Der vorliegenden Erfindung liegt
daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives System zur Einflußnahme auf
die Nozizeption, insbesondere zur Schmerzbekämpfung, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die in den
Ansprüchen
gekennzeichneten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung gelöst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure bereitgestellt,
enthaltend einen Sequenzabschnitt, der mindestens einen die Expression
des VR1-Rezeptors
modulierenden Bereich der Sequenz gemäß 3 und/oder gemäß 4 und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399,
Positionen 221931 bis 223344, und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116,
Positionen 31673 bis 36359, und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787,
Positionen 44731 bis 43231 (unter dieser GenBank-Zugriffsnummer
ist einer reverse Sequenz abgelegt) und/oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787,
Positionen 36616 bis 33151 (unter dieser GenBank-Zugriffsnummer
ist eine reverse Sequenz abgelegt) aufweist, oder ein die Expression
des VR1-Rezeptors modulierendes homologes Derivat, Allel oder Fragment
davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende
Sequenz.
Der Ausdruck "die Expression des VR1-Rezeptors modulierender
Bereich" bedeutet,
daß der
entsprechende Bereich der vorstehend genannten Nukleotidsequenzen
regulierend, d.h. entweder verstärkend
oder hemmend, bei der Expression des Vanilloid-Rezeptors, insbesondere
bei der Transkription, einzugreifen vermag.
Bspw. wirken Bereiche mit Enhancer-Funktion
der obigen Sequenzen, insbesondere die Bereiche der Sequenzen gemäß 3 bzw. 4, verstärkend, während solche, die Repressorbindungsstellen
aufweisen, vermindernd auf die Expressionsrate, insbesondere die
Transkriptionsrate des auf die in der 3 gezeigten 5'-regulatorischen Region folgenden VR1-Gens
(in diesem Fall beginnend mit Exaon 1 ab), bzw. die Transkriptionsrate
des auf die in der 4 gezeigten
5'-regulatorischen Region
folgenden VR1-Gens (in diesem Fall entweder beginnend mit Exon 1c
oder Exon 1d), insbesondere des Gens der Ratte wirken. Bspw. ist
eine Repressorwirkung der nachstehenden Faktoren delta EF1 und GFI1
bekannt (Funahasi et al. (1993) Development 119(2): 433-446; Zweidler
et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 08/1996: 4024-4034. Ebenfalls wirken
Bereiche mit Enhancer-Funktion der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399,
Positionen 221931 bis 223344, bzw. der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer
AL663116, Positionen 31673 bis 36359, verstärkend auf die Expressionrate
(z.B. Transkriptionsrate) des jeweiligen auf den in diesen Sequenzen
enthaltenen 5'-regulatorischen
Bereich folgenden VR1-Gens (beginnend mit Exon 1 ab oder Exon 1c
bzw. Exon 1d), während
Bereiche mit Repressorfunktion auf die Expressionsrate des VR1-Gens,
insbesondere des VR1-Gens der Maus, vermindern wirken. Dementsprechend
wirken Bereiche mit Enhancer-Funktion der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787,
Positionen 44731 bis 43231, bzw. der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787,
Positionen 36616 bis 33151, verstärkend auf die Expressionrate
(z.B. Transkriptionsrate) des jeweiligen auf den in diesen Sequenzen
enthaltenen 5'-regulatorischen
Bereich folgenden VR1-Gens (beginnendr mit Exon 1ab oder Exon 1c
bzw. Exon 1d), während
Bereiche mit Repressorfunktion auf die Expressionsrate des VR1-Gens,
insbesondere des humanen VR1-Gens, vermindern wirken.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der die
Expression des VR1-Rezeptors modulierende Bereich mindes tens eine
in der Sequenz der 3 und/oder 4 vorhandene Transkriptionsfaktorbindungsstelle,
insbesondere eine Kernsequenz (Bindungsmotiv) einer derartigen Bindungsstelle.
Bevorzugte Bindungsstellen umfassen die Bindungsmotive für die Transkriptionsfaktoren MZF1
(myeloid zinc finger protein 1; vgl. z.B. Position 39, 173, 1169
gemäß 3), NFkappaB (nuclear factor-kappaB;
vgl. z.B. Position 39 gemäß 3), GATA 1/2/3 (GATA-binding
factor, vgl. z.B. Position 62, 376, 1076 gemäß 3), IK 2 (Ikaros factor 2; vgl. z.B.
Position 174, 517, 1087, 1235 gemäß 3), NFAT (nuclear factor of activated
T-cells; vgl. z.B. Position 176, 1089 gemäß 3 bzw. Position 4013, 4139 gemäß 4), AP4 (activatorprotein
4; vgl. z.B. Position 336 gemäß 3), SRY (sex-determining
region Y gene product; vgl. z.B. Position 392 gemäß 3), SOX5 (Sox-5; vgl. z.B.
Position 393 gemäß 3), CP2 (vgl. z.B. Position
498 gemäß 3), cMyb (vgl. z.B. Position
824 gemäß 3), SREBP1 (sterol regulatory
element-binding protein; vgl. z.B. Position 982 gemäß 3), deltaEF1 (delta-crystalli/E2-box
factor 1; vgl. z.B. Position 984, 998, 1118, 1294 gemäß 3), MyoD (myoblast determining
factor, vgl. z.B. Position 983, 997 gemäß 3), GKLF (gut-enriched Krüppel-like
factor; vgl. z.B. Position 1099 gemäß 3), NRF2 (nuclear respiratory factor
2; vgl. z.B. Position 1104 gemäß 3), NF1 (nuclear factor
1; vgl. z.B. Position 1122 gemäß 3), CETS1P54 (c-Ets (p54);
vgl. z.B. Position 1254 gemäß 3) und NFY (nuclear factor
Y; vgl. z.B. Position 1346 gemäß 3).
Zusätzlich oder alternativ in der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure bevorzugt
vorhandene Transkriptionsfaktorbindungsstellen sind z.B. diejenigen
für TH1E47
(Thing1/E47 heterodimer, vgl. z.B. Position 560, 1533 gemäß 4), RORA1 (RAR-related
orphan receptor alphal; vgl. z.B. Position 699 gemäß 4), SRY (vgl. z.B. Position
744 gemäß 4), GFI1 (growth faetor
independence 1; vgl. z.B. Position 749 gemäß 4), AP1 (activator protein 1; vgl. z.B.
Position 870, 998 gemäß 4), deltaEF1 (vgl. z.B.
Position 1030, 4372 gemäß 4), GATA 1 (vgl. z.B. Position
1129 gemäß 4), TCF11 (TCF11/KCR-F1/Nrf1
homodimers; vgl. z.B. Position 1381 gemäß 4), MZF1(vgl. z.B. Position 3375, 4255
gemäß 4) IK2/1 (vgl. z.B. Position
3376, 4137, 4149, 4159, 4505 gemäß 4), Brn2 (POU factor Brn2;
vgl. z.B. Position 3484 gemäß 4), cMyb (vgl. z.B.
