JP4718541B2 - 改良された凝固因子調節剤 - Google Patents
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Description
クマリン薬、例えばワファリン、ならびにグリコサミノグリカン、ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、抗凝固薬として一般に使用されている。ワファリン(クマリン誘導体)は、プロトロンビンおよび他のビタミンK依存性凝固因子のビタミンK依存性後翻訳修飾と競合することにより作用する。この作用は、ヘパリンより多少遅くおよび長い永続作用である。クマリン薬は、トロンビンの機能に必要なビタミンK依存性カルボキシル化反応、ならびに第VII、第IXおよび第X因子、ならびにプロテインCおよびSを阻害することにより、凝固を阻害する。これらの薬物は、ビタミンKのキノン誘導体がこれらの活性ヒドロキノン形態に還元するのを阻害することによって作用する。クマリン薬のこの作用方式のため、最大効果の実現には数日かかる。ヘパリンは、抗トロンビンIIIに結合し、これを活性化し、これが、次いで、凝固カスケードのセリンプロテアーゼを阻害する。これらの効力に一部起因して、ヘパリンおよびLMWへパインには欠点がある。制御できない出血が、主要な合併症であり、持続注入を受けている患者の7%以下、間欠的ボーラス用量を与えられた患者の14%以下において観察される。患者を出血の危険のある状態にすることなく効能を達成する治療範囲は狭く、血漿のmLあたり、ヘパリン約1から3ug未満である。4ug/mLより高いヘパリンの濃度では、凝固活性を検出することができない。従って、患者の血漿濃度をこの治療範囲内に保つように多大な配慮を払わねばならない。
核酸は、生物学的プロセスにおいて情報を提供する役割を主として果たすと従来考えられてきた。過去10年の間に、核酸の三次元構造により核酸がタンパク質と相互作用し、これらを調整する能力を得ることができることが明らかになった。こうした核酸リガンドまたは「アプタマー」は、高い親和性および特異性で所定のリガンドに結合することができる短いDNAまたはRNAオリゴマーである。1つの類として、アプタマーの三次元構造は、アプタマーが、モノマー化合物であれ、ポリマー化合物であれ、事実上、あらゆる化学的化合物に結合し、リガンドとして作用できるために十分な可変性がある。アプタマーは、特に癌療法および血液凝固調整において有望な新規診断用および治療用化合物として登場した。
Duke UniversityのPCT国際公開パンフレット第02/096926号には、調節剤の投与により核酸リガンドの生物学的活性を調節するための薬剤および方法が記載されている。この公報には、核酸であり得る調節剤により制御されるアプタマーが記載されている。これらの調節可能アプタマーは、凝固、伸長因子2活性または脈管形成を阻害することが重要である疾病の治療に有用であると記載されている。凝固を制御するための調節可能アプタマーとしては、凝固第VII因子または凝固第VIIa因子、凝固第VIII因子または凝固第VIIIa因子、凝固第IX因子または凝固第IXa因子、凝固第V因子または凝固第Va因子、凝固第X因子または凝固第Xa因子、これらの因子とで形成される複合体、ならびに血小板受容体に対するアプタマーが挙げられる。この調節剤は、核酸リガンドのこの標的への結合を変化させることができ、核酸リガンドがこの作用を発揮している間に、核酸リガンドを分解もしくは別様に切断、代謝または破壊することができる。調節剤は、患者の経過ならびに最適な治療を達成する方法に関する医師の自由裁量をはじめとする様々な因子に基づき、必要に応じて即時投与することができる。
アプタマーが有用な治療試薬であるためには、タンパク質に緊密に結合しなければならず、拮抗薬が望まれる場合にはこのタンパク質の特定機能を阻害せねばならず、および有害な副作用がないものでなければならない。血液にはリボヌクレアーゼが豊富であるので、現実としては、未修飾RNAは治療薬として使用されない。1本鎖RNAおよびDNAの何らかの修飾が、血液中で安定な分子を生じさせることがあり、ある種の公知アプタマーは、各々のピリミジンヌクレオチドの中に2’F基または2’NH2基を有する。
