WO2002068636A1 - Verfahren und mittel zur modifikation humaner angiogenese - Google Patents

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WO2002068636A1
WO2002068636A1 PCT/EP2002/000859 EP0200859W WO02068636A1 WO 2002068636 A1 WO2002068636 A1 WO 2002068636A1 EP 0200859 W EP0200859 W EP 0200859W WO 02068636 A1 WO02068636 A1 WO 02068636A1
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acid molecule
arna
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protein
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PCT/EP2002/000859
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Herwig Brunner
Brigitte Koch-Pelster
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to RNA components of a metallo-ribonucleoprotein morphogen from leukocytes, processes for their preparation and characterization and nucleic acid complexes comprising these RNA components and processes for their use, in particular processes and agents for modifying angiogenesis and Methods and agents for tumor cell control.
  • Angiogenesis is the formation of new blood vessels by sprouting capillaries from an existing vascular system (Hertig, 1935).
  • the neovascularization that takes place in the context of angiogenesis takes place in several partial steps (Folkman and Shing, 1992).
  • the basement membrane surrounding the blood vessels is broken down with the help of various proteolytic enzymes, for example collagenase, and the extracellular matrix is also fragmented in the perivascular space.
  • the endothelial cell is then differentiated, the cell morphology changing and pseudopodia associated therewith being formed.
  • Angiogenic stimuli cause the exposed endothelial cells to migrate in the direction of a chemotactic stimulus. The endothelial cells then proliferate.
  • pathological angiogenic processes include, for example, diabetic retinopathy, the various forms of rheumatoid arthritis and the formation of hemangiomas.
  • pathological processes are caused by the fact that angiogenetically stimulating factors, such as, for example, metalloproteases, are in excess of their inhibitors, for example TIMP (tissue inhibitor of metalloproteases).
  • TIMP tissue inhibitor of metalloproteases
  • Targeted inhibition of individual angiogenesis factors attempts to inhibit such pathological angiogenic processes (Adamis et al., 1996).
  • Tumor angiogenesis is a special case of pathogenic angiogenesis (Folkman 1971, Folkman 1995b).
  • Angiotropin a metallo-ribonucleoprotein morphogen isolated from ischemic heart muscle tissue, wound fluid and the supernatants of serum-free mass cultures of lectin-stimulated porcine leucocytes, is known to be a mediator of angiogenetic processes (Wissler and Renner 1981, Wissler 1982, Wissler 1984) , The angiogenic efficacy of angiotropin has been demonstrated using standard in vivo and in vitro test systems. For example, a test on corioallantoic membranes of the chicken embryo (CAM test) showed that after administration of angiotropin there was increased capillarization in this membrane (Wissler 1982, Noll 1998, Kuhn 1998).
  • stage II ie after about four to seven days, long bipolar cytoplasmic extensions with tubular structures were observed that organized themselves spatially. There were one or two large transparent vacuoles with movable granules inside the endothelial cells. If the endothelial cells were still stimulated with angiotropin-containing medium, they went into stage III. The vacuoles disappeared and irregularly shaped particles appeared outside the cell body and the pseudopods. If stage II endothelial cells were further cultivated with new medium which did not contain angiotropin, the cell morphological changes regressed after 24 hours until the cells returned to their original appearance.
  • angiotropin caused a reversible change in the cell morphology and thus the phenotype of endothelial cells. It is also important that angiotropin had no mitogenic effect on endothelial cell cultures and therefore only differentiation, but none Proliferation of the endothelial cells induced (Höckel et al. 1986, Höckel et al. 1987, Höckel 1988).
  • angiotropin stimulated the migration of endothelial cells, but not the migration of 3T3 fibroblasts (Höckel et al. 1987, Höckel 1988). This means that angiotropin has a specific effect on endothelial cells. Furthermore, it could be demonstrated that angiotropin has nuclease activity and can inhibit translation in in vitro translation assays (Seibt 1998, Noll 1998).
  • Angiotropin is a metal-containing ribonucleotide polypeptide (RNP) complex that could be isolated extracellularly. Copper, calcium, sodium and potassium ions have been detected as metal ions (Wissler et al., 1986). The copper ion is presumably present in a divalent form (Kuhn et al., 1996, Kuhn 1998). The sequencing of the protein component ARP (angipotropin related protein) showed that it is 100% homologous to calgranulin C (Kuhn 1998).
  • ARP angipotropin related protein
  • the protein belongs to the family of SlOO proteins and has already been isolated from porcine granulocytes without an RNA component, in which it forms 8% of the total cytosolic protein (Dell 'Angelica et al., 1994). It is a protein with 91 amino acids and a molecular weight of 10614 daltons. Like other SlOO proteins, calgranulin C has two calcium binding motifs known as EF hand structures (Kretsinger 1980, Isobe et al. 1981; Moncrief et al. 1990; Klingman & Hilt 1988; Schfer & Walkermann 1996).
  • RNPs biologically active metal-containing, in particular copper, zinc or calcium-containing ribonucleopolypeptides (RNPs) as non-mitogenic morphogens for blood vessels of a defined primary structure, as well as methods for producing and obtaining these RNPs.
  • RNPs biologically active metal-containing, in particular copper, zinc or calcium-containing ribonucleopolypeptides
  • a partial sequence of the porcine angiotropin RNA sequence and the amino acid sequence of the protein component are described.
  • RNA component (ARNA) of porcine angiotropin in particular the sequences ARNA II, ARNA III, ARNA IV and ARNA V.
  • RNA sequences associated with porcine angiotropin in particular the ARNA I sequence and the ARNA VI sequence.
  • RNA sequences associated with porcine angiotropin In view of the experimentally proven importance of angiotropin for angiogenesis in the mammalian organism, in particular with regard to the use of this morphogen for the targeted modulation of pathogenic angiogenic processes in humans, for example for the treatment of human diseases, it is desirable to understand the RNA sequences of human angiotropin to isolate and characterize.
  • the publications known in the prior art do not provide any insight into the molecular mechanisms that underlie the angiogenic activity of angiotropin. In particular, in particular, it is not known what function the RNA component specifically has.
  • angiotropin in human medicine, however, it is desirable to understand these molecular mechanisms precisely in order to be able to specifically modulate the angiogenic activity of angiotropin, that is to say to induce or to increase or to inhibit it as required ,
  • the technical problem on which the present invention is based is therefore to provide methods and means for isolating and characterizing RNA sequences for human angiotropin, and further methods and means based on these methods and means, with the aid of which, in particular in the human body, physiologically desired angiogenesis.
  • Processes, for example in wound healing, can be specifically induced or strengthened, or pathological angiogenesis processes, for example in diabetic retinopathy or in tumor formation, can be specifically inhibited.
  • nucleic acid molecule which is suitable as a functional component of a biologically active metallo-ribonucleoprotein complex, selected from the group consisting of:
  • nucleic acid molecule which is obtainable by reverse transcription of placenta Total RNA with ARNA I-specific primers, in particular with the primers shown in SEQ ID No. 6 and / or 7, and a fragment thereof;
  • nucleic acid molecule comprising at least one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID Nos. 1 to 5 and 8 to 15 and a fragment thereof;
  • nucleic acid molecule which can be obtained by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases of a nucleic acid molecule according to a) to b);
  • nucleic acid molecule which hybridizes with a nucleic acid molecule according to a) to c) and a fragment thereof
  • nucleic acid molecule which is complementary to a nucleic acid molecule according to a) to b), and a fragment thereof.
  • the invention also solves this problem by providing nucleic acid complexes which contain these nucleic acid molecules and which combine the nucleic acid molecule according to the invention together with at least one metal ion, the nucleic acid molecule according to the invention together with at least one metal ion and at least one protein (also referred to here as metal-containing ribonucleotide polypeptides) or contain the nucleic acid molecule according to the invention together with a protein (also referred to here as ribonucleotide polypeptides).
  • Such nucleic acid complexes, in particular metal-containing ribonucleotide polypeptides are suitable for a large number of diagnostic and therapeutic applications are outstandingly suitable.
  • the technical problem was solved in a preferred embodiment by the human RNA sequence ARNA I associated with human angiotropin using the RT-PCR method using the porcine primers ARNA I (forward) and ARNA I (reverse) from the Total RNA was isolated from human placenta, an angiogenetically extremely active tissue.
  • this human ARNA-I sequence contains a 42 nucleotide sequence segment which was not detected in the porcine ARNA I sequence .
  • MFOLD program a computer model of the secondary structure of the human ARNA I sequence was created and compared with the secondary structure of all known ARNA sequences, including the porcine ARNA sequences.
  • RNA sequences with ribozyme activity into target cells of the angiotropin complex, for example endothelial cells
  • these RNA sequences are provided with the sequences which form the hairpin loop in the ARNA sequences using known methods of genetic engineering and then, using these RNA sequences, the ARP component and metal ions, ternary complexes are formed in vitro which are introduced into the cells to be treated.
  • the proven hairpin loop of the ARNA sequences according to the invention offers the possibility, using the nucleic acids according to the invention containing them, to isolate further proteins, for example other SlOO proteins, which, like ARP, can bind to such hairpin structures and as potential transport molecules for ARNA sequences or for nucleic acids modified according to the invention, which are naturally not associated with the angiotropin complex, can be used.
  • further proteins for example other SlOO proteins, which, like ARP, can bind to such hairpin structures and as potential transport molecules for ARNA sequences or for nucleic acids modified according to the invention, which are naturally not associated with the angiotropin complex, can be used.
  • ternary angiotropin complexes ie metal-containing ribonucleotide proteins
  • ARNA I sequences CuCl 2
  • ARP Corioallantois membrane
  • the results of the CAM assays showed an overall RNA-dependent regulatory mechanism for angiotropin-induced angiogenesis.
  • ARNA I sense or sense RNA
  • II copper
  • ternary complexes reconstituted with the ARNA I (antisense or antisense) sequence (ARNA I (as)) not only showed no angiogenic activity, but could even inhibit angiogenic processes in the test system.
  • the human ARNA I (s) sequence as an active ingredient for a therapeutic agent for inducing angiogenesis, for example in the context of wound healing, while in a further preferred embodiment the human ARNA I (as) Sequence as an active ingredient for a therapeutic agent for inhibiting patho- general angiogenic processes, especially tumor angiogenesis, can be used.
  • the ARNA I (s) or (as) sequence according to the invention can be used together with metal ions and / or proteins, for example calgranulin C, or its components.
  • a nucleic acid which can be associated with human angiotropin and which is the human ARNA I sequence is provided for the first time.
  • the human ARNA I sequence was according to the invention from a human total placenta RNA by means of the RT-PCR method using the primers ARNA I (forward) (SEQ ID No. 6) and ARNA I specific for the porcine ARNA I sequence (reverse) (SEQ ID No. 7) isolated and cloned.
  • ARNA I forward
  • ARNA I specific for the porcine ARNA I sequence reverse
  • a second sequence called human pseudo-ARNA I sequence was isolated and cloned.
  • ARNA sequences are understood to mean nucleic acids, in particular RNAs, which can be isolated extracellularly and in native form under suitable conditions together with a protein, in particular ARP (angiotropin-related protein) or calgranulin C or similar proteins, and Metal ions, in particular copper, calcium, sodium or potassium ions, form a ternary complex, in particular an angiotropin complex, which has angiogenic activity.
  • ARP angiotropin-related protein
  • calgranulin C or similar proteins calgranulin C or similar proteins
  • Metal ions in particular copper, calcium, sodium or potassium ions, form a ternary complex, in particular an angiotropin complex, which has angiogenic activity.
  • An ARNA I sequence is used in connection with the present invention a nucleic acid, in particular an RNA, understood that, in methods for the purification of angiotropin, for example using lectin-induced porcine leukocytes as the starting material, after various purification steps as the only known ARNA sequence in the after the last purification step obtained fraction, which still has angiogenic activity, is specifically enriched and is therefore assumed to be the RNA form which is incorporated into the angiotropin complex.
  • angiogenic activity means that a substance has the ability to induce or intensify the formation of new blood vessels by sprouting capillaries from an already existing vascular system.
  • human ARNA I sequence When sequencing the human ARNA I sequence, it was found according to the invention that it contains a sequence section which is completely identical in terms of its length and its sequence to the porcine ARNA I sequence isolated from lectin-stimulated porcine leukocytes.
  • the human ARNA I sequence also contains a human-specific section comprising 42 nucleotides, which was not detected in the porcine sequence and is shown in SEQ ID No. 1.
  • the first 19 nucleotides of these 42 nucleotides have special human specificity and are shown in both orientations in SEQ ID No. 14 and 15. Since the identified human ARNA I sequence did not contain a poly (A) tail at the 3 'end, the orientation in which the native sequence is intra- or extracellular.
  • SEQ ID No. 2 shows the sequence of SEQ ID No. 1 in an anti-sense orientation.
  • SEQ ID No. 3 shows the complete nucleotide sequence of the human ARNA I molecule in sense orientation.
  • SEQ ID No. 4 shows the complete sequence in antisense orientation.
  • the region comprising 42 nucleotides in sense orientation (SEQ ID No. 1) is located at the 3 ′ region of the human ARNA-I sequence (SEQ ID No. 3, positions 164 to 205).
  • this nucleic acid according to the invention which is presumably a pre-mRNA or a section of a larger pre-mRNA, consists of two different sections and is shown in SEQ ID No. 5 and schematically in FIG. 3. These two sections of the pseudo-ARNA I sequence are probably intron (ARNA I (as)) and exon (L27a exon II) sequences.
  • the 5 'section of the pseudo-ARNA I sequence (SEQ ID No. 5) comprises the first 63 nucleotides (SEQ ID No. 11) of the 5' end of the human ARNA I (antisense) sequence (SEQ ID No.
  • the first (ie 5 'located) 23 nucleotides of the 63 nucleotides mentioned correspond to the first 23 nucleotides of the porcine ARNA I (s) sequence. This is due to the self-complementarity of the 5 'and 3' ends of the human ARNA I (as). The same applies to ARNA I (s). Nucleotides 43 to 49 (inclusive) are part of the intron sequence of the pseudo-ARNA-I sequence.
  • the 19 nucleotides 24 to 42 (each inclusive) of the 63 nucleotides of the human ARNA I (as) sequence mentioned represent the human-specific antisense nucleotide sequence in SEQ ID No. 2. therefore the last (i.e. 3 'positions 50 to 63 in SEQ ID No. 4 or 11) are 14 nucleotides (ie: 5'-GCU AAC AAA GUU UU-3') of the 63 nucleotide ARNA I (as) - Sequence section (SEQ ID No. 11) within the human pseudo-ARNA I sequence homologous to a section of the second exon of the pre-mRNA of the human ribosomal L27a protein. This 14 nucleotide section of the ARNA I (as) sequence could therefore be part of the 3 'splice site of this pre-mRNA.
  • a further section of the pseudo-ARNA I sequence comprises the ARNA (as) sequence with the nucleotides 64 to 5 located 5 'to the right of the 63 nucleotide sequence 205 and the L27a exon I sequence located 5 'therefrom.
  • Ribosomal proteins are generally known to be one of the oldest proteins in terms of developmental biology and that the genes on which they are based are highly conserved. It is also known from the human ribosomal L27a protein that the mRNA of this protein in carcinoma cells is strongly overexpressed compared to the mRNA of other ribosomal proteins, so that it can be assumed that this protein is involved in an increased cell proliferation (Frigerio et al 1995). Although the gene underlying the pseudo-ARNA I sequence cannot be assigned a clear function at the present time, it can be assumed that it is very likely that it is a pseudogen of the ribosomal L27a gene is. Pseudogenes are found particularly in gene families whose products are often needed.
  • the partial sequence of the ARNA I sequence contained therein is obviously conserved across all species as a putative intron sequence, since this sequence region is also contained in the porcine ARNA I sequence.
  • the pseudo-ARNA I sequence supports the assumption that the ARNA I sequence is the intron sequence of a longer pre-mRNA and is spliced from it in a circular form.
  • the potential generation of a circular ARNA I (s) is shown in FIG. 3.
  • nucleic acid is therefore selected, selected from the group consisting of:
  • a nucleic acid which can be obtained by reverse transcription of total placenta RNA with ARNA I-specific primers, in particular with the nucleotide sequences shown in SEQ ID No. 6 and / or No. 7, or a fragment thereof;
  • nucleic acid comprising at least one nucleotide sequence shown in SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 8, 10, 12 or / and 14;
  • nucleic acid which is complementary to a nucleic acid according to a) to b), in particular a nucleic acid with at least one of the nucleic acids shown in SEQ ID No. 2, 4, 9, 11, 13 or / and 15 set nucleotide sequence, or a fragment thereof;
  • nucleic acid which can be obtained by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases of a nucleic acid according to a) to c);
  • nucleic acid which hybridizes due to the degeneration of the genetic code with a nucleic acid according to a) to d) or a fragment thereof.
  • the nucleic acid can be single-stranded or double-stranded.
  • the nucleic acid can be a DNA sequence, for example part of a genomic DNA sequence or a cDNA sequence, or an RNA sequence, for example a mRNA sequence or a part thereof.
  • a DNA sequence in the RNA sequences shown, the uracil bases marked with U must be replaced by T, that is to say thymine bases, and vice versa.
  • the nucleic acid can be part of a longer native nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid can exist both as a circular and as a linear nucleic acid molecule.
  • the nucleic acids, shown in SEQ ID Nos. 1 to 15, are detected by the invention in both orientations 5 'to 3' and 3 'to 5' and as a sense and anti-sense strand.
  • the nucleic acid can be of natural origin, that is, it can be isolated both extracellularly and intracellularly from cells, tissues or organs of a mammalian organism be of synthetic origin.
