DE69328549T2

DE69328549T2 - Für einen humanen serotoninrezeptor (5-ht4b) kodierende dns und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69328549T2
Application number: DE69328549T
Authority: DE
Inventors: Jonathan A Bard; Theresa Branchek; Richard L Weinshank
Original assignee: Synaptic Pharmaceutical Corp
Current assignee: Lundbeck Research USA Inc
Priority date: 1992-11-03
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 2000-08-24
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: CA2127117A1; FI952094A; EP0624100A1; KR950704001A; WO1994009828A1; US6083749A; US5985585A; NO951689L; US6432655B1; EP0624100A4; CA2127117C; DE69328549D1; EP0624100B1; ES2070104T1; NZ258320A; FI952094A0; HUT72837A; NO951689D0; JPH08506240A; FI111337B

Description

Hintergrund der Erfindung

In dieser Anmeldung wird auf verschiedene in Klammern stehende Veröffentlichungen, die unvollständig zitiert sind, Bezug genommen. Die vollständigen Zitate dieser Veröffentlichungen befinden sich am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Ansprüchen. Die Offenbarung dieser Veröffentlichungen sind in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme in dieser Anmeldung eingeschlossen, um den diese Erfindung betreffenden Stand der Technik umfassender zu beschreiben.
Der Gegenstand dieser Erfindung betrifft humane Serotoninrezeptor- (5-HT4B) codierende DNA und deren Verwendungen, wobei der "5-HT4B-Rezeptor" von dem Ausschuss für die Serotonin-Rezeptor-Namensgebung der IUPHAR in "5-HT&sub7;- Rezeptor" umbenannt wurde. Daher beziehen sich alle Ansprüche, die entweder direkt oder indirekt den 5-HT4B- Rezeptor und Nucleinsäuremoleküle, die den 5-HT4B-Rezeptor codieren, betreffen, auf den 5-HT&sub7;-Rezeptor und auf Nucleinsäuremoleküle, die den 5-HT&sub7;-Rezeptor codieren.
Die primäre Aminosäuresequenz und die Signaltransduktionsdaten wurden bis heute für vier klonierte 5-HT&sub1;--ähnliche Rezeptoren, drei klonierte 5-HT&sub2;-Rezeptoren und einen 5-HT&sub3;-ähnlichen Rezeptor veröffentlicht. Die Analyse der Seguenzhomologie sowie die Signaltransduktionswege dieser Rezeptoren führt auf der Basis dieser Merkmale zu ihrer Gruppierung: die 5-HT&sub1; Subfamilie umfasst: 5-HT1A (Fargin, 1988, Kobilka, 1989), 5-HT1B/5-HT1Dβ (Weinshank et al., 1991 und andere), 5-HT1Dα (Branchek et al., 1991, Hambin and Metcalf, 1991, Weinshank et al., 1992), 5- HTIE (Levy et al., 1992, McAllister et al., 1992, Zgombick et al., 1992) und 5-HTIF (Adham et al., 1993). Diese Subtypen haben > 50% transmembrane Aminosäureidentität gemeinsam und an der Inhibition von Adenylatcyclase beteiligt. Die 5-HT&sub2; Familie umfasst den 5-HT&sub2; (Pritchett et al., 1992), den 5-HTic (Julius et al., 1989) und den 5-HT2F -Rezeptor (Rat Stomach Fundus, Foquet et al., 1992; Kursar et al., 1992). Diese Rezeptoren weisen Aminosäureidentität von > 70% auf und sind an der Phosphoinositid-Hydrolyse beteiligt. Es wurde gezeigt, dass der 5-HT&sub3;-Rezeptor ein Ionenkanal ist (Maricq et al., 1991). Die Heterogenität der 5-HT&sub3;-Rezeptoren ist kontrovers, obwohl andere Liganden-kontrollierte Tonenkanäle bedeutende Heterogenität aufweisen. Es ist zu bemerken, dass in dieser Reihe die 5-HT&sub4;-Rezeptoren fehlen. Die second messenger Bindung in Gewebestudien weist auf die Aktivierung von Adenylatcyclase als erster Schritt der Signaltransduktion hin (Dumius et al., 1988, Bockaert et al., 1990). Hier berichten wir über die Klonierung eines ersten 5-HT- Rezeptors, der an der Stimulierung der Adenylatcyclaseaktivität beteiligt ist, wobei wir den Namen 5-HT4B vorschlagen. Die pharmakologischen Eigenschaften dieses Rezeptors weisen darauf hin, dass er Ähnlichkeit mit den funktionell definierten 5-HT-Rezeptoren aufweist, die in der Schweinehohlvene (Trevethick et al., 1984), der Katzen- Sapheniusvene, den Koronararterien (Cushing and Cohen, 1992) festgestellt wurden und verschiedene vaskuläre dilatorische Wirkungen haben (Mylecharane und Philipps, 1989). Die Rezeptoren scheinen die kontraktiven und relaxierenden Wirkungen in isolierten Blutgefäßen zu unterstreichen, was auf den potentiellen therapeutischen Nutzen bei Angina, koronarer Herzkrankheit, Arteriosklerose und möglicherweise zerebralen Blutgefäßstörungen, die zum Schlaganfall führen, hinweist. Die Gegenwart dieses Subtyps im ZNS weist außerdem auf deren potentielle Verwendung bei Störungen kognitiver Abläufe sowie bei der Kontrolle autonomer Wirkung hin.

Zusammenfassung der Erfindung

Der Umfang der beanspruchten Erfindung ist in den Ansprüchen 1 bis 66 am Ende dieser Anmeldung definiert.
Es wird außerdem daran gedacht, die Erfindung auf andere Weise zu verwenden, wobei die anderen Verwendungsmöglichkeiten derzeit kein Teil der beanspruchten Erfindung sind, aber die der Vollständigkeit halber diskutiert werden. Sie sind unten als (a) bis (m) aufgeführt (und sie sind nicht beansprucht, wobei aber die Verwendung einer oder mehrerer der beanspruchten Gegenstände daran beteiligt sind):
(a) Es kann ein transgener nicht humaner Säuger bereitgestellt werden, dessen Genom DNA umfasst, die einen Säuger 5-HT4B-Rezeptor codiert, wobei sie in dem Genom so positioniert ist, dass sie in Antisinn-niRNA transkribiert wird, die mit der mRNA komplementär ist, die den Säuger 5- HT4B-Rezeptor codiert, und bei der Hybridisierung der komplementären mRNA mit mRNA, die den Säuger 5-HT4B-Rezeptor codiert, die Translation der mRNA, die den Säuger 5-HT4B- Rezeptor codiert, verhindert wird.
(b) Es kann ein transgener nicht humaner Säuger bereitgestellt werden, dessen Genom DNA umfasst, die humanen 5-HT4B codiert, wobei sie in dem Genom so positioniert ist, dass sie in Antisinn-mRNA transkribiert wird, die mit der mRNA komplementär ist, die humanen 5-HT4B codiert, und bei der Hybridisierung komplementäre mRNA mit mRNA, die humanen 5-HT4B codiert, die Translation der mRNA, die humanen 5-HT4B codiert, verhindert wird.
(c) Es kann ein transgener nicht humaner Säuger bereitgestellt werden, dessen Genom DNA umfasst, die einen Säuger 5-HT4B-Rezeptor codiert, wobei sie in dem Genom so positioniert ist, dass sie in Antisinn-mRNA transkribiert wird, die mit der mRNA komplementär ist, die den Säuger 5- HTaß-Rezeptor codiert, und bei der Hybridisierung der Antisinn-mRNA mit mRNA, die den 5-HT4B-Rezeptor codiert, die Translation von mRNA, die den 5-HT4B-Rezeptor codiert, verhindert wird.
(d) Es kann ein transgener nicht humaner Säuger bereitgestellt werden, dessen Genom DNA umfasst, die einen humanen 5-HT4B-Rezeptor codiert, wobei sie in dem Genom so positioniert ist, dass sie in Antisinn-mRNA transkribiert wird, die mit der mRNA komplementär ist, die den humanen 5- HT4B-Rezeptor codiert, und bei der Hybridisierung der Antisinn-mRNA mit mRNA, die humanen 5-HT4B-Rezeptor codiert, die Translation von mRNA, die den 5-HT4B-Rezeptor codiert, verhindert wird.
(e) Es kann ein Verfahren zum Screenen von Medikamenten bereitgestellt werden, um Medikamente zu identifizieren, die mit einem Säuger 5-HT4B-Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle wechselwirken oder daran binden, umfassend das in Kontakt bringen einer Säugerzelle, die ein isoliertes einen Säuger 5- HTaß-Rezeptor codierendes DNA-Molekül umfasst, wobei das dadurch codierte Protein auf der Zelloberfläche mit einer Vielzahl von Medikamenten exprimiert wird, Bestimmen dieser Medikamente, die an die Säugerzelle binden, wodurch Medikamente identifiziert werden, die spezifisch mit einem Säuger 5-HT4B-Rezeptor wechselwirken und daran binden.
(f) Es kann ein Verfahren zum Screenen von Medikamenten bereitgestellt werden, um Medikamente zu identifizieren, die spezifisch mit einem humanen 5-HT4B-Rezeptor auf der Oberfläche der Zelle wechselwirken und daran binden, umfassend das in Kontakt bringen einer Säugerzelle, die ein isoliertes einen humanen 5-HT4B-Rezeptor codierendes DNA- Molekül umfasst, wobei das dadurch codierte Protein auf der Zelloberfläche mit einer Vielzahl von Medikamenten exprimiert wird, Bestimmen dieser Medikamente, die an die Säugerzelle binden, wodurch Medikamente identifiziert werden, die spezifisch mit einem humanen 5-HT4B-Rezeptor wechselwirken und daran binden.
(g) Es kann ein Verfahren bereitgestellt werden, um physiologische Wirkungen zu bestimmen, wenn verschiedene Gehalte des Säuger 5-HT4B-Rezeptors exprimiert werden, umfassend das Herstellen eines transgenen nicht humanen Tiers, wobei der Gehalt der Säuger 5-HT4B-Rezeptor-Expression durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors, der die Säuger 5-HT4B-Rezeptor-Expression reguliert, variiert wird.
(h) Es kann ein Verfahren bereitgestellt werden, um physiologische Wirkungen zu bestimmen, wenn verschiedene Gehalte des humanem 5-HT4B-Rezeptors exprimiert werden, umfassend das Herstellen eines transgenen nicht humanen Tiers, wobei das Expressionsniveau der humanen 5-HT4B- Rezeptor durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors, der die humane 5-HT4B-Rezeptor-Expression reguliert, variiert wird.
(i) Es kann ein Verfahren bereitgestellt werden, um physiologische Wirkungen zu bestimmen, wenn verschiedene Gehalte des Säuger 5-HT4B-Rezeptors exprimiert werden, umfassend das Herstellen eine Reihe von transgenen nicht humanen Tieren, wobei jedes eine unterschiedliche Menge des humanen 5-HT4B-Rezeptors exprimiert.