「核酸リガンド」または「アプタマー」は、リガンドとして標的分子と相互作用することを可能ならしめる三次元構造を形成することできる核酸である。この用語は、一定の環境で所定の標的分子と複合体を形成することができる特異的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを指し、この場合、同環境にある他の物質は、このオリゴヌクレオチドと複合体化されない。この結合の特異性は、この環境でのアプタマーおよび他の材料または一般には非関連分子に関する解離定数(Kd)と比較した場合の標的に対するアプタマーの比較解離定数によって定義される。典型的に、標的に関するアプタマーのKdは、この環境における非関連材料または付随材料に関するKdより10倍、50倍、100倍または200倍小さいであろう。
本発明は、血液凝固カスケードにおける特定の因子との相互作用により血液凝固を調整する、改良された核酸リガンドまたはアプタマーを提供する。本発明は、凝固を調整する改良されたアプタマー−解毒剤ペアも提供する。本改良アプタマーは、第IX遺伝子産物(これは、第IXa因子を含む)を標的にし、故に、他の血液凝固因子標的に関連した不特定の副作用を減少させる。凝固カスケードにおける大部分の因子は、様々な生理的役割を有する広範なタンパク質(すなわち、トロンビン)である。
血液凝固因子の阻害を免除できることも重要である。第IX因子などの血液凝固因子の過剰阻害の結果、生命を脅かす疾病が生じることがある。例えば、血友病Bは、第IX因子欠損の結果、生じる。血友病Bに罹患しているすべての患者が、凝固時間の延長および第IX因子凝固活性の低下を有する。血友病A同様、重症、中程度および軽症型の血友病Bがあり、血漿における第IX因子活性を反映している。
1つの実施態様において、本発明の改良解毒剤は、被標的アプタマー配列の少なくとも一部に相補的な配列を含む。絶対相補性は必要ない。1つの実施態様におけるその配列は、アプタマーとハイブリダイズすることができる十分な相補性を有する。ハイブリダイズする能力は、相補性度とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。有利なことに、本解毒剤オリゴヌクレオチドは、被標的アプタマーの6から25個の連続するヌクレオチド、好ましくは8から20個の連続するヌクレオチド、さらに好ましくは10から15個の連続するヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。特定の側面において、本解毒剤は、少なくとも10から25ヌクレオチド、少なくとも15から25、少なくとも20から25、少なくとも14、17または少なくとも25ヌクレオチド長である。本発明の解毒剤は、1本鎖の、DNAもしくはRNAまたはこれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾バージョンであり得る。
改良アプタマーまたは解毒剤は、酵素核酸で場合もある。こうしたリボザイムまたはDNAザイムは、先ず、標的RNAまたはDNAに結合し(Cech 米国特許第5,180,818号参照)、次いで、この標的を切断することによって作用する。酵素核酸は、新たな標的への結合および切断を繰り返し行うことができ、これによってRNAアプタマーを不活性化することができる。リボザイムには少なくとも5つの種類があり、これらの各々が異なるタイプの特異性を提示する。解毒剤の場合、この酵素活性が、改良アプタマーへの「自殺位置」の導入を補足するか、代わりになることができる。
本発明のもう1つの側面において、本改良アプタマーの解毒剤は、ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acids(PNA))である。PNAは、オリゴヌクレオチドに類似しているが、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格がペプチド骨格により置換されている点で組成が異なる。このペプチド骨格の各サブユニットは、自然発生または非自然発生核酸塩基に付いている。
本発明の改良アプタマーおよびアプタマーと解毒剤の組み合わせは、特定の糖残基を置換することによって、アプタマーの組成およびアプタマーの特定の領域のサイズを変えることによって、ならびに解毒剤によりさらに有効に阻害され得るアプタマーを設計することによって修飾される。アプタマーの設計は、アプタマーの二次構造(図1参照)およびこの二次構造と解毒剤対照の間の関係についての正しい認識を含む。従来の核酸修飾法とは異なり、本発明に包含されるFIX遺伝子産物に対する改良されたアプタマーの設計は、解毒剤対照の考察を含まねばならない。制御されたアプタマーには、このアプタマーが循環の際には安定であるが、解毒剤で制御されないほど安定ではないことが求められる。アプタマーは、切り詰めによって修飾することができるが、解毒剤は、切り詰めされたときの各アプタマーを制御するように設計する必要がある。さらに、一定の修飾、特に、ステムとループの界面での修飾は、2’−フルオロから修飾されるばずはなく、このアプタマーは、活性を失うことがある。
