JP2001524320A - 組織標的に対する核酸リガンド - Google Patents

組織標的に対する核酸リガンド

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ネクスター ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、複合組織標的に対する高親和性オリゴヌクレオチドリガンド、特に複合組織標的への結合能を有する核酸リガンド、及びこのようなリガンドを得る方法に関する。組織標的は、細胞、細胞成分、細胞凝集物、細胞収集物、及びより高度に整列された構造を含む。特に、血管に対する核酸リガンドを説明している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の技術分野 本明細書は、組織に対する核酸リガンドの同定及び調製法を記している。本明
細書に記された組織は、不均一環境における巨大分子の集合体である。この定義
に従う組織は、単一細胞型、細胞型の集合体、細胞の凝集体又は巨大分子の凝集
体を包含している。このような核酸リガンドを同定するためにここで使用される
方法は、“指数関数的富化によるリガンドの系統的進化”(Systematic Evolutio
n of Ligands by EXponential enrichment) の頭文字をとってSELEX と称される
。ここで詳細に説明されるのは、様々な組織に結合する高親和性核酸リガンドで
ある。
【０００２】 発明の背景 標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化の方法が開発さ
れている。SELEX と称される“指数関数的富化によるリガンドの系統的進化”の
方法は、米国特許出願第07/536,428号、発明の名称「指数関数的富化によるリガ
ンドの系統的進化(Systematic Evolution of ligands by Exponential Enrichme
nt) 」で現在は放棄されたもの、1991年6 月10日に出願された米国特許出願第07
/714,131号で発明の名称「核酸リガンド（Nucleic Acid Ligands）」で現在米国
特許第5,475,096 号であるもの、1992年8 月17日に出願された米国特許出願第07
/931,473号で発明の名称「核酸リガンドの同定法（Methods for Identifying Nu
cleic Acid Ligands）」で現在米国特許第5,270,163 号（同じくPCT 国際特許公
開第91/19813号も参照）に説明されており、これらの各出願は本明細書に参照と
して組入れられている。これらの出願は、本明細書においては集合的にSELEX 特
許出願と称するが、各々、いずれか所望の標的分子に対する核酸リガンドの製造
に関する新規方法について基礎から開示している。
【０００３】 SELEX 法は、結合の親和性及び選択性の実際に何らかの望ましい基準を達成す
るための、候補となるオリゴヌクレオチドの混合物からの選択、並びに同じ一般
的選択方策を使用する結合、分割及び増幅の段階的反復に関連している。好まし
くはランダム化された配列のセグメントを含む核酸混合物から出発するSELEX 法
は、結合にとって好ましい条件下での混合物と標的の接触、標的分子に特異的に
結合した核酸からの非結合核酸の分割、核酸−標的分割の解離、標的分子に対す
る高特異性高親和性核酸リガンドを得るために望ましい回数のサイクルを通じて
の解離及び増幅の工程を含む。
【０００４】 基本的SELEX 法は、多くの特定の目的を達成するために改変されている。例え
ば、1992年10月14日に出願され現在は放棄された米国特許出願第07/960,093号、
発明の名称「構造を基にした核酸選択法（Method for Selecting Nucleic Acids
on the Basis of Structure）」は、折れ曲がりDNA のような特異的構造特性を
有する核酸分子を選択するためにゲル電気泳動と組合せてSELEX を使用すること
を開示している。1993年9 月17日に出願され現在放棄された米国特許出願第08/1
23,935号、発明の名称「核酸リガンドの光選択(Photoselection of Nucleic Aci
d Ligands)」は、標的分子に結合可能な及び／又は標的分子を光架橋及び／又は
光不活化することができる光反応性基を含む核酸リガンドを選択するためのSELE
X を基にした方法を開示している。1993年10月7 日に出願された米国特許出願第
08/134,028号で、現在米国特許第5,580,737 号である米国特許出願第08/443,957
号を優先して放棄された、発明の名称「テオフィリンとカフェインを識別する高
親和性核酸リガンド(High-Afinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate B
etween Theophylline and Caffeine) 」は、逆-SELEXと称される、密に関連した
分子間で識別が可能な非常に特異的な核酸リガンドの同定法を開示している。
【０００５】 1993年10月25日に出願された米国特許第08/143,564号で、現在米国特許第5,56
7,588 号である米国特許出願第08/461,069号を優先して放棄された、発明の名称
「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化：溶液SELEX(Systematic Evoluti
on of Ligands by EXponential Enrichment : Solution SELEX) 」は、標的分子
に対し高及び低親和性を有するオリゴヌクレオチド間の高い分割を達成するSELE
X を基本にした方法を開示している。1992年10月21日に出願された米国特許出願
第07/964,624号である「HIV-RT及びHIV-1 Rev への核酸リガンド(Nucleic Acid
Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev)」で、現在は米国特許第5,496,938 号である
ものは、SELEX 実施後に改善された核酸リガンドを得る方法を開示している。19
95年3 月8 日に出願された米国特許出願第08/400,440号で、現在は米国特許第5,
705,337 号である、発明の名称「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化：
化学的-SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment :
Chemi-SELEX) 」は、標的へリガンドを共有結合する方法を開示している。
【０００６】 このSELEX 法は、改善されたインビボ安定性又は改善されたデリバリー特性の
ような、リガンドに改善された特性を付与する修飾されたヌクレオチドを含む高
親和性核酸リガンドの同定を包含している。このような修飾の例は、リボース及
び／又はリン酸及び／又は塩基の位置での化学的置換を含む。SELEX-同定された
修飾されたヌクレオチドを含む核酸リガンドは、「修飾されたヌクレオチドを含
む高親和性核酸リガンド(High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Mod
ified Nucleotides)」で、現在米国特許第5,660,985 号である米国特許出願第08
/430,709号を優先して放棄されたが、これはピリミジンの5-及び2'- 位で化学的
に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを開示している。前
述の米国特許出願第08/134,028号は、2'- アミノ(2'-NH2)、2'- フルオロ(2'-F)
、及び／又は2'-O- メチル(2'-OMe)で修飾された1 個以上のヌクレオチドを含む
高特異性核酸リガンドを開示している。1994年6 月22日に出願された米国特許出
願第08/264,029号で現在放棄されている、「分子内求核置換による公知又は新規
の2'- 修飾ヌクレオシドの新規調製法(Novel Method of Preparation of Known
and Novel 2'-Modified Nucleosides by Intramolecular Nucleophilic Displac
ement)」は、様々な2'- 修飾されたピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを開示
している。
【０００７】 SELEX 法は、選択されたオリゴヌクレオチドと別の選択されたオリゴヌクレオ
チド及び非- オリゴヌクレオチド機能単位を組合せることを包含しており、各々
、1994年8 月2 日に出願された米国特許出願第08/284,063号で発明の名称「指数
関数的富化によるリガンドの系統的進化：化学的-SELEX」である、現在の米国特
許第5,637,459 号、及び1994年4 月28日出願された米国特許出願第08/234,997号
で発明の名称「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化：溶液SELEX 」であ
る、現在の米国特許第5,683,867 号に開示されている。これらの出願は、他の分
子の所望の特性と、オリゴヌクレオチドの数多くの様々な形状及び他の特性、並
びに効果的増幅及び複製特性の組合せを可能にする。基本的SELEX 手順の改変に
ついて説明している前述の各特許出願は、その全体が本明細書に参照として組入
れられている。
【０００８】 SELEX 法が非常に強力であることは疑う余地が無い。しかし、今のところこの
方法は、タンパク質又は小さい分子のような、主に純粋で単純な標的について成
功することが明らかにされている。本発明は、複雑な標的もSELEX 法と共存でき
ることの最初の説明を提供する。 様々な理由により、複合組織標的への核酸リガンドを得ることが望ましい。第
一に、組織SELEX は、明確な標的は不明であるが、所望のリガンド作用の一般的
態様が示されているような場合に核酸リガンドを得るために有用であり得る。第
二に、組織SELEX は、核酸リガンドが機能的結果を基に望まれる場合に有用であ
り得る。第三に、組織標的にとって単一標的が有効であるかどうかが不明である
場合に、複合組織標的に対する核酸リガンドを得るために望ましい。更に精製さ
れた標的が利用できないかもしくは不安定である場合に複合組織標的に対する核
酸リガンドを得るためにも有用である。 発明の簡単な概要 本発明は、組織のような複合標的に対する核酸リガンドの同定及び生成法、並
びにこのようにして同定及び生成された核酸リガンドに関する。より詳細に述べ
ると、核酸リガンドは、例えば全細胞又はその下部構造、細胞の凝集物、細胞の
集合体、巨大分子の凝集物などのような、不均一環境中の巨大分子である組織に
特異的に結合することが可能であるように提供される。
【０００９】 更に本発明は、(a) 核酸の候補混合物を調製する工程、(b) 組織への親和性を
基に該候補混合物のメンバーを分割する工程、及び(c) 選択された分子を増幅し
、組織への結合について比較的高い親和性を有する核酸配列について富化された
核酸混合物を得る工程を含む、組織に対する核酸リガンドを同定する方法を含む
。更にこのような方法によって同定された核酸リガンドも含む。
【００１０】 本発明の別の実施態様は、類似の組織型間のわずかな差異の識別を完全に行う
ために、ネガティブ選択が実施される方法を含む。この実施態様においては、得
られるリガンドは、単に特定の組織型について特異性があるだけではなく、同型
のわずかに異なる組織間で識別することもできる。例えばこの方法は、正常及び
異常の組織型間、誘導及び非誘導の組織型間を識別することができる。
【００１１】 本発明の別の実施態様において、組織標的上の比較的大きい未知の巨大分子の
成分であり、これまでは不明であるかもしくは特徴付けられなかったエピトープ
を同定する方法を提供する。本発明により進化するリガンドは、これまでは不明
であったエピトープに結合することが可能であり、その後この未知のエピトープ
を含む巨大分子を常法により同定することができる。例えばリガンドは、複合組
織標的の状況で発見されたこれまで不明のタンパク質へと進化され得る。本発明
のリガンドは、標準的タンパク質精製法及び同定法による組織標的からタンパク
質を精製することに使用することができる。これらの標準的方法は、親和性精製
、微量塩基配列決定及びcDNAデータバンクの検索を含む。この態様において、よ
り大きい未知の巨大分子の成分である新たに同定されたエピトープ、例えば新た
に又はこれまでは特徴付けられなかったタンパク質が、本発明によって提供され
る。これらの新規エピトープ及びそれらがその成分である巨大分子は、診断薬及
び治療薬として、更にはそれらの同定を補助するリガンドとして有用であろう。
【００１２】 より詳細に述べると、本発明は、末梢血単核細胞(PBMC)、血餅、動脈細胞及び
動脈を含む血管に対する核酸リガンドを含み、これらは各々表2 、5 、8 、10、
12及び13に示されたリガンドを含む。更に、所定のリガンドのいずれかに対して
実質的に相同であり、かつ前述の組織への結合能が実質的に同じである前述の組
織に対する核酸リガンドも含む。更に本発明は、本明細書に記されたリガンドと
実質的に同じ構造を有する前述の組織に対する核酸リガンドを含む。 発明の詳細な説明 本出願は、一般にSELEX として公知の方法に従って同定された複合組織標的に
対する核酸リガンドを説明している。先に記したように、SELEX 技術は、本明細
書に参照として組入れられているSELEX 特許出願において詳細に説明されている
。組織SELEX と称されるこの方法は、これまでSELEX 法において使用されている
より単純な標的に対するものとは対照的に、複合標的を組入れている。本明細書
において発明を説明するために使用される特定の用語は、以下のように定義され
る： 「SELEX 」方法論は、前記及びSELEX 特許出願において詳細に説明されたよう
な、例えばタンパク質への結合のような望ましい方法で標的と相互作用する核酸
リガンドの選択と、これらの選択された核酸の増幅の組合せを意味する。選択／
増幅工程の反復循環は、非常に多くの核酸を含むプールから標的と最も強力に相
互作用するひとつ又は少数の核酸を選択することを可能にする。選択／増幅手順
の循環は、選択された目的が達成されるまで繰り返される。
【００１３】 「組織SELEX 」方法論は、組織標的に対するSELEX 方法論に適用される。組織
SELEX にはいくつかの利点がある。第一に、組織SELEX を使用して、関連したエ
ピトープの定義された理解を欠くような特異的細胞型に対するリガンドを得るこ
とができる。それに対するリガンドが進化されるようなエピトープは、通常比較
的大きい巨大分子の構造成分である。この方法で発見されるリガンドは、更に組
織標的上の新規タンパク質又は他の新規巨大分子の同定においても有用である。
この新規タンパク質又は新たに同定されたエピトープを含む他の新規巨大分子は
、常法により精製され特徴付けられる。第二にそれらの生理的な細胞又は膜の環
境に関して定義されたエピトープ又は巨大分子に対するリガンドを得ることがで
きる。第三に例えば活性化された、移動しているなど機能的に変更された表現型
で、組織に対するリガンドを得ることが可能である。リガンド及びこの方法で同
定されたリガンドエピトープを含む新規巨大分子は、診断又は治療において有用
であろう。
【００１４】 組織SELEX は、多くの様々な細胞の挙動、例えばアポトーシス、アネルギー、
分化、増殖などを媒介することができる核酸リガンドで、これらの変化を制御す
る特異的な組織標的を同定する知識がこれまではないものを同定することを可能
にする強力な方法論である。SELEX 法の感度は、複合組織標的上の様々なエピト
ープ毎に認識する可能性のあるオリゴヌクレオチドの生成へとつながり得る。単
純な標的SELEX と比べて、より多数の様々な配列モチーフが、組織SELEX 法を使
用して予想され、これは様々なモチーフが、複合組織標的上の異なるエピトープ
を認識するであろうと考えられるからである。いくつかのエピトープは同じタン
パク質内にあることができるが、多くは様々なタンパク質又は組織の他の分子へ
と向けられるであろう。組織SELEX はインビボ又はインビトロにおいて行うこと
ができる。
【００１５】 ある実施態様において、組織SELEX によって駆動されたリガンドが、正確な特
異性及び親和性を有する可能性を増強するために、ネガティブ選択法（逆-SELEX
と称す）が使用される。この実施態様において、リガンドは特異的組織について
選択され、次にネガティブ選択が、このリガンドに望まれるような特定の特性を
有さない関連組織に対して行われる。ネガティブ選択は、類似の細胞株又は細胞
型、異なる細胞、正常な組織、血漿又は血液、非特異的抗体又は他の利用できる
リガンドに対して行うこともできる。このネガティブ選択のある例では、最初の
選択に腫瘍細胞標的（例えば悪性黒色腫など）を用い、その後腫瘍形成性でない
類似の細胞型（例えば正常なヒトメラノサイト）に対して、得られる核酸が逆選
択される。正常及び新生物形成性の組織の両方と相互作用するリガンドは、この
ネガティブ選択によって除去され、かつ腫瘍細胞と特異的に結合する核酸リガン
ドのみが同定（又は保持）されるであろう。得られる核酸リガンドは、腫瘍に対
して特異的であろう。この技法は、2 種の密に関連した標的の間、すなわち、癌
細胞と同じ組織型の非転換細胞の間を識別することができるような核酸リガンド
を同定する能力を提供する。ネガティブ 選択はインビボにおいても行うことが
できる。この方法を用いると、複合組織表面上の特異的標的に対するリガンドを
生成することができるのみではなく、特定の型の正常組織及び異常組織間の差異
を認識することも可能である。
【００１６】 「SELEX 標的」又は「標的」は、核酸が予め定められた所望の方法で作用する
ことができるようないずれかの化合物を意味する。SELEX 標的分子は、タンパク
質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体
、抗原、抗体、ウイルス、病原菌、毒素、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補
因子、阻害剤、医薬品、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織などであることが
できるが、これらに限定されるものではない。実際にあらゆる化学的又は生物学
的エフェクターが適当なSELEX 標的となるであろう。あらゆるサイズの分子をSE
LEX 標的として使用することができる。標的は、標的と核酸の間の相互作用の可
能性を増大するために、特定の方法で修飾することもできる。
【００１７】 「組織標的」又は「組織」は、前述のSELEX 標的の特定のサブセットを意味す
る。この定義に従うと、組織は、不均一環境中の巨大分子である。ここで使用さ
れるように、組織は、単一細胞型、細胞型の集合体、細胞の凝集体、又は巨大分
子の凝集体を意味する。これは、典型的にはタンパク質のような単離された可溶
性分子である単純SELEX の標的とは異なる。好ましい実施態様において、組織は
単純SELEX の標的よりも何倍も大きいような不溶性巨大分子である。組織は、多
数の巨大分子で造られた複合標的であり、各巨大分子は多くの可能性のあるエピ
トープを有している。多くのエピトープを含む様々な巨大分子は、タンパク質、
脂質、炭水化物など、又はそれらの組合せであることができる。組織は一般に、
構造及び組成の両方に関して、流動性又は剛性のいずれかの巨大分子が物理的に
整列したものである。細胞外マトリックスは、構造的及び組成的の両方でより剛
性のある組織の例である一方で、二層膜は構造及び組成においてより流動性であ
る。組織は一般に可溶性ではなく、固相であり続け、従って分離は比較的容易に
達成することができる。組織は、通常特定の種類の細胞凝集体を、例えば腎組織
、脳組織などの所定の臓器の一般的細胞繊維(cellular fabric) を意味するよう
に通常使用される構造的物質のひとつを形成するそれらの細胞内物質と共に含む
が、これに限定されるものではない。組織の一般的4 クラスは、上皮組織、結合
組織、神経組織及び筋組織である。
【００１８】 この定義に該当する組織の例は、無細胞であるフィブリンクロットのような、
巨大分子の不均一凝集体；同種又は異種の細胞凝集体；臓器、腫瘍、リンパ節、
動脈などのような、特異的機能を有する細胞を含むより高次の構造；及び、個々
の細胞を含むが、これらに限定されるものではない。組織又は細胞は、その天然
の環境にあるか、単離されるか、もしくは組織培養され得る。組織は無傷又は修
飾されることができる。修飾は、形質転換、トランスフェクション、活性化、及
び細胞膜、細胞核、細胞オルガネラのような下部構造の単離のような多くの変化
を含む。
【００１９】 組織、細胞、又は細胞下の構造の供給源は、原核細胞に加え、真核細胞から得
ることができる。これは、ヒト、動物、植物、細菌、真菌及びウイルスの構造を
