DE10324997A1

DE10324997A1 - Mrp8/Mrp14 Inhibitoren und ihre Verwendung zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden

Info

Publication number: DE10324997A1
Application number: DE10324997A
Authority: DE
Inventors: Andreas Goppelt; Stephanie Fritz; Michaela Bittner
Original assignee: Switch Biotech AG
Current assignee: Switch Biotech AG
Priority date: 2003-06-03
Filing date: 2003-06-03
Publication date: 2004-12-23
Also published as: WO2004106519A2; WO2004106519A3

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Mrp8/Mrp14 Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden. Ferner betrifft die Erfindung neuartige Mrp8 oder Mrp14 Inhibitoren, insbesondere siRNAs.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Mrp8/Mrp14 Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden. Ferner betrifft die Erfindung neuartige Mrp8 oder Mrp14 Inhibitoren.
Narben bilden sich immer nach Verletzungen der Haut nach Abschluss der Heilung. Dabei kommt es nach Abschluss der Reepithelisierung von verletzter Haut zu einer Reorganisation der extrazellulären Matrix, insbesondere von Kollagenen. Im Idealfall entsteht eine flache Narbe, die makroskopisch nicht als solche zu erkennen ist. In manchen Fällen kommt es jedoch zu einer übermäßigen Ausbildung der extrazellulären Matrix in der Dermis, sodass durch die überschießende Narbenbildung eine optisch unschöne, erhabene und unregelmäßig geformte hypertrophe Narbe entsteht. Diese Narben stellen nicht nur ein kosmetisches Problem dar sondern sind auch durch das Fehlen von Hautanhanggebilden, wie Haarfollikeln, Talgdrüsen, sowie schlechte mechanische Eigenschaften gekennzeichnet, sodass bei thermischer oder mechanischer Belastung große Probleme für den Patienten entstehen. Des Weiteren können Keloide entstehen; d.h. Narbenwucherungen, die sogar in das gesunde Hautgewebe einwuchern, wodurch sich eine sich ständig vergrößernde Narbe bildet.
Hypertrophe Narben und Keloide sind durch eine aberrante Produktion von Extrazellulärmatrix-Komponenten in der Dermis gekennzeichnet, was zu einer verdickten Dermis führt. Dabei spielen die Fibroblasten, die in der Epidermis liegen, eine entscheidende Rolle. Es ist jedoch auch bekannt, dass die Keratinozyten der darüber liegenden Epidermis maßgeblich die Fibroblasten bei der Narbenbildung beeinflussen. So wurde beispielsweise gezeigt, dass aus Keloiden isolierte Keratinozyten bei Kokultivierung mit Fibroblasten diese dazu anregen, verstärkt zu proliferieren und Kollagen zu sekretieren, ähnlich dem bekannten Verhalten von Fibroblasten aus Keloiden. Somit sind falsch regulierte Keratinozyten in frischem Narbengewebe für die übermäßigen Produktion von Kollagenen und Glykoproteinen in der darunter liegenden dermalen Schicht verantwortlich.
Die der Narbenbildung zu Grunde liegenden molekularbiologischen Faktoren sind im Wesentlichen ungeklärt. Deswegen sind im Stand der Technik auch keine Behandlungsmethoden von hypertrophen Narben und/oder Keloiden bekannt, welche auf die molekularen Mechanismen selbst gerichtet sind. Die im Stand der Technik bekannten Behandlungsmethoden von Keloiden beschränken sich sehr häufig auf einfaches chirurgisches Entfernen der Keloide; jedoch findet man in bis zu 90% der Fälle ein erneutes Auftreten der Keloide. Generell existieren für Keloide keine Behandlungsmöglichkeiten mit annehmbarer Erfolgsrate. Bei hypertrophen Narben führen bestehende Behandlungstechniken ebenfalls meist nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Klassische Methoden umfassen das operative Entfernen von Narben, wobei häufig eine Neubildung der hypertrophen Narbe beobachtet wird, sowie Behandlung mit Silikongel-Verbänden, Behandlung mit Druckverbänden, Behandlung mit Kortikosteroiden (z.B. Triamcinolon acetonid), Bestrahlung mit Lasern oder CO₂ sowie Kryobehandlung des Gewebes. Bei Verwendung von Silikongel-Verbänden beruht der Effekt wahrscheinlich weniger auf dem Silikon selbst, sondern auf dem hydratisierenden und abschließenden Effekt des Verbandes. Die intraläsionale Läsion von Kortikosteroiden führt zu einer Verminderung der Kollagensynthese, jedoch werden bei andauernder Behandlung schwere Nebeneffekte wie Atrophien der Haut, Hypopigmentierung oder Geschwüre beobachtet. Weiterhin wird auch versucht, Kollagen oder Hyaluronsäure in das Narbengewebe einzuspritzen, um optisch eine ebenere Hautoberfläche zu erreichen. Diese Substanzen werden jedoch innerhalb von wenigen Monaten resorbiert, und die Behandlung muss alle 6–12 Monate wiederholt werden. Neuere Behandlungsansätze umfassen die Gabe von Interferon-alpha, Interferon-beta oder Interferon-gamma oder die Gabe von Imiquimod, das die Expression von Interferonen induziert. Auch Gabe von TGF-beta wird für die Verhinderung der Bildung hypertropher Narben diskutiert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, verbesserte Mittel zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Verwendung mindestens eines Mrp8- und/oder Mrp14 Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden gelöst.
Im Rahmen der Erfindung hat es sich überraschenderweise herausgestellt, dass Mrp8 und/oder Mrp14 Inhibitoren, insbesondere gegen Mrp8 und/oder Mrp14 gerichtete siRNA Moleküle, zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden geeignet sind. Es hat sich überraschenderweise ergeben, dass MrpB/Mrp14 spezifisch in aberranten hypertrophen Narben und Keloiden, jedoch nicht in normalen Narben exprimiert werden, wobei die Überexpression spezifisch in den suprabasalen Keratinozyten des erkranktem Gewebe zu finden ist. Ferner wurde überraschenderweise gefunden, dass durch Zugabe von siRNA-Molekülen, die gegen Mrp8 und/oder Mrp14 gerichtet sind, eine signifikante Inhibition der Proliferation von Keratinozyten in vitro erreicht werden kann. Da wie oben dargestellt diese Keratinozyten bei der Bildung von hypertrophen Narben und Keloiden eine entscheidende Rolle spielen, stellt die vorliegende Erfindung damit wirksame Mittel zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Kelodiden bereit.
Mrp8 und Mrp14 sind Proteine der S100-Proteinfamilie, die seit langem bekannt sind und zusammen ein nicht-kovalentes Heterodimer Mrp8/14 bilden können. Die Expression der Proteine ist in einer Vielzahl von Erkrankungen stark gesteigert, in anderen jedoch erniedrigt. Die biologische Funktion der Proteine ist völlig unklar. Beispiele solcher Erkrankungen, in denen eine erhöhte Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 nachgewiesen wurde, sind rheumatoide Arthritis und andere Arthritiserkrankungen, Inflammatory Bowel disease und andere entzündliche Darmerkrankungen, zystische Fibrose, Parodontose, sowie Autoimmunerkrankungen wie das Kawasaki Syndrom. Je nach unterschiedlichem Wundtyp ist die Expression in Wunden entweder erhöht oder erniedrigt (WO 92/088181, EP 1114862 ).
Eine enzymatische Funktion der Proteine ist unbekannt. Gleichzeitig weiß man, dass die Proteine eine Vielzahl von Stoffen binden können, wie beispielsweise Calcium, Zink, Fettsäuren, insbesondere Arachidonsäure, Heparin, Heparansulfat Glykosaminoglykane und Tubulinfilamente. Welche von diesen extra- wie intrazellulären Bindungspartners in vivo eine Rolle spielen, ist unklar. Mrp8 und Mrp14 werden sekretiert, allerdings ist unklar, ob das intrazelluläre und/oder das extrazelluläre Auftreten für die Pathogenese einer Erkrankung entscheidend ist.
Aufgrund der unklaren biologischen Funktion der Proteine bzw. des Heterodimers wird im Stand der Technik im Allgemeinen nur die diagnostische Verwendung der Proteine vorgeschlagen, d.h. es wird eine veränderte Expression der Proteine in einer Erkrankung festgestellt, ohne dass daraus ein therapeutisches Konzept abzuleiten wäre.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Inhibitor dadurch definiert, dass er in der Lage ist, die Funktion von MRP8 und/oder MRP14 im Organismus zu hemmen und daher therapeutisch eingesetzt werden kann. Dies kann dadurch geschehen, dass der Inhibitor die Funktion des Moleküls inhibiert, beispielsweise durch Anlagern an das Protein, oder dadurch, dass die Expression des Proteins inhibiert wird.