Position 3557 gemäß 4), S8 (vgl. z.B. Position 3731 gemäß 4), MyoD (vgl. z.B. Position
3890 gemäß 4), NKX25 (homeodomain
factor Nkx-2.5/Csx; vgl. z.B. Position 4065 gemäß 4), NF1 (vgl. z.B. Position 4104 gemäß 4), AP4 (vgl. z.B. Position
4179, 4182, 4308, 4334, 4418 gemäß 4), HNF3B (hepatocyte nuclear
factor-3beta; vgl. z.B. Position 4204 gemäß 4) und HFH2 (HNF3 forkhead homologue 2;
vgl. z.B. Position 4204 gemäß 4). Selbstverständlich kann
die erfidungsgemäße Nukleinsäure eine
oder mehrere derartige Bindungsstellen eines oder mehrerer Transkriptionsfaktoren,
alleine oder in irgendeiner Kombination, enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die oben definierte
Nukleinsäure
als doppelsträngiges
DNA-Molekül. Als
ein solches DNA-Molekül,
insbesondere wenn es relativ kurzes Oligodesoxyribonukleotid (ODN)
vorliegt, stellt die Nukleinsäure
ein sog. "Decoy-ODN" oder "Cis-Element Deco" dar, das eine Sequenz
enthält,
die der natürlichen
Kernbindungssequenz bspw. einer der vorstehend genannten Transkriptionsfaktoren
entspricht oder ähnelt
und an die der jeweilige Transkriptionsfaktor, insbesondere die
vorgenannten Transkriptionsfaktoren, in der Zelle, insbesondere
im Zellkern, bindet. Das Cis-Element Decoy wirkt daher als Molekül zur kompetitiven
Hemmung der Aktivität
des jeweiligen Transkriptionsfaktors.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung
besteht daher darin, die erfindungsgemäße Nukleinsäure als Inhibitor der Aktivität von an
die 5'-regulatorischen
Region des VR1-Gens gemäß den Sequenzen
in 3, 4, GenBank-Zugriffsnummer AL670399,
Positionen 221931 bis 223344, GenBank-Zugriffsnummer AL663116, Positionen
31673 bis 36359, GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 44731
bis 43231, oder GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen 36616
bis 33151 bindenden Transkriptionsfaktoren als Arzneimittel einzusetzen.
Derartige Proteine, zu denen auch die vorgenannten Transkriptionsfaktoren
zählen, können in
ihrer Wirkung als Transkriptionsaktivatoren durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit
Wirkung als Cis-Element Decoy inhibiert werden.
Bevorzugt zur spezifischen Inhibierung
der Aktivität,
insbesondere vorstehend genannter Transkriptionsfaktoren, ist daher
die Verwendung von erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotiden (auch
Cis-Decoy oder Decoy-ODN
genannt), die eine oder mehrere Bindungsstellen für die oder
den jeweiligen Transkriptionsfaktor(en) enthalten. Die exogene Zufuhr
einer großen
Zahl von Transkriptionsfaktorbindungsstellen, insbesondere in viel
höherer
Zahl als im Genom vorhanden, erzeugt eine Situation, in der ein
Großteil eines
bestimmten intrazellulär
vorliegenden Transkriptionsfaktors spezfisch an das jeweilige Cis-Element Decoy und
nicht an seine endogenen Ziel-Bindungsstellen im Genom bindet. Dieser
Ansatz zur Inhibition der Bindung von Transkriptionsfaktoren an
ihre endogene Bindungsstelle wird auch als "Squelching" bezeichnet. Das Squelching der Transkription
unter Verwendung von Cis-Element Decoy wurde bspw. erfolgreich eingesetzt, um
das Wachstum von Zellen zu inhibieren. Dabei wurden DNA-Fragmente
verwendet, die spezifische Transkriptionsfaktorbindungsstellen des
Transkriptionsfaktors E2F enthielten (Morishita et al. (1995) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 92: 5855).
Erfindungsgemäß ist bspw. die Sequenz einer
Nukleinsäure
geeignet, die an die Transkriptionsfaktoren C/EBP B, MZF, Nkx 2.5,
NF-AT, GATA, MZF, Brn-2, IK2 oder AT4 bindet. C-EBTB bindet spezifisch
an das Motiv mit der Kernsequenz GCAA, MZF bindet spezifisch an
Motive mit der Kernsequenz GGG, Nkx 2.5 bindet spezifisch an Motive
mit der Kernsequenz TAAT, NF-AT bindet spezifisch an Motive mit
der Kernsequenz GAAA, GATA bindet spezifisch an Sequenzen mit dem
Kernmotiv GATA, Brn-2 bindet spezifisch an Kernsequenzen mit dem
Motiv AAAT, IK2 bindet spezifisch an das Motiv mit der Kernsequenz
GGGA und AP4 bindet spezifisch an Motive mit der Kernsequenz GAGC.
Weitere spezifische Beispiele für
erfindungsgemäß verwendbare
Motive können
den in den Tabellen 1 bis 6 (jeweils letzte (rechte) Spalte) im
Anhang angegebenen Sequenzen entnommen werden, wobei die jeweilige
Kernsequenz (Bindungsmotiv) in Großbuchstaben hervorgehoben ist.
Daher kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure als
Cis-Element Decoy als Oligomer ausgestaltet sein, das eine oder
mehrere der vorstehenden Konsensus-Kernbindungssequenzen aufweist.
Selbstverständlich kann
das Cis-Element Decoy eine variable Größe aufweisen, die deutlich
größer als
die jeweilige Kernbindungssequenz ist und am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende verlängert ist.
Da die Nukleinsäure als Cis-Element Decoy eine
doppelsträngige
Nukleinsäure
ist, umfaßt
ein derartiges erfindungsgemäßes DNA-Oligonukleotid
jeweils nicht nur die Sense- oder Forward-Sequenz, sondern auch
die komplementäre
Antisense- oder Reverse-Sequenz. Die jeweiligen komplementären Sequenzen
sind hier nicht wiedergegeben, ergeben sich jedoch für einen
Fachmann leicht einsehbar aus der spezifischen Basenpaarung (A-T,
G-C) in DNA-Molekülen.
Das erfindungsgemäße Cis-Element Decoy kann aufgrund
der spezifischen Basenpaarung in DNA nicht nur mehrere Bindungsstellen
für einen
oder mehrere Transkriptionsfaktoren auf einem Strang aufweisen, sondern
es kann/können
jeweils eine oder mehrere Bindungsstellen im Sense- und Antisense-Strang
vorliegen. Einem Fachmann ist daher ersichtlich, daß eine Vielzahl
von Sequenzen als Inhibitoren bspw. für die vorstehend genannten
Transkriptionsfaktoren verwendet werden können, solange sie die vorstehend
dargelegten Bedingungen der Konsensus-Kernbindungssequenzen erfüllen und
eine Affinität
zum jeweiligen Transkriptionsfaktor aufweisen.
Die Affinität der Bindung einer erfindungsgemäßen doppelsträngigen Nukleinsäuresequenz
an einen Transkriptionsfaktor kann durch die Verwendung des Electrophoretic
Mobility Shift Assay (EMSA) (Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning:
A Laboratory Handbook, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold
Spring Harbour; Krzesc et al. (1999) FEBS Lett. 453: 191) bestimmt
werden. Dieser Test ist für
die Qualitätskontrolle der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure bei
der Verwendung als Transkriptionsinhibitor des VR1-Gens bzw. für die Bestimmung
der optimalen Länge
einer Bindungsstelle besonders geeignet. Der EMSA ist ebenfalls
zur Identifizierung anderer Sequenzen, an welche die vorstehend
genannten Transkriptionsfaktoren oder andere Transkriptionsfaktoren,
welche an die in der 1 gezeigte
Sequenz binden, geeignet. Das EMSA-Testsystem, wel ches für die Isolierung
neuer Bindungsstellen verwendet wird, wird bevorzugt mit gereinigten
oder rekombinant exprimierten Versionen der jeweiligen Transkriptionsfaktoren
durchgeführt,
die in mehreren abwechselnden Runden von PCR-Vervielfältigung und Selektion beim
EMSA eingesetzt werden (Thiesen und Bach (1990) Nucleic Acids Res.
18: 3203).
Durch die erfindungsgemäße Nukleinsäure als
Cis-Element Decoy wird die Transkription des VR1-Gens derart moduliert,
daß dieses
Gen nicht oder vermindert exprimiert wird. Verminderte oder unterdrückte Expression
bedeutet gemäß der vorliegenden
Erfindung, daß die
Transkriptionsrate verringert ist im Vergleich zu Zellen, die nicht
mit einem erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotid behandelt werden.
Eine derartige Verminderung kann bspw. mittels Northern Blot (Sambrook
et al., supra) oder RT-PCR (Sambrook et al., supra) bestimmt werden.
