JP2002503455A - 補体系タンパク質の高アフィニティー核酸リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 補体系タンパク質に対する高アフィニティー核酸リガンドを同定及び調製するための方法が記載される。補体系タンパク質Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する高アフィニティー核酸リガンドを同定及び調製するための方法が記載される。ＳＥＬＥＸ法により同定されたＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する特定のＲＮＡリガンドが本発明に含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 補体系タンパク質に対する高アフィニティー核酸リガンドを同定し、調製する
ための方法が本明細書に記載される。このような核酸リガンドを同定するために
本明細書において利用される方法は、Systematic Evolution of Ligands by Exp
onential enrichment の頭文字をとってＳＥＬＥＸ^TMと呼ばれる。補体系タンパ
ク質Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する高アフィニティー核酸リガンドを同定し、調
製するための方法が本明細書に記載される。この発明は、Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５
の高アフィニティー核酸リガンドを含む。Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５のＲＮＡリガン
ドも開示される。補体系を阻害及び／又は活性化する核酸リガンドも開示される
。本発明のオリゴヌクレオチドは医薬又は診断剤として役立つ。

【０００２】 発明の背景 補体系は、病原体の細胞外型を攻撃するための統制されたカスケードシステム
において一緒に機能する一組の少くとも２０の血漿及び膜タンパク質を含む（Ja
neway ら（1994) Immunobiology : The Immune System in Health and Disease.
Current Biology Ltd. San Francisco, pp. 8 : 35-8 : 55 ; Morgan (1995) C
rit. Rev. in Clin Lab. Sci. 32 (3) : 265-298) 。２つの別個の酵素活性化カ
スケード、古典的経路及び別の経路、並びに膜攻撃経路として知られる非酵素的
経路がある。

【０００３】 古典的経路は、通常、外来粒子に結合した抗体により誘発される。それは、い
くつかの成分、Ｃ１，Ｃ４，Ｃ２，Ｃ３及びＣ５（経路中の順番に従い列記）を
含む。補体系の古典的経路の始まりは、免疫及び非免疫アクティベーターの両方
による最初の補体成分（Ｃ１）の結合及び活性化の後におこる（Cooper (1985)
Adv. Immunol. 37 : 151) 。Ｃ１は、成分Ｃｌｑ，Ｃｌｒ及びＣｌｓのカルシウ
ム依存性複合体を含み、Ｃｌｑ成分の結合を介して活性化される。Ｃｌｑは６つ
の同一のサブユニットを有し、各々のサブユニットは３つの鎖（Ａ，Ｂ及びＣ鎖
）を含む、各々の鎖はコラーゲン様テールに接続した球状ヘッド領域を有する。
抗原−抗体複合体によるＣｌｑの結合及び活性化はＣｌｑヘッドグループ領域を
介しておこる。タンパク質、細胞及び核酸を含む多数の非抗体Ｃｌｑアクティベ
ーター（Reidら（1993) The Natural Immune System : Humoral Factors. E. Si
m. ed. IRL Press, Oxford, p. 151) はコラーゲン様ストーク領域上の別個の部
位を介して結合し、活性化する。

【０００４】 非抗体Ｃｌｑタンパク質アクティベーターは、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ
）（Jiang ら（1991) J. Immunol. 146 : 2324) 及び血清アミロイドタンパク質
（SAP) (Briston ら（1986) Mol. Immunol. 23 : 1045)を含み；これらは各々リ
ン脂質又は炭水化物への結合により凝集した時にＣｌｑを活性化するであろう。
モノマーＣＲＰ又はＳＡＰはＣｌｑを活性化しない。Ｃｌｑは、アルツハイマー
病に見られるプラークの成分である（Jiang ら（1994) J. Immunol. 152 : 5050
; Eikelenboom and Stam (1982) Acta Neuropathol (Berl) 57 : 239 : Eikele
nboom ら（1989) Virchows Arch. [B] 56 : 259 : Rogersら（1992) Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 89 : 10016 : Dietzschold ら（1995) J. Neurol. Sci. 130 : 11) 凝集したアミロイドペプチド（Schultz ら（1994) Neurosci. Lett. 175 : 99 ; Snyder ら（1994) Exp. Neurol. 128 : 136) への結合を介しても活性化
される。Ｃｌｑ活性化は、アルツハイマー病に関連する組織損傷も悪化させ得る
。これらのアクティベーターは、イムノグロブリンアクティベーターが結合する
ヘッドグループ領域から離れたそのコラーゲン様領域上でＣｌｑに結合する。Ｃ
ｌｑコラーゲン様領域に結合する他のタンパク質は、コラーゲン（Menzelら（19
81) Biochim. Biophys. Acta 670 : 265) 、フィブロネクチン（Reidら（1984)
Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C92 (Suppl. 284) : 11)、ラ
ミニン（Bohnsackら（1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 3824) 、フィブ
リノーゲン及びフィブリン（Entwistle ら（1988) Biochem. 27 : 507), HIV rs
gp41 (Stoiber ら（1995) Mol. Immunol. 32 : 371) 、アクチン（Nishiokaら（
1982) Biochem. Biophys. Res. Communm. 108 : 1307) 及びタバコグリコプロテ
イン（Koetheら（1995) J. Immunol. 155 : 826)がある。

【０００５】 Ｃｌｑは、アニオン性炭水化物（Hughes-Jonesら（1978) Immunology 34 : 45
9)例えばコポリサッカライド（Almedaら（1983) J. Biol. Chem. 258 : 785) 、
フカン（Blondin et al. (1994) Mol. Immunol. 31 : 247) 、プロテオグンカン
（Silvestri ら（1981) J. Biol. Chem. 256 : 7383)、並びに脂質、例えばリポ
ポリサッカライド（LPS) (Zohairら（1989) Biochem. J. 257 : 865 ; Stoiber
ら（1994) Eur. J. Immunol. 24 : 294)に結合し、それらによっても活性化され
得る。両方のDNA (Schravendijk 及びDwek (1982) Mol. Immunol. 19 : 1179 ;
Rosenberg ら（1988) J. Rheumatol 15 : 1091 ; Uwatokoら（1990) J. Immunol
. 144 : 3484) 及びRNA (Acton et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 : 3530) も
Ｃｌｑに結合し、活性化することができる。Ｃｌｑを活性化する細胞内成分には
、細胞及び亜細胞膜（Linder (1981) J. Immunol. 126 : 648 : Pinckardら（19
73) J. Immunol. 110 : 1376 ; Storrs ら（1981) J. Biol. Chem. 256 : 10924
; Giclas ら（1979) J. Immunol. 122 : 146 ; Storrsら（1983) J. Immunol. 131 : 416)、中間フィラメント（Linder et al. (1979) Nature 278 : 176)及び
アクチン（Nishiokaら（1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 108 : 1307)が
ある。これらの相互作用全てが細菌（又はウィルス）感染に対する保護のため、
又は抗体の欠如下での組織損害に対する応答として（Liら（1994) J. Immunol. 152 : 2995) 古典的経路を補充するであろう。

【０００６】 CRP (Jiangら（1991) J. Immunol. 146 : 2324), SAP (Yingら（1993) J. Imm
unol. 150 : 169)、アミロイドペプチド（Newman (1994) Curr. Biol. 4 : 462)
及びDNA (Jiangら（1992) J. Biol. Chem. 267 : 25597) を含む非抗体アクティ
ベーターのための部位は、Ｃｌｑ Ａ鎖のアミノ末端の残基１４〜２６に局在化
している。この配列を含む合成ペプチドは結合及び活性化の両方を有効に阻害す
る。ペプチド１４〜２６はいくつかの塩基性残基を含み、ヘパリン結合モチーフ
の１つに適合する（Yabkowitz ら（1989) J. Biol. Chem. 264 : 10888 ; Cardi
n ら（1989) Arteriosclerosis 9 : 21)。そのペプチドは、コラーゲン・テール
を有するアセチルコリンエステラーゼ内のペプチド１４５〜１５６とも高度に相
同性であり；この部位はヘパリン−スルフェート基底膜結合に関連している（De
prezら（1995) J. Biol. Chem. 270 : 11043) 。残基７６〜９２の第２のＣｌｑ
Ａ鎖部位もより弱い結合に関連し得；この部位は球状ヘッド領域及びコラーゲ
ン様テールの連結部にある。

【０００７】 別の経路として知られる第２の酵素活性化カスケードは、補体系活性化及び増
幅のための迅速な抗体と独立した経路である。その別の経路はいくつかの成分、
Ｃ３、因子及び因子Ｄを含む。別の経路の活性化はＣ３のタンパク質分解開裂型
であるＣ３ｂが細菌のような活性化表面に結合する時におこる。次に因子ＢがＣ
３ｂに結合し、そして因子Ｄにより開裂されて活性化酵素Ｂａを生成する。次に
酵素Ｂａはより多くのＣ３をＣ３ｂに開裂し、その活性化表面上のＣ３ｂ−Ｂａ
複合体を更に析出させる。第２のＣ３ｂが析出してＣ３ｂ−Ｃ３ｂ−Ｂａ複合体
を形成した時、その酵素は、次にＣ５を開裂して末端経路の活性化を誘発する。

【０００８】 膜攻撃経路としても知られる非酵素的末端経路は、成分Ｃ５，Ｃ６，Ｃ７，Ｃ
８及びＣ９を含む。この膜攻撃経路の活性化は、Ｃ５成分が古典的又は別の経路
により酵素的に開裂されて小さなＣ５ａポリペプチド（９kDa ）及び大きなＣ５
ｂフラグメント（２００kDa ）を作り出す時におこる。Ｃ５ａポリペプチドは白
血球上に元来、ある７つの膜貫通Ｇタンパク質連結レセプターに結合し、肝細胞
（Havilandら（1995) J. Immunol. 154 : 1861) 及びニューロン（Gasqueら（19
97) Am. J. Pathol. 150 : 31)を含む種々の組織上で発現されることが知られて
いる。Ｃ５ａ分子はヒト補体系の最初の走化性成分であり、白血球走化性、平滑
筋収縮、細胞内シグナル伝達経路の活性化、好中球−内皮接着（Mulliganら（19
97) J. Immunol. 158 : 1857) 、サイトカイン及び脂質遊離及び酸化体形成を含
む種々の生物応答を誘発し得る。大きな方のＣ５ｂフラグメントは逐次的により
後の成分に結合してＣ５ｂ−９膜攻撃複合体（ＭＡＣ）を形成する。Ｃ５ｂ−９
ＭＡＣは赤血球を直接溶解し、より大量に、白血球を溶解し、筋肉、上皮及び内
皮細胞のような組織に損傷を与える（Stahl ら（1997) Circ. Res. 76 : 575)。
半溶解量において、ＭＡＣは接着分子の上昇制御を刺激し、細胞内カルシウムは
増加し、そしてサイトカインが遊離する（Ward (1996) Am. J. Pathol. 149 : 1
079)。更に、Ｃ５ｂ−９ＭＡＣは、細胞溶解を引きおこすことなく内皮細胞及び
血小板のような細胞を刺激することができる。Ｃ５ａ及びＣ５ｂ−９ＭＡＣの非
溶解効果は時折、極めて小さい。

【０００９】 補体系は細菌及びウィルス感染に対する防御において並びにおそらく腫瘍に対
する免疫サーベイランスにおいて重要な役割を有する。これは、補体成分に欠損
があるヒトにおいて最も明らかに証明される。早期補体（Ｃ１，Ｃ４，Ｃ２又は
Ｃ３）を欠損している個体は再発性の感染を患うが、後期補体（Ｃ５〜Ｃ９）に
欠損がある個体はニッセリア（ｎｉｓｓｅｒｉａ）感染に対して感受性である。
補体古典的経路は抗体により、ＣＲＰ又はＳＡＰの結合により、又はＬＰＳを介
する直接の活性化により細菌上で活性化される。補体の別の経路はＣ３の細胞コ
ートへの結合を介して活性化される。補体は、抗体を介してウィルスにより活性
化され、ウィルスに感染した細胞上でも活性化され得る。なぜならこれらは外来
物として認識されるからである。同様に、形質転換された細胞は。外来物として
認識され得、補体系により溶解されるか、又は免疫クリアランスのための標的と
され得る。

【００１０】 補体系の活性化は、治療目的のために用いることができ、そして用いられてい
る。次に、腫瘍細胞に対して作られた抗体は補体系を活性化し腫瘍拒絶を引きお
こすのに用いられている。補体系は、不要なリンパ球を除去するためにポリクロ
ーナル又はモノクローナル抗体と一緒に用いられている。例えば、抗リンパ球グ
ルブリン又はモノクローナル抗Ｔ細胞抗体は、さもなければ拒絶を媒介するであ
ろうリンパ球を除去するために器官移植の前に用いられる。

【００１１】 補体系は健康のメンテナンスにおいて重要な役割を有しているが、それは病気
を引きおこし又はそれに関与し得る。補体系は多数の腎臓、リウマチ学、神経学
、皮膚科学、血液学、血管／肺、アレルギー、感染、生体適合性／ショック及び
他の病気又は状態に関与している（Morgan (1995) Crit. Rev. in Clin Lab. Sc
i. 32 (3) : 265-298 : Matis 及びRollins (1995) Nature Madicine 1 (8) : 8
39-842) 。補体系は必ずしもその病状の唯一の原因ではないが、病因に関与する
いくつかの因子の１つであり得る。

【００１２】 補体系を生体内で阻害するいくつかの医薬が開発されているが、多くは毒性を
引きおこすか又は弱いインヒビターである（Morgan (1995) Crit. Rev. in Clin
Lab. Sci. 32 (3) : 265-298)。ヘパリン、Ｋ７６ＣＯＯＨ及びナファムスタッ
ト（ｎａｆａｍｓｔａｔ）メシレートは動物研究において有効であることが示さ
れている（Morgan (1995) Crit. Rev. in Clin Lab. Sci. 32 (3) : 265-298)。
補体系の天然のインヒビターの組換え型が開発され、考慮中であり、これらは、
膜調節タンパク質補体レセプター１（ＣＲ１）、ディケイ加速因子（ＤＡＦ）、
膜補因子（ＭＣＰ）及びＣＤ５９を含む。