改良アプタマーでの凝固の調整
本発明は、FIX、FIXa、またはこの内因性テナーゼ複合体に結合させるための改良されたアプタマーの使用を包含する。この結合は、インビトロである場合もあり、インビボである場合もある。FIX、FIXa、またはこの内因性テナーゼ複合体への結合の結果は、これらタンパク質または複合体の生物活性の阻害であり得る。本改良アプタマーを使用して、深在静脈血栓症、動脈血栓症、手術後血栓症、冠動脈バイパスグラフト(CABG)、経皮的冠動脈形成術(PTCA)、発作、腫瘍転移、炎症、敗血症性ショック、高血圧、ARDS、肺動脈塞栓症、播種性血管内凝固(DIC)、血管再狭窄、血小板沈着、心筋梗塞、脈管形成などの疾患を治療すること、またはアテローム硬化性血管に罹患しており血栓症の危険がある哺乳動物の予防的治療を行うことができる。
血栓性疾患に罹患しているか、凝固誘発性事象中の患者の治療に関する多くの課題の中に、抗凝固薬物療法に関連した出血の潜在的危険がある。出血の危険の根底にあるメカニズムは複雑であるが、薬物のばらつき(血栓形成度または血栓負荷度に対して過剰な抗凝固作用)、薬物濃度と抗凝固作用の間の比較的不良な相関関係、止血の障害(血小板の動作、血管の完全性、多段階凝固)に対する広範にわたる妥協および抗凝固薬の挙動の限定制御の関数であることは議論の余地がない。
組織における心血管疾患を治療するための本方法は、心血管疾患が発生しているまたは発生する危険がある組織を、凝固因子に結合することができる改良されたアプタマーの治療有効量を含む組成物と接触させること、ならびに改良された解毒剤を供給して、この解毒剤の投与によりこのアプタマーの作用を反転させることを企図している。従って、この方法は、RNAアプタマーを含有する生理学的に許容される組成物の治療有効量を患者に投与すること、ならびに解毒剤を供給して、この解毒剤の投与によりこのアプタマーの作用を反転させる方法を含む。
本発明のアプタマーおよび解毒剤は、改良アプタマーに加えて解毒剤または調節剤および医薬適合性の担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる医薬組成物に調合することができる。この組成物の正確な性質は、この改良アプタマーおよび解毒剤の性質ならびに投与経路に一部依存するであろう。最適な投薬計画は、当業者には容易に確立することができ、ならびにこの改良アプタマー、この解毒剤の組み合わせ、この患者および求められる効果によって変化し得る。
(実施例)
以下の試験を用いて、凝固因子を阻害する改良アプタマーおよび解毒剤の能力を評価する。
プリン残基が存在する4つの二次構造単位:ステム1(Apt 1);ループ1(Apt2);ステム3(Apt 3);ループ2(Apt 4)(図1A参照)における2’−ヒドロキシルプリンを2’−O−メチルプリンで置換した。
4、5および6塩基対ステムから成るステム1変異体の2つの「ファミリー」を設計した(Apt 6から8および9から11;図1B)。すべての構築物は、Apt−2バックグラウンドで設計した。解毒剤が最小二次構造を含むようにステム1配列に対する相補解毒剤オリゴヌクレオチドを設計する能力、および適正な二次構造を呈するアプタマーの能力について、ステム1配列を評価した。
実験: Apt 6から11の抗凝固活性を1uMから低ナノモルの範囲の化合物濃度での標準APTT凝固アッセイにおいて評価した。Apt 6から11の解毒剤対照を5uMから下の範囲の解毒剤濃度での標準APTT解毒剤アッセイにおいて評価した。(基準Apt AおよびApt 2実験についての125nMとは対照的に)これらのアッセイについてのApt 2およびApt 6から11の濃度は、250nMに固定した。
Apt 12から17の抗凝固活性を1uMから低ナノモルの範囲の化合物濃度での標準APTT凝固アッセイにおいて評価した。Apt 12から17の「中和能力」を5uMから下の範囲の解毒剤濃度での標準APTT解毒剤アッセイにおいて評価した。これらのアッセイでは、Apt 12、14、15および16についてのアプタマー濃度を125nMに固定し、Apt 13および17についてのアプタマー濃度を250nMに固定した。
Apt 18から20の抗凝固活性を1uMから低ナノモルの範囲の化合物濃度での標準APTT凝固アッセイにおいて評価した。Apt 18から20の「中和能力」を5uMから下の範囲の解毒剤濃度(18から20に、それぞれ、解毒剤6、7および8)での標準APTT解毒剤アッセイにおいて評価した。これらのアッセイでは、アプタマー濃度を125nMに固定した。
