Verfahren und Mittel zur Modifikation humaner Angiogenese
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft RNA-Bestandteile eines Metallo-Ribonucleoprotein-Morphogens aus Leu- kocyten, Verfahren zu deren Herstellung und Charakterisierung sowie diese RNA-Bestandteile aufweisen- de Nucleinsäure-Komplexe und Verfahren zu deren Verwendung, insbesondere Verfahren und Mittel zur Modifikation der Angiogenese und Verfahren und Mittel zur Tumorzellbekämpfung.
Unter Angiogenese versteht man die Ausbildung neuer Blutgefäße durch das Aussprossen von Kapillaren aus einem bereits bestehenden Gefäßsystem (Hertig, 1935) . Die im Rahmen der Angiogenese stattfindende Neovaskularisierung erfolgt in mehreren Teilschritten (Folkman und Shing, 1992) . Dabei wird zunächst die die Blutgefäße umgebende Basalmembran mit Hilfe verschiedener proteolytischer Enzyme, zum Beispiel Kollagenase, abgebaut und zusätzlich wird die extrazelluläre Matrix im perivaskulären Raum fragmentiert. Anschließend erfolgt die Differenzierung der Endothelzelle, wobei sich die Zellmorphologie ändert und damit verbunden Pseudopodien ausgebildet werden. Angiogene Stimuli bewirken, dass die freigelegten Endothelzellen in Richtung eines chemotak- tischen Reizes migrieren. Anschließend erfolgt eine Proliferation der Endothelzellen. Durch die Anei- nanderlagerung der Außenwände einer oder mehrerer Endothelzellen werden neue Gefäßschleifen mit einem
kapillarförmigen Lumen ausgebildet. Danach setzt die Synthese einer neuen Basalmembran ein. Sobald zwei Kapillarsprossen an der Spitze miteinander verschmelzen und ein gemeinsames Lumen bilden, ist die Ausbildung eines neuen funktionsfähigen Kapillarsystems abgeschlossen und der Blutfluss kann einsetzen. Unter nicht-pathologischen Bedingungen treten beim erwachsenen Mann, abgesehen von der Wundheilung, nahezu keine angiogenetischen Prozesse auf, so dass sich das Endothel nur wenige Male im Leben erneuert. Bei der erwachsenen Frau ist die Situation jedoch völlig anders, da insbesondere im Rahmen des Menstruationszykluses, das heißt während der Ovulation, der Reifung des Corpus luteum und des Aufbaus des Endometriums, bis zur Menopause an- giogenetische Prozesse stattfinden. Während der Schwangerschaft tritt Angiogenese verstärkt auf, insbesondere bei der Plazentabildung und der Lakto- genese in den Mammae (Hertig, 1935) .
Neben der physiologisch essentiellen Angiogenese gibt es auch eine Vielzahl pathologischer angioge- netischer Prozesse (Folkman, 1995a). Zu diesen gehören beispielsweise die diabetische Retinopathie, die verschiedenen Formen von rheumatoider Arthritis und die Ausbildung von Hämangiomen. Diese pathologischen Prozesse werden dadurch verursacht, dass angiogenetisch stimulierende Faktoren, wie zum Beispiel Metalloproteasen, gegenüber ihren Inhibitoren, beispielsweise TIMP (tissue inhibitor of me- talloproteases) , im Überschuss vorliegen. Durch gezielte Inhibition einzelner Angiogenese-Faktoren versucht man solche pathologischen angiogenetischen Prozesse zu inhibieren (Adamis et al . , 1996). Ein
Spezialfall der pathogenen Angiogenese stellt die Tumorangiogenese dar (Folkman 1971, Folkman 1995b). Beim Tumorwachstum sezernieren die Tumorzellen selbst angiogene Faktoren, die chemotaktisch die Aussprossung neuer Blutgefäße in Richtung des Tumors induzieren. Durch eine erhöhte Anzahl von Blutgefäßen kann der Tumor verstärkt mit lebensnotwendigen Nährstoffen und Sauerstoff versorgt werden. Dies hat wiederum ein verstärktes Tumorwachs- turn zur Folge. Ein zur Zeit rasch expandierendes Forschungsgebiet innerhalb der Tumorforschung stellt daher die Anti-Angiogenese-Forschung dar. Auch hier wird nach Faktoren gesucht, die die Tumorangiogenese und damit auch gleichzeitig das Tumor- Wachstum inhibieren (Folkman 1995a, Folkman 1995b).
Von Angiotropin, einem aus ischämischen Herzmuskelgewebe, Wundflüssigkeit und den Überständen serumfreier Massenkulturen Lektin-stimulierter porciner Leucozyten isolierten Metallo-Ribonucleoprotein- Morphogen, ist bekannt, dass es ein Mediator angio- genetischer Prozesse ist (Wissler und Renner 1981, Wissler 1982, Wissler 1984). Die angiogenetische Wirksamkeit von Angiotropin wurde mit Hilfe üblicher in vivo- und in vitro-Testsysteme nachgewie- sen. So konnte beispielsweise mittels eines Tests an Corioallantois-Membranen des Hühnerembryos (CAM- Test) gezeigt werden, dass nach Verabreichung von Angiotropin eine verstärkte Kapillarisierung in dieser Membran erfolgte (Wissler 1982, Noll 1998, Kuhn 1998). Eine verstärkte Vaskularisierung wurde auch bei der intradermalen Injektion von Angiotropin am Kaninchenohr beobachtet (Höckel et al . 1984, Höckel 1988). Im Endothelzell-Test konnten nach
Verabreichung von Angiotropin zeit- und dosisabhängige Änderungen der Zellmorphologie von ursprünglich kontaktinhibierten konfluenten Endothelzellen beobachtet werden, wobei diese Änderungen in drei Stufen erfolgten (Höckel et al . 1986, Höckel 1988, Noll 1998) . Im Stadium I, das heißt innerhalb von zwei bis drei Tagen, nahmen die ursprünglich flachen polygonalen Endothelzellen eine abgerundete, bipolare, parallel orientierte Form an. Dabei bil- deten sich in verstärktem Maße Pseudopodien und Va- cuolen aus. Im Stadium II, das heißt nach etwa etwa vier bis sieben Tagen, waren lange bipolare Cy- toplasma-Ausläufer mit tubulären Strukturen zu beobachten, die sich spatial organisierten. Innerhalb der Endothelzellen waren dabei eine oder zwei große transparente Vakuolen mit beweglichen Granula vorhanden. Wenn die Endothelzellen weiterhin mit Angi- otropin-haltigem Medium stimuliert wurden, gingen sie in Stadium III über. Dabei verschwanden die Va- kuolen und es traten unregelmäßig geformte Partikel außerhalb des Zellkörpers und der Pseudopodien auf. Wurden Endothelzellen im Stadium II mit neuem Medium, das kein Angiotropin enthielt, weiterkultiviert, bildeten sich die zellmorphologischen Verän- derungen nach 24 Stunden zurück, bis die Zellen wieder ihr ursprüngliches Erscheinungsbild zeigten.
Anhand dieser Tests zeigte sich, dass Angiotropin eine reversible Veränderung der Zellmorphologie und damit des Phänotyps von Endothelzellen bewirkte. Von Bedeutung ist fernerhin, dass Angiotropin keine mitogene Wirkung auf Endothelzell-Kulturen ausübte und daher nur eine Differenzierung, jedoch keine
Proliferation der Endothelzellen induzierte (Höckel et al. 1986, Höckel et al . 1987, Höckel 1988).
Ferner wurde gezeigt, dass Angiotropin die Migration von Endothelzellen stimulierte, nicht jedoch die Migration von 3T3-Fibroblasten (Höckel et al . 1987, Höckel 1988). Das heißt, dass Angiotropin eine spezifische Wirkung auf Endothelzellen ausübt. Des weiteren konnte nachgewiesen werden, dass Angiotropin eine Nuclease-Aktivität aufweist und bei in vitro-Translations-Assays die Translation inhibieren kann (Seibt 1998, Noll 1998) .
Bei Angiotropin handelt es sich um einen metallhaltigen Ribonucleotidpolypeptid (RNP) -Komplex, der extrazellulär isoliert werden konnte. Als Metallio- nen konnten Kupfer-, Calcium-, Natrium- und -Kaliumionen nachgewiesen werden (Wissler et al., 1986). Das Kupferion liegt darin vermutlich in zweiwertiger Form vor (Kuhn et al., 1996, Kuhn 1998). Die Sequenzierung des Protein-Bestandteils ARP (Angi- otropin related protein) ergab, dass dieser zu 100% homolog zu Calgranulin C ist (Kuhn 1998) . Das Protein gehört zur Familie der SlOO-Proteine und wurde bereits ohne RNA-Komponente aus Schweine- Granulocyten isoliert, in denen es 8% des gesamten cytosolischen Proteins bildet (Dell 'Angelica et al., 1994) . Es handelt sich um ein Protein mit 91 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 10614 Dalton. Wie andere SlOO-Proteine besitzt auch Calgranulin C zwei als EF-Handstrukturen bekannte Calcium-Bindungsmotive (Kretsinger 1980, Isobe et al. 1981; Moncrief et al . 1990; Klingman & Hilt 1988; Schäfer & Heizmann 1996) .
Die DE 196 28 895 AI beschreibt biologisch aktive metallhaltige, insbesondere Kupfer-, Zink- oder Calcium-haltige Ribonucleopolypeptide (RNPs) als nicht-mitogene Morphogene für Blutgefäße definier- ter Primärstruktur sowie Verfahren zur Herstellung und Gewinnung dieser RNPs . Insbesondere werden eine Teilsequenz der porcinen Angiotropin-RNA-Sequenz sowie die Aminosäuresequenz des Proteinbestandteils beschrieben.
Die DE 198 10 998 Cl beschreibt Sequenzen des RNA- Bestandteils (ARNA) von porcinem Angiotropin, insbesondere die Sequenzen ARNA II, ARNA III, ARNA IV und ARNA V.
Die DE 198 11 047 Cl beschreibt weitere mit porci- nem Angiotropin assoziierte RNA-Sequenzen, insbesondere die ARNA I-Sequenz und die ARNA Vl-Sequenz.
