JPH08502966A

JPH08502966A - Ｒｎａ／リガンド結合の低分子抑制

Info

Publication number: JPH08502966A
Application number: JP6511215A
Authority: JP
Inventors: グリーン，マイケル・アール; ザップ，マリア・エル; スターン，セス
Original assignee: ユニバーシティー・オブ・マサチューセッツ・メディカル・センター
Priority date: 1992-10-23
Filing date: 1993-10-25
Publication date: 1996-04-02
Also published as: US5935776A; CA2147605A1; EP0668766A1; WO1994009792A1

Abstract

(57)【要約】リガンドのＲＮＡへの結合を抑制する方法が開示されるが、この抑制は、ＲＮＡに結合する小型の有機分子によって仲介され、それによってリガンドの結合を抑制する。好ましい種類の小型有機分子は、２−デオキシストレプタミン（２−ＤＯＳ）アミノグリコシドである。本明細書で開示されるのは、トランス一活性化型蛋白へのＲＮＡ結合の抑制に有用な２−ＤＯＳ類に属するものである。

Description

【発明の詳細な説明】ＲＮＡ／リガンド結合の低分子抑制発明の背景ヒトレトロウイルス（例えば免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１））の複製は、ウイルスの秩序正しい形質発現パターンを必要とする。この統制された形質発現は、ウイルスの２つの制御蛋白（ＴａｔおよびＲｅｖ）とウイルスＲＮＡ上のそれぞれの部位との配列特異的相互反応に依存する。Ｔａｔは転写アクチベーターであり、一方、Ｒｅｖは、ウイルスｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の細胞質蓄積を増加させるために転写後に作用する。ＴａｔおよびＲｅｖはウイルス複製に必須であるので、治療的な介入には魅力的な標的である。これらのウイルス性制御蛋白レベルを低下またはそれらの作用を阻害するために、今日までのところ３種類の戦法が試された。先ず初めに、ＲｅｖｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸が定常的なＲｅｖ蛋白レベルを低下させるために用いられた。第二の方法は、親和性の高い蛋白結合部位を含む、極めて過剰量の小型の「囮」ＲＮＡを導入することによって制御蛋白を隔離（滴定）するものである。例えば、Ｔａｔ結合部位ＴＡＲを発現しているレトロウイルスベクターは、培養細胞でのウイルス複製を抑制することができる。第三の方法は、ウイルス制御蛋白についての優性ネガティブ突然変異体（ミュータント）を発現させるものである。例えば、Ｃ−末端の限定領域内に変異を有するＲｅｖ誘導体はＲｅｖ活性を破壊し、さらにこれら変異体は、同時核酸感染（コトランスフェクション）アッセーで野生型Ｒｅｖを抑制することができる。これら３種の戦法に固有の主要な問題は、この治療薬（核酸または蛋白のいずれかである）の送達の困難さである。発明の要旨本発明は、リガンドのＲＮＡへの結合を抑制するために小型の有機分子を使用することに関する。好ましい実施態様では、このリガンドはトランス活性化型（ trans-activating）制御蛋白で、このＲＮＡはシス作動性（cis-acting）配列を含むＭＲＮＡまたはプレーＭＲＮＡである。好ましい種類の小型の有機分子は２−デオキシストレプタミン（２−ＤＯＳ）アミノグリコシドである。本明細書で開示されるものは、トランス活性化型制御蛋白のｍＲＮＡへの結合を抑制するために有用な２−ＤＯＳ類である。本発明はまた、多様な構造的修飾に関するが、これら構造的修飾は、リガンドのＲＮＡへの結合を抑制する２−ＤＯＳ−アミノグリコシドの能力に影響を与えることが分かった。図面の詳細な説明図１：ＴａｔペプチドのＴＡＲＲＮＡへの結合のシソマイシンによる抑制Ａ）２６ヌクレオチド³²Ｐ標識ＴＡＲＲＮＡプローブ（＋１８から＋４４）を、指定した抗生物質の非存在下（−）またはその２５０ μＭの存在下（＋）で、ＨＩＶ−１Ｔａｔ蛋白（Calnanら、Genes Rev.，5:20 1-210（1991））のアミノ酸４８−６０を含む合成ペプチドと共に保温した。Ｔａｔペプチドの存在（＋）は各レーンの上に示す。コントロールの反応は左に示す。Ｔａｔ−ＴＡＲ複合体と未結合ＲＮＡプローブは矢印で示す。Ｔａｔ結合を抑制する抗生物質は星印（*）で示す。Ｂ）同じＴＡＲプローブをＴａｔペプチドの存在下（＋）でシソマイシンの濃度（マイクロモル）を減少させながら保温した。ペプチドまたは抗生物質が存在しない場合（−）はレーンの上に示す。Ｔａｔ−ＴＡＲ複合体および未結合プローブは矢印で示す。図２：シソマイシンによるＴａｔ−ＴＡＲの相互反応特異的抑制Ａ）シソマイシンはＲｅｖ−ＲＲＥ相互反応に影響を与えない。親和性の高いＲｅｖ結合部位を含む³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（Zappら、Cell，74:969-978（ 1993））を、精製大腸菌（E．coli）由来Ｒｅｖ蛋白と共にシソマイシンの濃度を上げながら保温した。抗生物質の濃度（マイクロモル）は各レーンの上に示す。抗生物質が存在しないコントロール反応は左に示す。Ｒｅｖ−ＸＲＥ複合体および未結合プローブは矢印で示す。Ｂ）プレ−ｍＲＮＡスプライシングに影響を与えない抑制性アミノグリコシド ³²Ｐ標識ヒトβ−グロビンプレ−ｍＲＮＡ（Krainerら、Cell，36:993-1005（ 1984）およびRuskinら、Cell，38:317-331（1984））を、数種のアミノグリコシドの存在下（＋）または非存在下（−）でＨｅＬａ核抽出物中で保温した。濃度（マイクロモル）は左に示す。反応生成物の構造は右に示す。コントロール反応は左に示す。図３：ＴＡＲＲＮＡの限定領域へのシソマイシンの結合ケトキサール修飾／保護実験。親和性の高いＴＡＴ結合部位を含む４６−ヌクレオチドＲＮＡを、シソマイシンの濃度を上昇させながら（１０μＭ、１００μ Ｍまたは１ｍＭ）、またはその非存在下で保温し、さらに表示したようにケトキサールで処理した。逆転写ＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ヌクレオチドの位置はオートラジオグラムの左に示した通りである。シソマイシンによって選択的に保護されたグアノシンは星印（＊）によって示す。図４：ジヒドロストレプトマイシンによるＨＴＬＶ−１Ｒｅｘ蛋白のＸＲＥＲＮＡへの結合抑制親和性の高いＲｅｘ結合部位を含む１００ヌクレオチドの³²Ｐ標識ＲＮＡプローブを、精製大腸菌（E．coli）由来ＧＳＴ−Ｒｅｘ蛋白と共に種々のアミノグリコシドの存在下または非存在下で保温した。被検抗生物質は各レーンの上に示す。濃度（マイクロモル）または抗生物質は左に示す。コントロール反応は左側に示す。Ｒｅｘ−ＸＲＥ複合体および未結合プローブは矢印で記した。図５：Ｒｅｘ−ＸＲＥ相互反応の抑制の特異性親和性の高いＲｅｖ結合部位を含む６７ヌクレオチドの³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（Zappら、Cell,74:969-978（1989））を、精製大腸菌（E．coli）由来Ｒｅｖ蛋白と共にジヒドロストレプトマイシンの濃度を増加させながら、またはその非存在下で保温した。抗生物質の濃度は各レーンの上に記した。コントロール反応は左側に示す。Ｒｅｘ−ＸＲＥ複合体および未結合プローブは矢印で示す。図６：６ＤＥＥによるＴａｔペプチドのＴＡＲＲＮＡへの結合抑制Ａ）２６ヌクレオチドの³²Ｐ標識ＴＡＲＲＮＡプローブ（＋１８から＋４４）を、ＨＩＶ−１Ｔａｔ蛋白のアミノ酸４０−６０を含む合成ペプチドと共に２５０μＭの表示化合物の存在下、またはその非存在下で保温した（Calnanら、Genes Rev.