含む。 「血管」は、生体において血液が循環するいずれかの血管であり、心臓、大動
脈、動脈、静脈及び毛細血管を含むと理解される。
【００２０】 「核酸」は、DNA 、RNA 、1 本鎖又は2 本鎖及びそれらの化学的修飾物のいず
れかを意味する。修飾は、個々の核酸塩基又は全体としての核酸への追加荷電、
分極率、水素結合、静電的相互作用、及び流動性(fluxionality)を組込む他の化
学基を提供するものを含むが、これらに限定されるものではない。このような修
飾は、2'- 位糖修飾、5-位ピリミジン修飾、8-位プリン修飾、シトシン環外アミ
ンの修飾、5-ブロモ- ウラシル置換のような修飾された塩基；骨格の修飾、メチ
ル化、イソ塩基類のイソシチジン及びイソグアニジンなどのような稀な塩基- 対
の組合せなどを含むが、これらに限定されるものではない。修飾は更に、キャッ
ピングのような3'及び5'修飾を含む。増幅の各ラウンド後に生じる修飾も、本発
明と共存できる。ポスト- 増幅修飾は、各増幅ラウンド後に可逆的又は不可逆的
に追加され得る。事実上核酸のあらゆる修飾が、本発明によって意図されている
。
【００２１】 「核酸被験混合物」又は「核酸候補混合物」は、異なるランダム化された配列
の核酸の混合物である。「核酸被験混合物」の供給源は、天然に生じる核酸又は
その断片、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸、又は前述の技術
の組合せによって生成された核酸に由来することができる。好ましい実施態様に
おいて、各核酸は、増幅工程を促進するために、ランダム化された領域の周りに
固定された配列を有する。核酸のランダム切片の長さは一般に、8 〜250 ヌクレ
オチドの間であり、好ましくは8 〜60ヌクレオチドの間である。
【００２２】 「核酸リガンド」は、所望の方法で標的に作用する核酸候補混合物から単離さ
れた核酸である。望ましい方法での標的に対する作用の例は、標的の結合、標的
の触媒的変化、標的又は標的の機能的活性を修飾／変更するような方法での標的
との反応、自殺阻害剤としての標的との共有結合、標的と他の分子の間の反応の
促進を含むが、これらに限定されるものではない。殆どであるが全てではない例
において、この望ましい方法は標的との結合である。最も好ましい実施態様にお
いて、核酸リガンドは、組織標的分子に対する特異的結合親和性を有する天然に
は生じない核酸リガンドであり、このような標的分子は顕著にワトソン／クリッ
ク塩基対又は三重らせん結合に依存する機序により該核酸リガンドと結合するポ
リヌクレオチド以外の３次元化学構造であり、ここで該核酸リガンドは、標的分
子によって結合される公知の生理的機能を有する核酸ではない。
【００２３】 核酸リガンドは、実際に組織SELEX 法によって単離された核酸リガンドと実質
的に相同である核酸配列を含む。実質的相同性とは、一次配列の相同性の程度が
、70％を超える、最も好ましくは80％を超え、かつより一層好ましくは90％、95
％又は99％を超えることさえあることを意味する。本明細書に記した相同性の割
合は、長さ1O個のヌクレオチド中1 ギャップがその並置を助けるために導入され
る場合に、比較される配列中の同じヌクレオチド残基を並べたふたつの配列の小
さい方に認められたヌクレオチドの割合として算出される。過去には、特異的標
的に対する様々な核酸リガンドの配列相同性が、ほとんど又は全く一次相同性の
ない配列が、実質的に同じ標的結合能を有することを示すことが発表されている
。これらの理由のために、本発明は、組織SELEX 法によって同定された核酸リガ
ンドと同じ標的結合能を実質的に有する核酸リガンドも含んでいる。実質的に同
じ標的結合能とは、その親和性がそこに記されたリガンドの親和性の数桁以内で
あることを意味する。当業者は、所定の配列−ここで詳細に記されたものと実質
的に相同−が実質的に同じ組織標的への結合能を有するかどうかを熟知している
。
【００２４】 本発明は更に、実質的に同じと仮定された構造又は構造モチーフを有する核酸
リガンドも含む。実質的に同じ構造又は構造モチーフは、Zukerfold プログラム
を用いる配列並置により仮定することができる(Zucker 、Science 、244:48-52(
1989) を参照のこと) 。当該技術分野において公知であるように、二次構造又は
構造モチーフを予測するための他のコンピュータプログラムも使用することがで
きる。溶液中の又は結合した構造としての核酸リガンドの実質的に同じ構造又は
構造モチーフは、更にNMR 又は他の当該技術分野において公知の方法を用いて仮
定することができる。
【００２５】 用語「クローン」は、用語「核酸リガンド」と互換的に使用される。 「分割」は、未反応の核酸候補混合物の残りから核酸リガンドを分離する工程
を意味する。分割は、様々な当該技術分野において公知の方法によって達成する
ことができる。適当な分割法の例は、フィルター結合、アフィニティークロマト
グラフィー、液−液分割、ろ過、ゲルシフト、密度勾配遠心分離である。以下に
詳細に記した平衡分割法も使用することができる。本発明の組織標的は不溶性で
あるので、本発明によく適した多くの簡単な分割法がある。簡単な分割法は、固
体の液体からの分離法、例えば油分の有無による遠心分離、膜分離及び不溶性組
織標的の単純な洗浄などのいずれかの方法を含む。リガンドは、特異的抗体又は
リガンドにより標的から特異的に溶離することもできる。分割法の選択は、標的
及び核酸の特性によって決まり、かつ当業者には公知の原理及び特性に従い行わ
れ得る。
【００２６】 「増幅」は、分子コピー又は分子種の量又は数を増大するいずれかの処理又は
処理工程の組合せを意味する。好ましい実施態様において、増幅は、被験混合物
のメンバーが分割された後に行われ、かつこれは増幅される所望の産物に会合し
た促進核酸(facilitating nucleic acid) である。例えばRNA 分子の増幅は、3
つの一連の反応によって行うことができる：選択されたRNA のcDNAコピーの生成
、各cDNAのコピー数を増大するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用、及び選択さ
れたRNA と同じ配列を有するRNA 分子を得るためのcDNA コピーの転写である。
直接DNA 複製、直接RNA 増幅などを含む当該技術分野において公知のあらゆる反
応又は反応の組合せを、適切に使用することができることは当業者には理解され
るであろう。この増幅法は、増幅前の混合物の様々な配列の割合を本質的に示す
増幅された混合物の割合をもたらすものでなければならない。核酸の多くの修飾
は、酵素的増幅と共存できることが公知である。増幅と共存できない修飾が必要
である場合は、増幅の各ラウンド後に行うことができる。
【００２７】 「ランダム化」は、原則的に、所定の長さ以上のあらゆる可能性のある配列を
有する核酸のセグメントを説明するために使用される用語である。ランダム化さ
れた配列は、様々な長さであり、望ましくは、約8 から100 以上に及ぶヌクレオ
チドの範囲である。ランダム配列セグメントが生成されるような化学反応又は酵
素反応は、存在し得る未知のバイアス又はヌクレオチド優先性(preference)のた
めに、数学的にランダムである配列を生じることはできない。用語「ランダム化
」は、理想的でないものからの逸脱の可能性を反映するために「ランダム」の代
わりに使用される。例えば逐次化学合成のような現在公知の技術において、大き
い逸脱が生じるかどうかはわかっていない。ヌクレオチド20個以下のような短い
セグメントについて、存在し得る何らかの小さいバイアスは、無視できる結果を
もたらすであろう。単回合成の配列がより長くなると、バイアスの影響も大きく
なる。
【００２８】 バイアスは、ランダム化された配列へ故意に導入され、これは例えば、合成反
応における前駆体ヌクレオシド（又はデオキシヌクレオシド）トリリン酸のモル
比、又は化学合成におけるホスホルアミダイト比の変更によるものである。例え
ば二次構造に影響を及ぼし、促進活性を有することがわかっている分子へ向ける
バイアスを導入し、特定の構造特性を導入し、又は予備的結果をふまえた故意の
バイアスが望ましい。
【００２９】 最も基本的な形において、SELEX 法は、下記の一連の工程によって定義される
： 1)様々な配列の核酸の候補混合物を調製する工程。この候補混合物は一般に、
固定された配列領域（すなわち、候補混合物の各メンバーは、同じ位置に同じ配
列を含む。）、及びランダム化された配列領域を含む。固定された配列領域は、
次のいずれかのために選択される：(a) 以下に記す増幅工程を補助する、(b) 標
的に結合することがわかっている配列を模倣する、又は(c) 候補混合物中の核酸
の所定の構造配列の濃度を増大する。ランダム化された配列は、全体的にランダ
ム化するか（すなわち、いずれかの位置で塩基を認める可能性が1/4 である）、
又は部分的にのみランダム化する（例えば、いずれかの位置で塩基を認める可能
性を、0 〜100 ％のレベルで選択することができる。）ことができる。
【００３０】 2)候補混合物が、選択された標的と、標的と候補混合物の一員との結合にとっ
て好ましい条件下で接触される工程。これらの状況下では、標的と候補混合物の
核酸の間の相互作用は、標的及び標的と最も強力な親和性を有するそれらの核酸
との間での核酸−標的対の形成とみなすことができる。 3)標的に対して最高の親和性を有する核酸が、標的に対してより低い親和性を
有するそれらの核酸から分割される工程。候補混合物中に存在する最高の親和性
のある核酸に相当するのはごくわずかの配列（及び恐らく核酸の1 個の分子のみ
）であるので、一般に、候補混合物中の著しい量（およそ5 〜50％）の核酸が分
割時に保持されるような分割基準を設定することが望ましい。
【００３１】 4)分割時に選択された標的に対して比較的高い親和性を有するこれらの核酸を
、次に増幅し、標的に対して比較的高い親和性を有する核酸が豊富な新規候補混
合物を形成する工程。 5)前述の分割工程及び増幅工程を反復する工程で、これにより、新たに形成さ
れた候補混合物が含む独自(unique)配列が徐々に減り、かつ標的に対して平均程
度の親和性を持つ核酸が全般的に増加するであろう。極端な場合はこのSELEX 法
は、標的分子に対する最高の親和性を有する当初の候補混合物から、これらの核
酸を代表する1 個又は少数の独自核酸を含む候補混合物を生じるであろう。
【００３２】 SELEX 特許出願は、この方法の細部について開示しかつ詳細に述べている。こ
の方法において使用することができる標的；候補混合物中の核酸の分割法；及び
、分割された核酸を増幅し、富化された候補混合物を生成する方法が含まれてい
る。SELEX 特許出願は更に、タンパク質が核酸結合タンパク質であるもの及びそ
うではないものの両タンパク質標的を含む、多くの標的種に対して得られるリガ
ンドについて開示している。
【００３３】 SELEX 法は、更に診断又は治療用の複合体中における、選択された核酸リガン
ドと親油性化合物又は非- 免疫原性高分子量化合物との組合せを包含しており、
これは1995年3 月4 日に出願された米国特許出願第08/434,465号、発明の名称「
核酸リガンド複合体」に開示されている。診断又は治療用の複合体中でジアシル
グリセロール又はジアルキルグリセロールのような親油性化合物と会合するVEGF
核酸リガンドが、1996年10月25日に出願された米国特許出願第08/739,109号、発
明の名称「血管内皮増殖因子(VEGF)核酸リガンド複合体(Vascular Endothelial
Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes) 」に開示されている。
グリセロール脂質のような親油性化合物、又はポリアルキレングリコールのよう
な非- 免疫原性高分子量化合物と会合するVEGF核酸リガンドは、更に1997年7 月
21日に出願された米国特許出願08/897,351号、発明の名称「血管内皮増殖因子(V
EGF)核酸リガンド複合体」に開示されている。非- 免疫原性高分子量化合物又は
親油性化合物に会合されたVEGF核酸リガンドは、更に、1997年10月17日に出願さ
れた国際公開公報第98/18480号、発明の名称「血管内皮増殖因子(VEGF)核酸リガ
ンド複合体」に開示されている。基本的SELEX 手順の改変について述べている前
述の各特許出願は、その全体が本明細書に参照として組入れられている。
【００３４】 本発明のある実施態様は、非- 免疫原性高分子量化合物又は親油性化合物と共
有結合された1 個以上の組織標的に対する核酸リガンドを含む複合体を提供する
。ここで使用された複合体は、組織標的の核酸リガンドの、非- 免疫原性高分子
量化合物への共有結合により形成された分子全体を説明している。非- 免疫原性
高分子量化合物は、およそ100Da 〜1,000,000Da 、より好ましくはおよそ1000Da
〜500,000Da 、及び最も好ましくはおよそ1000Da〜200,000Da の間の化合物であ
り、これらは通常免疫応答を生じない。本発明の目的に関して、免疫応答とは生
物に抗体タンパク質産生を引き起こすものである。ある好ましい本発明の実施態
様において、非- 免疫原性高分子量化合物はポリアルキレングリコールである。
最も好ましい実施態様において、このポリアルキレングリコールはポリエチレン
グリコール(PEG) である。より好ましくは、PEG は分子量が約10〜80K のもので
ある。最も好ましくは、PEG の分子量は約20〜45K である。ある本発明の実施態
様において、非- 免疫原性高分子量化合物は核酸リガンドであることもできる。
【００３５】 本発明の別の実施態様は、組織標的への核酸リガンド及び親油性化合物で構成
される複合体に関する。親油性化合物は、脂質と会合又は分割する傾向を有する
化合物及び／又は低い誘電率を有する他の物質又は相であり、実質的に親油性成
分で構成される構造を含む。親油性化合物は、脂質に加え、脂質と会合する傾向
がある非- 脂質含有化合物（及び／又は低い誘電率を有する他の物質又は相）で
ある。更なる親油性化合物の例は、コレステロール、リン脂質及びグリセロ脂質
、例えばジアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、及びグリセロールア
ミド脂質などである。好ましい実施態様において、親油性化合物はグリセロ脂質
である。
【００３６】 非- 免疫原性高分子量化合物又は親油性化合物は、組織標的に対する核酸リガ
ンド上の様々な位置に共有結合することができ、例として、組織標的に対する核
酸リガンドの塩基の環外アミノ基、ピリミジンヌクレオチドの5-位、プリンヌク
レオチドの8-位、リン酸のヒドロキシル基、5'又は3'- 末端のヒドロキシル基又
は他の基がある。親油性化合物がグリセロ脂質であるか、又は非- 免疫原性高分
子量化合物がポリアルキレングリコール又はポリエチレングリコールであるよう
な実施態様において、これはそれらのリン酸基の5'又は3'ヒドロキシルに結合し
ていることが好ましい。最も好ましい実施態様において、親油性化合物又は非-
免疫原性高分子量化合物は、核酸リガンドのリン酸基の5'ヒドロキシルに結合し
ている。非- 免疫原性高分子量化合物又は親油性化合物の組織標的に対する核酸
リガンドへの結合は、直接又はリンカー又はスペーサーを利用して行うことがで
きる。
【００３７】 リンカーは、2 個以上の分子全体を共有結合又は共有結合以外の相互作用を介
して連結する分子全体であり、かつこれらの1 個以上の分子全体の機能特性を保
ち続ける方法で、分子全体の空間的分離を可能にする。 組織標的に対する核酸リガンド及び非- 免疫原性高分子量化合物又は親油性化
合物を含む複合体は、更に脂質構築物に会合することができる。脂質構築物とは
、脂質を水性懸濁液中に取り込むことがわかっているような様々な異なる構造的
配置を有する脂質、リン脂質又はそれらの誘導体を含む構築物である。これらの
構造は、脂質2 層小胞、ミセル、リポソーム、エマルション、脂質リボン(lipid
ribbon)又はシートを含むが、これらに限定されるものではなく、かつ様々な薬
剤及び医薬として許容できることがわかっている成分と複合することができる。
好ましい実施態様において、脂質構築物はリポソームである。好ましいリポソー
ムは、単層であり、かつ相対的サイズ200nm 未満を有する。常用の脂質構築物中
の追加成分は、中でもコレステロール及びα−トコフェロールである。脂質構築
物は、単独で、又は、特定の用途にとって望ましい特性を提供することが当業者
には理解できるような組合せで使用することができる。更に、脂質構築物及びリ
ポソーム製剤の技術的態様は、当該技術分野において周知であり、かつこの分野
で通常実践される方法のいずれかを本発明に適用することができる。
【００３８】 SELEX は、標的分子の高親和性リガンドを提供する。これは、核酸研究の分野
において前例のない唯一の業績を示している。本発明は、より複雑な組織標的に
対してSELEX 法を適用する。 ネガティブ選択（逆-SELEX）が、任意に組織SELEX 処理の前、中、後に使用さ
れる。ネガティブ選択は、密に関連しているが異なる組織型間の識別を提供する
。例えば、ネガティブ選択は、腫瘍細胞に対して高度の特異的を有するが、同系
の正常組織は認識しないような核酸リガンドを同定するために導入することがで
きる。同様に、特異的にアテローム性動脈硬化した動脈組織を認識するが、正常
な動脈組織は認識しないような核酸リガンドが同定される。フィブリンは認識す
るが、フィブリノーゲンは認識しない核酸リガンドも、この方法で同定される。
加えて、特定の受容体を発現する細胞型に対する核酸リガンドは、この受容体（
又は他のこのような巨大分子）を発現しないように操作された細胞株により逆-
選択することができる。
【００３９】 当業者は、このネガティブ選択を達成するために様々な機序を用いることがで
きることを容易に理解するであろう。以下の例は、主にネガティブ選択の方法を
詳細に説明するために提供されるものであり、いかなる限定も意味しない。ネガ
ティブ選択又は逆-SELEX法は、1993年10月7 日に出願された米国特許出願第08/1
34,028号で、米国特許出願第08/443,957号を優先して放棄された、発明の名称「
テオフィリンとカフェインを識別する高親和性核酸リガンド」で、現在は米国特
許第5,580,737 号であるものに最初に開示されており、これは本明細書に参照と
して組入れられている。ネガティブ選択の具体的な履行は、平衡分割を用いて実
施されている。この方法では、2 種の細胞株又は他の組織型が、平衡透析チャン
バー内の半浸透膜（粒径0.45〜0.90μm ）によって分離されている：一方の細胞
株は、新生物形成標的細胞株であり、他方はネガティブ選択に使用された正常組
織である。ネガティブ選択のための細胞又は組織型の選択は、望まれる具体的な
最終結果によって決まり、かつ新生物形成標的と同じ組織型の悪性でない細胞株
からなることが多い。別の実験では、様々な正常細胞型が、ネガティブエピトー
プ「シンク(sink)」を形成するために組合せられている。核酸のランダムプール
が、透析チャンバー（一方は正常細胞；これは、腫瘍細胞及び正常細胞の両方に
共通の高結合活性標的からバックグラウンドをなくす）に入れられ、かつこれら
2 種の細胞株間で平衡状態に到達させる。平衡時に標的細胞株又は組織に結合し
続けるこれらの核酸配列が、選択的に回収され、かつ次のSELEX ラウンドのため
に増幅される。
【００４０】 このネガティブ選択方法論の例は、極めて強力である。第一に、平衡透析ネガ
ティブ選択は、ポジティブ及びネガティブ選択が「同時」に行われることを可能
にする。第二に、ネガティブ選択の緊縮性を、透析膜の両側に配置された「ポジ
ティブ」及び「ネガティブ」細胞の相対量を変更することにより変動することが
できる。平衡透析ネガティブ選択に関するこれらふたつの特性は、標的細胞又は
組織型に特異的な核酸リガンドの進化全体の正確な制御を可能にする。
【００４１】 この同じ型の平衡分割ネガティブ選択は、付着細胞について行うことができる
。この実施態様において、単層の標的及びネガティブ細胞又は組織が、多ウェル
プレートの異なるウェルの中に入れられる。付着後、培地を、オリゴヌクレオチ
ドプールと共に、ウェルが細胞培地の容量によってつながるように添加する。オ
リゴヌクレオチドプールを平衡化した後、標的細胞株又は組織型と結合されたこ
れらの配列は、単離され、かつ次のSELEX ラウンドのために増幅される。
【００４２】 前記の平衡ネガティブ選択戦略は、組織標的、特に腫瘍関連抗原(TAA) に対す
る核酸リガンド形成の強力な方法を提供する。 加えて、いくつかの他のネガティブ選択法があり、これらは「ポスト-SELEXス
クリーニング法」として分類されている。これらの方法で最も簡単なものは、交
叉反応性のために、正常組織に対する独立した核酸リガンド（これらの配列は、
組織SELEX によって作成され、かつ組織標的に対して高- 親和性リガンドである
ことが示される。）の試験である。しかしこの方法は、長々と時間のかかる方法
である。
【００４３】 より好結果をもたらす「ポスト-SELEX」法は、例えばネガティブ選択標的とし
て正常組織を使用し、所望の複合組織標的、例えば、形質転換された細胞株に対