  • the nucleic acid can be associated with metal ions, in particular copper, sodium, potassium or calcium ions, and also with proteins, such as calgranulin C or ARP.
  • the invention also encompasses modified nucleic acids which are obtainable, for example, by substitution, addition, inversion and / or deletion of one or more bases of a nucleic acid according to the invention, that is to say also nucleic acids which are referred to as mutants, derivatives or functional equivalents of a nucleic acid according to the invention can.
  • the sequence of the nucleic acids can, for example, be specifically modified in order to provide suitable restriction cleavage sites within the nucleic acid sequence or to remove unnecessary nucleic acid sequences or restriction cleavage sites.
  • the nucleic acids according to the invention are inserted into plasmids and subjected to mutagenesis or a sequence change by recombination using standard microbiology / molecular biology methods.
  • the present invention also encompasses nucleic acids which hybridize with one of the nucleic acids described above according to a) to d).
  • nucleic acid which hybridizes with a nucleic acid according to a) to d) used in connection with the present invention means a nucleic acid which hybridizes under moderately stringent conditions with a nucleic acid according to a) to d).
  • hybridization with a radioactive gene probe in a hybridization solution (25% formamide; 5 x SSPE; 0.1% SDS; 5 x Denhardt's solution; 50 ⁇ g / ml herring sperm DNA; for the composition of the individual components see Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) for 20 hours at 37 ° C.
  • unspecifically bound probe is washed by washing the filter twice in 2 x SSC / 0.1% SDS removed at 42 ° C.
  • the filters are preferably washed with 0.5 x SSC / 0.1% SDS, particularly preferably with 0.1 x SSC / 0.1% SDS at 42 ° C.
  • a model of the secondary structure was modeled from this nucleic acid using the MFOLD program.
  • the MFOLD program version 2 (Zuker 1989; Jaeger et al. 1989; Jaeger et al. 1990) provides information about the structures of nucleic acids with the lowest free enthalpy.
  • models of the secondary structures were created in order to determine possible structural homologies between these nucleic acids and thus to characterize essential functional areas of the nucleic acids.
  • the computer modeling according to the invention of the secondary structure of the human ARNA I (s) sequence shown in FIG. 1 showed that, due to its large number of sequence-complementary regions, this nucleic acid forms a highly symmetrical, double-stranded secondary structure over large sequence sections, in particular by means of two cloverleaf structures is marked.
  • the second cloverleaf structure differs from the first in that it contains the open 5 '-3' end of the nucleic acid molecule.
  • the sequence of the 3 'end of the human ARNA I sequence is complementary to the sequence of the 5' end. This sequence complementarity also made it possible to amplify the human ARNA I sequence with only one primer.
  • a comparison of the secondary structure created with that of other known ARNA sequences showed that all ARNA sequences have the common consensus sequence 5'-CUG-3 ', in particular the sequences shown in SEQ ID No. 12 and 13, each of which only occurs in a sequence orientation and is always in the area of a hairpin loop.
  • the hairpin loop found in the known ARNA sequences presumably represents the binding domain of these ARNA sequences to ARP or calgranulin C or a similar protein.
  • the consensus sequence 5'-CUG-3 'contained in the hairpin loop is located in a sequence section which Has homologies to the sequence of the hammerhead ribozyme.
  • the hammerhead ribozyme is a component of self-splicing, circular, viral RNA molecules that replicate either alone or as a function of helper viruses (Haseloff and Gerlach 1988).
  • the conserved consensus sequence 5'-CUGANGA (N) X GAAAC of the hammerhead ribozyme is partly also in the human ARNA I sequence (sense orientation) (5'-CUG GAU UGA AAA G -3 ', SEQ ID no. 8) included. This indicates that the ARNA I molecule, like the other ARNA molecules, contains in this sequence section, in addition to the protein binding domain, a further functional region which has ribozyme activity.
  • the invention therefore also relates to a nucleic acid which, in its secondary structure, forms a hairpin loop with the consensus sequence 5'-CUG-3 ', in particular with one of the sequences shown in SEQ ID Nos. 12 and 13.
  • the invention further relates to a nucleic acid whose hairpin loop formed in the secondary structure with one of the sequences shown in SEQ ID Nos. 12 and 13 mediates the binding of the nucleic acid to a protein, in particular an angiotropin-related protein molecule.
  • the present invention also relates to a binding domain of nucleic acids, in particular ARNA nucleic acids, for the first time, for binding to proteins, in particular ARP or calgranulin C or similar proteins, which is characterized by the formation of a characteristic hairpin loop with the consensus occurring only in a sequence orientation.
  • Sequence 5'-CUG-3 ' in particular a sequence selected from SEQ ID No. 12 or 13, the latter possibly having a higher specificity for the protein binding domain ARP or Cal C.
  • ARP or calgranulin C or the like Proteins are molecules for the inter- and / or intracellular transport of the various RNA components associated with the angiotropin complex. According to the invention, this offers the possibility of using the angiotropin protein constituent ARP or similar proteins, in particular other S100 proteins, also for RNA molecules, which are not naturally associated with the angiotropin complex, as transport molecules.
  • RNA molecules with enzymatic activity such as, for example, ribozymes, or nucleic acids, for example, RNA molecules, which are the transcription products of genes of potential therapeutic or diagnostic interest.
  • ARNA-specific sequences according to the invention which, under suitable conditions, lead to the formation of a hairpin loop for binding to ARP or calgranulin C or similar proteins, in particular other SlOO proteins, which corresponds to that detected in ARNA sequences.
  • Those nucleic acids which have an ARNA-specific hairpin structure for binding to ARP or similar transport proteins are preferably produced using conventional synthetic or genetic engineering processes (cf. Sambrook et al. 1989).
  • the attached hairpin loop sequence can optionally be modified such that it has a stronger homology to the consensus sequence of hammerhead ribozymes than the hairpin loop of the human ARNA I sequence according to the invention. If the nucleic acid to be transferred should not have any ribozyme activity, the sequence for forming a hairpin loop can be modified in such a way that the nucleotides relevant for the ribozyme activity are exchanged for nucleotides which lead to a blocking of the ribozyme activity. Such sequence modifications can be carried out with the aid of customary genetic engineering methods, for example methods of in vitro mutagenesis.
  • the nucleic acids produced or modified in this way can be specifically introduced into cells and / or tissues that target natural cells. len or target tissue for angiotropin, for example endothelial cells. If the nucleic acids produced or modified in this way are to be introduced specifically into other target cells, other proteins, for example other SlOO proteins, which may have different target cell specificities, are used to form ternary complexes. According to the invention, those proteins which enable binding to the nucleic acid can be used for the association of the nucleic acid with the protein. These can be proteins that have the same binding domain to RNAs as ARP or Cal C.
  • proteins can bind to an RNA which has either the sequence sequence 5 '-CUG-3' or the sequence sequence of SEQ ID No. 12 or SEQ ID No. 13 within a hairpin loop.
  • These proteins can also have additional sequence domains, that is to say different from ARP or Cal C. These further sequence domains can mediate a target cell specificity that differs from ARP and Cal C.
  • the nucleic acid complex formed can dock specifically to the desired cells, penetrate them and then develop the desired activity.
  • the nucleic acid complex formed can be introduced in vivo or in vitro into any eukaryotic cells, cell cultures or tissues, but especially cells and tissues from mammals and birds.
  • nucleic acids or genes are switched off, for example via a ribozyme activity of the introduced nucleic acids, via an anti-sense mechanism or a cosuppression effect. It is also possible to introduce genes which were not previously present in these cells or whose function was impaired in these cells. For example, targeted tumor therapy is possible in that target cells are recognized and combated by these specifically recognizing nucleic acid complexes.
  • the method according to the invention is also particularly suitable for somatic gene therapy. Genes can also be introduced into cells that act as reporter genes, for example in order to label or detect such cells.
  • RNA molecules are generally very sensitive to hydrolysis, which leads to a relatively short half-life of the molecules.
  • efficiency with conventional methods for transfecting RNA molecules was very low.
  • several methods are described in the prior art which can be used to overcome the problems mentioned.
  • a chemical modification of the ribose-phosphate framework can stabilize an RNA so that it shows greater resistance to hydrolysis (Perreault et al., 1991; Yang et al. 1992; Heidenreich et al. 1993), in particular 2 ' -OH groups by other functional groups, for example amino, fluoro-, O-allyl or O-methyl groups can be substituted.
  • RNA molecules can be introduced intracellularly (Akhtar et al. 1991).
  • nucleic acids modified according to the invention Before the nucleic acids modified according to the invention are introduced into target cells, they can therefore optionally be chemically modified by, for example, one or more functional 2'-OH groups of the sugar-phosphate skeleton against other functional groups, for example an amino, Fluoro-, O-allyl or O-methyl group are exchanged to stabilize the nucleic acid.
  • the nucleic acids complexed with metal ions and / or proteins can optionally be introduced into target cells using liposomes in order to improve the efficiency of the transport into the desired target cells.
  • the invention also captures post-transcriptional modifications occurring naturally in cells.
  • the present invention therefore relates to a method for transporting a nucleic acid molecule into eukaryotic cells, cell cultures or tissues, in particular cells and tissues from mammals and birds, in vitro or in vivo, comprising the following steps: - Modification of the nucleic acid molecule to be transported, which is of course not related to the angiotropin complex and / or similar complexes, by adding sequences of a nucleic acid molecule according to the invention which, under suitable conditions, form a hairpin loop with the Consensus sequence 5'-CUG-3 'are suitable;
  • the present invention relates to a method for transporting a nucleic acid molecule into a eukaryotic cell, the protein being an ARP molecule, calgranulin C or a similar protein, in particular a protein having the binding motif of ARP or calgranulin C for the nucleic acid molecule is.
  • metal ions such as Cu 2+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Na + , K + or Zn 2+ ions are used to produce the ternary complex.
  • the modified nucleic acid molecule is a molecule with enzymatic activity.
  • the invention also provides for the ARNA to be specifically labeled for diagnostic purposes.
  • radioactive label with digoxigenin or with fluorescent markers.
  • digoxigenin with digoxigenin or with fluorescent markers.
  • in situ hybridizations can be carried out, which would allow cellular localization of the ARNA after cellular uptake.
  • An ARNA labeled with fluorescent substances can be tracked microscopically both temporally and spatially in cultured cells after their cellular uptake.
  • a particularly preferred embodiment of the present invention therefore sees the use of ARNA-specific sequences, that is to say the nucleic acids according to the invention, in particular sequences which, under suitable conditions, are capable of forming a hairpin structure containing the consensus sequence 5'-CUG-3 ' are for the modification of nucleic acids that are not naturally associated with the angiotropin complex for the production of diagnostics and therapeutic agents.
  • the nucleic acids modified in this way can be used as diagnostics or therapeutic agents for specific cells or tissues by binding them to ARP or calgranulin C or similar transport molecules and introducing them into the target cells to be treated via these transport molecules.
  • diagnostic agents are understood to mean any substances that specifically determine the presence of conditions, Can recognize processes or substances or their absence and in particular can draw conclusions about disease states. Diagnostics often have recognizing and marking functions.
  • therapeutic agents is understood to mean in particular those substances which can be used either prophylactically or accompanying the disease in order to avoid, alleviate or eliminate disease states.
  • diseases are also understood to mean conditions such as unnatural states of mind, pregnancies, signs of aging, developmental disorders or the like.
  • a further preferred embodiment of the present invention therefore provides the use of ARNA-specific sequences, that is to say the nucleic acids according to the invention, in particular sequences which, under suitable 'conditions, form the consensus sequence 5'-CUG-3', in particular a sequence shown in SEQ ID No. 12 or 13 containing hairpin structure are able to isolate proteins which, similar to ARP, can bind to such hairpin structures.
  • Such proteins can be, for example, other representatives of the SlOO proteins, which may have different cell specificities than ARP.
  • the function of the human ARNA I sequence according to the invention was tested in vivo using using the chorioallantoic membrane test on incubated chicken egg.
  • the chorioallantoic membrane test is a simple test system for examining neovascularization processes. An angiogenic effect can easily be demonstrated by the formation of blood vessels.
  • Angiotropin RNA synthesized in vitro was reconstituted with ARP (calgranulin C) and CuCl 2 to a ternary angiotropin complex and applied to the exposed membrane.
  • the reconstituted ternary angiotropin complexes or the in vitro synthesized ARNA I (sense or antisense) sequences had a toxic effect on the chicken embryos over a wide concentration range. Within the non-lethal concentration range, the results of the CAM assays showed an RNA-dependent regulatory mechanism for angiotropin-induced angiogenesis. According to the invention, it was surprisingly found that not only the reconstituted ternary angiotropin complex comprising ARNA I (s) RNA, copper (II) ions and native porcine calgranulin C showed angiogenic activity, but also the ARNA I (s) sequence in combination with copper (II) ions, but without the protein component calgranulin C. It was also surprisingly found that ternary complexes containing ARNA I (antisense) sequences (ARNA I (as)) not only showed no angiogenic activity, but in the test system could even inhibit angiogenesis.
  • the ARNA I (s) sequence is used as an active ingredient for producing a therapeutic agent for inducing angiogenic processes, in particular for wound healing.
  • the ARNA I (s) molecule can be used in transplant surgery in order to accelerate the integration of the transplant through the increased vascularization and to avoid the formation of ischemic necrosis.
  • the ARNA I (s) molecule can be used to induce the neovascularization of coronary arteries. This avoids coronary angioplasty using a balloon catheter or by means of a bypass operation.
  • the ARNA I (s) sequence can be used either in combination with copper (II) ions and calgranulin C or only in combination with copper (II) ions, that is to say without the calgranulin C protein.
  • the ARNA I (as) sequence is used as an active ingredient for producing a therapeutic agent for inhibiting pathogenic angiogenic processes, in particular in the case of hemangiomas or in tumor angiogenesis.
  • the ARNA I (as) sequence is preferably in the form of a ternary complex, that is to say in combination with calgranulin C and copper (II) ions. In a preferred embodiment, this is ternary complex along with potassium and sodium ions.
  • the nucleic acids intended for use as an active ingredient for modulating angiogenic processes can also be chemically modified by, for example, one or more functional 2′-OH groups of the sugar-phosphate structure against other functional groups, for example an amino, fluorine or oxygen group -Allyl or 0-methyl group are exchanged to stabilize the nucleic acid.
  • the nucleic acids complexed with metal ions and / or proteins can also be introduced into the target cells using liposomes in order to improve the efficiency of the transfection.
  • the present invention therefore also relates to a method for inducing angiogenic processes in tissues of a mammalian organism, comprising the following steps:
  • the present invention also relates to a method for inhibiting angiogenic processes in tissues of a mammalian organism, comprising the following steps: - Production of a ternary complex by complexing a nucleic acid molecule according to the invention in antisense orientation with metal ions and optionally a protein in vitro; and
  • the present invention further relates to methods and uses resulting from FIG. 2, by means of which the molecular functions of the RNA component ARNA I associated with the angiotropin complex can be used in the differentiation of endothelial cells to capillary cells in the context of angiogenesis ,
  • the ARNA I (s) sequence present in the native angiotropin is partially complementary to the intron sequence of the pseudo-ARNA I sequence.
  • the antisense transcript of the pseudo-ARNA I gene therefore probably represents the precursor transcript for ARNA I (s).
  • This antisense transcript is transcribed analogously to a pre-mRNA and contains the ARNA I (s) as an intron.
  • ARNA I (s) form, possibly in circular form, is then spliced from this transcript.
  • the potential generation of the ARNA I (s) sequence is shown in FIG. 3.
  • the ARNA I (s) sequence is presumably circular.
  • the complete metallo-RNP complex angiotropin is constituted by association of the ARNA I (s) molecule with ARP and Cu 2+ and / or optionally zinc, calcium, potassium and / or sodium ions. If necessary, this grain plex secretes from the cell, diffuses to the endothelial cells and reaches the interior of the endothelial cells by means of endocytosis or via a receptor. There the single-stranded ARNA I (s) sequence is attached to homologous regions of the pre-mRNA or mRNA of the L27a gene, so that it can no longer function as a transcription template for the synthesis of the ribosomal L27a protein.
  • the nucleic acid molecules according to the invention which in particular enable binding to the mRNA of the L27a gene, for example the sequences of SEQ ID Nos. 1 to 5, 10 and 11 inhibition of the ribosomal L27a protein is a key site.
  • the mRNA of this protein is strongly overexpressed in carcinoma cells compared to the mRNA of other ribosomal proteins, so that there is a direct connection between this protein and an increased cell proliferation.
  • angiotropin complexes comprising ARNA I sequences into these cells.
  • the ARNA I sequences lead to a direct inhibition of L27a translation in the carcinoma cells and thus to an inhibition of the proliferation of these cells.
  • the invention therefore also relates to methods for reducing the proliferation of cells and / or for premature initiation of differentiation of these cells, a nucleic acid molecule of the present invention, in particular a nucleic acid molecule, being shown in one of SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 4 , 5, 10 and / or 11, a vector containing these nucleic acid molecules, a host cell containing these molecules or vectors, a complex containing these nucleic acid molecules and / or an antibody against this complex is introduced into the cell, thereby the Activity and / or expression of the L27a gene or gene product encoded thereby inhibited or reduced, and thus proliferation the cell is reduced or inhibited and, if necessary, the differentiation is initiated prematurely.
  • a nucleic acid molecule of the present invention in particular a nucleic acid molecule, being shown in one of SEQ ID Nos. 1, 2, 3, 4 , 5, 10 and / or 11, a vector containing these nucleic acid molecules, a host cell containing these molecules or vectors, a
  • the cells are strongly proliferating cells, in particular stem cells, tumor cells and cells which, for example, are degenerate due to pathogenic processes and proliferate strongly, but also endothelial cells .