【００１３】 Ｃ５は、補体系インヒビターの開発のための注目すべき標的である。なぜなら
古典的及び別の経路は補体Ｃ５に収束するからである（Matis 及びRollins (199
5) Nature Medicine 1 (8) : 839-842) 。更に、Ｃ５開裂の阻害は白血球及び組
織、例えば内皮細胞へのＣ５ａ及びＣ５ｂ効果の両方をブロックし（Ward (1996
) Am. J. Pathol. 149 : 1079)、これによりＣ５阻害は種々の病気及び状態、例
えば肺の炎症（Mulliganら（1998) J. Clin. Invest. 98 : 503)、体外補体活性
化（Rinderら（1995) Rinderら（1995) J. Clin. Invest : 1564) 又は抗体媒介
性補体活性化（Biesecker ら（1989) J. Immunol. 142 : 2654) において治療的
利益を有し得る。Matis 及びRollins ((1995) Nature Medicine 1 (8) : 839-84
2)は、抗炎症生物医薬としてＣ５特異的モノクローナル抗体を開発した。Ｃ５ａ
及びＭＡＣは、両方とも、ヒトの病気に関連した急性及び慢性炎症に関連してお
り、それらの病状における役割は動物モデルにおいて確認されている。Ｃ５ａは
補体−及び好中球依存性肺血管傷害のために要求され（Ward (1997) J. Lab. Cl
in. Med. 129 : 400 ; Mulligan ら（1998) J. Clin. Invest. 98 : 503)、ショ
ック及び火傷における好中球及び血小板活性化と関連する（Schmidら（1997) Sh
ock 8 : 119 ) ＭＡＣは、急性自己免疫重症筋無力症における筋肉傷害（Biesck
er及びGomez (1989) J. Immunol. 142 : 2654)、移植における器官拒絶（Baldwi
n ら（1995) Transplantation 59 : 797 ; Brauer ら（1995) Transplantation 59 : 288 ; Takahashiら（1997) Immunol. Res. 16 : 273) 及び自己免疫系球体
腎炎における腎傷害（Biesecker (1981) J. Exp. Med. 39 : 1979 ; Nangaku (1
997) Kidney Int. 52 : 1570) を媒介する。Ｃ５ａ及びＭＡＣの両方は急性心筋
虚血（Homeister 及びLucchesi (1994) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34 :
17) 、急性（Bednarら（1997) J. Neurosurg. 86 : 139) 及び慢性ＣＮＳ傷害（
Morgan (1997) Exp. Clin. Immunogenet. 14 : 19)、体外循環の間の白血球活性
化（Sun ら（1995) Nucleic Acids Res. 23 : 2909 ; Spycher及びNydegger (19
95) Infushionsther. Transfusionsmed. 22 : 36) に、並びに関節炎及び狼瘡を
含む自己免疫病に関連する組織傷害に関連する。これにより、Ｃ５の阻害開裂は
、補体系の２つの潜在的損傷活性化の形成を防ぐ。Ｃ５ａ遊離の阻害は主要補体
系走化及び血管作動活性を除去し、Ｃ５ｂ形成の阻害は細胞溶解Ｃ５ｂ−９ＭＡ
Ｃのアセンブリーをブロックする。更に、Ｃ５の阻害は、完全な重要な補体系防
御及びクリアランスメカニズム、例えばＣ３及びＣｌｑ食細胞活性、免疫複合体
のクリアランス及び先天的な免疫応答を残しながら補体系による傷害を防ぐ（Ca
rrol (1998) Amm. Rev. Immunol. 16 : 545)。

【００１４】 Ｃ３は、それは両方の経路に共通しているので、補体系インヒビターの開発の
ための注目すべき標的である。天然のインヒビターの組換え型を用いるＣ３の阻
害（Kalli ら（1994) Springer Semin. Immunopathol. 15 : 417) は細胞媒介性
組織傷害も防ぐことができ（Mulliganら（1992) J. Immunol. 148 : 1479) これ
は、心筋梗塞（Weisman ら（1990) Science 249 : 146)及び肝臓虚血／再灌流（
Chavez-Cartayaら（1995) Transplantation 59 : 1047)のような病気において治
療的利益を有することが示されている。Ｃ３の制御は補体系のほとんどの生物活
性を限定する。ＤＡＦ，ＭＣＰ，ＣＲＩ及び因子Ｈを含むほとんどの天然のイン
ヒビターはＣ３を標的とする。

【００１５】 ＳＥＬＥＸ^TM 標的分子の高度に特異的な結合を伴う核酸分子の試験管内進化のための方法が
開発されている。この方法、ＳＥＬＥＸ法と呼ばれるSystematic Evolution of
Ligands by Exponentiol enrichment は、現在、放棄された、“Systematic Evo
lution of Ligands by Exponential Enrichment ”とのタイトルの１９９０年６
月１１日に出願された米国特許通し番号０７／５３６，４２８号；“Nucleic Ac
id Ligands”とのタイトルの１９９１年６月１０日に出願された米国特許出願通
し番号０７／７１４，１３１号、現在米国特許第５，４７５，０９６号；“Meth
od for Identifying Nucleic Acid Ligands ”とのタイトルの１９９２年８月１
７日に出願された米国特許出願通し番号０７／９３１，４７３号、現在の米国特
許第５，２７０，１６３号（ＷＯ９１／１９８１３も参照のこと）に記載される
。これら各々はその全体において引用により組み込まれる。ＳＥＬＥＸ特許出願
として本明細書に集合的に言及されるこれらの出願の各々はいずれの要求される
標的分子に対する核酸リガンドを作るための根本的に新規な方法を記載する。

【００１６】 ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、並びに同じ一
般的選択スキームを用いる結合、分画及び増幅の段階的くり返しにより結合アフ
ィニティー及び選択の本質的にいずれの要求される基準も達成することに関する
。好ましくはランダム配列のセグメントを含む、核酸の混合物から出発して、Ｓ
ＥＬＥＸ法は、その混合物を標的に結合のために好ましい条件下で接触させ、標
的分子に特異的に結合したこれらの核酸から未結合の核酸を分画し、その核酸−
標的複合体を解離させ、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して核酸のリ
ガンドの豊富な混合物を作り出し、次に標的分子に対する高い特異的の高アフィ
ニティーの核酸リガンドを作り出すために要求されるのと同じ程度のサイクルを
介して結合、分画、解離及び増幅のステップを再びくり返すことを含む。

【００１７】 基本的なＳＥＬＥＸ法は、いくつかの特定の目的を達成するために改良されて
いる。例えば、現在、放棄された“Method for Selecting Nucleic Acids on Ba
sis of Structure”とのタイトルの１９９２年１０月１４日に出願された米国特
許出願通し番号０７／９６０，０９３号は、ベントＤＮＡのような特定の構造的
特徴を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と合わせたＳＥＬＥＸ法の
使用を記載する。現在、放棄された“Photoselection of Nucleic Acid Ligands
”とのタイトルの１９９３年９月１７日に出願された米国特許出願通し番号０８
／１２３，９３５号（米国特許第５，７６３，１７７号も参照のこと）は、標的
分子に結合し及び／又はそれに光架橋し及び／又はそれを光不活性化することが
できる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸベースの方法
を記載する。現在、放棄された“High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Di
scriminate Between Theophylline and Caffeine”とのタイトルの１９９３年１
０月７日に出願された米国特許出願通し番号０８／１３４，０２８号（米国特許
第５，５８０，７３７号も参照のこと）は、Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸと呼ば
れる、密接に関連する分子間を識別することができる高度に特異的な核酸リガン
ドを同定するための方法を記載する。現在放棄された“Systemic Evolution of
Ligands by Exponential Enrichment : Solution SELEX”とのタイトルの１９９
３年１０月２５日に出願された米国特許出願通し番号０８／１４３，５６４号（
米国特許第５，５６７，５８８号も参照のこと）及び“Flow Cell SELEX ”との
タイトルの１９９７年１月３１日に出願された米国特許出願通し番号０８／７９
２，０７５号、現在の米国特許第５，８６１，２５４号は、標的分子について高
い及び低いアフィニティーを有するオリゴヌクレオチド間を極めて有効に分画す
るＳＥＬＥＸベースの方法を記載する。“Nucleic Acid Ligands to HIV-RT及び
HIV-1 Rev ”とのタイトルの１９９２年１０月２１日に出願された米国特許出願
通し番号０７／９６４，６２４号、現在、米国特許第５，４９６，９３８号は、
ＳＥＬＥＸ法を行った後に改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する
。“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Errichment : Chemi-SE
LEX ”とのタイトルの１９９５年３月８日に出願された米国特許出願通し番号０
８／４００，４４０号は、リガンドをその標的に共有結合させるための方法を記
載する。

【００１８】 ＳＥＬＥＸ法は、リガンドに生体内安定性の改良又はデリバリー特性の改良の
ような改良された特徴を与える改良されたヌクレオチドを含む高アフィニティー
核酸リガンドの同定を含む。このような改変の例には、リバース及び／又はホス
フェート及び／又は塩基位置での化学的置換がある。改良されたヌクレオチドを
含むＳＥＬＥＸで同定された核酸リガンドは、ピリミジンの５−及び２′−位で
化学的に改変されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する現
在、放棄された、“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Moditied
Nucleotides”とのタイトルの１９９３年９月８日に出願された米国特許出願通
し番号０８／１１７，９９１（米国特許第５，６６０，９８５号も参照のこと）
に記載される。米国特許出願通し番号０８／１３４，０２８号、現在米国特許第
５，５８０，７３７号、前掲は、２′−アミノ（２′−ＮＨ₂ ）、２′−フルオ
ロ（２′−Ｆ）、及び／又は２′−Ｏ−メチル（２′−ＯＭｅ）で改変された１
又は複数のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する。現在、
放棄された“Novel Method of Preparation of Known and Novel 2′Moditied N
ucleosides by Intramotecular Nucleophilic Displacement”とのタイトルの１
９９４年６月２２日に出願された米国特許出願通し番号０８／２６４，０２９号
は、種々の２′−改変ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する。

【００１９】 ＳＥＬＥＸ法は、“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enric
hment : Chimeric SELEX”とのタイトルの１９９４年８月２日に出願された米国
特許出願通し番号０８／２８４，０６３号、現在米国特許第５，６３７，４５９
号、及び“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment : Bl
ended SELEX ”とのタイトルの１９９４年４月２８日に出願された米国特許出願
通し番号０８／２３４，９９７号、現在米国特許第５，６８３，８６７号に各々
記載されるように、所定のオリゴヌクレオチドを、他の所定のオリゴヌクレオチ
ド及び非オリゴヌクレオチド機能単位と組み合わせることを含む。これらの出願
は、他の分子の要求される特性と共に、オリゴヌクレオチドの広範囲の形状及び
他の特性、並びに効率的な増幅及び複製特性の組合せを許容する。基本的ＳＥＬ
ＥＸ法の改変を記載する上述の特許出願の各々はそれらの全体において本明細書
に引用により組み込まれる。

【００２０】 発明の要約 本発明は、補体系タンパク質及び相同タンパク質に対する核酸リガンドを同定
及び製造する方法並びにこれにより同定され及び製造された核酸リガンドを含む
。相同性タンパク質とは、８０％又はそれ超のアミノ酸同一性の程度を意味する
。典型例は、Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する核酸リガンドを同定及び製造する方
法並びにこれにより製造された核酸リガンドである。Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に特
異的に結合することができる核酸リガンド配列を供する。特に、Ｃｌｑ，Ｃ３及
びＣ５に特異的に結合することができるＲＮＡ配列を供する。表２〜６，８，１
０及び１２〜１３並びに図５Ａ〜Ｂ（配列番号：５〜１５５及び１６０〜１９６
）に示されるＲＮＡリガンド配列が特に本発明に含まれる。補体系のタンパク質
の機能を阻害する核酸リガンドも本発明に含まれる。特に、Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ
５の機能を阻害するＲＮＡリガンドが本発明に含まれる。補体系を阻害及び／又
は活性化する核酸リガンドも含まれる。

【００２１】 更に、補体系タンパク質に対する核酸リガンド及び核酸リガンド配列を同定す
る方法であって、（ａ）核酸の候補混合物を調製し、（ｂ）その核酸の候補混合
物を補体系タンパク質に接触させ、（ｃ）その補体系タンパク質に対するアフィ
ニティーに基づいてその候補混合物のメンバー間を分画し、そして（ｄ）その所
定の分子を増幅して、補体系タンパク質への結合について比較的高いアフィニテ
ィーを有する核酸配列について豊富な核酸の混合物を作り出すことを含む方法が
本発明に含まれる。

【００２２】 Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する核酸リガンド及び核酸リガンド配列を同定する
方法であって、（ａ）核酸の候補混合物を調製し、（ｂ）核酸の候補混合物をＣ
ｌｑ，Ｃ３及びＣ５に接触させ（ｃ）Ｃｌｑ，Ｃ３又はＣ５に対するアフィニテ
ィーに基づいて候補混合物のメンバー間を分画し、そして（ｄ）所定の分子を増
幅してＣｌｑ，Ｃ３又はＣ５への結合について比較的高いアフィニティーを有す
る核酸配列が豊富な核酸の混合物を作り出すことを含む方法も包含する。

【００２３】 より詳しくは、本発明は、上述の方法に従って同定されたＣｌｑ，Ｃ３及びＣ
５に対するＲＮＡリガンド、例えばＣｌｑに対するＲＮＡリガンド、例えば表２
（配列番号：５〜２０）及び表６（配列番号：８４〜１５５）に示すリガンド、
Ｃ３に対するＲＮＡリガンド、例えば表３（配列番号：２１〜４６）に示す配列
、並びにＣ５に対するＲＮＡリガンド、例えば表４（配列番号：４７〜７４）、
表５（配列番号：７６〜８３）、表８（配列番号：７５，１６０〜１６２）、表
１０（配列番号：１６３〜１８９）、表１２（配列番号：１９０〜１９２）、表
１３（配列番号：１９４〜１９６）及び図５Ａ〜Ｂ（配列番号：１６０及び１９
３）に示す配列を含む。所定のリガンドのいずれかに実質的に相同であり、かつ
Ｃｌｑ，Ｃ３又はＣ５に結合する実質的に同じ能力を有し、Ｃｌｑ，Ｃ３又はＣ
５の機能を阻害するＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対するＲＮＡリガンドを含む。本明
細書に供されるリガンドと実質的に同じ構造形態を有し、かつＣｌｑ，Ｃ３又は
Ｃ５と実質的に同じ能力を有しＣｌｑ，Ｃ３又はＣ５の機能を阻害するＣｌｑ，
Ｃ３及びＣ５に対する核酸リガンドが更に本発明に含まれる。

【００２４】 本発明は、本明細書において同定されるＲＮＡリガンドに基づく改変ヌクレオ
チド配列及びその混合物も含む。 発明の詳細な記載 本願は、ＳＥＬＥＸとして知られる方法に全般的に同定された補体系タンパク
質に対する核酸リガンドを記載する。上述の通り、ＳＥＬＥＸ技術は、全体が引
用により本明細書に組み込まれるＳＥＬＥＸ特許出願に詳細に記載される。本発
明を記述するために用いる特定の用語を以下に定義する。

【００２５】 本明細書に用いる“核酸リガンド”は、標的に対して要求される作用を有する
非天然核酸である。要求される作用には、これらに限らないが、標的への結合、
標的の触媒的変化、標的又は標的の機能的活性を改変／変化する様式での標的と
の反応、自殺インヒビターとしての標的への共有結合、並びに標的と他の分子と
の間反応の容易化がある。好ましい実施形態において、要求される作用は標的分
子への特異的結合であり、ここでその標的分子はワトソン／クリック塩基対又は
三本鎖ヘリックス結合に主に依存するメカニズムを介して核酸リガンドに結合す
るポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、ここでその核酸リガンドは標
的分子に結合する周知の生理的機能を有する核酸ではない。核酸リガンドには、
核酸の候補混合物から同定された核酸があり、ここでその核酸リガンドは、候補
混合物を標的と混合し、ここでその候補混合物に対して標的に対する増加された
アフィニティーを有する核酸を候補混合物の残りから分画することができ；ｂ）
その増加されたアフィニティーの核酸を候補混合物の残りから分画し；そしてｃ
）増加したアフィニティーの核酸を増幅してリガンドの豊富な核酸、混合物を作
り出すことを含む方法による所定の標的のリガンドである。

【００２６】 “候補混合物”は、要求されるリガンドをそこが選択する異なる配列の核酸の
混合物である。候補混合物のソースは、天然の核酸又はそのフラグメント、化学
的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸又は先の技術の組合せにより作ら
れた核酸からのものであってよい。好ましい実施形態において、各々の核酸は、
増幅過程を容易にするためにランダム領域の周囲の固定された配列を有する。