Es ist erfindungsgemäß ebenfalls
möglich,
die als Cis-Element Decoy ausgestaltete Nukleinsäure zur Erhöhung der Expressionsrate des
VR1-Gens einzusetzen, indem im Cis-Element Decoy eine oder mehrere Bindungsstellen
für ein
die Transkriptionsrate des VR1-Gens verminderendes Protein (Repressor)
vorhanden sind. Als Beispiele für
derartige Sequenzen können
die bereits vorstehend genannten Faktoren delta EF1 und GFI1, von
denen eine Repressorwirkung bekannt ist, angeführt werden.
Typischerweise wird die Transkriptionsrate
des VR1-Gens bei mit erfindungsgemäßen Decoys behandelten Zellen
im Vergleich zu Zellen, die nicht mit einem erfindungsgemäßen doppelsträngigen DNA-Oligonukleotid
behandelt werden, mindestens 2-fach, insbesondere 5-fach, besonders
bevorzugt mindestens 10-fach verringert
oder erhöht.
Die als Cis-Element Decoy verwendete
erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält in einer
bevorzugten Ausführungsform
ein oder mehrere, vorzugsweise 1, 2, 3, 4 oder 5, insbesondere bevorzugt
1 oder 2 in der Sequenz der 1 gezeigten Bindungsstellen,
an welche ein Transkriptionsfaktor spezifisch bindet. Die jeweilige
Nukleinsäure
kann synthetisch, oder mit molekularbiologischem Verfahren in vitro
oder intrazellulär
hergestellt werden. Das jeweilige Verfahren ist einem Fachmann bekannt
(vgl. bspw. Sambrook et al., supra).
Die Länge der erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere
des doppelsträngigen
DNA-Oligonukleotids, ist vorzugsweise mindestens so lang wie eine
verwendete Sequenz, die spezifisch an einen Transkriptionsfaktor
bindet, der eine der in den vorstehend aufgeführten Sequenzen enthaltenen
Kernbindungssequenzen aufweist. Üblicherweise
umfaßt
die erfindungsgemäße Nukleinsäure etwa
13 bis etwa 65 Bp, vorzugsweise etwa 18 bis etwa 23 Bp.
Oligonukleotide werden in der Regel
schnell durch Endo- und Exonukleasen, insbesondere DNasen und RNasen,
in der Zelle abgebaut. Daher kann eine erfindungsgemäße Decoy-Nukleinsäure modifiziert
werden, um sie gegen enzymatischen Abbau zu stabilisieren, so daß über einen
längeren
Zeitraum eine hohe Konzentration der doppelsträngigen Nukleinsäure in der
Zelle gewährleistet
ist und damit deren Wirkungsdauer verlängert wird. Typischerweise
kann eine derartige Stabilisierung durch die Einführung einer
oder mehrerer modifizierter Internukleotidbindungen oder durch Einführung einer
modifizierten Nukleobase erhalten werden.
Eine derartig modifizierte Nukleinsäure, insbesondere
ein DNA-Oligonukleotid, enthält
nicht notwendigerweise eine Modifikation an jeder Internukleotidbindung
oder jeder Nukleobase. Vorzugsweise sind bspw. die Internukleotidbindungen
an den jeweiligen Enden beider Oligonukleotide eines Cis-Element
Decoy modifiziert. Dabei können
die letzten 6, 5, 4, 3, 2 oder die letzte oder eine andere oder
mehrere Internukleotidbindungen) innerhalb der letzten 6 Internukleotidbindungen
modifiziert sein. Ferner können
verschiedene Modifikationen der Internukleotidbindungen in die Nukleinsäure eingeführt werden
und die daraus entstehenden doppelsträngigen DNA-Oligonukleotide
auf die sequenzspezifische Bindung an die oder den gewünschten
Transkriptionsfaktor(en) unter Verwendung des Stan dard-EMSA-Testsystems
getestet werden. Das EMSA-Testsystem erlaubt die Bestimmung der
Bindungskonstante der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und
so die Bestimmung, ob die Affinität durch die Modifikation verändert wurde.
Das Cis-Element
Decoy, die noch eine ausreichende Bindung zeigen, können ausgewählt werden,
wobei eine ausreichende Bindung mindestens etwa 50% oder mindestens
etwa 75%, besonders bevorzugt etwa 100% der Bindung der unmodifizierten
Nukleinsäure bedeutet.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere Cis-Element
Decoys, mit modifizierter oder modifizierten Internukleotidbindung(en)
oder modifizierten Nukleobasen, die immer noch eine ausreichende
Bindung zeigen, können
dahingehend überprüft werden,
ob sie stabiler in der Zelle sind als die unmodifizierten Moleküle. Die
mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure transfizierten
Zellen werden dazu zu verschiedenen Zeitpunkten auf die Menge der
dann noch vorhandenen Nukleinsäure
untersucht. Dabei können
die einem Fachmann bekannten Verfahren verwendet werden, z.B. Southern
Blot-Techniken (Sambrook et al., supra) oder DNA-Chip-Array-Techniken
(US-Patent 5,837,466). Eine erfolgreich modifizierte erfindungsgemäße Nukleinsäure, bspw.
ein erfindungsgemäßes Cis-Element Decoy, hat
eine Halbwertszeit in der Zelle, die höher ist als die des unmodifizierten
Moleküls,
vorzugsweise mindestens eine Halbwertszeit von etwa 48 Stunden,
mehr bevorzugt von mindestens etwa 4 Tagen, besonders bevorzugt
von mindestens etwa 7 Tagen.
Geeignete modifizierte Internukleotidbindungen
sind bspw. in Uhlmann und Peiman ((1990) Chem. Rev. 90: 544 ) zusammengefaßt. Modifizierte
Internukleotid-Phosphat-Reste
und/oder nicht-Phosphor-Brücken
in einer Nukleinsäure,
die erfindungsgemäß eingesetzt
werden können,
enthalten z.B. Methylphosphonat, Phosphorthioat, Phosphordithioat,
Phosphoramidat, Phosphatester, während
nicht-Phosphor-Internukleotid-Analoge bspw. Siloxan-Brücken, Carbonat-Brücken, Carboxymethylether-Brücken, Acetamidat-Brücken und/oder
Thioether-Brücken enthalten.
Als modifizierte Nukleobasen können
bspw. 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden.
Eine weitere Möglichkeit der Stabilisierung
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ist
die Einführung struktureller
Merkmale in die erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche
die Halbwertszeit der Nukleinsäure
erhöhen.
Derartige Strukturen, die z.B. Haarnadel- und Glocken-DNA enthalten,
sind im US-Patent 5,683,985 offenbart. Gleichzeitig können modifizierte
Internukleotid-Phosphat-Reste und/oder nicht-Phosphor-Brücken und/oder modifizierte
Nukleobasen, zusammen mit den genannten Strukturen in die erfindungsgemäße Nukleinsäure eingeführt werden.
Die sich daraus ergebenden Nukleinsäuren können im vorstehend beschriebenen
Testsystem auf Bindung und Stabilität hin überprüft werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der vorstehend definierte
regulatorische Seequenzabschnitt die in 3 gezeigte Sequenz, insbesondere die
Nukleotide der in den Positionen 1 bis 1423 dieser Figur gezeigten
Sequenz (d.h. bis zum Beginn des die cDNA codierenden Genabschnitts,
der mit Exon 1a beginnt), oder ein die Expression des VR1-Rezeptors modulierendes
Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen
hybridisierende Sequenz.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der vorstehend definierte
regulatorische Sequenzabschnitt die in 4, gezeigte Sequenz, insbesondere die
Nukleotide der in den Positionen 1 bis 4549 der in dieser Figur
gezeigten Sequenz (d.h. bis zum Beginn des die cDNA codierenden
Genabschnitts, der mit Exon 1d beginnt), oder ein die Expression
des VR1-Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon,
oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Nukleinsäure umfaßt der vorstehend definierte
regulatorische Sequenzabschnitt die in 4, gezeigte Sequenz, insbesondere die
Nukleotide der in den Positionen 1 bis 4190 der in dieser Figur
gezeigten Sequenz (d.h. bis zum Beginn des die cDNA codierenden
Genabschnitts, der mit Exon 1c beginnt), oder ein die Expression
des VR1-Rezeptors modulierendes Derivat, Allel oder Fragment davon,
oder eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.
