AT397102B - Verwendung eines antibiotikums des typs 2-desoxystreptamin - Google Patents
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Description
AT 397102 B
Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamin.
Bisher werden Krankheitserreger bzw. sonstige Mikroorganismen, die auf den menschlichen bzw. tierischen Organismus schädigende Wirkung haben, durch Antibiotika behandelt, wobei je nach Art der Antibiotika entweder ein größeres Spektrum abgedeckt wird, also sogenannte Breitbandantibiotika, oder aber bei genauer Kenntnis des Krankheitserregers Antibiotika eingesetzt werden, die speziell auf Bakterien u. dgl. gerichtet sind. All diese Antibiotika haben den Nachteil, daß sie sehr weit gestreut, d. h. unspezifisch wirken, sodaß auch jene Organismen geschädigt werden, die der menschliche bzw. tierische Körper zum Leben benötigt, die also in Symbiose mit dem menschlichen Organismus leben. Ein besonders gutes Beispiel dafür sind die Darmbakterien, die der Mensch zur Verdauung der Nahrung benötigt. Auch diese Darmbakterien werden durch die bisher eingesetzten Antibiotika abgetötet bzw. im besten Fall nur geschädigt.
Es ist daher seit langem das Bestreben der Wissenschaftler, Antibiotika zu entwickeln, welche gezielt auf bestimmte Mikroorganismen anwendbar sind, u. zw. sowohl in der Medizin, als auch in der biotechnologischen Produktion.
Es hat sich nun gezeigt, daß unterschiedliche Reaktionen zwischen Antibiotika und Organismen auftreten, und zwar abhängig davon, ob in der Ribosomen-RNA Introns der Gruppe I enthalten sind. Gruppe I Introns sind vor allem in Prokaryonten und einzelnen Eukaryonten enthalten. D. h. also, daß die üblicherweise als Krankheitserreger oder sonstige Schädlinge auftretenden Organismen im wesentlichen jene sind, welche Gruppe I Introns enthalten. Wenn also jene Organismen gezielt am Wachstum gehindert werden können, welche Gruppe I Introns enthalten, dann können damit gezielt schädliche Organismen bekämpft werden, ohne daß für das menschliche Leben notwendige Organismen geschädigt werden.
Der Erfindung liegt daher in der Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamin, insbesondere eines 4,6 bzw. 4,5, mit Aminozuckem substituierten 2-Desoxystreptamins zur Hemmung des Wachstums von Gruppe I Introns enthaltenden Organismen, insbesondere in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments.
Vorteilhafterweise kann als Antibiotikum vom Typ des 4,6 substituierten 2-Desoxystreptamins Gentamicin (B, CI, Cla, C2), Kanamycin (A, B, C), Tobramycin oder Amikacin eingesetzt werden. Als Antibiotikum vom Typ des 4,5 substituierten 2-Desoxystreptamins kann Neomycin B, Paromomycin, Ribostamycin, Lividomycin oder Butirosin eingesetzt werden. Die angeführten Antibiotika können wegen ihrer bakteriziden Wirkung gegen gram-negative als auch gegen gram-positive Bakterien im klinischen und generell antimikrobiellen Bereich eingesetzt werden (siehe dazu Veröffentlichungen von Davies J. & Yagisawa M., in Biochemistry and Genetic Regulation of commercially important Antibiotics (ed. Vining L. C.) 329 - 354 (Addison-Wesley Pub. Comp., London, 1983); Cundliffe E., in The Ribosome (eds. Hill, W. E. et al.) pp 479 - 490 ASM, Washington, 1990).
Die Wirkung des 2-Desoxystreptamins liegt darin, daß sie die Selbstexzision von Gruppe I Intron RNA aus deren Exons inhibieren. Der codierende Bereich eines Gens wird nämlich in vielen Fallen von nichtcodierenden Bereichen, den Introns, unterbrochen. Diese Introns und die codierenden Bereiche, die Exons, werden bei der Transkription von der DNA in die RNA überschrieben und die Introns nun auf RNA-Ebene herausgespleißt. Für die nachfolgende Translation ist es essentiell, daß die codierenden Bereiche wieder zusammen ligiert werden, damit ein funktionelles Genprodukt, das Protein, entsteht. Aufgrund des Spleißmechanismus, der angenommenen RNA-Sekundär- bzw. Tertiärstruktur und dem Vorkommen in den Organismen können die Gruppe I Introns folgendermaßen beschrieben werden:
Sie haben einen Satz von konservierten Sequenzen, deren Bereiche mit (P, Q, R, S) bezeichnet weiden, wobei der Abstand zwischen diesen Bereichen unterschiedlich groß sein kann. Die RNA kann aufgrund von Paarungsmöglichkeiten eine charakteristische Sekundärstruktur aufweisen, wobei diese Paarungen von (PI) bis (P10) bezeichnet werden, und zwar abhängig von der Zugehörigkeit zu einer bestimmten Untergruppe innerhalb der Gruppe I Introns. Es kommt dabei weniger auf Sequenzkonservierung als auf Strukturkonservierung an (siehe dazu Burke J. M. et al., Nucl. Acids Res. 15,7217 - 7221,1987).
