DE69233469T2

DE69233469T2 - Menschliche Calcium-Kanale und Verwendungen davon

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Publication number: DE69233469T2
Application number: DE69233469T
Authority: DE
Inventors: Michael M. Santa FE Harpold; Steven B. San Diego Ellis; Mark E. Carlsbad Williams; Ann F. La Mesa McCue; Daniel H. Gainesville Feldman; Robert Austin Brenner
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1991-08-15
Filing date: 1992-08-14
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2012-08-15
Also published as: CA2113203C; EP0598840A1; AU677571B2; AU2495792A; EP0992585A2; EP0598840B1; ATE191920T1; DE69230938T2; CA2113203A1; DE69230938D1; EP1469074B1; EP0992585B1; EP0992585A3; ES2235417T3; GR3033961T3; EP1469074A1; ATE286976T1; DK0598840T3; DE69233469D1; ES2147184T3

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie und Pharmakologie. Insbesondere betrifft die Erfindung Calciumkanalzusammensetzungen und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Calciumkanäle sind membranüberspannende Proteine mit mehreren Untereinheiten, welche den kontrollierten Eintritt von Ca²⁺-Ionen in Zellen aus dem extrazellulären Fluid erlauben. Durchweg besitzen Zellen des Tierreiches und mindestens einige Bakterien-, Pilz- und Pflanzenzellen einen oder mehrere Calciumkanaltypen.
Der häufigste Calciumkanaltyp ist spannungsabhängig. Das „Öffnen" eines spannungsabhängigen Kanals zum Ermöglichen eines Einstroms von Ca²⁺-Ionen in die Zellen erfordert eine Depolarisierung auf ein gewisses Niveau der Potentialdifferenz zwischen der Innenseite der den Kanal tragenden Zelle und dem die Zelle umgebenden extrazellulären Medium. Die Einströmgeschwindigkeit von Ca²⁺ in die Zelle hängt von dieser Potentialdifferenz ab. Alle „erregbaren" Zellen in Lebewesen, wie z. B. Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS), periphere Nervenzellen und Muskelzellen, einschließlich derjenigen von Skelettmuskeln, Herzmuskeln und venösen und arteriellen glatten Muskeln, besitzen spannungsabhängige Calciumkanäle.
Es wurden viele Calciumkanaltypen in Säugerzellen verschiedener Gewebe, einschließlich Skelettmuskel, Herzmuskel, Lunge, glattem Muskel und Gehirn, identifiziert [siehe beispielsweise Bean, B. P., (1989), Ann. Rev. Physiol. 51: 367–384, und Hess, P., (1990), Ann. Rev. Neurosci. 56: 337]. Die verschiedenen Calciumkanaltypen wurden grob in vier Klassen eingeteilt, den L-, T-, N- und P-Typ, die sich hinsichtlich Stromkinetik, Haltepotentialsensitivität und Sensitivität für Calciumkanalagonisten und -antagonisten unterscheiden.
Calciumkanäle sind Proteine mit mehreren Untereinheiten. Ein Calciumkanal aus Kaninchen-Skelettmuskel enthält beispielsweise zwei große Untereinheiten, die als α₁ und α₂ bezeichnet werden, welche Molekulargewichte von zwischen ungefähr 130 und ungefähr 200 Kilodaltons („kD") aufweisen, sowie eine bis drei verschiedene kleinere Untereinheiten mit weniger als ungefähr 60 kD Molekulargewicht. Mindestens eine der größeren Untereinheiten und möglicherweise einige der kleineren Untereinheiten sind glykosyliert. Einige der Untereinheiten können phosphoryliert werden. Die α₁-Untereinheit hat ein Molekulargewicht von ungefähr 150 bis ungefähr 170 kD, wenn sie nach Isolierung aus Säugermuskelgewebe mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert wird, und besitzt spezifische Bindungsstellen für verschiedene 1,4-Dihydropyridine (DHPs) und Phenylalkylamine. Unter nichtreduzierenden Bedingungen (in Gegenwart von N-Ethylmaleimid) migriert die α₂-Untereinheit bei SDS-PAGE als eine Bande, die einem Molekulargewicht von ungefähr 160 bis 190 kD entspricht. Nach der Reduktion werden ein großes Fragment und kleinere Fragmente freigesetzt. Die β-Untereinheit des Kaninchenskelettmuskel-Calciumkanals ist ein phosphoryliertes Protein, welches ein durch SDS-PAGE-Analyse bestimmtes Molekulargewicht von 52 bis 65 kD aufweist. Diese Untereinheit ist gegen reduzierende Bedingungen unempfindlich. Die γ-Untereinheit des Calciumkanals, welche nicht in allen gereinigten Präparationen beobachtet wird, scheint ein Glykoprotein mit einem durch SDS-PAGE-Analyse bestimmten scheinbaren Molekulargewicht von 30 bis 33 kD zu sein.
Zur Untersuchung der Calciumkanalstruktur und -funktion werden große Mengen reinen Kanalproteins benötigt. Aufgrund der komplexen Natur dieser aus vielen Untereinheiten bestehenden Proteine, der variierenden Konzentrationen an Calciumkanälen in Gewebequellen des Proteins, des Vorhandenseins von gemischten Populationen von Calciumkanälen in Geweben, Schwierigkeiten bei der Beschaffung der interessierenden Gewebe und der Modifikationen des nativen Proteins, welche während des Isolierungsverfahrens auftreten können, ist es extrem schwierig, große Mengen an hochgereinigtem, vollständig intaktem Calciumkanalprotein zu gewinnen.
Die Charakterisierung eines bestimmten Calciumkanaltyps durch Analyse ganzer Zellen wird stark beeinträchtigt durch das Vorhandensein von gemischten Populationen verschiedener Calciumkanaltypen in einem Großteil der Zellen. Verfahren zur Aufzeichnung von einzelnen Kanälen, die zur Untersuchung von individuellen Calciumkanälen angewandt werden, geben keinen Aufschluß über die molekulare Struktur oder biochemische Zusammensetzung des Kanals. Außerdem wird bei der Durchführung dieser Art von Analyse der Kanal von anderen zellulären Bestandteilen isoliert, welche für natürliche Funktionen und pharmakologische Wechselwirkungen wichtig sein könnten.
Die Charakterisierung des Gens oder der Gene, das/die für Calciumkanäle kodiert/en, stellt ein weiteres Mittel zur Charakterisierung verschiedener Typen von Calciumkanälen dar. Die von einer vollständigen Nukleotidsequenz der kodierenden Region eines für einen Calciumkanal kodierenden Gens bestimmte Aminosäuresequenz stellt die Primärstruktur des Proteins dar. Darüber hinaus können die Sekundärstruktur des Calciumkanalproteins und das Verhältnis zwischen dem Protein und der Membran auf der Basis der Primärstrukturanalyse vorhergesagt werden. Beispielsweise deuten Hydropathie-Plots des α₁-Unterein heitsproteins des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel darauf hin, dass es vier interne Repeats enthält, jedes mit sechs mutmaßlichen Transmembranregionen [Tanabe, T., et al. (1987), Nature 328: 313].
Die cDNA- und entsprechenden Aminosäuresequenzen der α₁-, α₂-, β- und γ-Untereinheiten des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel [siehe Tanabe et al. (1987), Nature 328: 313–318; internationale Anmeldung Nr. WO 89/09834, welche der US-Anmeldung Serien-Nr. 07/603,751 entspricht, welche der Continuation-in-part der US-Anmeldung Serien-Nr. 07/176,899 entspricht; Ruth et al. (1989), Science 245: 1115–1118; und US-Patentanmeldung Serien-Nr. 482,384, eingereicht am 20. Februar 1990] wurden bestimmt. Die cDNA- und entsprechenden Aminosäuresequenzen von α₁-Untereinheiten aus Kaninchenherzmuskel-Calciumkanälen [Mikami, A., et al. (1989), Nature 340: 230–233] und Kaninchenlungen-Calciumkanälen [Biel, M., (1990), FEBS Letters 269: 409–412] wurden bestimmt.
Darüber hinaus wurde ein für einen Calciumkanal aus Kaninchenhirn (als BI-Kanal bezeichnet) kodierender cDNA-Klon isoliert [Mori, Y., et al. (1991), Nature 350: 398–402].
Partielle cDNA-Klone, die für Teile mehrerer unterschiedlicher Subtypen der α₁-Untereinheit von Calciumkanälen, welche man als Rattenhirn-Klasse A, B, C und D bezeichnet, kodieren, wurden aus Rattenhirn-cDNA-Banken isoliert [Snutch, T., et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3391–3395]. Vor kurzem wurden vollständige Rattenhirn-cDNA-Klone der Klasse A [Starr, T., et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5621–5625] und Klasse C [Snutch, T., et al. (1991), Neuron 7: 45–57] isoliert. Obwohl die von der DNA der Rattenhirn-Klasse C kodierte Aminosäuresequenz zu ungefähr 95% mit der DNA, die für die α₁-Untereinheit des Kaninchenherzmuskel-Calciumkanals kodiert, identisch ist, weist die von der Rattenhirn-Klasse A-DNA kodierte Aminosäuresequenz nur 33% Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz auf, die von der DNA kodiert wird, welche für die α₁-Untereinheit aus Kaninchenskelett- oder -herzmuskel kodiert. Ein cDNA-Klon, der für eine weitere α₁-Untereinheit des Rattenhirn-Calciumkanals kodiert, wurde gleichfalls erhalten [Hui, A., et al. (1991), Neuron 7: 35–44]. Die von diesem Klon kodierte Aminosäuresequenz ist zu ungefähr 70% mit den Proteinen, die von der Calciumkanal-DNA aus Kaninchenskelett- und -herzmuskel kodiert werden, homolog. Auch ein cDNA-Klon, der mit der für die Rattenhirn-Klasse C-α₁-Untereinheit kodierenden cDNA eng verwandt ist, sowie Sequenzen von partiellen cDNA-Klonen, die mit weiteren partiellen cDNA-Klonen verwandt sind, die anscheinend für verschiedene Calciumkanal-α₁-Untereinheiten kodieren, wurden isoliert [siehe Snutch, T., et al. (1991), Neuron 7: 45–57; Perez-Reyes, E., et al. (1990), J. Biol. Chem. 265: 20430; und Hui, A., et al. (1991), Neuron 7: 35–44]. Auch DNA-Klone, die für weitere Calciumkanäle kodieren, wurden identifiziert und isoliert.
Die Expression von cDNA, die für Calciumkanaluntereinheiten kodiert, wurde mit mehreren der verschiedenen oben diskutierten α₁-Untereinheits-cDNA-Klone aus dem Kaninchen oder der Ratte erreicht. In murinen L-Zellen, die mit einer für die Calciumkanal-α₁-Untereinheit aus Kaninchenskelettmuskel kodierenden DNA transfiziert worden waren, wurden spannungsabhängige Calciumströme nachgewiesen [Peres-Reyes et al. (1989), Nature 340: 233–236 (1989)]. Diese Ströme wurden in Gegenwart des Calciumkanalagonisten Bay K 8644 verstärkt. Bay K 8644-empfindliche Ba²⁺-Ströme wurden in Oozyten nachgewiesen, denen in-vitro-Transkripte der cDNA für die α₁-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenherzmuskel injiziert worden waren [Mikami, A., et al. (1989), Nature 340: 230–233]. Diese Ströme wurden in Gegenwart des Calciumkanalantagonisten Nifedipin beträchtlich reduziert. Die Bariumströme eines Oozyten, dem eine für die α₁-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenherzmuskel kodierende RNA und eine für die α₂-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel kodierende RNA coinjiziert worden war, waren mehr als 2-mal so groß wie diejenigen von Oozyten, denen Transkripte der für die α₁-Untereinheit des Kaninchenherz-Calciumkanals kodierenden cDNA injiziert worden waren. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Oozyten RNA coinjiziert wurde, die für die α₁-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenlunge und die α₂-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel kodiert. Der Bariumstrom war größer als der in Oozyten nachgewiesene, denen lediglich für die α₁-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenlunge kodierende RNA injiziert worden war [Biel, M., et al. (1990), FEBS Letters 269: 409–412]. Nach innen gerichtete Bariumströme wurden in Oozyten nachgewiesen, denen in vitro-RNA-Transkripte injiziert worden waren, die für den BI-Kanal aus Kaninchenhirn kodieren [Mori et al. (1991), Nature 350: 398–402]. Diese Ströme wurden um zwei Größenordnungen erhöht, wenn in vitro-Transkripte der α₂-, β- oder α₂-, β- und γ-Untereinheiten des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel zusammen mit Transkripten der BI-kodierenden cDNA coinjiziert wurden. Die Bariumströme in Oozyten, denen Transkripte coinjiziert wurden, die für den BI-Kanal und α₂ und β des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel kodieren, wurden durch die Calciumkanalantagonisten Nifedipin oder ω-CgTx nicht beeinflußt und wurden durch Bay K 8644 und Rohgift aus Agelenopsis aperta inhibiert.
Die Ergebnisse von Untersuchungen der rekombinanten Expression von für die α₁-Untereinheit des Kaninchen-Calciumkanals kodierenden cDNA-Klonen und Transkripten der cDNA-Klone deuten darauf hin, dass die α₁-Untereinheit eine Pore bildet, durch welche Calcium in die Zellen eindringt. Die Relevanz der in diesen rekombinanten Zellen erzeugten Bariumströme für den tatsächlichen Strom, der durch Calciumkanäle erzeugt wird, die als eine Komponente die jeweiligen α₁-Untereinheiten enthalten, in vivo ist unklar. Um jedoch die verschiedenen Calciumkanaltypen vollständig und genau zu charakterisieren und zu beur teilen, ist es unerläßlich, die funktionellen Eigenschaften von rekombinanten Kanälen zu untersuchen, die alle in vivo gefundenen Untereinheiten enthalten. Obwohl man mit der Expression von für Calciumkanaluntereinheiten aus Kaninchen und Ratte kodierender DNA leidliche Erfolge erzielt hat, wurde in Bezug auf humane Calciumkanäle viel weniger erreicht. Man weiß wenig über die Struktur und Funktion und Genexpression des humanen Calciumkanals. Das Verstehen der Struktur und Funktion humaner Calciumkanäle würde die Identifizierung von Substanzen erlauben, die auf gewisse Weise die Aktivität der Calciumkanäle modulieren und ein Potential für eine Verwendung bei der Behandlung derartiger Krankheiten haben.
Da Calciumkanäle in verschiedenen Geweben vorhanden sind und bei der Regulierung der intrazellulären Calciumionenkonzentrationen eine zentrale Rolle spielen, hat man sie mit einer Anzahl von lebenswichtigen Prozessen in Tieren, einschließlich Neurotransmitterfreisetzung, Muskelkontraktion, Schrittmacheraktivität und Sekretion von Hormonen und anderen Substanzen, in Verbindung gebracht. Diese Prozesse scheinen bei vielen menschlichen Krankheiten eine Rolle zu spielen, wie z. B. ZNS- und kardiovaskulären Krankheiten. Calciumkanäle sind somit auch für viele Krankheiten von Bedeutung. Von einer Anzahl nützlicher Verbindungen für die Behandlung verschiedener kardiovaskulärer Krankheiten in Tieren, einschließlich Menschen, wird angenommen, dass sie ihre vorteilhaften Wirkungen durch die Modulierung von Funktionen der spannungsabhängigen Calciumkanäle, die in glatten Muskeln des Herzens und/oder der Gefäße vorhanden sind, ausüben. Viele dieser Verbindungen binden an Calciumkanäle und blockieren das Einströmen von Ca²⁺ in diese Zellen oder reduzieren dessen Geschwindigkeit als Folge einer Depolarisierung der Zellmembran.
Ein Verständnis der Pharmakologie von Verbindungen, die mit Calciumkanälen in anderen Organsystemen, wie z. B. dem ZNS, wechselwirken, könnte beim rationalen Entwickeln von Verbindungen hilfreich sein, die spezifisch mit Subtypen von humanen Calciumkanälen wechselwirken, um erwünschte therapeutische Wirkungen zu haben, wie z. B. bei der Behandlung von neurodegenerativen und kardiovaskulären Krankheiten. Ein solches Verständnis und das Vermögen, therapeutisch wirksame Verbindungen rational zu entwerfen, wurden jedoch durch die Unfähigkeit, die Typen von humanen Calciumkanälen und die molekulare Natur einzelner Subtypen, insbesondere im ZNS, unabhängig zu bestimmen, sowie durch die mangelnde Verfügbarkeit reiner Präparationen spezifischer Kanalsubtypen zur Verwendung für die Beurteilung der Spezifität von calciumkanal-wirksamen Verbindungen behindert. Daher wäre die Identifizierung von DNA, die für Calciumkanaluntereinheiten kodiert, und die Verwendung einer solchen DNA zur Expression von Calciumkanal untereinheiten und funktionellen Calciumkanälen zum Screenen und Entwickeln therapeutisch wirksamer Verbindungen hilfreich.
Deshalb besteht hier eine Aufgabe darin, für spezifische Calciumkanaluntereinheiten kodierende DNA bereitzustellen, sowie eukaryotische Zellen, die rekombinante gewebespezifische oder subtypspezifische Calciumkanäle tragen, bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, Assays für die Identifizierung potentiell therapeutischer Verbindungen bereitzustellen, welche als Calciumkanalantagonisten und -agonisten fungieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden eukaryotische Zellen bereitgestellt, die heterologe DNA, kodierend für eine oder mehrere α_1B-Untereinheiten eines Calciumkanäls, insbesondere humane Calciumkanaluntereinheiten, enthalten, oder solche, die RNA-Transkripte von DNA-Klonen enthalten, die für eine oder mehrere der Untereinheiten kodieren. Die Zellen enthalten DNA oder RNA, die für eine humane α_1B-Untereinheit kodiert. In stärker bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Zellen DNA oder RNA, die für zusätzliche heterologe Untereinheiten kodiert, einschließlich mindestens einer β-, α₁- oder γ-Einheit. In solchen Ausführungsformen werden eukaryotische Zellen bereitgestellt, die stabil oder transient mit irgendeiner Kombination von einem, zwei, drei oder vier der für Untereinheiten kodierenden cDNA-Klone, wie z. B. α₁, α₁₊ β, α₁₊β + α₂, transfiziert wurden. In stärker bevorzugten Ausführungsformen sind die von der heterologen DNA kodierten Untereinheiten humane Untereinheiten.
In bevorzugten Ausführungsformen exprimieren die Zellen solche heterologen Calciumkanaluntereinheiten und bringen eine oder mehrere der Untereinheiten in membranüberspannende heterologe Calciumkanäle ein. In stärker bevorzugten Ausführungsformen exprimieren die eukaryotischen Zellen funktionelle, heterologe Calciumkanäle, die in der Lage sind, den Durchfluß von calciumkanal-selektiven Ionen zu steuern und/oder Verbindungen, welche in physiologischen Konzentrationen die Aktivität des heterologen Calciumkanals modulieren, zu binden. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die heterologen Calciumkanäle mindestens eine heterologe Calciumkanaluntereinheit. In am meisten bevorzugten Ausführungsformen bestehen die Calciumkanäle, die auf der Oberfläche der eukaryotischen Zellen exprimiert werden, im wesentlichen oder ganz aus Untereinheiten, die von der heterologen DNA oder RNA kodiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen sind die heterologen Calciumkanäle solcher Zellen von etwaigen endogenen Calciumkanälen der Wirtszelle unterscheidbar.
In bestimmten Ausführungsformen werden die rekombinanten eukaryotischen Zellen, welche die für die Calciumkanaluntereinheiten kodierende heterologe DNA enthalten, durch Transfektion mit DNA erhalten, die für eine oder mehrere der Untereinheiten kodiert, oder ihnen werden RNA-Transkripte von cDNA injiziert, die für eine oder mehrere der Calciumkanaluntereinheiten kodiert. Die DNA kann als lineares DNA-Fragment eingeführt werden oder sie kann in einem Expressionsvektor für die stabile oder transiente Expression der für Untereinheiten kodierenden DNA eingeschlossen sein. Vektoren, welche für humane Calciumkanaluntereinheiten kodierende DNA enthalten, werden ebenfalls bereitgestellt.
Die eukaryotischen Zellen, welche heterologe Calciumkanäle exprimieren, können in Assays für die Calciumkanalfunktion verwendet werden oder, im Falle von Zellen, die mit weniger für Untereinheiten kodierenden Nukleinsäuren transformiert wurden als nötig sind, um einen funktionellen rekombinanten humanen Calciumkanal zu bilden, können solche Zellen verwendet werden, um die Wirkungen von zusätzlichen Untereinheiten auf die Calciumkanalaktivität zu bestimmen. Die zusätzlichen Untereinheiten können durch nachfolgende Transfektion solcher Zellen mit einem oder mehreren DNA-Klonen oder RNA-Transkripten, die für humane Calciumkanaluntereinheiten kodieren, bereitgestellt werden.
Die rekombinanten eukaryotischen Zellen, welche membranüberspannende heterologe Calciumkanäle exprimieren, können in Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Calciumkanalaktivität modulieren, verwendet werden. Insbesondere werden die Zellen in Assays verwendet, welche Agonisten und Antagonisten der Calciumkanalaktivität in Menschen identifizieren, und/oder zur Bestimmung der Beteiligung der verschiedenen Calciumkanaluntereinheiten am Transport und an der Regulierung des Transports von Calciumionen.
Es werden Assays bereitgestellt, welche die eukaryotischen Zellen zur Identifizierung von Verbindungen verwenden, welche die Calciumkanalaktivität modulieren.
Obwohl die vorliegende Erfindung die in den Ansprüchen identifizierten α_1B-Untereinheiten betrifft, beschreibt die folgende Offenbarung detalliert andere Untereinheiten, welche mit der α_1B-Untereinheit inkorporiert werden können, um funktionelle heterologe Calciumkanäle zu bilden, die ein Merkmal der vorliegenden Erfindung darstellen, zusammen mit den Verwendungen solcher Calciumkanäle.
Es werden isolierte und gereinigte DNA-Fragmente beschrieben, welche für humane Calciumkanaluntereinheiten kodieren. Es wird eine für α₁-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodierende DNA und eine für solche Untereinheiten kodierende RNA, die durch Transkription einer solchen DNA erzeugt wurde, beschrieben. Insbesondere werden für α₁-Untereinheiten von spannungsabhängigen humanen Calciumkanälen (VDCCs) des Typs A, des Typs B (auch als VDCC IV bezeichnet), des Typs C (auch als VDCC II bezeichnet) und des Typs D (auch als VDCC III bezeichnet) kodierende DNA-Fragmente beschrieben.
Insbesondere wird eine für eine α_1D-Untereinheit, welche im wesentlichen die als Reste 10–2161 von Sequenz-ID Nr. 1 angegebenen Aminosäuren umfaßt, kodierende DNA beschrieben. Gleichfalls wird eine für eine α_1D-Untereinheit, welche im wesentlichen die als Aminosäuren 1–34 in SEQ-ID-Nr. 2 angegebenen Aminosäuren anstelle der Aminosäuren 373–406 von SEQ-ID-Nr. 1 umfaßt, kodierende DNA beschrieben. Gleichfalls wird eine für eine α_1C-Untereinheit, welche im wesentlichen die in SEQ-ID-Nr. 3 oder SEQ-ID-Nr. 6 angegebenen Aminosäuren umfaßt, kodierende DNA beschrieben sowie eine DNA bereitgestellt, die für eine α_1B-Untereinheit kodiert, welche im wesentlichen eine in SEQ-ID-Nr. 7 oder in SEQ-ID-Nr. 8 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt. Ein Phagenlysat eines E. coli-Wirts, enthaltend für α_1A kodierende DNA, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, unter der Hinterlegungs-Nr. gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die DNA in solchen Phagen umfaßt ein DNA-Fragment mit der in SEQ-ID-Nr. 21 angegebenen Sequenz. Dieses Fragment hybridisiert mit DNA, welche für α_1A kodiert, jedoch nicht mit DNA, welche für α_1B kodiert.
Für α₂-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodierende DNA und für derartige Untereinheiten kodierende RNA, die durch Transkription einer solchen DNA hergestellt wird, werden beschrieben. DNA, die für Spleißvarianten der α₂-Untereinheit, einschließlich gewebespezifischer Spleißvarianten, kodiert, wird ebenfalls beschrieben. Insbesondere wird DNA beschrieben, welche fürdie α_2a-α_2c-Untereinheitssubtypen kodiert. In besonders bevorzugten Ausführungsformen wird die für die α₂-Untereinheit kodierende DNA durch alternative Prozessierung eines Primärtranskripts erzeugt, welches DNA, die für die in SEQ-ID-Nr. 11 angegebenen Aminosäuren kodiert, und die DNA von SEQ-ID-Nr. 13, inseriert zwischen den Nukleotiden 1624 und 1625 von SEQ-ID-Nr. 11, einschließt.
Es werden isolierte und gereinigte DNA-Fragmente, die für humane Calciumkanal-β-Untereinheiten kodieren, einschließlich DNA, die für Spleißvarianten der β₁-Untereinheit und für die β₃-Untereinheit kodiert, beschrieben. Insbesondere wird für die β₁ -und β₃-Untereinheiten, einschließlich der Spleißvarianten β_1-1–β_1-5 der β₁-Untereinheit, kodierende DNA beschrieben. Auch wird eine für β-Untereinheiten kodierende, durch Transkription der DNA erzeugte RNA bereitgestellt. Escherichia coli (E. coli), welche Plasmide enthalten, die für β₃ kodierende DNA enthalten, wurden gemäß dem Budapester Vertrag unter der Hinterlegungs-Nr. 69048 bei der American Type Culture Collection hinterlegt. Eine Teilsequenz des hinterlegten Klons ist in SEQ-ID-Nr. 19 (Sequenz vom 5'-Ende) und SEQ-ID-Nr. 20 (Sequenz vom 3'-Ende) angegeben.
DNA, die für β-Untereinheiten kodiert, welche durch alternative Prozessierung eines für eine β-Untereinheit kodierenden Primärtranskripts erzeugt werden, einschließlich eines Transkripts, welches die für die in SEQ-ID-Nr. 9 angegebenen Aminosäuren kodierende DNA umfaßt, oder eines Primärtranskripts, welches für β₃ kodiert, wie hinterlegt unter der ATCC Hinterlegungs-Nr. 69048, wobei jedoch alternative Exons fehlen können oder umfaßt sein können, wird beschrieben oder kann aus der hier beschriebenen DNA konstruiert werden. Beispielsweise wird auch eine für eine β-Untereinheit kodierende DNA beschrieben, die durch alternative Prozessierung eines Primärtranskripts erzeugt wird, welches die für die in SEQ-ID-Nr. 9 angegebenen Aminosäuren kodierende DNA, die jedoch anstelle der Nukleotide 615–781 von SEQ-ID-Nr. 9 die in SEQ-ID-Nr. 12 angegebene DNA inseriert enthält, einschließt. DNA, die für β-Untereinheiten kodiert, die von Transkripten kodiert werden, welche die in SEQ-ID-Nr. 9 angegebene Sequenz, unter Einschluß der in SEQ-ID-Nr. 12 angegebenen DNA anstelle der Nukleotide 615–781 von SEQ-ID-Nr. 9, aufweisen, die jedoch eine oder mehrere der folgenden Nukleotidsequenzen nicht aufweisen: Nukleotide 14–34 von SEQ-ID-Nr. 12, Nukleotide 13–34 von SEQ-ID-Nr. 12, Nukleotide 35–55 von SEQ-ID-Nr. 12, Nukleotide 56–190 von SEQ-ID-Nr. 12 und Nukleotide 191–271 von SEQ-ID-Nr. 12, wird ebenfalls beschrieben.
