혈(lyse)시킬 수 있으며, 그리고 더 많은 양으로, 백혈구에 대해서도 용혈을 일으키며 그리고 근육, 상피 세포 및 내피 세포와 같은 조직에 손상을 일으킨다. 용혈을 일으키지 않는 양으로, MAC은 부착 분자의 상향조절(upregulation), 세포내 칼슘 증가 및 사이토카인 방출을 자극할 수 있다. 추가로, C5b-9 MAC은 세포 용혈을 일으키지 않으면서 내피 세포와 혈소판과 같은 세포를 자극할 수 있다. C5a와 C5b-9 MAC의 비-용혈성 효과는 때때로 상당히 유사하다.
비록 보체 시스템이 건강을 유지하는데 중요한 역할을 가지지만, 그것은 잠정적으로 질병을 일으키거나 질병에 기여하는 것이다. 예컨대, 보체 시스템은 관상 동맥 우회 이식편(coronary artery bypass graft, "CABG") 수술, 다수의 신장 질환, 류마티즘성 질환, 신경성 질환, 피부상 질환, 혈액성 질환, 혈관/폐 질환, 알러지 질환, 감염성 질환, 및 생체적합성(biocompatibility)/쇼크(shock) 질환 및/또는 질병, 그리고 당뇨성 망막병증(retinopathy)과 관련된 부작용과 관련되어 있다. 보체 시스템은 반드시 질병 상태의 유일한 원인은 아니지만, 그것은 병인(pathogenesis)에 기여하는 여러가지 인자 중 하나일 수 있다.
문헌[Fitch et al, Circ. 100:2499-506(1999)]에서는 심폐 우회술(cardio-pulmonary bypass, "CPB")로 관상 동맥 우회 이식편 수술을 하는 환자에 대해, 항-C5 단일-체인 항체 단편 펙셀리주마브(Pexelizumab)의 효과를 테스트하였다. 개별 환자들에게는, 단회-볼러스 투여량(single-bolus dose)으로 CPB에 10 분 앞서 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg 및 2.0 mg/kg으로 투여하였다. 혈액 시료를 제거하고, 투여 이전, 투여 5 분 이후, 28 ℃에서 5 분 이후, 재가온(rewarming)의 개시 이후, 37 ℃에서 5 분 이후, 그리고 CPB 이후 7일 이내에서 보체 활성을 측정하였다. 약물역학 분석에서는, 2 mg/kg 투여량에서 14 시간까지 보체의 용혈 활성이 현저하게 투여량-의존적으로 억제되었으며, 그리고 프로염증성(proinflammatory) 보체 부산물(sC5b-9)의 생성이 투여량-의존적으로 효과적으로 억제된다는 것을 보여주었다. 그렇지만, 앞서 언급한 바와 같이, 항체 요법은 어느 정도 제한이 있다.
따라서, 보체-관련 질환의 처치시 치료와 진단으로서 사용하기 위한 보체 시스템의 신규한 억제제를 가지는 것이 바람직하다.
발명의 개요
본 발명은 보체 관련 질병을 치료, 예방 및 완화시키기 위한 물질과 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, PEG 부분(moiety)에 컨쥬게이트화된 ARC186(서열 번호: 4)에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 특정 구체예에서, 이 ARC186 압타머/PEG 컨쥬게이트는 서열 번호: 4에 따른 서열로 구성되는 압타머로서 C5 보체 단백질에 대해 실질적으로 동일한 결합 친화성을 가지지만 PEG 부분은 가지지 않는다. 본원에서 사용한 것으로서 실질적으로 동일한 결합 친화성이란 도트 블롯 분석(dot blot assay)에 의해 측정한 것으로서 해리 상수에 있어서 단지 약 2 내지 10배 차이, 바람직하게는 단지 2 내지 5배 차이를 의미한다. 일부 구체예에서 해리 상수는 이하의 실시예 1A에 기재한 바와 같이 경쟁 도트 블롯 분석에 의해 측정한다. 일부 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 부분은 분자량 10 kDa 이상, 구체적으로 분자량 20 kDa, 더 구체적으로는 30 kDa, 더 구체적으로는 40 kDa을 포함한다. 일부 구체예에서, PEG 부분은 ARC186(서열 번호:4)의 5' 말단에 컨쥬게이트화된다. 일부 구체예에서 압타머/PEG 컨쥬게이트는 영장류에서, 2-컴파트먼트 모델에서 이하의 실시예 5E에서 기재한 방법에 의해 측정한 것으로서, 반감기, 바람직하게는 말단 반감기 15 시간 이상, 바람직하게는 24 시간 이상, 더 바람직하게는 48 시간 이상을 포함한다. 일부 구체예에서 압타머/PEG 컨쥬게이트는 래트에서, 2-컴파트먼트 모델에서 반감기, 바람직하게는 말단 반감기, 10 시간 이상, 바람직하게는 15 시간 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, ARC186(서열 번호: 4)의 5' 말단에 컨쥬게이트화된 PEG는 40 kDa PEG이다. 특정 구체예에서 40 kDa PEG는 분지형 PEG이다. 일부 구체예에서 분지형 40 kDa PEG는 1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)이다. 다른 구체예에서 분지형 40 kDa PEG는 2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일이다.
구체예에서, 분지형 40 kDa PEG가 1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)인 경우, 하기 구조를 갖는 압타머를 제공한다:
Figure 112014008692587-pat00001
상기 식 중,
~~~~~는 링커(linker)를 의미하며,
Figure 112014008692587-pat00002
여기서 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드이며, mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이며, 모든 기타 뉴클레오티드는 2'-OH이며, 그리고 3T는 역전된(inverted) 데옥시 티미딘을 나타낸다.
구체예에서 분지형 40 kDa PEG가 2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일인 경우, 하기 구조를 갖는 압타머를 제공한다:
Figure 112014008692587-pat00003
상기 식 중,
~~~~~는 링커를 의미하며,
Figure 112014008692587-pat00004
여기서 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드이며, mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이며, 모든 기타 뉴클레오티드는 2'-OH이며, 그리고 3T는 역전된 데옥시 티미딘을 나타낸다.
본 발명의 이 태양의 일부 구체예에서 링커는 알킬 링커이다. 특정 구체예에서, 알킬 링커는 2 내지 18개의 연속적인 CH2 기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 알킬 링커는 2 내지 12개의 연속적인 CH2 기를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서 알킬 링커는 3 내지 6개의 연속적인 CH2 기를 포함한다.
특정 구체예에서 하기 구조를 갖는 압타머, ARC187(서열 번호: 5)를 제공한다:
Figure 112014008692587-pat00005
상기 식 중,
Figure 112014008692587-pat00006
여기서 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드이며, mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이며, 모든 기타 뉴클레오티드는 2'-OH이며, 그리고 3T는 역전된 데옥시 티미딘을 나타낸다.
다른 구체예에서 하기 구조를 가지는 압타머, ARC1905(서열 번호: 67)를 제공한다:
Figure 112014008692587-pat00007
상기 식 중,
Figure 112014008692587-pat00008
여기서 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드이며, mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이며, 모든 기타 뉴클레오티드는 2'-OH이며, 그리고 3T는 역전된 데옥시 티미딘을 나타낸다.
다른 태양에서, 본 발명은 약학 조성물을 제공한다. 하나의 구체예에서, 약학 조성물은 치료적 유효량의 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67) 또는 이들의 염을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이 태양에서, 본 발명은 생체내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 치료적 유효량의 압타머 또는 이것의 염 그리고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 이 태양에서 생체내에서 질병을 치료, 예방 또는 완화시키는데 사용하기 위한 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67) 약학 조성물을 제공한다. 또한 본 발명의 이 태양에서 약학 조성물을 제조하는데 사용하기 위한 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67)를 제공한다.
본 발명의 다른 태양에서, 치료 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 C5 보체 단백질, 및/또는 이것의 유도체 C5a 및 C5b-9에 의해 매개되는 질병을 치료 예방 또는 완화시키는 것을 포함하며, 그 방법은 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67) 또는 이들의 염을 포함하는 약학 조성물을 척추동물에세 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 그 방법은 포유동물에게 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 포유동물은 인간이다.
일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 급성 허혈성 질환들(심근경색증(myocardial infarction), 심장마비(stroke), 허혈성/재관류(reperfusion) 손상); 급성 염증성 질환들(감염성 질환, 패혈증(septicemia), 쇼크(shock), 급성/과급성(hyperacute) 이식 거부); 만성 염증성 질환 및/또는 면역-매개 질환들(알러지, 천식, 류마티즘성 관절염, 및 기타 류마티즘성 질환들, 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 기타 신경학상의 질환들, 건선(psoriasis) 및 기타 피부상 질환들, 중증근무력증(myasthenia gravis), 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE), 아급성(subacute)/만성 이식 거부, 사구체신염(glomerulonephritis) 및 기타 신장 질환들)이다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개 질환은 투석 또는 혈액을 합성 튜브 및/또는 외래 물질을 통해서 여과시키고/시키거나, 통과시키는 환경과 관련된 보체 활성화를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관성형술(balloon angioplasty)과 관련된 심근 손상 및 재발협착증과 관련된 심근 손상으로 구성되는 군으로부터 선택한다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 이하로 구성되는 군으로부터 선택한다: CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관성형술과 관련된 심근 손상, 재발협착증과 관련된 심근 손상, CABG 수술과 관련된 보체 단백질 매개 합병증, 경피적 관상동맥 중재술(percutaneous coronary intervention)과 관련된 보체 단백질 매개 합병증, 발작성 야간 혈색소뇨증(paroxysomal nocturnal hemoglobinuria), 급성 이식 거부, 과급성 이식 거부, 아급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부. 일부 구체예에서 치료되는 C5 보체 단백질 C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 CABG 수술과 관련된 합병증이다. 특정 구체예에서, 치료되는 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67)를 포함하는 약학 조성물을 투여하여 내인성 C5 보체 단백질에 비해 약 0.5 내지 약 10배인 압타머 혈장 농도를 획득하게 되는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학적 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67) 압타머 조성물을 투여하여 내인성 C5 보체 단백질에 비해 약 0.75 내지 약 5배, 0.75 내지 약 3배, 및 1.5 내지 약 2배의 압타머 혈장 농도를 획득하게 되며, 다른 구체예에서는 압타머 조성물을 투여하여 내인성 보체 단백질과 균등한 농도를 획득하게 된다. 일부 구체예에서, ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67)을 포함하는 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 압타머 혈장 농도 약 5 μM, 약 4 μM, 약 3 μM , 약 2 μM, 약 1.5 μM, 약 1 μM 또는 약 500 nM을 획득하게 된다.
투여의 경로, 기간(duration), 및 속도는 본 발명의 압타머 혈장 농도를 획득하는데 충분한 것을 사용할 수 있다. 일부 구체예에서 약학 조성물은 정맥내로 투여한다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 볼러스로서 및/또는 연속 인퓨젼으로서 투여한다.
CABG 수술과 관련된 합병증, 특별히 CABG 수술과 관련된 심근 손상을 치료, 예방 및/또는 완화시키기 위한 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 수술 전에 그리고 적어도 24시간에서, 일부 구체예에서 약 48 시간 또는 일부 구체예에서 약 72 시간에서 연속 투여로 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 이 태양의 특정 구체예에서, 낮은 투여량의 압타머를 정맥내 인퓨젼시키기에 앞서, 동시에 또는 이후에, 바람직하게는 치료되는 환자의 kg 당 약 1 mg의 압타머를 정맥내 볼러스로 약 0.75 내지 1.25 투여함으로써, 내인성 보체 단백질의 약 2배의 혈장 압타머 농도를 획득하게 되며 여기서 mg은 컨쥬게이트화된 PEG의 중량을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서 낮은 투여량은 0.001 내지 0.005 mg/kg/min의 범위로부터 선택한 속도로 인퓨젼시키며 여기서 mg은 컨쥬게이트화된 PEG의 중량을 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, 낮은 투여량은 약 0.0013 mg/kg/min의 속도로 인퓨젼시킨다. 본 발명의 이 태양의 더 다른 구체예에서, 압타머/컨쥬게에트가 충분히 긴 반감기를 가지는 경우, 압타머 약학 조성물은 1일 1회 또는 2회 정맥내 볼러스 투여량로서 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서, 진단 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 진단 방법은 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67)를 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체를 포함하는 것으로 추정되는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 보체 단백질 또는 변이체는 척추동물, 구체적으로 포유동물, 더 구체적으로 인간이다. 본 발명은 시험관내 또는 생체내 진단용으로 사용하기 위한 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67) 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 태양에서, 이하로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다: ARC330(서열 번호: 2) 및 ARC188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522-525, ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537, ARC1730,(서열 번호: 6 내지 서열 번호: 66). 다른 구체예에서 약학 조성물을 제조하는데 사용하기 위한 ARC330(서열 번호: 2) 및 ARC188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522-525, ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537, ARC1730,(서열 번호: 6 내지 서열 번호: 66) 중 어느 하나를 제공한다. 이 태양에서, 본 발명은 생체내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 압타머 또는 이것의 염의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
특정 구체예에서, 서열 번호: 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 일부 구체예에서, 압타머가 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 그 압타머는 서열 번호: 4에 따른 서열로 구성되는 압타머로서 C5 보체 단백질에 대해 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖지만 다만 PEG 부분은 갖지 않는다.
일부 구체예에서 압타머가 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 그 압타머는 이하의 실시예 5E에서 측정한 바와 같이 2-컴파트먼트 모델에서, 영장류에서 반감기, 바람직하게는 말단 반감기 15 시간 이상, 바람직하게는 30 시간 이상을 가진다. 일부 구체예에서 압타머가 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 그 압타머는 2-컴파트먼트 모델에서, 래트에서 반감기, 바람직하게는 말단 반감기 1 시간 반 이상, 바람직하게는 7 시간 이상을 가진다.
본 발명의 이 태양의 일부 구체예에서, 압타머가 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 그 압타머는 다음과 같은 식 5' 링커: H2N~~~~~5'압타머3',(식 중, ~~~~~은 링커를 나타냄)로 합성한다. 일부 구체예에서 링커는 다음과 같은 식의 알킬 링커: H2N-(CH2)n-5'압타머3'이며, 식 중 n = 2 내지 18, 바람직하게는 n = 2 - 12, 더 바람직하게는 n = 3 내지 6, 더 바람직하게는 n = 6이며,
Figure 112014008692587-pat00009
여기서 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드이며, mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이며, 모든 기타 뉴클레오티드는 2'-OH이며, 그리고 3T는 역전된 데옥시 티미딘을 나타낸다. 얻어진 아민-변환 압타머는 10 kDa PEG, 20 kDa PEG, 30 kDa PEG 및 40 kDa 선형 PEG로 구성되는 군으로부터 선택한 PEG 부분에 컨쥬게이트화될 수 있다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 1, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터, 구체적으로 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 또는 이것의 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 태양에서 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터, 구체적으로 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 포함하며, 생체내에서 질병을 치료, 예방 또는 완화시키는데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
다른 구체예에서, C5 보체 단백질에 의해 매개되는 질병을 치료, 예방 또는 완화시키는 방법을 제공하며, 그 방법은 압타머 또는 이것의 염을 포함하는 약학 조성물을 척추동물에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 압타머는 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터, 구체적으로 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 이 태양의 일부 구체예에서, 그 방법은 본 발명의 약학 조성물을 포유동물에게, 바람직하게는 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 급성 허혈성 질환들(심근경색증, 심장마비, 허혈성/재관류 손상); 급성 염증성 질환들(감염성 질환, 패혈증, 쇼크, 급성/과급성 이식 거부); 만성 염증성 질환 및/또는 면역-매개 질환들(알러지, 천식, 류마티즘성 관절염, 및 기타 류마티즘성 질환들, 다발성 경화증 및 기타 신경학상의 질환들, 건선 및 기타 피부상 질환들, 중증근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 아급성/만성 이식 거부, 사구체신염 및 기타 신장 질환들)이다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개 질환은 투석 또는 혈액을 합성 튜브 및/또는 외래 물질을 통해서 여과시키고/시키거나, 통과시키는 환경과 관련된 보체 활성화를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관성형술과 관련된 심근 손상 및 재발협착증과 관련된 심근 손상으로 구성되는 군으로부터 선택한다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 이하로 구성되는 군으로부터 선택한다: CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관성형술과 관련된 심근 손상, 재발협착증과 관련된 심근 손상, CABG 수술과 관련된 보체 단백질 매개 합병증, 경피성 관성혈관 개입과 관련된 보체 단백질 매개 합병증, 발작성 야간 혈색소뇨증, 급성 이식 거부, 과급성 이식 거부, 아급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부. 일부 구체예에서 치료되는 것인 C5 보체 단백질 C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 CABG 수술과 관련된 합병증이다. 특정 구체예에서, 치료되는 것인 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터, 구체적으로 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호 NO: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 가지는 압타머를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하여 내인성 C5 보체 단백질의 약 0.5 내지 약 10배인 압타머 혈장 농도를 획득하게 되는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학적 압타머 조성물을 투여하여 내인성 C5 보체 단백질에 비해 약 0.75 내지 약 5배, 0.75 내지 약 3배, 및 1.5 내지 약 2배의 압타머 혈장 농도를 획득하게 되며, 다른 구체예에서는 압타머 조성물을 투여하여 내인성 보체 단백질과 균등한 농도를 획득하게 된다. 일부 구체예에서, ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC1905(서열 번호: 67)을 포함하는 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 압타머 혈장 농도 약 5 μM, 약 4 μM, 약 3 μM , 약 2 μM, 약 1.5 μM, 약 1 μM 또는 약 500 nM을 획득하게 된다.
투여의 경로, 기간, 및 속도의 임의의 조합은 본 발명의 압타머 혈장 농도를 획득하는데 충분한 것을 사용할 수 있다. 일부 구체예에서 약학 조성물은 정맥내로 투여한다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 볼러스로서 및/또는 연속 인퓨젼으로서 투여한다.
CABG 수술과 관련된 합병증, 특별히 CABG 수술과 관련된 심근 손상을 치료, 예방 및/또는 완화시키기 위한 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 수술 전에 그리고 적어도 24시간에서, 일부 구체예에서 약 48 시간 또는 일부 구체예에서 약 72 시간에서 연속 투여로 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 이 태양의 특정 구체예에서, 치료되는 환자에게 낮은 투여량의 압타머를 정맥내 인퓨젼하기에 앞서, 동시에 또는 그 이후에 정맥내 볼러스 투여함으로써, 목적하는 압타머 혈장 농도, 일부 구체예에서 내인성 보체 단백질 농도의 2배를 얻게 된다. 본 발명의 이 태양의 더 다른 구체예에서, 압타머/컨쥬게이트가 충분히 긴 반감기를 가지는 경우, 압타머 약학 조성물은 정맥내 볼러스 투여량으로서 1일 1회 또는 2회 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에서 진단 방법을 제공한다. 하나의 구체예에서, 진단 방법은 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체를 포함하는 것으로 추정되는 조성물과 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6 내지 서열 번호 66으로 구성되는 군으로부터, 구체적으로 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 접촉시키는 단계, 및 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 보체 단백질 또는 변이체는 척추동물, 구체적으로 포유동물, 및 더 구체적으로 인간이다. 본 발명은 시험관내 또는 생체내 진단용으로 사용하기 위한, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6 내지 서열 번호 66으로 구성되는 군으로부터, 구체적으로 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 가지는 압타머 조성물을 제공한다. 본 발명에서는, 약학 조성물을 제조하는데 사용하기 위한, 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6 내지 서열 번호 66으로 구성되는 군으로부터, 구체적으로 서열 번호: 61, 서열 번호: 62, 및 서열 번호: 64 내지 서열 번호: 66으로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다.
본 발명의 다른 태양에서, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83, 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 서열 중 어느 하나와 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81, 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 서열 중 어느 하나의 고유한 영역과 80% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 다른 구체예에서 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83, 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 서열 중 어느 하나와 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 특정 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81, 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 서열 중 어느 하나의 고유한 영역과 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 더 다른 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 서열 중 어느 하나에 포함되는 40개의 연속 뉴클레오티드와 동일한 것인 40개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 서열 중 어느 하나에 포함되는 30개의 연속 뉴클레오티드와 동일한 것인 30개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 더 다른 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 서열 중 어느 하나에 포함되는 10개의 연속 뉴클레오티드와 동일한 것인 10개의 연속 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구제척으로 C5 보체 단백질에 결합하는 압타머를 제공한다. 바람직한 구체예에서 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다.
일부 구체예에서, 방금 앞서 기재한 본 발명의 이 태양의 압타머는 이하로 구성되는 군으로부터 선택한 화학적 변형을 추가로 포함할 수 있다: 당 위치에서의 화학적 치환; 포스페이트 위치에서의 화학적 치환; 및 핵산 서열의 염기 위치에서의 화학적 치환. 일부 구체예에서 그 변형은, 변형된 뉴클레오티드의 도입; 3' 캡핑(capping), 고분자량에 대한 컨쥬게이션, 비-면역원성 화합물; 친지질성(lipophilic) 화합물에 대한 컨쥬게이션; 및 포스페이트 백본(back bone)의 변형으로 구성되는 군으로부터 선택한다.
본 발명의 이 태양의 바람직한 구체예에서, 압타머는 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체의 기능을 조절한다. 특히 바람직한 구체예에서, 압타머는 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체의 기능을, 바람직하게는 생체내에서, 더 바람직하게는 인간의 생체내에서 억제한다. 본 발명의 이 태양의 하나의 구체예에서, 그 기능은, 압타머가 C5 보체 단백질을 절단시키면서 조절되며, 바람직하게는 억제된다.
다른 태양의 일부 구체예에서, 본 발명은 생체내에서 C5 보체 단백질 절단을 차단하는 압타머 또는 이것의 염의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열과 80% 동일한, 바람직하게는 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 또는 이것의 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열의 고유한 영역과 80% 동일한, 바람직하게는 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머 또는 이것의 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 40, 30 또는 10개의 뉴클레오티드와 동일한 40, 30 또는 10개의 연속 뉴클레오티드를 가지는 압타머의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 태양에서 생체내에서 질병을 치료, 예방 또는 완화시키는데 사용하기 위해 약학 조성물을 제공하며, 이 경우 약학 조성물은 서열 번호: 3 내지 4, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 가지는 압타머 또는 이것의 염을 포함한다. 이 태양에서, 약학 조성물을 제조하는데 사용하기 위한 서열 번호: 3 내지 4, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 가지는 압타머를 제공한다. 이 태양에서, 본 발명은 생체내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 압타머 또는 이것의 염의 치료적 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 급성 허혈성 질환들(심근경색증, 심장마비, 허혈성/재관류 손상); 급성 염증성 질환들(감염성 질환, 패혈증, 쇼크, 급성/과급성 이식 거부); 만성 염증성 질환 및/또는 면역-매개 질환들(알러지, 천식, 류마티즘성 관절염, 및 기타 류마티즘성 질환들, 다발성 경화증 및 기타 신경학상의 질환들, 건선 및 기타 피부상 질환들, 중증근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 아급성/만성 이식 거부, 사구체신염 및 기타 신장 질환들)이다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개 질환들은 투석 또는 혈액을 합성 튜브 및/또는 외래 물질을 통해서 여과시키고/시키거나, 통과시키는 환경과 관련된 보체 활성화를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관성형술과 관련된 심근 손상 및 재발협착증과 관련된 심근 손상으로 구성되는 군으로부터 선택한다. 일부 구체예에서, 치료되는 것인 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 이하로 구성되는 군으로부터 선택한다: CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관성형술과 관련된 심근 손상, 재발협착증과 관련된 심근 손상, CABG 수술과 관련된 보체 단백질 매개 합병증, 경피성 관성혈관 개입과 관련된 보체 단백질 매개 합병증, 발작성 야간 혈색소뇨증, 급성 이식 거부, 과급성 이식 거부, 아급성 이식 거부, 및 만성 이식 거부. 일부 구체예에서 치료되는 것인 C5 보체 단백질 C5a 및/또는 C5b-9-매개 질환은 CABG 수술과 관련된 합병증이다. 특정 구체예에서, 치료되는 것인 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 서열 번호: 3 내지 4, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 가지는 압타머를 포함하는 약학 조성물을 환자에게 투여하여, 내인성 C5 보체 단백질의 약 0.5 내지 약 10배인 압타머 혈장 농도를 획득하게 되는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학적 압타머 조성물을 투여하여 내인성 C5 보체 단백질의 약 0.75 내지 약 5배, 0.75 내지 약 3배, 및 1.5 내지 약 2배인 압타머 혈장 농도를 획득하게 되며, 다른 구체예에서 압타머 조성물을 투여하여 내인성 보체 단백질과 균등한 농도를 획득하게 된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 약 5 μM, 약 4 μM, 약 3 μM, 약 2 μM, 약 1.5 μM, 약 1 μM 또는 약 50O nM의 압타머 혈장 농도를 얻게 된다.
투여의 경로, 기간, 및 속도의 임의의 조합은 본 발명의 압타머 혈장 농도를 획득하는데 충분한 것을 사용할 수 있다. 일부 구체예에서 약학 조성물은 정맥내로 투여한다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 볼러스로서 및/또는 연속 인퓨젼으로서 투여한다.
CABG 수술과 관련된 합병증, 특별히 CABG 수술과 관련된 심근 손상을 치료, 예방 및/또는 완화시키기 위한 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 수술 전에 그리고 적어도 24시간에서, 일부 구체예에서 약 48 시간 또는 일부 구체예에서 약 72 시간에서 연속 투여로 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 이 태양의 특정 구체예에서, 치료되는 환자에게 낮은 투여량의 압타머를 정맥내 인퓨젼하기에 앞서, 동시에 또는 그 이후에 정맥내 볼러스 투여함으로써, 목적하는 압타머 혈장 농도, 일부 구체예에서 내인성 보체 단백질 농도의 2배를 얻게 된다. 본 발명의 이 태양의 더 다른 구체예에서, 압타머/컨쥬게이트가 충분히 긴 반감기를 가지는 경우, 압타머 약학 조성물은 정맥내 볼러스 투여량으로서 1일 1회 또는 2회 투여할 수 있다.
다른 구체예에서 진단 방법을 제공하며, 그 방법은 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체를 포함하는 것으로 추정되는 조성물과 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 접촉시키는 단계, 및 C5 보체 단백질 또는 그들의 변이체의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 보체 단백질 또는 변이체는 척추동물, 구체적으로 포유동물, 및 더 구체적으로 인간이다. 본 발명은 시험관내 또는 생체내 진단용으로 사용하기 위한, 서열 번호: 75 내지 81, 서열 번호: 83 및 서열 번호: 88 내지 98로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 가지는 압타머 조성물을 제공한다.
일부 구체예에서, 서열 번호: 68 및 69로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열로 필수적으로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 일부 구체예에서, 서열 번호: 68 및 69로 구성되는 군으로부터 선택한 뉴클레오티드 서열로 구성되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 압타머를 제공한다. 본 발명의 이 태양의 일부 구체예에서, 진단 방법에 압타머를 사용할 수 있다.
도 1은 보체 시스템의 전형적인 경로와 대안적인 경로를 도시한 도면이다.
도 2는 불규칙(random) 서열 올리고뉴클레오티드의 풀(pool)로부터 시험관내 압타머 선택(SELEXTM) 프로세스를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3a는 항-C5 압타머의 뉴클레오티드 서열과 2차적인 구조를 도시한 도면이며(서열 번호: 1), 이 중 밑줄친 잔기는 2'-H 피리미딘 잔기 또는 2'-플루오로 피리미딘 잔기이며, 박스 안의 잔기는 2-플루오로 피리미딘 잔기 또는 2'-OMe 피리미딘 잔기이며, 그리고 화살표(→)로 표시한 잔기는 반드시 2'-플루오로 변형을 포함하는 것이다.
도 3b는 ARC33O 항-C5 압타머의 뉴클레오티드 서열과 2차적인 구조를 도시한 도면이며(서열 번호: 2), 이 중 원형 안의 잔기는 2'-H 잔기이며, 피리미딘 잔기는 2'-플루오로 치환되었으며, 그리고 다수의 푸린 잔기는 2'-OMe 치환되었으며, 다만 외곽선으로 표시한 3개의 2'-OH 푸린 잔기는 제외한다.
도 3c는 ARC186 항-C5 압타머의 뉴클레오티드 서열과 2차적인 구조를 도시한 도면이며(서열 번호: 4), 이 중 모든 21개의 피리미딘 잔기는 2'-플루오로 변형을 가지며 다수의 푸린(14개의 잔기)은 2'-OMe 변형을 가지며, 다만 외곽선으로 표시한 3개의 2'-OH 푸린 잔기는 제외한다.
도 4는 40 kD 분지형(branched) PEG(1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)의 도면이다.
도 5는 압타머의 5' 말단에 결합된 40 kD 분지형 PEG(1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)의 도면이다.
도 6은 고분자량 PEG-핵산 컨쥬게이트(conjugate)를 합성하기 위한 다양한 전략을 도시한 도면이다.
도 7a는 PEG화 항-C5 압타머(ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62), 및 ARC187(서열 번호: 5))에 의한 투여량 의존성 용혈의 억제를, 비-PEG화 항-C5 압타머(ARC186(서열 번호: 4))와 비교한 그래프이며; 도 7b는 도 7a에 도시된 용혈 분석법에서 사용한 압타머의 IC50 수치의 표이며; 도 7c는 PEG화 항-C5 압타머 ARC187(서열 번호: 5), ARC1537(서열 번호: 65), ARC1730(서열 번호: 66), 및 ARC1905(서열 번호: 67)에 의해 투여량 의존성으로 용혈을 억제하는 것을 비교한 그래프이며; 도 7d는 도 7c에 도시된 용혈 분석법에서 사용한 압타머의 IC50 수치의 표이다.
도 8은 인간 혈청 보체 대비 시노몰거스(cynomolgus) 혈청 보체의, 항-C5 압타머, ARC658(서열 번호: 62)에 의한 용혈의 억제 %의 그래프이다.
도 9는 항온처리 15 분 이후 37 ℃와 실온(23 ℃)에서 ARC186(서열 번호: 4)과 정제된 C5 단백질과의 결합을 도시한 그래프이다.
도 10은 항온처리 4 시간 이후 37 ℃와 실온(23 ℃)에서 ARC186(서열 번호: 4)과 정제된 C5 단백질과의 결합을 도시한 다른 그래프이다.
도 11은 C5·ARC186 복합체가 23 ℃에서 해리(dissociation)되는 시간 과정을 나타내는 그래프이다.
도 12는 C5·ARC186 복합체가 23 ℃에서 평형을 이루는 시간 과정을 나타내는 그래프이다.
도 13은 보체 캐스케이드 중에서 C5 단백질 대비 전후의 단백질 성분들에 대한 ARC186(서열 번호: 4) 결합을 도시하는 그래프이다.
도 14는 비표지화된 경쟁자 ARC186(서열 번호: 4), ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 또는 ARC187(서열 번호: 5)의 존재 하에서 C5와 결합하는 것으로서 방사능 표지화된 ARC186(서열 번호: 4)의 %를 도시한 그래프이다.
도 15는 ARC186(서열 번호: 4) 압타머의 다양한 농도의 존재 하에서 5 시간 동안 25 ℃와 37 ℃에서 항온처리시킨 혈액 시료 중에서 생성된 C5b 보체 단백질의 양을 도시한 그래프이다.
도 16은 희석시키지 않은 인간 혈청, 시트레이트화 인간 전혈 또는 시노몰거스 혈청 중에서 자이모산(zymosan)의 존재 하에서 ARC187(서열 번호: 5)에 의한 보체 억제 %를 도시한 그래프이다.
도 17은 ARC658(서열 번호: 62)이 실시예 1D에 기재한 튜빙 루프 모델(tubing loop model) 중에서 보체 활성화(C5a)를 전적으로 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 18은 C5 선택 풀의 라운드(round) 10에 대한 해리 상수를 도시한 그래프이다. 해리 상수(Kds)는 이하의 방정식에 대해 데이타를 핏팅함으로써 추정한다: 분획 RNA 결합 = 폭(amplitude)*Kd/(Kd + [C5]). "ARC520"(서열 번호: 70)은 천연의 선택하지 않은 dRmY 풀을 의미하며, "+"는 경쟁자의 존재를 의미한다(O.1mg/ml tRNA, 0.1mg/ml 연어 정자 DNA).
도 19는 C5 클론 해리 상수 곡선을 도시한 그래프이다. 해리 상수(KdS)는 이하의 방정식에 데이타를 핏팅함으로써 추정한다: RNA 결합 분획 = 폭*Kd/(Kd + [C5]).
도 20은 다양한 농도의 항-C5 압타머 클론 ARC913(서열 번호: 75)의 용혈 활성에 대한 억제 효과를 ARC186(서열 번호: 4)에 비교하여 도시한 IC50 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 21은 ARC187(서열 번호: 5)의 구조를 도시한 도면이다.
도 22는 ARC1905(서열 번호: 67)의 구조를 도시한 도면이다.
도 23은 처음 단리되어 있는 관류된 심장(isolated perfused heart) 연구의 실험 디자인의 표 형식의 개요이다.
도 24는 인간 혈장에 노출시킨 단리된 심장의 좌심실(LV)에서의 심실내 압력에 대한 압력 추적(A)을 대조군 압타머 용액에 노출시킨 단리된 심장의 LVP 압력 추적(B)과 비교한 그래프이다.
도 25는 몰당량, 10× 및 50× 압타머/C5 용액에 노출시킨 단리된 심장의 좌심실(LV)에서의 심실내 압력에 대한 압력 추적을 비교한 그래프이다(여기서 정상적으로, 희석시키지 않은 인간 혈장에서 C5에 대해 대략 500 nM의 농도로 가정한다).
도 26은 인간 혈장과 다양한 혈장/압타머 용액에 노출시킨 이후 단리된 마우스 심장에서 분당 박동(beats per minute, bpm)으로 된 심박수 변화를 비교한 그래프이다.
도 27은 0 - 1× 몰비 ARC186(서열 번호: 4)(정지된 심장), 또는 10 - 50× 몰비(C5 압타머로 보호된 심장)을 포함하는 인간 혈장에 노출시키기 이전과 이후에 단리된 마우스 심장에서 심장의 중량의 변화를 비교한 그래프이다.
도 28은 다양한 압타머 농도를 포함하는 인간 혈장 중에서, 단리된 마우스 심장을 통해 관류시킨 이후 상대적 C5a 생성을 비교한 그래프이다. 상대적 C5a 농도를 흡광도 단위(Abs)로서 플로팅하였으며, 여기서 더 높은 판독치는 더 높은 C5a 수치의 존재를 반영하는 것이다.
도 29는 다양한 압타머 농도를 포함하는 인간 혈장 중에서, 단리된 마우스 심장을 관류시킨 이후 상대적 가용성 C5b-9 생성을 비교한 그래프이다.
도 30은 마우스 심장 유출물(effluent) 중에서 C3 절단에 대한 ARC186(서열 번호: 4)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 31은 단리되어 있는 관류된 마우스 심장 연구에 대한 면역조직화학(immunohisto-chemistry) 스테이닝(staining) 결과를 나타내는 표이다.
도 32는 인간 또는 영장류의 혈청에서, C5b-매개 손상으로부터 보호하는데 필요한 ARC658(서열 번호: 62)의 몰비를 나타내는 표이다.
도 33은 래트와 시노몰거스 마카크(cynomolgus macaque) 혈장에서 항온처리 시간의 함수로서 전장(full-length) ARC186의 잔류 %의 로그-선형 플롯을 나타내는 그래프이다.
도 34는 실시예 5에서 기재하고 있는 바와 같이 스프라그-다울리 래트(Sprague-Dawley rat)에서 실시한 약물동력학 연구의 실험 디자인을 나타내는 표이다.
도 35는 스프라그-다울리 래트에서 시간에 대한 ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 또는 ARC187(서열 번호: 5)의 평균 혈장 농도를 나타내는 표이다.
도 36은 래트에게 압타머를 정맥 투여한 이후 시간에 걸쳐 ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 및 ARC187(서열 번호: 5)의 평균 혈장 농도를 도시하는 그래프이다.
도 37은 도 35와 36에 도시한 시간 데이타 대비 농도의 비-컴파트먼트 분석(noncompartmental analysis)을 나타내는 표이다.