，5:201-210（1991））。Ｔａｔペプチドが存在する場合（＋）は各レーンの上に記した。コントロール反応は左側に示す。Ｔａｔ−ＴＡＲ複合体および未結合プローブは矢印で示す。６ＤＥＥの存在下でのＴａｔ結合反応は星印（*）で示す。Ｂ）同じプローブを６ＤＥＥの濃度（マイクロモル）を減少させながらＴａｔペプチドの存在下（＋）または非存在下（−）で保温した。ペプチドまたは６ＤＥＥが存在しない場合（−）はレーンの上に示した。Ｔａｔ−ＴＡＲ複合体および未結合プローブは矢印で示す。図７：６ＤＥＥによるＴａｔ−ＴＡＲ相互反応の特異的抑制親和性の高いＲｅｖ結合部位を含む³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（Zappら、Cell，74 :969-978（1993））を、精製大腸菌（E．coli）由来Ｒｅｖ蛋白と共に６ＤＥＥの濃度を上昇（＋）させながら保温した。６ＤＥＥの濃度（マイクロモル）は各レーンで示した。６ＤＥＥの非存在下でのコントロール反応は左側に示す。Ｒｅｖ−ＲＲＥ複合体および未結合プローブは矢印で示す。図８：プレ−ｍＲＮＡスプライシングに影響を与えない抑制性化合物６ＤＥＥ ³²Ｐ標識ヒトβ−グロビンプレ−ｍＲＮＡ（Krainerら、Cell，36:993-1005（ 1984）およびRuskinら、Cell，38:317-331（1984））を、６ＤＥＥの存在下（＋）または非存在下（−）でＨｅＬａ核抽出物中で保温した。濃度（マイクロモル）は左に示す。反応生成物の構造は右側に記した。コントロール反応は左側に示す。発明の詳細な説明本発明は、リガンドのＲＮＡへの特異的結合は小型の有機分子によって抑制されるという発見に基づいている。この小型の有機分子はＲＮＡに結合し、それによってリガンドがＲＮＡに結合するのを抑制する。本明細書で用いられているように、”小型有機分子”という表現は、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはその類似体以外の分子量が約２０００ダルトン未満の化合物を指す。ＲＮＡ／リガンド対のＲＮＡ部分はいずれのリボ核酸ポリマーであってもよい。ＲＮＡ／リガンド対のリガンド部分は好ましくは蛋白、核酸、脂質または炭水化物である。ある実施態様では、リガンド／ＲＮＡ対のリガンド部分はＨＩＶＲｅｖ蛋白である。Ｒｅｖ蛋白は転写後に機能し、感染細胞の核から細胞質へのｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖｍＲＮＡの輸送を促進する。Ｒｅｖがなければ、これらの構造遺伝子転写物は、細胞質内に蓄積されず、ウイルスは複製することができない。Ｒｅｖによる活性化のために、Ｒｅｖ反応性転写物内のシス−作動性成分が要求される。この成分（Ｒｅｖ反応性成分（ＲＲＥ）と呼ばれる）は、２３４ヌクレオチドフラグメントまでマッピングされている（Malimら、Nature 338:254（198 9）参照）。Ｒｅｖは、インビトロでＲＲＥと特異的に結合する。化学的保護実験およびＲＮＡ分解酵素（ＲＮＡアーゼ）保護実験では、Ｒｅｖの結合は主として６６ヌクレオチドフラグメント内のヌクレオチド（ＲＲＥのドメインIIと呼ばれる）を保護する。このフラグメントは親和性の高いＲｅｖ結合のために必要にして十分であることが示された。下記の実施例では、標識した６７ヌクレオチドの高親和性Ｒｅｖ結合部位へＲｅｖが結合するのを阻害する能力について小型有機分子が調べられた（Bartelら、Cell，67:529（1991）参照）。以下に詳細に説明するように、高親和性ＲＲＥへのＲｅｖの結合抑制達成は、好ましい種類の小型有機分子（２−デオキシストレプタミン（２−ＤＯＳ）アミノグリコシド類）を用いて認められた。この２−ＤＯＳ類には、グリコシド結合で１つまたはそれ以上の糖部分に連結された２−デオキシストレプタミン核を有するという特徴をもつ１群のアミノグリコシドが含まれる。下記の実施例の章で説明する実験では、１３種類の２−ＤＯＳアミノグリコシド類のＲｅｖ／ＲＲＥ結合抑制アッセーでのテストが記載されている。具体的には、テストされた２−ＤＯＳ化合物は、ネアミン、アミカシン、シソマイシン、リボスタマイシン、ブチロシン、カナマイシンＢ、カナマイシンＡ、トブラマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシンＢ、パロマイシン１、リビドマイシンＡおよびヒグロマイシンＢである。リビドマイシンＡを除いてこれらの化合物の各々の化学的構造は、Merck Index（第11版、Budavariら編、Rahway（1989））で与えられる。リビドマイシンＡの構造は「抗生物質化合物」のＣＲＣハンドブック（J．Berdi、CRC Handbook of”Antibiotic Compounds”、Ｉ巻（炭水化物性抗生物質）、CRC Press Inc.、Boca Raton、フロリダ（1980））で与えられる。２−ＤＯＳ類化合物は、構造的特徴に基づきサブクラスに分類できる。サブクラスに分類する方法の１つは、２−デオキシストレプタミン核に結合した糖部分の数に基づく。サブクラス分類のもう１つの慣用的方法は、２−デオキシストレプタミン核上の置換基の位置によるものである。以下の表は、テストした２−ＤＯＳ化合物の各々についてのこれら構造的特性をまとめたものである。驚いたことに、Ｒｅｖ／ＲＲＥ結合抑制アッセーでテストした１３種の２−ＤＯＳアミノグリコシドのうち、８種（ネオマイシンＢ、ネアミン、リボスタマイシン、リビドマイシンＡ、カナマイシンＢ、アミカシン、ゲンタマイシンＣおよびトブラマイシン）がＲＲＥへのＲｅｖ結合抑制に有効であった。さらに、３種の２−ＤＯＳアミノグリコシド（ネオマイシンＢ、トブラマイシンおよびリビドマイシンＡ）は、例外的な抑制能力を有していた。これらのデータは、２−ＤＯＳアミノグリコシドはこのＲｅｖ／ＲＲＥ結合抑制をもたらす未だ未知の構造的特性という特徴をもつことを明瞭に示している。このことは、有効な２−ＤＯＳアミノグリコシドは適切な方向性をもつアミノ基とヒドロキシル基を含み、ＲＮＡ塩基に対して水素結合供与体および受容体を提供し、ＲＮＡの陰性荷電燐酸基と相互反応させるために陽性に荷電したアミノ基を提供するようにみえる。したがって、本発明はまた、この構造特性を模倣しそれによってＲｅｖ／ＲＲＥ相互反応を抑制することができる小型の有機分子に関する。別の実施態様では、リガンド／ＲＮＡ対のリガンド部分はＨＩＶＴａｔ蛋白である。このｔａｔ蛋白は、転写段階で作用することによって遺伝子発現を強化することが知られている。この機能は、トランス作動性反応性成分（つまりＴＡＲ）と結合するアルギニン富裕ＲＮＡ結合モチーフを介して達成される。ＴＡＲはＨＩＶ遺伝子ひとつひとつのｍＲＮＡ転写物中に含まれる。下記の実施例では、２６ヌクレオチドの標識ＴＡＴＲＮＡプローブ（Calnanら、Genes Dev．5:201-210（1991））へのＴＡＴ結合阻害に関して３２種の小型有機分子の能力をテストする実験を開示する。ＲＲＥへのＲｅｖ結合に関して分かるように、２−ＤＯＳ化合物の化学特性はＴａｔ／ＴＡＲ結合について必須である。アミノグリコシド系抗生物質のシソマイシン（構造Ｉ）は、濃度５０μＭで８０％より大きいＴａｔ／ＴＡＲ結合抑制をもたらした。リボスタマイシン、ジヒドロストレプトマイシン（構造ＩＩ）、リンコマイシンおよびチオストレプトンは抑制を示さなかった。これら化合物の各々の化学構造はMerck Index（第11 版、Budavariら編、Rah-way（1989））で与えられる。実施例で説明する化学的保護実験およびＲＮＡアーゼ保護実験において、Ｔａｔ／ＴＡＲ相互反応のシソマイシンによる抑制は非常に特異的であることが明瞭に示された。また、シソマイシンの結合はＴＡＲの限定領域に局在したが、この場合シソマイシンは、ＴＡＲのＲＮＡ構造をゆがめている。