Im Rahmen der Erfindung werden zur Bestimmung, ob eine Substanz ein Inhibitor im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, bevorzugt Assays verwendet, in de nen die Inhibition der Mrp8 und/oder Mrp14 Expression oder Mrp8 und/oder Mrp14 Aktivität gemessen wird. Die Inhibition der Expression kann beispielsweise in vitro (Beispiel 3), in vivo oder in Zelllysaten untersucht werden. Die Expressionsunterschiede werden dabei auf der Ebene der mRNA oder Proteine, insbesondere auf der Ebene der Proteine nachgewiesen. So können beispielsweise, wie in Beispiel 3 gezeigt, Zelllinien, insbesondere Keratinozytenzelllinien, untersucht werden, die transient oder stabil Mrp8 und Mrp14 überexprimieren, um nach Gabe eines Inhibitors die Inhibition der Expression quantitativ bestimmen zu können. Der Nachweis von Mrp8 oder Mrp14 kann über geeignete Antikörper erfolgen, die jeweils spezifisch Mrp8 oder Mrp14 erkennen. Geeignete Nachweismethoden sind beispielsweise Western Blot Analyse oder Immunlokalisierung. Ein solcher Assay zur Bestimmung der Wirkung eines Inhibitors auf die Proteinexpression kann beispielsweise aus folgenden Schritten bestehen:

(1) Kultivierung von Zellen, die nachweisbare Mengen an Mrp8 und/oder Mrp14 Protein produzieren,
(2) Gabe eines Inhibitors zu den Zellen,
(3) Nachweis der Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 Protein in den Zellen,
(4) Vergleich zu der Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 Protein in nichtbehandelten Kontrollzellen.

Eine im Vergleich zu Kontrollzellen erniedrigte Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 Protein weist die Wirkung als Inhibitor nach.
Analog kann auch die Menge einer Mrp8 und/oder Mrp14 mRNA bestimmt werden, um die inhibitorische Wirkung zu bestimmen:

(1) Kultivierung von Zellen, die nachweisbare Mengen an Mrp8 und/oder Mrp14 mRNA produzieren,
(2) Gabe eines Inhibitors zu den Zellen,
(3) Nachweis der Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 mRNA in den Zellen,
(4) Vergleich zu der Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 mRNA in nichtbehandelten Kontrollzellen.

Eine im Vergleich zu Kontrollzellen erniedrigte Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 mRNA weist die Wirkung als Inhibitor nach. Geeignete Nachweismethoden sind beispielsweise PCR-basierte Methoden, wie RTPCR oder in situ Hybridisierung (Current Protocols, John Wiley & Son, Inc., New York (2003)).
Der Nachweis der inhibitorischen Wirkung eines zu testenden Inhibitors kann auch in vivo erfolgen. So kann beispielsweise der Einfluss eines zu testenden Inhibitors auf die Mrp8 und/oder Mrp14 Expression in einem bestimmten Gewebe im Tiermodell getestet werden. Analog zu den oben beschriebenen in vitro Experimenten zur Bestimmung der Mrp8 und/oder Mrp14 Expression kann eine zu testende Substanz auf ein Gewebe, insbesondere die Haut eines Tieres aufgetragen werden; anschließend wird die behandelte Probe entnommen, wie oben beschrieben die Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 Protein oder mRNA bestimmt und mit der Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 Protein oder mRNA in unbehandeltem Gewebe verglichen. Dabei kann das unbehandelte Gewebe vom gleichen Tier oder von einem anderen Tier stammen. Eine im Vergleich zu Kontrollzellen erniedrigte Menge an Mrp8 und/oder Mrp14 Protein oder mRNA weist die Wirkung als Inhibitor nach.
Die Entnahme der Proben kann beispielsweise durch Biopsienahme, insbesondere der Haut, oder durch Entnahme von Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, geschehen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet „hypertrophe Narben" ein Krankheitsbild, bei dem es nach Abschluss der Wundheilung zu einer verstärkten Produktion von Extrazellulärmatrix-Komponenten in der Dermis kommt, wodurch die Dermis verdickt wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet „Keloid" ein Krankheitsbild, bei dem Narbenwucherungen in das gesunde Hautgewebe einwuchern und sich somit eine Narbe bildet, die über die Grenzen des Ortes des ursprünglichen Traumas bzw. der Wunde hinauswuchert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Inhibitor um einen Inhibitor von humanem Mrp8 und/oder humanem Mrp14. Erfindungsgemäß ist aber auch eingeschlossen, dass es sich um einen Inhibitor gegen Mrp8 und/oder Mrp14 aus anderen Spezies handelt, beispielsweise Affe, Schwein, Rind, Pferd, Ratte oder Maus.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird nur ein Inhibitor verwendet. Im Rahmen der Erfindung hat es sich überraschenderweise gezeigt, dass ein Inhibitor, der entweder gegen Mrp8 oder Mrp14 gerichtet ist, bereits die selbe Wirkung wie eine Kombination zweier Inhibitoren zeigt, die gegen Mrp8 und Mrp14 gerichtet sind. Somit kann bereits durch die Gabe eines Inhibitors ein voller therapeutischer Erfolgt erreicht werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Antikörpern, anderen natürlichen oder synthetischen Proteinen und Peptiden, die beispielsweise eine erhöhte Degradation oder Sequestrierung von Mrp8 und/oder Mrp14 bewirken, Molekülen mit geringem Molekulargewicht (LMWs) und Mrp8/Mrp14 Rezeptor-Antagonisten.
Moleküle mit geringem Molekulargewicht sind Moleküle, die keine Proteine, Peptide, Antikörper oder Nukleinsäuren sind und die ein Molekulargewicht von weniger als ca. 5000 Da, vorzugsweise weniger als 2000 Da, insbesondere weniger als 1000 Da, am meisten bevorzugt weniger als 500 Da aufweisen. Derartige Inhibitoren können insbesondere im Rahmen von High-Through-Put Verfahren ausgehend von Molekülbanken identifiziert werden. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ein Antikörper. Dieser Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Unter dem Begriff „Antikörper" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und ggf. modifizierte Antikörper bzw. antigenbindende Teile davon, wie z.B. chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oligospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)2-Fragmente (siehe z.B. EP-B1-368684, US 4,816,567 , US 4,816,397 , WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor eine Nukleinsäure, vorzugsweise mit einer Länge von maximal ca. 200 Nukleotiden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform binden diese Nukleinsäuren an Mrp8 und/oder Mrp14 mRNA oder DNA, insbesondere genomische DNA, besonders bevorzugt an mRNA.
Bevorzugt sind Nukleinsäuren mit einer Länge eines Einzelstrangs von maximal 100 Nukleinsäuren, vorzugsweise maximal 50 Nukleinsäuren, insbesondere bevorzugt maximal 30 Nukleinsäuren.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform hemmen die Nukleinsäuren die Expression und/oder Aktivität von Mrp8 und/oder Mrp14. Besonders bevorzugt hemmen sie die Expression von Mrp8 und/oder Mrp14 Polypeptiden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung verwendeten Nukleinsäuren modifiziert sein.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform bindet die Nukleinsäure an eine humane Mrp8 oder Mrp14 mRNA gemäß SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 oder Varianten davon, z.B. allelische Varianten, Sequenzen mit Polymorphismen zu den Sequenzen SEQ ID No. 1 und 2 oder splice Varianten.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure ein Antisense-Molekül oder eine siRNA, vorzugsweise eine siRNA.
siRNAs (small interfering RNAs) wirken über den Mechanismus der dsRNA vermittelten RNA Interferenz. Dabei bewirken kleine dsRNA Moleküle einen sequenzspezifischen, so genannten Knock-Down der Genexpression, im Unterschied zu langen dsRNA Molekülen, die in Säugerzellen eine unspezifische Inhibition der Translation bewirken (Elbashir et al., 2001, Genes Dev, 15: 188–200; Vattem et al., 2001; Eur. J. Biochem., 268: 3674–84). Eine Länge von ca. < 30 Nukleotiden pro Einzelstrang ist nötig, um eine sequenzspezifische RNA Interferenz (RNAi) in Säugetierzellen zu erreichen (Xia et al., 2002, Nature Biotech., 20: 1006–1010). dsRNAs mit 2–3 Nukleotiden langen 3'-Überhängen wurden als effiziente siRNAs beschrieben, jedoch gibt es Hinweise, dass auch dsRNAs ohne Überhang (blunt end) in vivo funktionieren.
siRNAs sind doppelsträngige oder partiell doppelsträngige RNAs, die zu targetspezifischer Interferenz fähig sind. Üblicherweise besteht ein siRNA Molekül aus zwei RNA Einzelsträngen, es können aber auch siRNAs verwendet werden, die aus einem RNA-Strang bestehen und so beschaffen sind, dass sie einen Doppelstrang mit Hairpin Struktur bilden.