DNA, welche für γ-Untereinheiten von humanen Calciumkanälen kodiert, wird ebenfalls beschrieben. RNA, welche für γ-Untereinheiten kodiert und durch Transkription der DNA erzeugt wird, wird ebenfalls bereitgestellt. Insbesondere wird DNA beschrieben, welche die in SEQ-ID-Nr. 14 angebene Nukleotidsequenz aufweist.
Vollständige DNA-Klone und entsprechende RNA-Transkripte, welche für die α₁-Untereinheiten, einschließlich α_1D, α_1B, α₂, und für β-Untereinheiten, einschließlich β_1-1–β_1-5, von humanen Calciumkanälen kodieren, werden beschrieben. Ebenfalls beschrieben werden DNA-Klone, die für wesentliche Teile der α_1A-, α_1C-, β₃- und γ-Untereinheiten von spannungsabhängigen humanen Calciumkanälen kodieren, zur Herstellung von vollständigen DNA-Klonen, welche für die vollständigen α_1A-, α_1C-, β₃- und γ-Untereinheiten kodieren.
Es werden Nukleinsäuresonden beschrieben, welche mindestens etwa 14 aufeinander folgende Nukleotide von für α_1D-, α_1C-, α_1B-, α_1A-, α₂-, β-, einschließlich β₁-Spleißvarianten und β₃-, und γ-Untereinheiten kodierender DNA enthalten. Es werden ebenfalls Verfahren unter Verwendung der Sonden zur Isolierung und Klonierung von cDNA, die für Calciumkanaluntereinheiten kodiert, einschließlich Spleißvarianten innerhalb von Geweben und Varianten zwischen Geweben, beschrieben.
Es werden gereinigte humane Calciumkanaluntereinheiten und gereinigte humane Calciumkanäle beschrieben. Die Untereinheiten und Kanäle können aus einer eukaryotischen Zelle isoliert werden, die mit einer für die Untereinheit kodierenden DNA transfiziert wurde.
Beschrieben werden Immunglobuline oder Antikörper, welche aus dem Serum eines Tieres erhalten wurden, das mit einer im wesentlichen reinen Präparation eines humanen Calciumkanals, einer Untereinheit eines humanen Calciumkanals oder einem epitop-enthaltenden Fragment einer Untereinheit eines humanen Calciumkanals immunisiert wurden. Ebenfalls beschrieben werden monoklonale Antikörper, die unter Verwendung eines humanen Calciumkanals, einer Untereinheit eines humanen Calciumkanals oder einem epitop-enthaltenen Fragment davon als Immunogen hergestellt wurden. E. coli-Fusionsproteine, die ein Fragment einer Untereinheit eines humanen Calciumkanals umfassen, können ebenfalls als Immunogen verwendet werden. Solche Fusionsproteine können ein bakterielles Protein oder einen Teil davon enthalten, wie z. B. das E. coli-TrpE-Protein in Fusion mit einem Calciumkanal-Unteneinheitspeptid. Die Immunoglobuline, die unter Verwendung der Calciumkanaluntereinheiten oder gereinigten Calciumkanäle als Immunogene hergestellt werden, besitzen neben anderen Eigenschaften die Fähigkeit, spezifisch und bevorzugt an einen humanen Calciumkanal oder eine Untereinheit davon, die in einer biologischen Probe oder einer von einer solchen biologischen Probe abgeleiteten Lösung vorhanden sein können, zu binden und/oder deren Immunpräzipitation hervorzurufen.
Ebenfalls beschrieben wird ein diagnostisches Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens des Lambert-Eaton-Syndroms (LES) bei einem Menschen auf der Grundlage der immunologischen Reaktivität von LES-Immunglobulin G (IgG) mit einer humanen Calciumkanalunteneinheit oder einer eukaryotischen Zelle, welche einen rekombinanten humanen Calciumkanal oder eine Untereinheit davon exprimiert. Insbesondere wird beschrieben ein Immunoassay-Verfahren zur Diagnose des Lambert-Eaton-Syndroms bei einer Person durch Kombinieren von Serum oder einer IgG-Fraktion der Person (Testserum) mit Calciumkanalproteinen, welche die α- und β-Untereinheiten umfassen, und Bestimmen, ob Antikörper in dem Testserum mit einer oder mehreren dieser Untereinheiten oder mit einer rekombinanten Zelle, welche eine oder mehrere der Untereinheiten exprimiert, in einem größeren Ausmaß reagiert als Antikörper in Kontrollserum, welches von einer Person oder einer Gruppe von Personen erhalten wurde, von denen man weiß, dass sie das Syndrom nicht haben. Für dieses Verfahren kann jedwedes Immunoassay-Verfahren, des im Stand der Technik zum Nachweis von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen in Serum bekannt ist, verwendet werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
Soweit nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie vom Fachmann in dem Bereich, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstanden werden. Alle Patente und Publikationen, auf die hier Bezug genommen wird, sind hier durch Verweis aufgenommen.
Verweise auf jede der Calciumkanaluntereinheiten umfassen die Untereinheiten, die hier speziell offenbart sind, sowie Untereinheiten von humanen Calciumkanälen, die von DNAs kodiert werden, welche unter Verwendung der offenbarten DNA als Sonden und durch Screenen einer geeigneten humanen cDNA- oder genomischen Bank bei mindestens geringer Stringenz isoliert werden können. Eine solche DNA umfaßt auch DNA, welche für Proteine kodiert, die ungefähr 40% Homologie zu irgendeinem der hier beschriebenen Untereinheitsproteine aufweisen, oder DNA, welche unter Bedingungen mindestens geringer Stringenz mit der hier bereitgestellten DNA hybridisiert, und wobei das durch eine solche DNA kodierte Protein zusätzliche Identifizierungscharakteristika aufweist, wie z. B. Funktion oder Molekulargewicht, mit Ausnahme von DNA, welche für die α_1B-Untereinheit kodiert.
Es versteht sich, dass Untereinheiten, die von Transkripten kodiert werden, welche Spleißvarianten der offenbarten Untereinheiten oder anderer solcher Untereinheiten darstellen, weniger als 40% Gesamthomologie zu einer einzelnen Untereinheit aufweisen können, dass sie jedoch Regionen solcher Homologie zu einer oder mehreren solcher Untereinheiten umfassen werden. Es versteht sich ebenso, dass 40% Homologie sich auf Proteine bezieht, welche ungefähr 40% gemeinsame Aminosäuren haben oder weniger gemeinsame Aminosäuren haben, jedoch konservative Aminosäuresubstitutionen umfassen, wodurch die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert wird.
Wie hier verwendet, werden die α₁-Untereinheitstypen, die von unterschiedlichen Genen kodiert werden, als Typ α_1A, α_1B, α_1C und α_1D bezeichnet. Diese Typen können auch als VDCC IV für α_1B, VDCC II für α_1C und VDCC III für α_1D bezeichnet werden. Subtypen von Untereinheiten, welche Spleißvarianten darstellen, werden beispielsweise als α_1B-1, α_1B-2, α_1C-1, usw. bezeichnet.
Somit bedeutet eine für die α₁-Untereinheit kodierende DNA, wie hier verwendet, eine DNA, welche mit einer hier bereitgestellten DNA unter Bedingungen zumindest geringer Stringenz hybridisiert, oder welche für eine Untereinheit kodiert, die grob ungefähr 40 Homologie zu dem Protein aufweist, welches von der hier offenbarten DNA kodiert wird, die für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert. Eine α₁-Untereinheit kann durch ihre Fähigkeit, einen Calciumkanal zu bilden, identifiziert werden. Typischerweise weisen α₁-Untereinheiten Molekulargewichte von mehr als mindestens ungefähr 120 kD auf. Die Aktivität eines Calciumkanals kann in vitro mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren gemessen werden, einschließlich der hier beschriebenen elektrophysiologischen und anderen Verfahren. Typischerweise umfassen α₁-Untereinheiten Regionen, mit denen ein oder mehrere Modulatoren der Calciumkanalaktivität, wie z. B. 1,4-DHP oder ω-CgTx, direkt oder indirekt wechselwirken. Die Typen von α₁-Untereinheiten können durch jedwedes dem Fachmann bekannte Verfahren unterschieden werden, einschließlich solcher auf der Grundlage der Bindungsspezifität. Beispielsweise wurde hier festgestellt, dass α_1B-Untereinheiten an der Bildung von N-Typ-Kanälen beteiligt sind, α_1D-Untereinheiten an der Bildung von L-Typ-Kanälen beteiligt sind und dass α_1A-Untereinheiten an der Bildung von Kanälen beteiligt zu sein scheinen, welche die typischen Eigenschaften von P-Typ-Kanälen aufweisen. Somit ist beispielsweise die Aktivität von Kanälen, welche die α_1B-Untereinheit enthalten, gegenüber 1,4-DHPs unempfindlich, während die Aktivität von Kanälen, welche die α_1D-Untereinheit enthalten, durch ein 1,4-DHP moduliert oder verändert wird. Typen und Subtypen von α₁-Untereinheiten können auf der Grundlage der Wirkungen solcher Modulatoren auf die Untereinheit oder einen diese Untereinheit enthaltenden Kanal charakterisiert werden, sowie auch der Unterschiede der Ströme und Stromkinetiken, die durch die Untereinheit enthaltende Calciumkanäle hervorgerufen werden.
Eine α₂-Untereinheit, wie hier verwendet, wird von einer DNA kodiert, welche unter Bedingungen geringer Stringenz mit der hier bereitgestellten DNA hybridisiert oder welche für ein Protein kodiert, welches ungefähr 40% Homologie mit dem hier offenbarten aufweist. Eine solche DNA kodiert für ein Protein, welches typischerweise ein Molekulargewicht von mehr als ungefähr 120 kD aufweist, welches jedoch in Abwesenheit einer α₁-Untereinheit keinen Calciumkanal bildet und die Aktivität eines eine α₁-Untereinheit enthaltenden Calciumkanals ändern kann. Subtypen der α₂-Untereinheit, die von Spleißvarianten herrühren, werden mit kleinen Buchstaben gekennzeichnet, wie z. B. α_2a, ... α_2e. Zusätzlich scheinen die α₂-Untereinheit und das unter reduzierenden Bedingungen erzeugte große Fragment mit mindestens N-verknüpften Zuckern glykosyliert zu sein und nicht spezifisch an die 1,4-DHPs und Phenylalkylamine zu binden, welche spezifisch an die α₁-Untereinheit binden. Das kleinere Fragment, das C-terminale Fragment, wird als δ-Untereinheit bezeichnet und umfaßt die Aminosäuren von ungefähr 946 (SEQ-ID-Nr. 11) bis etwa zum C-Terminus. Dieses Fragment kann vom übrigen Teil von α₂ dissoziieren, wenn die α₂-Untereinheit reduzierenden Bedingungen ausgesetzt wird.
Eine β-Untereinheit, wie hier verwendet, wird von einer DNA kodiert, welche mit der hier bereitgestellten DNA unter Bedingung geringer Stringenz hybridisiert oder welche für ein Protein kodiert, das mit dem hier offenbarten ungefähr 40% Homologie aufweist und ein Protein ist, welches typischerweise ein niedrigeres Molekulargewicht als die α-Untereinheiten hat, im Bereich von etwa 50–80 kD, und welches in Abwesenheit einer α₁-Untereinheit keinen nachweisbaren Calciumkanal bildet, welches jedoch die Aktivität eines Calciumkanals verändern kann, der eine α₁-Untereinheit oder eine α₁- und eine α₂-Untereinheit enthält.
Typen der β-Untereinheit, die von unterschiedlichen Genen kodiert werden, werden mit tiefgestellten Ziffern bezeichnet, wie z. B. β₁ und β₃. Subtypen von β-Untereinheiten, die als Spleißvarianten eines bestimmten Typs auftreten, werden mit tiefgestellten Ziffern bezeichnet, die sich auf den Subtyp und die Variante beziehen. Solche Subtypen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die β₁-Spleißvarianten, einschließlich β_1-1–β_1-5.
Eine γ-Untereinheit, wie hier verwendet, ist eine Untereinheit, die von einer DNA kodiert wird, welche hier als eine für die γ-Untereinheit kodierende DNA offenbart ist, und kann unter Verwendung der hier offenbarten DNA als Sonde durch Hybridisierung und andere solcher im Stand der Technik bekannten Methoden isoliert und identifiziert werden, wobei vollständige für eine γ-Untereinheit kodierende Klone isoliert oder konstruiert werden können. Eine γ-Untereinheit wird von einer DNA kodiert, welche unter Bedingungen geringer Stringenz mit der hier bereitgestellten DNA hybridisiert oder welche eine ausreichende Sequenzhomologie aufweist, um für ein Protein zu kodieren, welches mit der hier beschriebenen γ-Untereinheit ungefähr 40% Homologie aufweist.
Somit kann ein Fachmann unter Berücksichtigung der vorliegenden Offenbarung DNA identifizieren, welche für α₁-, α₂-, β-, δ-Untereinheiten von Calciumkanälen kodiert, einschließlich Typen, die von unterschiedlichen Genen kodiert werden, und Subtypen, welche Spleißvarianten darstellen. Beispielsweise können von der hier offenbarten DNA abgeleitete DNA-Sonden verwendet werden, um eine geeignete Bank zu screenen, einschließlich einer genomischen oder cDNA-Bank, und um DNA in einem oder mehreren Klonen zu erhalten, welche ein Fragment mit einem offenen Leserahmen umfaßt, das für ein vollständiges Protein kodiert. Anschließend an das Screening einer geeigneten Bank mit der hier offenbarten DNA kann die isolierte DNA auf das Vorliegen eines offenen Leserahmens, von dem die Sequenz des kodierten Proteins abgeleitet werden kann, untersucht werden. Die Bestimmung des Molekulargewichts und der Vergleich mit den hier offenbarten Sequenzen sollte die Identität der Untereinheit als α₁-, α₂- etc. -Untereinheit offenbaren. Falls notwendig, können funktionelle Assays verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Untereinheit eine α₁-, α₂-Untereinheit oder eine β-Untereinheit ist.
Beispielsweise kann für α_1A kodierende DNA isoliert werden durch Screenen einer geeigneten Bank mit DNA, welche für die gesamte oder einen Teil der humanen α_1A-Untereinheit kodiert, isoliert aus dem unter einer ATCC Hinterlegungs-Nr. hinterlegten Phagen, einschließlich Screenen mit einem Oligonukleotid mit der SEQ-ID-Nr. 21 angegebenen Sequenz. Ähnlich kann für die β₃ kodierende DNA durch Screenen einer humanen cDNA-Bank mit aus dem unter der ATCC Hinterlegungs-Nr. 69048 hinterlegten Plasmid β1.42 hergestellten DNA-Sonden oder Sonden mit Sequenzen, welche gemäß den in SEQ-ID-Nr. 19 und 20 angegebenen Sequenzen hergestellt wurden, isoliert werden. Jedes dem Fachmann bekannte Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von DNA und zur Herstellung von vollständigen genomischen oder cDNA-Klonen, einschließlich hier beispielhaft dargestellter Verfahren, kann verwendet werden.
Die von der isolierten DNA kodierte Untereinheit kann durch Vergleich mit den DNA- und Aminosäuresequenzen der hier bereitgestellten Untereinheiten identifiziert werden. Spleißvarianten haben ausgedehnte Regionen mit Homologie, umfassen jedoch nichthomologe Regionen. Von unterschiedlichen Genen kodierte Untereinheiten haben eine einheitliche Verteilung nichthomologer Sequenzen.
Eine Spleißvariante, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Variante, die durch unterschiedliche Prozessierung eines Primärtranskripts genomischer DNA erzeugt wird, was zu mehr als einem Typ von mRNA führt. Spleißvarianten können innerhalb eines einzigen Gewebetyps oder als zwischen Geweben (gewebespezifische Varianten) auftreten. Somit werden cDNA-Klone, welche für Subtypen von Calciumkanaluntereinheiten kodieren, die Regionen identischer Aminosäuren und Regionen unterschiedlicher Aminosäuresequenzen aufweisen, hier als „Spleißvarianten" bezeichnet.
Ein „calciumkanal-selektives Ion", wie hier verwendet, ist ein Ion, das in der Lage ist, durch einen Calciumkanal, welcher eine Zellmembran überspannt, unter Bedingungen, die im wesentlichen auf ähnliche Weise den Durchfluß von Ca²⁺ erlauben oder blockieren würden, zu fließen oder am Durchfluß gehindert zu werden. Ba²⁺ ist ein Beispiel eines Ions, welches ein calciumkanal-selektives Ion ist.
Eine Verbindung, welche die Calciumkanalaktivität moduliert, wie hier verwendet, ist eine Verbindung, welche die Fähigkeit des Calciumkanals, calciumkanal-selektive Ionen passieren zu lassen, oder andere nachweisbare Calciumkanaleigenschaften, wie z. B. Stromkinetiken, beeinflußt. Solche Verbindungen umfassen Calciumkanalantagonisten und -agonisten und Verbindungen, welche ihre Wirkung auf die Aktivität des Calciumkanals direkt oder indirekt ausüben.
Ein(e) „im wesentlichen reine(s)" Untereinheit oder Protein, wie hier verwendet, ist eine Untereinheit oder ein Protein, die/das ausreichend frei von anderen Polypeptidverunreinigungen ist, so dass sie/es bei SDS-PAGE homogen erscheint oder eindeutig sequenziert werden kann.
Die hier verwendeten Begriffe heterologe oder fremde DNA und RNA werden austauschbar verwendet und bezeichnen DNA oder RNA, welche nicht natürlich als Teil des Genoms, in dem sie sich befindet, auftritt, oder die sich an einer Stelle oder Stellen im Genom befindet, die von den Stellen, an denen sie in der Natur vorkommt, verschieden ist/sind. Es handelt sich um DNA oder RNA, die für die Zelle nicht endogen ist und künstlich in die Zelle eingebracht wurde. Beispiele heterologer DNA umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, DNA, die für eine Calciumkanaluntereinheit kodiert, und DNA, die für RNA oder Proteine kodiert, welche die Expression endogener DNA steuern oder ändern, indem sie die Transkription, Translation oder andere regulierbare biochemische Prozesse beein flussen. Die Zelle, welche die heterologe DNA, wie z. B. für die Calciumkanaluntereinheit kodierende DNA exprimiert, kann für die gleichen oder unterschiedliche Calciumkanaluntereinheiten kodierende DNA enthalten. Die heterologe DNA muß nicht exprimiert werden und kann auf eine solche Art und Weise eingebracht werden, dass sie in das Wirtszellgenom integriert wird oder episomal aufrechterhalten wird.
Die operative Verknüpfung heterologer DNA mit regulatorischen und Effektor-Nukleotidsequenzen, wie z. B. Promotoren, Enhancer, Transkriptions- und Translationsstopstellen, und anderen Signalsequenzen, wie hier verwendet, bezeichnet die funktionelle Beziehung zwischen solcher DNA und solchen Nukleotidsequenzen. Beispielsweise bedeutet die operative Verknüpfung einer heterologen DNA mit einem Promotor die physische und funktionelle Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, dergestalt, dass die Transkription einer solchen DNA von dem Promotor durch eine RNA-Polymerase initiiert wird, welche die DNA im Leserahmen spezifisch erkennt, daran bindet und sie transkribiert.
Isolierte, im wesentlichen reine DNA, wie hier verwendet, bedeutet DNA-Fragmente, die gemäß von Fachleuten verwendeten Standardtechniken gereinigt wurden [siehe z. B. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY].
Expression, wie hier verwendet, bedeutet den Prozeß, durch den Nukleinsäure in mRNA transkribiert und in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert wird. Wenn die Nukleinsäure von einer genomischen DNA abgeleitet ist, kann die Expression, falls eine geeignete eukaryotische Wirtszelle oder geeigneter Organismus ausgewählt wird, das Spleißen der mRNA umfassen.
Vektor oder Plasmid, wie hier verwendet, bezeichnet diskrete Elemente, die eingesetzt werden, um heterologe DNA in Zellen einzuführen, entweder für die Expression der heterologen DNA oder zur Replikation der klonierten heterologen DNA. Die Selektion und Anwendung solcher Vektoren und Plasmide liegt ohne weiteres im Rahmen des Standes der Technik.
Ein Expressionsvektor, wie hier verwendet, umfaßt Vektoren, die in der Lage sind, DNA-Fragmente zu exprimieren, die sich in operativer Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen, wie z. B. Promotorregionen, befinden, welche in der Lage sind, die Expression solcher DNA-Fragmente zu bewirken. Somit bezeichnet ein Expressionsvektor ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie z. B. ein Plasmid, einen Phagen, rekombinanten Virus oder anderen Vektor, der nach dem Einführen in eine geeignete Wirtszelle die Expression der klonierten DNA bewirkt. Geeignete Expressionsvektoren sind den Fachleuten wohlbekannt und umfassen solche, die sich in eukaryotischen Zellen und/oder prokaryoti schen Zellen replizieren können, und solche, welche episomal bleiben oder sich in das Wirtszellgenom integrieren können.
Eine Promotorregion, wie hier verwendet, bezeichnet den Teil der DNA eines Gens, welcher die Transkription der DNA, die damit in operativer Verknüpfung steht, kontrolliert. Die Promotorregion umfaßt spezifische DNA-Sequenzen, die für die Erkennung, das Binden und die Transkriptionsinitiierung der RNA-Polymerase ausreichend sind. Dieser Teil der Promotorregion wird als Promoter bezeichnet. Zusätzlich umfasst die Promotorregion Sequenzen, welche diese Erkennungs-, Bindungs- und Transkriptionsinitiierungsaktivität der RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können in cis agieren oder können auf trans-agierende Faktoren reagieren. Je nach der Art der Regulierung können Promotoren konstitutiv oder reguliert sein.
Eine rekombinante eukaryotische Zelle, wie hier verwendet, ist eine eukaryotische Zelle, die heterologe DNA oder RNA enthält.
Ein rekombinanter oder heterologer Calciumkanal, wie hier verwendet, bezeichnet einen Calciumkanal, der eine oder mehrere Untereinheiten enthält, die von einer heterologen DNA kodiert werden, welche in eukaryotische Zellen eingeführt und exprimiert wurde, wobei die eukaryotischen Zellen den rekombinanten Calciumkanal exprimieren. Ein rekombinanter Calciumkanal kann auch Untereinheiten umfassen, die von für die Zelle endogener DNA erzeugt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann der rekombinante oder heterologe Calciumkanal ausschließlich Untereinheiten enthalten, die von heterologer DNA kodiert werden.
„Funktionell" in Bezug auf einen rekombinanten oder heterologen Calciumkanal, wie hier verwendet, bedeutet, dass der Kanal in der Lage ist, den Eintritt von calciumkanal-selektiven Ionen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Ca²⁺ oder Ba²⁺, als Antwort auf einen Stimulus und/oder die Bindung von Liganden mit Affinität für den Kanal zu erlauben und zu regulieren. Bevorzugt ist eine solche Calciumkanalaktivität von einer endogenen Calciumkanalaktivität in der Wirtszelle durch elektrophysiologische, pharmakologische oder andere im Stand der Technik bekannte Mittel unterscheidbar.
Ein Peptid mit im wesentlichen einer Aminosäuresequenz wie in einer bestimmten SEQ-ID-Nr. angegeben, wie hier verwendet, umfaßt Peptide, welche dieselbe Funktion haben, aber geringfügige Variationen in der Sequenz, wie z. B. konservative Aminosäureaustausche oder geringfügige Deletionen oder Insertionen, welche die Aktivität des Peptids nicht verändern, umfassen können. Die Aktivität eines Peptids einer Calciumkanalrezeptoruntereinheit bezieht sich auf seine Fähigkeit, mit weiteren solchen Untereinheiten funktionelle Calciumkanäle zu bilden.
Eine physiologische Konzentration einer Verbindung, wie hier verwendet, ist diejenige, welche für das Stattfinden eines biologischen Prozesses notwendig und ausreichend ist. Beispielsweise ist eine physiologische Konzentration eines calciumkanal-selektiven Ions eine Konzentration des calciumkanal-selektiven Ions, die notwendig und ausreichend ist, um einen nach innen gerichteten Strom zu erzeugen, wenn die Kanäle sich öffnen.
Die Aktivität eines Calciumkanals, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Bewegung eines calcium-selektiven Ions durch einen Calciumkanal. Eine solche Aktivität kann mit Hilfe jedweder im Stand der Technik bekannten Methode, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Messung der Menge an Strom, welche in Antwort auf einen Stimulus durch den rekombinanten Kanal fließt, gemessen werden.
Ein „funktioneller Assay", wie hier verwendet, bezeichnet einen Assay, der funktionelle Calciumkanäle identifiziert. Ein funktioneller Assay ist somit ein Assay zur Beurteilung der Funktion.
Wie für Fachleute ersichtlich, erfordern Assayverfahren zur Identifizierung von Verbindungen, wie z. B. Antagonisten und Agonisten, welche die Calciumkanalaktivität modulieren, im allgemeinen den Vergleich mit einer Kontrolle. Eine Art einer „Kontroll"-Zelle oder „Kontroll"-Kultur ist eine Zelle oder eine Kultur, die im wesentlichen wie die Zelle oder Kultur behandelt wird, welche der Testverbindung ausgesetzt wird, außer dass die Kontrollkultur der Testverbindung nicht ausgesetzt wird. Eine weitere Art von „Kontroll"-Zelle oder von „Kontroll"-Kultur kann eine Zelle oder eine Kultur von Zellen sein, welche mit den transfizierten Zellen identisch sind, außer dass die für die Kontrollkultur verwendeten Zellen keine funktionellen Calciumkanäle exprimieren. In dieser Situation wird die Antwort der Testzelle auf die Testverbindung mit der Antwort (oder dem Fehlen einer Antwort) der rezeptornegativen Zelle auf die Testverbindung verglichen, wenn Zellen oder Kulturen jeden Zelltyps in Gegenwart der zu testenden Verbindung im wesentlichen denselben Reaktionsbedingungen unterliegen. Beispielsweise kann in Verfahren, welche elektrophysiologische „Patch Clamp"-Verfahren verwenden, dieselbe Zelle in Gegenwart und in Abwesenheit der Testverbindung getestet werden, indem die die Zelle umgebende externe Lösung wie im Stand der Technik bekannt ausgetauscht wird.
Assays
Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Calciumkanalaktivität modulieren
In-vitro-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, wie z. B. Calciumkanalagonisten und -antagonisten, welche die Aktivität von Calciumkanälen modulieren, unter Verwendung eukaryotischer Zellen, die heterologe humane Calciumkanäle exprimieren, werden hier bereitgestellt.
Insbesondere verwenden die Assays eukaryotische Zellen, welche von hier bereitgestellten heterologen DNAs kodierte heterologe humane Calciumkanaluntereinheiten exprimieren, um potentielle Calciumkanalagonisten und -antagonisten, welche spezifisch für humane Calciumkanäle sind, zu screenen und insbesondere, um nach Verbindungen zu suchen, welche für bestimmte humane Calciumkanalsubtypen spezifisch sind. Solche Assays können zusammen mit Verfahren des rationellen Arzneimitteldesigns („rational drug design") verwendet werden, um unter Agonisten und Antagonisten, die sich geringfügig in ihrer Struktur unterscheiden, solche auszuwählen, die für die Modulation der Aktivität von humanen Calciumkanälen besonders geeignet sind, und um Verbindungen zu entwerfen oder auszuwählen, welche subtyp- oder gewebespezifische Calciumkanalantagonisten- und -agonistenaktivitäten zeigen.