別の実施態様では、リガンド部分はヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ −１）のＲｅｘ蛋白である。Ｒｅｘ蛋白は、ＨＴＬＶ−１複製に必須の配列特異的ＲＮＡ結合蛋白である。Ｒｅｘが機能するためには、Ｒｅｘ反応性成分つまり「ＸＲＥ」と呼ばれるシス−作動性ＲＮＡ成分が必要で、これはＵ３領域の３’ 部分に位置している。ＨＩＶ−１Ｒｅｖ蛋白に似て、このＨＴＬＶ−１Ｒｅｘ蛋白は転写後に機能し、ウイルスの構造蛋白をコードするスプライシング前のｍＲＮＡまたは１回だけスプライシングされたｍＲＮＡの核−細胞質再分布を促進させる。下記の実施例では、親和性の高いＲｅｘ結合部位を含む１００ヌクレオチドの標識ＲＮＡプローブ（Ohtaら、J．Virol．，62:4445-4451（1988））を用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｒｅｘ融合蛋白の結合を抑制する能力について、小型の有機分子をテストした実験が記載されている。具体的には、３２種のアミノグリコシド系および非アミノグリコシド系の抗生物質がこの態様でテストされた。ＲｅｖおよびＴａｔ蛋白の場合のように、２−Ｄｏｓ核内に含まれる構造成分はリガンド／ＲＮＡ抑制に必須のようにみえる。具体的にはジヒドロストレプトマイシン（構造ＩＩ）は５０μＭの低い濃度でＲｅｘ結合を完全に抑制した。ヒグロマイシンＢ、リンコマイシン、カスガマイシン、オリボマイシンおよびクロモマイシンＡは２５０μＭまで抑制を示さなかった。これら化合物の各々の構造はカスガマイシンを除いてMerck Index（第11版、Budav ariら編、Rahway（1989））で与えられる。カスガマイシンの構造は、「抗生物質化合物」のＣＲＣハンドブック（J．Berdi、CRC Handbook of”Anti-biotic C ompounds”、Ｉ巻（炭水化物性抗生物質）、CRC Press，Inc.、Boca Raton、フロリダ（1980））で与えられる。ジヒドロストレプトマイシンの結合は、Ｒｅｘ−ＸＲＥ相互反応に特異的である。このことは、Ｒｅｖ／ＲＲＥ結合抑制が１００μＭ以下の濃度では効果がないことが示されたとき明らかとなった。Ｒｅｘ−ＸＲＥに対するジヒドロストレプトマイシンの特異性はまた、ＲＮＡアーゼ保護実験でも示された。これらの実験のより詳細な記載は下記の実施例で提供される。本明細書で開示する抑制方法は種々の状況で有用である。インビトロの場合には、本抑制方法は、例えばこの所望の特性をもつ他の化合物の同定のためにデザインした実験でＲｅｖ／ＲＲＥ結合抑制用の陽性コントロールとして用いることができる。実施例の章で示すように、本抑制方法をＨＩＶ感染細胞の治療に応用し、それによってＨＩＶウイルスの複製抑制をもたらすことができる。２−ＤＯＳアミノグリコシドに官能基を付加し、本明細書に開示した所望の特性の強化についてさらにテストすることができる。アミンおよびヒドロキシ官能基が誘導用として好ましい場所である。２−ＤＯＳアミノグリコシドの官能基付加は、この化合物のＲＲＥに対する親和性／特異性の増強に役立つ。この修飾はまた、該化合物の膜透過性および細胞内取り込みの増強に役立つ。アミンの塩基性を低下させる親油性部分または親油基の誘導はこの所望の効果をもつかもしれない。治療の場合には、修飾アミノグリコシドは毒性の低下を示すであろう。修飾２−ＤＯＳアミノグリコシド自体はＲｅｖＲＲＥの抑制物質ではないが、細胞内部で活性な抑制物質に変換されるえる場合もまた含まれる。ある実施態様では、添加された３つの糖をもつ２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのアミンは、２−ＤＯＳアミノグリコシドの分子量を５００ダルトンまで増加させる修飾基を付加される。別の実施例では、４，５−二置換２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドはまた、２−ＤＯＳアミノグリコシドの分子量を５００ダルトンまで増加させる修飾基を付加される。また別の実施態様では、１つ、２つまたは４つの添加糖をもつ２−デオキシストレプタミンアミノグリコシド並びに４−一置換および４，６−二置換２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのアミンに、修飾基が付加されるが、この場合分子量の制限はない。この制限を満たす共通の修飾基には、例えば、ベンジル、置換ベンジル、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、カルボベンジルオキシ、アルキル、置換アルキル、アシル、ベンゾイル、置換ベンゾイルアルカノイルまたは置換アルカノイルが含まれる。この修飾基は、好ましくは２−ＤＯＳアミノグリコシドの全体的な親油性を高める傾向をもつ基である。別の実施態様では、２−ＤＯＳアミノグリコシドの全アミンがメチルで置換されているか、または一級アミンのいずれかであることを条件として、アミン修飾基はメチル基である。この例では、２−ＤＯＳ分子上のヒドロキシル基は、置換されていなくても、また部分的にもしくは完全に置換されていてもよい。２−ＤＯＳアミノグリコシドのヒドロキシ官能基はまた、修飾基を用いて官能基付加を行うことができる。ヒドロキシル誘導に有用な共通の修飾基には、例えば、ベンジル、置換ベンジル、ベンゾイル、置換ベンゾイル、アルキル、置換アルキル、アルカノイル、置換アルカノイルまたはシリルが含まれる。アミン誘導のために考察したように、ヒドロキシル修飾のための修飾基の選択は、好ましくは２−ＤＯＳアミノグリコシドの全体的な親油性を増強する傾向をもつ基である。以下に詳述する構造に関する情報は、特に有用な２−ＤＯＳアミノグリコシド誘導体を説明するために提供される。これらには、下記の構造III−IVで説明する構造特色をもつ４−置換、４，５二置換、または４，６二置換２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが含まれる。式中、Ｒ₁は、ＨまたはＬ−（−）−４−アミノ−２−ヒドロキシブチリルから選ばれ；Ｒ₂は、下記構造IVの構造をもつヘキソースの基から選ばれ：（式中、Ｒ₅はアミノまたはヒドロキシルのいずれかで、Ｒ₆およびＲ₇はＨまたはヒドロキシルのいずれかで、Ｒ₈はアミノまたはヒドロキシルのいずれかで、Ｒ₉はアミノまたはメチルアミノのいずれかである）、Ｒ₃およびＲ₄はそれぞれ別個にＨ、Ｒ₁₀または下記の構造Ｖの構造をもつ分子部分から選ばれ：式中、Ｒ₁₀は構造VIに示すように、Ｈまたは下記の構造VIから成る基から選ばれ；Ｒ₁₁はＨまたはマンノシルから成る基から選ばれるが；Ｒ₃またはＲ₄の少なくとも１つはＨでなければならない。上記の構造Ｉ−IVに示した構造のアミンおよびヒドロキシル基は、本発明の詳細な説明ですでに述べたように修飾できることは理解されるところであろう。実施例に示すように、インビトロでのＲｅｖ／ＲＲＥ結合の２−ＤＯＳアミノグリコシドによる抑制は、アミノグリコシドの感染細胞におけるＨＩＶ複製抑制を予測するものとして役立つであろう。したがって、本発明の別の特徴は、ＨＩＶ感染細胞におけるＨＩＶ複製抑制に関する。感染細胞を複製抑制に十分な量のアミノグリコシドと接触させることによって複製抑制は影響を受ける。小型の有機分子の投与のための慣用の態様を治療において用いることができる。上記で検討した好ましい種類の小型の有機分子（２−ＤＯＳアミノグリコシド類）の他に、非アミノグリコシド系でもなく抗生物質ですらない小型の有機分子の使用が有効であることを示す実験を、以下の実施例の章で述べる。より具体的には、以下に述べるこの実験は、エリプチシン誘導体（６−２［２−（ジエチルアミノ）エチル］エリプチシン二塩酸塩（６ＤＥＥ）（構造VII））は、ＴＡＲＲＮＡへのＴａｔペプチドの結合を抑制することを示す。