  • the cells are pathologically altered cells, for example cells which arise in psoriasis (type of psoriasis).
  • the cells are nerve cells.
  • a protein in the nucleic acid complex of the aforementioned type which on the one hand binds the nucleic acid molecule but on the other hand also has specificity with regard to the target cell to be transformed.
  • a molecule can be calgranulin C or ARP or a similar protein.
  • a similar protein in connection with the present invention is a protein which enables binding to a nucleic acid molecule of the present invention, in particular of the type defined above, in particular has a binding domain of calgranulin C or ARP to the nucleic acid molecule. According to the invention, this protein has recognition sites which do not allow specific recognition, binding and penetration of specific target cells to be transformed all cells of the treated organism are recorded.
  • the invention also relates to vectors containing a nucleic acid sequence of the present invention, optionally together with regulatory elements, elements which enable replication in a host, elements which enable the selection of cells transformed with the vector or other elements known in the art.
  • the vector can be, for example, a cosmid, phage or plasmid.
  • the invention also relates to host cells containing such vectors.
  • host cells can be bacterial, plant, animal or human cells, for example primate cells, mouse cells, hamster cells or also insect cells.
  • the invention also encompasses nucleic acid complexes comprising at least one nucleic acid molecule of the present invention, either together with at least one metal ion and / or a protein.
  • the protein can be, for example, from the family of SlOO proteins (Dell'Ange lica et al., loc. cit.), in particular a human or porcine calgranulin C or angiotropin-related protein molecule.
  • a S100 protein is understood to mean a protein with two calcium binding motifs, which are referred to as EF hand structures, in particular a protein with an amino acid sequence identity of at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, 97% and 99% to human ARP.
  • Ca 2+ , Cu 2+ , Na + , K + , Zn 2+ or Mg + ions can be used as the metal ion, for example.
  • a nucleic acid complex according to the invention comprising a nucleic acid molecule and a protein or its constituent, for example oligopeptide or polypeptide, is also referred to as a ribonucleotide polypeptide and, if this contains metal ions, as a metal-containing ribonucleotide polypeptide.
  • Such complexes can have chemical, radioactive or fluorescent markings, also with a cytotoxic effect.
  • the invention also relates to antibodies, in particular monoclonal or polyclonal antibodies, which can specifically recognize and bind one of the aforementioned nucleic acid complexes.
  • the invention also relates to diagnostic or pharmaceutical compositions containing at least one of the above-mentioned agents, such agents comprising the nucleic acids, vectors, host cells, nucleic acid according to the invention.
  • agents comprising the nucleic acids, vectors, host cells, nucleic acid according to the invention.
  • compositions also optionally contain additives or auxiliaries, such as pharmaceutically acceptable carriers, colorants, flavorings, sweeteners, thickeners, release agents, acidifying agents, lubricants, preservatives or the like.
  • the pharmaceutical compositions can be used to specifically influence the angiomorphogenesis and the vascular state of a tissue of the body of organisms, to transmit genetic information into cells, to selectively change the nucleic acid content of cells, to induce angiogenic processes and / or to heal wounds Inhibition of angiogenic processes and / or to combat tumors.
  • the nucleic acid complexes according to the invention also have a cell-selective morphogenic effect in vitro on isolated primary and / or cloned blood capillary endothelial cells in culture for the non-mitogenic induction of the change in the cell phenotype from the confluent state or / and for the non-mitogenic change in the spatiotemporal supracellular organization of the cells to three-dimensional ones organoid capillary-like structures in culture.
  • they are specific Chemotropic effect on blood vessels in vivo, suitable for inducing a directional growth of blood vessels in vivo and for inducing neovascularization of tissues through directed ingrowth of blood vessels.
  • compositions provided according to the invention contain, for example, the nucleic acids and / or nucleic acid complexes according to the invention.
  • they can be administered subcutaneously, intracutaneously, intramuscularly or intravenously.
  • the compositions according to the invention can be used topically or systemically.
  • the diagnostic compositions can be used, for example, to diagnose changes in blood vessel growth.
  • nucleic acids, nucleosides or nucleotides for example for deaminating adenosine and deoxiadenosine, for the hydrolysis of inosine and deoxiinosine, for the hydrolysis of guanosine, for deaminating guanine, for the hydrolysis of phosphoric acid diesters, for the hydrolysis of phosphoric acid monoesters, for the hydrolysis of nucleic acid substrates as well as for the production of nucleic acids in vivo and in vitro.
  • the uses according to the invention are were to carry out magnesium 2+ ions.
  • the above-mentioned agents can be used to produce adenosine, deoxiadenosine, guanosine, deoxiguanosine, inosine, adenine, guanine, hypoxanthine or xanthine.
  • the invention relates to the use of the abovementioned agents for the abovementioned purposes, in particular for the prophylaxis or curing of diseases, and to the use of the abovementioned agents for the production of medicaments for achieving the abovementioned purposes, in particular for the prophylaxis or curing of diseases.
  • the invention also relates to the use of SlOO proteins, in particular ARP, calgranulin C, or the nucleic acid complexes of the abovementioned invention as a transport molecule for nucleotide sequences, in particular RNA molecules.
  • FIG. 1 shows the secondary structure of the human ARNA I sequence (antisense) created with the aid of the MFOLD program.
  • FIG. 2 shows in schematic form the mechanism of ARNA I (s) -induced translation inhibition via an antisense mechanism.
  • This antisense Mechanism leads to differentiation of endothelial cells, whereby capillaries are formed.
  • FIG. 3 schematically shows the structure of the pseudo-ARNA I sequence according to the invention (top: sense strand, bottom: anti-sense strand).
  • sequence listing (all sequences are shown in 5 'to 3' orientation) includes:
  • SEQ ID No. 1 shows 42 nucleotides of the human, specific ARNA I sequence which were not detected in the corresponding porcine ARNA I sequence (sense orientation).
  • SEQ ID No. 2 shows 42 nucleotides of the human, specific ARNA-I sequence from SEQ ID No. 1 in anti-sense orientation.
  • SEQ ID No. 3 shows the complete, 205 nucleotide sequence of the human ARNA I sequence, which comprises the 163 nucleotide sequence part, which is identical to the sequence of the porcine ARNA I sequence, in sense orientation.
  • SEQ ID No. 4 shows the complete, 205 nucleotide sequence of the human ARNA I sequence from SEQ ID No. 3 in the anti-sense orientation.
  • SEQ ID No. 5 shows the sequence of the human pseudo-ARNA I sequence (sense orientation) comprising 235 nucleotides, including the ARNA I nucleotides 1 to 63 present at the 5 'end in the anti-sense orientation.
  • SEQ ID No. 6 shows the sequence of the primer ARNA I (forward) used to isolate the human ARNA I sequence.
  • SEQ ID No. 7 shows the sequence of the primer ARNA I (reverse) used to isolate the human ARNA I sequence.
  • SEQ ID No. 8 shows a section of the human ARNA-I sequence (sense orientation) with potential ribozyme activity.
  • SEQ ID No. 9 shows the sequence of SEQ ID No. 8 in anti-sense orientation.
  • SEQ ID No. 10 shows the 63 nucleotides of human ARNA I mentioned in SEQ ID No. 5 in sense orientation.
  • SEQ ID No. 11 shows the 63 nucleotides of human ARNA I mentioned in SEQ ID No. 5 in an anti-sense orientation.
  • SEQ ID No. 12 shows the consensus area located in the hairpin loop area between ARNA I (s) and ARNA II (as) sequences in sense orientation.
  • SEQ ID No. 13 shows the sequence of SEQ ID No. 12 in an anti-sense orientation.
  • SEQ ID No. 14 shows the region of SEQ ID No. 1 with 19 nucleotides with special human specificity in sense orientation.
  • SEQ ID No. 15 shows the 19 nucleotides, particularly human-specific region of SEQ ID No. 2 in an antisense orientation.
  • RNA from human placenta was used using the primer ARNA I (forward) (SEQ ID No. 6), which contains an Eco Rl interface, and the primer ARNA I (reverse) (SEQ ID No. 7), which contains a Barn HI restriction site, subjected to an RT-PCR.
  • the amplification products obtained were cleaved with the restriction enzymes Eco RI and Barn HI and subjected to gel electrophoretic purification on a 2.5% agarose gel. After the fragments had been purified, they were cloned into the vector pUC 19, which had previously been cleaved with Eco RI and Barn HI.
  • sequence of the insertions in the cloning vector was determined. Sequencing was carried out using the Dye Terminator Cycle Sequencing Kit and the ABI PRISM 377A DNA sequencer. The complete and partial sequences of ARNA I (s), ARNA I (as) and pseudo-ARNA I obtained in this way are shown in SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 5 and 8 to 15. In Fi 3, the pseudo-ARNA I sequence is shown schematically. The upper area represents the 5'-3 'orientation of a sense transcript from the pseudo-ARNA I in pre-mRNA form, that is to say the potential L27a exon I and the potential intron, comprising the ARNA I nucleotides No.
  • Nucleotides 50-63 of ARNA I (as) represent a common sequence section between ARNA I (as) and the region of the pseudo-ARNA I transcript that is homologous to the 5 'end of exon II of L27a.
  • the 3 'splice point of the pre-mRNA of L27a or possibly also of the pseudo-ARNA I (s) sequence lies in the area marked with the double arrow.
  • the antisense transcript of the pseudo-ARNA I (lower area) is the corresponding intron area ARNA I (s) 142 to 1 and ARNA I (s) 205 to 143, which serves as a template for the generation of a circular ARNA I (s) - Sequence serves.
  • the potential circularization of this sequence is shown by means of the arrow shown.
  • the arrowhead indicates the position of the 5 'and the arrow end the position of the 3' splice point of ARNA I (s) within the antisense transcript the pseudo-ARNA I sequence.
  • Nucleotides 143-156 of ARNA I (s) can hybridize against this exon from the position of the 3 'splice site of exon II of the mRNA or pre-mRNA of the L27a gene.
  • the cloned ARNA I sequences were used as templates for in vitro RNA synthesis.
  • blunt-end DNA templates were created via PCR, which enabled the subsequent RNA transcript to be terminated in a defined manner.
  • These DNA templates contained a promoter sequence for the T7 RNA polymerase at the 5 'end and the desired DNA sequence whose RNA was to be synthesized at the 3' terminal to the promoter sequence.
  • RNA synthesis was carried out using highly concentrated T7 RNA polymerase according to the method of Milligan and Uhlenbeck (1989), but the RNA synthesis was carried out over 18 h. After synthesis, the RNA was purified using DNase treatment and phenol / chloroform treatment. After the RNA had been purified using microconcentrations from Amicon (optionally also replaced by ethanol filling), the RNA synthesized in this way could be used for the in vitro reconstitution of ternary angiotropin complexes.
  • RNA synthesized in Example 2 was used to reconstitute ternary angiotropin complexes. puts. Intracellularly isolated and purified porcine calgranulin C from porcine granulocytes was used as the protein component. CuCl 2 was also used. Since the concentration ratio between RNA and calgranulin C has not yet been clearly quantified experimentally (Kuhn 1998), the ternary complexes were reconstituted using different concentrations. After a 1 hour incubation at 37 ° C the complexes were diluted 1: 100 with buffer solution.
  • the CAM test was carried out as described by Noll (1998) and Kuhn (1998).
  • FIG. 2 shows schematically the cellular mechanism of the translation inhibition induced by native human ARNA I (s) by means of an antisense mechanism.
  • the ARNA I (s) generated in leucocytes 50 represents the antisense transcript of the Pseudo-ARNA I gene with the ARNA l (s) sequence shown in black as the intron sequence.
  • This intron sequence comprises the complete sequence of ARNA I (s) (SEQ ID No. 3), which is therefore a cellular splice Mechanism is subject.
  • the gene product of the pseudo-ARNA gene is therefore not or not only on the sense strand, but rather on the antisense strand.
  • the antisense transcript is thus the functional transcript of this gene.
  • the antisense transcript of the pseudo-ARNA I gene represents the precursor transcript for ARNA I (s).
  • ARNA I (s) By association of the spliced, presumably circularized ARNA I (s) (15) with ARP 18 and Cu 2+ ions, the complete metallo according to the invention becomes -RNP complex angiotropin 20 constituted. If necessary, the metallo-RNP complex angiotropin (designated 20) is secreted into the extracellular space 30 and diffuses to the endothelial cells 40.
  • the ARNA I (s) 15 hybridizes against the pre-mRNA 60 or mRNA of the L27a gene or directly against the L27a gene at the transcriptional level. This inhibits the synthesis of the ribosomal L27a protein.
  • the aforementioned system can be used as a model system for cell-selective RNA transfer and the stabilization of RNA in antisense and ribozyme strategies.
  • the invention therefore also covers endothelium-specific transfection kits.
  • the invention makes it possible to heal wounds with regard to the ARNA I (s) sequence and the nucleic acid complexes containing them, to heal coronary coronary artery diseases and to carry out improved transplantation surgery.
  • the ARNA I (s) sequence according to the invention and nucleic acid complexes containing them can also be used to induce the growth of nerve cells.
  • the ARNA I (as) sequence and the nucleic acid complexes containing it it is possible to inhibit tumor angiogenesis and to carry out gene therapies for example for hemangiomas.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur Modifikation humaner Angiogenese, wobei die in diesen Verfahren eingesetzten Mittel Nucleinsäuren, Nucleinsäurekomplexe (Angiotropin) oder Antikörper dagegan sein können.

Description

Verfahren und Mittel zur Modifikation humaner Angiogenese
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft RNA-Bestandteile eines Metallo-Ribonucleoprotein-Morphogens aus Leu- kocyten, Verfahren zu deren Herstellung und Charakterisierung sowie diese RNA-Bestandteile aufweisen- de Nucleinsäure-Komplexe und Verfahren zu deren Verwendung, insbesondere Verfahren und Mittel zur Modifikation der Angiogenese und Verfahren und Mittel zur Tumorzellbekämpfung.
Unter Angiogenese versteht man die Ausbildung neuer Blutgefäße durch das Aussprossen von Kapillaren aus einem bereits bestehenden Gefäßsystem (Hertig, 1935) . Die im Rahmen der Angiogenese stattfindende Neovaskularisierung erfolgt in mehreren Teilschritten (Folkman und Shing, 1992) . Dabei wird zunächst die die Blutgefäße umgebende Basalmembran mit Hilfe verschiedener proteolytischer Enzyme, zum Beispiel Kollagenase, abgebaut und zusätzlich wird die extrazelluläre Matrix im perivaskulären Raum fragmentiert. Anschließend erfolgt die Differenzierung der Endothelzelle, wobei sich die Zellmorphologie ändert und damit verbunden Pseudopodien ausgebildet werden. Angiogene Stimuli bewirken, dass die freigelegten Endothelzellen in Richtung eines chemotak- tischen Reizes migrieren. Anschließend erfolgt eine Proliferation der Endothelzellen. Durch die Anei- nanderlagerung der Außenwände einer oder mehrerer Endothelzellen werden neue Gefäßschleifen mit einem kapillarförmigen Lumen ausgebildet. Danach setzt die Synthese einer neuen Basalmembran ein. Sobald zwei Kapillarsprossen an der Spitze miteinander verschmelzen und ein gemeinsames Lumen bilden, ist die Ausbildung eines neuen funktionsfähigen Kapillarsystems abgeschlossen und der Blutfluss kann einsetzen. Unter nicht-pathologischen Bedingungen treten beim erwachsenen Mann, abgesehen von der Wundheilung, nahezu keine angiogenetischen Prozesse auf, so dass sich das Endothel nur wenige Male im Leben erneuert. Bei der erwachsenen Frau ist die Situation jedoch völlig anders, da insbesondere im Rahmen des Menstruationszykluses, das heißt während der Ovulation, der Reifung des Corpus luteum und des Aufbaus des Endometriums, bis zur Menopause an- giogenetische Prozesse stattfinden. Während der Schwangerschaft tritt Angiogenese verstärkt auf, insbesondere bei der Plazentabildung und der Lakto- genese in den Mammae (Hertig, 1935) .
Neben der physiologisch essentiellen Angiogenese gibt es auch eine Vielzahl pathologischer angioge- netischer Prozesse (Folkman, 1995a). Zu diesen gehören beispielsweise die diabetische Retinopathie, die verschiedenen Formen von rheumatoider Arthritis und die Ausbildung von Hämangiomen. Diese pathologischen Prozesse werden dadurch verursacht, dass angiogenetisch stimulierende Faktoren, wie zum Beispiel Metalloproteasen, gegenüber ihren Inhibitoren, beispielsweise TIMP (tissue inhibitor of me- talloproteases) , im Überschuss vorliegen. Durch gezielte Inhibition einzelner Angiogenese-Faktoren versucht man solche pathologischen angiogenetischen Prozesse zu inhibieren (Adamis et al . , 1996). Ein Spezialfall der pathogenen Angiogenese stellt die Tumorangiogenese dar (Folkman 1971, Folkman 1995b). Beim Tumorwachstum sezernieren die Tumorzellen selbst angiogene Faktoren, die chemotaktisch die Aussprossung neuer Blutgefäße in Richtung des Tumors induzieren. Durch eine erhöhte Anzahl von Blutgefäßen kann der Tumor verstärkt mit lebensnotwendigen Nährstoffen und Sauerstoff versorgt werden. Dies hat wiederum ein verstärktes Tumorwachs- turn zur Folge. Ein zur Zeit rasch expandierendes Forschungsgebiet innerhalb der Tumorforschung stellt daher die Anti-Angiogenese-Forschung dar. Auch hier wird nach Faktoren gesucht, die die Tumorangiogenese und damit auch gleichzeitig das Tumor- Wachstum inhibieren (Folkman 1995a, Folkman 1995b).