Die im Stand der Technik bekannten Dokumente offenbaren ausschließlich RNA-Sequenzen, die mit Angiotropin vom Schwein assoziiert sind. Angesichts der experimentell nachgewiesenen Bedeutung von Angiotropin für die Angiogenese im Säugerorganismus, insbesondere hinsichtlich der Verwendung dieses Morphogens zur gezielten Modulation pathogener an- giogenetischer Prozesse beim Menschen, beispiels- weise zur Behandlung humaner Krankheiten, ist es jedoch wünschenswert, die RNA-Sequenzen von humanem Angiotropin zu isolieren und zu charakterisieren. Darüber hinaus geben die im Stand der Technik bekannten Druckschriften keinerlei Einblicke in die molekularen Mechanismen, die der angiogenetischen Aktivität von Angiotropin zugrunde liegen. Insbe-
sondere ist nicht bekannt, welche Funktion speziell der RNA-Bestandteil besitzt. Gerade im Hinblick auf eine humanmedizinische Anwendung von Angiotropin ist es jedoch wünschenswert, diese molekularen Me- chanismen genau zu verstehen, um die angiogeneti- sche Aktivität von Angiotropin gezielt modulieren zu können, das heißt je nach Bedarf zu induzieren beziehungsweise zu verstärken oder aber zu inhibieren.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel zur Isolierung und Charakterisierung von RNA-Sequenzen für humanes Angiotropin sowie auf diesen Verfahren und Mitteln basierende weitere Verfahren und Mittel bereitzustellen, mit deren Hilfe insbesondere im menschlichen Körper physiologisch erwünschte Angiogenese-Prozesse, beispielsweise bei der Wundheilung, gezielt induziert oder verstärkt werden können oder aber pathologische An- giogenese-Prozesse, beispielsweise bei der diabeti- schen Retinopathie oder bei der Tumorbildung, gezielt inhibiert werden können.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung der Lehre gemäß des Hauptan- spruchs, insbesondere durch ein Nucleinsäuremole- kül, das als funktionaler Bestandteil eines biologisch aktiven Metallo-Ribonucleoprotein-Komplexes geeignet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :
a) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta-
Gesamt-RNA mit ARNA I-spezifischen Primern insbesondere mit den in SEQ ID Nr. 6 und/oder 7 dargestellten Primern, und einem Fragment davon;
b) einem Nucleinsäuremolekül, das mindestens eine der in SEQ ID Nr. 1 bis 5 und 8 bis 15 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst und einem Fragment davon;
c) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nuc- leinsäuremoleküls nach a) bis b) ;
d) einem Nucleinsäuremolekül, das mit einem Nucleinsäuremolekül nach a) bis c) und einem Fragment davon hybridisiert, und
e) einem Nucleinsäuremolekül, das zu einem Nucleinsäuremolekül nach a) bis b) komplementär ist, und einem Fragment davon.
Die Erfindung löst dieses Problem auch durch die Bereitstellung von diese Nucleinsäuremoleküle ent- haltenen Nucleinsäurekomplexen, die das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit mindestens einem Metallion, das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit mindestens einem Metallion und mindestens einem Protein (hier auch als metallhal- tige Ribonucleotidpolypeptide bezeichnet) oder das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit einem Protein enthalten (hier auch als Ribonucleotidpolypeptide bezeichnet) . Derartige Nucleinsäure- Komplexe, insbesondere metallhaltige Ribonucleotid- polypeptide, sind für eine Vielzahl von diagnosti-
schen und therapeutischen Anwendungen in hervorragender Weise geeignet.
Erfindungsgemäß wurde das technische Problem in bevorzugter Ausführungsform gelöst, indem die mit hu- manem Angiotropin assoziierte humane RNA-Sequenz ARNA I mit Hilfe des RT-PCR-Verfahrens unter Verwendung der porcinen Primer ARNA I (forward) und ARNA I (reverse) aus der Gesamt-RNA von humaner Plazenta, einem angiogenetisch äußerst aktivem Ge- webe, isoliert wurde. Diese humane ARNA-I-Sequenz enthält neben einem Sequenzabschnitt , der hinsichtlich seiner Länge und seiner Sequenz identisch mit der porcinen ARNA I-Sequenz ist, einen 42 Nucleoti- de umfassenden Sequenzabschnitt, der in der porci- nen ARNA I-Sequenz nicht nachgewiesen wurde. Mit Hilfe des MFOLD-Programms wurde ein Computermodell der Sekundärstruktur der humanen ARNA I-Sequenz erstellt und mit der Sekundärstruktur aller bekannten ARNA-Sequenzen einschließlich der porcinen ARNA- Sequenzen verglichen. Anhand dieses Vergleichs wurde gezeigt, dass alle ARNA-Sequenzen die gemeinsame Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' aufweisen, die jeweils nur in einer Sequenzorientierung auftritt und sich immer im Bereich einer Haarnadelschleife befindet. Diese bei allen bekannten ARNA-Sequenzen gefundene Haarnadelschleife stellt, ohne durch die Theorie gebunden zu sein, möglicherweise die Bindungsdomäne dieser ARNA-Sequenzen an ARP oder Calgranulin C dar, was darauf hinweist, dass dieses Protein ein zelluläres Transportmolekül für verschiedene, mit dem Angiotropin-Komplex assoziierte RNA-Moleküle ist. Diese anhand der computersimulierten Sekundärstruktur nachgewiesene Haarnadelschleife mit der
Konsensussequenz 5'-CUG-3', insbesondere der Sequenz gemäß der SEQ ID Nr. 12 und/oder 13, bietet erfindungsgemäß einerseits die Möglichkeit, den An- giotropin-Proteinbestandteil ARP auch als Trans- portmolekül für andere RNA-Sequenzen zu verwenden, die natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin- Komplex assoziiert sind. Um beispielsweise RNA- Sequenzen mit ribozymatischer Aktivität in Zielzellen des Angiotropin-Komplexes, zum Beispiel Endo- thelzellen, einzuführen, werden diese RNA-Sequenzen unter Verwendung bekannter Verfahren der Gentechnik mit den Sequenzen, die bei den ARNA-Sequenzen diese Haarnadelschleife bilden, versehen und dann werden unter Verwendung dieser RNA-Sequenzen, des ARP- Bestandteils und von Metall-Ionen in vitro ternäre Komplexe gebildet, die in die zu behandelnden Zellen eingeführt werden. Andererseits bietet die nachgewiesene Haarnadelschleife der ARNA-Sequenzen erfindungsgemäß die Möglichkeit, unter Verwendung der sie enthaltenden erfindungsgemäßen Nucleinsäu- ren weitere Proteine, beispielsweise andere SlOO- Proteine, zu isolieren, die ähnlich wie ARP an solche Haarnadel-Strukturen binden können und als potentielle Transportmoleküle für ARNA-Sequenzen be- ziehungsweise für erfindungsgemäß modifizierte Nuc- leinsäuren, die natürlicherweise nicht mit dem An- giotropin-Komplex assoziiert sind, verwendet werden können .
Unter Verwendung von in vitro synthetisierten ARNA I-Sequenzen, CuCl2 und des Proteinbestandteils ARP wurden in bevorzugter Ausführungsform erfindungsgemäß ternäre Angiotropin-Komplexe, also metallhaltige Ribonucleotidproteine in vitro rekonstituiert
und mit Hilfe des Corioallantois-Membran (CAM) - Tests am bebrüteten Hühnerei hinsichtlich ihrer angiogenetischen Aktivität in vivo getestet. Dabei zeigte sich, dass die rekonstituierten ternären An- giotropin-Komplexe beziehungsweise die in vitro synthetisierten ARNA I (Sense- beziehungsweise An- tisense-) -Sequenzen über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg auf die untersuchten Hühnerembryonen toxisch wirkten. Innerhalb des nicht-lethalen Konzentrationsbereichs zeigten die Ergebnisse der CAM-Assays insgesamt einen RNA-abhängigen Regulationsmechanismus der Angiotropin-induzierten Angiogenese. Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, dass nicht nur der rekonstituierte ternäre Angiotropin-Komplex aus ARNA I (Sense oder Sinn)-RNA (ARNA I(s)), Kupfer ( II ) -Ionen und nativem porcinen Calgranulin C angiogenetische Aktivität zeigte, sondern auch die nur mit Kupfer (II ) -Ionen kombinierte ARNA I (s ) -Sequenz . Das heißt, für die angiogenetische Aktivität des Angiotropin-Komplexes ist der Proteinbestandteil Calgranulin C nicht erforderlich. Ebenso überraschend wurde festgestellt, dass mit der ARNA I (Antisense oder Antisinn) - Sequenz (ARNA I(as)) rekonstituierte ternäre Kom- plexe nicht nur keine angiogenetische Wirksamkeit zeigten, sondern im Testsystem sogar angiogenetische Prozesse hemmen konnten. Erfindungsgemäß ist daher in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, die humane ARNA I(s) -Sequenz als Wirkstoff für ein Therapeutikum zur Induzierung der Angiogenese, beispielsweise im Rahmen der Wundheilung, zu verwenden, während in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die humane ARNA I (as) -Sequenz als Wirkstoff für ein Therapeutikum zur Hemmung patho-
gener angiogenetischer Prozesse, insbesondere von Tumorangiogenese, eingesetzt werden kann. In beiden vorgenannten Ausführungsformen kann die erfindungsgemäße ARNA I(s) oder (as) -Sequenz zusammen mit Me- tallionen und/oder Proteinen, zum Beispiel Calgranulin C, beziehungsweise dessen Bestandteilen, eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird erstmals eine mit humanem Angiotropin assoziierbare Nucleinsäure bereitge- stellt, bei der es sich um die humane ARNA I- Sequenz handelt. Die humane ARNA I-Sequenz wurde erfindungsgemäß aus einer humanen Plazenta-Gesamt- RNA mittels des RT-PCR-Verfahrens unter Verwendung der für die porcine ARNA I-Sequenz spezifischen Primer ARNA I (forward) (SEQ ID Nr. 6) und ARNA I (reverse) (SEQ ID Nr. 7) isoliert und cloniert. Dabei wurde neben der humanen ARNA I-Sequenz (SEQ ID Nr. 3 beziehungsweise 4) eine zweite, als humane Pseudo-ARNA-I-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) bezeichnete Sequenz isoliert und cloniert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter ARNA-Sequenzen Nucleinsäuren, insbesondere RNAs, verstanden, die extrazellulär isoliert werden können und in nativer Form unter geeigneten Bedingungen zusammen mit einem Protein, insbesondere ARP (Angiotropin related protein) oder Calgranulin C oder ähnlichen Proteinen, und Metall-Ionen, insbesondere Kupfer-, Calcium-, Natrium- oder Kalium-Ionen, einen ternären Komplex, insbesondere ei- nen Angiotropin-Komplex, bilden, der angiogenetische Aktivität besitzt. Unter einer ARNA I-Sequenz wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
eine Nucleinsäure, insbesondere eine RNA, verstanden, die bei Verfahren zur Aufreinigung von Angiotropin, beispielsweise unter Verwendung von Lek- tin-induzierten Schweine-Leukocyten als Ausgangsma- terial, nach verschiedenen Reinigungsschritten als einzige der bekannten ARNA-Sequenzen in der nach dem letzten Reinigungsschritt erhaltenen Fraktion, die noch angiogenetische Aktivität aufweist, spezifisch angereichert vorliegt und von der deshalb an- genommen wird, das sie die RNA-Form ist, die in den Angiotropin-Komplex eingebaut wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „angiogenetische Aktivität", dass eine Substanz die Fähigkeit aufweist, die Aus- bildung neuer Blutgefäße durch das Aussprossen von Kapillaren aus einem bereits bestehenden Gefäßsystem zu induzieren oder zu verstärken.
