CN110305868B - 凝血酶环状核酸适配体及其应用 - Google Patents

凝血酶环状核酸适配体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种凝血酶环状核酸适配体。该凝血酶环状核酸适配体的核苷酸序列选自a)～d)中至少一种：a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列且5'端和3'端连接成环；b)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列，并且具有特异性识别凝血酶功能的环状DNA分子；c)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列，并且具有特异性识别凝血酶功能的环状DNA分子；d)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列，并且具有特异性识别凝血酶功能的环状DNA分子；e)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经化学基团修饰的核苷酸序列。本发明的凝血酶核酸适配体特异性识别凝血酶，半衰期长达8小时。

Description

凝血酶环状核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种凝血酶环状核酸适配体及其应用。
背景技术
凝血酶作为一种血液里的蛋白酶，在多种生理过程，例如凝血、炎症、细胞信号中发挥着重要的作用。近年来许多研究发现凝血酶可以作为多种疾病的生物标志物，其在血液中含量的异常可以指示一些肝肾疾病、糖尿病、血栓性静脉炎、癌症等疾病的发生。目前特异性靶向凝血酶的药物主要是化学药物和单克隆抗体药物。化学药物的生物相容性较差，会对生物体产生一定的毒副作用。单克隆抗体药物的制备需要依赖生物体，成本高，批次之间的一致性差，并且容易产生免疫原性。
核酸适配体是一类可以与靶标高特异性、高亲和力结合的单链DNA或RNA分子，通常通过指数富集的系统配体进化技术(systematic evolution of ligands byexponential enrichment，缩写SELEX)体外筛选获得。通过这种“试管进化”的方法得到的核酸分子与抗体类似，具备与靶标高亲和力特异性结合的功能，并且相较于传统的抗体，核酸适配体还具备许多优势：(1)核酸适配体稳定性好，不易失活，能够抵制住热变性，在温度适宜的时候，可折叠回原始的构象。(2)核酸适配体分子量小，能很快渗透组织，无免疫原性，生物兼容性好。(3)核酸适配体的筛选和合成方式相对于抗体更加方便高效，不需要依靠生物体，通过体外化学合成，成本低，且合成批次之间差异小，可以得到更加广泛的应用。以上这些特性使核酸适配体在药物开发、药物递送、靶向治疗、医疗检测与诊断等方向有着良好的应用前景。
然而，核酸适配体在生物医疗领域的应用也面临着诸多挑战，其中非常重要的一点是作为核酸类物质，核酸适配体在复杂生物体系，例如血液或生物体内易被核酸酶降解，未经修饰的核酸适配体在全血中的半衰期可短至2分钟。因此，提高核酸适配体抵抗核酸酶降解的能力，即提高核酸适配体的生物稳定性，对其在生物医疗领域的实际应用至关重要。目前通常的做法是对核酸适配体进行化学修饰，但是经过化学修饰的核酸适配体的生物相容性较差。因此，提供一种生物稳定性高且生物相容性好的凝血酶核酸适配体至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种半衰期时间长，生物稳定性高，特异性高的凝血酶核酸适配体及其应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种凝血酶环状核酸适配体(ThrombinBinding Circular Aptamer，简称TBCA)，所述凝血酶环状核酸适配体的核苷酸序列选自a)～d)中至少一种：
a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列且5'端和3'端连接成环，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列，并且具有特异性识别凝血酶功能的环状DNA分子，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1具有80％以上同源性；
c)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列，并且具有特异性识别凝血酶功能的环状DNA分子，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有70％以上的同源性；
d)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列，并且具有特异性识别凝血酶功能的环状DNA分子，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有80％以上的同源性；
e)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经化学基团修饰的核苷酸序列。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列均具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列与所述SEQID NO:1具有85％以上同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1具有90％以上同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1具有95％以上同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1具有98％以上同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代获得的核苷酸序列包括如b1)～b5)中至少一种：
b1)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为5'-NNNNNNNCTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b2)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGANNNNNNNTAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b3)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAANNNNNNNTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b4)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTNNNNNNNGTCTCGGAT-3'；
b5)SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTNNNNNNNNN-3'；
其中，所述N表示A、T、C和G中至少一种。
更具体地，所述N表示T和/或A。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有75％以上的同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有80％以上的同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有95％以上的同源性。
具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经缺失获得的核苷酸序列包括c1)～c3)中至少一种：
