DE60122301T2

DE60122301T2 - Kaliumkanalprotein kcnq5, ein ziel für erkrankungen des zentralen nervensystems und herz-gefäss-systems

Info

Publication number: DE60122301T2
Application number: DE60122301T
Authority: DE
Inventors: Christian Lerche; Constanze Scherer; Guiscard Seebohm; Andreas Busch; Klaus Steinmeyer
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2000-03-21
Filing date: 2001-03-13
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2021-03-14
Also published as: EP1268545A1; DE10013732A1; EP1268545B1; AU2001237438A1; JP5622345B2; JP2004512009A; WO2001070811A1; DE60122301D1; ATE336508T1

Description

Die Erfindung betrifft das neue Kaliumkanalprotein KCNQ5, das als Angriffspunkt bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems und des Herz-Kreislauf-Systems in Betracht kommt. Das Protein wird als Screening Tool zur Identifizierung von Verbindungen, die Symptome von Krankheiten des zentralen Nervensystems und des Herz-Kreislauf-Systems verbessern, verwendet.
Spannungsabhängige Kaliumkanäle sind Schlüsselregulatoren des Membranruhepotentials und modulieren die Erregbarkeit von elektrisch aktiven Zellen wie Neuronen und Herzmuskelzellen. Mehrere Klassen von spannungsabhängigen K⁺-Kanälen sind kloniert worden, wobei wahrscheinlich alle durch die Zusammenlagerung von vier α-Protein-Untereinheiten oligomere Proteine bilden. Der tetramere Porenkomplex kann darüberhinaus mit Hilfsuntereinheiten Wechselwirken, welche die durch die porenbildenden α-Untereinheiten vermittelten Ströme verstärken und/oder modifizieren.
Die KCNQ-Familie von spannungsabhängigen K⁺-Kanälen wurde ursprünglich durch positionelles Klonieren des KCNQ1-Gens (KvLQT1), welches ein K⁺-Kanalprotein mit sechs transmembranen Domänen und einer charakteristischen Porenregion kodiert, begründet. Bislang besteht die KCNQ-Familie aus vier Mitgliedern, die alle mit Erkrankungen des Menschen in Verbindung gebracht werden. KCNQ1 wechselwirkt funktionell mit KCNE1, einem kleinen β-Untereinheitsprotein mit einer einzelnen transmembranen Domäne und erzeugt so den langsam aktivierenden verzögert gleichrichtenden I_Ks-Strom der Herzmuskelzellen. Inaktivierende Mutationen in beiden Untereinheiten führen zu einer Verlängerung des Herzaktionspotentials und einem erhöhten Risiko von ventrikulärer Arrhythmie bei Patienten mit langem QT-Syndrom (LQTS). KCNQ1 und KCNE1 finden sich auch im Innenohr, und einige Mutationen von KCNE1 und KCNQ1, die einen Funktionsverlust zufolge haben, werden mit Gehörverlust in Verbindung gebracht. Im Darm ist KCNQ1 wahrscheinlich mit dem strukturell verwandten KCNE3-Protein assoziiert und bildet so verschiedene K⁺-Kanäle. Der KCNQ1/KCNE3-Kanalkomplex stellt wahrscheinlich die basolaterale cAMP¹-regulierte K⁺-Konduktanz in Krypten des Kolons dar, und ist wahrscheinlich wichtig für die apikale cAMP-stimulierte Chloridsekretion und an sekretorischer Diarrhoe und cystischer Fibrose beteiligt.
KCNQ2 und KCNQ3 werden im Hirn exprimiert und kommen gemeinsam in verschiedenen Hirnregionen vor (Biervert, C. et al.; Science 279, 403-406, 1998). Während KCNQ2 K⁺-Ströme erzeugt, die denen von KCNQ1 sehr ähnlich sind (Schröder, B. C. et al.; Nature 396, 687-690, 1998), erzeugt KCNQ3 alleine nur kleine Ströme (Wang, W.-P. et al., J.Biol. Chem. 273, 19419-19423, 1998). Durch Coexprimierung von KCNQ2 und KCNQ3 ließen sich Ströme erzeugen, die wenigstens 10-mal so groß waren wie die von KCNQ2 alleine erzeugten (Wang, H.-S. et al.; Science 282, 1890-1893, 1998), was nahelegt, daß KCNQ3 die Exprimierung von KCNQ2-Untereinheiten durch Bildung eines heteromeren Komplexes von KCNQ2- und KCNQ3-Untereinheiten erleichtert. Da sie mit einer Form von Epilepsie in Kleinkindern in Verbindung gebracht werden, hat man die für KCNQ2 und KCNQ3 kodierenden Gene geklont, und bei Patienten mit benignen familiären neonatalen Konvulsionen (BNFC) wurden in beiden Genen Mutationen gefunden, die zu einem Verlust der Funktion führen (Sigh, N. A. et al.; N. Genet. 18, 25-29, 1998; Charlier, C. et al.; N. Genet. 18, 53-55, 1998). Da Epilepsie auf eine elektrische Übererregbarkeit im Hirn zurückzuführen ist, kann es sein, daß die KCNQs eine wichtige stabilisierende Rolle im Nervensystem spielen. Die biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften der KCNQ2/KCNQ3-Ströme sind denen des nativen neuronalen M-Typ K⁺-Stroms sehr ähnlich, der auch durch muscarinische Modulation charakterisiert ist, und von dem man annimmt, daß er auch ein prominenter Regulator der neuronalen Erregbarkeit ist. Ähnlich wie der native M-Strom wird die KCNQ2/KCNQ3-Kanalaktivität durch muscarinische Acetylcholinagonisten stark reduziert, und es wird daher inzwischen angenommen, daß die KCNQ2- und KCNQ3-Untereinheiten zum nativen M-Kanal beitragen.