Gemäß einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
umfaßt
der regulatorische Sequenzabschnitt der erfindungsgemäßen Nukleinsäure die
Nukleotide der in den Positionen 4060 bis 4219 der in 4 gezeigten Sequenz oder
ein die Expression des VR1-Rezeptors modulierendes Derivat, Allel
oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen
hybridisierende Sequenz. Der vorstehende Sequenzabschnitt, umfassend
die Nukleotide der in den Positionen 4060 bis 4219 der in 4 gezeigten Sequenz, zeichnet
sich durch eine hohe Konservierung zwischen verschiedenen Spezies,
bspw. Ratte, Maus und Mensch aus (vgl. auch 2) und spielt daher eine herausragende
Rolle bei der Regulation der Expression des VR1-Rezeptors.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft eine für
VR1 codierende Nukleinsäure, insbesondere
eine (m)RNA oder (c)DNA, umfassend eine der in 1A, B und C gezeigten Sequenzen. (wobei bei einer
RNA für
jedes in der 1A, B und C vorhandenes
t (Thymidin) ein u (Uracil) steht), oder ein für VR1 codierendes Derivat,
Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit unter Standardbedingungen
hybridisierende Sequenz. Bevorzugte Ausführungsformen dieser weiteren
Nukleinsäure
der vorliegenden Endung enthalten die Nukleotide 1 bis 263 der 1A (Exon 1ab), 1 bis 191
der 1B (Exon 1c) oder
1 bis 138 der 1C (Exon
1d) oder ein für
VR1 codierendes Derivat, Allel oder Fragment davon, oder eine hiermit
unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz.
Erfindungsgemäße funktionshomologe Derivate,
Allele oder Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäure als
auch infunktionelle Derivate, Allele, Analoga bzw. Fragmente können durch
Standardverfahren (Sambrook et al., supra) hergestellt werden. Hierbei
werden bei den entsprechenden Sequenzen ein oder mehrere Nukleotide
insertiert, deletiert oder substituiert.
Fragmente der erfidungsgemäßen Nukleinsäure sind
insbesondere solche Sequenzabschnitte, die eine Sequenz aufweisen,
welche eine oder mehrere der in der 3,
der 4, der Sequenz
gemäß GenBank-Zugriffsnummer
AL670399 (Positionen 221931 bis 223344), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer
AL663116 (Positionen 31673 bis 36359), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787
(Positionen 44731 bis 43231) oder der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer
AF168787 (Positionen 36616 bis 33151) gezeigten Transkriptionsfaktorbindungsstellen
enthalten. Hierbei bevorzugte Transkriptionsfaktorbindungsstellen
sind in den Tabellen 1 bis 6 im Anhang angegeben.
Derivate erfindungsgemäßer Nukleinsäuren bzw.
Fragmenten davon, sind bspw. vorstehend beschriebene Moleküle mit Internukleotidbindungs-
bzw. Nukleobasen-Modifikationen.
Funktionshomologe Allel-Varianten
im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Varianten, die mindestens
60%, bevorzugt mindestens 70%, mehr bevorzugt mindestens 90% Homologie
aufweisen. Allel-Varianten umfassen insbesondere solche funktionellen
oder infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Inseriion oder Substitution
von Nukleotiden aus der Sequenz gemäß 3, der Sequenz gemäß 4, der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399
(Positionen 221931 bis 223344), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116
(Positionen 31673 bis 36359), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen
44731 bis 43231) oder der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787 (Positionen 36616
bis 33151) erhältlich
sind, wobei jedoch die regulatorische Funktion bezüglich der
Expression des VR1-Rezeptors im wesentlichen erhalten bleibt.
Homologe oder sequenzverwandte Nukleotidsequenzen
können
aus Säugerspezies,
einschließlich Mensch,
nach gängigen
Verfahren durch Homologie-Screening,
durch Hybridisierung mit einer Probe der erfidungsgemäßen Nukleinsäuresequenz
oder Teilen davon isolieri werden. Unter funktionellen Äquivalenten
sind auch Homologe der Sequenz gemäß 3, der Sequenz gemäß 4, der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399
(Positionen 221931 bis 223344), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116
(Positionen 31673 bis 36359), der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787
(Positionen 44731 bis 43231) oder der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer
AF168787 (Positionen 36616 bis 33151), bspw. ihrer Homologen aus
anderen Säugetieren,
verkürzte
Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA, zu verstehen. Derartige funktionelle Äquivalente
lassen sich ausgehend von der Nukleotidsequenz gemäß 3, der Nukleotidsequenz
gemäß 4, der Nukleotidsequenz
gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399
(Positionen 221931 bis 223344), der Nukleotidsequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116
(Positionen 31673 bis 36359), der Nukleotidsequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer
AF168787 (Positionen 44731 bis 43231) oder der Nukleotidsequenz
gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787
(Positionen 36616 bis 33151), oder Teilen dieser Sequenzen, bspw.
mit üblichen
Hybridisierungsverfahren oder per PCR-Technik aus anderen Veriebraten,
insbesondere Mammalia, isolieren. Daher sind erfindungsgemäß alle mit
den vorstehend genannten Sequenzen hybridisierende Sequenzen mit
offenbart. Diese Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen
mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen.
Zur Hybridisierung werden vorteilhafterweise kurze Oligonukleotide
der konservierten Bereiche verwendet. Es können jedoch auch längere Fragmente
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder
die vollständige
Sequenz zur Hybridisierung verwendet werden.
Je nach der verwendeten Nukleinsäuresequenz
(Oligonukleotid, längeres
Fragment oder vollständige Sequenz)
bzw. je nachdem, welche Nukleinsäureart
(DNA oder RNA) für
die Hybridisierung verwendet wird, variieren diese Standardbedingungen.
So liegen bspw. die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger
als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. Unter Standardbedingungen
sind bspw., je nach Nukleinsäure,
Temperaturen zwischen 42°C
und 58°C
in einer wässrigen
Pufferlösung
mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM
Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich
in Gegenwart von 50% Formamid, wie bspw. 42°C in 5 × SSC, 50 % Formamid, zu verstehen.
Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride
bei 0,1 × SSC
und Temperaturen zwischen etwa 20°C
bis 45°C,
bevorzugt zwischen etwa 30°C
bis etwa 45°C.
Für DNA:
RNA Hybride liegen die Hybridisierungstemperaturen vorteilhafterweise
bei 0,1 × SSC
und Temperaturen zwischen etwa 30°C
bis 55°C,
bevorzugt zwischen etwa 45°C
bis etwa 55°C.
Diese angegebenen Temperaturen für
die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte
für eine
Nukleinsäure
mit einer Länge
von ca. 100 Nukleotiden und einem G+C-Gehalt von 50% in Abwesenheit
von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind
einem Fachmann aus einschlägigen
Lehrbüchern
der Genetik, bspw. Sambrook et al., supra, bekannt und lassen sich
nach bekannten Formeln, bspw. abhängig von der Länge der
Nukleinsäuren,
der Art der Hybride oder dem G+C-Gehalt, berechnen. Weitere Informationen
zur Hybridisierung kann ein Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen:
Ausubel et al. (Hrsg.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons,
New York; Hames und Higgins (Hrsg.), 1985, Nuclic Acids Hybridization:
A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford;
Brown (Hrsg.), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach,
IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Weiterhin sind erfindungsgemäß unter
Derivaten auch Varianten zu verstehen, die vorzugsweise am 3'-Ende verändert wurden.