するSELEX 由来の既に進化しているプールについて、ネガティブ選択を行う。こ
の例は、形質転換された細胞株のSELEX 由来の最終ラウンドで高度に進化したプ
ールを使用する、正常組織に対する2 〜3 のネガティブ選択の遂行を示している
。特定の配列の正常組織への結合は、進化したプールからの配列を差し引くため
に使用される。この方法は、正常及び形質転換された細胞株の両方に共通の標的
に対する高親和性を示す、数百から数千の核酸配列から迅速に除去することを可
能にする。
【００４４】 別の「ポスト-SELEX」スクリーニング法は、光架橋実験の変形である。例とし
て、組織SELEX プロトコールにおいて使用されるPCR プライマーの5'末端に、高
度に光反応性の亜硝酸(nitrine) 基（ヨウ素化することもできる）を合成により
組込むことが可能である。例えば腫瘍細胞株SELEX 由来の後期- ラウンドのプー
ルは、この光反応性（及び125I- 標識）プライマーにより増幅され、その後この
配列プールは腫瘍細胞の存在下及び正常組織の存在下で照射されるであろう。膜
タンパク質は、SDS ゲル上での分析により単離・可溶化される。腫瘍及び正常細
胞株の両方について、特異的オリゴヌクレオチド配列でタグをつけられた多くの
様々なタンパク質エピトープが認められることは予想されるであろう。2 、3 の
タグのついた標的は腫瘍細胞株に特有である。オリゴヌクレオチドは、タンパク
質標的に、オリゴヌクレオチドの塩基配列を破壊しないような方法で光化学的に
連結しているので、SDS ゲルから腫瘍- 特異性のバンドを単離し、PCR を用いて
、特定の腫瘍抗原を認識する特異的配列モチーフを回収することが可能である。
従って一工程において恐らく数百の細胞表面抗原を認識するオリゴヌクレオチド
配列をプールから取り出し、1 又は数種の単一の腫瘍- 特異性抗原に特異的に結
合する配列のファミリーを残すことが可能であろう。
【００４５】 前述のように、組織SELEX 法は、組織標的上の新規エピトープを含む巨大分子
の同定を含む。巨大分子の新規のエピトープ成分に対する核酸リガンドを、この
巨大分子の精製、同定及び特徴付けに使用することができる。新規巨大分子は、
未知のタンパク質又はペプチド、脂質、炭水化物などであることができる。実際
に組織を形成している分子の一部であるようなあらゆる分子を、組織SELEX 法に
よって同定することができる。
【００４６】 本発明のこの態様を十分に利用するために、新規エピトープを含む新規巨大分
子の精製及び同定の戦略を開発し、かつ組織のこれらの新規巨大分子成分が生物
学的システムにおいて作用する役割を決定することは重要である。新規巨大分子
の精製法は、特にタンパク質精製の分野で、周知である。これらの標準的精製法
は、架橋、アフィニティークロマトグラフィー、ペプチド微量配列決定、エドマ
ン配列決定、質量分析、及びcDNAライブラリー検索を含む。
【００４７】 下記の考察は、新規腫瘍関連抗原(TAA) の同定に適用される本発明の方法を説
明している。この考察に関してTAA は、腫瘍細胞上に発現されるが、類似の正常
細胞上には発現されない巨大分子である。TAA は、免疫原性であっても、なくと
もよい。TAA は、組織SELEX 法によって同定され得、かつ単に例証のために使用
される巨大分子の例のひとつにすぎない。しかし、この方法を、組織SELEX 法に
よって同定されるあらゆる新規巨大分子の同定に適用できることは容易に理解さ
れる。
【００４８】 TAA への適用に際して、組織SELEX 法による新規TAA の同定は、ふたつの主要
部分で構成される：ひとつは、新規TAA の精製及び同定戦略の開発であり、ふた
つめは、これらの腫瘍抗原の癌において果たす役割を解明する（すなわち、特定
の癌の発症及び進行における各々の特定のTAA の生物学的意義を決定する）こと
である。
【００４９】 ほとんどのTAA の精製及び同定の工程は、タンパク質精製分野の業者には容易
かつ理解できるものである。抗体と同じように、SELEX は、細胞全体又は他の組
織由来の抗原の精製に非常に有用である試薬−腫瘍抗原に特異的な高- 親和性リ
ガンド−を提供する。限定を意図しない例として、ほとんどの抗原は、光- 親和
性架橋の戦略の段又は前段のネガティブ選択と順応性がある。3'ビオチン抱合体
を伴う光活性化オリゴヌクレオチドを用いる、TAA の特異的架橋は、ストレプト
アビジンで被覆されたビーズを使用してTAA 標的を1 回で精製することを可能に
している。この精製戦略の別法は、カラムに結合した高- 親和性核酸リガンドを
使用し、TAA 標的を可溶化された標的細胞膜調製物から親和性で精製することで
ある。
【００５０】 組織上に新規エピトープを含む巨大分子を同定するためにここで提供された方
法が、従来の新規巨大分子発見法とは異なる利点があると考えるには、多くの説
得力のある理由がある。更に、以下の考察は腫瘍関連抗原の発見について説明す
るが、あらゆる新規巨大分子の発見に広く適用できることは容易に理解されるで
あろう。
【００５１】 腫瘍関連抗原への適用に関して、腫瘍抗原に関してわかっていることは全て免
疫系の特定の抗原に対する反応によって得られるものであり；科学は免疫系の、
及び新生物形成及び正常組織の間の抗原的差異を識別するための免疫系のレパー
トリーの特別な制限に左右されることを十分考慮しなければならない。免疫系に
支配されない他の腫瘍抗原が存在することは完全に可能である。一部の研究者は
、癌と正常組織の間には実際に多くの抗原的差異があり、残念なことにこれらは
免疫原性ではないと仮定している。
【００５２】 SELEX 方法論は、免疫系によってもたらされた制約を避けTAA を同定する改善
された方法を提供する： a. SELEXは実際に、生物の全ての可能性のある抗体のレパートリー以外のTAA
のより深い研究を提供する−SELEX において使用される核酸ライブラリーのサイ
ズは、生物学的システムによって無比のものとなる； b. SELEXは、免疫寛容のために免疫系に対して抗原性でないものを含む標的に
対する核酸リガンドを提供する。同定されているTAA の多くは、胎児腫瘍性抗原
であり−これらは成長又は細胞分化時のいくつかの時点で発現される抗原である
。これらは、「自己」抗原となる前は、初期の免疫寛容のために、明らかな免疫
応答は惹起されない。TAA に関するSELEX を基にした研究は、腫瘍抗原を同定す
る手段として免疫系を使用することの堂堂巡りの性質(circular nature) を避け
る； c. SELEX核酸リガンドは、標的の高次構造に対する理にかなった感度であるこ
とが示されている。ほとんどの抗体は高次構造的、又は不連続のエピトープを認
識するが、抗体機能性エピトープはわずかに2 、3 個のアミノ酸で構成されてい
る。オリゴヌクレオチドリガンドの可能性のある表面結合は、抗体の可変領域の
それよりも非常に大きく、かつ大きい標的のより大きい高次構造上の識別を提供
することができる。加えて、SELEX リガンドに関する交叉反応性は、実質的にモ
ノクローナル抗体に関するものよりも問題が少ない。更にかなりの制約が、T-細
胞が媒介した腫瘍反応を制御する。これらの免疫系の限界は、重要な生物学的機
能を提供する；しかし、これらはTAA 同定に関する免疫系の力を制限する； d. SELEXは、恐らく小量の抗原に対して免疫系よりも感度がある。反応性に関
する免疫系の閾値は、抗原性MHC −提示ペプチドについて200 コピー／細胞であ
るのに対して、一価の標的に対するB-細胞の抗体応答（ペプチド以外の抗原−炭
水化物、脂質又は高次構造抗原にとって必要）は、抗原濃度約100mM を必要とす
る。SELEX は、細胞表面上に低く提示されたTAA 標的に対するリガンドを形成す
ることができる；及び e. SELEXは、TAA 発見の迅速かつ一貫した(thorough)方法を提供する。組織切
片に対するモノクローナル抗体のスクリーニング並びにMHC ペプチドの精製及び
同定は、TAA 探求の深さと完全性に関する実践的制約のある骨の折れる作業であ
る。組織SELEX 実験は、かなり短い時間を要する。
【００５３】 本発明の方法によって同定された組織標的又は組織エピトープに対する核酸リ
ガンドは、診断薬及び医薬品として有用である。この核酸リガンドは、新規巨大
分子の同定のためにも有用である。この核酸リガンドは、抗体の使用に適してい
るあらゆる用途において有用である。 核酸を治療目的に使用する際に遭遇する問題点のひとつは、リン酸ジエステル
型のオリゴヌクレオチドが、所望の作用を顕在化する以前に、エンドヌクレアー
ゼ及びエキソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外酵素により、体液中で容易
に分解されることである。核酸リガンドの特定の化学修飾を行い、核酸リガンド
のインビボ安定性を増大する、もしくは、核酸リガンドの送達を増強又は媒介す
ることができる。本発明で意図された核酸リガンドの修飾は、核酸リガンドの基
本部又は核酸リガンド全体に追加荷電、極性、疎水性、水素結合、静電的相互作
用、及び流動性を組込む他の化学基を提供するようなものを含むが、これらに限
定されるものではない。このような修飾は、2-位糖修飾、5-位ピリミジン修飾、
8-位プリン修飾、環外アミンの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモ又は5-イ
オド- ウラシルの置換；骨格の修飾、ホスホロチオエート又はアルキルリン酸の
修飾、メチル化、イソ塩基であるイソシチジン及びイソグアニジンのような一般
的でない塩基−対の組合せなどを含むが、これらに限定されるものではない。修
飾は、キャップ形成のような3'及び5' 修飾を含むこともできる。
【００５４】 核酸リガンドがSELEX 法によって得られる場合、修飾は、プレ- 又はポスト-S
ELEX修飾であることができる。プレ-SELEX修飾は、組織標的に対する特異性及び
改善されたインビボ安定性の両方を有する核酸リガンドを生じる。2'-OH 核酸リ
ガンドが形成されるポスト-SELEX修飾は、核酸リガンドの結合能に悪影響を及ぼ
すことなく、改善されたインビボ安定性をもたらすことができる。本発明の組織
核酸リガンドの好ましい修飾は、5'及び3'ホスホロチオエートのキャップ形成及
び／又は3'末端での3'3'転化したホスホジエステル結合である。ある好ましい実
施態様において、組織核酸リガンドの好ましい修飾 は、3'末端での3'3'転化さ
れたホスホジエステル結合、及びヌクレオチドの一部又は全部の2' フルオロ(2
'-F)及び／又は2'アミノ(2'-NH2)、及び／又は2' Oメチル(2'-OMe) 修飾である
。
【００５５】 診断薬としてのリガンド又は組織エピトープは、インビトロ診断及びインビボ
造影の両方の用途で使用することができる。本明細書に記載されかつ請求された
SELEX 法、一般にSELEX 法の特異的適合は、特に診断の用途に適している。SELE
X は、高親和性及び驚くほどの特異性を伴い標的に結合することができる核酸リ
ガンドを同定する。これらの特徴は、当然、診断用リガンドを求めている当業者
にとっては望ましい特性である。診断の用途でのリガンドの使用に関する詳細は
、当業者には周知である。腫瘍のような病原組織に特異的に結合する核酸リガン
ドは、ヒトでの腫瘍造影のような病的状態の造影、更には治療目的の細胞毒性化
合物又は免疫増強剤の送達においてさえも役割を果たすことができる。
【００５６】 本発明の核酸リガンドは、当業者によって使用される多くの技術に従って診断
目的に日常的に適用することができる。診断薬は、使用者が特定の位置又は濃度
で所定の標的が存在することを確認することができることのみを必要とする。簡
単に述べると、標的と結合対を形成する能力は、診断のための陽性シグナルの引
き金となるのに十分である。当業者は、リガンドの存在を追跡するために、標識
されているタグを組み込む当該技術分野において公知の方法によって、あらゆる
核酸リガンドを受け入れることができるであろう。このようなタグは多くの診断
法において使用される。例えば核医学の分野では、放射性診断薬が、生体の部位
の造影に有用である。1994年12月15日に出願された米国特許出願第08/358,065号
、及び1995年6 月7 日に出願された米国特許第08/488,290号は、両方とも発明の
名称は「金属錯体及びオリゴヌクレオチドによって製造された抱合体、抱合体含
有試薬、それらの放射診断における使用更にはそれらの製造法(Conjugates Made
of Metal Complexes and Oligonucleotides, Agents Containing the conjugat
es, their use in Radiodiagnosis as well as Process for Their Production)
」で、本明細書に参照として組入れられているが、これらの出願は、複合体試薬
に共有結合したオリゴヌクレオチド、更には99m-Tcのような造影放射性アイソト
ープも含有する診断薬を開示している。
【００５７】 特に、特定の腫瘍抗原に対して高度に特異的なオリゴヌクレオチドリガンドが
、癌の検出、造影及び検査においてモノクローナル抗体と同程度重要になってき
ている。修飾された核酸リガンドは、血漿中のヌクレアーゼ抵抗性を示し、かつ
5' 及び3'キャップ構造の使用は、モノクローナル抗体に匹敵する動物における
安定性を提供するであろう（及び動物由来のMAb の免疫原性を伴わない）。放射
性核種、磁性化合物などは、癌の造影のために、腫瘍- 特異性のオリゴヌクレオ
チドに抱合することができる。更にSELEX 腫瘍リガンドは、これらの腫瘍抗原が
腫瘍から脱落され(slough)、PSA のように血漿中で検出可能であるかどうかを決
定するために使用することができる。
【００５８】 組織標的又は新たに同定された組織の巨大分子成分に対する核酸リガンドも医
薬として有用である。治療的使用は、ヒト患者における疾患又は病的状態の治療
又は予防を含む。治療的用途は、動物への適用も含む。これらのリガンドは、受
容体に結合し、かつ受容体アンタゴニストとして有用である。対照的に、特定の
状況では、これらのリガンドは、受容体に結合し、受容体のキャッピングを形成
し、受容体アゴニストとして作用することができる。
【００５９】 医薬としての使用にとって望ましい核酸を生成するためには、核酸リガンドが
、(1) 標的に対する所望の作用を達成することが可能な方法で、標的に結合し；
(2) 所望の作用を得るのに限りなく小さく；(3) できる限り安定しており；かつ
(4) 選択された標的に対して特異的リガンドであることが好ましい。ほとんどの
状況において、核酸リガンドが、標的に対して可能な限り高い親和性を有するこ
とが好ましい。
【００６０】 本発明の核酸リガンドについて標準処方を使用することができ、これは当業者
にとって公知のものである。 下記実施例は、本発明の限定的でない説明を提供する。実施例１は、複合組織
標的である末梢血単核細胞(PBMC)に対するssDNA リガンドを得ることを説明して
いる。PBMCに対するリガンドには、癌のスクリーニングのためのリンパ節の造影
及びAIDSのモニタリングに使用されるフローサイトメトリーを含む多くの用途が
ある。
【００６１】 実施例２は、ヒトフィブリンクロットに対するRNA リガンドを得る能力を説明
する。これらのRNA リガンドのピリミジン残基は、糖の2'- 位でフッ素で修飾さ
れている。フィブリンリガンドは、下記のように診断薬として有用である。 循環フィブリノーゲンは、内在性及び外在性の凝血カスケードの通常の生成物
であるトロンビンの作用によって、不溶性フィブリンに転換される。フィブリン
は、血小板沈澱及びその後のフィブロブラストの浸潤を可能にするクロットのた
めのフィブリン網を提供する。フィブリンは、全ての血栓中に多量に存在し、血
小板が豊富な動脈クロット中にはフィブリンが豊富な静脈クロットよりもより少
なく存在する。更にフィブリンは、トロンビン及び内皮活性化及び平滑筋細胞増
殖をもたらすような他のマイトジェンを停留することにより、アテローム性動脈
硬化性プラークの巣及び再発狭窄性病巣を提供する。
【００６２】 血栓の非侵襲的検出及び局在化は、臨床診断における依然大きい挑戦であり続
けている。深在静脈血栓症(DVT) 及び肺塞栓症(PE)は、死亡率及び罹患率ともに
非常に高い。深在静脈血栓症(DVT) は、主な入院合併症であり、臨床検査の1/3
未満によって診断される。リスクのある患者は、大きい内科疾患、悪性疾患、一
般的腹部、胸部の手術、又は整形外科の大手術の既往のあるものを含む。高リス
ク患者は、40〜80％のDVT のリスクを、1 〜2 ％の致命的肺塞栓症(PE)のリスク
と共に有する (Weinmann及びSalzman 、New Engl. J. Med. 、331:1630-1641(19
94))。PEでは、年間50,000名が死亡する。PEの90％は、死に至ることは無いが、
以下の疾患の罹患率が高い：呼吸窮迫、肺梗塞、膿瘍、又は高血圧。PEの95％は
、DVT の合併症である。これらの状態の診断は困難で進歩がなく、かつ剖検時に
診断されていないPEの割合が高いことは注目に値するほど、長期間改善されてい
ない。Freiman らは、様々な死因の死体の連続剖検を行い、その64％において不
顕性PEの痕跡を発見した(Freimanら、N. Engl. J. Med.、272:1278-1280(1965))
。ほとんどアテローム変性に随伴する動脈血栓は、更に非侵襲的診断が困難であ
る。
【００６３】 静脈クロットの非侵襲的造影は、下肢の深在静脈系の超音波画像に頼っている
。これらの試験は限定され（一般に大腿部）、検査実施者によって左右されやす
い。PE診断は、一般に侵襲的肺血管造影法が第一の標準技法(gold-standard) で
あり、放射性アイソトープを使用する換気及び灌流スキャンニングによって行わ
れる。放射能標識されたフィブリノーゲンは組織学的に使用されている(Lensing
及びHirsch、Thromb. Haemost.( ドイツ) 、2:2-7(1993))。これは臨床的に顕在
化した後に、予期される投与又は血栓伸張(thrombus extension)のいずれかが必
要である。フィブリン又は血小板に対する放射能標識した抗体に関する多くの論
文が報告されている。これらは、トレーサー注入後12〜48時間で程よい画像が出
現するというように、感度は良いが時間がかかる。適正なシグナル／ノイズ比を
可能にする、血管系からの未結合抗体のクリアランスのために、画像形成を遅ら
せる必要がある。冠動脈疾患の有意でない画像が報告されている。推測によると
、左心房の血液プールの厚さが、小さい重なっている心外膜の冠動脈からのシグ
ナルを有意に不明瞭にしている。動脈造影は、抗フィブリン又は抗血小板抗体を
用いて、大動脈又は大腿動脈のような比較的太い血管で行われている。両抗体と
も問題点がある：抗フィブリン抗体は、あまり接近できず(poorly accessible)
かつクロット安定化及び繊維素溶解を通じて一貫して変化しているようなエピト
ープに結合する；抗血小板抗体は、循環血中に存在するエピトープに結合し、こ
れにより、そのバックグラウンドを上昇する。小動脈の疾患検出に意味のある高
解像度には、高い特異性、未結合物質の迅速なクリアランス、及び恐らく３次元
断層写真の技法が必要である。多くの点で、RNA リガンドは、これらの診断法に
適した物質である。肺塞栓症の優れた非侵襲的診断検査は、特に臨床的に意義の
あるものであろう。
【００６４】 実施例３は、ラットの狭窄性頸動脈に対するRNA リガンドを得る能力に関する
。狭窄性頸動脈リガンドは、以下の診断及び医薬品として有用である。 アテローム性動脈硬化症は、世界中で主要な死因である。この病理組織に対す
る治療薬及び診断薬を同定しかつ標的化する多くの努力がなされている。実験的
にはアテローム性動脈硬化には、理想的動物モデルがないという欠点がある。げ
っ歯類の血管は、特に新生血管内膜(neointima) の点で霊長類とは顕著に異なる
。霊長類モデルは高価である。ブタ又は「ミニブタ」は、再発狭窄モデルを提供
するが、原発性アテローム性動脈硬化症の良好なモデルは提供しない。最近にな
って、トランスジェニックマウスモデルが利用できるようになったが、依然限定
的である。
【００６５】 アテローム性動脈硬化の機序及び構成要素は完全には定義されていないが、ほ
とんどの研究者は、平滑筋細胞が重要な役割を果たしている点では同意している
。内膜でのこれらSMC の増殖及びある種の「活性化」については合意が形成され
ている。ラットのバルーン損傷頸動脈モデルは、動脈損傷に対する反応の最良の
解明モデルのひとつである。このモデルには限界があるにもかかわらず、内皮の
損傷に反応して、増殖反応がSMC に関連して原発的に惹起されることについては
明らかな証拠がある。この組織更にはSMC 活性化のシグナルの寄与、移行及び増
殖、更には細胞外マトリックスの沈澱から、多くの固有のタンパク質が同定され
ている。このようにこれは、最狭窄、及び直接性は低いが原発性のアテローム性
動脈硬化症の実行可能なモデルである。
【００６６】 ラットのバルーン損傷頸動脈(RBIC)モデルは、核酸リガンドは、密接に関連し
た正常組織の除外のために病理組織を認識することが可能であるようなSELEX 方