도 38a는 마우스에서 ARC187(서열 번호: 5)과 ARC1905(서열 번호: 67)의 약물동력학 연구에 대한 디자인을 나타내는 표이고; 도 38b는 CD-1 마우스에서 단회 IV 볼러스 투여 이후 ARC187(서열 번호: 5)과 ARC1905(서열 번호: 67)의 약물동력학적 프로파일을 도시하는 그래프이며; 도 38c는 도 38b에 도시된 시간 데이타 대비 농도의 비-컴파트먼트 분석을 나타내는 표이다.
도 39는 정맥내 투여 이후 마우스 심장 조직에서 나열된 압타머의 검출을 나타내는 표이다.
도 40은 실시예 5E에서 기재한 동물 연구 1의 실험 디자인을 나타내는 표이다.
도 41은 시노몰거스 마카크에게 압타머를 정맥내 볼러스 투여한 이후 시간 대비 압타머의 혈장 농도를 나타내는 표이다.
도 42는 연구 1에서 시노몰거스 마카크에게 정맥내로 투여한 ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 및 ARC187(서열 번호: 5)에 대한 약물동력학적인 파라미터를 나열한 표이다.
도 43(a)와 43(c)는 시노몰거스 마카크에게 항-C5 압타머 ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62), 또는 ARC187(서열 번호: 5)을 정맥내 투여한 이후 시간에 대해 sC5b-9와 C5a의 혈장 농도를 도시하는 그래프이며; 도 43(b)와 43(d)는 항-C5 압타머, ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62), 또는 ARC187(서열 번호: 5)의 농도 대비 sC5b-9와 C5a의 혈장 농도를 도시하는 그래프이다.
도 44는 실시예 5F에서 기재한 연구 2의 실험 디자인을 나타내는 표이다.
도 45는 시노몰거스 마카크에게 ARC658(서열 번호: 62), 또는 ARC187(서열 번호: 5)을 정맥내 투여한 이후 다양한 시간 지점에서 평균 압타머 혈장 농도를 보나타내는 그래프이다.
도 46은 시노몰거스 마카크에게 정맥내 볼러스로 압타머를 투여한 이후 시간 데이타 대비 농도의 2-컴파트먼트 분석을 나타내는 표이다.
도 47은 시노몰거스 마카크에서 자이모산의 존재 하에 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC658(서열 번호: 62) 농도 대비 C5b-9 농도를 도시하는 그래프이다.
도 48은 시노몰거스 혈장 중 자이모산의 존재 하에 ARC187(서열 번호: 5) 또는 ARC658(서열 번호: 62) 농도 대비 C5a 농도를 도시한 그래프이다.
도 49는 시노몰거스 마카크에게 IV 볼러스 더하기 인퓨젼(infusion) 투여 동안과 그 이후에 ARC187(서열 번호: 5)의 PK-PD 연구를 요약한 표이다.
도 50은 시노몰거스 마카크에게 IV 볼러스 투여 이후 ARC187(서열 번호: 5)에 대한 약물동력학적 파라미터를 요약한 표이다.
도 51은 시노몰거스 마카크에게 IV 볼러스 더하기 인퓨젼 투여 동안과 그 이후에 ARC187(서열 번호: 5)의 약물동력학적 프로파일의 계산한 값과 실제 측정한 값을 도시하는 그래프이다.
도 52는 시노몰거스 마카크에게 IV 볼러스 더하기 인퓨젼 투여 동안과 그 이후에 실제 ARC187(서열 번호: 5)의 혈장 레벨이 일정하게 유지되는 것을 나타내는 그래프이다.
도 53은 CABG 수술 중 항-C5 압타머에 대한 예측된 인간 투약 요건(human dosing requirement)을 나타내는 표이다.
도 54는 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)에 의해 측정된 것으로서 ARC187(서열 번호: 5)이 응고에 대해 상대적으로 시험관내 효과가 없다는 것을 조시하는 그래프이다.
도 55는 헤파린의 항-응고 활성, 및 프로타민의 전응고(precoagulation) 활성에 대한 ARC187(서열 번호: 5)의 시험관내 효과를 요약한 표이다.
도 56은 ARC187(서열 번호: 5)이 생체내 헤파린 항응고의 역전에 대해 효과를 미치지 않는다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 57은 자이모산의 보체 활성화를 억제함으로써 측정한 것으로서, 헤파린과 프로타민이 둘 다 ARC187(서열 번호: 5) 항-보체 기능에 대해 효과를 가지지 않는다는 것을 보여준다.
도 58은 항-C5 압타머 ARC1905(서열 번호: 67) 또는 ARC672(서열 번호: 63)의 농도의 함수로서 인간 혈청의 존재 하에 양(sheep) 적혈구 용혈의 억제 %를 도시한 그래프이다.
도 59a는 ARC1905(서열 번호: 67)에 의해 인간, 시노몰거스 멍키 및 래트 혈청의 존재 하에 용혈의 억제 %를 도시한 그래프이며; 도 59b는 인간, 시노몰거스 멍키 및 래트 혈청에서 ARC1905, 항-C5 압타머 또는 ARC127, C5와 결합하지 않는 것인 부적절한 압타머(irrelevant aptmer)(음성 대조군)에 의해 보체 활성화의 억제에 대한 평균 IC50 수치를 요약한 표이다.
도 60은 경쟁 결합 분석법(competition binding assay)으로서, 방사능 표지화된 ARC186(서열 번호: 4)의 억제에 대한 IC50 수치(세로 축)를 비표지화된 경쟁자 ARC1905(서열 번호: 67) 또는 ARC672(서열 번호: 63)(가로 축)의 농도의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 61은 경쟁 결합 분석법으로서, 37 ℃와 25 ℃에서 방사능 표지화된 ARC186(서열 번호: 4)의 억제에 대한 IC50 수치(세로 축)를 비표지화된 경쟁자 ARC1905(서열 번호: 67)(가로 축)의 농도의 함수로서 도시한 그래프이다.
도 62는 인간 C5a(hC5a) 및 시노몰거스 멍키 C5a(hC5a eq)에 대한 표준 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 63은 자이모산-유도 보체 활성화 분석법(zymosan-induced complement activation assay)에서 측정한 것으로서, ARC1905(서열 번호: 67)에 의해 인간과 시노몰거스 멍키 혈청에서 C5 활성화의 억제에 대한 IC50, IC90 및 IC99 수치를 요약한 표이다.
도 64는 자이모산-유도 보체 활성화 분석법에서 측정한 것으로서, 인간 및 시노몰거스 멍키 혈청에서 ARC1905(서열 번호: 67) 농도의 함수로서 C5a 생성의 억제 %를 도시한 그래프이다.
도 65는 자이모산-유도 보체 활성화 분석법에서 측정한 것으로서, 인간 또는 시노몰거스 멍키 혈청에서 C3a 생성에 대한 ARC1905(서열 번호: 67)의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 66은 보체 활성화의 튜빙 루프 모델에서 측정한 것으로서, 5명의 도너로부터 인간 혈청에서 보체 활성화의 ARC1905 억제(서열 번호: 67)에 대한 평균 IC50, IC90 및 IC99 수치를 요약한 표이다.
도 67은 보체 활성화의 튜빙 루프 모델에서, ARC1905, 항-C5 압타머, 또는 ARC127, C5와 결합하지 않는 것인 무의미한 압타머(음성 대조군)의 농도의 함수로서 C5a 및 C3a의 생성의 억제 %를 도시한 그래프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 하나 또는 그 이상의 구체예의 상세사항을 이하에 수반되는 명세서에 기재하였다. 본원에 기재한 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법과 물질을 본 발명을 실시하거나 또는 테스트하는데 사용할 수 있지만, 바람직한 방법과 물질을 이제 기재하였다. 본 발명의 다른 특징, 목적, 및 장점은 본 명세서로부터 명백하다. 본 명세서에서는, 명백하게 문장에서 달리 언급하지 않았다면, 단수 형태는 또한 복수 형태를 포함한다. 달리 정의하지 않았다면, 본원에서 사용한 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 혼란이 생기는 경우, 본 명세서는 조절된다.
셀렉스 ( SELEX TM ) 방법
압타머를 생성시키는 적절한 방법은 일반적으로 도 2에 도시한 "지수 부가에 의한 리간드의 체계적 진화(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)"("SELEXTM")로 명명된 프로세스이다. SELEXTM 프로세스는 표적 분자에 상당히 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 시험관내 진화시키기 위한 방법이며, 미국 특허출원 No. 07/536,428(Jun. 11, 1990 출원 후 현재 포기), 미국 특허 No. 5,475,096(발명의 명칭 "핵산 리간드"), 및 미국 특허 No. 5,270,163(또한 WO 91/19813 참조, "핵산 리간드")에 기재되어 있다. 각각의 SELEXTM-확인 핵산 리간드, 예컨대, 각각의 압타머는, 주어진 표적 화합물 또는 분자의 특이적인 리간드이다. SELEXTM 프로세스는 핵산이 다양한 2-차원과 3-차원 구조를 형성하기 위해 충분한 용량(capacity), 및 단량체이거나 또는 중합체이거나 실질적으로 임의의 화학적 화합물과 리간드로서 작용(즉, 특이적인 결합 쌍을 형성)하는 그들의 단량체 내에서 가능한 충분한 화학적 다양성을 가진다는 특유한 사상에 기초한 것이다. 임의의 크기의 분자 또는 조성물이 표적으로서 작용할 수 있다.
SELEXTM은 불규칙화된 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 대형 라이브러리 또는 풀 상에서 출발 지점으로서 의존한다. 그 올리고뉴클레오티드는 변형되거나 또는 변형되지 않은 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 일부 구체예에서, 그 풀은 100% 불규칙 또는 부분 불규칙 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 그 풀은 불규칙 또는 부분 불규칙이며, 불규칙화된 서열 안에 도입된 적어도 하나의 고정되고/되거나, 보존된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 그 풀은 그것의 5' 및/또는 3' 말단에 적어도 하나의 고정되고/되거나, 보존된 서열을 포함하며 불규칙 또는 부분 불규칙 올리고뉴클레오티드를 포함하며 이것은 올리고뉴클레오티드 풀의 모든 분자에 의해 공유되는 서열을 포함할 수 있다. 고정 서열은 예컨대 PCR 프라이머용 하이브리드화 부위, RNA 폴리머라제에 대한 프로모터 서열(예컨대, T3, T4, T7, 및 SP6), 제한 부위, 또는 동종중합성 서열, 예컨대 폴리 A 또는 폴리 T 트랙(tract), 효소성 코어, 친화도 칼럼에 대한 선택적 결합용 부위, 및 관심이 되는 올리고뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 시퀀싱(sequencing)을 촉진하는 다른 서열들이다. 보존 서열은, 동일한 표적에 결합하는 다수의 압타머에 의해 공유되는 것으로서 앞서 기재한 고정 서열이 아닌 서열이다.
그 풀의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 불규칙 서열 부분 뿐 아니라 충분히 증폭되는데 필요한 고정 서열을 포함한다. 통상적으로 출발 풀의 올리고뉴클레오티드는 30-50개의 불규칙 뉴클레오티드의 내부 영역에 플랭킹된(flank) 고정 5' 및 3' 말단 서열을 포함한다. 불규칙 뉴클레오티드는 불규칙하게 절단된 세포성 핵산으로부터 화학적 합성과 크기 선택을 포함하는 다수의 방식으로 생성시킬 수 있다. 테스트 핵산에서의 서열 다양성은 또한 선택/증폭 반복(iteration) 이전 또는 그 동안 돌연변이화에 의해 도입되거나 또는 증가될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 불규칙화된 서열 부분은 임의의 길이일 수 있으며 그리고 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며 그리고 변형되거나 또는 비-천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체(analogs)를 포함할 수 있다. 미국 특허 No. 5,958,691; 미국 특허 No. 5,660,985; 미국 특허 No. 5,958,691; 미국 특허 No. 5,698,687; 미국 특허 No. 5,817,635; 미국 특허 No. 5,672,695, 및 PCT 공개 WO 92/07065 참조. 불규칙 올리고뉴클레오티드는 본 기술 분야에서 주지된 고체상 올리고뉴클레오티드 합성을 사용하여 포스포디에스테르-결합된 뉴클레오티드로부터 합성할 수 있다. 예컨대, 문헌[Froehler et al, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467(1986) 및 Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575-5578(1986)] 참조. 불규칙 올리고뉴클레오티드는 또한 트리에스테르 합성 방법과 같은 용액상 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 예컨대, 문헌[Sood et al, Nucl. Acid Res. 4:2557(1977) 및 Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449(1978)] 참조. 자동화된 DNA 합성 장비 상에서 수행하는 통상적인 합성에 의해 1014-1016개의 개별 분자를 얻으며, 이 수치는 대부분의 SELEXTM 실험에 충분하다. 서열 디자인 중 불규칙 서열의 충분히 큰 영역은 각각의 합성된 분자가 고유한 서열을 나타내는 것과 유사한 방식으로 증가하게 된다.
올리고뉴클레오티드의 출발 라이브러리는 DNA 합성기 상에서 자동화된 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 불규칙화된 서열을 합성하기 위해, 합성 프로세스 동안 모든 4개의 뉴클레오티드의 혼합물을 각각의 뉴클레오티드 첨가 단계에서 첨가하여, 뉴클레오티드를 불규칙 도입시킨다. 전술한 바와 같이, 하나의 구체예에서, 불규칙 올리고뉴클레오티드는 전적으로 불규칙 서열들을 포함하지만; 그렇지만, 다른 구체예에서, 불규칙 올리고뉴클레오티드는 비-불규칙 또는 부분 불규칙 서열의 스트레치(stretches)를 포함할 수 있다. 부분 불규칙 서열은 각각의 첨가 단계에서 4개의 뉴클레오티드를 상이한 몰비로 첨가함으로써 생성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 츨발 라이브러리는 RNA 또는 DNA일 수 있다. RNA 라이브러리를 출발 라이브러리로 사용하는 그런 경우 그것은 통상 시험관내에서 T7 RNA 폴리머라제 또는 변형된 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 DNA 라이브러리를 전사시키며 그리고 정제함으로써 생성된다. 이후 RNA 또는 DNA 라이브러리를 결합에 바람직한 조건 하에 표적과 혼합시키며 그리고 동일한 일반 선택 반응식을 사용하여, 결합, 분배(partitioning) 및 증폭을 단계적으로 반복시켜, 임의의 목적하는 수준의 결합 친화성 및 선택성을 실질적으로 얻게 된다. 더 구체적으로, 핵산의 출발 풀을 포함하는 혼합물로 시작하는 경우, SELEXTM 방법은 이하의 단계를 포함한다:(a) 결합에 바람직한 조건 하에서 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계;(b) 표적 분자에 특이적으로 결합하는 그런 핵산으로부터 결합하지 않은 핵산을 분배하는 단계;(c) 핵산-표적 복합체를 해리시키는 단계;(d) 핵산-표적 복합체로부터 해리시킨 핵산을 증폭시켜 핵산의 리간드-보강 혼합물을 얻는 단계; 및(e) 목적하는 바와 같은 다수의 사이클을 통해 결합, 분배, 해리 및 증폭의 단계를 반복하여 표적 분자에 대해 상당히 특이적이고, 상당히 친화성이 있는 핵산 리간드를 얻는 단계. RNA 압타머를 선택하는 그런 경우, SELEXTM 방법은 이하의 단계를 포함한다:(i) 단계(d)에서 증폭시키기 이전에 핵산-표적 복합체로부터 해리시킨 핵산을 역전사시키는 단계; 및(ii) 프로세스를 재출발하기 이전에 단계(d)로부터 증폭된 핵산을 전사시키는 단계.
다수의 가능한 서열과 구조를 포함하는 핵산 혼합물은, 주어진 표적에 대해 광범위한 결합 친화성을 가진다. 예컨대, 20개의 뉴클레오티드 불규칙화 세그먼트를 포함하는 핵산 혼합물은 420개의 후보 가능성을 가질 수 있다. 표적에 가장 잘 결합하는 표적이 더 높은 친화성 상수를 가진다. 분배, 해리 및 증폭 이후, 2차 핵산 혼합물이 생성되며, 이는 더 높은 결합 친화성 후보로 보강된 것이다. 선택의 추가 라운드는, 얻어진 핵산 혼합물이 하나 또는 수개의 서열로 우세하게 구성될 때까지 공격적으로 최선의 리간드를 선호한다. 이들은 이후 클로닝되고, 시퀀싱되며 그리고 순수한 리간드 또는 압타머로서 결합 친화성에 대해 개별적으로 테스트받게 된다.
선택과 증폭의 사이클은 목적하는 목표를 얻을 때까지 반복한다. 가장 일반적인 경우, 그 사이클의 반복 상에서 얻어지는 경합 강도에 있어서 현저한 향상이 없을 때까지 선택/증폭을 계속한다. 그 방법은 통상적으로 대략 1014개의 상이한 핵산 종(species)을 시료로 사용하지만 약 1018개 만큼이나 상이한 핵산 종을 시료로 사용할 수 있다. 일반적으로, 핵산 압타머 분자는 5 내지 20회의 사이클 과정으로 선택한다. 하나의 구체예에서, 초기 선택 단계에서만 이종성(heterogeneity)이 도입되며 그리고 복제 프로세서를 통해서는 발생하지 않는다.
SELEXTM의 하나의 구체예에서, 이 선택 프로세스는 선택된 표적에 가장 강하게 결합하는 그런 핵산 리간드를 분리하는데 있어 상당히 효과적이며, 단지 1회 사이클의 선택과 증폭이 필요하다. 그런 효율적인 선택은, 예컨대, 크로마토그래피-유형 프로세스에서 발생할 수 있으며 여기서 핵산이 칼럼 상에 결합된 표적과 연결되는 핵산의 능력은 칼럼이 충분히 분리시킬 수 있으며 그리고 가장 높은 친화성의 핵산 리간드를 분리시킬 수 있는 그런 방식으로 작동한다.
많은 경우에, 단일 핵산 리간드를 확인할 때까지 SELEXTM의 반복성 단계를 실시하는 것이 반드시 바람직한 것은 아니다. 표적-특이적 핵산 리간드 용액은 다수의 보존 서열과 표적에 대한 핵산 리간드의 친화성에 현저하게 영향을 미치지 않으면서 치환되거나 또는 첨가될 수 있는 다수의 서열을 가지는 하나의 패밀리의 핵산 구조 또는 모티프(motif)를 포함할 수 있다. 완료 이전에 SELEXTM 프로세스를 종결시킴으로써, 다수의 핵산 리간드 용액 패밀리의 서열을 결정하는 것이 가능하다.
다양한 핵산 1차 구조, 2차 구조 및 3차 구조가 존재하는 것으로 알려져 있다. 비-왓슨-크릭 유형 상포작용이 관여하여 가장 통상적인 것으로 보여지는 그런 구조 또는 모티프는 헤어핀(hairpin) 루프, 대칭성 및 비대칭성 돌출부(bulge), 유사매듭(pseudoknot) 및 그것들의 무수한 조합으로서 일컬어진다. 거의 대부분의 그런 모티프의 알려진 경우는 그들이 30개 이하의 뉴클레오티드의 핵산 서열 중에서 형성될 수 있다는 것을 제안한다. 이러한 이유로, 빈번하게 연속 불규칙 세그먼트를 가지는 SELEXTM 과정이 약 20 내지 약 50개의 뉴클레오티드 사이 및 일부 구체예에서 약 30 내지 약 40개의 뉴클레오티드 사이의 불규칙화 세그먼트를 포함하는 핵산 서열로 개시되는 것이 바람직하다. 하나의 실시예에서, 5'-고정:불규칙:3'-고정 서열은 약 30 내지 약 50개의 뉴클레오티드의 불규칙 서열을 포함한다.
코어 SELEXTM 방법은 다수의 특이적 대상을 얻도록 변형되어 왔다. 예컨대, 미국 특허 No. 5,707,796은 특이적 구조 특징 예컨대 굽힌 DNA를 갖는 핵산 분자를 선택하기 위해 겔 전기영동과 조합시킨 SELEXTM의 사용을 기재하였다. 미국 특허 No. 5,763,177은 표적 분자를 결합시키고/시키거나, 광가교(photocrosslinking)시키고/시키거나, 광활성화시킬 수 있는 광활성 기를 포함하는 핵산 리간드를 선택하기 위한 방법에 기초하는 SELEXTM을 기재하였다. 미국 특허 No. 5,567,588 및 미국 특허 No. 5,861,254는 표적 분자에 대해 높고 낮은 친화성을 가지는 올리고뉴클레오티드 사이에서 상당히 효과적인 분배를 얻는 방법에 기초하는 SELEXTM을 기재하였다. 미국 특허 No. 5,496,938은 SELEXTM 프로세스를 실시한 이후 향상된 핵산 리간드를 얻기 위한 방법을 기재하고 있다. 미국 특허 No. 5,705,337은 그것의 표적에 대해 리간드를 공유 결합시키기 위한 방법을 기재하고 있다.
SELEXTM은 또한 표적 분자 상에 1 이상의 위치에 결합하는 핵산 리간드를 얻으며, 그리고 표적 상에 특이적 위치에 결합하는 비-핵산 종을 포함하는 핵산 리간드를 얻는데 사용할 수 있다. SELEXTM은 표적, 대형 및 소형 바이오분자 예컨대 핵산-결합 단백질 및 그들의 생물학적 기능의 일부로서 핵산에 결합하는 것으로 알려지지 않은 단백질 뿐 아니라 조인자(cofactor) 및 다른 소형 분자를 포함하는 임의의 가시적인 표적에 결합하는 핵산 리간드를 분리하며 그리고 확인하기 위한 수단을 제공한다. 예컨대, 미국 특허 No. 5,580,737은 SELEXTM를 통해 확인된 핵산 서열을 개시하고 있으며 그것은 카페인 및 밀접하게 관련된 유사체, 테오필린에 높은 친화성으로 결합할 수 있다.
카운터-SELEXTM는 1 또는 그 이상의 비-표적 분자에 대한 교차-반응성을 가지는 핵산 리간드 서열을 제거함으로써 표적 분자에 대한 핵산 리간드의 특이성을 향상시키는 방법이다. 카운터-SELEXTM는 이하의 단계를 포함한다:(a) 핵산의 후보 혼합물을 준비하는 단계;(b) 후보 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계, 여기서 후보 혼합물에 상대적으로 표적에 대해 증가된 친화성을 가지는 핵산은 후보 혼합물의 잔류물로부터 분리될 수 있어야 함;(c) 후보 혼합물의 잔류물로부터 증가된 친화성의 핵산을 분리하는 단계;(d) 표적으로부터 증가된 친화성의 핵산을 해리시키는 단계; e) 증가된 친화성의 핵산을 1 또는 그 이상의 비-표적 분자와 접촉시켜 비-표적 분자(들)에 대해 특이적 친화성을 가지는 핵산 리간드를 제거시키는 단계; 및 f) 오로지 표적 분자에 대해서만 특이적 친화성을 가지는 핵산을 증폭시켜, 표적 분자에 대해 상대적으로 높은 친화성을 가지며 그리고 표적 분자에 대한 결합에 있어서 특이성을 가지는 핵산 서열에 대해서 보강된 핵산의 혼합물을 얻는 단계. 앞서 SELEXTM에 대해서 기재한 바와 같이, 선택과 증폭의 사이클은 목적하는 목표가 획득될 때까지 필요한 만큼 반복한다.
치료제와 백신으로서의 핵산의 용도에 개입된 하나의 잠재적인 문제점은, 그들의 포스포디에스테르 형태로 된 올리고뉴클레오티드가, 목적하는 효과를 달성하기 이전에 세포내 효소와 세포밖 효소 예컨대 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의해 체액 중에서 빠르게 분해될 수 있다는 점이다. 따라서 SELEXTM 방법은 리간드 상에 향상된 특성, 예컨대 향상된 생체내 안정성 또는 향상된 운반 특성을 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 고-친화성의 핵산 리간드를 확인하는 것을 포함하게 된다. 그런 변형의 예는 리보즈 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 SELEXTM-확인 핵산 리간드는, 예컨대, 미국 특허 No. 5,660,985에 기재되어 있으며, 여기에서는 2' 위치의 리보즈, 5 위치의 피리미딘, 및 8 위치의 푸린에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있으며, 미국 특허 No. 5,756,703에서는 다양한 2'-변형된 피리미딘을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있으며, 그리고 미국 특허 No. 5,580,737에서는 2'-아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F), 및/또는 2'-OMe(2'-OMe) 치환기로 변형된 1 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 상당히 특이적인 핵산 리간드를 기재하고 있다.
본 발명에서 고려중인 핵산 리간드의 변형은, 추가 전하, 분극성(polarizability), 소수성(hydrophobicity), 수소 결합, 정전기적 상호작용, 및 전체로서의 핵산 리간드 염기 또는 핵산 리간드에 대한 유동성(fluxionality)을 도입시킨 다른 화학적 기를 제공하는 것을 포함하지만, 그것 만으로 한정하는 것은 아니다. 뉴클레아제에 저항하는 올리고뉴클레오티드 집단(population)을 생성시키기 위한 변형은 또한 1 또는 그 이상의 치환체 뉴클레오티드간 결합, 바뀐 당, 바뀐 염기 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 그런 변형은, 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 푸린 변형, 엑소사이클릭(exocyclic) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-아이오도-우라실의 치환; 백본 변형, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변형, 메틸화, 및 비정상적인 염기-쌍 조합 예컨대 이소베이스 이소시티딘 및 이소구아니딘을 포함하지만, 이것 만으로 한정하는 것은 아니다. 변형은 또한 캡핑과 같이 3' 및 5' 변형을 포함할 수 있다.
하나의 구체예에서, P(O)O 기가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), P(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 대치된 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H 또는 치환되거나 또는 치환되지않은 알킬이다. 연결기는 -O-, -N-, 또는 -S- 연결(linkage)을 통해 인접하는 뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 중에 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 포스포로티오에이트는 포스포디에스테르 결합 중에 1 또는 그 이상의 비-가교(non-bridging) 산소 원자가 1 또는 그 이상의 황 원자로 대치된 것을 포함한다.
추가 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 그룹, 예컨대, 1 또는 그 이상의 하이드록실 기가 할로겐, 지방족 기, 또는 에테르 또는 아민과 같이 작용기화된 것을 치환된 것을 포함한다. 하나의 구체예에서, 푸라노즈 잔기의 2'-위치가 OMe, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴, 또는 할로 기 중 임의의 것으로 치환된다. 2'-변형 당의 합성 방법은, 예컨대, 문헌[Sproat, et al, Nucl. Acid Res. 19:733-738(1991); Cotten, et al, Nucl. Acid Res. 19:2629-2635(1991); 및 Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138-5145(1973)]에 기재하고 있다. 다른 변형에 대해서도 본 기술 분야에서 당업자에게 알려져 있다. 그런 변형은 프리(pre)-SELEXTM 프로세스 변형 또는 포스트(post)-SELEXTM 프로세스 변형(사전에 확인된 변형되지 않은 리간드의 변형)일 수 있으며 또는 SELEX 프로세스 중에 도입시킴으로써 만들어질 수 있다.
프리-SELEX 프로세스 변형 또는 SELEX 프로세스 중에 도입시킴으로써 만들어진 것은 그들의 SELEXTM 표적에 대한 특이성 및 향상된 안정성, 예컨대, 생체내 안정성을 둘 다 가지는 핵산 리간드를 제공한다. 핵산 리간드에 대해 만들어진 포스트-SELEXTM 프로세스 변형은 핵산 리간드의 결합 능력에 반대로 영향을 미치지 않으면서 향상된 안정성, 예컨대, 생체내 안정성을 유발시킬 수 있다.
SELEXTM 방법은 선택된 올리고뉴클레오티드와 다른 선택된 올리고뉴클레오티드 및 비-올리고뉴클레오티드 작용 단위를 조합시키는 것을 포함하며, 미국 특허 No. 5,637,459 및 미국 특허 No. 5,683,867에 기재하고 있다. SELEXTM 방법은 추가로 선택된 핵산 리간드를 진단용 또는 치료용 복합체 중에서 친지질성 또는 비-면역원성 고분자량의 화합물과 조합시키는 것을 포함하며, 예컨대, 미국 특허 No. 6,011,020, 미국 특허 No. 6,051,698, 및 PCT 공개 No. WO 98/18480에 기재하고 있다. 이들 특허 및 특허출원은 넓은 범위의 형태와 다른 성질들과, 올리고뉴클레오티드의 효율적인 증폭과 복제 성질, 및 다른 분자의 바람직한 성질을 조합시키는 것에 대해 가르쳐 주고 있다.
SELEXTM 방법을 통해 소형, 가요성(flexible) 펩티드에 대한 핵산 리간드를 확인하는 것을 또한 개발하였다. 소형 펩티드는 가요성 구조를 가지며 그리고 일반적으로 용액 중에서 다중 컨퍼머(conformer)와 평형으로 존재하며, 그리고 따라서 초기에는 결합 친화성이 가요성 펩티드와의 결합을 잃게되는 구조상 엔트로피(conformational entropy)에 의해 제한될 수 있는 것으로 생각되었었다. 그렇지만, 용액 중 소형 펩티드에 대한 핵산 리간드를 확인하는 것에 대한 타당성은 미국 특허 No. 5,648,214에서 설명하고 있었다. 이 특허에서는, 성분(substance) P, 11개의 아미노산 펩티드에 대한 RNA 핵산 리간드의 높은 친화성을 확인하였다.
표적(들)에 대해 특이성과 결합 친화성을 가지는 본 발명의 압타머는 통상 본원에 기재하고 있는 바와 같이 SELEXTM 프로세스에 의해 선택한다. SELEXTM 프로세스의 일부로서, 표적에 대해 결합하는 것으로 선택된 서열들은 이후 선택적으로 최소화되어 목적하는 결합 친화성을 가지는 최소의 서열로 결정되게 된다. 선택된 서열들 및/또는 최소화된 서열들은, 결합 친화성을 증가시키기 위해 또는 대안으로 결합 활성에 필수적인 서열 중에서의 위치를 결정하기 위해 그 서열의 불규칙 또는 목적하는 돌연변이화를 수행시킴으로써 선택적으로 최적화된다. 추가로, 압타머 분자로 하여금 생체내에서 분해에 대해 안정화되도록 변형된 뉴클레오티드를 도입시킨 서열로 선택을 실시할 수 있다.
2' 변형 SELEX TM
압타머로 하여금 치료용으로 사용하기에 적합하게 하기 위해서는, 바람직하게는 합성하는데 비용이 적게 들고, 생체내에서 안전하며 그리고 안정하여야 한다. 천연형(wild-type) RNA 및 DNA 압타머는 통상적으로 생체내에서 안정하지 않으며 그 이유는 뉴클레아제에 의해 분해되는 그들의 감수성(susceptibility) 때문이다. 뉴클레아제 분해에 대한 저항은 2'-위치에 변형 기를 도입시킴으로써 상당히 증가시킬 수 있다.
플루오로 및 아미노 기를 올리고뉴클레오티드 라이브러리 내로 성공적으로 도입시켜 왔으며 이들로부터 압타머를 연속하여 선택하여 왔다. 그렇지만, 이들 변형은 얻어진 압타머의 합성 비용을 증가시키며, 그리고 일부 경우에서는 안전성 문제를 유발시킬 수 있는데 그 이유는 변형된 올리고뉴클레오티드가 분해되며 그리고 DNA 합성에 대해 기질로서 뉴클레오티드의 후속 사용되는 것에 의해 숙주 DNA 내에서 회수될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 가능성 때문이다.
2'-OMe 뉴클레오티드를 함유하는 압타머("2'-OMe")는, 본원의 일부 구체예에서 제공하는 바와 같이, 많은 이들 단점을 극복하였다. 2'-OMe 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제-저항성이며 그리고 합성하는데 비용이 적게든다. 비록 2'-0Me 뉴클레오티드가 생물학적 시스템에서 편재하긴 하지만, 생리적 조건 하에서 천연 폴리머라제는 기질로서 2'-O-메틸 NTP를 수용하지 않으며, 따라서 숙주 DNA 내로 2'-0Me 뉴클레오티드의 회수에 대한 안전성 문제가 없게 되는 것이다. 2'-변형 압타머를 생성시키는데 사용하는 SELEXTM 방법은, 예컨대, 미국 임시 특허출원 No. 60/430,761(December 3, 2002 출원), 미국 임시 특허출원 No. 60/487,474(July 15, 2003 출원), 미국 임시 특허출원 No. 60/517,039(November 4, 2003 출원), 미국 특허출원 No. 10/729,581(December 3, 2003 출원), 및 미국 특허출원 No. 10/873,856(June 21, 2004 출원, 발명의 명칭 "Method for in vitro Selection of 2'-OMe Substituted Nucleic acid")에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에서 그것의 전문을 참고문헌으로 인용하고 있다.
본 발명은 효소에 의한 분해 및 화학적 분해 뿐 아니라 열에 의한 분해 및 물리적 분해에 대해 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 더 안정한 올리고뉴클레오티드를 만들기 위해, 보체 단백질 C5에 결합하며 그리고 변형 뉴클레오티드(즉, 2' 위치에서 변형을 가지는 뉴클레오티드)를 함유하는 보체 단백질 C5의 기능을 조절하는 압타머를 포함한다. 문헌 중에 압타머를 포함하는 2'-0Me의 몇가지 예가 있지만(즉, Green et al., Current Biology 2, 683-695, 1995 참조) 이들은 변형 전사체의 라이브러리를 시험관내에서 선택함으로써 생성되며 이 중 C 및 U 잔기는 2'-플루오로(2'-F) 치환되며 그리고 A 및 G 잔기는 2'-OH이다. 일단 기능성 서열을 확인한 이후 각각의 A 및 G 잔기를 2'-OMe 치환에 대한 내성(tolerance)을 테스트하며, 그리고 그 압타머는 2'-0Me 잔기로서 2'-0Me 치환을 내성시킨 모든 A 및 G 잔기를 가지도록 재-합성된다. 이 2-단계 유형에서 생성된 압타머의 대부분의 A 및 G 잔기들은 2'-0Me 잔기로의 치환에 내성이며, 다만, 평균상, 대략 20%는 그렇지 않다. 그 결과로서, 이 방법을 사용하여 생성된 압타머는 2 내지 4개의 2'-OH 잔기를 함유하는 경향이 있으며, 그리고 결과적으로 안정성과 합성의 비용이 타당하다. 변형 뉴클레오티드를 전사 반응 내로 도입시킴으로써 올리고뉴클레오티드 풀에 사용하는 안정화된 올리고뉴클레오티드를 생성시키고 그로부터 압타머를 SELEXTM에 의해 선택하고 향상시킴으로써(및/또는 본원에 기재한 것을 포함하는 것으로서, 그것의 편차와 향상 중 임의의 것), 본 발명의 방법은(예컨대, 변형 뉴클레오티드로 압타머 올리고뉴클레오티드를 재합성함으로써) 선택된 압타머 올리고뉴클레오티드를 안정화시키기 위한 필요를 제거하였다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 및 2'-0Me 변형의 조합을 포함하는 압타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-0Me, 2'-NH2, 및 T-메톡시에틸 변형의 조합을 포함하는 압타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP, 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-0Me, 2'-NH2, 및 2'-메톡시에틸 변형의 56개의 조합을 포함하는 압타머를 제공한다.
본 발명의 2' 변형 압타머는 변형 폴리머라제를 사용하여 생성시키며, 예컨대, 변형 T7 폴리머라제로서, 푸라노즈 2' 위치에서 천연형 폴리머라제보다 더 높은 벌키(bulky) 치환기를 가지는 변형 뉴클레오티드의 도입의 비를 가진다. 예컨대, 639 위치에서 타이로신 잔기가 페닐알라닌으로 바뀐 단일 돌연변이체 T7 폴리머라제(Y639F)는 용이하게 2'데옥시, 2'아미노-, 및 2'플루오로- 뉴클레오티드 트리포스페이트(NTPs)를 기질로서 사용하며 그리고 다양하게 응용되기 위해 변형 RNA를 합성하는데 널리 사용되어 왔다. 그렇지만, 보고된 바에 의하면 이 돌연변이체 T7 폴리머라제는 벌키 2'-치환기 예컨대 2'-0Me 또는 2'-아지도(2'-N3) 치환기를 가지는 NTP를 용이하게 사용할 수 없다(즉, 도입할 수 없다). 벌키 2' 치환을 도입시키기 위해, Y639F 돌연변이에 추가로 784 위치에서 히스티딘이 알라닌 잔기로 바뀐 이중(double) T7 폴리머라제 돌연변이체(Y639F/H784A)가 기재되어 있으며 그리고 변형 피리미딘 NTP를 도입시키기 위한 제한된 환경에서 사용되어 왔었다. 문헌[Padilla, R. 및 Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138] 참조. 784 위치에서 히스티딘이 알라닌 잔기로 바뀐 단일 돌연변이체 T7 폴리머라제(H784A) 또한 기재되어 있다. 문헌[Padilla et al, Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138 참조]. Y639F/H784A 이중 돌연변이체 및 H784A 단일 돌연변이체 T7 폴리머라제 둘 다에서, 더 작은 아미노산 잔기 예컨대 알라닌으로 바뀐 것은 더 벌키한 뉴클레오티드 기질, 예컨대, 2'-0 메틸 치환된 뉴클레오티드의 도입을 허용한다.