(k) Es kann ein Verfahren bereitgestellt werden zur Diagnose einer Prädisposition einer Störung, die mit der Expression eines humanen 5-HT4B-Rezeptor-Allels verbunden ist, umfassend: (a) Erhalten von DNA von Patienten, die unter dieser Störung leiden, (b) Durchführen eines Restriktionsverdaus der DNA mit einer Reihe von Restriktionsenzymen, (c) elektrophoretisches Trennen der resultierenden DNA-Fragmente auf einem Gel nach Größen, (d) in Kontakt bringen des resultierenden Gels mit einer Nucleinsäuresonde, die spezifisch an DNA hybridisieren kann, die einen 5-HT4B-Rezeptor codiert und Markieren mit einem nachweisbaren Marker, (e) Nachweisen der markierten Banden, die mit der DNA hybridisierten, die einen 5-HT4B-Rezeptor codieren, der mit einem nachweisbaren Marker markiert ist, um ein einzelnes Sondenmuster zu ermitteln, das spezifisch für die DNA der Patienten ist, die unter der Störung leiden, (f) Herstellen der erhaltenen DNA zur Diagnose durch die Schritte (a) bis (e), und (g) Vergleichen des einzelnen Bandenmusters, das spezifisch für die DNA der Patienten ist, die unter der Störung leiden, aus Schritt (e) und der zur Diagnose erhaltenen DNA aus Schritt (f), um zu bestimmen, ob die Muster die gleichen sind.
(1) Es kann ein Verfahren bereitgestellt werden zur Bestimmung, ob ein Substrat, von dem bekannt ist, dass es nicht an den Säuger 5-HT4B-Rezeptor bindet, an einen Säuger 5-HT4B-Rezeptor bindet, umfassend das in Kontakt bringen einer Säugerzelle, die ein isoliertes den Säuger 5-HT4B- Rezeptor codierendes DNA-Molekül umfasst, mit dem Substrat unter Bedingungen, die die Bindung von Substraten, von denen bekannt ist, dass sie an den 5-HT4B-Rezeptor binden, ermöglicht, Nachweisen der Gegenwart der an den 5-HT4B- Rezeptor gebundenen Substrate, wodurch bestimmt wird, ob das Substrat an den 5-HT4B-Rezeptor bindet.
(m) Es kann ein Verfahren bereitgestellt werden zur Bestimmung, ob ein Substrat, von dem bekannt ist, dass es nicht an einen humanen 5-HT4B-Rezeptor bindet, an einen humanen 5-HT4B-Rezeptor bindet, umfassend das in Kontakt bringen einer Säugerzelle, die ein isoliertes den humanen 5- HT4B-Rezeptor codierendes DNA-Molekül umfasst, mit dem Substrat unter Bedingungen, die die Bindung von Substraten, von denen bekannt ist, dass sie an einen humanen 5-HT4B- Rezeptor binden, ermöglicht, Nachweisen der Gegenwart der an den 5-HT4B-Rezeptor gebundenen Substrate, wodurch bestimmt wird, ob die Substrate an den 5-HT4B-Rezeptor binden.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1 Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz eines neuen humanen 5-HT4B-Serotonin-Rezeptors. Die Nucleotide sind in der 5' zu 3'-Orientierung dargestellt und der codierende Bereich ist nummeriert beginnend mit dem Anfangs-Methionin und endend mit dem Endcodon. Die durch die Translation des langen offenen Leserahmens abgeleitete Aminosäuresequenz ist zusammen mit den 5'- und 3'- nicht-translatierten Bereichen gezeigt. Die Nummern am linken und rechten Rand stellen die Nucleotide (obere Linie) und die Aminosäure (untere Linie) dar, wobei die erste Position jeweils Adenosin (A) und Anfangsmethionin (M) ist.
Fig. 2 Sequenzanordnung des humanen 5-HT4B-Rezeptorklons (genannt hp78a) mit 5-HT1A, 5-HT1Dα, 5-HT1Dβ, 5-HT1E und 5-HT1F. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des humanen 5-HT4B-Rezeptors (erste Linie) beginnend vom Anfangsmethionin (M) bis zum Stopcodon (*) ist angeordnet mit dem humanen 5-HT1A- Serotoninrezeptorklon (Kobilka et al., 1987), dem 5-HT1Dα Serotoninrezeptorklon (Hamblin et al., 1991, Weinshank et al., 1992, Demchyshyn et al., 1992), dem 5-HT1Dβ Serotoninrezeptörklon (Jin et al., 1992, Weinshank et al., 1992), dem 5-HT1E Serotoninrezeptorklon (Zgombick et al., 1992, McAllister et al., 1992 und dem 5-HT1F (Adham et al., eingereicht). Gedankenstriche stellen zusätzliche Zwischenräume dar, die für eine genaue Anordnung notwendig sind. Die graue Schattierung deutet auf Reste in den Rezeptorklonen hin, die mit dem humanen 5-HT4B-Rezeptor identisch sind. Die Nummern über den Aminosäuresequenzen entsprechen den Aminosäurenpositionen des humanen 5-HT4B- Rezeptors, beginnend mit dem Anfangsmethionin (M) und endend mit dem Terminationscodon (*), wobei Zwischenräume für die richtige Anordnung eingesetzt wurden.
Fig. 3 Humane Gewebeverteilung der mRNA, die das 5-HT4B- Rezeptor-Gen codiert. Die gesamte RNA, die aus verschiedenen humanen Geweben isoliert wurde, wurde in einzelsträngige cDNA durch Random-Priming mit Reverser Transkriptase umgewandelt. Die cDNA wurden durch PCR unter Verwendung funktioneller hp78a-spezifischer PCR-Primer amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,5-%igen Agarosegel laufen gelassen, auf Nylonmembranen blottiert und mit internen genspezifischen Oligonucleotiden hybridisiert. Die positive Kontrolle war ein genspezifisches rekombinantes Plasmid, dH&sub2;O diente als negative Kontrolle. Die PCR-Amplifizierung und das Southern-Blotting der RNA-Proben, die nicht mit der Reversen Transkriptase behandelt worden waren, waren negativ.
Fig. 4 Stimulierung der cAMP Herstellung durch 5-HT in transient transfizierten Cos-7 Zellen, die den klonierten humanen 5-HT4B-Rezeptor exprimieren. cAMP-Messungen auf intakten Zellen wurden wie in "Verfahren und Materialien" beschrieben durchgeführt. Jeder Datenpunkt stellt den Wert von drei Untersuchungen aus einem einzelnen Experiment, das zumindest für zwei andere repräsentativ ist, dar. Die Stäbe zeigen die Standardabweichungen des Mittelwertes. Die Daten sind dargestellt als prozentuale Grundabgabe von cAMP (Grundwert: 0,053 +/- 0,004 pmol(ml/10 min).
Fig. 5 Stimulierung der cAMP Herstellung durch 5-CT in transient transfizierten Cos-7 Zellen, die den klonierten humanen 5-HT4B-Rezeptor exprimieren. Die cAMP-Messungen auf intakten Zellen wurden wie in "Verfahren und Materialien" beschrieben durchgeführt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von drei Untersuchungen aus einem einzelnen Experiment, das für zumindest zwei andere repräsentativ ist, dar. Die vertikalen Stäbe zeigen die Standardabweichungen des Mittelwertes. Die Daten sind dargestellt als prozentuale Grundabgabe von cAMP (Grundwert: 0,053 +/- 0,004 pmol(ml/10 min).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Diese Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das einen Säuger 5-HT4B-Rezeptor codiert. Diese Erfindung stellt außerdem ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das einen humanen 5-HT4B-Rezeptor codiert. Hier bedeutet der Ausdruck "isoliertes Nucleinsäuremolekül" ein nicht in der Natur vorkommendes Nucleinsäuremolekül, das heißt, ein Molekül in einer Form, die nicht in der Natur auftritt. Beispiele eines solchen isolierten Nucleinsäuremoleküls sind ein RNA-, cDNA- oder isoliertes Genom-DNA-Molekül, das einen Säuger 5-HT4B-Rezeptor oder einen humanen 5-HT4B-Rezeptor codiert. Hier bedeutet "5-HT4B- Rezeptor" ein Molekül, das unter physiologischen Bedingungen im wesentlichen spezifisch für den Neurotransmitter Serotonin ist, eine starke Affinität für Serotonin aufweist und dessen Aktivierung mit der Aktivierung von Adenylatcyclase verbunden ist. Eine erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das einen Säuger 5-HT4B- Rezeptor codiert. Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das einen humanen 5-HT4B- Rezeptor codiert. Ein solches Molekül kann codierende Sequenzen aufweisen, die im wesentlichen mit den in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenzen übereinstimmen. Das DNA- Molekül der Fig. 1 (Sequenz ID Nr. 1) codiert einen humanen 5-HT4B Rezeptor. Ein Verfahren zur Isolierung eines Säuger 5-HT4B Rezeptors ist, eine Säuger-Genombibliothek mit einer natürlichen oder künstlich entworfenen DNA Sonde zu sondieren, wobei im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Säuger 5-HT4B Rezeptor ein humanes Protein, und das Nukleinsäuremolekül, das den humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, wird aus einer humanen Genombibliothek und einer humanen cDNA-Bibliothek isoliert. Überlappende transmembrane Oligonucleotidsonden, die von dem Drosophila Serotonin Rezeptorgen DRO5HTR abstammen, sind nützliche Sonden für diesen Zweck. Die DNA- und cDNA-Moleküle, die den humanen 5-HT4B Rezeptor codieren, werden verwendet, um komplementäre Genom-DNA, cDNA oder RNA aus Menschen, Säugern oder anderen Tieren zu erhalten oder um verwandte cDNA oder Genomklone durch Screenen von cDNA- oder Genombibliotheken zu isolieren, indem Verfahren verwendet werden, die nachfolgend genauer beschrieben sind. Die transkriptionalen Regulationselemente des 5' nicht-translatierten Bereichs des isolierten Klons und andere Stabilitäts-, Processing-, Transkriptions-, Translations- und Gewebespezifitätbestimmende Bereiche der 3' und 5' nicht-translatierten Bereiche des isolierten Gens werden dadurch erhalten.
Diese Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das derart mutiert ist, dass es kein Molekül mit normaler 5-HT4B Rezeptor Aktivität codieren und keinen natürlichen 5-HT4B Rezeptor exprimieren kann. Ein Beispiel eines mutierten Nucleinsäuremoleküls, das erfindungsgemäß bereitgestellt wird, ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das im Leserahmen ein Stopcodon aufweist, das in die codierende Sequenz eingeführt ist, so dass die transkribierte RNA nicht in ein Protein translatiert wird.
Diese Erfindung stellt außerdem ein cDNA-Molekül bereit, das einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, wobei das cDNA-Molekül eine codierende Sequenz aufweist, die im wesentlichen mit der in Fig. 1 gezeigten Sequenz (Sequenz ID Nr. 1) übereinstimmt. Diese Erfindung stellt außerdem ein cDNA- Molekül bereit, das einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, wobei das cDNA-Molekül eine codierende Sequenz aufweist, die im wesentlichen mit der in Fig. 1 gezeigten Sequenz (Sequenz ID Nr. 1) übereinstimmt. Diese Moleküle und ihre Äquivalente wurden durch die oben beschriebenen Verfahren erhalten.