法論によって進化され得るという仮説を検証するための独特なモデルを提供する
。RBIC は、それらの組成及び構造に関して比較的良好に理解されており、入手
が簡単な実験動物において、容易かつ再現性を伴って行うことができ、かつヒト
病態と関連している。
【００６７】 実施例４は、エクスビボSELEX の12ラウンド、それに続くインビボ富化の12ラ
ウンドに関連した、ラットの狭窄性頸動脈に対するRNA リガンドを得る第二の実
験を説明しており、これはその後1 配列（クローン12.2；配列番号：242 ）が、
最終の富化ライブラリーの48％を代表していることが確定された。この配列は、
投与後1 時間で、バルーン損傷頸動脈中に1.4 ±0.4 ％注射用量／g(ID/g％) が
蓄積したのに対し、対側の冠動脈中には0.1 ±0.05ID/g％であった。1 時間後の
血中レベルは0.2 ±0.06ID/g％であった。組織特異性（バルーン損傷：頸動脈：
正常頸動脈）は、14(p＜0.05) であり、バックグラウンドに対するシグナル（バ
ルーン損傷：頸動脈：血液）は7(p ＜0.05) であった。
【００６８】 実施例５は、アテローム性動脈硬化症のWatanabe遺伝性高脂血症(WHHL)ウサギ
モデルを用いて、血管組織に対するRNA リガンドを得る能力を示す。WHHLウサギ
のプラーク組織リガンドは、診断薬及び医薬品として有用である。WHHLウサギモ
デルは、血管病理が誘発された部位に特異的に蓄積する核酸リガンドを同定する
ための、及びインビボ 造影剤の開発のための新規技法を提供する。この実施例
において、プラークWHHL血管組織に対して、非- プラークWHHL血管組織又は血管
組織よりも3.5 〜1O倍増強された親和性を有する、核酸リガンド（クローン10.3
1 ；配列番号：268 ）が同定された。
【００６９】 実施例６は、ヒトアテローム性動脈硬化症プラーク組織と、WHHLウサギアテロ
ーム性動脈硬化症プラーク組織に対する核酸リガンドのインビトロ結合を説明し
ており、これはWHHLウサギ- 由来の核酸リガンドが、ヒトアテローム性動脈硬化
症プラーク組織と交叉反応性であることを示している。 実施例７は、実施例５で同定された、クローン10.31 （配列番号：268 ）がウ
サギの血管プラークに蓄積することを示している。
【００７０】 実施例８は、実施例５で同定された99m-Tc- 標識されたクローン10.3のin vi
tro 結合、インビボ造影及び生体分布を説明している。りん光- 造影は、投与用
量の15％が、プラーク化された動脈に蓄積されていることを示し、このことはイ
ンビボ造影剤がこの方法で開発できることを示唆している。 実施例９は、WHHLウサギ及び非アテローム性動脈硬化症のニュージーランド白
ウサギの両方におけるWHHLウサギ由来の核酸リガンドのインビボ造影及び生体分
布の比較を説明している。大動脈弓は、WHHLウサギにおいて観察されたが、ニュ
ージーランドウサギでは認められなかった。
【００７１】 実施例10は、トランケートの活性に対する置換の作用を試験するための、トラ
ンケートのプリン位が2'-OMeで置換されたWHHLリガンド10.31 （配列番号：268
）のトランケーション及びポスト-SELEX修飾について説明している。 実施例11は、ヒトアテローム性動脈硬化症冠動脈セグメントに関する組織SELE
X を示す。
【００７２】 実施例１ 末梢血単核細胞(PBMC)へのssDNA リガンド 本実施例は、複合組織標的であるヒト末梢血単核細胞(PBMC)に対するssDNA リ
ガンドを得る能力を示す。PBMCは、以下に記したように全血から単離され、かつ
B リンパ球、T リンパ球及び単球を含む細胞型の複合混合物を含む。PBMC への
リガンドは、癌のスクリーニングのためのリンパ節の造影及びエイズのモニタリ
ングのためのフローサイトメトリーの使用を含む多くの使用を有する。
【００７３】 A. 材料及び方法 PBMCの単離 新鮮なヒトの血液を、ヘパリン処理した減圧容器(vacutainer)中に採取し、全
血最大35mlを、50mlポリエチレン製コニカルチューブ中のフィコール(Sigma His
topaque 1077（登録商標）)10ml の上に重ねた。この試料を400 x g で30分間室
温で遠心分離し、血液を3 層に分離した：フィコール下の赤血球(RBC) 、フィコ
ールのすぐ上の末梢血単核細胞（PBMC、B リンパ球、T リンパ球及び単球を含む
）、並びにPBMCの上の無細胞血漿である。遠心分離後、不透明なPBMC境界0.5cm
中へと、血漿をパスツールピペットで吸引した。このPBMC境界は、「バッフィコ
ート(buffy coat)」とも称されるが、これをパスツールピペットで15mlのコニカ
ルチューブへと移し、リン酸緩衝生理食塩水10ml（PBS 、137mM NaCl、2.7mM KC
l 、10.1mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4）を添加し、かつ細胞を穏やかに吸引するこ
とによって洗浄した。次に細胞を、250 x g で10分間室温で遠心分離し、かつ上
清を吸引し破棄した。細胞のペレットを、5ml PBS 中で再懸濁し、穏やかに吸引
して混合し、250 x g で10分間室温で遠心分離し、かつ上清を吸引し破棄した。
この洗浄工程を3 回繰り返し、細胞を最終容量0.3ml PBS に再懸濁し、1.7ml の
エッペンドルフ管へと移し、氷上で保存した。PBMCの収量及び生存力を、細胞を
PBS 中で1 ：50希釈し、0.4 ％トリパンブルーを等容量添加し、かつ生存細胞を
血球計数器を使って計測して決定した。典型的収量は、106 細胞／ml全血であり
生存力＞95％であった。
【００７４】 縮重ssDNA ライブラリーの作成 不変プライマーアニーリング部位に隣接された40個のランダムヌクレオチドを
含む合成DNA オリゴヌクレオチドのライブラリー（オリゴヌクレオチド1 、5'-A
GGGAGGACGATGCGG-[N]40-CAGACGACTCGCCCGA-3' ）（配列番号：1 ）を、ポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR) により、プライマーとして、オリゴヌクレオチド2(5'-AGGGA
GGACGATGCGG-3')(配列番号：２) 及び3 (5'-( ビオチン)3-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'
)(配列番号：3)を用いて３サイクル増幅した。オリゴヌクレオチド3 は、その5'
末端に結合され3 個のビオチンホスホロアミドを有した。72個のヌクレオチド二
本鎖生成物を、等容量のホルムアミドを添加し、95℃で3 分間加熱することによ
って変性し、8M尿素を含有する8 ％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。
ビオチンタグを持たないDNA 鎖は、ビオチン化された鎖よりも早く移動し、かつ
これをゲルから切り出して単離し、2mM EDTA 0.4ml中で潰し、15分間緩やかに攪
拌・溶出し、かつ微量遠心分離フィルターユニット(CoStar Spin-X) を用いて5
分間遠心分離し、ゲルスラリーからssDNA を分割した。回収されたssDNA を、0.
5M NaCl 及び2 倍容量のエタノールで沈殿し、遠心分離してペレット化し、70％
エタノール0.4ml で1 回洗浄し、乾燥し、かつ脱イオンした蒸留水 (ddH2O)中に
再懸濁した。
【００７５】 PBMC親和性及び増幅の選択 PBMCの縮重ssDNA ライブラリーの親和性を、細胞- 過剰ニトロセルロースフィ
ルター結合アッセイを用いて決定した(Careyら、Biochemistry、22:2601-2609(1
983)) 。PBMC表面上の可能性のあるDNA 結合標的の数は不明であるから、親和値
は、このアッセイにおいて半分の飽和を示す細胞濃度として報告した（細胞単位
／μl ）。PBMC親和性の選択は、非増幅競合物として作用しかつ緊縮度を増加す
るようにDNA を過剰量添加されたヘパリン（Calbiochem、平均分子量5000）によ
って、利用可能な標的部位を飽和すると予測されたDNA-過剰条件下で行った。PB
MC、DNA 、及びヘパリンは、37℃で15分間平衡化し、かつPBMC：DNA 複合体を、
ろ過により遊離DNA から分離した。PBMC- 独立体（バックグラウンド）のDNA 保
持を、同様の反応を欠くPBMCをろ過することにより測定した。フィルターを、１
mlの洗浄緩衝液(50mM トリス酢酸、pH 7.4) で予め湿らせ、その後試料を塗布し
、洗浄緩衝液5ml で洗浄し、非結合のDNA を除去した。選択9-21のために、洗浄
緩衝液に0.5M尿素を添加し、更にバックグラウンド保持を低下した。フィルター
への親和性を持つDNA を富化する可能性を最小化するために、我々は、特に3 種
の異なるフィルターで変更した：ニトロセルロース(Millipore、タイプHA、0.45
μm)、アクリル−被覆ナイロン(Gelman Sciences、Versapor450 、0.45μm)及び
マイクロガラスファイバー(Whatman GF/C)。
【００７６】 最初の選択のために、14μM DNA(70pmoles又は約4 x 1013分子) を、100 μM
ヘパリンで平衡化し、50μl PBS 中のPBMCの最終濃度を40,000、20,000、10,000
、5,000 、及び2,500 細胞とした。PBMCに複合化しかつフィルターに保持された
総DNA 分画を、シンチレーションカウンター中でCerenkov放射を測定することに
よって算出した。総DNA の関数としての結合したDNA 分画をプロットし、1 細胞
あたりの結合したDNA 分子数に等しい勾配の直線関係を示した（1 細胞あたりの
DNA 結合標的の数の推定値）。その後の選択5-9 の各々について、PBMC濃度を試
験し、かつこの形式でプロットし、DNA ／細胞値を記録した。各選択についてフ
ィルター結合剤の富化を低下することを更に試み、総DNA の1 ％〜10％に保持さ
れた細胞濃度を伴い、かつ可能であるならばPBMC- 独立( バックグラウンド) の
保持量よりも少なくとも10倍多いDNA を伴うフィルターを、更なる増幅及び富化
に選択した。Tuerk 及びGoldの論文（Science 、249:505-510(1990) ）に記され
たように、選択されたDNA をフィルターから収集し、PCR により増幅し、かつ前
述の8 ％ポリアクリルアミド、8M尿素ゲル上での電気泳動によりサイズにより精
製した。富化は連続する選択を通じて進行するので、緊縮度はDNA 濃度を低下し
ヘパリン濃度を増大することによって上昇し、かつ選択#12-21については、PBS
の代わりに新鮮なヒト血漿中で選択を行った。血漿成分に対して高い親和性を伴
うPBMC- 結合DNA 分子はこのライブラリーから激減されるので、血漿中の選択の
実行は、特異性の要素を加える。DNA 、PBMC、及びヘパリン濃度、更には他の関
連する選択データを、表1 にまとめた。
【００７７】 単離物のクローニング及び配列決定 選択#21 の後、選択されたライブラリー2pmol を、プライマーとして、オリゴ
ヌクレオチド4(5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3'、Hind III制
限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、下線)(配列番号：4)及びオリゴヌクレオ
チド5(5'-GCCGGATCCTCGGGCGAGTCGTCTG-3' 、Bam HI部位、下線)(配列番号：5)を
用い、PCR により増幅した。二本鎖生成物を8 ％ポリアクリルアミドゲル上でサ
イズにより精製し、かつ前述のように回収した。PCR 産物15pmolを、Hind III及
びBamHI で、pUC19 1pmol(全てNew England Biolabs から入手) と共に、37℃で
3 時間消化した。消化の後、試料を各1 容量のフェノール及びクロロホルムで抽
出し、前述のように沈殿して回収した。選択されたライブラリーを、DNA リガー
ゼ(New England Biolabs) によりpUC19 に37℃で3 時間ライゲーションし、かつ
このライゲーション生成物をE.coli DH1α細胞に、電気穿孔形質転換により導入
した。
【００７８】 成功した形質転換体からのベクターを標準のプラスミド少量調製(mini-prep)
プロトコールを使って単離し、かつ末端を標識したオリゴヌクレオチド 6 (5'-T
TCACACAGGAAACAG-3')(配列番号：6)を、Sequenase T7 DNAポリメラーゼ(United
States Biochemical) と共に用いるジデオキシ伸張により配列決定した。これら
の技法に関する詳細な説明は、Schneider らの論文（FASEB 、7:201-207(1993)
）を参照のこと。より多量の個々のリガンド( ＞20pmol) を、プライマーとして
オリゴヌクレオチド2 及び3 を用いるPCR によるベクター挿入物の増幅、並びに
前述のような生成物の変性及びサイズによる精製により調製した。
【００７９】 PBMC：DNA 複合体の崩壊を測定する競合アッセイ PBS を溶媒とする100 μM ヘパリンを含有している反応液20μl 中において、
10nM末端- 標識したDNA が、37℃で10分間 PBMC (10,000 細胞／μl)の飽和濃度
と平衡になるようにした。その後、標識していない競合DNA 5 μl を、最終濃度
が1.25nM〜3.2 μM の範囲になるように添加し、かつ37℃で10分間平衡化した。
反応液をろ過し、フィルター上に保持された総標識されたDNA の割合を記録した
。
【００８０】 B. 結果 PBMCへの親和性は40- 倍富化され、かつヘパリン依存性であった 選択及び増幅によって21ラウンド富化した後、PBMCのDNA ライブラリーの親和
性は40倍富化された。PBS 及び100 μM ヘパリン中の細胞−過剰な滴定において
、縮重ライブラリー(DNA-O) は、43,500細胞／μl で半分の飽和を示した一方で
、完全に富化されたライブラリー(DNA-21)は、1,000 細胞／μl で半分の飽和を
示した。DNA-O 及びDNA-21の間の親和性の差は、ヘパリン依存性であり、かつ10
〜100 μM の範囲で最も感受性があった。10μM 以下では、ランダムライブラリ
ーの結合は、選択されたライブラリーのものに近づくが、他方100 μM 以上では
、選択されたライブラリーへの結合は減少し始め、ランダムライブラリーのもの
に近づいていく。ヘパリン濃度とDNA 結合の間の関係は、PBMC上の非特異的結合
部位と効果的に競合するヘパリンの能力を示している。
【００８１】 富化されたライブラリーは保存されたエレメントを伴うファミリーからなる 富化されたライブラリーから、34メンバーを単離し、配列決定し、表2 に示し
た( 配列番号：7 〜39) 。これら34配列の中の33個は独自であり、かつ29個は、
40ヌクレオチドランダムカセット内の2 つの位置において配列TAGGG(又は1 塩基
を取り除いた変異) を含んでいる。TAGGG ペンタマー(pentamer)によって並置し
た場合、追加の保存エレメントが明らかにされ、かつ表２に示されたファミリー
への単離体の分類に使用された。富化されたライブラリーからの34種の単離体の
配列は、それらの保存されたTAGGG エレメント（太字）によって並置し、かつ他
の保存されたエレメントを共有するファミリーに分類した。進化した40種のヌク
レオチドカセットの配列のみがこの並置に示されている。不変のフランキング領
域の配列を枠の中に示し、かつこれは配列番号：1 のものと同じである。2 個以
上のG 残基の連続には下線をつけた。更に特徴付けるために選択された10種の単
離体には黒点をつけた。コンピュータアルゴリズムでは、選択されたリガンドに
ついて安定した二次構造を同定することができず、これは恐らくランダムカセッ
ト内のピリミジン残基（特にC 残基）の全般的欠如によるものであろう。しかし
、複合体のより高次の構造の保存は、多くのGGエレメント（表２で下線をつけ、
かつG-4 つ組モチーフの形成と一致する）がランダム領域のために選択されかつ
不変フランキング領域の上流に存在することを除外することはできなかった。
【００８２】 富化されたライブラリーからの単離体は高親和性でPBMCに結合する 選択されたPBMCファミリーの親和性を比較するために、各々の中の1 員を結合
アッセイのために選択した（表２において黒点で示した）。PBS 及び100 μM ヘ
パリン中の選択されたリガンドの親和性は、リガンドL9以外は400 〜3,000 細胞
／μl の範囲であり、L9は保存されたTAGGG エレメントを欠いており、表３にお
いて15,400細胞／μl で半分飽和を示した。
【００８３】 PBMCには結合するがRBC には結合しない富化されたライブラリー DNA リガンドがPBMCに対して高親和性を示すのみではなく、PBMCに対して特異
的結合を示す場合には、これが最も有用である。前述の細胞−過剰結合アッセイ
を用いて、DNA-O 及びDNA-21の、ヒトPBMC、ラットPBMC、及びヒト赤血球(RBC)
に対する親和性を比較した。PBS 及び2.5mM ヘパリン中において、ラットPBMCは
、各DNA ライブラリーとのそれらの相互作用においてヒトPBMCを模倣する。PBS
及び100 μM ヘパリン中において、DNA-21はDNA-O よりもより良くヒトRBC へ結
合したが、細胞濃度は105 ／μl 程度であり（DNA-21に対するPBMC結合の飽和条
件）、RBC は、わずかに5 ％のDNA-21への結合及び1 ％未満のDNA-O への結合を
示した。
【００８４】 DNA ：PBMC複合体はDNA 競合物により破壊される 死滅した細胞の特徴は、内部DNA のポンプによる排泄ができないことである。
結合アッセイにおいて認められたDNA 結合が、死滅細胞による内在化よりもむし
ろ生存細胞の表面上への複合体形成の尺度であることを示すために、我々は飽和
濃度のPBMCを放射能標識したDNA-21に予め結合し、かつその後過剰な様々な濃度
の非標識DNA-21を追跡した。データを競合物濃度の関数として結合した標識DNA
の割合としてプロットした場合、S 字型(sigmoidal) 相関関係が認められ、これ
はおよそ20nM競合物での1/2 飽和を示し、競合物濃度が増すにつれてゼロに近づ
くことがわかった。このデータをスキャッチャード（scatchard)としてプロット
した場合は、ふたつの型の相互作用が認められた： Kd 8nM 及び化学量論的には
3 x 105 DNA ／細胞である高親和性相互作用、及び Kd 値が460nM 及び化学量論
的には3 x 106 DNA ／細胞である低親和性相互作用である。死滅したPBMCによる
DNA の内在化は、これらの結果とは一致しせず、予め結合したDNA-21の全てが、
1000nM以上の非放射能標識DNA-21の濃度では競合した。 実施例２ ヒトフィブリンクロットへの2'-F RNAリガンド この実施例は、ヒトフィブリンクロットに対するRNA リガンドを得る能力を説
明している。これらのRNA リガンドのピリミジン残基は、糖の2'- 位でフッ素で
修飾されている。このフィブリンリガンドは、先に記した診断薬において有用で
ある。 A.方法 クロット形成 ヒトの血液を、EDTA減圧チューブ(Becton-Dickenson)に採取し、臨床検査用遠
心分離機を用い4 ℃で回転した。血漿を除去し、-70 ℃で保存した。ガラスチュ
ーブ中で、CaCl2 を最終濃度20mMとなるよう添加し、37℃で12〜16時間インキュ
ベーションし、クロットを形成した。
【００８５】 SELEX プロトコールについては、ガラスハンガー(glass hanger)の下でクロッ
トを形成した。クロットは、20℃で2 時間、125ml 0.01M HEPES 、O.125M NaCl
、2mM MgCl2 、pH7.5 （フィブリン緩衝液）を連続して交換し、洗浄した。 インビトロアッセイのためには、96- ウェルのマイクロタイター皿中で、50ml
血漿の再カルシウム沈着により、クロットを形成した。37℃の加湿器の中に12〜
16時間放置した後、クロットを4 x 200 μl の緩衝液を15分毎に交換して洗浄し
た。
【００８６】 インビボ肺塞栓症アッセイのためには、前述のようにクロットを、再カルシウ
ム沈着した血漿から形成した。血漿2ml から得たクロットを枠に入れ(rimmed)、
かつ臨床検査用遠心分離機を用い10分間遠心分離した。これらは2ml 緩衝液と共
に遠心分離して洗浄した。その後クロットを、Tissue-Tearor(Biospec Products
) を用いて1 分間低速でホモジナイズした。ホモジネートを、3 x 2ml 緩衝液で
洗浄し、引き続き、各々18、20、21、22及び23ゲージ(Ga)針を通した。ホモジネ
ートは、最初の血漿容量に対して0.5 容量の緩衝液中に再懸濁した。
【００８７】 RNA プールの作成 このSELEX のためには、2'F-ピリミジン、2'OH- プリンRNA を用いた。最初の