일반적으로, 그것은 본원에 개시한 조건 하에서 발견되었으며, Y693F 단일 돌연변이체는 GTP를 제외한 모든 2'-0Me 치환된 NTP 를 도입시키는데 사용할수 있으며 그리고 Y639F/H784A 이중 돌연변이체는 GTP를 포함하는 모든 2'-0Me 치환된 NTP를 도입시키는데 사용할 수 있다. H784A 단일 돌연변이체는 본원에서 개시한 조건 하에서 사용하는 경우 Y639F 및 Y639F/H784A 돌연변이체와 유사한 성질을 가지는 것으로 기대된다.
2'-변형 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드 전체로서, 또는 변형 뉴클레오티드의 서브세트(subset)로서 합성할 수 있다. 그 변형은 동일하거나 또한 상이할 수 있다. 모든 뉴클레오티드는 변형될 수 있으며, 그리고 모두 동일한 변형을 포함할 수 있다. 모든 뉴클레오티드가 변형될 수 있지만, 상이한 변형을 포함하는데, 예컨대, 동일한 염기를 포함하는 모든 뉴클레오티드는 하나의 유형의 변형을 가질 수 있으며, 다른 염기를 포함하는 뉴클레오티드는 상이한 유형의 변형을 가질 수 있다. 모든 푸린 뉴클레오티드는 하나의 유형의 변형을 가질 수 있으며(또는 변형되지 않으며), 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 서로 상이한 유형의 변형을 가진다(또는 변형되지 않는다). 이 방식으로, 전사체, 또는 전사체의 풀이 변형의 임의의 조합을 사용하여 생성되며, 예컨대, 리보뉴클레오티드(2'-OH), 데옥시리보뉴클레오티드(2'-데옥시), 2'-F, 및 2'-0Me 뉴클레오티드를 포함한다. 2'-OMe C 및 U 그리고 2'-OH A 및 G를 포함하는 전사 혼합물을 "rRmY" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "rRmY" 압타머라고 일컫는다. 데옥시 A 및 G 그리고 2'-0Me U 및 C를 포함하는 전사 혼합물을 "dRmY" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "dRmY" 압타머라고 일컫는다. 2'-0Me A, C, 및 U, 그리고 2'-OH G를 포함하는 전사 혼합물을 "rGmH" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "rGmH" 압타머라고 일컫는다. 대안으로 2'-0Me A, C, U 및 G 그리고 2'-0Me A, U 및 C 그리고 2'-F G를 포함하는 전사 혼합물을 "교대(alternating) 혼합물'로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "교대 혼합물" 압타머라고 일컫는다. 10%의 G가 리보뉴클레오티드인 2'-0Me A, U, C, 및 G를 포함하는 전사 혼합물을 "r/mGmH" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "r/mGmH" 압타머라고 일컫는다. 2'-0Me A, U, 및 C, 그리고 2'-F G를 포함하는 전사 혼합물을 "fGmH" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "fGmH" 압타머라고 일컫는다. 2'-0Me A, U, 및 C, 그리고 데옥시 G를 포함하는 전사 혼합물을 "dGmH" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "dGmH" 압타머라고 일컫는다. 데옥시 A, 그리고 2'-0Me C, G 및 U를 포함하는 전사 혼합물을 "dAmB" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "dAmB" 압타머라고 일컬으며, 그리고 모든 2'-OH 뉴클레오티드를 포함하는 전사 혼합물을 "rN" 혼합물로 일컬으며 그리고 그것으로부터 선택한 압타머는 "rN" 또는 "rRrY" 압타머라고 일컫는다. "mRmY" 압타머는 모든 2'-0Me 뉴클레오티드를 포함하는 것이며 그리고 가능한 경우, 임의의 2'-OH Gs를 2'-0Me Gs로의 포스트-SELEX 치환에 의해 r/mGmH 올리고뉴클레오티드로부터 일반적으로 유도된다.
바람직한 구체예는 2'-OH, 2'-데옥시 및 T- OMe 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함한다. 더 바람직한 구체예는 2'-데옥시 및 2'-0Me 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함한다. 더 더욱 바람직한 구체예는 2'-데옥시와 2'-0Me 뉴클레오티드의 임의의 조합이며 여기서 그 피리미딘은 2'-0Me이다(예컨대 dRmY, mRmY 또는 dGmH).
변형 뉴클레오티드를 본 발명의 압타머 내에 도입시키는 것은 선택 프로세스(예컨대, 프리-SELEXTM 프로세스 변형) 이전에(pre-) 실시되었다. 선택적으로, 본 발명의 압타머는 그것의 변형 뉴클레오티드를 프리-SELEXTM 프로세스 변형으로부터 도입한 것으로서, 포스트-SELEXTM 프로세스 변형에 의해 추가로 변형될 수 있다(즉, 프리-SELEXTM 변형 이후 포스트-SELEXTM 프로세스 변형). 프리-SELEXTM 프로세스 변형은 SELEXTM 표적에 대해 특이성을 가지는 변형 핵산 리간드를 제공하며 그리고 또한 생체내 안정성이 향상된다. 포스트-SELEXTM 프로세스 변형, 예컨대, 변형(예컨대, 프리-SELEXTM 프로세스 변형에 의해 도입된 뉴클레오티드를 가지는 것으로서 절단(truncation), 삭제, 치환 또는 사전에 확인한 리간드의 추가 뉴클레오티드 변형)은 프리-SELEXTM 프로세스 변형에 의해 도입된 뉴클레오티드를 가지는 핵산 리간드의 결합능에 반대 영향을 미치지 않으면서 생체내 안정성에 있어 더욱 향상을 가져올 수 있다.
폴리머라제가 2'-변형 NTP를 수용하는 조건 하에서 2'-변형(예컨대, 2'-0Me) RNA 전사체의 풀을 생성하기 위해, 바람직한 폴리머라제는 Y693F/H784A 이중 돌연변이체 또는 Y693F 단일 돌연변이체이다. 다른 폴리머라제, 특별히 벌키한 2'-치환기에 대해 상당한 내성을 나타내는 것은, 또한 본 발명에서 사용할 수 있다. 그런 폴리머라제는, 본원에 기재된 전사 조건 하에서 변형 뉴클레오티드를 도입하는 그들의 능력을 분석함으로써 이 가능성에 대해서 스크리닝될 수 있다.
본원에 개시한 방법에 있어서 유용한 전사 조건에 중요한 것으로 다수의 인자들을 측정하였다. 예컨대, 리더 서열이 DNA 전사 주형의 5' 말단에서 고정된 서열의 5' 말단 안으로 도입되는 때에, 얻어진 전사체의 적어도 약 첫번째 6개의 잔기가 모두 푸린이 되는 때에, 변형 전사체의 수율을 증가시키는 것이 관찰되었다.
변형 뉴클레오티드를 도입시킨 전사체를 얻는데 있어 다른 중요한 인자는 2'-OH GTP의 존재 또는 농도이다. 전사는 2개의 페이즈로 나뉠 수 있다: 첫번째 페이즈는 개시이며, NTP가 GTP(또는 다른 치환된 구아노신)의 3'-하이드록실 말단에 첨가되는 동안 약 10-12개의 뉴클레오티드만큼 확장된 디뉴클레오티드를 얻게 되며; 두번째 페이즈는, 전사가 진행되는 동안 첫번째 약 10-12개의 뉴클레오티드가 첨가되는 것을 지나 연장(elongation)이다. 과량의 2'-0Me GTP를 함유하는 전사 혼합물에 첨가된 소량의 2'-OH GTP는 폴리머라제로 하여금 2'-OH GTP를 사용하여 전사를 개시하는 것을 가능하게 하는데 충분하지만, 일단 전사가 연장 페이즈로 들어가면 2'-0Me와 2'-OH GTP 사이에서의 구별이 감소하는 것과, 그리고 2'-OH GTP에 비해 과량의 2'-0Me GTP는 주로 2'-0Me GTP의 도입을 허용하는 것을 발견하였다.
2'-0Me 치환 뉴클레오티드를 전사체 내에 도입시키기 위한 다른 중요한 인자는 전사 혼합물 중에 2가의 마그네슘과 망간을 사용하는 것이다. 염화마그네슘과 염화망간의 상이한 농도의 조합은 2'-0Me 전사체의 수율에 영향을 미치며, 염화마그네슘과 염화망간의 최적 농도는 2가 금속 이온이 복합체를 이루게 되는 전사 반응 혼합물 중에서의 NTP의 농도에 좌우한다는 것을 발견하였다. 최대로 2' 치환된 OMe 전사체의 최대 수율을 얻기 위해서(즉, 모든 A, C, 및 U 그리고 약 90%의 G 뉴클레오티드), 각각의 NTP가 0.5 mM의 농도로 존재하는 경우 대략 5 mM 염화마그네슘 및 1.5 mM 염화망간이 바람직하다. 각각의 NTP가 1.0 mM의 농도인 경우, 대략 6.5 mM 염화마그네슘 및 2.0 mM 염화망간의 농도가 바람직하다. 각각의 NTP의 농도가 2.0 mM인 경우, 대략 9.6 mM 염화마그네슘 및 2.9 mM 염화망간의 농도가 바람직하다. 임의의 경우, 이들 농도로부터 2배까지 벗어나는 것은 여전히 변형 전사체의 현저한 양을 제공한다.
GMP 또는 구아노신으로 전사를 프라이밍(priming)시키는 것이 또한 중요하다. 이 효과는 개시 뉴클레오티드에 대한 폴리머라제의 특이성으로부터 기인한 것이다. 결과적으로, 이 유형으로 생성된 임의의 전사체의 5'-말단 뉴클레오티드는 따라서 2'-OH G이다. GMP(또는 구아노신)의 바람직한 농도는 0.5 mM이며 그리고 더욱 더 바람직하게는 1 mM이다. 전사 반응 중에 PEG, 바람직하게는 PEG-8000을 포함하는 것이, 변형 뉴클레오티드의 도입을 최대화하는데 유용하다는 것을 또한 발견하였다.
2'-0Me ATP(100%), UTP(100%), CTP(100%) 및 GTP(~90%)("r/mGmH")를 전사체 안으로 최대 도입시키기 위해서는 이하의 조건이 바람직하다: HEPES 버퍼 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘(spermidine) 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), 트리톤(Triton) X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(6.5 mM 여기서 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 1.0 mM), MnCl2 1.5 mM(2.0 mM 여기서 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 1.0 mM), 2'-0Me NTP(각각) 500 μM(더 바람직하게는, 1.0 mM), 2'-OH GTP 30 μM, 2'-OH GMP 500 μM, pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 유닛(units)/ml, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/ml, 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이의 전체-푸린 리더(leader) 서열. 본원에서 사용한 것으로서, 1 유닛의 Y639F/H784A 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제(또는 본원에서 특정한 것으로서 임의의 다른 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제)는 r/mGmH 조건 하에서 1 nmole의 2'-OMe NTP를 전사체 안으로 도입시키는데 필요한 효소의 양으로서 정의한다. 본원에서 사용한 것으로서, 1 유닛의 무기 파이로포스파타제는 pH 7.2 및 25 ℃에서 1 분당 1.0 몰의 무기 오르소포스페이트를 유리시키는 효소의 양으로서 정의한다.
2'-OMe ATP, UTP 및 CTP("rGmH")를 전사체 안으로 최대 도입(100%)시키기 위해서는 이하의 조건이 바람직하다: HEPES 버퍼 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(9.6 mM 여기서 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM), MnCl2 1.5 mM(2.9 mM 여기서 각각의 2'-0Me NTP의 농도는 2.0 mM), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(더 바람직하게는, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/ml, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/ml, 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이의 전체-푸린 리더 서열.
2'-OMe UTP 및 CTP("rRmY")를 전사체 안으로 최대 도입(100%)시키기 위해서는 이하의 조건이 바람직하다: HEPES 버퍼 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(9.6 mM 여기서 각각의 2'-0Me NTP의 농도는 2.0 mM), MnCl2 1.5 mM(2.9 mM 여기서 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM), 2'-0Me NTP(각각) 500μM(더 바람직하게는, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/ml, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/ml, 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이의 전체-푸린 리더 서열.
데옥시 ATP 및 GTP 그리고 2'-OMe UTP 및 CTP("dRmY")를 전사체 안으로 최대 도입(100%)시키기 위해서는 이하의 조건이 바람직하다: HEPES 버퍼 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼민(spermine) 2 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-0Me NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/ml, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/ml, 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이의 전체-푸린 리더 서열.
2'-0Me ATP, UTP 및 CTP 그리고 2'-F GTP("fGmH")를 전사체 안으로 최대 도입(100%)시키기 위해서는 이하의 조건이 바람직하다: HEPES 버퍼 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/ml, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/ml, 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이의 전체-푸린 리더 서열.
데옥시 ATP 및 2'-0Me UTP, GTP 그리고 CTP("dAmB")를 전사체 안으로 최대 도입(100%)시키기 위해서는 이하의 조건이 바람직하다: HEPES 버퍼 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-0Me NTP(각각) 2.0 mM, pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/ml, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/ml, 및 적어도 8개의 뉴클레오티드 길이의 전체-푸린 리더 서열.
각각의 상기(a) 전사는 바람직하게는 온도 약 20 ℃ 내지 약 50 ℃에서, 바람직하게는 약 30 ℃ 내지 45 ℃에서, 그리고 더 바람직하게는 약 37 ℃에서 적어도 2 시간의 기간 동안 실시하며 그리고(b) 50-300 nM의 이중 표준 DNA 전사 주형을 사용한다(다양성을 증가시키기 위해 1 라운드에서 200 nM 주형을 사용(dRmY 전사에 300 nM 주형을 사용함)), 그리고 다음 라운드는 본원에 기재한 조건을 사용하여, 대략 50 nM, 1/10 최적화된 PCR 반응의 1/10 희석을 사용하였다. 바람직한 DNA 전사 주형은 이하에 기재하였다(이 경우 모든 2'-0Me 조건 하에서 ARC254와 ARC256을 전사시켰으며 그리고 rRmY 조건 하에서 ARC255를 전사시켰다).
Figure 112014008692587-pat00010
본 발명의 rN 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2'-OH 구아노신 트리포스페이트(GTP), 2'-OH 시티딘 트리포스페이트(CTP), 및 2'-OH 우리딘 트리포스페이트(UTP)를 포함한다. 본 발명의 rN 전사 혼합물을 사용하여 제조한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-OH 시티딘, 및 2'-OH 우리딘을 포함한다. rN 전사의 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 더 바람직한 구체예에서, 얻어진 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트, 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-0Me 시티딘 트리포스페이트, 및 2'-0Me 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rRmY 전사 혼합물을 사용하여 제조한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-OMe 시티딘, 및 2'-OMe 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OMe 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OMe 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OMe 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OMe 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 dRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-데옥시 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dRmY 전사 조건을 사용하여 제조한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-데옥시 아데노신, 2'-데옥시 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘, 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 얻어진 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
본 발명의 rGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-0Me 시티딘 트리포스페이트, 2'-0Me 우리딘 트리포스페이트, 및 2'-OMe 아데노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rGmH 전사 혼합물을 사용하여 제조한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 구아노신, 2'-OMe 시티딘, 2'-OMe 우리딘, 및 2'-OMe 아데노신을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 우리딘이며, 그리고 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 아데노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 우리딘이며, 그리고 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 아데노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 우리딘이며, 그리고 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 아데노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 r/mGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OMe 아데노신 트리포스페이트, 2'-0Me 시티딘 트리포스페이트, 2'-0Me 구아노신 트리포스페이트, 2'-0Me 우리딘 트리포스페이트 및 2'-OH 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 r/mGmH 전사 혼합물을 사용하여 제조한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-0Me 아데노신, 2'-0Me 시티딘, 2'-0Me 구아노신, 및 2'-0Me 우리딘을 포함하며, 이 경우 구아노신 뉴클레오티드의 수는 최대 약 10% 2'-OH 구아노신이다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 본 발명의 r/mGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 우리딘이며, 그리고 모든 구아노신 뉴클레오티드의 단지 약 10%가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OMe 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OMe 우리딘이며, 그리고 모든 구아노신 뉴클레오티드의 단지 약 10%가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90%가 2'-OMe 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 이상이 2'-OMe 우리딘이며, 그리고 모든 구아노신 뉴클레오티드의 단지 약 10%가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 fGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OMe 아데노신 트리포스페이트, 2'-0Me 우리딘 트리포스페이트, 2'-OMe 시티딘 트리포스페이트, 및 2'-F 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 fGmH 전사 조건을 사용하여 제조한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-0Me 아데노신, 2'-0Me 우리딘, 2'-0Me 시티딘, 및 2'-F 구아노신을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 우리딘이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 시티딘이며, 그리고 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 우리딘이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 시티딘이며, 그리고 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 우리딘이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 시티딘이며, 그리고 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다.
본 발명의 dAmB 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-0Me 시티딘 트리포스페이트, 2'-0Me 구아노신 트리포스페이트, 및 2'-0Me 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dAmB 전사 혼합물을 사용하여 제조한 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-데옥시 아데노신, 2'-0Me 시티딘, 2'-0Me 구아노신, 및 2'-0Me 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 구아노신이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-0Me 우리딘인 서열을 포함한다. 더 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 구아노신이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 구아노신이며, 그리고 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 우리딘인 서열을 포함한다.
각각의 경우, 전사 생성물은 이후에 SELEXTM 프로세스에서 압타머를 확인하고/하거나, 주어진 표적에 대한 결합 특이성을 가지는 서열을 보존 모티프를 결정하는데 있어 라이브러리로서 사용될 수 있다. 얻어진 서열은 이미 안정화된 것이며, 프로세스로부터 이 단계를 제거하여 안정화된 압타머 서열에 도달하며 그리고 결과적으로 더욱 상당히 안정화된 압타머를 얻게 된다. 2'-0Me SELEXTM 프로세스의 다른 장점은, 얻어진 서열이 서열 중에 필요한 것으로서 더 적은 2'-OH 뉴클레오티드를 가지거나, 가능하게는 없다는 점이다. 2'OH 뉴클레오티드가 남는 정도에 대해 그들은 포스트-SELEX 변형을 실시함으로써 그들을 제거할 수 있다.
이하에서 기재하는 바와 같이, 앞서 기재한 최적화된 조건이 아닌 조건 하에서 2' 치환 뉴클레오티드를 전제적으로 도입시킨 전사체의 낮으면서도 여전히 유용한 수율을 얻을 수 있다. 예컨대, 전술한 전사 조건에 대한 변수는 다음을 포함한다:
HEPES 버퍼 농도는 0 내지 1 M의 범위일 수 있다. 본 발명은 또한 pKa 5와 10 사이를 갖는 다른 완충제, 예컨대, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 사용하는 것을 고려하고 있다.
DTT 농도는 0 내지 400 mM의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 다른 환원제, 예컨대, 머캅토에탄올의 용도를 제공한다.
스퍼미딘 및/또는 스퍼민 농도는 0 내지 20 mM의 범위일 수 있다.
PEG-8000 농도는 0 내지 50 %(w/v)의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 다른 소수성 고분자, 예컨대, 다른 분자량 PEG 또는 다른 폴리알킬렌 글리콜의 용도를 제공한다.
트리톤 X-100 농도는 0 내지 0.1%(w/v) 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 다른 비-이온성 세제, 예컨대, 다른 세제, 다른 트리톤-X 세제의 용도를 제공한다.
MgCl2 농도는 0.5 mM 내지 50 mM의 범위일 수 있다. MnCl2 농도는 0.15 mM 내지 15 mM의 범위일 수 있다. MgCl2와 MnCl2는 기재한 범위 안에 존재하며 그리고 바람직한 구체예에서 약 10 내지 약 3의 비로 된 MgCl2:MnCl2, 바람직하게는, 약 3-5:1의 비, 더 바람직하게는, 약 3-4:1의 비이다.
2'-OMe NTP 농도(각각의 NTP)는 5 μM 내지 5 mM의 범위일 수 있다.
2'-OH GTP 농도는 0 μM 내지 300 μM의 범위일 수 있다.
2'-OH GMP 농도는 0 내지 5 mM의 범위일 수 있다.
pH는 pH 6 내지 pH 9의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 변형 뉴클레오티드를 도입하는 대부분의 폴리머라제의 활성의 pH 범위 안에서 실시할 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 전사 반응 조건에서 킬레이트화제, 예컨대, EDTA, EGTA, 및 DTT의 선택적인 사용을 제공한다.
이하의 실시예에서 기재하고 있는 바와 같이 생물학적 분석법에 의해 나타나는 것으로서 높은 친화성과 특이적 결합을 갖는 것으로 선택된 압타머는 C5 보체 단백질이 병인론에 관계된 것인 치료 조건에 대해 적절한 치료제가 된다.
보체 시스템 단백질 C5 에 결합 친화성을 가지는 압타머
보체 시스템이 건강을 유지하는데 있어 중요한 역할을 가짐에도 불구하고, 그것은 잠재적으로 질병을 일으키거나 또는 질병에 기여한다. 따라서, 치료제 용도용 보체 시스템의 억제제를 개발하는 것이 바람직할 수 있다. 보체 단백질 C5의 억제제를 개발하는 것이 특히 바람직할 수 있는데 그 이유는 그것이 보체 활성화 캐스케이드의 전형적인 경로와 대안적인 경로 둘 다의 성분이기 때문이다(Matis and Rollins(1995) Nature Medicine 1(8): 839-842). 따라서 C5를 억제시키면 두 경로에 의해 유발되는 보체-매개 손상을 예방할 수 있다. 일부 보체 시스템 단백질, 예컨대 C1q 및 C3는, 미생물체에 대한 정상적인 방어 메카니즘에서 그리고 면역 성분과 손상된 조직의 클리어런스(clearance)에서 중요하다; 다만, C5는 이들 기능에 대해서는 상대적으로 중요하지 않다. 따라서, 보체 시스템의 보호 역할을 손상시키지 않으면서 단기간 또는 장기간 동안 C5 기능을 억제할 수 있다.
치료제용 C5 억제제가 또한 바람직한데 그 이유는 C5의 절단을 억제하는 것이 2개의 잠재적으로 손상된 보체 활성의 생성을 예방하기 때문이다. 첫번째, C5의 절단으로부터 C5a의 생성을 억제하면 주된 보체의 화학주성(chemotactic) 활성과 혈관활동성(vasoactive) 활성을 제거하게 된다. 두번째, C5의 절단으로부터 C5b의 생성을 억제하면 세포용해성 C5b-9 멤브레인 공격 복합체("MAC")의 집합(assembly)를 차단한다. C5 절단을 억제하면 백혈구와 조직 예컨대 내피 세포에 대한 C5a와 C5b 효과 둘 다를 차단하게 된다(Ward(1996) Am. J. Pathol. 149:1079).
C5a와 MAC은 둘 다 인간의 질병과 연관된 급성 염증과 만성 염증에 연루되어 있으며, 그리고 질병 상태에 대한 그들의 역할은 동물 모델에서 확인되어 왔었다. C5a는 보체 및 호중구 의존성 폐 혈관성 부상에 대해 필요하며(Ward(1997) J. Lab. Clin. Med. 129:400; Mulligan et al,(1998) J. Clin. Invest. 98:503), 그리고 쇼크와 이유없는 부상(bum injury)에서의 호중구와 혈소판 활성화와 연관되어 있다(Schmid et al,(1997) Shock 8:119). MAC은 급성 자가면역성 중증 근무력증에서의 근육 부상(Biesecker and Gomez(1989) J. Immunol. 142:2654), 이식시 장기 거부(Baldwin et al,(1995) Transplantation 59:797; Brauer et al,(1995) Transplantation 59:288; Takahashi et al,(1997) Immunol. Res. 16:273), 그리고 자가면역성 사구체신염에서의 신장 부상(Biesecker(1981) J. Exp. Med. 39:1779; Nangaku(1997) Kidney Int. 52:1570)을 매개한다. C5a와 MAC는 둘 다 급성 심근 허혈(Homeister and Lucchesi(1994) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34:17), 급성(Bednar et al,(1997) J. Neurosurg. 86:139) 및 만성 CNS 부상(Morgan(1997) Exp. Clin. Immunogenet. 14:19), 체외 순환 동안 백혈구 활성화(Sun et al,(1995) Nucleic Acids Res. 23:2909; Spycher andNydegger(1995) Infushionsther. Transfusionsmed. 22:36) 및 관절염과 홍반을 포함하는 자가면역 질환과 관련된 조직 부상(Wang et al,(1996) Immunology 93:8563)에 연루되어 있다.
보체 활성화는 또한 당뇨병성 망막병증에 연루되어 있으며, 그리고 신장 혈관 손상을 조합시키거나 또는 개시시킬 수 있다(Zhang et al,(2002) Diabetes 51:3499). 낮은 수준의 구성성(constitutive) 보체 활성화가 비-당뇨성 눈에서 정상적으로 발생하며, 이는 비-당뇨병 래트의 눈에서 MAC와 보체 조절성 단백질의 존재의 증거가 되는 것으로서, 당뇨 환자에서 보체 이상조절이 일어나는 것을 의미한다(Sohn et al.,(2000) IOVS 41:3492). 추가로, 당뇨병 인간 도너로부터 신장 혈관에서 C5b-9 침착이 검출되었으며 비-당뇨병 인간 도너로부터는 나타나지 않았으며(Zhang et al), 당뇨병성 망막에서는 CD55와 CD59의 발현 감소가 보였으며(Zhang et al), 그리고 당뇨병 환자로부터의 뇨(urine)에서 글리케이트화(glycated) CD59가 존재하였지만, 비-당뇨성 환자에서는 그렇지 않았다(Acosta et al,(2002) PNAS 97, 5450-5455). 추가로, 보체와 혈관 시스템은 제1형 당뇨병에서 활성화되는 것으로 알려져 있다. 문헌[Hansen, T.K. et al, Diabetes, 53: 1570-1576(2004)] 참조. C5a는 면역 시스템과 보체 시스템과의 상호작용을 통해 내피 세포를 활성화시킨다. 문헌[Albrecht, E.A. et al, Am J Pathology, 164: 849-859(2004)] 참조. 당뇨병성 망막병증을 포함하는 안질환에서는 혈관 시스템이 활성화된다. 문헌[Gert, V.B. et al, Invest Opthalmol Vis Sci, 43: 1104-1108(2002)] 참조. 보체 시스템은 또한 당뇨병성 망막병증에서 활성화된다. ㅁ문헌[Gert, V.B. et al, Invest Opthalmol Vis Sci, 43: 1104-1108(2002) 및 Badouin, C et al, Am J Opthalmol, 105:383-388(1988)] 참조.
일부 구체예에서, 본 발명의 물질은 약 15 내지 약 60개의 뉴클레오티드 길이의 일련의 핵산 압타머를 포함하며 이것은 보체 단백질 C5에 특이적으로 결합하며 그리고 생체내에서 및/또는 세포 수준(cell-based) 분석법에서 보체 단백질 C5의 활성을 기능적으로 조절하는 것, 예컨대, 차단하는 것이다.
보체 단백질 C5와 특이적으로 결합할 수 있으며 그리고 조절할 수 있는 압타머는 본원에 기재하고 있다. 이들 압타머는 낮은 독성, 안전성, 및 다양한 보체-관련 질병 또는 질환을 치료하고, 완화시키고/시키거나, 예방하는데 효과적인 실행방법(modality)을 제공하며, 다양한 보체-관련 질병 또는 질환은, 예컨대 다음을 포함한다, 보체-관련 심장 질환(즉, 심근 부상; 관상 동맥 우회 이식편(CABG) 수술 예컨대 수술-후 출혈, 전신성 호중구 및 백혈구 활성화, 심근경색의 위험 증가, 및 인지 기능장애의 증가와 관련된 C5 매개 보체 합병증; 재발협착증; 및 경피성 관상동맥 개입과 관련된 C5 매개 보체 합병증), 허혈-재관류 부상(즉, 심근경색, 심장마비, 동상), 보체-관련 염증성 질환(즉, 천식, 관절염, 패혈증, 및 장기 이식 이후 거부), 및 보체-관련 자가면역 질환(즉, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE)). C5 억제가 바람직한 다른 적응증은 다음을 포함한다, 예컨대, 폐 염증(Mulligan et al.(1998) J. Clin. Invest. 98:503), 체외 보체 활성화(Rinder et al.(1995) J. Clin. Invest. 96:1564), 항체-매개 보체 활성화(Biesecker et al.(1989) J. Immunol. 142:2654), 사구체신염 및 다른 신장 질환, 눈 관련 적응증 예컨대 C5 매개 눈 조직 손상, 예컨대 당뇨병성 망막병증, 및 발작성 야간 혈색소요증. 이들 압타머는 또한 진단용으로 사용할 수 있다.
이들 압타머는 본원에 기재된 것으로서, 예컨대, 친지질성 또는 고분자량 화합물(즉, PEG)에 대한 컨쥬게이션, 캡핑 부분의 도입, 변형 뉴클레오티드의 도입, 및 포스페이트 백본에 대한 변형을 포함하는 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서 C5 보체 단백질에 결합하는 것으로서 분리된, 비-천연 발생 압타머를 제공한다. 일부 구체예에서, 분리된, 비-천연 발생 압타머는 C5 보체 단백질에 대한 해리상수("Kd") 100 μM 이하, 1 μM 이하, 500 nM 이하, 100 nM 이하, 50 nM 이하, 1 nM 이하, 50O pM 이하, 100 pM 이하, 50 pM 이하를 가진다. 본 발명의 일부 구체예에서, 해리상수는 이하의 실시예 1에 기재한 바와 같이 도트 블롯 적정(dot blot titration)에 의해 측정한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 압타머는 C5 보체 단백질의 기능을 조절한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 압타머는 C5 기능을 억제하며 다른 구체예에서 압타머는 C5의 기능을 자극한다. 본원에서 사용한 것으로 C5 보체 단백질 변이체는 C5 보체 단백질 기능으로서 실질적으로 동일한 기능을 수행하는 변이체를 포함한다. C5 보체 단백질 변이체는 바람직하게는 실질적으로 동일한 구조를 포함하며 그리고 일부 구체예에서 이하의 아미노산 서열(서열 번호: 102)을 포함하는 C5 보체 단백질의 아미노산 서열에 대해 80% 서열 상동성, 더 바람직하게는 90% 서열 상동성, 더 바람직하게는 95% 서열 상동성을 포함한다(Haviland et al, J Immunol. 1991 Jan 1;146(1):362-8에서 인용).:
Figure 112014008692587-pat00011
본 발명의 일부 구체예에서, 표적 변이체의 서열 상동성은 이하에 기재한 바와 같이 BLAST를 사용하여 측정한다. 2 또는 그 이상의 핵산 또는 단백질 서열의 문장 중에서 용어 "서열 상동성"이란, 최대 대응(correspondence)에 대해 비교하고 배열하는 경우, 알고리즘 비교 또는 시각 검사를 통해 이하의 서열 중 하나를 사용하여 측정한 것으로서, 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 구체화된 퍼센트를 가지는 2 또는 그 이상의 서열 또는 서열들을 의미한다. 서열 비교시, 통상적으로 참조 서열로서 작용하는 하나의 서열에 테스트 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 테스트 서열과 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 만약 필요하다면 다음 좌표를 지정하며, 그리고 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이후 서열 비교 알고리즘이 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 상대적인 테스트 서열(들)의 서열 상동성을 계산한다. 예컨대, 문헌[Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482(1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443(1970)]의 상동성 배열 알고리즘에 의해, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444(1988)]의 유사성 방법에 대해 검색함으로써, 이들 알고리즘의 컴퓨터화 실행함으로써(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 시각 검사에 의해(일반적으로, Ausubel et al., infra 참조) 비교를 위해 서열이 최적 배열될 수 있다.
서열 상동성 %를 측정하는데 적절한 알고리즘의 하나의 예는 기본 국소 배열 검색 툴(basic local alignment search tool, 이하에서는 "BLAST")에 사용하는 알고리즘이다, 예컨대 문헌[Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403-410(1990) 및 Altschul et al, Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402(1997)] 참조. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명과학기술 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, 이하에서는 "NCBI")를 통해 공개적으로 구입할 수 있다. NCBI로부터 구입가능한 소프트웨어, 예컨대, BLASTN(뉴클레오티드 서열인 경우) 및 BLASTP(아미노산 서열인 경우)를 사용하여 서열 상동성을 측정하는데 사용하는 기본 파라미터는 문헌[McGinnis et al., Nucleic Acids Res., 32: W20-W25(2004)]에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 서열 번호 1-2, 5-67, 75-81, 83 또는 88-98 중 임의의 하나를 포함하는 압타머로서 C5 보체 단백질과 결합하는 실질적으로 동일한 능력을 가지는 압타머를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 압타머는 실질적으로 동일한 구조와 서열 번호 1-2, 5-67, 75-81, 83 또는 88-98 중 임의의 하나를 포함하는 압타머로서 C5 보체 단백질과 결합하는 능력을 가진다. 다른 구체예에서, 본 발명의 압타머는, 서열 번호: 2, 5-67, 75-81, 83 또는 88-98 중 임의의 하나에 따라, 임의의 화학적 변형을 포함하는 서열을 가진다. 다른 구체예에서, 본 발명의 압타머는 약학 조성물 중 활성 성분으로서 사용한다. 다른 구체예에서, 압타머 또는 본 발명의 압타머를 함유하는 조성물은 다양한 보체-관련 질병 또는 질환을 치료하는데 사용하며, 이 질병 또는 질환은 이하로 구성되는 군으로부터 선택한 임의의 하나를 포함한다: 보체-연관 심장 질환(예컨대, 심근 부상; 관상동맥 우회 이식편(CABG)과 관련된 C5 매개 보체 합병증 예컨대 수술 이후 출혈, 전신성 호중구 및 백혈구 활성화, 심근경색의 위험 증가 및 인지 기능장애의 증가; 재발협착증; 및 경피성 관상동맥 개입과 관련된 C5 매개 보체 합병증), 허혈-재관류 부상(즉, 심근경색, 심장마비, 동상), 보체-관련 염증성 질환(예컨대, 천식, 관절염, 패혈증, 및 장기 이식 이후 거부), 및 보체-관련 자가면역 질환(예컨대, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE), 폐 염증, 체외 보체 활성화, 항체-매개 보체 활성화 및 눈 관련 적응증 예컨대 보체 매개 눈 조직 손상 예컨대 당뇨병성 망막병증.
하나의 구체예에서, 본 발명의 항-C5 압타머는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-OMe 변형 뉴클레오티드("2'-0Me") 및 2'-OH 푸린 잔기의 혼합물을 포함한다. 변형 항-C5 압타머에 대해 기술한 일반 서열(서열 번호: 1)을 이하의 표 1에 도시하였으며, 그리고 그 구조는 도 3a에 도시하였다. 대부분의 푸린(A 및 G)은, 2'-OH로 남아있는 단지 2개의 G 잔기를 제외하고(외곽선으로 나타낸 잔기) 2'-0Me로 변형되었다. 원으로 표시한 잔기는 압타머의 항-C5 활성을 동시에 바꾸지 않으면서 동시에 2'-H로 변형될 수 있는 피리미딘의 서브세트를 나타낸다(이하의 표 1 중 ARC330(서열 번호: 2, 도 3b) 참조). 도 3a에 도시되어 있는 밑줄친 잔기는 2'-플루오로 또는 2'-H 변형(다만 2'-0Me가 아님)을 함유할 수 있는 피리미딘 잔기를 나타내며, 박스로 표시한 잔기는 2'-플루오로 또는 2-OMe 변형(다만 2'-H가 아님)을 둘 다 포함할 수 있는 피리디민 잔기를 나타낸다. 화살표(→)로 나타낸 잔기는 2'-플루오로 변형을 반드시 포함한다. 화살표(→)에 의해 나타낸 잔기에서 2'-플루오로 변형 없이는, 얻어진 압타머의 얻어진 용혈 활성이 실질적으로 감소한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-C5 압타머는 서열 번호: 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항-C5 압타머의 예는 도 3c에서 도시되고 미국 특허 Ser. No. 6,395,888에 기재된 ARC186(서열 번호: 4)이며, 이는 그것의 전문을 본원에서 참고문헌으로 인용하였다. ARC186의 모든 21개의 피리미딘 잔기는 2'-플루오로 변형을 가진다. 푸린의 대부분(14개의 잔기)는 2'-0Me 변형을 가지며, 다만 3개의 2'-OH 푸린 잔기는 제외한다(도 3c에 외곽선으로 도시된 것). 본 발명의 항-C5 압타머는 또한 2'-플루오로와 2'-H 변형의 상이한 혼합물을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 다른 항-C5 압타머는 도 3b에 도시된 ARC330(서열 번호: 2)이다. ARC330(서열 번호: 2)은 7개의 2'-H 변형(도 3b에서 원으로 표시한 잔기), 2'-플루오로 변형인 14개의 피리미딘 잔기, 2'-OMe 변형인 14개의 푸린 잔기, 및 3개의 2'-OH 푸린 잔기(도 3b에서 외곽선으로 도시된 것)를 포함한다.