Bei der Sequenzierung der humanen ARNA I-Sequenz wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass sie einen Sequenzabschnitt enthält, der bezüglich seiner Länge und seiner Sequenz vollkommen identisch mit der aus Lektin-stimulierten Schweine-Leukocyten isolierten porcinen ARNA I-Sequenz ist. Die humane ARNA I-Sequenz enthält darüber hinaus einen human- spezifischen 42 Nucleotide umfassenden Abschnitt, der in der porcinen Sequenz nicht nachgewiesen wurde und in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Die ersten 19 Nucleotide dieser 42 Nucleotide weisen besondere Humanspezifität auf und sind in beiden Orientie- rungen in SEQ ID Nr. 14 und 15 dargestellt. Da die identifizierte humane ARNA I-Sequenz am 3' -Ende keinen Poly(A)-Tail enthielt, konnte nicht ermit-
telt werden, in welcher Orientierung die native Sequenz intra- oder extrazellulär vorliegt. Die nachstehend beschriebenen Sinn- beziehungsweise Anti- sinn-Orientierungen der humanen ARNA I-Sequenz wur- den daher willkürlich festgelegt. SEQ ID Nr. 2 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 in Antisinn- Orientierung . Die vollständige Nucleotidsequenz des humanen ARNA I-Moleküls in Sinn-Orientierung ist in SEQ ID Nr. 3 dargestellt, während SEQ ID Nr. 4 die vollständige Sequenz in Antisinn-Orientierung zeigt. Der 42 Nucleotide in Sinn-Orientierung umfassende Bereich (SEQ ID Nr. 1) befindet sich am 3 '-Bereich der humanen ARNA-I-Sequenz (SEQ ID Nr. 3, Position 164 bis 205) .
Eine Analyse der humanen ARNA I-Sequenz ergab, dass sie ausschließlich mit dem porcinen ARNA I (forward) -Primer amplifiziert wurde, was sich am besten dadurch erklären lässt, dass es sich bei der ursprünglich amplifizierten Nucleinsäuresequenz um ein circuläres Molekül handelt. Einen weiteren Hinweis darauf, dass es sich bei der ursprünglich amplifizierten Nucleinsäure um ein circuläres Molekül handelt, liefert die erfindungsgemäß identifizierte humane ARNA I-Nucleotidsequenz selbst. Die Sequenz ihres 5' -Endes und die Sequenz ihres 3'- Endes sind komplementär zueinander, dass heißt, die Sequenzen des 5' -Endes und des 3' -Endes können sich unter geeigneten Bedingungen aneinanderlagern und somit zu einer Circularisierung des Moleküls füh- ren. Es ist bekannt, dass bei der Prozessierung von prä-mRNAs circuläre RNAs erhalten werden können (Padgett et al . 1984; Reed und Maniatis 1985). Dabei werden die darin enthaltenen Introns in Form
von Lariaten gespleißt. Die isolierte humane ARNA I-Sequenz stellt daher mit großer Wahrscheinlichkeit die Intronsequenz einer längeren prä-mRNA dar.
Unterstützt wird diese Vermutung durch die zweite isolierte Nucleinsäuresequenz, die humane Pseudo- ARNA I-Sequenz. Wie Untersuchungen von Sequenzübereinstimmungen zeigten, besteht diese erfindungsgemäße Nucleinsäure, bei der es sich vermutlich um eine prä-mRNA oder ein Teilstück einer größeren prä-mRNA handelt, aus zwei unterschiedlichen Abschnitten und ist in SEQ ID Nr. 5 sowie schematisch in Figur 3 dargestellt. Bei diesen beiden Abschnitte der Pseudo-ARNA I-Sequenz handelt es sich wahrscheinlich um Intron- (ARNA I(as)) und Exon-(L27a Exon II ) Sequenzen . Der 5' gelegene Abschnitt der Pseudo-ARNA I-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) umfasst die ersten 63 Nucleotide (SEQ ID Nr. 11) des 5' -Endes der humanen ARNA I ( Antisinn) -Sequenz (SEQ ID Nr. 4), denen sich die Sequenz des zweiten Exons der RNA des humanen ribosomalen L27a-Proteins und ein Poly(A)-Tail am 3' -Ende anschließen. Die ersten (das heißt 5' gelegenen) 23 Nucleotide der genannten 63 Nucleotide entsprechen den ersten 23 Nucleo- tiden der porcinen ARNA I(s) Sequenz. Dies ist auf die Selbstkomplementarität des 5'- und 3 ' -Endes der humanen ARNA I(as) zurückzuführen. Gleiches gilt für die ARNA I(s). Die Nucleotide 43 bis 49 (jeweils einschließlich) sind Bestandteile der Intronsequenz der Pseudo-ARNA-I-Sequenz . Dabei stellen die 19 Nucleotide 24 bis 42 (jeweils einschließlich) der genannten 63 Nucleotide der humanen ARNA I (as) -Sequenz die human-spezifische Antisinn- Nucleotidsequenz in SEQ ID Nr. 2 dar. Überraschen-
derweise sind die letzten (das heißt 3' gelegenen Positionen 50 bis 63 in SEQ ID Nr. 4 oder 11) 14 Nucleotide (also: 5'-GCU AAC AAA GUU UU-3' ) des 63 Nucleotide langen ARNA I (as) -Sequenzabschnittes (SEQ ID Nr. 11) innerhalb der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz homolog zu einem Teilabschnitt des zweiten Exons der prä-mRNA des humanen ribosomalen L27a-Proteins . Dieser 14 Nucleotide umfassende Abschnitt der ARNA I (as) -Sequenz könnte daher Be- standteil der 3' -Spleiß-Stelle dieser prä-mRNA sein .
Ein weiterer, in SEQ ID Nr. 5 nicht dargestellter, Abschnitt der Pseudo-ARNA I-Sequenz umfasst die in Figur 3 dargestellten 5'-wärts von der 63 Nucleoti- de umfassenden Sequenz gelegene ARNA (as) -Sequenz mit den Nucleotiden 64 bis 205 und die wiederum 5' davon gelegene L27a Exon I-Sequenz.
Von ribosomalen Proteinen ist allgemein bekannt, dass diese entwicklungsbiologisch zu den ältesten Proteinen gehören und dass die ihnen zu Grunde liegenden Gene hochkonserviert sind. Vom humanen ribosomalen L27a-Protein ist außerdem bekannt, dass die mRNA dieses Proteins in Karzinomzellen gegenüber der mRNA anderer ribosomaler Proteine stark übe- rexprimiert wird, so dass zu vermuten ist, dass dieses Protein an einer verstärkten Zellprolifera- tion beteiligt ist (Frigerio et al. 1995). Obwohl dem der Pseudo-ARNA I-Sequenz zu Grunde liegenden Gen zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine eindeutige Funktion zugeordnet werden kann, kann man davon ausgehen, dass es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um ein Pseudogen des ribosomalen L27a-Gens
handelt. Pseudogene sind insbesondere bei Genfamilien anzutreffen, deren Produkte häufig benötigt werden. Bei der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz ist weiterhin bemerkenswert, dass die darin enthaltende Teilsequenz der ARNA I-Sequenz als mutmaßliche Intron-Sequenz offensichtlich spezies-übergreifend konserviert ist, da dieser Sequenzbereich ebenfalls in der porcinen ARNA I-Sequenz enthalten ist. Durch die Pseudo-ARNA I-Sequenz wird die Vermutung unter- mauert, dass die ARNA I-Sequenz die Intronsequenz einer längeren prä-mRNA ist und daraus in circulä- rer Form gespleißt wird. Die potentielle Generierung einer zirkulären ARNA I(s) ist in Figur 3 dargestellt .
Erfindungsgemäß wird also eine, vorzugsweise isolierte und vollständig gereinigte, Nucleinsäure bereitgestellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :
a) einer Nucleinsäure, die erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta-Gesamt-RNA mit ARNA I-spezifischen Primern insbesondere mit den in SEQ ID Nr. 6 und/oder Nr. 7 dargestellten Nucleotidsequenzen, oder einem Fragment davon;
b) einer Nucleinsäure, die mindestens eine in SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 8, 10, 12 oder/und 14 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst;
c) einer Nucleinsäure, die zu einer Nucleinsäure nach a) bis b) komplementär ist, insbesondere einer Nucleinsäure mit mindestens einer der in SEQ ID Nr. 2, 4, 9, 11, 13 oder/und 15 darge-
stellten Nucleotidsequenz, oder einem Fragment davon;
d) einer Nucleinsäure, die erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Dele- tion einer oder mehrerer Basen einer Nucleinsäure nach a) bis c) ; und
e) einer Nucleinsäure, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nucleinsäure nach a) bis d) oder einem Fragment davon hybridisiert.
Die Nucleinsäure kann sowohl einzelsträngig als auch doppelsträngig vorliegen.