DNA 鋳型である40N8を、固相自動DNA 合成装置を用い常法により合成し、かつ配
列gggagauaagaauaaacgcucaa-40N-uucgacaggaggcucacaacaggc( 配列番号：40) を
有した。全てのその後のPCR ラウンドは、5' 及び3'プライマーとして、各々、
プライマー 5'-taatacgactcactatagggagauaagaauaaacgcucaa( 配列番号：41) 及
び5'-gcctgttgtgagcctcctgtcgaa(配列番号：42) を用いた。 PCR、逆転写及びT7
RNAポリメラーゼによるRNA の形成は、先に記したように行った。2'F RNA の転
写は、ATP 及びGTP 各1mM （α-32P-ATP存在又は非存在）、並びに2'F UTP 及び
2'F CTP 各3mM 存在下で行った。転写は、37℃で5 〜14時間かけて進行し、その
後ホルムアミド及び7M尿素含有−ゲル電気泳動により精製した。
【００８８】 SELEX プロトコール 本SELEX に使用される一般的プロトコールは、表４に概略した。血漿0.5ml か
らのクロットを、フィブリン緩衝液中の2'F RNA プールの1 〜4mM 溶液に、20℃
で1 時間浸漬した。クロットは、各々4 x 1ml 緩衝液に30分間浸漬することによ
って洗浄した。その後クロットを鋭利な刃で液浸し柔らかくし、0.6ml フェノー
ル及び0.45ml 7M 尿素中で1 時間激しく振盪した。相分離を誘導するために0.4m
l CHCl3 を添加し、引き続き14,000RPM で遠心分離した。水相を、等量の1:1 フ
ェノール：CHCl3 で、その後CHCl3 で抽出し、かつNaOAc 及び担体としてのtRNA
存在下で、1:1 イソプロパノール：エタノール15mlで沈殿した。一般に、1 回の
SELEX ラウンドから、0.5 〜10pmole のRNA が回収された。
【００８９】 このプールが緩衝液中の結合の増加の徴候を示した後に、SELEX に緊縮性及び
特異性を加えた。まずSELEX の7 ラウンド後に、SELEX 結合反応を、ヘパリン-
抗凝血剤添加血漿中で行った。その後緩衝液中で洗浄した。それ以降のラウンド
においては、洗浄もヘパリン化血漿中で行った。クロットサイズ又はRNA 濃度の
変更は試みなかった。この方法で行った最初のSELEX は、顕著な量のフィブリノ
ーゲン交叉反応性を生じた。第一回目のラウンド6 から分岐して第二回目のSELE
X を行い、この時点でフィブリノーゲン「逆-SELEX」を添加した。1mM の転写さ
れたプールRNA 1 〜4nmoleを、ヒトフィブリノーゲンと予備混合し、最終濃度25
μM とした。15分間37℃でインキュベートした後、この溶液を、3 枚の直径1cm
、0.45ミクロンのニトロセルロースフィルターを通して2 回ろ過した。これは、
80〜90％のタンパク質の除去をもたらした。ろ過したRNA を、再度定量し、クロ
ットSELEX 反応に加えた。
【００９０】 配列の並置 クラスターアルゴリズム クラスターは、増大しつつあるコンセンサス内のギャップ位置を再度最適化す
ることにより複数の配列の並置を行うプログラムである。このアルゴリズムはふ
たつの部分からなる：配列の並置及びクラスター化。配列の並置は、Altschul及
びEricksonの動的に(dynamic) プログラムされたアルゴリズムを使用し(Altschu
l 及びErickson、Bulletin of Mathematical Biology、48:603-616(1986)) 、演
繹的統計ベースについて選択された重みベクター(weight vector) 、すなわち一
致(match) ＝1.O 、不一致＝-1/3、ギャップオープニング＝-1.O、及びギャップ
延長＝-1/3を用いた。並置の総コストは、Altschulの準天然の(quasi-natural)
ギャップコストを利用し、コンセンサス内での各対の並置の合計である(Altschu
l 、J. Theoretical Biology、138:297-309(1989))。並置コストを標準化し、異
なる配列数を含む並置間の比較を可能にしている。クラスターにおいて使用され
た標準化は、一致する位置毎の最も可能性のあるものに対する並置を比較する。
【００９１】 標準化されたスコアは、最も可能性のある並置のコストで除された並置のコス
トである。K-Means アルゴリズムは、配列をファミリーにクラスター化する。こ
こでこのアルゴリズムは、距離測定としての並置のコストを適合するように、本
来のバージョン（Tou 及びGonzales、Pattern Recognition Principles、1974年
、Addison-Wesley Publishing Company ）からわずかに変更されている。これら
が単に1 ファミリーである場合、又はいずれか2 種のクラスターを一緒にするコ
ストが閾値を越える場合に、収束進化が生じる。最適化（工程3 ）は、配列のサ
ブセットを引き出し、かつこれらを論文（Subbiah 及びHarrison、J. Mol. Biol
. 、209:539-548(1989) ）に記されたように再度並べる。
【００９２】 フィブリノーゲン結合 フィブリノーゲン結合は、SELEX 特許出願に開示されているような標準のニト
ロセルロースフィルター結合アッセイにより測定した。 インビトロクロットアッセイ マイクロタイターウェル中のクロット50μl に、100 μl 中5,000 又は25,000
CPM（約0.5 又は2.5pmoles ）を添加した。クロットを1 時間インキュベートし
、引き続き4 x 200 μl の緩衝液で各15分間洗浄した。マイクロタイターウェル
を、存在するシンチラントについて直接計測した。
【００９３】 インビボ肺塞栓症アッセイ 前述のようにクロットのホモジネートを血漿200 μl から調製し、100pmoles
（約1 x 106 CPM ）で22℃で15分間混合し、その直後、スプラーグ−ドーリー系
ラットのオスで体重 200〜250gm の動物に、懸濁液を23- ゲージ針を用いて尾静
脈から注射した。予め定めた時点で、動物を放血屠殺し、肺を摘出した。わずか
1 葉の左肺を、1 枚のワットマンろ紙上に押し付け、ゲル乾燥器で80℃で2 時間
乾燥し、オートラジオグラフィーにかけた。多右葉肺を緩衝液1ml 中でホモジネ
ートし、シンチラントで定量した。
【００９４】 組織学的オートラジオグラフィー クロット- 結合RNA を可視化するために、組織学的オートラジオグラフィーを
用いた。RNA は、5'- 末端をγ-33P-ATPで標識した。結合は、SELEX 反応又はイ
ンビボ肺塞栓症アッセイについて説明したように行った。組織を、少なくとも24
時間、10％中性緩衝化したホルマリン中で固定し、パラフィン処理し、かつポリ
-L- リシンスライド上で5 μm 切片とした。60℃の炉で乾燥した後、これらを脱
パラフィンし、露光する前に再度水和した。肺は、通常の生理食塩水で右心房か
ら灌流し、かつ摘出する前に10％ホルマリンで膨張させ、固定しかつ包埋した。
スライドを、融解した核乳液(Amersham LM-1) 中に液浸し、乾燥させ、かつ4 ℃
で露光した。スライドを、Dektol現像液(Kodak) 中で現像し、定着し(Kodak Fix
er) 、ギムザ染色した(Sigma) 。
【００９５】 B.結果 2 種の個別のSELEX 実験を、表４に概略を示したように、フィブリンクロット
について行った。これら2 種のSELEX 実験は、逆-SELEXの程度及び方法が異なっ
た。第一のSELEX 実験（FCと称す）では全11ラウンドを行った。結合反応は、最
初の7 ラウンドについては、緩衝液中で行った。ラウンド8 及び9 については、
ヒトのヘパリン化血漿中で結合を行った。最終ラウンドは、ヒトのヘパリン化全
血中で行った。全てのラウンドにおいて、クロットは、フィブリン緩衝液で洗浄
した。第二のSELEX 実験（FCN と称す）においては、第一とは、最初の富化を示
したのがラウンド6 である点が異なった。フィブリノーゲン逆-SELEX の25μM
を、ラウンド6 で開始する各ラウンドに添加した。加えて、ラウンド7 〜14につ
いては、結合反応をヘパリン化ヒト血漿中で行い、かつクロットを、生理的緩衝
液の代わりに血漿で洗浄した。ヘパリン化血漿の存在下で、最終ラウンドプール
は各々、2.5 ％及び6.4 ％結合していた。第一及び第二のSELEX 実験について、
各々、ラウンド12及び14プールを配列決定した。両方の場合、RNA 配列決定は、
かなりの非ランダム度(nonrandomness) を示した。これらのプールを、5'及び3'
末端に、各々EcoR1 及びHindIII 部位を含む新規プライマーにより増幅し、pUC1
8 にクローニングした。
【００９６】 クロット結合の可視化 最初のSELEX 由来のラウンド11プールを、33P により5'- 末端を標識した。こ
のプールを、フィブリン緩衝液中でSELEX と同じ方法でクロットと混合した。洗
浄後、クロットをホルマリンで固定し、包埋し、切片とし、かつオートラジオグ
ラフィー用乳剤の上に載せた。この切片を現像したところ、RNA （黒色粒として
可視化された）がクロットの外側を覆っており、一部がクロットの間隙に拡散し
ていることが示された。別の実験において、ラットのPEモデルについて、33P キ
ナーゼリン酸化されたリガンドを用いて行った。プールをホモジナイズしたクロ
ットに予備結合し、かつラットの尾静脈から注射した。15分経過後、ラットの肺
床(pulmonary bed) に右心房から生理食塩水を灌流した。肺は膨張し、かつ気管
へ10％ホルマリンを注射して固定し、その後摘出し、ホルマリンに漬けた。組織
は前述のように処理した。組織は、静脈内クロットに密接した部分にのみ黒色粒
を示した。閉塞血管の下流のRNA 貯留(pooling) の痕跡は無かった。更に、試験
を進化していないラウンドO プールについて行った場合は、黒色粒は肺には認め
られなかった。
【００９７】 配列分析及び活性スクリーニング 各々の72クローンを配列決定した( 配列番号：43〜130)。88の独自のクローン
が認められ、かつ15クローンは、わずか1 個のヌクレオチドのみが異なっていた
。この配列は分析のために一緒にし、クラスターの適用及び表５に示された肉眼
による検証により、配列モチーフにグループ化した。進化した40ヌクレオチドカ
セットの配列のみをこの並置に示している。不変のフランキング領域配列が各ク
ローンに含まれ、これは配列番号：40のものと同じであった。両SELEX に由来す
る独自のクローンを一緒にしてクラスター分析し、これらは17の個別のモチーフ
を形成していた。27/88 クローン(31 ％) が、2 個の主なモチーフにグループ化
された。モチーフI 及びIIは、各々15及び12のメンバーを有していた。第三のモ
チーフ（モチーフIII ）は、主に第一のSELEX 由来の9 メンバーを含み、かつモ
チーフI と類似の特性を有していた。これらのモチーフ中の4 種が、各々わずか
に2 メンバーのみを有していた。
【００９８】 定性的インビトロマイクロタイタープレートアッセイにおいて、結合のための
78/88(89％) クローンをスクリーニングした。これらのクローンを、高、中及び
低親和性にグループ化したところ、各群メンバーは、37、10及び31であった。ス
クリーニングした78クローン中46をフィブリノーゲン- 結合活性について更にス
クリーニングした。このスクリーニングは、0.1 〜10μM のフィブリノーゲン濃
度の4 点曲線(four point curve)を使用する標準ニトロセルロース結合アッセイ
であった。これらのクローン中の16を、インビボでのラット肺塞栓症アッセイで
のクロット結合について更にスクリーニングした。これらの各々の結果を表５に
示した。
【００９９】 主な2 種の配列モチーフの27クローン中の24を、マイクロタイタープレートア
ッセイにおいて結合を最初にスクリーニングし評価した。これらの中で、15/24(
63％) は、高- 親和性又は中- 親和性クロット結合物と特徴付けられた。フィブ
リノーゲン- 結合のスクリーニングは、更に、高、中及び低親和性群に分かれ、
各群、14、6 及び26であった。フィブリノーゲン- 結合スクリーニングにおいて
、高- 親和性結合物は、Kd＜1mM の場合であり、低- 親和性結合物はKd＞1mM の
クローンを含んだ。
【０１００】 モチーフI において、10/11(91％) が、フィブリノーゲン結合について、高-
又は中- 親和性であったのに対して、モチーフIIでは、0/9(O ％) が、高- 又は
中- 親和性フィブリノーゲン結合群に属した。モチーフI 、IIの11メンバーを、
インビボ PE アッセイにおいて試験した。結合反応が緩衝液中で行われた場合に
は、モチーフI 由来のクローンは、クロット結合に関してモチーフIIよりも平均
40％の上昇を示した。しかし、結合反応がヘパリン化血漿中で行われる場合は、
モチーフI は、結合の90％の減少を示す一方で、モチーフIIはわずかに10％減少
した。フィブリノーゲン結合度に関して、モチーフI とIIの間には明確な差異が
存在した。モチーフI は、モチーフIIよりわずかに大きい程度でクロットに結合
したが、著しい程度の交叉反応性を有していた。より厳密なフィブリノーゲン結
合曲線は、モチーフI のクローンがKd値200 〜600nM を有することを示した。モ
チーフIIのKd値（フィブリノーゲン）は、正確に定量化するにはあまりにも高か
った。結合の1 〜3 ％は、10μM の最高のフィブリノーゲン濃度であることが認
められた。100 μM 以上のKdは、外挿することができる。
【０１０１】 結合の定量化 フィブリノーゲンに対して最低の親和性を有するPEモデルの 2つの最良の結合
物を求めた。これらのクローンは両方ともモチーフIIに属していた。クローン69
( 配列番号：55) は、インビトロ ホモジナイズしたクロット結合について分析
した。一定量の放射能標識したクローン69(2nM) を、一定量のクロット(200μl
血漿等量) に、放射能標識していないリガンド量を漸増しながら加えることによ
って、結合を定量化した。Scatchard フォーマットにおける分析データは、高及
び低親和性結合成分について2 成分曲線をもたらした。これらは、200nM 高親和
性部位／200 μl 血漿等量であった。リガンドは、これらの部位に、Kd値10〜20
nMで結合した。これらの部位は飽和可能であった。更に、このリガンドがクロッ
トホモジネートに予備結合されている場合は、半減期37分の非標識クローンFC69
3μM を添加することによって競合された。標識したリガンドは、緩衝液単独又
はクロットに対し測定可能な親和性を有さない2'-Fクローン3mM 中では、4 時間
以上かけても、何ら顕著な程度クロットホモジネートに拡散しなかった。このよ
うに、クロットに対し特異的なリガンドの結合は、特異的でありかつ安定してい
るように思われる。
【０１０２】 クローントランケーション リガンドを5'又は3'末端のいずれかで放射能標識し、境界(boundary)実験を行
った。このリガンドに、穏やかなアルカリ加水分解による部分切断を施し、かつ
フィブリンに結合した。結合RNA を精製し、かつ配列決定した。結果を表６に示
した。典型的には、配列決定用ゲル上から流出する(step-off)点で、結合に重要
な領域が失われるまで、ラダーが認められた。両端を標識したものとの反応を二
回行うことは、5'及び3'境界の両方の決定を可能にした。境界試験は、モチーフ
I の1 クローン及びモチーフIIの2 クローンについて行った。これらのクローン
は全て、境界と一致する推定二次構造へと折畳むことができた。モチーフI は、
「ダンベル」構造へと折畳むことができた。モチーフIIは、著しい量の3'- 固定
領域を使用した。これは、ステムループ／ふくらみ(bulge) 構造へと折畳むこと
ができた。境界及び構造の可能性を基に、クローンFC 69(配列番号：55) の入れ
子式（nested) 合成2'F オリゴヌクレオチドを4 個、自動化された固相合成装置
を用いて長さ25〜41ヌクレオチドの範囲で合成した( 配列番号： 131〜134)。
【０１０３】 これらを、インビトロ及びラットのPEモデルの両方で、ホモジナイズしたクロ
ットに対する結合について試験し、完全な長さの物質と競合させた。インビトロ
アッセイにおいて、4 クローン全てにおいて定性的結合が認められ、69.4( 配列
番号：134)（最長）が最良であった。ラットのPEモデルにおいても、4 種全ての
トランケートがクロットに結合した。3 '-末端の境界に更に4 個のヌクレオチド
を伴う2 種のトランケートの方が、3'- 境界で正確に終わる配列の結合よりも3
倍多い結合を示した。完全な長さの物質へと標準化された肺におけるクロットへ
の結合は、4 種のトランケートについて、各々、32、118 、36及び108 ％であっ
た。更に、このアッセイにおいて最良のトランケートの結合を示す69.2( 配列番
号：133)(29-ヌクレオチド) は、非標識の完全な長さのクローンFC 69 の1 μM
を添加することによって部分的に阻害された。
【０１０４】 実施例３ 狭窄性頸動脈に対するRNA リガンド 本実施例は、ラットの狭窄性頸動脈に対するRNA リガンドを得る能力について
説明している。狭窄性頸動脈リガンドは、先に記したような診断薬及び医薬品と
して有用である。
【０１０５】 A.方法 RNA プールの形成 2'F-ピリミジン、2'OH- プリンRNA を、このSELEX に用いた。最初のDNA 鋳型
である40N8は、自動化された固相DNA 合成装置により常法に従い合成し、かつ配
列gggagauaagaauaaacgcucaa-40N-uucgacaggaggcucacaacaggc( 配列番号：40) を
有していた。全てのその後のPCR ラウンドには、5'及び3'プライマーとして、各
々、プライマー：5'-taatacgactcactatagggagauaagaauaaacgcucaa ( 配列番号：
41) 及び5'-gcctgttgtgagcctcctgtcgaa(配列番号：42) を使用した。PCR 、逆転
写及びT7 RNAポリメラーゼによるRNA の生成は、前述のように行った。2'F RNA
の転写は、ATP 及びGTP 各1mM （α-32P-ATPの存在又は不存在）、並びに2'F UT
P 及び2'F CTP 各3mM 存在下で行った。転写は、37℃で5 〜14時間かけて進行し
、その後ホルムアミド及び7M尿素含有−ゲル電気泳動により精製した。
【０１０６】 SELEX プロトコール スプラーグ−ドーリー系ラット（オス、250g）に、単側又は両側のいずれかの
頸動脈のバルーン- 損傷を施した。ラットはイソフルランで麻酔した。頸動脈は
、1cm の正中切開により露出した。普通の内及び外頸動脈を確認した。分岐部の
直上から、外頸動脈に#2フレンチフォガルティカテーテルを挿管し、大動脈弓ま
で刺した。バルーンを膨張し、分岐部まで引き戻した。この操作を6 回繰り返し
た。カテーテルを取り外し、外頸動脈を結紮した。シアノアクリレート接着剤で
、皮膚を縫合した。損傷は10〜14日間顕在化した。
【０１０７】 SELEX 時に、動物は麻酔下で放血屠殺した。両方の頸動脈を、分岐部から大動
脈弓まで切除した。動脈から結合組織を全て優しく剥いだ。SELEX の12ラウンド
を、表７に示したようにエクスビボで行った。最初の3 ラウンドは、2 個の動脈
を、2 μM RNA 溶液0.5ml に単純に浸漬することによって行った。結合反応を20
℃で進行した。その後頸動脈セグメントを、4 回、1ml 緩衝液で各15分間洗浄し
、その後結合したRNA を収集した。引き続き、2 個の頸動脈を、短いポリエチレ
ンチューブに、直列に結紮した。更に遠位末端に、注射器に装着されたチューブ
のついたカニューレを挿管し、溶出液収集器を設置した。これらの手順は、動脈
セグメントの破壊を最小にするように行った。
【０１０８】 SELEX のために、この動脈セグメントに、生理的緩衝液1ml 中の0.75〜2.3nmo
les を、4ml ／時で通過させた。その後、このセグメントを追加の緩衝液1ml で
、4ml ／時で洗浄した。このセグメントを、ラインから取り出し、Cherenkov 放
射線を計測し、RNA 抽出について処理した。ラウンド4 〜7 は、この方法で、バ
ルーン損傷された両動脈セグメントについて行った。全ての組織を、RNA 抽出に
ついて処理した。ラウンド8 〜12については、損傷していない動脈を、図１に示
した損傷した動脈の上流に結紮した。前述のように灌流した。両動脈セグメント
は対向していたが、損傷したセグメントのみを、RNA 抽出について処理した。ラ
ウンド8 〜12は、進化したRNA に結合する正常動脈内皮に対する「逆-SELEX」で
行った。次の対照において、非損傷動脈は、因子VIII免疫組織化学により、内膜
内皮の無傷の1 層を有することが示されている。
【０１０９】 2'-F-RNAの組織抽出 頸動脈セグメントをメスで細かく刻み、TRIZOL試薬1ml(Gibco)中でホモジナイ
ズした。全て製造業者の指示に従い、ホモジネートを、遠心分離により透明化し
、CHCl3 により相分離し、かつ水相をイソプロパノールで沈殿した。精製したRN
