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Serotonin ist nicht nur ein Neurotransmitter
im zentralen Nervensystem (CNS), sondern auch ein überall in
der Peripherie zu findendes Hormon, das in die Vasokonstriktion
und Thrombozytenfunktion einbezogen ist. Tryptophanhydroxylase ist
das geschwindigkeitsbestimmende Enzym in der Serotoninbiosynthese.
Serotonin (5-hydroxytryptamin, 5-HT) ist ein monoaminergener Neurotransmitter,
der an mehrfachen Aspekten der Stimmungssteuerung und der Regulierung
des Schlafs, der Angst, des Alkoholismus, des Drogenmissbrauchs,
der Nahrungsaufnahme und des sexuellen Verhaltens (J. Veenstra-VanderWeele,
G. M. Anderson, E. H. Cook Jr., Eur. J. Pharmacol. 410, 165 (2000))
mit Tryptophanhydroxylase (TPH; EC 1.14.16.4) als geschwindigkeitsbegrenzendes
Enzym der ersten Stufe bei seiner Biosynthese beteiligt ist (P.
F. Fitzpatrick, Annu. Rev. Biochem. 68, 355 (1999)). Das TPH-Enzym
gehört
zur Superfamilie der aromatischen Aminosäurehydroxylasen (P. F. Fitzpatrick,
Annu. Rev. Biochem. 68, 355 (1999)), zusammen mit Phenylalanin-
(PAH) und Tyrosinhydroxylasen (TH).
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Das serotonergene Projektionssystem
ist das umfangreichste monoaminergene System im Hirn der Wirbeltiere,
ist jedoch auch am schwierigsten zu untersuchen. Die Wurzeln dieses
Systems sind auf wenige selektiv 5-HT synthetisch erzeugende Neuronen
im Mittelhirn, Pons und der Medulla oblongata, die insgesamt die
verschiedenen Gruppen der Nuclei Raphe B1-B9 darstellen, beschränkt (A.
Dahlström,
K. Fuxe, Acta Physiol. Scand. 62: Suppl. 232, 1 (1964)). Des weiteren
stellt 5-HT ein Zwischenprodukt in der Biosynthese des Hormons Melatonin
dar und daher exprimiert die Epiphyse bei einer 24-Stundensteuerung
mit ma ximaler Aktivität
in der dunklen Periode (J. M. Miguez, F. J. Martin, M. Aldegunde,
Neurochem. Res. 22, 87 (1997)) die höchsten Mengen an TPH.
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Außer im Hirn und in der Epiphyse
wurde TPH in enterischen Neuronen (E. Fiorica-Howells, L. Maroteaux,
M. D. Gershon, J. Neurosci. 20, 294 (2000)), präimplantierten Embryonen (D.
J. Walther, M. Bader, Mol. Brain Res. 68, 55 (1999)), Mastzellen
(L. M. Finocchiaro et al. J. Interferon Res. 8, 705 (1988)) und
am auffallendsten in Enterochromaffinzellen des Magen- und Darmtraktes
entdeckt (L. J. Weber, A. Horita, Biochem. Pharmacol. 14, 1141 (1965)).
Von diesen Zellen wird angenommen, dass sie die Quelle von 5-HT
im Blut sind, wo es fast ausschließlich in dichten Lagervesikeln
der Thrombozyten (J. Champier et al. Life Sci. 60, 2191 (1997))
eingelagert ist. 5-HT ist in verschiedene Prozesse im peripheren
Gewebe einbezogen, wie Regulierung des vaskulären Tonus (M. M. Rapport, A.
A. Green, I. H. Page, J. Biol. Chem. 176, 1237 (1948)), der Darmmotilität (M. D.
Gershon, Aliment. Pharmacol. Ther. 13, 15 (1999)), der primären Hämostase
(J. M. Holland, Proc. Exp. Biol. Med. 151, 32 (1976)) und der zellvermittelten
Immunreaktionen (G. P. Geba et al. J. Immunol. 157, 557 (1996)).
Da die 5-HT-Mengen im Hirn und der Peripherie mit der TPH-Aktivität direkt
verbunden sind, ist das Verständnis
der TPH-Expression und Regulation ein wichtiger Schritt zur Aufklärung der
Funktionen von 5-HT im ZNS und im peripheren Gewebe.
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MÄNGEL DES
STANDS DER TECHNIK
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Vom Vorhandensein von TPH mRNA und
Protein im ZNS von Wirbeltieren wurde mehr als zehn Jahre berichtet,
die Daten waren jedoch unvereinbar. In der Epiphyse und den Nuclei
Raphe (S. Dumas, M. C. Darmon, J. Delort, J. Mallet, J. Neurosci.
Res.
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24, 537 (1989), R. P. Hart, R. Yang,
L. A. Riley, T. L. Green, Mol. Cell. Neurosci. 2, 71 (1991)) wurden z.
B. verschiedene mRNA- zu Proteinmengen entdeckt: vergleichbare TPH-Proteinmengen sind
in Nuclei Raphe und in der Epiphyse vorhanden, während die mRNA-Mengen zumindest
1000 Mal höher
in letzterer sind (F. Chamas, L. Serova, E. L. Sabban, Neurosci.
Lett. 267, 157 (1999)). Diese Unterschiede in den ProteinmRNA-Verhältnissen
wurden in allen Studien den verschiedenen Translationsleistungen
von mRNAs, die in der 5'-nichttranslatierten
Region unterschiedlich gespleißt
wurden, zugeschrieben.
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Es gibt jedoch seit mehr als dreißig Jahren
Nachweise der Existenz verschiedener TPH-Isoformen (C. D. Cash,
Gen. Pharmac. 30, 569 (1998), 21. S. M. Mockus, K. E. Vrana, J.
Mol. Neurosci. 10, 163 (1998)) in der Literatur: a) in Reinigungsverfahren
wurden zwei Aktivitätsspitzen
in Hirnhomogenaten (H. Nakata, H. Fujisawa, Eur. J. Biochem. 122,
41 (1982)) entdeckt und partiell gereinigte Enzyme mit eindeutigen
biochemischen Eigenschaften wurden beschrieben in Abhängigkeit
von den analysierten Geweben (D. M. Kuhn, M. A. Meyer, W. Lovenberg,
Arch. Biochem. Biophys. 199, 355 (1980)), b) die erste Generation
von Antikörpern
gegen TPH, gereinigt von einer Mäusemastozytomzelllinie
(P815), hat mit der Hirn-TPH nicht überkreuz reagiert (H. Nakata,
H. Fujisawa, Eur. J. Biochem. 124, 595 (1982)), obwohl das derzeit
im Handel erhältliche
Antikörper
tun. Bisher wurden diese Erscheinungen mit verschiedenen Phosphorylationszuständen der
Proteine (C. D. Cash, Gen. Pharmac. 30, 569 (1998)) erklärt.