【００２７】 “核酸”は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖並びにそれらのいずれかの化
学的改変物を意味する。改変には、これらに限らないが、更なる電荷、極性、水
素結合、静電相互作用、及びフラクショナリティーを核酸リガンド塩基に又は全
体としての核酸リガンドに与える別の化学基を供するものがある。このような改
変には、これらに限らないが、２′−位糖の改変、５−位ピリミジンの改変、８
−位プリンの改変、環外アミンの改変、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ又
は５−イオドーウラシルの置換、骨格改変、メチル化、異常な塩基対の組合せ、
例えばイソベース、イソシチジン及びイソグアニジン等がある。改変は、キャッ
ピングのような３′及び５′改変も含み得る。

【００２８】 “ＳＥＬＥＸ^TM”法は、要求される様式で標的と相互作用する。例えばタンパ
ク質に結合する核酸リガンドの選択の、これらの選択された核酸の増幅との組合
せに関する。選択／増幅ステップの反復サイクルは、極めて多数の核酸を含むプ
ールからの標的と最も強く相互作用する１つの又は少数の核酸の選択を許容する
。選択／増幅手順のサイクルは、選択された目的が達成されるまで続けられる。
本発明においてＳＥＬＥＸ法は、Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する核酸リガンドを
得るために用いられる。ＳＥＬＥＸ法は、ＳＥＬＥＸ特許出願に記載される。

【００２９】 “標的”は、リガンドが要求される関心のいずれかの化合物又は分子を意味す
る。標的にこれらに限らないが、タンパク質、ペプチド、炭水化物、ポリサッカ
ライド、グリコプロテイン、ホルモン、レセプター、抗原、抗体、ウィルス、基
質、代謝物、遷移状態アナログ、補因子、インヒビター、薬剤、染料、栄養素、
成長因子等であり得る。この適用において、標的は、補体系タンパク質、好まし
くはＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５である。

【００３０】 “補体系タンパク質”は、これらに限らないが、Ｃｌ，Ｃｌｑ，Ｃｌｒ，Ｃｌ
ｓ，Ｃ２，Ｃ３，Ｃ３ａ，Ｃ３ｂ，Ｃ４，Ｃ４ａ，Ｃ５，Ｃ５ａ，Ｃ５ｂ，Ｃ６
，Ｃ７，Ｃ８，Ｃ９、因子Ｂ（Ｂ）、因子Ｄ（Ｄ）、因子Ｈ（Ｈ）及びそれらの
レセプター、並びに他の可溶性及び膜インヒビター／調節タンパク質を含む、補
体系のいずれかのタンパク質又は成分を意味する。

【００３１】 “補体系”は、病原体又は感染もしくは形質転換された細胞の細胞外型を攻撃
するために統制されたカスケードシステムにおいて、並びに免疫反応物又は細胞
デブリスのクリアランスにおいて一緒に機能する一組の血漿及び膜タンパク質で
ある。補体系は、特定の病原体上で自発的に又は病原体への抗体結合により活性
化することができる。病原体は摂取及び破壊のために（オプソニン処理された）
補体系タンパク質でコートされる。病原体は、直接、溶解され殺され得る。同様
のメカニズムは、感染した、形質転換された、又は損傷した細胞を標的にする。
補体系は、免疫及び細胞デブリスのクリアランスにも寄与する。

【００３２】 ＳＥＬＥＸ法は、現在、放棄された“Systematic Evolution of Ligands by E
xponential Enrichment ”とのタイトルの１９９０年６月１１日に出願された米
国特許出願通し番号０７／５３６，４２８；“Nucleic Acid Ligands”とのタイ
トルの１９９１年６月１０日に出願された米国特許出願通し番号０７／７１４，
１３１、現在、米国特許第５，４７５，０９６号；“Methods for Indenifyins
Nucleic Acid Ligands”とのタイトルの１９９２年８月１７日に出願された米国
特許出願通し番号０７／９３１，４７３号、現在米国特許第５，２７０，１６３
号（ＷＯ９１／１９８１３も参照のこと）に記載される。これらの出願は、各々
引用により本明細書に組み込まれ、ＳＥＬＥＸ特許出願と集合的に呼ぶ。

【００３３】 その最も基本的な形態において、ＳＥＬＥＸ法は、以下の一連のステップによ
り定義することができる： １）異なる配列の核酸の候補配列を調製する。その候補混合物は、一般に、混
合配列の領域（即ち候補混合物の各々は同じ位置に同じ配列を含む）及びランダ
ム配列の領域を含む。その固定された配列領域は、（ａ）以下に記載の増幅ステ
ップを補助するため、（ｂ）標的に結合することが知られている配列に擬態させ
るため、又は（ｃ）候補混合物中の核酸の所定の構造的配置の濃度を増加させる
ために選択される。ランダム配列は、全体的にランダムであっても（即ちいずれ
の位置での塩基を見い出す確率も４分の１である）、又は部分的にのみランダム
であっても（例えばいずれかの位置で塩基を見い出す確率は、０〜１００％のい
ずれかのレベルで選択することができる）。

【００３４】 ２）候補混合物を、選択された標的に、標的と候補混合物との間の結合のため
にも好ましい条件下で接触させる。これらの環境下で、標的と候補混合物との間
の相互作用は、標的とその標的のために最も強いアフィニティーを有する核酸と
の間の核酸−標的対を形成するとして考えることができる。 ３）標的について最も高いアフィニティーを有する核酸を標的に対して小さい
アフィニティーの核酸から分画する。最も高いアフィニティーの核酸に相当する
極めて小数の配列（及びおそらく唯一の分子の核酸）のみが候補混合物中に存在
するので、候補混合物中の有意な量の核酸（約５〜５０％）が分画の間、保存さ
れるように分画基準を設定することが一般に要求される。

【００３５】 ４）次に、標的に対して相対的に高いアフィニティーを有するとして分画の間
に選択された核酸を増幅して、標的に対して相対的に高いアフィニティーを有す
る核酸が豊富な新しい候補混合物を作り出す。 ５）上述の分画及び増幅ステップをくり返すことにより、新しく形成された候
補混合物は、次第に弱く結合する配列が少くない、標的に対する核酸のアフィニ
ティーの平均の程度は一般に増加するであろう。最高では、ＳＥＬＥＸ法は、標
的分子に対して最も高いアフィニティーを有するもとの候補混合物から、これら
の核酸を示す１又は小数の特有の核酸を含む候補混合物を作り出すであろう。

【００３６】 ＳＥＬＥＸ特許出願は、かなり詳細にこの方法を記述し、詳述する。この方法
に用いることができる標的；候補混合物内の核酸を分画するための方法；及び富
化された候補混合物を作り出すための分画された核酸を増幅するための方法が含
まれる。ＳＥＬＥＸ特許出願は、タンパク質が核酸結合タンパク質である、及び
そうでない両方のタンパク質標的を含む、得られるリガンドからいくつかの標的
種までも記述する。

【００３７】 ＳＥＬＥＸ法は、選択された核酸リガンドを、“Nucleic Acid Ligand Comple
xes ”とのタイトルの１９９５年３月４日に出願された米国特許出願第０８／４
３４，４６５号、現在、米国特許第５，８５９，２２８号に記載されるように、
診断又は治療用複合体において脂溶性又は非免疫学的高分子量化合物と組み合わ
せることを更に含む。診断用又は治療用複合体におけるジアシルグリセロール又
はジアルキルグリセロールのような脂溶性化合物と会合するＶＥＧＦ核酸リガン
ドは、“Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Co
mplexes ”とのタイトルの１９９６年１０月２５日に出願された米国特許出願通
し番号０８／７３９，１０９に記載される。グリセロール脂質のような脂溶性化
合物、又はポリアルキレングリコールのような非免疫学的高分子量化合物と会合
するＶＥＧＦ核酸リガンドは、更に、“Vascular Endothelial Growth Factor (
VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes ”とのタイトルの１９９７年７月２１日
に出願された米国特許出願通し番号０８／８９７，３５１号に記載される。非免
疫学的高分子量化合物又は脂溶性化合物と会合するＶＥＧＦ核酸リガンドは、更
に、“Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Comp
lexes ”とのタイトルの１９９７年１０月１７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９７
／１８９９４にも記載される。基本的なＳＥＬＥＸ法の改変を記述する上述の特
許出願の各々はその全体が引用により本明細書に組み込まれる。

【００３８】 本発明の特定の実施形態は、非免疫原性高分子量化合物又は脂溶性化合物に共
有結合した補体系タンパク質に対する１又は複数の核酸リガンドを含む複合体を
供する。本明細書に用いる複合体は、補体系タンパク質の核酸リガンドの、非免
疫原性高分子量化合物への共有結合により形成された分子を記述する。非免疫原
性高分子量化合物は、典型的には免疫原性応答を形成しない、約１００Da〜１，
０００，０００Da、より好ましくは約１０００Da〜５００，０００Da、最も好ま
しくは約１０００Da〜２００，０００Daの化合物である。本発明の目的のため、
免疫原性応答は、生物に抗体タンパク質を作らせるものである。本発明の１つの
好ましい実施形態において非免疫原性高分子化合物はポリアルキレングリコール
である。最も好ましい実施形態において、ポリアルキレングリコールはポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）である。より好ましくは、ＰＥＧは約１０〜８０Ｋの
分子量を有する。最も好ましくは、ＰＥＧは約２０〜４５Ｋの分子量を有する。
本発明の特定の実施形態において、非免疫原性高分子量化合物は核酸リガンドで
もあり得る。

【００３９】 本発明の別の実施形態は、補体系タンパク質に対する核酸リガンド及び脂溶性
化合物から構成される複合体に関する。脂溶性化合物は、脂質、及び／又は脂溶
性成分から実質的に構成される構造を含む、低い誘電率の他の材料又は相と会合
し又はそれに分画される特性を有する化合物である。脂溶性化合物には、脂質及
び脂質（及び／又は低誘電率の他の材料又は相）と会合する特性を有する非脂質
含有化合物がある。コレステロール、リン脂質、及びグリセロール脂質、例えば
ジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール及びグリセロールアミド脂質は
脂溶性化合物の更なる例である。好ましい実施形態において、脂溶性化合物はグ
リセロール脂質である。

【００４０】 非免疫原性高分子量化合物又は脂溶性化合物は、補体系タンパク質に対する核
酸リガンドの種々の位置に、例えば塩基上の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオ
チドの５′−位、プリンヌクレオチドの８−位、ホスフェートのヒドロキシル基
、又は補体系タンパク質に対する核酸リガンドの５′又は３′末端のヒドロキシ
ル基又は他の基に共有結合することができる。脂溶性化合物がグリセロール脂質
であり、又は非免疫原性高分子量化合物がポリアルキレングリコール又はポリエ
チレングリコールである実施形態において、好ましくは、非免疫原性高分子量化
合物はそのホスフェート基の５′又は３′ヒドロキシルに結合する。最も好まし
い実施形態において脂溶性化合物又は非免疫原性高分子量化合物は核酸リガンド
のホスフェート基の５′ヒドロキシルに結合する。非免疫原性高分子量化合物又
は脂溶性化合物の、補体系タンパク質の核酸リガンドへの結合は、直接、又はリ
ンカー又はスペーサーを利用して、行うことができる。

【００４１】 リンカーは、共有結合又は非共有結合相互作用を介して２又はそれ超の分子を
接続する分子であり、１又は複数の分子の機能的特性を保護する様式で分子の空
間的分離を許容し得る。リンカーは、スペーサーと呼ぶこともできる。 補体系タンパク質に対する核酸リガンド及び非免疫原性高分子量化合物又は脂
溶性化合物は、脂質構成物と更に会合させることができる。脂質構成物は、脂質
が水性懸濁液に適合することが知られている種々の異なる構造的配置を含む、脂
質、リン脂質、又はそれらの誘導体を含む構造である。これらの構造は、これら
に限らないが、脂質二層ベシクル、ミセル、リポソーム、エマルション、脂質リ
ボン又はシートを含み、医薬として許容されることが知られている種々の薬剤及
び成分と複合化することができる。好ましい実施形態において、脂質構成物はリ
ポソームである。好ましいリポソームはユニラメラであり、２００nm未満の相対
的サイズを有する。脂質構成物中の一般的な付加成分には、とりわけ、コレステ
ロール及びα−トコフェロールがある。脂質構成物は、単独で又はいずれかの組
合せで用いることができ、それは、当業者が特定の適用のために要求される特徴
を供することを認めるであろう。更に、脂質構成物及びリポソーム形成の技術的
態様は当該技術分野で公知であり、その分野で一般に実施される方法のいずれも
本発明のために用いることができる。

【００４２】 本明細書に記載される方法及びこの方法により同定される核酸リガンドは、治
療及び診断の両方の目的のために役立つ。治療的使用には、ヒト患者の病気又は
医学的状態、特に補体系の活性化により引きおこされる病気又は状態の治療又は
予防がある。補体系は病状の唯一の原因である必要はないが、その各々が病因に
関与するいくつかの因子の１つであり得る。このように病気又は状態には、これ
らに限らないが、腎臓病、例えばループス腎炎及び膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰ
ＧＮ）、膜性腎炎、ＩｇＡニューロパシー；リウマチ学的病気、例えば慢性関節
リウマチ、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、ベーチェット症候群、若年性関
節リウマチ、シェーグレン症候群及び全身性硬化症；神経学的病気、例えば重症
筋無力症、多発性硬化症；脳狼瘡、ギラン・バレー症候群及びアルツハイマー病
；皮膚科学的病気、例えば天疱瘡／類天疱瘡、植物毒素反応、脈管炎及び火傷；
血液学的病気、例えば発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、酸性化血清溶解
テスト陽性の遺伝性赤芽球性多核性（ＨＥＭＰＡＳ）及び特発性血小板性紫斑症
（ＩＴＰ）；生物適合性／ショック疾患、例えばバイパス後症候群、成人呼吸窮
迫症候群（ＡＲＤＳ）、カテーテル反応、過敏症、移植拒絶、子癇前症、血液透
析及び血小板ストレージ；脈管／肺疾患、例えばアテローム性動脈硬化、心筋梗
塞、発作及び再灌流傷害；アレルギー、例えば過敏症、ぜんそく及び皮膚反応；
感染、例えば敗血症性ショック、ウィルス感染及び細菌感染；並びに他の状態、
例えばアテローム、腸の炎症、甲状腺炎、不妊症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮ
Ｈ）及び溶血性貧血を含む。

【００４３】 補体系は、異なる構成物を標的にすることにより活性化カスケードにおいてい
くつかの点で阻害することができる。Ｃｌｑの阻害は、抗体又は非抗体メカニズ
ムによりその開始をブロックするであろう。抗体は、ＳＬＥ、重症筋無力症及び
関節炎を含む多くの症病気においてＣｌｑを活性化する。非抗体補体系活性化は
、アルツハイマー病、心筋梗塞及び敗血症性ショックを含む多くの病気において
おこる。Ｃｌｑのブロックは、これらの病気において補体が媒介する組織損傷を
防ぎ得る。