Der Spleißmechanismus wird durch einen externen Kofaktor, Guanosin, eingeleitet. Dabei wird allgemein angenommen, daß die Hydroxylgruppe der Ribose des Guanosins an die Phosphordiesterbindung des letzten Nukleotids des vorhergehenden Exons und des ersten Nukleotids des Introns einen nukleophilen Angriff unternimmt und dabei kovalent an das 5' Ende der Intron RNA gebunden wird. Das freigesetzte Hydroxyl am 3' Ende des vorhergehenden Exons wiederum greift die Phosphordiesterbindung zwischen dem letzten Nukleotid des Introns und dem ersten Nukleotid des nachfolgenden Exons an, bricht diese auf und ligiert sich an das Exon, das Intron wird freigesetzt. Es handelt sich um zwei Umesterifizierungen. Einige Gruppe I Introns sind in der Lage, diesen Prozeß autokatalytisch, d. h. ohne Zugabe von Proteinen, in vitro durchzuführen. Für eine Reihe von Gruppe I Introns ist gezeigt worden, daß in vivo Proteine für den Spleißprozeß notwendig sind (siehe Cech T. R., Ann. Rev. Biochem. 59,543 - 568,1990).
Das Vorkommen der Gruppe I Introns erstreckt sich vom Kemgenom von niederen Eukaryonten, Mitochondrien von niederen Pilzen, Chloropiasten bis zu Eubakterien, Bakteriophagen und Archaebakterien. Gruppe I Introns sind nicht in höheren Eukaryonten gefunden worden. Ihr Vorkommen ist nicht auf für Proteine kodierende Gene beschränkt, sie kommen auch in Genen für die tRNA und rRNA vor. Eine rezente und umfassende Kompilation des Vorkommens und des Spleißmechanismus findet sich in der Publikation von -2-
AT397102B
Michel F. & Westhof E., 1990, J. Mol. Biol. 216,585 - 610.
Die erfindungsgemäß hergestellten Medikamente können somit generell für die Hemmung des Wachstums von solchen Organismen verwendet werden, die ein Gruppe I Intron enthalten und normalerweise nicht sensitiv gegen die angeführten Antibiotika sind. Die Anwendung dieser Medikamente soll sich dabei besonders auf den therapeutischen Bereich erstrecken, wobei der Wiikungsort der genannten Antibiotika an der Intron RNA und nicht an der ribosomalen RNA interessant ist.
Der Wirkmechanismus des Antibiotikums auf Gruppe I Introns wird nachstehend anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Fig. 1 zeigt verschiedene Audioradiographie-Darstellungen von Introns, die mittels Guanosintriphosphat (im folgenden G1P bezeichnet) herausgespleißt wurden, wobei die Wirkung des Antibiotikums gezeigt ist. Fig. 2 veranschaulicht den Spleißvorgang der preRNA und die Ligierung der beiden Exons unter Abspaltung des linearen Introns. Fig. 3 gibt die Grundstrukturformeln der wichtigsten eingesetzten Antibiotika wieder, wobei unterhalb der einzelnen Gruppen bezüglich der getesteten Antibiotika die Wirksamkeitsgrenze angeführt ist Fig. 4 zeigt die Sekundärstruktur der Core-Region, die die 3' Schnittstelle von dem td-Intron (Fig. 4a) und dem sunY-Intron (Fig. 4b) zeigt
Das Verfahren zur Messung der Wirkung von Antibiotika auf Gruppe I Introns wurde dabei wie folgt durchgeführt:
Das zu diesem Verfahren verwendete Gen ist die Thymidylatsynthase aus dem Coliphagen T4. Das Gen wurde in den Vektor pTZ18U (Firma USB) mit einem verkürzten Intron delta P6 kloniert (Schroeder et al., Biochemistry 30,3295 - 3303,1991). Zur Herstellung der ungespleißten Vorstufe wird das Plasmid mit EcoRI Iinearisiert und in vitro transkribiert. Die Transkriptionsbedingungen sind wie folgt 1 pg DNA in einem Volumen von 20 μΐ bei 30 °C für 1 Stunde in einem Puffer aus 40 mM Tris-HCl pH 7,5,5 mM MgCl2,0,4 mM Spermidine, 5 mM DTT, 10 Einheiten T7 RNA Polymerase (Stratagene), 10 μ Ci (Alpha-35S)-CTP (Amersham) und 10 Einheiten RNase Inhibitor (Boehringer Mannheim). Die RNA Vorstufe wird dann mittels Gelelektrophorese (5 % Acrylamide/7M Harnstoff in Tris-Borat-EDTA) gereinigt. Für den Antibiotikainhibierungstest werden 20.000 cpm RNA Vorstufe in 5 μΐ Spleißingpuffer (2,5 μΜ GTP, 40 mM Tris-HCl, 8 mM MgCl2,0,4 mM Spermidine), mit steigenden Mengen Antibiotikum (in der Regel 0,1 μΜ bis 2 mM) für 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mittels Zugabe von 45 μΐ Stoplösung (2,5 mM EDTA, 0,1 mg/ml Hefe tRNA) und 150 μΐ 0.3 M NaOAc/Äthanol gefällt. Nach Resuspension in 5 μΐ Wasser und Erhitzen auf 65 °C für 5 Minuten mit weiteren 5 μΐ Denaturierungsmix (100 % Formamid, 0,1 % Bromphenolblau, 0,1 % Xylenxyanol) werden die Reaktionsprodukte wie oben beschrieben auf einem 5 % Acrylamidgel/7M Harnstoff aufgetrennt und mit einem Röntgenfilm sichtbar gemacht.