Die Nucleinsäure kann eine DNA-Sequenz, zum Beispiel Teil einer genomischen DNA-Sequenz oder eine cDNA-Sequenz, oder eine RNA-Sequenz, zum Beispiel eine mRNA-Sequenz oder ein Teil davon, sein. Im Falle einer DNA-Sequenz sind bei dargestellten RNA- Sequenzen die mit U gekennzeichneten Uracilbasen durch T, also Thyminbasen, auszutauschen und umge- kehrt. Die Nucleinsäure kann Teil eines längeren nativen Nucleinsäuremoleküls sein. Die Nucleinsäure kann sowohl als circuläres als auch als lineares Nucleinsäuremolekül vorliegen. Die Nucleinsäuren, dargestellt in den SEQ ID Nr. 1 bis 15, werden von der Erfindung in beiden Orientierungen 5' zu 3' und 3' zu 5' sowie als Sinn- und Antisinn-Strang er- fasst. Die Nucleinsäure kann sowohl natürlichen Ursprungs sein, das heißt, sie kann sowohl extra- als auch intrazellulär aus Zellen, Geweben oder Organen eines Säugerorganismus isoliert werden, als auch
synthetischen Ursprungs sein. Außerdem kann die Nucleinsäure sowohl mit Metall-Ionen, insbesondere Kupfer-, Natrium-, Kalium- oder Calcium-Ionen, als auch mit Proteinen, wie Calgranulin C oder ARP, as- soziiert vorliegen.
Die Erfindung umfasst auch modifizierte Nucleinsäu- ren, die beispielsweise durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuren, die als Mutanten, Derivate oder funktioneilen Äquivalente einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure bezeichnet werden können. Die Sequenz der Nucleinsäuren kann beispielsweise gezielt modifiziert werden, um innerhalb der Nucleinsäuresequenz geeignete Restriktions-Schnittstellen bereitzustellen oder nicht erforderliche Nucleinsäuresequenzen oder Restriktions-Schnittstellen zu entfernen. Dabei werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren in Plas- miden inseriert und mittels Standardverfahren der Mikrobiologie/Molekularbiologie einer Mutagenese oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unterzogen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletio- nen oder Substitutionen, wie Transitionen und Transversionen, sind beispielsweise Verfahren zur in vitro-Mutagenese, "primer repair"-Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren geeignet (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). Sequenzveränderungen lassen sich auch durch Anlagerung natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen erreichen. Beispiele für synthetische Nucleinsäure-
Sequenzen sind Adaptoren oder Linker, die u.a. auch zur Verknüpfung von Nucleinsäure-Fragmenten an diese Fragmente angefügt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleinsäu- ren, die mit einer der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren nach a) bis d) hybridisieren. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure nach a) bis d) hybridisiert" bedeutet eine Nucleinsäure, die unter mäßig stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure nach a) bis d) hybridisiert. Beispielsweise kann die Hybridisierung mit einer radioaktiven Gensonde in einer Hybridisie- rungslösung (25% Formamid; 5 x SSPE; 0,1% SDS; 5 x Denhardt-Lösung; 50 μg/ml Heringsperma-DNA; bezüglich Zusammensetzung der Einzelkomponenten vgl. Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) 20 Stunden bei 37°C erfol- gen. Anschließend wird unspezifisch gebundene Sonde durch mehrfaches Waschen der Filter in 2 x SSC/0,1% SDS bei 42°C entfernt. Vorzugsweise werden die Filter mit 0,5 x SSC/0,1% SDS, besonders bevorzugt mit 0,1 x SSC/0,1% SDS bei 42°C gewaschen.
Zur Charakterisierung der erfindungsgemäß identifizierten humanen ARNA I-Sequenz wurde von dieser Nucleinsäure unter Verwendung des MFOLD-Programms ein Modell der Sekundärstruktur modelliert. Das MFOLD-Programm, Version 2 (Zuker 1989; Jaeger et al. 1989; Jaeger et al. 1990) liefert Aussagen über die Strukturen von Nucleinsäuren mit der geringsten freien Enthalpie. Ebenso wurden von allen bekannten
ARNA-Sequenzen einschließlich der bekannten porcinen ARNA-Sequenzen Modelle der Sekundärstrukturen erstellt, um mögliche Strukturhomologien zwischen diesen Nucleinsäuren zu bestimmen und somit wesent- liehe funktioneile Bereiche der Nucleinsäuren zu charakterisieren .
Die erfindungsgemäß vorgenommene Computer- Modellierung der in Figur 1 dargestellten Sekundärstruktur der humanen ARNA I(s) -Sequenz zeigte, dass diese Nucleinsäure aufgrund ihrer Vielzahl von sequenzkomplementären Bereichen eine hochsymmetrische, über weite Sequenzabschnitte hinweg dop- pelsträngige Sekundärstruktur bildet, die insbesondere durch zwei Kleeblattstrukturen gekennzeichnet ist. Wie aus Figur 1 ersichtlich, unterscheidet sich die zweite Kleeblattstruktur von der ersten dadurch, dass sie das offene 5' -3' -Ende des Nuc- leinsäuremoleküls enthält. Aus der Figur 1 ist e- benfalls ersichtlich, dass, wie vorstehend be- schrieben, die Sequenz des 3' -Endes der humanen ARNA I-Sequenz komplementär zur Sequenz des 5' -Endes ist. Diese Sequenzkomplementarität ermöglichte auch die Amplifikation der humanen ARNA I-Sequenz mit nur einem Primer.
Ein Vergleich der erstellten Sekundärstruktur mit denen anderer bekannter ARNA-Sequenzen zeigte, dass alle ARNA-Sequenzen die gemeinsame Konsensus- Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere die in SEQ ID Nr. 12 und 13 gezeigten Sequenzen aufweisen, die je- weils nur in einer Sequenzorientierung auftritt und sich immer im Bereich einer Haarnadelschleife befindet. Diese bei allen Sekundärstrukturmodellen
der bekannten ARNA-Sequenzen gefundene Haarnadelschleife stellt vermutlich die Bindungsdomäne dieser ARNA-Sequenzen an ARP oder Calgranulin C oder ein ähnliches Protein dar. Die in der Haarnadel- schleife enthaltene Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' befindet sich in einem Sequenzabschnitt, der Homologien zur Sequenz des Hammerhead-Ribozyms aufweist. Das Hammerhead-Ribozym ist Bestandteil sich selbstspleißender, circulärer, viraler RNA-Moleküle, die sich entweder allein oder in Abhängigkeit von Helfer-Viren replizieren (Haseloff und Gerlach 1988) . Die konservierte Konsensus-Sequenz 5'- CUGANGA (N) XGAAAC des Hammerhead-Ribozyms ist teilweise auch in der humanen ARNA I-Sequenz (Sinnori- entierung) (5'-CUG GAU UGA AAA G -3', SEQ ID Nr. 8) enthalten. Das deutet darauf hin, dass das ARNA I- Molekül, wie auch die anderen ARNA-Moleküle, in diesem Sequenzabschnitt neben der Proteinbindungsdomäne einen weiteren funktionellen Bereich ent- hält, der ribozymatische Aktivität besitzt.
Die Erfindung betrifft daher auch eine Nucleinsäure, die in ihrer Sekundärstruktur eine Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere mit einer der in SEQ ID Nr. 12 und 13 ge- zeigten Sequenzen ausbildet. Die Erfindung betrifft ferner eine Nucleinsäure, deren in der Sekundärstruktur ausgebildete Haarnadelschleife mit einer der in SEQ ID Nr. 12 und 13 gezeigten Sequenzen die Bindung der Nucleinsäure an ein Protein, insbeson- dere ein Angiotropin related protein-Molekül vermittelt .
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine erstmalig nachgewiesene Bindungsdomäne von Nucleinsäuren, insbesondere ARNA-Nucleinsäuren, zur Bindung an Proteine, insbesondere ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine, die gekennzeichnet ist durch die Ausbildung einer charakteristischen Haarnadelschleife mit der jeweils nur in einer Sequenzorientierung auftretenden Konsensus-Sequenz 5'-CUG- 3' , insbesondere einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nr. 12 oder 13, wobei letztere gegebenenfalls eine höhere Spezifität zur Proteinbindungsdomäne ARP beziehungsweise Cal C aufweisen.
Die Tatsache, dass die vorstehend beschriebene Haarnadelschleife der ARNA-Sequenzen, also die ver- mutliche Bindungsdomäne an ARP oder Calgranulin C oder ein ähnliches Protein, in der Sekundärstruktur unterschiedlicher ARNA-Sequenzen vorhanden ist, weist darauf hin, dass ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine Moleküle für den inter- und/oder intrazellulären Transport der verschiedenen, mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten RNA- Bestandteile sind. Dies bietet erfindungsgemäß die Möglichkeit, den Angiotropin-Proteinbestandteil ARP oder ähnliche Proteine, insbesondere andere S100- Proteine, auch für RNA-Moleküle, die natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex assoziiert sind, als Transportmoleküle zu nutzen.
Erfindungsgemäß können RNA-Moleküle mit enzymati- scher Aktivität, wie zum Beispiel Ribozyme, oder Nucleinsäuren, beispielsweise RNA-Moleküle, die die Transkriptionsprodukte von Genen von potentiellem therapeutischem oder diagnostischem Interesse dar-
stellen, mit den erfindungsgemäßen ARNA- spezifischen Sequenzen versehen werden, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife zur Bindung an ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine, insbesondere andere SlOO- Proteine, führen, die der bei ARNA-Sequenzen nachgewiesenen entspricht. Vorzugsweise werden solche Nucleinsäuren, die eine ARNA-spezifische Haarnadelstruktur zur Bindung an ARP oder ähnliche Trans- portproteine aufweisen, unter Verwendung herkömmlicher synthetischer oder gentechnischer Verfahren (vgl. Sambrook et al. 1989) hergestellt. Soll die zu transferierende Nucleinsäure ribozymatische Aktivität aufweisen, kann die angelagerte Haarnadel- schleifen-Sequenz gegebenenfalls so modifiziert werden, dass sie eine stärkere Homologie zur Konsensus-Sequenz von Hammerhead-Ribozymen als die erfindungsgemäße Haarnadelschleife der humanen ARNA I-Sequenz aufweist. Soll die zu transferierende Nucleinsäure keine ribozymatische Aktivität aufweisen, kann die Sequenz zur Ausbildung einer Haarnadelschleife so modifiziert werden, dass die für die Ribozym-Aktivität relevanten Nucleotide gegen Nucleotide ausgetauscht werden, die zu einer Blockie- rung der Ribozym-Aktivität führen. Solche Sequenzmodifikationen können mit Hilfe üblicher gentechnischer Verfahren, beispielsweise Verfahren der in vitro-Mutagenese, erfolgen.