実施例実施例１：ＨＩＶＲＮＡのＲＲＥへのＲｅｖ結合を抑制するアミノグリコシド系抗生物質抗生物質がＲｅｖのＲＲＥへの結合を阻害することができるか否かをテストするために、高い親和性のＲｅｖ結合部位を含む６７ヌクレオチドの³²Ｐ標識ＲＮＡプローブを、種々の抗生物質の存在下で精製大腸菌由来Ｒｅｖ蛋白とともに保温した。ＲｅｖのＲＮＡプローブへの結合は、ＲＮＡゲル移動度シフトアッセーによって定量した。総数３２種のアミノグリコシド系および非アミノグリコシド系抗生物質を、Ｒｅｖ結合抑制能について先ず調べた。いくつかの結論がこのデータから得られた。第一に、非アミノグリコシド系抗生物質（エリスロマイシン、テトラサイクリン、チオストレプトン、クロラムフェニコール、クロモマイシンＡ、オリボマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシンＡ、ビネオマイシン、カプレオマイシン、ビオマイシン、ジスタマイシンＡ、アンピシリン、カルベニシリンおよびチュニカマイシン）は、検査したいずれの濃度でも抑制を示さなかった。第二に、３種のアミノグリコシド系抗生物質（ネオマイシンＢ、トブラマイシンおよびリビドマイシンＡ）は顕著な抑制能を有していた。特に、ネオマイシンＢは１μＭの低い濃度でＲｅｖ結合を完全に抑制した。また、親和性の高い結合部位を含む３３ヌクレオチドＲＮＡプローブへの、およびインビボでＲｅｖ反応を支える２３４ヌクレオチドＲＲＥへのＲｅｖの結合は、この同じ濃度の薬剤で抑制された。トブラマイシンおよびリビドマイシンＡは共にＲｅｖ結合抑制を達成するためにはわずかに高い濃度（１０μＭ）を必要とした。第三群のアミノグリコシド（ゲンタマイシン、カナマイシンＢ、リボスタマイシン、ネアミン、アミカシンおよびシソマイシン）は、１００μｍで抑制を示した。テストしたその他のアミノグリコシド系抗生物質（ブチロシン、カナマイシンＡ、パロモマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カスガマイシン、ジヒドロストレプトマイシンおよびヒグロマイシンＢ）は、用いたいずれの濃度でも抑制活性を示さなかった。ＲＮＡとアミノグリコシドとの結合は、この薬剤の陽性荷電のアミノ基とＲＮＡの陰性荷電の燐酸基との間のイオン反応を必要とする。ＲＮＡ結合のためのアミノ基の重要性は、いくつかの重要な構造−活性相関性によって明らかにされる。カナマイシンＡ対カナマイシンＢおよびネオマイシンＢ対パロマイシンの両方の事例で、アミノのヒドロキシル基への変更によって抑制活性は排除された。Ｒｅｖ−ＲＲＥ抑制データによって、２−デオキシストレプタミン（２−ＤＯＳ）コア構造が抑制に必要であることが示唆される。例えば、２−ＤＯＳを欠く薬剤（例えばストレプトマイシンおよびスペクチノマイシン）は、非アミノグリコシド系抗生物質がそうであったように活性をもたなかった。最も活性の高いアミノグリコシドは、４，５−二置換２−ＤＯＳ（ネオマイシンＢおよびリビドマイシンＡ）および４，６−二置換２−ＤＯＳ（トブラマイシン）部分を含む。極めて驚くべき構造と活性の相関性はネオマイシンＢとパロマイシンを含む。これら２つの分子はほとんど同一で、２−ＤＯＳの４位のアミノグルコースのＣ６置換基の性質だけが異なっている。最も強力な抑制物質であるネオマイシンＢは、アミノ基を有し、一方、完全に活性をもたないパロマイシンはこの位置にヒドロキシル基を有する。実施例２：ネオマイシンＢは特異的にＲｅｖ−ＲＲＥ相互反応を抑制する抑制がＲｅｖ−ＲＲＥ相互反応に特異的であるか否かを決定するために、いくつかの無関係な配列特異的ＲＮＡおよびＤＮＡ結合蛋白に対する抑制性抗生物質の影響を調べた。先ず初めに、プレ−ｍＲＮＡスプライシングに必要な２種のよく性状が分かっている蛋白を調べた。これらはスプライシング必須因子Ｕ２ＡＦ⁶⁵ およびショウジョウバエ（Drosophila）の性致死スプライシング調節蛋白である。これらの結合実験では、性致死蛋白またはＵ２ＡＦ⁶⁵の６５ｋＤサブユニット（それぞれグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白として精製された）を、ショウジョウバエのｔｒａ遺伝子で発見された十分に性状が分かっているポリピリミジントラクト−３’スプライシング部位を含む³²Ｐ標識ＲＮＡとともに、１００μＭのネオマイシンＢまたは１００μＭのトブラマイシンの存在下で保温した。ＧＳＴ−性致死蛋白のｔｒａＲＮＡへの結合は、１００μＭのネオマイシンＢとともに保温した後影響を受けない。同様に、ＧＳＴ−ＳｅｘＵ２ＡＦ⁶⁵のインビトロ結合も１００μＭのネオマイシンＢの存在によって抑制されない。したがって、これらの実験は、ネオマイシンＢはこれら２種のＲＮＡ結合蛋白のインビトロ結合特性に影響をあたえないことを明らかにしている。次にグリヤルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（配列特異的態様でトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のサブセットにまた結合する糖分解酵素）を調べた。ＧＡＰＤＨのｔＲＮＡ^Tyrへの結合は１００μＭのネオマイシンＢまたは１００μＭのトブラマイシンによって影響を受けなかった。Ｒｅｖは、アルギニン富裕ＲＮＡ結合モチーフを含むＲＮＡ結合蛋白類に含まれる。次にアミノグリコシド系抗生物質がこの種類の別の部分つまりＨＩＶ−１Ｔａｔの蛋白の結合を抑制することができるか否かを調べた。Ｔａｔのアルギニン富裕領域を含む１２アミノ酸ペプチドは、完全な長さの蛋白のそれと匹敵するＲＮＡ結合活性を有する。Ｔａｔペプチドの結合はアミノグリコシド系抗生物質のいずれによっても影響を受けなかった。したがって、テストした全てのＲＮＡ−蛋白相互反応のうち、Ｒｅｖ−ＲＲＥ相互反応のみが抑制された。実施例３：ネオマイシンＢによるＤＮＡ結合蛋白の抑制ネオマイシンＢによる抑制がＲｅｖ：ＲＲＥ相互反応に特異的であるというさらに別の証拠を提供するために、ＤＮＡ結合蛋白のインビトロ結合特性におけるネオマイシンＢの影響を調べた。これらの実験では、ゲル内移動度シフトアッセーを用いて、２つの真核細胞転写因子（Ｏｃｔ−１およびＡＴＦ−２）のＤＮＡ結合活性を、１００μＭネオマイシンＢ中で保温した後精査した。ＨＳＶＩＣＰＯオクタマー結合部位を含む³² Ｐ標識７０ヌクレオチドＤＮＡプローブ（Stern & Herr，Genes and Developm ent，5:2555-2566（1991））とともに、精製Ｏｃｔ−１をネオマイシンＢの非存在下または存在下（１００μＭ）で保温した。さらに、ＡＴＦ−２の３５ヌクレオチドＤＮＡプローブ（ＨＴＬＶ−１のＬＴＲのヌクレオチド−２５１から−２３２と相同）への結合に対する１００μＭネオマイシンＢの影響も精査した。ＨＳＶＩＣＰＯオクタマー結合部位へのＯＣＴ−１の結合は１００μＭのネオマイシンＢでは影響されなかった。ＡＴＦ−２に対するＤＮＡ結合活性の程度は１００μＭネオマイシンＢとの保温後も変化がなかった。したがって、ネオマイシンＢは、Ｏｃｔ−１およびＡＴＦ−２のインビトロＤＮＡ結合特性に影響を与えない。実施例４：前駆体ｍＲＮＡプロセッシングの抑制これまでの研究で、ネオマシシンＢやトブラマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質は、グループＩのイントロンのセルフスプライシングをインビトロで効果的に抑制すると報告された（von Ahsenら、J．Mol．Biol.，226:935-941 （1992））。しかしながら、これらの抗生物質が、多くのＲＮＡ：蛋白相互反応を伴う反応工程である前駆体ｍＲＮＡスプライシングに抑制作用を有するかどうかは未だ確定されていない。