각각이 ARC186(서열 번호: 4)으로부터 유래된 것으로서, 2'-플루오로 변형, 2'-0Me 변형, 2'-OH 푸린 잔기의 혼합물, 및 다양한 크기의 비-면역원성 고분자량 화합물(예컨대, PEG)에 대한 컨쥬게이션을 포함하는 압타머의 다른 조합은 이하의 표 1에 도시하였다. 본 발명은 이하의 표 1에 기재한 압타머를 포함한다. 본 발명은 또한 이하에 기재한 것으로서 표시된 3' 캡(예컨대, 역전된 데옥시티미딘 캡) 및/또는 이하에 표시된 압타머는 없지만 3' 캡을 표시하지 않은 경우 3' 캡(예컨대, 역전된 dT)을 포함하는 압타머를 포함한다.
달리 언급이 없다면, 이하의 표 1의 뉴클레오티드 서열은 5'으로부터 3' 방향으로 나열하였다. 표 1의 개별 서열의 각각의 경우, 모든 2'-OMe 푸린 또는 피리미딘 변형은 해당하는 뉴클레오티드의 앞에 "m"으로 표시하였으며; 모든 2'-플루오로 피리미딘 변형은 대응하는 뉴클레오티드의 앞에 "f"로 표시하였으며; 모든 푸린 또는 피리미딘 데옥시 변형은 대응하는 뉴클레오티드의 앞에 "d"로 표시하였으며; 그리고 뉴클레오티드 앞에 "m", "f , 또는 "d"가 없는 임의의 푸린 또는 피리미딘은 2'-OH 잔기를 나타낸다. 추가로 "3T"는 역전된 데옥시 티미딘을 나타내며, "NH"는 헥실아민 링커를 나타내며, "NH2"는 헥실아민 말단 기를 나타내며, "PEG"는 표시된 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜 기를 나타내며, 그리고 "바이오틴"은 5' 말단에 컨쥬게이트화된 바이오틴을 가지는 압타머를 나타낸다.
표 1:
Figure 112014008692587-pat00012
Figure 112014008692587-pat00013
Figure 112014008692587-pat00014

Figure 112014008692587-pat00015
Figure 112014008692587-pat00016
Figure 112014008692587-pat00017
Figure 112014008692587-pat00018
보체 단백질 C5에 결합하는 본 발명의 다른 압타머를 이하의 실시예 3에 기재하였다.
일부 구체예에서 압타머 치료제는 그들의 표적에 대해 엄청난 친화성과 특이성을 가지면서, 만약 압타머 치료제가 환자 또는 개체의 신체에서 분해된다면 비-천연으로 생성되는 뉴클레오티드 치환으로부터의 해로운 부작용을 감소시킨다. 일부 구체예에서, 본 발명의 압타머 치료제를 포함하는 치료용 조성물은 플루오르화 뉴클레오티드가 없거나 또는 감소된 양을 가진다.
본 발명의 압타머는 본 기술 분야에서 주지된 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 기술(예컨대, Froehler et al, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467(1986) 및 Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575-5578(1986) 참조) 및 용액상 방법 예컨대 트리에스테르 합성 방법(예컨대, Sood et al, Nucl. Acid Res. 4:2557(1977) 및 Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449(1978) 참조)을 포함하는 본 기술 분야에서 공지된 임의의 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 사용하여 합성할 수 있다.
약학 조성물
본 발명은 또한 보체 단백질 C5에 결합하는 압타머 분자를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 그 조성물은 체내(internal) 사용에 적합한 조성물이며 그리고 본 발명의 약물학적 활성 화합물의 유효량을, 단독으로 또는 1 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함한다. 그 화합물들은 특별히 유용하며, 만약 임의의 독성이 있다면 그것은 매우 낮다.
본 발명의 조성물은 병리(pathology), 예컨대 질병 또는 질환을 치료하거나 또는 예방하는데, 또는 환자에게 그런 질병 또는 질환의 증상을 약화시키는데 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물은 보체-관련 신장 질환과 관련된 병리(즉, 심근 부상; 관상동맥 우회 이식편(CABG) 수술과 관련된 C5 매개 보체 합병증 예컨대 수술 이후 출혈, 전신성 호중구 및 백혈구 활성화, 심근경색의 위험 증가 및 인지 기능장애의 증가; 재발협착증; 및 경피성 관상동맥 개입과 관련된 C5 매개 보체 합병증), 허혈-재관류 부상(즉, 심근경색, 심장마비, 동상), 보체-관련 염증성 질환(즉, 천식, 관절염, 패혈증, 및 장기 이식 이후 거부), 및 보체-관련 자가면역 질환(즉, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE 또는 루프스), 폐 염증, 체외 보체 활성화, 항체-매개 보체 활성화 및 눈 관련 적응증 예컨대 보체 매개 눈 조직 손상 예컨대 당뇨병성 망막병증을 치료하거나 또는 예방하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 압타머가 특이적으로 결합하는 보체 단백질 C5와 관련되거나 또는 그것으로부터 유래하는 질병 또는 질환으로 고통받거나 또는 걸리기 쉬운 개체에게 투여하기에 유용하다.
본 발명의 조성물은 병리를 가지는 환자 또는 개체를 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은, 압타머가 보체 단백질 C5에 결합함으로써 그것의 생물학적 기능을 바꾸고, 그럼으로써 병리를 치료하게 되도록, 보체 단백질 C5에 결합하는 압타머 또는 압타머를 포함하는 조성물을 환자 또는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
병인을 가지는 환자 또는 개체, 즉, 본 발명의 방법으로 치료되는 환자 또는 개체는 척추동물, 더 구체적으로 포유동물, 또는 더 구체적으로, 인간일 수 있다.
사실상, 압타머 또는 그들의 약학적 허용 염은 그들의 목적하는 생물학적 활성을 나타내는데, 예컨대, 압타머 표적이 그것의 수용체에 결합하는 것을 억제하고, 표적 단백질의 절단을 억제하는데 충분한 양으로 투여한다.
본 발명의 하나의 태양은 C5 매개 보체 질환에 대한 다른 치료와 조합시킨 본 발명의 압타머 조성물을 포함한다. 본 발명의 압타머 조성물은, 예컨대, 1 이상의 압타머를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 1 또는 그 이상의 본 발명의 화합물을 함유하는 본 발명의 압타머 조성물은, 다른 유용한 조성물 예컨대 소염제, 면역억제제, 항바이러스제 등과 조합하여 투여한다. 추가로, 본 발명의 화합물은 세포독성제, 세포증식억제제, 또는 화학요법제 예컨대 전술한 바와 같은 알킬화제, 항-대사제, 유사분열 억제제 또는 세포독성 항생제와 조합하여 투여할 수 있다. 일반적으로, 그런 조합에 사용하기 위한 알려진 치료제의 현재 가능한 제형이 적절하다.
"병용 치료(Combination therapy)"(또는 "공동(co)-치료")는 본 발명의 압타머 조성물 및 이들 치료제의 공동-작용으로부터 이로운 효과를 제공하는 것으로 고려되는 특정 치료법의 일부로서 적어도 2차 약물을 투여하는 것을 포함한다. 조합의 이로운 효과는, 치료제의 조합으로부터 유발되는 약동학 또는 약력학적인 공동-작용을 포함하지만, 이것 만으로 한정하는 것은 아니다. 통상적으로 조합시킨 이들 치료제를 투여하는 것은 한정된 시간 기간에 걸쳐 실시한다(선택한 조합에 좌우하여 일반적으로 분, 시간, 일 또는 주).
"병용 치료"는, 일반적으로는 그렇지 않지만, 우연히 그리고 제멋대로 본 발명의 조합을 유발시키는 개별 단독치료용 치료법의 일부로서 2 또는 그 이상의 이들 치료제를 투여하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. "병용 치료"는 이들 치료제를 연속적인 방식으로, 즉, 이 경우 각각의 치료제를 상이한 시간에 투여하는 것, 뿐 아니라 이들 치료제, 또는 2 이상의 치료제를, 실질적으로 동시의 방식으로 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도된다. 실질적으로 동시 투여는, 예컨대, 각각의 치료제의 고정된 비율을 가지는 단일 캡슐 또는 각각의 치료제에 대한 단일 캡슐을 여러개를 개체에게 투여함으로써 실행시킬 수 있다.
각각의 치료제를 순차적으로 또는 실질적으로 동시에 투여하는 것은, 국소 경로, 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로에 의할 수 있지만, 이것 만으로 한정하는 것은 아니다. 치료제들은 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여할 수 있다. 예컨대, 선택된 조합의 1차 치료제는 주사로 투여할 수 있으며 조합의 다른 치료제는 국소적으로 투여할 수 있다.
대안으로, 예컨대, 모든 치료제를 국소적으로 투여할 수 있으며 또는 모든 치료제를 주사로 투여할 수 있다. 치료제를 투여하는 순서는 달리 언급이 없다면 협소하게 결정적인 것은 아니다. "병용 치료"는 또한 다른 생물학적 활성 성분과 추가 조합시킨 전술한 바와 같은 치료제의 조합을 포함할 수 있다. 병용 요법이 비-약물 요법을 추가로 포함하는 경우, 비-약물 요법은 치료제의 조합의 공동-작용으로부터 이로운 효과가 지속되며 그리고 비-약물 치료를 얻게되는 한 임의의 적절한 시간에 실시할 수 있다. 예컨대, 적절한 경우, 치료제들의 투여로부터 비-약물 치료를 일시적으로, 아마도 며칠 또는 심지어 몇주 제외하는 경우 이로운 효과는 여전히 얻게된다.
본 발명의 치료용 또는 약물학적 조성물은 일반적으로 약학적 허용 매질(medium) 중에 용해시키거나 또는 분산시킨 치료 활성 성분(들)의 유효량을 포함한다. 약학적 허용 매질 또는 담체는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제(isotonic agent) 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 성분에 대한 그런 매질과 시약은 본 기술 분야에 주지되어 있다. 보조 활성 성분은 또한 치료용 본 발명의 조성물 내에 도입시킬 수 있다.
약학적 조성물 또는 약물학적 조성물을 제조하는 것은 본 개시의 관점에서 본 기술 분야에 알려져 있다. 통상적으로 그런 조성물은, 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사할 수 있는 것; 주사하기에 앞서 액체 중에서 용액 또는 현탁액으로 적절한 고체형; 경구 투여용 정제 또는 다른 고체; 시간 방출 캡슐; 또는 안약(eye drops), 크림, 로숀, 연고, 흡입기 등을 포함하여 현재 사용하는 임의의 다른 형태로서 제조할 수 있다. 무균 제제, 예컨대 식염수 위주의 세척의 용도는, 외과의사, 의사 또는 건강관리사에 의해 수술 분야에서 특별한 영역을 처리하는데 특히 유용할 수 있다. 조성물들은 또한 마이크로장치, 마이크로입자 또는 스폰지를 통해 운반될 수 있다.
제제에 있어서, 투약 제제와 양립할 수 있는 방식으로, 그리고 약물학적으로 유효한 그런 양으로 치료제를 투여한다. 그 제제는 다양한 제형으로, 예컨대 전술한 주사용 용액의 형태로서 용이하게 투여하지만, 약물 방출 캡슐 등 또한 사용할 수 있다.
이와 관련하여, 활성 성분의 양과 투여하는 조성물의 부피는 치료되는 숙주 동물에 좌우한다. 투여에 필요한 활성 성분의 정밀한 양은 숙련가의 판단에 좌우하며 그리고 각 개인별로 독특하다.
활성 화합물을 분산시키는데 필요한 조성물의 최소 부피를 통상적으로 사용한다. 투여에 적절한 치료법은 또한 다양하지만, 최초로 화합물을 투여함으로써 그리고 결과를 모니터링함으로써 그리고 이후 추가 간격에서 추가 조절된 투여량을 수여함으로써 전형화시킨다.
예를 들면, 정제 또는 캡슐(예컨대, 젤라틴 캡슐)의 형태로 경구 투여하기 위해서, 활성 약물 성분을 경구용, 비-독성 약학적 허용 불활성 담체 예컨대 에탄올, 글리세롤, 물 등과 조합시킬 수 있다. 게다라, 목적하거나 또는 필요한 경우, 적절한 결합제, 윤활제(lubricant), 붕해제 및 착색제를 또한 혼합물 중에 도입시킬 수 있다. 적절한 결합제는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 당 예컨대 글루코즈 또는 베타-락토즈, 옥수수 감미제, 천연 검 및 합성 검 예컨대 아카시아, 트라가칸트 또는 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이들 제형에 사용하는 윤활제는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염 및/또는 폴리데틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제는, 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검 전분, 아가, 알진산 또는 그것의 소듐 염, 또는 발포성 혼합물 등을 포함한다. 희석제는, 예컨대, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스 및/또는 글라이신을 포함한다.
주사용 조성물은 바람직하게는 수성 등장 용액 또는 현탁액이며, 그리고 지방성 유제 또는 현탁액으로부터 좌제를 유리하게 제조한다. 그 조성물은 무균화시킬 수 있고/있거나, 어쥬반트(adjuvant), 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제를 포함하며, 용액 프로모터, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 버퍼를 포함한다. 추가로, 그들은 또한 다른 치료적으로 가치있는 성분들을 포함할 수 있다. 그 조성물은 각각 전형적인 혼합법, 과립화 방법 또는 코팅 방법에 따라 제조하며, 그리고 통상적으로 약 0.1 내지 75%, 바람직하게는 약 1 내지 50%의 활성 성분을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 시간 방출과 지연 방출 정제 또는 캡슐, 환제(pill), 분말, 과립, 엘릭서, 팅크제(tincture), 현탁액, 시럽 및 유제로서 경구 제형으로 투여할 수 있다.
액체, 특별히 주사용 조성물은, 예컨대, 용해시킴으로써, 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 활성 화합물을 약학적 순수 용매, 예컨대, 물, 식염수, 수성 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등에 용해시키거나 또는 혼합시키며, 그럼으로써 주사용 용액 또는 현탁액을 형성하게 된다. 추가로, 주사하기에 앞서 액체 중에 용해시키는데 적절한 고체형을 제제화할 수 있다.
본 발명의 화합물은 정맥내(볼러스와 인퓨젼 둘 다), 복막내, 피하 또는 근육내 형태로 투여할 수 있으며, 사용하는 모든 형태는 약학 분야에서 당업자에게 주지된 것이다. 주사용제는 액체 용액 또는 현탁액으로서 전형적인 형태로 제조할 수 있다.
장관외 주사용 투여는 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사 및 인퓨젼에 사용한다. 추가로, 장관외 투여에 대한 하나의 접근은 서방형 또는 지연-방출 시스템의 삽입을 실시하며, 이것은 투약의 일정한 수준을 유지하는 것을 보장하며, 참고문헌으로 본원에서 인용하고 있는 미국 특허 No. 3,710,795를 참고한다.
추가로, 본 발명에 바람직한 화합물들은 본 기술 분야에서 당업자에게 주지된 비강내 비이클(intranasal vehicle), 흡입기를 적절한 국소 사용을 통해 비강내 형태로서, 또는 경피 경로를 통해, 경피 피부 패치제의 제형을 사용하여 투여할 수 있다. 경피 운반 시스템의 형태로 투여하려면, 제형 투여는, 물론, 제형 치료제를 통해 간헐적이기 보다는 연속적이 되어야 한다. 다른 바람직한 국소 제제는 크림, 연고, 로숀, 에어로졸 스프레이와 젤을 포함하며, 여기서 활성 성분의 농도는 통상적으로 0.01% 내지 15%, w/w 또는 w/v의 범위이다.
고체 조성물인 경우, 부형제는 약학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 소듐 사카린, 탈쿰, 셀룰로스, 글루코즈, 수크로즈, 탄산마그네슘, 등을 사용할 수 있다. 앞서 정의한 활성 화합물은 또한 예컨대, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜을 담체로서 사용하여 좌제로서 제제화할 수 있다. 일부 구체예에서, 좌제는 지방성 유제 또는 현탁제로부터 유리하게 제조한다.
본 발명의 화합물은 또한 리포좀 운반 시스템, 예컨대 소형 유니라멜라(unilamellar) 베시클, 대형 유니라멜라 베시클 및 멀티라멜라 베시클의 형태로 투여할 수 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 함유하는 다양한 인지질로부터 제조할 수 있다. 일부 구체예에서, 미국 특허 No. 5,262,564에 기재한 바와 같이, 지질 성분의 필름을 약물의 수용액으로 수화시켜 약물을 둘러싸는 지질 층을 형성시킨다. 예컨대, 본원에 기재한 압타머 분자는 친지질성 화합물 또는 비-면역원성, 본 기술 분야에서 공지의 방법을 사용하여 구축한 고분자량 화합물과 복합시킴으로써 제공할 수 있다. 복합체와 연관된 핵산의 예는 미국 특허 No. 6,011,020에 제공하고 있다.
본 발명의 화합물은 또한 표적용 약물 담체로서 가용성 중합체와 함께 커플링시킬 수 있다. 그런 중합체들은 폴리비닐피롤리돈, 파이란 공중합체, 폴리하이드록시프로필-메트아크릴아미드-페놀, 폴리하이드록시에틸아스판아미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리라이신를 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물들은 약물의 방출 조절을 얻는데 유용한 클래스의 생물분해성 중합체, 예컨대, 폴리아세트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르소에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로파이란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교 또는 양쪽성 블럭 공중합체에 커플링시킬 수 있다.
만약 목적한다면, 투여하는 약학 조성물은 또한 소량의 비-독성 보조 성분들 예컨대 습윤화제 또는 유화제, pH 완충제, 및 다른 성분들 예컨대, 초산나트륨, 및 트리에탄올아민 올레에이트를 포함할 수 있다.
압타머를 사용하는 투약 용법은 환자의 유형, 종(species) 연령, 체중, 성별 및 의료적 조건; 치료되는 질병의 심각성; 투여 경로; 환자의 신장 기능과 간 기능; 및 사용된 특정 압타머 또는 이것의 염을 포함하는 다양한 인자에 따라 선택한다. 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사는 질병의 진행을 예방하고, 억제하거나 또는 공격하는데 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 경구 제형은, 표시된 효과에 대해 사용하는 경우, 경구로 약 0.05 내지 7500 mg/일 사이의 범위이다. 그 조성물은 바람직하게는 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 및 1000.0 mg의 활성 성분을 함유하는 분획화된(scored) 정제의 형태로 제공된다. 본 발명의 화합물들은 일일 단회 투여로 투여할 수 있거나, 또는 전체 일 투여량을 2, 3, 또는 4회/일의 투여량으로 나누어 투여할 수 있다.
인퓨젼 투약, 비강내 투약 및 경피 투약은 0.05 내지 7500 mg/day 사이의 범위이다. 피하, 정맥내 및 복강내 투약은 0.05 내지 3800 mg/day 사이의 범위이다.
본 발명의 화합물의 효과적인 혈장 수치는 0.002 mg/mL 내지 50 mg/mL의 범위이다.
압타머 치료제의 약동학과 생체분배의 조절
목적하는 약학적 응용과 매칭시키기 위해 압타머를 포함하여 모든 올리고뉴클레오티드에 기초한 치료제에 대한 약동학적 성질을 재단하는 것이 중요하다. 세포밖 표적을 직접 향하는 압타머는(안티센스 및 RNAi에 기초한 치료제로서) 세포내 운반과 관련된 어려움과는 무관하며, 그런 압타머는 반드시 표적 장기와 조직에 분산시킬 수 있어야 하며, 그리고 목적하는 투여 치료법의 시간의 기간 동안 시종일관 신체에 잔류하여야 한다.
따라서, 본 발명은 압타머 조성물의 약물동력학, 구체적으로 압타머 약물동력학을 튜닝시키는 능력에 영향을 미치는 물질과 방법을 제공한다. 압타머 약물동력학의 튜닝가능성(즉, 조절하는 능력)은 핵산의 화학 조성을 바꾸기 위한 압타머에 대한 변형 부분(예컨대, PEG 중합체)의 컨쥬게이션을 통해 및/또는 변형 뉴클레오티드의 도입(예컨대, 2'-플루오로 또는 2'-0Me)을 통해 얻어진다. 압타머 약물동력학을 튜닝하는 능력은 기존 치료제 용도를 향상시키거나, 또는 대안으로, 새로운 치료제 용도를 개발하는데 사용한다. 예컨대, 일부 치료제 용도에서, 예컨대, 빠른 약물 클리어런스(clearance) 또는 턴-오프(turn-off)가 바람직할 수 있는 경우, 항-신생물제 또는 급성 캐어 셋팅(care setting)에서는, 순환시 압타머의 체류 시간을 감소시키는 것이 바람직하다. 대안으로, 다른 치료 용도에서, 예컨대, 치료제의 전신 순환이 바람직한 경우 유지 치료시, 순환시 압타머의 체류 시간을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
추가로, 압타머 약물동력학의 튜닝가능성은 개체에게 압타머 치료제의 생체분배를 변형시키는데 사용한다. 예컨대, 일부 치료제 용도에서, 표적 특정 유형의 조직 또는 특정 장기(또는 장기의 세트)에 대해 압타머 치료제의 생체분배를 노력해서 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이들 용도에서, 압타머 치료제는 특정 조직 또는 장기(들)에 우선적으로 축적된다. 다른 치료제 용도에서, 주어진 질환, 세포성 손상 또는 다른 비정상적 병리와 관련된 세포 마커 또는 징후를 나타내는 조직을 표적으로 하는 것이 바람직할 수 있으며, 그럼으로써 압타머 치료제가 영향을 받는 조직에 우선적으로 축적되게 된다. 예컨대, 동시진행중인 미국 임시 출원 No. 60/550790(March 5, 2004 출원, 발명의 명칭 "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of aptamer Therapeutics)에 기재한 바와 같이, 압타머 치료제의 PEG화(예컨대, 20 kDa PEG 중합체에 의한 PEG화)는 염증이 있는 조직을 표적으로 하는데 사용하며, 그럼으로써 염증이 있는 조직에 PEG화된 압타머 치료제가 우선적으로 축적되게 된다.
압타머 치료제의 약물동력학적 프로파일과 생체분배 프로파일을 측정하기 위해(예컨대, 압타머 컨쥬게이트 또는 변형된 화학성질을 가지는 압타머, 예컨대 변형 뉴클레오티드) 다양한 파라미터를 모니터링한다. 그런 파라미터는, 예컨대, 반감기(t1 /2), 혈장 클리어런스(Cl), 분배 부피(Vss), 농도-시간 곡선의 곡선하 면적(AUC), 최대 관찰된 혈청 또는 혈장 농도(Cmax), 및 압타머 조성물의 평균(mean) 체류 시간(MRT)을 포함한다. 본원에서 사용한 것으로서, 용어 "AUC"는 압타머 치료제의 혈장 농도를 압타머 투여 이후 시간에 대한 플롯 이하의 면적을 의미한다. AUC 값은 주어진 압타머 치료제의 생체이용률(즉, 압타머 투여 이후 순환시 투여한 압타머 치료제의 백분율) 및/또는 전신 클리어런스(Cl)(즉, 순환으로부터 압타머 치료제가 제거되는 속도)를 산출하는데 사용한다. 분배의 부피는 신체에 존재하는 압타머의 양에 대한 압타머 치료제의 혈장 농도와 관련된다. Vss가 클수록, 더 많은 압타머가 혈장 밖에서 발견된다(즉, 혈장 유출이 많아진다).
본 발명은 압타머를 변형 부분 예컨대 소형 분자, 펩티드, 또는 중합체 말단기에 컨쥬게이트화함으로써, 또는 변형 뉴클레오티드를 압타머 내에 도입시킴으로써 안정화시킨 압타머 조성물의 생체내 약물동력학과 생체분배를 조절된 방식으로 조절하는 물질과 방법을 제공한다. 본원에 기재한 바와 같이, 변형 부분의 도입 및/또는 뉴클레오티드(들)을 바꾼 화학적 조성은 순환시 압타머 체류 시간 및 조직에서의 분배의 기본적은 태양을 변화시킨다.
뉴클레아제에 의한 클리어런스에 더하여, 올리고뉴클레오티드 치료제는 신장 여과를 통해 제거되는 대상이다. 그렇기 때문에, 여과를 차단할 수 없다면, 통상적으로 정맥내로 투여한 뉴클레아제-내성 올리고뉴클레오티드는 생체내 반감기 ＜10 분을 나타낸다. 이는 조직 내에서 혈류의 빠른 분배를 촉진시킴으로써 또는 사구체에 대해 중단하는 효과적인 크기 이상의 올리고뉴클레오티드의 겉보기 분자량을 증가시킴으로써 실행시킬 수 있다. 이하에 기재한 바와 같이, 소형 치료제를 PEG 중합체와 컨쥬게이션(PEG화)시키면, 치료시 압타머의 체류 시간을 상당히 연장시킬 수 있으며, 그럼으로써 투약 빈도를 감소시키게 되며 그리고 혈관 표적에 대한 효력을 향상시키게 된다.
압타머는 다양한 변형 부분, 예컨대 고분자량 중합체, 예컨대, PEG; 펩티드, 예컨대, Tat(13개의-아미노산 단편의 HIV Tat 단백질(Vives, et al.(1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant(초파리(Drosophila antennapedia) 항상성 단백질의 세번째 헬릭스로부터 유래된 16개의-아미노산 서열(Pietersz, et al.(2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) 및 Arg7(폴리아르기닌으로 구성되며, 짧고 양으로 하전된 세포-투과성 펩티드(Arg7)(Rothbard, et al.(2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J et al.(2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); 및 소형 분자, 예컨대, 친지질성 화합물 예컨대 콜레스테롤에 컨쥬게이션시킬 수 있다. 본원에 기재한 다양한 컨쥬게이트 중에, 압타머의 생체내 성질은 PEG 기와 복합시킴으로써 가장 심각하게 바뀐다. 예컨대, 20 kDa PEG 중합체와 혼합된 2'F 및 2'-OMe 변형 압타머 치료제는 건강한 조직과 염증있는 조직 둘 다에 대해 신장 여과를 억제하며 압타머 분배를 촉진한다. 추가로, 20 kDa PEG 중합체-압타머 컨쥬게이트는 압타머의 신장 여과를 억제하는데 있어 40 kDa PEG 중합체만큼 거의 효과적인 것으로 증명되었다. PEG화의 하나의 효과는 압타머 클리어런스에 대한 것이며, 20 kDa 부분의 존재에 의해 가능한 전체 노출의 연장은 또한 압타머가 조직, 구체적으로 상당히 흩어져 있는 장기와 염증의 부위에 있는 조직에 분배되는 것을 촉진한다. 압타머-20 kDa PEG 중합체 컨쥬게이트는 염증 부위에 대한 압타머 분배를 지향하며, 그럼으로써 PEG화 압타머는 우선적으로 염증 조직에 축적된다. 일부 경우에서, 20 kDa PEG화 압타머 컨쥬게이트는 세포, 예컨대, 신장 세포 안으로 접근할 수 있다.
콜레스테롤과 세포-투과성 펩티드를 포함하는 저분자량 변형 부분에 의해 생성된 압타머 약물동력학 및 조직 분배에 대한 전체적인 효과는 뉴클레오티드의 PEG화 또는 변형(예컨대, 변화된 화학 조성)의 결과로서 생성된 것보다는 덜 뚜렷하다. 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 혈장 지질단백질과의 콜레스테롤-매개 연관은, 안티센스 컨쥬게이트의 경우에서 발생하는 것으로 가정한 것으로서 압타머-콜레스테롤 컨쥬게이트 폴딩된 구조의 특정 상황에서 제외되고/되거나, 콜레스테롤 그룹의 친지질성 성질의 태양과 관련된다는 것을 제안한다. 콜레스테롤과 같이, Tat 펩티드 태그가 존재하면, 48 시간에서 신장에서 컨쥬게이트가 비교적 상당한 수준으로 나타나면서 혈류로부터 압타머의 클리어런스를 촉진한다. 시험관내에서 세포 멤브레인을 가로지르는 거대분자의 통과를 매개하는 것으로 본 기술 분야에서 보고되어 왔던 다른 펩티드(예컨대, Ant, Arg7)는, 순환으로부터 압타머 클리어런스를 촉진하는 것으로 나타나지 않는다. 그렇지만, Tat와 같이, Ant 컨쥬게이트는 다른 압타머와는 상대적으로 신장에 현저하게 축적된다. 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 생체내에서 3차원으로 폴딩된 압타머의 상황에서 Ant와 Arg7 펩티드 변형 부분이 목적하지 않게 나타나는 것은 이들 펩티드가 압타머 수송 특성에 영향을 미치는 능력을 손상시킨다는 것이 가능할 수 있다.
변형 뉴클레오티드는 또한 압타머의 혈장 클리어런스를 조절하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 2'-F 및 2'-0Me 안정화 화학특성을 둘 다 도입한 컨쥬게이트화되지 않은 압타머는, 그것이 시험관내 및 생체내에서 높은 수준의 뉴클레아제 안정성을 나타내는 바와 같이 현재 생성 압타머의 전형이며, 변형되지 않은 압타머와 비교시, 혈장으로부터 빠른 손실(즉, 빠른 혈장 클리어런스) 및 조직 내, 우선적으로 신장 내에서의 빠른 분배를 나타낸다.
PEG - 유도체화 핵산
전술한 바와 같이, 고분자량 비-면역원성 중합체에 의한 핵산의 유도체화는 핵산의 약물역학과 약동학을 바꾸어 그들로 하여금 더 효과적인 치료제가 되게 하는 잠재력을 가진다. 활성에 있어서 바람직한 변화는 뉴클레아제에 의한 분해에 대한 내성이 증가하는 것, 신장을 통한 여과가 감소하는 것, 면역 시스템에 대한 노출이 감소하는 것, 및 신체를 통해 치료제의 분배를 바꾸는 것을 포함한다.
본 발명의 압타머 조성물은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 부분에 의해 유도체화될 수 있다. PAG-유도체화된 핵산의 예는 미국특허출원 No.10/718,833(November 21, 2003 출원)에서 찾아볼 수 있으며, 그것의 전문을 본원에서 참고문헌으로 인용하였다. 본 발명에 사용한 전형적인 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG'), 또한 폴리(에틸렌 옥시드)("PEO")로 알려진 것 및 폴리프로필렌 글리콜(폴리 이소프로필렌 글리콜 포함)을 포함한다. 추가로, 상이한 알킬렌 옥시드(즉, 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드)의 불규칙 공중합체 또는 블럭 공중합체를 많은 용도에 사용할 수 있다. 가장 평범한 형태로서, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 PEG는 하이드록실 기로 된 각각의 말단이 종료되는 선형 중합체이다: HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH. 이 중합체, 알파-, 오메가-디하이드록실폴리(에틸렌 글리콜)은 또한 HO-PEG-OH로서 나타낼 수 있으며, 이 경우 -PEG- 심벌은 이하의 구조 단위를 나타내는 것으로 이해된다: -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2- 여기서 n은 통상적으로 약 4 내지 약 10,000의 범위이다.
나타난 바와 같이, PEG 분자는 2-작용기성이며 그리고 때때로 "PEG 디올"로서 언급된다. PEG 분자의 말단 부분은 상대적으로 비-반응성 하이드록실 부분이며, -OH 기가, 화합물 상의 반응성 위치에서 다른 화합물과 PEG의 결합을 위해 활성화될 수 있거나 또는 작용기 부분로 전환될 수 있다. 그런 활성화된 PEG 디올은 본원에서 이중 활성화(bi-activated) PEG로서 언급한다. 예컨대, PEG 디올의 말단 부분은 상대적으로 비반응성 하이드록실 부분, -OH를 N-하이드록시 석신이미드로부터 석신이미딜 활성 에스테르 부분로 치환시킴으로써, 아미노 부분와의 선택적 반응을 위해 활성 카보네이트 에스테르로 작용기화시켰다.
많은 응용에서, 하나의 말단 상의 PEG 분자를 본질적으로 비-반응성 부분으로 캡핑시켜 PEG 분자가 단일-작용기성(또는 단일-활성화) 되게 하는 것이 바람직할 수 있다. 활성화된 PEG에 대해 일반적으로 다중 반응 위치를 나타내는 단백질 치료제의 경우, 이중-작용기성 활성화 PEG는 광범위한 가교를 유발하며, 작용기성 응집을 거의 나타내지 않는다. 단일-활성화 PEG를 생성시키기 위해, PEG 디올 분자의 말단 상의 하나의 하이드록실 부분은 통상적으로 비-반응성 메톡시 말단 부분, -OCH3로 치환된다. PEG 분자의 다른 캡핑시키지 않은 말단은 통상적으로 표면 또는 분자 예컨대 단백질 상의 반응성 위치에 접촉시키기 위해 활성화될 수 있는 반응성 말단 부분으로 전환된다.
PAG은 물 및 많은 유기 용매 중에서의 용해도의 특성을 가지며, 독성이 없으며, 그리고 면역원성이 없는 중합체이다. PAG의 하나의 용도는 중합체에 공유적으로 결합하여 가용성 분자로 하여금 가용성 PAG-분자 "컨쥬게이트"를 얻게 하는 것이다. 예컨대, 비-수용성 약물 피클리탁셀이 PEG와 커플링되는 때에 수용성이 되는 것을 보여주었다. 문헌[Greenwald, et al, J. Org. Chem., 60:331-336(1995)] 참조. PAG 컨쥬게이트는 용해도와 안정성을 향상시키는데 뿐 아니라 분자의 혈액 순환 반감기를 연장시키는데 자주 사용한다.
본 발명의 폴리알킬화 화합물은 통상적으로 5 내지 80 kD 크기 사이지만 압타머 및 용도에 좌우하는 선택으로 임의의 크기를 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 PAG 화합물들은 10 내지 80 kD 크기 사이이다. 본 발명의 더 다른 PAG 화합물들은 10 내지 60 kD 크기 사이이다. 예컨대, PAG 중합체는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 80 kD 크기일 수 있다. 그런 중합체는 선형이거나 또는 분지형일 수 있다.
생물학적으로-발현시킨 단백질 치료제와는 대조적으로, 핵산 치료제는 통상 활성화된 단량체 뉴클레오티드로부터 화학적으로 합성한다. PEG-핵산 컨쥬게이트는 동일한 반복성 단량체 합성을 사용하여 PEG를 도입시킴으로써 제조할 수 있다. 예컨대, 포스포르아미다이트 형태로 전환시킴으로써 활성화된 PEG는 고체-상 올리고뉴클레오티드 합성 안으로 도입시킬 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드 합성은 반응성 PEG 결합 부위의 위치-특이적인 도입으로 완료시킬 수 있다. 가장 일반적으로 유리(free) 1급 아민을 5'-말단에 첨가함으로써 이를 실시하였다(고체상 합성의 최종 커플링 단계에서 변형 포스포르아미다이트를 사용하여 도입시켰다). 이 방식을 사용하여, 반응성 PEG(예컨대, 활성화되어 아민과 반응하며 그리고 결합을 형성하는 것)를 정제된 올리고뉴클레오티드와 조합시키며 그리고 커플링 반응을 용액 중에서 실시하였다. 일부 구체예에서 중합체는 분지형 PEG 분자이다. 더 다른 구체예에서 중합체는 40 kDa 분지형 PEG이다, 예컨대 도 4에 도시한(1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드) 참조. 일부 구체예에서 40 kD 분지형 PEG(1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)는 도 5에 도시한 바와 같이 압타머의 5' 말단에 결합한다.