KCNQ4, ein weiteres Mitglied dieser Genfamilie, wird in den sensorischen äußeren Haarzellen der Innenohrschnecke exprimiert und ist bei dominanter Taubheit mutiert. Interessanterweise führte eine Coexprimierung von KCNQ3 mit KCNQ4 ebenfalls zu erhöhten Stromamplituden, wenngleich in weit geringerem Ausmaß, als dies bei der KCNQ2/KCNQ3-Coexprimierung beobachtet wurde. Dies deutet auf die Möglichkeit hin, daß sich verschiedene KCNQ-Kanäle vereinigen können, um in verschiedenen Teilen des Nervensystems M-Strom-Variationen zu erzeugen.
Aufgabe der Erfindung war die Identifikation anderer Genmitglieder der KCNQ-Famile einschließlich des Proteins zur Verwendung als Target für die Behandlung verschiedener Erkrankungen.
KCNQ5 bildet K⁺-Kanäle, die durch Depolarisierung aktiviert werden, und die den von anderen KCNQ-Kanälen erzeugten Strömen sehr ähnlich sind. KCNQ5 wird im Skelettmuskel und im Hirn exprimiert, wobei sein Expressionsmuster mit dem der dem nativen M-Strom zugrundeliegenden KCNQ2 und KCNQ3 überlappt. Ähnlich wie KCNQ2 bildet KCNQ5 funktionale Heteromere mit KCNQ3, was nahelegt, daß neuronale M-Kanäle wahrscheinlich auch KCNQ5-Untereinheiten enthalten können.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine für ein die Aktivität eines spannungsabhängigen Kaliumkanals zeigendes Polypeptid kodierende DNA-Sequenz, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 2 aufweisen soll.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine DNA-Sequenz mit der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NR. 1.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen rekombinanten DNA-Vektor, wobei der Vektor ein Polynukleotidelement, durch das er für die Multiplikation in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen geeignet wird, und eine wie oben erwähnt für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 2 kodierende DNA-Sequenz umfaßt, die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NR. 1. Bei diesem DNA-Element, durch das der Vektor für eine Multiplikation geeignet wird, kann es sich um einen Replikationsursprung handeln, der in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen wirkt. Ein Beispiel eines Replikationsursprungs, der in prokaryontischen Zellen wirkt, ist colE1 ori. Ein rekombinanter Vektor benötigt weiterhin zur Kontrolle der den Vektor umfassenden Organismen einen Selektionsmarker. Als Selektionsmarker eignen sich Gene, die, wenn sie in Zellen als Proteine exprimiert werden, den Organismus gegen Antibiotika, z. B. Ampicillin, Streptomycin oder Chloramphenicol, schützen (Antibiotikaresistenz) oder für Wachstum auch unter Umweltmangelbedingungen (auxotropen Wachstumsbedingungen) sorgen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei den prokaryontischen Zellen für die Multiplikation des rekombinanten Vektors um Bakterien. Bei besonders bevorzugten Versionen der Erfindung handelt es sich bei den Bakterien insbesondere um Escherichia coli oder Bacillus spec.-Bakterien. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zur Multiplikation des rekombinanten Vektors handelt es sich bei den eukaryontischen Zellen um eine Zelllinie oder Hefezellen. Bei besonders bevorzugten Versionen der Erfindung handelt es sich bei der Zelllinie um Zellen einer COS, Hela- oder 3T3-Zelllinie und bei den Hefezellen um Saccharomyces cerevisiae-Zellen.
Die rekombinate DNA könnte ein Promotorelement bereitstellen, das operativ mit einer für die Aminosäuresequenz oder Polynukleotidsequenz eines KCNQ5 verbunden ist, wodurch die Transkription der betreffenden RNA und/oder die Expression des betreffenden Proteins ermöglicht wird. Bei bevorzugten Versionen der Erfindung kann dieses Promotorelement aus prokaryontischen Promotoren bzw. eukaryontischen Promotoren ausgewählt werden. Ein prokaryontischer Promotor ist durch seine Fähigkeit, in prokaryontischen Organismen eine Transkription zu induzieren, gekennzeichnet, während ein eukaryontischen Promotor durch seine Fähigkeit, in eukaryontischen Organismen eine Transkription zu induzieren, gekennzeichnet ist. Sowohl beim prokaryontischen als auch beim eukaryontischen Promotorelement kann es sich bevorzugt um induzierbare Promotoren oder weiter bevorzugt konstitutive Promotoren handelt. Ein induzierbarer Promotor ist nur dann angeschaltet, wenn ein Signalereignis eingetreten ist. Das Signal kann aus dem Metabolismus der Organismen stammen. In diesem Fall handelt es sich hierbei häufig um Stoffwechselprodukte, Hormone, Abbauprodukte von Makromolekülen oder anderen aus dem Stoffwechsel stammenden Substanzen. Das Signal kann auch aus der Umgebung stammen.