Als derartige Markierungen oder "Tags" sind in der Literatur
bspw. Hexa-Histidin-Anker bekannt oder Epitope, die als Antigene
verschiedener Antikörper
erkannt werden können
(Studir et al. (1990) Meth. Enzymol, 185: 60 bis 89, und Ausubel
et al., supra).
Darüber hinaus kommen alle einem
Fachmann geläufigen
Methoden für
die Herstellung, Modifikation und/oder Detektion erfindungsgemäßer Nukleinsäuresequenzen,
die in vivo, in situ oder in vitro ausgeführt werden können, in
Betracht (PCR (vgl. Innis et al,. PCR Protocols: A Guide to Methods
and Applications) oder chemische Synthese). Durch entsprechende
PCR-Primer können
bspw. neue Funktionen in eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eingeführt werden, bspw.
Restriktionsstellen. Hierdurch können
erfindungsgemäße Sequenzen
für den
Transfer in Klonierungsvektoren entsprechend entworfen werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft einen Vektor oder ein rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt,
das eine vorstehend definierte Nukleinsäure (Sequenz), typischerweise
eine DNA-Sequenz enthält.
Dabei kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure (Sequenz)
mit mindestens einem weiteren genetischen Regulationselement, bspw.
Transkriptionssignalen, funktional verknüpft werden. Mit solchermaßen hergestellten
Vektoren können
anschließend
Wirtsorganismen bzw. Wirtszellen, z.B. Zellkulturen aus Säugetierzellen,
transformiert werden. Ein erfindungsgemäßer Vektor, enthaltend die
vorstehend definierte Nukleotidsequenz, kann bspw. die für den VR1-Rezeptor
codierende cDNA-Sequenz,
vorzugsweise der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz
nachgeschaltet, enthalten. Selbstverständlich kann der für den VR1-Rezeptor
codierende Abschnitt auch für
ein funktionshomologes Derivat, Allel oder Fragment des VR1-Rezeptors codieren,
bzw. eine hiermit unter Standardbedingungen hybridisierende Sequenz
enthalten.
Bevorzugte DNA-Sequenzen, die für ein funktionshomologes
Protein des VR1-Rezeptors
codieren, weisen mindestens 60% Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens
80% und noch mehr bevorzugt mindestens 95% mit der cDNA-Sequenz auf, die
sich aus den entsprechenden Angaben im GenBank-Eintrag AF 327067
(genomische Sequenz des VR1-Gens der Ratte) ergibt. Auch die sich
aus diesen DNA-Sequenzen ergebenden funktionshomologen Teilsequenzen
können
mit Hilfe des erfindungsgemäßen Vektors
exprimiert werden. Darüber
hinaus gehören
zum Rahmen der vorliegenden Erfindung auch alle nativen Spleißvarianten der
VR1-cDNA-Sequenz. Erfindungsgemäß bevorzugte
Ausführungsformen
der VR1-cDNA beginnen z.B. mit Exon 1ab, Exon 1a oder Exon 1d (vgl.
auch 6).
Der erfindungsgemäße Vektor bzw. das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt
kann auch für
eine Allelvariante oder Isoform des VR1-Rezeptors codieren. Unter
Allelvarianten werden im Sinne der vorliegenden Erfindung Varianten
ver standen, die 60 – 100%
Homologie auf Aminosäureebene,
bevorzugt 70 – 100%, ganz
besonders bevorzugt 90 – 100%
aufweisen. Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen oder
infunktionellen Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution
von Nukleotiden aus der für
den VR1-Rezeptor codierenden cDNA-Sequenz (z.B. beginnend mit Exon
1ab, Exon 1c oder Exon 1d) erhältlich sind,
wobei die wesentliche biologische Eigenschaft als Ligandengesteuerter
Kationenkanal erhalten bleibt.
Darüber hinaus kann ein erfindungsgemäßer Vektor
bzw. ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt,
enthaltend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
bzw. deren Derivate, Varianten, Homologe oder Fragmente, auch ein
Protein mit der Funktion des VR1-Rezeptors aber auch einer infunktionellen
Variante, bspw. einer doppelt negativen Mutante (DN-Mutante) in
therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Form verwendet werden.
Zur Generierung derartiger rekombinanter VR1-Proteine können Vektorsysteme
oder Oligonukleotide verwendet werden, welche die für das VR1-Konstrukt
codierenden Sequenzen um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und
damit für
veränderte
Polypeptide codieren, die bspw. einer einfacheren Aufreinigung dienen.
Des weiteren kann ein erfindungsgemäßer Vektor
funktionell mit den vorstehend genannten Elementen verknüpfte weitere
Regulationselemente, bspw. Translationsstart- bzw. Translationsstopsignale,
umfassen. Diese Verknüpfung
führt je
nach gewünschter
Anwendung zu einer nativen Expressionsrate oder auch zu einer Erhöhung bzw.
Erniedrigung der nativen Genexpression.
Der erfindungsgemäße Vektor, bspw. ein Expressionsvektor
zur Expression funktioneller oder unfunktioneller VR1-Rezeptoren,
kann weitere Regulationssequenzen umfassen, die bspw. in Promotoren
wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-,
T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, I-PR- oder eben I-PL-Promotor
enthalten sind. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind bspw.
in den Gram-positiven Promotoren wie amy und SPO2, in den Hefepromotoren
wie ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH oder in Säugetierpromotoren wie CaM- Kinase II, CMV, Nestin,
L7, BDNF, NF, MBP, NSE, β-Globin,
GFAP, GAP43, Tyrosin-Hydroxylase, Kainat-Rezeptor-Untereinheit 1,
Glutamat-Rezeptor-Untereinheit
B enthalten. Prinzipiell können alle
natürlichen
Promotoren mit ihren Regulationssequenzen mit der erfindungsgemäßen regulatorischen
Nukleinsäuresequenz,
bspw. die vorstehend genannten Regulationssequenzen, für einen
erfindungsgemäßen (Expressions-)Vektor
verwendet werden.
Darüber hinaus können auch
synthetische Promotoren vorteilhaft kombiniert werden. Diese regulatorischen
Sequenzen sollen die gezielte Expression bspw. von VR1-Rezeptor-Konstrukten
ermöglichen.
Dies kann bspw. je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen
erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort
exprimiert und/oder überexprimiert
wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei
vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So
kann eine Verstärkung
der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene
erfolgen, in dem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden.
Daneben ist aber auch eine verstärkte
Translation möglich,
in dem bspw. die Stabilität
der mRNA verbessert wird.
Als Regulationssequenzen werden alle
dem Fachmann geläufigen
Elemente bezeichnet, die auf der Transkriptions- und/oder Translationsebene
die Expression beeinflussen können.
Insbesondere sind dabei neben Promotorsequenzen sog. "Enhancer"-Sequenzen hervorzuheben,
die über
eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA
eine erhöhte
Expression bewirken können.
Als weitere Regulationssequenzen seien beispielhaft die sog. "Locus Control Regions", "Silencer" oder jeweilige Teilsequenzen davon
genannt. Diese Sequenzen können
vorteilhaft für
gewebsspezifische Expression verwendet werden. Auch sog. "Terminatorsequenzen" werden vorteilhafterweise
in einem erfindungsgemäßen (Expressions-)Vektor
vorhanden sein und erfindungsgemäß unter
den Terminus "Regulationssequenz" subsummiert.
Unter den Begriff "Vektor" fallen sowohl rekombinante
Nukleinsäurekonstrukte
bzw. Genkonstrukte, wie zuvor beschrieben, als auch komplette Vektorkonstrukte,
die neben erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
und etwaigen weiteren Regulationssequenzen typischerweise auch weitere
Elemente enthalten. Diese Vektorkonstrukte oder Vektoren können bspw.
zur Expression des VR1-Rezeptors in einem geeigneten Wirtsorganismus
verwendet werden. Vorteilhafterweise wird mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, enthaltend
einen vorstehend genannten Sequenzabschnitt, in einen wirtsspezifischen
Vektor insertiert. Geeignete Vektoren sind einem Fachmann wohl bekannt
und können
bspw. aus "Cloning
Vectors" (Hrsg.