二系列の変異体によりステム2およびループ2における残基に最適な糖組成を評価する。Apt 16バックグラウンドでの第一系列。Apt 16バックグラウンドでのものだが、Apt Aにおいて見出されるヘキサヌクレオチドがFIXaアプタマー9.20(Rusconiら Nature 419,p.90−94,2002および図1参照)において見出されるテトラループで置換されている第二の系列。Apt 4に関する研究は、ループ2内の2’−O−メチルプリン置換がApt Aの効力の強化を導くのに対し、ステム2内の2’−O−メチルプリン置換は効力の中等度の喪失を導くこと、および2’−O−メチルプリンステム1に関連してステム2およびループ2内の同時2’−O−メチルプリン置換がApt A効力(Apt 5)の有意な喪失を導くことを示した。従って、ステム2(Apt 22、26)およびループ2(Apt 32、27)において独立して2’−O−メチルプリン置換した(図9)。ステム2の塩基におけるGを、この位置に2’ヒドロキシルが必要な場合には2’ヒドロキシルとして残す(Apt 25、29)が、ステム2およびループ2(Apt 24、Apt 28)内のプリンの2’−O−メチル置換が完了していることを再び評価した。
Apt 30から33の抗凝固活性を1uMから低ナノモルの範囲の化合物濃度での標準APTT凝固アッセイにおいて評価した。Apt 30および33の「中和能力」を5uMから下の範囲の解毒剤濃度(Apt 14 AD)での標準APTT解毒剤アッセイにおいて評価した。これらのアッセイでのアプタマー濃度は、125nMに固定した(図10参照)。
原型Apt Aと比較したApt 35から39(Apt Aのステム1に基づく番号付け):
1)Apt 30から31: 違いは、C16、G17、U24、G25、C26である。
試験した抗凝固薬は、炭素数6のNH2結合基によりアプタマー配列の5’末端にコンジュゲートした40KDaのポリエチレングリコールを有するApt 39(PEG−Apt 39)である。解毒剤は、Apt7ADである。
この試験は、ブタにおいてPEG−Apt 39のインビボ抗凝固活性および解毒剤中和活性を、a)抗凝固活性の効力および永続性およびb)抗凝固活性の中和に関してCH−Apt Aで得られた以前のデータと比較するものである。3つの実験グループ(各々につき動物 n=2)は、a)全身性凝固;b)全身性凝固および薬物中和;ならびにc)全身性凝固、薬物中和および再凝固である。
血漿中のアプタマーレベルは、サンドイッチ型ハイブリダイゼーションアッセイと検出のための酵素結合イムノアッセイ(ELISA)を用いて判定する。アプタマーの定量には、2つのオリゴヌクレオチドプローブ、DNA捕捉プローブおよび2’−OメチルRNA検出プローブを利用する。DNA捕捉プローブは、長さ15ヌクレオチドであり、アプタマーの3’末端15ヌクレオチドと相補的であり、およびこの5’末端にビオチン部分を含有し、これによって、このプローブを含有するオリゴヌクレオチド複合体のアビジン被覆表面への捕捉が可能となる。2’OメチルRNA検出プローブも長さ15ヌクレオチドであり、解毒剤が結合するアプタマーの部分に相補的であり、および標準的な酵素結合蛍光発生酵素/基質試薬を使用してこのプローブを含有する複合体を検出することができるジゴキシゲニン部分を含有する。
Apt 39の抗凝固特性とApt 39/Apt 7 AD複合体の抗凝固特性の間の関係およびこれらの化合物の血漿中レベルをサルにおいて評価した。簡単に言うと、12匹のサルを3つの治療グループに割り付けた。グループ1には抗FIXaアプタマーApt 39を与え、グループ2には解毒剤Apt 7 ADを与え、グループ3は、Apt 39で、および3時間後にApt 7 ADで治療した。用量は、試験品の2つの量を通して段階的に増加させ、第一の用量は、試験の4日目に行い、第二の用量は、13日目に行った。アプタマーへの用量−応答をよりよく理解するために、グループ1に割り付けた4匹のサルを13日目に2つのグループにさらに分け、2匹の動物に低い用量を与え(グループ1a、5mg/kg)、2匹の動物に高い用量を与えた(グループ1b、30mg/kg)。
Claims (33)
- 核酸配列番号19を含む単離された核酸アプタマー。
- 請求項1に記載のアプタマーに結合する、単離された解毒剤オリゴヌクレオチドであって、前記アプタマーの6から25個の連続するヌクレオチドに対して相補的な配列である前記解毒剤オリゴヌクレオチド。
- 核酸配列番号3を含む、単離された請求項2に記載の解毒剤オリゴヌクレオチド。