In diesem Fall kann es sich hierbei um Strahlung, Temperatur oder chemische Verbindungen der Umgebung handeln. Ein konstitutiver Promotor benötigt für die Aktivierung keine Induktion.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Wirtszelle, wobei diese Wirtszelle wenigstens einen wie oben erwähnten rekombinanten DNA-Vektor enthält. Die Wirtszelle wird bevorzugt unter prokaryontischen bzw. eukaryontischen Zellen ausgewählt. Ist sie aus prokaryontischen Zellen ausgewählt, so handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine Zelle eines Bakteriums, insbesondere von Escherichia coli oder Bacillus spec. Handelt es sich bei der Wirtszelle um eine eukaryontische Zelle, so ist dies vorzugsweise eine Zelle einer Zelllinie, insbesondere eine Zelle einer COS-, einer Hela- oder einer 3T3-Zelllinie, oder eine Hefezelle, insbesondere eine Zelle von Saccaromyces cerevisiae.
Diese Wirtszelle läßt sich herstellen, indem man die Wirtszelle mit einem rekombinanten DNA-Vektor, der eine für eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 2 oder die Polynukleotidsequenz von SEQ ID NR. 1 kodierende DNA-Sequenz enthält, transformiert. Die Transformation kann nach in der Mikrobiologie angewendeten Routineverfahren erfolgen, wie beispielsweise durch die Transformation von kompetenten Zellen, durch Ca²⁺-Phosphat-Ausfällung oder Elektroporation.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein durch eine der oben erwähnten DNA-Sequenzen kodiertes Protein. Dieses Protein hat die Aktivität einer KCNQ5. KCNQ5-Aktivität ist durch Ionentransport dieses Transporttyps gekennzeichnet. Weiterhin umfaßt die Erfindung die Herstellung eines Proteins, bei der man zunächst eine Wirtszelle, die einen rekombinaten Vektor enthält, der eine für eine Aminosäuresequenz oder eine Polynukleotidsequenz für KCNQ5 kodierende DNA-Sequenz einschließt, in einem geeigneten Wachstumsmedium ausgewählt entsprechend des betreffenden Zelltyps aus Medien für Bakterien oder für eukaryontische Zellen propagiert. Diese propagierten Zellen werden anschließend durch herkömmliche biochemische Verfahren wie Zentrifugieren oder Filtrieren geerntet und zu rohen Zellextrakten verarbeitet. Die Zellextrakte werden sodann durch für die Aufreinigung von Protein verwendete Verfahren wie Größenaustauschchromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und andere aufgereinigt, wodurch man das Protein von Interesse (KCNQ5) abgetrennt von anderen Verbindungen der Zelllysate erhält.
Die Erfindung schließt weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung ein, die sich für die Modifikation der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität eines spannungsabhängigen Kaliumkanals, wie oben erwähnt, eignet, bei dem man

a) das obige Protein mit der Aktivität eines spannungsabhängigen Kaliumkanals bereitstellt;
b) wenigstens eine chemische Verbindung bereitstellt;
c) die chemische Verbindung nach b) mit einem Protein nach a) inkubiert
d) die Aktivität des Proteins nach a) mißt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das in a) beanspruchte obige Protein mit der Aktivität eines spannungsabhängigen Kaliumkanals in einer wie oben erwähnten Wirtszelle bereitgestellt. Das obige Protein mit Aktivität kann bei einer weiter bevorzugten Version der Erfindung zum Zweck der vorliegenden Erfindung mit anderen Proteinen wechselwirken. Insbesondere wechselwirkt es mit KCNQ3. Ein solches Screening-Assay kann eingesetzt werden zur Identifikation wenigstens einer chemischen Verbindung, welche die Aktivität von KCNQ5 modifiziert und eine Wirkung auf Krankheiten des zentralen Nervensystems oder des Herz-Kreislauf-Systems hat.
Beispiel:
Beispiel 1: Molekulares Klonen und Expression von KCNQ5
KCNQ5, ein neues Mitglied der KCNQ-Familie von Kaliumkanälen, wurde isoliert. Das Gen wird in verschiedenen Regionen des Hirns und im Skelettmuskel exprimiert. Bei einer Expression in Xenopus-Oozyten erzeugt KCNQ5 alleine spannungsabhängige, langsam aktivierende, K⁺-selektive Ströme, die gegenüber dem K⁺-Kanalblocker TEA unempfindlich sind und bei positiven Membranspannungen eine deutliche nach innen gerichtete Rektifikation zeigen. Bei gemeinsamer Expression mit dem verwandten KCNQ3-Kanal wird die Amplitude des K⁺-Stroms um einen Faktor von 4–5 erhöht. Verglichen mit homomeren KCNQ5-Strömen zeigen heteromere KCNQ3/KCNQ5-Ströme auch eine langsamere Aktivierung und eine geringere nach innen gerichtete Rektifikation, was zeigt, daß sich KCNQ5 mit KCNQ3 unter Bildung funktioneller Kanalproteine vereinigt. Die funktionelle Wechselwirkung zwischen KCNQ5 und KCNQ3, einer bekannten Proteinuntereinheit des neuronalen M-Stroms legt nahe, daß KCNQ5 möglicherweise zu nativen neuronalen M-ähnlichen Strömen beitragen kann.