Nach Bildung eines ternären Komplexes mit ARP und Metall-Ionen, beispielsweise Kupfer-Ionen, können die so hergestellten beziehungsweise modifizierten Nucleinsäuren gezielt in solche Zellen und/oder Gewebe eingeschleust werden, die natürliche Zielzel-
len oder Zielgewebe für Angiotropin darstellen, zum Beispiel Endothelzellen. Sollen die so hergestellten beziehungsweise modifizierten Nucleinsäuren spezifisch in andere Zielzellen eingeführt werden, werden zur Bildung ternärer Komplexe andere Proteine, beispielsweise andere SlOO-Proteine, verwendet, die gegebenenfalls andere Zielzell-Spezifitäten aufweisen. Erfindungsgemäß können für die Assoziation der Nucleinsäure mit dem Protein solche Prote- ine verwendet werden, die eine Bindung an die Nucleinsäure ermöglichen. Dies können Proteine sein, die dieselbe Bindungsdomäne an RNAs wie ARP oder Cal C besitzen. Diese Proteine können an eine RNA binden, die innerhalb einer Haarnadelschleife ent- weder die Sequenzabfolge 5 ' -CUG-3 ' oder die Sequenzabfolge der SEQ ID Nr. 12 oder der SEQ ID Nr. 13 aufweist. Diese Proteine können noch zusätzliche, das heißt von ARP beziehungsweise Cal C verschiedene Sequenzdomänen aufweisen. Diese weiteren Sequenzdomänen können eine von ARP und Cal C abweichende Zielzellspezifität vermitteln.
Aufgrund dieser gezielt modifizierten Zielzellspe- zifität kann der gebildete Nucleinsäurekomplex spezifisch an die jeweils gewünschten Zellen andocken, in diese penetrieren und anschließend die gewünschte Aktivität entfalten. Der gebildete Nucleinsäurekomplex kann in vivo oder in vitro in beliebige eu- karyontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, insbesondere jedoch Zellen und Gewebe von Säugern und Vögeln, eingeschleust werden.
Nach Einführung solcher modifizierten Nucleinsäuren können in den Zellen beispielsweise spezifische
Nucleinsäuren oder Gene ausgeschaltet werden, zum Beispiel über eine ribozymatische Aktivität der eingeschleusten Nucleinsäuren, über einen Anti- sense-Mechanismus oder einen Cosuppressions-Effekt . Es können auch Gene eingeführt werden, die vorher in diesen Zellen nicht vorhanden waren beziehungsweise deren Funktion in diesen Zellen gestört war. So ist zum Beispiel eine gezielte Tumortherapie' möglich, indem Zielzellen durch diese spezifisch erkennende Nucleinsäurekomplexe erkannt und bekämpft werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eig- -net sich insbesondere auch zur somatischen Gentherapie. Ebenso können auch Gene in Zellen eingeführt, die als Reporter-Gene fungieren, beispiels- weise um solche Zellen zu markieren oder nachzuweisen .
Dem therapeutischen Einsatz von Ribozymen standen in der Vergangenheit prinzipiell zwei Probleme gegenüber. Zum einen sind RNA-Moleküle allgemein sehr Hydrolyse-empfindlich, was zu einer relativ kurzen Halbwertszeit der Moleküle führt. Zum anderen war in der Vergangenheit die Effizienz bei herkömmlichen Verfahren zur Transfektion von RNA-Molekülen sehr gering. Im Stand der Technik sind jedoch meh- rere Verfahren beschrieben, mit deren Hilfe die genannten Probleme überwunden werden können. Beispielsweise kann durch eine chemische Modifikation des Ribose-Phosphat-Gerüstes eine RNA so stabilisiert werden, dass sie gegenüber Hydrolyse größere Resistenz zeigt (Perreault et al., 1991; Yang et al. 1992; Heidenreich et al. 1993), wobei insbesondere 2' -OH-Gruppen durch andere funktionelle Gruppen, beispielsweise Amino-, Fluoro-, O-Allyl- oder
O-Methylgruppen substituiert werden. Die Effizienz der Transfektion von RNAs kann beispielsweise dadurch erhöht werden, dass die Transfektion über Li- posomen vermittelt wird, insbesondere solche, die kationische Lipide und neutrale Phospholipide umfassen (Feigner et al. 1993). Mit Hilfe solcher Li- posomen können RNA-Moleküle intrazellulär eingeschleust werden (Akhtar et al . 1991).
Bevor die erfindungsgemäß modifizierten Nucleinsäu- ren in Zielzellen eingeführt werden, können sie daher gegebenenfalls chemisch modifiziert werden, indem beispielsweise eine oder mehrere funktioneile 2 ' -OH-Gruppen des Zucker-Phosphat-Gerüsts gegen andere funktionelle Gruppen, beispielsweise eine Ami- no-, Fluoro-, O-Allyl- oder O-Methylgruppe ausgetauscht werden, um die Nucleinsäure zu stabilisieren. Die mit Metall-Ionen und/oder Proteinen kom- plexierten Nucleinsäuren können gegebenenfalls unter Verwendung von Liposomen in Zielzellen einge- führt werden, um die Effizienz des Transports in die gewünschten Zielzellen zu verbessern. Selbstverständlich erfasst die Erfindung auch natürlicherweise in Zellen stattfindende posttranskriptio- nale Modifikationen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zum Transport eines Nucleinsäuremoleküls in eukaryontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, insbesondere Zellen und Gewebe von Säugern und Vögeln, in vitro oder in vivo umfassend die folgenden Schritte:
- Modifikation des zu transportierenden Nucleinsäu- remoleküls, das natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex und/oder ähnlichen Komplexen im Zusammenhang steht, durch Anlagerung von Se- quenzen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremole- küls, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarnadel-schleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' geeignet sind;
- Herstellung eines ternären Komplexes durch in vitro Zugabe von Metall-Ionen und mindestens einem Protein zu dem modifizierten Nucleinsäuremolekül;
- Applikation des hergestellten ternären Komplexes auf Zellen oder Gewebe, in die das modifizierte Nucleinsäuremolekül eingebracht werden soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transport eines Nucleinsäuremoleküls in eine eukaryontische Zelle, wobei das Protein ein ARP-Molekül, Calgranu- lin C oder ein ähnliches Protein, insbesondere ein das Bindemotiv von ARP oder Calgranulin C für das Nucleinsäuremolekül aufweisendes Protein ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden zur Herstellung des ternären Komplexes Metallionen wie Cu2+-, Mg2+-, Ca2+-, Na+-, K+- oder Zn2+-Ionen verwendet. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das modifizierte Nucleinsäuremolekül ein Molekül mit enzymatischer Aktivität .
Erfindungsgemäß ist ferner vorgesehen, die ARNA für diagnostische Zwecke spezifisch zu markieren. Dies kann beispielsweise mit einem radioaktiven Label, mit Digoxigenin oder mit fluoreszierenden Markern erfolgen. Mittels radioaktiv und Digoxigenin markierter ARNA können beispielsweise in situ Hybridisierungen durchgeführt werden, die eine zelluläre Lokalisation der ARNA nach der zellulären Aufnahme ermöglichen würden. Eine mit fluoreszierenden Sub- stanzen markierte ARNA kann beispielsweise in kultivierten Zellen nach deren zellulärer Aufnahme mikroskopisch sowohl zeitlich als auch räumlich verfolgt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vor- liegenden Erfindung sieht daher die Verwendung von ARNA-spezifischen Sequenzen, also der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, insbesondere Sequenzen, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer die Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' enthaltenden Haar- nadelstruktur fähig sind, zur Modifikation von natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten Nucleinsäuren zur Herstellung von Di- agnostika und Therapeutika vor. Die so modifizierten Nucleinsäuren lassen sich als Diagnostika oder Therapeutika für spezifische Zellen oder Gewebe verwenden, indem sie an ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Transportmoleküle gebunden und über diese Transportmoleküle in die zu behandelnden Zielzellen eingeschleust werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Diagnostika beliebige Stoffe verstanden, die spezifisch das Vorhandensein von Zuständen,
Prozessen oder Substanzen beziehungsweise deren Abwesenheit erkennen können und insbesondere Rückschlüsse auf Krankheitszustände geben können. Diagnostika weisen häufig erkennende und markierende Funktionen auf.
Unter dem Begriff Therapeutika werden insbesondere solche Stoffe verstanden, die entweder prophylaktisch oder krankheitsbegleitend eingesetzt werden können, um Krankheitszustände zu vermeiden, zu lin- dern oder zu beseitigen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Krankheiten auch Zustände wie unnatürliche Gemütszustände, Schwangerschaften, Alterserscheinungen, Entwicklungsstörungen oder ähnliches verstanden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht daher die Verwendung von ARNA-spezifischen Sequenzen, also der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, insbesondere Sequenzen, die unter geeigneten 'Bedingungen zur Ausbildung einer die Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere eine Sequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 12 oder 13, enthaltenden Haarnadelstruktur fähig sind, zur Isolierung von Proteinen vor, die ähnlich wie ARP an solche Haarnadel-Strukturen binden können. Bei solchen Proteinen kann es sich beispielsweise um andere Vertreter der SlOO-Proteine handeln, die gegebenenfalls andere Zellspezifitäten aufweisen als ARP.