【００４４】 補体は、Ｃ３段階で直接、抗体の欠如下でも活性化され得る。細菌、ウィルス
粒子又は損傷した細胞を含む活性化表面は、Ｃｌｑを要求しない補体系活性化を
誘発し得る。Ｃ３のインヒビターは、補体系活性化及びこれらの状態での損傷を
防ぎ得る。 他の例において、Ｃ５の阻害が最も役立つ。Ｃｌｑ又はＣ３による補体系の活
性化は両方ともＣ５の活性化を導き、これによりＣ５の阻害はいずれかの経路に
よる補体系媒介損傷を防ぐ。しかしながら、Ｃｌｑ及びＣ３は微生物に対する通
常の防御において及び免疫成分及び損傷した組織のクリアランスにおいて重要で
あるが、Ｃ５はこの機能についてほとんど重要でない。それゆえ、Ｃ５は、短期
間又は長期間、阻害することができ、補体系の保護的役割は傷つけられないであ
ろうが、Ｃｌｑ又はＣ３の長期の阻害は要求されない。最後に、Ｃ５フラグメン
トＣ５ａ及びＣ５ｂは、直接、不要な補体系活性化に関連する組織傷害及び病気
の大部分を引きおこす。それゆえ、Ｃ５の阻害は治療的利益を得る最も直接的方
法である。

【００４５】 他の例において、補体系の活性化はヒト患者の病気又は医学的状態の治療又は
予防において要求される。例えば、補体系の活性化は細菌又はウィルス感染及び
悪性腫瘍の治療に要求される。更に、移植前のＴ細胞上での補体系の活性化は、
拒絶を媒介するＴ細胞を排除することにより器官又は組織の拒絶を防ぎ得る。 更に、細胞表面標的に結合する核酸リガンドは、それらに補体系を活性化する
能力を与えることにより、より有効になり得る。次に、核酸結合は、例えば膜攻
撃複合体溶解及びオプソニン化を介する細胞クリアランスにより、標的機能を阻
害し、細胞を除去する。核酸リガンドは古典的な又は別の経路を介して補体系を
活性化することができる。Ｃｌｑ核酸リガンドは、細胞表面成分を標的とする他
の構造にコンジュゲートすることができる。例えば、Ｃｌｑ核酸リガンドは、細
胞標的に対する抗体、サイトカイン、成長因子又は細胞レセプターに対するリガ
ンドにコンジュゲートすることができる。これは、Ｃｌｑ核酸リガンドが標的の
細胞表面上で多量化し、補体系を活性化してそれにより細胞を殺すのを許容する
であろう。

【００４６】 原型の古典的経路のアクティベーターは免疫凝集物であり、それは、Ｃｌｑ成
分上の球状ヘッドグループへの結合を介して補体系を活性化する。一般に、２又
はそれ超のＦｃドメインのＣｌｑへの結合が要求され；５量体ＩｇＭは特に有効
なアクティベーターである。対照的に、核酸リガンドはＣｌｑコラーゲン様テー
ル領域上の別個の部位への結合を介して活性化することができる。この部位は、
Ｃ−反応性タンパク質、血清アミロイドタンパク質、エンドトキシン、アミロイ
ドペプチド１−４０及びミトコンドリア膜を含む種々の他の非抗体アクティベー
ターにも結合する。イムノグロブリンに関して、これらの非抗体アクティベータ
ーは、活性化するために多量体化することが必要である。

【００４７】 Ｃｌｑのコラーゲン様領域上の部位に結合する核酸リガンドも、凝集した時に
アクティベーターになり得る。このような補体系活性化凝集物は、それが細胞表
面上に形成されたなら、例えば腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は白血球抗原に結合
したなら、溶解し得る。核酸リガンドが媒介する活性化の程度は、核酸リガンド
凝集（即ち核酸リガンド−Ｃｌｑ相互作用の多量化）の程度と共に増加する。補
体系が媒介する殺害は、核酸リガンドが活性でないモノマーとして循環するなら
特に特異的であるが、それらが標的の細胞表面上で多量体化した時に、アクティ
ベーターになる。

【００４８】 いずれの補体系活性化についても、程度及び特異性は、標的となる細胞上に析
出したＣ３の量により決定される。析出したＣ３は、Ｃ５を開裂し膜攻撃複合体
形成を開始する酵素コンバターゼを形成する。Ｃ３は食細胞消化を標的とするた
めの古典的な血清オプソニンでもある。原型の別の経路のアクティベーターは、
細菌及びイースト細胞壁、フコイジン及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ、又はグリコプロ
テイン、例えばエンドトキシン又は糖衣を含む反復炭水化物単位である。核酸リ
ガンドは、細胞表面上のＣ３成分を凝集させることにより別の経路を活性化し得
る。Ｃ３を細胞上におくことは因子Ｂ結合及び別の経路Ｃ３コンベルターゼ形成
を促進する。Ｃ３への核酸リガンドの結合は、インヒビターＨの結合をブロック
し、Ｃ３ｂディケイを防ぐ。これは、Ｃ３コンバターゼ形成及び別の経路の活性
化も増加させるであろう。Ｃ３に対する核酸リガンドはこの活性を有し得る。な
ぜならヘパリンは活性化Ｃ３に結合し、別の経路活性化を促進し得るからである
。核酸リガンドのＣ３への結合は膜関連インヒビターＣＲ１，ＣＲ２，ＭＣＰ及
びＤＡＦのＣ３への結合をブロックし、Ｃ３ｂコンベルターゼディケイを防ぎ、
別の経路の活性化を刺激する。この別の経路のメカニズムは、細胞殺害及び溶解
におけるＣｌｑ依存性活性化と同程度、効率的であり得る。

【００４９】 核酸リガンド媒介補体系細胞殺害は、いくつかの方法で、例えばａ）腫瘍細胞
の直接の殺害；ｂ）標的の微生物又は感染した細胞の溶解；及びｃ）リンパ球又
はリンパ球サブセットの排除により、用いることができる。核酸リガンドは、こ
れらの目的のために現在、用いられる抗体に置きかわり得る。 診断的利用は、生体内又は試験管診断適用の両方を含み得る。一般に、ＳＥＬ
ＥＸ法及び特に本明細書に教示され、クレームされるＳＥＬＥＸ法の特定の適用
は、特に診断的適用のために適している。ＳＥＬＥＸ法は、高アフィニティーで
及び驚くべき特異性で標的に結合することができる核酸リガンドを同定する。も
ちろん、これらの特徴は、当業者が診断用リガンドにおいて見い出すであろう要
求される特性である。

【００５０】 本発明の核酸リガンドは、当業者が用いるいくつかの技術に従って診断目的の
ために慣用的に適合させることができる。診断剤は、使用者が特定の場所又は濃
度で所定の標的の存在を同定するのを許容し得ることだけを必要とする。同様に
、標的と結合対を形成する能力は診断目的のための陽性シグナルを誘発するのに
十分であり得る。当業者は、このようなリガンドの存在を追跡するために、標的
タグを組み込むために当該技術分野で周知の手順によりいずれの核酸リガンドも
適合させることができよう。このようなタグは、いくつかの診断手順に用いるこ
とができる。本明細書に記載されるＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する核酸リガンド
は、Ｃｌｑ，Ｃ３又はＣ５タンパク質の同定のために、特に用いることができる
。

【００５１】 ＳＥＬＥＸ法は、標的分子の高アフィニティーリガンドを供する。これは、核
酸調査の分野で前例のないまれなことである。本発明は、そのＳＥＬＥＸ法を、
補体系活性化の古典的経路の最初の成分（Ｃ１）の一部である特定の標的Ｃｌｑ
に、古典的及び別の経路の両方の一部である特定の標的Ｃ３に、及び末端経路の
一部である特定の標的Ｃ５に適用する。以下の実施例セクションにおいて、Ｃｌ
ｑ，Ｃ３及びＣ５に対する核酸リガンドを単離及び同定するために用いる実験パ
ラメーターが記載される。

【００５２】 医薬として用いるために要求される核酸を製造するために、核酸リガンドは（
１）標的上で要求される効果を達成することができる様式で標的に結合し；（２
）要求される効果を得るために出来る限り小さく；（３）出来る限り安定で；及
び（４）選択された標的に対して特異的なリガンドであることが好ましい。ほと
んどの場合において、核酸リガンドは標的に対して最も高い可能なアフィニティ
ーを有することが好ましい。

【００５３】 これらに限らないが、小さな分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ヌクレ
オシド、及びポリペプチドを含む医薬剤は、要求されない様式で補体系を活性化
し得る。補体系タンパク質に対する核酸リガンドは、医薬剤が補体系を活性化す
る不要な副作用を誘発することなく投与され、治療に有効な量を達成するように
、補体系を一般的に阻害することにより予防剤として用いることができよう。

【００５４】 同時係属の同じ譲渡人の米国特許出願通し番号０７／９６４，６２４号（１９
９２年１０月２１日出願）、現在、米国出願第５，４９６，９３８号（ '９３８
特許）においては、ＳＥＬＥＸを行った後に改良された核酸リガンドを得るため
の方法が記載される。“Nucleic Acid Ligands to HIV-RT及びHIV-1 Rev ”との
タイトルの '９３８特許は、特に、その全体が引用により本明細書に組み込まれ
る。

【００５５】 本発明において、ＳＥＬＥＸ実験は、３０又は５０のランダムを位置（３０Ｎ
又は５０Ｎ）を含む縮重ライブラリーからＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５について特異的
な高アフィニティーのＲＮＡを同定するために、行った。本発明は、実施例２及
び６に記載される方法により同定した表２（配列番号：５〜２０）及び表６（配
列番号：８４〜１５５）に示すＣｌｑに対する特定のＲＮＡリガンド、実施例３
に記載される方法により同定された、表３（配列番号：２１〜４６）に示すＣ３
１に対する特定のＲＮＡリガンド、並びに実施例４，９，１０及び１１に記載さ
れる方法により同定された、表４（配列番号：４７〜７４）、表５（配列番号：
７６〜８３）、表８（配列番号：７５，１６０〜１６２）、表１０（配列番号：
１６３〜１８９）、表１２（配列番号：１９０〜１９２）、表１３（配列番号：
１９４〜１９６）及び図５Ａ〜Ｂ（配列番号：１６０及び１９３）に示すＣ５に
対する特定のＲＮＡリガンドを含む。本発明は、更に、Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５の
機能を阻害するＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対するＲＮＡリガンドを含む。本発明に
より包含されるリガンドの範囲は、ＳＥＬＥＸ法により同定された、修飾された
及び修飾されないＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５の全ての核酸リガンドを含む。より詳し
くは、本発明は、表２〜６，８，１０及び１２〜１３並びに図５Ａ〜Ｂ（配列番
号：５〜１５５及び１６０〜１９６）に示すリガンドに実質的に相同である核酸
配列を含む。実質的に相同とは、７０％超、より好ましくは８０％超、更により
好ましくは９０％、９５％又は９９％超の一次配列相同性の程度を意味する。本
明細書に記載される相同性のパーセンテージは、アラインメントを補助するため
に１０ヌクレオチドの長さ中に１のギャップを導入することができる時に比較し
た配列中の同一のヌクレオチド残基でアラインする２つの配列のうちの小さい方
において見い出されるヌクレオチドのパーセンテージとして計算される。表２（
配列番号：５〜２０）及び表６（配列番号：８４〜１５５）に示すＣｌｑのリガ
ンドの配列相同性の報告は、ほとんど又は全く一次相同性がない配列が、Ｃｌｑ
に結合する実質的に同じ能力を有し得ることを示す。同様に、表３（配列番号：
２１〜４６）に示すＣ３のリガンドの配列相同性の報告は、ほとんど又は全く一
次相同性がない配列が、Ｃ３に結合する実質的に同じ能力を有し得ることを示す
。同様に、表４（配列番号：４７〜７４）、表５（配列番号：７６〜８３）、表
８（配列番号：７５，１６０〜１６１）、表１０（配列番号：１６３〜１８９）
、表１２（配列番号：１９０〜１９２）、表１３（配列番号：１９４〜１９６）
及び図５Ａ〜Ｂ（配列番号：１６０及び１９３）に示すＣ５のリガンドの配列相
同性の報告は、ほとんど又は全く一次相同性がない配列が、Ｃ５に結合する実質
的に同じ能力を有し得ることを示す。これらの理由のため、本発明は、表２（配
列番号：５〜２０）及び表６（配列番号：８４〜１５５）に示す核酸リガンドと
実質的に同じ構造及びＣｌｑに結合する能力を有する核酸リガンド、表３（配列
番号：２１〜４６）に示す核酸リガンドと実質的に同じ構造及びＣ３に結合する
能力を有する核酸リガンド並びに表４（配列番号：４７〜７４）、表５（配列番
号：７６〜８３）、表８（配列番号：７５，１６０〜１６２）、表１０（配列番
号：１６３〜１８９）、表１２（配列番号：１９０〜１９２）、表１３（配列番
号：１９４〜１９６）及び図５Ａ〜Ｂ（配列番号：１６０及び１９３）に示す核
酸リガンドと実質的に同じ構造及びＣ５に結合する能力を有する核酸リガンドも
含む。Ｃｌｑ，Ｃ３又はＣ５に結合する実質的に同じ能力とは、そのアフィニテ
ィーが本明細書に記載されるリガンドのアフィニティーの１又は２オーダーの倍
率以内であることを意味する。本明細書に特に記載される配列と実質的に相同で
ある所定の配列がＣｌｑ，Ｃ３又はＣ５に結合する実質的に同じ能力を有するか
否かを決定することは当業者に公知である。

【００５６】 本発明は、実質的に同じ仮定される構造又は構造モチーフを有する核酸リガン
ドも含む。実質的に同じ構造又は構造モチーフは、Ｚｕｋｅｐｆｏｌｄプログラ
ム（Zucker (1989) Science 244 : 48-52 ) を用いて配列アラインメントにより
仮定することができる。当該技術分野で知られているように、二次構造及び構造
モチーフを予測するために他のコンピュータープログラムを用いることができる
。溶液中の又は結合構造としての核酸リガンドの実質的に同じ構造又は構造モチ
ーフも、当該技術分野で知られているであろうように、ＮＭＲ又は他の技術を用
いて仮定することができる。

【００５７】 核酸の治療、予防及び生体内診断での使用において出くわす１つの潜在的な問
題は、ホスホジエステル型のオリゴヌクレオチドが、要求される効果が顕在化す
る前にエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外酵
素により体液中で迅速に分解され得ることである。核酸リガンドの特定の化学的
改変を行って核酸リガンドの生体内安定性を増加させ又は核酸リガンドのデリバ
リーを媒介することができる。例えば、全体が引用により本明細書に組み込まれ
る、現在、放棄された、“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containins Mo
dified Nucleotides”とのタイトルの１９９３年９月８日に出願された米国特許
出願通し番号０８／１１７，９９１号（米国出願第５，６６０，９８５も参照の
こと）及び“Nucleic Acid Ligand Compliexes”とのタイトルの１９９５年３月
４日に出願された米国特許出願通し番号０８／４３４，４６５号を参照のこと。
本発明に考慮される核酸リガンドの改変は、これらに限らないが、付加的な電荷
、極性、疎水性、水素結合、静電相互作用、及びフラクショナリティーを核酸リ
ガンド塩基又は核酸リガンド全体に組み込む別の化学基を供するものを含む。こ
のような改変は、これらに限らないが、２′−位糖の改変、５−位ピリミジンの
改変、８−位プリンの改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンの置換、５
−ブロモ又は５−イオドーウラシルの置換、骨格の改変、ホスホロチオエート又
はアルキルホスフェートの改変、メチル化、異常な塩基対の組合せ、例えばイソ
ベースイソシチジン及びイソグアニジン等を含む。改変は、キャッピングのよう
な３′及び５′改変も含み得る。