Diese Assays sollten die relative therapeutische Wirksamkeit einer Verbindung für die Behandlung bestimmter Krankheiten bei Menschen präzise voraussagen. Zusätzlich können Zellen mit gewebespezifischen oder subtypspezifischen rekombinanten Calciumkanälen hergestellt und in Assays zur Identifizierung von gewebe- oder subtypspezifischen Wirkstoffen für humane Calciumkanäle verwendet werden, da subtyp- und gewebespezifische Calciumkanaluntereinheiten bereitgestellt werden.
Die Assays beinhalten das Inkontaktbringen der Zellmembran einer rekombinanten eukaryotischen Zelle, welche mindestens eine Untereinheit eines humanen Calciumkanals, bevorzugt mindestens eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, exprimiert, mit einer Testverbindung und Messen der Fähigkeit der Testverbindung, spezifisch an die Membran zu binden oder die Aktivität eines heterologen Calciumkanals auf der Membran zu verändern oder zu modulieren.
In bevorzugten Ausführungsformen verwendet der Assay eine rekombinante Zelle, welche einen Calciumkanal aufweist, der eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals in Kombination mit einer β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals und/oder einer α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals enthält. Rekombinante Zellen, welche heterologe Calciumkanäle exprimieren, die jede der humanen α₁-, β- und α₂-Untereinheiten und gegebenenfalls eine γ-Untereinheit eines humanen Calciumkanals enthalten, sind zur Verwendung in solchen Assays besonders bevorzugt.
In bestimmten Ausführungsformen werden die Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Calciumkanalaktivität modulieren, durchgeführt durch Messen der Calciumkanalaktivität einer eukaryotischen Zelle mit einem heterologen funktionellen Calciumkanal, wenn eine solche Zelle einer die Testverbindung und ein calciumkanal-selektives Ion enthaltenden Lösung ausgesetzt wird, und durch Vergleichen der gemessenen Calciumkanalaktivität mit der Calciumkanalaktivität derselben Zelle oder einer im wesentlichen identischen Kontrollzelle in einer die Testverbindung nicht enthaltenden Lösung. Die Zelle wird in einer Lösung mit einer Konzentration an calciumkanal-selektiven Ionen gehalten, die bei offenen Kanälen zum Erzeugen eines nach innen gerichteten Stroms ausreichend ist. Besonders bevorzugt zur Verwendung ist eine rekombinante Zelle, welche Calciumkanäle exprimiert, die jede der humanen α₁-, β- und α₂-Untereinheiten sowie gegebenenfalls eine γ-Untereinheit eines humanen Calciumkanals umfassen. Verfahren zur Durchführung solcher Assays sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Hinsichtlich ähnlicher, bei Xenopus laevis-Oozyten und Acetylcholinrezeptoren angewandter Verfahren siehe z. B. Mishina et al. [(1985), Nature 313: 364] und hinsichtlich solcher Oozyten und Natriumkanäle siehe Noda et al. (1986), Nature 322: 826–828]. Hinsichtlich ähnlicher Studien, die mit dem Acetylcholinrezeptor durchgeführt wurden, siehe z. B. Claudio et al. [(1987), Science 238: 1688–1694].
Die Assays verwenden somit hier bereitgestellte Zellen, die funktionelle heterologe Calciumkanäle exprimieren, und messen funktionell, z. B. elektrophysiologisch, die Fähigkeit einer Testverbindung, die Höhe und Dauer des Flusses von calciumkanal-selektiven Ionen, wie z. B. Ca⁺⁺ oder Ba⁺⁺, durch den funktionellen heterologen Kanal zu potenzieren, zu antagonisieren oder auf sonstige Weise zu modulieren. Die Menge des Stroms, der durch die rekombinanten Calciumkanäle einer Zelle fließt, kann direkt, wie z. B. elektrophysiologisch, oder durch Überwachen einer unabhängigen Reaktion, die intrazellulär stattfindet und direkt in einer von Calciumionen (oder anderen) Ionen abhängigen Weise beeinflußt wird, bestimmt werden.
Jedes Verfahren zum Messen der Aktivität eines Calciumkanals kann in Verbindung mit den hier bereitgestellten Zellen und Assays angewandt werden. Beispielsweise wird in einer Ausführungsform des Verfahrens zum Testen einer Verbindung auf ihre Fähigkeit, die Calciumkanalaktivität zu modulieren, die Strommenge durch ihre Modulierung einer Reaktion gemessen, welche für calciumkanal-selektive Ionen sensitiv ist und eine eukaryotische Zelle verwendet, welche einen heterologen Calciumkanal exprimiert und auch ein Transkriptionskontrollelement in operativer Verknüpfung zur Expression eines strukturellen Gens enthält, welches für ein Indikatorprotein kodiert. Das für die Transkription des Indikatorgens verwendete Transkriptionskontrollelement reagiert in der Zelle auf ein calciumkanal-selektives Ion, wie z. B. Ca²⁺ und Ba²⁺. Die Details solcher Assays auf Transkriptionsbasis werden beschrieben in der in Gemeinschaftsbesitz befindlichen internationalen PCT-Patentanmeldung Nr. PCT/US91/5625, eingereicht am 7. August 1991, welche die Priorität der in Gemeinschaftsbesitz befindlichen mitanhängigen US-Anmeldung mit der Serien-Nr. 07/563,751, eingereicht am 7. August 1990, beansprucht, wobei der Inhalt dieser Anmeldungen hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist.
Assays für die Diagnose von LES
LES ist eine durch unzureichende Freisetzung von Acetylcholin aus den motorischen Nervenendungen, die normalerweise auf Nervenimpulse reagieren, charakterisierte Autoimmunkrankheit. Immunglobuline (IgG) aus LES-Patienten blockieren einzelne spannungsabhängige Calciumkanäle und inhibieren somit die Calciumkanalaktivität [Kim und Neher, Science 239: 405–408 (1988)]. Hier wird ein diagnostischer Test für das Lambert-Eaton-Syndrom (LES) bereitgestellt. Der diagnostische Test für LES beruht auf der immunologischen Reaktivität von LES-IgG mit den humanen Calciumkanälen oder bestimmten Untereinheiten allein oder in Kombination oder exprimiert auf der Oberfläche von rekombinanten Zellen. Beispielsweise kann ein solcher Test auf der Immunpräzipitation von LES-IgG durch die hier bereitgestellten humanen Calciumkanaluntereinheiten und Zellen, welche solche Untereinheiten exprimieren, beruhen.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für humane Calciumkanaluntereinheiten kodiert
Es werden Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von DNA, die für α₁-, α₂-, β- und γ-Untereinheiten humaner Calciumkanäle kodiert, bereitgestellt.
Die Identifizierung und Isolierung solcher DNA kann durch Hybridisieren einer restriktionsenzym-verdauten humanen DNA mit einer markierten Sonde, die mindestens 14 Nukleotide aufweist und von irgendeinem zusammenhängenden Abschnitt von DNA mit einer Nukleotidsequenz wie hier unter einer Sequenzidentifikationsnummer (SEQ-ID-Nr.) angegeben, abgeleitet ist, unter angemessenen Bedingungen bei mindestens geringer Stringenz durchgeführt werden, wobei die DNA, welche für die erwünschte Untereinheit kodiert, isoliert wird. Nachdem ein hybridisierendes Fragment in der Hybridisierungsreaktion identifiziert wurde, kann es unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Standardklonierungstechniken kloniert werden. Vollständige Klone können durch das Vorhandensein eines vollständigen offenen Leserrahmens identifiziert werden und die Identität des davon kodierten Proteins kann mit Hilfe eines Sequenzvergleichs mit den hier bereitgestellten Untereinheiten und durch funktionelle Assays zum Bestimmen der Fähigkeit, Calciumkanäle zu bilden, oder einer anderen Funktion bestätigt werden. Dieses Verfahren kann angewandt werden, um genomische DNA, welche für die Untereinheit kodiert, oder cDNA, welche für Spleißvarianten von humanen Calciumkanalunteneinheiten kodiert, die durch alternatives Spleißen des Primärtranskripts der genomischen Untereinheits-DNA erzeugt wurden, zu identifizieren. Beispielsweise können DNA, cDNA oder genomische DNA, die für eine Calciumkanaluntereinheit kodieren, durch Hybridisieren mit einer DNA-Sonde identifiziert werden und durch im Stand der Technik bekannte Verfahren, wie z. B. Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung, charakterisiert werden und mit der hier bereitgestellten DNA verglichen werden, um Heterogenität oder Abweichungen in den Sequenzen der DNA zu identifizieren. Solche Sequenzunterschiede können darauf hindeuten, dass die Transkripte, von denen die cDNA erstellt wurde, das Ergebnis alternativen Spleißens eines Primärtranskriptes sind, wenn die nichthomologen und homologen Regionen Cluster bilden, oder von einem unterschiedlichen Gen stammen, wenn die nichthomologen Regionen über die klonierte DNA verteilt sind.
Jedes geeignete Verfahren zur Isolierung von Genen unter Verwendung der hier bereitgestellten DNA kann verwendet werden. Beispielsweise wurden Oligonukleotide, die Regionen mit Sequenzunterschieden entsprechen, verwendet, um durch Hybridisierung DNA zu isolieren, welche für eine vollständige Spleißvariante kodiert, und können verwendet werden, um genomische Klone zu isolieren. Eine Sonde auf der Basis einer hier offenbarten Nukleotidsequenz, die für mindestens einen Teil einer Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, wie z. B. ein gewebespezifisches Exon, kann als Sonde zum Klonieren verwandter DNA, zum Klonieren eines vollständigen cDNA-Klons oder genomischen Klons, der für die humane Calciumkanaluntereinheit kodiert, verwendet werden.
Bereitgestellt werden markierte, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, radioaktiv oder enzymatisch markierte RNA oder einzelsträngige DNA mit mindestens 14 im wesentlichen aufeinanderfolgenden Basen, bevorzugt mindestens 30 aufeinanderfolgenden Basen, einer Nukleinsäure, die für mindestens einen Teil einer humanen Calciumkanaluntereinheit kodiert, wobei die Sequenz der Nukleinsäure einem Abschnitt einer hier unter Verweis auf eine SEQ-ID-Nr. offenbarten Nukleinsäuresequenz entspricht. Solche Nukleinsäuresegmente können in den hier bereitgestellten Verfahren zum Klonieren von für Calciumkanaluntereinheiten kodierender DNA als Sonden verwendet werden. Siehe allgemein Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Zusätzlich können Nukleinsäureamplifizierungstechniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, verwendet werden, um Spleißvarianten von Calciumkanaluntereinheiten zu lokalisieren, indem Oligonukleotide auf der Basis von DNA-Sequenzen, welche die abweichenden Sequenzen umgeben, als Primer für die Amplifizierung humaner RNA oder genomischer DNA verwendet werden. Längen- und Sequenzbestimmungen der Amplifikationsprodukte können Spleißvarianten aufzeigen. Des weiteren kann die Isolierung humaner genomischer DNA-Sequenzen durch Hybridisierung DNA ergeben, welche mehrere durch Introns getrennte Exons aufweist, die verschiedenen Spleißvarianten von Transkripten entsprechen, welche für humane Calciumkanaluntereinheiten kodieren.
DNA, welche für Typen und Subtypen jeder der Untereinheiten α₁, α₂, β und γ von spannungsabhängigen humanen Calciumkanälen kodiert, wurde hier kloniert, indem humane cDNA-Banken, erstellt aus isolierter Poly A+-mRNA aus Zellinien oder Gewebe humanen Ursprungs mit solchen Calciumkanälen, gescreent wurden. Unter den Quellen solcher Zellen oder Gewebe zum Gewinnen von mRNA befinden sich humanes Hirngewebe oder eine humane Zellinie neuronalen Ursprungs, wie z. B. eine Neuroblastomzellinie, humane Skelettmuskel- oder glatte Muskelzellen und dgl. Verfahren zur Herstellung von cDNA-Banken sind im Stand der Technik wohlbekannt [siehe allgemein Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York; und Davis et al. (1986), Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., New York].
Im Hinblick auf die jeweiligen Untereinheiten eines humanen Calciumkanals (α₁, α₂, β oder γ) wurde der isolierte Klon, nachdem die für die Kanaluntereinheit kodierende DNA durch ein Nukleinsäurescreeningverfahren identifiziert worden war, für weiteres Screening zur Identifizierung von überlappenden Klonen verwendet. Einige der klonierten DNA-Fragmente können in einen geeigneten Vektor, wie z. B. pIBI24/25 (IBI, New Haven, CT); M13mp18/19, pGEM4, pGEM3, pGEM7Z, pSP72 und andere solcher Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, subkloniert werden und sind subkloniert und durch DNA-Sequenzierung und Restriktionsenzymkartierung charakterisiert worden. Eine aufeinanderfolgende Serie überlappender Klone kann somit für jede der Untereinheiten erstellt werden, bis ein vollständiger Klon nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden kann, welche eine Identifizierung der Translationsstartcodons (Start) und Translationsterminationscodons (Stop) einschließen. Zur Expression der klonierten DNA können die 5'-nichtkodierende Region und andere transkriptionale und translationale Kontrollregionen eines solchen Klons durch eine effiziente Ribosomenbindungsstelle und andere im Stand der Technik bekannte regulatorische Regionen ersetzt werden. Die Beispiele II–VI unten beschreiben detailliert die Klonierung jeder der verschiedenen Untereinheiten eines humanen Calciumkanals, sowie die Subtypen und Spleißvarianten, einschließlich gewebespezifischer Varianten davon. In den Fällen, in denen partielle Sequenzen einer Untereinheit offenbart werden, liegt es in Anbetracht der hier offenbarten Lehre im Vermögen des Fachmanns, die entsprechende vollständige für die Untereinheit, den Subtypen oder die Spleißvariante davon kodierende Nukleotidsequenz zu erhalten.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für α₁-Untereinheiten kodiert
Eine Anzahl Gene für spannungsabhängige Calciumkanal-α₁-Untereinheiten, die im humanen ZNS exprimiert werden, wurden identifiziert und als α_1A, α_1B (oder VDCC IV), α_1C (oder VDCC II) und α_1D (oder VDCC III) bezeichnet. Es wurde DNA isoliert, die aus einer humanen neuronalen cDNA-Bank isoliert wurde und die für jede der Untereinheitstypen kodiert. Gleichfalls wird DNA bereitgestellt, welche für Subtypen jeder der Typen, die als Spleißvarianten auftreten, kodiert. Subtypen werden hier beispielsweise als α_1B-1, α_1B-2 bezeichnet.
Die α₁-Untereinheitstypen A, B, C und D von spannungsabhängigen Calciumkanälen und Subtypen davon unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Sensitivität für bekannte Klassen von Calciumkanalagonisten und -antagonisten, wie z. B. DHPs, Phenylalkylamine, Omega-Conotoxin (ω-CgTx) und Pyrazonoylguanidine. Sie scheinen sich gleichfalls bezüglich des Haltepotentials und der Ionenkinetik von Strömen zu unterscheiden, die nach der Depolarisierung von Zellmembranen, die verschiedene Typen von α₁-Untereinheiten umfassende Calciumkanäle enthalten, erzeugt werden.
DNA, welche für eine α₁-Untereinheit kodiert, die an mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus Dihydropyridinen, Phenylalkylaminen, ω-CgTx, Komponenten des Trichterspinnentoxins und Pyrazonoylguanidinen, bindet, wird bereitgestellt. Beispielsweise scheint die hier bereitgestellte α_1B-Untereinheit in N-Typ-Kanälen spezifisch mit ω-CgTx zu wechselwirken und die hier bereitgestellte α_1D-Untereinheit wechselwirkt spezifisch mit DHPs in L-Typ-Kanälen.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für die α_1D-Untereinheit von humanen Calciumkanälen kodiert
Die cDNA für die α_1D-Untereinheit wurde isoliert unter Verwendung von Fragmenten der α₁-Untereinheits-cDNA aus dem Calciumkanal aus Kaninchenskelettmuskel als Sonde zum Screenen einer cDNA-Bank einer humanen Neuroblastomzellinie, IMR32, um den Klon α1.36 zu erhalten. Dieser Klon wurde als Sonde verwendet, um zusätzliche cDNA-Banken aus IMR32-Zellen zu screenen, um überlappende Klone zu erhalten, welche dann zum Screenen verwendet wurden, bis eine ausreichende Serie von Klonen erhalten wurde, um die Länge der für die humane α_1D-Untereinheit kodierenden Nukleotidsequenz zu überspannen. Vollständige Klone, welche für α_1D kodieren, wurden durch Ligieren von Teilen der partiellen α_1D-Klone wie in Beispiel II beschrieben konstruiert. SEQ-ID-Nr. 1 zeigt die 7635 Nukleotide lange Sequenz der cDNA, die für die α_1D-Untereinheit kodiert. Es gibt einen 6483 Nukleotide langen Leserahmen, welche für eine Sequenz von 2161 Aminosäuren kodiert (wie in SEQ-ID-Nr. 1 angegeben).
SEQ-ID-Nr. 2 gibt die Sequenz eines alternativen Exons an, welches für die IS6-Transmembrandomäne der α_1D-Untereinheit kodiert [siehe Tanabe T., et al. (1987), Nature 328: 313–318 hinsichtlich einer Beschreibung der Transmembrandomänenterminologie].
SEQ-ID-Nr. 1 zeigt auch die 2161 Aminosäuren lange Sequenz, die von der DNA für die α_1D-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals abgeleitet wurde. Auf Basis der Aminosäuresequenz besitzt das des α_1D-Proteins ein berechnetes Molekulargewicht Mr von 245.163. Die α_1D-Untereinheit des Calciumkanals enthält vier mutmaßliche interne Repeat-Regionen. Vier intern wiederholte Regionen (Repeats) stellen 24 mutmaßliche Transmembransegmente dar und die Amino- und Carboxyltermini reichen in den intrazellulären Raum.
Es wurde gezeigt, dass die α_1D-Untereinheit eine lang anhaltende, DHP-sensitive, durch hohe Spannung aktivierte Calciumkanalaktivität steuert. Diese Calciumkanalaktivität wurde nachgewiesen, wenn in Oozyten RNA-Transkripte coinjiziert wurden, welche für eine α_1D- und β₁-Untereinheit oder für α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodieren. Diese Aktivität war von Ba²⁺-Strömen verschieden, die man detektiert, wenn man Oozyten RNA-Transkripte injiziert, die für die β₁- ± α₂-Untereinheiten kodieren. Diese Ströme ähnelten pharmakologisch und biophysikalisch den für nichtinjizierte Oozyten berichteten Ca²⁺-Strömen.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für die humane α_1A-Calciumkanaluntereinheit kodiert
Biologisches Material, welches die für die α_1A-Untereinheit kodierende DNA enthält, wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der Internationalen Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen für die Zwecke einer Patenterteilung und der gemäß diesem Vertrag erlassenen Regeln hinterlegt. Proben des hinterlegten Materials sind für Patentämter und andere Personen, welche gemäß den Bedingungen des Vertrags und der Regeln und ansonsten in Übereinstimmung mit den Patentgesetzen und Regelwerken der Vereinigten Staaten von Amerika und aller anderen Nationen oder internationalen Organisationen, bei denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht wird oder bei denen irgendein Patent, das auf irgendeiner solchen Anmeldung basiert, erteilt wird, gesetzlich zu deren Empfang berechtigt sind, jetzt und in Zukunft verfügbar.
Die α_1A-Untereinheit wird kodiert von einem ca. 3 kb langen Insert im Phagen λgt10 mit der Bezeichnung α1.254 im E. coli-Wirtsstamm NM514. Ein Phagenlysat dieses Materials wurde bei der American Typ Culture Collection unter einer ATCC-Hinterlegungs-Nr. hinter legt wie oben beschrieben. Für α_1A kodierende DNA kann auch durch Screenen mit einer Sonde identifiziert werden, die aus DNA mit der SEQ-ID-Nr. 21:
5' CTCAGTACCATCTCTGATACCAGCCCCA 3'
hergestellt wurde.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für die humane α_1B-Calciumkanaluntereinheit kodiert
Für die α_1B-Untereinheit kodierende DNA wurde durch Screenen einer humanen Basalganglien-cDNA-Bank mit Fragmenten der cDNA, die für die α₁-Untereinheit eines Kaninchenskelettmuskel-Calciumkanals kodiert, isoliert. Ein Teil eines der positiven Klone wurde zum Screenen einer cDNA-Bank aus IMR32-Zellen verwendet. Klone, die mit der DNA-Sonde der Basalganglien hybridisierten, wurden verwendet, um eine cDNA-Bank aus IMR32-Zellen weiter zu screenen, um überlappende Klone zu identifizieren, welche wiederum zum Screenen einer humanen Hippocampus-cDNA-Bank verwendet wurden. Auf diese Weise wurde eine ausreichende Serie von Klonen erhalten, um annähernd die gesamte Länge der Nukleotidsequenz, welche für die humane α_1B-Untereinheit kodiert, zu überspannen. PCR-Amplifizierung von spezifischen Regionen der α_1B-mRNA der IMR32-Zellen ergab zusätzliche Segmente der α_1B-Kodierungssequenz.
Ein vollständiger α_1B-DNA-Klon wurde durch Ligieren von Teilen der partiellen cDNA-Klone wie in Beispiel II.C. beschrieben konstruiert. SEQ-ID-Nr. 7 und 8 zeigen die Nukleotidsequenzen von DNA-Klonen, welche für die α_1B-Untereinheit kodieren, sowie die abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Die von SEQ-ID-Nr. 7 kodierte α_1B-Untereinheit wird als die α_1B-1-Untereinheit bezeichnet, um sie von einer anderen α_1B-Untereinheit, α_1B-2, die von der in SEQ-ID-Nr. 8 dargestellten Nukleotidsequenz kodiert wird und die durch alternatives Spleißen des α_1B-Untereinheitstranskripts erhalten wird, zu unterscheiden.
Eine PCR-Amplifizierung von IMR32-Zell-mRNA mit Oligonukleotidprimern, die gemäß Nukleotidsequenzen innerhalb der α_1B-1-kodierenden DNA konstruiert wurden, identifizierte Varianten des α_1B-Transkripts, die Spleißvarianten zu sein scheinen, da sie abweichende Kodierungssequenzen enthalten.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für die humane α_1C-Calciumkanaluntereinheit kodiert
Es wurden zahlreiche α_1C-spezifische DNA-Klone isoliert. Die Charakterisierung dieser Sequenz offenbarte die α_1C-Kodierungssequenz, die α_1C-Translationsinitiierungssequenz sowie eine alternativ gespleißte Region von α_1C. Es wurden alternativ gespleißte Varianten der α_1C-Untereinheit identifiziert. SEQ-ID-Nr. 3 gibt die für eine α_1C-Untereinheit kodierende DNA an. Die in SEQ-ID-Nr. 4 und Nr. 5 angegebenen DNA-Sequenzen kodieren für zwei mögliche aminoterminale Enden des α_1C-Proteins. SEQ-ID-Nr. 6 kodiert für ein alternatives Exon für die IV S3-Transmembrandomäne.
Die Isolierung und Identifizierung von DNA-Klonen, die für Teile der α_1C-Untereinheit kodieren, ist detailliert in Beispiel II beschrieben.
Ebenfalls wurde DNA isoliert, die für weitere α₁-Untereinheiten, einschließlich α_1A, kodiert. Unter Verwendung der hier bereitgestellten DNA oder anderer dem Fachmann bekannter Verfahren können auch weitere solche Untereinheiten wie für die α_1B-, α_1C- und α_1D-Untereinheiten beschrieben isoliert und identifiziert werden.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für humane β-Calciumkanaluntereinheiten kodiert
Für β₁ kodierende DNA
Zur Isolierung von DNA, die für die β₁-Untereinheit kodiert, wurde eine humane Hippocampus-cDNA-Bank durch Hybridisierung mit einem für eine Kaninchenskelettmuskel-Calciumkanal-β-Untereinheit kodierenden DNA-Fragment gescreent. Ein hybridisierender Klon wurde ausgewählt und wiederum verwendet, um überlappende Klone zu isolieren, bis die überlappenden Klone, welche DNA umfassten, die für die gesamte humane Calciumkanal-β-Untereinheit kodiert, isoliert und sequenziert wurden.
Es wurden fünf alternativ gespleißte Formen der humanen Calciumkanal-β-Untereinheit identifiziert und DNA, die für eine Anzahl Formen kodiert, wurde isoliert. Diese Formen werden als β_1-1, exprimiert in Skelettmuskel, β_1-2, exprimiert im ZNS, β_1-3, ebenfalls exprimiert im ZNS, β_1-4, exprimiert in Aortagewebe und HEK 293-Zellen, und β_1-5, exprimiert in HEK 293-Zellen, bezeichnet. Es wurde ein vollständiger für die β_1-2-Untereinheit kodierender DNA-Klon konstruiert. Die Untereinheiten β_1-1, β_1-2, β_1-4 und β_1-5 wurden durch PCR-Analyse als alternativ gespleißte Formen der β-Untereinheit identifiziert.
Die alternativ gespleißten Varianten wurden durch Vergleich der Aminosäuresequenzen, die von der DNA für Calciumkanal-β-Untereinheiten aus humanen Neuronen und Kaninchenskelettmuskel kodiert werden, identifiziert. Dieser Vergleich zeigte eine 45 Aminosäuren lange Deletion in der humanen β-Untereinheit im Vergleich mit der Kaninchen-β-Untereinheit. Unter Verwendung von DNA aus dieser Region als Sonde für DNA-Klonierung, sowie für PCR-Analyse und DNA-Sequenzierung dieses Gebiets der Sequenzabweichung wurden alternativ gespleißte Formen des Transkripts für die humane Calciumkanal-β-Untereinheit identifiziert. Beispielsweise ist die Sequenz der für eine Spleißvariante β_1-2 kodierenden DNA in SEQ-ID-Nr. 9 angegeben. SEQ-ID-Nr. 10 gibt die Sequenz für die β_1-3-Untereinheit an (Nukleotide 1–1851, einschließlich der 3'-untranslatierten Sequenz der Nukleotide (Nt.) 1795–1851), welche eine weitere Spleißvariante des Primärtranskripts für die β₁-Untereinheit darstellt. β_1-2 und β_1-3 sind humane neuronale β-Untereinheiten. DNA, die für einen Teil der β-Untereinheit (β_1-4) eines humanen Aorta-Calciumkanals und ebenso für humane embryonale Nierenzellen (HEK) kennzeichnend ist, ist in SEQ-ID-Nr. 12 (Nt. 1–13 und 191–271) angegeben. Die DNA-Sequenz, die für einen Teil der in Skelettmuskel exprimierten humanen Calciumkanal-β-Untereinheit kodiert (β_1-1), ist in SEQ-ID-Nr. 12 (Nt. 1–12 und 35–271) dargestellt.
Für β₃ kodierende DNA
DNA, die für die β₃-Untereinheit und etwaige Spleißvarianten davon kodiert, kann durch Screenen einer Bank, wie für die β₁-Untereinheit oben beschrieben, unter Verwendung von gemäß SEQ-ID-Nr. 19 und 20 hergestellten DNA-Sonden oder dem gesamten oder einem Teil des hinterlegten β₃-Klon-Plasmids β1.42 (ATCC Hinterlegungs-Nr. 69048) isoliert werden.