Erfindungsgemäß wurde die Funktion der erfindungs- gemäßen humanen ARNA I-Sequenz in vivo unter Ver-
wendung des Chorioallantois-Membran-Tests am bebrüteten Hühnerei bestimmt. Der Chorioallantois- Membran-Test stellt ein einfaches Testsystem zur Untersuchung von Neovaskularisierungs-Prozessen dar. Eine angiogenetische Wirkung lässt sich anhand der Ausbildung von Blutgefäßen leicht nachweisen. In vitro synthetisierte Angiotropin-RNA wurde mit ARP (Calgranulin C) und CuCl2 zu einem ternären Angiotropin-Komplex rekonstituiert und auf die frei- gelegte Membran appliziert. Dabei zeigte sich, dass die rekonstituierten ternären Angiotropin-Komplexe beziehungsweise die in vitro synthetisierten ARNA I (Sense- beziehungsweise Antisense-) -Sequenzen über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg auf die Hühnerembryonen toxisch wirkten. Innerhalb des nicht-letalen Konzentrationsbereichs zeigten die Ergebnisse der CAM-Assays insgesamt einen RNA- abhängigen Regulationsmechanismus der Angiotropin- induzierten Angiogenese. Erfindungsgemäß wurde ü- berraschenderweise festgestellt, dass nicht nur der rekonstituierte ternäre Angiotropin-Komplex aus ARNA I(s)-RNA, Kupfer ( II ) -Ionen und nativem porcinen Calgranulin C angiogenetische Aktivität zeigte, sondern auch die ARNA I(s) -Sequenz in Kombination mit Kupfer ( II) -Ionen, jedoch ohne den Proteinbestandteil Calgranulin C. Ebenso überraschend wurde festgestellt, dass ARNA I (Antisense) -Sequenzen (ARNA I(as)) enthaltende ternäre Komplexe nicht nur keine angiogenetische Wirksamkeit zeigten, sondern im Testsystem sogar die Angiogenese hemmen konnten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist daher vorgesehen, die erfindungsgemä-
ße ARNA I-Sequenz als Wirkstoff zur Modulation an- giogenetischer Prozesse einzusetzen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ARNA I(s) -Sequenz als Wirkstoff zur Herstellung eines Therapeutikums zur Induzierung angiogenetische Prozesse, insbesondere zur Wundheilung, verwendet. In einer vorteilhaften Ausgestaltung kann das ARNA I(s) -Molekül in der Transplantationschirurgie eingesetzt werden, um durch die verstärkte Vaskularisierung die Integration des Transplantats zu beschleunigen und die Bildung i- schämischer Nekrosen zu vermeiden. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das ARNA I(s)- Molekül zur Induzierung der Neovaskularisierung von Herzkranzgefäßen verwendet werden. Dadurch läßt sich eine Coronarangioplastie unter Verwendung eines Ballonkatheders oder mittels einer Bypass- Operation vermeiden. Erfindungsgemäß kann die ARNA I(s) -Sequenz entweder in Kombination mit Kup- fer (II ) -Ionen und Calgranulin C oder nur in Kombination mit Kupfer (II ) -Ionen, das heißt ohne das Protein Calgranulin C, eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ARNA I (as) -Sequenz als Wirkstoff zur Herstellung eines Therapeutikums zur Hemmung pathogener angiogenetischer Prozesse, insbesondere bei Hämangiomen oder bei der Tumorangiogenese, verwendet. Vorzugsweise liegt die ARNA I (as ) -Sequenz in Form eines ternären Komplexes, das heißt in Kom- bination mit Calgranulin C und Kupfer (II ) -Ionen, vor. In bevorzugter Ausführungsform liegt dieser
ternäre Komplex zusammen mit Kalium- und Natriumionen vor.
Erfindungsgemäß können die zur Verwendung als Wirkstoff zur Modulierung angiogenetischer Prozesse vorgesehenen Nucleinsäuren auch chemisch modifiziert werden, indem beispielsweise ein oder mehrere funktionelle 2' -OH-Gruppen des Zucker-Phosphat- Gerüsts gegen andere funktionelle Gruppen, beispielsweise eine Amino-, Fluoro-, O-Allyl- oder 0- Methylgruppe ausgetauscht werden, um die Nucleinsäure zu stabilisieren. Gegebenenfalls können die mit Metall-Ionen und/oder Proteinen komplexierten Nucleinsäuren auch unter Verwendung von Liposomen in die Zielzellen eingeführt werden, um die Effi- zienz der Transfektion zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Induzierung angiogenetischer Prozesse in Geweben eines Säugerorganismus, umfassend die folgenden Schritte:
- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom- plexierung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure- moleküls in Sinn-Orientierung mit Metall-Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen der angiogenetische Prozess induziert werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Hemmung angiogenetischer Prozesse in Geweben eines Säugerorganismus, umfassend die fol- genden Schritte:
- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom- plexierung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure- moleküls in Antisinn-Orientierung mit Metall- Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen ein angiogenetischer Prozess gehemmt werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin sich aus Figur 2 ergebene Verfahren und Verwendungen, mittels derer die molekularen Funktionen des mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten RNA-Bestand- teils ARNA I bei der Differenzierung von Endothelzellen zu kapillaren Zellen im Rahmen der Angioge- nese genutzt werden können.
Die im nativen Angiotropin vorliegende ARNA I(s)- Sequenz ist partiell komplementär zur Intronsequenz der Pseudo-ARNA-I-Sequenz . Das Antisinn- Transkript des Pseudo-ARNA I-Gens stellt daher wohl das Vorläufertranskript für die ARNA I(s) dar. Dieses Antisinn-Transkript wird analog einer prä-mRNA transkribiert und enthält die ARNA I(s) als Intron. Aus diesem Transkript wird dann ARNA I(s)-Form, gegebenenfalls in circulärer Form, gespleißt. Die po- tentielle Generierung der ARNA I(s) -Sequenz ist in Figur 3 dargestellt. Die ARNA I(s) -Sequenz liegt vermutlich circulär vor. Durch Assoziation des ARNA I (s) -Moleküls mit ARP und Cu2+- und/oder gegebenenfalls Zink-, Calcium-, Kalium- und/oder Natrium- Ionen wird der vollständige Metallo-RNP-Komplex Angiotropin konstituiert. Bei Bedarf wird dieser Korn-
plex aus der Zelle sezerniert, diffundiert zu den Endothelzellen und gelangt mittels Endocytose oder über einen Rezeptor in das Zellinnere der Endothelzellen. Dort lagert sich die einsträngige ARNA I(s) -Sequenz an homologe Bereiche der prä-mRNA beziehungsweise mRNA des L27a-Gens, so dass diese nicht mehr als Transkriptionsmatrize zur Synthese des ribosomalen L27a-Proteins fungieren kann. Da außerdem in der Proteinbindungsdomäne des ARNA I (s) -Moleküls ein zur Konsensus-Sequenz der Ham- merhead-Ribozyme homologer Sequenzabschnitt identifiziert wurde, könnte zudem eine sequenzspezifische Hydrolyse der prä-mRNA beziehungsweise mRNA des L27a-Gens erfolgen. Auch dies hätte zur Folge, dass die Synthese des ribosomalen L27a-Proteins unterbrochen wird. Da sich ohne das L27a-Protein jedoch keine funktionsfähigen Ribosomen konstituieren können, führt dies zur vollständigen Inhibition der gesamten zellulären Translation. Dies wiederum be- wirkt, dass Endothelzellen nicht mehr prolifieren könnten. Dass Angiotropin die Proliferation von Endothelzellen hemmt, wurde experimentell nachgewiesen (Höckel et al . 1987; Noll 1998). Sobald kein Angiotropin mehr in den Zellen vorhanden ist, kann deren Proliferation wieder stattfinden, so dass dieser Prozess reversibel ist. Die durch die Hemmung der zellulären Translation erzwungene Umstellung des Stoffwechsels der Zelle führt dann zu der experimentell nachgewiesenen Differenzierung von Endothelzellen zu kapillaren Zellen.
In der erfindungsgemäß vorgesehenen Verfahrensweise zur Angiotropin-induzierten Differenzierung von Zellen, insbesondere stark proliferierenden Zellen,
wie Tumorzellen und Stammzellen, aber auch Endothelzellen und Nervenzellen, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Molekülen, die insbesondere eine Bindung an die mRNA des L27a-Gens ermöglichen, zum Beispiel die Sequenzen der SEQ ID Nr. 1 bis 5, 10 und 11, nimmt die Inhibition des ribosomalen L27a-Proteins eine Schlüsselstelle ein. Wie vorstehend erwähnt, wird die mRNA dieses Proteins in Karzinomzellen gegenüber der mRNA anderer ribosomaler Proteine stark überexprimiert, so dass ein direkter Zusammenhang zwischen diesem Protein und einer verstärkten Zeilproliferation besteht. Erfindungsgemäß besteht daher die Möglichkeit, Karzinomzellen direkt zu behandeln, indem ARNA I- Sequenzen umfassende Angiotropin-Komplexe in diese Zellen eingeschleust werden. Die ARNA I-Sequenzen führen in den Karzinomzellen zu einer direkten Hemmung der L27a-Translation und damit zu einer Hemmung der Proliferation dieser Zellen.
Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Reduktion der Proliferation von Zellen und/oder zur vorzeitigen Einleitung der Differenzierung dieser Zellen, wobei ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein Nucleinsäuremo- lekül dargestellt in einer der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 10 und/oder 11, ein diese Nucleinsäuremolekü- le enthaltener Vektor, ein diese Moleküle oder Vektoren enthaltene Wirtszelle, eine diese Nucleinsäu- remoleküle enthaltender Komplex und/oder ein Anti- körper gegen diesen Komplex in die Zelle eingeschleust wird, dabei die Aktivität und/oder Expression des L27a-Gens oder davon codierten Genproduktes gehemmt oder reduziert und so die Proliferation
der Zelle reduziert oder gehemmt wird sowie gegebenenfalls dadurch eine vorzeitige Einleitung der Differenzierung erfolgt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens han- delt es sich also bei den Zellen um stark prolife- rierende Zellen, insbesondere Stammzellen, Tumorzellen und Zellen, die zum Beispiel aufgrund patho- gener Prozesse degeneriert sind und stark prolife- rieren, aber auch um Endothelzellen. In einer wei- teren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zellen um krankhaft veränderte Zellen, beispielsweise um Zellen, die bei der Schuppenflechte ( Psoriasis-Formenkreis) entstehen. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den Zellen um Nervenzellen.
In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, in dem Nucleinsäure- komplex der vorgenannten Art ein Protein einzusetzen, welches einerseits das Nucleinsäuremolekül bindet, andererseits aber auch Spezifität im Hinblick auf die zu transformierende Zielzelle aufweist. Ein solches Molekül kann Calgranulin C oder ARP oder ein ähnliches Protein sein. Ein ähnliches Protein im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfin- düng ist ein Protein, welches eine Bindung an ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, insbesondere der vorstehend definierten Art ermöglicht, insbesondere eine Bindungsdomäne von Calgranulin C oder ARP an das Nucleinsäuremolekül auf- weist. Dieses Protein weist erfindungsgemäß Erkennungsstellen auf, die eine spezifische Erkennung, Bindung und Penetration von bestimmten zu transformierenden Zielzellen ermöglicht, so dass nicht
sämtliche Zellen des behandelten Organismus erfasst werden. Aufgrund der durch diese Bindungs- und Erkennungsstellen des Proteins vermittelten Spezifi- tät ist es möglich, einzelne Zelltypen in einem Or- ganismus gezielt den erfindungsgemäß erzielten Effekten auszusetzen, das heißt beispielsweise diese Zellen mittels der erfindungsgemäß vorgesehenen Wirkung dosisabhängig entweder zu töten oder die Proliferation zu unterbinden und die Differenzie- rung einzuleiten.