- 1個またはそれ以上の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 1個またはそれ以上の2’−フルオロ修飾を含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 2’−フルオロ修飾を含まない、請求項1に記載のアプタマー。
- 第一および第二ステムを含む三次元構造を含み、ヒドロキシル糖(2’−OH)を含む前記第二ステムに少なくとも1個のグアニンを含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 2’−フルオロまたは2’−O−メチルで修飾された少なくとも1個のウリジンを含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 2’−フルオロ修飾されている少なくとも1個のシチジンを含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 前記核酸配列が配列番号55-59から選択される配列を含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 前記核酸配列が配列番号59を含む、請求項1に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、水溶性ポリマーで修飾される、請求項1に記載のアプタマー。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項12に記載のアプタマー。
- 1個またはそれ以上の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項3に記載の解毒剤オリゴヌクレオチド。
- 1個またはそれ以上の2’−フルオロ修飾を含む、請求項3に記載の解毒剤オリゴヌクレオチド。
- 2’−フルオロ修飾を含まない請求項3に記載の解毒剤オリゴヌクレオチド。
- 前記解毒剤オリゴヌクレオチドが水溶性ポリマーで修飾されている、請求項3に記載の解毒剤オリゴヌクレオチド。
- 請求項1および4から13のいずれか一項に記載のアプタマーの有効量を医薬適合性の担体と併せて含む医薬組成物。
- 請求2、3および14から17のいずれか一項に記載の解毒剤オリゴヌクレオチドの有効量を医薬適合性の担体と併せて含む医薬組成物。
- 核酸配列番号59を有し、請求項11に記載のアプタマーを含む、請求項18に記載の組成物。
- 前記アプタマーが水溶性ポリマーで修飾されている請求項12に記載のアプタマーを含む、請求項18に記載の組成物。
- 核酸配列番号3を有し、請求項3に記載の解毒剤オリゴヌクレオチドを更に含む、請求項19に記載の組成物。
- 全身投与、静脈内投与、経口投与または非経口投与に適する、請求項18または19に記載の組成物。
- 凝固を抑制するための医薬品の製造における、核酸配列番号19を含む核酸アプタマーの有効量の使用。
- 凝固を調節するための医薬品の製造における、核酸配列番号19を含む核酸アプタマーの有効量、および核酸配列番号3を含む解毒剤オリゴヌクレオチドの有効量の使用。
- 前記核酸アプタマーが配列番号59を含む、請求項24または25に記載の使用。
- 前記医薬品が治療計画の下で治療されている患者に投与される、請求項24または25に記載の使用。
- 前記医薬品が外科的介入を受けている患者に投与される、請求項24または25に記載の使用。
- 前記医薬品が心血管疾患または介入に罹患しているまたは罹患する危険がある患者に投与される、請求項24または25に記載の使用。
- 前記医薬品が急性心筋梗塞(心臓発作)、脳血管障害(脳卒中)、虚血、血管形成術、CABG(冠動脈バイパス移植術)、心肺バイパス、心臓バイパス装置の循環におけるおよび腎臓透析を受けている患者における血栓症、不安定性狭心症、肺動脈塞栓症、深在静脈血栓症、動脈血栓症、ならびに播種性血管内凝固から成る群より選択される障害に罹患しているまたは罹患する危険がある患者に投与される、請求項24または25に記載の使用。
- 凝固誘発性炎症を予防するための医薬品の製造における、核酸配列番号19を含む核酸アプタマーの有効量の使用。
- 前記凝固誘発性炎症が、アテローム性動脈硬化症、急性冠動脈症候群(ACS)、心筋梗塞、再潅流障害および血管形成術後再狭窄から成る群より選択される疾患に関連している、請求項31に記載の使用。
- 配列番号3を有する解毒剤オリゴヌクレオチドの有効量の使用をさらに含む、請求項31に記載の核酸アプタマーの使用。
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