Von Angiotropin, einem aus ischämischen Herzmuskelgewebe, Wundflüssigkeit und den Überständen serumfreier Massenkulturen Lektin-stimulierter porciner Leucozyten isolierten Metallo-Ribonucleoprotein- Morphogen, ist bekannt, dass es ein Mediator angio- genetischer Prozesse ist (Wissler und Renner 1981, Wissler 1982, Wissler 1984). Die angiogenetische Wirksamkeit von Angiotropin wurde mit Hilfe üblicher in vivo- und in vitro-Testsysteme nachgewie- sen. So konnte beispielsweise mittels eines Tests an Corioallantois-Membranen des Hühnerembryos (CAM- Test) gezeigt werden, dass nach Verabreichung von Angiotropin eine verstärkte Kapillarisierung in dieser Membran erfolgte (Wissler 1982, Noll 1998, Kuhn 1998). Eine verstärkte Vaskularisierung wurde auch bei der intradermalen Injektion von Angiotropin am Kaninchenohr beobachtet (Höckel et al . 1984, Höckel 1988). Im Endothelzell-Test konnten nach Verabreichung von Angiotropin zeit- und dosisabhängige Änderungen der Zellmorphologie von ursprünglich kontaktinhibierten konfluenten Endothelzellen beobachtet werden, wobei diese Änderungen in drei Stufen erfolgten (Höckel et al . 1986, Höckel 1988, Noll 1998) . Im Stadium I, das heißt innerhalb von zwei bis drei Tagen, nahmen die ursprünglich flachen polygonalen Endothelzellen eine abgerundete, bipolare, parallel orientierte Form an. Dabei bil- deten sich in verstärktem Maße Pseudopodien und Va- cuolen aus. Im Stadium II, das heißt nach etwa etwa vier bis sieben Tagen, waren lange bipolare Cy- toplasma-Ausläufer mit tubulären Strukturen zu beobachten, die sich spatial organisierten. Innerhalb der Endothelzellen waren dabei eine oder zwei große transparente Vakuolen mit beweglichen Granula vorhanden. Wenn die Endothelzellen weiterhin mit Angi- otropin-haltigem Medium stimuliert wurden, gingen sie in Stadium III über. Dabei verschwanden die Va- kuolen und es traten unregelmäßig geformte Partikel außerhalb des Zellkörpers und der Pseudopodien auf. Wurden Endothelzellen im Stadium II mit neuem Medium, das kein Angiotropin enthielt, weiterkultiviert, bildeten sich die zellmorphologischen Verän- derungen nach 24 Stunden zurück, bis die Zellen wieder ihr ursprüngliches Erscheinungsbild zeigten.
Anhand dieser Tests zeigte sich, dass Angiotropin eine reversible Veränderung der Zellmorphologie und damit des Phänotyps von Endothelzellen bewirkte. Von Bedeutung ist fernerhin, dass Angiotropin keine mitogene Wirkung auf Endothelzell-Kulturen ausübte und daher nur eine Differenzierung, jedoch keine Proliferation der Endothelzellen induzierte (Höckel et al. 1986, Höckel et al . 1987, Höckel 1988).
Ferner wurde gezeigt, dass Angiotropin die Migration von Endothelzellen stimulierte, nicht jedoch die Migration von 3T3-Fibroblasten (Höckel et al . 1987, Höckel 1988). Das heißt, dass Angiotropin eine spezifische Wirkung auf Endothelzellen ausübt. Des weiteren konnte nachgewiesen werden, dass Angiotropin eine Nuclease-Aktivität aufweist und bei in vitro-Translations-Assays die Translation inhibieren kann (Seibt 1998, Noll 1998) .
Bei Angiotropin handelt es sich um einen metallhaltigen Ribonucleotidpolypeptid (RNP) -Komplex, der extrazellulär isoliert werden konnte. Als Metallio- nen konnten Kupfer-, Calcium-, Natrium- und -Kaliumionen nachgewiesen werden (Wissler et al., 1986). Das Kupferion liegt darin vermutlich in zweiwertiger Form vor (Kuhn et al., 1996, Kuhn 1998). Die Sequenzierung des Protein-Bestandteils ARP (Angi- otropin related protein) ergab, dass dieser zu 100% homolog zu Calgranulin C ist (Kuhn 1998) . Das Protein gehört zur Familie der SlOO-Proteine und wurde bereits ohne RNA-Komponente aus Schweine- Granulocyten isoliert, in denen es 8% des gesamten cytosolischen Proteins bildet (Dell 'Angelica et al., 1994) . Es handelt sich um ein Protein mit 91 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 10614 Dalton. Wie andere SlOO-Proteine besitzt auch Calgranulin C zwei als EF-Handstrukturen bekannte Calcium-Bindungsmotive (Kretsinger 1980, Isobe et al. 1981; Moncrief et al . 1990; Klingman & Hilt 1988; Schäfer & Heizmann 1996) . Die DE 196 28 895 AI beschreibt biologisch aktive metallhaltige, insbesondere Kupfer-, Zink- oder Calcium-haltige Ribonucleopolypeptide (RNPs) als nicht-mitogene Morphogene für Blutgefäße definier- ter Primärstruktur sowie Verfahren zur Herstellung und Gewinnung dieser RNPs . Insbesondere werden eine Teilsequenz der porcinen Angiotropin-RNA-Sequenz sowie die Aminosäuresequenz des Proteinbestandteils beschrieben.
Die DE 198 10 998 Cl beschreibt Sequenzen des RNA- Bestandteils (ARNA) von porcinem Angiotropin, insbesondere die Sequenzen ARNA II, ARNA III, ARNA IV und ARNA V.
Die DE 198 11 047 Cl beschreibt weitere mit porci- nem Angiotropin assoziierte RNA-Sequenzen, insbesondere die ARNA I-Sequenz und die ARNA Vl-Sequenz.
Die im Stand der Technik bekannten Dokumente offenbaren ausschließlich RNA-Sequenzen, die mit Angiotropin vom Schwein assoziiert sind. Angesichts der experimentell nachgewiesenen Bedeutung von Angiotropin für die Angiogenese im Säugerorganismus, insbesondere hinsichtlich der Verwendung dieses Morphogens zur gezielten Modulation pathogener an- giogenetischer Prozesse beim Menschen, beispiels- weise zur Behandlung humaner Krankheiten, ist es jedoch wünschenswert, die RNA-Sequenzen von humanem Angiotropin zu isolieren und zu charakterisieren. Darüber hinaus geben die im Stand der Technik bekannten Druckschriften keinerlei Einblicke in die molekularen Mechanismen, die der angiogenetischen Aktivität von Angiotropin zugrunde liegen. Insbe- sondere ist nicht bekannt, welche Funktion speziell der RNA-Bestandteil besitzt. Gerade im Hinblick auf eine humanmedizinische Anwendung von Angiotropin ist es jedoch wünschenswert, diese molekularen Me- chanismen genau zu verstehen, um die angiogeneti- sche Aktivität von Angiotropin gezielt modulieren zu können, das heißt je nach Bedarf zu induzieren beziehungsweise zu verstärken oder aber zu inhibieren.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht also darin, Verfahren und Mittel zur Isolierung und Charakterisierung von RNA-Sequenzen für humanes Angiotropin sowie auf diesen Verfahren und Mitteln basierende weitere Verfahren und Mittel bereitzustellen, mit deren Hilfe insbesondere im menschlichen Körper physiologisch erwünschte Angiogenese-Prozesse, beispielsweise bei der Wundheilung, gezielt induziert oder verstärkt werden können oder aber pathologische An- giogenese-Prozesse, beispielsweise bei der diabeti- schen Retinopathie oder bei der Tumorbildung, gezielt inhibiert werden können.
Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung der Lehre gemäß des Hauptan- spruchs, insbesondere durch ein Nucleinsäuremole- kül, das als funktionaler Bestandteil eines biologisch aktiven Metallo-Ribonucleoprotein-Komplexes geeignet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :
a) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta- Gesamt-RNA mit ARNA I-spezifischen Primern insbesondere mit den in SEQ ID Nr. 6 und/oder 7 dargestellten Primern, und einem Fragment davon;
b) einem Nucleinsäuremolekül, das mindestens eine der in SEQ ID Nr. 1 bis 5 und 8 bis 15 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst und einem Fragment davon;
c) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nuc- leinsäuremoleküls nach a) bis b) ;
d) einem Nucleinsäuremolekül, das mit einem Nucleinsäuremolekül nach a) bis c) und einem Fragment davon hybridisiert, und
e) einem Nucleinsäuremolekül, das zu einem Nucleinsäuremolekül nach a) bis b) komplementär ist, und einem Fragment davon.
Die Erfindung löst dieses Problem auch durch die Bereitstellung von diese Nucleinsäuremoleküle ent- haltenen Nucleinsäurekomplexen, die das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit mindestens einem Metallion, das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit mindestens einem Metallion und mindestens einem Protein (hier auch als metallhal- tige Ribonucleotidpolypeptide bezeichnet) oder das erfindungsgemäße Nucleinsäuremolekül zusammen mit einem Protein enthalten (hier auch als Ribonucleotidpolypeptide bezeichnet) . Derartige Nucleinsäure- Komplexe, insbesondere metallhaltige Ribonucleotid- polypeptide, sind für eine Vielzahl von diagnosti- schen und therapeutischen Anwendungen in hervorragender Weise geeignet.
Erfindungsgemäß wurde das technische Problem in bevorzugter Ausführungsform gelöst, indem die mit hu- manem Angiotropin assoziierte humane RNA-Sequenz ARNA I mit Hilfe des RT-PCR-Verfahrens unter Verwendung der porcinen Primer ARNA I (forward) und ARNA I (reverse) aus der Gesamt-RNA von humaner Plazenta, einem angiogenetisch äußerst aktivem Ge- webe, isoliert wurde. Diese humane ARNA-I-Sequenz enthält neben einem Sequenzabschnitt , der hinsichtlich seiner Länge und seiner Sequenz identisch mit der porcinen ARNA I-Sequenz ist, einen 42 Nucleoti- de umfassenden Sequenzabschnitt, der in der porci- nen ARNA I-Sequenz nicht nachgewiesen wurde. Mit Hilfe des MFOLD-Programms wurde ein Computermodell der Sekundärstruktur der humanen ARNA I-Sequenz erstellt und mit der Sekundärstruktur aller bekannten ARNA-Sequenzen einschließlich der porcinen ARNA- Sequenzen verglichen. Anhand dieses Vergleichs wurde gezeigt, dass alle ARNA-Sequenzen die gemeinsame Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' aufweisen, die jeweils nur in einer Sequenzorientierung auftritt und sich immer im Bereich einer Haarnadelschleife befindet. Diese bei allen bekannten ARNA-Sequenzen gefundene Haarnadelschleife stellt, ohne durch die Theorie gebunden zu sein, möglicherweise die Bindungsdomäne dieser ARNA-Sequenzen an ARP oder Calgranulin C dar, was darauf hinweist, dass dieses Protein ein zelluläres Transportmolekül für verschiedene, mit dem Angiotropin-Komplex assoziierte RNA-Moleküle ist. Diese anhand der computersimulierten Sekundärstruktur nachgewiesene Haarnadelschleife mit der Konsensussequenz 5'-CUG-3', insbesondere der Sequenz gemäß der SEQ ID Nr. 12 und/oder 13, bietet erfindungsgemäß einerseits die Möglichkeit, den An- giotropin-Proteinbestandteil ARP auch als Trans- portmolekül für andere RNA-Sequenzen zu verwenden, die natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin- Komplex assoziiert sind. Um beispielsweise RNA- Sequenzen mit ribozymatischer Aktivität in Zielzellen des Angiotropin-Komplexes, zum Beispiel Endo- thelzellen, einzuführen, werden diese RNA-Sequenzen unter Verwendung bekannter Verfahren der Gentechnik mit den Sequenzen, die bei den ARNA-Sequenzen diese Haarnadelschleife bilden, versehen und dann werden unter Verwendung dieser RNA-Sequenzen, des ARP- Bestandteils und von Metall-Ionen in vitro ternäre Komplexe gebildet, die in die zu behandelnden Zellen eingeführt werden. Andererseits bietet die nachgewiesene Haarnadelschleife der ARNA-Sequenzen erfindungsgemäß die Möglichkeit, unter Verwendung der sie enthaltenden erfindungsgemäßen Nucleinsäu- ren weitere Proteine, beispielsweise andere SlOO- Proteine, zu isolieren, die ähnlich wie ARP an solche Haarnadel-Strukturen binden können und als potentielle Transportmoleküle für ARNA-Sequenzen be- ziehungsweise für erfindungsgemäß modifizierte Nuc- leinsäuren, die natürlicherweise nicht mit dem An- giotropin-Komplex assoziiert sind, verwendet werden können .
Unter Verwendung von in vitro synthetisierten ARNA I-Sequenzen, CuCl2 und des Proteinbestandteils ARP wurden in bevorzugter Ausführungsform erfindungsgemäß ternäre Angiotropin-Komplexe, also metallhaltige Ribonucleotidproteine in vitro rekonstituiert und mit Hilfe des Corioallantois-Membran (CAM) - Tests am bebrüteten Hühnerei hinsichtlich ihrer angiogenetischen Aktivität in vivo getestet. Dabei zeigte sich, dass die rekonstituierten ternären An- giotropin-Komplexe beziehungsweise die in vitro synthetisierten ARNA I (Sense- beziehungsweise An- tisense-) -Sequenzen über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg auf die untersuchten Hühnerembryonen toxisch wirkten. Innerhalb des nicht-lethalen Konzentrationsbereichs zeigten die Ergebnisse der CAM-Assays insgesamt einen RNA-abhängigen Regulationsmechanismus der Angiotropin-induzierten Angiogenese. Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, dass nicht nur der rekonstituierte ternäre Angiotropin-Komplex aus ARNA I (Sense oder Sinn)-RNA (ARNA I(s)), Kupfer ( II ) -Ionen und nativem porcinen Calgranulin C angiogenetische Aktivität zeigte, sondern auch die nur mit Kupfer (II ) -Ionen kombinierte ARNA I (s ) -Sequenz . Das heißt, für die angiogenetische Aktivität des Angiotropin-Komplexes ist der Proteinbestandteil Calgranulin C nicht erforderlich. Ebenso überraschend wurde festgestellt, dass mit der ARNA I (Antisense oder Antisinn) - Sequenz (ARNA I(as)) rekonstituierte ternäre Kom- plexe nicht nur keine angiogenetische Wirksamkeit zeigten, sondern im Testsystem sogar angiogenetische Prozesse hemmen konnten. Erfindungsgemäß ist daher in einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehen, die humane ARNA I(s) -Sequenz als Wirkstoff für ein Therapeutikum zur Induzierung der Angiogenese, beispielsweise im Rahmen der Wundheilung, zu verwenden, während in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die humane ARNA I (as) -Sequenz als Wirkstoff für ein Therapeutikum zur Hemmung patho- gener angiogenetischer Prozesse, insbesondere von Tumorangiogenese, eingesetzt werden kann. In beiden vorgenannten Ausführungsformen kann die erfindungsgemäße ARNA I(s) oder (as) -Sequenz zusammen mit Me- tallionen und/oder Proteinen, zum Beispiel Calgranulin C, beziehungsweise dessen Bestandteilen, eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird erstmals eine mit humanem Angiotropin assoziierbare Nucleinsäure bereitge- stellt, bei der es sich um die humane ARNA I- Sequenz handelt. Die humane ARNA I-Sequenz wurde erfindungsgemäß aus einer humanen Plazenta-Gesamt- RNA mittels des RT-PCR-Verfahrens unter Verwendung der für die porcine ARNA I-Sequenz spezifischen Primer ARNA I (forward) (SEQ ID Nr. 6) und ARNA I (reverse) (SEQ ID Nr. 7) isoliert und cloniert. Dabei wurde neben der humanen ARNA I-Sequenz (SEQ ID Nr. 3 beziehungsweise 4) eine zweite, als humane Pseudo-ARNA-I-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) bezeichnete Sequenz isoliert und cloniert.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter ARNA-Sequenzen Nucleinsäuren, insbesondere RNAs, verstanden, die extrazellulär isoliert werden können und in nativer Form unter geeigneten Bedingungen zusammen mit einem Protein, insbesondere ARP (Angiotropin related protein) oder Calgranulin C oder ähnlichen Proteinen, und Metall-Ionen, insbesondere Kupfer-, Calcium-, Natrium- oder Kalium-Ionen, einen ternären Komplex, insbesondere ei- nen Angiotropin-Komplex, bilden, der angiogenetische Aktivität besitzt. Unter einer ARNA I-Sequenz wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eine Nucleinsäure, insbesondere eine RNA, verstanden, die bei Verfahren zur Aufreinigung von Angiotropin, beispielsweise unter Verwendung von Lek- tin-induzierten Schweine-Leukocyten als Ausgangsma- terial, nach verschiedenen Reinigungsschritten als einzige der bekannten ARNA-Sequenzen in der nach dem letzten Reinigungsschritt erhaltenen Fraktion, die noch angiogenetische Aktivität aufweist, spezifisch angereichert vorliegt und von der deshalb an- genommen wird, das sie die RNA-Form ist, die in den Angiotropin-Komplex eingebaut wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „angiogenetische Aktivität", dass eine Substanz die Fähigkeit aufweist, die Aus- bildung neuer Blutgefäße durch das Aussprossen von Kapillaren aus einem bereits bestehenden Gefäßsystem zu induzieren oder zu verstärken.