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Eine fundierte Erklärung für die genannten
unterschiedlichen mRNA- und Proteinmengen, sowie die widersprüchlichen
Daten fehlte jedoch. Dies ist in vorliegender Erfindung gelungen.
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AUFGABE-LÖSUNGSZUSAMMENHANG
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Vorliegend wird durch "Gene targeting" erstmals gezeigt,
dass Serotonin unabhängig
von zwei verschiedenen Tryptophanhydroxylaseisoenzymen in peripheren
Geweben und Neuronen synthetisch hergestellt wird. Desweiteren wird
erstmalig eine spezifisch neuronale Tryptophanhydroxylaseisoform
identifiziert. Obwohl die Aminosäuresequenzen
der zwei Tryptophanhydroxylasen hoch homolog zueinander sind, zeigen
die Gensequenzen nur eine geringe Ähnlichkeit, was erklärt, warum
die neuronale Tryptophanhydroxylase (im folgenden als snTPH bezeichnet)
jahrzehntelang unentdeckt blieb.
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Die Isolierung der spezifsch neuronal
exprimierten snTPH kann für
die Entwicklung und Bereitstellung von neuen Präparaten zur Behandlung von
neuronalen/psychiatrischer Krankheiten nützlich sein.
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Demzufolge ist es eine wesentliche
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen,
mit dem neuronale und psychiatrische Krankheiten durch die Beeinflussung
des Serotoninstoffwechsel durch Veränderung der Menge/Aktivität von snTPH
behandelt werden. Ferner ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
Nukleinsäuremoleküle und Isoformspezifische
Inhibitoren/Aktivatoren bereitzustellen, die für die Herstellung von pharmazeutischen
Präparaten
zur Behandlung von neuronalen Erkrankungen und für die Diagnose derselben durch
Beeinflussung des Serotoninstoffwechsels durch snTPH eingesetzt
werden können.
Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
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Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der
unabhängigen
Ansprüche,
insbesondere basierend auf der Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen,
deren Genprodukte unmittelbar zur Beeinflussung des neuronalen Serotoninstoffwechsels
eingesetzt werden können,
gelöst.
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Vorteilhafte Ausgestaltungen sind
in den Unteransprüchen
definiert.
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Es ist bei der vorliegenden Erfindung überraschenderweise
erstmals gelungen, Nukleinsäuremoleküle bereitzustellen,
die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer neuronalen Tryptophanhydroxylase
(snTPH) kodieren. Zur Untersuchung der physiologischen Auswirkungen
des Verlustes der 5-HT-Synthese wurden Mäuse mit einem genetischen Mangel
an TPH gezüchtet.
Obwohl ein letaler Phänotypus
dieser genetischen Manipulation erwartet wurde, wie das für Tiere
mit einem Mangel an TH (Q. Y. Zhou, C. J. Quaife, R. D. Palmiter,
Nature 374, 640 (1995)) festgestellt wurde, wurden überraschenderweise
lebensfähige,
homozygote TPH-Knockout-Mäuse
(TPH(-/-)) erzeugt. Diesen Mäusen
mangelt es an 5-HT in der Peripherie. Es konnte erstmalig festgestellt
werden, dass der Wirkungsmechanismus von 5-HT bei der primären Hämostase
die Freisetzung des Von-Willebrand-Faktors bedeutet (vWf). Völlig unerwartet
tritt jedoch nur eine geringe Verminderung der stabilen 5-HT-Mengen
in den klassischen serotonergenen Hirnregionen von TPH(-/-)Mäusen auf,
was zur Identifizierung einer TPH-Isoform führte, die speziell in den Neuronen
exprimiert wird.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
somit eine rekombinante Nukleinsäuresequenz,
die für
ein Polypeptid mit neuronaler Tryptophanhydroxylaseaktivität kodiert,
ausgewählt
aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz
mit der in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID No: 5 (DNA-SEQUENZ MENSCH,
MAUS, RATTE) dargestellten Sequenz oder Fragmente davon,
- b) Nukleinsäuresequenzen,
die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der
in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID No: 5 dargestellten Nukleinsäuresequenz
ableiten oder Fragmente davon,
- c) Derivate der in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID No:
5 dargestellten Nukleinsäuresequenz,
die für
die Polypeptide mit der in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID
No: 6 (AMINOSÄURESEQUENZ MENSCH,
MAUS, RATTE) kodieren und mindestens 80% Homologie auf Aminosäureebene
aufweisen, ohne daß die
biologische Aktivität
der Polypeptide wesentlich reduziert ist,
- d) einer humanen genomischen Nukleinsäuresequenz, welche das Gen
für sn-TPH
enthält
und Polymorphismen aufweist.
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Es ist festzuhalten, daß der Begriff "neuronale Tryptophanhydroxylase" (sn-TPH) im Anmeldungstext alle
Peptide und Proteine mit Tryptophanhydroxylaseaktivität einschließen soll.
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Diese Nukleinsäuren lassen sich in eukaryontischen
und prokaryontischen Organismen bevorzugt Mammalia, wie Homo sapiens
(Mensch), Rattus norvegicus (Ratte) oder Mus musculus (Maus) finden.
Diese Nukleinsäuren
kodieren für
die Aminosäuresequenzen
der SEQ ID NO: 2 (Homo sapiens), SEQ ID No: 4 (Mus musculus) oder
SEQ ID No: 6 (Rattus norvegicus).
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Diese Nukleotidsequenzen werden im
folgenden als snTPH-Gene und ihre Homologen, die Aminosäuresequenzen
als snTPH und ihre Homologen bezeichnet.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
die für
die oben beschriebenen Proteine kodieren, insbesondere für solche
mit der in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 dargestellten
Primärstruktur. Die
Nukleinsäuresequenz
aus Homo sapiens ist in SEQ ID No: 1 und aus Mus musculus in SEQ
ID No: 3 und aus Rattus norvegicus in SEQ ID No: 5 dargestellt.
Nach Isolierung und Sequenzierung sind die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen
in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID No: 5 oder deren funktionelle Äquivalente
wie z.B. Allelvarianten erhältlich.