치료제의 생체분배를 변화시키는 PEG 컨쥬게이트화의 능력은 컨쥬게이트의 겉보기 크기(예컨대, 유체역학 반경의 측면에서 측정한 것으로서)를 포함하는 다수의 인자와 관련된다. 더 큰 컨쥬게이트(＞10 kDa)는 신장을 통한 여과를 더 효과적으로 차단하며 그리고 결과적으로 소형 거대분자(예컨대, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 혈청 반감기를 증가시킨다. 여과를 차단하는 PEG 컨쥬게이트의 능력은 PEG 크기를 대략 50 kDa까지 증가시키는 것으로 나타났다(추가로 증가시키면 신장을 통한 제거 보다는 마크로파지-매개 대사에 의해 반감기를 정의하게 되면서 최소의 유리한 효과를 가진다).
고분자량 PEG(＞ 10 kDa)를 제조하는 것은 어렵고, 비효율적이며, 그리고 비용이 많이들 수 있다. 고분자량 PEG-핵산 컨쥬게이트의 합성을 향하는 경로로서, 종래의 연구들은 더 높은 분자량의 활성화 PEG의 생성을 향해 촛점을 맞추어 왔다. 그런 분자를 생성시키기 위한 하나의 방법은 분지형 활성화 PEG를 생성시키는 것을 포함하며 이 경우 2 또는 그 이상의 PEG를 활성화 기를 운반하는 중심 코어에 결합시킨다. 이들 더 높은 분자량의 PEG 분자의 말단 부분, 예컨대, 상대적으로 비-반응성 하이드록실(-OH) 부분이, 1 또는 그 이상의 PEG를 그 화합물 상의 반응성 위치에서 다른 화합물들에 결합시키기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 작용기성 부분로 전환된다. 분지형 활성화된 PEG는 2개 이상의 말단을 가지며, 그리고 2 또는 그 이상의 말단이 활성화되었던 경우에, 그런 활성화된 더 높은 분자량의 PEG 분자는 본원에서 언급한 것으로서, 다중-활성화 PEG라고 언급한다. 일부 경우에서, 분지형 PEG 분자의 말단 모두가 활성화되는 것은 아니다. 분지형 PEG 분자의 임의의 2개의 말단이 활성화되는 경우, 그런 PEG 분자는 이중-활성화 PEG라고 언급한다. 분지형 PEG 분자의 단 하나의 말단이 활성화되는 경우, 그런 PEG 분자는 단일-활성화된 것으로 언급한다. 이런 접근의 하나의 예로서, 라이신 코어에 2개의 모노메톡시 PEG를 결합시킴으로써 활성화 PEG를 제조하고 결과적으로 반응을 위해 활성화 된다는 것이 기재되어 있다(Harris et al, Nature, vol.2: 214-221, 2003).
본 발명은 다중 PEG화 핵산을 포함하는 고분자량 PEG-핵산(바람직하게는, 압타머) 컨쥬게이트를 합성하는 비용 효과적인 다른 경로를 제공한다. 본 발명은 또한 PEG-연결 다중합체성 올리고뉴클레오티드, 예컨대, 이합화된 압타머를 포함한다. 본 발명은 또한 고분자량 조성물에 관한 것으로서 이 경우 PEG 안정화 부분이 링커로서 압타머의 상이한 부분을 분리시키며, 예컨대, 그 PEG는 단일 압타머 서열 안에 컨쥬게이트화되며, 그럼으로써 고분자량 압타머 조성의 선형 배열은, 예컨대, 핵산-PEG-핵산(-PEG-핵산)n이며 여기서 n은 1 이상이거나 또는 1과 동일하다.
본 발명의 고분자량 조성물은 10 kD 이상의 분자량을 가지는 것을 포함한다. 조성물들은 통상 10 내지 80 kD 크기 사이의 분자량을 가진다. 본 발명의 고분자량 조성물은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 또는 80 kD 크기 이상이다.
안정화 부분은 본 발명의 고분자량 압타머 조성물의 약물역학과 약동학 특성을 향상시키는 분자, 또는 분자의 일부이다. 일부 경우, 안정화 부분은 2 또는 그 이상의 압타머, 또는 압타머 도메인을, 인접한 곳으로 가져오거나, 또는 본 발명의 고분자량 압타머 조성물의 전체적인 회전 자유도를 감소시키는 분자, 또는 분자의 일부이다. 안정화 부분은 선형 또는 분지형인, 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있는 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 다른 안정화 부분은 펩티드핵산(PNA)과 같은 중합체를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 안정화 부분일 수 있으며; 그런 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 및/또는 변형 연결, 예컨대 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다. 안정화 부분은 압타머 조성의 집중 부분(integral part)일 수 있으며, 예컨대, 그것은 압타머에 공유 결합될 수 있다.
본 발명의 조성물은 2 또는 그 이상의 핵산 부분이 1 이상의 폴리알킬렌 글리콜 부분에 공유결합으로 컨쥬게이트화된 고분자량 압타머 조성물을 포함한다. 폴리알킬렌 글리콜 부분은 안정화 부분으로서 작용한다. 폴리알킬렌 글리콜이 핵산 부분과 함께 하나의 분자 내에서 결합하도록 조성물에서 폴리알킬렌 글리콜 부분이 압타머에 두 말단에 공유결합으로 결합되는 경우, 그 폴리알킬렌 글리콜은 연결 부분이라고 한다. 그런 조성물에서, 공유결합 분자의 1차 구조는 선형 배열 핵산-PAG-핵산을 포함한다. 하나의 예는 1차 구조 핵산-PEG-핵산을 가지는 조성물이다. 다른 예는 핵산 - PEG - 핵산 - PEG - 핵산의 선형 배열이다.
핵산 - PEG - 핵산 컨쥬게이트를 생성시키기 위해, 하나의 반응성 부위를 가지도록(예컨대, 단일-활성화되도록) 먼저 핵산을 합성한다. 바람직한 구체예에서, 이 반응성 위치는 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성시 최종 단계로서 변형 포르포로아미다이트를 첨가함으로써 5'-말단에 도입된 아미노기이다. 변형 올리고뉴클레오티드의 탈보호와 정제에 이어서, 활성화 PEG의 자발적 가수분해를 최소화하는 용액 중에서 고농도에서 재구성된다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 1 mM이며 그리고 재구성된 용액은 200 mM NaHCO3-버퍼, pH 8.3을 포함한다. 컨쥬게이트의 합성은 상당히 정제된 이중-작용기성 PEG를 천천히 단계적으로 첨가함으로써 개시한다. 바람직한 구체예에서, PEG 디올은 석신이미딜 프로피오네이트로 유도체화시킴으로써(이중-활성화된) 두 말단에서 활성화된다. 반응에 이어, PEG-핵산 컨쥬게이트는 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피에 의해 정제하여 완전-, 부분- 및 비-컨쥬게이트화된 종으로 분리시킨다. 연쇄된 다중 PAG 분자(예컨대, 불규칙 또는 블럭 공중합체로서) 또는 더 작은 PAG 체인은 연결되어 다양한 길이(또는 분자량)를 얻을 수 있다. 비-PAG 링커는 다양한 길이의 PAG 체인 사이에서 사용할 수 있다.
2'-OMe, 2'-플루오로 및 다른 변형 뉴클레오티드 변형은 뉴클레아제에 대해 압타머를 안정화시키며 그리고 그것의 생체내 반감기를 증가시킨다. 3'-3'-dT 캡은 또한 엑소뉴클레아제 내성을 증가시킨다. 예컨대, 미국 특허 5,674,685; 5,668,264; 6,207,816; 및 6,229,002를 참조하며, 이들 각각은 그것의 전문을 본원에서 참고문헌으로 인용하였다.
반응성 핵산의 PAG - 유도체화
고분자량 PAG-핵산-PAG 컨쥬게이트는 1 이상의 반응성 부위를 가지는 핵산과 단일-작용기성 활성화 PEG의 반응에 의해 제조할 수 있다. 하나의 구체예에서, 핵산은 이중-반응성이거나, 또는 이중-활성화된 것이며, 그리고 2개의 반응성 부위를 포함한다: 5'-아미노기 및 3'-아미노기를 종래의 포스포로아미다이트 합성을 통해 올리고뉴클레오티드 안으로 도입시킨다, 예컨대: 도 6에 도시한 바와 같은 3'-5'-디-PEG화. 대안의 구체예에서, 예컨대, 5-위치의 피리미딘, 8-위치의 푸린, 또는 2'-위치의 리보스를 1급 아민의 결합을 위한 사이트로서 사용하여, 반응성 부위를 내부 위치에 도입시킬 수 있다. 그런 구체예에서, 핵산은 수개의 활성화 또는 반응성 부위를 가질 수 있으며 그리고 다중으로 활성화되었다고 한다. 합성과 정제에 이어서, 올리고뉴클레오티드 반응성 부위와의 선택성 반응을 촉진시키면서 자발적인 가수분해를 최소화하는 조건하에서 변형 올리고뉴클레오티드를 단일-활성화 PEG와 조합시킨다. 바람직한 구체예에서, 모노메톡시-PEG를 석신이미딜 프로피오네이트로 활성화시키며 그리고 pH 8.3에서 커플링 반응을 실시한다. 이중-치환된 PEG의 합성을 유도하기 위해, 올리고뉴클레오티드에 상대적으로 화학식량비의 과량으로 PEG을 제공한다. 반응에 이어서, PEG-핵산 컨쥬게이트를 겔 전기영동 또는 액체 크로마토그래피로 정제하여 완전-, 부분- 및 비-컨쥬게이트화된 종으로 분리시킨다.
연결 도메인은 또한 거기에 결합한 1 또는 그 이상의 폴리알킬렌 글리콜 부분을 가질 수 있다. 그런 PAG은 다양한 길이일 수 있으며 그리고 그 조성물의 목적하는 분자량을 얻기 위해 적절한 조합으로 사용할 수 있다.
특정 링커의 효과는 그것의 화학적 조성과 길이 둘 다에 의해 영향을 받을 수 있다. 너무 길거나, 너무 짧거나, 또는 표적과 목적하지 않는 입체 상호작용 및/또는 이온성 상호작용을 형성하는 링커는 압타머와 표적 사이에서 복합체의 행성을 배제시키게 된다. 핵산들 사이의 거리에 걸치는데 필요한 것보다 더 긴 링커는, 리간드의 유효 농도를 감소시킴으로써 결합 안정성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 압타머의 표적에 대한 친화성을 최대화하기 위해 링커 조성과 길이를 최적화하는 것이 흔히 필요하다.
본원에 인용된 모든 공개 문헌 및 특허 문헌은 마치 각각의 그러한 공개 문헌 또는 특허 문헌이 본원에 참고 인용한 것으로서 특징적으로 그리고 개별적으로 나타낸 바와 같이 본원에 참고 인용되어 있다. 그 공개 문헌 및 특허 문헌의 인용은 임의의 것이 선행 기술과 관련되었다는 허가로서 의도하는 것은 아니며, 동일한 것의 내용물 또는 출판일에 대한 임의의 허가를 구성하지도 않는다. 본 발명은 기술되는 기재의 방식으로 이제 기재되며, 본 기술 분야에서 당업자는 본 발명을 다양한 구체예로 실시할 수 있다는 것 및 전술한 기재와 이하의 실시예는 설명을 위한 목적이며 이어지는 청구항을 제한하는 것이 아니라는 것을 인식하고 있다.
[실시예]
실시예 1
전형적인 보체 경로와 대안적인 보체 경로에서의 항- C5 압타머 활성
실시예 1A: 용혈 분석법.
CH50 테스트로, 혈청 테스트 시료 중에서 항체-코팅된 양(sheep) 적혈구의 표준 현탁액 중에서 50%의 세포를 용혈시키는 보체 시스템의 능력을 측정하였다. 다양한 항-C5 압타머가 존재하거나 또는 존재하지 않는 조건 하에서 0.2% 인간 혈청의 용액을 항체-코팅된 양 적혈구와 혼합시켰다(Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., 플로리다주 마이애미 소재). 그 분석법은 칼슘, 마그네슘 및 1% 젤라틴(GVB++ 보체 버퍼)를 함유하는 베로날(veronal)-완충 식염수 중에서 키트 프로토콜에 따라 실시하였으며 그리고 30 분 동안 37 ℃에서 항온처리시켰다. 항온처리 이후, 시료를 원심분리시켜 손상되지 않은 적혈구를 펠렛화하였다. 상청액의 412 nm에서의 광학 밀도(OD412)를 읽어서 가용성 헤모글로빈의 방출을 정량화하였으며, 이는 용혈량과 비례하였다(Green et al,(1995) Chem. Biol. 2:683-95). 압타머가 C5 활성화를 차단하는 것을 증명하기 위해, ELISA(C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 ELISA 키트 프로토콜에 따라 C5a 및 C5b-9의 존재에 대해 일부 용혈 상청액을 분석하였다.
비-PEG화 항-C5 압타머(ARC186)(서열 번호: 4)를 반응 혼합물에 첨가하면, 도 7a의 그래프에 도시된 바와 같이, 니트로셀룰로스 여과에 의해 측정한 KD와 일치하는 값으로서, IC50 0.5 ± 0.1 nM으로(도 7b 참조) 투여량-의존적인 방식으로 용혈을 억제하였다. 상당히 높은 압타머 농도에서(±10 nM), 용혈량은 본질적으로 백그라운드로부터 구분되지 않았으며(혈청을 첨가하지 않은 경우), 이는 ARC186(서열 번호: 4)이 보체 활성을 완전히 차단할 수 있다는 것을 의미한다. ARC186(서열 번호: 4) 압타머와 20 kDa(ARC657; 서열 번호: 61), 30 kDa(ARC658; 서열 번호: 62), 분지형 40 kDa(1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)(ARC187; 서열 번호: 5), 분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일)(ARC1905; 서열 번호: 67), 선형 40 kDa(ARC1537; 서열 번호: 65), 및 선형 2×20 kDa(ARC1730; 서열 번호: 66) PEG 기의 컨쥬게이션은 CH50 용혈 분석에서 압타머 억제 활성에 거의 효과를 갖지 않았다(도 7a-도 7d).
추가 연구에서, PEG화 항-C5 압타머 ARC1905(분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일); 서열 번호: 67)의 억제 활성을, 전술한 바와 같이 CH50 용혈 분석에서 말단 5'-아민을 함유하는 그것의 비-PEG화 전구체, ARC672(서열 번호: 63)와 비교하였다. 인간 혈청 용액(Innovative Research, Southfield, MI)을 ARC1905와 ARC627 각각의 다양한 농도의 존재 또는 부재시 각각의 분석법에서 혈청의 최종 농도가 0.1%가 되도록 항체-코팅된 양 적혈구와 혼합시켰으며(Diamedix EZ 보체 CH50 Kit, Diamedix Corp., 플로리다주 마이애미 소재), 및 제조업자의 추천 프로토콜에 따라 분석법을 실시하였다. 용혈 반응을 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕시키면서 현탁액 중에 세포가 잔류하는 것을 확인하면서 항온처리시켰다. 항온처리가 끝날 무렵, 손상되지 않은 세포를 원심분리로 펠렛화시키고(2000 rpm, 2 분, 실온), 200 μL 상청액을 평평한-바닥 폴리스티렌 플레이트에 이동시켰다(VWR, cat# 62409-003). 상청액의 415 nm에서의 광학 밀도(OD415)를 읽고 가용성 헤모글로빈의 방출을 정량화하였다. 측정한 압타머 농도에서의 억제 %를 방정식 억제 % = 100 - 100 ×(A시료 - A비혈청) /(A비압타머 - A비혈청)을 사용하여 계산하였으며, 여기서 A시료는 다양한 압타머 농도에서의 시료 흡광도이며, A비혈청은 혈청이 없이 백그라운드 용혈에 의한 흡광도이며(억제 100% 대조군) 그리고 A비압타머는 압타머 없이 베이스라인 보체 활성에 의한 흡광도이다(억제 0% 대조군). 억제 % 대비 [억제제]의 플롯으로부터 방정식 억제 % =(억제 % )최대 × [억제제]n /(IC50 n + [억제제]n) + 백그라운드를 사용하여 IC50 값을 측정하였다. IC90 및 IC99 값은 IC50 값으로부터 방정식 IC90 = IC50 × [90/(100-9O]1/n 및 IC90 = IC50 × [99/(100-99]1/n을 사용하여 산출하였다. 이 병렬 연구에서 ARC1905 및 ARC627의 IC50 값은 각각 0.648 +/- 0.0521 및 0.913 +/- 0.0679였으며(또한 도 58 참조) 이는 만약 있다고 한다면 약간, PEG화가 압타머 기능에 영향을 미친다는 것을 확인하는 것이다.
용혈 상청액의 ELISA 분석은 C5a 방출의 차단과 관련된 이 기능 억제를 의미한다. 따라서, 용혈 데이타는 ARC186(서열 번호: 4), 및 그것의 PEG화 컨쥬게이트가 C5의 컨버타제-촉매 활성화를 차단함으로써 기능하는 아주 강력한 보체 억제제라는 것을 보여준다.
비-PEG화 물질에 의한 용혈 분석은 항-C5 압타머가 래트, 기니아 피그(guinea pig), 개 및 돼지를 포함하는 다수의 비-영장류 종으로부터의 C5와는 교차-반응하지 않는다는 것을 의미한다. 그렇지만, 시노몰거스 마카크와 침팬지로부터의 혈청을 포함하는 영장류 혈청의 스크린에서 현저한 억제 활성을 관찰하였다. 항-C5 압타머의 시험관내 효력을 시노몰거스 혈청에서 ARC658(서열 번호: 62), ARC186(서열 번호: 4)의 30 kDa-PEG 유사체를 사용하여 추가로 조사하였다. 일대일(side-by-side) 비교에서(n = 3), ARC658은 IC50 0.21 ± 0.0 nM로 인간 보체 활성을 억제하며 그리고 시노몰거스 보체 활성은 IC50 1.7 ± 0.4 nM(도 8)로 억제하였다. 따라서 ARC658(서열 번호: 62)은 이 측정에서 인간에 비해 시노몰거스 혈청에서 8 ± 3배 덜 강하다.
관련 연구에서, 양 적혈구 용혈에 의해 분석한 것으로서 분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일) PEG화 항-C5 압타머, ARC1905(서열 번호: 67)의 전형적인 보체 경로 활성화를 인간(Innovative Research, 미시간주 사우쓰필드 소재), 시노몰거스 멍키(Bioreclamation, 뉴욕주 힉스빌 소재), 또는 래트의 혈청(Bioreclamation, 뉴욕주 힉스빌 소재)의 존재 하에서 조사하였다. 이들 분석법은, 앞에 직접 기재한 바와 같이 양 적혈구 용혈 상에서 ARC672에 대한 ARC1905의 억제 효과를 비교하는데 사용한 것과 동일한 조건하에서 상당히 희석시킨 혈청, 인간과 시노몰거스 멍키에 대해 0.1%, 및 래트에 대해 0.3% 중에서 실시하였다. 일대일 비교시, 인간과 시노몰거스 멍키 혈청에서 ARC1905에 의해 시험관내 보체 활성의 완전 억제(90-99%)를 얻을 수 있었지만 ARC1905는 래트 보체 시료 중에서 특이적 억제 활성을 나타내지 않았다(도 59a). ARC658과 유사하게, 분석법의 조건 하에서 시노몰거스 보체 활성에 대해 ARC1905는 ~10-배 더 약했으며, 이는 도 59b에 보고된 IC90 및 IC99 값에서도 반영되는 바와 같다.
니트로셀룰로스 필터 결합 분석법. γ-32P-ATP와 폴리뉴클레오티드 키나제를 함께 항온처리시킴으로써 개별 압타머를 5' 말단에 32P-표지화시켰다(New England Biolabs, Beverly, MA). 방사능 표지화된 압타머를 겔-여과시키고 이어서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 유리 ATP로부터 정제하였다. 항-C5 압타머 친화성을 측정하기 위해, 방사능 표지화된 압타머(＜ 10 pM)를 1 mM MgCl2를 함유하는 포스페이트-완충 식염수 중에서 농도를 증가시킨(0.05 - 100 nM) 정제된 C5 단백질(Quidel, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)과 실온(23℃) 및 37℃에서, 15 분 및 4 hr 시간 간격으로 항온처리시켰다. 니트로셀룰로스 여과에 의해 결합 반응을 미니폴드(Minifold) I 도트-블롯(dot-blot), 96-웰 진공 여과 매너폴드(manifold)를 사용하여 분석하였다(Schleicher & Schuell 뉴햄프셔주 킨 소재). 프로트란(Protran) 니트로셀룰로스(Schleicher & Schuell), 하이본드-P 나일론(Hybond-P nylon, Amersham Biosciences, 뉴저지주 피스캣어웨이 소재) 및 GB002 겔 블롯 페이퍼(gel blot paper, Schleicher & Schuell)로 구성된(정상부에서 바닥부까지) 3-층 여과 매질을 사용하였다. 핵산에 대해 선택적으로 단백질과 결합하는 니트로셀룰로스 층은, 단백질 리간드와 복합체를 이룬 항-C5 압타머에 우선적으로 잔류하며, 비-복합체화된 항-C5 압타머는 니트로셀룰로스를 통과하여 나일론에 부착된다. 겔 블롯 페이퍼는 간단히 다른 필터에 대한 지지 매질로서 포함된다. 여과에 이어, 필터 층을 분리시키고, 건조시키고 포스포르 스크린(Amersham Biosciences) 상에 노출시켰으며 그리고 Storm 860 Phosphorimager® 블롯 이미지화 시스템(Amersham Biosciences)을 사용하여 정량화하였다.
도 9 및 도 10에 도시되어 있는 바와 같이, C5 농도를 증가시키는 것은 니트로셀룰로스 멤브레인 상에 포획된 ARC186의 비율을 증가시킨다. C5 농도 증가에 대한 결합된 ARC186의 의존성은 단일-부위 결합 모델에 의해 잘 설명되어진다(C5 + ARC186 ↔ C5·ARC186; 결합 % = C최대 /(1 + KD / [C5]); C최대는 포화 [C5]에 결합된 최대 %이며; KD는 해리 상수이다). 15 분 또는 4 시간 항온처리 이후 2개의 온도에서의 ARC186 결합 곡선을 도 9 및 10에 각각 도시하였다. 15 분 항온처리 이후, 23 및 37 ℃에서의 ARC186 결합 곡선은 오차 범위 내에서 본질적으로 구별되지 않았으며, 이는 KD 값 0.5 - 0.6 nM과 들어맞는다(도 9). 항온처리 시간이 연장된 때에는 23 및 37 ℃에서의 결합 곡선 사이의 차이는 더 드러난다. 4 hr 항온처리 이후(도 10), 23 ℃에서 관찰한 KD가 0.08 ± 0.01 nM로 감소하였으며, 37 ℃에서 관찰한 KD는 바뀌지 않고 남아있다(0.6 ± 0.1 nM).
실온에서 항온처리가 오래 필요한 경우에 대한 기초를 증명하기 위해, 이 온도에서의 친화성은 동력학적인 방법을 사용하여 추가로 조사하였다. C5·ARC186의 해리를 설명하는 역반응의 속도 νrev = k-1 /[C5·ARC186]이며, 여기서 νrev는 속도이며(M min-1의 단위) 그리고 k-1은 1차 해리 속도 상수이다(min-1의 단위). C5·ARC186 복합체를 형성하는 것을 설명하는 정반응의 속도 νfor = k1[C5][ARC186]이며, 여기서 νfor는 속도이며(M min-1의 단위) 그리고 k1은 2차 결합 속도 상수이다(M-1min-1의 단위). 유사-1차 가정을 사용하여 데이타를 분석하였으며, 여기서 하나의 반응물의 농도는(이 경우 C5) 다른 것에 대해 거대 과량이며([C5] ≫ [ARC186]), 그리고 따라서 반응 전반에 걸쳐 본질적으로 변화하지 않고 남는다. 이들 조건 하에서, 정반응은 1차 프로세스에 대한 속도 방정식으로 설명되며, νfor = k1'[ARC186], 여기서 k1' = k1[C5]이다.
C5·ARC186의 해리를 분석하기 위해, 방사능 표지화된 ARC186(＜ 10 pM)을 실온(23 ℃)에서 1 mM MgCl2를 함유하는 포스페이트-완충 식염수 중에서 5 nM C5 단백질로 사전 평형을 유지시켰다. 비표지화된 ARC186(1 μM)을 첨가함으로써 해리 반응을 개시시켰으며, 이것은 유리 C5에 대한 트랩(trap)으로서 작용하며, 그리고 결합한 방사능 표지화된 ARC186과 유리된 것을 니트로셀룰로스 여과 분배시킴으로써 정지시켰다. 해리 반응의 개시와 여과 사이의 간격을 변화시킴으로써 ARC186 해리의 시간과정을 얻었다. 해리의 시간과정은, 니트로셀룰로스 필터 상에 포획된 방사능 표지화된 ARC186의 감소 백분율로서 관찰되는 것으로서(C5에 대한 결합 %와 동일함), 단일-지수형 감소에 의해 잘 설명되어지며 여기서 % 결합된 ARC186 = 100 × e-k-1t 이다(도 11 참조). 이 방법으로 측정한 해리 속도 상수 k-1의 값은, 0.013 ± 0.02 min-1이며, 반감기(t1 /2 = ln2 / k-1) 53 ± 8 min에 대응한다.
해리 반응을 분석하기 위해, C5·ARC186의 생성에 대한 평형 속도 상수(keq)를 C5 단백질(1 - 5 nM)의 다양한 농도의 존재하에서 측정하였다. C5 단백질과 방사능 표지화된 ARC186을 함께 1 mM MgCl2를 함유하는 PBS 중에서 실온(23 ℃)에서 혼합함으로써 복합체 형성을 개시하였으며, 그리고 니트로셀룰로스 여과 분배시킴으로써 정지시켰다. 해리 반응에 대해 기재한 바와 같이, 반응의 개시와 여과 사이의 간격을 변화시킴으로써 복합체 생성의 시간과정을 얻었다. 평형의 시간과정은, 니트로셀룰로스 필터 상에 포획된 방사능 표지화된 ARC186의 백분율의 증가로서 관찰되어지는 것으로서, 단일-지수형 감소로서 잘 설명되어지며 여기서 ARC186 결합 % = 100 ×(1 - e - k1t)이다. 1, 2 및 4 nM C5에 대한 평형의 시간과정을 도 12에 도시하였다. 기대한 바와 같이, keq의 값은 [C5]에 따라 선형으로 증가하였다(keq(1 nM) = 0.19 ± 0.02 min-1; km(2 nM) = 0.39 ± 0.03 min-1; keq (3 nM) = 0.59 ± 0.05 min-1; keq (4 nM) = 0.77 ± 0.06 min-1; keq (5 nM) = 0.88 ± 0.06 min-1). 실험의 조건 하에서, keq, k1 및 k-1 사이의 관계는 keq = k1[C5] + k-1이다. 따라서, k1에 대한 추정은 keq 대 [C5]의 플롯의 기울기로부터 유도되며(도 12 인세트 참조), 이 경우에는 0.18 ± 0.01 nM-1min-1이었다.
이들 데이타는, 낮은 C5 농도(즉, 0.1 nM)의 조건 하에서, C5와 방사능 표지화된 ARC186의 혼합물로 하여금 평형에 도달하게 하기 위하여 항온처리를 연장시키는 것이 필요하다는 것을 의미한다. 이들 조건 하에서, keq =(0.18 ± 0.01 nM-1min-1)(0.1 nM) + 0.013 min-1 = 0.03 min-1이었으며, 반감기 22 min에 대응하였다. 따라서, 평형을 완료(＞ 95%)시키는데 거의 2 시간의 실온 항온처리(반감기의 ~ 5배)가 필요하다. 15 min(KD = 0.5 nM) 대비 4 시간(KD = 0.08 nM) 항온처리에 대해 관찰된 친화성에서의 차이에 의해 앞서 나타난 바와 같이, 항온 처리 시간이 짧은 것은(예컨대, 15 분) 복합체의 실질적인 친화성을 현저하게 과소평가시킨다. 실온 KD의 대체 추정은 관계식 KD = k-1 / k1에 따라 동력학적 데이타로부터 계산할 수 있다. 이 경우, 계산된 KD는 0.07 ± 0.01 nM이며, 열역학적 방법으로 앞서 측정한 KD와 완벽하게 일치하였다.
C5에 대한 ARC186(서열 번호: 4)의 특이성은 또한, 보체 캐스케이드 중에서 C5로부터 업스트림과 다운스트림 둘 다에서 보체 성분과 비교함으로써 니트로셀룰로스 여과 분석법으로 평가하였다. C1q(cat. # A099.18; 2.3 μM), C3(cat. # A113c.8; 27 μM), C5(cat. # A120.14; 5.4 μM), C5a des Arg(cat. # A145.6; 60 μM), sC5b-9(cat. # A127.6; 1 μM), 팩터 B(cat. #A135.12; 11 μM) 및 팩터 H(cat. # A137.13P; 6.8 μM)를 포함하는 정제 인간 단백질 및 단백질 복합체는 Complement Technologies(Tyler, TX)로부터 입수하였다. 1-4 시간 동안 25 ℃ 또는 37 ℃에서 항온처리시킨, 1 mM MgCl2, 0.02 mg/mL BSA 및 0.002 mg/mL tRNA를 포함하는 PBS 중에서 단백질의 병렬 희석을 실시함으로써 결합 반응을 실시하였으며, 그리고 이후 전술한 바와 같이 니트로셀룰로스 여과 장비에 적용하였다. 해리 상수 KD는 이하의 방정식에 데이타를 핏팅시킴으로써 % 니트로셀룰로스 결합 대비 [C5]의 세미-로그(semi-log) 플롯으로부터 측정하였다: 니트로셀룰로스 결합 % = 폭(amplitude) × [C5] /(KD + [C5]).
도 13에 도시한 결과는 압타머가 본질적으로 C5a를 인식하지 않는다는 것을 보여주지만(KD ≫ 3 μM), 아마도 C5b 성분과의 상호작용에 의해 가용성 C5b-9(KD ＞ 0.2 μM)에 대한 약한 친화성을 보여준다. 다른 보체 성분은 압타머에 대한 비교적 낮은 친화성을 나타낸다. 비-활성화 C3는 본질적으로 압타머에 결합하지 않지만; 팩터 H(KD ~ 100 nM)와, 더 적은 양으로, C1q(KD ＞ 0.3 μM)는 결합한다. 이와 함께, 그 데이타는 ARC186(서열 번호: 4)이, 주로 C5b 도메인을 인식하는 것을 통해 인간 C5에 높은 친화성으로 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, ARC186 및 그것의 PEG화 유도체 예컨대, ARC1905는 C3b의 생성을 방해하지 않아야 하며, 이것은 박테리아의 옵소닌작용(opsonization), 또는 조절 인자들에 의한 C' 활성화의 본질적인 조절에 중요하다.
압타머와 고분자량 PEG 부분의 컨쥬게이션은 친화성의 감소를 유발하게 되는 입체 장애의 가능성을 도입시킨다. PEG-변형 압타머는, 심지어 표적 단백질이 없는 경우에도 이들 압타머가 니트로셀룰로스에 부착하는 경향으로 인하여 니트로셀룰로스 여과에 의해 직접 결합에 대해 용이하게 평가되지 않는다. 그렇지만, 37℃에서 실시하는 경쟁 결합 분석법으로서 알려진 니트로셀룰로스 여과에 의해 측정한 것으로서 표적에 대한 결합에 대해, 이들 압타머의 상대적인 친화성은 방사능 표지화된, 비-PEG화 압타머(≤ 10 pM)와 경쟁하는 그들의 비교 능력으로부터 산출할 수 있다. 콜드(cold)(즉, 방사능 비표지화된) 경쟁자의 농도가 증가함에 따라, 표적 단백질에 대한 방사능 표지화된 압타머의 결합 %는 감소한다. 도 14에 도시된 바와 같이, 콜드 ARC186(서열 번호: 4) 또는 PEG화 압타머(ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62), 및 ARC187(서열 번호: 5))(0.05 - 1000 nM)의 농도를 증가시키면 2 nM C5 단백질의 존재시 결합에 대해 방사능 표지화된 ARC186(서열 번호: 4)와 쉽게 경쟁한다. 추가로, 4개 압타머 전부의 적정 곡선은 거의 중첩하며, 이는 ARC657, ARC658 및 ARC187의 경우에서 PEG 컨쥬게이션이 C5에 대한 압타머의 친화성에 대해 거의 영향을 적게 미치거나 또는 영향을 미치지않는다는 것을 의미한다.
유사한 연구에서, C5에 대한 결합에 대한 PEG 컨쥬게이션의 효과는 경쟁 결합 분석법을 사용하여 ARC672(5'-말단 아민을 가지는 ARC186; 서열 번호 63)와 ARC1905(분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일) PEG와 컨쥬게이트화된 ARC627)을 비교함으로써 테스트하였다. 각각의 압타머의 10 μM 스탁(stock)을 PBS + 1 mM MgCl2, 0.01 mg/mL BSA, 0.002 mg/mL tRNA 중에서 제조하였으며, 그리고 연속적으로 희석시켜 ＞100-배 범위의 압타머 농도를 커버하는 1O× 시료 시리즈를 얻었다. 각 시료의 12 μL 분취량을 이후 96-웰 플레이트에 첨가하고 96 μL 32P-방사능 표지화된 ARC186로 라벨 경쟁자와 콜드 경쟁자의 1.1 × 용액을 제조하였다. 90 μL의 라벨/경쟁자 용액을 이후 10 μL의 1O× C5 단백질에 첨가하여 반응을 개시시켰다. 각 반응 중에서 방사능 표지화된 ARC186의 최종 농도를 일정하게 유지시켰다. 결합 반응은 15 - 30 분 동안 37 ℃에서 평형을 이루었으며, 그리고 이후 전술한 니트로셀룰로스 여과 장비 상에서 여과시켰다. 데이타 분석의 목적을 위해, 콜드 경쟁자 압타머를 ARC186/C5 상호작용의 경쟁적 억제제로서 취급하였다; 경쟁자(억제 0% 대조군)가 없는 대조군 반응에 대해 데이타를 정규화시킴으로써 억제 %를 산출하였다. 억제 % 대비 [ARC672] 또는 [ARC1905]의 세미-로그 플롯으로부터 이하의 방정식에 데이타를 핏팅시킴으로써 IC50 값을 측정하였다: 억제 % = 폭 × [경쟁자]n /(IC50 n + [경쟁자]n).
도 60에 도시되어 있는 바와 같이, 분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일)PEG를 첨가하는 것은 경쟁적 결합에 의해 측정한 것으로서 압타머 친화성에 적게 영향을 미치거나 또는 영향을 미치지 않는다. 0.46 ± 0.149 nM 및 0.71 ± 0.130 nM의 KD 값은 도 60에서 IC50 대비 C5 데이타에 대한 라인 피트의 y-절편에 의해 ARC672 및 ARC1905 각각에 대해 추정하였다. 두 값은 37 ℃에서 ARC186에 대해 측정한 KD에 인접하였다.
ARC1905과 C5 사이의 상호작용의 온도 의존성은 또한 경쟁 분석법에 의해 추정하였다. ARC1905를 연속적으로 희석시켜 1O× 시료 시리즈를 전술한 바와 같이 제조하였다. 1 - 4 시간 동안 25 ℃ 또는 37 ℃에서 결합 반응이 평형을 이루었으며, 그리고 이후 니트로셀룰로스 필터 장치 상에서 여과시켰다. 경쟁자(억제 0% 대조군) 없이 또는 C5 단백질(억제 100% 대조군) 없이 반응을 조절하는 데이타를 정규화시킴으로써 억제 %를 산출하였다. 억제 % 대비 [ARC672] 또는 [ARC1905]의 세미-로그 플롯으로부터 이하의 방정식에 데이타를 핏팅시킴으로써 IC50 값을 산출하였다: 억제 % = 폭 × [경쟁자]n /(IC50 n + [경쟁자]n). 도 61에 도시되어 있는 바와 같이, ARC1905는 25 ℃ 및 37 ℃에서 높은 친화성으로 C5에 결합한다. IC50 대비 C5 데이타의 y-절편으로부터 0.15 ± 0.048 nM 및 0.69 ± 0.148 nM의 KD 값을 각각 25 ℃ 및 37 ℃에서 얻었다. 두 값은 전술한 ARC186/C5 상호작용에 대해 측정한 KD 값과 일치한다.