Diese Erfindung stellt außerdem ein isoliertes Protein bereit, das einen Säuger 5-HT4B Rezeptor darstellt. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Protein ein humanes 5-HT4B Rezeptorprotein mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen ähnlich wie die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz (Sequenz ID Nrn. 1 und 2) ist. In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Protein ein murines 5-HT4B Rezeptorprotein mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen ähnlich wie die in Fig. 1 gezeigte Aminosäuresequenz (Sequenz ID Nrn. 1 und 2) ist. Der Ausdruck "isoliertes Protein", wie er hier verwendet wird, soll ein Proteinmolekül umfassen, das frei von anderen zellulären Komponenten ist. Ein Verfahren zum Erhalt eines isolierten Säuger 5-HT4B Rezeptorproteins besteht darin das DNA, die den 5-HT4B Rezeptor codiert in einem geeigneten Wirt, wie einer Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren exprimiert wird und nach der Expression in einem solchen Wirt das Rezeptorprotein gewonnen wird, wobei wiederum im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. Der Rezeptor kann außerdem aus Zellen isoliert werden, die ihn exprimieren, insbesondere aus Zellen, die mit Expressionsvektoren transfiziert sind, und die nachfolgend detailliert beschrieben werden.
Diese Erfindung stellt einen Vektor bereit, der ein isoliertes Nucleinsäuremolekül umfasst, wie DNA, RNA oder cDNA, die einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codieren. Diese Erfindung stellt außerdem einen Vektor bereit, der ein isoliertes Nucleinsäuremolekül umfasst, wie DNA, RNA oder cDNA, die einen humanen 5-HT4B Rezeptor codieren. Vektorbeispiele sind Viren, wie Bakteriophagen (einschließlich des Phagen Lambda, wobei nicht auf ihn eingschränkt werden soll), Viren von Tieren (einschließlich des Baculovirus, murinen Leukämievirus und Herpesvirus, wobei nicht auf diese eingeschränkt werden soll), Cosmide, Plasmide (wie pUClB, erhältlich von Pharmacia, Piscataway, NJ) und andere Rekombinationsvektoren. Die Nucleinsäuremoleküle werden in Vektorgenome eingeführt, indem Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispiele solcher Plasmide sind Plasmide, umfassend cDNA mit einer codierenden Sequenz, die im wesentlichen mit der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz (Sequenz ID Nr. 1) übereinstimmt und der als pcEXV-5-HT4B bezeichnete Klon, der unter der ATCC Zugangsnummer 75332 hinterlegt ist.
Alternativ kann zum Erhalt dieser Vektoren sowohl Insert- als auch Vektor-DNA einem Restriktionsenzym ausgesetzt werden, um komplementäre Enden an beiden Molekülen herzustellen, die miteinander eine Basenpaarung eingehen und anschließend mit einer Ligase miteinander ligiert werden. Alternativ können Linker mit der Insert-DNA ligiert werden, die einer Restriktionsstelle in der Vektor-DNA entspricht, wobei anschließend mit dem Restriktionsenzym verdaut wird, das an dieser Stelle schneidet. Andere Wege stehen außerdem zur Verfügung.
Diese Erfindung stellt außerdem zur Verfügung Vektoren, umfassend ein DNA-Molekül, das einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert und Vektoren, umfassend ein DNA-Molekül, das einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, wobei sie auf die Expression in einer Bakterien-, Hefe- oder Säugerzelle angepasst sind, die zusätzlich die Regulationselemente umfasst, die zur Expression der DNA in Bakterien-, Hefe-, Säuger- oder Insektenzellen notwendig sind, wobei sich diese im Verhältnis zu der DNA, die einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, oder zu der DNA, die einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, an Stellen befinden, die deren Expression ermöglichen. Die DNA, die codierende Sequenzen aufweist, die im wesentlichen mit der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz übereinstimmen, kann in diese Vektoren eingeführt werden, um einen humanen 5-HT4B Rezeptor zu codieren. Regulationselemente, die zur Expression erforderlich sind, umfassen Promotorsequenzen zur RNA-Polymerasebindung und Transkriptionsanfangssequenzen zur Ribosomenbindung. Zum Beispiel umfasst ein bakterieller Expressionsvektor einen Promotor, wie den lac-Promotor, und zum Transkriptionsstart die Shine-Dalgarno-Sequenz und das Startcodon AUG (Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). In ähnlicher Weise umfasst ein eukaryontischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für die RNA-Polymerase II, ein stromabwärts liegendes Polyadenylierungssignal, das Startcodon AUG und ein Endcodon zum Abtrennen des Ribosoms. Außerdem verwendet ein Insektenexpressionvektor die Polyhedringenexpressionssignale zur Expression des eingeführten Gens in Insektenzellen. Solche Vektoren sind im Handel erhältlich oder können aus Sequenzen zusammengestellt werden, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren, zum Beispiel dem Verfahrenzur Herstellung von Vektoren im allgemeinen, das oben beschrieben wird. Die Expressionsvektoren sind nützlich zur Herzustellung von Zellen, die Rezeptoren exprimieren. Bestimmte Verwendungen solcher Zellen sind nachfolgend detaillierter beschrieben.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Plasmid zur Expression in einer Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder insbesondere Säugerzelle angepasst, wobei das Plasmid ein DNA-Molekül, das einen Säuger 5-HT4B Rezeptor, oder ein DNA- MOlekül, das einen humanen 5-HT4B Rezeptor, und Regulationselemente, die zur Expression der DNA in der Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle notwendig sind, umfasst, wobei sich diese im Verhältnis zu der DNA, die einen Säuger 5-HT4B Rezeptor oder zu der DNA, die einen humanen 5- HT4B Rezeptor codiert, dort befinden, dass deren Expression ermöglicht wird. Geeignete Plasmide sind Plasmide, die auf die Expression in einer Säugerzelle angepasst sind, z. B. EVJB, EXV-3, sind aber nicht auf diese beschränkt. Ein Beispiel eines solchen Plasmids, das auf die Expression in einer Säugerzelle angepasst ist, ist ein Plasmid, umfassend cDNA, die codierende Sequenzen aufweist, die im wesentlichen mit der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz (Sequenz ID Nr. 1) übereinstimmen und Regulationselemente, die zur Expression der DNA in der Säugerzelle notwendig sind. Dieses Plasmid wurde pcEXV-5-5-HT4B genannt und ist unter der ATCC- Hinterlegungsnummer 75332 hinterlegt. Für den Fachmann ist verständlich, dass zahlreiche Plasmide, die auf die Expression in einer Säugerzelle angepasst sind, und DNA, die einen Säuger- oder humanen 5-HT4B Rezeptor codieren und Regulationselemente, die notwendig sind, um eine solche DNA in einer Säugerzelle zu exprimieren, umfassen, hergestellt werden können, wobei vorhandene Plasmide verwendet werden, die in geeigneter Weise angepasst sind, um Regulationselemente zu enthalten, die notwendig sind, um die DNA in der Säugerzelle zu exprimieren. Die Plasmide können durch die oben beschriebenen Verfahren zur Expression von Vektoren und Vektoren im allgemeinen und durch andere im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden.
Die supra diskutierte Hinterlegung wurde gemäß den Voraussetzungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei der American Type Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt.
Diese Erfindung stellt eine Säugerzelle bereit, umfassend ein DNA-Molekül, das einen Säuger 5-HT4B Rezeptor, codiert, z. B. eine Säugerzelle, die ein Plasmid umfasst, das zur Expression in einer Säugerzelle angepasst ist, indem es umfasst ein DNA- Molekül, das einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, und Regulationselemente, die zur Expression der DNA in der Säugerzelle notwendig sind und die sich im Verhältnis zu der DNA, die einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, dort befinden, dass sie deren Expression ermöglichen. Zahlreiche Säugerzellen können als Wirte verwendet werden, einschließlich - aber nicht darauf beschränkt - die Mäuse Fibroblastenzelle NIH3T3, CHO Zellen, HeLa Zellen, LM (tk-) Zellen, Cos Zellen usw.. Die Expressionsplasmide (wie die supra beschriebenen) können verwendet werden, um Säugerzellen durch Verfahren zu transfektieren, die im Stand der Technik bekannt sind, z. B. durch Calciumphosphatausfällung, oder aber DNA, die einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, kann auf andere Weise in Säugerzellen eingeführt werden, z. B. durch Mikroinjektion, um Säugerzellen zu erhalten, die DNA umfassen, z. B. cDNA oder ein Plasmid, das einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert. LM (tk-) Zellen, die das Plasmid pcEXV-5-HT4B umfassen und exprimieren, wurden wie oben beschrieben, bei der ATCC unter Erhalt der ATCC Hinterlegungsnummer CRL 11166 hinterlegt.
Diese Erfindung stellt eine Nucleinsäuresonde bereit, umfassend ein Nucleinsäuremolekül mit mindestens 15 Nucleotiden, das spezifisch mit einer Sequenz hybridisieren kann, die in der Sequenz eines einen humanen 5-HT4B Rezeptor codierenden Nucleinsäuremoleküls enthalten ist, zum Beispiel mit einer codierenden Sequenz, die in der in Fig. 1 gezeigten Sequenz (Sequenz ID Nr. 1) enthalten ist. Der Ausdruck "spezifisches Hybridisieren", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit eines Nucleinsäuremoleküls, eine Nucleinsäuresequenz zu erkennen, die mit ihrer eigenen komplementär ist, und Doppelhelix-förmige Segmente durch Wasserstoffbindung zwischen den komplementären Basenpaaren zu bilden. Die Technologie von den Nucleinsäuresonden ist dem Fachmann bekannt, für den verständlich ist, dass solche Sonden sich in ihrer Länge stark unterscheiden können, und zum Beispiel mit einem Radioisotop oder einem fluoreszierenden Farbstoff markiert sein können, um den Nachweis der Sonde zu erleichtern. Der Nachweis der Nucleinsäure, die einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, ist als diagnostischer Test für jeden Krankheitsverlauf nützlich, bei dem die Expressionsniveaus des 5-HT4B Rezeptor verändert sind. DNA-Sondenmoleküle werden hergestellt durch Einführen eines DNA-Moleküls, das einen 5-HT4B Rezeptor codiert oder dessen Fragmente in geeignete Vektoren, z. B. in Plasmide oder Bakteriophagen, mit anschließender Einführung in geeignete Bakterien Wirtszellen und Replizieren und Ernten der DNA- Sonden, wobei im Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel kann die DNA aus einem Zell- Lysat unter Verwendung von Phenol und Ethanol extrahiert, mit Restriktionsenzymen, die der Insertionsstelle der DNA in den Vektor (oben diskutiert) entsprechen, verdaut, elektrophorisiert und aus dem resultierenden Gel ausgeschnitten werden. Ein Beispiel eines solchen DNA- Moleküls ist in Fig. 1 gezeigt. Die Sonden sind nützlich zur "in-Situ" Hybridisierung, um Gewebe aufzufinden, das diese Genfamilie exprimiert oder für andere Hybridisierungsassays, um das Vorhandensein ihrer Gene oder ihrer mRNA in verschiedenen biologischen Geweben festzustellen. Außerdem sind synthetisierte Oligonucleotide (hergestellt durch einen DNA Synthetisierer), die mit der Sequenz eines DNA-Moleküls komplementär sind, die einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codieren oder mit der Sequenz eines DNA-Moleküls komplementär sind, die einen humanen 5-HT4B Rezeptor codieren, als Sonden nützlich für diese Gene, für ihre damit verbundene mRNA, oder zur Isolierung der verwandten Gene durch Homologie-Screening von Genom- oder cDNA-Bibliotheken oder zur Verwendung der Amplifikationstechniken, wie der Polymerasekettenreaktion.