Unter Allelvarianten sind in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID
No: 5-Varianten zu verstehen, die 60 bis 100% Homologie auf Aminosäureebene
(= Identität),
bevorzugt 70 bis 100 %, besonders bevorzugt 90 bis 100% aufweisen.
Allelvarianten umfassen insbesondere solche funktionellen Varianten,
die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden
aus der in SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3 oder SEQ ID No: 5 dargestellten
Sequenz erhältlich
sind, wobei wenigstens eine der wesentlichen biologischen Eigenschaften
erhalten bleibt.
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Homologe oder sequenzverwandte Nukleinsäuresequenzen
können
aus allen Säugerspezies
einschließlich
Mensch nach gängigen
Verfahren zum Beispiel mittels Homologiescreening durch Hybridisierung mit
einer Probe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
oder Teilen davon isoliert werden.
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Hybridisierung bedeutet im Rahmen
dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen,
vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise
in Sambrook et al. (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2. Auflage Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York) beschrieben sind.
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Unter Standardhybridisierungsbedingungen
sind beipsielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42°C und 58°C in einer
wässrigen
Pufferlösung
mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM
Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich
in Gegenwart von 50% Formamid, wie beispielsweise 42 °C in 5 × SSC, 50%
Formamid zu verstehen.
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DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen
hybridisieren, welche snTPH kodieren, können z.B. aus genomischen oder
cDNA-Bibliotheken
beliebiger Vertebraten, bevorzugt Mammalia, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
besitzen, isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger
DNA-Sequenzen kann dabei z.B. unter Verwendung von DNA-Sequenzen
erfolgen, die exakt oder im wesentlichen die in SEQ ID No: 1, SEQ
ID No: 3 oder SEQ ID No: 5 angegebene DNA-Sequenz oder Teile davon
aufweisen, bzw. der reversen Komplemente dieser DNA-Sequenzen, z.B.
mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (s. z.B. Sambrook
et a. (1989), vide supra). Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten
Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln,
die mit Hilfe üblicher
Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen
mit einer der oben erwähnten
snTPH-Sequenzen oder einem Teil davon übereinstimmt.
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Nukleinsäuresequenzen, die ein Protein
mit der biologischen Aktivität
einer neuronalen Tryptophanhydroxylase kodieren, umfassen auch DNA-Sequenzen,
deren Nukleinsäuresequenzen
zu einer der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen degeneriert ist.
Die Degeneration des genetischen Codes bietet dem Fachmann u.a.
die Möglichkeit,
die Nukleotidsequenz der DNA-Sequenz
an die Codonpräferenz
(codon usage) des Zielorganismus anzupassen und die Expression dadurch
zu optimieren.
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Die oben beschriebenen DNA-Sequenzen
umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben
beschriebenen DNA-Sequenzen,
die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer neuronalen Tryptophanhydroxylase
kodieren. Unter Fragmenten werden dabei Teile der DNA-Sequenz verstanden,
die lang genug sind, um eines der beschriebenen Proteine zu kodieren.
Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Sequenzen
sich von den oben beschriebenen DNA-Sequenzen an einer oder mehreren
Positionen unterscheiden, aber einen hohen Grad an Homologie vorweisen.
Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 25 Prozent,
insbesondere eine Identität
von mindestens 40 Prozent, vorzugsweise von mindestens 60 Prozent,
besonders bevorzugt von über
80 Prozent und am meisten bevorzugt von über 90 Prozent. Dabei weisen
die durch diese DNA-Sequenzen kodierten Proteine eine Sequenzidentität zu den
in in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 angegebenen Aminsoäuresequenzen
von mindestens 60 Prozent, insbesondere mindestens 80 Prozent, vorzugsweise
85 Prozent und besonders bevorzugt über 90 Prozent, 95 Prozent
und 98 Prozent auf. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen DNA-Sequenzen können dabei
beispielsweise durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination
entstanden sein.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
oder deren Fragmente lassen sich darüber hinaus auch zur Isolierung
genomischer Sequenzen über
Homologiescreening unter Verwendung der oben genannten Hybridisierungsbedingungen
einsetzen.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
sind die erfindungsgemäßen isolierten
Proteine. Daraunter sind Proteine zu verstehen, die in SEQ ID No:
2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 dargestellte Aminosäuresequenz
oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion
von einem oder mehreren Aminosäureresten
erhältliche
Sequenz enthalten, wobei wenigstens noch eine der wesentlichen biologischen
Eigenschaften des in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No:
6 dargestellten Proteins erhalten bleibt. Dabei können beispielsweise
bestimmte Aminosäuren
durch solche mit ähnlichen
physikochemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizität etc.)
ersetzt werden. Es können
aber auch eine oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge vertauscht,
hinzugefügt
oder entfernt werden oder es können
mehrere dieser Maßnahmen
miteinander kombiniert werden. Die solchermassen gegenüber der
SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 veränderten Pro teine besitzen wenigstens
60%, bevorzugt 70 % und besonders bevorzugt wenigstens 90% Sequenzidentität zu den
Sequenzen in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 berechnet
nach dem Algorithmus von Altschuld et al. (1990, J. Mol. Biol.,
215: 403-410, BLAST-Programm (derzeit aktuelle Version) über die
gesamte Länge
der Proteinsequenzen).
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Unter funktionellen Äquivalenten
der genannten Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die für Proteine
kodieren, die die biologische Aktivität von snTPH aufweisen und mindestens
50 % der Aktivität
der unter SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 genannten
Sequenzen aufweisen. Diese funktionellen Äquivalente interagieren bevorzugt
mit anderen Proteinen, mit denen sie sogenannte Proteinkomplexe
(Proteinheteromere) bilden.
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In einer weiteren Ausführungsform
gehört
zu den wesentlichen biologischen Eigenschaften außerdem die
spezifische Bindung von synthetischen oder natürlichen Agonisten und Antagonisten
an die erfindungemäßen Proteine
mit den in SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 4 oder SEQ ID No: 6 dargestellten
Aminosäuresequenzen oder
deren funktionelle Äquivalente,
deren biologische Eigenschaften dadurch verändert oder moduliert wird.
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Die erfindungsgemäßen Proteine und ihre funktionellen
Varianten lassen sich vorteilhafterweise aus dem Gehirn von Mammalia
wie Homo sapiens (u.a. humane SCLC-Zellen, SHP-77), Mus musculus
oder Rattus norvegicus isolieren.
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Weiter betrifft die Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die
die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
enthalten oder durch natürlich
vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Prozesse und Syntheseverfahren
aus diesen entstanden sind bzw. von diesen abgeleitet wurden. Hierbei
kann es sich beispiels weise um DNA- oder RNA-Moleküle, cDNA,
genomische DNA, mRNA usw. handeln.