Der E. coli-Wirt, der das Plasmid β1.42 enthält, welches die für die β₃-Untereinheit kodierende DNA enthält, wurde als ATCC Hinterlegungs-Nr. 69048 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der Internationalen Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen für die Zwecke einer Patenterteilung und der gemäß diesem Vertrag erlassenen Regeln hinterlegt. Proben des hinterlegten Materials sind für Patentämter und andere Personen, welche gemäß den Bedingungen des Vertrags und der Regeln und ansonsten in Übereinstimmung mit den Patentgesetzen und Regelwerken der Vereinigten Staaten von Amerika und aller anderen Nationen oder internationalen Organisationen, bei denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht wird oder bei denen irgendein Patent, das auf irgendeiner solchen Anmeldung basiert, erteilt wird, gesetzlich zu deren Empfang berechtigt sind, jetzt und in Zukunft verfügbar.
Das β₃-kodierende Plasmid wird als β1.42 bezeichnet. Das Plasmid enthält ein 2,5 kb langes EcoRI-Fragment, welches für β₃ kodiert, in den Vektor pGem^®7zF(+) inseriert und wurde im E. coli-Wirtsstamm DN5α hinterlegt. Eine DNA-Teilsequenz der 5'- und 3'-Enden von β₃ ist in SEQ-ID-Nr. 19 bzw. 20 angegeben.
Identifizierung und Isolierung von DNA, welche für die humane α₂-Calciumkanaluntereinheit kodiert
DNA, welche für eine humane neuronale Calciumkanal-α₂-Untereinheit kodiert, wurde auf im wesentlichen ähnliche Weise wie für die Isolierung der DNA, welche für eine α₁-Untereinheit kodiert, isoliert, außer dass eine humane genomische DNA-Bank unter Bedingungen niedriger und hoher Stringenz mit einem Fragment von DNA, welche für die Calciumkanal-α₂-Untereinheit aus Kaninchenskelettmuskel kodiert, sondiert wurde. Das Fragment umfaßte Nukleotide mit einer Sequenz, die der Nukleotidsequenz zwischen den Nukleotiden 43 und 272 einschließlich der Calciumkanal-α₂-Untereinheits-cDNA aus Kaninchenrückenskelettmuskel entspricht, wie offenbart in der Internationalen PCT-Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 89/09834, die der US-Anmeldung Serien-Nr. 07/620,520 entspricht, die eine Continuation-in-Part der US-Serien-Nr. 176,899, eingereicht am 4. April 1988, darstellt, welche Anmeldungen hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen sind.
Beispiel IV beschreibt die Isolierung von DNA-Klonen, welche für α₂-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodieren, aus einer humanen DNA-Bank unter Verwendung von genomischen DNA- und cDNA-Klonen, identifiziert durch Hybridisierung mit der genomischen DNA, als Sonden.
SEQ-ID-Nr. 11 zeigt die DNA-Sequenz, welche für eine α₂-Untereinheit kodiert. Wie in Beispiel V beschrieben, identifizierte die PCR-Analyse von RNA aus humanem Skelettmuskel, Hirngewebe und Aorta unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die für eine Region der cDNA der humanen neuronalen α₂-Untereinheit spezifisch sind, welche von der α₂-Untereinheits-cDNA des Kaninchenskelettmuskel-Calciumkanals abweicht, Spleißvarianten des Transkripts für die α₂-Untereinheit des humanem Calciumkanals.
Identifizierung und Isolierung von DNA, die für humane γ-Calciumkanaluntereinheiten kodiert
DNA, welche für eine γ-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals kodiert, wurde wie in Beispiel VI detailliert beschrieben isoliert. SEQ-ID-Nr. 14 zeigt die Nukleotidsequenz am 3'-Ende dieser DNA, welche einen Leserahmen umfaßt, der für eine Sequenz von 43 Aminosäureresten kodiert.
Herstellung von rekombinanten eukaryotischen Zellen, welche für heterologe Calciumkanaluntereinheiten kodierende DNA enthalten
DNA, welche für eine oder mehrere der Calciumkanaluntereinheiten oder einen Teil einer Calciumkanaluntereinheit kodiert, kann zur Expression oder Replikation der DNA in eine Wirtszelle eingeführt werden. Eine solche DNA kann unter Verwendung von in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren oder unter Verwendung anderer dem Fachmann wohlbekannten Verfahren eingebracht werden. Das Einbringen klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion von eukaryotischen Zellen mit einem Plasmidvektor oder einer Kombination von Plasmidvektoren, wobei jeder für ein oder mehrere unterschiedliche(s) Gen(e) kodiert, oder mit linearer DNA und die Selektion von transfizierten Zellen sind ebenso im Stand der Technik wohlbekannt [siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press].
Klonierte Vollängen-DNA, die für irgendeine der Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodiert, kann in einen Plasmidvektor zur Expression in einer eukaryotischen Zelle eingebracht werden. Eine solche DNA kann genomische DNA oder cDNA sein. Wirtszellen können mit einem oder einer Kombination der Plasmide transfiziert werden, wobei jedes für mindestens eine Calciumkanaluntereinheit kodiert. Als Alternative können Wirtszellen nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren mit linearer DNA transfiziert werden.
Während die hier bereitgestellte DNA in jeder eukaryotischen Zelle, einschließlich Hefezellen, wie z. B. P. pastoris [siehe z. B. Cregg et al. (1987), Bio/Technology 5: 479], exprimiert werden kann, sind Säugerexpressionssysteme für die Expression der DNA, welche für die hier bereitgestellten humanen Calciumkanaluntereinheiten kodiert, bevorzugt.
Die heterologe DNA kann durch jedwedes im Stand der Technik bekannte Verfahren eingeführt werden, beispielsweise durch Transfektion mit einem Vektor, der für die heterologe DNA kodiert. Besonders bevorzugte Vektoren für die Transfektion von Säugerzellen sind die pSV2dhfr-Expressionsvektoren, welche den frühen Promotor von SV40, das dhfr-Gen der Maus, sowie Polyadenylierungs- und Spleißstellen von SV 40 und Sequenzen enthalten, die zur Aufrechterhaltung des Vektors in Bakterien notwendig sind, Vektoren auf Basis des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors, wie z. B. pCMV oder pCDNA1, sowie Vektoren auf MMTV-Promotorbasis. DNA, welche für die humanen Calciumkanaluntereinheiten kodiert, wurde an einer Position unmittelbar hinter dem CMV-Promotor in den Vektor pCDNA1 inseriert.
Stabil oder transient transfizierte Säugerzellen können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden, indem Zellen mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, welcher ein selektierbares Markergen, wie z. B. das Gen für Thymidinkinase, Dihydrofolatreduktase, Neomycinresistenz oder dgl. aufweist, transfiziert werden, und für die transiente Transfektion, indem die transfizierten Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, die für die das Markergen exprimierende Zellen selektiv sind. Funktionelle spannungsabhängige Calciumkanäle wurden in HEK 293-Zellen produziert, die mit einem Derivat des Vektors pCDNA1 transfiziert wurden, welches für eine humane Calciumkanaluntereinheit kodierende DNA enthält.
Die heterologe DNA kann in der Zelle als episomales Element aufrechterhalten werden oder sie kann in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden. Die resul tierenden rekombinanten Zellen können dann aus einer solchen Kultur oder Subkultur davon kultiviert oder subkultiviert werden (oder, im Fall von Säugerzellen, Passagen unterzogen werden). Verfahren zur Transfektion, Injektion und Kultivierung von rekombinanten Zellen sind dem geschulten Fachmann bekannt.
Eukaryotische Zellen, in die DNA oder RNA eingebracht werden kann, umfassen alle Zellen, die durch eine solche DNA oder RNA transfizierbar sind oder in die eine solche DNA injiziert werden kann. Praktisch jede eukaryotische Zelle kann als Vehikel für heterologe DNA dienen. Bevorzugte Zellen sind solche, die auch die DNA und RNA exprimieren können, und am meisten bevorzugt sind Zellen, welche rekombinante oder heterologe Calciumkanäle bilden können, welche eine oder mehrere durch die heterologe DNA kodierte Untereinheit(en) umfassen. Solche Zellen können empirisch identifiziert werden oder unter solchen ausgewählt werden, die bekanntermaßen unschwer transfiziert oder injiziert werden. Bevorzugte Zellen zum Einbringen von DNA umfassen solche, welche transient oder stabil transfiziert werden können, und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Zellen, die von Säugern stammen, wie z. B. COS-Zellen, Maus-L-Zellen, CHO-Zellen, Humanembryo-Nierenzellen, Zellen der afrikanischen grünen Meerkatze und weitere solcher Zellen, die dem Fachmann bekannt sind, amphibische Zellen, wie z. B. Oozyten aus Xenopus laevis, oder Hefezellen, wie z. B. Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Bevorzugte Zellen für die Expression injizierter RNA-Transkripte umfassen Oozyten aus Xenopus laevis. Zellen, die für die Transfektion von DNA bevorzugt sind, sind solche, die einfach und effizient transfiziert werden können. Solche Zellen sind dem Fachmann bekannt oder können empirisch identifiziert werden. Bevorzugte Zellen umfassen DG44-Zellen und HEK 293-Zellen, insbesondere HEK 293-Zellen, welche an das Wachstum in Suspension angepaßt wurden und welche in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend aufgetaut und weiter kultiviert werden können. Solche HEK 293-Zellen sind beispielsweise im US-Patent Nr. 5,024,939 von Gorman beschrieben [siehe auch Stillman et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 2051–2060].
Die Zellen können als Vehikel für die Replizierung darin eingeführter heterologer DNA oder zur Expression der darin eingeführten heterologen DNA verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Zellen als Vehikel für die Expression der heterologen DNA verwendet, um im wesentlichen reine humane Calciumkanaluntereinheiten oder heterologe Calciumkanäle zu erzeugen. Die heterologe DNA enthaltenden Wirtszellen können unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Calciumkanäle exprimiert werden. Die Calciumkanaluntereinheiten können unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden. Beispielsweise können Antikörper, wie z. B. die hier bereitgestellten, die spezifisch an eine oder mehrere der Untereinheiten binden, zur Affinitätsreinigung der Untereinheit oder der die Untereinheiten enthaltenden Calciumkanäle verwendet werden.
Es werden im wesentlichen reine α₁-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals, α₂-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals, β-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals und γ-Untereinheiten eines humanen Calciumkanals bereitgestellt. Im wesentlichen reine isolierte Calciumkanäle, enthaltend mindestens eine der humanen Calciumkanaluntereinheiten, werden ebenso bereitgestellt. Im wesentlichen reine Calciumkanäle, enthaltend eine Mischung aus einer oder mehrerer Untereinheiten, die von der Wirtszelle kodiert werden, sowie einer oder mehrerer Untereinheiten, die durch in die Zelle eingebrachte heterologe DNA oder RNA kodiert werden, werden gleichfalls bereitgestellt. Ebenso werden im wesentlichen reine subtyp- oder gewebetypspezifische Calciumkanäle bereitgestellt.
In weiteren Ausführungsformen werden eukaryotische Zellen, welche eine heterologe DNA enthalten, die für mindestens eine von einer α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, einer α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, einer β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals und einer γ-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, bereitgestellt. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die heterologe DNA in der eukaryotischen Zelle exprimiert und kodiert vorzugsweise für eine humane Calciumkanal-α₁-Untereinheit.
In besonders bevorzugten Aspekten exprimiert die die heterologe DNA enthaltende eukaryotische Zelle diese und bildet eine rekombinante funktionelle Calciumkanalaktivität. In stärker bevorzugten Aspekten ist die rekombinante funktionelle Calciumkanalaktivität leicht nachweisbar, da sie eines Typs ist, der in der untransfizierten Wirtszelle nicht vorhanden ist oder in diesem Ausmaß in der untransfizierten Zelle nicht gezeigt wird.
Unter solchen Zellen ist eine rekombinante eukaryotische Zelle mit einem funktionellen heterologen Calciumkanal bevorzugt. Die rekombinante Zelle kann durch Einbringen und Exprimieren von heterologer DNA oder RNA-Transkripten, welche für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodieren und bevorzugter auch exprimieren, einer heterologen DNA, die für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und/oder einer heterologen DNA, die für eine α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, hergestellt werden. Besonders bevorzugt ist die Expression jeder der α₁-, β- und α₂-Untereinheiten, die von einer solchen heterologen DNA oder RNA-Transkripten kodiert werden, und gegebenenfalls die Expression einer heterologen DNA oder eines RNA-Transkripts, welche(s) für eine γ-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, in einer solchen rekombinanten Zelle.
In bestimmten Ausführungsformen wird die eukaryotische Zelle mit einem heterologen Calciumkanal durch Einbringen einer ersten Zusammensetzung, welche mindestens ein RNA-Transkript enthält, das in der Zelle in eine Untereinheit eines humanen Calciumkanals translatiert wird, in die Zelle hergestellt. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die translatierten Untereinheiten eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals. Stärker bevorzugt enthält die eingebrachte Zusammensetzung ein RNA-Transkript, welches für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und enthält weiterhin (1) ein RNA-Transkript, welches für eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert, und/oder (2) ein RNA-Transkript, welches für eine α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert. Besonders bevorzugt ist das Einbringen einer RNA, welche für eine α₁-, eine β- und eine α₂-Untereinheit eines humanen Calciumkanals sowie gegebenenfalls eine γ-Untereinheit eines humanen Calciumkanals kodiert.
Verfahren zur in-vitro-Transkription einer klonierten DNA und Injektion der resultierenden RNA in eukaryotische Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt. Transkripte jeder vollständigen DNA, die für eine der Untereinheiten eines humanen Calciumkanals kodiert, können allein oder in Kombination mit weiteren Transkripten in eukaryotische Zellen zwecks Expression in diesen Zellen injiziert werden. Amphibien-Oozyten sind für die Expression von in-vitro-Transkripten der hier bereitgestellten cDNA-Klone von humanen Calciumkanaluntereinheiten besonders bevorzugt.
Die funktionellen Calciumkanäle können vorzugsweise mindestens eine α₁-Untereinheit und eine β-Untereinheit eines humanen Calciumkanals umfassen. Mittels Transfektion von DNA und durch Injektion von RNA-Transkripten wurden eukaryotische Zellen hergestellt, welche diese beiden Untereinheiten exprimieren, und auch Zellen, welche zusätzliche Untereinheiten exprimieren. Solche Zellen zeigten eine spannungsabhängige Calciumkanalaktivität, die auf Calciumkanäle zurückzuführen ist, welche eine oder mehrere der heterologen humanen Calciumkanaluntereinheiten enthalten. Beispielsweise wurde gezeigt, dass eukaryotische Zellen, welche heterologe Calciumkanäle exprimieren, die eine α₂-Untereinheit zusätzlich zu der α₁-Untereinheit und einer β-Untereinheit enthalten, als Antwort auf eine Depolarisierung einen erhöhten calcium-selektiven Ionenfluß über die Zellmembran aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die α₂-Untereinheit die Calciumkanalfunktion potenzieren könnte.
Eukaryotische Zellen, welche heterologe Calciumkanäle exprimieren, die mindestens eine humane α₁-Untereinheit, eine humane β-Untereinheit und eine humane α₂-Untereinheit enthalten, sind bevorzugt. Mit einer Zusammensetzung, welche eine cDNA oder ein RNA-Transkript enthält, welche/s für eine α₁-Untereinheit allein oder in Kombination mit einer β- und/oder einer α₂-Untereinheit kodiert, transformierte eukaryotische Zellen können zur Herstellung von Zellen verwendet werden, die funktionelle Calciumkanäle exprimieren.
Da rekombinante Zellen, welche humane Calciumkanäle exprimieren, die alle der von der heterologen cDNA oder RNA kodierten humanen Untereinheiten enthalten, besonders bevorzugt sind, ist es wünschenswert, solchen Wirtszellen eine ausreichende Konzentration der für die Untereinheiten kodierenden Nukleinsäuren zu injizieren oder sie damit zu transfizieren, um Calciumkanäle zu bilden, welche die von der heterologen DNA oder RNA kodierten humanen Untereinheiten enthalten. Die genauen Mengen und Verhältnisse der DNA oder RNA, die für die Untereinheiten kodiert, können empirisch bestimmt und für bestimmte Kombinationen von Untereinheiten, Zellen und Assaybedingungen optimiert werden.
Für die Messung der Aktivität von funktionellen heterologen Calciumkanälen kann vorzugsweise die endogene Ionenkanalaktivität und, gewünschtenfalls, die heterologe Kanalaktivität von Kanälen, welche die erwünschten Untereinheiten nicht enthalten, einer Wirtszelle bis zu einem erheblichen Grad mit Hilfe von chemischen, pharmakologischen und elektrophysiologischen Mitteln, einschließlich der Verwendung eines differentiellen Haltepotentials, inhibiert werden, um das S/N-Verhältnis der gemessenen Aktivität eines heterologen Calciumkanals zu erhöhen.
Unter den Verwendungen für eukaryotische Zellen, die eine oder mehrere Untereinheiten rekombinant exprimieren, sind Assays zur Feststellung, ob eine Testverbindung für einen Calciumkanal eine Agonisten- oder Antagonisten-Aktivität aufweist. Wünschenswerterweise stellt eine Wirtszelle für die Expression von Calciumkanaluntereinheiten keine endogenen Calciumkanaluntereinheiten des Typs oder in einer solchen Menge her, die/der den Nachweis von heterologen Calciumkanaluntereinheiten in Ligandenbindungsassays oder den Nachweis einer heterologen Calciumkanalfunktion, wie z. B. das Erzeugen eines Calciumstroms, in funktionellen Assays stört.
Für die Ligandenbindungsassays sollten die Wirtszellen vorzugsweise keinen endogenen Calciumkanäle produzieren, welche nachweislich mit Verbindungen wechselwirken, die in physiologischen Konzentrationen (im allgemeinen nanomolare oder picomolare Konzentrationen) eine Affinität für Calciumkanäle haben, welche eine oder alle der hier bereitgestellten humanen Calciumkanaluntereinheiten enthalten.
Für Ligandenbindungsassays zur Identifizierung einer Verbindung, welche eine Affinität für Calciumkanäle hat, werden Zellen eingesetzt, welche bevorzugt mindestens eine heterologe α₁-Untereinheit exprimieren. Transfizierte eukaryotische Zellen, die mindestens eine α₁-Untereinheit exprimieren, können verwendet werden, um die Fähigkeit einer Testverbindung zu bestimmen, die Aktivität eines Calciumkanals spezifisch zu verändern. Solche Ligandenbindungsassays können mit intakten transfizierten Zellen oder daraus hergestellten Membranen durchgeführt werden.
Das Vermögen einer Testverbindung, an Membranen, die heterologe Calciumkanäle oder Untereinheiten davon enthalten, zu binden oder auf andere Art und Weise mit ihnen zu wechselwirken, kann unter Anwendung irgendeines geeigneten Verfahrens, wie z. B. kompetitiver Bindungsanalyse, z. B. Scatchard-Graphen, in denen das Bindungsvermögen solcher Membranen in Gegenwart und Abwesenheit einer oder mehrerer Konzentrationen einer Verbindung mit einer bekannten Affinität für den Calciumkanal bestimmt wird, bestimmt werden. Falls notwendig, können die Ergebnisse mit einem Kontrollexperiment verglichen werden, welches gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren entworfen wurde. Beispielsweise können als negative Kontrolle die Ergebnisse mit denen von Assays einer identisch behandelten Membranpräparation aus Wirtszellen, die nicht mit Nukleinsäuren, kodierend für eine oder mehrere Untereinheit(en), transfiziert wurden, verglichen werden.
Stabil oder transient transfizierte Zellen oder injizierte Zellen, die spannungsabhängige humane Calciumkanäle exprimieren, welche eine oder mehrere der Untereinheiten eines humanen Calciumkanals enthalten, können wünschenswerterweise in Assays verwendet werden, um Mittel, welche die Calciumkanalaktivität modulieren, wie z. B. Calciumkanalagonisten und -antagonisten, zu identifizieren. Funktionelle Tests der Aktivität von Testverbindungen, einschließlich Verbindungen mit unbekannter Aktivität, hinsichtlich Calciumkanalagonisten- oder -antagonistenaktivität, um zu bestimmen, ob die Testverbindung den Calciumfluß durch einen humanen Calciumkanal potenziert, inhibiert oder auf eine andere Art und Weise verändert, können durchgeführt werden, indem (a) eine eukaryotische Zelle, die zwecks Expression eines heterologen funktionellen Calciumkanals, der in der Lage ist, den Fluß von calciumkanal-selektiven Ionen in die Zelle in einem calciumkanal-selektive Ionen enthaltenden Medium zu regulieren, transfiziert oder injiziert wurde, (i) in Gegenwart und (ii) in Abwesenheit einer Testverbindung gehalten wird; (b) die Zelle unter solchen Bedingungen gehalten wird, dass die heterologen Calciumkanäle im wesentlichen geschlossen sind und endogene Calciumkanäle der Zelle im wesentlichen inhibiert sind; (c) die Membran der in Schritt (b) gehaltenen Zelle in einem solchen Grad und für eine ausreichende Zeitdauer depolarisiert wird, um zu veranlassen, dass (bevorzugt im wesentlichen nur) die heterologen Calciumkanäle für die calciumkanal-selektiven Ionen permeabel werden; und (d) die Menge und Dauer des Stromflusses in die Zelle in Gegenwart der Testverbindung mit dem Stromfluß in die Zelle oder eine im wesentlichen ähnliche Zelle in Abwesenheit der Testverbindung verglichen wird.
Funktionelle rekombinante oder heterologe Calciumkanäle können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise können wohlbekannte elektrophysiologische Verfahren zur Messung des Stroms über eine ionenselektive Membran einer Zelle verwendet werden. Die Menge und Dauer des Flusses von calcium-selektiven Ionen durch heterologe Calciumkanäle einer rekombinanten Zelle, welche DNA enthält, die für eine oder mehrere der hier bereitgestellten Untereinheiten kodiert, wurde mit Hilfe von elektrophysiologischen Aufzeichnungen unter Verwendung einer Zweielektrodentechnik und der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik gemessen. Um die Empfindlichkeit der Tests zu verbessern, können bekannte Verfahren angewendet werden, um die Nicht-Calciumströme und Calciumströme, die von endogenen Calciumkanälen herrühren, zu eliminieren, wenn Calciumströme durch rekombinante Kanäle gemessen werden. Beispielsweise verstärkt das DHP Bay K 8644 spezifisch die L-Typ-Calciumkanalfunktion durch Verlängerung der Dauer des offenen Zustands der Kanäle; [siehe z. B. Hess, J. B., et al. (1984), Nature 311: 538–544]. Verlängertes Öffnen der Kanäle führt zu Calciumströmen erhöhter Größe und Dauer. Endströme sind zu beobachten, wenn die Zellmembran nach der Aktivierung von Calciumkanälen durch einen depolarisierenden Spannungsbefehl repolarisiert wird. Die geöffneten Kanäle brauchen eine endliche Zeit, um sich nach der Repolarisierung wieder zu schließen oder zu „deaktivieren", und der Strom, der während dieser Zeit durch die Kanäle fließt, wird als Endstrom („tail current") bezeichnet. Da Bay K 8644 die Öffnungsereignisse von Calciumkanälen verlängert, neigt es dazu, diese Endströme zu verlängern und sie ausgeprägter zu machen.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind lediglich zur Veranschaulichung eingeschlossen und sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken.
BEISPIEL 1: HERSTELLUNG VON BANKEN, DIE ZUR ISOLIERUNG VON DNA VERWENDET WURDEN, WELCHE FÜR SPANNUNGSABHÄNGIGE HUMANE NEURONALE CALCIUMKANALUNTEREINHEITEN KODIERT
A: RNA-Isolierung
1. IMR32-Zellen
IMR32-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC-Hinterlegungs-Nr. CCL127, Rockville, MD) erhalten und in DMEM, 10% fötalem Rinderserum, 1% Penicillin/-Streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY) plus 1,0 mM Dibutyryl-cAMP (dbcAMP) für zehn Tage kultiviert. Gesamt-RNA wurde gemäß dem von H. C. Birnboim [(1988), Nucleid Acids Research 16: 1487–1497] beschriebenen Verfahren aus den Zellen isoliert. Poly(A⁺)-RNA wurde gemäß Standardverfahren selektiert [siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Seiten 7.26–7.29].
2. Humanes Thalamusgewebe
Humanes Thalamusgewebe (2,34 g), welches von der National Neurological Research Bank, Los Angeles, CA, erhalten und bei –70°C eingefroren gelagert worden war, wurde mit einem Mörser und Pistill in Gegenwart von flüssigem Stickstoff pulverisiert und die Zellen wurden in 12 ml Lysepuffer (5 M Guanidiniumisothiocyanat, 50 mM TRIS, pH 7,4, 10 mM EDTA, 5% β-Mercaptoethanol) lysiert. Zu dem Lysat wurde Lysepuffer hinzugegeben, um ein Endvolumen von 17 ml zu ergeben. Zu dem Gemisch wurden N-Laurylsarcosin und CsCl hinzugegeben, um jeweils Endkonzentrationen von 4% bzw. 0,01 g/ml in einem Endvolumen von 18 ml zu ergeben.
Die Probe wurde bei 9000 U/min in einem Sorvall SS34 Rotor für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das unlösliche Material als Pellet zu entfernen. Der Überstand wurde in zwei gleiche Teile geteilt und jeder wurde auf ein 2-ml-Kissen einer Lösung aus 5,7 M CsCl, 0,1 M EDTA in getrennten Zentrifugenröhrchen gegeben, um ungefähr 9 ml pro Röhrchen zu ergeben. Die Proben wurden in einem SW41 Rotor bei 37.000 U/min für 24 Stunden bei 20°C zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurde jedes RNA-Pellet in 3 ml ETS (10 mM TRIS, pH 7,4, 10 mM EDTA, 0,2% SDS) resuspendiert und in einem einzigen Röhrchen vereinigt. Die RNA wurde mit 0,25 M NaCl und zwei Volumen 95%igen Ethanols gefällt.
Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gewonnen und in 4 ml PK-Puffer (0,05 M TRIS, pH 8,4, 0,14 M NaCl, 0,01 M EDTA, 1% SDS) resuspendiert. Zu der Probe wurde bis zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml Proteinase K hinzugegeben. Die Probe wurde bei 22°C für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von einer zweimaligen Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (50 : 48 : 2), gefolgt von einer Extraktion mit einem gleichen Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24 : 1). Die RNA wurde mit Ethanol und NaCl gefällt. Das Präzipitat wurde in 400 μl ETS-Puffer resuspendiert. Die Ausbeute an Gesamt-RNA betrug ungefähr 1,0 mg. Poly A⁺-RNA (30 μg) wurde gemäß Standardverfahren wie in Beispiel I.A.1. beschrieben aus der Gesamt-RNA isoliert.
B. Erstellung einer Bank
Doppelsträngige cDNA wurde gemäß Standardverfahren synthetisiert [siehe z. B. Sambrook et al., (1989) in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 8]. Jede Bank wurde im wesentlichen auf die gleiche Art und Weise hergestellt, außer dass bei 1) dem Oligonukleotid, das zum Primen der Erststrang-cDNA-Synthese verwendet wurde, 2) den Adaptern, die an die doppelsträngige cDNA gebunden wurden, 3) dem Verfahren, welches zum Entfernen der freien oder nicht verwendeten Adapter verwendet wurde, und 4) der Größe der in den λ-Phagen-Vektor ligierten, fraktionierten cDNA Unterschiede bestanden.