Das KCNQ5-Gen wurde zunächst als Sequenz bei einer genomischen Reihenuntersuchung (BAC-Klon) bei einer Homologie-Suche bei GenBank (accession number AQ344243) identifiziert. Unter Verwendung dieser Sequenz wurde eine cDNA-Bibliothek des menschlichen Hirns (erhältlich von Edge Biosystems) durchsucht. Ein zusammengesetztes vollständiges cDNA-Konstrukt wurde aus zwei überlappenden cDNA-Klonen zusammengesetzt und in den Xenopus Expressionsvektor pSGEM (Villmann, C. et al.; J. Neurosci. 17, 7634-7643) subkloniert. Die cDNA wurde in ihrer Gesamtheit unter Verwendung eines automatischen DNA Sequenzers (ABI 310) an beiden Strängen sequenziert. Zur Expression im Xenopus-Oocyten wurde gekappte cRNA unter Verwendung des T7 mMessage mMachine-Kits (AMBION) synthetisiert. Für die Northern-Blot-Analyse wurde gemäß den Angaben des Herstellers mit dem DIG RNA Labeling Kit (erhältlich von ROCHE) eine DIG-markierte Riboprobe mit einer Länge von 1,6 kb (die im wesentlichen C-terminate Sequenzen enthielt) erzeugt und mit einer Reihe von humanen RNA-Blots hybridisiert (erhältlich von CLONTECH).
Beispiel 2: Chromosomale Lokalisierung von KCNQ5
Zur Bestimmung der chromosomalen Lokalisierung von KCNQ5 wurde eine Fluoreszenz-In Situ-Hybridisierungsanalyse (erhältlich von FISH, Genome Systems) durchgeführt. Kurz beschrieben wurde gereinigte DNA des BAC-Klons (AQ344243) durch Nick-Translation mit Digoxigenin dUTP markiert, und die markierte Probe wurde mit von mit PHA-stimulierten Lymphocyten aus peripherem Blut gewonnenen menschlichen Metaphasechromosomen hybridisiert. Unter Verwendung von fluoreszinierten Antidigoxigenin-Antikörpern und nachfolgender Gegenfärbung mit DAPI wurden KCNQ5-spezifische Signale auf dem langen Arm des Chromosoms 6 (6g14) gefunden, die dann durch Cohybridisierung mit einem zuvor von 6p21 kartiertem genomischen Klon bestätigt wurden.
Beispiel 3: Elektrophysiologie
Xenopus laevis-Oocyten wurden von mit Tricain betäubten Tieren erhalten. Die Eierstöcke wurden 120 Minuten lang in OR 2-Lösung (NaCl 82,5 mM, KCl 2 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,4) mit Collagenase behandelt (1 mg/1 ml, Worthington, Typ II) und anschließend bei 18°C in der Aufzeichnungslösung ND-96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl₂ 1,8 mM, MgCl₂ 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,4) mit zusätzlichem Na-Pyruvat (275 mg/l), Theophyllin (90 mg/l) und Gentamycin (50 mg/l) aufbewahrt. Den einzelnen Oocyten wurden jeweils 10 ng von für hKCNQ5, rKCNQ3 (GenBank accession number AF087454), hKCNQ2, bzw. hKCNQ1 kodierender cRNA injiziert oder 10 ng hKCNQ5 gemeinsam mit 5 ng hlsk (KCNE1), hMiRP1 (KCNE2), hMiRP2 (KCNE3) bzw. mMiRP3 (KCNE4) injiziert. rKCNQ3 wurde aus einer λZAP cDNA-Bibliothek (STRATAGENE) unter Verwendung eines DIG-markierten (ROCHE) EST-Klons (GenBank accession number AA019129) als Sonde kloniert. hMiRP1 und hMiRP2 wurden aus humaner genomischer DNA kloniert, und mMiRP3 von cDNA aus Mäusehirn, unter Verwendung von aus den veröffentlichten Sequenzen (13) abgeleiteten Primern. Die Standard Zwei-Elektroden Voltage-Clamp-Aufzeichnungen wurden bei Raumtemperatur mit einem Turbo Tec 10CD (NPI) Verstärker, einem ITC-16 Interface zusammen mit Pulse-Software (HEKA) und Origin zur Datensammlung auf einem Pentium II PC durchgeführt. Die makroskopischen Ströme wurden 2–4 Tage nach der Injektion aufgezeichnet. Allen Anpassungsverfahren lag der Simplex-Algorithmus zugrunde. Die Prüfung auf statistische Signifikanz, von der ausgegangen wurde, wenn P < 0.05 war, und die durch * angezeigt wird, wurde unter Verwendung von Students t-Test durchgeführt.