これらアミノグリコシド系抗生物質が前駆体ｍＲＮＡスプライシングを抑制するか否かを決定し、さらに、ネオマイシンＢによる抑制がＲｅｖ：ＲＲＥ相互反応に特異的であることを示すために、カナマイシンＡ、ネオマイシンＢまたはトブラマイシンの前駆体ｍＲＮＡプロセッシングのインビトロ抑制能を調べた。これらの実験では、２２０ヌクレオチドのアデノウイルス主要後期前駆体ｍＲＮＡ（ＭＸＳＶＬ）を、カナマイシンＡ、ネオマイシンＢまたはトブラマイシンを含むＨｅＬａ細胞核抽出物中で保温した。これらのアミノグリコシド系抗生物質を１００μＭまでの濃度で哺乳類のインビトロスプライシング抽出物に添加した場合、前駆体ｍＲＮＡスプライシングのいずれの段階においても影響を与えなかった。前述の項で述べた結果を合わせると、これらのデータは、ネオマイシンによるＲｅｖのＲＲＥへの結合抑制は極めて特異的であることを示している。実施例５：ネオマイシンＢはＲＲＥのコア結合部位に結合する次に抑制の基礎を決定するための実験を実施した。アミノグリコシド系抗生物質に関する背景情報が与えられるならば、ネオマイシンＢはＲＲＥと複合体を形成し、Ｒｅｖ結合を阻害することができるという可能性が存在する。この仮説をテストするために、化学的フットプリント実験を実施した。６７ヌクレオチドＲＲＥＲＮＡを単独、Ｒｅｖとともに、またはネオマイシンＢ、トブラマイシンもしくはカナマイシンＡの濃度を高めながら（０．１、１．０および１０μＭ）ともに保温し、さらに硫酸ジメチル（ＤＭＳ）またはケトキサールのいずれかで処理した。前者はＮ１のアデノシンおよびＮ３のシトシンをメチル化し、後者はグアノシンのＮ１およびＮ２を修飾する。特異的塩基の修飾はプライマーの伸長によって検出した。このような条件の下では、ＤＭＳおよびケトキサールは一本鎖特異的で、したがって単独ＲＮＡの修飾パターンは二次構造の指標を提供する。ネオマイシンＢの存在下で実施された化学修飾／保護実験の結果によって、ネオマイシンＢは、Ｒｅｖ蛋白に対して親和性が高い認識／結合部位内に含まれるＲＲＥ内のヌクレオチドに結合することが明らかにされた。トブラマイシンは同様な保護パターンを生じたが、トブラマイシンによる保護は弱く、これはトブラマイシンの弱い抑制活性と一致する。例えば、Ｒｅｖ、ネオマイシンＢ、トブラマイシンは全て、６７ヌクレオチドＲＮＡのヌクレオチド４６−４８を強力に保護した。同じ濃度の非抑制性アミノグリコシドのカナマイシンＡはＲＲＥを化学的修飾から防護しなかった。実施例６：ＲｅｖはＲＲＥへの結合についてネオマイシンＢと競合する実施例５の化学修飾／保護実験は、抑制性抗生物質は親和性が高いＲｅｖ結合部位のコア内の塩基を保護することを示した。このことは、これら薬剤は競合的メカニズムによってＲｅｖ結合を抑制することを示唆した。この仮説が予測するものは、高濃度のＲｅｖによって抑制が抑えられるということである。この可能性を調べるために、Ｒｅｖの濃度を増加させながら、１００μＭのネオマイシンＢを含む反応混合物に加えた。最も低い蛋白濃度（１．３−２ｎｇ）でも薬剤によってＲｅｖ結合は完全に抑制された。しかしながら、Ｒｅｖの量が増加するにつれ、ＲＮＡ結合は回復した（１０−２０ｎｇ）。実施例５と６の結果を総合すると、ネオマイシンＢによるＲｅｖ結合の抑制は競合的メカニズムによって生じることが示唆される。実施例７：ネオマイシンＢはインビトロでＲｅｖ機能と拮抗する上記の実験によって、精製ＲｅｖのＲＮＡへの結合に干渉するこれら抗生物質の能力が測定された。これによって、抑制性抗生物質は、またＲｅｖ機能と干渉する可能性が示唆された。この仮説は、インビトロでＲｅｖ機能を精査することによって調べた。このアッセーでは、スプライシングの抑制は、ＲＮＡに結合することができるＲｅｖ誘導体とＲＲＥを含むプレ−ｍＲＮＡの両方を必要とする。したがって、スプライシングの抑制はＲｅｖ−ＲＲＥ相互反応に依存する。ネオマイシンＢはＲｅｖ結合を抑制するので、この薬剤はスプライシング抑制を逆転させるであろう。この実験の結果は、Ｒｅｖ誘導体はＲＲＥを含むプレ−ｍＲＮＡのスプライシングを抑制することを示した。特に、ネオマイシンＢは、Ｒｅｖ結合を抑制する濃度（１．０−２．５μＭ）と同じ濃度でＲｅｖ仲介スプライシング抑制を無効にした。対照的に、非抑制性抗生物質であるカナマイシンＡは４０倍高い濃度でもスプライシング抑制を逆転させることができなかった。このことは、ネオマイシンＢはインビトロでＲｅｖ機能を抑制することを示す。ネオマイシンＢは、４００倍高い濃度でもＲＮＡベースのプレ−ｍＲＮＡスプライシング反応を抑制しなかったので（実施例４参照）、抑制は極めて特異的であることは明らかである。実施例８：ネオマイシンＢはインビボで選択的にＲｅｖ機能と拮抗する次に、抑制性抗生物質がインビボでもＲｅｖ機能と拮抗することができるか否かを知るために実験を行った。Ｒｅｖ機能は、クロラムフェニコールアセチトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポータープラスミドｐＣＭ１２８（これはＲＲＥおよび細菌性ＣＡＴコード配列の両方を含むただ１つのイントロンを有する）を用いて同時核酸感染アッセーで測定した（Hopeら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87 :7787-7791（1990））。イントロンは通常スプライシングによって能率的に切り出され、したがってｐＣＭ１２８をトランスフェクトされた細胞は、ほんの微量のＣＡＴ酵素活性を発現するだけである。Ｒｅｖ発現プラスミドによる同時核酸感染はスプライシングされていない転写物が細胞質に入るのを可能にし、したがって、ＣＡＴ発現が増加する。ネオマイシンＢおよびトブラマイシンによってＲｅｖ機能の用量依存抑制が生じるが、一方、カナマイシンＡは抑制作用をもたなかった。これらの発見は、上記のインビトロＲｅｖ結合アッセーおよびスプライシング抑制アッセーで得られた結果と一致する。３つの考察によって、Ｒｅｖ機能の抑制は特異的で、形質発現におけるより一般的な抑制作用によるものではないということが示唆される。第一に、テストした全ての抗生物質の濃度で、細胞の生存度および増殖は正常で、細胞内翻訳総量（［³⁵Ｓ］メチオニンの取り込み）は抑制されなかった。第二に、Ｒｅｖ機能を抑制するネオマイシンＢおよびトブラマイシンの濃度は、同時核酸感染を行った β−ガラクトシダーゼ、レポーター遺伝子の発現を抑制しなかった。第三に、ネオマイシンＢおよびトブラマイシンの対応濃度では、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−ＣＡＴレポーターの発現、またはＨＩＶのロングターミナルリピート− ＣＡＴレポーターのＨＩＶＴａｔ−仲介活性化を抑制しなかった。したがって、Ｒｅｖ機能の抑制は、転写または転写後の段階におけるＣＡＴ形質発現に対する干渉によるものではない。転写活性化はＴａｔとトランス作動性反応性配列との間のＲＮＡ−蛋白相互反応を必要とするので、Ｔａｔを抑制できないことは極めて明瞭である。この実験から、ネオマイシンＢおよびトブラマイシンは、インビボでのＲｅｖ機能を選択的に抑制すると結論することができる。実施例９：ネオマイシンＢはＨＩＶの産生を抑制するこれまでの実験は、ＲｅｖはＨＩＶの複製に必須であることを示した。したがって、上記に示した結果から予想されることは、ネオマイシンＢはウイルス産生を抑制するであろうということである。この予想をテストするために、慢性的感染を起こしている細胞株（Ｕ１）でのウイルス産生におけるネオマイシンＢの作用を精査した。この細胞株は、ウイルス産生のＲｅｖ依存活性化を調べるためのモデルとしてこれまで用いられてきた（Pomerantzら、Cell，61:1271-1276（199 0）； Michaelら、J．Virol.，55:1291-1303（1991））。ウイルス産生は、ネオマイシンＢの濃度を上げながら、培溶液中のウイルス構造蛋白（ｐ２４）量を測定するという標準アッセーを用いて調べた。この実験の結果は、ネオマイシンＢは用量依存態様（０−２．５ｍＭ）でウイルス産生を抑制することを明瞭に示した。