Unter dem „Sense-Strang" der siRNA ist derjenige RNA Strang einer siRNA zu verstehen, der über einen Bereich von mindestens ca. 16, insbesondere mindestens ca. 17, vorzugsweise mindestens ca. 18, am meisten bevorzugt mindestens ca. 19 Nukleotide identisch oder zu mindestens ca. 90% identisch zu der Targetsequenz ist. Vorzugsweise ist er identisch.
Der „Antisense-Strang" der siRNA ist dann der dazu komplementäre Strang.
Unter einem Target wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, deren Expression auf Protein- und/oder mRNA-Ebene, vorzugsweise auf Proteinebene moduliert werden soll. Dabei ist eine Targetsequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung die Sequenz desjenigen Stranges eines Targets, der komplementär zu dem Strang ist, der als Matrize bei der Transkription verwendet wird; d.h. bei der Targetsequenz handelt es sich um den Sense-Strang des Targets. Targets der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäuren, die für Mrp8 und Mrp14 Proteine kodieren.
Unter „Basissequenz der siRNA Moleküle" ist derjenige Teil des Sense-Strangs einer siRNA zu verstehen, der doppelsträngig vorliegt.
Unter „Basis-Targetsequenz" ist ein Teil einer Targetsequenz mit einer Länge X zu verstehen, die im Bereich der Nukleotide 3-X zur Basissequenz der siRNA Moleküle identische oder zu mindestens 90% identisch, vorzugsweise identisch ist.
„Vor" im Zusammenhang mit der relativen Position von Nukleinsäuren innerhalb von Oligo- oder Polynukleinsäuren ist als in Richtung des 5'-Endes des Moleküls zu verstehen.
„Hinter" im Zusammenhang mit der Position von Nukleinsäuren und Oligo- oder Polynukleinsäuren ist als in Richtung des 3'-Endes des Moleküls zu verstehen.
siRNA-Interferenz wird dadurch erreicht, dass der Antisense-Strang der siRNA zu einem Teil der Targetsequenz komplementär oder zu mindestens ca. 90% komplementär ist, wobei Komplementarität bevorzugt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antisense-Strang der siRNA in einem Bereich von mindes tens 16 bis 23 Aminosäuren, vorzugsweise 17 bis 22, insbesondere 18 bis 21, besonders bevorzugt 19 bis 20, am meisten bevorzugt 19 Nukleinsäuren zu einer erfindungsgemäßen Targetsequenz komplementär oder zu mindestens 90% komplementär, vorzugsweise komplementär. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die siRNA in einem Bereich von ungefähr 16 bis 23 Aminosäuren, vorzugsweise 17 bis 22, insbesondere 18 bis 21, besonders bevorzugt 19 bis 20, am meisten bevorzugt 19 Nukleinsäuren doppelsträngig. Bevorzugt ist der dopplesträngige Teil derjenige Teil der siRNA, der wie oben definiert komplementär zur Targetsequenz ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform bildet die siRNA einen Doppelstrang ohne Einzelstrangüberhang („blunt end"). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die siRNA am 3'-Ende des Sense- bzw. Antisense-Strangs unabhängig voneinander Einzelstrangüberhänge von mindestens 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Nukleinäuren Länge. Vorzugsweise ist die Anzahl der überhängenden Nukleinsäuren am Sense- und Antisense 3'-Ende identisch. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Länge der Einzelstrangüberhänge am 3'-Ende des Sense- oder Antisense-Strangs 0 bis 5. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Länge der Einzelstrangüberhänge am 3' Ende des Sense- oder Antisense-Strangs gleich 0 oder 2, insbesondere gleich 2. Häufig werden als überhängende Nukleinsäuren dTdT verwendet, dies ist jedoch für die Funktion der siRNA nicht entscheidend. Weiterhin sind siRNA Moleküle mit einem GC-Gehalt von ca. 20–80%, besonders ca. 30–70%, insbesondere von ca. 50% bevorzugt. Weiterhin ist die Auswahl solcher siRNAs bevorzugt, bei denen die Targetsequenz vor dem Bereich (d.h. 5' davon) der zum Sense-Strang der siRNA zu mindestens ca. 90% identisch, vorzugsweise identisch ist, 1, insbesondere 2 Adenosine trägt.
Am effektivsten haben sich siRNAs erwiesen, die aus 21 Nukleotide langen RNA Strängen aufgebaut sind, die so gepaart sind, dass 1–3 Nukleotide lange Überhänge, insbesondere 2 Nukleotide lange 3'-Überhänge an beiden Enden der dsRNA vorhanden sind. siRNAs, die aus jeweils 21 Nukleotiden langen RNAs aufgebaut sind, und so gepaart sind, dass 2 Nukleotide lange 3'-Überhänge, nämlich dTdT-Überhänge, an beiden Enden der dsRNA vorhanden sind, wurden in den Beispielen 1 und 2 erfolgreich verwendet.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung nur eine siRNA verwendet, die entweder gegen Mrp8 oder Mrp14 gerichtet ist. Somit genügt überraschenderweise die Gabe einer siRNA, um sowohl die Expression von Mrp8 als auch die von Mrp14 zu modulieren. Damit kann durch eine siRNA ein vollständiger therapeutischer Erfolg erzielt werden. Dadurch wird das Problem der unbekannten Rolle von Mrp8 und Mrp14, der heterogenen Bindungspartner und der unklaren intra- bzw. extrazellulären Bedeutung der beiden Proteine umgangen.
Erfindungsgemäß verwendete siRNAs können aus jedem Bereich einer Mrp8 oder Mrp14 mRNA Sequenz abgeleitet werden, insbesondere aus humanen Mrp8 und Mrp14 mRNA Sequenzen, am meisten bevorzugt aus Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No: 2. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäß verwendete siRNAs dadurch gekennzeichnet, dass der Sense-Strang die Sequenz einer der in SEQ ID No: 3 bis 946 dargestellten Sequenzen umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäß verwendete siRNAs dadurch gekennzeichnet, dass der doppelsträngige Anteil des Sense-Strangs die Sequenz einer der in SEQ ID No: 3 bis 946 dargestellten Sequenzen aufweist. Insbesondere sind solche siRNAs bevorzugt, in denen beide Stränge der siRNAs über einen Bereich von 19 Nukleotiden Watson-Crick Basenpaarungen enthalten und der Antisense-Strang zu 100% komplementär ist zu einer Targetsequenz und beide Stränge am 3'-Ende Überhänge der Länge 0–5 Nukleotide, bevorzugt 1–3 Nukleotide, am meisten bevorzugt 2 Nukleotide haben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungsgemäß verwendete siRNA dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt der Mrp8 oder Mrp14 Targetsequenz, der identisch oder zu ca. 90% identisch ist zum Sense-Strang der siRNA, an der ersten Nukleinsäure vor der ersten Nukleinsäure des Sense-Strangs der siRNA (entspricht Position -1) ein Adenosin aufweist; insbesondere vorzugsweise an den ersten beiden Nukleinsäuren vor der ersten Nukleinsäure des Sense-Strangs der siRNA zwei Adenosine aufweist (entspricht Positionen -2 und -1). Weitere bevorzugte siRNAs (bzw. deren Basissequenz), die dadurch gekennzeichnet sind, dass der Abschnitt der Mrp8 oder Mrp14 Targetsequenz, der identisch ist zum Sense-Strang der siRNA, an den ersten beiden Nukleinsäuren vor der ersten Nukleinsäure des Sense-Strangs der siRNA zwei Adenosine aufweist (entspricht Positionen -2 und -1), sind in den Tabellen 5 und 6 aufgeführt, bzw. es wird in den Tabellen 5 und 6 auf die SEQ ID NOs der Sequenzen, die eine solche bevorzugte siRNA enthalten kann (= eine der möglichen Basissequenzen) verwiesen.
siRNAs, die im Sense-Strang eine der in SEQ ID No. 164, 202 und 238 dargestellten Sequenzen enthalten, wurden erfolgreich zur Inhibition der MrpB Expression und/oder zur Inhibition der Keratinozyten eingesetzt (Beispiele 1, 2). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die siRNA daher dadurch gekennzeichnet, dass der Sense-Strang die Sequenz einer der SEQ ID No: 164, 202, 238 enthält.
siRNAs, die im Sense-Strang eine der in SEQ ID No: 548, 649, 712 dargestellten Sequenzen enthalten, wurden erfolgreich zur Inhibition der Mrp14 Expression und/oder zur Inhibition der Keratinozyten eingesetzt (Beispiele 1, 2). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die siRNA daher dadurch gekennzeichnet, dass der Sense-Strang die Sequenz einer der SEQ ID No: 548, 649, 712 enthält.