A をH20 中に再懸濁し、かつ逆転写緩衝液中で、0.1 U/μL DNAse I (Pharmacia
) 及び100 μg/ml RNAse A (Sigma)で15分間37℃で消化した。2'-F- ピリミジン
、2'-OH-プリンRNA が、RNAse A 消化に適している。この消化物を、フェノール
、フェノール／CHCl3 抽出し、かつ酢酸ナトリウムからEtOH沈殿した。その後RN
A に、標準条件下でRT/PCRを施し、T7 RNA ポリメラーゼのための鋳型を生成し
た。12ラウンド後、プールをクローニングし、かつ配列決定した。表８のC#と同
定された配列が本プロトコールにより得られた。
【０１１０】 インビトロ SELEX 次のSELEX において、ラウンド12のプール3 〜5nmoleを、14日目の単側病変ラ
ットに尾静脈から直接注射した。15分後、動物を屠殺し、かつ頸動脈を処置した
。RNA を前述のように増幅した。インビボ SELEXにおいて4 ラウンドを、表７に
示したように行った。このプールをクローニングし、かつ配列決定し、両方のク
ローニング工程から得られた配列を、配列分析のために一緒にした。表８におい
てCiv#と同定された配列は、このプロトコールから得られた。
【０１１１】 結合分析 プール又は個々のクローンのいずれかとしてのRNA の結合を、正常対損傷した
頸動脈セグメントに結合した32P 値を比較することによって行った。結合は、エ
クスビボ灌流システム又は新鮮な凍結頸動脈切片へ積層したRNA のいずれかにお
ける組織学的オートラジオグラフィーにより可視化した。
【０１１２】 組織学的オートラジオグラフィー 頸動脈に結合したRNA を可視化するために、組織学的オートラジオグラフィー
を用いた。RNA は、γ-33P-ATPで5'- 末端を標識した。 SELEX反応について記し
たように、結合を行った。組織は少なくとも24時間、10％中性緩衝化したホルマ
リン中で固定し、パラフィンで処理し、かつポリ-L- リシンスライド上で5mm 切
片とした。60℃の炉で乾燥した後、これらを脱パラフィンし、露光する前に再度
水和した。スライドを、融解した核乳液(Amersham LM-1) 中に液浸し、乾燥させ
、かつ4 ℃で露光した。スライドを、Dektol現像液(Kodak) 中で現像し、定着し
(Kodak Fixer) 、ギムザ染色した(Sigma) 。
【０１１３】 新鮮な凍結した頸動脈切片を、OCT 中で、正常又は損傷した頸動脈セグメント
を包埋することによって調製し、かつ-20 ℃で凍結した。切片5 μm をクリオス
タット上で切断し、スライド上に置き（典型的には正常及び損傷した切片を1 枚
のスライド上に並べて置いた）、かつ-5℃で凍結保存した。スライドを室温に戻
し、対の切片をグリースペンで取り囲み、30ml PBS、0.5 ％Tween-20、1mM 低分
子量ヘパリン(Calbiochem)と予備結合した。15分後、この溶液を取り除き、かつ
10,000 CPM (〜1pmol) 33P- 標識したRNA を含有する同じ溶液を30分間添加した
。スライドを、PBS ／Tween-20で2 回、PBS で2 回洗浄した。スライドを、10％
中性緩衝化したホルマリンで固定し、その後蒸留水ですすいだ後、露光した。
【０１１４】 配列並置 クラスターアルゴリズム クラスターは、増大しつつあるコンセンサス内のギャップ位置を再度最適化す
ることにより複数の配列の並置を行うプログラムである。このアルゴリズムはふ
たつの部分からなる：配列の並置及びクラスター化。配列の並置は、Altschul及
びEricksonの動的にプログラムされたアルゴリズムを使用し(Altschul and Eric
kson、Bulletin of Mathematical Biology、48:603-616(1986)) 、演繹的統計ベ
ースについて選択された重みベクター、一致＝1.O 、不一致＝-1/3、ギャップオ
ープニング＝-1.O、及びギャップ延長＝-1/3を用いた。並置の総コストは、Alts
chulの準天然のギャップコストを利用し、コンセンサス内での各対の並置の合計
である(Altschul 、J. Theoretical Biology、138:297-309(1989))。並置コスト
を標準化し、異なる配列数を含む並置間の比較を可能にしている。クラスターに
おいて使用された標準化は、一致する位置毎の最も可能性のあるものに対する並
置を比較する。
【０１１５】 標準化されたスコアは、最も可能性のある並置のコストで除された並置のコス
トである。K-Means アルゴリズムは、配列をファミリーにクラスター化する。こ
こでこのアルゴリズムは、距離測定としての並置のコストを適合するように、本
来のバージョン（Tou 及びGonzales、Pattern Recognition Principles、1974年
、Addison-Wesley Publishing Company ）からわずかに変更されている。これら
が単に1 ファミリーである場合、又はいずれか2 種のクラスターを一緒にするコ
ストが閾値を越える場合に、収束進化が生じる。最適化（工程3 ）は、配列のサ
ブセットを引き出し、かつこれらを論文（Subbiah 及びHarrison、J. Mol. Biol
. 、209:539-548(1989) ）に記されたように再度並べる。
【０１１６】 B.結果 SELEX 表７に示したように、エクスビボRBIC SELEX 12 ラウンドを行い、その後イン
ビボ SELEX 4ラウンドを示した。プールをクローニングし、かつエクスビボSELE
X 及びエクスビボ／インビボ SELEX後、配列決定した；これらの配列を表８に示
した。進化した40ヌクレオチドカセットの配列のみを表８に並置した。不変フラ
ンキング領域の配列は、各クローンに含まれ、かつ配列番号：40のものと同じで
あった。エクスビボSELEX 最後の5 ラウンドは、ネガティブ選択（逆-SELEX）と
して正常頸動脈で行った。これらのラウンドの評価は、最後の5 ラウンドにわた
って、損傷した頸動脈が、最終ラウンドにおける結合を増加する傾向を伴わずに
0.07〜0.5 ％の間で結合したことを示した。正常及び損傷の間の識別は3.2 〜4.
5 であり、更に、識別を増加する傾向は伴わなかった。ラウンド12において、RN
A プールを配列決定し、かつ有意にランダムでないプールであることを示した。
【０１１７】 その後このプールでインビボ SELEXを行った。極微量のRNA が損傷した頸動脈
(0.2〜0.6pmoles)から回収された。正常対損傷のCPM を比較すると、値2.61〜3.
54の識別が得られた。インビボ SELEXの第一ラウンドでは、ラウンド12のRNA 及
びラウンドO のRNA の等量を、2 匹の個別の動物に、両方とも片側バルーン損傷
により注射した。ラウンドO のRNA について識別はなかったが（すなわち、損傷
動脈と正常動脈に結合した数は同じ）、ラウンド12のプールは、損傷動脈におい
て、非損傷動脈と比べて2.61倍多いRNA 結合を示した。ラウンド15では、正確に
ラウンド8 〜12について行ったように、進化したプールを動物に注射するか、も
しくは、エクスビボ装置により灌流した。ラウンド15のRNA の識別は4.61であり
、これは、エクスビボSELEX の間に認められたものよりもより高かった。
【０１１８】 エクスビボSELEX からの72クローンを配列決定し、その中の50は表８に示した
ように独自のものであった。際立った知見は、72クローンのうち2 個が多コピー
で存在したことである。一方のクローン（クローンC33 ；配列番号：146 ）は、
9 個の同一又は1 塩基が異なるコピーを有し、別のは（クローンC37 ；配列番号
：186 ）は10コピーを有した。従って、最初の配列決定の際の22コピーの中の19
が、2 つの配列に由来した。これら2 つからの配列のステム化(stemming)は、組
合せた分析における最大の単一ファミリーの（モチーフI ）を生じるC33 に関連
したクローンにより、インビボ SELEX後に存続した。
【０１１９】 クローン結合の分析 2 種のSELEX 法からの 94 個の独自のクローンのうち、28個を、ラットの新鮮
な凍結頸動脈切片に対する結合についてスクリーニングした。これらは、染色強
度(+, ++, +++)及び特異性(s, ns) により定性的に等級化し、表８に示した。ク
ローンには、全ての組織成分に対して、認められない結合から強力な結合まで、
様々なパターンが認められた。特異性は、正常又は損傷の中膜又は外膜を覆う新
生血管内膜組織の結合の相対強度を基に等級化した。C33(配列番号：146)に関す
る初期は、未進化のラウンドO 又はラウンド12プールRNA について増大した強度
及び特異性の両方を有することがわかった。更なるスクリーニングは、より良い
結合特性を有する別の3 クローンをカバーしなかった：C59(配列番号：150)、Ci
v45(配列番号：202)、及びCiv37(配列番号：210)。
【０１２０】 興味深いのはCiv41(配列番号：158)であり、理由はこれがC33 及びC59 としの
同じモチーフであったが、非常に強い染色及びわずかな特異性：染色している新
生血管内膜、更には正常及び損傷した中膜を有するからである。3 種の個別の結
合実験においてCiv45 は、特異的新生血管内膜の分布を最も強力に染色した。こ
のクローンは更に、正常な中膜よりも損傷した中膜への結合のわずかな増加を示
した。損傷された動脈において平滑筋細胞が、中膜から新生血管内膜へと移行す
るならば、結果的にこのクローンが損傷した中膜内で結合するかどうかは驚くべ
きことではない。高特異性で注目された4 個のクローンの中で、2 個がモチーフ
I に由来し、かつ密に関連していた。4 個のうちの3 個は、配列GUUUG （表８の
下線）を有した。推定される二次構造を表９に示した。現時点で、これらの構造
が真の構造と相関性があるかどうかは不明である。境界実験が行われないの場合
は、トランケーション試験の基礎となるものを提供する。
【０１２１】 クローンC33 及びC59 は、33P-標識し、かつエクスビボ法により灌流した。定
量は行わなかったが、これらは、損傷を受けた動脈の内腔壁に劇的な結合を示し
たが、正常血管には示さなかった。 C59 を用いて、様々な年齢のRBICの新鮮な凍結切片を染色した。頸動脈を、バ
ルーン損傷後1 、2 、4 、6 、8 、16週目に収集した。新生血管内膜のシグナル
は2 〜6 週目に最大であった。1 週目に最小であり、6 週後は消失していった。
高特異性クローンにおける新生血管内膜の染色パターンは、拡散性の顆粒(diffu
sely granular)である。銀粒子は、平滑筋細胞には明らかに会合していなかった
。RNA は細胞外マトリックス(ECM) 成分に結合しているという仮説が立てられる
。SMCSは、移行にECM 足場(scaffold)が必要であることはわかっている。これら
は、新生血管内膜増殖コースにおいて独特なプロテオグリカンを蓄えることはわ
かっている。 これらの独特なプロテオグリカンの存在及び消失は、一時的に新
生血管内膜へのRNA の結合に対応している。このように、生育可能な可能性は、
RNA は、これらのプロテオグリカンへ特異的結合することである。
【０１２２】 実施例４ 狭窄性頸動脈に対するRNA リガンド この実施例は、ラットの狭窄性頸動脈に対するRNA リガンドを、実施例３に類
似しているが若干改変した方法を用いて同定することを説明している。 この実施例において2'-F- ピリミジン、2'-OH-プリンRNA プールを生成するた
めに使用した方法は、実施例３に記した方法と同じである。
【０１２３】 A.方法 SELEX プロトコール 実施例３に記したように、スプラーグ−ドーリー系ラット(250g)の頸動脈に、
片側又は両側のバルーン損傷を施した。 最初の選択はエクスビボで行った。ラットの頸動脈は、#2 Fogartyカテーテル
を用いて、外頸動脈まで挿管し、大動脈弓まで進め、バルーンで露出した(denud
ed) 。14日後、頸動脈を摘出し、慎重に過剰な結合組織を剥がし、かつポリエチ
レンチューブに直列に結紮した（図１）。動脈セグメントを、25℃のリン酸緩衝
生理食塩水(PBS) 浴中に置いた。PBS 中の32P 本体標識した転写物(0.75mM)を、
15分以上かけて、動脈を1 回通過させた（4ml ／時）。その後動脈セグメントを
同じ方法で、PBS を用いて洗浄した。このセグメントを取り外し、細断し、かつ
実施例３に記載したようにRNA を抽出した。その後RNA に、標準条件下でRT/PCR
を施し、T7 RNAポリメラーゼの鋳型を形成した。この方法のセットに、SELEX の
1 ラウンドを続けた。6 ラウンド後、RNA の0.62％が動脈に結合していた。ラウ
ンド7 の時点で、同じラットから摘出した損傷していない頸動脈セグメントを、
バルーンで露出したセグメントの上流に直列に結紮し、進化したRNA に結合する
正常（非損傷）動脈内皮に対して「逆-SELEX」で行った。
【０１２４】 インビボ SELEX エクスビボSELEX の12ラウンド以降に、インビボ SELEXを開始した。エクスビ
ボで富化されたライブラリー4 〜6nmoleを、14日目の単側のバルーン損傷頸動脈
病変を伴うラットに、尾静脈から注射した。15分（インビボラウンド14）、30分
後（ラウンド5 〜6 ）、40分後（ラウンド7 ）又は60分後（ラウンド8 〜12）で
動物を屠殺した。組織を摘出し、かつ実施例３のようにRT/PCR用に抽出した。図
２は、SELEX ラウンドの回数の関数としての結合したRNA ／組織湿重量(CPM/mg)
の量として示された、インビボ SELEXの進行状況を示す。インビボ SELEXの12ラ
ウンド後、富化されたライブラリーをクローニングした。
【０１２５】 結合分析 クローンは、組織学的オートラジオグラフィーにより、インビトロにおける、
新生血管内膜組織への結合をスクリーニングした。組織学的オートラジオグラフ
ィーは、図１のような血管を通じてのγ-33P- 標識を用いて5'- 末端を標識した
灌流RNA 、又は実施例３に示した新鮮な凍結切片の切断及び切断面へのリガンド
適用のいずれかにより行った。
【０１２６】 B.結果 エクスビボRBIC SELEXの12ラウンドを行い、引き続きインビボ SELEXのラウン
ドを行った。プールをインビボ SELEX後、クローニングし、かつ配列決定した；
配列を表10に示した（配列番号：224 〜258 ）。示された配列は、配列のランダ
ム領域である；不変フランキング領域の3'及び5'配列は、これらのクローンには
含まれなかったが、それぞれ、配列番号：139 及び140 に示されたものと同じで
ある。エクスビボSELEX の最後の6 ラウンドは、ネガティブ選択（逆- SELEX ）
として、正常頸動脈を用いて行った。これらのラウンドの評価は、最後の6 ラウ
ンドにわたって、最初に結合した損傷した頸動脈は、バルーン損傷セグメントへ
の結合を減少し（0.02％）、最後の5 ラウンドの結合を増大したことを示した。
12及び最後のエクスビボラウンドでは、正常及びバルーン損傷したセグメントへ
の結合は、各々、O.1 ％及び0.34％であった。
【０１２７】 その後プールの、12ラウンドについてのインビボ SELEXを行った。インビボ S
ELEXのラウンド12をクローニングし、かつ配列決定した。44個のクローンを配列
決定し、2 種のモチーフへと並べた（表10）。配列決定したライブラリーの48％
は、1 個の高度に保存されたモチーフを含む配列によって代表され、この中でク
ローン12.2（配列番号：242 ）が最も優勢なメンバーであった。
【０１２８】 クローン結合の分析 灌流後のオートラジオグラフィーは、新生血管内膜への浸透をほとんど伴わな
い内腔表面への取り込みの強度を示した。新鮮な凍結切片へのクローンの適用後
のオートラジオグラフィーは、ランダムライブラリーと比べて、富化されたライ
ブラリーの実質的新生血管内膜への結合を示した。均一な顆粒状銀粒子の分布は
、明らかに細胞と会合しておらず、これは細胞外マトリックスを標的とすること
を示唆している。灌流と新鮮な凍結オートラジオグラフィーの比較は、クローン
は、病変の内腔表面に提示され、さらに、新生血管内膜マトリックス全体に広く
分布している、新生血管内膜成分に結合するという結論を導いている。
【０１２９】 両方の配列ファミリーからの代表的クローンは、組織学的オートラジオグラフ
ィーによって、結合に関してクローン12.2と特異的に競合することができた。放
射能標識したクローン12.2は、非標識クローン12.2（配列番号：242 ）、12.13
（配列番号：246 ）、12.15 （配列番号：248 ）及び12.37 （配列番号：250 ）
により、モル数が30倍過剰の非標識クローンによる完全な競合を伴う用量反応型
では、新鮮な凍結切片とは競合しなかった。しかしこれらは、クローン12.2とス
クランブルされたバージョンである配列のモル数が300 倍過剰の配列の添加によ
るシグナルの減少は無かった。識別できる配列同等性を有さない2 種の配列ファ
ミリーが、標的結合に関して互いに競合することができるという注目点は興味深
い。
【０１３０】 二次構造分析 クローン12.2の二次構造（図３）を、RNA 折畳みアルゴリズム(Zuker、Scienc
e 、 244:48-52(1989)) を用いて推定し、更に構造−特異性エンドヌクレアーゼ
及びトランケーション分析により裏付けた。コンピュータを使った構造予測は、
エンドヌクレアーゼプロービングによって実験的に裏付けられた。消化は、1 本
鎖に特異的なエンドヌクレアーゼT1（Gp↓N 、Boehringer Mannheim 、1 x 10-3 U/ml）、U2（Ap↓N 、USB 、10 U/ml ）、S1 (N ↓pN、Boehringer Mannheim 、
4 x 10-4U/ml) 、及びP1 (N ↓pN、Boehringer Mannheim 、3 U/ml) 、並びに2
本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼV1（N ↓pN、Pharmacia 、7 U/ml）により、
非変性条件下で行った（PBS 中で4 ℃、10分間）。部分的切断ラダーを形成し、
変性PAGEにより可視化し、反応性ヌクレオチドを同定した。トランケーション分
析は、クローン12.2（点線の枠内）の欠失又は置換領域によって行い、インビト
ロ活性をアッセイした。活性を減少又は除去する変更は、構造の上側の括弧で示
し、活性に対し作用の無いものは、構造の下側括弧で示した。
【０１３１】 このモチーフは、5'及び3'末端が並置された「ダンベル」型を形成している2
個のステムループからなる。クローン12.2のトランケートバージョンは、インビ
トロで転写され、各々、クローン12.2の最初の12塩基を含んでおり、これは2'-F
ピリミジンRNA の効果的な転写に必要である。トランケートは、インビトロ組織
学的オートラジオグラフィーアッセイにより定量的に試験し、かつ選択されたト
ランケートは、バルーン損傷頸動脈組織蓄積についてインビボにおいてアッセイ
した。トランケーション分析の結果は図３にまとめた。5' ステムループヌクレ
オチドのほとんど（#13 〜41）は、活性を失うことなく除去することができる。
2 個の3'- 末端ヌクレオチド(#86〜87) も除去することができる。このループの
配列（ヌクレオチド #65〜69）は、これは活性に影響を及ぼすことなく、GAAA
テトラループと交換できるので、重要ではなかった(Uhlenbeck、Nature、346:61
3-614(1990))。
【０１３２】 対照的に、3'ステムの小さい欠失は大きく活性を失った。残基#62 及び2 個の
ループに近接した塩基対(#63〜64及び #70〜71) の除去は、活性を失わせた。残
基 #13〜41の喪失は容認でき、残基 #13〜46の除去は活性を失わせた。最も興味
深い知見は、2 個の並んだグアノシン(#1 及び#85)が、ホスホジエステル結合に
よって連結されていないことが必要条件であるように思われることである。ヌク
レオチド#1〜4 に連結したヌクレオチド #42〜85からなる合成オリゴヌクレオチ
ドは活性を有さないが、転写されたオリゴヌクレオチド12.2t55L（図４；配列番
号：259 ）は、5'ステムループ(#13〜41) は殆ど欠いているが、転写リーダー配
列 (#1〜12) は含んでおり、これは完全な活性を有している（図４）。2 個のス
テムループの間の「ヒンジ」部分（残基#46 ）の柔軟性は、高親和性結合にとっ
て重要であるように思われる。更に、合成トランケート12.2t55Lにおける5'- 末
端GGG(#1〜3)の除去は、活性をなくし、図４に提唱された構造に一致する。55個
のヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド12.2t55Lは、インビトロにおいて、完
全な長さのクローン12.2と同じ活性を有する、現時点で最も短いトランケートで
ある。
【０１３３】 生体分布試験 制限された生体分布試験をラットで行った（図５）。32P-α-ATP- 標識したク
ローン12.2の2nmoles(10mCi)をボーラス注射して60分後、放射能が、血中には0.