c1)SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTGTCTCGGAT-3'；
c2)SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGT-3'；
c3)SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAA-3'。
具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有95％以上的同源性。
更具体地，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经添加一个或多个核苷酸获得的核苷酸序列与所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有98％以上的同源性。
具体地，所述化学基团包括：修饰在嘧啶环的2’位置上的-NH2或-F、修饰在嘌呤环的2’位置上的-OCH3、将修饰在相邻核苷酸之间的硫代磷酸根、以及修饰在5’端点上的嘧啶类似物。
更具体地，所述嘧啶类似物为尿苷。
本发明第二方面提供上述凝血酶环状核酸适配体在制备抑制凝血酶制剂中的应用。
本发明第三方面提供上述凝血酶环状核酸适配体在制备预防和/或治疗与凝血酶相关的疾病的制剂中的应用。与凝血酶相关的疾病包括：与肝损伤有关的疾病、与肾衰竭有关的疾病、糖尿病、以及血栓性静脉炎等。
本发明提供的凝血酶环状核酸适配体能够特异性地识别凝血酶，尤其是人源的α-凝血酶，由于凝血酶环状核酸适配体去除了核酸分子端点，不受核酸外切酶的外切效应影响，具有生物稳定性高、生物相容性好的特点，在37℃，50％的血清中，该凝血酶环状核酸适配体的半衰期长达8小时。
本发明的凝血酶环状核酸适配体可以应用在制备抑制凝血酶制剂中，具有很好的疗效。
本发明的凝血酶环状核酸适配体可以应用在制备预防和/或治疗与凝血酶相关的疾病的制剂中，具有很好的疗效。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出了TBCA和凝血酶线性核酸适配体(Thrombin Binding Apta mer，简称TBA)孵育不同时间的结果图。
图2示出了本发明提供的TBCA和随机环状核酸对凝血酶抑制作用的结果图。
图3示出了本发明提供的凝血酶环状核酸适配体对凝血酶抑制作用的结果图。
图4示出了本发明提供的TBCA与现有的凝血酶抑制剂Argatroban(阿加曲班)对凝血酶抑制作用的结果图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
下述实施例所用的DNA分子的核苷酸序列详见表1：
表1 DNA分子的核苷酸序列
Figure BDA0002117416880000061
Figure BDA0002117416880000071
表1中N代表随机核苷酸。
实施例1
本实施例用于证明本发明提供的凝血酶环状核酸适配体(TBCA)的半衰期时间长，生物稳定性高。
分别将0.5μM TBCA与TBA(二者的核苷酸序列如SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2所示)在50％的血清中孵育，孵育的温度为37℃，之后分别于0min、1min、2min、5min、10min、30min、60min(1h)、120min(2h)、240min(4h)、480min(8h)、720min(12h)、以及1440min(24h)取样进行电泳，最后对电泳条带的灰度值进行分析，结果如图1所示。图1示出了TBCA和TBA在37℃下，50％血清中共同孵育一定时间后的剩余量。如图1所示，TBA的半衰期约为2分钟，而TBCA的半衰期长达约8小时。可见，TBCA的生物稳定性显著高于TBA。
实施例2
本实施例证明TBCA能够特异性识别凝血酶，并且对凝血酶具有高效的抑制作用。
将0.1nM的凝血酶，2μM的纤维蛋白原分别与不同浓度的TBCA以及Lib在缓冲体系中(反应总体积100μL)孵育一定时间(反应到达平衡时)，通过使用酶标仪测定反应体系在350nm处的吸光度来拟合计算出TBCA和Lib的IC50值。
比较TBCA与随机环状核酸(Lib)对于凝血酶催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白这一过程的阻碍作用。请参见图2，图2示出了根据本发明提供的凝血酶环状核酸适配体和随机环状核酸对凝血酶抑制作用的结果图。如图2所示，在凝血酶浓度为0.1nM时，TBCA的IC50值为0.15nM，Lib的IC50值为72.14nM。可见，TBCA对凝血酶的抑制作用显著高于随机环状核酸(Lib)。
实施例3
本实施例用于证明本发明提供的凝血酶环状核酸适配体对凝血酶的具有高效的抑制作用。
将0.1nM的凝血酶，2μM的纤维蛋白原分别与不同浓度的TBCA以及M1、M2、M3、M4、M5、D1、D2、D3在缓冲体系中(反应总体积100μL)孵育一定时间(反应到达平衡时)，通过使用酶标仪测定反应体系在350nm处的吸光度来拟合计算出TBCA和M1、M2、M3、M4、M5、D1、D2、D3的IC50值。
请参见图3，图3示出了本发明提供的凝血酶环状核酸适配体对凝血酶抑制作用的结果图。如图3所示，在凝血酶浓度为0.1nM时，TBCA、M1、M2、M3、M4、M5、D1、D2、D3的IC50值分别为0.15nM、0.37nM、0.36nM、0.18nM、0.10nM、0.11nM、0.15nM、0.09nM、0.13nM。由此可见，本发明提供的凝血酶环状核酸适配体能够特异性地识别凝血酶，并且对凝血酶具有高效的抑制作用。
实施例4
本实施例证明相对于现有的凝血酶抑制剂，本发明提供的TBCA对凝血酶具有更加高效的抑制作用。
将0.1nM的凝血酶，2μM的纤维蛋白原分别与不同浓度的TBCA、TBA以及阿加曲班(Argatroban)在缓冲体系中(反应总体积100μL)孵育一定时间(反应到达平衡时)，通过使用酶标仪测定反应体系在350nm处的吸光度来拟合计算出TBCA、TBA和阿加曲班(Argatroban)的IC50值。
参见图4，图4示出了本发明提供的TBCA与现有的凝血酶抑制剂对凝血酶抑制作用的结果图，其中现有的凝血酶抑制剂分别为TBA和阿加曲班(Argatroban)。如图4所示，TBCA对凝血酶的抑制作用显著高于现有的线性凝血酶核酸适配体以及抗凝化学药物。TBCA、特异性靶向α凝血酶的核酸适配体TBA、以及目前一种常用的特异性靶向凝血酶的抗凝药阿加曲班(Argatroban)为例，通过测定这些抗凝物质对凝血酶催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白这一过程的阻碍作用，来测定IC50值。在凝血酶浓度为0.1nM时，APT15的IC50值为1.3nM，阿加曲班的IC50值为3.0nM，即TBCA对凝血酶的抑制效果比现有的特异性靶向α凝血酶的核酸适配体TBA高13倍，比阿加曲班高30倍。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 合肥工业大学
<120> 凝血酶环状核酸适配体及其应用
<160> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
atctcgacta gtcatagggg gcgcgaacat acgcggttgg tgtggttggc tgacaa 56
<210> 11
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
atctcgacta gtcannnnnn nnnnnnnnnn nnnnggttgg tgtggttggn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnt gtctcggat 79