Die siRNAs, die in Beispielen 1 und 2 verwendet wurden, sind dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des Einzelstranges 21 Nukleotide beträgt, die RNA-Einzelstränge am 3'-Ende 2-Nukleotide lange Überhänge, nämlich dTdT- Überhänge haben und im Bereich des Doppelstranges von 19 Nukleotiden Länge ausschließlich Watson-Crick Bindungen vorliegen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungsgemäß verwendete siRNA daher dadurch gekennzeichnet, dass der Sense- und Antisense-Strang über einen Bereich von 19 Nukleotiden komplementär sind und somit einen Doppelstrang von 19 Nukleotiden Länge bilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die siRNA dadurch gekennzeichnet, dass die siRNA am 3'-Ende Einzelstrangüberhänge von 2 Nukleotiden Länge besitzt, beispielsweise mit der Sequenz dTdT.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure ein Antisense-Molekül.
Antisense-Moleküle sind üblicherweise einsträngige DNA Moleküle die zum Sense-Strang eines Gens komplementär sind und einen „Knock-down" in der Expression des gewünschten Gens bewirken. Die Mechanismen, die dabei eine Rolle spielen, umfassen die Inhibition der Translation, hauptsächlich jedoch die Destabilisierung der mRNA, indem nach Bindung des Antisense-Moleküls an die Target mRNA die Endonuklease RNAse H einen Abbau der mRNA bewirkt. Wirksame Antisense-Moleküle können gegen jeden Teil einer Targetsequenz gerichtet sein.
Vorzugsweise hat ein Antisense-Molekül eine Länge von maximal ca. 30 Nukleotiden, vorzugsweise von ca. 18 und 26 Nukleotiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäß verwendetes Antisense-Molekül dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure die komplementäre Sequenz einer der in SEQ ID No. SEQ ID No:3 bis 946 dargestellten Sequenzen oder Teile davon besitzt oder ein DNA oder DNA/RNA Hybrid Analogon davon ist.
siRNA oder Antisense-Moleküle können durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden.
Geeignete Expressionssysteme, um stabile RNA Interferenz in Säugerzellen zu erhalten, sind beispielsweise in McManus und Sharp (Nature Genetics, 3:737–747) beschrieben: Beispielsweise können die siRNAs unter der Expressionskontrolle von Pol II und Pol III Promotoren, wie CMV, H1 und U6, stehen. Die Pol III Transkription endet mit einer Reihe von Thymidin-Resten, und die transkribierte RNA enthält daher mehrere Uridine am Ende. Die Expressionskassetten können so konstruiert sein, dass ein einzelnes siRNA Molekül mit invertierter Hairpin-Struktur entsteht, oder die beiden Stränge der siRNA können separat exprimiert werden, gefolgt von Annealen der beiden Stränge. Die siRNAs können direkt als therapeutisches Agens eingesetzt werden oder in gentherapeutisch annehmbare Trägersysteme eingesetzt werden. Beispiele für gentherapeutisch annehmbare Trägersysteme, die eine stabile Expression der siRNAs in Zellen erlauben, sind beispielsweise Plasmide und virale Expressionssysteme, beispielsweise Adenoviren und Lentiviren.
Die Applikation der siRNAs entweder direkt oder als Expressionssystem exprimierend eine erfindungsgemäße siRNA kann durch Formulierung beispielsweise zusammen mit geeigneten kationischen Lipiden, wie beispielsweise Cytofectin^TM, AdVectin^TM oder Oligofectamine^TM erfolgen. Weiterhin können die Substanzen gespritzt werden, beispielsweise intravenös oder intradermal. Intravenöse Applikation von siRNA Expressionssystemen wurden im Tiermodell bereits erfolgreich getestet (Xia et al., 2002, Nature Biotech., 20:1006–10010). Weiterhin besteht die Möglichkeit, die Nukleinsäuren durch Ionophorese oder Elektroporation zu applizieren. Bevorzugt ist eine lokale Gabe des erfindungsgemäßen Mittels, um Nebenwirkungen zu vermeiden. Bevorzugt ist daher eine topische oder intradermale Applikation.
Erfindungsgemäß können die Inhibitoren als solche verabreicht werden, oder vorzugsweise in Kombination mit mindestens einem geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoff z.B. mit einem oder mehreren geeigneten Adjuvanzien und/oder einem oder mehreren pharmazeutisch wirksamen und/oder verträglichen Trägerstoffen, Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Bindemitteln u.ä.
Wenn die Verabreichung topisch ist, ist vorzugsweise der Hilfs- oder Zusatzstoff hydrophob und ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wachs, Oleylalkohol, Propylenglykolmonostearat, Propylenglykolmonopahnitostearat, Isopropyllaureat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Isopropylstearat, Ethylmyristat, Propylmyristat, Butylmyristat, Ethyloleat, Cetylstearylalkohol, Vaseline, Lanolinalkohol und Paraffinöl.
Die Applikation von erfindungsgemäßen Antisense-Molekülen kann über die gleichen Methoden erfolgen wie für siRNA Moleküle. Die Methoden zur topischen Applikation von Antisense-Molekülen, wie Ionophorese, Elektroporation, intradermale Applikation und direktes topisches Auftragen sind in Wraight und White (Pharmacology & Therapeutics, 2001, 89–104) zusammengefasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die siRNA rekombinant durch Expression eines einzigen Nukleinsäuremoleküls hergestellt, wobei zunächst ein doppelsträngiges RNA Molekül mit stem loop entsteht. Das Molekül kann direkt als siRNA Molekül eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die siRNA durch chemische Synthese, beispielsweise unter Verwendung geschützter Ribonukleosidphosphoramidite, hergestellt.
Weiterhin können die siRNA Moleküle rekombinant durch gleichzeitige Expression beider Stränge in einer Zelle hergestellt werden, beispielsweise durch Ex pression unter der Kontrolle eines Pol III Promotors. Beispiele sind der U6 und der H1 Promotor.
Gemäß einer besonders bevorzugen Ausführungsform weisen die Antisense-Moleküle und siRNAs modifizierte Nukleinsäuren auf, vorzugsweise mit Phosphothioat, Methylphosphonat oder Peptidbindungen modifizierte Nukleinsäuren.
Geeignete modifizierte Nukleinsäuren sind in Uhlmann & Peimann (1990; Chem. Ref. 90, 544) zusammengefasst (siehe auch Beigelman et al., 1995; Nucleic Acid Research 23:3989–94; Dudycz 1995, WO 95/11910; Macadam et al, 1998; WO 98/37240; Reese et al. 1997; WO 97/29116).
Modifizierte Internukleotid Phosphatbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzt werden können, enthalten z.B. Methylphosphonat, Phosophorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat, Phosphatester, während nicht-Phosphat Internukleotidanaloga beispielsweise Siloxanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren werden vorzugsweise im Rahmen einer topischen Behandlung verwendet. Bevorzugt ist, dass die Inhibitoren, bevorzugt die Nukleinsäuren, in die Epidermis eindringen können.
Die Erfindung betrifft ferner Inhibitoren von Mrp8 und/oder Mrp14, welche Nukleinsäuren darstellen. Dabei gelten die oben definierten Ausführungsformen auch für diesen Aspekt der Erfindung.
Ferner betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthält, vorzugsweise in Kombination mit geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoffen. Dabei sind die geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoffe wie oben definiert.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden in Patienten, bei dem eine wirksame Menge mindestens eines Mrp8- und oder Mrp14 Inhibitors verabreicht wird. Dabei gelten die oben im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung offenbarten Ausführungsformen auch für das erfindungsgemäße Verfahren.
Im Rahmen der vorliegenden Verwendung bedeutet der Ausdruck „wirksame Menge" eine Menge, die ausreicht, um ein gewünschtes physiologisches Ergebnis zu erreichen, entweder in in vitro behandelten Zellen oder in einem in vivo behandelten Subjekt. Genauer gesagt ist eine wirksame Menge eine pharmazeutisch wirksame Menge, die ausreicht, hypertrophe Narben und/oder Keloide zu behandeln. Die wirksame Menge kann von dem jeweiligen ausgewählten Inhibitor abhängen, und hängt außerdem von einer Vielzahl von Faktoren und Bedingungen ab, die sich auf das zu behandelnde Subjekt und die Schwere der Krankheit beziehen. Beispielsweise, falls der Inhibitor in vivo verabreicht wird, sind Faktoren wie Alter, Gewicht, Geschlecht und allgemeiner Gesundheitszustand des Patienten genauso wie Dosisantwortkurven und Toxizitätsdaten, die in vorklinischen Tierversuchen erhalten wurden, von Bedeutung. Die Bestimmung einer wirksamen Menge für einen bestimmten Inhibitor ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise ist der Inhibitor in einer Konstruktion von 0,1–50 Gew.-% der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden, besonders bevorzugt 1–30%.