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Weiterhin ist es von Vorteil, die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren funktionell
mit mindestens einem genetischen Regulationselement zu den erfindungegemäßen rekombinanten
Nukleinsäuremolekülen (Expressionskassette,
Genkonstrukt) zu verknüpfen,
die die Transkription und, falls erwünscht, die Translation in der Zelle
gewährleisten.
Dazu werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen üblicherweise
mit genetischen Regulationselementen wie Transkriptions- und Translationssignalen
funktionell verknüpft.
Dabei kann die Nukleinsäuresequenz
in Antisense oder Sense-Richtung mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft sein.
Diese Verknüpfung
kann je nach gewünschter
Anwendung zu einer Erhöhung
oder Erniedrigung der Genexpression führen.
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Für
die Expression der in den erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremolekülen enthaltenen
DNA-Sequenzen in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen kommen
grundsätzlich
alle natürlichen Promotoren
mit ihren Regulationssequenzen in Frage.
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Diese regulatorischen Sequenzen bzw.
Faktoren können
dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch
erhöhen.
So kann eine Verstärkung
der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene
erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren vorhanden
sind. Ruch ist eine gezielte genetische Veränderung des natürlich vor
den Sequenzen vorhandenen Promotors vorteilhaft. Weitere Regulationssignale
wie 3' gelegene
Terminatoren oder Polyadenylierungssignale oder Enhancer können funktionell
in den rekombinanten Nukleinsäuremolekülen Anwendung
finden.
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In jedem Fall kann der Fachmann geeignete
Promotoren der Literatur entnehmen oder mittels Routineverfahren
aus beliebigen Organismen isolieren.
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Ferner sind Transkriptions- bzw.
Terminationssequenzen vorhanden, die der korrekten Beendigung der
Transkription dienen, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an
das Transkript dienen können,
dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen
wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und beliebig
austauschbar.
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Weiterhin betrifft die Erfindung
die Bereitstellung von Vektoren, umfassend die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz
oder ein erfindungsgemäßes rekombinantes
Nukleinsäuremolekül, deren
Verwendung zur Herstellung transgener Organismen mit erhöhter oder
erniedrigter Produktion/Aktivität
von snTPH dienen.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
somit auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Kosmide, Viren, Bakteriophagen
und andere in der Gentechnik gängige
Vektoren, die die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten
und ggf. für
den Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle auf eukaryontische
oder prokaryontische Zellen eingesetzt werden können.
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Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße rekombinanten
Nukleinsäuremolekül oder können die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren auch
in Form therapeutisch oder diagnostisch geeigneter Fragmente exprimiert
werden. Zur Generierung des rekombinanten Proteins können Vektorsysteme
oder Oligonukleotide verwendet werden, die die Nukleinsäuren oder
das rekombinante Nukleinsäuremolekül um bestimmte
Nukleotidsequenzen verlängern
und damit für
veränderte
Polypeptide kodieren, die einer einfacheren Reinigung dienen (TAGS).
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Als Wirtsorganismen sind prinzipiell
alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrerer
Allelvarianten, ihrer Homologen, funktionellen Äquivalente oder Derivate, des rekombinanten
Nukleinsäuremoleküls oder
der Vektoren, ermöglichen.
Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise eukryontische oder prokaryontische
Wirtsorganismen wie Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische
Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien wie Escherichia
coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen
wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukryotische Zellen aus
Mensch oder Tier, wie beispielsweise die Zelllinien COS7, NG108-15
und P815.
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Diese transgenen oder rekombinanten
Organismen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie entweder die erfindungegemäßen Nukleinsäuren, ihre
Allelvarianten, ihre Homologen, funktionellen Äquivalente oder Derivate, das
rekombinante Nukleinsäuremolekül oder die
Vektoren natürlicherweise
nicht enthalten oder nicht an dieser Stelle im Genom oder in der
Zelle enthalten oder aber dass der natürliche Promotor der erfindungsgemässen rekombinanten
Nukleinsäuremoleküle so genetisch
manipuliert wurde, dass die entsprechenden Gene entsprechend stärker oder
schwächer
exprimiert werden.
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Dabei kann der beschriebene Wirtsorganismus
mindestens eine erfindungemäße Nukleinsäuresequenz
oder mindestens ein rekombinantes Nukleinsäuremoleküle oder mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor
enthalten.
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Vorteilhaft kann das Genprodukt auch
in transgenen Organismen wie transgenen Tieren, zB. Mäusen, Ratten,
Schafen, Rindern oder Schweinen zur Expression gebracht werden.
Auch transgene Pflanzen sind denkbar, wobei es sich hier um Proteingewinnung
durch molecular farming handeln könnte. Bei den transgenen Organismen
kann es sich auch um sogenannte Knock-Out Tiere handeln.
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Dabei können die transgenen Tiere eine
funktionelle oder nicht funktionelle erfindungegemäße Nukleinsäuresequenz
oder ein funktionelles oder nicht funktionelles Nukleinsäurekonstrukt
enthalten.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder
Teile davon zur Gentherapie in Säugetieren,
z.B. Mensch. Auch zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder
Teilen davon komplementäre
Sequenzen können
zur Gentherapie verwendet werden. Gentherapie umfasst dabei alle
Therapieformen, die entweder Sequenzen nach Anspruch 1 in den Körper oder Teile
davon einbringen, oder die Expression von Sequenzen nach Anspruch
1 beeinflussen. Dazu können
Oligonukleotide, z.B. Antisense- oder Hybrid-RNR-DNA Oligonukleotide,
mit beliebigen Modifikationen, die Teile der Sequenzen gemäß Anspruch
1 enthalten, benutzt werden. Ebenfalls können virale Konstrukte, enthaltend eine
Sequenz nach Anspruch 1 oder Teile davon benutzt werden.
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Ein weitere vorteilhafte Ausführungsform
ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
des erfindungsgemäßen rekombinanten
Nukleinsäuremoleküls oder
der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz
zur Identifizierung/Auffindung von Proteinen, die zu einem Protein,
das durch die Aminosäuresequenz
gemäß Anspruch
2 oder 3 kodiert wird, spezifische Bin dungsaffinitäten aufweisen,
oder zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Proteine kodieren, die zu
einer Aminosäuresequenz
gemäß Anspruch
2 oder 3 spezifische Bindungsaffinitäten aufweisen. Vorteilhafterweise
werden hierzu das Two-Hybrid
System oder andere biochemische Verfahren allein oder in Kombination
verwendet. Es lassen sich so Interaktionsdomänen des erfindungsgemäßen Proteins
und andere konservierte Bereiche und damit pharmakotherapeutische
Interventionspunkte bestimmen.