Bei der Sequenzierung der humanen ARNA I-Sequenz wurde erfindungsgemäß festgestellt, dass sie einen Sequenzabschnitt enthält, der bezüglich seiner Länge und seiner Sequenz vollkommen identisch mit der aus Lektin-stimulierten Schweine-Leukocyten isolierten porcinen ARNA I-Sequenz ist. Die humane ARNA I-Sequenz enthält darüber hinaus einen human- spezifischen 42 Nucleotide umfassenden Abschnitt, der in der porcinen Sequenz nicht nachgewiesen wurde und in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Die ersten 19 Nucleotide dieser 42 Nucleotide weisen besondere Humanspezifität auf und sind in beiden Orientie- rungen in SEQ ID Nr. 14 und 15 dargestellt. Da die identifizierte humane ARNA I-Sequenz am 3' -Ende keinen Poly(A)-Tail enthielt, konnte nicht ermit- telt werden, in welcher Orientierung die native Sequenz intra- oder extrazellulär vorliegt. Die nachstehend beschriebenen Sinn- beziehungsweise Anti- sinn-Orientierungen der humanen ARNA I-Sequenz wur- den daher willkürlich festgelegt. SEQ ID Nr. 2 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 in Antisinn- Orientierung . Die vollständige Nucleotidsequenz des humanen ARNA I-Moleküls in Sinn-Orientierung ist in SEQ ID Nr. 3 dargestellt, während SEQ ID Nr. 4 die vollständige Sequenz in Antisinn-Orientierung zeigt. Der 42 Nucleotide in Sinn-Orientierung umfassende Bereich (SEQ ID Nr. 1) befindet sich am 3 '-Bereich der humanen ARNA-I-Sequenz (SEQ ID Nr. 3, Position 164 bis 205) .
Eine Analyse der humanen ARNA I-Sequenz ergab, dass sie ausschließlich mit dem porcinen ARNA I (forward) -Primer amplifiziert wurde, was sich am besten dadurch erklären lässt, dass es sich bei der ursprünglich amplifizierten Nucleinsäuresequenz um ein circuläres Molekül handelt. Einen weiteren Hinweis darauf, dass es sich bei der ursprünglich amplifizierten Nucleinsäure um ein circuläres Molekül handelt, liefert die erfindungsgemäß identifizierte humane ARNA I-Nucleotidsequenz selbst. Die Sequenz ihres 5' -Endes und die Sequenz ihres 3'- Endes sind komplementär zueinander, dass heißt, die Sequenzen des 5' -Endes und des 3' -Endes können sich unter geeigneten Bedingungen aneinanderlagern und somit zu einer Circularisierung des Moleküls füh- ren. Es ist bekannt, dass bei der Prozessierung von prä-mRNAs circuläre RNAs erhalten werden können (Padgett et al . 1984; Reed und Maniatis 1985). Dabei werden die darin enthaltenen Introns in Form von Lariaten gespleißt. Die isolierte humane ARNA I-Sequenz stellt daher mit großer Wahrscheinlichkeit die Intronsequenz einer längeren prä-mRNA dar.
Unterstützt wird diese Vermutung durch die zweite isolierte Nucleinsäuresequenz, die humane Pseudo- ARNA I-Sequenz. Wie Untersuchungen von Sequenzübereinstimmungen zeigten, besteht diese erfindungsgemäße Nucleinsäure, bei der es sich vermutlich um eine prä-mRNA oder ein Teilstück einer größeren prä-mRNA handelt, aus zwei unterschiedlichen Abschnitten und ist in SEQ ID Nr. 5 sowie schematisch in Figur 3 dargestellt. Bei diesen beiden Abschnitte der Pseudo-ARNA I-Sequenz handelt es sich wahrscheinlich um Intron- (ARNA I(as)) und Exon-(L27a Exon II ) Sequenzen . Der 5' gelegene Abschnitt der Pseudo-ARNA I-Sequenz (SEQ ID Nr. 5) umfasst die ersten 63 Nucleotide (SEQ ID Nr. 11) des 5' -Endes der humanen ARNA I ( Antisinn) -Sequenz (SEQ ID Nr. 4), denen sich die Sequenz des zweiten Exons der RNA des humanen ribosomalen L27a-Proteins und ein Poly(A)-Tail am 3' -Ende anschließen. Die ersten (das heißt 5' gelegenen) 23 Nucleotide der genannten 63 Nucleotide entsprechen den ersten 23 Nucleo- tiden der porcinen ARNA I(s) Sequenz. Dies ist auf die Selbstkomplementarität des 5'- und 3 ' -Endes der humanen ARNA I(as) zurückzuführen. Gleiches gilt für die ARNA I(s). Die Nucleotide 43 bis 49 (jeweils einschließlich) sind Bestandteile der Intronsequenz der Pseudo-ARNA-I-Sequenz . Dabei stellen die 19 Nucleotide 24 bis 42 (jeweils einschließlich) der genannten 63 Nucleotide der humanen ARNA I (as) -Sequenz die human-spezifische Antisinn- Nucleotidsequenz in SEQ ID Nr. 2 dar. Überraschen- derweise sind die letzten (das heißt 3' gelegenen Positionen 50 bis 63 in SEQ ID Nr. 4 oder 11) 14 Nucleotide (also: 5'-GCU AAC AAA GUU UU-3' ) des 63 Nucleotide langen ARNA I (as) -Sequenzabschnittes (SEQ ID Nr. 11) innerhalb der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz homolog zu einem Teilabschnitt des zweiten Exons der prä-mRNA des humanen ribosomalen L27a-Proteins . Dieser 14 Nucleotide umfassende Abschnitt der ARNA I (as) -Sequenz könnte daher Be- standteil der 3' -Spleiß-Stelle dieser prä-mRNA sein .
Ein weiterer, in SEQ ID Nr. 5 nicht dargestellter, Abschnitt der Pseudo-ARNA I-Sequenz umfasst die in Figur 3 dargestellten 5'-wärts von der 63 Nucleoti- de umfassenden Sequenz gelegene ARNA (as) -Sequenz mit den Nucleotiden 64 bis 205 und die wiederum 5' davon gelegene L27a Exon I-Sequenz.
Von ribosomalen Proteinen ist allgemein bekannt, dass diese entwicklungsbiologisch zu den ältesten Proteinen gehören und dass die ihnen zu Grunde liegenden Gene hochkonserviert sind. Vom humanen ribosomalen L27a-Protein ist außerdem bekannt, dass die mRNA dieses Proteins in Karzinomzellen gegenüber der mRNA anderer ribosomaler Proteine stark übe- rexprimiert wird, so dass zu vermuten ist, dass dieses Protein an einer verstärkten Zellprolifera- tion beteiligt ist (Frigerio et al. 1995). Obwohl dem der Pseudo-ARNA I-Sequenz zu Grunde liegenden Gen zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine eindeutige Funktion zugeordnet werden kann, kann man davon ausgehen, dass es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um ein Pseudogen des ribosomalen L27a-Gens handelt. Pseudogene sind insbesondere bei Genfamilien anzutreffen, deren Produkte häufig benötigt werden. Bei der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz ist weiterhin bemerkenswert, dass die darin enthaltende Teilsequenz der ARNA I-Sequenz als mutmaßliche Intron-Sequenz offensichtlich spezies-übergreifend konserviert ist, da dieser Sequenzbereich ebenfalls in der porcinen ARNA I-Sequenz enthalten ist. Durch die Pseudo-ARNA I-Sequenz wird die Vermutung unter- mauert, dass die ARNA I-Sequenz die Intronsequenz einer längeren prä-mRNA ist und daraus in circulä- rer Form gespleißt wird. Die potentielle Generierung einer zirkulären ARNA I(s) ist in Figur 3 dargestellt .
Erfindungsgemäß wird also eine, vorzugsweise isolierte und vollständig gereinigte, Nucleinsäure bereitgestellt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus :
a) einer Nucleinsäure, die erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta-Gesamt-RNA mit ARNA I-spezifischen Primern insbesondere mit den in SEQ ID Nr. 6 und/oder Nr. 7 dargestellten Nucleotidsequenzen, oder einem Fragment davon;
b) einer Nucleinsäure, die mindestens eine in SEQ ID Nr. 1, 3, 5, 8, 10, 12 oder/und 14 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst;
c) einer Nucleinsäure, die zu einer Nucleinsäure nach a) bis b) komplementär ist, insbesondere einer Nucleinsäure mit mindestens einer der in SEQ ID Nr. 2, 4, 9, 11, 13 oder/und 15 darge- stellten Nucleotidsequenz, oder einem Fragment davon;
d) einer Nucleinsäure, die erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Dele- tion einer oder mehrerer Basen einer Nucleinsäure nach a) bis c) ; und
e) einer Nucleinsäure, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes mit einer Nucleinsäure nach a) bis d) oder einem Fragment davon hybridisiert.
Die Nucleinsäure kann sowohl einzelsträngig als auch doppelsträngig vorliegen.
Die Nucleinsäure kann eine DNA-Sequenz, zum Beispiel Teil einer genomischen DNA-Sequenz oder eine cDNA-Sequenz, oder eine RNA-Sequenz, zum Beispiel eine mRNA-Sequenz oder ein Teil davon, sein. Im Falle einer DNA-Sequenz sind bei dargestellten RNA- Sequenzen die mit U gekennzeichneten Uracilbasen durch T, also Thyminbasen, auszutauschen und umge- kehrt. Die Nucleinsäure kann Teil eines längeren nativen Nucleinsäuremoleküls sein. Die Nucleinsäure kann sowohl als circuläres als auch als lineares Nucleinsäuremolekül vorliegen. Die Nucleinsäuren, dargestellt in den SEQ ID Nr. 1 bis 15, werden von der Erfindung in beiden Orientierungen 5' zu 3' und 3' zu 5' sowie als Sinn- und Antisinn-Strang er- fasst. Die Nucleinsäure kann sowohl natürlichen Ursprungs sein, das heißt, sie kann sowohl extra- als auch intrazellulär aus Zellen, Geweben oder Organen eines Säugerorganismus isoliert werden, als auch synthetischen Ursprungs sein. Außerdem kann die Nucleinsäure sowohl mit Metall-Ionen, insbesondere Kupfer-, Natrium-, Kalium- oder Calcium-Ionen, als auch mit Proteinen, wie Calgranulin C oder ARP, as- soziiert vorliegen.
Die Erfindung umfasst auch modifizierte Nucleinsäu- ren, die beispielsweise durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure erhältlich sind, das heißt also auch Nucleinsäuren, die als Mutanten, Derivate oder funktioneilen Äquivalente einer erfindungsgemäßen Nucleinsäure bezeichnet werden können. Die Sequenz der Nucleinsäuren kann beispielsweise gezielt modifiziert werden, um innerhalb der Nucleinsäuresequenz geeignete Restriktions-Schnittstellen bereitzustellen oder nicht erforderliche Nucleinsäuresequenzen oder Restriktions-Schnittstellen zu entfernen. Dabei werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren in Plas- miden inseriert und mittels Standardverfahren der Mikrobiologie/Molekularbiologie einer Mutagenese oder einer Sequenzveränderung durch Rekombination unterzogen. Zur Erzeugung von Insertionen, Deletio- nen oder Substitutionen, wie Transitionen und Transversionen, sind beispielsweise Verfahren zur in vitro-Mutagenese, "primer repair"-Verfahren sowie Restriktions- und/oder Ligationsverfahren geeignet (vgl. Sambrook et al., 1989, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). Sequenzveränderungen lassen sich auch durch Anlagerung natürlicher oder synthetischer Nucleinsäuresequenzen erreichen. Beispiele für synthetische Nucleinsäure- Sequenzen sind Adaptoren oder Linker, die u.a. auch zur Verknüpfung von Nucleinsäure-Fragmenten an diese Fragmente angefügt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleinsäu- ren, die mit einer der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuren nach a) bis d) hybridisieren. Der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Ausdruck "Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäure nach a) bis d) hybridisiert" bedeutet eine Nucleinsäure, die unter mäßig stringenten Bedingungen mit einer Nucleinsäure nach a) bis d) hybridisiert. Beispielsweise kann die Hybridisierung mit einer radioaktiven Gensonde in einer Hybridisie- rungslösung (25% Formamid; 5 x SSPE; 0,1% SDS; 5 x Denhardt-Lösung; 50 μg/ml Heringsperma-DNA; bezüglich Zusammensetzung der Einzelkomponenten vgl. Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) 20 Stunden bei 37°C erfol- gen. Anschließend wird unspezifisch gebundene Sonde durch mehrfaches Waschen der Filter in 2 x SSC/0,1% SDS bei 42°C entfernt. Vorzugsweise werden die Filter mit 0,5 x SSC/0,1% SDS, besonders bevorzugt mit 0,1 x SSC/0,1% SDS bei 42°C gewaschen.
Zur Charakterisierung der erfindungsgemäß identifizierten humanen ARNA I-Sequenz wurde von dieser Nucleinsäure unter Verwendung des MFOLD-Programms ein Modell der Sekundärstruktur modelliert. Das MFOLD-Programm, Version 2 (Zuker 1989; Jaeger et al. 1989; Jaeger et al. 1990) liefert Aussagen über die Strukturen von Nucleinsäuren mit der geringsten freien Enthalpie. Ebenso wurden von allen bekannten ARNA-Sequenzen einschließlich der bekannten porcinen ARNA-Sequenzen Modelle der Sekundärstrukturen erstellt, um mögliche Strukturhomologien zwischen diesen Nucleinsäuren zu bestimmen und somit wesent- liehe funktioneile Bereiche der Nucleinsäuren zu charakterisieren .
Die erfindungsgemäß vorgenommene Computer- Modellierung der in Figur 1 dargestellten Sekundärstruktur der humanen ARNA I(s) -Sequenz zeigte, dass diese Nucleinsäure aufgrund ihrer Vielzahl von sequenzkomplementären Bereichen eine hochsymmetrische, über weite Sequenzabschnitte hinweg dop- pelsträngige Sekundärstruktur bildet, die insbesondere durch zwei Kleeblattstrukturen gekennzeichnet ist. Wie aus Figur 1 ersichtlich, unterscheidet sich die zweite Kleeblattstruktur von der ersten dadurch, dass sie das offene 5' -3' -Ende des Nuc- leinsäuremoleküls enthält. Aus der Figur 1 ist e- benfalls ersichtlich, dass, wie vorstehend be- schrieben, die Sequenz des 3' -Endes der humanen ARNA I-Sequenz komplementär zur Sequenz des 5' -Endes ist. Diese Sequenzkomplementarität ermöglichte auch die Amplifikation der humanen ARNA I-Sequenz mit nur einem Primer.
Ein Vergleich der erstellten Sekundärstruktur mit denen anderer bekannter ARNA-Sequenzen zeigte, dass alle ARNA-Sequenzen die gemeinsame Konsensus- Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere die in SEQ ID Nr. 12 und 13 gezeigten Sequenzen aufweisen, die je- weils nur in einer Sequenzorientierung auftritt und sich immer im Bereich einer Haarnadelschleife befindet. Diese bei allen Sekundärstrukturmodellen der bekannten ARNA-Sequenzen gefundene Haarnadelschleife stellt vermutlich die Bindungsdomäne dieser ARNA-Sequenzen an ARP oder Calgranulin C oder ein ähnliches Protein dar. Die in der Haarnadel- schleife enthaltene Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' befindet sich in einem Sequenzabschnitt, der Homologien zur Sequenz des Hammerhead-Ribozyms aufweist. Das Hammerhead-Ribozym ist Bestandteil sich selbstspleißender, circulärer, viraler RNA-Moleküle, die sich entweder allein oder in Abhängigkeit von Helfer-Viren replizieren (Haseloff und Gerlach 1988) . Die konservierte Konsensus-Sequenz 5'- CUGANGA (N) XGAAAC des Hammerhead-Ribozyms ist teilweise auch in der humanen ARNA I-Sequenz (Sinnori- entierung) (5'-CUG GAU UGA AAA G -3', SEQ ID Nr. 8) enthalten. Das deutet darauf hin, dass das ARNA I- Molekül, wie auch die anderen ARNA-Moleküle, in diesem Sequenzabschnitt neben der Proteinbindungsdomäne einen weiteren funktionellen Bereich ent- hält, der ribozymatische Aktivität besitzt.
Die Erfindung betrifft daher auch eine Nucleinsäure, die in ihrer Sekundärstruktur eine Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere mit einer der in SEQ ID Nr. 12 und 13 ge- zeigten Sequenzen ausbildet. Die Erfindung betrifft ferner eine Nucleinsäure, deren in der Sekundärstruktur ausgebildete Haarnadelschleife mit einer der in SEQ ID Nr. 12 und 13 gezeigten Sequenzen die Bindung der Nucleinsäure an ein Protein, insbeson- dere ein Angiotropin related protein-Molekül vermittelt . Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine erstmalig nachgewiesene Bindungsdomäne von Nucleinsäuren, insbesondere ARNA-Nucleinsäuren, zur Bindung an Proteine, insbesondere ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine, die gekennzeichnet ist durch die Ausbildung einer charakteristischen Haarnadelschleife mit der jeweils nur in einer Sequenzorientierung auftretenden Konsensus-Sequenz 5'-CUG- 3' , insbesondere einer Sequenz ausgewählt aus SEQ ID Nr. 12 oder 13, wobei letztere gegebenenfalls eine höhere Spezifität zur Proteinbindungsdomäne ARP beziehungsweise Cal C aufweisen.