Beispiel 4: Klonierung und Gewebeverteilung von KCNQ5
Beim Durchsuchen der GenBank-Datei wurde eine humane BAC-Endsequenz (AQ344243) mit signifikanter Homologie zur KCNQ K⁺-Kanalfamilie gefunden. Diese Sequenzinformation wurde zur Isolierung von überlappenden cDNA-Klonen aus einer cDNA-Bibliothek von menschlichem Hirn (Edge Biosystems) verwendet, und zwei cDNA-Klone wurden zum vollständigen cDNA-Klon zusammengesetzt. Dem Initiator Methionin der cDNA wurde das erste ATG im Leserahmen zugeordnet, und ihm geht ein Stoppcodon im selben Leserahmen voran. Die vollständige KCNQ5 cDNA kodiert für ein Polypeptid mit 932 Aminosäuren (1A) mit einer vorausgesagten Molekülmasse von 102 kDa. Das topologische Modell mit sechs transmembranen Domänen wird durch die Hydropathieanalyse unterstützt. KCNQ5 zeigt signifikante Homologie mit anderen KCNQ-Proteinen, wobei KCNQ4 den größten Verwandtschaftsgrad aufweist (65% Identität). KCNQ5 ist zu ungefähr 50% identisch mit KCNQ3 und KCNQ2, jedoch nur zu 40% mit KCNQ1 (1B). Homologie läßt sich insbesondere überall in den membranüberspannenden Regionen und der konservierten P-Schleife zwischen den transmembranen Segmenten S5 und S6 beobachten. Die KCNQ-Proteine sind durch ihre sehr langen C-terminalen Schwänze charakterisiert. KCNQ5 weist den längsten C-Terminus aller KCNQ-Proteine auf, gefolgt von KCNQ2 und KCNQ3. Es enthält eine hochkonservierte Region, deren Funktion noch nicht bekannt ist, die jedoch in anderen KCNQ-Proteinen häufig mutiert ist. Weiterhin führt bei einer BNFC-Familie eine Mutation mit Leserahmenverschiebung am nichtkonservierten 3'-Ende zu einem mutierten KCNQ2-Protein mit 56 zusätzlichen Aminosäuren am C-Terminus. Überraschenderweise waren die durch das größte mutierte Protein in Oocyten erzeugten Ströme im Vergleich zum Wildtyp um 50% reduziert. Weiterhin wurde durch Einführung einer Stoppmutation an der gleichen Position, wodurch die sieben letzten Aminosäuren gestutzt werden, die Aktivität des Kanals um einen Faktor von zwei erhöht. Zusammen genommen zeigen diese Ergebnisse, daß die C-terminale Region von KCNQ-Proteinen wichtig für die Funktion des Kanals ist.
Das KCNQ5-Protein enthält eine Vielzahl potentieller Stellen für PKC-Phosphorylierung, ihm fehlt jedoch die in KCNQ1 und KCNQ2 vorhandene N-terminale Konsensusstelle für cAMP-abhängige Phosphorylierung. Sowohl KCNQ1- als auch I_Ks-Ströme wurden durch PKA stimuliert, während über die Wirkung von PKA auf KCNQ2-Ströme widersprüchliche Daten veröffentlicht wurden.
Durch Northern-Blot-Analysen wurden 7,5 kb große KCNQ5-Transkripte in humanem Skelettmuskel und Hirn gefunden. Im Hirn sind die Transkripte weit verteilt, wobei die Expression im cerebralen Cortex, im Okzipitalpol, im Stirnlappen und im Schläfenlappen am stärksten ist. Niedrigere Konzentrationen wurden in Hippocampus und Putamen gefunden. Das Expressionsmuster von KCNQ5 im Hirn ähnelt dem zuvor für KCNQ2 und KCNQ3 beschriebenen stark, die Transkriptgrößen von 8,5 kb bzw. 10,5 kb aufweisen. Im Gegensatz zu KCNQ2 kommt KCNQ5 im Cerebellum wahrscheinlich nicht vor.
Beispiel 5: Expression von KCNQ5 in Xenopus-Oocyten
Die mögliche Funktion von KCNQ5 als Kaliumkanal wurde durch elektrophysiologische Analyse von Xenopus-Oocyten, die mit in vitro transkribierter KCNQ5 cRNA injiziert wurden, untersucht. Zwei bis vier Tage nach der Injektion wurden neue Ströme entdeckt, die in mit Wasser injizierten Kontrollooycten nicht beobachtet werden konnten. Die Ströme wurden sehr langsam aktiviert (3A) und waren selbst nach 2 Sekunden noch nicht voll aktiviert. Bei niedrigeren Potentialen zeigen die KCNQ5-Ströme eine verzögerte Aktivierung, ähnlich der von KCNQ1-Strömen. Aktivierungsspuren über +20 mV zeigen ein Cross-Over-Phänomen. Die Aktivierung der KCNQ5-Ströme ist im allgemeinen langsamer als die anderer KCNQ-Ströme. Sie kann jedoch als eine Biexponentialfunktion beschrieben werden. Während eines Depolarisierungspulses von –100 bis +40 mV wurde der Strom mit Zeitkonstanten von 116 ± 7 und 927 ± 51 ms aktiviert (Tabelle 1). Die Strom-Spannungs-Relationen von KCNQ5-Strömen sind in 3B gezeigt. Die Ströme wurden bei Depolarisierungspotentialen, die positiver als –60 mV waren, aktiviert und bei Potentialen größer als 0 mV beträchtlich einwärtsgleichgerichtet. Eine starke Einwärtsgleichrichtung ist bislang nur für den verwandten KCNQ3-Kanal gezeigt worden. Die KCNQ5-Deaktivierung korrelierte gut mit einer Exponentialfunktion zweiter Ordnung. Die beiden Deaktivierungskomponenten wurden bei einer Repolarisierungsspannung von –100 mV, die auf einen 3s Depolarisierungsschritt auf +40 mV folgte, bestimmt. Die Zeitkonstanten betrugen 64 ± 5 bzw. 269 ± 24 ms (Tabelle 1). Die KCNQ1-„tail currents" zeigen einen charakteristischen „Haken", der auf eine Erholung von der Inaktivierung hindeutet. Bei Spannungen zwischen –100 und +40 mV konnten wir dieses Phänomen nicht beobachten. Wir führten zusätzlich noch ein Doppelpuls-Protokoll durch, das gewöhnlich zum Aufdecken einer Inaktivierung von Kaliumströmen eingesetzt wird.