【００５８】 核酸リガンドがＳＥＬＥＸ法により得られる場合、改変は、ＳＥＬＥＸ前又は
後の改変であり得る。ＳＥＬＥＸ前改変は、それらのＳＥＬＥＸ標的についての
特異性及び改良された生体内安定性の両方を有する核酸リガンドを作り出す。２
′−ＯＨ核酸リガンドに行うＳＥＬＥＸ後改変は核酸リガンドの結合能力に逆に
作用することなく生体内安定性を改善する。本発明の核酸リガンドの好ましい改
変は、５′及び３′ホスホロチオエートキャッピング及び／又は３′端の３′−
３′逆ホスホジエステル結合である。１つの好ましい実施形態において、核酸リ
ガンドの好ましい改変は、３′端における３′−３′逆ホスホジエステル結合で
ある。ヌクレオチドのいくつか又は全ての更なる２′−フルオロ（２′−Ｆ）及
び／又は２′−アミノ（２′−ＮＨ₂ ）及び／又は２′−Ｏ−メチル（２′−Ｏ
Ｍｅ）改変が好ましい。２′−ＮＨ₂ 改変され２′−Ｆ改変されてＳＥＬＥＸ法
に組み込まれた核酸リガンドが本明細書に記載される。ＳＥＬＥＸ後改変におい
て２′−ＯＭｅプリンを含むよう改変されたＳＥＬＥＸ法由来の２′−Ｆ改変核
酸リガンドが更に本明細書に記載される。

【００５９】 他の改変は当業者に知られている。このような改変は、ＳＥＬＥＸ後（先に同
定された非改変リガンドの改変）に、ＳＥＬＥＸ法への組込みにより行うことが
できる。 上述の通り、Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に選択的に結合する能力のため、本明細書
に記載されるＣｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する核酸リガンドは医薬として役立つ。
それゆえ、本発明は、補体系タンパク質又は相同性タンパク質に結合することが
できる核酸リガンドの投与により補体系が媒介する疾患を治療するための方法も
含む。特定の病気又は状態、例えばアルツハイマー病又は心筋梗塞はコラーゲン
様領域を介してＣｌｑを活性化する。アルツハイマー病において、β−アミロイ
ドはＣｌｑを活性化する。中間フィラメント、ミトコンドリア膜又はアクチンの
ような心筋梗塞の間にさらされた心筋中の構造はＣｌｑを活性化する。Ｃ３又は
Ｃ５に対する核酸リガンドは、補体系が抗体もしくは非抗体メカニズムによりＣ
ｌｑを介して、又は別の経路を介してＣｌｑと独立して活性化されるか否かにか
かわらず、アルツハイマー病又は心筋梗塞における補体系活性化も阻害し得る。
これにより、本発明の核酸リガンドは、アルツハイマー病又は心筋梗塞を治療す
るのに役立ち得る。

【００６０】 核酸リガンドの治療用組成物は、注入により非経口的に投与することができる
。但し、他の有効な投与形態、例えば動脈内注入、吸入ミスト、経口活性製剤、
経皮イオン導入又は坐剤も想像される。１つの好ましい担体は、生理食塩水であ
るが、他の医薬として許容される担体も用いることができると考えられる。１つ
の好ましい実施形態において、担体及び核酸リガンドは生理学的に適合するゆっ
くり放出する製剤（徐放性製剤）を構成すると考えられる。このような担体中の
主な溶媒は天然で水性又は非水性であり得る。更に、担体は、pH、オスモル濃度
、粘度、透明さ、色、滅菌性、溶解の比率、又は製剤のにおいを改良し又は維持
するための他の薬理的に許容される賦形剤を含み得る。同様に、担体は、リガン
ドの安定性、溶解の比率、遊離又は吸収を改良し又は維持するための他の薬理的
に許容される賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、単位投与又は多重投与形
態における非経口的投与のための投与量を調剤するために通常及び慣用的に用い
られる物質である。

【００６１】 治療用組成物が調剤された後、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、
固体又は脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌容器内に保存することができる。
このような製剤は、直ちに用いる形態で又は投与直前に再構成を要求する形態で
保存することができる。全身デリバリーのための核酸リガンドを含む製剤を投与
する様式は、皮下、筋内、静脈内、鼻内又は膣もしくは直腸坐剤を介してであり
得る。

【００６２】 以下の例は、本発明を説明し、詳述するために供され、本発明を限定すること
を意図しない。これらの例は、Ｃｌｑ，Ｃ３及びＣ５に対する高アフィニティー
ＲＮＡリガンドを同定するためのＳＥＬＥＸ法の使用を記述する。実施例は、実
施例２，３，４及び６に用いる種々の材料及び実験手順を記載する。実施例２は
、Ｃｌｑに対する２′−ＮＨ₂ ＲＮＡリガンドの生成を記載する。実施例３は、
補体系タンパク質Ｃ３の２′−Ｆ核酸リガンドの生体を記載する。実施例４は、
補体系タンパク質Ｃ５の２′−Ｆ核酸リガンドの生成を記載する。実施例５は、
Ｃｌｑリガンドを介しての補体系の活性化を記載する。実施例６は、Ｃｌｑに対
する２′−Ｆ ＲＮＡの形成を記載する。実施例７は、Ｃ５に対する２′−Ｆ
ＲＮＡリガンドについての血液溶解性阻害のためのアッセイを記載する。実施例
８は、ヒトＣ５に対する核酸リガンド（クローンＣ６）によるＣ５ａ放出の阻害
についてのアッセイを記載する。実施例９は、ヒトＣ５に対する核酸リガンドに
ついての最小結合配列を決定するために行った境界実験を記載する。実施例１０
は、テンプレートにおけるランダム配列としてクローンＣ６の４２mer トランケ
ート配列を用いて、核酸リガンドアフィニティーを改良するために行ったＢｉａ
ｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験を記載する。実施例１１は、インターフェレンスアッセ
イにおいてヒトＣ５核酸リガンドにおける２′−ＯＭｅプリン置換の結果を記載
する。実施例１２は、ヒトＣ５に対する核酸リガンドの３８mer ・トランケート
の構造を記載する。実施例１３は、ヒトＣ５に対する２′−ＯＭｅプリン置換化
核酸リガンドの血液溶解アッセイを記載する。

【００６３】 実施例１．実験手順 この例は、Ｃｌｑに対する２′−ＮＨ₂ 及び２′−Ｆ ＲＮＡリガンド並びに
Ｃ３及びＣ５に対する２′−Ｆリガンドの同定のための実施例２，３，４及び６
に従い、それに組み込まれる一般的な手順を供する。 Ａ．生化学品 Ｃｌｑ，Ｃ３，Ｃ５及びＣ４欠失モルモット血清は、Ｑｕｉｄｅｌ（San Dieg
o, CA ) から得た。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ抗ＢＳＡ，ＣＲＰ，
ＳＡＰ及びアミロイドペプチド１〜４０及び１〜４２は、Ｓｉｇｍａ（St. Loui
s, MO ) から得た。ヌクレオチドＧＴＰ，ＡＴＰ、及びデオキシヌクレオチドは
、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Uppsala, Sweden ) から得た。ＴａｑポリメラーゼはＰ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Normalk, CT ) から得た。改変ヌクレオチド２′−Ｎ
Ｈ₂ −ＣＴＰ及び２′−ＮＨ₂ −ＵＴＰ、並びに２′−Ｆ−ＣＴＰ及び２′−Ｆ
−ＵＴＰはJellinekら（1995) Riochem. 34 : 11363 に記載されるように調製し
た。トリ逆転写酵素はLife Science (St. Petersburg. FL) から、Ｔ７ ＲＮＡ
ポリメラーゼはＵＳＢ（Cleveland, OH ）から得た。ニトロセルロースフィルタ
ーはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（Bedford, MA ）から得た。全ての化学物質は利用でき
る最も高いグレードであった。

【００６４】 Ｂ．ＲＮＡ ＳＥＬＥＸ法 ＳＥＬＥＸ法はＳＥＬＥＸ特許出願（Jellinekら（1995) Biochem. 34 : 1136
3 : Jellinekら（1994) Biochem. 33 : 10450 も参照のこと）に詳細に記載され
ている。要約すると、ＤＮＡテンプレートを、Ｔ７プロモーターを含む５′−固
定化領域、次にランダム配列の３０Ｎ又は５０Ｎストレッチ、及び次に３′−固
定化領域で合成した（表１；配列番号：１及び１５６）。初回のＳＥＬＥＸ法の
ために、１ｎモル（約１０¹⁴ユニーク配列）のＲＮＡ（表１；配列番号：２及び
１５７）を、混合ＧＴＰ／ＡＴＰ及び２′−ＮＨ₂ −ＣＴＰ（ＵＴＰ又は２′−
Ｆ−ＣＴＰ／ＵＴＰヌクレオチドを用いて、α−〔³²Ｐ〕−ＡＴＰを加えて、Ｔ
７ポリメラーゼ（Milliganら（1987) Nucleic Acids Res. 12 : 785 ) により試
験管内で転写した。ＳＥＬＥＸ法のこの及び次の回のために、ＲＮＡを、７Ｍ尿
素、１０mM Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ，２mM ＥＤＴＡ，pH８．３ランニング緩
衝液で８％アクリルアミドゲルでの電気泳動により精製した。オートラジオグラ
フィーの後、標識された改変ＲＮＡ転写物を含むバンドを切り出し、−７０℃に
凍結し、次に４００μＬの１００mM ＮａＣｌ，２mM ＥＤＴＡを加え、そのゲ
ルをつぶして、そのスラリーを２cmのガラス−ウール（Rnase-free-Alltech Ass
ociate, Deerfield, IL ）及び２つのニトロセルロースフィルターを介して回転
させた。そのＲＮＡを、１１５容量の６．６Ｍ ＮＨ₂ ＯＡｃ，pH７．７＋２容
量のエタノールを加えることにより沈殿させた。そのペレットを８０％エタノー
ルで２回、洗い、乾燥させた。その乾燥ＲＮＡペレットを、１mM ＭｇＣｌ₂ を
含むリン酸緩衝塩類溶液（ＭｇＰＢＳ）（Sambrookら（1988) Molecular Clonin
g. A laboratory Marual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbo
r, NY ）に溶かした。

【００６５】 ＳＥＬＥＸ法の各々の回について、ＲＮＡをＣｌｑ，Ｃ３又はＣ５と、ＭｇＰ
ＢＳ中で、１０分、３７℃でインキュベートした。次にそのサンプルを４３mmニ
トロセルロースフィルターを介してろ過し、そのフィルターを１０mLのＭｇＰＢ
Ｓで洗った。いくつかの回について、その希釈したＲＮＡを一晩、ニトロセルロ
ースフィルターと共に予め浸漬し、バックグラウンドを減少させた。各々のサン
プルについて結合Ｋｄを測定するために、ＲＮＡ及びＣｌｑ，Ｃ３又はＣ５の両
方の（結合を測定するために適切な範囲にあるよう選択した）より少い量で、ほ
とんどの回について平行して４つのサンプルを走らせた。更に、各々の回におい
て、バックグラウンドを決定するために、ＲＮＡのサンプルをタンパク質なしで
ろ過した。

【００６６】 フィルターを空気乾燥させ、ストリップにスライスし、そして次に６０分、３
７℃で、４００μＬの１％ＳＤＳ，０．５mg／mLプロティナーゼＫ（Boehringer
Mannheim, Indianapolis IN) 、１．５mM ＤＴＴ，１０mM ＥＤＴＡ，０．１
Ｍ Ｔｉｒｓ．pH７．５で、４０μｇのｔＲＮＡ担体を加えて抽出した。ＲＮＡ
水溶液をフェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）、及びクロロホルム
で抽出し、次に上述の通りＮＨ₄ ＯＡｃ／ＥｔＯＨを加えた後に沈殿させた。Ｒ
ＮＡを１時間〜一晩、５０μＬの容量で逆転写させた。そのＤＮＡを、特定のプ
ライマー（表１；配列番号：３〜４）で、５００μＬの容量で１２〜１４サイク
ルでＰＣＲ増幅し、次にフェノール／クロロホルム抽出し、ＮａＯＡｃ／Ｅｔｏ
Ｈ沈殿させた。そのＤＮＡペレットをＨ₂ Ｏにとり、アリコートを、ＳＥＬＥＸ
法の次の回のためにＴ７転写した。

【００６７】 Ｃ．クローニング １２回目及び１４回目からのＤＮＡを、クローニングを容易にするために連結
部位も含むプライマーで増幅した。そのＤＮＡをｐＵＣ９ベクターにクローン化
し、そしてコロニーと、一晩の成長及びプラスミドｍｉｎｉ−ｐｒｅｐｓ（PERF
ECTprep, 5′-3′, Boulder, CO ）について採取した。精製したプラスミドを（
上述のように）もとの５′及び３′プライマーでＰＣＲ増幅し、産物をアガロー
スゲル電気泳動（Sambrookら（1989) Molecular Clonibng. A laboratory Manua
l. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) により分析した
ＤＮＡを、α−〔³²Ｐ〕−ＡＴＰでＴ７転写して結合分析のために放射能標識Ｒ
ＮＡを調製し、阻害研究のために放射能標識なしでＲＮＡを調製した。

【００６８】 Ｄ．シーケンシング ＰＥＲＦＥＣＴｐｒｅｐキットを用いて精製したプラスミドを、ＡＢＩ ｄＲ
ｈｏｃｌａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｉｎｇキット（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で配列決定した。サンプルを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７
ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで配列決定した。

【００６９】 Ｅ．結合アッセイ 個々のクローン化ＤＮＡをα−〔³²Ｐ〕−ＡＴＰでＴ７転写し、全長の〔³²Ｐ
〕−２′−ＮＨ₂ −ＲＮＡ又は２′−Ｆ−ＲＮＡを（上述の通り）ゲルで精製し
た。ＲＮＡを３０μＬサンプル（＜１０pM）当り約５，０００cpm で懸濁し、ア
リコートを３７℃で１０分、ＭｇＰＢＳ中種々の濃度のＣｌｑ，Ｃ３又はＣ５イ
ンキュベートした。次に、サンプルをニトロセルロースを介してろ過し、そのフ
ィルターを緩衝液で洗い、赤外線ランプ下で乾燥させ、シンチレーション液（Ec
oscint A, National Diagnosis, Atlanta, GA ）を加えてカウントした。ＲＮＡ
のバックグラウンドサンプルを平行して走らせた。Ｃｌｑに結合するリガンドの
阻害を測定するために、ＲＮＡ核酸リガンド＋Ｃｌｑ＋インヒビター（例えばＡ
−鎖残基１４〜２６部位、ＳＡＰ、β−アミロイドペプチド（ＲＰ）を３７℃で
１０分、インキュベートし、次にろ過した。フィルターを洗ってカウントした。