Pouwls et al., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0
444 904018) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden
auch alle anderen einem Fachmann bekannte Vektoren wie bspw. Phagen,
Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Sindbisvirus, Transposons,
IS-Elemente, Phasmide,
Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese
Vektoren können
autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert
werden. Für
die Integration in das Genom von Säugetieren wird typischerweise
lineare DNA verwendet.
Die Expression mit den erfindungsgemäßen, an
regulatorische Nukleinsäuresequenzen
gekoppelten VR1-Rezeptor-DNA-Sequenzen kann vorteilhaft durch Erhöhen der
Genkopienzahl und/oder durch Verstärkung regulatorischer Faktoren,
welche die Genexpression weiter positiv beeinflussen, erhöht werden.
So kann eine Verstärkung
regulatorischer Elemente vorzugsweise auf Transkriptionsebene erfolgen,
indem weitere Transkriptionssignale, wie Promotoren und Enhancer
verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der
Translation möglich,
indem bspw. die Stabilität
der mRNA verbessert oder die Ableseeffizienz dieser mRNA an den
Ribosomen erhöht
wird. Bei Erhöhung
der Kopienzahl können
die Nukleinsäuresequenzen
bei homologen Genen, bspw. in ein Nukleinsäurefragment bzw. in einen Vektor
eingebaut werden, der vorzugsweise eine den jeweiligen Genen zugeordnete,
regulatorische Gensequenzen oder analog wirkende Promotoraktivität enthält. Insbesondere
werden solche weiteren regulatorischen Sequenzen verwendet, welche
die Genexpression verstärken.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen können zusammen
mit den für
interagierende oder für
potentiell interagierende Proteine codierenden Sequenzen in einen
einzelnen Vektor kloniert werden und anschließend in vitro in einer Wirtszelle
oder in vivo in einem Wirtsorganismus exprimiert werden. Alternativ
kann auch jede der potentiell interagierenden Nukleinsäuresequenzen
und die für
ein VR1-Genkonstrukt
codierende Sequenz in je einen einzelnen Vektor eingebracht und
diese getrennt in den jeweiligen Organismus über übliche Methoden, bspw. Transformation,
Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Partikel-Gun eingebracht
werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform
kann mindestens ein Marker-Gen (bspw. Antibiotika-Resistenz-Gene
und/oder Gene, die für
ein fluoreszierendes Protein codieren, insbesondere GFP) in einen erfindungsgemäßen (Expressions-)Vektor,
insbesondere ein komplettes Vektorkonstrukt, eingebaut werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung betrifft Wirtszellen, ausgenommen humane Keimzellen und
humane embryonale Stammzellen, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder einem
erfindungsgemäßen Vektor
transfonniert sind. Als Wirtszellen kommen alle Zellen pro- oder
eukaryontischer Natur in Betracht, bspw. von Bakterien, Pilzen,
Hefen, pflanzlichen oder tierischen Zellen. Bevorzugte Wirtszellen
sind Bakterienzellen, wie Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus
oder Pseudomonas, eukaryontische Mikroorganismen, wie Aspergillus
oder Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe (Stinchcomb et al.
(1997) Nature 282: 39).
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden jedoch zur Transformation mittels erfindungsgemäßer Nukleinsäuren und/oder
Vektoren Zellen aus multizellulären
Organismen gewählt.
Dies geschieht bspw. bei der Expression von VR1-Konstrukten vor dem Hintergrund einer
ggf. erwünschten
Glykosylierung (N- und/oder O-gekoppelt)
des codierten VR1-Konstrukts. Diese Funktion kann in höheren Eukaryontenzellen – im Vergleich zu
Prokaryontenzellen – in
geeigneter Weise ausgeführt
werden. Im Prinzip ist jede höhere
eukaryontische Zellkultur als Wirtszelle verfügbar, wenn auch Zellen von
Säugern,
bspw. Affen, Ratten, Hamstern, Mäusen oder
Menschen, ganz besonders bevorzugt sind. Dem Fachmann ist eine Vielzahl
von etablierten Zellinien bekannt. In einer keineswegs abschließenden Aufzählung werden
die folgenden Zellinien genannt: 293T (Embryonennierenzellinie)
(Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59 (1997), BHK (Babyhamsternierenzellen),
CHO (Zellen aus den Hamsterovarien, Urlaub und Chasin, Proc. Natl.
Accad. Sci. USA 77: 4216, (1980)), HeLa (humane Karzinomzellen)
und weitere – insbesondere
für den
Laboreinsatz etablierte – Zellinien,
bspw. HEK293-, SF9- oder
COS-Zellen. Ganz besonders bevorzugt sind humane Zellen, insbesondere
neuronale Stammzellen und Zellen des "Schmerz-Weges", vorzugsweise primäre sensorische Neuronen. Humane
Zellen, insbesondere autologe Zellen eines Patienten, eignen sich
nach (vor allem ex vivo) Transformation mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder
erfindungsgemäßen Vektoren,
ganz besonders als Arzneimittel für bspw. gentherapeutische Zwecke,
also nach Durchführung
einer Zellentnahme, ggf. ex vivo Expansion, Transformation, Selektion und
abschließender
Retransplantation in den Patienten.
Die Kombination aus einer Wirtszelle
und einem zu den Wirtszellen passenden erfindungsgemäßen Vektor,
wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie bspw. Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promotorsystem,
die Phagen λ,
Mu oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren
vorteilhaften regulatorischen Sequenzen, bilden eine erfindungsgemäße Wirtszelle,
die als Expressionszellsystem in Verbindung mit der erfindungsgemäßen regulatorischen
Nukleinsäuresequenz
dienen kann. Bevorzugte erfindungsgemäße Expressionssysteme auf der
Basis erfindungsgemäßer Wirtszellen
sind bspw. die Kombination aus Säugetierzellen,
bspw. CHO-Zellen oder neuronale Zellen, und Vektoren, wie bspw.
pcDNA 3neo-Vektor oder bspw. HEK293-Zellen und CMV-Vektoren, die
für Säugetierzellen
besonders geeignet sind.
Somit eignen sich die erfindungsgemäßen Gegenstände als
Arzneimittel einerseits zur Inhibition der Nozizeption, bspw. aufgrund
der Verminderung der Transkription des VR1-Rezeptors mittels erfindungsgemäßer Cis-Element-Decoy-Moleküle oder
durch verstärkte
Expression einer infunktionellen Variante des VR1-Rezeptors mit
Hilfe eines Vektors, umfassend die gesamte in 3 oder 4 gezeigte
regulatorische Nukleinsäuresequenz
oder die gesamte regulatorische Nukleinsäuresequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399
(Positionen 221931 bis 223344), gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116
(Positionen 31673 bis 36359), gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787
(Positionen 44731 bis 43231) oder gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787
(Positionen 36616 bis 33151), oder geeignete Abschnitte, Allel oder
Derivate dieser Sequenzen. Andererseits können die erfindungsgemäßen Gegenstände dazu
verwendet werden, eine mit dem VR1-Rezeptor zusammenhängende Sensibilitätsstörung, die
zur verminderten Sensibilität
des jeweiligen Organismus, insbesondere zu einer Hyp- oder Analgesie,
führt,
mittels erfindungsgemäßer Gegenstände behandelt
werden, indem bspw. eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Kombination mit der
für den
VR1-Rezeptor codierenden cDNA in die Zellen des jeweiligen Organismus
eingebracht wird, um so, bspw. bei abnorm verminderter oder fehlender
Expression des endogenen VR1-Rezeptors, für die Expression eines funktionsfähigen VR1-Rezeptorkonstrukts
zu sorgen.