調べた最高の濃度では、抑制は約８５％であった。とりわけ、これら薬剤の全ての濃度で、細胞増殖は未処理コントロールの９４− １０８％であった。ネオマイシンＢはしたがって、慢性感染を生じた細胞のＨＩＶ産生を明瞭に抑制する。実施例１０：シソマイシンはＴＡＴペプチドのＴＡＲＲＮＡへの結合を抑制するＴａｔ結合抑制能について、総計３２種のアミノグリコシド系および非アミノグリコシド系抗生物質をテストした。これらのデータのいくつかを図１Ａに示す。２６ヌクレオチド³²Ｐ標識ＴＡＲＲＮＡプローブ（＋１８から＋４４）を、ＨＩＶＴａｔ蛋白（Calnanら、Genes Rev.，5:201-210（199l））のアミノ酸４８−６０を含む合成ペプチドとともに２５０μＭの表示抗生物質の存在下または非存在下で保温した。結果は、アミノグリコシド系抗生物質であるシソマイシンだけがＴａｔペプチドのＴＡＲＲＮＡへの結合を抑制することを示した。リボスタマイシン（１００μＭまたはそれ以上の濃度でＲｅｖ結合を抑制することがこれまで示されていたアミノグルコシド）は、Ｔａｔ結合に関して２５０μＭでは影響を与えなかった。同じＴＡＲプローブをＴＡＴペプチドの存在下でシソマイシンの濃度（マイクロモル）を減少させながら保温した。データは図１Ｂに示す。このデータは、５０μＭの低さの濃度で、ＴＡＴペプチド結合は＞８０％抑制されることを示している。実施例１１：シソマイシンはＴａｔ−ＴＡＲ相互反応を特異的に抑制するＴａｔは、アルギニン富裕ＲＮＡ結合モチーフを含むＲＮＡ結合蛋白類の１つである。シソマイシン抑制がＴａｔ／ＴＡＲに特異的であるか否かを調べるために、親和性の高いＲｅｖ結合部位を含む³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（Zappら、Cell ，74:969-978（1993））を、精製大腸菌（E．coli）由来Ｒｅｖ蛋白とともにシソマイシンの濃度を増加させながら保温した。図２Ａに示すように、Ｒｅｖの結合はテストしたいずれの濃度のシソマイシンでも影響されなかった。実施例１２：シソマイシンは哺乳類プレ−ｍＲＮＡスプライシングを抑制しないプレ−ｍＲＮＡのスプライシングは多くのＲＮＡ−蛋白相互反応およびＲＮＡ −ＲＮＡ相互反応を必要とし、したがって、ＲＮＡ結合蛋白抑制因子についての厳密なテストを提供する。³²Ｐ標識ヒトβ−グロビンプレ−ｍＲＮＡ（Krainer ら、Cell，36:993-1005（1984）、及びRuskinら、Cell，38:317-331（1984））を数種のアミノグリコシドの存在下または非存在下でＨｅＬａ核抽出物中で保温した。スプライシングは１００μＭシソマイシンによって影響を受けなかった（図２Ｂ）。上記の結果と合わせて、これらのデータは、シソマイシンによるＴａｔ−ＴＡＲ相互反応の抑制は高度に特異的であることを示している。実施例１３：シソマイシンはＴＡＲの限定領域に結合するシソマイシンがＴＡＲの限定領域に結合するか否かをテストするために、化学的フットプリント実験をケトキサール（これはグアノシンのＮ１位とＮ２位を修飾する）を用いて実施した。親和性の高いＴＡＴ結合部位を含む４６ヌクレオチドＲＮＡを、シソマイシンの濃度を増加させながら（１０μＭ、１００μＭまたは１Ｍｍ）またはその非存在下で保温し、表示したようにケトキサールで処理した。ジデオキシシーケンシング反応（Ｃ、Ｕ、ＧおよびＡ）および未処理ＲＮＡによるコントロール反応（Ｋ）に加えて、逆転写ＲＮＡを変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。結果（図３）は、シソマイシンは２つのグアノシン（Ｇ３３及びＧ４３）を保護することを示しているが、このことは、シソマイシンはＴＡＲＲＮＡの構造的変化を誘発することを示唆する。これらのデータを合わせれば、シソマイシンはＴＡＲＲＮＡに直接結合し、その構造を歪めることが示唆される。誘発された構造的変化におけるこの直接結合によって上記のＴａｔ結合抑制が説明される。実施例１４：ＨＴＬＶ−１Ｒｅｘ蛋白の結合を抑制する低分子抗生物質がＨＴＬＶ−１Ｒｅｘ蛋白のその同系のＲＮＡ結合部位（ＸＲＥ）への結合を阻害するか否かをテストするために、親和性の高いＲｅｘ結合部位（ Ohtaら、J．Virol．62:4445-4451（1988）を含む１００ヌクレオチド³²Ｐ標識ＲＮＡプローブを、精製大腸菌由来グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｒｅｘ融合蛋白とともに種々の抗生物質の存在下で保温した。ＧＳＴ−ＲｅｘのＲＮＡプローブへの結合はＲＮＡ移動度シフトアッセーによって測定した。総数３２種のアミノグリコシドおよび非アミノグリコシド系抗生物質を、Ｒｅｘ結合を抑制する能力についてテストした。これらのデータのいくつかを図４に示す。特に、ジヒドロストレプトマイシンは、５０μＭの濃度でＲｅｘ結合を完全に抑制した。図４に示したその他の抗生物質は（ヒグロマイシンＢ、リンコマイシン、カスガマイシン、オリボマイシン、クロモマイシンＡ）は、テストに用いた最高濃度（２５０μＭ）でも抑制活性をもたなかった。実施例１５：ジヒドロストレプトマイシンはＲｅｘ−ＸＲＥ相互反応を特異的に抑制する抑制がＲｅｘ−ＸＲＥ相互反応に特異的か否かを調べるために、無関係の配列特異的ＲＮＡ結合蛋白、ＨＩＶ−１Ｒｅｖ蛋白に対するジヒドロストレプトマイシンの作用を調べた。Ｒｅｘは、アルギニン富裕ＲＮＡ結合モチーフを含むＲＮＡ結合蛋白類の１つである。ジヒドロストレプトマイシンがこの種類に含まれる別の蛋白の結合を抑制することができるか否かを調べるために、ＨＩＶ−１Ｒｅｖ蛋白を調べた。親和性の高いＲｅｖ結合部位を含む６７ヌクレオチド³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（Zappら、Cell，74:969-978（1989））を、精製大腸菌（E ．coli）由来Ｒｅｖ蛋白とともにジヒドロストレプトマイシンの濃度を上げながら、またはその非存在下で保温した。図５に示したように、ＲｅｖのＸＲＥへの結合は、最高濃度（１００ｍＭ）のジヒドロストレプトマイシンによって影響されなかった。実施例１６：ジヒドロストレプトマイシンは哺乳類のプレ −ｍＲＮＡスプライシングを抑制しない上記に述べたように、プレ−ｍＲＮＡスプライシングは、ＲＮＡ−蛋白相互反応およびＲＮＡ−ＲＮＡ相互反応の抑制因子についての厳密な特異性テストを提供する。図２Ｂおよび実施例１２で述べたように、１００μＭのジヒドロストレプトマイシンは、ＨｅＬａ細胞核抽出物中のヒトβ−グロビンプレ−ｍＲＮＡの基質のスプライシングに影響を与えなかった。上記の結果と合わせて、これらのデータは、ジヒドロストレプトマイシンによるＲｅｘ−ＸＲＥ相互反応の抑制は高度に特異的であることを示唆している。実施例１７：アミノグリコシド系抗生物質ではない低分子はＨＩＶＴＡＴ蛋白の結合を選択的に抑制するエリプチシンは抗腫瘍活性をもつことが知られている化合物の１つの種類である。それらは、ＤＮＡとの相互作用によって、おそらく挿入メカニズムを介して抗腫瘍効果を示すと考えられている。したがって、この種類に含まれるいずれかの分子によって、ＲＮＡ結合蛋白とその系統のＲＮＡ結合部位（ＴＡＲ）との相互反応が抑制されるか否かをテストした。親和性の高いＴａｔ結合部位を含む３６ヌクレオチド³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（＋１８から＋４４）を、Ｔａｔアルギニン富裕ＲＮＡ結合領域（Calnanら、Ge nes Rev.，5:201-210（1991））を含む合成ペプチドとともに保温した。この特有なＴａｔペプチド（アミノ酸４８−６０）は、完全な長さのＴａｔ蛋白のＲＮＡ結合活性に匹敵するＲＮＡ結合活性を有することが以前に示されていた。ＴａｔペプチドのＴＡＲＲＮＡプローブへの結合は、ＲＮＡゲル移動度シフトアッセーによって測定した。