【００７０】 Ｃｌｑに結合するＲＮＡリガンドを、Ｃｌｑヘッドグループへのリガンドの結
合をブロックするであろう免疫−複合体の存在下でも測定した。免疫複合体（Ｉ
Ｌ）は、６２０μｇのＢＳＡを、等量で、１mLのウサギ抗−ＢＳＡ（Sigrna, St
. Louis. MO ）＋１％最終濃度まで加えたＰＥＧ８０００と混合し、次にサンプ
ルを４℃で一晩、インキュベートした。そのＩＣを、１０分、１２，０００rpm
でのマイクロフェーゲーションによりペレット化し、ＰＢＳで５回、洗い、そし
て１mLのＭｇＰＢＳに懸濁した。Ｃｌｑ−免疫複合体（Ｃｌｑ−ＩＣ）に結合す
るＣｌｑ ＲＮＡクローンの測定のため、２０μＬの精製〔³²Ｐ〕−ＲＮＡ＋２
０μＬのＩＣをＭｇＰＢＳ＋１％ Ｔｒｉｔｏｎ中１０^-11 〜１０^-7Ｍの種々の
濃度で２０μＬのＣｌｑと混合した。サンプルを３０分、室温でインキュベート
し、遠心し、そしてそのペレット及び上清をカウントした。

【００７１】 Ｆ．溶血アッセイ 補体系消費を記載（Gaither ら（1974) J. Immunol. 113 : 574 ) されるよう
に、Ｃ４溶血アッセイにより測定した。全てのサンプルを希釈し、アッセイを、
カルシウム、マグネシウム及び１％ゼラチンを含むベロナール緩衝塩類溶液（Ｇ
ＶＢ⁺⁺−補体系緩衝液）で行った。β−アミロイドペプチドによるＣ４消費の測
定のために、ペプチドを、２５０μｇ／mLで、全ヒト血清の１１８希釈まで加え
、次に３７℃で６０分、インキュベートした。次にそのサンプルをＣ４溶血活性
のアッセイのために希釈した。Ｃｌｑ ２′−ＮＨ₂ −ＲＮＡクローンによるβ
−アミロイドペプチドが媒介する補体消費の阻害のアッセイのために、Ｃｌｑ
ＲＮＡ核酸リガンドを最初のβ−アミロイドペプチド−全ヒト血清インキュベー
ション混合物中でインキュベートし、次に上述の通りＣ４の量をアッセイした。

【００７２】 Ｃ５核酸リガンドによる補体系阻害を、ヒト血清及び抗体をコートしたヒツジ
赤血球を用いて測定した。赤血球は、新しいヒト血清の１：４０希釈物と、及び
Ｃ５リガンドの連続希釈物と、３７℃で３０分、インキュベートした。血清及び
リガンドの希釈物は、補体緩衝液（先の段落を参照のこと）中に作った。インキ
ュベーションの後、サンプルを、ＥＤＴＡを含む４℃緩衝液で希釈して反応を停
止させ、ヘモグロビン遊離量を４１２nmの光学密度から定量した。

【００７３】 実施例２．Ｃｌｑに対する２′−ＮＨ₂ ＲＮＡリガンド Ａ．ＲＮＡ ＳＥＬＥＸ ２．３μＭのＫｄでニトロセルロースフィルターアッセイによりＣｌｑに結合
したランダム５０Ｎ ７−２′−ＮＨ₂ ＲＮＡのプール。ＳＥＬＥＸ法の１回目
について、Ｃｌｑ濃度は０．１５６〜１．２５μＭであり、ＲＮＡ濃度は１５μ
Ｍであった。ＳＥＬＥＸ法の間、ＲＮＡ濃度をＣｌｑの濃度より約１０倍大きく
維持し、それを１３６pMの最終回１４Ｃｌｑ濃度で各々の回で減少させた。ＲＮ
Ａのニトロセルロースフィルターへのバックグラウンド結合はＳＥＬＥＸ法を通
じて低く維持した。これは、部分的には、ＲＮＡがニトロセルロース膜に予め吸
着したからである。プールＲＮＡのＣｌｑへの結合は各々の回で改善した。進展
した１４回目のプール２′−ＮＨ₂ ＲＮＡはＫｄ＝６７０pMでＣｌｑに結合し、
３４００倍の結合Ｋｄの全体の改善を示した。

【００７４】 次に、バルクＲＮＡを配列決定及び結合の評価のためにクローン化した。０．
１及び０．５mMのＣｌｑでの結合の比較により、個々のクローンを評価し、バッ
クグラウンド上のＣｌｑ結合のクローンを配列決定し、表２に示す（配列番号：
５〜２０）。ファミリー１は１９の全配列のうちの１２を含んだ。ファミリー２
は３つの配列を含んだ。ファミリー３及びファミリー４の両方は２つの配列を含
んだ。ファミリー１及び２の配列は、Ｇの豊富な領域を含み、両方とも、反復配
列モチーフ：ＧＧＡＧ及びＧＧＵＧを有する。ファミリー１メンバーの同一性及
び相同性はＧが豊富な５′半分で最も大きい。Ｃの豊富な３′半分は配列相同性
のある唯一の短いストレッチを有し、これらは大きなギャップ領域を含むことだ
けが示された。全てのファミリーからの配列は広大なワトソン−クリック塩基対
を有するステムループ構造を供するようにホールディングすることができる。最
も高いアフィニティーリガンドのための完全な結合曲線は、２９０pM〜３．９mM
のＫｄ範囲を作り出し；全部の４つの配列のファミリーにおいて高アフィニティ
ーリガンドが見い出された。結合曲線の全ては単相性であった。最大の結合は、
精製の間におこる種々の量の核酸変化のため、１００％ではない。これは、通常
、リガンドはタンパク質に結合し、抽出され、そして次に再び結合し得ることが
知られており、１００％に達する最大結合を供する（データは示さない）。

【００７５】 Ｂ．競合 異なるファミリーからの２′−ＮＨ₂ ＲＮＡリガンドは交差競合（ｃｒｏｓｓ
−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）により示されるように、Ｃｌｑ上の同じ又はオーバ
ーラップする部位と相互作用する。この部位は証拠の２つの線により示されるよ
うに、コラーゲン様領域上に、Ａ−鎖１４〜２６残基部位に又はその近くにある
（Jiang ら (1994) J. Immunol. 152 ：5050）。最初に、ＩＣに結合した時のＣ
ｌｑはまだリガンド＃５０（配列番号：１２）に結合し；イムノグロブリンＦｃ
への結合は、ベッドグループ領域をブロックするが、利用できるコラーゲン様テ
ールを残し、このことは、ＳＥＬＥＸ法由来の核酸リガンドはテールに結合して
いることを示唆する。第２に、及びより直接的に、リガンド＃５０は、ＳＡＰ，
β−アミロイドペプチド及びＣＲＰを含む、Ａ鎖残基１４〜２６部位に結合する
ことが知られているタンパク質と競合する。最後に、リガンド＃５０は、Ａ鎖上
の残基１４〜２６と同じアミノ酸配列を有するペプチドと競合する。この結果は
、以下に記載されるように、溶血阻害についての結果により更に支持される。

【００７６】 Ｃ．消費 ＳＥＬＥＸ法により得られた核酸のＡ鎖１４〜２６アミノ酸部位への結合は、
Ｃｌｑを活性化することができ、又はあるいは、ＳＥＬＥＸ由来核酸リガンドは
、他の分子の結合を阻害し、Ｃｌｑ活性化を防ぐことができた。これは、２′−
ＮＨ₂ ＳＥＬＥＸ由来核酸リガンドとのインキュベーションの後、又は２′−Ｎ
Ｈ₂ 核酸リガンドと一緒の周知のＣｌｑアクティベーターとのインキュベーショ
ンの後に血清中のＣ４消費を測定することによりテストした。血清中でインキュ
ベートした時のＳＥＬＥＸ由来核酸リガンドはＣ４を消費せず、これによりＣｌ
ｑアクティベーターである。これらのリガンドはこの濃度で抗体をコートしたヒ
ツジ赤血球の血清溶解を阻害もせず、それは、リガンドがＣｌｑヘッドグループ
近くに結合したならおこるであろう（データは示さない）。そのリガンドは、別
のＣｌｑアクティベーター、β−アミロイド１〜４０ペプチドによるＣ４消費を
阻害する。このペプチドは、Ａ鎖１４〜２６残基部位での結合を介してＣｌｑを
活性化することが知られており；それゆえこの阻害は、ＳＥＬＥＸ由来核酸リガ
ンドがこのＡ鎖部位で結合することを確認する。ニトロセルロースアッセイによ
りＣｌｑに結合しなかったＳＥＬＥＸ法からの対照リガンドは、β−アミロイド
１〜４０ペプチドＣｌｑ活性化をブロックすることにおいても有効でなかった。

【００７７】 実施例３．補体系タンパク質Ｃ３の２′−フルオロ核酸リガンド 補体タンパク質Ｃ３に対するリガンドを作り出すために、所定の配列に隣接し
た連続ランダム配列の３０ヌクレオチドを含む約１０¹⁴のＲＮＡのライブラリー
を作った。この実験において、最初の候補混合物の３０Ｎランダムヌクレオチド
は２′−Ｆピリミジン塩基から構成された。選択及び増幅のラウンドを、当該分
野で周知の技術を用いて実施例１に記載される通り行った。１回目において、３
０Ｎ７−２′−Ｆ−ＲＮＡ及びＣ３を両方とも、３μＭでインキュベートした。
このラウンドで、わずかに検出できる結合が存在した。ＲＮＡ及びＣ３濃縮物の
両方はＳＥＬＥＸ法の間、減少した。ＳＥＬＥＸ法由来の配列を表３（配列番号
：２１〜４６）に示す。

【００７８】 実施例４．補体系タンパク質Ｃ５の２′−フルオロ核酸リガンド ヒト補体タンパク質Ｃ５に対するリガンドを作り出すために、所定の配列に隣
接した連続ランダム配列の３０ヌクレオチドを含む約１０¹⁴ＲＮＡのライブラリ
ーを作った。この実験において、最初の候補混合物の３０Ｎランダムヌクレオチ
ドは２′−Ｆピリミジン塩基から構成された。要約すると、ＤＮＡテンプレート
を、Ｔ７プロモーターを含む５′−固定化領域、次にランダム配列の３０Ｎスト
レッチ、及び次に３′−固定化領域（表１：配列番号：１）で合成した。選択及
び増幅のラウンドは、当該分野で知られた技術を用いて、実施例１に記載される
通り行った。ＳＥＬＥＸ実験の最初の回は、Ｃ５の選択されていないＲＮＡへの
結合が極めて低いので、２′−Ｆ ＲＮＡ（７．５μＭ）及びタンパク質（３μ
Ｍ）の高い濃度で設定した。ＳＥＬＥＸ実験を、Ｃ５ａ−Ｃ５ｂ開裂部位でのＲ
ＮＡの結合を促進するようにデザインした。ＲＮＡ及びＣ５を、Ｃ５の限定され
たトリプシン処理が単一部位での開裂を作り出し、Ｃ５ａ様活性を作り出すとの
推論（Wetsel又はKolb (1983) J. Exp. Med 157 ：2029）で、少量のトリプシン
と一緒にインキュベートした。この開裂は、ランダムＲＮＡ結合のわずかな増加
を導いた。Ｃ５ａ様ドメインの露出と構造的に関連したＲＮＡ結合の増強は、Ｃ
５コンバターゼ部位近くに結合する核酸リガンドを進化させることができ、Ｃ５
開裂を妨害し又は阻害することができた。ＳＥＬＥＸ実験は、核酸リガンド進化
が最も高いアフィニティー勝者を選び出すであろうように、ネイティブ及び軽く
トリプシン処理したタンパク質の両方に対して同時に行った。この手順で、多重
タンパク質種に対する最も高いアフィニティー勝者が進化するであろうし、多重
アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）及び特定のアプタマーが１回のＳＥＬＥＸ実験か
ら得られるであろう。

【００７９】 ＳＥＬＥＸ法の各々の回について、緩衝液のみ又は０．３〜０．０００１mg／
mLのトリプシンを添加して約５倍過剰のＲＮＡで別個のチューブで平行してその
方法を行った。サンプルを３７℃で４５分、ＭｇＰＢＳ中でインキュベートし、
次にニトロセルロースを介してろ過した。そのフィルターを洗い、乾燥させてカ
ウントし、抽出し、逆転写し、次にＰＣＲ増幅し、最後に混合ＧＴＰＩＡＴＰ及
び２′−Ｆ−ＣＴＰ／ＵＴＰヌクレオチド及び−〔³²Ｐ〕−ＡＴＰを用いて試験
管内でＲＮＡにＴ７転写した。ＲＮＡを、７Ｍ尿素及びＴｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ
ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＢＥ）での８％アクリルアミドゲルでの電気泳動により精
製した。ＲＮＡを単離し、ＮＨ₄ ＯＡｃ／エタノールで沈殿させ、次に１nm Ｍ
ｇＣｌ₂ を含むリン酸緩衝塩類溶液（ＭｇＰＢＳ）に溶かした。最も高い結合フ
ィルターが先に運ばれた。各々のラウンドの終りに、（トリプシンあり又はなし
の）タンパク質に結合したＲＮＡの全てをプールした。各々のラウンドのタンパ
ク質及びＲＮＡ濃度は、２．５nm及び１０nmの最終濃度で各々減少した。トリプ
シンは、０．３〜０．０００１μｇ／mLの濃度で加えた。バックグラウンド結合
を各々のラウンドでモニターし、４ラウンド目に、バックグラウンドを減少させ
るためにＳＥＬＥＸラウンドの前に、転写されたＲＮＡをニトロセルロースフィ
ルターに一晩、予め浸漬した。

【００８０】 ニトロセルロースアッセイによるネイティブＣ５へのＲＮＡの結合に基づいて
、ラウンド１２のＤＮＡをクローン化し、表４（配列番号：４７〜７４）に示す
ような配列を得た。配列を相同性及び機能に従ってグループ化した。グループＩ
配列は高い相同性であり、単一のもとの配列からのＰＣＲ変異により生じ得る。
グループＩ核酸リガンドの結合アフィニティーは極めて類似しており、これを表
７に示す。グループII核酸リガンドは、一般に、グループＩ核酸リガンドと同様
のアフィニティーで結合する。但し、いくつかの弱い結合物も存在する。グルー
プII配列及び長さはグループＩ核酸リガンドより多様である。Ｃ５核酸リガンド
は、Ｃｌｑ，Ｃ３、又は因子Ｂ，ＨもしくはＤを含む他の補体成分に結合しない
。

【００８１】 各々のファミリーからの核酸リガンドを、ラット補体系活性の阻害についても
アッセイした（表５；配列番号：７６〜８３）。ファミリーＩ及びファミリーII
I からの核酸リガンドはラット補体を、阻害したが、ファミリーIIからの核酸リ
ガンドはそうでなかった。これらに限らないが、重症筋無力症、心筋梗塞、糸球
体腎炎、ＡＲＤＳ、関節炎及び移植を含む、種々のラットの病気モデルで補体系
活性化を阻害するために、阻害性核酸リガンドを用いることができる。

【００８２】 実施例５．Ｃｌｑ核酸リガンドを介する補体系の活性化 オリゴヌクレオチドは古典的及び別の経路の両方を活性化することができる。
特に、Ｇ−４組構造を形成することができ、かつＣｌｑコラーゲン様領域と相互
作用することができるポリＧオリゴヌクレオチドは、高分子量凝集物を形成する
ことができ、それらは両方とも、Ｃｌｑ結合し、それを活性化する。ホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチドと比べて不特異的結合が増加したホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド、特にポリＧ含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは
効率的な補体系アクティベーターでもある。溶液相補体のオリゴヌクレオチド活
性化についての結果を以下に示す。ここでは、古典的（Ｃｌａｓｓ）経路活性化
はＥＬＩＳＡ（Quidel, San Diego, CA ）によるＣ４ｄフラグメントの遊離によ
り測定し、そして別の（Ａｌｔｅｒｎ．）経路の活性化は、Ｂｂ ＥＬＩＳＡ（
Quidel, San Diego, CA ）により測定した。これらの経路は別個であるが、両方
の経路のオリゴヌクレオチド活性化がＣｌｑ依存性であることを示唆する証拠が
ある。