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Daher ist ein weiterer Aspekt der
Erfindung die Verwendung des Two-Hybrid Systems oder biochemischer
Verfahren allein oder in Kombination zur Identifizierung der Interaktionsdomänen von
snTPH und die Verwendung zur pharmakotherpeutischen Intervention.
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Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform
der Erfindung ist die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch
1 als Marker für
humane Erbkrankheiten, insbesondere neuronale Erkrankungen.
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Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung eines Proteins gemäß Anspruch 2 seiner funktionellen Äquivalente
oder von Peptidfragmenten davon als Antigen zur Erzeugung von spezifischen
poly- oder monoklonalen Antikörpern
oder Antikörpergemischen
gerichtet gegen Proteine gemäß Anspruch
2 oder 3. Mit Antikörpern
sind sowohl polyklonale, monoklonale, humane oder humanisierte oder
rekombinante Antikörper
oder Fragmente davon, single chain Antikörper oder auch synthetische
Antikörper
gemeint. Unter erfindungegemäßen Antikörpern oder
deren Fragmente sind prinzipiell alle Immunoglobulinklassen oder
ihre Subklassen oder deren Mischungen zu verstehen. Als Fragmente
seien alle verkürzten
oder veränder ten
Antikörperfragmente
mit einer oder zwei dem Antigen komplementären Bindungsstellen genannt. Auch
genmanipulierte nicht-verkürzte
Fragmente können
vorteilhaft verwendet werden. Die Antikörper oder Fragmente können allein
oder in Mischungen verwendet werden.
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Die Antikörpergene für die gentechnischen Manipulationen
lassen sich in einer dem Fachmann bekannten Weise beispielsweise
aus den Hybridomzellen isolieren. Dazu werden Antikörperproduzierende
Zellen angezogen und die mRNA bei ausreichender optischer Dichte
der Zellen über
Zell-Lyse mit Guanidiniumthiocyanat, Ansäuern mit Natriumacetat, Extraktion
mit Phenol, Chloroform/Isoamylalkohol, Fällungen mit Isopropanol und
waschen mit Ethanol aus den Zellen in bekannter Weise isoliert.
anschließend
wird mit Hilfe der Reversen Transkriptase cDNA aus der mRNA synthetisiert.
Die synthetisierte cDNA kann direkt oder nach genetischer Manipulation
beispielsweise durch site directed mutagenesis, Einführung von
Insertionen, Inversionen, Deletionen oder Basenaustausche in geeignete
tierische, pilzliche, bakterielle oder virale Vektoren inseriert
und in den entsprechenden Wirtsorganismen exprimiert werden.
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Spezifische Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Proteine
können
sich sowohl als diagnostische Reagenzien als auch als Therapeutika
bei Krankheitsbildern, die u.a. durch Veränderungen des Serotoninstoffwechsels
charakterisiert sind, eignen.
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Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
gemäß Anspruch
1, ihre funktionellen Äquivalente, Homologe
oder Derivate oder deren Fragmente, die von ihren kodierten Proteinen
mit den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen,
sowie davon abgeleitete Reagenzien (Oligonukleotide, Antikörper, Peptide)
können zur
Feststellung einer Prädisposition,
zur Diagnose, zur Therapie und zum Monitoring von neurologischen
Erkrankungen, insbesondere im Zusammenhang mit den serotonergen
Effekten in der Verhaltensphysiologie, verwendet werden.
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Die Beeinflussung der snTPH erfolgt
auf folgenden Wegen:
Es werden spezifische Inhibitoren der
neuronalen TPH-Isoformen entwickelt, die auf den beschriebenen molekularen
unterschieden der TPH-Isoformen beruhen, andererseits auch Inhibitoren,
die nicht Blut-Hirnschranken-gängig
sind. Spezifische Inhibitoren für
die TPH-Isoformen können
in vitro durch dem Fachmann bekannte Standard-Screeningmethoden
gefunden werden, da die erhaltenen cDNAs der snTPH mit Hilfe von
Expressionssystemen zur gezielten Expression der reinen Isoformen
verwendet werden können.
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Diesen Inhibitoren kommen neben dem
diagnostischen Nutzen auch therapeutische Anwendungsmöglichkeiten
zu, denn erhöhte
Serotonin-Spiegel im ZNS werden bei einer Vielzahl an Komplikationen
aufgefunden.
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Die Beeinflussung der snTPH-Regulation
(Aktivität
und/oder Menge des snTPH) kann erfindungsgemäß auf folgenden Wegen erfolgen:
Die spezifische Herunterregulierung der snTPH erfolgt molekularbiologisch
mit Ribozymen, Antisense-Oligonucleotiden oder durch Antisens-RNA-Expression,
wobei die Sequenzunterschiede der Isoform mRNAs die Beeinflussung
jeweils nur einer mRNA erlauben. Außerdem wird gemäß der Erfindung
auch mit pharmakologischen Ansätzen
mit Hilfe spezifischer TPH-Inhibitoren, wie beispielsweise p-Chlorophenylalanin
oder p-Ethinylphenylalanin, gearbeitet.
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Die Serotonin-Produktion wird molekularbiologisch
bevorzugt durch gewebsspezifsche Überexpression der snTPH stimuliert,
pharmakologisch können
beispielsweise die Vorgänger-Substanz,
5-Hydroxytryptophan, oder auch substituierte Analoge verabreicht
werden, nicht zuletzt aber auch Serotonin selbst.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnostik
von neuronalen Erkrankungen ist dadurch gekennzeichnet, daß eine spezifische
Inhibierung der peripheren Serotoninbiosynthese durchgeführt wird,
nachfolgend die aus dem CNS stammenden Metabolitenkonzentrationen
bestimmt werden und anhand einer Vergleichskurve der Krankheitsgrad
ermittelt wird. Dazu ist es notwendig, Substanzen einzusetzen, die
nicht Blut-Hirn-Schranken-gängig
sind.
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Vorteilhaft ist weiterhin die Verwendung
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
der erfindungsgemäßen rekombinanten
Nukleinsäuremoleküle oder
der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen zur
Behandlung von Störungen
des Schlafs, der Angst, des Alkoholkonsums, des Drogenkonsums, der
Nahrungsaufnahme und des sexuellen Verhaltens, dadurch gekennzeichnet,
dass der Serotoninspiegel durch Modulation der Genexpression von
snTPH oder Veränderung
der Aktivität
von snTPH beeinflusst wird.