2 ±0.050 ID/g％ (＋／−s.e.) まで蓄積し、内肋間筋には0.05＋／−0.02ID/g
％、正常な頸動脈にはO.1 ＋／−0.05ID/g％、及び損傷した頸動脈には1.4 ＋／
−0.4 ID/g％蓄積した。クローン12.2に関するバルーン損傷対正常頸動脈の比は
、14 (p ＜0.05) であった。同じ末端不変領域を伴う87- ヌクレオチドの2'-F転
写対照を、非特異的対照として使用した。損傷頸動脈に結合しているクローン12
.2の非- 特異的オリゴヌクレオチドに対する比は、7(p ＜0.05) であった。これ
らの値の比較は、血管造影剤について先に報告されたものにとって非常に好まし
いものである (Leesら、Arteriosclerosis、8:461-470(1988) ；Hardoff ら、J.
Clin. Pharrrracol. 、33:1039-1047(1993)) 。クローン12.2は、最初に肝臓、
腎臓及び脾臓において明らかになり、60分でこれらの各組織において3 〜4 ID/g
％蓄積した。これらの臓器における配列によって決まる蓄積は、日常的に認めら
れた。血管、筋肉、正常及びバルーン損傷頸動脈組織を摘出し、湿組織重量に対
して標準化し、かつ変性ゲルに塗布した（図６）。
【０１３４】 損傷された動脈への完全な長さの転写物の蓄積を評価した。Trizol (Calbioch
em) によりRNA 抽出し、相分離後に水相に放射能標識の60〜70％を得た。2'-F
転写物が抽出直前にエクスビボにおいて組織に添加されたならば、放射能標識の
90％以上が完全な長さのRNA として沈殿する。第1 ラウンド（ラットで15分）に
おいて、損傷した動脈から抽出された放射能標識の47％が、完全な長さの物質と
してイソプロパノール沈殿した。12ラウンド（ラットで60分）までに、抽出され
た標識の85％が完全な長さで沈殿した。対照的に、12ラウンド目に血管から抽出
された放射能は、わずかに15％沈殿した。
【０１３５】 完全な長さの物質は、損傷した頸動脈組織からは容易に可視化したが、他の組
織ではかすかに存在するのみであった。他の動物における、クローン12.2への結
合を可視化するために、大動脈弓及び両頸動脈から、1 個の小片を切り出した。
これらの血管は、りん光捕獲スクリーン(Fuji)上で可視化した。この画像は、バ
ルーン損傷動脈におけるクローン12.2の単位面積あたりの取り込みが、対照動脈
又は他の動脈弓領域と比べて、7 倍増加したことを示した。
【０１３６】 結合の動力学 結合の動力学を試験した。クローン12.2の結合は、迅速であり、かつ早い時点
（15分）で3 ID/g％に到達し、損傷した頸動脈t1/2＝50分であった。この場合、
損傷した頸動脈対血管の存在するクローン12.2の比は、40〜60分で最高に達した
。シルナル対ノイズ比が60分で最高であり、この時点を、インビボ SELEXの最後
のラウンドのために使用した点は興味深い。
【０１３７】 実施例５ Watanabe遺伝性高脂血症ウサギの動脈に対するRNA リガンド 本実施例は、Watanabe遺伝性高脂血症ウサギ(WHHL)動脈への RNAリガンドを得
る能力に関する。Watanabe遺伝性高脂血症ウサギ(WHHL)は、ウサギが低密度リポ
タンパク質受容体の同型接合性欠損を有する、アテローム性動脈硬化症の非常に
有用なモデルである。これらの動物は非常に高いコレステロールレベルを維持し
、かつアテローム性動脈硬化症病変を自発的に発症した。
【０１３８】 A.方法 RNA プールの作成 2'-Fピリミジン、2'-OH プリンRNA をこのSELEX には用いた。最初のDNA 鋳型
40N8を固相自動DNA 合成装置によって合成し、これは配列 gggagauaagaauaaacgc
ucaa-4ON-uucgacaggaggcucacaacaggc(配列番号：40）を有した。全ての逐次PCR
ラウンドは、5'及び3'プライマーとして、各々、プライマー：5'-taatacgactcac
tatagggagauaagaauaaacgcucaa(配列番号：41）及び5'-gcctgttgtgagcctcctgtcga
a(配列番号：42）を用いた。PCR 、逆転写及びT7 RNAポリメラーゼによるRNA 作
成は、先に説明したように行った。 2'-F RNA の転写は、ATP 及びGTP 各1mM(α
-32P-ATP存在又は不存在）、並びに2'-F UTP及び2'-F CTP各3mM 存在下で行った
。転写は、37℃で5 〜14時間かけて進行し、その後ホルムアミド及び7M尿素含有
−ゲル電気泳動により精製した。
【０１３９】 SELEX プロトコール WHHL又は対照ニュージーランド白(NZW) ウサギには、イソフロランで麻酔をか
けた。これらの動物を放血し、弓から隔膜まで大動脈を摘出した。動脈セグメン
トを、37℃の25mM HEPESで緩衝化したHanks 液(H/H) （pH 7.3）中に置いた。H/
H 中の 32P- 本体標識した転写物（0.25〜1.0mM ）を、動脈セグメントと共に、
45分間37℃で攪拌しながらインキュベートした。その後動脈セグメントを、同じ
方法で4 回、洗浄緩衝液容量を増加しながら行い、SELEX を緊縮性が増大するよ
うに継続した（表11）。洗浄液容量は、ラウンド1 の4 mLから、ラウンド9 及び
10の160mL まで増大した。次に、プラーク- 含有セグメントを秤量し、細断し、
かつRNA を抽出した。ラウンド1 〜3(インビトロ SELEX）については、肉眼で観
察して容易に明らかであるプラークを有する領域を、内膜、中膜及び外膜を含む
完全な厚さで単離した。このRNA を逆転写し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) によ
り増幅し、かつRNA へと転写した。この手順のセットで、SELEX の1 ラウンドと
した。インビトロ SELEXにおける5 ラウンドを、表11に示したように行った（ラ
ウンド1 、2 、3 、9 及び10）。
【０１４０】 インビボ SELEX 本明細書に参照として組入れられている国際公開公報第98/30575号であって、
1998年7 月16日に公開された、発明の名称「巨大分子の生体結合」は、5'- 位の
トリリン酸以外の基を生じるヌクレオシド又はヌクレオチドにより開始されたDN
A 鋳型の転写を、RNA ポリメラーゼが触媒することを開示している。ラウンド4
〜8 において、SELEX プールは、転写物の5'- 末端に特有の1 級アミンを効果的
に配置するために、グアノシントリリン酸よりも5 倍過剰のグアノシンアミノヘ
キシルリン酸（5' 位にヘキシルアミン部分を伴うグアノシン-5'-モノリン酸）
が存在する中で転写した。
【０１４１】 前述の米国特許出願第08/358,065号及び第08/488,290号に開示されたように、
転写物のプールを、N-ヒドロキシスクシンアミド化合物を介して、トリペプチジ
ル99m-Tcキレート部分（メルカプトアセチル- グリシル- グリシル- アミジル)-
6-ヘキシ-1- イル) に接合した。接合したプール5nmoleを、99m-Tc （精製後放
射化合物の収量90〜95％）で標識し、比活性1,000 Ci/mmoleとした。標識したプ
ールを、WHHLウサギの辺縁耳静脈に注射した。左側臥位のウサギの10分間画像を
、Siemans LEM DIFITRAC ZLC 1O" FOVガンマカメラにより得た。表11に示したよ
うに、15〜65分後に動物を放血した。
【０１４２】 胸動脈及び弓を摘出し、プラークを収集した。ラウンド4 〜6(インビボ SELEX
) について、肉眼で観察して容易に明らかであるプラークを有する領域を、内膜
、中膜及び外膜を含む完全な厚さで単離した。ラウンド7 〜8(インビボ SELEX、
表11) については、内膜及びプラークを中膜及び外膜から剥がして処理した。 インビトロ SELEXの追加の2 ラウンド（ラウンド9 〜1O）を、前述のように行
った。プールを、動脈セグメントと共にインキュベートし、その後動脈セグメン
トを表11に示したように洗浄した。次にプラークを含むセグメントを秤量し、細
断し、RNA を抽出した。ラウンド9 〜1O（インビトロ SELEX) については、内膜
及びプラークを中膜及び外膜から剥がして処理した。
【０１４３】 B.結果 WHHLウサギ及びニュージーランド白(NZW) ウサギからの動脈のりん光造影装置
の画像を、辺縁耳静脈からラウンド9 の5mCiの注射後40分して収集して得、イン
ビトロインキュベートデータ及びRNA プール配列決定データ（示さず）を確かめ
たところ、これは、最初のライブラリーが進化し、かつ容易に配列決定されると
いう結論を裏付けていた。ラウンド5 及び1Oのプールを、クローニングし、かつ
配列決定した；ラウンド10の配列は、表12に示した（配列番号： 260〜354)。ラ
ウンド10のプールから、配列の28％が、高度に関連し、恐らく単一クローンに由
来したであろう（ファミリー1 ；配列番号： 260〜287)。更に第二のファミリー
（ファミリー2 ；配列番号： 288〜294)は、7 個の高度に関連した配列を有する
ことが同定された。
【０１４４】 残りの配列の65％（孤児；配列番号： 295〜354)は、ファミリーに属さず、更
には活性がスクリーニングされなかった。ファミリー1 のメンバーは、プラーク
を含む動脈セグメントと共にインビトロインキュベートすることによってスクリ
ーニングした。動脈セグメントを、このクローン50nMと共に、37℃で30分間イン
キュベートし、その後37℃で、3 x 40分間洗浄した。図７は、スクリーニングの
結果を示す。スクリーニングしたクローンの1 個を除いて全て、プラークに対し
て高親和性を有していた。非- 結合クローンは、他のクローンとは無関係と結論
した。クローン10.31 （配列番号：268 ）を、更なる分析のためのリードクロー
ンとして選択した。
【０１４５】 実施例６ ヒトアテローム性動脈硬化症プラーク組織に対するクローン10.5及び10.31 の
インビトロ結合 実施例５から得たクローン10.5 （配列番号：260 ）及び10.31 （配列番号：
268 ）を、ヒトのアテローム性動脈硬化症プラーク組織に対するインビトロ結合
について、2 個の個別の実験によりアッセイした。ヒト組織は、心臓移植のレシ
ピエントから入手した。レシピエントから摘出後3 時間以内の動脈を用い、使用
時まで酸素添加したTyrodes 緩衝液中に保存した。各実験において、動脈セグメ
ントを、37℃の25mM HEPESで緩衝化したHanks 液(H/H) （pH 7.3）に入れた。転
写物を、動脈セグメントと共に30分間インキュベートし、かつ動脈セグメントを
3 x 40分間洗浄した。
【０１４６】 最初の実験において、クローン10.5を40N8（最初に進化したライブラリー; 配
列番号：40）と比較した。図８は、ファミリーメンバー10.5のヒトプラーク- 含
有冠動脈に対する結合を、陰性対照としての40N8と共に示している。クローン10
.5は、進化していないファイブラリーと比べて約3.5 倍良く結合した。 第二の被験者から個別に採取した動脈を用いる別の実験において、クローン10
.31 を33P で標識した。これは、りん光造影装置のより高い空間解像度及び更に
結合の組織学的オートラジオグラフィー分析を可能にした。クローン 10.31及び
陰性対照10.15 （配列番号：348 ）と一緒のエクスビボインキュベートの組織学
的オートラジオグラフィーは、内皮又は内皮下のマトリックスのレベルでの結合
が不統一な強度であることを、ごく少量の組織への拡散と共に示した。組織学的
構造は、10.31 が結合したものを確定しなかった。この実験は、WHHLウサギ由来
の核酸リガンドが、ヒトアテローム性動脈硬化症組織と交叉反応性であることを
示している。
【０１４７】 実施例７ 静脈内投与後のWHHLウサギにおけるプラーク蓄積に関するクローン10.31 の分
析 実施例５のクローン10.31 （配列番号：268 ）を、ウサギにおけるプラーク蓄
積について分析した。先のインキュベート試験は、投与用量の10〜20％がプラー
ク中に蓄積することを示した。 3.5nmole(50μCi) のクローン10.31 を、32P で
本体を標識し、かつWHHLウサギへ辺縁耳静脈を介して注射した。60分後に動物を
屠殺し、胸動脈を摘出し、弓を除去し大動脈をりん光造影装置にかけた。画像は
、プラーク領域に10.31 の明らかな蓄積があり、これはOil Red O 染色により赤
く染まることを示した。プラーク対非- プラーク血管の蓄積の比は5 であった。
この試験の一部では、組織をTrizol抽出し、イソプロパノールで沈殿し、カウン
トし、かつPAGEゲルに塗布した。図９は、様々な組織についての、Trizol抽出後
の32P エタノール沈殿分画のカウント数を示した。放射能の大半は、非- 沈殿カ
ウントの形であり、このことは、クローン10.31 の崩壊を示している。プラーク
中の10.31 の崩壊量は、驚くべきものであった。注射後組織から回収された放射
能のうちわずかに20％が沈殿し、これは全て完全な長さであった。
【０１４８】 実施例８ 99m-Tc- 標識した10.31 のインビトロ結合、インビボ造影及び生体分布 クローン10.31 （配列番号：268 ）を、グアノシントリリン酸よりも5 倍過剰
のグアノシンアミノヘキシルリン酸が存在する中で転写し、その後実施例５に記
したように、N-ヒドロキシスクシナミド化学を介して、トリペプチジル99m-Tcキ
レート部分に接合し、キレート部分に90％以上が接合された転写物を生成した。
この実施例において、接合転写物を、99m-Tcで標識し、比活性5000 Ci/mmole 転
写物とした。
【０１４９】 実験のパート1 において、99m-Tc標識10.31 の50nM(0.5mCi)（図15；配列番号
：355 ）を、WHHL動脈セグメントと共に37℃で30分間、インビトロインキュベー
トし、その後３７℃で3 x 30 分間洗浄した。この動脈セグメントのりん光造影
装置の画像は、投与用量の15％がプラーク付着動脈中に認められることを示した
。
【０１５０】 実験のパート２において、同じ日に、99m-Tc標識10.31 を、別のWHHLウサギに
注射し、インビボ造影及び生体分布を調べた。WHHLウサギに、対側の耳にカテー
テルを挿管し、その後10.31 を注入した。99m-Tc標識10.31 を7.5mCiを、辺縁耳
静脈に注射した。所定の時間で、血液をカテーテルから採取し、99m-Tcを測定し
た。図10のように、血液からの放射能標識の迅速な消失が認められた。放射能標
識は、10分までに急速に低下し、その後定常状態を保ち、ゼロにはならなかった
。先のTrizol抽出データ（実施例７）から、この基準値は、完全な長さの物質を
示してはいない。
【０１５１】 インビボ造影のために、10分間の画像を得、その後60分目に屠殺した。画像は
、肝臓のクローン10.31 の取り込みが非常に迅速であることを示した。時間がた
って、肝臓の放射能標識が消失した点が、ウサギはラット及びマウスとは異なる
。最後のガンマカメラ像（50〜60分）は、腎臓、脾臓及び膀胱において、肝臓よ
りも有意に多い放射能標識を認めた。比較的暗い露光で、大動脈瘤が認められた
。興味深い領域の分析（図11A 及び11B ）は、放射能標識は、非常に急速に（10
分以内）弓に蓄積し、かつその後1 時間は留まったことを示した。図12は、正式
の生体分布データを示している。プラーク中のクローン10.31 の蓄積は、0.015
ID/g％であった。
【０１５２】 インビボ造影研究完了後、動物を屠殺し、大動脈を摘出し、インビトロ造影し
た。無傷の大動脈をガンマカメラに配置した。弓が最高強度であるような、強力
なシグナルが認められ、活性の第二の中心は末梢であった。これらの核種の蓄積
の焦点は、Oil Red O によりプラークであることを確認し、りん光造影装置によ
りより明確に境界を定めた。
【０１５３】 実施例９ WHHL及びニュージーランドウサギにおける10.31 のインビボ造影及び生体分布
の比較 第二の造影実験は、生体分布データを得かつ動脈瘤がNZW ウサギにおいて認め
られるかどうかを調べるために行った。この実験は、99m-Tc- 標識10.31 （配列
番号：355 ）5mCi(1nmole)をWHHL及びNZW ウサギの両方に注射した以外は、実施
例８に記したように行った。再度、WHHLウサギの対側の耳静脈にカテーテルを挿
管し、その後注射し、血液試料を採取した。WHHL及びNZW ウサギにおける放射能
標識した10.31 の生体分布は全般的に、実施例８と類似していた。NZW ウサギの
胸部のりん光造影装置による画像は、心臓における血液の早期消散(dissipate)
が認められることを示した。NZW ウサギの大動脈弓はいずれの時点においても可
視化されなかった。WHHLウサギのりん光造影装置の画像は、より多くの標識が心
臓に留まっていることを示した。大動脈弓及び下行大動脈を代表する心臓後方部
分は、60分を通じて認められた。この実験結果は、大動脈弓の領域が、WHHLウサ
ギでは明確に認められたが、NZW ウサギでは認められなかったことを示した。
【０１５４】 静脈注射の60分後、動物を屠殺し、大動脈を摘出し、インビトロ造影した。大
動脈は、ガンマカメラに配置した。WHHLウサギの画像は、WHHLウサギの弓への強
度の取り込みを示した。図13及び14は、WHHL（黒棒）及びNZW （斜線棒）ウサギ
における99m-Tc標識10.31 の生体分布を示している。ここでも、60分での最高の
蓄積は腎臓であった。WHHL弓では、0.038 ID/g％標識が認められたのに対して、
NZW の弓ではその半分であった。これらの数値は、先の実施例において認められ
たものよりも高かった。正常及び罹患した動脈の間の差異は、ラットの再発狭窄
性動脈において認められるものよりも少なかった（実施例４、図５）。引き続き
、プラークを取り出した。このプラークは、正常血管よりも多くの1g当たりのカ
ウント数を有しなかったが、単位面積当たりでは正常血管よりも多い蓄積を示し
た。
【０１５５】 実施例10 WHHLリガンド10.31 のトランケーション及び-SELEX修飾 臨床応用のための核酸リガンドの開発を進める際に、酵素的に生成された種か
ら化学的に合成されたものへと、転写物を変形させることは望ましい。この研究
第一の部分において、転写物をその最小結合成分へと減らし、トランケート化と