1. IMR32-cDNA-Bank #1
Einzelsträngige cDNA wurde unter Verwendung von IMR32-Poly (A⁺)-RNA (Beispiel I.A.1.) als Matrize synthetisiert und mit Oligo (dT)_12–18 (Collaborative Research Inc., Bedford, MA) als Primer behandelt. Die einzelsträngige cDNA wurde in doppelsträngige cDNA überführt und die Ausbeute betrug ungefähr 2 μg. EcoRI-Adapter:
5'-AATTCGGTACGTACACTCGAGC-3' = 22-mer (SEQ-ID-Nr. 15)
3'-GCCATGCATGTGAGCTCG-5' = 18-mer (SEQ-ID-Nr. 16)
welche ebenfalls SnaBI- und XhoI-Restriktionsstellen enthielten, wurden dann gemäß dem folgenden Verfahren der doppelsträngigen cDNA hinzugefügt.
a. Phosphorylierung des 18-mers
Das 18-mer wurde unter Anwendung von Standardverfahren phosphoryliert [siehe z. B. Sambrook et al. (1989) in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 8], indem das 18-mer (225 pMol) mit [³²P]-γ-ATP (7000 Ci/mMol; 1,0 μl) und Kinase (2 E) in 10 μl Gesamtvolumen vereinigt und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden 1 μl 10 mM ATP und zusätzliche 2 E Kinase zugegeben und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Kinase wurde dann durch Kochen für 10 Minuten inaktiviert.
b. Hybridisierung des 22-mers
Das 22-mer wurde durch Zugabe von 225 pMol des 22-mers (plus Wasser, um das Volumen auf 15 μl zu bringen) zu dem phosphorylierten 18-mer und durch Inkubation bei 65°C für 5 Minuten hybridisiert. Das Reaktionsgemisch ließ man dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen.
Die Adapter waren somit in einer Konzentration von 15 pMol/μl vorhanden und für eine cDNA-Adapter-Ligierung bereit.
c. Ligierung der Adapter an cDNA
Nachdem die EcoRI- SnaBI-, XhoI-Adapter unter Verwendung eines Standardprotokolls [siehe z. B. Sambrook et al. (1989) in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 8] an die doppelsträngige cDNA ligiert worden waren, wurde die Ligase durch Erwärmen des Gemisches auf 72°C für 15 Minuten inaktiviert. Die folgenden Reagenzien wurden zu der cDNA-Ligierungsreaktion zugegeben und für 30 Minuten auf 37°C erwärmt: cDNA-Ligierungsreaktionsmischung (20 μl), Wasser (24 μl), 10 × Kinasepuffer (3 μl), 10 mM ATP (1 μl) und Kinase (2 μl von 2 E/μl). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 μl 0,5 M EDTA gestoppt, gefolgt von einer Phenol/Chloroform-Extraktion und einer Chloroformextraktion.
d. Größenselektion und Verpackung von cDNA
Die mit den EcoRI-, SnaBI-, XhoI-Adaptern ligierte doppelsträngige cDNA wurde von den freien oder nicht ligierten Adaptern unter Verwendung einer Sepharose CL-4B-Säule (Sigma, St. Louis, MO) von 5 ml gereinigt. 100-μl-Fraktionen wurden gesammelt und diejenigen, welche die cDNA enthielten, wie bestimmt durch Überwachung der Radioaktivität, wurden vereinigt, ethanolgefällt, in TE-Puffer resuspendiert und auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt und die Fraktion von 1 bis 3 kb wurde aus dem Gel ausgeschnitten. Die in der Agarose eingebettete cDNA wurde unter Verwendung des „Geneluter Electroelution System" (Invitrogen, San Diego, CA) eluiert. Die eluierte cDNA wurde mittels Ethanolfällung gesammelt und in TE-Puffer bei 0,10 pMol/μl resuspendiert. Die cDNA wurde mit 1 μg EcoRI-verdautem dephosphoryliertem λgt11 in einem 5-μl-Reaktionsvolumen bei einem 2- bis 4-fachen molaren Überschußverhältnis von cDNA gegenüber dem λgt11-Vektor ligiert. Der ligierte, das cDNA-Insert enthaltende λgt11 wurde in λ-Phagenvirionen unter Verwendung des Gigapack-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) in vitro verpackt. Die verpackten Phagen wurden als Vorbereitung für das Screening auf einen bakteriellen Rasen von E. coli Y1088 ausplattiert.
2. IMR32-cDNA-Bank #2
Diese Bank wurde wie beschrieben hergestellt (Beispiel I.B.1.), außer dass cDNA-Fragmente von 3 bis 9 kb anstelle der Fragmente von 1 bis 3 kb in den λgt11-Phagenvektor ligiert wurden.
3. IMR32-cDNA-Bank #3
Poly(A⁺)-RNA aus IMR32-Zellen (Beispiel I.A.1.) wurde als Matrize zur Synthese einzelsträngiger cDNA verwendet. Die Primer für die Erststrang-cDNA-Synthese waren statistische Primer (Hexadesoxynukleotide [pd(N)₆] Kat. #5020-1, Clontech, Palo Alto, CA). Die doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert (Beispiel I.B.1.), EcoRI-, SnaBI-, XhoI-Adapter wurden der cDNA hinzugefügt (Beispiel I.B.1.), die unligierten Adapter wurden entfernt (Beispiel I.B.1.) und die doppelsträngige cDNA mit den ligierten Adaptern wurde auf einem Agarosegel fraktioniert (Beispiel I.B.1.). Die cDNA-Fraktion mit einer Größe von mehr als 1,8 kb wurde aus der Agarose eluiert (Beispiel I.B.1.), in λgt11 ligiert, verpackt und auf einen bakteriellen Rasen von Y1088 ausplattiert (Beispiel I.B.1.).
4. IMR32-cDNA-Bank #4
Poly(A⁺)-RNA aus IMR32-Zellen (Beispiel I.A.1.) wurde als Templat zur Synthese einzelsträngiger cDNA verwendet. Die Primer für die Erststrang-cDNA-Synthese waren Oligonukleotide: 89–365a, spezifisch für die Kodierungssequenz der α₁-Untereinheit vom α_1D (VDCC III)-Typ (siehe Beispiel II.A.) (die Komplementärsequenz von Nt. 2927 bis 2956, SEQ-ID-Nr. 1); 89–495, spezifisch für die Kodierungssequenz der α₁-Untereinheit vom α_1C (VDCC II)-Typ (siehe Beispiel II.B) (die Komplementärsequenz von Nt. 852 bis 873, SEQ-ID-Nr. 3); und 90–12, spezifisch für die Kodierungssequenz der α_1C-Untereinheit (die Komplementärsequenz von Nt. 2496 bis 2520, SEQ-ID-Nr. 3). Die cDNA-Bank wurde dann wie beschrieben erstellt (Beispiel I.B.3), mit der Ausnahme, dass anstelle der Fraktion von mehr als 1,8 kb die cDNA-Größenfraktion von mehr als 1,5 kb aus dem Agarosegel eluiert wurde.
5. IMR32-cDNA-Bank #5
Die cDNA-Bank wurde wie beschrieben erstellt (Beispiel I.B.3.), mit der Ausnahme, dass anstelle der Fraktion von mehr als 1,8 kb die Größenfraktion von mehr als 1,2 kb aus der Agarose eluiert wurde.
6. Human-Thalamus-cDNA-Bank #6
Poly (A⁺)-RNA aus humanem Thalamus (Beispiel I.A.2.) wurde als Matrize zur Synthese einzelsträngiger cDNA verwendet. Oligo(dT) wurde zum Primen der Erststrang-Synthese verwendet (Beispiel I.B.1.). Die doppelsträngige cDNA wurde synthetisiert (Beispiel I.B.1) und EcoRI-, KpnI-, NcoI-Adapter der folgenden Sequenz:
5' CCATGGTACCTTCGTTGACG 3' = 20 mer (SEQ-ID-NR. 17)
3' GGTACCATGGAAGCAACTGCTTAA 5' = 24 mer (SEQ-ID-NR. 18)
wurden mit der doppelsträngigen cDNA wie beschrieben (Beispiel I.B.1.) ligiert, wobei das 20-mer das 18-mer ersetzte und das 24-mer das 22-mer ersetzte. Die unligierten Adapter wurden durch Passieren des cDNA-Adapter-Gemischs durch eine BioGel A-50-Säule (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA.) von 1 ml entfernt. Es wurden Fraktionen (30 μl) gesammelt, und 1 μl jeder Fraktion im ersten Radioaktivitätspeak wurde auf einem 1%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf einem Vakuumgeltrockner getrocknet und damit ein Röntgenfilm belichtet. Die Fraktionen, die cDNA-Fragmente mit mehr als 600 bp enthielten, wurden vereinigt, ethanolgefällt und in λgt11 ligiert (Beispiel I.B.1.). Die Erstellung der cDNA-Bank wurde wie beschrieben durchgeführt (Beispiel I.B.1.).
C. Hybridisierungs- und Waschbedingungen
Die Hybridisierung von radiomarkierten Nukleinsäuren mit immobilisierter DNA für das Screenen von cDNA-Banken, DNA-Southern-Übertragungen oder Northern-Übertragungen wurde routinemäßig unter Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt [5 × SSPE, 5 × Denhardts, 50% entionisiertes Formamid, 200 μg/ml ultraschall-behandelte Heringssperma-DNA (Kat. #223646, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)]. Die Rezepte für SSPE und Denhardts und die Herstellung von entionisiertem Formamid sind beispielsweise in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 8 beschrieben. Bei einigen Hybridisierungen wurden Bedingungen geringerer Stringenz verwendet, wobei 10%iges entionisiertes Formamid das für die Standardhybridisierungsbedingungen beschriebene 50%ige entionisierte Formamid ersetzte.
Die Waschbedingungen zum Entfernen der unspezifischen Sonde von den Filtern waren entweder hohe, mittlere oder niedrige Stringenz wie unten beschrieben:

1) hohe Stringenz: 0,1 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C
2) mittlere Stringenz: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
3) niedrige Stringenz: 1,0 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C.

Es versteht sich, dass äquivalente Stringenzbedingungen unter Verwendung von alternativen Puffern, Salzen und Temperaturen erzielt werden können.
Beispiel II: ISOLIERUNG VON DNA, WELCHE FÜR DIE α₁-UNTEREINHEIT DES HUMANEN NEURONALEN CALCIUMKANALS KODIERT
A. Isolierung von DNA, welche für die α_1D-Untereinheit kodiert
1. Referenzliste partieller α_1D-cDNA-Klone
Es wurden viele α_1D-spezifische cDNA-Klone isoliert, um die vollständige α_1D-Kodierungssequenz plus Teile der 5'- und 3'-untranslatierten Sequenzen zu charakterisieren, SEQ-ID-Nr. 1 zeigt die vollständige α_1D-DNA-Kodierungssequenz plus 510 Nukleotide der 5'-untranslatierten Sequenz von α_1D, die mit dem Guanidinnukleotid neben dem Adeninnukleotid der vermuteten Translationsstartstelle endet, sowie 642 Nukleotide der 3'-untranslatierten Sequenz. Ebenfalls in SEQ-ID-Nr. 1 gezeigt ist die abgeleitete Aminosäuresequenz. Eine Liste der partiellen cDNA-Klone, die zur Charakterisierung der α_1D-Sequenz verwendet wurden, sowie die Nukleotidposition jedes Klons relativ zur vollständigen a_1D-cDNA-Sequenz, welche in SEQ-ID-Nr. 1 angegeben ist, ist unten gezeigt. Die Isolierung und Charakterisierung dieser Klone ist unten beschrieben (Beispiel II.A.2.).
2. Isolierung und Charakterisierung von in Beispiel II.A.1. aufgelisteten individuellen Klonen
a. IMR32 1.36
Zwei Millionen Rekombinante der IMR32-cDNA Bank #1 (Beispiel I.B.1.) wurden in einer Dichte von ungefähr 200.000 Plaques pro 150-mm-Platte unter Verwendung eines Gemischs radiomarkierter Fragmente der Kodierungsregion der α₁-cDNA für den Calciumkanal aus Kaninchenskelettmuskel doppelt gescreent [hinsichtlich der Sequenz der Calciumkanal-α₁-Untereinheits-cDNA aus Kaninchenskelettmuskel siehe Tanabe et al. (1987), Nature 328: 313–318]:

Fragment Nukleotide

KpnI-EcoRI –78 bis 1006

EcoRI-XhoI 1006 bis 2653

ApaI-ApaI 3093 bis 4182

BglII-SacI 4487 bis 5310
Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurde aus den 2 × 10⁶ gescreenten nur eine einzige α_1D-spezifische Rekombinante identifiziert (IMR32 1.36). IMR32 1.36 wurde unter Anwendung von Standardmethoden [J. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kapitel 8] plaquegereinigt, in pGEM3 (Promega, Madison, WI) subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert.
b. IMR32 1.80
Ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten aus der IMR32-cDNA-Bank #2 (Beispiel I.B.2.) wurden in einer Dichte von ungefähr 100.000 Plaques pro 150-mm-Platte unter Verwendung des IMR32 1.36-cDNA-Fragments (Beispiel II.A.1.) als Sonde doppelt gescreent. Es wurden Standardhybridisierungsbedingungen verwendet (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Drei positive Plaques wurden identifiziert, von denen einer IMR32 1.80 war. IMR32 1.80 wurde mittels Standardverfahren plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert.
c. IMR32 1.144
Ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #3 (Beispiel I.B.3.) wurden mit dem EcoRI-PvuII-Fragment (Nt. 2083 bis 2518, SEQ-ID-Nr. 1) aus IMR32 1.80 gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel IC.) durchgeführt und die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden drei positive Plaques identifiziert, von denen einer IMR32 1.144 war. IMR32 1.144 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert und das cDNA-Insert wurde in pGEM7Z (Promega, Madison, WI) subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Diese Charakterisierung zeigte, dass IMR32 1.144 eine Serie von ATG-Codons aufweist, die für sieben mögliche Startmethionine kodieren (Nt. 511 bis 531, SEQ-ID-Nr. 1). Die PCR-Analyse und DNA-Sequenzierung klonierter PCR-Produkte, die für diese sieben ATG-Codons kodierten, bestätigte, dass diese Sequenz in dem in dbcAMP-induzierten IMR32-Zellen exprimierten α_1D-Transkript vorhanden ist.
d. IMR32 1.136
Ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #4 (Beispiel I.B.4.) wurden mit dem EcoRI-PvuII-Fragment (Nt. 2083 bis 2518, SEQ-ID-Nr. 1) von IMR32 1.80 (Beispiel II.A.1.) gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.) durchgeführt, und die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden sechs positive Plaques identifiziert, von denen einer IMR32 1.136 war. IMR32 1.136 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert, und das cDNA-Insert wurde in einen Standardplasmidvektor, pSP72 (Promega, Madison, WI), subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Diese Charakterisierung zeigte, dass IMR32 1.136 für ein unvollständig gespleißtes α_1D-Transkript kodiert. Der Klon enthält die Nukleotide 1627 bis 2988 von SEQ-ID-Nr. 1 im Anschluß an ein ungefähr 640 bp langes Intron. Vor diesem Intron befindet sich dann ein 104 Nt. langes Exon (SEQ-ID-Nr. 2), welches ein alternatives Exon darstellt, das für die IS6-Transmembrandomäne [siehe z. B. Tanabe et al. (1987), Nature 328: 313–318 hinsichtlich einer Beschreibung der Transmembranterminologie IS1 bis IVS6) der α_1D-Untereinheit kodiert, und kann Nt. 1627 bis 1730, SEQ-ID-Nr. 1, ersetzen, um ein vollständig gespleißtes α_1D-Transkript zu ergeben.
e. IMR32 1.163
Ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #3 (Beispiel I.B.3.) wurden mit dem NcoI-XhoI-Fragment von IMR32 1.80 (Beispiel II.A.1.), welches Nt. 5811 bis 6468 (SEQ-ID-Nr. 1) enthält, gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden drei positive Plaques identifiziert, von denen einer IMR32 1.163 war. IMR32 1.163 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert, und das cDNA-Insert wurde in einen Standardplasmidvektor, pSP72 (Promega, Madison, WI), subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Diese Charakterisierung zeigte, dass IMR32 1.163 das α_1D-Terminationscodon enthält, Nt. 6994 bis 6996 (SEQ-ID-Nr. 1).
3. Konstruktion einer vollständigen α_1D-cDNA [pVDCCIII(A)]
Die α_1D-cDNA-Klone IMR32 1.144, IMR32 1.136, IMR32 1.80 und IMR32 1.163 (Beispiel II.A.2.) überlappen und umfassen die gesamte α_1D-Kodierungssequenz, Nt. 511 bis 6993 (SEQ-ID-Nr. 1) mit der Ausnahme einer 148-bp-Deletion, Nt. 2984 bis 3131 (SEQ-ID-Nr. 1). Teile dieser partiellen cDNA-Klone wurden ligiert, um eine vollständige α_1D-cDNA in einem eukaryotischen Expressionsvektor zu erzeugen. Der resultierende Vektor wurde als pVDCCIII(A) bezeichnet. Die Konstruktion von pVDCCIII(A) wurde in vier Schritten, wie unten detailliert beschrieben, durchgeführt: (1) Konstruktion von pVDCCIII/5' unter Verwendung von Abschnitten von IMR32 1.144, IMR32 1.136 und IMR32 1.80, (2) die Konstruktion von pVDCCIII/5'.3, welches die 148-Nt.-Deletion in dem IMR32 1.80-Abschnitt von pVDCCIII/5' korrigiert, (3) die Konstruktion von pVDCCIII/3'.1 unter Verwendung von Abschnitten von IMR32 1.80 und IMR32 1.163 und (4) die Ligierung eines Abschnitts des pVDCCIII/5'.3-Inserts, des Inserts von pVDCCIII/3'.1 und pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), um pVDCCIII(A) zu bilden. Der Vektor pcDNA1 ist ein eukaryotischer Expressionsvektor, der einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor enthält, welcher ein von der RNA-Polymerase II in Säugerwirtszellen erkannter konstitutiver Promotor ist.
Jedes der zur Herstellung des vollständigen Konstrukts verwendeten DNA-Fragmente wurde mittels Elektrophorese durch ein Agarosegel auf DE81-Filterpapier (Whatman, Clifton, NJ) und Elution von dem Filterpapier unter Verwendung von 1,0 M NaCl, 10 mM TRIS, pH 8,0, 1 mM EDTA gereinigt. Die Ligierungen wurden typischerweise in einem 10-μl-Reaktionsvolumen mit einem gleichen Molverhältnis von Insert-Fragment und einem zweifachen molaren Überschuß des Gesamtinserts bezogen auf den Vektor durchgeführt. Die verwendete DNA-Menge betrug normalerweise ungefähr 50 ng bis 100 ng.
a. pVDCCIII/5'
Zur Konstruktion von pVDCCIII/5' wurde IMR32 1.144 (Beispiel II.A.2.c.) mit XhoI und EcoRI verdaut und das Fragment, welches den Vektor (pGEM7Z), α_1D-Nt. 1 bis 510 (SEQ-ID-Nr. 1) und α_1D-Nt. 511 bis 1732 (SEQ-ID-Nr. 1) enthielt, wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Das EcoRI-ApaI-Fragment von IMR32 1.136 (Beispiel II.A.2.d.), Nukleotide 1732 bis 2667 (SEQ-ID-Nr. 1), und das ApaI-HindIII-Fragment von IMR32 1.80 (Beispiel II.A.2.b.), Nukleotide 2667 bis 4492 (SEQ-ID-Nr. 1), wurden isoliert. Die drei DNA-Klone wurden ligiert, um pVDCCIII/5' zu bilden, der Nt. 1 bis 510 (5'-untranslatierte Sequenz; SEQ-ID-Nr. 1) und Nt. 511 bis 4492 (SEQ-ID-Nr. 1) enthielt.
b. pVDCCIII/5'.3
Ein Vergleich der IMR32 1.36- und IMR32 1.80-DNA-Sequenzen zeigte, dass diese beiden cDNA-Klone sich in ihrer α_1D-Kodierungssequenz, Nukleotide 2984 bis 3212, unterscheiden. Die PCR-Analyse von IMR32 1.80-RNA und dbcAMP-induzierter (1,0 mM, 10 Tage) zytoplasmatischer IMR32-RNA (gemäß Ausubel, F. M., et al. (Hrsg.) (1988), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York) isoliert) zeigte, dass IMR32 1.80 eine 148 Nukleotide lange Deletion aufwies, Nt. 2984 bis 3131 (SEQ-ID-Nr. 1), und dass IMR32 1.36 eine 132 Nt. lange Deletion aufwies, Nt. 3081 bis 3212. Zur Durchführung der PCR-Analyse wurde eine Amplifizierung mit den α_1D-spezifischen Oligonukleotiden 112 (Nukleotide 2548 bis 2572, SEQ-ID-Nr. 1) und 311 (die Komplementärsequenz von Nt. 3928 bis 3957, SEQ-ID-Nr. 1) als Primer initiiert. Diese Produkte wurden dann unter Verwendung der α_1D-spezifischen Oligonukleotide 310 (Nt. 2583 bis 2608, SEQ-ID-Nr. 1) und 312 (die Komplementärsequenz von Nt. 3883 bis 3909) reamplifiziert. Diese reamplifizierte Produkt, welches AccI- und BglII-Restriktionsstellen enthält, wurde mit AccI und BglII verdaut und das AccI-BglII-Fragment, Nt. 2764 bis 3890 (SEQ-ID-Nr. 1), wurde in den mit AccI-BglII verdauten pVDCCIII/5' kloniert, um das AccI-BglII-Fragment aus pVDCCII/5', welches die Deletion enthielt, zu ersetzen. Dieses neue Konstrukt wurde pvDCCIII/5'.3 genannt. Eine DNA-Sequenzbestimmung von pVDCCIII/5'.3 über die amplifizierte Region bestätigte die 148-Nt.-Deletion in IMR32 1.80.
c. pVDCCIII/3'.1
Zur Konstruktion von pVDCCIII/3'.1 wurde das cDNA-Insert von IMR32 1.163 (Beispiel II.A.2.e.) als XhoI-Fragment in pBluescript II (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert. Die XhoI-Stellen auf dem cDNA-Fragment wurden von den Adaptern geliefert, die zur Konstruktion der cDNA-Bank verwendet worden waren (I.B.3.). Das Insert war so orientiert, dass die Translationsorientierung des Inserts von IRM32 1.163 zu derjenigen des in dem Plasmid vorlie genden lacZ-Gens entgegengesetzt war, wie durch Analyse von Restriktionsenzymverdauen des resultierenden Plasmids bestätigt wurde. Dies erfolgte, um die Möglichkeit einer Expression von α_1D-Sequenzen in DH5α-Zellen, die mit diesem Plasmid transformiert waren, aufgrund von Fusion mit dem lacZ-Gen auszuschließen. Dieses Plasmid wurde dann mit HindIII und BglII verdaut, und das HindIII-BglII-Fragment (die HindIII-Stelle stammt aus dem Vektor und BglII-Stelle findet sich bei Nt. 6220, SEQ-ID-Nr. 1) wurde eliminiert, wobei Nt. 5200 bis 6220 (SEQ-ID-Nr. 1) des IMR32 1.163-Klons deletiert wurden und diese Sequenz aus dem Restplasmid entfernt wurde, welches das 3'-BglII-XhoI-Fragment, Nt. 6220 bis 7635 (SEQ-ID-Nr. 1), enthielt. pVDCCIII/3'.1 wurde dann hergestellt, indem das HindIII-PvuII-Fragment aus IMR32 1.80 (Nukleotide 4492 – 5294, SEQ-ID-Nr. 1), das PvuII-BglII-Fragment aus IMR32 1.163 (Nukleotide 5294 bis 6220, SEQ-ID-Nr. 1) und das HindIII-BglII-verdaute pBluescript-Plasmid, welches das 3'-BglII/XhoI-IMR32 1.163-Fragment (Nt. 6220 bis 7635, SEQ-ID-Nr. 1) enthielt, zusammengespleißt wurden.
d. pVDCCIII(A): Das vollständige α_1D-Konstrukt
Zur Konstruktion von pVDCCIII(A) wurde das DraI-HindIII-Fragment (5'-untranslatierte Sequenz, Nt. 327 bis 510, SEQ-ID-Nr. 1, und kodierende Sequenz, Nt. 511 bis 4492, SEQ-ID-Nr. 1) aus pVDCCIII/5'.3 (Beispiel II.A.3.b.) isoliert; das HindIII-XhoI-Fragment von pVDCCIII/3'.1 (enthaltend Nt. 4492 bis 7635, SEQ-ID-Nr. 1, plus die XhoI-Stelle des Adapters) (Beispiel II.A.3.c.) wurde isoliert; und der Plasmidvektor, pcDNA1, wurde mit EcoRV und XhoI verdaut und auf einem Agarosegel isoliert. Die drei DNA-Fragmente wurden ligiert und es wurde MC1061-P3 (Invitrogen, San Diego, CA) transformiert. Die isolierten Klone wurden durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung analysiert und es wurde pVDCCIII(A) identifiziert, welcher die korrekt zusammenligierten Fragmente aufwies: DraI-HindIII, HindIII-XhoI, XhoI-EcoRV, wobei die glattendigen DraI- und EcoRV-Stellen zusammenligiert wurden, um das zirkuläre Plasmid zu ergeben.
Der Aminoterminus der α_1D-Untereinheit wird von sieben aufeinanderfolgenden 5'-Methionincodons (Nt. 511 bis 531, SEQ-ID-Nr. 1) kodiert. Dieser 5'-Abschnitt plus Nt. 532 bis 537, die für zwei Lysinreste kodieren, wurde aus pVDCCIII(A) deletiert und durch eine effiziente Ribosomenbindungsstelle (5'-ACCACC-3') ersetzt, um pVDCCIII.RBS(A) zu bilden. Expressionsexperimente, in denen Transkripte dieses Konstrukts in Oozyten aus Xenopus laevis injiziert wurden, führten nicht zu einer Erhöhung des Expressionsniveaus von rekombinanten spannungsabhängigen Calciumkanälen gegenüber dem Expressionsniveau in Oozyten, denen Transkripte von pVDCCIII(A) injiziert worden waren.
B. Isolierung von DNA, die für die α_1C-Untereinheit kodiert
1. Referenzliste von partiellen α_1CcDNA-Klonen
Es wurden zahlreiche α_1C-spezifische cDNA-Klone isoliert, um die α_1C-kodierende Sequenz, die α_1C-Translationsinitiierung und eine alternativ gespleißte Region von α_1C zu charakterisieren. SEQ-ID-Nr. 3 gibt die charakterisierte α_1C-Kodierungssequenz (Nt. 1 bis 5904) sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz an. SEQ-ID-Nr. 4 und 5 kodieren für zwei mögliche aminoterminale Enden des α_1C-Proteins. SEQ-ID-Nr. 6 kodiert für ein alternatives Exon für die IV S3-Transmembrandomäne. Unten ist eine Liste von Klonen dargestellt, die zur Charakterisierung der α_1C-Sequenz verwendet wurden, sowie die Nukleotidposition jedes Klons bezüglich der charakterisierten α_1C-Sequenz (SEQ-ID-Nr. 3). Die Isolierung und Charakterisierung dieser cDNA-Klone ist unten beschrieben (Beispiel II.B.2.).