図６Ａは、エリプチシン誘導体（６−［２−（ジエチルアミノ）エチル］エリプチシンジヒドロクロリド（６ＤＥＥ））は、ＴＡＲＲＮＡへのＴａｔペプチドの結合を２５０μＭで抑制したことを示す。図６Ｂは、同じプローブをＴＡＴペプチドの存在下または非存在下で６ＤＥＥの濃度を減少させながら保温した場合の測定実験を表している。このデータは、６ＤＥＥは５０μＭの濃度でＴａｔペプチドの結合を＞８５％抑制したことを示している。６ＤＥＥがこの種類の別のペプチドの結合を抑制することができるかどうかを知るために、ＨＩＶ−１Ｒｅｖ蛋白を次にテストした。親和性の高いＲｅｖ結合部位を含む³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（94.7 Zappら、Cell 74:969-978（1993））を、精製大腸菌（E．coli）由来Ｒｅｖ蛋白とともに６ＤＥＥの濃度を上げながら保温した。実施例１８：６ＤＥＥは哺乳類のプレ−ｍＲＮＡスプライシングを抑制しない ³²Ｐ標識ヒトβ−グロビンプレ−ｍＲＮＡ（Krainerら、19:4， Ruskinら、19 :4）をＨｅＬａ核抽出物中で６ＤＥＥの存在下または非存在下で保温した。図８は、１００μＭの６ＤＥＥは、ＨｅＬａ細胞核抽出物中で、ヒト³²Ｐ標識β−グロビンプレ−ｍＲＮＡ基質のスプライシングに影響を与えなかったことを示す。上記の結果と合わせて、これらのデータは、６ＤＥＥによるＴａｔ−ＴＡＲ相互反応の抑制は高度に特異的であることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 ＡＤＹＣ１２Ｎ 15/09 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ザップ，マリア・エルアメリカ合衆国マサチューセッツ州01505, ボイルストン，グリーン・ストリート・ 368 (72)発明者スターン，セスアメリカ合衆国マサチューセッツ州01564, スターリング，リバー・ビュー・ロード・ 18ビー

Claims

【特許請求の範囲】１．ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはその類似体以外の、約２０００ダルトン未満の分子量をもつ小型有機化合物とＲＮＡを接触させることを含むＲＮＡ− リガンド相互反応を抑制する方法であって、当該小型有機化合物が該ＲＮＡに直接結合し、それによって該ＲＮＡへのリガンドの結合を抑制する、ＲＮＡ−リガンド相互反応抑制方法。２．該リガンドが蛋白、核酸、脂質または炭水化物から成る群から選ばれる、請求の範囲第１項の方法。３．該小型有機化合物がアミノグリコシドである、請求の範囲第２項の方法。４．アミノグリコシドが２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドである、請求の範囲第３項の方法。５．ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはその類似体以外の、約２０００ダルトン未満の分子量をもつ小型有機化合物とシス−作動性ＲＮＡを接触させることを含むシス−作動性ＲＮＡ配列へのトランス−活性化型調節蛋白の結合を抑制する方法であって、該小型有機化合物が該ＲＮＡに直接結合し、それによって該ＲＮＡへの該蛋白の結合を抑制する、シス−作動性ＲＮＡ配列へのトランス−活性化型調節蛋白の結合を抑制する方法。６．該ＲＮＡがｍＲＮＡまたは前駆体ｍＲＮＡである、請求の範囲第５項の方法。７．該ｍＲＮＡがウイルスによってコードされる、請求の範囲第６項の方法。８．該ウイルスがＲＮＡウイルスである、請求の範囲第７項の方法。９．該ＲＮＡウイルスがレトロウイルスである、請求の範囲第８項の方法。 10．該ウイルスがＨＩＶ−１である、請求の範囲第９項の方法。 11．該トランス−活性化型調節蛋白がＲｅｖである、請求の範囲第１０項の方法。 12．該トランス−活性化型調節蛋白がＴａｔである、請求の範囲第１０項の方法。 13．該ウイルスがＨＴＬＶ−１である、請求の範囲第９項の方法。 14．該トランス−活性化型調節蛋白がＲｅｘである、請求の範囲第１３項の方法。 15．該小型有機化合物がアミノグリコシドである、請求の範囲第１０項の方法。 16．該小型有機化合物がアミノグリコシドである、請求の範囲第１３項の方法。 17．該アミノグリコシドが２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドである、請求の範囲第１５項の方法。 18．該アミノグリコシドが２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドである、請求の範囲第１６項の方法。 19．Ｒｅｖ反応性構成成分を含むＲＮＡへのＨＩＶＲｅｖ蛋白結合を抑制する方法であって、該ＲＮＡと、該ＲＮＡに直接結合する２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドとを接触させ、それによってＲｅｖ反応性構成成分へのＨＩＶＲｅｖ蛋白結合を抑制するることを含む、Ｒｅｖ反応性構成成分を含むＲＮＡへのＨＩＶＲｅｖ蛋白結合を抑制する方法。 20．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが３つの糖部分を含む、請求の範囲第１９項の方法。 21．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のアミノ基が、分子量合計が５００ダルトン未満の修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第２０項の方法。 22．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第２１項の方法。 23．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のヒドロキシル基が修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第２０項の方法。 24．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第２３項の方法。 25．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのアミノ官能基が、それぞれ別個にメチル置換されているか、または１級アミンである、請求の範囲第２０項の方法。 26．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのヒドロキシル部分が官能基付加されていない、請求の範囲第２５項の方法。 27．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが１つ、２つまたは４つの糖部分を含む、請求の範囲第１９項の方法。 28．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のアミノ基が修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第２７項の方法。 29．該修飾基が２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第２８項の方法。 30．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のヒドロキシル基が修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第２７項の方法。 31．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第３０項の方法。 32．