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, enthaltend eine Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit regulatorischen Elementen, Elementen, die die Replikation in einem Wirt ermöglichen, Elementen, die die Selektion mit dem Vektor transformierter Zellen ermöglichen oder sonstigen im Stand der Technik bekannten Elementen. Erfindungsgemäß kann der Vektor zum Beispiel ein Cosmid, Phage oder Plasmid sein.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die derartige Vektoren enthalten. Derartige Wirtszellen können bakterielle, pflanzliche, tierische oder menschliche Zellen sein, zum Beispiel Primatenzellen, Mauszellen, Hamsterzellen oder auch Insekten- zellen.
Wie vorstehend erläutert, erfasst die Erfindung auch Nucleinsäurekomplexe, umfassend mindestens ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, entweder zusammen mit mindestens einem Metallion und/oder einem Protein. Das Protein kann beispielsweise aus der Familie der SlOO-Proteine (Dell'Ange-
lica et al., a.a.O.) stammen, insbesondere ein humanes oder porcines Calgranulin C oder Angiotropin- related-Proteinmolekül sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem S100- Protein ein Protein mit zwei Calciumbindungsmotiven verstanden, die als EF-Handstrukturen bezeichnet werden, insbesondere ein Protein mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, min- destens 90 % und bevorzugt mindestens 95 %, 97 % und 99 % zu humanem ARP. Als Metallion können beispielsweise Ca2+-, Cu2+-, Na+-, K+-, Zn2+ oder Mg+- Ionen verwendet werden.
Ein erfindungsgemäßer Nucleinsäurekomplex umfassend ein Nucleinsäuremolekül und ein Protein oder dessen Bestandteil, zum Beispiel Oligopeptid oder Polypep- tid, wird auch als Ribonucleotidpolypeptid und, wenn dieser Metallionen enthält, als metallhaltiges Ribonucleotidpolypeptid bezeichnet. Derartige Kom- plexe können chemische, radioaktive oder fluores- zente Markierungen, auch mit cytotoxischer Wirkung, aufweisen .
Die Erfindung betrifft auch Antikörper, insbesondere monoclonale oder polyclonale Antikörper, die spezifisch einen der vorgenannten Nucleinsäure- Komplexe erkennen und binden können.
Die Erfindung betrifft auch mindestens eins der vorstehend genannten Agenzien enthaltende diagnostische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, wo- bei derartige Agenzien die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, Vektoren, Wirtszellen, Nucleinsäure-
Komplexe oder Antikörper sein können. Diese Zusammensetzungen weisen weiterhin gegebenenfalls Zusatz- oder Hilfsstoffe, wie pharmazeutisch verträgliche Träger, Farbstoffe, Aromastoffe, Süßungsmit- tel, Verdickungsmittel, Trennmittel, Säuerungsmittel, Gleitmittel, Konservierungsmittel oder ähnliches auf. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur spezifischen Beeinflussung der Angio- morphogenese und des vaskulären Zustands eines Ge- webes des Körpers von Organismen, zur Übertragung genetischer Informationen in Zellen, zur selektiven Veränderung des Nucleinsäuregehaltes von Zellen, zur Induzierung angiogenetischer Prozesse und/oder zur Wundheilung, zur Hemmung angiogenetischer Pro- zesse und/oder zur Bekämpfung von Tumoren eingesetzt werden. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die vorstehend genannten Agenzien zur zellselektiven reversiblen Inhibierung der Proteinbiosynthese, zum Beispiel in Endothelzellen, zur Inhibierung von Blutendothelzellen, zur spezifischen in vivo oder in vitro Beeinflussung der Blutgefäßbildung, insbesondere bei Herz- und Gefäßerkrankungen, in der Transplantationschirurgie oder zur Inhibition des Wachstums von Tumoren ebenso wie in der Wundheilung einzusetzen. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure- komplexe weisen auch eine zellselektive morphogene Wirkung in vitro auf isolierte primäre und/oder clonierte Blutkapillarendothelzellen in Kultur zur nichtmitogenen Induktion der Änderung des Zellphä- notyps aus dem konfluenten Zustand oder/und zur nichtmitogenen Änderung der spatiotemporalen suprazellulären Organisation der Zellen zu dreidimensionalen organoiden kapillarähnlichen Strukturen in Kultur auf. Schließlich sind sie zur spezifischen
chemotropischen Wirkung auf Blutgefäße in vivo, zur Induktion eines Richtungswachstums von Blutgefäßen in vivo und zur Induktion einer Neovaskualisierung von Geweben durch gerichtetes Einwachsen von Blut- gefäßen geeignet.
Die erfindungsgemäß vorgesehenen diagnostischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten zum Beispiel die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren und/oder Nucleinsäurekomplexe . Sie können bei- spielsweise subkutan, intrakutan, intramuskulär o- der intravenös appliziert werden. Es sind jedoch selbstverständlich auch weitere im Stand der Technik gebräuchliche Applikationsmöglichkeiten einsetzbar. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen topisch oder systemisch eingesetzt werden.
Die diagnostischen Zusammensetzungen können zum Beispiel zur Diagnose von Veränderungen des Blutgefäßwachstums eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die vorstehend genannten Agenzien zur Strukturanalyse von Nucleinsäuren, Nucleosiden oder Nucleotiden einzusetzen, zum Beispiel zur Deaminierung von Adenosin und Deo- xiadenosin, zur Hydrolyse von Inosin und Deoxiino- sin, zur Hydrolyse von Guanosin, zur Deaminierung von Guanin, zur Hydrolyse von Phosphorsäurediestern, zur Hydrolyse von Phosphorsäuremonoes- tern, zur Hydrolyse von Nucleinsäuresubstraten e- benso wie zur Herstellung von Nucleinsäuren in vivo und in vitro. Gegebenenfalls kann vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Verwendungen auch in Gegen-
wart von Magnesium2+-Ionen durchzuführen. Insbesondere kann erfindungsgemäß mit den vorstehend genannten Agenzien die Herstellung von Adenosin, De- soxiadenosin, Guanosin, Desoxiguanosin, Inosin, Adenin, Guanin, Hypoxanthin oder Xanthin durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der vorstehend genannten Agenzien für die vorstehend genannten Zwecke, insbesondere zur Prophylaxe oder Hei- lung von Erkrankungen ebenso wie die Verwendung der vorstehend genannten Agenzien zur Herstellung von Arzneimitteln zur Erzielung der genannten Zwecke, insbesondere zur Prophylaxe oder Heilung von Krankheiten .
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von SlOO-Proteinen, insbesondere ARP, Calgranulin C, oder der Nucleinsäure-Komplexe der vorgenannten Erfindung als Transportmolekül für Nucleotidsequen- zen, insbesondere RNA-Moleküle.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung .
Figur 1 zeigt die mit Hilfe des MFOLD-Programms er- stellte Sekundärstruktur der humanen ARNA I-Sequenz (Antisinn) .
Figur 2 zeigt in schematischer Form den Mechanismus der ARNA I ( s) -induzierten Translationsinhibition über einen Antisinn-Mechanismus . Dieser Antisinn-
Mechanismus führt zur Differenzierung von Endothelzellen, wobei Kapillaren gebildet werden.
Figur 3 zeigt schematisch die Struktur der erfindungsgemäßen Pseudo-ARNA I-Sequenz (oben: Sinn- sträng, unten: Antisinnstrang) .
Das Sequenzprotokoll (alle Sequenzen sind in 5' zu 3' -Orientierung dargestellt) umfasst:
SEQ ID Nr. 1 zeigt 42 Nucleotide der humanen, spezifischen ARNA I-Sequenz, die in der entsprechenden porcinen ARNA I-Sequenz nicht nachgewiesen wurden (Sinn-Orientierung) .
SEQ ID Nr. 2 zeigt 42 Nucleotide der humanen, spezifischen ARNA-I-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 in Anti- sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 3 zeigt die vollständige, 205 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen ARNA I-Sequenz, die den 163 Nucleotide umfassenden Sequenzteil umfasst, der identisch mit der Sequenz der porcinen ARNA I- Sequenz ist, in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 4 zeigt die vollständige, 205 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen ARNA I-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 in Antisinn-Orientierung .
SEQ ID Nr. 5 zeigt die 235 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz (Sinn- Orientierung) , inclusive der am 5' Ende vorhandenen ARNA I Nucleotide 1 bis 63 in Antisinn- Orientierung .
SEQ ID Nr. 6 zeigt die Sequenz des zur Isolierung der humanen ARNA I-Sequenz verwendeten Primers ARNA I (forward) .
SEQ ID Nr. 7 zeigt die Sequenz des zur Isolierung der humanen ARNA I-Sequenz verwendeten Primers ARNA I (reverse) .
SEQ ID Nr. 8 zeigt einen Teilabschnitt der humanen ARNA-I Sequenz (Sinnorientierung) mit potentieller ribozymatischer Aktivität.
SEQ ID Nr. 9 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 8 in AntiSinnorientierung .
SEQ ID Nr. 10 zeigt die in SEQ ID Nr. 5 erwähnten 63 Nucleotide der humanen ARNA I in Sinn- Orientierung.
SEQ ID Nr. 11 zeigt die in SEQ ID Nr. 5 erwähnten 63 Nucleotide der humanen ARNA I in Antisinn- Orientierung.
SEQ ID Nr. 12 zeigt den im Haarnadelschleifenbereich gelegenen Konsensusbereich zwischen ARNA I(s) und ARNA II (as) Sequenzen in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 13 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 12 in Antisinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 14 zeigt den 19 Nucleotide mit besonderer Humanspezifität aufweisenden Bereich der SEQ ID Nr. 1 in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 15 zeigt den 19 Nucleotide umfassenden besonders humanspezifischen Bereich der SEQ ID Nr. 2 in Antisinn-Orientierung.
Beispiel 1
Identifizierung von ARNA I-Sequenzen in humanem Probenmaterial
Voruntersuchungen mittels RT-PCR unter Verwendung verschiedener Primer hatten gezeigt, dass zur porcinen ARNA I-Sequenz homologe Nucleinsäuren sowohl in kommerzieller humaner Plazenta-Gesamt-RNA als auch in Con A-stimulierter Leukocyten-Gesamt-RNA nachgewiesen werden konnten.