2. Isolierung und Charakterisierung von in Beispiel II.B.1. beschriebenen Klonen
a. ZNS 1.30
Es wurden ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten der cDNA-Bank Nr. 6 des humanen Thalamus (Beispiel I.B.6.) mit Fragmenten der in Beispiel II.A.2.a. beschriebenen α₁-cDNA des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden sechs positive Plaques identifiziert, von denen einer ZNS 1.30 war. ZNS 1.30 wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. ZNS 1.30 kodiert für eine α_1C-spezifische Sequenz von Nt. 2199 bis 3903 (SEQ-ID-Nr. 3), gefolgt von Nt. 1 bis 84 eines der zwei identifizierten alternativen α_1C-Exons (SEQ-ID-Nr. 6). 3' von SEQ-ID-Nr. 6 enthält ZNS 1.30 ein Intron und ZNS 1.30 kodiert somit für ein teilweise gespleißtes α_1C-Transkript.
b. 1.16G
Es wurden ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten einer humanen genomischen DNA-Bank auf λEMBL3-Basis (Kat. # HL1006d Clontech Corp., Palo Alto, CA) unter Verwendung eines cDNA-Fragments (Nt. –78 bis 1006, Beispiel II.A.2.a.) aus Kaninchenskelettmuskel gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.) Es wurden vierzehn positive Plaques identifiziert, von denen einer 1.16G war. Klon 1.16G wurde plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und Abschnitte wurden durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Die DNA-Sequenzierung zeigte, dass 1.16G für eine α_1C-spezifische Sequenz kodiert, wie beschrieben in Beispiel II.B.1.
c. IMR32 1.66 und IMR32 1.67
Es wurden ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #5 (Beispiel I.B.5.) mit einem 151-bp-KpnI-SacI-Fragment aus 1.16G (Beispiel II.B.2.b.), welches für die α_1C-Sequenz kodiert (Nt. 758 bis 867, SEQ-ID-Nr. 3), gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.). Die Filter wurden dann bei 65°C in 0,5 × SSPE gewaschen. Von den positiven Plaques wurden IMR32 1.66 und IMR32 1.67 identifiziert. Die hybridisierenden Plaques wurden gereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Zwei dieser cDNA-Klone, IMR32 1.66 und 1.67, kodieren für α_1C-Untereinheiten wie beschrieben (Beispiel II.B.1.). Zusätzlich kodiert IMR32 1.66 für ein teilweise gespleißtes α_1C-Transkript, welches durch ein GT-Spleißdonor-Dinukleotid, beginnend an dem Nukleotid 3' von Nt. 916 (SEQ-ID-Nr. 3), gekennzeichnet ist. Die Intronsequenz innerhalb von 1.66 ist 101 Nt. lang. IMR32 1.66 kodiert für den α_1C-Translationsstart, Nt. 1 bis 3 (SEQ-ID-Nr. 3), und vor dem Startcodon in IMR32 1.66 befinden sich 132 Nt. der 5'-untranslatierten Sequenz (SEQ-ID-Nr. 4).
d. IMR32 1.37 und IMR32 1.38
Es wurden ungefähr 2 × 10⁶ Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #1 (Beispiel I.B.1.) mit den ZNS 1.30-cDNA-Fragment (Beispiel II.B.2.a.) gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz durchgeführt (Beispiel I.C.) und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden vier positive Plaques identifiziert, plaquegereinigt, restriktionskartiert, subkloniert und durch DNA- Sequenzierung charakterisiert. Zwei der Klone, IMR32 1.37 und IMR32 1.38, kodieren für α_1C-spezifische Sequenzen wie in Beispiel II.B.1. beschrieben.
Der DNA-Sequenzvergleich von IMR32 1.37 und IMR32 1.38 zeigte, dass das α_1C-Transkript zwei Exons umfaßt, welche für die IVS3-Transmembrandomäne kodieren. IMR32 1.37 weist ein einziges Exon auf, Nt. 3904 bis 3987 (SEQ-ID-Nr. 3), und IMR32 1.38 scheint anomal gespleißt zu sein und beide Exons nebeneinander aufzuweisen, Nt. 3904 bis 3987 (SEQ-ID-Nr. 3), gefolgt von Nt. 1 bis 84 (SEQ-ID-Nr. 6). Das alternative Spleißen des α_1C-Transkripts, um eines der beiden Exons, die für die IVS3-Region kodieren, zu enthalten, wurde durch Vergleich der ZNS 1.30-Sequenz mit der IMR32 1.37-Sequenz bestätigt. ZNS 1.30 enthält Nt. 1 bis 84 (SEQ-ID-Nr. 6), denen die identische Sequenz, die in IMR32 1.37 für Nt. 2199 bis 3903 (SEQ-ID-Nr. 3) enthalten ist, vorangeht. Wie im Beispiel II.B.2.a. beschrieben, folgt auf Nt. 1 bis 84 (SEQ-ID-Nr. 6) ein Intron. Zwei alternative Exons wurden neben Nt. 3903 (SEQ-ID-Nr. 3) gespleißt, repräsentiert durch ZNS 1.30 und IMR32 1.37.
e. IMR32 1.86
Es wurde die IMR32-cDNA-Bank #1 (Beispiel I.B.1.) unter Verwendung der Oligonukleotidsonden 90-9 (Nt. 1462 bis 1491, SEQ-ID-Nr. 3) und 90-12 (Nt. 2496 bis 2520, SEQ-ID-Nr. 3) zweifach gescreent. Diese Oligonukleotidsonden wurden gewählt, um einen Klon zu isolieren, welcher für die α_1C-Untereinheit zwischen dem 3'-Ende von IMR32 1.67 (Nt. 1717, SEQ-ID-Nr. 3) und dem 5'-Ende von ZNS 1.30 (Nt. 2199, SEQ-ID-Nr. 3) kodiert. Die Hybridisierungsbedingungen waren Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.), außer dass das 50%ige entionisierte Formamid auf 20%ig verringert wurde. Die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Es wurden drei positive Plaques identifiziert, von denen einer IMR32 1.86 war. IMR32 1.86 wurde plaquegereinigt, subkloniert und durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert. IMR32 1.86 kodiert für α_1C-Sequenzen wie im Beispiel II.B.1. beschrieben. Die Charakterisierung durch DNA-Sequenzierung zeigte, dass IMR32 1.86 eine 73-Nt.-Deletion im Vergleich mit der DNA, die für die α₁-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenherzmuskel kodiert, aufweist [Mikami et al. (1989), Nature 340: 230], Nt. 2191 bis 2263. Diese fehlenden Nukleotide entsprechen Nt. 2176 bis 2248 von SEQ-ID-Nr. 3. Da das 5'-Ende von ZNS 1.30 mit dem 3'-Ende von IMR32 1.86 überlappt, sind einige dieser fehlenden Nukleotide, d. h. Nt. 2205 bis 2248 von SEQ-ID-Nr. 3, auf ZNS 1.30 zurückzuführen. Die verbleibenden fehlenden Nukleotide der 73-Nt.-Deletion in IMR32 1.86 (d. h. Nt. 2176 bis 2204, SEQ-ID-Nr. 3) wurden durch PCR-Analyse von RNA aus dbcAMP-induzierten IMR32-Zellen bestimmt. Die 73-Nt.-Deletion ist eine Frameshift-Mutation (Mutation, die zur Verschiebung des Leserahmens führt) und muß daher korrigiert werden. Die exakte humane Sequenz dieser Region (die durch die DNA-Sequenz von ZNS 1.30 und PCR-Analyse der RNA aus IMR32-Zellen bestimmt worden war) kann gemäß Standardverfahren, beispielsweise Ersetzen eines Restriktionsfragments oder stellengerichtete Mutagenese, in IMR32 1.86 inseriert werden.
f. IMR32 1.157
Es wurden eine Million Rekombinanten der IMR32-cDNA-Bank #4 (Beispiel I.B.4.) mit einem XhoI-EcoRI-Fragment von IMR32 1.67, welches für α_1C-Nt. 50 bis 774 (SEQ-ID-Nr. 3) kodiert, gescreent. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen durchgeführt (Beispiel I.C.). Die Filter wurden bei hoher Stringenz gewaschen (Beispiel I.C.). Einer der identifizierten positiven Plaques war IMR32 1.157. Dieser Plaque wurde gereinigt, das Insert wurde restriktionskartiert und in einen Standardplasmidvektor, pGEM7Z (Promega, Madison, WI), subkloniert. Die DNA wurde durch Sequenzierung charakterisiert. IMR32 1.157 scheint für einen alternativen 5'-Abschnitt der α_1C-Sequenz, beginnend mit Nt. 1 bis 89 (SEQ-ID-Nr. 5) und gefolgt von Nt. 1 bis 873 (SEQ-ID-Nr. 3), zu kodieren. Die Analyse der 1.66- und 1.157-5'-Sequenz ist unten beschrieben (Beispiel II.B.3.).
3. Charakterisierung der Translationsstartstelle von α_1C
Abschnitte der Sequenzen von IMR32 1.157 (Nt. 57 bis 89, SEQ-ID-Nr. 5; Nt. 1 bis 67, SEQ-ID-Nr. 3), IMR32 1.66 (Nt. 100 bis 132, SEQ-ID-Nr. 4; Nt. 1 bis 67, SEQ-ID-Nr. 3) wurden mit der cDNA-Sequenz des CaCB-Rezeptors aus Kaninchenlunge, Nt. –33 bis 67 [Biel et al. (1990), FEBS Lett. 269: 409], verglichen. Die humanen Sequenzen sind mögliche alternative 5'-Enden des α_1C-Transkripts, welches für die Region des Translationsstarts kodiert. IMR32 1.66 stimmt mit der cDNA-Sequenz des CaCB-Rezeptors gut überein und weicht von der cDNA-Sequenz des CaCB-Rezeptors in der 5'-Richtung beginnend bei Nt. 122 (SEQ-ID-Nr. 4) ab. Das in der cDNA-Sequenz des CaCB-Rezeptors identifizierte Startcodon ist dasselbe Startcodon, welches zum Beschreiben der α_1C-Kodierungssequenz, Nt. 1 bis 3 (SEQ-ID-Nr. 3), verwendet wird. Die funktionelle Bedeutung der IMR32 1.157-Sequenz, Nt. 1 bis 89 (SEQ-ID-Nr. 5), ist nicht klar. Chimären, welche die Sequenz zwischen 1.157 und der α_1C-Kodierungssequenz enthalten, können konstruiert werden und funktionelle Unterschiede können getestet werden.
C. Isolierung von cDNA-Teilklonen, welche für die α_1B-Untereinheit kodieren, sowie Konstruktion eines vollständigen Klons
Eine humane Basalganglien-cDNA-Bank wurde mit den cDNA-Fragmenten der α₁-Untereinheit aus Kaninchenskelettmuskel (siehe Beispiel II.A.2.a. für eine Beschreibung der Fragmente) bei niedrigen Stringenzbedingungen gescreent. Einer der hybridisierenden Klone wurde verwendet, um eine cDNA-Bank aus IMR32-Zellen zu screenen, um zusätzliche α_1B-cDNA-Teilklone zu erhalten, welche wiederum zum weiteren Screenen einer cDNA-Bank aus IMR32-Zellen hinsichtlich zusätzlicher cDNA-Teilklone verwendet wurden. Einer der IMR32-α_1B-Teilklone wurde zum Screenen einer humanen Hippocampus-Bank verwendet, um einen α_1B-Teilklon zu erhalten, welcher für das 3'-Ende der α_1B-Kodierungssequenz kodiert. Die Sequenz einiger der Regionen der cDNA-Teilklone wurde mit der Sequenz der Produkte einer PCR-Analyse von RNA aus IMR32-Zellen verglichen, um die Genauigkeit der cDNA-Sequenzen zu bestimmen.
Die PCR-Analyse von RNA und genomischer DNA aus IMR32-Zellen unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die Sequenzen 5' und 3' des Stopcodons der für die α_1B-Untereinheit kodierenden DNA entsprechen, zeigte eine alternativ gespleißte, für α_1B kodierende mRNA in IMR32-Zellen. Dieses zweite mRNA-Produkt ist das Ergebnis differentiellen Spleißens des Transkripts für die α_1B-Untereinheit, um ein weiteres Exon zu umfassen, welches in der mRNA, die der anderen 3'-α_1B-cDNA-Sequenz entspricht, die ursprünglich isoliert wurde, nicht vorhanden ist. Um diese Spleißvarianten der α_1B-Untereinheit zu unterscheiden, wird die Untereinheit, die von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die der Form mit dem zusätzlichen Exon entspricht, als α_1B-1 (SEQ-ID-Nr. 7) bezeichnet, während die Untereinheit, die von einer DNA-Sequenz kodiert wird, die der Form ohne das zusätzliche Exon entspricht, als α_1B-2 (SEQ-ID-Nr. 8) bezeichnet wird. Die Sequenz von α_1B-1 weicht von derjenigen von α_1B-2 beginnend bei Nt. 6633 (SEQ-ID-Nr. 7) ab. Nach der Sequenz des zusätzlichen Exons in α_1B-1 (Nt. 6633 bis 6819; SEQ-ID-Nr. 7) sind die α_1B-1- und α_1B-2-Sequenzen identisch (d. h. Nt. 6820 bis 7362 in SEQ-ID-Nr. 7 und Nt. 6633 bis 7175 in SEQ-ID-Nr. 8). SEQ-ID-Nr. 7 und Nr. 8 geben 143 Nt. der 5'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1 bis 143) sowie 202 Nt. der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 7161 – 7362, SEQ-ID-Nr. 7) der DNA, welche für α_1B-1 kodiert, und 321 Nt. der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 6855 bis 7175, SEQ-ID-Nr. 8) der DNA, die für α_1B-2 kodiert, an.
Die PCR-Analyse der IS6-Region des α_1B-Transkripts offenbarte etwas, das aufgrund von beobachteten mehreren Fragmentgrößen auf einem mit Ethidiumbromid angefärbten Agarosegel, welches die Produkte der PCR-Reaktion enthielt, zusätzliche Spleißvarianten zu sein schien.
Ein vollständiger α_1B-1-cDNA-Klon, als pcDNA-α_1B-1 bezeichnet, wurde in einem achtschrittigen Verfahren wie folgt hergestellt.
SCHRITT 1: Die SacI-Restriktionsstelle von pGEM3 (Promega, Madison, WI) wurde durch Verdau an der SacI-Stelle zerstört, wobei durch Behandlung mit T4 DNA-Polymerase glatte Enden gebildet wurden, gefolgt von einer Religierung. Der neue Vektor wurde pGEMΔSac bezeichnet.
SCHRITT 2: Fragment 1 (HindIII/KpnI; Nt. 2337 bis 4303 von SEQ-ID-Nr. 7) wurde in den HindIII/KpnI-verdauten pGEMΔSac ligiert, um pα1.177HK zu ergeben.
SCHRITT 3: Fragment 1 hat eine Deletion von 2 Nukleotiden (Nt. 3852 und 3853 von SEQ ID Nr. 7). Die Deletion wurde durch Inserieren eines PCR-Fragments (Fragment 2) von IMR32-RNA in pα1.177HK repariert. Somit wurde Fragment 2 (NarI/KpnI; Nt. 3828 bis 4303 von SEQ-ID-Nr. 7) in den mit NarI/KpnI verdauten pα1.177HK inseriert, wobei der NarI/KpnI-Abschnitt von Fragment 1 ersetzt wurde und pα1.177HK/PCR erzeugt wurde.
SCHRITT 4: Fragment 3 (KpnI/KpnI; Nt. 4303 bis 5663 von SEQ-ID-Nr. 7) wurde in den mit KpnI verdauten pα1.177HK/PCR ligiert, um pα1B5'K zu ergeben.
SCHRITT 5: Fragment 4 (EcoRI/HindIII; EcoRI-Adapter plus Nt. 1 bis 2337 von SEQ-ID-Nr. 7) und Fragment 5 (HindIII/XhoI-Fragment von pα1B5'K; Nt. 2337 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7) wurden zusammen in den EcoRI/XhoI-verdauten pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert, um pα1B5' zu ergeben.
SCHRITT 6: Fragment 6 (EcoRI/EcoRI; EcoRI-Adapter an beiden Enden plus Nt. 5749 bis 7362 von SEQ-ID-Nr. 7) wurde in den EcoRI-verdauten pBluescript II KS (Stratagene, La Jolla, CA) mit dem 5'-Ende des Fragments proximal zur KpnI-Stelle im Polylinker ligiert, um pα1.230 zu ergeben.
SCHRITT 7: Fragment 7 (KpnI/XhoI; Nt. 4303 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7) und Fragment 8 (XhoI/CspI; Nt. 5446 bis 6259 von SEQ-ID-Nr. 7) wurden in den KpnI/CspI-verdauten pα1.230 (entfernt Nt. 5749 bis 6259 von SEQ-ID-Nr. 7, die in pα1.230 kodiert waren, und behält Nt. 6259 bis 7362 von SEQ-ID-Nr. 7) ligiert, um pα1B3' zu ergeben.
SCHRITT 8: Fragment 9 (SphI/XhoI; Nt. 4993 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7) und Fragment 10 (XhoI/XbaI von pα1B3'; Nt. 5446 bis 7319 von SEQ-ID-Nr. 7) wurden in den SphI/XbaI-verdauten pα1B5' (entfernt Nt. 4993 bis 5446 von SEQ-ID-Nr. 7, die in pα1B5' kodiert waren, und behält Nt. 1 bis 4850 von SEQ-ID-Nr. 7) ligiert, um pcDNAα_1B-1 zu ergeben.
Das resultierende Konstrukt, pcDNAα_1B-1, enthält in pcDNA1 eine vollständige Kodierungsregion, die für α_1B-1, (Nt. 144 bis 7362, SEQ-ID-Nr. 7) kodiert, plus 5'-untranslatierte Sequenz (Nt. 1 bis 143; SEQ-ID-Nr. 7) und 3'-untranslatierte Sequenz (Nt. 7161 bis 7319, SEQ-ID-Nr. 7) unter der transkriptionalen Kontrolle des CMV-Promotors.
BEISPIEL III: ISOLIERUNG VON cDNA-KLONEN, WELCHE FÜR DIE β₁-UNTEREINHEIT DES HUMANEN NEURONALEN CALCIUMKANALS KODIEREN
A. Isolierung von cDNA-Teilklonen, welche für die β-Untereinheit kodieren, und Konstruktion eines vollständigen Klons, welcher für die β₁-Untereinheit kodiert
Eine humane Hippocampus-cDNA-Bank wurde mit dem cDNA-Fragment der β₁-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel (Nt. 441 bis 1379) [zur Isolierung und Sequenz der β₁-Untereinheits-cDNA des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel siehe U.S. Patentanmeldung Serien-Nr. 482,384 oder Ruth et al. (1989), Science 245: 1115] unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.) gescreent. Ein Abschnitt eines der hybridisierenden Klone wurde zum erneuten Screenen der Hippocampus-Bank verwendet, um zusätzliche cDNA-Klone zu erhalten. Die cDNA-Inserts der hybridisierenden Klone wurden durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung charakterisiert und mit der cDNA-Sequenz der β₁-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel verglichen.
Abschnitte der partiellen cDNA-Klone der β₁-Untereinheit wurden ligiert, um einen vollständigen Klon zu erzeugen, welcher für die gesamte β₁-Untereinheit kodiert. SEQ-ID-Nr. 9 zeigt die β₁-Untereinheits-Kodierungssequenz (Nt. 1 bis 1434) sowie einen Abschnitt der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1435 bis 1546). Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist ebenfalls in SEQ-ID-Nr. 9 dargestellt. Um Expressionsexperimente durchzuführen, wurden vollständige cDNA-Klone der β₁-Untereinheit wie folgt konstruiert.
Schritt 1: DNA-Fragment 1 (~ 800 bp der 5'-untranslatierten Sequenz plus Nt. 1 bis 277 von SEQ-ID-Nr. 9) wurde mit DNA-Fragment 2 (Nt. 277 bis 1546 von SEQ-ID-Nr. 9 plus 448 bp Intronsequenz) ligiert und in pGEM7Z kloniert. Das resultierende Plasmid, pβ1-1.18, enthielt einen vollständigen β₁-Untereinheitsklon, welcher ein 448-bp-Intron umfaßte.
Schritt 2: Um die 5'-untranslatierte Sequenz von pβ1-1.18 durch eine Ribosomenbindungsstelle zu ersetzen, wurde ein doppelsträngiger Adapter synthetisiert, welcher eine EcoRI-Stelle, eine für eine Ribosomenbindungsstelle (5'-ACCACC-3') kodierende Sequenz und Nt. 1 bis 25 von SEQ-ID-Nr. 9 enthält. Der Adapter wurde mit dem SmaI-verdauten pβ1-1.18 ligiert und die Produkte der Ligierungsreaktion wurden mit EcoRI verdaut.
Schritt 3: Das EcoRI-Fragment aus Schritt 2, welches den EcoRI-Adapter, die effiziente Ribosomenbindungsstelle und Nt. 1 bis 1546 von SEQ-ID-Nr. 9 plus Intronsequenz enthält, wurde in einen Plasmidvektor kloniert und als pβ1-1.18RBS bezeichnet. Das EcoRI-Fragment von pβ1-1.18RBS wurde in mit EcoRI-verdauten pcDNA1 subkloniert, wobei das Startcodon proximal zum CMV-Promoter lag, um pHBCaCHβ_1aRBS(A) zu bilden.
Schritt 4: Zur Herstellung eines vollständigen Klons ohne Intronsequenz, welcher für die β₁-Untereinheit kodiert, wurde DNA-Fragment 3 (Nt. 69 bis 1146 von SEQ-ID-Nr. 9 plus 448 bp Intronsequenz, gefolgt von Nt. 1147 bis 1546 von SEQ-ID-Nr. 9) einer stellenspezifischen Mutagenese unterzogen, um die Intronsequenzzu deletieren, wobei pβ1(–) erhalten wurde. Das EcoRI-XhoI-Fragment von pβ1-1.18RBS (enthaltend die Ribosomenbindungsstelle und Nt. 1 bis 277 von SEQ-ID-Nr. 9) wurde mit dem XhoI-EcoRI-Fragment von pβ1(–) (enthaltend Nt. 277 bis 1546 von SEQ-ID-Nr. 9) ligiert und in pcDNA1 kloniert, wobei der Translationsstart proximal zum CMV-Promotor lag. Das resultierende Expressionsplasmid wurde als pHBCaCHβ_1bRBS(A) bezeichnet.
B. Spleißvariante β_1-3
Die DNA-Sequenz-Analyse der DNA-Klone, welche für die β₁-Untereinheit kodieren, zeigte, dass im Zentralnervensystem (ZNS) mindestens zwei alternativ gespleißte Formen desselben Primärtranskripts der humanen β₁-Untereinheit exprimiert werden. Eine Form wird durch die in SEQ-ID-Nr. 9 gezeigte Sequenz dargestellt und wird als β_1-2 bezeichnet. Die Sequenzen von β_1-2 und der alternativen Form β_1-3 weichen bei Nt. 1334 (SEQ-ID-Nr. 9). voneinander ab. Die vollständige β_1-3-Sequenz (Nt. 1 bis 1851), einschließlich einer 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1795 bis 1851), ist in SEQ-ID-Nr. 10 angegeben.
BEISPIEL IV: ISOLIERUNG VON cDNA-KLONEN, WELCHE FÜR DIE α₂-UNTEREINHEIT DES HUMANEN NEURONALEN CALCIUMKANALS KODIEREN
A. Isolierung von cDNA-Klonen
Die vollständige humane neuronale α₂-Kodierungssequenz (Nt. 35 bis 3307) plus ein Abschnitt der 5'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1 bis 34) sowie ein Abschnitt der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 3308 bis 3600) sind in SEQ-ID-Nr. 11 angegeben.
Zur Isolierung von DNA, welche für die humane neuronale α₂-Untereinheit kodiert, wurden zunächst humane genomische α₂-Klone durch Sondierung humaner genomischer Southernblots unter Verwendung eines cDNA-Fragments der α₂-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel [Nt. 43 bis 272, Ellis et al. (1988), Science 240: 1661] isoliert. Die humane genomische DNA wurde mit EcoRI verdaut, einer Elektrophorese unterzogen, geblottet und unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen (Beispiel I.C.) und Waschbedingungen niedriger Stringenz (Beispiel I.C.) mit der Kaninchenskelettmuskelsonde untersucht. Es wurden zwei Restriktionsfragmente identifiziert, 3,5 kb und 3,0 kb. Diese EcoRI-Restriktionsfragmente wurden durch Herstellung einer λgt11-Bank, welche humane genomische EcoRI-Fragmente im Bereich von 2,2 kb bis 4,3 kb enthält, kloniert. Die Bank wurde wie oben beschrieben unter Verwendung der Kaninchen-α₂-Sonde gescreent, hybridisierende Klone wurden isoliert und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. HGCaCHα2.20 enthielt das 3,5-kb-Fragment und HGCaCHα2.9 enthielt das 3,0-kb-Fragment.
Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung zeigte, dass HGCaCHα2.20 ein 82-bp-Exon (Nt. 130 bis 211 der humanen α₂-Kodierungssequenz, SEQ-ID-Nr. 11) auf einem 650-bp-PstI-XbaI-Restriktionsfragment enthält, und dass HGCaCHα2.9 150 bp eines Exons (Nt. 212 bis 316 der Kodierungssequenz, SEQ-ID-Nr. 11) auf einem 750-bp-XbaI-BglII-Restriktionsfragment enthält. Diese Restriktionsfragmente wurden verwendet, um die humane Basalganglien-cDNA-Bank (Beispiel II.C.2.a.) zu screenen. HBCaCHα2.1 wurde isoliert (Nt. 29 bis 1163, SEQ-ID-Nr. 11) und zum Screenen einer humanen Gehirnstamm-cDNA-Bank (ATCC Hinterlegungs-Nr. 37432), erhalten von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, zu screenen. Es wurden zwei Klone isoliert, HBCaCHα2.5 (Nt. 1 bis 1162, SEQ-ID-Nr. 11) und HBCaCHα2.8 (Nt. 714 bis 1562, SEQ-ID-Nr. 11, gefolgt von 1600 Nt. dazwischenliegender Sequenz). Ein 2400 bp langes Fragment von HBCaCHα2.8 (beginnend bei Nt. 759 von SEQ-ID-Nr. 11 und endend bei einer SmaI-Stelle im Intron) wurde verwendet, um die Hirnstamm-Bank noch einmal zu screenen und um HBCaCHα2.11 (Nt. 879 bis 3600, SEQ-ID-Nr. 11) zu isolieren. Die Klone HBCaCHα2.5 und HBCaCHα2.11 überlappen und kodieren für ein vollständiges Humanhirn-α₂-Protein.
B. Konstruktion von pHBCaCHα₂A
Zur Konstruktion von pHBCaCHα₂A, enthaltend DNA, die für eine vollständige humane Calciumkanal-α₂-Untereinheit kodiert, wurde ein (EcoRI)-PvuII-Fragment von HBCaCHα2.5 (Nt. 1 bis 1061, SEQ-ID-Nr. 11, EcoRI-Adapter, PvuII-Teilverdau) und ein PvuII-PstI-Fragment von HBCaCHα2.11 (Nt. 1061 bis 2424, SEQ-ID-Nr. 11; PvuII-Teilverdau) in EcoRI-PstI-verdauten pIBI24 (Stratagene, La Jolla, CA) ligiert. Anschließend wurde ein (EcoRI)-PstI-Fragment (Nt. 1 bis 2424, SEQ-ID-Nr. 11) isoliert und mit einem PstI-(EcoRI)-Fragment (Nt. 2424 bis 3600, SEQ-ID-Nr. 11) von HBCaCHα2.11 in einen EcoRI-verdauten pIBI24 ligiert, um DNA, nämlich HBCaCHα2, zu ergeben, welche für eine vollständige Humanhirn-α₂-Untereinheit kodiert. Das 3600-bp-EcoRI-Insert von HBCaCHα2 (Nt. 1 bis 3600, SEQ-ID-Nr. 11) wurde in pcDNA1 subkloniert (pHBCaCHα2A), wobei das Methioninstartcodon proximal zum CMV-Promoter liegt. Das 3600-bp-EcoRI-Insert von HBCaCHα2 wurde ebenfalls in pSV2dHFR [Subramani et al. (1981), Mol Cell. Biol. 1: 854–864] subkloniert, welcher den frühen SV40-Promotor, das Dihydrofolatreduktasegen der Maus (dhfr), SV40-Polyadenylierungs- und Spleißstellen, sowie für die Erhaltung des Vektors in Bakterien erforderliche Sequenzen enthält.