Aus den Fig. 1A bis IE ist die Inhibierungswirkung des 2-Desoxystreptamins auf Gruppe I Introns erkennbar, wobei insbesondere aus Fig. 1A ersichtlich ist, daß das Gentamicin zwar die Auftrennung in zwei Bruchstücke, von welchen das eine Exon (El) und das andere die Verbindung Intron (E2) ist, zuläßt, jedoch das Abspalten des Introns vom (E2) Exon und die Ligierung der beiden Exons behindert. In der Fig. 1A ist erkennbar, daß selbst bei ganz niedrigen Dosierungen von GTP bereits der Spleißvorgang stattfindet, daß jedoch auch dann bereits bei niedrigen Gentamicin-Konzentrationen die Abspaltung des Introns und die Ligierung der beiden Exons behindert wird. Fig. 1B zeigt die analogen Verhältnisse in bezug auf sunY Intron. Fig. IC gibt einen Parallelversuch mit einem Gruppe II Intron wieder, und es ist klar erkennbar, daß hier die Aufspaltung der preRNA in das lineare Intron (L Intron) und in die ligierten (El, E2) Exons erfolgt, und zwar unabhängig von der Antibiotika-Konzentration. Im vorliegenden Fall wurde Gentamicin verwendet, welches, wie aus den Fig. 1A und 1B ersichtlich, Gruppe I Introns gezielt hemmt. Die Verfahrensbedingungen waren in allen angeführten Ausführungsformen die gleichen. Ähnliches wie Fig. 1A zeigen auch die Fig. ID und IE, wobei in Fig. ID anstelle des Gentamicins Tobramycin und beim Ausführungsbeispiel gemäß Fig. IE Paromomycin eingesetzt wurde.
Bei allen beiliegenden Beispielen bedeuten preRNA die getestete RNA, IN-E2 die Verbindung von Intron mit Exon 2, L-In das Linearintron, (El - E2) die ligierten Exos (El) und (E2) und (El) alleine Exon 1.
Bei der Darstellung in Hg. 2 werden durch die starken Balken die beiden Exons (El) und (E2) angedeutet, wobei der Spleißmechanismus der preRNA durch die Behandlung mit GTP wiedergegeben ist. Es ist erkennbar, daß im ersten Schritt das Exon 1 von dem Bruchstück Intron-Exon 2 abgespalten wird. Der erste Schritt des Spleißvorganges wird durch das exogene Guanosin (G - OH) eingeleitet, wobei das Guanosin die G-Bindungs-seite angreift, auf der 5-Spleißseite durch nukeophiles Angreifen aufschneidet und kovalent mit dem ersten Nukleotid des Introns verbunden wird. In einem zweiten Schritt erfolgt dann die Legierung der beiden Exons (El) und (E2), und das Intron, das an seinen Enden jeweils das Guanosin enthält, liegt herausgetrennt vor.
In den Fig. 3A bis 3C sind eine Reihe von 2-Desoxystreptaminverbindungen angeführt, mit welchen die in Fig. 1 angeführten Tests durchgeführt wurden. Bei den Konzentrationen wurde die beste Wirkungskonzentration zu den einzelnen Substanzen angegeben.