Die K⁺-Selektivität von KCNQ5-Strömen wurde durch Bestimmung der „tail current"-Umkehrpotentiale in Badlösungen mit 5,4, 9,6, 20, 54 und 96 mM K⁺ untersucht. Durch eine zehnfache Verminderung von externem K⁺ verschob sich das Umkehrpotential um 58 mV (3C), was darauf hinweist, daß KCNQ5 perfekt K⁺-selektiv ist.
Die pharmakologischen Eigenschaften von KCNQ5 sind in 3D gezeigt. Gegenüber dem nicht-selektiven K⁺-Kanalblocker TEA waren die KCNQ5-Ströme unempfindlich, wie auch für KCNQ3 beschrieben. Damit übereinstimmend enthalten beide Kanalproteine Threoninreste in der Porenregion in einer Position, die die Empfindlichkeit gegenüber einer Blockade durch TEA bestimmt. Im Gegensatz dazu ist ein Thyrosinrest in dieser Position für die hohe TEA-Empfindlichkeit von KCNQ2 verantwortlich. 300 µM des unspezifischen Ionenkanalblockers Chinidin blockieren die KCNQ5-Ströme zu 50%.
Inhibitoren von KCNQ1 und 1_Ks wurden bei Konzentrationen getestet, die diese Ströme vollständig bzw. stark blockieren. Von diesen Inhibitoren war Chromanol 293B der wirksamste, jedoch blockierte er bei 100 µM KCNQ5-Ströme nur zu 45%. Im Vergleich dazu wird bei dieser Konzentration KCNQ1 zu 80% blockiert. Clofilium, ein Antiarrhythmikum der Klasse III, blockiert KCNQ1 mit einem IC₅₀ < 10 µM. Bei 30 µM reduzierte es den KCNQ5-Strom um 40%, ähnlich seiner hemmenden Wirkung- auf KCNQ3 (30% Inhibierung bei 10µM). Bei 10 µM bewirkte Clofilium nur eine geringe Inhibition von KCNQ2. Die pharmakologischen Eigenschaften von KCNQ5 ähneln daher mehr denen von KCNQ3 als denen von KCNQ2.
Beispiel 6: Funktionale Wechselwirkung von KCNQ5 und KCNQ3
Alle Mitglieder der KCNQ-Familie bilden funktionale Heteromere mit homologen oder strukturell verschiedenen K⁺-Kanaluntereinheiten. Wir untersuchten die Möglichkeit der Bildung von gemischten Kanälen von KCNQ5 mit einer anderen Proteinuntereinheit, indem wir in Xenopus-Oocyten KCNQ5 mit anderen KCNQ-Proteinen und mit cDNAs die für andere KCNE-Polypeptide kodieren, coexprimierten.
Nach Coexpression mit entweder KCNQ1 oder KCNQ2, oder mit einem der vier bekannten KCNE-Peptide (KCNE1 bis KCNE4) konnten wir keine Hinweise auf eine funktionelle Wechselwirkung eines dieser Proteine mit KCNQ5 entdecken. Bei der Coexpression von KCNQ5 mit KCNQ3 jedoch waren die resultierenden Ströme in bemerkenswerter Weise verändert. Während KCNQ3 alleine nur sehr kleine Ströme erzeugt, die, in Übereinstimmung mit früheren Befunden fast ununterscheidbar vom Hintergrundrauschen sind, wurden die Ströme bei Coinjektion mit KCNQ5 im Vergleich zu KCNQ5 alleine um einen Faktor von 4–5 verstärkt. Bei der Spannungsabhängigkeit der Ströme gab es keine signifikante Verschiebung; jedoch zeigt die I-V-Kurve, daß die KCNQ5/KCNQ3-Ströme bei positiven Membranpotentialen weniger einwärtsgleichgerichtet waren. Der Anstieg in der Amplitude des Stroms wurde auch, wie in Tabelle 1 gezeigt, von Änderungen der Öffnungskinetik begleitet. Durch die Aufnahme von KCNQ3 verlangsamte sich die schnelle Aktivierungskomponente signifikant, die langsame Komponente änderte sich jedoch nicht. Außerdem war die schnelle Deaktivierung von KCNQ5/KCNQ3-Strömen im Vergleich zu homomeren KCNQ5 verlangsamt. Wie verlautet ändert, zusätzlich zu einer großen Zunahme in der Amplitude des Stroms, die Assoziation von KCNQ2 und KCNQ3 ebenfalls die Öffnungseigenschaften der resultierenden heteromeren Ströme. Wir untersuchten daher die Öffnungskinetik des KCNQ2/KCNQ3-Stroms und verglichen sie mit KCNQ5/KCNQ3 (Tabelle 1). Im Fall von KCNQ2/KCNQ3 wurden sowohl die schnellen als auch die langsamen Zeitkonstanten der Aktivierung verlangsamt, wie auch die schnelle Deaktivierungskomponente. So aktivieren KCNQ2/KCNQ3-Heteromere zwar immer noch schneller als KCNQ3/KCNQ5-Heteromere, die Deaktivierungskinetik der beiden Heteromere war jedoch nicht signifikant verschieden.