Diese Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Nachweis der Expression eines humanen 5-HT4B Rezeptors auf der Oberfläche einer Zelle, indem die Gegenwart der mRNA, die einen 5-HT4B Rezeptor codiert, nachgewiesen wird. Diese Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Nachweis der Expression eines Säuger 5-HT4B Rezeptors auf der Zelloberfläche, indem die Gegenwart der mRNA, die einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, nachgewiesen wird. Diese Verfahren umfassen das Erhalten der gesamten mRNA aus den Zellen durch Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren, bei Hybridisierungsbedingungen das in Kontakt bringen der so erhaltenen mRNA mit einer Nucleinsäuresonde, wie zuvor beschrieben, und das Nachweisen der mit der Sonde hybridisierten mRNA, wodurch die Expression des Rezeptors durch die Zelle nachgewiesen wird. Die Hybridisierung der Sonden an Zielnucleinsäuremoleküle, wie mRNA Moleküle, erfolgt durch im Stand der Technik bekannte Techniken. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Nucleinsäuren aus lysierten Zellen durch Ausfällung extrahiert, und die mRNA wird aus dem Extrakt unter Verwendung einer Säule, die an die Poly-A-Enden der mRNA Moleküle bindet, isoliert (Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Eine Nitrozellulosemembran wird anschließend mit der mRNA und einer radioaktiv markierten Sonde behandelt, wobei die Sonde mit komplementären mRNA Sequenzen hybridisiert und diese markiert. Die Bindung kann durch Autoradiographie oder Scintillationszählung nachgewiesen werden. Andere Verfahren zur Durchführung dieser Schritte sind dem Fachmann jedoch bekannt und die obige Diskussion ist nur ein Beispiel.
Die Erfindung stellt ein Antisinn-Oligonucleotid bereit, das eine Sequenz aufweist, die spezifisch binden kann an Sequenzen eines mRNA-Moleküls, das einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, um dadurch die Translation des humanen 5- HTas Rezeptors zu verhindern. Die Erfindung stellt außerdem ein Antisinn-Oligonucleotid bereit, das eine Sequenz aufweist, die spezifisch binden kann an Sequenzen eines mRNA- Moleküls, das einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, um dadurch die Translation des Säuger 5-HT4B Rezeptors zu verhindern. Der Ausdruck "spezifisches Binden", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Fähigkeit eines Antisinn- Oligonucleotids, eine Nucleinsäuresequenz zu erkennen, die mit seiner eigenen komplementär ist und durch Wasserstoffbindung zwischen den komplementären Basenpaaren Doppelhelix-förmige Segmente zu bilden. Das Antisinn- Oligonucleotid kann eine Sequenz aufweisen, die spezifisch an Sequenzen des cDNA-Moleküls binden kann, dessen Sequenz in Fig. 1 gezeigt ist. Ein bestimmtes Beispiel eines Antisinn- Oligonucleotids ist ein Antisinn-Oligonucleotid, das chemische Analoga von Nucleotiden umfasst.
Diese Erfindung stellt außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine wirksame Menge des oben beschrieben Nucleotids, um wirksam die Expression eines humanen 5-HT4B Rezeptors zu verringern, indem es die Zellmembran passiert und spezifisch an mRNA bindet, die den 5-HT4B Rezeptor in der Zelle codiert, wodurch dessen Translation verhindert wird und einen pharmzeutisch annehmbaren hydrophoben Träger, der die Zellmembran passieren kann. Die Erfindung stellt außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine wirksame Menge des oben beschrieben Oligonucleotids, um wirksam die Expression eines Säuger 5-HT4B Rezeptors zu verringern, indem es die Zellmembran passiert und spezifisch in der Zelle an mRNA bindet, die einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, um dadurch dessen Translation zu verhindern und einen pharmzeutisch annehmbaren hydrophoben Träger, der eine Zellmembran passieren kann. Der Ausdruck "pharmzeutisch annehmbarer Träger", wie er hier verwendet wird, umfasst jeden pharmazeutischen Standardträger, z. B. eine Phosphatkomponente, eine Kochsalzlösung, eine Wasser und Emulsionen, wie eine Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion, und verschiedene Arten von Vernetzungsmitteln. Das Oligonucleotid kann an eine Substanz gebunden werden, die mRNA inaktiviert, wie ein Ribosom. Der pharmzeutisch annehmbare hydrophobe Träger, der Zellmembranen passieren kann, kann außerdem eine Struktur umfassen, die an einen Transporter bindet, der für einen ausgewählten Zelltyp spezifisch ist, und daher von Zellen des ausgewählten Zelltyps aufgenommen wird. Die Struktur kann ein Teil eines Proteins sein, von dem bekannt ist, dass es an einen Transporter, der für einen Zelltyp spezifisch ist, bindet, zum Beispiel ein Insulinmolekül, das auf Bauchspeicheldrüsenzellen gerichtet ist. DNA-Moleküle mit einer codierenden Sequenz, die im wesentlichen mit den in Fig. 1 codierenden Sequenzen übereinstimmt, können als Oligonucleotide der pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Behandeln von Abnormalitäten, die durch die Verringerung der Expression des 5-HT4B Rezeptors vermindert auftreten. Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge der oben beschriebenen Zusammensetzung an eine Versuchsperson oder ein Versuchstier, um die Expression des 5-HT4B Rezeptors zu verringern.
Diese Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Behandeln eines abnormalen Zustands, der die 5-HT4B Rezeptoraktivität betrifft, umfassend die Verabreichung einer Menge der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung an eine Versuchsperson oder ein Versuchstier, um die Expression des 5-HT4B Rezeptors wirksam zu verringern. Beispiele solcher abnormaler Zustände sind Angina, koronare Herzkrankheit, Arteriosklerose, zerebrale Blutgefäßstörungen, die zum Schlaganfall führen, Reizkolon oder andere Störungen der gastrointestinalen Motilität, Störungen des ZNS, Schmerzempfindung, affektive Psychosen, Störungen kognitiver Abläufe, einschließlich Schizophrenie, aber nicht darauf beschränkt, sowie Kontrolle autonomer Wirkung.
Die Antisinn-Oligonucleotid-Medikamente inhibieren die Translation der den 5-HT4B Rezeptor codierenden mRNA. Synthetische Antisinn-Oligonucleotide oder andere chemische Antisinn-Strukturen werden entworfen, um an die den 5-HT4B Rezeptor codierende mRNA zu binden und die Translation der mRNA zu inhibieren und sind nützlich als Medikamente zur Inhibition der Expression der 5-HT4B Rezeptor-Gene in Patienten. Die Erfindung stellt Mittel bereit, um therapeutisch Expressionsniveaus eines humanen oder Säuger 5- HTas Rezeptors zu ändern, indem ein synthetisches Antisinn- Oligonucleotid-Medikament (SAOD) verwendet wird, das die Translation der den 5-HT4B Rezeptor codierenden mRNA inhibiert. Synthetische Antisinn-Oligonucleotide oder andere chemische Antisinn-Strukturen, die zum Erkennen und selektiven Verbinden an mRNA entworfen wurden, werden hergestellt, um mit Teilen der in Fig. 1 gezeigten Nucleotidsequenz, mit DNA, RNA oder chemisch modifizierten, künstlichen Nucleinsäuren komplementär zu sein. Das SAOD wird so entworfen, dass es im Blutkreislauf stabil ist, oder dass es unter Zellkulturbedingungen im Labor stabil ist, um es in die vom Patienten entfernten Zellen zu geben. Das SAOD wird so entworfen, dass es die Zellmembran passieren kann, um in das Cytoplasma der Zelle einzutreten durch physikalische und chemische Eigenschaften des SAODs, wodurch es Zellmembranen passieren kann (z. B. durch Entwerfen von kleinen, hydrophoben chemischen SAOD Strukturen) oder durch spezifische Transportsysteme in der Zelle, die das SAOD erkennen und in die Zelle transportieren. Außerdem kann das SAOD so entworfen werden, dass es nur an bestimmte ausgewählte Zellpopulationen verabreicht werden kann, indem das SAOD derart entworfen wird, dass es von spezifischen zellulären Aufnahmemechanismen erkannt wird, die das SAOD nur innerhalb bestimmter ausgewählter Zellpopulationen binden und aufnehmen. Zum Beispiel kann das SAOD so entworfen werden, dass es an einen Transporter bindet, der nur in einem bestimmten Zelltyp festgestellt wurde, wie oben beschrieben. Das SAOD kann außerdem so entworfen werden, dass es die mRNA- Zielsequenz, die einer Sequenz entspricht, die in der Fig. 1 gezeigten Sequenz enthalten ist, erkennt und selektiv an die mRNA durch komplementäre Basenpaarung bindet. Letzlich kann das SAOD so entworfen werden, dass es die mRNA-Zielsequenz durch einen der drei Mechanismen inaktiviert: 1) durch Binden der Ziel-mRNA, wodurch der Abbau der mRNA durch intrinsische zelluläre Mechanismen, wie RNAse I Verdau, ausgelöst wird, 2) durch Inhibieren der Translation der ZielmRNA, indem die Bindung von Translations-regulierenden Faktoren oder Ribosomen beeinträchtigt wird, oder 3) durch Einführen anderer chemischer Strukturen, wie Ribosomsequenzen oder reaktive chemische Gruppen, die entweder die Ziel-mRNA abbauen oder chemisch modifizieren. Es wurde gezeigt, dass synthetische Antisinn-Oligonucleotid-Medikamente die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, wenn sie gegen ZielmRNA gerichtet sind (J. S. Cohen, Trends in Pharm. Sci. 10, 435 (1989), H. M. Weintraub. Sci. Am. Januar (1990) Seite 40). Außerdem ist die Bindung der Ribosomen an Antisinn- Oligonucleotide eine vielversprechende Strategie zur Inaktivierung von Ziel-mRNA (N. Sarver et al., Science 247, 1222 (1990)). Ein SAOD dient als wirksames therapeutisches Mittel, wenn es so entworfen wird, dass es an einen Patienten durch Injektion verabreicht werden kann, oder, wenn die Zielzellen des Patienten entfernt, mit dem SAOD im Labor behandelt und in den Patienten zurückgeführt werden. Auf diese Weise dient ein SAOD als Therapie zur Reduzierung der 5-HT4B Rezeptor Expression in bestimmten Zielzellen eines Patienten, bei jedem klinischen Zustand, der von einer reduzierten Expression des 5-HT4B Rezeptors profitieren kann.