Die Tatsache, dass die vorstehend beschriebene Haarnadelschleife der ARNA-Sequenzen, also die ver- mutliche Bindungsdomäne an ARP oder Calgranulin C oder ein ähnliches Protein, in der Sekundärstruktur unterschiedlicher ARNA-Sequenzen vorhanden ist, weist darauf hin, dass ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine Moleküle für den inter- und/oder intrazellulären Transport der verschiedenen, mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten RNA- Bestandteile sind. Dies bietet erfindungsgemäß die Möglichkeit, den Angiotropin-Proteinbestandteil ARP oder ähnliche Proteine, insbesondere andere S100- Proteine, auch für RNA-Moleküle, die natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex assoziiert sind, als Transportmoleküle zu nutzen.
Erfindungsgemäß können RNA-Moleküle mit enzymati- scher Aktivität, wie zum Beispiel Ribozyme, oder Nucleinsäuren, beispielsweise RNA-Moleküle, die die Transkriptionsprodukte von Genen von potentiellem therapeutischem oder diagnostischem Interesse dar- stellen, mit den erfindungsgemäßen ARNA- spezifischen Sequenzen versehen werden, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife zur Bindung an ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Proteine, insbesondere andere SlOO- Proteine, führen, die der bei ARNA-Sequenzen nachgewiesenen entspricht. Vorzugsweise werden solche Nucleinsäuren, die eine ARNA-spezifische Haarnadelstruktur zur Bindung an ARP oder ähnliche Trans- portproteine aufweisen, unter Verwendung herkömmlicher synthetischer oder gentechnischer Verfahren (vgl. Sambrook et al. 1989) hergestellt. Soll die zu transferierende Nucleinsäure ribozymatische Aktivität aufweisen, kann die angelagerte Haarnadel- schleifen-Sequenz gegebenenfalls so modifiziert werden, dass sie eine stärkere Homologie zur Konsensus-Sequenz von Hammerhead-Ribozymen als die erfindungsgemäße Haarnadelschleife der humanen ARNA I-Sequenz aufweist. Soll die zu transferierende Nucleinsäure keine ribozymatische Aktivität aufweisen, kann die Sequenz zur Ausbildung einer Haarnadelschleife so modifiziert werden, dass die für die Ribozym-Aktivität relevanten Nucleotide gegen Nucleotide ausgetauscht werden, die zu einer Blockie- rung der Ribozym-Aktivität führen. Solche Sequenzmodifikationen können mit Hilfe üblicher gentechnischer Verfahren, beispielsweise Verfahren der in vitro-Mutagenese, erfolgen.
Nach Bildung eines ternären Komplexes mit ARP und Metall-Ionen, beispielsweise Kupfer-Ionen, können die so hergestellten beziehungsweise modifizierten Nucleinsäuren gezielt in solche Zellen und/oder Gewebe eingeschleust werden, die natürliche Zielzel- len oder Zielgewebe für Angiotropin darstellen, zum Beispiel Endothelzellen. Sollen die so hergestellten beziehungsweise modifizierten Nucleinsäuren spezifisch in andere Zielzellen eingeführt werden, werden zur Bildung ternärer Komplexe andere Proteine, beispielsweise andere SlOO-Proteine, verwendet, die gegebenenfalls andere Zielzell-Spezifitäten aufweisen. Erfindungsgemäß können für die Assoziation der Nucleinsäure mit dem Protein solche Prote- ine verwendet werden, die eine Bindung an die Nucleinsäure ermöglichen. Dies können Proteine sein, die dieselbe Bindungsdomäne an RNAs wie ARP oder Cal C besitzen. Diese Proteine können an eine RNA binden, die innerhalb einer Haarnadelschleife ent- weder die Sequenzabfolge 5 ' -CUG-3 ' oder die Sequenzabfolge der SEQ ID Nr. 12 oder der SEQ ID Nr. 13 aufweist. Diese Proteine können noch zusätzliche, das heißt von ARP beziehungsweise Cal C verschiedene Sequenzdomänen aufweisen. Diese weiteren Sequenzdomänen können eine von ARP und Cal C abweichende Zielzellspezifität vermitteln.
Aufgrund dieser gezielt modifizierten Zielzellspe- zifität kann der gebildete Nucleinsäurekomplex spezifisch an die jeweils gewünschten Zellen andocken, in diese penetrieren und anschließend die gewünschte Aktivität entfalten. Der gebildete Nucleinsäurekomplex kann in vivo oder in vitro in beliebige eu- karyontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, insbesondere jedoch Zellen und Gewebe von Säugern und Vögeln, eingeschleust werden.
Nach Einführung solcher modifizierten Nucleinsäuren können in den Zellen beispielsweise spezifische Nucleinsäuren oder Gene ausgeschaltet werden, zum Beispiel über eine ribozymatische Aktivität der eingeschleusten Nucleinsäuren, über einen Anti- sense-Mechanismus oder einen Cosuppressions-Effekt . Es können auch Gene eingeführt werden, die vorher in diesen Zellen nicht vorhanden waren beziehungsweise deren Funktion in diesen Zellen gestört war. So ist zum Beispiel eine gezielte Tumortherapie' möglich, indem Zielzellen durch diese spezifisch erkennende Nucleinsäurekomplexe erkannt und bekämpft werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eig- -net sich insbesondere auch zur somatischen Gentherapie. Ebenso können auch Gene in Zellen eingeführt, die als Reporter-Gene fungieren, beispiels- weise um solche Zellen zu markieren oder nachzuweisen .
Dem therapeutischen Einsatz von Ribozymen standen in der Vergangenheit prinzipiell zwei Probleme gegenüber. Zum einen sind RNA-Moleküle allgemein sehr Hydrolyse-empfindlich, was zu einer relativ kurzen Halbwertszeit der Moleküle führt. Zum anderen war in der Vergangenheit die Effizienz bei herkömmlichen Verfahren zur Transfektion von RNA-Molekülen sehr gering. Im Stand der Technik sind jedoch meh- rere Verfahren beschrieben, mit deren Hilfe die genannten Probleme überwunden werden können. Beispielsweise kann durch eine chemische Modifikation des Ribose-Phosphat-Gerüstes eine RNA so stabilisiert werden, dass sie gegenüber Hydrolyse größere Resistenz zeigt (Perreault et al., 1991; Yang et al. 1992; Heidenreich et al. 1993), wobei insbesondere 2' -OH-Gruppen durch andere funktionelle Gruppen, beispielsweise Amino-, Fluoro-, O-Allyl- oder O-Methylgruppen substituiert werden. Die Effizienz der Transfektion von RNAs kann beispielsweise dadurch erhöht werden, dass die Transfektion über Li- posomen vermittelt wird, insbesondere solche, die kationische Lipide und neutrale Phospholipide umfassen (Feigner et al. 1993). Mit Hilfe solcher Li- posomen können RNA-Moleküle intrazellulär eingeschleust werden (Akhtar et al . 1991).
Bevor die erfindungsgemäß modifizierten Nucleinsäu- ren in Zielzellen eingeführt werden, können sie daher gegebenenfalls chemisch modifiziert werden, indem beispielsweise eine oder mehrere funktioneile 2 ' -OH-Gruppen des Zucker-Phosphat-Gerüsts gegen andere funktionelle Gruppen, beispielsweise eine Ami- no-, Fluoro-, O-Allyl- oder O-Methylgruppe ausgetauscht werden, um die Nucleinsäure zu stabilisieren. Die mit Metall-Ionen und/oder Proteinen kom- plexierten Nucleinsäuren können gegebenenfalls unter Verwendung von Liposomen in Zielzellen einge- führt werden, um die Effizienz des Transports in die gewünschten Zielzellen zu verbessern. Selbstverständlich erfasst die Erfindung auch natürlicherweise in Zellen stattfindende posttranskriptio- nale Modifikationen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zum Transport eines Nucleinsäuremoleküls in eukaryontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, insbesondere Zellen und Gewebe von Säugern und Vögeln, in vitro oder in vivo umfassend die folgenden Schritte: - Modifikation des zu transportierenden Nucleinsäu- remoleküls, das natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex und/oder ähnlichen Komplexen im Zusammenhang steht, durch Anlagerung von Se- quenzen eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremole- küls, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarnadel-schleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' geeignet sind;
- Herstellung eines ternären Komplexes durch in vitro Zugabe von Metall-Ionen und mindestens einem Protein zu dem modifizierten Nucleinsäuremolekül;
- Applikation des hergestellten ternären Komplexes auf Zellen oder Gewebe, in die das modifizierte Nucleinsäuremolekül eingebracht werden soll.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transport eines Nucleinsäuremoleküls in eine eukaryontische Zelle, wobei das Protein ein ARP-Molekül, Calgranu- lin C oder ein ähnliches Protein, insbesondere ein das Bindemotiv von ARP oder Calgranulin C für das Nucleinsäuremolekül aufweisendes Protein ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden zur Herstellung des ternären Komplexes Metallionen wie Cu2+-, Mg2+-, Ca2+-, Na+-, K+- oder Zn2+-Ionen verwendet. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das modifizierte Nucleinsäuremolekül ein Molekül mit enzymatischer Aktivität . Erfindungsgemäß ist ferner vorgesehen, die ARNA für diagnostische Zwecke spezifisch zu markieren. Dies kann beispielsweise mit einem radioaktiven Label, mit Digoxigenin oder mit fluoreszierenden Markern erfolgen. Mittels radioaktiv und Digoxigenin markierter ARNA können beispielsweise in situ Hybridisierungen durchgeführt werden, die eine zelluläre Lokalisation der ARNA nach der zellulären Aufnahme ermöglichen würden. Eine mit fluoreszierenden Sub- stanzen markierte ARNA kann beispielsweise in kultivierten Zellen nach deren zellulärer Aufnahme mikroskopisch sowohl zeitlich als auch räumlich verfolgt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vor- liegenden Erfindung sieht daher die Verwendung von ARNA-spezifischen Sequenzen, also der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, insbesondere Sequenzen, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer die Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' enthaltenden Haar- nadelstruktur fähig sind, zur Modifikation von natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten Nucleinsäuren zur Herstellung von Di- agnostika und Therapeutika vor. Die so modifizierten Nucleinsäuren lassen sich als Diagnostika oder Therapeutika für spezifische Zellen oder Gewebe verwenden, indem sie an ARP oder Calgranulin C oder ähnliche Transportmoleküle gebunden und über diese Transportmoleküle in die zu behandelnden Zielzellen eingeschleust werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Diagnostika beliebige Stoffe verstanden, die spezifisch das Vorhandensein von Zuständen, Prozessen oder Substanzen beziehungsweise deren Abwesenheit erkennen können und insbesondere Rückschlüsse auf Krankheitszustände geben können. Diagnostika weisen häufig erkennende und markierende Funktionen auf.
Unter dem Begriff Therapeutika werden insbesondere solche Stoffe verstanden, die entweder prophylaktisch oder krankheitsbegleitend eingesetzt werden können, um Krankheitszustände zu vermeiden, zu lin- dern oder zu beseitigen.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Krankheiten auch Zustände wie unnatürliche Gemütszustände, Schwangerschaften, Alterserscheinungen, Entwicklungsstörungen oder ähnliches verstanden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sieht daher die Verwendung von ARNA-spezifischen Sequenzen, also der erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, insbesondere Sequenzen, die unter geeigneten 'Bedingungen zur Ausbildung einer die Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere eine Sequenz dargestellt in SEQ ID Nr. 12 oder 13, enthaltenden Haarnadelstruktur fähig sind, zur Isolierung von Proteinen vor, die ähnlich wie ARP an solche Haarnadel-Strukturen binden können. Bei solchen Proteinen kann es sich beispielsweise um andere Vertreter der SlOO-Proteine handeln, die gegebenenfalls andere Zellspezifitäten aufweisen als ARP.
Erfindungsgemäß wurde die Funktion der erfindungs- gemäßen humanen ARNA I-Sequenz in vivo unter Ver- wendung des Chorioallantois-Membran-Tests am bebrüteten Hühnerei bestimmt. Der Chorioallantois- Membran-Test stellt ein einfaches Testsystem zur Untersuchung von Neovaskularisierungs-Prozessen dar. Eine angiogenetische Wirkung lässt sich anhand der Ausbildung von Blutgefäßen leicht nachweisen. In vitro synthetisierte Angiotropin-RNA wurde mit ARP (Calgranulin C) und CuCl2 zu einem ternären Angiotropin-Komplex rekonstituiert und auf die frei- gelegte Membran appliziert. Dabei zeigte sich, dass die rekonstituierten ternären Angiotropin-Komplexe beziehungsweise die in vitro synthetisierten ARNA I (Sense- beziehungsweise Antisense-) -Sequenzen über einen weiten Konzentrationsbereich hinweg auf die Hühnerembryonen toxisch wirkten. Innerhalb des nicht-letalen Konzentrationsbereichs zeigten die Ergebnisse der CAM-Assays insgesamt einen RNA- abhängigen Regulationsmechanismus der Angiotropin- induzierten Angiogenese. Erfindungsgemäß wurde ü- berraschenderweise festgestellt, dass nicht nur der rekonstituierte ternäre Angiotropin-Komplex aus ARNA I(s)-RNA, Kupfer ( II ) -Ionen und nativem porcinen Calgranulin C angiogenetische Aktivität zeigte, sondern auch die ARNA I(s) -Sequenz in Kombination mit Kupfer ( II) -Ionen, jedoch ohne den Proteinbestandteil Calgranulin C. Ebenso überraschend wurde festgestellt, dass ARNA I (Antisense) -Sequenzen (ARNA I(as)) enthaltende ternäre Komplexe nicht nur keine angiogenetische Wirksamkeit zeigten, sondern im Testsystem sogar die Angiogenese hemmen konnten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist daher vorgesehen, die erfindungsgemä- ße ARNA I-Sequenz als Wirkstoff zur Modulation an- giogenetischer Prozesse einzusetzen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ARNA I(s) -Sequenz als Wirkstoff zur Herstellung eines Therapeutikums zur Induzierung angiogenetische Prozesse, insbesondere zur Wundheilung, verwendet. In einer vorteilhaften Ausgestaltung kann das ARNA I(s) -Molekül in der Transplantationschirurgie eingesetzt werden, um durch die verstärkte Vaskularisierung die Integration des Transplantats zu beschleunigen und die Bildung i- schämischer Nekrosen zu vermeiden. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das ARNA I(s)- Molekül zur Induzierung der Neovaskularisierung von Herzkranzgefäßen verwendet werden. Dadurch läßt sich eine Coronarangioplastie unter Verwendung eines Ballonkatheders oder mittels einer Bypass- Operation vermeiden. Erfindungsgemäß kann die ARNA I(s) -Sequenz entweder in Kombination mit Kup- fer (II ) -Ionen und Calgranulin C oder nur in Kombination mit Kupfer (II ) -Ionen, das heißt ohne das Protein Calgranulin C, eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die ARNA I (as) -Sequenz als Wirkstoff zur Herstellung eines Therapeutikums zur Hemmung pathogener angiogenetischer Prozesse, insbesondere bei Hämangiomen oder bei der Tumorangiogenese, verwendet. Vorzugsweise liegt die ARNA I (as ) -Sequenz in Form eines ternären Komplexes, das heißt in Kom- bination mit Calgranulin C und Kupfer (II ) -Ionen, vor. In bevorzugter Ausführungsform liegt dieser ternäre Komplex zusammen mit Kalium- und Natriumionen vor.
Erfindungsgemäß können die zur Verwendung als Wirkstoff zur Modulierung angiogenetischer Prozesse vorgesehenen Nucleinsäuren auch chemisch modifiziert werden, indem beispielsweise ein oder mehrere funktionelle 2' -OH-Gruppen des Zucker-Phosphat- Gerüsts gegen andere funktionelle Gruppen, beispielsweise eine Amino-, Fluoro-, O-Allyl- oder 0- Methylgruppe ausgetauscht werden, um die Nucleinsäure zu stabilisieren. Gegebenenfalls können die mit Metall-Ionen und/oder Proteinen komplexierten Nucleinsäuren auch unter Verwendung von Liposomen in die Zielzellen eingeführt werden, um die Effi- zienz der Transfektion zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Induzierung angiogenetischer Prozesse in Geweben eines Säugerorganismus, umfassend die folgenden Schritte:
- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom- plexierung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure- moleküls in Sinn-Orientierung mit Metall-Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen der angiogenetische Prozess induziert werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Hemmung angiogenetischer Prozesse in Geweben eines Säugerorganismus, umfassend die fol- genden Schritte: - Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom- plexierung eines erfindungsgemäßen Nucleinsäure- moleküls in Antisinn-Orientierung mit Metall- Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen ein angiogenetischer Prozess gehemmt werden soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin sich aus Figur 2 ergebene Verfahren und Verwendungen, mittels derer die molekularen Funktionen des mit dem Angiotropin-Komplex assoziierten RNA-Bestand- teils ARNA I bei der Differenzierung von Endothelzellen zu kapillaren Zellen im Rahmen der Angioge- nese genutzt werden können.