Folglich umfaßt die vorliegende Erfindung
die Verwendung der vorstehend genannten Gegenstände zur Behandlung bzw. zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention
von Schmerzen, insbesondere akuten oder chronischen Schmerzen, sowie
auch die Verwendung zur Behandlung bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung von Sensibilitätsstörungen,
die mit dem VR1-Rezeptor zusammenhängen, insbesondere zur Behandlung
von Hyperalgesie, Hypalgesie oder Analgesie, Neuralgie, Myalgie.
Erfindungsgemäße Arzneimittel bzw. unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände hergestellte
Arzneimittel enthalten neben den vorstehend definierten Gegenständen ggf.
einen oder mehrere geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstof fe. Erfindungsgemäße Arzneimittel
können
als flüssige
Arzneiform in Form von Injektionslösung, Tropfen oder Säfte, als
halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches,
Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten
neben dem mindestens einen erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer
Form ggf. Trägermaterialien,
Füllstoffe,
Lösungsmittel, Verdünnungsmittel,
Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie
die einzusetzenden Mengen derselben hängen davon ab, ob das Arzneimittel
oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal,
intramuskulär,
intranasal, bukkal, rektal oder topisch, den Schleimhäuten, den
Augen usw., appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen
sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten,
Tropfen, Säften
und Sirupen, für
die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen,
Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie
Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem
Depot in gelöster
Form oder in einem Pflaster, ggf. unter Zusatz von die Hautpenetration
fördernden
Mitteln sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral
oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen.
Die einem Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in
Abhängigkeit
vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation
und dem Grad der Erkrankung. Üblicherweise
werden 2 bis 500 mg/kg Körpergewicht
wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes
appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet
werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe
bspw. eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Protease-
oder DNAse-Inhibitoren usw.
Geeignete Zusatz- und/oder Hilfsstoffe,
bspw. bei Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure als
Cis-Element Decoy, sind als Beispiele Lipide, kationische Lipide,
Polymere, Liposomen, Nukleinsäure-Aptamere,
Peptide und Proteine, die an DNA gebunden sind (oder synthetische
Peptid-DNA-Moleküle
zu nennen, um bspw. die Einbringung von Nukleinsäuren in die Zelle zu erhöhen, um
das Arzneimittelgemisch auf nur eine Untergruppe von Zellen zu richten,
um den Abbau der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der
Zelle zu verhindern, um die Lagerung des Arzneimittelgemischs vor
der Verwendung zu erleichtern usw. Beispiele für Peptide und Proteine oder
synthetische Peptid-DNA-Moleküle
sind z.B. Antikörper,
Antikörperfragmente,
Liganden, Adhäsionsmoleküle, die
alle modifiziert oder unmodifiziert sein können. Hilfsstoffe, die bspw.
die Cis-Element Decoys in der Zelle stabilisieren, sind z.B. Nukleinsäure-kondensierende
Substanzen wie kationische Polymere, Poly-L-Lysin oder Polyethylenimin.
Bei einer lokalen Anwendung erfindungsgemäßer Gegenstände, bspw.
von Cis-Element
Decoys, erfolgt die Verabreichung durch Injektion, Katheter, Suppositorium
("Zäpfchen"), Aerosole (Nasen-
bzw. Mundspray, Inhalation), Trokars, Projektile, pluronische Gele,
Polymere, die anhaltend Medikamente freisetzen, oder irgendeine
andere Vorrichtung, die einen lokalen Zugang ermöglicht. Auch die ex vivo Anwendung
des erfindungsgemäßen Arzneimittelgemischs,
das zur Behandlung der vorstehend genannten Indikationen verwendet
wird, erlaubt einen lokalen Zugang.
Erfindungsgemäße Gegenstände können ggf. in einer Zusammensetzung
als Arzneimittel- (Wirkstoff)gemisch mit bspw. mindestens einem
weiteren Schmerzmittel kombiniert werden. Auf diese Weise können erfindungsgemäße Gegenstände bspw.
in Verbindung mit Opiaten und/oder synthetischen Opioiden (bspw.
Morphin, Levomethadon, Codein, Tramadol, Bupremorphin) und/oder
NSAID (bspw. Diclofenac, Ibuprofen, Paracetamol) kombiniert werden,
bspw. in einer der vorgenannt offenbarten Verabreichungsformen oder
auch im Zuge einer kombinierten Therapie in jeweils separierten
Verabreichungsformen mit ggf. unterschiedlicher Konfektionierung
in einem an die Bedürfnisse
des jeweiligen Patienten angepassten medizinisch sinnvoll gestalteten
Therapieplan. Bevorzugt ist die Verwendung derartiger Zusammensetzungen
als Arzneimittelgemische mit bspw. etablierten Analgetika zur Behandlung
(bzw. zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung) von vorliegend
offenbarten medizinischen Indikationen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch
ein Verfahren zur Modulation der Expression des VR1-Rezeptors oder
ggf. anderer Rezeptorgene oder Gene, umfassend das Einbringen der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder
des Vektors in eine das VR1-Gen enthaltende Zelle.
Des weiteren umfaßt die vorliegende Erfindung
auch ein Verfahren zur Behandlung der vorstehend genannten Indikationen,
umfassend das Verabreichen mindestens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes bzw.
eines vorstehend beschriebenen Arzneimittels an einen Patienten,
der einen derartigen Wirkstoff benötigt. Die bevorzugten Verabreichungswege,
Mengen der Wirkstoffe bzw. des Arzneimittels usw., die im erfindungsgemäßen Behandlungsverfahren
verwendet werden können,
wurden bereits vorstehend dargelegt. „Patienten" im Sinne der vorliegenden Erfindung
sind neben Menschen auch Tiere, insbesondere Nager, z.B. Maus, Ratte,
Meerschweinchen und Kaninchen, und Haus- bzw. Nutztiere, bspw. Huhn,
Gans, Ente, Ziege, Schaf, Schwein, Rind, Pferd, Hund und Katze.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung
bzw. beim Behandlungsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände eignet
sich insbesondere die von der in 3 bzw. 4 gezeigten Sequenz abgeleitete
Nukleinsäure
bzw. der entsprechende Vektor bzw. die korrespondierende Wirtszelle
zum Einsatz bei der Ratte. Dabei eignen sich die von der in 3 gezeigten Sequenz abgeleiteten
Gegenstände
besonders zur Regulation der Expression VR-1 Gens und damit zusammenhängenden
Störungen
in Niere, Gehirn und/oder Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen
oder Zelllinien), während
sich die von der in der 4 gezeigten
Sequenz abgleiteten Gegenstände
besonders zur Beeinflussung der VR1-Genexpression in Spinalganglien
(bzw. entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien) eignen.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung
bzw. beim Behandlungsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände eignet
sich insbesondere die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399,
Positionen 221931 bis 223344, bzw. von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116,
Positionen 31673 bis 36359, abgeleitete Nukleinsäure bzw. der entsprechende
Vektor bzw. die korrespondierende Wirtszelle zum Einsatz bei der Maus.
Dabei eignen sich die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL670399,
Positionen 221931 bis 223344, abgeleiteten Gegenstände besonders
zur Regulation der Expression VR-1 Gens und damit zusammenhängenden
Störungen
in Niere, Gehirn und/oder Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen
oder Zelllinien), während
sich die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL663116,
Positionen 31673 bis 36359, abgleiteten Gegenstände besonders zur Beeinflussung
der VR1-Genexpression in Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen
oder Zelllinien) eignen.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung
bzw. beim Behandlungsverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Gegenstände eignet
sich insbesondere die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787,
Positionen 44731 bis 43231, bzw. der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787, Positionen
36616 bis 33151, abgeleitete Nukleinsäure bzw. der entsprechende
Vektor bzw. die konespondierende Wirtszelle zum Einsatz beim Menschen.