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In einer weiteren Ausführunsform
werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen,
die erfindungsgemäßen rekombinanten
Nukleinsäuremoleküle oder
die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen zur
Entwicklung und Herstellung eines Kombinationspräparats eingesetzt, umfassend
ein Protein nach Anspruch 2 oder 3 und mindestens ein weiteres Protein,
insbesondere zur Regulation des Serotonin-Stoffwechsels. Neben einem
herkömmlichen
Trägermaterial
kann das Kombinationspräparat
grundsätzlich
al le vorteilhaften pharmazeutisch verträglichen Proteine enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Kombinationspräparat
als weiteren Wirkstoff eine periphere Tryptophanhydroxylase zur
gleichzeitigen Behandlung von neuronalen/psychiatrischen und thrombotischen
Erkrankungen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall (periphere und die
neuronale Serotoninproduktion werden gleichzeitig beeinflusst durch
Erhöhung
oder Erniedrigung). In diesem Zusammenhang ist erwähnenswert,
dass bei der Anwendung von SSRI (serotonin specific reuptake inhibitors)-Antidepressiva
in der psychopharmakologischen Therapie in einigen Fällen ernsthafte Blutungs-Komplikationen
hervorrufen. Durch Einsatz von Präparaten mit spezifischer neuronaler
Wirkung kann dies unterbunden werden. Dementsprechend ist eine weitere
Ausführungsform
der Erfindung das beschriebene Kombinationspräparat zur Behandlung von Blutungsepisoden
in der psychopharmakologischen Behandlung von Depressionen mit Antidepressiva,
die auf den Serotonin-Wiederaufnahme-Transporter
wirken, enthaltend Antidepressiva und von Willebrand-Faktor.
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BEISPIELE
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Die beschriebene Erfindung wird nunmehr
durch die folgenden Beispiele erläutert. Verschiedenartige, andere
Ausgestaltungen werden für
den Fachmann aus der vorliegenden Beschreibung ersichtlich. Es wird
jedoch ausdrücklich
darauf hingewiesen, daß die
Beispiele, die Beschreibung der Abbildungen und die Abbildungen
lediglich zur Erläuterung
vorgesehen und nicht als Einschränkung
der Erfindung anzusehen sind.
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Soweit nicht anders angegeben wurde
bei der experimentelle Durchführung
entsprechend den Vorschriften in Ausubel et al. (eds), 1998, Current
Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York und Sambrook et al.
(eds.), 1989, Molecular cloning: A laboratory manual. CSH Laboratory
Press, New York" verfahren.
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AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 1 UNVERÄNDERTE 5-HT-BIOSYNTHESE
IM ZNS VON TPH(-/-)MÄUSEN.
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Dazu wurde ein "Gene-targeting"-Vektor geschaffen, der eine Substitution
einer transkriptionell aktiven neomyzinbeständigen Genkassette für die 3'-Kodierungsregion
des ersten translatierten Exons des tph-Gens (1A)
herbeiführte,
um die TPH-Expression zu deaktivieren. Mäuse mit einem TPH-Mangel wurden
mit "Gene-targeting"-Standardmethoden
(Walther et al. J. Biol. Chem. 273, 11867 (1998)) geschaffen. Mit
PCR ( 1B) und Southern Blots mit einer äußeren (1C) und einer inneren Sonde, die identische
Fragmente feststellte, wurden die Tiere, die für die mutierten tph-Allele
heterozygot oder homozygot sind, identifiziert.
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Der Verlust von TPH-Aktivität in "gene-targeted" Mäusen wurde
zunächst
in Vollblutproben unter Anwendung der Hochdruckflüssigkeitschromatographie
mit einem fluorimetrischen (HPLC-FD; 1D)
und elektrochemischen (HPLC-ECD; 1D und E) Nachweis gezeigt. Die Wildtyp-(TPH(+/+))Nachkommenschaft
eines Elternpaares und die durch Inzucht erzeugten Labormäuserassen
C57BL/6 und 129SvJ, von denen die TPH(-/-)-Tiere abstammen, enthalten
die erwarteten hohen Konzentrationen von 5-HT, während bei TPH(-/-)-Tieren kein
5-HT mit diesen empfindlichen Versuchen nachweisbar war. Da die
Nachweisgrenze bei Vollblut 5pg/μl
betrug, musste 5-HT unter 1 % der Normalmengen in den Thrombozythen
dieser Mäuse
betragen.
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Darüber hinaus waren gastrointestinale
Enterochromaffinzellen, die die Quelle für die großen 5-HT-Pools im Vollblut
sind, frei von 5-HT bei TPH(-/-)-Mäusen, wie immunhistochemisch
nachgewiesen wurde (1F), während überraschenderweise
eindeutige Spuren von 5-HT (weniger als 4 % des normalen) im Zwölffingerdarm
von TPH(-/-)-Mäusen
unter Anwendung von HPLC (1D) nachgewiesen
wurden.
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Es ist höchst bemerkenswert, dass nur
geringe Rückgänge der
5-HT-Mengen und
seines wichtigsten Metaboliten, der 5-Hydroxyindole-3-Essigsäure (5-HIAA),
in den serotonergenen Projektionsbereichen der TPH(-/-)-Mäusehirne
zu verzeichnen waren, die nur statistische Bedeutung im Hippokampus
gegenüber TPH(+/+)-Mäusen (1E)
erreichten. Die 5-HT-Mengen von Labormausrassen (C57/BL/6 und 129SvJ)
unterscheiden sich mehr voneinander in den untersuchten Hirnregionen
als die 5-HT-Mengen von TPH(-/-)- und TPH(+/+)-Mäusen. Jedoch enthält interessanterweise
die Epiphyse von TPH(-/-)-Mäusen
weniger als 1 % des 5-HT und 5-HIAA, das bei TPH(+/+)-Mäusen (1E) festgestellt wurde.
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Das Vorhandensein von 5-HT und TPH
im CNS wurde qualitativ des weiteren durch immunhistochemische Analysen
bestimmt. In den Nuclei Raphe (1G)
waren nur minimale Unterschiede in den 5-HT-Mengen (1H)
und der TPH-Expression (1I) nachweisbar.
Somit spiegelte das Targeting des tph-Gens eine unerwartete Trennung
der 5-HT-Biosynthese im CNS und im peripheren Gewebe wider.