Der Inhibitor kann einmal oder in wiederholten Dosen verabreicht werden. Wiederholte Dosen sind bevorzugt, bis die hypertrophen Narben und/oder Keloide verschwunden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt somit erstmals Mittel bereit, mit denen hypertrophe Narben und/oder Keloide behandelt werden können oder mittels derer diesen Erkrankungen vorgebeugt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass Mrp8 und Mrp14 spezifisch in hypeitrophen Narben und Keloiden krankhaft hochreguliert sind, wobei die verstärkte Expression in den proliferierenden, suprabasalen Keratinozyten zu beobachten ist. Dagegen wird in intakter Haut und in normalen gesunden Narben, die immer nach einer Verwundung auftreten, keine Expression beobachtet. Somit wird insbesondere durch den Einsatz von siRNAs, die gegen Mrp8 und/oder Mrp14 gerichtet sind, ein lokalspezifischer Therapie bzw. Präventionsansatz bereitgestellt, der auf proliferierende Keratinozyten und damit auf krankhafte Vernarbungsprozesse beschränkt ist, während die normale Narbenbildung, die für den Abschluss des normalen Heilungsprozesses notwendig ist, nicht beeinträchtigt wird.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1: Sequenz einer humanen Mrp8 mRNA Targetsequenz gemäß SEQ ID NO:1
2: Sequenz einer humanen Mrp14 mRNA Targetsequenz gemäß SEQ ID NO:2.
3: Lokalisierung von MrpB und Mrp14 mRNA in Narbengewebe. A: Expression von Mrp14 (linke Abbildungen) und Mrp8 (rechte Abbildungen) in Keloiden (obere Abbildungen) im Vergleich zu intakter Haut (untere Abbildungen) desselben Menschen. Während in intakter Haut keine Färbung sichtbar ist wird sowohl bei Mrp8 als auch Mrp14 eine starke Färbung ausschließlich in suprabasalen Keratinozyten des Keloids beobachtet. Beispiele für angefärbte suprabasale Schichten sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. B: Lokalisierung in normalen Narben eines gesunden Probanden. Es wurde keine Färbung beobachtet.
4: Nachweis der Mrp8 und Mrp14 mRNA Expression in Narben- und Keloidbiopsien mittels TaqMan Analyse im Vergleich zu intakter Haut gesunder Probanden. Es wurde beobachtet dass spezifisch in hypertrophen Narben und Keloi den, jedoch nicht in normalen Narben gesunder Probanden eine starke Hochregulation der Expression sowohl von Mrp8 als auch Mrp14 stattfindet. Weiterhin ist bei Keloidpatienten bereits in intakter Haut ein eine erhöhte Menge an Mrp8 und Mrp14 zu beobachten, was zeigt dass die Expression von Mrp8 und Mrp14 mRNA in der Haut ein geeigneter Marker zum Nachweis einer Keloidprädisposition ist.
5: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp8 und/oder Mrp14 gerichtet sind auf die Proliferation von HaCaT Keratinozyten. 2 typische Versuchsergebnisse sind gezeigt. Eine höhere Lumineszenz zeigt dabei eine erhöhte Proliferation an. Als Negativkontrolle wurde eine siRNA verwendet die gegen EGFP gerichtet ist (GFP-d3; Tabelle 7). Der Effekt von verschiedenen siRNAs die gegen Mrp8 (1333-d1, 1333-d3; Tab. 3) und Mrp14 (1759-d2, 1759-d3; Tab. 4) gerichtet sind sowie Mischungen davon (1333-d1/1759-d3) wurden untersucht. Es wurde beobachtet dass bereits mit einer einzelnen siRNA ein voller therapeutischer bzw. präventiver Effekt erzielt werden kann.
6: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp8 und Mrp14 gerichtet sind auf die Expression von Mrp8 und Mrp14 Protein in Keratinozyten. A: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp8 gerichtet sind auf die Expression von Mrp8 Protein nachgewiesen mittels Western Blot. Der Effekt von verschiedenen siRNAs die gegen Mrp8 (1333-d1, 1333-d2, 1333-d3; Tab. 3) und Mischungen mit siRNAs die gegen Mrp14 gerichtet sind (1333-d1/1759-d3; 1333-d1/1759-d2; Tab. 3, 4) wurde untersucht. Alle siRNAs bzw. siRNA Mischungen zeigten einen deutlichen inhibitorischen Effekt auf die Mrp8 Expression. Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes Mrp8/14 nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurde der Einfluss der siRNA GFP-d3 untersucht. B: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp14 gerichtet sind auf die Expression von Mrp14 Protein nachgewiesen mittels Western Blot. Der Effekt von verschiedenen siRNAs die gegen Mrp14 (1759-d1, 1759-d2, 1759-d3; Tab. 3) und Mischungen mit siRNAs die gegen Mrp8 gerichtet sind (1333-d1/1759-d3; 1333-d1/1759-d2; 1333d1-1759-d1; Tab. 3, 4) wurde untersucht. Alle siRNAs bzw. siRNA Mischungen zeigten einen deutlichen inhibito rischen Effekt auf die Mrp14 Expression. Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes Mrp8/14 nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurde der Einfluss der siRNAs GFP-d3 und IGdI untersucht (Tab. 7). C: Effekt von siRNAs die gegen Mrp8 und/oder Mrp14 gerichtet sind auf die Expression von Mrp8 und Mrp14 mittels Western Blot. Der obere Blot zeigt einen Mrp14 Western Blot; der untere Blot zeigt einen Mrp8 Western Blot. Es wurden Proben aus dem gleichen Versuchsansatz zum Nachweis beider Proteine aufgetragen. Sparbelegung: 1: Marker; 2: Marker, 3: Negativkontrolle, mit GFP-d3 siRNA behandelte Zellen, 4: Negativkontrolle, mit IGD-d1 siRNA (Tab.7) behandelte Zellen, 5: mit siRNA 1333-d1 behandelte Zellen (Tab. 3), 6: mit siRNA 1759-d3 behandelte Zellen (Tab. 4), 7: mit siRNA Mischung 1333-d1/1759-d3 behandelte Zellen (Tab. 3, 4), 8: mit siRNA 1333-d3 behandelte Zellen (Tab. 3) 9: mit siRNA 1759-d2 behandelte Zellen (Tab. 4), 10: Kontrolle, unbehandelte Kontrollzellen.
Beispiele
Beispiel 1: Spezifische Hochregulation von Mrp8 und Mrp14 in hypertrophen Narben u. Keloiden
Zunächst wurde die Expression von Mrp8 und Mrp14 mRNA in verschiedenen Narbengewebeschnitten untersucht. Die in situ Hybridisierung (nicht radioaktiv) ermöglicht den Nachweis von mRNA am Gewebeschnitt. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der PCR ist, dass ein Bezug zur Morphologie hergestellt werden kann. Zunächst wurden zur Sondenherstellung mit Hilfe folgender Primer Amplikons mittels PCR generiert:
Die Amplikons wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt, dokumentiert und die spezifische Bande mit dem Skalpell ausgeschnitten, um anschließend das PCR Produkt mit dem QIAquick Extraction Kit (Qiagen, Hilden) zu eluieren. Die gereinigten Amplikons wurden nach Angaben des Herstellers in das Plasmid TOPO 2.1 (Invitrogen, Karlsruhe) kloniert und in kompetente Zellen (TOP 10) transformiert. Die Bakterienanzucht (Transformanten) und Plasmidisolation wurden gemäß Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) durchgeführt. Klone mit rekombinanten Plasmid (= weiß) wurden gepickt und erneut in flüssigem LB-Medium angezüchtet. Nach Aufreinigung der Plasmide über eine Silica Säule (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, Hilden) wurden die rekombinanten Plasmide zur Überprüfung des Inserts sequenziert. Zur Markierung der Sonden mit Digoxigenin-11-dUTP ("random primed" DNA-Markierung) mittels in vitro Transkription wurde der DIG RNA Labeling Kit (Roche, Mannheim) verwendet und die Transkripte anschließend präzipitiert und gelelektrophoretisch überprüft. Antisense-Sonden wurden über SP6 RNA Polymerasen generiert, während die Sense-Sonde (Negativ-Kontrolle) mit T3 RNA Polymerase transkribiert wurde.