Die Erfindung stellt einen Antikörper bereit, der gegen den humanen 5-HT4B Rezeptor gerichtet ist. Die Erfindung stellt außerdem einen Antikörper bereit, der gegen den Säuger 5-HT4B Rezeptor gerichtet ist. Der Antikörper kann zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper umfassen, der gegen ein Epitop eines humanen 5-HT4B Rezeptors, das auf der Zelloberfläche vorhanden ist, gerichtet ist, wobei das Epitop eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen mit einer Aminosäuresequenz eines Zelloberflächenepitops des humanen 5- HT4B Rezeptors übereinstimmt, wobei die in der Fig. 1 gezeigte Sequenz eingeschlossen ist. Aminosäuresequenzen können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie hydrophobe oder hydrophile Bereiche in den Proteinen, die sie bilden, herstellen. Im Fall von Zellmembranproteinen ist von hydrophoben Bereichen bekannt, dass sie den Teil des Proteins bilden, der in die die Zellmembran-bildende biomolekulare Fettschicht eingeführt wird, wohingegen sich hydrophile Bereiche auf der Zelloberfläche in einer wässrigen Umgebung befinden. Daher binden Antikörper gegen die in Fig. 1 gezeigten hydrophilen Aminosäuresequenzen an ein Oberflächenepitop eines 5-HT4B Rezeptors, wie zuvor beschrieben. Antikörper, die gegen einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor gerichtet sind, können von Serum abstammen oder monoklonal sein und werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt. Zum Beispiel werden monoklonale Antikörper unter Verwendung der Hybridomtechnik durch Verbinden von B-Zellen-herstellenden Antikörpern aus immunisierten Tieren mit Myelomzellen und Auswählen der den gewünschten Antikörper-herstellenden resultierenden Hybridomzell-Linie hergestellt. Zellen, wie NIH3T3 Zellen oder LM (tk&supmin;) Zellen, können als Immunogene verwendet werden, um Antikörper zu züchten. Alternativ können synthetische Peptide unter Verwendung herkömmlich erhältlicher Vorrichtungen und die in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen hergestellt werden. Außerdem kann DNA, wie eine cDNA oder ein Fragment davon, kloniert, exprimiert, das resultierende Polypeptid gewonnen und als Immunogen verwendet werden. Dieser Antikörper ist nützlich, um die Gegenwart des von der isolierten DNA codierten 5-HT4B Rezeptors nachzuweisen oder die Wirkung des 5-HT4B Rezeptors in Tieren, Menschen oder biologischen Geweben oder Flüssigkeiten, die von Tieren oder Menschen isoliert wurden, zu inhibieren.
Diese Erfindung stellt außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine wirksame Menge eines Antikörpers, der gegen ein Epitop des humanen oder Säuger 5- HT4B Rezeptors gerichtet ist, um die Bindung von natürlich vorkommender Substrate an den 5-HT4B Rezeptor wirksam zu blockieren, und einen pharmzeutisch annehmbaren Träger. Ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein auf der Zelloberfläche vorhandenes Epitop des humanen 5-HT4B Rezeptors gerichtet ist, und der eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen mit der Aminosäuresequenz des Zelloberflächenepitops des 5-HT4B Rezeptors übereinstimmt, wobei die in der Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz eingeschlossen ist, ist für diesen Zweck nützlich.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zur Behandlung von Abnormalitäten in einer Versuchsperson oder einem Versuchstier, die durch die Reduktion der Expression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors vermindert ist, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung, die oben beschrieben ist, an eine Versuchsperson oder ein Versuchstier, um die Bindung von in der Natur vorkommender Substrate an den Rezeptor wirksam zu verhindern, wodurch die Abnormalitäten, die auf die Überexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, vermindert werden. Die Bindung des Antikörpers an den Rezeptor verhindert, dass der Rezeptor wirkt, wodurch die Wirkungen der Überexpression neutralisiert werden. Die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper werden für diesen Zweck verwendet. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Behandeln eines abnormalen Zustands, der einen Überschuss an 5-HT4B Rezeptoraktivität betrifft, umfassend das Verabreichen einer Menge der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Versuchstier oder eine Versuchsperson, um wirksam die Bindung von in der Natur vorkommender Substrate an den 5-HT4B Rezeptor zu blockieren, wodurch der abnormale Zustand vermindert wird. Einige Beispiele abnormaler Zustände, die mit einem Überschuss an 5-HT4B Rezeptoraktivität verbunden sind, sind Angina, koronare Herzkrankheit, Arteriosklerose, zerebrale Blutgefäßstörungen, die zum Schlaganfall führen, Störungen kognitiver Abläufe (z. B. Schizophrenie), sowie Kontrolle autonomer Wirkung.
Die Erfindung stellt Verfahren bereit zum Nachweisen der Gegenwart eines 5-HT4B Rezeptors auf der Zelloberfläche, umfassend das in Kontakt bringen der Zelle mit einem Antikörper, der gegen den 5-HT4B Rezeptor gerichtet ist, unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an den Rezeptor ermöglichen, Nachweisen der Gegenwart des an die Zelle gebundenen Antikörpers und dadurch der Gegenwart des 5- HT4B Rezeptors auf der Zelloberfläche. Solche Verfahren sind nützlich zur Bestimmung, ob eine bestimmte Zelle einen Mangel in der Expression von 5-HT4B Rezeptoren aufweist. Gebundene Antikörper werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren nachgewiesen, zum Beispiel durch fluoreszierende Markierungen, die an Antikörper gebunden sind, und untersuchen der Zellprobe unter einem Fluoreszenzmikroskop, um Fluoreszenz auf einer Zelle nachzuweisen, was auf eine Antikörperbindung hinweist. Die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper sind für diesen Zweck nützlich.
Die Erfindung stellt außerdem einen transgenen nicht humanen Säuger bereit, der humanen 5-HT4B Rezeptor codierende DNA exprimiert und einen transgenen nicht humanen Säuger, der Säuger 5-HT4B Rezeptor codierende DNA exprimiert. Diese Erfindung stellt außerdem einen transgenen nicht humanen Säuger bereit, der DNA exprimiert, die einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, wobei er so mutiert ist, dass er keine normale Rezeptoraktivität aufweist und keinen natürlichen 5-HT4B Rezeptor exprimiert. Die Erfindung stellt außerdem bereit einen transgenen nicht humanen Säuger, dessen Genom eine einen humanen 5-HT4B Rezeptor codierende DNA umfasst, die so platziert ist, dass sie zu Antisinn-mRNA transkribiert wird, die komplementär ist mit mRNA, die einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, und die mit mRNA, die einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, hybridisiert, wodurch die Translation verringert wird und einen transgenen nicht humanen Säuger, dessen Genom eine einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codierende DNA umfasst, die so platziert ist, dass sie in Antisinn-mRNA transkribiert wird, die komplementär ist mit einer einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codierenden mRNA und die mit mRNA hybridisiert, die einen Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, wodurch die Translation verringert wird. Die DNA kann außerdem einen induzierbaren Promotor oder gewebespezifische Regulationselemente umfassen, so dass die Expression ausgelöst oder auf spezifische Zelltypen beschränkt werden kann. DNA Beispiele sind DNA oder cDNA Moleküle mit einer codierenden Sequenz, die im wesentlichen mit den in Figur gezeigten codierenden Sequenzen übereinstimmt. Ein Beispiel eines transgenen Tiers ist eine transgene Maus. Beispiele von Bereichen, die gewebespezifisch sind, sind der Metallothionin-Promotor (Low, M. J., Lechan, R. M., Hammer, R. E. Et al. Science 231: 1002-1004 (1986) und der L7-Promotor (Oberdick, J., Smeyne, R. J., Mann, J. R., Jackson, S. und Morgan, J. I. Science 248: 223-226 (1990)).
Tiermodellsysteme, die die physiologischen und verhaltensmäßigen Rollen von Säugerrezeptoren aufklären, werden durch Erzeugen von transgenen Tieren entwickelt, bei denen die Expression eines Rezeptors entweder vermindert oder verstärkt ist, oder bei denen die Aminosäuresequenz des exprimierten Rezeptorproteins geändert ist, wobei eine Vielzahl von Techniken verwendet werden. Beispiele dieser Techniken umfassen - aber sind nicht darauf beschränkt - : 1) die Einführung normaler oder mutanter DNA Versionen, die einen humanen 5-HT4B Rezeptor codieren, oder homologer Tierversionen dieses Gens durch Mikroinjektion, retrovirale Infektion oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren in geeignete befruchtete Embryonen, um ein transgenes Tier zu erzeugen (Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)) oder, 2) die homologe Rekombination (Capecchi M. R. Science 244: 1288-1292 (1989), Zimmer, A, und Gruss, P. Nature 338: 150-153 (1989)) mutanten oder normalen, humanen oder Tierversionen dieser Gene mit dem natürlichen Genlokus in transgenen Tieren, um die Regulation der Expression oder Strichstruktur des Rezeptors zu ändern. Die Technik der homologen Rekombination ist im Stand der Technik beschrieben. Sie ersetzt das natürliche Gen mit dem eingeführten Gen und ist daher zur Erzeugung von Tieren nützlich, die nicht den natürlichen Rezeptor exprimieren können, aber zum Beispiel einen eingeführten mutanten Rezeptor exprimieren, der an die Stelle des natürlichen Rezeptors in dem Genom des Tiers durch Rekombination gerückt ist, wodurch der Rezeptor unterexprimiert wird. Die Mikroinjektion führt Gene in das Genom ein, entfernt aber keine Gene und ist daher nützlich zur Erzeugung eines Tiers, das seine eigenen Rezeptoren und hinzugefügte Rezeptoren exprimiert, was zu einer Überexpression des Rezeptors führt. Ein verfügbares Verfahren zur Erzeugung transgener Tiere, wie zum Beispiel einer Maus, ist wie folgt: weibliche Mäuse werden gepaart und die resultierenden befruchteten Eier werden aus ihren Eileitern seziert. Die Eier werden in einem geeigneten Medium, wie M2 Medium (Hogan B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)), aufbewahrt. DNA oder cDNA, die ein Rezeptor codiert, wird aus dem Vektor gereinigt (wie aus dem Plasmid pcEXV-5-HT4B, oben beschrieben) durch im Stand der Technik bekannte Verfahren. Induzierbare Promotoren können mit dem codierenden Bereich der DNA verbunden werden, um ein experimentelles Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Expression des trans-Gens reguliert. Alternativ oder zusätzlich können gewebespezifische Regulationselemente mit dem codierenden Bereich verbunden werden, um die gewebespezifische Expression des trans-Gens zu ermöglichen. Die DNA in einer geeigneten gepufferten Lösung wird in eine Mikroinjektionsnadel aufgenommen (die aus einem kapillaren Rohr unter Verwendung eines "pipet pullers" hergestellt wird) und das zu injizierende Ei wird auf eine Scheibe mit einer Vertiefung gelegt. Die Nadel wird in den Pronucleus des Eis eingeführt und die DNA wird injiziert. Das injizierte Ei wird anschließend in den Eileiter einer scheinschwangeren Maus (einer Maus, die mit geeigneten Hormonen stimuliert wurde, um die Schwangerschaft aufrecht zu erhalten, aber die tatsächlich nicht schwanger war), überführt, wo es in die Gebärmutter gelangt, sich dort einnistet und entwickelt. Wie oben bemerkt, ist die Mikroinjektion nicht das einzige Verfahren zum Einführen von DNA in die Eizelle und ist hier nur beispielhaft dargelegt.