실시예 IB : 전혈 분석법.
보체 시스템의 대안적인 경로 상에서 항-C5 압타머의 효과를 이하의 전혈 분석법을 사용하여 분석하였다. 항응고제가 없는 경우, 정상 인간 자원자로부터 혈액을 얻었다. 혈액의 분취량(항-응고제가 없는 것)을 5 시간 동안 실온 또는 37 ℃에서 ARC186(서열 번호: 4)의 농도를 증가시키면서 항온처리시켰다. 시료를 원심분리시켜 혈청을 분리시키며 그리고 혈청 중 C5b의 존재를 sC5b-9 ELISA로 검출하였다(C5b-9 ELISA kit, Quidel, 캘리포니아주 샌 디에고 소재). 도 15에 도시되어 있는 바와 같이, C5b-9의 제조시 반영되는 것으로서, 상이한 온도에서 항온처리한 시료들 사이의 항-보체 활성은 3 μM에서 갈라진다. 실온 데이타는 정량적 억제에 필요한 압타머의 농도가 3-6 μM의 범위라는 것을 의미하며, C5의 보고된 농도는 대략 400 nM이다. 이들 결과는 C5 활성을 완전 억제시키는데 10-배 몰 이상의 과량의 항-C5 압타머(ARC186; 서열 번호: 4)가 필요할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 1C: 자이모산(Zymosan)에 의한 보체 활성화.
자이모산은 효모 세포벽의 폴리사카라이드 성분이며, 대체 보체 캐스케이드의 강력한 활성화제이다. 자이모산을 혈액, 혈장 또는 혈청의 생체외 시료에 첨가하면, C5a 및 가용성 버젼의 C5b-9(sC5b-9)를 포함하는 보체 활성화 생성물의 축적을 유발한다. 희석시키지 않은 인간 혈청(Center for Blood Research, 메사추세츠주 보소톤 소재), 시트레이트화 인간 전혈(Center for Blood Research, Boston, MA) 또는 시노몰거스 혈청(Charles River Labs, 메사추세츠주 윌밍톤 소재)의 시료를 ARC658(서열 번호: 62)의 농도, ARC186(서열 번호: 4)의 3OK PEG 유사체의 농도를 증가시키면서 스파이킹시켰다(spiked). 보체를 활성화시키기 위해, 10× 현탁액 중의 자이모산(Sigma, St. Louis, MO)을 시료에 첨가하여 최종 농도 5 mg/mL가 되게 하였다. 37 ℃에서 15 분 항온처리 이후, 원심분리시켜 자이모산 입자를 제거하였으며 그리고 보체 활성화의 정도를 C5a 및/또는 sC5b-9 ELISA로 측정하였다(C5b-9 ELISA kit, Quidel, 캘리포니아주 샌 디에고 소재; C5a ELISA kit, BD Biosciences, 캘리포니아주 샌 디에고 소재).
압타머가 없는 경우, 자이모산을 처리하면 처리하지 않은 시료에서의 ~1% 활성화에 비해 ~50%의 혈청 또는 전혈 C5를 활성화시킨다. 항-C5 압타머를 50 nM(혈중 C5 농도 ~10%)까지 증가시키면 sC5b-9 형성에 거의 효과를 미치지 않는다. 그렇지만, ARC658(서열 번호: 62)의 농도를 증가시켜 C5를 추가 적정하면 도 16에 도시된 바와 같이 투여량-의존적으로 C5 활성화를 억제하였다. 인간 혈청 또는 전혈에서, 0.8 - 1 μM ARC658(서열 번호: 62)에서 정량적(~99%) 억제를 관찰하였으며, 이는 압타머의 C5에 대한 ~2 몰당량과 일치한다. 시노몰거스 혈청에서 비교할만한 억제를 얻기 위해서는 더 높은 농도의 압타머가 필요하였다. 이 경우에, 단지 10 μM 압타머, 또는 ~20 몰당량의 압타머의 존재시 C5에 대해 억제 99%를 얻었다.
유사한 연구에서, ARC1905(ARC186의 분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일) PEG화 버젼)의 억제 효과는 자이모산을 사용하여 다음과 같이 대체 경로를 통해 보체를 활성화시켜 인간과 시노몰거스 멍키에서 테스트하였다. 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 자이모산 A는 Sigma-Aldrich, Inc.로부터 구입하였다(cat. no. Z4250-1G, St. Louis, MO). 자이모산 A는 분말로서 공급되었으며 그리고 그것을 둘베코(Dulbecco)의 PBS(Gibco, 캘리포니아주 칼스배드 소재, cat. no. 14190-144)에 재현탁시켜 50 mg/mL 현탁액을 얻었다. 동결시키고, 풀링시킨(pooled) 정상 인간 혈청(cat. no. IPLA-SER)을 Innovative Research(마이애미주 사우쓰필드 소재)로부터 구입하였다. 동결시키고, 풀링시킨 시노몰거스 마카크 혈청(cat. no. CYNSRM)을 Bioreclamation(뉴욕주 힉스빌 소재)로부터 구입하였다. 공급자로부터 제공받은 5 - 10 mL 혈청의 바이알을 37 ℃에서 해동시키고, 분취하고(~1 mL) 및 ~ 20℃에서 보관하였다. 37 ℃에서 항온처리에 의해 사용하기 바로 전에 필요한 만큼 분취량을 해동시켰으며 그리고 실험 동안 얼음 위에서 보관하였다. 혈청의 최종 농도는 각 분석법에서 ~100% 였다. 20 μM 스탁의 ARC1905를 0.9% 식염수 중에서 제조하고 연속적으로 희석시켜 압타머 농도의 ~90 배 범위를 커버하는 1O× 시료 시리즈를 제조하였다. 압타머가 없는(식염수만 있는) 시료를 또한 음성(억제 0%) 대조군으로서 포함시켰다.
90 μL의 혈청을 96-웰 PCR 플레이트(VWR, cat. no. 1442-9596)의 웰 안에 피펫팅하였다. 10 μL의 압타머 시료를 실온에서 혈청 내에서 직접 희석시키며 그리고 혼합하였다. 8 μL의 50 mg/mL 자이모산을 별도의 96-웰 PCR 플레이트의 웰 안에 피펫팅하였다. 두 플레이트를 동시에 37 ℃에서 15 분 동안 사전-항온처리시켰다. 사전-항온처리에 이어서 즉시, 80 μL의 혈청/압타머 혼합물을 직접 8 μL의 자이모산에 첨가하며 그리고 혼합하여, 5 mg/mL의 자이모산 최종 농도를 얻었다. 반응 플레이트를 밀봉시키며 그리고 15 분 동안 37 ℃에서 항온처리시켰다. 항온처리가 끝날 무렵, 8 μL 0.5M EDTA를 웰 안에 피펫팅 및 혼합함으로써 반응을 켄칭시켰다. 원심분리시킴으로써 자이모산을 펠렛화시키며(3700 rpm, 5 min, 실온) 그리고 ~80 uL 켄칭시킨 상청액을 새로운 96-웰 PCR 플레이트에 옮기고 밀봉시켰다. 상청액을 액체 질소 중에서 신선하게 냉동시키고 -20℃에서 보관하였다. 자이모산-비의존적 백그라운드 활성화를 조절하기 위해, 혈청 시료를 제조하였으며 그리고 자이모산 대신에 식염수 8 μL를 첨가하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 정확히 처리하였다.
각각의 자이모산-활성화 시료 중에서 생성된 C5a의 상대적인 수준으로부터 C5 활성화를, C5a ELISA(ALPCO Diagnostics, 뉴햄프셔주 윈드햄 소재, cat. no. EIA-3327)에 의해 C5a ELISA 키트 프로토콜에 따라 측정하였다. C5a ELISA 키트는 인간 특이적인 시약을 포함하며 그리고 혈장 또는 혈청 시료 중에서 인간 C5a(hC5a)의 분석에 맞추어 포맷시켰다. 따라서 시노몰거스 농도 표준을 사용하여 시노몰거스 멍키 C5a에 대한 ELISA의 반응을 규명하는 것이 필요하다. 한 세트의 표준을 제조하기 위해, 인간 또는 시노몰거스 멍키 혈청의 0.5 mL 분취량을 15 분 동안 37 ℃에서 5 mg/mL 자이모산과 함께 항온처리하였으며, 12.5 μL 0.5M EDTA로 켄칭시키며 그리고 원심분리시켜 자이모산을 제거하였다. 자이모산-활성화 인간 혈청 시료 중의 C5a의 농도는 키트와 함께 제공되는 hC5a 표준 혈장에 비교함으로써 대략 2 μg/mL hC5a으로 측정되었다. 시노몰거스 멍키 시료 중의 C5a의 농도는, 인간 C5a 균등물(hC5a eq)에서 발현된 것으로서, 대략 0.6 μg/mL hC5a eq으로 측정하였다. (ELISA를 방해하지 않는) 래트 혈청 안에서 희석시킴으로써 0.4 - 400 ng/mL hC5a 또는 0.12 - 120 ng/mL hC5a eq의 범위를 커버하는 일련의 표준을 제조하였다. ELISA 키트 프로토콜에 지시하고 있는 바와 같이 표준을 단백질-침전화 시약과 함께 전처리시켰으며 그리고 ELISA 플레이트에 추가 희석시키지 않고 적용시켰다. VersaMax UV/vis 흡광도 플레이트 측정기(absorbance plate reader, Molecular Dynamics, 캘리포니아주 서니베일 소재)를 사용하여 450 nm(A450)의 흡광도 최대값에서 ELISA 플레이트를 읽었다. A450은 낮은 C5a에서는 C5a 농도 0.1 이하 - 0.2에 따라 가변적이었으며, 높은 C5a에서는 ~3.5의 플래토(plateau) 상태였다. 분석 시료 중의 C5a를 정량화시키기 위한 목적을 위해, 정량의 최대와 최소 한계를 각각, 인간에 대해서 25 및 0.78 ng/mL hC5a, 및 시노몰거스 멍키에 대해 15 및 0.94 ng/mL hC5a eq로 제한하였다. A450 대비 ng/mL hC5a 또는 hC5a eq를 도 62에 도시된 바와 같이 플로팅하였으며, 그리고 이하의 방정식을 사용하여 4-파라미터 핏팅으로부터 표준 곡선을 얻었다: y =((A - D)/(1 +(x/C)B)) + D.
C5a 분석을 하기 바로 전에, 분석 시료(식염수만 있는 것과 자이모산이 없는 대조군 포함)를 ELISA 키트 프로토콜에서 지시하는 바와 같이 단백질-침전화 시약과 함께 전처리시키고, 이후 0.9% 식염수로 연속 희석시켰다. 희석시키지 않은 분석 시료(자이모산이 없는 대조군의 일부 포함) 중의 C5a 레벨은 통상 정량의 최대 한계(upper limit of quantitation, ULOQ)을 초과하였다. 따라서, 1/5, 1/50 및 1/250의 희석을 테스트하여 분석 시료 C5a 농도의 전범위를 수용시켰다. 적절한(인간 또는 시노몰거스 멍키) 표준 곡선과 비교함으로써 그리고 희석에 대해 보정하여 C5a 레벨을 정량화하였다. 각각의 압타머 농도에서의 억제 %는 이하의 방정식을 사용하여 산출하였다: 억제 % = 100 - 100 ×(C5a시료 - C5ano - 자이모산) /(C5a식염수 - C5ano - 자이모산). 억제 % 대비 [ARC1905]의 플롯으로부터 이하의 방정식을 사용하여 IC50 값을 산출하였다: 억제 % = (억제 %)최대 × [ARC1905]n /(IC50 n + [ARC1905]n) + 백그라운드. IC90 및 IC99 값은 IC50 값으로부터 이하의 방정식을 사용하여 산출하였다: IC90 = IC50 × [90/(100-9O]1/n 및 IC99 = IC50 × [99/(100-99]1/n.
C3 활성화(일반적인 보체 경로에서 C5의 바로 다음 업스트림에서의 단계)의 양은, C3a ELISA(Becton-Dickinson OptiEIA C3a ELISA kit, cat. no. 550499, 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)에 의해 C3a ELISA 키트 프로토콜에 따라 각각의 자이모산-활성화 시료에서 생성된 C3a의 상대적 레벨로부터 측정하였다.
C3a 분석을 하기 바로 전에, 시료(식염수만 있는 것과 자이모산이 없는 대조군 포함)를 0.9% 식염수로 병렬로 희석시켰다. C3a ELISA는 C5a에 대해서보다 더 민감하며; 따라서, 시료 C3a 농도의 전범위를 수용하는데 1/500, 1/5000 및 1/25,000의 희석이 필요하다. 인간 혈청으로부터 유래한 키트 표준을, C5a 분석용으로 준비한 일반 표준 대신에 사용하였다. C3a 레벨이 많이 변화하지 않기 때문에, 인간-특이적 표준은 그들의 상대적 레벨의 충분한 표식을 제공한다.
C5a 및 C3 ELISA 둘 다로부터 얻은 데이타는 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)을 사용하여 분석하였으며, 그리고 평균 억제 % 값을 칼레이다그래프(Kaleidagraph, v. 3.51, Synergy Software)를 사용하여 플로팅하였다. IC50, IC90 및 IC99 값은 엑셀에 플러그-인(plug-in)시킨 XLfit 4.1을 사용하여 산출하였다. 인간과 시노몰거스 멍키 보체 활성화에 대한 ARC1905의 비교 효과는, 이 접근에 의해 측정한 것으로서, 도 63 및 도 64에 요약하였다. 이들 도면으로부터 볼 수 있는 바와 같이, 대체 경로를 통한 C5 활성화의 완전 억제는 시험관내에서 인간과 시노몰거스 멍키 혈청 중 ARC1905로 얻을 수 있다. 인간 혈청에서, 희석시키지 않은 시료 중에서 C5 활성화를 90% 억제하는데 필요한 ARC1905의 농도는 442 ± 23 nM이며, 대략 C5의 평균 몰농도와 동일하다. 그렇지만, IC90 및 IC99 값에서 반영된 것과 같은 분석법 조건 하에서, ARC1905는 시노몰거스 멍키 보체 활성에 대해서는 4 - 6-배 덜 강하다.
ARC1905 C3 활성화의 효과는, C3a 레벨에 의해 측정한 것으로서, 도 65에 요약되어 있다. 보체 경로의 테일(tail) 말단을 특이적으로 표적으로 하기 위한 근본적 이유는 C3a 및 C3b 생성시에 축적되는 업스트림 팩터의 병원균-대항 기능을 위협하지 않으면서 C5a와 멤브레인 공격 복합체(MAC)의 사전-염증성 기능을 차단하기 위한 것이다. 도 65의 데이타는 ARC1905가, 2 μM 까지는 C3a 생성을 억제하지 않는다는 것을 보여주며 그리고 업스트림 보체 활성화가 ARC1905에 의해 나쁘게 영향받지 않는다는 것을 의미한다. 대체 경로 C5 활성화의 본질적으로 완전한 차단은 ARC1905를 사용하여 인간과 시노몰거스 멍키 혈청 시료 둘 다에서 얻어진다. ARC1905는, 이 분석법의 조건 하에서 인간 C5 활성화보다 시노몰거스 멍키 C5 활성화를 억제하는데 있어 대략 덜 강한 크기의 순이다. 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 보체 활성화에 대한 ARC1905의 억제 효과는 C5에 대해서만 특이적이며 그 이유는 C3의 활성화가 억제되지 않기 때문이다.
실시예 1D: 보체 활성화의 튜빙 루프 모델( Tubing loop model )
외래 물질에 대한 노출에 의해 유도되는 보체 활성화를 억제하는 항-C5 압타머의 능력을 테스트하기 위해, 심폐 우회 회로(cardiopulmonary bypass circuit)에서 발견되는 바와 같이, 본 발명자들은 Nilsson과 그의 동료들에 의해 기재된 튜빙 루프 모델을 사용하였다 (Gong et al,(1996) Journal of Clinical Immunology 16, 222-9; Nilsson et al,(1998) Blood 92, 1661-7). 타이곤(Tygon) S-50-HL 의료용/수술용 튜빙(1/4" 안쪽 직경)(United States Plastic Corp.(오하이오주 소재), cat. # 00542)을 대략 300 mm(대략 9 mL 부피)의 길이로 절단하며 그리고 0.4 유닛/mL 헤파린(Celsus) 및 다양한 농도의 ARC658(서열 번호: 62)(0 - 5 μM)을 함유하는 인간 도너의 혈액 5mL로 채웠다. 타이곤 튜브의 각각의 길이는, Gong et al에 기재한 바와 같이, 루프 내에서 비-수술용 실리콘(silicone) 링커 튜브(3/8" 안쪽 직경)(United States Plastic Corp., formulation R-3603, cat. # 00271)의 짧은 섹션(~50 mm)과 인접하고 있다. 튜빙 루프를 1 시간 동안 대략 30 rpm으로 37 ℃ 수조에서 회전시켰다. 루프 내용물을 이후 EDTA(10 mM 최종 농도)를 함유하는 폴리프로필렌 원추형 튜브에 쏟아부어 보체 활성화를 켄칭시켰다. 혈소판이 적은 혈장은 원심분리시켜 분리하였으며 그리고 ELISA에 의해 C5a 및 C3a를 분석하였다(C3a ELISA kit, Quidel, 캘리포니아주 샌 디에고 소재; C5a ELISA ldt, BD Biosciences, 캘리포니아주 샌 디에고 소재).
자이모산 분석에 비교하면 압타머 없이 전체 보체 활성화는 적었다. 통상적으로, 1 시간 항온처리 이후 C5a 레벨은 대략 6 ng/mL로 증가하였으며, 이는 가능한 C5의 ＜1%가 활성화되는 것과 대응하는 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 증가는 반복적이며 그리고 ARC658(서열 번호: 62)로 적정시킴으로써 억제된다. 도 17에 도시된 바와 같이, 300 - 400 nM ARC658(서열 번호: 62)은 C5 활성화를 99% 억제시키는데 충분하였으며, 이 레벨은 혈액 중 C5의 몰농도와 대략 동일하거나 또는 약간 적은 것이다. 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 자이모산 모델에서보다 이 모델에서 C5 활성화를 99% 억제시키는데 더 적은 압타머가 필요함에도 불구하고, 이 결과는 2개의 분석법에서 사용하는 보체-활성화 자극에서 실질적인 차이를 반영할 수 있다. 대조군으로서 C3a 생성을 또한 모니터링하여 ARC658(서열 번호: 62)이 보체 캐스케이드 중에서 C5보다 먼저 활성화 단계를 억제하지 않는다는 것을 증명하고자 하였다. 1 시간 항온처리에 이어 C3a 레벨은 대략 4000 ng/mL로 증가하였으며, 이는 가능한 C3 중 10% 부근이 활성화된 것에 대응한다. C5a 생성과는 대조적으로, ARC658(서열 번호: 62)로 적정시켜도 C3a 생성에 대한 투여량 의존적인 억제는 거의 관찰되지 않았으며 이는 ARC658(서열 번호: 62)이 특이적으로 C5 절단을 차단한다는 것을 설명한다.
항-C5 압타머 ARC1905(서열 번호: 67)로 튜빙 루프 모델 연구를 반복하였다. ARC1905를 0.9% 식염수로 병렬 희석시켜 압타머 농도의 100-배 범위를 커버하는 20× 시료 시리즈를 얻었다(분석법 중에서 최종 10 - 1000 nM). 부적절한 압타머(ARC127)를 포함하는 시료는 비특이적 올리고뉴클레오티드 효과에 대한 대조군으로서 포함시켰다. 압타머 없이(식염수 만으로) 또한 시료를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 내부 자원자로부터 표준 정맥절개술(phlebotomy) 방법에 의해 단일-도너 혈액 시료를 얻었다. 5명의 개별 도너로부터 전혈을 얻었으며 이것을 직접 60 mL 시린지(syringe)(Becton-Dickinson,(Franklin Lakes, NJ), cat. # 309653) 안에 얻으며 그리고 +/-압타머에서 비발리루딘(20 μM 최종) 안에서 즉시 분취하였다(Prospec-Tany Technogene Ltd.,(Israel), lot # 105BIV01). 항-응고제 비발리루딘은, 직접 트롬빈 억제제로서, 헤파린 대신에 사용하여 보체 활성화를 방해하는 것이다.
바로 앞서 기재한 바와 같이, 튜빙 루프 모델을 기본적으로 실시하였다. 도너로부터 혈액을 받은 이후 즉시 튜브의 ~300 mm 섹션(직경 1/4", 부피 ~9 mL)을 5 mL의 혈액/압타머/비발리루딘 시료로 채웠다. 이후 그 튜브를 실리콘 링커 튜브의 짧은 섹션(~50 mm)을 가지는 루프 안에서 안전하게 조여주었으며, ~4 mL 부피의 기체가 발생하였다. 37 ℃ 수조에서 1 시간 동안 항온처리시키는 동안 32 rpm으로 튜빙 루프를 수직으로 회전시켰다. 항온처리 이후, 모든 5 mL의 시료를 100 μL의 0.5M EDTA를 함유하는 15 mL 원추형 튜브로 이동시켜(Corning,(Corning, NY), cat. # 430766), 최종 EDTA 농도 10 mM을 얻었다. 4 ℃(3,300 rpm, 20 분)에서 원심분리(Eppendorf Centrifuge 5804) 이후 각각의 켄칭시킨 시료로부터 1 mL의 혈장 상청액을 수집하였다. 상청액을 액체 질소 중에서 급속(flash) 냉동시키며 그리고 -20 ℃에서 보관하였다. 백그라운드 활성화를 조절하기 위해, 100 μL 0.5M EDTA를 함유하는 얼음 상에서 15 mL 원추형 튜브에 직접 신선한 혈액 5 mL을 첨가함으로써 프리-CPB 시료를 제조하였다. 이 시료를 혈장에 대해 가공하고 전술한 바와 같이 보관하였다.
C5 활성화의 양은, 바로 앞서 기재한 바와 같이 C5a ELISA에 의해 측정한 것으로서, 각각의 활성화된 시료 중에 생성된 C5a의 상대적 레벨로부터 측정하였다. ELISA 키트 프로토콜에 따라 희석시키지 않은 혈장 시료 상에서 C5a ELISA를 실시하였으며 그리고 제조자에 의해 제공되는 C5a 표준과 비교함으로써 시료 C5a 레벨을 정량화하였다. 각각의 압타머 농도에서 C5a 생성의 억제 %는 이하의 방정식을 사용하여 산출하였다: 억제 % = 100 - 100 ×(C5a 시료 - C5a 프리 - CPB) /(C5a 식염수 단독 - C5a 프리 - CPB). 억제 % 대비 [ARC1905]의 플롯으로부터 이하의 방정식을 사용하여 IC50 값을 산출하였다: 억제 % =(억제 % )최대 × [ARC1905]n /(IC50 n + [ARC1905]n) + 백그라운드. IC90 및 IC99 값은 IC50 값으로부터 이하의 방정식을 사용하여 산출하였다: IC90 = IC50 × [90/(100-90]1/n 및 IC99 = IC50 × [99/(100-99]1/n.
C3 활성화의 양은, 바로 앞서 기재한 바와 같이 C3a ELISA에 의해 측정한 것으로서, 각각의 활성화된 시료 중에 생성된 C3a의 상대적 레벨로부터 측정하였다. C3a 분석하기 바로 전에, 시료(식염수만 있는 것과 프리-CPB 대조군 포함)을 0.9% 식염수로 병렬 희석시켰다. C3a ELISA는 C5a에 대해서 보다 더 민감하며; 따라서, 시료 C3a 농도의 범위를 수용하기 위해 1/5000 희석이 필요하다. 시료 C3a 레벨은 키트 표준과 비교함으로써 정량화하였으며, 그리고 억제 %는 C5a에 대해 기재한 바와 같이 산출하였다. 데이타는 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 분석하였으며, 그리고 평균 억제 % 값은 칼레이다그래프(v3.5 Synergy Software)를 사용하여 플로팅하였다. IC50, IC90 및 IC99 값은 엑셀에 플러그-인된 XLfit 4.1을 사용하여 산출하였다.
5명의 도너에서 ARC1905 및 부적절한 압타머 ARC127의 보체 활성화에 대한 평균 효과를 도 66에 요약하였다. 도 67에 도시된 바와 같이, C5 활성화의 완전 차단은, C5a의 생성을 반영하는 것으로서, ＜500 nM ARC1905에서 얻어지며, 부적절한 압타머는 1 μM 까지 억제 효과를 갖지 않았다. 평균 전혈 IC50, IC90 및 IC99 값은 각각 119 ± 28.6 nM, 268 ± 39.2 nM 및 694 ± 241 nM이었다(도 66). 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 전체 중 대략 45%를 포함하는 ARC1905를 세포 혈액 부피로부터 배제시키는 것으로 가정하는 것이 합리적이다. IC50, IC90 및 IC99 값은, 혈장 중 C5 억제를 반영하도록 조정된 것으로서, 따라서, 216 ± 52.0 nM, 487 ± 71 nM 및 1261 ± 438 nM이다. 이들 값은 혈장 중에 자이모산-유도 보체 활성화의 ARC1905 억제에 대해 계산한 파라미터들과 일치하였으며 이는 세포 혈액 성분이 ARC1905 항-C5 활성을 현저하게 방해하지 않는다는 것을 제안하는 것이다. C3a 생성은 ARC1905 또는 부적절한 압타머에 의해 1 μM 까지도 억제되지 않았다. 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 이는 ARC1905는 C3 컨버타제 반응을 억제하지도 않고, 또한 C3 침착과 컨버타제 어셈블리와 같은 대체 캐스케이드 활성화에 기여하는 다른 단계도 차단하지 않는다는 것을 제안한다.
실시예 2
새로운( De Novo ) 선택과 서열
dRmY 풀( pool )에 의한 C5 선택
dRmY 압타머를 인간 전장 C5 단백질에 대해 확인하기 위해 2가지 선택을 실시하였다. C5 단백질(Quidel Corporation, 캘리포니아주 샌 디에고 소재 또는 Advanced Research Technologies, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)은 전장(full length, "FL") 및 부분적으로 트립신화된 형태("TP")로 사용하였으며 그리고 2개의 선택은 소수성 플레이트 상에서 부동화시킨 단백질 표적에 대한 직접 선택이다. 양 선택으로, 전장 C5 결합에 대해 현저하게 영양을 받은 풀 대비 그대로의 선택되지 않은 풀을 얻었다. 본 실시예에서 모든 서열은 5'에서 3'으로 보여진다.
풀 제조: 서열에 의한 DNA 주형
Figure 112014008692587-pat00019
은 ABI EXPEDITETM DNA 합성기를 사용하여 합성하였으며, 그리고 표준 방법에 의해 탈보호시켰다. 주형은 5' 프라이머
Figure 112014008692587-pat00020
및 3' 프라이머
Figure 112014008692587-pat00021
로 증폭시켰으며 그리고 이후 Y639F 단일 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제로 시험관내 전사시키기 위한 주형으로서 사용하였다. 200 mM HEPES, 40 mM DTT, 2 mM 스퍼미딘, 0.01% Triton X-100, 10% PEG-8000, 9.5 mM MgCl2, 2.9 mM MnCl2, 2 mM NTP, 2 mM GMP, 2 mM 스퍼민, 0.01 유닛/μL 무기 파이로포스파타제, 및 Y639F 단일 돌연변이체 T7 폴리머라제를 사용하여 전사를 진행시켰다.
선택: 라운드 1에서, 니트로셀룰로스 필터 결합 칼럼 상에서 포지티브 선택 단계를 실시하였다. 간단하게는, 1 × 1015 분자(0.5 nmoles)의 풀 RNA를 3 uM 전장 C5 또는 2.6 uM 부분적으로 트립신화된 C5를 가지는 100 μL 결합 버퍼(1× DPBS) 중에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리시켰다. RNA:단백질 복합체 및 유리 RNA 분자를 0.45 um 니트로셀룰로스 스핀 칼럼을 사용하여 분리하였다(Schleicher & Schuell(뉴햄프셔주 킨 소재) 참조). 칼럼들은 1 mL 1× DPBS로 사전-세척하며, 그리고 이후 RNA:단백질 함유 용액을 칼럼에 첨가하였으며 그리고 원심분리기에서 1500 g에서 2 분 동안 스핀시켰다. 1 mL 씩 3회의 버퍼 세척을 실시하여 비특이적 결합체를 필터로부터 제거하였으며, 이후 필터에 부착된 RNA:단백질 복합체를 용출 버퍼(7 M 우레아, 100 mM 아세트산나트륨, 3 mM EDTA, 95 ℃로 사전에 가열시킨 것)의 200 μL 세척으로 2회 용출시켰다. 용출된 RNA를 침전시켰다(2 μL 글리코겐, 1 부피의 이소프로판올, 1/2 부피의 에탄올). PCR 증폭에 이어, ThermoScript RT-PCRTM 시스템(Invitrogen, 캘리포니아주 칼스베드 소재)으로 제조자의 지시에 따라 앞서 기재한 3' 프라이머 서열 번호: 72를 사용하여 RNA를 역전사시켰다(20 mM Tris pH 8.4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.5 uM 프라이머 서열 번호: 71 및 서열 번호: 72, 0.5 mM 각각의 dNTP, 0.05 유닛/μL Taq 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA)). PCR 주형은 Centricep 칼럼(Princeton Separations, 뉴저지주 ㅍ프린스톤 소재)을 사용하여 정제하였며 그리고 다음 라운드 풀을 전사시키는데 사용하였다.
이어지는 선택의 라운드에서, 결합된 RNA와 유리 RNA를 분리하는 것은 Nunc Maxisorp 소수성 플레이트 상에서 실시하였다(Nunc, 뉴욕주 로체스터 소재). 100 μL의 1× DPBS 중에서 20 pmoles의 전장 C5 및 부분적으로 트립신화된 C5 둘 다를 1 시간 동안 실온에서 플레이트의 표면에 대해 부동화시킴으로써 이 라운드를 개시하였다. 이후 상청액을 제거하였으며 그리고 웰을 120 μL 세척 버퍼(1× DPBS)로 4회 세척하였다. 단백질 웰을 이후 경쟁자로서 0.1 mg/mL 효모 tRNA 및 0.1 mg/mL 연어 정자 DNA를 함유하는 1× DPBS 버퍼로 차단시켰다. 사용한 풀 농도는 항상 단백질 농도의 4배 이상 과량이다. 풀 RNA는 또한 비어있는 웰에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리하여 임의의 플라스틱 결합 서열을 제거하였으며, 그리고 이후 단백질이 없는 차단된 웰에서 항온처리시켜 포지티브 선택 단계 이전에 풀로부터 임의의 경쟁자 결합 서열을 제거하였다. 이후 풀 RNA를 1 시간 동안 실온에서 항온처리시켰으며 그리고 부동화 C5에 결합한 RNA를, RT 혼합물(3' 프라이머, 서열 번호:72 및 Thermoscript RT, Invitrogen)을 첨가함으로써 선택 플레이트에서 직접 역전사시켰으며 이후 65 ℃에서 1 시간 동안 항온처리시켰다. 얻어진 cDNA를 PCR에 대한 주형으로 사용하였다(Taq 폴리머라제, New England Biolabs). 증폭시킨 풀 주형 DNA를 Centrisep 칼럼(Princeton Separations)으로 제조자의 추천 조건에 따라 염을 떼어냈으며 그리고 선택의 다음 라운드를 위해 풀 RNA의 전사 프로그램에 사용하였다. 전사시킨 풀을 매 라운드마다 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제하였다.
샌드위치 필터 결합(도트 블롯) 분석법을 사용하여 선택 진행을 모니터링하였다. 5'-32P-표지화된 풀 RNA(미량 농도)를 C5, 1× DPBS + 0.1 mg/mL tRNA 및 0.1 mg/mL 연어 정자 DNA와 함께, 30 분 동안 실온에서 항온처리시켰으며, 그리고 이후 도트 블롯 장치(Schleicher 및 Schuell) 중에서 니트로셀룰로스 및 나일론 필터 샌드위치에 적용하였다. 니트로셀룰로스에 결합한 풀 RNA의 백분율을 산출하였으며 그리고 단일 지점 스크린(+/- 300 nM C5)으로 대략 매 3 라운드를 모니터링하였다. 풀 Kd 측정은 전술한 바와 같이 단백질의 적정과 도트 블롯 장치를 사용하여 측정하였다.
선택 데이타 : 손대지 않은 풀에 대해 10 라운드 이후 두 선택을 강화시켰다. 도 18 참조. 라운드 10에서, 풀 Kd는 전장에 대해 대략 115 nM 및 트립신화된 선택에 대해 150 nM이지만, 결합량은 두 플래토에서 단지 약 10%였다. R10 풀은 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 클로닝시키며 그리고 시퀀싱하였다.
서열 정보: 각각의 풀로부터 45개의 클론을 시퀀싱하였다. R10 전장 풀은 하나의 단일 클론 ARC913(서열 번호: 75)이 우세하였으며 이는 풀의 24%로 이루어져 있으며, 2 세트의 2개복사(duplicate) 및 단일 서열은 나머지로 이루어져 있다. R10 트립신화 풀은 동일한 서열 ARC913(서열 번호: 75)의 8개의 카피를 포함하지만, 그 풀은 다른 서열(AMX221.A7; 46%)이 우세하였다. 클론 ARC913(서열 번호: 75)은 Kd 약 140 nM이며 그리고 결합량은 20 %였다. 도 19 참조.
표 5에 나열한 개별 서열은 5'으로부터 3' 방향으로 나열되었으며, 그리고 제공되는 dRmY SELEXTM 조건 하에서 선택되었던 압타머의 리보뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이것으로 유래한 본 발명의 구체예에서(그리고 서열 목록에서 반영된 것으로서) 푸린(A 및 G)은 데옥시이며 그리고 피리미딘(U 및 C)은 2'-0Me이다. 표 5에 나열한 서열은 캡핑(예컨대, 3'-역전 dT)을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 이하의 압타머의 고유한 서열은 뉴클레오티드 23에서 시작하며, 즉시 고정 서열
Figure 112014008692587-pat00022
이 이어지며, 그리고 그것이 3' 고정 핵산 서열
Figure 112014008692587-pat00023
을 만날때까지 진행한다.
표 5: C5 dRmY 압타머의 뉴클레오티드 서열
Figure 112014008692587-pat00024
용혈 분석법: 보체 시스템의 전형적인 경로에 대한 ARC913(서열 번호: 75)의 효과는 전술한 용혈 분석법을 사용하여 분석하였으며, ARC186(서열 번호: 4)(항-C5 압타머, 양성 대조군) 및 선택되지 않은 dRmY 풀(음성 대조군) 둘 다에 비교하였다. 용혈 억제의 분석법 중에서, 적정시킨 ARC913(서열 번호: 75)의 존재 하에 0.2% 인간 전혈장의 용액을 항체-코팅 양 적혈구(Diamedix EZ 보체 CH50 Test, Diamedix Corporation, 플로리다주 마이애미 소재)와 혼합시켰다. 칼슘, 마그네슘 및 1% 젤라틴(GVB 보체 버퍼)를 함유하는 베로날-완충 식염수 중에서 분석법을 진행하였으며 그리고 25 ℃에서 1 시간 동안 항온처리시켰다. 항온처리 이후 시료를 원심분리시켰다. 상청액의 415 nm에서의 광학 밀도(OD415)를 읽었다. 용혈 활성의 억제는 % 용혈 활성으로 대조군과 비교하여 표현하였다. 도 20 참조. 압타머의 IC50은 약 30 nM로 산출되었다.
실시예 3
조성물과 서열 최적화
실시예 3A: ARC913 의 최소화:
ARC913(서열 번호: 75)을 기초로 하는 6개의 구성을 전사시켰으며, 겔 정제하며, 그리고 C5에 대한 결합에 대해 도트 블롯으로 테스트하였다. ARC954는 Kd 130 nM인 모체 클론(parent clone)과 유사하며 그리고 결합량은 20%였으며, ARC874(서열 번호: 76)가 Kd 1 uM으로 C5에 결합하는 유일한 다른 클론이다.