In situ Hybridisierung:
An kryo-fixierten (PFA) Schnitten (8μm) wurden in situ Hybrisierungsfärbungen mit den oben beschriebenen für mrp8 als auch mrp14 spezifischen Sonden vorgenommen. Folgende Biopsien wurden verwendet: keloide Narbe und gesundes Areal des gleichen Patienten sowie intakte Haut eines gesunden Patienten und normale, „gesunde" Narbe eines gesunden Patienten. Die Schnitte wurden nach ent sprechender Vorbereitung (Trocknen, Proteinase K Verdau, Fix, Acetylierung) zunächst mit Hybridisierungs-Lösung (ohne Sonde) versetzt und bei 55°C (1h) inkubiert. Danach wurde die Lösung durch eine Hybridisierungs-Lösung (Antisense- bzw. Sense-Sonde enthalten, 80 ng/20 μl) ersetzt. Die Schnitte wurden über Nacht bei 55°C inkubiert. Anschließend wurden mehrere Waschschritte (SSC (2x) ± 50% Formamid-Puffer) durchgeführt, um ungebundene Sonden zu entfernen. Nach RNAse Verdau (20 μg/ml NTE-Puffer) und mehreren Waschschritten (SSC (0,1x) bzw. PBT (1x) sowie Waschpuffer (Roche, Mannheim)) wurden die Schnitte in Blockierungspuffer (Roche, Mannheim) 30 min inkubiert. Nach Entfernen des Puffers wurde ein mit alkaline Phosphatase konjugierter anti-DIG Antikörper (Verdünnung: 1:100) versetzter Blockierungspuffer zugesetzt und die Schnitte 2h darin inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen (Waschpuffer, Roche) wurden die Schnitte in Detektionspuffer (Roche, Mannheim) äquilibriert und anschließend in Färbelösung (NBT/BCIP, 200 20 μl/10 ml Detektionspuffer) überführt und die Schnitte 2 bis 24 h darin inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion wurden die Schnitte mit ddH₂O gewaschen, mikroskopisch betrachtet und ausgewertet. Alle Hybridisierungsschritte wurden unter RNAse-freien Bedingungen durchgeführt. Alle Puffer und Lösungen wurden mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) versetzt. Glaswaren wurden vor Gebrauch mit Hitze behandelt.
Die Ergebnisse des Versuchs sind in 3 zusammengestellt. Sowohl Mrp8 als auch Mrp14 mRNA wurde mittels in situ Hybridisierung spezifisch in den unteren suprabasalen, proliferierenden Zellschichten der keloiden Narbe detektiert, während in intakter Haut sowohl des Keloidpatienten als auch des gesunden Probanden wie auch in der normalen Narbe des gesunden Probanden keine Expression detektiert wurde. Mrp8 und Mrp14 zeigten ein vergleichbares Expressionsprofil. Die Negativ-Kontrolle (Sense-Sonde) zeigte keine Färbung der Schnitte.
Um die Expressionsunterschiede in Narbengewebe bzw. intakter Haut zu quantifizieren, wurde die Expression von Mrp8 und Mrp14 mRNA mittels TaqMan-Analyse in Biopsien nachgewiesen.
Dazu wurden von gesunden Probanden aus intakter Haut sowie aus normalen Narben Stanzbiopsien entnommen. Weiterhin wurden von Patienten mit hypertrophen Narben Biopsien von Narbengewebe und intakter Haut entnommen. Außerdem wurden von Patienten mit Keloiden Biopsien von Keloid und intakter Haut entnommen. Aus allen Biopsien wurde RNA isoliert. Dazu wurden die Biopsien in RNAclean-Puffer (AGS, Heidelberg), dem 1/100 Volumenanteil 2-Mercaptoethanol zugesetzt worden war, unter Verwendung eines Dispersers homogenisiert. Anschließend wurde die RNA durch zweimaliges Phenolisieren mittels mit Wasser gesättigtem saurem Phenol und in Gegenwart von 1-Bromo-3-Chloro-Propan extrahiert. Anschließend wurden eine Isopropanol- und eine Ethanol-Fällung durchgeführt und die RNA mit 75% Ethanol gewaschen. Danach wurde ein DNAse I Verdau der RNA durchgeführt. Hierzu wurden 20 μg RNA (ad 50 μl mit DEPC-behandeltem Wasser) mit 5,7 μl Transkriptionspuffer (Roche), 1 μl RNAse Inhibitor (Roche; 40 U/μl) und 1 μl DNAse I (Roche; 10 U/μl) 20 min bei 37°C inkubiert. Dann wurde wiederum 1 μl DNAse I zugegeben und weitere 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die RNA phenolisiert, Ethanol-gefällt und gewaschen. Alle oben aufgeführten Schritte wurden mit DEPC (Diethylpyrocarbonat)-behandelten Lösungen bzw. Flüssigkeiten durchgeführt, soweit diese keine reaktiven Aminogruppen enthielten.
Anschließend erfolgte die Herstellung von cDNA aus der extrahierten RNA. Dies erfolgte in Gegenwart von 1 × TaqMan RT-Puffer (Perkin Elmer), 5,5 mM MgCl₂ (Perkin Elmer), je 500 μM dNTPs (Perkin Elmer), 2,5 μM Random Hexamere (Perkin Elmer), 1,25 U/μl MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μl Perkin Elmer), 0,4 U/μl RNase Inhibitor (20 U/μl, Perkin Elmer), 20 μl RNA (50 ng/μl) und DEPC-behandeltem Wasser (ad 100 μl Volumen). Nach Zugabe der RNA und guter Durchmischung wurde die Lösung auf zwei 0,2 ml Gefäße verteilt (je 50 μl) und die reverse Transkription in einem Temperatur-Cycler durchgeführt (10 min bei 25°C; 30 min bei 48°C und 5 min bei 95°C). Die nachfolgende Quantifizierung der cDNA erfolgte mittels quantitativer PCR unter Verwendung des SYBR Green PCR Master Mixes (Perkin Elmer), wobei für die Bestimmung der Mrp8 bzw. Mrp14 cDNA Menge eine Dreifachbestimmung durchgeführt wurde. Als Referenz wurde Cyclophilin A (Gen Bank: XM039526) verwendet. Die Stammlösung für jedes Triplett enthielt bei 57 μl Gesamtvolumen 37,5 μl 2 × SYBR Master Mix, 0,75 μl AmpErase UNG (1 U/μl) und 18,75 μl DEPC-behandeltes Wasser. Pro Dreifachbestimmung wurden zu 57 μl Stammlösung je 1,5 μl Vorwärts- und Rückwärts-Primer in einem zuvor optimierten Konzentrationsverhältnis hinzugefügt. Je 60 μl der Stammlösung/Primer-Mischung wurde mit 15 μl cDNA-Lösung (2 ng/μl) gemischt und auf drei Wells verteilt. Parallel dazu wurde eine Stammlösung mit Primern zur Bestimmung von Cyclophilin A hergestellt, mit weiteren 15 μl der gleichen cDNA-Lösung gemischt und auf drei Wells verteilt. Außerdem wurden, um eine Standardkurve für die Cyclophilin-PCR zu erstellen, verschiedene cDNA-Lösungen als Verdünnungsreihe hergestellt (4 ng/μl; 2 ng/μl; 1 ng/μl; 0,5 ng/μl und 0,25 ng/μl). Je 15 μl dieser cDNA-Lösungen wurden mit 60 μl Stammlösung/Primer-Mischung zur Bestimmung von Cyclophilin gemischt und auf drei Wells verteilt. Ebenso wurde eine Standardkurve für Mrp8 bzw. Mrp14 erstellt; dabei wurden dieselben Verdünnungen, die auch für die Cyclophilin-Standardkurve zum Einsatz kamen, verwendet. Als Kontrolle diente ein PCR Ansatz ohne cDNA. Zu jeweils 60 μl Stammlösung/Primer-Mischung von jeweils humanem Mrp8 bzw. Mrp14 und Cyclophilin wurden je 15 μl DEPC-Wasser gegeben, gemischt und jeweils auf drei Wells verteilt. Die Amplifikation der Ansätze wurde im GeneAmp 5700 durchgeführt (2 min bei 50°C; 10 min bei 95°C, gefolgt von 3 Zyklen mit 15 sek bei 96°C und 2 min bei 60°C; danach 37 Zyklen mit 15 sek bei 95°C und 1 min bei 60°C). Die Auswertung erfolgte durch die Bestimmung der relativen Abundanz von Mrp8 und Mrp14 in Bezug auf die Cyclophilin Referenz. Dazu wurde zuerst eine Standardkurve erstellt, indem die C_T-Werte der Verdünnungsreihe gegen den Logarithmus der cDNA-Menge im PCR-Ansatz (in ng umgeschriebener RNA) aufgetragen wurden und die Steigung (s) der Geraden ermittelt wurde. Die Effizienz (E) der PCR ergibt sich dann wie folgt: E = 10^–1/s – 1. Die relative Abundanz (X) der untersuchten cDNA Spezies (Y) in Bezug auf Cyclophilin ist dann: X = (1 + E_Cyclophilin)^C _T ^{(Cyclophilin)}/(1 + E_Y)^C _T ^(Y). Anschließend wurden die Zahlenwerte normiert, indem die Menge an cDNA aus intakter Haut gesunder Probanden 1 gesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in 4 zusammengestellt.