Da die normale Wirkung von Rezeptor-spezifischen Medikamenten darin besteht, den Rezeptor zu aktivieren oder zu inhibieren, sind die oben beschriebenen transgenen Tiermodellsysteme nützlich zum Testen der biologischen Aktivität von Medikamenten, die gegen die Rezeptoren gerichtet sind, schon bevor solche Medikamente erhältlich sind. Diese Tiermodellsysteme sind nützlich zur Vorhersage oder Beurteilung möglicher therapeutischer Anwendungen von Medikamenten, die Rezeptoren aktivieren oder inhibieren, indem sie die Expression des natürlichen oder trans-Gens auslösen oder inhibieren, wodurch die Expression natürlicher oder mutanter Rezeptoren in Tieren erhöht oder verringert wird. Folglich wird ein Modellsystem hergestellt, in dem die biologische Aktivität von Medikamenten, die gegen die Rezeptoren gerichtet sind, beurteilt werden, bevor solche Medikamente verfügbar sind. Die transgenen Tiere, die entweder den Rezeptor über- oder unterproduzieren, weisen durch ihr physiologisches Stadium darauf hin, ob die Über- oder Unterproduktion des Rezeptors therapeutisch nützlich ist.
Es ist daher nützlich, den Wirkmechanismus des Medikaments auf Basis transgener Modellsysteme zu beurteilen. Eine Verwendung ist auf die Tatsache gerichtet, dass im Stand der Technik bekannt ist, dass ein Medikament, wie ein Antidepressivum durch Blockieren der Neurotransmitteraufnahme wirkt und dadurch die Menge des Neurotransmitters in dem synaptischen Spalt erhöht wird. Das physiologische Folge dieser Wirkung ist, die Herstellung von weniger Rezeptor in den betroffenen Zellen zu stimulieren, was letztlich zu Unterproduktion führt. Ein Tier, das diesen Rezeptor unterexprimiert, ist daher als Testsystem nützlich, um zu untersuchen, ob die Wirkungen solcher zur Unterexpression führender Medikamente in der Tat therapeutisch sind. Wenn feststellt wird, dass die Überexpression zu Abnormalitäten führt, ist es nützlich, ein Medikament zu entwickeln, das die Expression reguliert oder als Antagonist gegen den Rezeptor wirkt; und wenn eine vielversprechende therapeutische Anwendung durch diese Tiermodellsysteme entdeckt wird, wird die Aktivierung oder Inhibition des 5-HT4B Rezeptors therapeutisch erreicht entweder durch die Herstellung von Agonist- oder Antagonist-Medikamenten, die gegen den 5-HT4B Rezeptor gerichtet sind, oder durch jedes Verfahren, das die Expression dieses Rezeptors erhöht oder verringert.
Außerdem wird erfindungsgemäß ein Verfahren bereitgestellt, um die physiologischen Wirkungen zu bestimmen, wenn humane oder Säuger 5-HT4B Rezeptoren in verschiedenen Niveaus exprimiert werden, umfassend das Herstellen eines transgenen nicht humanen Tiers, dessen Expressionsniveaus des humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors variiert werden durch Verwendung eines induzierbaren Promotors, der die Rezeptorexpression reguliert. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zur Bestimmung der physiologischen Wirkungen bei unterschiedlichen Expressionsniveaus der humanen 5-HT4B Rezeptoren, umfassend das Herstellen einer Reihe von transgenen nicht humanen Tieren, die jeweils eine unterschiedliche Menge des humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors exprimieren. Solche Tiere können erzeugt werden durch Einführen verschiedener Mengen von DNA, die einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, in die Eizellen, aus denen sich die transgenen Tiere entwickeln.
Diese Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Identifizieren einer Substanz, die Abnormalitäten, die auf die Überexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, vermindern kann, umfassend das Verabreichen der Substanz an einen transgenen nicht humanen Säuger, der mindestens ein künstlich eingeführtes DNA-Molekül exprimiert, das einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codiert, und Bestimmen, ob die Substanz die physiologischen und verhaltensmäßigen Abnormalitäten, die von dem Tier an den Tag gelegt werden, als Folge der Überexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors vermindert. Der Ausdruck "Substanz", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Verbindung oder Zusammensetzung, die natürlich, synthetisch oder ein Produkt, das von Screenen abstammt, sein kann. Beispiele von DNA-Molekülen sind DNA- oder cDNA-Moleküle mit einer codierenden Sequenz, die im wesentlichen mit der in Fig. 1 codierenden Sequenz übereinstimmt.
Die Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine Menge der supra beschriebenen Substanz, die wirksam ist, um die Abnormalitäten, die auf die Überexpression des 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, zu vermindern, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zur Behandlung der Abnormalitäten, die auf die Überexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, umfassend das Verabreichen einer Menge der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung, die wirksam ist, um die Abnormalitäten, die auf die Überexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, zu vermindern, an einen Patienten.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Identifizieren einer Substanz, die die Abnormalitäten, die auf die Unterexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, vermindern kann, umfassend das Verabreichen der Substanz an den oben beschriebenen transgenen nicht humanen Säuger, der nur nicht funktionelles humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor exprimieren kann, und Bestimmen, ob die Substanz die physischen und verhaltensmäßigen Abnormalitäten, die von dem transgenen nicht humanen Tier an den Tag gelegt werden, als Folge der Unterexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors vermindert.
Die Erfindung stellt außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend eine Menge einer Substanz, die wirksam ist, um die Abnormalitäten zu vermindern, die auf die Unterexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Verfügung zur Behandlung der Abnormalitäten, die auf die Unterexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, umfassend das Verabreichen einer Menge der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung, die wirksam ist, um die Abnormalitäten, die auf die Unterexpression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptors zurückzuführen sind, zu vermindern, an einen Patienten.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Diagnose einer Prädisposition einer Störung, die mit der Expression eines humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptorallels verbunden ist, umfassend: a) Erhalten der DNA von Versuchstieren/Versuchspersonen, die unter dieser Störung leiden, b) Durchführung eines Restriktionsverdaus der DNA mit einer Reihen von Restriktionsenzymen, c) elektrophoretisches Auftrennen der resultierenden DNA Fragmente auf einem Gel nach Größen, d) in Kontakt bringen des resultierenden Gels mit einer Nucleinsäuresonde, die spezifisch mit einer einen humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codierenden DNA hybridisieren kann und mit einem nachweisbaren Marker markiert ist, e) Nachweisen der markierten Banden, die mit der den humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor codierenden DNA, die mit einem nachweisbaren Marker markiert sind, hybridisierten, um ein einzelnes Bandenmuster zu erzeugen, das spezifisch für die DNA der Versuchstiere/Versuchspersonen ist, die unter dieser Störung leiden, f) Herstellen der erhaltenen DNA zur Diagnose durch Schritte a)-e) und g) Vergleichen des einzelnen Bandenmusters, das spezifisch für die DNA von Versuchstieren/Versuchspersonen ist, die unter dieser Störung leiden, aus Schritt e), und der zur Diagnose aus Schritt f) erhaltenen DNA, um zu bestimmen, ob die Muster die gleichen oder verschieden sind, wodurch die Prädisposition der Störung diagnostiziert werden kann, wenn die Muster die gleichen sind. Dieses Verfahren kann außerdem zur Diagnose einer Störung verwendet werden, die mit der Expression einer spezifischen 5-HT4B humanen oder Säuger 5- HT4B Rezeptorallels verbunden ist.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zur Herstellung des isolierten 5-HT4B Rezeptors, das umfasst, dass die Zellen dazu gebracht werden, den Rezeptor zu exprimieren, der Rezeptor aus den resultierenden Zellen gewonnen und der so gewonnene Rezeptor gereinigt wird. Ein Beispiel eines 5-HT4B Rezeptors ist ein isoliertes Protein mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Zum Beispiel können Zellen dazu gebracht werden, Rezeptoren zu exprimieren, indem sie Substanzen, wie Hormonen ausgesetzt werden. Die Zellen können dann homogenisiert werden und der Rezeptor kann aus dem Homogenat unter Verwendung einer Affinitätssäule, die zum Beispiel Serotonin oder eine andere Substanz umfasst, von der bekannt ist, dass sie den 5-HT4B Rezeptor codiert, isoliert werden. Die resultierenden Fraktionen können anschließend gereinigt werden, indem sie mit einer Ionenaustauschersäule in Kontakt gebracht werden und indem bestimmt wird, welche Fraktion 5-HT4B Rezeptoraktivität enthält oder an die Rezeptorantikörper bindet.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Herstellen des isolierten 5-HT4B Rezeptors, umfassend das Einführen einer den 5-HT4B Rezeptor codierenden Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor, das Einführen des resultierenden Vektors in eine geeignete Wirtszelle, das Gewinnen des von der resultierenden Zelle hergestellten Rezeptors und das Reinigen des so gewonnenen Rezeptors. Ein Beispiel eines isolierten 5-HT4B Rezeptors ist ein isoliertes Protein mit im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz wie der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Diese Verfahren zum Herstellen des 5-HT4B Rezeptors verwenden rekombinante DNA Technologieverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel wird die den 5-HT4B Rezeptor codierende isolierte Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor eingeführt, z. B. einen Expressionsvektor. Eine geeignete Wirtszelle, wie eine Bakterienzelle, oder eine Eukaryontenzelle, z. B. eine Hefezelle, wird mit dem Vektor transfiziert. Der 5-HT4B Rezeptor wird aus dem Kulturmedium durch Affinitätsreinigung oder Chromatographie oder durch andere im Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit zum Bestimmen, ob ein Ligand, von dem bekannt ist, dass er nicht an einen humanen 5-HT4B Rezeptor bindet, an einen humanen 5-HT4B Rezeptor binden kann, umfassend das in Kontakt bringen einer Säugerzelle, umfassend ein einen humanen 5-HT4B Rezeptor codierendes DNA-Molekül, wobei das dadurch codierte Protein auf der Zelloberfläche exprimiert wird, mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Bindung von Liganden, von denen bekannt ist, dass sie an 5-HT4B Rezeptoren binden, ermöglicht, Nachweisen der Gegenwart jedes an den 5-HT4B Rezeptor gebundenen Liganden, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand an den 5-HT4B Rezeptor bindet. Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Nachweisen, ob ein Ligand, von dem bekannt ist, dass er nicht an den 5-HT4B Rezeptor binden kann, funktionell dessen Aktivität aktivieren oder die Wirkung eines Liganden, der es tut, verhindern kann. Dies umfasst das in Kontakt bringen einer Säugerzelle, umfassend ein isoliertes DNA-Molekül, das einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Aktivierung oder Blockierung einer funktionellen Response ermöglichen, die mittels eines Bioassays hinsichtlich der Säugerzellen nachgewiesen werden kann, z. B. eine Second- Messenger-Response, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand die Aktivierung des funktionellen Outputs des humanen 5-HT4B Rezeptors aktiviert oder verhindert.