Die im nativen Angiotropin vorliegende ARNA I(s)- Sequenz ist partiell komplementär zur Intronsequenz der Pseudo-ARNA-I-Sequenz . Das Antisinn- Transkript des Pseudo-ARNA I-Gens stellt daher wohl das Vorläufertranskript für die ARNA I(s) dar. Dieses Antisinn-Transkript wird analog einer prä-mRNA transkribiert und enthält die ARNA I(s) als Intron. Aus diesem Transkript wird dann ARNA I(s)-Form, gegebenenfalls in circulärer Form, gespleißt. Die po- tentielle Generierung der ARNA I(s) -Sequenz ist in Figur 3 dargestellt. Die ARNA I(s) -Sequenz liegt vermutlich circulär vor. Durch Assoziation des ARNA I (s) -Moleküls mit ARP und Cu2+- und/oder gegebenenfalls Zink-, Calcium-, Kalium- und/oder Natrium- Ionen wird der vollständige Metallo-RNP-Komplex Angiotropin konstituiert. Bei Bedarf wird dieser Korn- plex aus der Zelle sezerniert, diffundiert zu den Endothelzellen und gelangt mittels Endocytose oder über einen Rezeptor in das Zellinnere der Endothelzellen. Dort lagert sich die einsträngige ARNA I(s) -Sequenz an homologe Bereiche der prä-mRNA beziehungsweise mRNA des L27a-Gens, so dass diese nicht mehr als Transkriptionsmatrize zur Synthese des ribosomalen L27a-Proteins fungieren kann. Da außerdem in der Proteinbindungsdomäne des ARNA I (s) -Moleküls ein zur Konsensus-Sequenz der Ham- merhead-Ribozyme homologer Sequenzabschnitt identifiziert wurde, könnte zudem eine sequenzspezifische Hydrolyse der prä-mRNA beziehungsweise mRNA des L27a-Gens erfolgen. Auch dies hätte zur Folge, dass die Synthese des ribosomalen L27a-Proteins unterbrochen wird. Da sich ohne das L27a-Protein jedoch keine funktionsfähigen Ribosomen konstituieren können, führt dies zur vollständigen Inhibition der gesamten zellulären Translation. Dies wiederum be- wirkt, dass Endothelzellen nicht mehr prolifieren könnten. Dass Angiotropin die Proliferation von Endothelzellen hemmt, wurde experimentell nachgewiesen (Höckel et al . 1987; Noll 1998). Sobald kein Angiotropin mehr in den Zellen vorhanden ist, kann deren Proliferation wieder stattfinden, so dass dieser Prozess reversibel ist. Die durch die Hemmung der zellulären Translation erzwungene Umstellung des Stoffwechsels der Zelle führt dann zu der experimentell nachgewiesenen Differenzierung von Endothelzellen zu kapillaren Zellen.
In der erfindungsgemäß vorgesehenen Verfahrensweise zur Angiotropin-induzierten Differenzierung von Zellen, insbesondere stark proliferierenden Zellen, wie Tumorzellen und Stammzellen, aber auch Endothelzellen und Nervenzellen, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Molekülen, die insbesondere eine Bindung an die mRNA des L27a-Gens ermöglichen, zum Beispiel die Sequenzen der SEQ ID Nr. 1 bis 5, 10 und 11, nimmt die Inhibition des ribosomalen L27a-Proteins eine Schlüsselstelle ein. Wie vorstehend erwähnt, wird die mRNA dieses Proteins in Karzinomzellen gegenüber der mRNA anderer ribosomaler Proteine stark überexprimiert, so dass ein direkter Zusammenhang zwischen diesem Protein und einer verstärkten Zeilproliferation besteht. Erfindungsgemäß besteht daher die Möglichkeit, Karzinomzellen direkt zu behandeln, indem ARNA I- Sequenzen umfassende Angiotropin-Komplexe in diese Zellen eingeschleust werden. Die ARNA I-Sequenzen führen in den Karzinomzellen zu einer direkten Hemmung der L27a-Translation und damit zu einer Hemmung der Proliferation dieser Zellen.
Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Reduktion der Proliferation von Zellen und/oder zur vorzeitigen Einleitung der Differenzierung dieser Zellen, wobei ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein Nucleinsäuremo- lekül dargestellt in einer der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 10 und/oder 11, ein diese Nucleinsäuremolekü- le enthaltener Vektor, ein diese Moleküle oder Vektoren enthaltene Wirtszelle, eine diese Nucleinsäu- remoleküle enthaltender Komplex und/oder ein Anti- körper gegen diesen Komplex in die Zelle eingeschleust wird, dabei die Aktivität und/oder Expression des L27a-Gens oder davon codierten Genproduktes gehemmt oder reduziert und so die Proliferation der Zelle reduziert oder gehemmt wird sowie gegebenenfalls dadurch eine vorzeitige Einleitung der Differenzierung erfolgt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens han- delt es sich also bei den Zellen um stark prolife- rierende Zellen, insbesondere Stammzellen, Tumorzellen und Zellen, die zum Beispiel aufgrund patho- gener Prozesse degeneriert sind und stark prolife- rieren, aber auch um Endothelzellen. In einer wei- teren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Zellen um krankhaft veränderte Zellen, beispielsweise um Zellen, die bei der Schuppenflechte ( Psoriasis-Formenkreis) entstehen. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den Zellen um Nervenzellen.
In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es vorgesehen, in dem Nucleinsäure- komplex der vorgenannten Art ein Protein einzusetzen, welches einerseits das Nucleinsäuremolekül bindet, andererseits aber auch Spezifität im Hinblick auf die zu transformierende Zielzelle aufweist. Ein solches Molekül kann Calgranulin C oder ARP oder ein ähnliches Protein sein. Ein ähnliches Protein im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfin- düng ist ein Protein, welches eine Bindung an ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, insbesondere der vorstehend definierten Art ermöglicht, insbesondere eine Bindungsdomäne von Calgranulin C oder ARP an das Nucleinsäuremolekül auf- weist. Dieses Protein weist erfindungsgemäß Erkennungsstellen auf, die eine spezifische Erkennung, Bindung und Penetration von bestimmten zu transformierenden Zielzellen ermöglicht, so dass nicht sämtliche Zellen des behandelten Organismus erfasst werden. Aufgrund der durch diese Bindungs- und Erkennungsstellen des Proteins vermittelten Spezifi- tät ist es möglich, einzelne Zelltypen in einem Or- ganismus gezielt den erfindungsgemäß erzielten Effekten auszusetzen, das heißt beispielsweise diese Zellen mittels der erfindungsgemäß vorgesehenen Wirkung dosisabhängig entweder zu töten oder die Proliferation zu unterbinden und die Differenzie- rung einzuleiten.
Die Erfindung betrifft auch Vektoren, enthaltend eine Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit regulatorischen Elementen, Elementen, die die Replikation in einem Wirt ermöglichen, Elementen, die die Selektion mit dem Vektor transformierter Zellen ermöglichen oder sonstigen im Stand der Technik bekannten Elementen. Erfindungsgemäß kann der Vektor zum Beispiel ein Cosmid, Phage oder Plasmid sein.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die derartige Vektoren enthalten. Derartige Wirtszellen können bakterielle, pflanzliche, tierische oder menschliche Zellen sein, zum Beispiel Primatenzellen, Mauszellen, Hamsterzellen oder auch Insekten- zellen.
Wie vorstehend erläutert, erfasst die Erfindung auch Nucleinsäurekomplexe, umfassend mindestens ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, entweder zusammen mit mindestens einem Metallion und/oder einem Protein. Das Protein kann beispielsweise aus der Familie der SlOO-Proteine (Dell'Ange- lica et al., a.a.O.) stammen, insbesondere ein humanes oder porcines Calgranulin C oder Angiotropin- related-Proteinmolekül sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem S100- Protein ein Protein mit zwei Calciumbindungsmotiven verstanden, die als EF-Handstrukturen bezeichnet werden, insbesondere ein Protein mit einer Aminosäuresequenzidentität von mindestens 50 %, mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, min- destens 90 % und bevorzugt mindestens 95 %, 97 % und 99 % zu humanem ARP. Als Metallion können beispielsweise Ca2+-, Cu2+-, Na+-, K+-, Zn2+ oder Mg+- Ionen verwendet werden.
Ein erfindungsgemäßer Nucleinsäurekomplex umfassend ein Nucleinsäuremolekül und ein Protein oder dessen Bestandteil, zum Beispiel Oligopeptid oder Polypep- tid, wird auch als Ribonucleotidpolypeptid und, wenn dieser Metallionen enthält, als metallhaltiges Ribonucleotidpolypeptid bezeichnet. Derartige Kom- plexe können chemische, radioaktive oder fluores- zente Markierungen, auch mit cytotoxischer Wirkung, aufweisen .
Die Erfindung betrifft auch Antikörper, insbesondere monoclonale oder polyclonale Antikörper, die spezifisch einen der vorgenannten Nucleinsäure- Komplexe erkennen und binden können.
Die Erfindung betrifft auch mindestens eins der vorstehend genannten Agenzien enthaltende diagnostische oder pharmazeutische Zusammensetzungen, wo- bei derartige Agenzien die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren, Vektoren, Wirtszellen, Nucleinsäure- Komplexe oder Antikörper sein können. Diese Zusammensetzungen weisen weiterhin gegebenenfalls Zusatz- oder Hilfsstoffe, wie pharmazeutisch verträgliche Träger, Farbstoffe, Aromastoffe, Süßungsmit- tel, Verdickungsmittel, Trennmittel, Säuerungsmittel, Gleitmittel, Konservierungsmittel oder ähnliches auf. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur spezifischen Beeinflussung der Angio- morphogenese und des vaskulären Zustands eines Ge- webes des Körpers von Organismen, zur Übertragung genetischer Informationen in Zellen, zur selektiven Veränderung des Nucleinsäuregehaltes von Zellen, zur Induzierung angiogenetischer Prozesse und/oder zur Wundheilung, zur Hemmung angiogenetischer Pro- zesse und/oder zur Bekämpfung von Tumoren eingesetzt werden. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die vorstehend genannten Agenzien zur zellselektiven reversiblen Inhibierung der Proteinbiosynthese, zum Beispiel in Endothelzellen, zur Inhibierung von Blutendothelzellen, zur spezifischen in vivo oder in vitro Beeinflussung der Blutgefäßbildung, insbesondere bei Herz- und Gefäßerkrankungen, in der Transplantationschirurgie oder zur Inhibition des Wachstums von Tumoren ebenso wie in der Wundheilung einzusetzen. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäure- komplexe weisen auch eine zellselektive morphogene Wirkung in vitro auf isolierte primäre und/oder clonierte Blutkapillarendothelzellen in Kultur zur nichtmitogenen Induktion der Änderung des Zellphä- notyps aus dem konfluenten Zustand oder/und zur nichtmitogenen Änderung der spatiotemporalen suprazellulären Organisation der Zellen zu dreidimensionalen organoiden kapillarähnlichen Strukturen in Kultur auf. Schließlich sind sie zur spezifischen chemotropischen Wirkung auf Blutgefäße in vivo, zur Induktion eines Richtungswachstums von Blutgefäßen in vivo und zur Induktion einer Neovaskualisierung von Geweben durch gerichtetes Einwachsen von Blut- gefäßen geeignet.
Die erfindungsgemäß vorgesehenen diagnostischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten zum Beispiel die erfindungsgemäßen Nucleinsäuren und/oder Nucleinsäurekomplexe . Sie können bei- spielsweise subkutan, intrakutan, intramuskulär o- der intravenös appliziert werden. Es sind jedoch selbstverständlich auch weitere im Stand der Technik gebräuchliche Applikationsmöglichkeiten einsetzbar. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen topisch oder systemisch eingesetzt werden.
Die diagnostischen Zusammensetzungen können zum Beispiel zur Diagnose von Veränderungen des Blutgefäßwachstums eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die vorstehend genannten Agenzien zur Strukturanalyse von Nucleinsäuren, Nucleosiden oder Nucleotiden einzusetzen, zum Beispiel zur Deaminierung von Adenosin und Deo- xiadenosin, zur Hydrolyse von Inosin und Deoxiino- sin, zur Hydrolyse von Guanosin, zur Deaminierung von Guanin, zur Hydrolyse von Phosphorsäurediestern, zur Hydrolyse von Phosphorsäuremonoes- tern, zur Hydrolyse von Nucleinsäuresubstraten e- benso wie zur Herstellung von Nucleinsäuren in vivo und in vitro. Gegebenenfalls kann vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Verwendungen auch in Gegen- wart von Magnesium2+-Ionen durchzuführen. Insbesondere kann erfindungsgemäß mit den vorstehend genannten Agenzien die Herstellung von Adenosin, De- soxiadenosin, Guanosin, Desoxiguanosin, Inosin, Adenin, Guanin, Hypoxanthin oder Xanthin durchgeführt werden.
Die Erfindung betrifft die Verwendung der vorstehend genannten Agenzien für die vorstehend genannten Zwecke, insbesondere zur Prophylaxe oder Hei- lung von Erkrankungen ebenso wie die Verwendung der vorstehend genannten Agenzien zur Herstellung von Arzneimitteln zur Erzielung der genannten Zwecke, insbesondere zur Prophylaxe oder Heilung von Krankheiten .
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von SlOO-Proteinen, insbesondere ARP, Calgranulin C, oder der Nucleinsäure-Komplexe der vorgenannten Erfindung als Transportmolekül für Nucleotidsequen- zen, insbesondere RNA-Moleküle.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung .
Figur 1 zeigt die mit Hilfe des MFOLD-Programms er- stellte Sekundärstruktur der humanen ARNA I-Sequenz (Antisinn) .
Figur 2 zeigt in schematischer Form den Mechanismus der ARNA I ( s) -induzierten Translationsinhibition über einen Antisinn-Mechanismus . Dieser Antisinn- Mechanismus führt zur Differenzierung von Endothelzellen, wobei Kapillaren gebildet werden.
Figur 3 zeigt schematisch die Struktur der erfindungsgemäßen Pseudo-ARNA I-Sequenz (oben: Sinn- sträng, unten: Antisinnstrang) .
Das Sequenzprotokoll (alle Sequenzen sind in 5' zu 3' -Orientierung dargestellt) umfasst:
SEQ ID Nr. 1 zeigt 42 Nucleotide der humanen, spezifischen ARNA I-Sequenz, die in der entsprechenden porcinen ARNA I-Sequenz nicht nachgewiesen wurden (Sinn-Orientierung) .
SEQ ID Nr. 2 zeigt 42 Nucleotide der humanen, spezifischen ARNA-I-Sequenz von SEQ ID Nr. 1 in Anti- sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 3 zeigt die vollständige, 205 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen ARNA I-Sequenz, die den 163 Nucleotide umfassenden Sequenzteil umfasst, der identisch mit der Sequenz der porcinen ARNA I- Sequenz ist, in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 4 zeigt die vollständige, 205 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen ARNA I-Sequenz von SEQ ID Nr. 3 in Antisinn-Orientierung .
SEQ ID Nr. 5 zeigt die 235 Nucleotide umfassende Sequenz der humanen Pseudo-ARNA I-Sequenz (Sinn- Orientierung) , inclusive der am 5' Ende vorhandenen ARNA I Nucleotide 1 bis 63 in Antisinn- Orientierung . SEQ ID Nr. 6 zeigt die Sequenz des zur Isolierung der humanen ARNA I-Sequenz verwendeten Primers ARNA I (forward) .
SEQ ID Nr. 7 zeigt die Sequenz des zur Isolierung der humanen ARNA I-Sequenz verwendeten Primers ARNA I (reverse) .
SEQ ID Nr. 8 zeigt einen Teilabschnitt der humanen ARNA-I Sequenz (Sinnorientierung) mit potentieller ribozymatischer Aktivität.
SEQ ID Nr. 9 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 8 in AntiSinnorientierung .
SEQ ID Nr. 10 zeigt die in SEQ ID Nr. 5 erwähnten 63 Nucleotide der humanen ARNA I in Sinn- Orientierung.
SEQ ID Nr. 11 zeigt die in SEQ ID Nr. 5 erwähnten 63 Nucleotide der humanen ARNA I in Antisinn- Orientierung.
SEQ ID Nr. 12 zeigt den im Haarnadelschleifenbereich gelegenen Konsensusbereich zwischen ARNA I(s) und ARNA II (as) Sequenzen in Sinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 13 zeigt die Sequenz von SEQ ID Nr. 12 in Antisinn-Orientierung.
SEQ ID Nr. 14 zeigt den 19 Nucleotide mit besonderer Humanspezifität aufweisenden Bereich der SEQ ID Nr. 1 in Sinn-Orientierung. SEQ ID Nr. 15 zeigt den 19 Nucleotide umfassenden besonders humanspezifischen Bereich der SEQ ID Nr. 2 in Antisinn-Orientierung.
Beispiel 1
Identifizierung von ARNA I-Sequenzen in humanem Probenmaterial
Voruntersuchungen mittels RT-PCR unter Verwendung verschiedener Primer hatten gezeigt, dass zur porcinen ARNA I-Sequenz homologe Nucleinsäuren sowohl in kommerzieller humaner Plazenta-Gesamt-RNA als auch in Con A-stimulierter Leukocyten-Gesamt-RNA nachgewiesen werden konnten.