BEISPIEL V. DIFFERENTIELLE PROZESSIERUNG DES HUMANEN β₁-TRANSKRIPTS UND DES HUMANEN α₂-TRANSKRIPTS
A. Differentielle Prozessierung des β₁-Transkripts
Eine PCR-Analyse des in Skelettmuskel, Aorta, Hippocampus und Basalganglien und HEK 293-Zellen vorhandenen humanen β₁-Transkripts zeigte eine differentielle Prozessierung der Region, die Nt. 615 bis 781 von SEQ-ID-Nr. 9 entspricht, in jedem der Gewebe. Es wurden vier verschiedene Sequenzen identifiziert, welche zu fünf verschiedenen prozessierten β₁-Transkripten über diese Region führen. Die β₁-Transkripte aus den verschiedenen Geweben enthielten verschiedene Kombinationen der vier Sequenzen, mit der Ausnahme eines der β₁-Transkripte, die in HEK 293-Zellen exprimiert werden (β_1-5), in dem alle vier Sequenzen fehlten.
Keines der β₁-Transkripte enthielt alle vier Sequenzen. Zur einfacheren Bezugnahme werden jedoch alle vier Sequenzen aneinander gereiht als eine einzige lange Sequenz in SEQ-ID-Nr. 12 angegeben. Die vier Sequenzen, die unterschiedlich prozessiert werden, sind Sequenz 1 (Nt. 14 bis 34 in SEQ-ID-Nr. 12), Sequenz 2 (Nt. 35 bis 55 in SEQ-ID-Nr. 12), Sequenz 3 (Nt. 56 bis 190 in SEQ-ID-Nr. 12) und Sequenz 4 (Nt. 191 bis 271 in SEQ-ID-Nr. 12). Die Formen des β₁-Transkripts, die identifiziert wurden, umfassen: (1) eine Form, die Sequenz 1 nicht aufweist und als β_1-1 bezeichnet wird (in Skelettmuskel exprimiert), (2) eine Form, die Sequenzen 2 und 3 nicht aufweist und als β_1-2 bezeichnet wird (im ZNS exprimiert), (3) eine Form, die Sequenzen 1, 2 und 3 nicht aufweist und als β_1-2 bezeichnet wird (in der Aorta und in HEK-Zellen exprimiert) und (4) eine Form, die Sequenzen 1 bis 4 nicht aufweist und als β_1-5 bezeichnet wird (in HEK-Zellen exprimiert). Zusätzlich enthalten die β_1-4- und β_1-5-Formen das Guaninnukleotid (Nt. 13 in SEQ-ID-Nr. 12), welches in den β_1-1- und β_1-2-Formen fehlt.
B. Differentielle Prozessierung von Transkripten, die für die α₂-Untereinheit kodieren
Die vollständige humane neuronale α₂-Kodierungssequenz (Nt. 35 bis 3307) plus ein Abschnitt der 5'-untranslatierten Sequenz (Nt. 1 bis 34) sowie ein Abschnitt der 3'-untranslatierten Sequenz (Nt. 3308 bis 3600) ist als SEQ-ID-Nr. 11 angegeben.
Eine PCR-Analyse des in Skelettmuskel, Aorta und ZNS vorhandenen humanen α₂-Transkripts zeigte eine differentielle Prozessierung der Region, die Nt. 1595 bis 1942 von SEQ-ID-Nr. 11 entspricht, in jedem dieser Gewebe.
Die Analyse deutete darauf hin, dass das Primärtranskript der genomischen DNA, welches die Nukleotide entsprechend Nt. 1595 bis 1942 umfaßt, ebenfalls eine zusätzliche Sequenz umfaßt (SEQ-ID-Nr. 13: 5' CCTATTGGTGTAGGTATACCAACAATTAATTT AAGAAAAAGGAGACCCAATATCCAG 3'), die zwischen Nt. 1624 und 1625 von SEQ-ID-Nr. 11 inseriert ist. Fünf alternativ gespleißte Varianten von Transkripten, die sich durch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von einem bis drei unterschiedlichen Abschnitt(e) der Region des Primärtranskripts, welches die Region von Nt. 1595 bis 1942 von SEQ-ID-Nr. 11 plus SEQ-ID-Nr. 13, inseriert zwischen Nt. 1624 und 1625, einschließt, unterscheiden, wurden identifiziert. Die fünf α₂-kodierenden Transkripte aus den verschiedenen Geweben umfassen verschiedene Kombinationen der drei Sequenzen, außer dass einem der α₂-Transkripte, die in der Aorta exprimiert werden, alle drei Sequenzen fehlen. Keines der α₂-Transkripte enthielt alle der drei Sequenzen. Die Sequenzen der drei Regionen, die unterschiedlich prozessiert werden, sind Sequenz 1 (SEQ-ID-Nr. 13), Sequenz 2 (5' AACCCCAAATCTCAG 3', welche Nt. 1625 bis 1639 von SEQ-ID-Nr. 11 entspricht) und Sequenz 3 (5' CAAAAAAGGGCAAAATGAAGG 3', welche Nt. 1908 bis 1928 von SEQ-ID-Nr. 11 entspricht). Die fünf identifizierten α₂-Formen sind (1) eine Form, die Sequenz 3 nicht aufweist und α_2a genannt wird (in Skelettmuskel exprimiert), (2) eine Form, die Sequenz 1 nicht aufweist und α_2b genannt wird (im ZNS exprimiert), (3) eine Form, die Sequenzen 1 und 2 nicht aufweist und α_2c genannt wird (in der Aorta exprimiert), (4) eine Form, die Sequenzen 1, 2 und 3 nicht aufweist und α_2d genannt wird (in der Aorta exprimiert), und (5) eine Form, die Sequenzen 1 und 3 nicht aufweist und α_2e genannt wird (in der Aorta exprimiert).
BEISPIEL VI: ISOLIERUNG VON DNA, DIE FÜR EINE γ-UNTEREINHEIT EINES CALCIUMKANALS KODIERT, AUS EINER HUMANHIRN-cDNA-BANK
A. Isolierung von DNA, die für die γ-Untereinheit kodiert
Es wurden ungefähr 1 × 10⁶ Rekombinanten einer humanen Hippocampus-cDNA-Bank auf λgt11-Basis (Clontech Katalog #HL1088b, Palo Alto, CA) durch Hybridisierung mit einer 484-bp-Sequenz der γ-Untereinheits-cDNA des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel (Nt. 621 bis 626 der Kodierungssequenz plus 438 Nukleotide der 3'-untranslatierten Sequenz), die im Vektor γJ10 [Jay, S., et al. (1990), Science 248: 490–492] enthalten war, gescreent. Die Hybridisierung wurde bei moderaten Stringenzbedingungen durchgeführt (20% entionisiertes Formamid, 5 × Denhardts, 6 × SSPE, 0,2% SDS, 20 μg/ml Heringssperma-DNA, 42°C), und die Filter wurden bei niedriger Stringenz gewaschen (siehe Beispiel I.C.). Ein Plaque, der mit dieser Sonde hybridisierte, wurde gereinigt und Insert-DNA wurde in pGEM7Z subkloniert. Dieses cDNA-Insert wurde als γ1.4 bezeichnet.
B. Charakterisierung von γ1.4
γ1.4 wurde durch DNA-Hybridisierung bestätigt und durch DNA-Sequenzierung charakterisiert. Das 1500-bp-SstI-Fragment von γ1.4 hybridisierte mit der γJ10-cDNA der γ-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel auf einem Southernblot. Eine Sequenzanalyse dieses Fragments zeigte, dass es ungefähr 500 Nt. humaner DNA-Sequenz und ungefähr 1000 Nt. der λgt11-Sequenz enthält (aufgrund anscheinender Zerstörung einer der EcoRI-Klonierungsstellen in λgt11 mitumfaßt). Die humane Sequenz enthält 129 Nt. der Kodierungssequenz, unmittelbar gefolgt von einem Translationsstop-Codon und 3'-untranslatierter Sequenz (SEQ-ID-Nr. 14).
Um die restliche 5'-Sequenz der cDNA der humanen γ-Untereinheit zu isolieren, können humane ZNS-cDNA-Banken und/oder Präparationen von mRNA aus humanen ZNS-Geweben zunächst durch PCR-Verfahren unter Verwendung von Oligonukleotidprimern auf der Basis der γ-cDNA-spezifischen Sequenz von γ1.4 getestet werden. Zusätzliche für eine humane neuronale γ-Untereinheit kodierende DNA kann aus cDNA-Banken isoliert werden, die basierend auf den Ergebnissen des PCR-Assays γ-spezifische amplifizierbare cDNA enthalten. Alternativ dazu können cDNA-Banken aus mRNA-Präparationen erstellt werden, welche aufgrund der Ergebnisse von PCR-Assays γ-spezifische amplifizierbare Transkripte enthalten. Solche Banken werden gemäß Standardverfahren unter Verwendung von Oligo-dT, um die Erststrang-cDNA-Synthese von einer Poly A⁺-RNA zu primen, erstellt (siehe Beispiel I.B). Alternativ hierzu kann Erststrang-cDNA durch Primen der Erststrang-cDNA-Synthese mit einem γ-cDNA-spezifischen Oligonukleotid auf der Basis der humanen DNA-Sequenz in γ1.4 spezifiziert werden. Eine cDNA-Bank kann dann auf der Grundlage dieser Erststrang-Synthese erstellt und mit dem γ-spezifischen Abschnitt von γ1.4 gescreent werden.
BEISPIEL VII: REKOMBINANTE EXPRESSION VON FÜR HUMANE NEURONALE CALCIUMKANALUNTEREINHEITEN KODIERENDER cDNA UND RNA-TRANSKRIPTEN IN SÄUGERZELLEN
A. Rekombinante Expression der cDNA für die α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals in DG44-Zellen
1. Stabile Transfektion von DG44-Zellen
DG44-Zellen [dhfr^–-Ovarienzellen des chinesischen Hamsters; siehe z. B. Urlaub, G., et al. (1986), Som. Cell Molec. Genet. 12: 555–566], erhalten von Lawrence Chasin, Columbia University, wurden mit Hilfe von CaPO₄-Präzipitationsmethoden [Wigler et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373–1376] stabil mit einem pSV2dhfr-Vektor transfiziert, welcher die cDNA für die α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals enthielt (siehe Beispiel IV), für polycistronische Expression/Selektion in transfizierten Zellen. Die Transfektanten wurden in 10%igem DMEM-Medium ohne Hypoxanthin oder Thymidin kultiviert, um Zellen zu selektieren, welche den Expressionsvektor aufgenommen hatten. Zwölf Transfektantenzellinien wurden etabliert, wie gezeigt durch ihre Fähigkeit, in diesem Medium zu überleben.
2. Analyse der Expression von cDNA der α₂-Untereinheit in transfizierten DG44-Zellen
Gesamt-RNA wurde gemäß dem Verfahren von Birnboin [(1988), Nuc. Acids Res. 16: 1487–1497] aus vier der DG44-Zellinien extrahiert, die mit pSV2dhfr, enthaltend die cDNA für die α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals, stabil transfiziert worden waren. RNA (~ 15 μg pro Spur) wurde auf einem 1%igen Agarose-Formaldehydgel aufgetrennt, auf Nitrocellulose überführt und mit der statistisch geprimten α₂-cDNA des humanen neuronalen Calciumkanals hybridisiert (Hybridisierung: 50% Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardts, 42°C; Waschung: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C). Die Northernblot-Analyse der Gesamt-RNA aus vier der DG44-Zellinien, die mit dem die cDNA der α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals enthaltenden pSV2dhfr stabil transfiziert worden waren, zeigte, dass eine der vier Zellinien hybridisierende mRMA mit einer Größe enthielt, die für das Transkript der α₂-Untereinheits-cDNA erwartet wurde (5000 Nt., basierend auf der Größe der cDNA), wenn sie in Gegenwart von 10 mM Natriumbutyrat für zwei Tage kultiviert wurde. Butyrat induziert auf unspezifische Art und Weise die Transkription und wird oft zur Induktion des frühen SV40 Promotors verwendet [Gorman, C., und Howard, B. (1983), Nucleic Acids Res. 11: 1631]. Diese Zellinie, 44α₂-9, produzierte auch mRNA-Spezies, die kleiner (mehrere Spezies) und größer (6800 Nt.) waren als die für das Transkript der α₂-cDNA (5000 Nt.), welches mit der auf α₂-cDNA basierenden Sonde hybridisierte, erwartet wurde. Die 5000-Nt.- und 6800-Nt.-Transkripte, die von dieser Transfektante erzeugt wurden, sollten die gesamte α₂-Untereinheits-Kodierungssequenz enthalten und sollten daher ein vollständiges α₂-Untereinheits-Protein ergeben. Ein schwach hybridisierendes, 8000 Nukleotide langes Transkript war in untransfizierten und transfizierten DG44-Zellen vorhanden. Anscheinend transkribieren DG44-Zellen eine Calciumkanal-α₂-Untereinheit oder ein ähnliches Gen in geringem Maße. Das Expressionsniveau dieses endogenen α₂-Untereinheits-Transkripts schien durch die Exposition der Zellen gegenüber Butyrat vor der Isolierung der RNA für die Northern-Analyse nicht beeinflußt zu werden.
Aus drei der DG44-Zellinien, die mit dem die cDNA für die α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals enthaltenden pSV2dhfr stabil transfiziert worden waren, wurde Gesamtprotein extrahiert. Ungefähr 10⁷ Zellen wurden in 300 μl einer Lösung, enthaltend 50 mM HEPES, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, mit Ultraschall behandelt. Ein gleiches Volumen von 2 × Auftragsfarbstoff [Laemmli, U.K. (1970), Nature 227: 680] wurde zu den Proben hinzugefügt und das Protein wurde auf einem 8%igen Polyacrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen und dann auf Nitrocellulose elektrotransferiert. Die Nitrocellulose wurde mit polyklonalen Meerschweinchen-Antiseren (Verdünnung 1 : 200) gegen die α₂-Untereinheit des Calciumkanals aus Kaninchenskelettmuskel (erhalten von K. Campbell, University of Iowa) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit [¹²⁵I]-Protein A. Ein Röntgenfilm wurde bei –70°C mit dem Blot belichtet. Reduzierte Proteinproben aus den transfizierten Zellen sowie aus untransfizierten DG44-Zellen enthielten immunreaktives Protein mit einer Größe, die für die α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals zu erwarten war (130 bis 150 kDa). Die Konzentration dieses immunreaktiven Proteins war höher in 44α₂-9-Zellen, die in Gegenwart von 10 mM Natriumbutyrat kultiviert worden waren, als in 44α₂-9-Zellen, die in Abwesenheit von Natriumbutyrat kultiviert worden waren. Diese Daten korrelieren gut mit jenen, die in Northern-Analysen der Gesamt-RNA aus 44α₂-9- und untransfizierten DG44-Zellen erhalten wurden. Die Zellinie 44α₂-9 produzierte ebenfalls ein immunreaktives Protein von 110 kD, welches entweder ein Produkt eines proteolytischen Abbaus der vollständigen α₂-Untereinheit sein kann oder ein Produkt der Translation einer der kürzeren (< 5000 Nt.) mRNAs, die in dieser Zellinie erzeugt werden, welche mit der cDNA-Sonde der α₂-Untereinheit hybridisierten.
B. Expression von DNA, die für die α₁-, α₂- und β₁-Untereinheiten des humanen neuronalen Calciumkanals kodiert, in HEK-Zellen
Humane Embryo-Nierenzellen (HEK 293-Zellen) wurden transient und stabil mit humaner neuronaler DNA, die für Calciumkanaluntereinheiten kodiert, transfiziert. Individuelle Transfektanten wurden elektrophysiologisch auf das Vorhandensein von spannungsaktivierten Bariumströmen und funktioneller rekombinanter spannungsabhängiger Calciumkanäle analysiert.
1. Transfektion von HEK 293-Zellen
Separate Expressionsvektoren, die DNA enthalten, welche für die humanen neuronalen Calciumkanaluntereinheiten α_1D, α₂ und β₁ kodiert, die Plasmide pVDCCIII(A), pHBCaCHα₂A bzw. pHBCaCHβ_1aRBS(A), wurden jeweils wie in den Beispielen II.A.3, IV.B. und III.B.3. beschrieben konstruiert. Diese drei Vektoren wurden verwendet, um HEK 293-Zellen transient zu cotransfizieren. Für die stabile Transfektion von HEK 293-Zellen wurde der Vektor pHBCaCHβ_1bRBS(A) (Beispiel III.B.3.) anstelle von pHBCaCHβ_1aRBS(A) verwendet, um die DNA, die für die β₁-Untereinheit kodiert, zusammen mit pVDCCIII(A) und pHBCaCHα₂A in die Zellen einzubringen.
a. Transiente Transfektion
Die Expressionsvektoren pVDCCIII(A), pHBCaCHα₂A und pHBCaCHβ_1aRBS(A) wurden in zwei Sätzen transienter Transfektionen von HEK 293-Zellen (ATCC Hinterlegungs-Nr. CRL1573) verwendet. Bei einem Transfektionsverfahren wurden HEK 293-Zellen transient mit dem Expressionsplasmid für die α₁-Untereinheits-cDNA, dem Expressionsplasmid für die α₂-Untereinheits-cDNA, dem Expressionsplasmid für die β₁-Untereinheits-cDNA und dem Plasmid pCMVβgal (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) cotransfiziert. Das Plasmid pCMVβgal enthält das lacZ-Gen (welches für die β-Galactosidase von E, coli kodiert) in Fusion mit dem Cytomegalovirus (CMV)-Promotor und war bei dieser Transfektion als Markergen zur Überwachung der Transfektionseffizienz eingeschlossen. Bei dem anderen Transfektionsverfahren wurden HEK 293-Zellen transient mit dem Expressionsplasmid für die α₁-Untereinheits-cDNA, pVDCCIII(A), und pCMVβgal cotransfiziert. Bei beiden Transfektionen wurden 2 bis × 10⁶ HEK 293-Zellen auf einer 10-cm-Gewebekulturplatte transient mit 5 μg eines jeden der in das Experiment eingeschlossenen Plasmide gemäß CaPO₄-Präzipitations-Standardtransfektionsverfahren (Wigler et al., (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373–1376) transient cotransfiziert. Die Transfektanten wurden hinsichtlich β-Galactosidaseexpression durch direktes Färben des Produkts einer Reaktion von β-Galactosidase und dem X-gal-Substrat [Jones, J. R. (1986), EMBO 5: 3133–3142] und durch Messung der β-Galactosidaseaktivität [Miller, J. H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Seiten 352–355, Cold Spring Harbor Press] analysiert. Um die Expression der Untereinheits-cDNA in diesen Transfektanten zu beurteilen, wurden die Zellen auf Untereinheitstranskript-Produktion (Northern-Analyse), Untereinheitsprotein-Produktion (Immunoblot-Analyse von Zellysaten) und funktionelle Calciumkanalexpression (elektrophysiologische Analyse) analysiert.
b. Stabile Transfektion
HEK 293-Zellen wurden unter Verwendung der Calciumphosphat-Transfektionsprozedur [Current Protocols in Molecular Biology, Band 1, Wiley Inter-Science, Supplement 14, Einheit 9.1.1–9.1.9 (1990)] transfiziert. 10-cm-Platten, von denen jede 1 bis 2 Millionen HEK 293-Zellen enthielt, wurden mit 1 ml des DNA/Calciumphosphatpräzipitats, enthaltend 5 μg pVDCCIII(A), 5 μg pHBCaCHα₂A, 5 μg pHBCaCHβ_1bRBS(A), 5 μg pCMVβgal und 1 μg pSV2neo (als Selektionsmarker), transfiziert. Nach 10 bis 20 Tagen Wachstum in einem Medium, enthaltend 500 μg G418, hatten sich Kolonien gebildet, die unter Verwendung von Klonierungszylindern isoliert wurden.
2. Analyse von HEK 293-Zellen, die mit DNA, welche für humane neuronale Calciumkanaluntereinheiten kodiert, transient transfiziert wurden
a. Analyse der R-Galactosidaseexpression
Transiente Transfektanten wurden auf β-Galactosidaseexpression mit Hilfe von β-Galactosidase-Aktivitätsassays (Miller, J. H. (1972), Experiments in Molecular Genetics, Seiten 352–355, Cold Spring Harbor Press) von Zellysaten (hergestellt wie beschrieben in Beispiel VII.A.2) und Färben von fixierten Zellen (Jones, J. R. (1986), EMBO 5: 3133–3142) getestet. Die Ergebnisse dieser Assays zeigten an, dass ungefähr 30% der HEK 293-Zellen transfiziert worden waren.
b. Northern-Analyse
Poly A⁺-RNA wurde unter Verwendung des Invitrogen Fast Trak Kits (Invitrogen, San Diego, CA) aus HEK 293-Zellen isoliert, die mit einer DNA, welche für jede der α₁-, α₂- und β₁-Untereinheiten und das lacZ-Gen oder die α₁-Untereinheit und das lacZ-Gen kodierte, transient transfiziert worden waren. Die RNA wurde einer Elektrophorese auf einem Agarosegel unterzogen und auf Nitrocellulose überführt. Die Nitrocellulose wurde dann mit einer oder mehreren der folgenden radiomarkierten Sonden hybridisiert: das lacZ-Gen, cDNA, die für die α_1D-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals kodiert, cDNA, die für die α₂-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals kodiert, oder cDNA, die für die β₁-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals kodiert. Zwei Transkripte, die mit der für die α₁-Untereinheit kodierenden cDNA hybridisierten, wurden in HEK 293-Zellen nachgewiesen, die mit der für die α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit und das lacZ-Gen kodierender DNA transfiziert worden waren, wie auch in HEK-293-Zellen, die mit der cDNA für die α₁-Untereinheit und dem lacZ-Gen transfiziert worden waren. Eine mRNA-Spezies hatte die Größe, die für das Transkript der α₁-Untereinheits-cDNA zu erwarten war (8000 Nukleotide). Die zweite RNA-Spezies war kleiner (4000 Nukleotide) als die Größe, die für dieses Transkript zu erwarten war. RNA mit der erwarteten Größe für das Transkript des lacZ-Gens wurde in Zellen, die mit der für die α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierenden cDNA und dem lacZ-Gen transfiziert worden waren, und in Zellen, die mit der α₁-Untereinheits-cDNA und dem lacZ-Gen transfiziert worden waren, durch Hybridisierung mit der lacZ-Gensequenz nachgewiesen.
RNA aus Zellen, die mit der cDNA für die α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit und mit dem lacZ-Gen transfiziert worden waren, wurde ebenfalls mit den cDNA-Sonden für die α₁ und β₁-Untereinheiten hybridisiert. Zwei mRNA-Spezies hybridisierten mit der α₂-Untereinheits-cDNA-Sonde. Eine Spezies hatte die Größe, die für das Transkripts der α₂-Untereinheit-cDNA (4000 Nukleotide) zu erwarten war. Die andere Spezies war größer (6000 Nukleotide) als die erwartete Größe für dieses Transkript. Mehrere RNA-Spezies in den Zellen, die mit für die α₁-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierender cDNA und dem lacZ-Gen cotransfiziert worden waren, hybridisierten mit der β₁-Untereinheits-cDNA-Sonde. Es wurden mehrere β₁-Untereinheits-Transkripte verschiedener Größen produziert, da der β-Untereinheits-cDNA-Expressionsvektor zwei potentielle Poly A⁺-Additionsstellen aufweist.
c. Elektrophysiologische Analyse
Einzelne transient transfizierte HEK 293-Zellen wurden auf das Vorhandensein von spannungsabhängigen Bariumströmen unter Verwendung der Ganzzellvariante der Patch-Clamp-Technik [Hamill et al. (1981), Pflugers Arch. 391: 85–100] untersucht. HEK 293-Zellen, die transient mit pCMVβgal allein transfiziert worden waren, wurden als negative Kontrolle in diesen Experimenten auf Bariumströme getestet. Die Zellen wurden in eine Badlösung eingebracht, welche Bariumionen enthielt, die als Stromträger dienten. Anstelle von NaCl oder KCl wurde Cholinchlorid als Hauptsalzkomponente der Badlösung verwendet, um Ströme durch Natrium- und Kaliumkanäle zu eliminieren. Die Badlösung enthielt 1 mM MgCl₂ und war mit 10 mM HEPES auf pH 7,3 gepuffert (pH mit Natrium- oder Tetraethylammoniumhydroxid eingestellt). Patch-Pipetten wurden mit einer Lösung gefüllt, die 135 mM CsCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM Glucose, 10 mM EGTA, 4 mM ATP und 10 mM HEPES (pH mit Tetraethylammoniumhydroxid auf 7,3 eingestellt) enthielt. Cäsium- und Tetraethylammoniumionen blockieren die meisten Arten von Kaliumkanälen. Die Pipetten wurden mit Sylgard (Dow-Corning, Midland, MI) beschichtet und hatten Widerstände von 1 bis 4 Megohm. Die Ströme wurden gemessen durch einen 500 Megohm Headstage-Widerstand mit dem Axopatch IC (Axon Instruments, Foster City, CA) Amplifizierer, der über ein Interface mit einem Labmaster Datenakquisitions-Board (Scientific Solutions, Solon, OH) in einem IBM-kompatiblen PC verbunden war. PClamp (Axon Instruments) wurde zum Erzeugen von Spannungsbefehlen und zum Akquirieren von Daten verwendet. Die Daten wurden mit den Programmen pClamp oder Quattro Professional (Borland International, Scotts Valley, CA) analysiert.
Zur Verabreichung von Wirkstoffen wurden „Puffer"-Pipetten, die mehrere Mikrometer von der untersuchten Zelle entfernt positioniert waren, zum Verabreichen von Lösungen durch Druckapplikation verwendet. Die für die pharmakologische Charakterisierung verwendeten Wirkstoffe wurden in einer Lösung gelöst, die mit der Badlösung identisch war. Proben einer 10 mM Stammlösung von Bay K 8644 (RBI, Natick, MA), die in DMSO hergestellt war, wurden auf eine endgültige Konzentration von 1 μM in 15 mM Ba²⁺-enthaltender Badlösung verdünnt, bevor sie appliziert wurden.
Einundzwanzig negative Kontrollen, HEK 293-Zellen (transient transfiziert mit lediglich dem lacZ-Genexpressionsvektor pCMVβgal), wurden mit Hilfe der Ganzzellvariante des Patch-Clamp-Verfahrens zum Aufzeichnen von Strömen analysiert. Lediglich eine Zelle zeigte einen feststellbaren nach innen gerichteten Bariumstrom; dieser Strom wurde nicht durch das Vorhandensein von 1 μM Bay K 8644 beeinflußt. Zusätzlich führte das Behandeln von vier Zellen, die keine Ba²⁺-Ströme zeigten, mit Bay K 8644 zu keinem Auftreten irgendwelcher Ströme.