표 6은 5'으로부터 3' 방향으로 나열되었으며, 그리고 제공되는 dRmY SELEX 조건 하에서 선택되었던 압타머로부터 유래한 것이다. 이 선택으로부터 유래한 본 발명의 구체예에서(그리고 서열 목록에서 반영된 것으로서) 푸린(A 및 G)은 데옥시이며 그리고 피리미딘(U 및 C)은 2'-0Me이다. 표 6에 나열한 각각의 서열은 캡핑(즉, 3'-역전 dT)을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
표 6. ARC913 최소화 클론의 뉴클레오티드 서열
Figure 112014008692587-pat00025
실시예 3B: ARC913 의 최적화: 도핑된 재선택
C5 결합 친화성에 대한 클론 ARC913(서열 번호: 75)을 최적화하기 위해 그리고 핵심 결합 성분을 결정하기 위해, 도핑된 재선택을 실시하였다. 도핑된 재선택은 활성 클론 또는 미니머(minimer) 안에서 서열 요구성을 추적하는데 사용한다. 단일 서열에 기초하여 디자인되었던 합성, 퇴화(degenerate) 풀로 선택을 실시하였다. 퇴화의 수준을 일반적으로 70% 내지 85% 천연형(wild type) 뉴클레오티드로 다양하다. 일반적으로, 중성(neutral) 돌연변이가 관찰되지만 일부 경우에 서열 변화가 친화성의 향상을 초래할 수 있다. 이후 복합 서열 정보는 최소 결합 모티프와 최적화 노력에 있어서의 목표를 확인하는데 사용할 수 있다.
풀 제조: 주형 서열
Figure 112014008692587-pat00026
는 ARC913(서열 번호: 75)에 기초한 것이며 그리고 15% 레벨로 도핑된 불규칙 영역으로부터 유래하는 각각의 잔기로 합성하였다, 예컨대 각각의 불규칙("N") 위치에서, 잔기는 천연형 서열에서 발견되는 뉴클레오티드의 85% 기회를 가지며
Figure 112014008692587-pat00027
및 나머지 3개 뉴클레오티드 중 하나에 대해서 15% 기회를 가진다.
도핑된 재선택에 대한 주형과 RNA 풀을 기본적으로 전술한 바와 같이 제조하였다. 프라이머
Figure 112014008692587-pat00028
로 주형을 증폭시켰다. 전장 C5로 두 선택을 하였으며, 하나의 선택은 세척 단계에서 염의 고농도를 사용한 것이다. 선택 프로토콜은 전술한 바와 같이 실시하였으며, 다만 2개의 예외를 가진다: 1) 라운드 1은 단지 포지티브 단계로 소수성 플레이트 상에서 실시하였다(뿐 아니라 모든 이어지는 라운드); 그리고 2) 선택 동안 전혀 경쟁자를 사용하지 않았다. C5 농도 및 RNA 풀 농도는 각각 200 nM 및 1 uM에서 일정하게 유지되었다.
도핑된 재선택 데이타 . 손대지 않은 풀에 대해 5 라운드 이후 정상 염 선택과 고농도 염선택을 강화하였다. 라운드 5에서 풀 Kd는 고농도 선택에 대해 대략 165 nM이며 그리고 정상 농도 선택에 대해 175 nM이었다. 결합량은 두 플래토에서 약 20%였다. TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 R4 풀을 클로닝시켰으며, 그리고 각각의 풀로부터 48개의 클론을 시퀀싱하였다. 각각의 풀로부터 12개의 클론을 전사시키며 그리고 500 nM C5에서 단일 지점 도트 블롯 분석법으로 분석하였다. 해리 상수(Kds)는 전술한 도트 블롯 분석법을 사용하여 다시 측정하였다. 단일 지점 스크린에서 확인한 11개의 베스트 클론에 대해 이하의 방정식에 데이타를 핏팅시킴으로써 Kds를 추정하였다: 분획 RNA 결합 = 폭×Kd/(Kd + [C5]). 3개의 최선의 Kds로 된 클론은 서열 번호: 91(73 nM), 서열 번호: 96(84 nM) 및 서열 번호: 95(92 nM)이다. 이들 11개의 클론의 서열은 이하의 표 7에 나열하였다.
표 7에 나열한 서열은 5'으로부터 3' 방향으로 나열되었으며, 그리고 제공되는 dRmY SELEX 조건 하에서 선택되었던 압타머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이 선택으로부터 유래한 본 발명의 구체예에서(그리고 서열 목록에서 반영된 것으로서) 대응하는 서열들은 문장에 나타낸 바와 같이 잔기들읜 dRmY 조합을 포함하며, 여기서 푸린(A 및 G)은 데옥시이며 그리고 피리미딘(U 및 C)은 2'-0Me이다. 표 7에 나열한 각각의 서열은 캡핑(즉, 3'-역전 dT)을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 이하의 압타머의 고유한 서열은 뉴클레오티드 23에서 시작하며, 즉시 5' 고정 서열
Figure 112014008692587-pat00029
이 이어지며, 그리고 그것이 3' 고정 핵산 서열
Figure 112014008692587-pat00030
을 만날때까지 진행한다.
표 7. 도핑된 재선택으로부터의 클론의 뉴클레오티드 서열
Figure 112014008692587-pat00031
실시예 3C: ARC186 의 40 kDa 분지형 PEG 변형
올리고뉴클레오티드 5' NH2-
Figure 112014008692587-pat00032
Figure 112014008692587-pat00033
을 신속(Expedite) DNA 합성기(ABI, 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 상에서 제조자의 추천 방법에 따라, 상업상 구입할 수 있는 표준 2'-OMe RNA 및 2'-F RNA 및 TBDMS-보호 RNA 포스포로아미다이트(Glen Research, 버지니아주 스털링 소재) 및 역전 데옥시티미딘 CPG 지지체(support)를 사용하여 합성하였다. 말단 아민 작용기는 5'-아미노-변형기, 6-(트리플루오로아세틸아미노)헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포로아미다이트, C6-TFA(Glen Research, 버지니아주 스털링 소재)과 인접시켰다. 탈보호 이후, 올리고뉴클레오티드를 수퍼 Q 5PW(30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서 이온 교환 크로마토그래피로 정제하였으며 그리고 에탄올 침전시켰다.
아민-변형 압타머를 합성 이후 상이한 PEG 부분와 컨쥬게이트화하였다. 압타머를 물/DMSO(1:1) 용액에 농도 1.5 내지 3 mM 사이가 되도록 용해시켰다. 탄산나트륨 버퍼, pH 8.5를 첨가하여 최종 농도 100 mM로 하였으며, 그리고 올리고를 밤새 동일한 부피의 아세토니트릴에 용해시킨 목적하는 PEG 시약(즉 ARC1905 40 kDa Sunbright GL2-400NP p-니트로페닐 카보네이트 에스테르 [NOF Corp, 일본], 또는 ARC187 40 kDa mPEG2-NHS 에스테르 [Nektar, 알바마주 헌트빌 소재])의 1.7몰 과량으로 반응시켰다. 얻어진 생성물을 수퍼 Q 5PW(30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서 이온교환 크로마토그래피로 정제하였며, 그리고 Amberchrom CG300-S 수지(Rohm 및 Haas) 상에서 실행시킨 역상 크로마토그래피를 사용하여 탈염화시켰으며, 그리고 동결건조시켰다. ARC187(서열 번호: 5)의 구조는 도 21에 도시하였으며 ARC1905(서열 번호: 67)의 구조는 도 22에 도시하였다.
실시예 4
단리되어 있는 관류된 심장 모델( Isolated Perfused Heart Model )
실시예 4A: ARC186 에 의한 원칙의 증명
인간 혈장 중 보체 성분 C5의 평균 농도는 대략 500 nM이다. Krebs Heinseleit 버퍼로 관류시킨 분리된 마우스 심장을 6% 인간 혈장에 대해 노출시키면, 인간 보체 캐스케이드가 활성화되며, C5가 C5a 및 C5b로 절단되는 것을 유도하게 된다. 성분 C5b는 이어서 보체 성분 C6, C7, C8 및 C9와 복합체를 형성하며, 또한 "멤브레인 공격 복합체"("MAC" 또는 C5b-9)로서 알려진 것으로서 이것은 심장 혈관을 손상시키며 그리고 심장 근육세포(myocytes)를 손상시키며, 따라서 심근 기능손상(말기 확장기 압력의 증가, 부정맥)과 부전수축(asystole)을 유발한다 (Evans et. al., Molecular Immunology, 32, 1183-1195(1995)). 사전에, 인간 C5 절단을 차단하는 단일 클론 및 단일 체인 항체(펙셀리주마브(Pexelizumab) 또는 펙셀리주마브의 단일 체인 scFv 버젼)를 이 모델에 대해 테스트하였으며 그리고 심근손상과 기능이상을 억제하는 것을 보여주었다(Evans et al, 1995).
이 모델은 C5-차단 압타머 ARC186(서열 번호: 4)이, 펙셀리주마브와 유사하게, 단리되어 있는 관류된 마우스 심장에 대해 인간 C5-매개 보체 손상을 억제한다는 것을 확인하는데 사용하였다. C57 B1/6 마우스는 Charles River Laboratories,(메사추세츠주 윌밍톤 소재)로부터 구입하였다. 간단하게는, 심마취(deep anesthesia)를 유도시킨 이후, 심장을 Krebs Heinseleit 버퍼로 계속하여 관류시키면서, 각각의 마우스 심장을 제거하였으며 그리고 대정맥 안에 삽입했던 끝이 뭉툭한 니들 상에 장착시켰다. 압력 생성기(transducer)(Mouse Specifics, 메사추세츠주 보스톤 소재)를 좌심실 안에 삽입하여 심박수와 심실내 압력을 계속해서 측정하였다. 베이스라인 측정을 하는 동안 15-분 기간의 평형 이후, 이어서 심장을 버퍼 및 6% 인간 혈장 +/- 다양한 농도의 압타머로 관류시켰다(도 23 참조). 이 연구 동안 그리고 Evans et al.에 기재한 바와 같이, 본 발명자들은, Krebs Heinseleit 버퍼 + 6% 인간 혈장으로 주관류시킨 심장이 재관류물(perfusate)에 혈장을 첨가한지 5 분 이내에 정지를 경험하였으며, 반면에 지속적으로 버퍼 만으로 관류시킨 심장이 2 시간 이상 지속해서 박동한다는 것을 입증하였다. 따라서, 각 실험의 길이는 마음대로 15 분으로 한정하였다. ARC186으로 한 이 연구의 개요를 도 23에 도시하였다.
심실내 압력을 모니터링하였으며 그리고 계속해서 기록하여 압력 웨이브 기록(tracing)을 얻었다(도 24 및 25). 최저 편향(deflection) 지점은 말기 확장기압("EDP")을 나타내며 그리고 최고 편향 지점은 수축기압("SP")을 나타낸다. 베이스라인 압력 곡선은 각각의 추적 상에서 보여지는 "0"으로 마킹된 수직 흑선의 왼쪽에 나타난다. 이미 공개된 바와 같이(Evans et al, 1995), 6% 인간 혈장으로 관류시킨 심장은 좌심실의 말기 확장기 압력을 급격히 증가시켰으며, 궁극적으로 5 분 내에 부전수축(심장 정지)으로 끝이난다(도 24). 부적절한 압타머를 인간 혈장에 50-배 몰 과량으로 첨가하는 경우, EDP가 증가하였으며 그리고 부전수축이 또한 관찰되었다(도 24).
ARC186의 몰당량으로 시스템에 첨가하는 경우, 또한 EDP가 급격하게 증가하였으며, 부전수축으로 끝이났다(도 25). 보체-매개 손상을 경험한 3가지 심장 군 모두가, EDP와 부전수축이 증가하였으며, 그 심장은 눈으로 보기에 부종성이었으며 그리고 실험이 끝날 무렵에는 부어올랐다. ARC186을 10-배 또는 50-배(도 25) 몰 과량으로 첨가한 경우, 심실내 압력 곡선이 정상을 유지하였으며 그리고 부전수축이 관찰되지 않았다. 추가로, 상기 부종과 부어오른 것(turgidity)이 이들 군에서는 나타나지 않았다.
각각의 실험 동안, 심박수를 5 분 간격으로 기록하였으며, 그리고 각각의 간격 동안 군 별로 평균 심박수를 그래프화하였다. 도 26에 도시된 바와 같이 압타머 부재 하에 관류시키거나 또는 부적절한 압타머 존재 하에 관류시킨 심장은 빠르게 일반적으로 5 분 이내에 부전수축이 나타났다. 시스템에 몰 당량으로 ARC186을 첨가하면 부전수축의 개시가 약간 지연되었다. 그렇지만, 이 군에서의 심장은 궁극적으로 멈추었다. 혈장에 10-배 또는 50-배 몰 과량으로 ARC186을 첨가하면 각 실험 동안 심박수가 보존되었다.
베이스라인에 대한 심장 중량의 증가 %는 멈춘 심장의 대표적 시료에 대해 산출하였으며(압타머가 없거나 또는 부적절한 압타머 50-배 몰 과량) 및 ARC186-보호된 심장과 비교하였다(10-배 및 50-배 몰 과량의 ARC186). 도 27에 도시된 바와 같이, ARC186 보호된 심장은 대조군에서 멈춘 심장보다 현저하게 낮은 중량을 얻었다.
ARC186이 C5 절단을 억제하지만 C3 절단을 억제하지 않으므로, C5 절단 생성물(C5a 또는 C5b)이 아닌 C3 절단 생성물(C3a)이 ARC186으로 보호된 분리 심장으로부터의 유동 유출물(effluent)에서 발견된다. ARC186이 인간 혈장 C5의 절단을 억제한다는 것을 직접적으로 보여주기 위해, 인간 보체 단백질 C5a 및 C5b(C5 절단 생성물) 및 C3a(C3 절단 생성물)의 상대적 양을 상업적으로 구입할 수 있는 ELISA 키트(C5b-9 ELISA 키트, Quidel, 캘리포니아주 샌 디에고 소재; C5a 및 C3a ELISA 키트, BD Biosciences, San Diego, CA)로 다양한 군으로부터 버퍼 유출물 중에서 측정하였다. ARC186은 투여량-의존적인 방식으로 인간 혈장 C5 절단을 억제하며 그리고 C5a(도 28)와 C5b-9(도 29)의 생성을 억제한다. 이와는 달리, ARC186은 인간 C3가 C3a와 C3b로 절단되는 것에 대해서는 효과가 없었으며(도 30) 이것은 추가로 분자의 C5 특이성을 설명해준다.
일단 생성되면, 보체 C3b 및 C5b 단편은 보체 활성화의 위치 근처에 있는 조직 상에 국소적으로 침착된다. 실험 완료에 이어서, 마우스의 심장을 OCT 배지(Sakura Finetelc, 캘리포니아주 토르랜스 소재)에서 냉동시키고, 섹션을 나누며(sectioned) 그리고 이후 표준 인간 C3b(클론 H11, Chemicon, Temecula, CA), 인간 C5b-9(클론 aE11, DAKO, 캘리포니아주 카핀테리아 소재) 또는 대조군 마우스 IgG(Vector Laboratories, 캘리포니아주 버린게임 소재)의 존재에 대해 표준 면역조직화학(immunohistochemistry)을 사용하여 염색시켰다. 연구 결과를 도 31에 도시하였다.
이 연구에서 기재하고 있는 바와 같이, C5-차단 압타머 ARC186은 보체 성분 C5-매개 조직 손상의 생체외 모델에서 테스트하였으며 여기서는 Krebs Heinseleit 버퍼와 6% 헤파린화 인간 혈장으로 관류시킨 단리된 마우스의 심장을 사용하며, 이는 항-C5 항체, 펙셀루지마브의 보체 시스템에 대한 효과를 테스트했던 사전에 공개된 연구에 기재된 모델에 기초한 것이다(Evans, Molecular Immunol 32:1183,(1995). 이 모델을 사용하면, C5 - 차단 압타머가(a) 인간 혈장 C5(C3는 아님)의 절단을 억제하며,(b) 인간 C5b(C3b는 아님)의 마우스 심장 조직에 대한 침착을 억제하며 그리고(c) 임상적으로 적절한 농도에서 인간 C5b-9 매개 심근 기능이상을 억제한다(5 μM, 10-배 몰 과량의 압타머 vs. C5)는 것을 보여준다. 이들 데이타는 인간 보체 캐스케이드가 생리학적으로 적절한 방식으로 활성화되는 경우, C5 - 차단 압타머가 혈장 C5의 절단을 억제할 수 있으며 그리고 심근 손상과 기능이상을 예방할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4B: PEG 화 압타머의 효력
상기 실시예 4A에 기재한 것과 정확히 동일한 물질과 방법을 이 연구에서 사용하였다. 실험 디자인과 결과는 도 32에 도시하였다. 실험의 첫번째 반은 보체의 공급원으로서 인간 헤파린화 혈장(Center for Blood Research, Harvard Medical School, 메사추세츠주 보스톤 소재)을 사용하였으며 그리고 두번째 반은 보체의 공급원으로서 헤파린화 시노몰거스 마카크 혈장을 사용하였다(Charles River Laboratories, 메사추세츠주 윌밍톤 소재). PEG화 압타머(ARC658; 서열 번호: 62)를 몰비를 증가시키면서 시스템에 첨가하였다. 모두 적절한 심실내 압력 추적을 수집하였지만, 표에서는 말기 확장기 압력(EDP)의 증가가 나타나거나 또는 나타나지 않는 것과, 부전수축이 발생하거나 또는 발생하지 않는 것 및 심장이 멈출 때까지의 시간을 나열하였다(EDP의 상승 및 부전수축의 존재로서 정의한다).
인간 혈장으로 실험하는 동안, AR658(서열 번호: 62)의 최적 투여량은 몰당량으로 결정하였으며(500 nM), 비-인간 영장류 혈장으로 실험하는 동안에는, 50-배 몰 과량(25 μM)이 C5b-매개 손상으로부터 심장을 보호하는데 필요하였다(도 32 참조).
이들 데이타는 항-C5 압타머의 친화성에 있어서 시험관내 데이타에 의해 지시되는 인간 v. 비-인간 영장류 C5에 대한 차이와 일치하였다. 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 실시예 5에서 기재하고 있는 본 발명자들의 이어지는 시노몰거스 마카크 PK/PD 연구 동안, 본 발명자들은 추가로 30-배 몰 과량의 압타머가 자이모산-매개 혈장 C5 절단을 억제하는데 필수적이라는 것을 보였으며, 이는 압타머가 인간 C5 보다는 영장류 C5에 더 낮은 친화성으로 결합한다는 개념을 추가로 지지하는 것이다.
총괄하여, 이들 연구는 C5-차단 압타머 ARC186(서열 번호: 4)과 더 많은 양의 ARC658(서열 번호: 62) 둘 다가 단리되어 있는 관류된 마우스 심장 모델에 효과적이라는 것을 의미한다. 이 모델은 또한 현저하게 더 많은 ARC658(서열 번호: 62)이 인간 C5-매개 심장 손상(몰 당량)에 비해 시노몰거스 마카크 혈장 C5-매개 심장 손상(30+ 몰 과량)을 억제하는데 사용되었다는 것을 보여주며, 이는 압타머가 영장류 C5에 대해 더 낮은 친화성을 가진다는 것을 의미하는 시험관내 데이타를 추가로 지지하는 것이다. 최종적으로, 이들 데이타는 시노몰거스 마카크의 경우 PK/PD 연구 동안 생체내 C5 차단을 보여주기 위하여 30-배 몰 과량 이하로 투여받아야 한다는 것을 의미한다.
실시예 5
동물에서 항- C5 압타머의 약물 대사 & 약동학
실시예 5A-5G에서, 모든 중량에 기초한 농도 데이타는, PEG 컨쥬게이션에 부여되는 질량에 무관하게 압타머의 올리고뉴클레오티드 부분의 분자량 만을 의미한다.
실시예 5A: 영장류와 래트 혈장에서 C5 억제제 ARC186 의 대사 안정성
압타머(즉, ARC186; 서열 번호: 4)의 비-PEG화 올리고뉴클레오티드 전구체를 그것의 안정성, 속도 역학 및 분해 경로를 평가하기 위해 래트와 시노몰거스 마카크 혈장(Charles River Labs, 메사추세츠주 윌밍톤 소재)에서 테스트하였다. 50 시간의 과정에 걸쳐 95% 풀링시킨 혈장(시트레이트화) 중에서 37 ℃에서 항온처리시킨 5' 말단-방사능 표지화된(32P) 압타머를 사용하여 테스트를 실시하였다. 선택한 시간 지점에서, 압타머-합유 혈장의 분취량을 빼내고, 액체 질소에서 즉시 급속 냉동시켰으며, 그리고 -80 ℃에서 보관하였다. 액체-액체(페놀-클로로포름) 추출 이어서 겔 전기영동(10% 변성 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔) 및 고-분할 자동방사선사진법(autoradiography)을 사용하여, 혈장 중 압타머와 그것의 대사물을 검출하고 분석을 실시하였다.
도 33은 래트와 시노몰거스 마카크 혈장 중에서 전장 압타머의 잔류 %를 항온처리 시간의 함수로서의 로그-선형 플롯을 도시한 것이다. 두 종에서의 분해 프로파일은 본질적으로 단일상(monophasic)인 것으로 나타나며, 속도 상수는 대략 k ~ 0.002 hr-1이다.
실시예 5B: 정맥내 투여 이후 래트에서 ARC657 , ARC658 및 ARC187 의 약동학
영장류와 인간에서 ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 및 ARC187(서열 번호: 5)의 약물동력학 프로파일을 관찰하기 위해, 그리고 필요한 투여량 및 빈도를 추정하기 위해, 카테터를 삽입시킨(catheterized) Sprague-Dawley 래트(Charles River Labs, 메사추세츠주 윌밍톤 소재)에서 약물동력학 연구를 실시하였다. 압타머는 표준 식염수 중에서 10 mg/mL(올리고 중량)로 관류되도록 제제화하였으며 그리고 무균 조건 하에서 미리-살균 처리된 투약 바이알 안에서 살균-여과시켰다(0.2 μM). 래트 연구에 대해 사용하는 투여의 경로는 투여량 10 mg/kg에서 꼬리 정맥을 통한 정맥내 볼러스(bolus)이다. 연구 아암(arms)은 군 당 3마리의 동물로 구성되며, 이것으로부터 나란히 얻은 혈액을 사전-투여(pre-dose)로 지정하며 그리고 48 시간의 과정에 걸쳐 시간 지점을 지정하였다. 연구 디자인을 도 34에 개략화하였다. 혈액 시료는 수술로 이식시킨 경정맥 카테터로부터 얻었으며, 직접 EDTA-코팅 튜브에 옮기고, 반전시키면서 혼합하며, 그리고 혈장에 대해 가공될 때까지 얼음 위에 위치시켰다.
혈액-EDTA 튜브를 5000 rpm에서 5 분 동안 원심분리시킴으로써 혈장을 수집하며 그리고 상청액(혈장)을 사전에 표지화된 신선한 튜브로 이동시켰다. 혈장 시료는 -80 ℃에서 분석 시간까지 보관하였다. ARC187에 대한 혈장 시료의 분석은 상업상 구입할 수 있는 형광 핵산 검출 시약 올리그린(OligreenTM)(Molecular Probes, 오리건주 유진 소재)을 함유하는 분석 웰에 혈장 분취량을 직접 첨가하는 동종(homogeneous) 분석법 포맷을 사용하여 실시하였다. 실온에서 짧게(5 분) 항온처리시킨 이후, 빛으로부터 보호시켰으며, 분석 플레이트를 혈광 플레이트 판독기로 읽었다(SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일 소재). 각각의 웰로부터의 형광 신호는 웰 중 압타머의 농도에 비례하였으며, 그리고 시료 농도는 형광-농도 표준 곡선으로부터 형광값을 내삽(interpolation)함으로써 산출하였다(이중 또는 삼중 곡선으로부터의 평균값). 각각의 군 중 3마리의 동물로부터 각각의 시간 지점에서 평균 혈장 농도를 얻었다. 혈장 농도 대비 시간 데이타는 산업 표준 약물동력학적 모델링 소프트웨어 WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 비-컴파트먼트 분석(noncompartmental analysis, NCA)하였다. 이하의 기본적인 약물동력학 파라미터에 대해 추정값들을 얻었다: 최대 혈장 농도, Cmax; 농도-시간 곡선 하 면적, AUC; 말단 반감기, t1 /2; 말단 클리어런스, Cl; 및 정상 상태(steady state)에서의 분포 부피, Vss.
평균 혈장 농도 대비 시간 데이타를 도 35에 도시하였으며 그리고 도 36에 플로팅하였다. 농도 대비 시간 데이타는 WinNonLinTM v.4.0을 사용하여 비-컴파트먼트 분석(NCA)하였다. 이 분석으로 도 37에 도시한 수치들을 얻었다.
예상한 바와 같이, 40 kDa 압타머 ARC187(서열 번호: 5)이 가장 긴 반감기를 가졌으며 그리고 20 kDa 압타머, ARC657(서열 번호: 61)이 가장 짧았다. 알고 있는 혈장 부피(~40 mL/kg)에 대해 상대적인 관찰된 Vss는 ARC187(서열 번호: 5)이 혈관밖 공간에서 단백질 및/또는 조직 매트릭스에 대한 결합/격절(sequestration)의 정도가 적절하다는 것을 제안한다. 압타머의 5-배 몰 과량을 유지하기 위한 필요를 가정하면, 이 연구의 결과는 목적하는 혈장 레벨을 유지하는데 필요한 압타머의 투여 빈도 및 전체 양의 측면에서 ARC187(서열 번호: 5) 이 현저한 장점을 제공한다는 것을 제안한다.
유사한 조성물 중의 압타머를 가지고 로덴트와 영장류에서의 사전 연구에서는(데이타는 보이지 않음), 30 mg/kg 이하의 투여량에서 투여량 비례성/선형성을 가졌으며, 따라서 이 투여량 수치가 비선형 약물동력학 경향을 유도한다는 것을 예기하지는 않는다.
실시예 5C: 정맥내 투여 이후 마우스에서의 ARC187 과 ARC1905 의 약물동력학
40 kDa 분지형 PEG에 컨쥬게이트화된 ARC186(서열 번호: 4) 올리고뉴클레오티드 백본의 약물동력학 프로파일을 ARC187(서열 번호: 5)에 대해 관찰하기 위해, 암컷 CD-1 마우스(Charles River Labs, 메사추세츠주 윌밍톤 소재)에서 약물동력학 연구를 실시하였다. 압타머는 주사용으로 표준 식염수 중에서 2.5 mg/mL(올리고 중량)으로 제제화하였으며 그리고 무균 조건 하에서 사전에 살균시킨 투약 바이알 안에서 살균-여과시켰다(0.2 μM). 마우스 연구에 대해 사용하는 투여의 경로는 투여량 10 mg/kg에서 꼬리 정맥을 통한 정맥내 볼러스이다. 연구 아암은 군 당 3마리의 동물로 구성되며, 이것으로부터 나란히 얻은 혈액을 사전-투여(즉, 투여하지 않은 대조군)로 지정하며 그리고 72 시간의 과정에 걸쳐 시간 지점을 지정하였다. 연구 디자인을 도 38a에 개략화하였다.
말단 심장 천공에 의해 혈액 시료를 얻었으며, 직접 EDTA-코팅 튜브에 옮겼으며, 역전시켜 혼합하며, 그리고 혈장에 대해 가공될 때까지 얼음 위에 위치시켰다. 반전시키면서 혼합하며, 그리고 혈장에 대해 가공될 때까지 얼음 위에 위치시켰다. 혈액-EDTA 튜브를 5000 rpm에서 5 분 동안 원심분리시킴으로써 혈장을 수집하며 그리고 상청액(혈장)을 사전에 표지화된 신선한 튜브로 이동시켰다. 혈장 시료는 -80 ℃에서 분석 시간까지 보관하였다. ARC187과 1905에 대한 혈장 시료의 분석은 상업상 구입할 수 있는 형광 핵산 검출 시약 올리그린(OligreenTM)(Molecular Probes, 오리건주 유진 소재)을 함유하는 분석 웰에 혈장 분취량을 직접 첨가하는 동종(homogeneous) 분석법 포맷을 사용하여 실시하였다. 실온에서 짧게(5 분) 항온처리시킨 이후, 빛으로부터 보호시켰으며, 분석 플레이트를 혈광 플레이트 판독기로 읽었다(SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일 소재). 각각의 웰로부터의 형광 신호는 웰 중 압타머의 농도에 비례하였으며, 그리고 시료 농도는 형광-농도 표준 곡선으로부터 형광값을 내삽함으로써 산출하였다(이중 또는 삼중 곡선으로부터의 평균값). 각각의 군 중 3마리의 동물로부터 각각의 시간 지점에서 평균 혈장 농도를 얻었다. 혈장 농도 대비 시간 데이타는 산업 표준 약물동력학적 모델링 소프트웨어 WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 비-컴파트먼트 분석(NCA)하였다. 이하의 기본적인 약물동력학 파라미터에 대해 추정값들을 얻었다: 최대 혈장 농도, Cmax; 농도-시간 곡선 하 면적, AUC; 말단 반감기, t1 /2; 말단 클리어런스, Cl; 및 정상 상태에서의 분포 부피, Vss. 평균 혈장 농도 대비 시간 데이타를 도 38b에 플로팅하였다.
농도 대비 시간 데이타는 WinNonLinTM v.4.0을 사용하여 비-컴파트먼트 분석(NCA)하였다. 이 분석으로 도 38c에 도시한 수치들을 얻었다. 예상한 바와 같이, 두 벤더(vendor)로부터의 40 kDa PEG는 마우스에서 약물동력학적 동등성을 보여주었다.
방금 전에 기재한 올리그린 분석에 대해 사용한 ARC187과 1905에 대한 동일한 혈장 시료를 UV 검출기가 달린 인증된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 분석하였다.
ARC187과 ARC1905에 대한 평균 혈장 농도 값은 마이크로소프트 엑셀 2003을 사용하여 산출하였다. 혈장 농도 값이 투여-이전(시간 0)에서 생물분석학적 분석의 LLOQ 이하인 경우, 0(zero) 값으로 지정하였다. 투여 이후 시료로부터 LLOQ 이하의 값은 평균 혈장 농도 산출시 무시하였다. 모델-독립적인 PK 분석에 사용한 평균 혈장 농도는 WinNonlin, 버젼 5.1(Pharsight Corporation, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하였다. 혈장 농도-시간 곡선 하 면적(AUC0 - last)은 선형 사다리꼴 규칙(trapezoidal rule)을 사용하여 추정하였다. 계산시, 분석의 LLOQ 이하의 임의의 값은, 투여-이전 시료를 제외하고는, PK 파라미터 추정을 위한 계산으로부터 배제시켰다. 겉보기 말단 반감기는 이하의 방정식을 사용하여 계산하였으며 t1/2 = 0.693/λz 여기서 λz는 농도 대비 시간 곡선의 말단 기울기의 회귀(regression)로부터 추정한 제거 속도 상수이다. 말단 페이즈 상에서 피크 농도 이후 3개 이상의 혈장 농도 값을 사용하여 λz를 결정하였으며 그리고 결정 계수(coefficient of determination, r2)는 ＞ 0.85이 필요하였다.
전체적으로, 방근 전에 기재한 올리그린 분석이 ARC1905와 ARC187이 평균 Cmax, AUC0 - last 및 AUC0 -∞ 파라미터 추정의 비교에 기초하여 생물학적으로 동등한 것으로 밝혀진다는 것을 보여준다는 사실을 HPLC 분석이 확인시켜준다. ARC187에 상대적으로 ARC1905에 대한 AUC0 - last와 AUC0 -∞ 값의 차이는(HPLC로 측정한 것으로서) 생물학적 동등성 수용 기준 ± 20% 내에서 우수하다.
실시예 5D: 정맥내 볼러스 투여 이후 마우스에서 C5 억제제 ARC657 , ARC658 및 ARC187 의 조직 회수( uptake ) 연구
암컷 CD-1 마우스는 Charles River Labs(Wilmington, MA)으로부터 얻었다. ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 및 ARC187(서열 번호: 5)의 주사용 제제는 식염수 중에서 5 mg/ml이다. 투여 제제는 무균 조건 하에서 미리 살균시킨 투약 바이알 안에서 살균-여과시키고(0.2 μM) 및 동물들에게는 투여량 25 mg/kg으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 볼러스로 공급하였다. 이 연구는 각각의 4개의 시간-지점, t = 투여-이전, 3, 6, 12 시간에 대해 3마리의 동물 군으로 구성하였다. 방혈(exsanguination) 이후, 각 동물의 맥관(vasculature)을 식염수로 광범위하게 플러싱시켜(V~30 mL) 맥관에 남은 임의의 혈액을 제거하였다. 조직들(심장, 간, 신장)을 수집하고, 칭량하고, 이후 50% w/v 표준 식염수로 균질화시키며, 그리고 -80 ℃에서 분석 시간까지 보관하였다.
하이브리드화(hybridization)에 기초한 ELISA-유형 분석을 사용하여 ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62), 및 ARC187(서열 번호: 5)에 대한 조직 분석을 실시하였다. 이 분석에서, 바이오틴화 포획 프로브는 결합 용액 농도 125 nM에서 3 시간 동안 96-웰 마이크로플레이트 중의 웰에서 사전-부동화시켰다. 그 플레이트를 1× PBS로 5회 세척하였다. 이후 그 플레이트를 150 μL/웰의 TBS 중 1× 수퍼블록(SuperBlock)(Pierce Chemical, 일리노이주 록포드 소재)으로 차단시켰다. 플레이트를 다시 세척하고, 회수하며, 그리고 사용하기까지 4 ℃에서 보관하였다. 별개의 튜브에, 시료(들)을 FAM-표지화된(5'-플루오레세인) 시료-검출 프로브를 포함하는 버퍼 중에서 200 nM로 90 ℃에서 10 분 동안 어닐링시키고(annealed), 이후 얼음 위에서 켄칭시켰다. 혈장/조직의 농도 표준과 대조군 시료를 또한 시료-검출 프로브 용액으로 사전-어닐링시키며 그리고 이후 부동화 포획 프로브를 함유하는 분석 플레이트 웰 안으로 피펫팅하며, 그리고 45 ℃에서 2.5 hrs 동안 어닐링시켰다. 이후 플레이트를 다시 세척하며, 그리고 1× PBS 중에서 양고추냉이(horse radish) 퍼옥시다제(anti-FITC MAb-HRP, Molecular Probes, 오리건주 유진 소재)에 컨쥬게이트화된 1 μg/mL의 항-플루오레세인 단일 클론 항체를 함유하는 1× PBS를 포함하는 용액을 100 μL/웰로 채우며, 그리고 대략 1 시간 동안 항온처리시켰다. 플레이트를 전술한 바와 같이 다시 세척하였다. 분석 플레이트에 이후 불소 생성의 HRP 기질(QuantaBlu, Pierce Chemical, 일리노이주 록포드 소재)을 함유하는 용액 100 μL을 채우며, 그리고 빛으로부터 보호시키면서 20-30 분 동안 항온처리시켰다. 45 분 항온처리 이후, 100 μL/웰의 정지 용액을 첨가하여 형광=-침전-생성 반응을 켄칭시켰다. 형광 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, 캘리포니아주 서니베일 소재) 상에서 즉시 플레이트의 325 nm에서의 형광 여기(excitation) 및 420 nm에서 검출된 방사(emission)를 읽었다. 각각의 웰은 10 회 판독하였다. 3개의 시간 지점에서 3개의 압타머 모두를 심장 조직에서 검출할 수 있었다(도 39).
실시예 5E: 정맥내 투여 연구 1 이후 시노몰거스 마카크에서 C5 억제제 ARC657, ARC658 및 ARC187의 약동학과 약물역학
ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 및 ARC187(서열 번호: 5)의 주사용 제제는 표준 식염수 중에서 10 mg/mL이며 그리고 무균 조건 하에서 사전-살균시킨 투약 바이알 안에서 투약 제제를 살균-여과시켰다(0.2 μM). 마카크 연구에 사용한 투여 경로는 수술로 삽입시킨 대퇴부 정맥 카테터를 통해 30 mg/kg(대략 50-배 몰 과량) 투여량의 정맥내 볼러스였다. 연구 디자인은 도 40에 개략화하였다. 혈액 시료는 대퇴부 정맥 카테터로부터 얻었으며, 직접 시트르산나트륨-코팅 튜브로 옮기고, 반전시키면서 혼합하며, 그리고 그것을 원심분리시켜(3000 rpm, 5 분) 혈장을 분리하기 전까지 얼음 위에 위치시켰다. 이후 혈장을 250 μL 분취분으로 나누고 -80 ℃에서 보관하였으며 그리고 각 시료의 하나의 분취분을, 앞서 래트 PK 섹션에서 이미 설명한 바와 같이 형광계 올리그린TM 분석법을 사용하여 압타머 농도에 대해 평가하였다.