【００８３】

【表１】

【００８４】 補体系活性化は、赤血球膜上でも始まり、溶血アッセイによりテストされる。
２′−ＯＨポリ−Ｇ及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む周知のア
クティベーター、及び多量化Ｃｌｑ核酸リガンド及び小さな（例えば１５mer ）
２′−Ｆポリ−Ｇオリゴヌクレオチドのような潜在的なアクティベーターをヒツ
ジ赤血球上にコートし、次に血清補体による赤血球の溶解を測定する。オリゴヌ
クレオチド及び核酸リガンドを細胞上にコートする方法には、受動的吸収、化学
的コンジュゲーション、ストレプトアビジン−ビオチンカップリング及び特定の
核酸結合がある。新しいラット又はヒト血清での処理の後、補体成分の細胞上へ
の析出、膜損傷及び溶解は、当業者に周知であろう標準的な方法により測定され
る。

【００８５】 Ａ．Ｃｌｑ核酸リガンドの凝集 Ｃｌｑ核酸リガンドを種々の長さの化学的架橋剤を用いて二量体化した。ある
いは、核酸リガンド単量体をビオチニル化し、次にストレプトアビジンで多量体
化した。これらの多量体の各々を補体活性化及び赤血球の溶解についてテストし
た。

【００８６】 Ｃｌｑ核酸リガンドへのポリＧ配列の付加は、更なる結合能を供し、オリゴヌ
クレオチドが補体系を活性化する能力を増加させた。更に、個々のＣｌｑ核酸リ
ガンド上の短いポリＧ配列は、相互作用してより高次の構造を形成することがで
き、それは、Ｃｌｑ核酸リガンドを多量体化して活性化を引きおこすよう機能す
る。

【００８７】 Ｂ．赤血球及び白血球の溶解 赤血球溶解を促進する核酸リガンドを、白血球及び腫瘍細胞を含む有核細胞で
テストする。有核細胞は、赤血球が欠如する補体耐性のメカニズムを有する。例
えば、有核細胞は、抗原を隔離して、補体成分を含む膜ベシクルろ胞化し、赤血
球と比べて高いレベルの補体インヒビターを発現し、最初の補体攻撃に基づく保
護メカニズムを上昇制御することができる。高レベルの活性化は細胞殺害のため
に重要であるので、補体系成分析出の量及び膜損傷の程度についてアクティベー
ターが比較される。また、腫瘍細胞及びリンパ球の異なる型及びソースが、感受
性か細胞型特異的であるか否かを決定するためにテストされる。

【００８８】 核酸リガンドは、ＳＥＬＥＸ特許出願に記載されるように、本質的にいずれの
標的についても作り出すことができる。Ｌ−セレクチンに対する核酸リガンドは
形成されている（“High Affinity Nucleic Acid Ligands to Lectins ”とのタ
イトルの１９９５年６月７日に出願された米国特許出願通し番号０８／４７９，
７２４号、現在の米国特許５，７８０，２２８号（その全体は引用により本明細
書に組み込まれる）を参照のこと）。レクチン媒介機能の多様性は、レクチンア
ンタゴニストについての広範囲の潜在的な治療標的を供する。例えば、哺乳動物
セレクチンに対するアンタゴニスト、内在性炭水化物結合レクチンのファミリー
は、種々の白血球が媒介する病状において治療的適用性を有し得る。そのレセプ
ターに結合するセレクチンの阻害は、細胞接着ブロックし、結果として、炎症、
凝血、移植拒絶、腫瘍転移、慢性関節リウマチ、再灌流傷害、発作、心筋梗塞、
火傷、乾癬、多発性硬化症、細菌性敗血症、血液量減少性ショック及び外傷性シ
ョック、急性肺傷害及びＡＲＤＳを治療するのに役立ち得る。Ｃｌｑ核酸リガン
ドのＬ−セレクチン核酸リガンドへのカップリングは、標的での細胞殺害を促進
することにより、Ｌ−セレクチン核酸リガンドをより効率的にする。Ｃｌｑ核酸
リガンドはＬ−セレクチン核酸リガンドにカップリングされ、そのコンジュゲー
トは上述の通り白血球溶解についてテストされる。また、他の細胞表面標的に対
する核酸リガンド、それら自体では補体を活性化しない全ての標的に対する抗体
、サイトカイン、成長因子、又は細胞レセプターに対するリガンドは、Ｃｌｑ核
酸リガンドにカップリングさせて、細胞殺害のために用いることができよう。

【００８９】 Ｃ．補体活性化の生体内テスト 核酸リガンドが媒介する補体系活性化を、生体内核酸リガンド作用を評価する
ために動物においてテストした。赤血球及び／又はリンパ球を核酸リガンドでコ
ートし、ラットに注入して生体内の細胞殺害及び溶解をテストする。核酸リガン
ドの活性化は、補体系を活性化しないＭｏＡｂにもつながっており、ここでその
抗体はラット細胞抗原（例えばリンパ球抗原）に対するものである。次に、これ
らの細胞を核酸リガンド−抗体コンジュゲートでコートし、ラットに注入した。
あるいは、核酸リガンド−抗体コンジュゲートをラットに直接、注入し、次に生
体内白血球殺害を測定する。

【００９０】 Ｃｌｑ核酸リガンドが非ヒトＣｌｑと交差反応することも可能であり、非ヒト
Ｃｌｑは生体内アッセイのために用いることができよう。Ｃｌｑ核酸リガンドは
、マウス、ラット及びウサギＣｌｑのような種に対してテストする。Ｃｌｑは血
清から精製し、Ｃｌｑ核酸リガンドとの交差反応をニトロセルロース結合アッセ
イによりテストする。あるいは、Ｃｌｑは、血清に加えられた免疫複合体に結合
し、次にその凝集物へのＣｌｑ核酸リガンド結合をテストする。核酸リガンドが
種特異的であるなら、ラット血清はＩｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでの連続的
灌流によりラットＣｌｑを涸濁し、そしてその血清は当業者に周知の方法により
ヒトＣｌｑで再構成される。これらの再構成された動物は、次に標的の補体系活
性化及び細胞殺害についてＣｌｑ核酸リガンドをテストするのに用いられる。

【００９１】 実施例６．補体系タンパク質Ｃｌｑの２′−フルオロＲＮＡリガンド Ａ．ＲＮＡ ＳＥＬＥＸ ランダム３０Ｎ７−２′−Ｆ ＲＮＡのプールは２．３μＭのＫｄでニトロセ
ルロースフィルターアッセイによりＣｌｑに結合した。ＳＥＬＥＸ法の１回目に
ついて、Ｃｌｑ濃度は０．１５６〜１．２５μＭであり、ＲＮＡ濃度は１５μＭ
であった。ＳＥＬＥＸ法全体を通してＲＮＡ濃度はＣｌｑの濃度より約１０倍高
く維持し、それは１３６pMの最終日１４Ｃｌｑ濃度に各々の回に減少させた。Ｒ
ＮＡのニトロセルロースフィルターへのバックグラウンド結合はＳＥＬＥＸ法全
体を通して低く維持した。それは、部分的には、ＲＮＡがニトロセルロースに予
め吸着していたからである。プールＲＮＡのＣｌｑへの結合は各々の回で改善し
た。進化したラウンド１４のプール２′−Ｆ ＲＮＡは２mMのＫｄでＣｌｑに結
合し、１〜３０００倍の結合Ｋｄの全体の改善があった。

【００９２】 次にバルクＲＮＡを配列決定及び結合の評価のためにクローン化した。０．１
及び０．５mMのＣｌｑでの結合の比較を介して、個々のクローンを結合アフィニ
ティーについてランク付けした。２′−Ｆ ＲＮＡリガンドの配列を表６（配列
番号：８９〜１５５）に示す。２′−Ｆ−ＲＮＡ配列は、ファミリーに容易に分
類されないが、これらの配列はＧが豊富で類似しているが、実施例２に記載され
る２′−ＮＨ₂ ＲＮＡ配列と相同でない。

【００９３】 実施例７．Ｃ５に対する２′−Ｆ ＲＮＡリガンドについての溶血阻害 Ｃ５に対する２′−Ｆ ＲＮＡ核酸リガンド（実施例４）を、抗体をコートし
たヒツジ赤血球のヒト血清溶解のための標準的アッセイに希釈物を含めることに
より、溶血阻害についてアッセイした。ヒツジ細胞を、核酸又は緩衝液を含む血
清の１：４０希釈物と混合し、３７℃で３０分、インキュベートした。冷ＥＤＴ
Ａ緩衝液でクエンチングした後、サンプルを回転させ、上清をＯＤ４１２nmで読
みとった。グループは核酸リガンドは６０〜１００mMのＫｉで、１μＭでほぼバ
ックグラウンドに阻害した。結果を図１に示す。溶血阻害アッセイの結果は、Ｃ
５に対する２′−Ｆ ＲＮＡ核酸リガンドがＣ５上の特定の部位を標的にし、こ
こでそれらは補体Ｃ５コンバターゼとのＣ５の相互作用をブロックすることを示
唆する。これらの結果は、２′−Ｆ ＲＮＡ核酸リガンドが血清中で安定である
ことも確認した。

【００９４】 実施例８．Ｃ５の遊離の阻害 Ｃ５の開裂を阻害する核酸リガンド−Ｃ５相互作用はＣ５ｂ及びＭＡＣアセン
ブリーの形成を防ぐであろう。Ｃ５開裂の阻害はＣ５ａ遊離も阻害するはずであ
り、これは、クローンＣ６（配列番号：５１）（実施例４）での以下の実験で示
された。この実験のために、クローンＣ６の希釈物を、ザイモサンを加えたＧＶ
Ｂ⁺⁺（カルシウム、マグネシウム及び１％ゼラチンを含むベロナール緩衝塩類溶
液）中全ヒト血清とインキュベートした。次にサンプルをＥＤＴＡ−緩衝液でク
エンチングし、回転させ、上清をラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Wagner及び
Hugli (1984) Anal. Biochem. 136 ：75）によりＣ５ａについてアッセイした。
結果は、クローンＣ６は約１００nMのＫｉでＣ５ａ遊離を阻害した（図５）が、
対照ランダムプールＲＮＡは阻害を与えない（データは示さない）ことを示した
。このアッセイは、クローンＣ６の血清安定性も証明した。

【００９５】 実施例９．クローンＣ６の境界 最小結合配列の決定のためにクローンＣ６（配列番号：５１）（実施例４）を
選択した。これは以下の２つの方法で行った。 １）クローンＣ６のＣ５への結合のために要求される最小ＲＮＡ配列（５′及
び３′境界）を、クローンＣ６を部分的に加水分解しそしてタンパク質結合を測
定することにより決定した（Green ら (1995) Chem, Biol. 2 ：683 ）。要約す
ると、クローンＣ６を、（３′境界を決定するために）標識した５′−〔³²Ｐ〕
−キナーゼ又は（５′境界を決定するために）標識した３′−〔³²Ｐ〕−ｐＣｐ
として合成し、オリゴヌクレオチドを精製した。次に、そのオリゴヌクレオチド
をアルカリ加水分解にかけた。それは、オリゴヌクレオチドを３′端からプリン
塩基に開裂する。次に、部分的に加水分解したＲＮＡをＣ５とインキュベートし
、Ｃ５タンパク質に結合したＲＮＡをニトロセルロースで分画し、そのタンパク
質から溶出した。ＲＮＡラダーと一緒に、分画したＲＮＡを８％アクリルアミド
／７Ｍ尿素シーケンシングゲルにかけた。１つの更なる塩基の除去が結合を減少
させ又は排除するであろう境界を、選択されたＲＮＡ（Ｃ５に結合したＲＮＡ）
対非選択ＲＮＡ（Ｃ５に結合しないＲＮＡ）の比較により決定した。

【００９６】 標識したＲＮＡを、（オリゴヌクレオチドを３′端からＡ残基に開裂する）Ｔ ₁ ヌクレアーゼで消化し、Ｃ５とインキュベートし、そして第２のラダーのため
に、上述の通り分画した。図３Ａは５′−キナーゼ標識化ＲＮＡの消化の結果を
示す。この図において、３′−配列（５′端標識化）はアルカリ加水分解ラダー
とアラインされる。左側はＴ₁ ラダーであり、右側は５×及び１×濃度のＣ５で
選択したＲＮＡである。塩基の除去が結合を排除する境界を矢印で示す。アスタ
リスクはＴ₁ に対して超高感度であるＧを示す。最小配列中の他のＧヌクレオチ
ドはＴ₁ 消化から保護される。図３Ｂは、３′−ｐＣｐ−連結化ＲＮＡの結果を
示す。この図において、５′−配列（３′末端標識）はアラニン加水分解ラダー
とアラインする。Ｔ、及びタンパク質レーン、境界及び超感受性Ｇヌクレオチド
は図３Ａに記載される。

【００９７】 ２）第２の実験において上述の境界実験から得られた結果を用いて、Ｃ５に対
する合成したトランケートされた核酸リガンドを作製した。３４〜４２ヌクレオ
チドのいくつかのトランケートを、クローンＣ６（配列番号：５１）の両端の残
基を除去することにより合成し、Ｃ５結合についてアッセイした（表８）。Ｃ５
に結合した最も短いオリゴヌクレオチドは３８mer （配列番号：１６０）であり
、これは、境界ゲルを確認し、更なる核酸リガンド開発のための予備的構造を供
する。最小３８mer 配列において、３０塩基はランダム領域起源であり、８塩基
はクローンＣ６の５′固定化領域からのものであった。３６mer （配列番号：１
６）を作り出すための３８mer の５′及び３′末端の両方からの塩基の除去は結
合を減少させた。３４mer （配列番号：１６２）は結合しなかった。内部欠失の
ある他のトランケートされたオリゴヌクレオチドも結合しなかった。

【００９８】 実施例１０．Ｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ 核酸リガンドアフィニティーを改良するため及びその構造を更に規定するため
にｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ法を行った。実施例９（表８）からの４２mer トラ
ンケート（配列番号：７５）をＢｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験のためのテンプレ
ートとして用いた。新しいｎ８固定化領域に隣接した４２Ｎランダム領域を含む
合成テンプレート（表１０；配列番号：１６３）を作製し、合成した（Oligos,
Etc., CT）。ここでそのランダム領域は最初のＳＥＬＥＸ実験からのクローンＣ
６の４２mer トランケートにかたよらせた。４つの余分な塩基が末端のヘリック
スを伸長させたので、最小３８mer 配列でなく４２mer ランダム領域を選択した
。いずれの理論にも結びつけるつもりはないが、本発明者らは、これらの４つの
余分な塩基は結合のために本質的ではないが、核酸リガンド構造を選択すること
において及び新しく選択された核酸リガンド構造における固定化領域の可能な使
用を最小にすることにおいて、より長いヘリックスが要求されると考えられる。
ランダム領域内の各々の塩基を、４２mer 配列中の塩基に対応する塩基の０．６
７モル画分及び他の３つの塩基の各々の０．１２５モル画分を含むように合成し
た。Ｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験を、実施例１の標準的ＳＥＬＥＸ実験につい
て記載される通り行った。ＰＣＲ増幅は、表１（配列番号：１５８〜１５９）に
示すプライマーを用いて行った。