Die Colokalisierung von KCNQ5 mit KCNQ3 in verschiedenen Teilen des Hirns, die große Stromzunahme und die Unterschiede in der Öffnungskinetik, die bei einer Coexpression beobachtet werden, weisen stark darauf hin, daß sich KCNQ5 mit KCNQ3 unter Bildung von funktionellen Kanälen assoziieren kann. Da angenommen wird, daß KCNQ2/KCNQ3-Kanäle die molekulare Grundlage für den neuronalen M-Strom darstellen, legen unsere Ergebnisse weiterhin nahe, daß auch KCNQ5 eine Untereinheit dieses physiologisch wichtigen Stroms sein kann. Der M-Strom wird in periphären und zentralen Neuronen exprimiert, ist jedoch nicht im Zusammenhang mit dem Kleinhirn beschrieben worden. Damit übereinstimmend werden KCNQ3 und KCNQ5 nur in geringem Ausmaße oder überhaupt nicht in dieser Region exprimiert, im Gegensatz zu KCNQ2, welches merkwürdigerweise stark im Cerebellum exprimiert wird.
Auch KCNQ4 kann funktionell mit KCNQ3 wechselwirken und M-ähnliche Ströme erzeugen, wodurch sich die Möglichkeit ergibt, daß heterogene Populationen von M-Strömen im periphären und zentralen Nervensystem vorliegen können, die sich wahrscheinlich in ihren kinetischen und pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden. Es kann sein, daß die Heterogenizität in der molekularen Zusammensetzung der M-ähnlichen Kanäle durch den Beitrag von K⁺-Kanälen aus anderen Familien noch weiter vergrößert wird.
Durch die Möglichkeit, daß das KCNQ5-Protein zu den M-Strömen im Hirn beitragen kann, wird das KCNQ5-Gen zu einem möglichen Kandidaten für epileptische Erkrankungen. Durch Analyse mit Fluoreszenz-in situ-Hybridisation (FISH) ordneten wir das KCNQ5-Gen dem Chromosom 6q14 zu. Auf dem Chromosom 6 befinden sich zwei Loci, die mit epileptischen Erkrankungen in Verbindung gebracht wurden, ein bekanntes Gen auf 6q24, welches bei progressiver myoklonischer Epilepsie vom Typ 2 einen Defekt aufweist, und ein unbekanntes Gen auf 6p12-p11, welches für juvenile myoklonische Epilepsie (EJM1) verantwortlich ist. Unsere Kartierungsergebnisse schließen jedoch eine Rolle von KCNQ5 bei der letztgenannten Erkrankung aus. Durch die Identifizierung von KCNQ5 ist es nun möglich, eine mögliche Verbindung mit anderen Formen genetisch vererbter Epilepsie zu untersuchen.
Hinsichtlich der innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendeten Methoden sei auf "Current protocols of Molecular Biology; Hrsg.: Ausubel F. M. et al.; Wiley Interscience, New York; 2000 (gegenwärtig überarbeitet)" für Molekularbiologie und auf "Experimental Biochemistry; Hrsg.: Switzer, R. L. et al., W. H. Freeman & Co 1999" für Biochemie verwiesen.
In der Erfindung wurde ein neues Mitglied der KCNQ-Familie geklont und identifiziert.
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
cAMP, cyclisches 5'-Adenosin-monophosphat; DIG, Digoxigenin; GCG, Genetics Computer Group, Wisconsin Package Version 10; I_kS, langsame Komponente des cardialen „delayed rectifier"-Stroms; kb, Kilobase; KCNQ, Kaliumkanal der KCNQ-Genfamilie; PHA, Phytohämagglutinin; PKA, Proteinkinase A; SEM, Standardabweichung des Mittelwerts; TEA, Tetraethylammonium.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A: Proteinsequenz von KCNQ5 und Vergleich mit anderen KCNQ-Proteinen. A, Gegenüberstellung von humanem KCNQ5 mit humanem KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3 und KCNQ4. Identische und konservierte Aminosäuren sind in schwarzen bzw. grauen Kästchen eingefaßt. Die sechs putativen transmembranen Domänen S1 bis S6 und die Porenregion H5 sind durch gestrichelte Linien gekennzeichnet. Die KCNQ5-Sequenz ist in der EMBUGenBank-Datenbank hinterlegt worden.
1B: Dendrogramm des humanen KCNQ-Proteins, erzeugt mit dem Pileup-Programm des GCG-Softwarepakets.
2. Gewebeverteilung des humanen Kaliumkanals KCNQ5. Ein Northern-Blot von verschiedenen Geweben und zwei Blots von verschiedenen Teilen des menschlichen Hirns enthaltend poly(A)-RNA (Clontech) wurden mit einer KCNQ5-spezifischen DIG-markierten RNA-Sonde hybridisiert.
3. Funktionale Expression von KCNQ5 in Xenopus-Oocyten. A, repräsentative Stromspuren, aufgenommen an einer Oocyte, der KCNQ5 injiziert worden war und die einem Pulsprotokoll unterworfen wurde, bei dem das Membranpotential schrittweise vom Haltepotential (–100 mV) auf Testpulse von –100 bis + 50 mV und zurück zum Haltepotential geändert wurde. B, I-V-Kurve für KCNQ5-exprimierende Oocyten (n = 12), aufgenommen unter Verwendung des in A beschriebenen Protokolls. C, „tail current"-Umkehrpotential von KCNQ5-Strömen als Funktion der extrazellulären K⁺-Konzentration. Die gestrichelte Linie ist gemäß der Nernst-Gleichung für einen perfekt selektiven K⁺-Kanal gezeichnet (n = 5). D, Wirkungen von TEA, Clofilium, Chinidin und Chromanol 293B auf den KCNQ5-Strom. Die überlagerten Ströme wurden während eines 3s Depolarisierungsschrittes von –100 mV bis 0 mV während des gleichen Experiments erhalten. Vor der Untersuchung der nächsten Verbindung wurden die Oocyten mit ND96 perfundiert, bis sich die Wirkungen wieder vollständig umgekehrt hatten (die Stromspuren sind auf Kontrollwerte bezogen und bilden den Mittelwert von 5 Oocyten). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung des Mittelwertes an.