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Um die möglichen Auswirkungen der marginal
veränderten
zentralen 5-HT-Mengen zu untersuchen, wurden Verhaltensversuche
an TPH(-/-)- und an Kontrollmäusen
durchgeführt.
Es konnten in Elevated-plus-maze- und Hole-board- und water-maze-Tests,
die auf ein mit 5-HT verbundenes Verhalten hinweisen, keine wesentlichen
Unterschiede im Verhalten der Tiere mit verschiedenen Genotypen
nachgewiesen werden.
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AUSFÜHRUNGSBEISPIEL 2 IDENTIFIKATION
EINER NEURONALEN TPH.
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Veranlasst durch die in Ausfürungsbeispiel
1 beschriebenen Erkenntnisse wurde nach dem Grund für die verbleibende
TPH-Expression im
Hirn der TPH(-/-)-Tiere gesucht. Es wurde die Existenz eines zweiten, noch
nicht entdeckten Genstandortes, der eine neurospezifische TPH-Isoform
kodiert, angenommen, da die immunhistochemischen Versuche (1I) und Western Blots (Daten werden nicht
angegeben) das Vorhandensein eines TPH-Proteins im Hirn von TPH(-/-)-Tieren,
in der Größe ähnlich dem
bekannten TPH, zeigten.
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Nach dem Screening der Datenbank
HighTroughput Genomic Sequences (HTGS) der GenBank unter Verwendung
kurzer, translatierter TPH-Sequenzen wurde ein menschlicher genomischer
Klon auf Chromosom 12 (GenBankzugang ACO23966) mit einem offenen
Leserahmen, sehr ähnlich
dem TPH-Exon 4, jedoch anders als PAH, das ebenfalls am Chromosom
12 liegt, erhalten. Eine weitere Analyse der Sequenz zeigte das Vorhandensein
anderer putativer Exone. Weiterhin wurde ein genomischer Rattenklon
(ACO99197) gefunden, der auch die putativen Exone enthält. Es wurden
Primer entwickelt, die auf Teilen dieser Sequenzen basieren, die
den Exonen 4 und 6 der Mäuse-TPH
homolog sind. Damit wurde ein ein cDNA-Fragment aus dem Hirn von TPH(-/-)-Mäusen erhalten,
das sich von den bekannten TPH, PAH und TH der Maus unterscheidet.
Gestützt auf
die Sequenz dieses Fragments wurde die cDNA (neuer GenBankeintrag:
AY090565) der neuronalen TPH in voller Länge bei Verwendung von 5'- und 3'-RACE gewonnen. Die
abgeleitete Aminosäurensequenz
dieses Enzyms zeigt eine Ähnlichkeit
mit der klassischen Maus-TPH-Sequenz von 86 % ( 2A).
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Diese cDNA wurde in einen eukaryotischen
Expressionsvektor geklont und COS7-Zellen, die keine endogene TPH-Aktivität aufweisen,
vorübergehend
transfiziert. Homogenate transfizierter Zellen zeigten eine Tryptophanhydroxylationsaktivität, die die
Spezifität
dieses Hirnenzyms bestätigt
(2B).
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Bei Anwendung von RT-PCR konnte die
Expression dieser zweiten TPH-Isoform in Ratten (neuer GenBank-Eintrag:
AY098915) bestätigt
und eine homologe EST-Sequenz für
Hühner
(AL584678) gefunden werden, die sich von der bekannten Hühner-TPH
(GGU26428) unterscheidet, sowie EST-Sequenzen aus Zebrafischhirn
(BI475520, BI981676 und BM025115), außer einer weiteren EST-Sequenz
aus einem Zebrafischovarium (BI 979302) mit hoher Homologie zur
bekannten TPH. Daher scheint eine sich gegenseitig ausschließende und
zellspezifische Expression dieser beiden TPH-Isoformen in Wirbeltieren
aufzutreten. Es wurde auch das menschliche Homolog der neuen TPH-Isoform
(neuer Gen-Bankeintrag:
AY098914) geklont und sequenziert.
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Die bereits bekannte TPH mRNA wurde
im Zwölffingerdarm
und auch in der Thymusdrüse
und in der Milz nachgewiesen, jedoch nicht im Hirn, unter Anwendung
von 20 μg
Gesamt-RNA in RNase-Schutzversuchen,
speziell für
die beiden TPH-Isoformen ( 2C). Im
Gegensatz dazu ist die neuronale TPH ausschließlich im Hirn nachweisbar und
wird dort stark exprimiert (2C). Daher
wird die klassische TPH als periphere TPH, pTPH, und das neue Enzym
als neuronale TPH, snTPH, bezeichnet.
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Darüber hinaus unterstützt auch
die Analyse von P815 mRNA eine sich gegenseitig ausschließende zellspezifische
Expression von snTPH und pTPH, da nur pTPH mRNA, jedoch nicht snTPH
mRNA, durch spezifische RNAse-Schutzversuche nachgewiesen werden
kann (RPA, 2D), wobei des weiteren
nachgewiesen wurde, warum Anti-TPH-Antiseren, die gegen P815 TPH
erzeugt wurden, nicht das Hirnstammenzym nachweisen konnten. Gemäß der sich
gegenseitig ausschließenden
zellspezifischen Expression wird vorliegend gezeigt, dass Mengen
von snTPH mRNA im Hirn von TPH(-/-)-Mäusen nicht beeinträchtigt werden (2E). Des weiteren weisen das Mittelhirn
und Pons von den gesamten RNA-Proben
von Kontrolltieren, die in den RPAs verwendet wurden, etwa 50 Mal
mehr snTPH auf, als pTPH mRNA (2F).
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Somit zeigen die Ergebnisse an TPH(-/-)-Mäusen, dass
5-HT im ZNS und peripherem Gewebe durch zwei unabhängig gesteuerte
serotonergene Systeme synthetisch hergestellt wird, definiert durch
TPH-Isoformen, die von verschiedenen Genen mit sich gegenseitig
ausschließenden
gewebespezifischen Expressionsmustern kodiert wurden, was leicht
viele früher
rätselhafte
Daten erklärt.
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Beschreibung der Abbildungen
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Abbildung 1
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Züchtung
von TPH(-/-)Mäusen
und quantitative Bestimmung von Trp und 5-HT im peripheren Gewebe und
von Trp, 5-HT und 5-HIAA in ausgewählten Hirnbereichen unter Verwendung
von HPLC-FD und immunhistochemischer Färbung (A) Schematische Darstellung
des Targeting-Verfahrens. Die ersten vier der 11 Exons des TPH-Gens werden dargestellt.