称した。最初に、3 種のトランケート化した10.31(配列番号：268)のアナログを
、常法により、固相自動合成装置において、図16に示したように、5'- 固定領域
（配列番号：357 ）、3'- 固定領域（配列番号：358 ）又は5'- 及び3'- 固定領
域の両方（配列番号：356 ）を除くように合成した。実施例８に記した方法によ
り、WHHL 大動脈セグメントの32P 放射性能標識したポリアクリルアミドゲル電
気泳動で精製したトランケートのインビボ蓄積を調べ、これは3'- 固定領域は結
合活性には不要であるが、5'- 固定領域の全て又は一部は必要であることを示し
た。3'- 固定領域を伴わないトランケートの第二の構造予測は、37- ヌクレオチ
ドの可能性の強い構造を示した（図17）。この分子、あるいは10.31.37又はTr10
4(配列番号：359)と称するものの合成及びアッセイは、これが中心の結合モチー
フであることを示した。図17は、この中心の結合モチーフの推定される二次構造
を詳述している。8 個の塩基対のステムがNOSYのNMR により確認された。
【０１５６】 インビボ試験のための調製において、Tr123 （図19；配列番号：360 ）は、Tr
l04 に5'- ペンチルアミド及び3'-3' チミジンキャップを加えて合成した。5'-
アミンは、99m-Tcケージ、更には薬物動態学モジュレーティング分子のカップリ
ングを可能にし、一方3'キャップは、インビボで認められる3'- エキソヌクレア
ーゼから分子を安定化するために加えた。このリガンドは更に、WHHLプラークに
、Tr104 と同程度又はそれより良く結合した（図18）。
【０１５７】 これまでに、プリンの2'位のポスト-SELEX修飾が、核酸リガンドのヌクレアー
ゼ抵抗性を高めることが報告されている(Greenら、Current Biology 、2:683-69
5(1995))。Tr104 アナログのセットは、2'-OMeプリンで置換された2'-OH プリン
の数を増加し；Trl28 ( 配列番号：361)が18のプリンの内18が2'-OMeで修飾され
るように合成された。Tr129 ( 配列番号：362)は、18のプリンの内15が2'-OMeで
修飾された。Tr130(配列番号：363)は、18プリンの内13が2'-OMeで修飾された。
Tr131(配列番号：364)は、18プリンの内8 が2'-OMeで修飾された。図18に示され
た結果を基に、18のプリン(Tr130) の内少なくとも13が、活性に影響を及ぼすこ
となく2'-OMeで置換されていることが明らかであった（図18）。
【０１５８】 Tr130 は、更なる2'-O- メチル化試験の土台となった（図20A 〜H 、配列番号
： 369〜376)。インビトロ蓄積アッセイは、18の2'プリン部位の内の17が、活性
を喪失することなくO-メチル化されることを示した（図21；Tr159 ；配列番号：
375)。18部位全てのO-メチル化(Trl28；配列番号：360)は、アプタマーを不活性
にした。さらなる研究は、18位のアデノシンが核酸リガンドが結合活性を保持す
るための2'-OH を必要としていることを示した（図21）。
【０１５９】 O-メチル化のヌクレアーゼ抵抗性に対する影響を調べるために、選択された核
酸リガンドを、32P で末端を標識し、新鮮なヘパリン化WHHLウサギ血漿と共にイ
ンキュベートした。24時間にわたって所定の時点で、アリコートを採取し、希釈
し、かつ８％ポリアクリルアミド、7M尿素ゲルに流した。りん光造影装置により
、完全な長さの物質を定量した。図22は、３つのトランケート、Tr104 、Tr128
及びTr129 のプロット（図18より）を示している。ホスファターゼ活性の因子を
決定した後（これはO-メチル化の影響を受けない）、完全なO-メチル化が、t1/2 を4.2 倍延長するのに対し、部分的にO-メチル化された種はt1/2を2.5 倍延長す
ることがわかった。A-18のみが未置換のO-メチル化された種（Tr159 ；配列番号
：375 ）は、親核酸リガンドよりも長い2.5 〜4.2 倍の間の中程度の安定性を持
つと予想される。
【０１６０】 別の実験において、トランケートTr104 において選択されたウリジンを、5-Br
- デオキシウリジン(5-BrdU)と置換した。Tr132(配列番号：365)は、位置9 に5-
BrdUを有し、Tr133(配列番号：366)は位置16にBrdUを有し、Tr134(配列番号：36
7)は位置17にBrdUを有し、及びTr135(配列番号：368)は位置22にBrdUを有した。
これらのトランケートを放射能標識し、O-メチル化された核酸リガンドトランケ
ートと類似の方法でアッセイした。ここでも、Tr104 の活性は、末端ループ領域
における修飾に対し感受性があることが示された。位置17及び22のBrdU置換は、
結合に有意に影響を及ぼしたが、位置9 及び16の置換は及ぼさなかった。
【０１６１】 実施例11 ヒトアテローム性動脈硬化症冠動脈セグメントに対する組織SELEX ヒト冠動脈を、心臓移植レシピエントから入手した。心臓は、酸素添加された
Tyrodes 緩衝液中に入れて氷漬けにして輸送し、かつ摘出から3 時間以内に使用
した。実施例３に類似の方法で、1 〜3cm の冠動脈セグメントを、PEチューブを
つけたカニューレに取付けた。Hanks/HEPES 中のRNA ライブラリー40N8の0.25〜
2.0 μmoleの溶液を、動脈を通じて灌流し、再循環の方法は25℃で30分間、1ml
／分で行った。動脈を縦方向に切開した。プラーク含有領域を切除し、中膜及び
外膜を剥いだ。RNA ライブラリーを、ウサギのプラーク（実施例８）に類似の方
法で抽出した 。このライブラリーを、ラウンド5 の後、クローニングし、かつ
配列決定した。配列決定した64個のクローン中の19％(12/64) が、WHHLファミリ
ー１（表12）を示し、1.5 ％(1/64)がWHHLファミリー２を、11％(7/64)が新規フ
ァミリーを示し、これはhuart.1 と称した。2 配列がこの時点の3.1 ％(2/64)で
存在し、残りは独自であるか又はファミリーにグループ化することができないが
認められた。表13はヒト動脈配列を示す（配列番号： 377〜440)。
【０１６２】
【表１】
【０１６３】
【表２】
【０１６４】
【表３】
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
【表５】
【０１６７】
【表６】
【０１６８】
【表７】
【０１６９】
【表８】
【０１７０】
【表９】
【０１７１】
【表１０】
【０１７２】
【表１１】
【０１７３】
【表１２】
【０１７４】
【表１３】
【０１７５】
【表１４】
【０１７６】
【表１５】
【０１７７】
【表１６】
【０１７８】
【表１７】
【０１７９】
【表１８】
【０１８０】
【表１９】
【０１８１】
【表２０】
【０１８２】
【表２１】
【０１８３】
【表２２】
【０１８４】
【表２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 頸動脈SELEX 手順に用いた代表的概略図である。
【図２】 SELEX ラウンド数の関数としての、組織湿重量1g当たりに結合した放射性RNA
の蓄積(CPM/mg)として示した、インビボでのラットのバルーン損傷した頸動脈SE
LEX の進行を説明している。4 〜6nmol の32P-本体標識した2'-F RNA（PBS 中10
〜15μM 、0.1 ％(w/v) ヒト血清アルブミン）を、14日目のバルーン損傷したラ
ットに尾静脈から注入した。所定の時点（15〜60分）で動物を放血し、心カニュ
ーレにより通常の生理食塩水を、下大静脈からの液体が透明になるまで灌流し、
解剖し、RNA 抽出及び定量のために組織を採取した。血液(B) 、内肋間筋(M) 、
正常(N) 及びバルーン露出した頸動脈(I) を摘出し、各々のラウンドを比較した
。インビボラウンド0 （15分）、4 （15分）、6 （30分）、8 （60分）、10（60
分）の生体分布プロフィールを示した。
【図３】 実施例４で同定されたクローン12.2( 配列番号：242)の推定される二次構造を
示している。小文字は固定された領域を示し、大文字はランダム領域を示す。ヌ
クレオチドの位置を示す数は、5'- 末端から始まる。クローン12.2（点線の枠内
）の領域を欠失又は置換し、かつインビトロで活性をアッセイすることによって
、トランケーション分析を行った。活性を減弱又は除去する変更を、構造の上側
の括弧で示し、活性に対する作用を有さない変更は、構造の下側の括弧で示した
。
【図４】 トランケート12.2t55L( 配列番号：259)の推定される二次構造を示している。
残基は、図３の位置に合わせて数を振った。矢印は、クローン12.2の欠失した残
基#13-41及び#86-87を示している。クローン12.2の3'- ステムループのUCGAC ル
ープを、配列GAAAで置換した。
【図５】 CPM/mg及び注入用量g ％(ID/g%) で示した、血液(Bld) 、筋肉(Mscl)、正常(N
ml) 及びバルーン損傷(Inj) 頸動脈組織の湿重量1g当たりに結合した放射性クロ
ーン12.2( 配列番号：242)及び対照RNA の蓄積を示している。
【図６】 下記手順で得られたゲルのりん光像を示している：血液、筋肉及びバルーン損
傷した頸動脈組織20mg並びに正常頸動脈15mgを抽出し、かつ8 ％ポリアクリルア
ミド、7M尿素変性ゲルに流し、りん光捕獲スクリーン(Fuji)で可視化した。レー
ン1 は注入された用量；レーン2 は血液(Bld) 、レーン3 は筋肉(Mscl)、レーン
4 は正常動脈(Nml) 及びレーン5 はバルーン損傷した動脈(Inj) である。
【図７】 CPM/mm2 で示された、プラーク含有動脈セグメントと共にインビトロインキュ
ベートした後の、WHHLインビボ SELEXのラウンド10からの放射性クローンの蓄積
を示す。
【図８】 ヒトアテローム性動脈硬化症動脈セグメント中のWHHLクローン10.5( 配列番号
：260)及び陰性対照40N8( 非進化ライブラリー；配列番号：40) の蓄積を示す。
【図９】 WHHLウサギへの静脈注射後の様々な組織についての32P エタノール沈殿可能分
画のカウントを示す。
【図１０】 時間の関数としてID/g％で示した、WHHL血液中の99mTc-10.31(配列番号：355)
濃度のデータのまとめ。
【図１１Ａ】 経時的、肝臓（白丸) 及び腎臓（黒丸) への99mTc-10.31(配列番号：355)の蓄
積の関心領域(ROI) 分析を示す。
【図１１Ｂ】 経時的、大動脈弓（白丸) 及び心臓（黒丸) への99mTc-10.31(配列番号：355)
の蓄積の関心領域(ROI) 分析を示す。
【図１２】 ID/g％で表した、静脈注射後60分での、様々なWHHLウサギ組織中の99mTc-10.3
1(配列番号：355)の生体分布データのまとめ。
【図１３】 ID/g％で表した、静脈注射後60分での、選択されたWHHL（黒棒）及びNZW （斜
線棒）ウサギ組織中の99mTc-10.31(配列番号：355)の生体分布のまとめ。
【図１４】 ID/g％で表した、静脈注射後60分での、様々なWHHL（黒棒）及びNZW （斜線棒
）ウサギ組織中の99mTc-10.31(配列番号：355)の生体分布のまとめ。
【図１５】 リガンド10.31(配列番号：355)の抱合5'-[( メルカプトアセチル- グリシル-
グリシル- アミジル)-6-ヘキシ-1- イル] リン酸エステルのテクネチウム-99-複
合体の構造を示す。リガンド配列中の下側の枠の文字は、固定された配列領域を
示す。
【図１６】 クローン10.31(配列番号：268)、5'及び3'固定領域が除去されたクローン10.3
1 トランケート( 配列番号：356)、5'- 固定領域が除去されたクローン10.31 ト
ランケート( 配列番号：357)、及び3'- 固定領域が除去されたクローン10.31 ト
ランケート( 配列番号：358)の配列を示す。
【図１７】 クローン10.31(配列番号：268)の37- ヌクレオチドトランケート( 配列番号：
359)の提唱された二次構造を示す。
【図１８】 CMP/mm2 で表した、WHHLプラーク中の2'-OMeプリンで置換された2'-OH プリン
の数が増大するように合成された、Tr104(配列番号：359)アナログのインビトロ
蓄積アッセイをまとめている。
【図１９】 5'- フェニルアミン及び3'-3' チミジンを有するTr123(配列番号：360)の構造
を示す。
【図２０Ａ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２０Ｂ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２０Ｃ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２０Ｄ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２０Ｅ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２０Ｆ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２０Ｇ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２０Ｈ】 Tr130 の2'-OMeアナログの構造を示し、ここでmGは、2'-O- メトキシグアノシ
ンを示し、mAは2'-O- メトキシアデノシンを示している。
【図２１】 CMP/mm2 で表した、様々なTr130 の2'-OMeアナログのインビトロ蓄積アッセイ
をまとめている。
【図２２】 完全な長さの転写物％対時間で表した、3 種のリガンド：Tr1049( 配列番号：
359 ；黒丸、点線) 、Tr128(配列番号：361 ；黒丸、実線) 及びTr129(配列番号
：362 ；白四角) に対するヌクレアーゼ抵抗性へのO-メチル化の作用をまとめた
グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ゴールド，ラリー アメリカ合衆国，コロラド 80302，ボー ルダー，フィフス ストリート 1033 (72)発明者 スペック，ウルリッヒ ドイツ連邦共和国，デー−13465 ベルリ ン，フュルステンダム 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 CA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ01 QQ41 QQ61 QR08 QR32 QR56 QR62 QS15 QS25 QS32 QS34 QS36 QX02 QX07 4C057 NN10

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 血管に対する核酸リガンドの同定法であって： a)核酸配列の候補混合物を調製する工程； b)該核酸の候補混合物を該血管と接触する工程で、ここで候補混合物と比べて増
    大した血管に対する親和性を持つ核酸を、候補混合物の残りから分割することが
    できる； c)候補混合物の残りから親和性が増大した核酸を分割する工程；及び d)親和性が増大した核酸を増幅し、該血管に対する結合に関して比較的高い親和
    性及び特異性を有する核酸配列について富化された核酸の混合物を得、これによ
    り該血管の核酸リガンドを同定する工程を含む方法。
  2. 【請求項２】 更に、工程b)、工程c)及び工程d)を反復するe)工程を含む、
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記候補混合物が1 本鎖核酸を含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記1 本鎖核酸がリボ核酸である、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記1 本鎖核酸がデオキシリボ核酸である、請求項３記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 前記血管が、動脈、静脈及び毛細血管からなる群より選択さ
    れる、請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】 請求項１記載の方法に従って同定された血管に対する核酸リ
    ガンド。
  8. 【請求項８】 前記候補混合物が、1 本鎖核酸を含む、請求項７記載の核酸
    リガンド。
  9. 【請求項９】 前記1 本鎖核酸がデオキシリボ核酸である、請求項７記載の
    核酸リガンド。
  10. 【請求項１０】 前記1 本鎖核酸がリボ核酸である、請求項７記載の核酸リ
    ガンド。
  11. 【請求項１１】 前記リガンドが、表10記載の配列番号： 242〜258 の核酸
    配列からなる群より選択されたRNA リガンドである、請求項７記載の核酸リガン
    ド。
  12. 【請求項１２】 前記血管が、動脈、静脈及び毛細血管からなる群より選択
    される、請求項７記載の核酸リガンド。
  13. 【請求項１３】 前記血管が動脈である、請求項12記載の核酸リガンド。
  14. 【請求項１４】 前記リガンドが、配列番号： 260〜440 の核酸配列からな
    る群より選択されたRNA リガンドである、請求項13記載の核酸リガンド。
  15. 【請求項１５】 前記リガンドが更に標識を含む、請求項７記載の核酸リガ
    ンド。
  16. 【請求項１６】 前記リガンドが更に錯化剤を含む、請求項７記載の核酸リ
    ガンド。
  17. 【請求項１７】 前記錯化剤が標識を含む、請求項16記載の核酸リガンド。
  18. 【請求項１８】 前記標識が99m-Tcである、請求項17記載の核酸リガンド。
  19. 【請求項１９】 下記構造を有する、請求項18記載の核酸リガンド： 【化１】
  20. 【請求項２０】 精製されかつ単離された天然には生じない血管に対する核
    酸リガンド。
  21. 【請求項２１】 前記血管が、動脈、静脈及び毛細血管からなる群より選択
    される、請求項18記載の精製されかつ単離された天然には生じない核酸リガンド
    。
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