4. Funktionale Wechselwirkung von KCNQ5 mit KCNQ3. A, repräsentative Stromspuren, aufgenommen an einer Oocyte, der KCNQ5 und KCNQ3 unter Verwendung des gleichen Protokolls wie in 3A koinjiziert worden waren. B, I-V-Kurve für Oocyten, die KCNQ5 + KCNQ3 exprimieren (n = 11). C, die Balkendiagramme stellen die Mittelwerte der Stromamplituden am Ende eines 3s-Testpulses von –100 bis +40 mV dar. Den Oocyten wurde für KCNQ5 (n = 14), KCNQ3 (n = 6) bzw. KCNQ5 + KCNQ3 (n = 12) kodierende cRNA injiziert. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichung des Mittelwertes an.
5. Aktivierungs- und Deaktivierungszeitkonstanten von homomeren und heteromeren KCNQ-Kanälen. Den Oocyten wurden 10 ng KCNQ5 oder KCNQ2 cRNA oder eine Mischung von jeweils 10 ng KCNQ5 und KCNQ3 bzw. KCNQ2 und KCNQ3 cRNA injiziert. Die Ströme wurden gemessen und für die Aktivierungs- und Deaktivierungszeitkonstanten angepaßt, wie im Text bzw. den Experimentellen Verfahren beschrieben. Signifikanz wird durch Sternchen angezeigt. Bei den Werten handelt es sich um die Mittelwerte ± SEM (ermittelt aus 9–16 Oocyten). SEQUENCE LISTING

Claims

DNA Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, welches die Aktivität eines spannungsgesteuerten Kaliumkanals aufweist, und wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR. 2 aufweist.
DNA Sequenz nach Anspruch 1 mit der Polynucleotidsequenz von SEQ ID NR. 1.
Rekombinanter DNA Vektor, wobei der Vektor umfasst a) ein Polynucleotidelement, das den Vektor für seine Multiplikation in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen geeignet macht, b) eine DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2.
Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 3, umfassend ein Polynucleotidelement, das den Vektor für eine Multiplikation in prokaryotischen Zellen, insbesondere in Zellen von einem Bakterium, geeignet macht.
Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Zellen von einem Bakterium Zellen von Escherichia coli oder Bacillus spec. sind.
Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 3, umfassend ein Polynucleotidelement, das den Vektor für eine Multiplikation in eukaryotischen Zellen, insbesondere in Zellen einer Zelllinie oder Hefezellen, geeignet macht.
Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 6, wobei die Zellen von einer Zelllinie Zellen von einer COS-, Hela- oder 3T3-Zelllinie sind und die Hefezellen Zellen von Saccharomyces cerevisiae sind.
Rekombinanter DNA Vektor nach einem der Ansprüche 3 bis 7, worin die DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 2 wirkungsfähig an ein Promotorelement gebunden ist, das eine Transkription der betreffenden RNA und/oder Expression des betreffenden Proteins erlaubt.
Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 8, worin das Promotorelement ein prokaryotischer Promotor ist.
Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 8, worin das Promotorelement ein eukaryotischer Promotor ist.
Rekombinanter DNA Vektor nach Anspruch 9 oder 10, worin das Promotorelement induzierbar ist.
Wirtszelle, umfassend mindestens einen rekombinanten DNA Vektor nach Ansprüchen 3 bis 11.
Wirtszelle nach Anspruch 12, worin die Wirtszelle eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, worin die prokaryotische Zelle ein Bakterium, insbesondere eine Zelle von Escherichia coli, Bacillus spec. ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, worin die eukaryotische Zelle eine Zelle von einer Zelllinie, insbesondere eine Zelle von einer COS-, einer Hela- oder 3T3-Zelllinie oder eine Zelle von einer Hefe, insbesondere eine Zelle von Saccharomyces cerevisiae, ist.
Protein, kodiert von einer der DNA Sequenzen nach Ansprüchen 1 bis 2.
Herstellung eines Proteins nach Anspruch 16 durch erstens Züchten einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15, zweitens Ernten und Verarbeiten der Zellen und drittens anschließend Reinigen des Proteins.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, wobei die Verbindung zur Modifizierung von Aktivität von einem Protein mit einer Aktivität eines spannungsgesteuerten Kaliumkanals nach Anspruch 17 geeignet ist, umfassend a) Bereitstellen eines Proteins nach Anspruch 16 oder 17; b) Bereitstellen von mindestens einer chemischen Verbindung; c) Inkubieren der chemischen Verbindung nach b) mit einem Protein nach a); d) Messen der Aktivität von Protein nach a).
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Protein nach a) innerhalb einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 15 bereitgestellt wird und die Wirtszelle das Protein exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Protein nach a) mit KCNQ3 interagiert.