Die DNA in der Zelle kann eine codierende Sequenz sein, die bevorzugt im wesentlichen mit der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz übereinstimmt, und die Säugerzelle von nicht neuronalem Ursprung. Ein Beispiel einer nicht neuronalen Säugerzelle ist ein Ltk- Zelle, inbesondere die als L-5-HT4B Ltk-Zelle. Ein anderes Beispiel einer nichtneuronalen Säugerzelle, die in den funktionellen Assays verwendet werden kann, ist eine murine Fibroblastenzell- Linie, insbesondere die NIH3T3-Zelle. Das bevorzugte Verfahren zur Bestimmung, ob ein Ligand an den humanen 5-HT4B Rezeptor binden kann, umfasst das in Kontakt bringen einer transfizierten nicht neuronalen Säugerzelle (d. h. eine Zelle, die in der Natur keinen Typ von 5-HT oder G-Protein gebundenen Rezeptor exprimieren kann und daher nur einen solchen Rezeptor exprimiert, wenn er in die Zelle transfiziert ist), die auf ihrer Oberfläche einen 5-HT4B Rezeptor exprimiert, oder das in Kontakt bringen eines Membranpräparats, das von einer solchen transfizierten Zelle abstammt, mit dem Liganden unter Bedingungen, von denen bekannt ist, dass sie sich durchsetzen, und daher mit der in vivo Bindung der Liganden an einen 5-HT4B Rezeptor verbunden sind, das Nachweisen der Gegenwart jedes untersuchten Liganden, der auf der Zelloberfläche an den 5-HT4B Rezeptor gebunden ist, wodurch bestimmt wird, ob der Ligand an den 5- HTas Rezeptor bindet, ihn aktiviert oder die Aktivierung verhindert. Dieses Responsesystem wird erhalten durch Transfektion von isolierter DNA in eine geeignete Wirtszelle, die das gewünschte Second-Messenger-System enthält, wie Phosphoinositit-Hydrolyse, Adenylatcyclase, Guanylatcyclase oder Ionenkanäle. Ein solches Wirtssystem wird aus bestehenden Zell-Linien isoliert oder kann durch Einführen geeigneter Komponenten des Second-Messenger-Systems in bestehende Zell-Linien hergestellt werden. Ein solches Transfektionssystem liefert ein vollständiges Responsesystem zur Untersuchung oder zur Analyse der Aktivität des humanen 5-HT4B Rezeptors mit Liganden, wie oben beschrieben. Die Transfektionssysteme sind nützlich als lebende Zellkulturen für kompetitive Bindungsanalysen zwischen bekannten oder möglichen Medikamenten und Liganden, die an den Rezeptor binden und die mit radioaktiven, spektroskopischen oder anderen Reagenzien markiert sind. Die Membranpräparate, die den aus den transfizierten Zellen isolierten Rezeptor enthalten, sind außerdem für solche kompetitiven Bindungsanalysen nützlich. Funktionelle Analysen der Second- Messenger-Systeme oder ihrer Folgesysteme in Transfektionssystemen wirken als Assays für die Bindungsaffinität und Wirksamkeit bei der Aktivierung der Rezeptorfunktion. Ein Transfektionssystem besteht aus einem "Medikamentenentdeckungssystem", das zur Identifizierung natürlicher oder synthetischer Verbindungen nützlich ist, die Potential für die Medikamentenentwicklung haben, und die weiter modifiziert werden können, oder als therapeutische Verbindungen direkt verwendet werden können, um die natürlichen Wirkungen des humanen 5-HT4B Rezeptors zu aktivieren oder zu hemmen. Das Transfektionssystem ist außerdem nützlich zur Bestimmung der Affinität und Wirksamkeit bekannter Medikamente an humanen 5-HT4B Rezeptorstellen.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit zum Screenen von Medikamenten, um Medikamente zu identifizieren, die spezifisch mit dem humanen oder Säuger 5-HT4B Rezeptor auf der Oberfläche einer Zelle wechselwirken und daran binden, umfassend das in Kontakt bringen einer Säugerzelle, umfassend ein DNA-Molekül, das einen humanen oder Säuger 5- HT4B Rezeptor auf der Zelloberfläche codiert, mit einer Vielzahl von Medikamenten, das Nachweisen dieser Medikamente, die an die Säugerzelle binden, und dadurch das Identifizieren von Medikamenten, die spezifisch mit dem humanen und/oder Säuger 5-HT4B Rezeptor wechselwirken und daran binden. Verschiedene Verfahren zum Nachweis können verwendet werden. Die Medikamente können "markiert" werden durch Verbinden mit einer nachweisbaren Markersubstanz (z. B. einer Radiomarkierung oder nicht-isotopischen Markierung, wie Biotin). Die DNA in der Zelle kann eine codierende Sequenz aufweisen, die im wesentlichen mit der in Fig. 1 gezeigten codierenden Sequenz übereinstimmt. Bevorzugt ist die Säugerzelle nicht neuronalen Ursprungs. Ein Beispiel einer nicht neuronalen Säugerzelle ist eine COS-7 Zelle. Mögliche Medikamente werden identifiziert durch Auswählen chemischer Verbindungen, die mit hoher Affinität an das in den transfizierten Zellen exprimierte 5-HT4B Rezeptorprotein binden, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Radioliganden-Bindungsverfahren, wobei Beispiele in den hier beschriebenen Bindungsassays aufgeführt sind. Mögliche Medikamente werden außerdem auf Selektivität gescreent, indem Verbindungen identifiziert werden, die mit hoher Affinität an einen bestimmten Rezeptor binden, aber nicht mit hoher Affinität an jeden anderen Rezeptorsubtyp oder an andere bekannte Rezeptoren binden. Da Verbindungen, die einen hohe Affinität aufweisen und selektiv sind, primär nach der Verabreichung an den Patienten mit der 5-HT4B Ziel- Rezeptorstelle wechselwirken, werden die Wahrscheinlichkeiten, ein Medikament mit unerwünschten Nebenwirkungen herzustellen, minimiert. Die Erfindung stellt außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, umfassend ein Medikament, das durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wird, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Träger", wie er hier verwendet wird, umfasst jeden Standard pharmazeutischen Träger, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser und Emulsionen, wie eine Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion und verschiedene Arten von Benetzungsmitteln. Sobald für einen mögliches Medikament gezeigt wurde, dass es nach einem bestimmten Verabreichungsweg, zum Beispiel oral oder durch Injektion, bioverfügbar ist (geeignete therapeutische Konzentrationen müssen für einen ausreicheden Zeitraum an der Wirkungsstelle aufrechterhalten werden, um den gewünschten therapeutischen Nutzen zu gewinnen) und sich als nicht toxisch erwiesen hat und in geeigneten Krankheitsmodellen therapeutisch ist, kann das Medikament an Patienten verabreicht werden und zwar über den Weg, über den sich das Medikament als bioverfügbar erweist in einer geeigneten festen Formulierung oder als Lösung, um den gewünschten therapeutischen Nutzen zu erreichen.
Die Anmelder haben ein neues humanes 5-HT4B Rezeptorsubtyp- Protein identifiziert, das 5-HT4B genannt wird, und haben Verfahren beschrieben zur Identifizierung pharmakologischer Verbindungen für therapeutische Behandlungen. Die pharmakologischen Verbindungen, die gegen spezifische Rezeptorsubtypen gerichtet sind, liefern wirksame neue Therapien mit minimalen Nebenwirkungen.
Die Aufklärung der Molekularstrukturen der neuronalen Serotoninrezeptoren ist ein wichtiger Schritt, um die serotonerge Neurotransmission zu verstehen. Die Offenbarung berichtet über die Isolierung der Aminosäuresequenz und die funktionelle Expression eines neuen cDNA-Klons, der einen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert. Die Identifizierung von 5- HT Rezeptorsubtypen spielt eine bedeutende Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die der serotonergen Transmission zugrundeliegen, und sollte auch zur Entwicklung neuer therapeutischer Mittel beitragen.
Ein komplementärer DNA-Klon (genannt hp78a), der einen Serotoninrezeptorsubtyp codiert, wurde aus humaner cDNA und einer Genom-DNA-Bibliothek isoliert und seine funktionellen Eigenschaften wurden in Säugerzellen untersucht. Die Nucleotidsequenz lässt auf ein Protein mit 445 Aminosäuren mit 7 stark hydrophoben Bereichen, die mit Membanüberspannenden Bereichen kompatibel sind, schließen. Die Analyse der 5-HT4B Struktur und die Funktion stellt ein Modell bereit zur Entwicklung von Medikamenten, die nützlich sind zur Behandlung von Angina, koronarer Herzkrankheit, Arteriosklerose, zerebralen Blutgefäßstörungen, die zum Schlaganfall führen, Reizkolon oder anderen Störungen der gastrointestinalen Motilität, Störungen des ZNS, Schmerzempfindung, affektiven Psychosen und Störungen höherer kognitiver Abläufe, einschließlich Schizophrenie, aber nicht darauf beschränkt, sowie Kontrolle autonomer Wirkung.
Die Erfindung identifiziert zum ersten Mal einen Säugerserotoninrezeptor, seine Aminosäuresequenz und sein Säugergen, dessen Aktivierung Informationen liefert; und durch diese Entdeckung werden experimentelle Mittel bereitgestellt, die nützlich sind, um neue therapeutische Mittel und neue therapeutische oder diagnostische Assays für dieses Rezeptorprotein, sein mRNA-Molekül oder seine Genom- DNA zu entwickeln. Die Information und die experimentellen Möglichkeiten, die durch diese Entdeckung bereitgestellt werden, ist nützlich, um neue therapeutische Mittel und neue therapeutische oder diagnostische Assays für diesen neuen Serotoninrezeptorsubtyp, sein mRNA-Molekül oder seine Genom- DNA zu entwickeln.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Säuger-cDNA und Genom-DNA-Klonen, die einen neuen Serotoninrezeptor codieren, der 5-HT4B Rezeptor genannt wird. Das neue humane Gen für diesen Rezeptor, das hier als hp78a identifziert wird, wurde identifiziert und charakterisiert und eine Reihe von verwandten cDNA- und Genom-cDNA-Klonen wurden isoliert. Außerdem wurde der 5-HT4B Rezeptor in COS- Zellen durch Transfektion der Zelle mit dem Plasmid pcEXV-5- HT4B exprimiert. Die pharmakologischen Bindungseigenschaften des codierten 5-HT4B Rezeptors wurden bestimmt und die Bindungseigenschaften klassifizieren diesen Rezeptor als neuen Serotoninrezeptor. Säugerzell-Linien, die den humanen 5-HT4B Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimieren, wurden hergestellt, wodurch zum ersten Mal gut definierte kultivierte Zell-Linien mit denen der neue 5-HT4B Rezeptor untersucht werden kann, bereitgestellt wurden.
Die Erfindung wird verständlicher durch Bezugnahme auf die experimentellen Einzelheiten, die jetzt folgen, aber für den Fachmann ist verständlich, dass die spezifischen Experimente, die hiernach beispielhaft detailliert aufgeführt sind, nicht als die Erfindung beschränkend anzusehen sind, die durch die Ansprüche definiert ist.

Verfahren und Materialien

Klonierung und Sequenzierung: Eine humane Plazenta- Genombibliothek in λ dash II ( 1,5 · 10&sup6; Gesamtrekombinante, Stratagene, LaJolla, CA) wurde gescreent unter Verwendung von überlappenden transmembranen (TM) Oligonucleotidsonden (TM 3, 5, 6 und 7), die vom Drosophila-Serotoninrezeptorgen, Dro5HTR (Witz et al., 1990) abstammen. Die überlappenden Oligomere wurden mit [³²P] dATP und [³²P] dCTP durch Synthese mit dem großen Fragment der DNA Polymerase markiert. Die Hybridisierung wurde bei mittleren stringenten Bedingungen durchgeführt: 45ºC in einer Lösung, enthaltend 37,5% Formamid, 10% Dextransulfat, 5 · SSC (1 · SSC ist 0,15 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumcitrat), 1 · Denhardts-Lösung (0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Ficoll, 0,02% Rinderserumalbumin) und 200 ug/ul mit Schallwellen behandelte Lachsspermien-DNA. Die Filter wurden bei 45ºC in 0,1 · SSC, enthaltend 0,1% Natriumdodecylsulfat, gewaschen und bei - 70ºC mit einem Kodak XAR Film in der Gegenwart einer Intensivierungsscheibe ausgesetzt. Die Lambdaphagenklone, die mit der Sonde hybridisierten, wurden Plaque-gereinigt und DNA wurde für die Southern-Blot Analyse hergestellt (Southern, 1975, Sambrook et al., 1989). Zur Subklonierung und weiteren Southern-Blot Analyse wurde die DNA in pUC18 (Pharmacia, Piscataway, NJ), pGEM-5Zf (Promega, Madison, WI) oder pBluescriptll (Stratagene, LaJolla, CA) kloniert. Die Nucleotidsequenzanalyse wurde durchgeführt durch das Sanger Didesoxynucleotidketten-Terminationsverfahren (Sanger et al., 1977) auf denaturierten doppelsträngigen Plasmidmatrizen unter Verwendung von Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland, OH), dem Bst DNA Sequenzierungskit (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) oder dem TaqTrack Sequenzierungskit (Promega, Madison, WI).