Claims (7)

1.一种凝血酶环状核酸适配体，其特征在于，所述凝血酶环状核酸适配体的核苷酸序列选自a）或b）：
a）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列且5'端和3'端连接成环，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经化学基团修饰的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的凝血酶环状核酸适配体，其特征在于，所述化学基团包括：修饰在嘧啶环的2’位置上的-NH2或-F、修饰在嘌呤环的2’位置上的-OCH3、修饰在相邻核苷酸之间的硫代磷酸根、以及修饰在5’端点上的嘧啶类似物。
3.一种凝血酶环状核酸适配体，其特征在于，所述凝血酶环状核酸适配体的核苷酸序列为b1）~b5）中至少一种：
b1）SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列为5'-NNNNNNNCTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b2）SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGANNNNNNNTAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b3）SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAANNNNNNNTTTTGGTGTCTCGGAT-3'；
b4）SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTNNNNNNNGTCTCGGAT-3'；
b5）SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTTTTTGGTNNNNNNNNN-3'；
其中，N表示A、T、C或G。
4.根据权利要求3所述的凝血酶环状核酸适配体，其特征在于，所述N表示T或A。
5.一种凝血酶环状核酸适配体，其特征在于，所述凝血酶环状核酸适配体的核苷酸序列为c1）~c3）中至少一种：
c1）SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGTGTCTCGGAT-3'；
c2）SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAATACTCGT-3'；
c3）SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列为5'-ATCTCGACTAGTCATAGGGGGCGCGAACATACGCGGTTGGTGTGGTTGGCTGACAA-3'。
6.权利要求1-5中任意一项所述的凝血酶环状核酸适配体在制备抑制凝血酶制剂中的应用。
7.权利要求1-5中任意一项所述的凝血酶环状核酸适配体在制备预防和/或治疗与凝血酶相关的疾病的制剂中的应用。
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