영장류에서 혈장 농도 대비 시간 데이타를 도 41에 표의 형식으로 도시하였다. 예상한 바와 같이, 40 kDa PEG 압타머 ARC187(서열 번호: 5)은 가장 긴 기간 동안 혈장 중에 남아 있었으며, 20 kDa PEG 압타머 ARC657(서열 번호: 61)은 가장 짧은 시간 동안 남아 있었다. 도 41에 도시된 데이타를 검사하면 그 데이타는 2-컴파트먼트 모델에 의해 가장 잘 들어맞는다는 것을 보여준다. 따라서, 도 42에 보고된 약동학 파라미터 추측은 산업 표준 약동학 모델링 소프트웨어 WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 2-컴파트먼트 모델로부터 유도한 것이다.
도 42에 도시되어 있는 바와 같이, 모든 압타머는, 23과 30 μM 사이에서 유사한 Cmax 값을 가지며, 이는 압타머 투여량(30 mg/kg)으로 혈장 압타머의 50-배 몰 과량 vs C5 농도(50 배 몰 과량, 약 25 μM)을 얻는데 충분하다는 것을 의미한다. 비록 분자량이 10,000 정도 상이하지만, ARC657(20 kDa PEG)(서열 번호: 61) 및 ARC658(30 kDa PEG)(서열 번호: 62)는 유사한 노출(AUC), t1 /2(α) 및 t1 /2(β) 값을 가진다. 이와는 대조적으로, ARC187(서열 번호: 5)은 다른 분자들에 비해 현저하게 더 높은 노출(AUC) 수치, 연장된 t1 /2(α) 및 약간 더 길어진 t1 /2(β)을 가진다.
약동학 연구 도중 수집한 혈장 시료의 추가 분취분을 연속하여 시험관내 분석하여 영장류 C5 차단의 효율을 측정하였다. 전술한 바와 같이 자이모산 활성화 분석법을 실시하여 영장류 C5b-9 및 생성된 C5a의 양을 각각 측정하였다. 데이타는 C5b-9 농도 대비 시료 시간(도 43a), C5b-9 농도 대비 압타머 농도(도 43b), C5a 농도 대비 시료 시간(도 43c), 그리고 C5a 농도 대비 압타머 농도(도 43d)를 포함하는 몇개의 상이한 포맷으로 플로팅하였다.
40 kDa PEG 압타머 ARC187(서열 번호: 5)은 가장 오랜 기간 동안 영장류 C5 절단(C5b-9 및 C5a 농도)을 억제하였다(도면 43a 및 43c). C5b-9 및 C5a 데이타는 압타머 농도에 대해 플로팅하였으며, 그것은 C5 차단 압타머의 농도가 PEG 분자의 크기와 무관하게, C5 차단을 완전하게 억제하기 위해, 30-배 몰 과량을 초과한다는 것을 의미한다(도면 43b 및 43d).
요약하면, 시노몰거스 마카크 PK/PD 연구로부터의 데이타는 다음과 같은 것을 설명해준다:(a) 예상한 바와 같이, 30-배 몰 과량 이상의 압타머(약 15 μM 혈장 압타머 농도)가, PEG 기의 크기와 무관하게, 시노몰거스 마카크 생체내에서 C5 절단을 억제하는데 필요하며,(b) C5-차단 압타머는 이 종에서 명백한 독성을 유발하지 않으며, 그리고(c) 동물에게 상대적으로 높은 수준으로 투여하는 경우(50-배 몰 과량), 혈장 압타머 레벨은 시료 채취의 기간 동안 적절한 분석 범위 내에서 우수하여 약동학적 파라미터를 계산하는 것을 허용하게 된다.
실시예 5F: 정맥내 투여 이후 시노몰거스 마카크에서의 C5 억제제 ARC658 및 ARC187의 약동학과 약물역학 - 연구 2
연구 2는 전술한 연구 1과 디자인이 유사하며, 다음과 같은 예외를 가진다: a) 단지 2개의 화합물을 평가하였고(ARC658(서열 번호: 62) 및 ARC187(서열 번호: 5); b) 동물의 수는 군 당 4 마리로 증가시켰으며; 그리고 c) 1-분 혈장 시료를 삭제하고 144 시간 시료로 대체하여 말단 반감기 계산이 더 많은 데이카 포인트에 기초하도록 보장하였다. 이들 두 압타머의 제제와 투여, 혈액 시료 채취와 혈장 분리 기술은 연구 1에서 앞서 기재한 방법과 동일하였다. 연구 2에 대한 디자인은 도 44에 요약하였다.
연구 2를 완료한 이후, 연구 1에서 기재한 바와 같이 혈장 분취분을 분석하여 다음과 같은 것을 측정하였다: a) 정맥내 투여 이후 다양한 시간 지점에서 혈장 중 압타머의 농도, 및 b) C5 차단의 효율.
혈장 압타머 농도는 시간의 함수로서 플로팅하였으며(도 45) 및 ARC658(서열 번호: 62)과 ARC187(서열 번호: 5)에 대한 영장류 데이타는 도면 39 및 40에 각각 표의 형식으로 도시하였다. 40 kDa PEG 압타머 ARC187(서열 번호: 5)은 가장 긴 기간 동안 혈장에 남아있었다. 도 45를 관찰하면 그 데이타가 2-컴파트먼트 모델에 가장 잘 들어맞는다는 것을 나타내준다. 따라서, 도 46에 보고된 약동학 파라미터 추정값은 WinNonLinTM v.4.0(Pharsight Corp., 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)을 사용하여 2-컴파트먼트 모델로부터 유도된 것이다.
상기 PK/PD 연구 1과 연구 2 동안에 얻어진 약동학 파라미터들은 비교하면, ARC658(서열 번호: 62)과 ARC187(서열 번호: 5)에 대한 데이타는, ARC187에 있어서 t1/2(α) 측정을 제외하고는 유사하였다. 이론에 의해 구속되는 것으로 의도하는 것은 아니지만, 두 연구 사이에서 ARC187에 대한 t1 /2(α) 측정은 파일롯(pilot) 연구시 시료 크기가 작은 것 때문인 것 같다.
도 46에 도시되어 있는 바와 같이, Cmax 수치는 ARC658(서열 번호: 62)과 ARC187(서열 번호: 5)에 대해 유사하였다. 이와는 대조적으로, 약물 노출(AUC)은 ARC187(서열 번호: 5)로 처리한 동물에서 현저하게 더 컸다. 또한, ARC658(서열 번호: 62)에 비교시 ARC187은 t1 /2(α)과 t1 /2(β) 수치가 연장되었다. 이들 데이타는, PK/PD 연구 1 동안에 얻어진 데이타와 마찬가지로 C5-차단 압타머 ARC187이 주어진 투여량에 대해 가장 효과적인 생체내 C5 차단을 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
약동학 연구 동안 수집한 추가 분취분의 혈장 시료를 연속하여 시험관내 분석하여 영장류 C5 차단의 효율을 측정하였다. 이전과 같이, 자이모산 활성화 분석을 실시하여 생성된 영장류 C5b-9 및 C5a의 양을 각각 측정하였다. 데이타는 C5b-9 농도 대비 압타머 농도(도 47) 및 C5a 농도 대비 압타머 농도(도 48)로서 플로팅하였다. PK/PD 연구 1에서 이미 나타낸 바와 같이, C5 차단 압타머의 농도는, 영장류 C5 절단을 완전히 억제되게 하기 위해, PEG 분자의 크기와 무관하게 반드시 30-배 몰 과량(혈장 C5 농도에 대한 압타머), 또는 대략 15 μM을 초과하였다(도면 41 및 42).
도면 39 및 40의 표에서 데이타를 검사함으로써, 30-mg/kg I.V. 볼러스 이후, ARC658(서열 번호: 62)은 대략 4 시간 동안 15 μM 이상 남아있었으며 ARC187은 대략 8 시간 동안 15 μM 이상 남아있다는 것이 명백하다. 따라서, 40K 압타머 ARC187은 유사한 투여량으로 주어지는 경우 30K 압타머 ARC658(서열 번호: 62)보다 대략 2배 이상 만큼의 임상 효율을 제공한다.
요약하면, 시노몰거스 마카크는 생체내에서 C5 전환을 차단하기 위해 반드시 혈장 C5 대비 30-배 몰 과량 이상의 압타머로 처리하여야 한다. 이들 데이타는 기존 시험관내(용혈) 그리고 생체외(관류된 마우스 심장을 분리한 것) 연구와 일치하였으며, 이는 C5-결합 압타머가 인간 C5 대비 영장류 C5에 대해 더 낮은 친화성을 가진다는 것을 시사한다. C5-차단 압타머는, C5 농도 대비 대략적으로 50-배 몰 과량의 압타머와 동등한 것인 30 mg/kg 이하의 투여량으로 정맥내 볼러스로서 안전하게 운반될 수 있는 것으로 보였다.
실시예 5G: 시노몰거스 마카크에서 볼러스 IV 투여 이후 ARC1905
시노몰거스 마카크에게 정맥내 투여 이후 C5 억제 ARC1905의 약물역학을 평가하였다. ARC1905의 주사용 제제는 표준 식염수 중에서 7.5 mg/mL 이었으며 그리고 투여용 제제는 무균 조건 하에서 사전에-살균시킨 투약 바이알 안에서 살균-여과시켰다(0.2 μM). 시노몰거스 마카크(n=4)는 정맥내 볼러스 투여를 통해 0(식염수 대조군) 또는 30 mg/kg으로 투여하였다. 사지 정맥 또는 동맥 접근 포트(access port)로부터 혈액 시료를 얻었으며 그리고 혈액 시료(0.5 mL)를 디포타슘(K2) EDTA 튜브로 이동시키고, 습윤 얼음 위에 위치시키며, 그리고 대약 4 ℃에서 수집 30 분 동안 원심분리시켰다.
혈장 시료를 시험관내 분석하여 영장류 C5 차단시 ARC1905의 효율을 측정하였다. 실시예 1C에서 ARC1905와 관련하여 사전에 기재한 자이모산 분석법을 생성된 영장류 C5a의 양을 측정하는데 사용하였다. 투여 이후 0.5시간과 2 시간에서 포스트(post)-자이모산 C5a 수치가 감소하는 것은, 자이모산 활성화 분석법을 사용하여 시험관내에서 측정한 것으로서 대략 동일한 농도와 동일한 투여 경로에서 투여했을 때, 시노몰거스 마카크에서 ARC1905가 ARC187과 유사한 방식으로 생체내 C5 절단을 억제한다는 것을 의미한다.
실시예 5H: 시노몰거스 마카크에서 볼러스 IV 투여와 인퓨젼 이후 C5 억제제 ARC187의 약동학과 약물역학
ARC187(서열 번호: 5)의 약동학(PK)과 약물역학(PD) 프로파일은 또한, 시노몰거스 마카크에서 정맥내 인퓨젼의 개시에 이어 즉시 정맥내 로딩(loading) 볼러스 이후 평가하였다. 이 연구 디자인은 도 49에 도시하였다.
혈장 농도 1 uM 표적 정상 상태를 얻는데 필요한 로딩 볼러스 투여량과 인퓨젼 속도는 도 50에 나열한 IV-볼러스 만의 연구로부터 유도한 약동학 파라미터를 사용하여 산출하였다.
모두 3마리의 시노몰거스 마카크에게 IV 볼러스로 ARC187 1 mg/kg, 즉시 이어서 48 시간 기간 동안 0.0013 mg/kg/min의 속도로 IV 인퓨젼 투여하였다. 전체 혈액의 시료를 처리-이후 0으로부터 192 시간까지 수집하였으며, 습윤 얼음 위에 위치시켰으며, 혈장에 대해 진행시켰으며, 그리고 이후 -80 ℃에서 냉각시켰다. ARC187의 혈장 시료 중 농도는 형광 핵산 스테인(stain) 분석법(실시예 5B에 기재한 바와 같이)과 GLP-검증 성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석법 둘 다를 사용하여 측정하였다. 멍키 혈장에서 ARC187을 측정하기 위한 HPLC 분석 방법은 ClinTrials Bio-Research(캐나다 몬트리얼 소재)에 의해 검증된 것이다. 검증 연구는 미국식품의약품안전청(FDA) 우수 실험실 프랙티스(Good Laboratory Practice, GLP) 법률(21 CFR §58)에 부응하였다. HPLC 분석 방법은: 선택성(selectivity), 선형도(linearity), 정량화 최저 한계(lower limit of quantitation, LLOQ), 캐리-오버(carry-over), 분석내 정밀도와 정확도, 분석간 정밀도와 정확도, 스탁 용액 안정성, 주사 매질 안정성, 단기 매트릭스 안정성, 냉동-해동 안정성, 장기 매트릭스 안정성 및 희석 보전성(integrity)과 관련하여 검증되었다. 사용할 수 있는 분석의 선형 동력학적 농도 범위는 0.080 내지 50.0 μM인 것으로 측정하였다.
이들 조건 하에서 측정한 ARC187의 PK 프로파일은 IV 볼러스 PK 파라미터 만을 사용하여 얻은 계산 프로파일과 잘 일치하였다(도 51 참조). ＜5 분 투여-이후 표적 혈장 농도 1 uM을 확인하였으며 그리고 이를 인퓨젼 전체 동안 유지하였다. 인퓨젼을 멈춘 이후, 압타머는 말단 클리어런스 반감기, t1 /2(β) ~ 40-60 시간을 보였다.
시노몰거스 마카크에서 ARC187(서열 번호: 5)의 약물역학적 활성은, 앞서 기재한 바와 같이 시노몰거스 시료 혈장을 10% 인간 혈장 내에서 10-배로 희석시키며 그리고 이후 5 mg/mL 자이모산으로 처리하여 변형시킨 자이모산 활성화 분석법에서 PK 연구 동안 수집한 혈장 시료를 사용함으로써 생체외에서 평가하였다. C5 활성화는, C5a 절단 생성물의 등장에 의해 반영되는 것으로서, 인간 C5a에 특이적인 ELISA(C5a ELISA kit, BD Biosciences, 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로 측정하였다. 활성 ARC187의 각각의 시료 중에서의 농도는 이후, 알고 있는 ARC187 양으로 제조한 시료를 사용하여 자이모산 분석법으로부터 유도한 표준 곡선과 비교함으로써 정량화하였다(도 52 참조). 이 연구는 인퓨젼 동안을 통해 그리고 인퓨젼 이후에도 ARC187이 그것의 항-보체 활성을, 앞서 기재한 약동학 프로파일과 실질적으로 일치하는 수준으로 유지한다는 것을 의미한다.
실시예 5I: 인간 투약 요건의 예측
CABG 수술과 관련된 합병증을 예방, 완화 또는 치료하기 위한 인간 투약 요건은 다음과 같은 가정에 기초한다: 먼저, CABG 환자는 수술하기 전에 항-C5 압타머를 단회 정맥내 볼러스 투여량으로 투여하며, 이어서 연속 인퓨젼을 실시하며 그리고 CABG 수술 이후 정상-상태 혈장 농도 1.5 μM을 24-48 시간 동안 유지한다. 볼러스 투여량과 인퓨젼 속도 추정은, 앞서 기재한 바와 같이 시노몰거스 마카크에서 IV 볼러스 만으로의 연구 및 볼러스 더하기 인퓨젼 연구로부터 유래한 약동학 파라미터를 사용하는 계산에 기초한다. ARC187의 추정 볼러스 투여량은 1 mg/kg이며, 그리고 이어지는 인퓨젼 속도는 0.0013 mg/kg/min이다. 이 볼러스에 대해 48 시간 인퓨젼 요법을 더하는 경우, 예상하는 전체 약물 필요량은 ARC187에 대해 0.4 g이며, 여기서 중량은 올리고뉴클레오티드 중량 만을 의미한다(도 53의 표 중에 칼럼 7 참조). 도 53에 도시된 표의 칼럼 2는 ARC187의 올리고뉴클레오티드 부분에 컨쥬게이트화된 PEG 기의 중량을 의미하며, 칼럼 3은 ARC187의 올리고뉴클레오티드 부분의 분자량을 의미하며(그리고 그것의 올리고뉴클레오티드 서열로서 ARC186(서열 번호: 4)을 포함하는 모든 본원의 압타머에 대해서는 동일함), 칼럼 4는 상기 실시예 3C에서 기재한 바와 같이 아민 반응성 화학을 통해 ARC186(서열 번호: 4)에 컨쥬게이트화된 40 kDa PEG의 분자량을 의미하며, 칼럼 5는 2-컴파트먼트 모델에서 ARC187의 α 상 반감기를 의미하며, 그리고 칼럼 6은 2-컴파트먼트 모델에서 ARC187의 β 상 반감기를 의미한다.
실시예 6
항- C5 압타머와 헤파린/ 프로타민 상호작용
항-C5 압타머의 예상되는 응용 하나는 관상동맥 우회 이식편(CABG) 수술과 관련된 염증 부작용의 예방 또는 완화를 위한 예방제(prophylactic)이다. CABG 동안 혈전을 방지하기 위해 그리고 우회 펌프의 성분 내에서 효력(potency)을 유지하기 위해, 고농도의 항응고제 헤파린(3 - 5 유닛/mL 또는 1 - 2 μM)을 통상 투여하며; 그 과정 이후 헤파린의 효과의 역전, 및 정상적인 지혈 회복은 유사하게 고농도의 프로타민(~ 5 μM)을 투여함으로써 얻게된다. 환자에게 주어지는 잠재적인 위험은 이들 약물의 효력을 임의 손상시키는 것으로서, 그것은 항-C5 압타머가(1) 약물의 활성화를 바꾸지 않아야 하며 그리고(2) 환자에게 항응고제 치료를 복잡하게 할 수 있는 지혈에 대한 고유한 효과를 나타내지 않아야 한다는 것을 보여줄 필요가 있다.
헤파린은 황산화된 폴리사카라이드로서 전체적으로 음전하를 가지며 그리고 평균 분자량은 대략 15 kDa이며 안티트롬빈과의 상호작용을 촉진함으로써 응고 캐스케이드 중에서 다수의 프로테아제에 대해 억제 효과를 나타내는 것이다. 프로타민은, 상당히 양으로 하전된 폴리펩티드로서, 자연에서 적어도 부분적으로 정전기적인 상호작용을 약하게 특징으로 하는 것을 통해 헤파린 활성을 차단할 수 있다. ARC187(서열 번호: 5)의 작용기성 코어는, 헤파린과 같이, 상당히 음이온성이다. 따라서, ARC187이 헤파린-결합 위치 또는 프로타민에 비특이적으로 결합할 수 있다는 것과 및 이들 분자의 활성을 방해할 수 있다는 것은 추론할 수 있다. 이하의 연구는 ARC187의 고유한(즉, 헤파린-유사) 항응고제 성질, 헤파린 기능에 대한 ARC187의 효과, 프로타민에 의한 헤파린-중화에 대한 ARC187의 효과, 및 ARC187의 보체 억제 성질에 대한 프로타민의 효과를 연구하였다.
실시예 6A: 응고에 대한 ARC187 의 시험관내 효과
혈장 응고성에 대한 ARC187(서열 번호: : 5)의 고유한 효과는 각각 응고 캐스케이드의 외인성 아암과 내인성 아암의 표준 임상적 테스트, 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)을 사용하여 연구하였다. 도 54에 도시된 바와 같이, 농축 웰로 시트레이트화 인간 혈장을 적정시킨 것은 계획된 투여량의 과량(20 μM 이하)에서도 PT에 변화를 일으키지 않았으며, 그리고 단지 aPTT에 약간의 상승이 있었다.
헤파린과 프로타민 기능에 대한 ARC187의 시험관내 효과를 평가하기 위해, 3 개체로부터의 혈액을 4-5 유닛/mL 헤파린에 넣었으며, 이 투여량은 CABG 수술에 사용한 헤파린 양과 관련된 것이다. 이들 시료의 응고정도는 활성화 클롯 시간(ACT), 수술 동안 헤파린 활성을 모니터링하는데 보통 사용하는 전혈 응고 테스트를 사용하여 평가하였다. 헤파린의 이들 농도에서, 다른 첨가제 없이, ACT는 4 U/mL 헤파린의 존재시 ~150 초 내지 ~500초 또는 5 U/mL 헤파린의 존재시 ~800 초 만큼 베이스라인 값으로부터 현저하게 연장되었다. 이들 시료에 10 μM ARC187을 첨가하면 클롯 시간에 거의 효과가 없었으며, 이는 ARC187이 헤파린의 항응고 활성을 방해하지 않는다는 것을 나타내주는 것이다.
헤파린 항응고 효과는 프로타민을 6-8 μM(4 U/mL 헤파린) 또는 12 μM(5 U/mL 헤파린)까지 적정시킴으로써 쉽게 중화시킨다. 헤파린 존재시와 프로타민의 중화 농도의 존재시 ACT 값은 베이스라인으로부터 본질적으로 구별할 수 없는 정도이다. ARC187(12 kDa)의 핵산 코어가 프로타민(15 kDa)보다 더 큰 분자량이기 때문에, 당량 농도의 ARC187을 프로타민에 첨가하면 프로타민의 중화 활성을 완전히 역전시키는데 충분할 것으로 기대할 수 있다. 그렇기만, 프로타민을 대략 당량 농도의 ARC187과 사전-항온처리시키면 ACT에 대해 거의 효과가 없다. 프로타민의 중화 농도를 함유하는 혈액 시료는 10 μM ARC187이 존재하거나 또는 존재하지 않는 경우와 유사한 ACT 값을 보여주게 되며, 이는 ARC187이 프로타민의 전응고 활성에 대한 영향을 미친다고 해도 단지 약간이라는 것을 의미한다. 이들 결과는 도 55에 요약하였다.
실시예 6B: 응고에 대한 ARC187 의 생체내 효과
헤파린의 임상적 투여량 및 프로타민의 임상/전임상(subclinical)/초임상적(superclinical) 투여량에서, 항-C5 압타머 ARC187(서열 번호: 5)를 동시 투여하는 동안 헤파린과 프로타민의 기능 사이의 상호작용을 조사하여 ARC187의 전임상/초임상적 혈장 농도의 존재가 프로타민에 의한 헤파린 항응고의 역전을 방해하는지를 결정하고자 하였다. 이 연구의 결과는 도 56에 요약하였다. 간단하게는, 베이스라인 ACT 값은 10 uM(예컨대, 임상적 투여량의 10-배 몰 과량)의 ARC187에 의해서는 테스트된 모든 헤파린 투여량에서 영향을 미치지 않았다. 유사하게는, 10 uM ARC187에 의해 헤파린에 의한 항응고 정도는 영향을 받지 않았다. ARC187이 없는 경우, 프로타민이 효력을 나타내는 최소 투여량은 ~30%(임상적 투여량 = 100%)이다. 추가로, 30% 프로타민에 의한 헤파린 항응고의 역전은 임상적 투여량의 ARC187의 10-배 몰 과량(즉, 10 uM)에 의해서도 영향을 받지 않았다. 따라서, 임상적 셋팅(예컨대, CABG)시 보체 억제에 대해 ARC187을 사용하는 것은, 일반적인 투여량에서는 헤파린과 프로타민을 동시 사용하는 것에 의해 영향을 받지 않는다.
실시예 6C: 항- 보체 기능에 대한 헤파린과 프로타민의 효과
ARC187(서열 번호: 5)의 항-보체 활성에 대한 헤파린과 프로타민의 효과는, 실시예 1에 기재한 바와 같이, 자이모산으로 활성화시킨 시트레이트화 전혈 시료 중에서 시험하였다. 자이모산 활성화시키기에 바로 앞서, 다음과 같은 4개의 조건으로 시험할 시트레이트화된 혈액의 시료 안에 ARC187을 적정시켰다: 1) 처리하지 않는 것(헤파린 또는 프로타민이 없는 것); 2) 4 U/mL 헤파린; 3) 6 μM 프로타민; 4) 4 U/mL 헤파린 + 6 μM 프로타민. 자이모산으로 활성화시킨 이후, 혈장 중 sC5b-9를 ELISA 측정함으로써 C5 활성화를 정량화하였다(C5b-9 ELISA kit, Quidel, 캘리포니아주 샌 디에고 소재). 각각의 조건에 대해, ARC187 농도에 대해 C5 활성화의 억제 %로서 표현한 결과는 오차 내에서 구별할 수 없는 정도였다(도 57 참조). 모든 경우에서 1-2 μM ARC187에서 완전 억제를 얻었다. 따라서, 헤파린과 프로타민은 CABG 수술시 사용하는 그들의 관련 농도 개별적으로 또는 조합하여도, ARC187의 항-보체 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 드러났다.
여기서는 본 발명을 기재된 설명과 실시예의 방식으로 기재하였으며, 본 기술 분야의 당업자는 본 발명이 다양한 구체예로서 실시될 수 있으며 그리고 상기 기재와 실시예가 설명의 목적이며 이하의 청구항을 제한하지 않는 목적이라는 것을 인지하고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Archemix Corp., et al. <120> Aptamer Therapeutics Useful in the Treatment of Complement Related Disorders <130> 23239-576 CIP-061 <150> 11/058,134 <151> 2005-02-14 <160> 102 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <223> cytosine at positions 3, 4, 6 and 37 are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <223> uridine at positions 9, 30 and 31 are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n at position 1 is 2'-fluoro cytidine or 2'-O-methyl cytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n at position 2 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n at position 7 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n at position 8 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n at position 10 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n at position 11 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 is is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n at position 13 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n at position 14 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n at position 15 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is 2'-fluoro cytosine or 2'-O-methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n at position 19 is 2'-fluoro uridine or 2'-O-methyl uridine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n at position 21 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n at position 22 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n at position 23 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n at position 24 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n at position 25 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n at position 26 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n at position 27 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n at position 28 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n at position 29 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n at position 32 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n at position 33 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n at position 34 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n at position 35 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n at position 36 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n at position 38 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <400> 1 nnccgcnnun nnnnnngnnn nnnnnnnnnu unnnnncn 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy, and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <400> 2 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 3 <211> 42 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 3 gacgaugcgg ucucaugcgu cgagugugag uuuaccuucg uc 42 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 4 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is a modified by a 40 kDa branched (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propyl-2-(4'-butamide)) PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 5 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 6 <211> 44 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 6 aggacgaugc ggucucaugc gucgagugug aguuuaccuu cguc 44 <210> 7 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 2, 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH, and positions 1 and 34, wherein adenosine is 2'-OH <400> 7 agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 <210> 8 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 8 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 24, 33 and 34, wherein cytidine is deoxy, and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 9 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl, except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro, except at positions 10, 12, 16, 24, 33 and 34, wherein cytidine is deoxy; at positions 1, 3, and 37, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at postions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 10 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl, except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 1, 3, 10, 12, 16, 24 and 37, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 11 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrmidines are 2'-fluoro; except at positions 1, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy, and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 12 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 3, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 13 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 24 and 37, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 14 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 3, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 15 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 37, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 16 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 1, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 17 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at positions 1, 3 and 37, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 18 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 4, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 19 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 6, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 20 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 4, 6, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 21 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 18 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 22 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 19, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 23 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 18 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 19, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 24 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 29, which are deoxy thymidine <400> 25 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtu uaccugcg 38 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 30, which are deoxy thymidine <400> 26 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagut uaccugcg 38 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sqeuence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 31, which are deoxy thymidine <400> 27 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu taccugcg 38 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25, 29, 30 and 31, which are deoxy thymidine <400> 28 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtt taccugcg 38 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-flouro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 35, which are deoxy thymidine <400> 29 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uacctgcg 38 <210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 24, 33 and 34, wherein cytidine is deoxy; at position 9, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 30 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 4, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 31 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 6, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 32 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 4 and 6, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 33 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 34 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl <400> 34 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl <400> 35 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl <400> 36 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 29, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 37 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 30, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 38 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 31, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 39 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at positions 29, 30 and 31, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 40 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 35, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 41 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at position 5, wherein guanosine is deoxy; at position 17, wherein guanosine is 2'-OH; and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 42 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 43 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at position 5, wherein guanosine is 2'-OH; at position 17, wherein guanosine is deoxy; and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 43 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 44 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and position 32, wherein adenosine is deoxy <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 44 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 6 and 18, wherein guanosine is 2'-OH; and position 33, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 11, 13, 17 and 25, wherein cytidine is deoxy; at position 40, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 12, 24 and 26, which are deoxy thymidine <400> 45 gcgucgcggu ctcaggcgcu gagtctgagu uuaccuacgc 40 <210> 46 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and position 32, wherein adenosine is deoxy <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at positions 36, 37 and 38 wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 46 gggcgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccuccc 38 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 6 and 18, wherein guanosine is 2'-OH; and position 33, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 11, 13, 17 and 25, wherein cytidine is deoxy; at position 40, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 12, 24 and 26, which are deoxy thymidine <400> 47 gcgccgcggu ctcaggcgcu gagtctgagu uuaccugcgc 40 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 8 and 20, wherein guanosine is 2'-OH; and position 35 wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> thymidine at position 45 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 48 ggacgccgcg gucucaggcg cugagucuga guuuaccugc gucut 45 <210> 49 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18, 26, 35 and 36, which are deoxy cytidine; and at positions 20, 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all uridines are 2'-fluoro; except at position 21, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 13, 25, 27, 31 and 37, which are deoxy thymidine <400> 49 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tuuacctgcg cc 42 <210> 50 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18, 26, 35, 36 and 39, which are deoxy cytidine; and at positions 3, 20, 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> uridine at position 11 is 2'-fluoro; uridine at position 21 is 2'-O-methyl; positions 13, 25, 27, 31, 32, 33 and 37 are deoxy thymidine <400> 50 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42 <210> 51 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> cytosine at positions 5, 6, 8, 12, 14, 18, 26, 35, 36 and 39 are deoxy cytidine; and cystosine at positions 3, 20, 41 and 42 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> uridine at position 21 is 2'-O-methyl; positions 11, 13, 25, 27, 31, 32, 33 and 37 are deoxy thymidine <400> 51 ggcgccgcgg tctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42 <210> 52 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> uridine at positions 13, 21, 25 and 27 are 2'-O-methyl; positions 11, 31, 32, 33 and 37 are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> cytosine at positions 5, 6, 8, 12, 18, 35, 36 and 39 are deoxy cytidine; and cytosine at positions 3, 14, 20, 26, 41 and 42 are 2'-O-methyl <400> 52 ggcgccgcgg tcucaggcgc ugagucugag tttacctgcg cc 42 <210> 53 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> adenosine at position 1 has biotin conjugated to the 5' end <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 3, 8 and 20, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 2, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 53 agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18 and 26, which are deoxy cytidine; and at positions 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all uridines are 2'-fluoro; positions 13, 25, and 27 are deoxy thymidine <400> 54 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag uuuaccugcg cc 42 <210> 55 <211> 42 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18, 26, 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all uridines are 2'-fluoro; except at positions 13, 25, and 27, wherein uridine is 2'-O-methyl <400> 55 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg cc 42 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 56 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at position 19 wherein uridine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 57 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 29, which is deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 58 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 59 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 60 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; at position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at position 29, which is deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 60 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39 <210> 61 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 20 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 61 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 62 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified bya 30 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 62 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 5' amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 63 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 64 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 10 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 64 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 65 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a linear 40 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 65 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 66 <211> 38 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 20 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> guanosine at position 38 is modified by a 20 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <400> 66 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 67 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 40 kDa branched (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propyl-1-carbamoyl) PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 67 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 68 <211> 46 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(46) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 68 ggcgauuacu gggacggacu cgcgauguga gcccagacga cucgcc 46 <210> 69 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 69 ggcuucugaa gauuauuucg cgaugugaac uccagacccc 40 <210> 70 <211> 92 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (40)..(69) <223> n may be any nucleotide (a, c, g, or t) <400> 70 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng gtcgatcgat cgatcatcga tg 92 <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 71 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 72 catcgatgat cgatcgatcg acc 23 <210> 73 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 73 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 74 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 74 ggucgaucga ucgaucaucg aug 23 <210> 75 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(75) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 75 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 76 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 76 ccuugguuug gcacaggcau acauacgcag gg 32 <210> 77 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 77 ccuugguuug gcacaggcau acaaacgcag gg 32 <210> 78 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 78 ggguuuggca caggcauaca uaccc 25 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 79 ggguuuggca caggcauaca aaccc 25 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 80 ggcggcacag gcauacauac gcaggggucg cc 32 <210> 81 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(47) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 81 cguucuaccu ugguuuggca caggcauaca uacgcagggg ucgaucg 47 <210> 82 <211> 88 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (40)..(69) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 82 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng ttacgactag catcgatg 88 <210> 83 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <400> 83 cttggtttgg cacaggcata catacgcagg ggtcgatcg 39 <210> 84 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 84 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 85 catcgatgct agtcgtaac 19 <210> 86 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 86 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 87 guuacgacua gcaucgaug 19 <210> 88 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 88 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgauc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 89 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 89 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggugucgauc 60 uguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 90 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 90 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uaaauacgca gggcucgauc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 91 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 91 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcccaggca uauauacgca gggauugauc 60 cguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 92 <211> 78 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(78) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 92 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcgcaggca uacauacgca ggucgaucgg 60 uuacgacuag caucgaug 78 <210> 93 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 93 gggagaggag agaacguucu accuuguugu ggcacagcca acccuacgca cggaucgccc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 94 <211> 69 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(69) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 94 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggucgaucgg 60 uuacgacua 69 <210> 95 <211> 79 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(79) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 95 gggagaggag agaacguucu accuuagguu cgcacuguca uacauacaca cgggcaaucg 60 guuacgacua gcaucgaug 79 <210> 96 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(75) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n may be any nucleotide (a, t, u, c, or g) <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n may be any nucleotide (a, t, u, c, or g) <400> 96 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcncaggca uanauacgca cgggucgauc 60 gguuacgacu agcau 75 <210> 97 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 97 gggagaggag agaacguucu accuuucucu gccacaagca uaccuucgcg ggguucuauu 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 98 <211> 79 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(79) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 98 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uauauacgca gggucgaucc 60 guuacgacua gcaucgaug 79 <210> 99 <211> 93 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (25)..(54) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 99 catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60 cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93 <210> 100 <211> 92 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 100 catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 101 <211> 92 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 101 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 102 <211> 1676 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic C5 <400> 102 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160 Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu 165 170 175 Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190 Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205 Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220 Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270 Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285 Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300 Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350 Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365 Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380 Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400 Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415 Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430 Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala 435 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480 His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575 Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590 Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605 Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620 Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640 Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655 Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670 Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685 Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys 690 695 700 Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu 705 710 715 720 Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser 725 730 735 Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu 740 745 750 His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr 755 760 765 Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys 770 775 780 Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln 785 790 795 800 Gly Val Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys 805 810 815 Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830 Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845 Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860 Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880 Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val 885 890 895 Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910 Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg 915 920 925 Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu 930 935 940 Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960 Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975 Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990 Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005 Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His 1010 1015 1020 Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro 1025 1030 1035 Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys 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1245 Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 1250 1255 1260 Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln 1265 1270 1275 Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala 1280 1285 1290 Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg 1295 1300 1305 Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu 1310 1315 1320 His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val 1325 1330 1335 Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly 1340 1345 1350 Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr 1355 1360 1365 Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr 1370 1375 1380 Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1385 1390 1395 Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Arg Glu 1400 1405 1410 Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu 1415 1420 1425 Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val 1430 1435 1440 Glu Gly Val Asp Gln 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Arg Asp Thr Thr 1640 1645 1650 Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala 1655 1660 1665 Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 1670 1675

Claims (3)

  1. 서열 번호 4에 따른 뉴클레오티드 서열로 구성되는 압타머 또는 이의 염.
  2. 제1항에 있어서, CABG(관상동맥우회술) 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관성형술과 관련된 심근 손상, 재발협착증과 관련된 심근 손상, CABG 수술과 관련된 보체 단백질 매개 합병증 또는 경피적 관상동맥 중재술과 관련된 보체 단백질 매개 합병증을 치료하는 방법에 사용되기 위한 것인 압타머 또는 이의 염.
  3. 삭제
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