【００９９】 Ｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験は、クローンＣ６は既に溶血を阻害し、結合の
ためにトリプシン処理が要求されないので、ネイティブＣ５タンパク質で行った
。出発ＲＮＡプールのＣ５への結合は極めて低かったので、タンパク質及びＲＮ
Ａ濃度は最初のＳＥＬＥＸ実験と同様に、各々２．６μＭ各々７．１μＭで始め
た。結合は、ラウンド３で迅速に改善した。ＲＮＡ及びタンパク質濃縮物は、各
々６２．５pM及び３１pMのラウンド９まで、最終濃度まで各々の次のラウンドで
次第に減少させた。ＲＮＡプールのＣ５への結合は、ＳＥＬＥＸ実験からのＲＮ
Ａプールについて約１００nMであることと比較して約５nMであった（表９）。プ
ールのアフィニティーにおける改善のいくつかは低アフィニティーリガンド、サ
イズ変異及びバックグラウンド結合体の欠如から生じ、これらはこのより迅速な
ＳＥＬＥＸ実験の間、評価できる濃度まで形成されなかった。

【０１００】 ８ラウンドのＢｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ方法の後のＲＮＡプールは、最初のＳ
ＥＬＥＸ実験からのラウンド１２のプールより２０〜５０倍、改善された。ラン
ダムプールからの８ラウンドのＢｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ法からのプールへの全
体の改善は１０⁵ 倍を超えると評価される。Ｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験から
の単離され、クローン化された配列を表１０（配列番号：１６４〜１８９）に示
す。表１０に示す配列において、結合のために、要求される２つの塩基対ステム
は最小３８mer 配列から別個である。これらの塩基はそのステムを維持すること
を除いて選択圧力を示さない。もとのテンプレート配列に正確に適合する配列は
ない。

【０１０１】 Ｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験からのクローンをアッセイした。この代表的な
結合アフィニティーを表１１に示す。１０〜２０nMのＫ_b で結合したほとんどの
クローンはテンプレート（配列番号：１６３）より高いアフィニティーの結合リ
ガンドである。クローンの１つ、ＹＬ−１３（配列番号：１７５）は、Ｂｉａｓ
ｅｄ ＳＥＬＥＸ実験からの他のクローンより約５倍高いアフィニティーで、及
びクローンＣ６（配列番号：５１）より約１０倍高いアフィニティーで結合した
。Ｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験においてテンプレートのために用いた配列に正
確に適合した核酸リガンド配列はなかった。いくかの塩基置換はこのＢｉａｓｅ
ｄ ＳＥＬＥＸ実験配列セットに特有であり、核酸リガンドアフィニティーの増
加を説明し得る。

【０１０２】 実施例１１．ヌクレアーゼ保護のための２′−Ｏ−メチル置換 核酸リガンドを更に安定化するために、２′−ＯＨ−プリンヌクレオチドをヌ
クレアーゼ耐性２′−Ｏ−メチルヌクレオシドで置換できる位置を決定した。２
′−Ｏ−メチルインターフェレンスについていくつかの位置を同時にテストする
ためのアッセイを、Green ら(1995) Chem. Biol. 2 :683 に記載される方法の後
に用いた。

【０１０３】 ２′−Ｏ−メチルインターフェレンスアッセイにおいて、Ｂｉａｓｅｄ ＳＥ
ＬＥＸ実験からの配列ＹＬ−１３（配列番号：１７５）の３８mer トランケート
に基づくオリゴヌクレオチドの３つのセットを合成した。表１２にＭ３０１０（
配列番号：１９０）、Ｍ３０２０（配列番号：１９１）及びＭ３０３０（配列番
号：１９２）として示すこれらの配列のセットを、表１２にボールド下線で示す
ヌクレオチドの各々を２′−ＯＨ−ヌクレオチドとして５０％及び２′−ＯＭｅ
−置換化ヌクレオチドとして５０％、合成する様式で自動ＲＮＡシンセサイザー
で合成した。これは、Ｍ３０１０，Ｍ３０２０及びＭ３０３０のセットの各々に
ついて２５又は３２の異なる配列の混合物を作り出した。

【０１０４】 部分的に置換した２′−ＯＭｅオリゴヌクレオチドを５′−〔³²Ｐ〕−キナー
ゼで標識した。オリゴヌクレオチドを１００nM及び１０nMのＣ５で選択し、タン
パク質への結合はバックグラウンドフィルター結合より１０倍、大きかった。オ
リゴヌクレオチドをタンパク質から溶出し、アルカリ加水分解し、次に２０％ア
クリルアミド／７Ｍ尿素／ＴＢＥシーケンシングゲルに走らせた。隣接トラック
上に、Ｃ５で選択されないオリゴヌクレオチドを走らせた。バンドの強度をＩｎ
ｓｔａｎｔ Ｉｎａｇｅｎ（Packard, Meriden. CT）で定量化した。これらのオ
リゴヌクレオチドがアクリルアミドゲル上で分離した時、その混合ＯＨ・ＯＭｅ
位置は、全て２′−ＯＨ位置の５０％強度までを示した。なぜなら２′−ＯＭｅ
は加水分解に対して耐性だからである。２′−Ｆピリミジンも耐性であり、ゲル
上で示されない。

【０１０５】 各々の位置について、（タンパク質結合により選択されたバンドの強度）／（
タンパク質に対して選択されなかったオリゴヌクレオチドについてのバンド強度
）の比を計算した。これらの比をヌクレオチド位置に対してプロットし、直線適
合を決定した（図４、白抜き円）。同じ計算を、混合２′−ＯＨ／２′−ＯＭｅ
オリゴヌクレオチドについて行い、これらの比を先に決定された曲線と比べた（
図４、黒ぬり円）。２′−ＯＭｅ置換が結合を妨害しない場合、その比は２′−
ＯＨ比の標準偏差内であった。しかしながら、２′−ＯＭｅ置換が結合を妨害し
た場合、２′−ＯＨプリンについての結合選択はその比を増加させた。位置１６
及び３２での２つのヌクレオチドが２′−ＯＨヌクレオチドを要求すると決定さ
れた。別個に、残基ｇ５は２′−ＯＨを要求すると独立に決定され、残基Ｇ２０
は２′−ＯＭｅ置換を許容すると決定され、そしてこれらをレーンを標準化する
のに用いた。これらの結果を、２′−ＯＭｅ置換化オリゴヌクレオチドの合成及
びアッセイにより確認した。必須の２′−ＯＨ位置は、２つのバルジ（ｂｕｌｇ
ｅ）のうちの１つの中に、又は予想されるホールディング構造内のループの中に
あり、このことは、これらの特徴がタンパク質相互作用に関連していることを示
唆する。許容される２′−ＯＭｅ位置を決定した後、置換化オリゴヌクレオチド
を合成し、相対的結合アフィニティーを測定した。

【０１０６】 実施例１２．ヒトＣ５核酸リガンド構造 別の塩基と一緒のクローンＣ６の３８mer トランケートについての、トランケ
ーション実験、ヌクレアーゼ感度、Ｂｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験からの塩基置
換パターン、及び２′−ＯＭｅ置換に基づく予想されるホールディング及び塩基
対形成を図５Ａに示す。その塩基配列は３８mer トランケート（配列番号：１６
０）である。括弧内は最初のＳＥＬＥＸ実験からの変異体である。ブラケット内
はＢｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験からの変異体である。小文字の塩基は最初のＳ
ＥＬＥＸ実験からの５′ｎ７固定化領域由来である。大文字の塩基はもとのラン
ダム領域由来である。

【０１０７】 ステム・ループ構造は、１２〜１４塩基対を有する：ａ）提唱される５′，３
′−末端塩基対（ｃ１〜ａ３及びＵ３６〜Ｇ３８）；ｂ）ステムループ塩基対（
Ｕ１１〜Ｕ１４及びＧ２４〜Ａ２７）はＢｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ法の間の共変
の変化により支持され；及びｃ）全般に保存された中部ステム（ｇ７〜Ｃ１０及
びＧ２８〜Ｃ３４）、不変であるＵ９〜Ａ３２及びＢｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ法
の間、保存されたｇ８〜Ｃ３３。ｕ４→ｃ４変化は結合を改善し、この変化はＢ
ｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験からの全てのクローンにおいて見い出され、そして
Ｇ２９，Ａ２９変異体はＢｉａｓｅｄ ＳＥＬＥＸ実験からのクローンにおいて
のみ見い出される。

【０１０８】 ＵＵＵバルジは全般に保存される。１つのもとの配列は結合が減少しない２つ
のＵ塩基を含み、１つの塩基の置換を有する２つの核酸リガンドはＢｉａｓｅｄ
ＳＥＬＥＸ実験の間に見い出された。ＵＵＵ−バルジの後のＣ１０−Ｇ２８塩
基対は保存される。この保存されたバルジ及びステムを有する領域はタンパク質
相互作用の関連するようである。ステムループＧ１５〜Ｕ２３は、塩基１９を除
いて高度に保存される。

【０１０９】 ２′−ＯＭｅ置換パターンはこの構造と一致する（配列番号：１９３；図５Ｂ
）。２′−ＯＭｅ置換を行うことができる位置をボールドで示す。２′−ＯＨで
なければならない３′の位置を下線で示す。ｇ５，Ｇ１７及びＡ３２における必
須の２′−ＯＨは、タンパク質結合のために要求される特有の３次元構造を形成
し得るバルジ又はハープ領域内にある。２′−ＯＭｅ置換について許容される位
置は、標準的ヘリックス配列がよりもっともらしいステム領域内にある。

【０１１０】 実施例１３．ヒトＣ５に対する２′−ＯＭｅ−置換化核酸リガンドの溶血アッ セイ 溶血阻害への２′−ＯＭｅ置換の効果を比較するために、Ｂｉａｓｅｄ ＳＥ
ＬＥＸ実験からのクローンＹＬ−１３に基づいて３つのオリゴヌクレオチドを合
成した：（１）全てのヌクレオチドが２′−ＯＨである３８mer トランケートＢ
２０１０（配列番号：１９４）；（２）１つのヌクレオチド（位置２０）が２′
−ＯＭｅ−Ｇである３８mer （Ｂ２０７０；配列番号：１９５）；及び（３）許
容される位置（位置２，７，８，１３，１４，１５，２０，２１，２２，２６，
２７，２８，３６及び３８）の最大数を表１３に示す通り２′−ＯＭｅ−Ｇ及び
２′−ＯＭｅ−Ａとして合成した３８mer （Ｍ６０４０；配列番号：１９６）。
これらは実施例７に記載されるように溶血アッセイにおいてアッセイした。結果
を図６に示す。図６に示す通り、Ｋｉは２′−Ｏ−Ｍｅ置換の増加と共に減少し
た。Ｋ_d はわずかに優れていた（データは示さない）。この実験は、核酸リガン
ド安定性は２′−ＯＭｅ置換に伴い増加すること、及び補体系の長期の生体内阻
害は実行可能であることを示した。

【０１１１】

【表２】

【０１１２】

【表３】

【０１１３】

【表４】

【０１１４】

【表５】

【０１１５】

【表６】

【０１１６】

【表７】

【０１１７】

【表８】

【０１１８】

【表９】

【０１１９】

【表１０】

【０１２０】

【表１１】

【０１２１】

【表１２】

【０１２２】

【表１３】

【０１２３】

【表１４】

【０１２４】

【表１５】

【０１２５】

【表１６】

【０１２６】

【表１７】

【０１２７】

【表１８】

【０１２８】

【表１９】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＣ５に対する２′−Ｆ ＲＮＡリガンドＣ１２（配列番号：５９）、Ａ６
（配列番号：４８）、Ｋ７（配列番号：５０）、Ｃ９（配列番号：５８）、Ｅ５
ｃ（配列番号：４７）及びＦ８（配列番号：４９）を抗体でコートしたヒト赤血
球及び全ヒト血清とインキュベートしたインキュベーションアッセイの結果を示
す。結果は、光字密度対リガンドの濃度（nM）として供する。

【図２】 クローンＣ６（配列番号：５１）の濃度の関数としてのＣ５ａ生成の割合１％
）を示す。

【図３Ａ】 アルカリ加水分解又はＴ₁ ヌクレアーゼでの消化後の５′−キナーゼ標識化ク
ローンＣ６（配列番号：５１）のシーケンシングゲルを示す。３′−配列（５′
−末端標識化）をアルカリ加水分解ラダーでアラインする。左側はＴ₁ ラダーで
右側はＣ５の５×及び１×濃度で選択したＲＮＡである。塩基の除去が結合を排
除する境界を矢印で示す。アスタリスクはＴ₁ に対して超高感度であるＧを示す
。

【図３Ｂ】 アルカリ加水分解又はＴ₁ ヌクレアーゼでの消化後の３′−ｐＣｐ−連結化ク
ローンＣ６のシーケンシングゲルを示す。５′配列（３′−末端標識化）はアル
カリ加水分解ラダーでアラインする。Ｔ₁ 及びタンパク質レーン、境界及び超高
感度Ｇヌクレオチドは図３Ａについて記載されるのと同じである。

【図４】 ２′−Ｏ−メチルインターフェレンスアッセイの結果を示す。２′−ＯＨプリ
ンを２′−Ｏ−メチルで置換することができる位置は、結合インターフェレンス
から決定した。直線的曲線適合で（タンパク質により選択されたバンドの強度）
／（タンパク質により選択されなかったオリゴヌクレオチドについてのバンド強
度）の比をプロットする（白ぬき円）。混合した２′−ＯＨ：２′−ＯＭｅヌク
レオチドについての同じ比をもつプロットする（黒ぬき円）。

【図５Ａ】 別の塩基と一緒に、クローンＣ６（配列番号：５１）の３８mer トランケート
（配列番号：１６０）の予想される構造を示す。

【図５Ｂ】 クローンＣ６（配列番号：５１）の３８mer トランケート（配列番号：１９３
）の２′−Ｏ−メチル置換パターンを示す。２′−ＯＭｅ置換を行うことができ
る位置をボールドで示す。２′−ＯＨでなければならない位置を下線で示す。

【図６】 ２′−ＯＭｅ置換のない（配列番号：１９４；白ぬき円）、位置２０に２′−
ＯＭｅ置換のある（配列番号：１９５；黒ぬり三角）並びに位置２，７，８，１
３，１４，１５，２０，２１，２２，２６，２７，２８，３６及び３８に２′−
ＯＭｅ置換のある（配列番号：１９６；黒ぬり円）クローンＹＬ−１３（配列番
号：１７５）の３８mer トランケートについての核酸リガンドの濃度（μｍ）に
対する溶血の割合（％）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 CA20 HA12

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ５に対する精製されかつ単離された非天然核酸リガンドで
   あって、該リガンドが配列番号：７５，１６０〜１９６からなる群から選択され
   るＲＮＡリガンドであることを特徴とする核酸リガンド。
2. 【請求項２】 前記リガンドが、配列番号：７５，１６０〜１９６からなる
   群から選択されるリガンドと実質的に相同であり、かつ前記Ｃ５に結合するため
   の実質的に同じ能力を有することを特徴とする請求項１記載の核酸リガンド。
3. 【請求項３】 前記リガンドが、配列番号：７５，１６０〜１９６からなる
   群から選択されるリガンドと実質的に同じ構造を有し、かつ前記Ｃ５に結合する
   ための実質的に同じ能力を有することを特徴とする請求項１に記載の核酸リガン
   ド。