Zur Clonierung der humanen ARNA I-Sequenz wurde Gesamt-RNA von humaner Plazenta unter Verwendung des Primers ARNA I (forward) (SEQ ID Nr. 6), der eine Eco Rl-Schnittstelle enthält, und des Primers ARNA I (reverse) (SEQ ID Nr. 7), der eine Barn HI- Restriktionsstelle enthält, einer RT-PCR unterworfen. Die erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Barn HI gespalten und einer gelelektrophoretischen Aufreinigung auf einem 2,5%-igen Agarose-Gel unterworfen. Nach Aufreinigung der Fragmente wurden diese in den Vektor pUC 19 cloniert, der zuvor mit Eco RI und Barn HI gespalten worden war. Nach Transformation und Selektion geeigneter Transformanten wurde die Sequenz der Insertionen im Clonierungsvektor be- stimmt. Die Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des Dye Terminator Cycle Sequencing Kits und des ABI PRISM 377A DNA-Sequenators . Die dabei erhaltenen vollständigen und partiellen Sequenzen von ARNA I(s), ARNA I(as) und Pseudo-ARNA I sind in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und 8 bis 15 gezeigt. In Fi-
gur 3 wird in schematischer Weise die Pseudo-ARNA I-Sequenz gezeigt. Der obere Bereich stellt die 5'- 3' Orientierung eines Sinntranskripts von der Pseudo-ARNA I in prä-mRNA Form dar, also das potentiel- le L27a Exon I und das potentielle Intron umfassend die ARNA I-Nucleotide Nr. 64-205 und 1-63, beide in Antisinn-Orientierung, L27a Exon II und Poly A Schwanz (in 5' zu 3' Richtung) . Dabei stellen die Nucleotide 50-63 der ARNA I (as) einen gemeinsamen Sequenzabschnitt zwischen ARNA I(as) und dem Bereich des Pseudo-ARNA I Transkripts dar, der homolog zum 5' -Ende des Exon II von L27a ist. Die 3' Spleißstelle der prä-mRNA von L27a beziehungsweise möglicherweise auch der Pseudo-ARNA I(s) Sequenz liegt im mit dem Doppelpfeil gekennzeichneten Bereich. Im darunter gelegenen Bereich wird in 3' -5'- Orientierung (Antisinn-Transkript) dargestellt, wie das entsprechende Antisinn-Transkript der Pseudo- ARNA I-Sequenz aufgebaut ist, nämlich (in 3' zu 5' Richtung) : L27a Exon I in Antisinn, Intron aus ARNA I Nt 142-1 und ARNA I Nt 205-143 beide in Sinn- Orientierung, L27a Exon I (Antisinn) . Der potentielle Intronbereich der Pseudo-ARNA I-Sequenz wird durch die ARNA I(as) Bereiche 64 bis 205 und 1 bis 63 konstituiert. Im Antisinn-Transkript der Pseudo- ARNA I (unterer Bereich) befindet sich der entsprechende Intronbereich ARNA I(s) 142 bis 1 und ARNA I(s) 205 bis 143, der als Template für die Generierung einer zirkulären ARNA I(s) -Sequenz dient. Mit- tels des dargestellten Pfeils wird die potentielle Zirkularisierung dieser Sequenz dargestellt. Dabei kennzeichnet die Pfeilspitze die Position der 5'- und das Pfeilende die Position der 3 ' -Spleiß-Stelle der ARNA I(s) innerhalb des Antisinn-Transkriptes
der Pseudo-ARNA I-Sequenz. Die Nucleotide 143-156 der ARNA I(s) können ab der Position der 3' Spleißstelle des Exons II der mRNA beziehungsweise prä- mRNA des L27a-Gens gegen dieses Exon hybridisieren.
Beispiel 2
In vitro-RNA-Synthese von ARNA I-Sequenzen
Die clonierten ARNA I-Sequenzen wurden als Matrizen zur in vitro-RNA-Synthese verwendet. Dazu wurden via PCR blunt-end DNA-Templates hergestellt, die eine definierte Terminierung des nachfolgenden RNA- Transkripts ermöglichten. Diese DNA-Templats enthielten am 5' -Ende eine Promotorsequenz für die T7- RNA-Polymerase und 3'-terminal zur Promotorsequenz die gewünschte DNA-Sequenz, deren RNA synthetisiert werden sollte. Die RNA-Synthese erfolgte unter Verwendung hochkonzentrierter T7-RNA-Polymerase nach dem Verfahren von Milligan und Uhlenbeck (1989), wobei die RNA-Synthese jedoch über 18 h durchgeführt wurde. Nach der Synthese wurde die RNA mit- tels DNase-Behandlung und Phenol/Chloroform- Behandlung gereinigt. Nach Aufreinigung der RNA mittels Microkonzentrationen von Amicon (optional auch ersetzt durch Ethanolfüllung) konnte die so synthetisierte RNA zur in vitro-Rekonstitution ter- närer Angiotropin-Komplexe eingesetzt werden.
Beispiel 3
Rekonstitution ternärer Angiotropin-Komplexe
Zur Rekonstitution ternärer Angiotropin-Komplexe wurde die in Beispiel 2 synthetisierte RNA einge-
setzt. Als Protein-Komponente wurde intrazellulär isoliertes und aufgereinigtes porcines Calgranulin C aus Schweine-Granulocyten verwendet. Außerdem wurde CuCl2 eingesetzt. Da das Konzentrations- Verhältnis zwischen RNA und Calgranulin C bisher experimentell nicht eindeutig quantifiziert werden konnte (Kuhn 1998), erfolgte die Rekonstitution der ternären Komplexe unter Verwendung verschiedener Konzentrationen. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Komplexe mit Pufferlösung 1:100 verdünnt .
Beispiel 4
Bestimmung der angiogenetischen Aktivität mittels des CAM-Tests
Der CAM-Test wurde durchgeführt wie von Noll (1998) und Kuhn (1998) beschrieben.
Positive angiogenetische Reaktionen wurden entsprechend der Ausbildung von Blutgefäßen im Bereich der aufgetragenen Probe entweder mit „++++" (sehr starke Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen) , „+++" (starke Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen) , „++" (leichte Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen), „+" (sehr geringe Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen) oder „0" (keine Veränderung; entspricht der Reaktion auf Puffer ohne Substrat) . Eine Verringerung der Anzahl der Kapillarnetzstrukturen wurde mit „-„ beurteilt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in nachste- hender Tabelle zusammengefasst .
Tabelle
CAM-Testserie mittels PCR-Template synthetisierter ARNA I
Beispiel 5
Mechanismus der ARNA I-regulierten Angiogenese des Angiotropins mittels Antisense-Inhibierung
Figur 2 stellt schematisch den zellulären Mechanis- mus der durch native humane ARNA I(s) induzierten Translationsinhibition mittels Antisinn-Mechanismus dar. Die in Leucozyten 50 generierte ARNA I(s) (als 10 in Figur 2 bezeichnet) stellt das Antisinn- Transkript des Pseudo-ARNA I-Gens mit der schwarz dargestellten ARNA l(s) -Sequenz als Intron-Sequenz dar. Diese Intron-Sequenz umfasst die vollständige Sequenz von ARNA I(s) (SEQ ID Nr. 3), die somit einem zellulären Spleiß-Mechanismus unterliegt. Das Genprodukt des Pseudo-ARNA-Gens befindet sich daher nicht beziehungsweise nicht nur auf dem Sinnstrang, sondern vielmehr auf dem Antisinnstrang . Damit ist das Antisinn-Transkript das funktionelle Transkript dieses Gens. Das Antisinntranskript des Pseudo-ARNA I-Gens stellt das Vorläufertranskript für die ARNA I(s) dar. Durch Assoziation der herausgespleißten, vermutlich circularisierten ARNA I(s) (15) mit ARP 18 und Cu2+-Ionen wird der erfindungsgemäße vollständige Metallo-RNP-Komplex Angiotropin 20 konstituiert. Der Metallo-RNP-Komplex Angiotropin (als 20 bezeichnet) wird bei Bedarf in den extrazellulären Raum 30 sezerniert und diffundiert zu den Endothelzellen 40. In diesen hybridisiert die ARNA I(s) 15 gegen die prä-mRNA 60 beziehungsweise mRNA des L27a-Gens beziehungsweise direkt gegen das L27a-Gen auf Transkriptionsebene. Dadurch wird die Synthese des ribosomalen L27a-Proteins inhibiert. Da inner-
halb einer Haarnadelschleife der ARNA I(s) 15 eine Konsensussequenz zum Hammerhead-Ribozym identifiziert wurde, kann gegebenenfalls darüber hinaus noch eine sequenzspezifische Hydrolyse der prä-mRNA beziehungsweise der mRNA des L27a-Gens stattfinden.
Ohne ribosomales L27a-Protein kann keine Bildung von funktionsfähigen Ribosomen stattfinden. Die Inhibition der Translation ist die Folge, so dass die zelluläre Proteinbiosynthese gestoppt wird. Die En- dothelzellen können nicht mehr proliferieren und erhalten dadurch die benötigte Zeit zur Umdifferen- zierung in Kapillaren 70. Dieser Effekt scheint reversibel zu sein, da, wenn keine weitere ARNA l(s)- RNA 15 in die Endothelzellen eingeschleust wird, Proliferation wieder stattfindet.
Das vorgenannte System kann als Modellsystem für den zellselektiven RNA-Transfer und die Stabilisierung von RNA bei Antisinn- und Ribozymstrategien herangezogen werden. Die Erfindung erfasst daher auch endothelspezifische Transfektionskits .
Insbesondere erlaubt es die Erfindung hinsichtlich der ARNA I(s) -Sequenz und diese enthaltenden Nucleinsäure-Komplexe Wunden zu heilen, koronare Herzkranzgefäßerkrankungen zu heilen und eine verbes- serte Transplantationschirurgie durchzuführen. Die erfindungsgemäße ARNA I(s) -Sequenz und diese enthaltende Nucleinsäurekomplexe können darüber hinaus auch zur Induktion des Wachstums von Nervenzellen verwendet werden.
Hinsichtlich der ARNA I (as) -Sequenz und diese enthaltenden Nucleinsäure-Komplexen ist es möglich, die Tumorangiogenese zu inhibieren und Gentherapien zum Beispiel bei Hämangiomen durchzuführen.
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