Fig. 4 zeigt die sekundäre Struktur der Kemregion, die die 3' Spleißposition umgibt, und zwar unter (A) das Td-Intron und unter (B) das sunY-Intron. Die dargestellte Konfiguration zeigt die Situation knapp vor der zweiten Stufe des Spleißvorganges (die 5' Spleißposition ist abgespalten, das letzte G des Introns befindet sich -3-
AT 397 102 B in der G-Bindungsposition. Die Paarungselemente (PI), (P7), (P9) und (P10) sind entsprechend angedeutet. Dieses Modell wurde von der Tetrahymenastruktur abgenommen, wie sie von Michel et al. 9 angeführt wird. Die oben angeführten Buchstaben betreffen das Intron, und die unten angeführten Buchstaben die Exonreste. Die Nummern neben den beiden Resten geben die Nuldeotidposition im Intron wieder. Der G-Rest ist die Guanosin-Bindungsseite (9).
Ausfflhrungsbeispiel:
Da der Spleißvorgang von Gruppe I Introns durch Aminoglykosid-Antibiotika gehemmt wird, die Expression von Intron enthaltenden Genen aber vom korrekten Spleißvorgang abhängig ist, ist es möglich, das Wachstum von Organismen mit diesen Antibiotika zu hemmen, sofern die Introns in essentiellen Genen enthalten sind. Gruppe I Introns sind bis jetzt meistens in essentiellen Genen gefunden worden, in Eukaryonten meistens in Komponenten des Energiestoffwechsels oder in den ribosomalen RNA Genen.
Folgende Versuche wurden in E. coli durchgeführt, sollten sich aber auf andere Organismen übertragen lassen. E, coli Stämme 1- RRI delta Thy A:: kan R/pLST314/pACYC 184-td delta 1-3 2- RRI/pLST314 wurden auf Vollmedium bzw. auf thymindefizientem Medium in Abwesenheit und Anwesenheit von steigenden Mengen Gentamicin gezüchtet
Tabelle
Medium Gentamicin Vollmedium 0 50 200 1000 thymindefiz. Medium 0 50 200 1000 Stamm 1 2 + + + + + + + + + + +/- -+ + + +
Erläuterungen zu den Stämmen: RRI ist ein gängiger, häufig verwendeter E. coli Stamm (Bolivar et al. 1977, Gene 2:95) - delta thy A:: kan R bedeutet, daß das E. coli eigene intronlose Thymidilatsynthasegen disruptiert wurde und mit dem Gen für Kanamycin Resistenz ersetzt wurde (Bell-Pedersen et al. 1991, J. Bacteriol. 173:1193 -1200). - pLST314 ist ein Plasmid, welches das Gen kgmB aus Streptomyces tenebrarius enthält, welches die kleine ribosomale Untereinheit von E. coli methyliert und sie gegen Gentamicin resistent macht (Holmes and Cundliffe 1991, Mol. Gen. Genet. 229:229 - 237). - pACYC td delta 1 - 3 ist ein Plasmid, welches intronenthaltende Thymidilatsynthasegen aus dem T4 Phagen enthält (Beifort et al. 1990, Methods of Enzymol. 181: 521 - 539).
Erläuterungen zur Tabelle:
Stamm 2 enthält ein intronloses Thymidylatsynthasegen. Das Wachstum dieses Stammes auf thymindefizientem gentamicinhältigem Medium ist normal. Stamm 1 jedoch enthält ein Thymidilatsynthasegen mit Intron, welches für das Wachstum auf gentamicinhältigem thymindefizientem Medium korrekt gespleißt werden muß. Dieser Stamm kann unter den oben genannten Bedingungen nicht wachsen.
Die RNA aus den Zellen dieser Versuchsreihe wurde isoliert und das Verhältnis von gespleißter zu ungespleißter RNA wurde bestimmt. In Anwesenheit von Gentamicin nimmt die Menge an prozessierter mRNA ab, analog zu dem Wachstumsverhalten. Die Inhibierung des Wachstums ist also konelierbar mit der Abnahme an gespleißter RNA. -4-
Claims (3)
- 5 AT397102B PATENTANSPRÜCHE 1. Verwendung eines Antibiotikums des Typs 2-Desoxystreptamin, insbesondere eines 4,6 bzw. 4,5 mit 10 Aminozuckem substituierten 2-Desoxystreptamins, zur Hemmung des Wachstums von Gruppe I Introns enthaltenden Organismen, insbesondere in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments.
- 2. Verwendung nach Anspruch 1, mit der Maßgabe, daß als Antibiotikum vom Typ des 4,6 substituierten 2-Desoxystreptamins Gentamicin (B, CI, Cla, C2), Kanamycin (A, B, C), Tombramycin oder Amikacin 15 eingesetzt wird.
- 3. Verwendung nach Anspruch 1, mit der Maßgabe, daß als Antibiotikum vom Typ des 4,5-substituierten 2-Desoxystreptamins Neomycin B, Paramomycin, Ribostamycin, Lividomycin oder Butirosin eingesetzt wird. 20 Hiezu 6 Blatt Zeichnungen -5-
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