Zur Clonierung der humanen ARNA I-Sequenz wurde Gesamt-RNA von humaner Plazenta unter Verwendung des Primers ARNA I (forward) (SEQ ID Nr. 6), der eine Eco Rl-Schnittstelle enthält, und des Primers ARNA I (reverse) (SEQ ID Nr. 7), der eine Barn HI- Restriktionsstelle enthält, einer RT-PCR unterworfen. Die erhaltenen Amplifikationsprodukte wurden mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Barn HI gespalten und einer gelelektrophoretischen Aufreinigung auf einem 2,5%-igen Agarose-Gel unterworfen. Nach Aufreinigung der Fragmente wurden diese in den Vektor pUC 19 cloniert, der zuvor mit Eco RI und Barn HI gespalten worden war. Nach Transformation und Selektion geeigneter Transformanten wurde die Sequenz der Insertionen im Clonierungsvektor be- stimmt. Die Sequenzierung erfolgte mit Hilfe des Dye Terminator Cycle Sequencing Kits und des ABI PRISM 377A DNA-Sequenators . Die dabei erhaltenen vollständigen und partiellen Sequenzen von ARNA I(s), ARNA I(as) und Pseudo-ARNA I sind in SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 5 und 8 bis 15 gezeigt. In Fi- gur 3 wird in schematischer Weise die Pseudo-ARNA I-Sequenz gezeigt. Der obere Bereich stellt die 5'- 3' Orientierung eines Sinntranskripts von der Pseudo-ARNA I in prä-mRNA Form dar, also das potentiel- le L27a Exon I und das potentielle Intron umfassend die ARNA I-Nucleotide Nr. 64-205 und 1-63, beide in Antisinn-Orientierung, L27a Exon II und Poly A Schwanz (in 5' zu 3' Richtung) . Dabei stellen die Nucleotide 50-63 der ARNA I (as) einen gemeinsamen Sequenzabschnitt zwischen ARNA I(as) und dem Bereich des Pseudo-ARNA I Transkripts dar, der homolog zum 5' -Ende des Exon II von L27a ist. Die 3' Spleißstelle der prä-mRNA von L27a beziehungsweise möglicherweise auch der Pseudo-ARNA I(s) Sequenz liegt im mit dem Doppelpfeil gekennzeichneten Bereich. Im darunter gelegenen Bereich wird in 3' -5'- Orientierung (Antisinn-Transkript) dargestellt, wie das entsprechende Antisinn-Transkript der Pseudo- ARNA I-Sequenz aufgebaut ist, nämlich (in 3' zu 5' Richtung) : L27a Exon I in Antisinn, Intron aus ARNA I Nt 142-1 und ARNA I Nt 205-143 beide in Sinn- Orientierung, L27a Exon I (Antisinn) . Der potentielle Intronbereich der Pseudo-ARNA I-Sequenz wird durch die ARNA I(as) Bereiche 64 bis 205 und 1 bis 63 konstituiert. Im Antisinn-Transkript der Pseudo- ARNA I (unterer Bereich) befindet sich der entsprechende Intronbereich ARNA I(s) 142 bis 1 und ARNA I(s) 205 bis 143, der als Template für die Generierung einer zirkulären ARNA I(s) -Sequenz dient. Mit- tels des dargestellten Pfeils wird die potentielle Zirkularisierung dieser Sequenz dargestellt. Dabei kennzeichnet die Pfeilspitze die Position der 5'- und das Pfeilende die Position der 3 ' -Spleiß-Stelle der ARNA I(s) innerhalb des Antisinn-Transkriptes der Pseudo-ARNA I-Sequenz. Die Nucleotide 143-156 der ARNA I(s) können ab der Position der 3' Spleißstelle des Exons II der mRNA beziehungsweise prä- mRNA des L27a-Gens gegen dieses Exon hybridisieren.
Beispiel 2
In vitro-RNA-Synthese von ARNA I-Sequenzen
Die clonierten ARNA I-Sequenzen wurden als Matrizen zur in vitro-RNA-Synthese verwendet. Dazu wurden via PCR blunt-end DNA-Templates hergestellt, die eine definierte Terminierung des nachfolgenden RNA- Transkripts ermöglichten. Diese DNA-Templats enthielten am 5' -Ende eine Promotorsequenz für die T7- RNA-Polymerase und 3'-terminal zur Promotorsequenz die gewünschte DNA-Sequenz, deren RNA synthetisiert werden sollte. Die RNA-Synthese erfolgte unter Verwendung hochkonzentrierter T7-RNA-Polymerase nach dem Verfahren von Milligan und Uhlenbeck (1989), wobei die RNA-Synthese jedoch über 18 h durchgeführt wurde. Nach der Synthese wurde die RNA mit- tels DNase-Behandlung und Phenol/Chloroform- Behandlung gereinigt. Nach Aufreinigung der RNA mittels Microkonzentrationen von Amicon (optional auch ersetzt durch Ethanolfüllung) konnte die so synthetisierte RNA zur in vitro-Rekonstitution ter- närer Angiotropin-Komplexe eingesetzt werden.
Beispiel 3
Rekonstitution ternärer Angiotropin-Komplexe
Zur Rekonstitution ternärer Angiotropin-Komplexe wurde die in Beispiel 2 synthetisierte RNA einge- setzt. Als Protein-Komponente wurde intrazellulär isoliertes und aufgereinigtes porcines Calgranulin C aus Schweine-Granulocyten verwendet. Außerdem wurde CuCl2 eingesetzt. Da das Konzentrations- Verhältnis zwischen RNA und Calgranulin C bisher experimentell nicht eindeutig quantifiziert werden konnte (Kuhn 1998), erfolgte die Rekonstitution der ternären Komplexe unter Verwendung verschiedener Konzentrationen. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei 37°C wurden die Komplexe mit Pufferlösung 1:100 verdünnt .
Beispiel 4
Bestimmung der angiogenetischen Aktivität mittels des CAM-Tests
Der CAM-Test wurde durchgeführt wie von Noll (1998) und Kuhn (1998) beschrieben.
Positive angiogenetische Reaktionen wurden entsprechend der Ausbildung von Blutgefäßen im Bereich der aufgetragenen Probe entweder mit „++++" (sehr starke Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen) , „+++" (starke Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen) , „++" (leichte Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen), „+" (sehr geringe Erhöhung der Anzahl von Kapillarnetzstrukturen) oder „0" (keine Veränderung; entspricht der Reaktion auf Puffer ohne Substrat) . Eine Verringerung der Anzahl der Kapillarnetzstrukturen wurde mit „-„ beurteilt. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in nachste- hender Tabelle zusammengefasst . Tabelle
Figure imgf000051_0001
CAM-Testserie mittels PCR-Template synthetisierter ARNA I Beispiel 5
Mechanismus der ARNA I-regulierten Angiogenese des Angiotropins mittels Antisense-Inhibierung
Figur 2 stellt schematisch den zellulären Mechanis- mus der durch native humane ARNA I(s) induzierten Translationsinhibition mittels Antisinn-Mechanismus dar. Die in Leucozyten 50 generierte ARNA I(s) (als 10 in Figur 2 bezeichnet) stellt das Antisinn- Transkript des Pseudo-ARNA I-Gens mit der schwarz dargestellten ARNA l(s) -Sequenz als Intron-Sequenz dar. Diese Intron-Sequenz umfasst die vollständige Sequenz von ARNA I(s) (SEQ ID Nr. 3), die somit einem zellulären Spleiß-Mechanismus unterliegt. Das Genprodukt des Pseudo-ARNA-Gens befindet sich daher nicht beziehungsweise nicht nur auf dem Sinnstrang, sondern vielmehr auf dem Antisinnstrang . Damit ist das Antisinn-Transkript das funktionelle Transkript dieses Gens. Das Antisinntranskript des Pseudo-ARNA I-Gens stellt das Vorläufertranskript für die ARNA I(s) dar. Durch Assoziation der herausgespleißten, vermutlich circularisierten ARNA I(s) (15) mit ARP 18 und Cu2+-Ionen wird der erfindungsgemäße vollständige Metallo-RNP-Komplex Angiotropin 20 konstituiert. Der Metallo-RNP-Komplex Angiotropin (als 20 bezeichnet) wird bei Bedarf in den extrazellulären Raum 30 sezerniert und diffundiert zu den Endothelzellen 40. In diesen hybridisiert die ARNA I(s) 15 gegen die prä-mRNA 60 beziehungsweise mRNA des L27a-Gens beziehungsweise direkt gegen das L27a-Gen auf Transkriptionsebene. Dadurch wird die Synthese des ribosomalen L27a-Proteins inhibiert. Da inner- halb einer Haarnadelschleife der ARNA I(s) 15 eine Konsensussequenz zum Hammerhead-Ribozym identifiziert wurde, kann gegebenenfalls darüber hinaus noch eine sequenzspezifische Hydrolyse der prä-mRNA beziehungsweise der mRNA des L27a-Gens stattfinden.
Ohne ribosomales L27a-Protein kann keine Bildung von funktionsfähigen Ribosomen stattfinden. Die Inhibition der Translation ist die Folge, so dass die zelluläre Proteinbiosynthese gestoppt wird. Die En- dothelzellen können nicht mehr proliferieren und erhalten dadurch die benötigte Zeit zur Umdifferen- zierung in Kapillaren 70. Dieser Effekt scheint reversibel zu sein, da, wenn keine weitere ARNA l(s)- RNA 15 in die Endothelzellen eingeschleust wird, Proliferation wieder stattfindet.
Das vorgenannte System kann als Modellsystem für den zellselektiven RNA-Transfer und die Stabilisierung von RNA bei Antisinn- und Ribozymstrategien herangezogen werden. Die Erfindung erfasst daher auch endothelspezifische Transfektionskits .
Insbesondere erlaubt es die Erfindung hinsichtlich der ARNA I(s) -Sequenz und diese enthaltenden Nucleinsäure-Komplexe Wunden zu heilen, koronare Herzkranzgefäßerkrankungen zu heilen und eine verbes- serte Transplantationschirurgie durchzuführen. Die erfindungsgemäße ARNA I(s) -Sequenz und diese enthaltende Nucleinsäurekomplexe können darüber hinaus auch zur Induktion des Wachstums von Nervenzellen verwendet werden. Hinsichtlich der ARNA I (as) -Sequenz und diese enthaltenden Nucleinsäure-Komplexen ist es möglich, die Tumorangiogenese zu inhibieren und Gentherapien zum Beispiel bei Hämangiomen durchzuführen.
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Claims

Ansprüche
1. Nucleinsäuremolekül, das als funktionaler Bestandteil eines biologisch aktiven Metallo- Ribonucleoprotein-Komplexes geeignet ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist mittels reverser Transkription von Plazenta- Gesamt-RNA mit den ARNA I-spezifischen Primern mit den in SEQ ID Nr. 6 oder/und 7 dargestellten Nucleotidsequenzen, und einem Fragment davon;
b) einem Nucleinsäuremolekül, das mindestens eine der in SEQ ID Nr. 1 bis 5 oder 8 bis 15 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst;
c) einem Nucleinsäuremolekül, das erhältlich ist durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehrerer Basen eines Nuc- leinsäuremoleküls nach a) bis b) ;
d) einem Nucleinsäuremolekül, das mit einem Nucleinsäuremolekül nach a) bis c) und einem Fragment davon hybridisiert, und
e) einem Nucleinsäuremolekül, das zu einem Nucleinsäuremolekül nach a) bis b) komplementär ist, und einem Fragment davon.
2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine DNA oder RNA ist.
3. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es Teil einer längeren nativen Nucleinsäuremoleküls ist.
4. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in circulärer oder in linearer Form vorliegt.
5. Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es in seiner
Sekundärstruktur eine Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3', insbesondere mit der Sequenz aus SEQ ID Nr. 12 oder 13 ausbildet.
6. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, dadurch ge- kennzeichnet, dass die in der Sekundärstruktur des
Nucleinsäuremoleküls ausgebildete Haarnadelschleife die Bindung des Nucleinsäuremoleküls an ein Protein vermittelt .
7. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5 oder 6, da- durch gekennzeichnet, dass die in der Sekundärstruktur des Nucleinsäuremoleküls ausgebildete Haarnadelschleife die Bindung des Nucleinsäuremoleküls an ein Angiotropin related protein-Molekül vermittelt .
8. Vektor, enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gegebenenfalls zusammen mit regulatorischen Elementen.
9. Vektor nach Anspruch 8, der ein Cosmid, Phage, Liposom oder Plasmid ist.
10. Wirtszelle, enthaltend einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9.
11. Nueleinsäure-Komplex, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und Metallionen oder/und ein Protein.
12. Nueleinsäure-Komplex nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein aus der Familie der SlOO-Proteine stammt.
13. Nueleinsäure-Komplex nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Angiotropin related protein-Molekül oder Calgranulin C ist .
14. Nueleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallionen Cu2+-, Mg2+-, Ca2+-, Na+-, K+- oder Zn2+-Ionen sind.
15. Nueleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Nueleinsäure-Komplex ein Ribonucleotidpolypeptid ist.
16. Nueleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass dieser ein metallhaltiges Ribonucleotidpolypeptid ist.
17. Antikörper, der spezifisch einen Nueleinsäure- Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 erkennt und bindet.
18. Antikörper nach Anspruch 17, der ein monoclona- ler oder polyclonaler Antikörper ist.
19. Verfahren zum Transport eines Nucleinsäuremoleküls in eukaryontische Zellen, Zellkulturen oder Gewebe, insbesondere Zellen und Gewebe von Säugern und Vögeln, in vitro oder in vivo umfassend die folgenden Schritte:
- Modifikation des zu transportierenden Nucleinsäuremoleküls, das natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex und/oder ähnlichen Komplexen in Zusammenhang steht, durch Anlagerung von Sequenzen eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' geeignet sind;
- Herstellung eines ternären Komplexes durch in vitro Zugabe von Metall-Ionen und mindestens einem Protein zu dem modifizierten Nucleinsäuremolekül; und
- Applikation des hergestellten ternären Komplexes auf Zellen oder Gewebe, in die das modifizierte Nucleinsäuremolekül eingebracht werden soll.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das modifizierte Nucleinsäuremolekül ein Molekül mit enzyma- tischer Aktivität ist.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 oder 20, wobei die Metall-Ionen Cu2+-, Zn2+-, Mg2+- oder Ca2+- Ionen sind.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das Protein ein ARP-Molekül, Calgranulin C oder ein ähnliches Protein, insbesondere ein das Bindemotiv von ARP oder Calgranulin C für das Nuc- leinsäuremolekül aufweisendes Protein ist.
23. Verfahren zur Induzierung angiogenetischer Prozesse in Gewebe eines Säugerorganismus, umfassend die folgenden Schritte:
- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom- plexierung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Sinn-Orientierung mit Metall-Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen der angiogenetische Prozess induziert werden soll .
24. Verfahren zur Hemmung angiogenetischer Prozesse in Gewebe eines Säugerorganismus, umfassend die folgenden Schritte:
- Herstellung eines ternären Komplexes durch Kom- plexierung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Antisinn-Orientierung mit Metall-Ionen und gegebenenfalls einem Protein in vitro; und
- Applikation der komplexierten Nucleinsäure auf Gewebe, in denen ein angiogenetischer Prozess gehemmt werden soll.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Metall-
Ionen Cu ,2+-, Mg .2+-, Ca 2+ Na -, K - oder Zn 2+-Ionen sind.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Protein ein ARP-Molekül, Calgranulin C oder ein ähnliches Protein ist.
27. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, eine Wirtszelle nach Anspruch 10, einen Nueleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 17 oder 18 gegebenenfalls zusammen mit einem Träger.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis
7, einen Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, eine Wirtszelle nach Anspruch 10, einen Nueleinsäure-Komplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 oder einen Antikörper nach einem der Ansprüche 17 oder 18 gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28 zur spezifischen Beeinflussung der Angiomorpho- genese und des vaskulären Zustand eines Gewebes des Körpers von Organismen.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28 zur Übertragung genetischer Informationen in Zellen.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 28 zur selektiven Veränderung des Nucleinsäurege- haltes von Zellen.
32. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach ei- nem der Ansprüche 1 bis 7, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' fähig ist, zur Modifikation von Nucleinsäuremolekülen, die natürlicherweise nicht mit dem Angiotropin-Komplex im Zusammenhang stehen, so dass diese modifizierten Nucleinsäuremoleküle unter geeigneten Bedingungen an ARP, Calgranulin C oder ähnliche Proteine binden und in Zielzellen transportiert werden können.
33. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach ei- nem der Ansprüche 1 bis 7, die unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer Haarnadelschleife mit der Konsensus-Sequenz 5'-CUG-3' fähig ist, zur Isolierung und/oder zum Transport von Proteinen, an die diese Nucleinsäuremoleküle binden können und die so zum Transport von Nucleinsäuremolekülen in Zielzellen eingesetzt werden können.
3 . Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Sinn-Orientierung zur Herstellung von Therapeutika zur Induzierung angio- genetischer Prozesse und/oder zur Wundheilung.
35. Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in Antisinn-Orientierung zur Herstellung von Therapeutika zur Hemmung angiogenetischer Prozesse und/oder zur Bekämpfung von Tumoren.
36. Verwendung von ARP, Calgranulin C oder der Nuc- leinsäurekomplexe nach einem der Ansprüche 11 bis 16 als Transportmolekül für Nucleotidsequenzen, insbesondere RNA-Moleküle.
37. Verfahren zur Reduktion der Proliferation von Zellen und/oder zur vorzeitigen Einleitung der Differenzierung von Zellen, wobei ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, ein Vektor nach einem der Ansprüche 8 oder 9, eine Wirtszelle nach Anspruch 10, ein Nucleinsäurekomplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 und/oder ein Antikörper nach einem der Ansprüche 17 oder 18 in die Zelle eingeschleust wird und dabei die Aktivität und/oder Expression des L27a-Gens oder davon codierten Gen- produktes hemmt oder reduziert.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Zelle eine stark proliferierende Zelle, insbesondere eine Stammzelle, degenerierte Zelle oder Tumorzelle ist.
39. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Zelle ei- ne krankhaft veränderte Zelle, insbesondere eine
Zelle des Psoriasis-Formenkreises ist.
40. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Zelle eine Nervenzelle ist.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 40, wobei ein Nucleinsäurekomplex nach einem der Ansprüche 11 bis 16 eingesetzt wird.
42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Nucleinsäurekomplex ein Protein aufweist, das die Bindungsdomäne von Calgranulin C oder ARP an das Nuc- leinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, insbesondere die ARNA I (s) -Sequenz, und eine Bindungsdomäne an einen Oberflächenrezeptor der Zelle aufweist .
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