Das Knockoutkonstrukt (KO) wurde durch die homologe Rekombination
in ein Allel von ES-Zellen integriert, wobei das erste Kodierungsexon
(Exon 2) des TPH-Gens
zerstört wurde.
Des weiteren enthält
die integrierte Neomyzinbeständigkeitskassette
(neor) ein Transkriptionsbeendigungssignal
(pA). Die Positionen der analytischen PCR-Amplicons für die Identifizierung der wilden
und der KO-Allel werden angegeben sowie die Positionen der inneren
und äußeren Sonden
und die Eco RI-Stellen (fett RI), die für Southern Blot verwendet werden.
Verengungsstellen: RI: Eco R2; Hd: Hind III; Bm: Bam HI; Sc: Sac I.
(B) Agarosegelelektrophorese analytischer PCR-Produkte. Wie in (A)
angegeben, weist der PCR-Versuch an
wilden Tieren ein 1.1 kb-Fragment nach, während das KO-Allel als 1.3
kb-Fragment nachgewiesen wird. (C) Southern Blot von Eco RI-verdauter
genomischer DNA. Wie in (A) angegeben, weisen beide Sonden bei wildlebenden
Tieren ein 10 kb Eco RI-Fragment nach, während bei KO-Tieren ein kürzeres 8
kb-Fragment nachgewiesen wird, aufgrund der Eco RI-Stelle, die in
der Neomyzinbestätigkeitskassette
enthalten ist. (D) Trp und 5-HT im Vollblut und Zwölffingerdarm
von 129SvJ, C57BL/6, TPH(-/-) und TPH(+/+)-Mäusen, n.d., unterhalb der Nachweisgrenze
des (< 5 pg/μl). *, statistisch
signifikant (p < 0.05),
verglichen mit allen anderen untersuchten Mäuselinien. (E) Trp, 5-HT, and
5-HIAA im Ammonshorn und Frontalkortex, zwei serotonergene Projektionsbereiche
von 129SvJ, C57BL/6, TPH(-/-), und TPH(+/+)-Mäusen und in der Epiphyse von
TPH(-/-) und TPH(+/+)-Mäusen
*, statistisch signifikant (p < 0.05),
im Vergleich zu allen anderen untersuchten Mäuselinien. +, statistisch signifikant
(p < 0.05), im
Vergleich zu TPH(+/+)-Mäusen,
jedoch nicht zu anderen Labormauslinien. (F) Immunhistochemischer
Vergleich von 5-HT im Zwölffingerdarm
von TPH(-/-) (links) und Wildtyp (rechts) Mäusen. Eine Anti-5-HT-Färbung fehlt in Zwölffingerdarmschnitten
von TPH(-/-)Mäusen,
während
Enterochromaffinzellen bei TPH(+/+)-Mäusen eine starke Färbung zeigen.
(G–I)
Immunhistochemischer Vergleich von 5-HT (E) und TPH (F) in Nuclei Raphe von
TPH(-/-) (links) und Wildtyp (rechts) Mäusen. (G) Schematische Darstellung
der Fläche
der Vibratomschnitte. Kleines Nebenbild: der vertikale Strich zeigt
die Position bei seitlicher Ansicht des Hirns. Großes Nebenbild:
Zoom der gefärbten
Bereiche, wie auf (H) und (I) dargestellt. 4n: Nervus trochlearis
oder seine Wurzel; DRD: Dorsaler nucleus raphe, dorsaler Teil; DRV:
Dorsaler nucleus raphe, ventraler Teil; DRVL: dorsaler nucleus raphe,
ventrolateraler Teil; mlf: medialer Längsfasciculus; MnR: Mittlerer
nucleus raphe; PMnR: paramittlerer nucleus raphe; scp: Pedunculus
cerebellaris superior (brachium conjunctivum). (H) Anti-5-HT-Färbung von
TPH(-/-) und TPH(+/+)-Mäusen.
(I) Anti-TPH-Färbung
von TPH(-/-) und TPH(+/+)-Mäusen.
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Abbildung 2
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Sequenz und Expression von Maus-snTPH
(Mus musculus). (A) Der Sequenzvergleich der abgeleiteten Aminosäurensequenz
von snTPH bis pTPH zeigt die hohe Homologie beider Enzyme miteinander,
bei höchster Ähnlichkeit
im katalytischen Bereich (aa 149 bis 450). (B) Umgekehrte Phasen-HPLC-FD-Chromatogramme
der TPH-Aktivitätsversuche.
(Oben) Nichtransfizierte COS7-Zellen.
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(Mitte) COS7-Zellen, vorübergehend
mit einem eukaryotischen Expressionsvektor, der die Maus-snTPH cDNA
enthält,
transfiziert. (Unten) P815 Mausmastozytomzellen mit einer hohen
endogenen TPH-Aktivität. 5-hydroxyliertes
Tryptophan (5-HTP) eluiert mit einer Verweilzeit von 5 Min. (C)
RNase-Schutzversuche mit spezifischen Sonden für die zwei Isoformen zeigen
die Anwesenheit von pTPH mRNA im Zwölffingerdarm, der Thymusdrüse und in
der Milz von Wildtyp-Tieren, jedoch nicht bei TPH(-/-)-Mäusen. snTPH mRNA ist ausschließlich im
Hirn vorhanden, unabhängig
vom Genotyp (D) RNase-Schutzversuche speziell für snTPH (Bahn 1-3) und pTPH
(Bahn 4-6): Bahn 1:30 μg
Hirn-RNA, Bahn 2: 30 μg
Zwölffingerdarm-RNA,
Bahn 3: 30 μg
P815 RNA, Bahn 4: 80 μg
Hirn-RNA, Bahn 5: 80 μg
Zwölffingerdarm-RNA,
Bahn 6: 10 μg
P815 RNA. P815-Zellen exprimieren sehr hohe Mengen an pTPH mRNR,
jedoch keine nachweisbare snTPH mRNA. (E). Die quantitative Bestimmung
von snTPH mRNA in Hirn-RNA von Wildtyp-Tieren und TPH(-/-)-Mäusen, unter
Anwendung des Ranse-Schutzversuchs, zeigt keinen Einfluß der pTPH-Ablation. ß-Actin
mRNA wurde als interner Standard verwendet. (F) Vergleich von pTPH
(links) und snTPH mRNA (rechts) in Pons und der Mittelhirn-RNA von Wildtyp-Tieren.
Bahn 1-3: 50 μg
RNA für
pTPH, Bahn 4-6: 30 μg
RNA für
snTPH. β-Aktin
mRNA wurde als interner Standard verwendet.