Es zeigte sich, dass, wie bereits oben gezeigt, eine spezifische Fehlregulation von Mrp8 und Mrp14 mRNA in krankhaftem Narbengewebe, aber nicht in gesundem Narbengewebe auftritt: sowohl in hypertrophen Narben als auch in Keloiden ist die Expression beider mRNAs stark erhöht, während in normalen Wunden keine Erhöhung der Expression gegenüber intakter Haut festgestellt wurde. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Therapie und/oder Prävention von hypertrophen Narben und Keloiden eingesetzt werden können, da eine spezifische Fehlregulation in erkranktem Gewebe vorliegt. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Mrp8 und Mrp14 geeignet sind eine Prädisposition für Keloide zu diagnostizieren, da sowohl für Mrp8 und Mrp14 erhöhte Mengen an mRNA in intakter Haut von Keloidpatienten gefunden wurde im Vergleich zu intakter Haut von gesunden Probanden.
Beispiel 2: Einfluss von siRNAs die an Mrp8 oder Mrp14 binden auf die Proliferation von Keratinozyten
Um den Einfluß von Mrp8 und Mrp14 auf die Proliferation von Keratinozyten zu untersuchen, wurde die Expression der beiden Gene durch die Transfektion genspezifischer siRNAs inhibiert und der Einfluß auf die Zellproliferation über einen Vitalitätsassay analysiert. Dazu wurden siRNAs, die gegen Mrp8 oder Mrp14 gerichtet sind eingesetzt, sowie Mischungen aus siRNAs die gegen Mrp8 und Mrp14 gerichtet sind. Die Basissequenz und Aufbau verwendeter siRNAs sind in Tabellen 3 und 4 aufgeführt: 1333-d1, 1333-d3, 1759-d2, 1759-d3. Die in den Tabellen angegebenen Basissequenzen stellen die ersten 19 Nukleinsäuren des Sense-Strangs des siRNA Moleküls dar. Alle siRNAs waren aus je zwei RNA Strängen aufgebaut die im Bereich der angegebenen 19 Nukleotide langen Sequenz komplementär waren (d.h. Watson-Crick Basenpaarung) und am 3'-Ende jeweils 2-Nukleotide lange dTdT-Überhänge hatten. Als Negativkontrolle wurde eine EGFP spezifische siRNA (GFP-d3, Tab. 7) transfiziert. Zur Durchführung dieses Assays wurden HaCaT Zellen verwendet, welche in DMEM (GIBCO^TM) mit 10% FCS (PAN^TM) kultiviert werden. Der gesamte Assay lief über einen Zeitraum von 5 Tagen. Die Zellen wurden mit einer Zellzahl von 150.000 Zellen pro Welt 24 Stunden vor der ersten Transfektion in eine 24-Well-Platte (BD Falcon) ausgesät. Die lyophilisierten siRNAs wurden auf eine Konzentration von 20μM eingestellt. Der 1. Teil des Transfektionsansatzes wurde durch vorsichtiges Mischen von 9μl Optimem I (GIBCO^TM) mit 6μl Oligofectamin^TM (Invitrogen) hergestellt. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wurde der 2. Teil, bestehend aus 47 μl Optimem I und 6 μl siRNA (Bei einer Kombination zweier siRNAs, je 3 μl), in einem neuen Eppendorfgefäß vorgelegt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der 1. Teil in den 2. Teil pipettiert, vorsichtig vermischt und weitere 22 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte eine Zugabe von 182μl Optimem I. Das Kulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und die Zellen einmal mit Optimem I gewaschen. Anschließend wurden 250μl Transfektionsansatz/Well auf die Zellen gegeben und diese 4 h im Brutschrank (37°C/10% CO₂/95% rH) inkubiert. Nach der Inkubationszeit erfolgte die Zugabe von 150μl DMEM/30% FCS zur Regeneration der Zellen über Nacht. Am darauf folgenden Tag wurde die Transfektion wie oben beschrieben wiederholt mit dem einzigen Unterschied, dass die Zellen vor Zugabe des Transfektionsansatzes nicht mit Optimem I gewaschen wurden, da sie hierdurch austrocknen würden. Um dies zu verhindern gibt man vor dem Absaugen des Mediums DPBS (PAN^TM Biotech GmbH) in die Wells. Am 5. Tag, 48 h nach der 2. Transfektion, wurde die Zellvitalität mit Hilfe des CellTiter-Glo^TM Lumineszenz Zellvitalitätsassays von Promega analysiert. Hierfür wurde der Überstand abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und dann 200μl CellTiter-Glo/Well auf die Zellen gegeben. Die Platte wurde 10 min bei RT auf dem Rota tionsschüttler inkubiert, anschließend 100μl in eine 96-Well-Platte (BD Falcon) überführt und die Lumineszenz im Fusion^TMα (Packard BioScience) gemessen.
Die Versuche wurden mehrfach durchgeführt; 2 repräsentative Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Überraschenderweise wurde zum ersten Mal gefunden, dass siRNAs die gegen Mrp8 und/oder Mrp14 gerichtet sind, die Proliferation von Keratinozyten hemmen und somit diese siRNAs zur Prävention und/oder Therapie von von hypertrophen Narben und Keloiden. eingesetzt werden können. Darüber hinaus wurde überraschenderweise festgestellt dass die Gabe einer siRNA die gegen Mrp8 oder Mrp14 gerichtet ist, ausreicht, um den Effekt zu erreichen, die eine Mischung von siRNAs die gegen Mrp8 und Mrp14 gerichtet sind, bewirkt (siehe 5). Somit haben die neuen Nukleinsäuren den überraschenderweise Vorteil, dass die Gabe einer einzelnen Nukleinsäure, einer dsRNA, ausreicht um den vollen therapeutischen Effekt zu erreichen.