Zwei Tage nach der transienten Transfektion von HEK-293 Zellen mit für α₁-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierender cDNA und dem lacZ-Gen wurden individuelle Transfektanten auf spannungsabhängige Bariumströme hin untersucht. In neun Transfektanten wurden die Ströme aufgezeichnet. Da die Transfektionseffizienz einer Zelle von der Transfektionseffizienz einer anderen Zelle verschieden sein kann, variiert das Expressionsniveau heterologer Proteine in einzelnen Transfektanten und einige Zellen nehmen keine fremde DNA auf oder exprimieren keine fremde DNA. Nach innen gerichtete Bariumströme wurden in zwei dieser neun Transfektanten nachgewiesen. In diesen Assays betrug das Haltepotential der Membran –90 mV. Die Membran wurde in einer Serie von Spannungsschritten auf verschiedene Testpotentiale depolarisiert und der Strom in Gegenwart und Abwesenheit von 1 μM Bay K 8644 wurde aufgezeichnet. Der nach innen gerichtete Bariumstrom wurde in seiner Größe durch Zugabe von Bay K 8644 signifikant erhöht. Der höchste nach innen gerichtete Bariumstrom (~ 160 pA) wurde gemessen, wenn die Membran in Gegenwart von 1 μM Bay K 8644 auf 0 mV depolarisiert wurde. Ein Vergleich der I-V-Kurven, die durch Auftragen des nach jeder Depolarisation aufgezeichneten größten Stroms gegen die Depolarisierungsspannung erstellt wurden, entsprechend den in Anwesenheit und Abwesenheit von Bay K 8644 durchgeführten Aufzeichnungen, veranschaulichte die Verstärkung des spannungsaktivierten Stroms in Anwesenheit von Bay K 8644.
Ausgeprägte Endströme wurden in den Aufzeichnungen von Strömen nachgewiesen, die in Anwesenheit von Bay K 8644 in HEK 293-Zellen erzeugt wurden, die mit dem lacZ-Gen und für die Untereinheiten α₁, α₂ und β₁ kodierender cDNA transfiziert worden waren, was darauf hindeutet, dass die für die gemessenen spannungsaktivierten Bariumströme verantwortlichen rekombinanten Calciumkanäle DHP-empfindlich zu sein scheinen.
Die zweite der beiden transfizierten Zellen, welche nach innen gerichtete Bariumströme zeigten, wies einen ~50 pA-Strom auf, wenn die Membran von –90 mV depolarisiert wurde. Dieser Strom wurde fast vollständig durch 200 μM Cadmium, ein etablierter Calciumkanalblocker, blockiert.
Zehn Zellen, die transient mit der DNA, welche für die α₁-Untereinheit kodierte, und dem lacZ-Gen transfiziert worden waren, wurden durch Ganzzell-Patch-Clamp-Verfahren zwei Tage nach der Transfektion analysiert. Eine dieser Zellen zeigte einen nach innen gerichteten Bariumstrom von 30 pA. Dieser Strom wurde in Gegenwart von 1 μM Bay K 8644 2-fach amplifiziert. Des weiteren wurde kleine Endströme in Gegenwart von Bay K 8644 detektiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Expression einer cDNA, die für die α_1D-Untereinheit eines humanen neuronalen Calciumkanals kodiert, in HEK 293-Zellen zu einem funktionellen DHP-empfindlichen Calciumkanal führt.
3. Analyse von HEK 293-Zellen, die stabil mit DNA, die für humane neuronale Calciumkanaluntereinheiten kodiert, transfiziert wurden
Einzelne stabil transfizierte HEK 293-Zellen wurden elektrophysiologisch auf das Vorhandensein von spannungsabhängigen Bariumströmen analysiert, wie beschrieben für die elektrophysiologische Analyse von transient transfizierten HEK 293-Zellen (siehe Beispiel VII.B.2.c.). Bei einem Versuch, die Calciumkanalaktivität über die durch cAMP-abhängige Kinase gesteuerte Phosphorylierung (Pelzer et al., (1990), Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 114: 107–207] zu maximieren, wurde cAMP (Natriumsalz, 250 μM) zu der Pipettenlösung hinzugegeben und Forskolin (10 μM) wurde zur Badlösung bei einigen der Aufzeichnungen zugegeben. Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden bei Vorhandensein und Nichtvorhandensein dieser Verbindungen erhalten.
Bariumströme wurden von stabil transfizierten Zellen in Gegenwart und Abwesenheit von Bay K 8644 (1 μM) aufgezeichnet. Wenn die Zelle auf –10 mV von einem Haltepotential von –90 mV in Abwesenheit von Bay K 8644 depolarisiert wurde, wurde ein Strom von etwa 35 pA mit einem rapide deaktivierenden Endstrom gemessen. Während der Anwendung von Bay K 8644 erzeugte ein identisches Depolarisierungsprotokoll einen Strom von ungefähr 75 pA, begleitet von einem erhöhten und verlängerten Endstrom. Die Peakhöhe der in dieser selben Zelle aufgezeichneten Ströme als Funktion einer Serie von Depolarisierungsspannungen wurde ausgewertet. Die Antworten in Gegenwart von Bay K 8644 verstärkten sich nicht nur, sondern das gesamte Strom-Spannungsverhältnis verschob sich um ungefähr –10 mV. Somit wurden drei typische Kennzeichen der Wirkung von Bay K 8644, nämlich verstärkte Stromhöhe, verlängerte Endströme und negativ verschobene Aktivierungsspannung, beobachtet, was klar auf die Expression eines DHP-empfindlichen Calciumkanals in diesen stabil transfizierten Zellen hindeutet. In untransfizierten HEK 293-Zellen wurden weder mit noch ohne cAMP oder Forskolin derartige Wirkungen von Bay K 8644 beobachtet.
C. Verwendung von Vektoren auf pCMV-Basis und pcDNA1-Basis zur Expression von DNA, die für humane neuronale Calciumkanaluntereinheiten kodiert
1. Herstellung von Konstrukten
Zur Feststellung, ob die Niveaus der rekombinanten Expression von für humane Calciumkanaluntereinheiten kodierender DNA in Wirtszellen durch Verwendung von Expressionsvektoren auf der Basis von pCMV anstelle von pcDNA1 erhöht werden konnten, wurden zusätzliche Expressionsvektoren konstruiert. Die vollständige α_1D-cDNA aus pVDCCIII(A) (siehe Beispiel II.A.3.d.), die vollständige α₂-cDNA, enthalten in einem 3600-bp-EcoRI-Fragment aus HBCaCHα₂ (siehe Beispiel IV.B.), und eine vollständige β₁-Untereinheits-cDNA aus pHBCaCHβ_1βRBS(A) (siehe Beispiel III.B.3.) wurden separat in das Plasmid pCMVβgal subkloniert. Das Plasmid pCMVβgal wurde mit NotI verdaut, um das lacZ-Gen zu entfernen. Der verbliebene Vektorabschnitt des Plasmids, als pCMV bezeichnet, wurde an den NotI-Stellen mit glatten Enden versehen. Die vollständige α₂-kodierende DNA und β₁-kodierende DNA, die auf separaten EcoRI-Fragmenten enthalten war, wurde isoliert, mit glatten Enden versehen und separat in das glattendige Vektorfragment von pCMV ligiert, wobei die cDNAs zwischen den CVM-Promotor und die SV40-Polyadenylierungsstellen in pCMV positioniert wurden. Um die für α_1D kodierende cDNA mit pCMV zu ligieren, wurden die Restriktionsstellen in den Polylinkern unmittelbar 5' des CVM-Promotors und unmittelbar 3' der SV40-Polyadenylierungsstelle aus pCVM entfernt. An der NotI-Stelle wurde ein Polylinker hinzugefügt. Der Polylinker hatte die folgende Sequenz von Restriktionsenzymerkennungsstellen:
Die für α_1D kodierende DNA, die als BamHI/XhoI-Fragment aus pVDCCIII(A) isoliert wurde, wurde dann in den XbaII/SalI-verdauten pCMV ligiert, um sie zwischen den CMV-Promotor und die SV40-Polyadenylierungsstelle zu positionieren.
Das Plasmid pCMV enthält wie pcDNA1 den CMV-Promotor, unterscheidet sich jedoch von pcDNA1 durch die Positionierung der Spleißdonor/Spleißakzeptor-Stellen in Bezug auf die inserierte untereinheits-kodierende DNA. Nach dem Inserieren der untereinheits-kodierenden DNA in pCMV befinden sich die Spleißdonor/Spleißakzeptor-Stellen 3' des CMV-Promotors und 5' des Startcodons für die untereinheits-kodierende DNA. Nach dem Inserieren der untereinheits-kodierenden DNA in pcDNA1 befinden sich die Spleißdonor/Spleißakzeptor-Stellen 3' des Stopcodons der Untereinheits-cDNA.
2. Transfektion von HEK 293-Zellen
HEK 293-Zellen wurden jeweils transient mit der für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheit kodierenden DNA in pCMV oder mit der für die α_1D-, α₂- und β-Untereinheit kodierenden DNA in pcDNA1 (Vektor pVDCCIII(A), pHBCaCHα₂A bzw. pHBCaCHβ_1βRBS(A)) wie in Beispiel VII.B.1.a. beschrieben cotransfiziert. Das Plasmid pCMVβgal wurde in jeder Transfektion miteingeschlossen, um ein Maß für die Transfektionseffizienz bereitzustellen. Die Ergebnisse der β-Galactosidase-Assays der Transfektanten (siehe Beispiel VII.B.2.) zeigen, dass HEK 293-Zellen mit Plasmiden auf pCMV- und pcDNA1-Basis gleich effizient transfiziert wurden.
3. Northern-Analyse
Gesamt-RNA und Poly A⁺-RNA wurde aus den transient transfizierten Zellen wie in den Beispielen VII.A.2. und VII.B.2.b. beschrieben isoliert. Northernblots der RNA wurde mit den folgenden radiomarkierten Sonden hybridisiert: α_1D-cDNA, humane neuronale Calciumkanal-α₂-Untereinheits-cDNA und für die β₁-Untereinheit des humanen neuronalen Calciumkanals kodierende DNA. Messenger-RNA mit für Transkripte der α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheit erwarteten Größen wurden in allen Transfektanten nachgewiesen. In Zellen, die mit Plasmiden auf pCMV-Basis cotransfiziert worden waren, war eine größere Menge des α_1D-Transkripts vorhanden als in Zellen, die mit Plasmiden auf pcDNA1-Basis cotransfiziert worden waren. In allen Transfektanten wurden äquivalente Mengen von Transkripten der α₂- und β₁-Untereinheiten gefunden.
D. Expression von RNA, die für humane neuronale Calciumkanaluntereinheiten kodiert, in Xenopus laevis-Oozyten
Verschieden Kombinationen der Transkripte von DNA, die für die humanen neuronalen α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodiert, die in vitro hergestellt worden waren, wurden in Oozyten von Xenopus laevis injiziert. Diejenigen, denen Kombinationen, welche α_1D umfaßten, injiziert worden waren, zeigten spannungsaktivierte Bariumströme.
1. Herstellung von Transkripten
Für die humanen neuronalen Calciumkanaluntereinheiten α_1D, α₂ und β₁ kodierende Transkripte wurden gemäß der Instruktionen des mCAP mRNA CAPPING KITS (Stratagene, La Jolla, CA, Katalog #200350) synthetisiert. Die Plasmide pVDCCIII.RBS(A), enthaltend pcDNA1 und die α_1D-cDNA, die mit einer Ribosomenbindungsstelle und dem achten ATG-Codon der Kodierungssequenz (siehe Beispiel III.A.3.d.) beginnt, Plasmid pHBCaCHα₁A, enthaltend pcDNA1 und eine α₂-Untereinheits-cDNA (siehe Beispiel IV), und Plasmid pHBCaCHβ_1bRBS(A), enthaltend pcDNA1 und die β₁-DNA ohne Intronsequenz und enthaltend eine Ribosomenbindungsstelle (siehe Beispiel III), wurden durch Restriktionsverdau linearisiert. Die für die α_1D-cDNA und die α₂-Untereinheit kodierenden Plasmide wurden mit XhoI verdaut und das für die β₁-Untereinheit kodierende Plasmid wurde mit EcoRV verdaut. Das DNA-Insert wurde mit T7 RNA-Polymerase transkribiert.
2. Injektion in Oozyten
Xenopus laevis-Oozyten wurden isoliert und durch Collagenasebehandlung defollikuliert und in 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7,6, 20 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Streptomycin bei 19–25°C für 2 bis 5 Tage nach Injektion und vor der Aufzeichnung gehalten. Für jedes Transkript, welches in den Oozyten injiziert wurde, wurden pro Zelle 6 ng der speziellen mRNA in einem Gesamtvolumen von 50 nl injiziert.
3. Intrazelluläre Spannungsaufzeichnungen
Injizierte Oozyten wurden unter Verwendung von Zweielektroden-Spannungsklemmen-Techniken [Dascal, N. (1987), CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 317] auf spannungsabhängige Bariumströme untersucht. Es wurde das pClamp-Softwarepaket (Axon Instruments) zusammen mit einem Labmaster 125 kHz Datenakquisitionsinterface verwendet, um Spannungsbefehle zu erzeugen und um Daten zu akquirieren und zu analysieren. Bei dieser Analyse wurde auch Quattro Professional verwendet. Stromsignale wurden bei 1 bis 5 kHz digitalisiert und entsprechend gefiltert. Die Badlösung enthielt folgendes: 40 mM BaCl₂, 36 mM Tetraethylammoniumchlorid (TEA-Cl), 2 mM KCl, 5 mM 4-Aminopyridin, 0,15 mM Nifluminsäure, 5 mM HEPES, pH 7,6.
a. Elektrophysiologische Analyse von Oozyten, denen Transkripte, die für die humanen neuronalen Calciumkanaluntereinheiten α₁, α₂ und β₁ kodieren, injiziert worden waren
Nicht-injizierte Oozyten wurden durch Zweielektroden-Spannungsklemmen-Techniken untersucht und in lediglich einer von sieben analysierten Zellen wurde ein sehr kleiner (25 nA) endogener, nach innen gerichteter Ba²⁺-Strom detektiert.
Mit α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheits-Transkripten coinjizierte Oozyten zeigten anhaltende, nach innen gerichtete Bariumströme nach Depolarisierung der Membran von einem Haltepotential von –90 mV oder –50 mV (154 ± 129 nA, n = 21). Diese Ströme zeigten typischerweise wenig Inaktivierung wenn Testimpulse im Bereich von 140 bis 700 msec. angelegt wurden. Die Depolarisierung auf eine Reihe von Spannungen zeigte Ströme, die zuerst bei ungefähr –30 mV auftraten und bei ungefähr 0 mV ihren Höhepunkt hatten.
Die Anwendung des DHP Bay K 8644 erhöhte die Ströme, verlängerte die Endströme, die nach der Repolarisierung der Zelle auftraten, und induzierte eine hyperpolarisierende Verschiebung in der Stromaktivierung. Bay K 8644 wurde frisch aus einer Stammlösung in DMSO hergestellt und in 10-facher Konzentration direkt in das 60-μl-Bad eingebracht, während die Perfusionspumpe abgeschaltet war. Die DMSO-Konzentration der endgültigen verdünnten Wirkstofflösungen in Kontakt mit der Zelle betrug nie mehr als 0,1%. Kontrollexperimente zeigten, dass 0,1% DMSO keinen Einfluß auf Membranströme hatte.
Die Anwendung der DHP-Antagonisten Nifedipin (Stammlösung in DMSO hergestellt und wie für die Anwendung von Bay K 8644 beschrieben der Zelle appliziert) blockierte einen wesentlichen Teil (91 ± 6%, n = 7) des nach innen gerichteten Bariumstroms in Oozyten, denen Transkripte für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten coinjiziert worden waren. Eine verbleibende inaktivierende Komponente des nach innen gerichteten Bariumstroms blieb typischerweise nach der Nifedipin-Anwendung bestehen. Der nach innen gerichtete Bariumstrom wurde vollständig durch 50 μM Cd²⁺ blockiert, jedoch nur zu etwa 15% durch 100 μM Ni²⁺.
Der Effekt von ωCgTX auf die nach innen gerichteten Bariumströme in Oozyten, denen Transkripte für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten coinjiziert worden waren, wurde untersucht. ωCgTX (Bachem, Inc., Torrance CA) wurde in der 15 mM BaCl₂-Badlösung plus 0,1% Cytochrom C (Sigma) als Trägerprotein hergestellt. Kontrollexperimente zeigten, dass Cytochrom C auf die Ströme keinen Einfluß hatte. Eine Reihe von Spannungsimpulsen von einem –90 mV-Haltepotential bis 0 mV wurden in Intervallen von 20 msec aufgezeichnet. Um die Hemmung der ωCgTX-Bindung durch zweiwertige Kationen zu reduzieren, wurden die Aufzeichnungen in 15 mM BaCl₂, 73,5 mM Tetraethylammoniumchlorid und den übrigen identischen Bestandteilen der 40 mM Ba²⁺-Aufzeichnungslösung vorgenommen. Vor der Zugabe von ωCgTX wurde Bay K 8644 zu den Zellen hinzugegeben, um die Wirkung von ωCgTX auf die DHP-empfindliche Stromkomponente zu bestimmen, die durch die verlänerten Endströme gekennzeichnet war. Der nach innen gerichtete Bariumstrom wurde von relativ hohen Konzentrationen (10 bis 15 μM) von ωCgTX schwach (54 ± 29%, n = 7) und reversibel blockiert. Die Testströme und die begleitenden Endströme wurden progressiv innerhalb von 2 bis 3 Minuten nach der Anwendung von ωCgTX blockiert, erholten sich jedoch teilweise, wenn ωCgTX aus dem Bad ausgespült wurde.
b. Analyse von Oozyten, denen lediglich ein Transkript, das für die humane neuronale Calciumkanal α_1D kodiert, oder Transkripte, die für eine α_1D-Untereinheit und weitere Untereinheiten kodieren, injiziert wurde
Der Beitrag der α₂- und β₁-Untereinheiten zum nach innen gerichteten Bariumstrom in Oozyten, denen für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren, wurde durch Expression der α_1D-Untereinheit allein oder in Kombination entweder mit der β₁-Untereinheit oder der α₂-Untereinheit bestimmt. In Oozyten, denen nur das Transkript einer α_1D-cDNA injiziert worden war, wurden keine Ba²⁺-Ströme nachgewiesen (n = 3). In Oozyten, denen Transkripte von α_1D- und β₁-cDNAs injiziert worden waren, wurden nach Depolarisierung der Membran von einem Haltepotential von –90 mV kleine (108 ± 39 nA) Ba²⁺-Ströme nachgewiesen, die den Strömen glichen, die in Zellen, denen Transkripte von α_1D-, α₂- und β₁-cDNAs injiziert worden waren, beobachtet wurden, obwohl die Größe des Stroms geringer war. In zwei der vier Oozyten, denen Transkripte der α_1D-kodierenden und β₁-kodierenden DNA injiziert worden waren, zeigten die Ba²⁺-Ströme eine Empfindlichkeit für Bay K 8644, die ähnlich der Bay K 8644-Empfindlichkeit von Ba²⁺-Strö men war, die in Oozyten erzeugt wurden, denen Transkripte injiziert worden waren, die für die α_1D-α₁-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierten.
Drei von fünf Oozyten, denen Transkripte, die für die α_1D- und α₂-Untereinheiten kodierten, injiziert worden waren, zeigten sehr kleine Ba²⁺-Ströme (15 bis 30 nA) nach Depolarisierung der Membran von einem Haltepotential von –90 mV. Diese Bariumströme zeigten wenig oder keine Reaktion auf Bay K 8644.
c. Analyse von Oozyten, denen Transkripte injiziert worden waren, die für die humane neuronale Calciumkanal-α₂- und/oder β₁-Untereinheit kodierten
Zur Beurteilung des Beitrags der α_1D-α₁-Untereinheit an den nach innen gerichteten Bariumströmen, die in Oozyten nachgewiesen wurden, denen für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte coinjiziert worden waren, wurden Oozyten, denen Transkripte, die für die humanen neuronalen Calciumkanal-α₂- und/oder β₁-Untereinheiten kodierten, injiziert worden waren, auf Bariumströme hin untersucht. Oozyten, denen für die α₂-Untereinheit kodierende Transkripte injiziert worden waren, zeigten keine nachweisbaren nach innen gerichteten Bariumströme (n = 5). Oozyten, denen für eine β₁-Untereinheit kodierende Transkripte injiziert worden waren, zeigten meßbare (54 ± 23 nA, n = 5) nach innen gerichtete Bariumströme nach Depolarisierung, und Oozyten, denen für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren, zeigten nach innen gerichtete Bariumströme, die ungefähr 50% größer (80 ± 61 nA, n = 18) waren als solche, die man in Oozyten detektierte, denen lediglich Transkripte der β₁-kodierenden DNA injiziert worden waren.
Die nach innen gerichteten Bariumströme in Oozyten, denen für die β₁-Untereinheit oder α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren, wurden typischerweise erstmals beobachtet, wenn die Membran von einem Haltepotential von –90 mV auf –30 mV depolarisiert wurde, und hatten ihren Höhepunkt, wenn die Membran auf 10 bis 20 mV depolarisiert wurde. Makroskopisch waren die Ströme in Oozyten, denen für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte oder für die β₁-Untereinheit kodierende Transkripte injiziert worden waren, nicht zu unterscheiden. Im Gegensatz zu den Strömen in Oozyten, denen Transkripte der α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheits-cDNAs coinjiziert worden waren, zeigten diese Ströme eine signifikante Inaktivierung während des Testimpulses und eine starke Empfindlichkeit für das Haltepotential. Die nach innen gerichteten Bariumströme in Oozyten, denen für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte coinjiziert worden waren, wurden normalerweise auf 1 bis 60% der Peakhöhe während eines Impulses von 140 msec inaktiviert und waren beträchtlich empfindlicher für das Haltepotential als solche in Oozyten, denen für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte coinjiziert worden waren. Die Änderung des Haltepotentials der Membranen von Oozyten, denen für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte coinjiziert worden waren, von –90 auf –50 mV führte zu einer ungefähr 81%igen Reduktion (n = 11) der Höhe des nach innen gerichteten Bariumstroms in diesen Zellen. Im Gegensatz dazu waren die nach innen gerichteten Bariumströme, die in Oozyten gemessen wurden, denen für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte coinjiziert worden waren, um ungefähr 24% reduziert (n = 11), wenn das Haltepotential von –90 bis auf –50 mV geändert wurde.
Die nach innen gerichteten Bariumströme, die in Oozyten detektiert wurden, denen für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren, unterschieden sich pharmakologisch von solchen, die in Oozyten beobachtet wurden, denen für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte coinjiziert worden waren. Oozyten, denen Transkripte injiziert worden waren, die für die α₂- und β-Untereinheiten kodierten, zeigten nach innen gerichtete Bariumströme, die gegenüber Bay K 8644 unempfindlich waren (n = 11). Empfindlichkeit gegenüber Nifedipin war schwierig zu messen wegen der Haltepotentialempfindlichkeit von Nifedipin und des Stroms, den man in Oozyten beobachtete, denen Transkripte injiziert worden waren, die für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierten. Trotzdem zeigten zwei Oozyten, denen für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte coinjiziert worden waren, meßbare (25 bis 45 nA) nach innen gerichtete Bariumströme, wenn sie von einem Haltepotential von –50 mV depolarisiert wurden. Diese Ströme waren gegenüber Nifedipin (5 bis 10 μM) unempfindlich. Die nach innen gerichteten Bariumströme in Oozyten, denen für die α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren, zeigten dieselbe Empfindlichkeit gegenüber Schwermetallen wie die Ströme, die man in Oozyten nachweist, denen für die α_1D-, α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren.
Der in Oozyten, denen für die humanen neuronalen α₂- und β₁-Untereinheiten kodierende Transkripte injiziert worden waren, gemessene, nach innen gerichtete Bariumstrom weist pharmakologische und biophysikalische Eigenschaften auf, die Calciumströmen in nichtinjizierten Xenopus-Oozyten ähnlich sind. Da die Aminosäuren dieser humanen neuronalen Calciumkanal-β₁-Untereinheit keine hydrophoben Segmente aufweisen, die in der Lage sind, Transmembrandomänen zu bilden, ist es unwahrscheinlich, dass β₁-Untereinheiten allein einen Ιonenkanal bilden können. Es ist wahrscheinlicher, dass eine homologe endogene α₁-Untereinheit in Oozyten existiert und dass die Aktivität, die durch eine solche α₁-Untereinheit vermittelt wird, durch die Expression einer humanen neuronalen β₁-Untereinheit verstärkt wird.
Es folgt ein Glossar, welches detaillierter jede Sequenz in dem Sequenzverzeichnis beschreibt:
SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Isoliertes Nukleinsäurefragment, welches für eine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals mit einer in SEQ-ID-Nr. 7 oder SEQ-ID-Nr. 8 angegebenen Aminosäuresequenz kodiert.
Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 mit der in SEQ-ID-Nr. 7 oder SEQ-ID-Nr. 8 angegebenen Sequenz von Nukleotiden.
Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenz von Nukleotiden die in SEQ-ID-Nr. 7 angegebenen Nukleotide 144 bis 7160 umfaßt.
Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Sequenz von Nukleotiden die in SEQ-ID-Nr. 8 angegebenen Nukleotide 144 bis 6854 umfaßt.
Eukaryotische Zelle, umfassend eine heterologe Nukleinsäure, wobei die heterologe Nukleinsäure mindestens eines der Nukleinsäurefragmente nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche umfaßt.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 5, wobei mindestens ein Nukleinsäurefragment für eine α₁-Untereinheit vom α_1B-Typ eines humanen Calciumkanals kodiert.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 5, welche einen funktionellen heterologen Calciumkanal aufweist, der mindestens eine Untereinheit enthält, die von den Nukleinsäurefragmenten der Ansprüche 1, 2 oder 3 kodiert wird.
Eukaryotische Zelle nach den Ansprüchen 5, 6 oder 7, ausgewählt aus HEK 293-Zellen, Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze und Maus-L-Zellen.
Eukaryotische Zelle mit einem funktionellen heterologen Calciumkanal, hergestellt durch ein Verfahren, welches das Einführen mindestens eines RNA-Transkripts, das von einem Nukleinsäurefragment nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2 oder 3 kodiert wird, in eine Zelle umfaßt, wobei der so hergestellte heterologe Calciumkanal mindestens eine humane Calciumkanal-Untereinheit einschließt, die von der eingeführten RNA kodiert wird.
Eukaryotische Zelle nach Anspruch 9, welche ein Amphibien-Oozyt ist.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, welche die Aktivität eines Calciumkanals moduliert, umfassend: Suspendieren einer eukaryotischen Zelle nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 10, welche einen funktionellen heterologen Calciumkanal aufweist, in einer Lösung, welche die Verbindung und ein calciumkanal-selektives Ion enthält; Depolarisieren der Zellmembran der Zelle; und Nachweisen des in die Zelle fließenden Stroms, wobei der nachgewiesene Strom sich von demjenigen unterscheidet, welcher durch Depolarisieren derselben oder einer im wesentlichen identischen Zelle in Anwesenheit desselben calciumkanal-selektiven Ions, jedoch in Abwesenheit der Verbindung, erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei vor dem Depolarisierungsschritt die Zelle bei einem Haltepotential gehalten wird, welches im wesentlichen Calciumkanäle inaktiviert, die für die Zelle endogen sind.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Zelle eine HEK-Zelle ist und die Untereinheiten des heterologen Calciumkanals von heterologer DNA kodiert werden.
Im wesentlichen reine α₁-Untereinheit eines humanen Calciumkanals, kodiert von der Nukleinsäure nach Anspruch 1.
Nukleinsäurefragment nach Anspruch 1, wobei der humane Calciumkanal ein humaner Nerven-Calciumkanal, ein humaner Skelettmuskel-Calciumkanal oder ein humaner Aorta-Calciumkanal ist.