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのアミノ官能基が、それぞれ別個にメチル置換されているか、または１級アミンである、請求の範囲第２７項の方法。 33．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのヒドロキシル部分が官能基付加されていない、請求の範囲第３２項の方法。 34．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがトブラマイシンである、請求の範囲第１９項の方法。 35．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがネオマイシンＢである、請求の範囲第１９項の方法。 36．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがネアミンである、請求の範囲第１９項の方法。 37．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがリボスタマイシンである、請求の範囲第１９項の方法。 38．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがリビドマイシンＡである、請求の範囲第１９項の方法。 39．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがカナマイシンＢである、請求の範囲第１９項の方法。 40．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがアミカシンである、請求の範囲第１９項の方法。 41．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドがゲンタマイシンＣである、請求の範囲第１９項の方法。 42．Ｒｅｖ反応性構成成分を含むＲＮＡへのＨＩＶＲｅｖ蛋白結合を抑制する方法であって、該方法が、該ＲＮＡに直接結合し、それによってＲｅｖ反応性構成成分へのＨＩＶＲｅｖ蛋白結合を抑制する４−一置換、４，５−二置換、または４，６−二置換−２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドと該ＲＮＡとを接触させることを含み、さらに該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが以下の構造を有し：式中Ｒ₁はＨまたはＣＯＣＨＯＨＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂から成る群から選ばれ；Ｒ₂は以下から成る群から選ばれ；Ｒ₅はＮＨ₂またはＯＨから成る群から選ばれ；Ｒ₆はＨまたはＯＨから成る群から選ばれ；Ｒ₇はＨまたはＯＨから成る群から選ばれ；Ｒ₈はＮＨ₂またはＯＨから成る群から選ばれ；Ｒ₉はＮＨ₂またはＮＨＣＨ₃から成る群から選ばれ；Ｒ₃およびＲ₄はそれぞれ別個にＨ、Ｒ₁₀、から成る群から選ばれ；ここでＲ₁₀はＨまたはから成る群から選ばれ；Ｒ₁₁はＨまたはマンノシルから成る群から選ばれるが、少なくともＲ₃またはＲ₄ はＨでなければならない、Ｒｅｖ反応性構成成分を含むＲＮＡへのＨＩＶＲｅｖ蛋白結合を抑制する方法。 43．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のヒドロキシル基が修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第４２項の方法。 44．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第４３項の方法。 45．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのアミノ官能基が、それぞれ別個にメチル置換されているか、または１級アミンである、請求の範囲第４２項の方法。 46．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのヒドロキシル部分は官能基付加されていない、請求の範囲第４５項の方法。 47．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが４−一置換２−デオキシストレプタミンであって、ここでＲ₃およびＲ₄がＨ、またはＲ₃がＨの場合は４，６−二置換２−デオキシストレプタミンである、請求の範囲第４２項の方法。 48．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のアミノ基が修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第４７項の方法。 49．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第４８項の方法。 50．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが４，５−二置換２−デオキシストレプタミンであって、その場合Ｒ₄がＨである、請求の範囲第４２項の方法。 51．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のアミノ基が、分子量合計が５００ダルトン末満の修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第５０項の方法。 52．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第５１項の方法。 53．レトロウイルスによってコードされるＲＮＡに結合して、該ＲＮＡへの蛋白の結合を抑制し、それによってレトロウイルスの複製を抑制する２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドとレトロウイルス感染細胞とを接触させることを含む、レトロウイルスの複製を抑制する方法。 54．レトロウイルスがＨＩＶであり、ＨＩＶがコードする該ＲＮＡがＲｅｖ反応性構成成分を含み、ＨＩＶＲＮＡへの結合が抑制される該蛋白がＲｅｖである、請求の範囲第５３項の方法。 55．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが３つの糖部分を含む、請求の範囲第５４項の方法。 56．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のアミノ基が、分子量合計が５００ダルトン未満の修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第５５項の方法。 57．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第５６項の方法。 58．該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの１つまたは２つ以上のヒドロキシル基が修飾基で官能基付加されている、請求の範囲第５５項の方法。 59．該修飾基が該２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドの親油性を高める、請求の範囲第５８項の方法。 60．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのアミノ官能基が、それぞれ別個にメチル置換されているか、または１級アミンである、請求の範囲第５５項の方法。 61．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドのヒドロキシル部分は官能基付加されていない、請求の範囲第６０項の方法。 62．２−デオキシストレプタミンアミノグリコシドが１つ、２つまたは４つの糖部分を含む、請求の範囲第５４項の方法。