Beispiel 3: Einfluss von siRNAs die an Mrp8 oder Mrp14 binden auf Expression von Mrp8 und Mrp14
Es wurde untersucht, ob die verwendeten siRNAs, die gegen Mrp8 oder Mrp14 gerichtet sind, tatsächlich die Expression von Mrp8 oder Mrp14 beeinflussen. Verwendete siRNAs sind in Tabellen 4 und 3 aufgeführt (siehe auch Beispiel 1): 1333-d1, 1333-d2, 1333-d3, 1759-d1, 1759-d2, 1759-d3. Als Positivkontrolle wurde eine IGF-RI spezifische siRNA (IGd-1; Tabelle 7) und als Negativkontrolle eine EGFP spezifische siRNA (GFP-d3, Tab. 7) transfiziert. Zur Durchführung dieses Assays wurden HaCaT Zellen verwendet, welche nach stabiler Transfektion mit Mrp8 und Mrp14-Expressions-Plasmiden, beide Proteine überexprimieren (HaCaT mrp8p14n; S. Werner, ETH Zürich). Diese Zellen wurden in DMEM (GIBCO^TM) mit 10% FCS (PAN^TM), 0,1mg/ml Puromycin (SIGMA^TM) und 0,4mg/ml Geneticin (GIBCO^TM) kultiviert. Der gesamte Assay lief über einen Zeitraum von 4 Tagen. Die Zellen wurden mit einer Zellzahl von 100.000 Zellen pro Well 24 Stunden vor der ersten Transfektion in eine 24-Well-Platte (BD Fal con) in DMEM (GIBCO^TM) mit 10% FCS (PAN^TM) ohne Antibiotika ausgesät. Die lyhophilisierten siRNAs wurden auf eine Konzentration von 20μM eingestellt. Der 1. Teil des Transfektionsansatzes wurde durch vorsichtiges Mischen von 9μl Optimem I (GIBCO^TM) mit 6μl Oligofectamin^TM (Invitrogen) hergestellt. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wurde der 2. Teil, bestehend aus 47 μl Optimem I und 6 μl siRNA (Bei einer Kombination zweier siRNAs, je 3 μl), in einem neuen Eppendorfgefäß vorgelegt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der 1. Teil in den 2. Teil pipettiert, vorsichtig vermischt und weitere 22 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte eine Zugabe von 182μl Optimem I. Das Kulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und die Zellen einmal mit Optimem I gewaschen. Anschließend wurden 250μl Transfektionsansatz/Well auf die Zellen gegeben und diese 4 h im Brutschrank (37°C/10% CO2/95% rH) inkubiert. Nach der Inkubationszeit erfolgte die Zugabe von 150μl DMEM/30% FCS zur Regeneration der Zellen über Nacht. Am darauf folgenden Tag wurde die Transfektion wie oben beschrieben wiederholt mit dem einzigen Unterschied, dass die Zellen vor Zugabe des Transfektionsansatzes nicht mit Optimem I gewaschen wurden, da sie hierdurch austrocknen würden. Um dies zu verhindern gibt man vor dem Absaugen des Mediums DPBS (PAN^TM Biotech GmbH) in die Wells. Am 4. Tag, 24 h nach der 2. Transfektion, wurden die Zellen für die anschließende Western-Blot-Analyse geerntet. Dazu wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen einmal mit DPBS gewaschen. Durch Zugabe von 50μl/ Well Roti^®-Load1-Proteinauftragspuffer (ROTH) wurden die Zellen lysiert. Das Zell-Lysat wurde für 5 min auf 95°C erhitzt und durch Zentrifugation mit QIAshredder (QIAGEN) homogenisiert. Die Western-Blot-Analyse wurde mit dem XCell SureLock^TM Mini-Cell- und XCell II^TM Blot Module-System und 18% Novex^® Tris-Glycin Gelen mit 10 Taschen (INVITROGEN) durchgeführt. Von jeder Probe wurden je 25μl auf zwei Gele aufgetragen. Die Laufzeit der SDS-PAGE betrug 2,5h bei 130V und die Transferzeit auf die Nitrozellulose-Membran (AMERSHAM Biosciences) 1h bei 25V. Der Nachweis von Mrp8 erfolgte mit einem Maus-anti-Mrp8-Biotin Anti körper (Dianova) und Steptavidin-HRP (R&D Systems) jeweils in einer 1:200 Verdünnung. Der Nachweis von Mrp14 erfolgte mit einem Kaninchen-anti-Mrp14 Antikörper (J. Roth, Universitätsklinikum Münster) in einer 1:500 Verdünnung und einem Maus-anti-Kaninchen-Ig-HRP Antikörper (Promega) in einer 1:5000 Verdünnung. Zur Kontrolle der Gesamtproteinmenge in jeder Spur wurde die Membran nach dem Transfer bei einer Laufhöhe von 36kDa geteilt und der obere Teil der Membran mit einem Maus-anti-Aktin Antikörper (Chemicon) und einem anti-Maus-Ig-HRP Antikörper jeweils in einer 1:5000 Verdünnung gefärbt. Für die Chemilumineszenz-Reaktion und deren Nachweis wurde das ECL^TM Western Blotting Detection Reagent und ECL^TM Hyperfilm (AMERSHAM Biosciences) verwendet.
In einem ersten Ansatz wurde der Einfluss der siRNAs 1333-d1, 1333-d2 und 1333-d3 sowie Mischungen von 1333-d1 mit 1759-d2 und 1759-d3 auf die Expression von Mrp8 Protein untersucht. Das Ergebnis ist in 6A dargestellt: Erwartungsgemäß bewirken alle siRNAs und siRNA Mischungen eine verminderte Menge an Mrp8 Protein, da jeweils eine gegen Mrp8 gerichtete siRNA transfiziert wurde (wenn auch z.T. in einer Mischung mit einer weiteren siRNA, die gegen Mrp14 gerichtet ist). Dagegen wurde bei Verwendung der GFP-d3 KontrollsiRNA keine verminderte Expression beobachtet. In einem weiteren Ansatz wurde der Einfluss der siRNAs 1759-d1, 1759-d2 und 1759-d3 sowie Mischungen von 1759-d1, 1759-d2 und 1759-d3 mit 1333-d1 auf die Expression von Mrp14 Protein untersucht. Das Ergebnis ist in 6B dargestellt: Erwartungsgemäß bewirken alle diese siRNAs und siRNA Mischungen eine verminderte Menge an Mrp14 Protein, da jeweils eine gegen Mrp14 gerichtete siRNA transfiziert wurde (wenn auch z.T. in einer Mischung mit einer weiteren siRNA, die gegen Mrp8 gerichtet ist). Dagegen wurde bei Verwendung der IG-d1 und GFP-d3 Kontroll-siRNAs keine verminderte Expression beobachtet. In einem weiteren Versuch wurde gestestet ob siRNAs die gegen Mrp8 gerichtet sind einen Einfluss auf die Menge an Mrp14 Protein haben und umgekehrt. Dazu wurden wiederum die Mrp8 und Mrp14 überexprimierenden HaCaT Zellen mit siRNAs die gegen Mrp8 gerichtet sind (1333-d1, 1333-d3), sowie siRNAs die gegen Mrp14 gerichtet sind (1759-d2, 1759-d3) sowie Mischungen davon transfiziert und anschließend die Proben parallel auf Mrp8 und Mrp14 mittels Western Blot analysiert. Als Kontrolle wurden siRNAs IgD-d1 und GFP-d3 eingesetzt. Als Positivkontrolle für den Western Blot wurde rekombinantes Mrp8/Mrp14 mit aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 6C zusammengestellt. Überraschenderweise wurde festgestellt, dass siRNAs, die gegen Mrp14 gerichtet sind, eine Erniedrigung der Mrp8 und Mrp14 Menge in gleichem Masse bewirken (siehe z.B. Spur 6 Mrp8 und Mrp14 Blots vs. Spur 3 (Kontrolle)) und dass siRNAs, die gegen Mrp8 gerichtet sind, eine Erniedrigung der Mrp8 und Mrp14 Menge in gleichem Masse bewirken (siehe z.B. Spuren 5, 8 Mrp8 und Mrp14 Blots vs. Spur 3 (Kontrolle)). Außerdem ist überraschenderweise festgestellt worden dass der Einsatz von Mischungen aus siRNAs die gegen Mrp8 und Mrp14 gerichtet sind keinen zusätzlichen Effekt auf die Expression haben. Somit konnte bestätigt werden dass die erfindungsgemässen Nukleinsäuren geeignet sind sowohl Mrp8 und Mrp14 Proteinmengen in HaCaT Zellen zu verringern und somit eine Verringerung der Zellproliferation bewirken, wie in Beispiel 2 gezeigt. Grundsequenzen von denen bevorzugte siRNA Moleküle die gegen Mrp8 gerichtet sind, abgeleitet sind Tabelle 1

Grundsequenzen von denen bevorzugte siRNA Moleküle die gegen Mrp14 gerichtet sind, abgeleitet sind Tabelle 2

Tabelle 3: Grundsequenzen von denen besonders bevorzugte siRNA Moleküle die gegen Mrp8 gerichtet sind, abgeleitet sind
Tabelle 4: Grundsequenzen von denen besonders bevorzugte siRNA Moleküle die gegen Mrp14 gerichtet sind, abgeleitet sind

Tabelle 5: Basissequenzen von denen bevorzugte siRNA Moleküle die gegen Mrp8 gerichtet sind, abgeleitet sind. Die Basis-Targetsequenzen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleinsäuren an Positionen -1 und -2 Adenosine (A) sind

Tabelle 6: Basissequenzen von denen bevorzugte siRNA Moleküle die gegen Mrp14 gerichtet sind, abgeleitet sind. Die Basis-Targetsequenzen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleinsäuren an Positionen -1 und -2 Aderrosine (A) sind

Tabelle 7: Verwendete Kontroll-siRNA-Moleküle

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung mindestens eines Mrp8- und/oder eines Mrp14 Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Inhibitor von humanem Mrp8 und/oder humanem Mrp14 handelt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Inhibitor verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Antikörpern, anderen natürlichen oder synthetischen Proteinen und Peptiden, die beispielsweise eine erhöhte Degradation von Mrp8 und/oder Mrp14 bewirken, Molekülen mit geringem Molekulargewicht (LMWs) und Mrp8/Mrp14 Rezeptor-Antagonisten.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine Nukleinsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ein Antisense-Molekül oder eine siRNA ist, vorzugsweise eine siRNA.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Sense-Strang der siRNA oder der doppelsträngige Anteil des Sense-Stranges der siRNA eine wie in SEQ ID NO:3-946 dargestellte Sequenz aufweist oder umfasst.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die SEQ ID NO ausgewählt ist aus den Nummern 164, 202, 230, 548, 649, 712.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Antisense-Molekül eine komplementäre Sequenz zu einer der in SEQ ID NO:3-946 dargestellten Sequenzen oder Teilen davon aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Antisense-Molekül modifizierte Nukleinsäuren aufweist, vorzugsweise Phosphothioat-, Methylphosphonat- oder Peptidbindungen.
Mrp8 oder Mrp14 Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure, wie in den Ansprüchen 6–10 definiert, ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen Inhibitor gemäß Anspruch 11.