Dabei eignen sich die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer AF168787,
Positionen 44731 bis 43231, abgeleiteten Gegenstände besonders zur Regulation der
Expression VR-1 Gens und damit zusammenhängenden Störungen in Niere, Gehirn und/oder
Spinalganglien (bzw. entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien),
während
sich die von der Sequenz gemäß GenBank-Zugriffsnummer
AF168787, Positionen 36616 bis 33151, abgleiteten Gegenstände besonders
zur Beeinflussung der VR1-Genexpression in Spinalganglien (bzw.
entsprechenden Kulturzellen oder Zelllinien) eignen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden
Erfindung Nachweisverfahren für
einen Transkriptionsfaktor, vorzugsweise mit hohem Durchsatz. Hierzu
werden die an den erfindungsgemäßen 5'-regulatorischen
Bereich bindenden regulatorischen Proteine, bspw. Transkriptionsfaktoren,
durch die wechselseitigen Wechselwirkungen nachgewiesen. Dies kann
bspw. durch die Methoden Western-Blot, Gel-Shift-Tests oder Tests mit Reportergenen
erfolgen. Vorzugsweise kann ein solches Verfahren auch auf der Basis
eines ELISA durchgeführt
werden, auch im Sinne eines Hochdurchsatzverfahrens. Der herkömmliche
ELISA wird dabei, wie folgt abgewandelt. Der einzufangende bspw.
Transkriptionsfaktor wird nicht durch einen Antikörper eingefangen, sondern
vielmehr durch eine doppelsträngige
Oligonukleotidprobe, welche dem erfindungsgemäßen 5'-regulatorischen Bereich des VR1-Gens
oder einem Abschnitt desselben von mindestens 5, vorzugsweise mindestens
10 Nukleotiden Länge,
entspricht. Vorzugsweise werden die doppelsträngigen Proben auf einem Untergrund,
bspw. einer Mikrotiterplatte, gebunden. Eingefangene die Nukleotidprobe
bindende Proteine (soweit diese als Regulatorproteine für den 5'-Bereich von VR1
bekannt sind) können
bspw. durch entsprechende gegen die eingefangenen Proteine gerichtete
Antikörper,
bspw. radioaktiv- oder Fluoreszenz-markiert oder durch Meerettich-Peroxidase
konjugiert (nachgeschaltete Farbstoffreaktion), detektiert werden.
Auf diese Weise können Überexpression
und Unterexpression der Transkriptionsfaktoren in einer Probe, bspw.
in Zellextrakten, nachgewiesen werden und entsprechende diagnostische
Erkenntnisse, ggf. präventiv,
gewonnen werden.
Die Figuren zeigen:
1 zeigt
Sequenzen von 5'-RACE-Fragmenten,
die, ausgehend von mRNA aus Spinalganglien der Ratte, mit genspezifischen
Primern erhalten wurden, welche im Exon 2 der VR1-cDNA hybridisieren.
Dargestellt sind 3 Arten von RACE-Fragmenten, die im 3'-Bereich 49 Nukleotide
des Exons 2 enthalten (AF029310, grau unterlegt), aber sich in ihren
5'-Sequenzen unterscheiden.
Die Sequenz des Primers rVR72 ist unterstrichen. Die Sequenz des
RACE-Fragmentes 1ab (A) enthält
im 5'-Bereich zwei
Exons (1a und 1b). Das Exon 1a ist doppelt unterstrichen. Das dargestellte
Exon 1 des RACE-Fragmentes 1c (B) wurde in unterschiedlichen Längen isoliert.
Die Startpunkte der verschieden RACE-Fragmente 1c sind im Fettdruck
sowie doppelt unterstrichen dargestellt. Das RACE-Fragment in der 1C enthält das 138 by große Exon
1d. Die Sequenzen der Exons 1a, 1b, 1c und 1d sind in der genomischen
Sequenz der Ratte mit der Zugriffsnummer AC126839 enthalten [Position
53696 – 53790
(Exon 1a), 71745 – 71912
(Exon 1b), Position 87717 – 87907
(Exon 1c) und Position 88077 – 88214
(Exon 1d)].
2 zeigt
eine Gegenüberstellung
von Sequenzen des hoch konservierten DNA-Bereichs im 5'-Bereich des Exons
1c des VR1-Gens. Dargestellt sind die Sequenzabschnitte von Ratte
[AC126839, Position 87587 – 87746],
Maus [AL663116, Position 35875 – 36034]
und Mensch [AF 168787, Position 32580 – 32416]. Identische Nukleotide
sind grau unterlegt.
3 zeigt
die genomische Sequenz im 5'-Bereich
aufwärts
des Exons 1a des VR1-Gens der Ratte. Die Sequenz wurde unter Verwendung
des Genome-Walker
Kits (Fa. Clontech) isoliert und ist in der genomischen Sequenz
der Ratte mit der Datenbanknummer AC126839 [Position 52273 – 53722]
enthalten. Die ersten Nukleotide des RACE-Fragmentes 1 ab sind kursiv
dargestellt. DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, die
sowohl bei der Ratte als auch bei der Maus an der gleichen Sequenzposition
lokalisiert sind, sind unterstrichen dargestellt.
4 zeigt
die genomische VR1-Sequenz der Ratte 5'-wärts
des Exons 1d. Die dargestellte Sequenz ist in der Genomsequenz der
Ratte mit der Zugriffsnummer AC 126839 (Position 83528 – 88214)
enthalten. Die Exons 1 c und 1d sind grau unterlegt. Die GenomeWalker-Fragmente
sind an der Postion 1 bis 4361 lokalisiert. DNA-Bindungsstellen
für Transkriptionsfaktoren,
die sowohl bei der Ratte als auch bei der Maus an der gleichen Sequenzposition
lokalisiert sind, sind unterstrichen dargestellt. Der zwischen Mensch,
Maus und Ratte hochkonservierte Sequenzabschnitt (Positionen 4060
bis 4219) ist kursiv und im Fettdruck dargestellt (vgl. auch 2).
5 zeigt
photographische Aufnahmen von 1,5 %-Agarosegelen von RT-PCR-Proben, die der Amplifikation
von Exon-1c/2- und Exon-1d/2-Fragmenten der VR1-mRNA in verschiedenen
Geweben der Ratte dienten. Aufgetrennt wurden 10 μl der PCR-Reaktionen,
die mit den Primerpaaren 1C-145F/1c- 417R (A) und VR1d-18F/1c-417R (B) oder
mit GAPDH-Primern (C) und cDNA aus Gehirn (Spur 1), Herz (Spur 2),
Leber (Spur 3), Dann (Spur 4), Milz (Spur 5), Niere (Spur 6), Spinalganglien
(Spur 7) und Muskel (Spur 8) durchgeführt wurden. Die Reaktionen
mit den GAPDH-Primern dienten als Positivkontrolle. Es wurde 1 μl der jeweiligen
cDNA-Lösung
in die PCR-Reaktionen
eingesetzt. Zur werteren Kontrolle wurde aus allen verwendeten Gewebe-Isolationen
RNA entnommen und in einer PCR mit den verschiedenen Primerpaaren
getestet (Spur 9). Eine weitere Kontrolle wurde ohne cDNA- bzw.
RNA-Lösung
durchgeführt
(Spur 10). Die erwartete Größe der Produkte
umfasst 292 by (A), 364 by (B) und 227 by (C). In 5A ist in der Spur 1 ein weiteres Fragment mit
einer Länge
von etwa 600 by zu erkennen. Das größere Fragment in Spur 7 der 5B ist möglicherweise ein
PCR-Artefakt,
6 ist
eine schematische Darstellung der 5'-Enden der verschiedenen humanen VR1-cDNAs.
Im oberen Teil der Abbildung ist der genomische DNA-Abschnitt dargestellt
auf dem die Exons 1a, 1b, 1c, 1d und 2 lokalisiert sind. Außerdem sind
die 5'-Bereiche
mit Exon 1 und 2 der verschiedenen cDNA-Formen skizziert. Die Zugriffsnummem
der Sequenzen sind seitlich aufgeführt.
SEQUENZPROTOKOLL