Zur Isolierung eines vollständigen Klons wurden gescreent humane cDNA-Bibliotheken durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) mit jeweils 1 uM spezifischen Oligonucleotidprimern, die mit Hilfe des isolierten Genomklons hergestellt wurden: aus dem Sinnstrang (Nucleotid 512-535), 5' TGACCCTGTGCGTGATCAGCATTG 3' und aus dem Antisinnstrang (Nucleotid 945-974), 5' GCTTTCTGTTCTCGCTTAAAGATGGAGATG 3' (siehe Fig. 1). Die Primer stammten jeweils von dem 3' Ende von Tm3 und den Tm5/Tm6 Loop-Bereichen von den stromabwärts und stromaufwärts liegenden Primern ab. Eine der Phagen-DNA (2 ul) aus den cDNA-Bibliotheken (λ ZapII, Stratagene, LaJolla, CA), das 10&sup6; - 10&sup7; pfu entspricht, wurde in 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;, 0,01% Gelatine, jeweils 200 uM dATP, dCTP, dGTP, dTTP und 2,5 Einheiten Thermus aquaticus DNA-Polymerase (Taq Polymerase, Perkin- Elmer-Cetus, Norwalk, CT) amplifiziert. Das Amplifikationsprofil wurde über 30 Zyklen durchgeführt, eine 5 minütige anfängliche Denaturierung bei 95ºC (d. h. 1 Zyklus), gefolgt von einer 2-minütigen bei 94ºC, einer 2- minütigen bei 68ºC und einer 3-minütigen bei 72ºC mit einer 3 Sekunden-Verlängerung, gefolgt von einer abschließenden 10- minütigen Verlängerung bei 72ºC. Die PCR-Produkte wurden durch Ethidiumbromid (EtBr) gefärbte Agarosegele untersucht und jede Probe, die eine Bande auf dem EtBr gefärbten Gel entfaltete, wurde als positiv angesehen.
Eine positive Bibliothek wurde anschließend plattiert und gescreent mit überlappenden 45-mer Oligonucleotidsonden und versehen mit [α-³²P] dCTP und [α-³²P] dATP und dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase. Diese Sonde war hinsichtlich der oben beschriebenen Amplifizierungsprimer intern: aus dem Sinnstrang (Nucleotid 864-908) 5' CCTGAATGGCATAGTGAAGCTCCAGAAGGAGGTGGAAGAGTGTGC 3' und aus dem Antisinnstrang (Nucleotid 889-933), 5' ATGCTTGAGGAGTCTCGAAAGGTTTGCACACTCTTCCACCTCCTT 3' (siehe Fig. 1). Die positiven cDNA-Phagenklone wurden Plaque-gereinigt und pBluescriptII rekombinante DNA wurden aus dem λ Zap II unter Verwendung des Helferphagen R408 ausgeschnitten, wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben (Stratagene, LaJolla, CA). Die Einführungsstelle wurde bestätigt, indem der Verdau mit Restriktionsenzymen analysiert wurde und die Rekombinanten wurden wie oben beschrieben sequenziert.
Drei zusätzliche Serien überlappender Oligonucleotide wurden verwendet, um insgesamt drei Teil- aber überlappende cDNA- Klone zu isolieren. Diese Oligonucleotide und die entsprechenden Namen der cDNA-Klone sind: aus hFB9a (im Tm3/4 Loop), der Sinnstrang (Nucleotide 529-573) 5' AGCATTGACAGGTACCTTGGGATCACAAGGCCCCTCACATACCCT 3' und der Antisinnstrang (Nucleotide 554-599) 5' CCATGCATTTCCCATTCTGCCTCACAGGGTATGTGAGGGGCCTTG 3', aus hFB44A (im Tm2/3 Loop), der Sinnstrang (Nucleotide 412-456) 5' GTCAGCGTCACCGACCTCATCGGGGGCAAGTGGATCTTTGGACAC 3' und der Antisinnstrang (Nucleotide 437-481) 5' TGGCGATGAAGACATTACAGAAAAAGTGTCCAAAGATCCACTTGC 3', aus hFB41a (im NH&sub2; Terminus), der Sinnstrang (Nucleotide 107-150) 5' GGCGCCGACCCGGTCGCGGGCTCCTGGGCACCGCACCTGCGAGC 3' und der Antisinnstrang (Nucleotide 131-175) 5' TGGGCGCCGGGCTGGCTGTCACCTCGCTCAGCAGGTGCGGTGCCC 3'.
Expression: Der gesamte codierende Bereich des humanen 5-HT4B Rezeptors (1338 Bp), einschließlich 27 Bp der 5' nichttranslatierten (5' UT) und der 50 Bp der 3' nichttranslatierten (3' UT) Sequenz wurden in die SalI und EcoRI Stellen des Polylinker-modifizierten eukaryontischen Expressionsvektors pcEXV-3 (Miller et al., 1986), EXJ. HR (nicht veröffentliche Daten) kloniert. Das Konstrukt umfasste die Ligation von drei Fragmenten aus drei überlappenden humanen Plazentagenom und fetalen Gehirn-cDNA- Klonen: das Startcodon bis zum TM 3 auf einem 0,5 kb NcoI- NcoI Genomfragment (die vom Vektor stammende SalI Stelle wurde zum Subklonieren verwendet anstelle der internen vom Insert stammenden NcoI-Stelle am 5' Ende), TM 3 allein, als überlappende Oligonucleotide synthetisiert (auf Basis einer zuvor bestimmten cDNA-Sequenz) mit NcoI und KpnI Termini, der TM3/4 Loop bis zum Stopcodon und 3' UT auf einem 0,8 kb KpnI- EcoRI cDNA-Fragment. Nierenzellen vom Affen (Cos-7) wurden transient mit dem Plasmid hp78a/EXJ (einem das humane 5-HT4B Rezeptorgen codierenden Expressionsvektor) unter Verwendung der DEAE Dextranmethodik (Reagenzien wurden von Specialty Media, Lavellette, NJ bezogen) transfiziert. Die Zellen wurden als Monoschichten in Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (Gibco, Grand Island, N. Y., 23) in einer kontrollierten Umgebung (37ºC, 5% CO&sub2;) wachsen gelassen. Stabile Zell-Linien wurden erhalten durch Cotransfektion mit dem Plasmid hp78a/EXJ (Expressionsvektor, enthaltend das humane 5-HT4B Rezeptorgen) und dem Plasmid pGCcos3neo (Plasmid, enthaltend das Aminoglycosidtransferasegen) in LM (tk&supmin;) Zellen unter Verwendung der Calciumphosphattechnik. Die Zellen wurden wachsen gelassen in einer kontrollierten Umgebung (37ºC, 5% CO&sub2;) als Monoschichten in Dulbeccos mdofiziertem Eagle Medium (Gibco, Grand Island, N. Y.), enthaltend 25 mM Glucose, das mit 10% Rinderserumalbumin, 100 Einheiten/ml Penicillin G und 100 ug/ml Streptomycinsulfat ergänzt ist. Die stabilen Klone wurden anschließend ausgewählt nach der Resistenz gegen das Antibiotikum G-418 (1 mg/ml), wie zuvor beschrieben (Weinshank et al., 1990), und die Membranen wurden geerntet und auf ihre Fähigkeit untersucht, [³H] Hydroxytryptamin wie unten beschrieben (siehe Radioliganden-Bindungsassays) zu binden.
Macrolokalisierung (PCR/transkriptionale Gewebeexpressionsuntersuchungen): Humane Gewebe (NDRI) wurden homogenisiert und die gesamte RNA wurde unter Verwendung des Guanidinisothiocyanat/CsCl Cushion-Verfahrens, wie zuvor beschrieben (Kingston, 1987) extrahiert. Die cDNA wurde aus 5 ug Gesamt-RNA mit wahlweise Hexanucleotid-Primern (500 pMol) unter Verwendung der Superscript reversen Transkriptase (BRL) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, Puffer enthaltend 40 E RNasin, 2,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl und 1 mM dNTP bei 42ºC hergestellt, wobei die Reaktion 1 Stunde durchgeführt wurde. RNase H (2 E) wurde zugegeben, 20 Minuten bei 37ºC inkubiert, und dann bei 95ºC 5 Minuten erwärmt und auf Eis gekühlt. Eine Aliquote des ersten cDNA-Stranges wurde verdünnt (1 : 5) in einer 50 ul PCR-Reaktionsmischung (200 uM dNTP Endkonzentration), enthaltend 1,25 E Taq Polymerase in dem Puffer, der vom Hersteller (Cetus Corp.) zur Verfügung gestellt wird und 1 uM Primer in einem PCR-Protokoll (die 5' und 3' Oligos waren diesselben, die zum Screenen der cDNA- Bibliotheken verwendet wurden, siehe oben). Die PCR- Amplifizierungsreaktion wurde durchgeführt, indem zunächst eine 5-minütige Inkubierung bei 95ºC und daraufhin 30 Runden des folgenden Zyklus durchgeführt wurden: 2 Minuten bei 94ºC, 2 Minuten bei 68ºC, 3 Minuten bei 72ºC und abschließend 10 Minuten Inkubierung bei 72ºC. Zur Kontrolle der Amplifzierung der DNA (die während der RNA-Extraktion überführt wurde) wurden parallel Kontroll-PCR Reaktionen durchgeführt mit RNA, die auf die gleiche Weise wie die cDNA- Probe verdünnt wurden. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,5 % Agarosegel laufen gelassen und auf eine geladene Nylonmembran (ZetaProbe, Bio-Rad) übertragen. Die Filter wurden mit einer endmarkierten (mit [α-³²P]ATP) internen Sonde hinsichtlich der PCR-Primer (dieses Oligo war das gleiche wie das, das zum Screenen der anfänglichen humanen fetalen Hirn-cDNA Bibliothek verwendet wurde, siehe oben) hybridisiert, unter stark stringenten Bedingungen (50ºC) gewaschen und bei -70ºC einem Kodak XAR Film in der Gegenwart einer Intensivierungsscheibe ausgesetzt, wie oben beschrieben.
Microlokalisierung (In Situ Hybridisierung): atten, die zur In Situ Hybridisierung und für Rezeptor-Autoradiographie verwendet wurden, wurden mit CO&sub2; getötet und enthauptet, die Gehirne wurden herausseziert und in kaltem Isopentan gefroren. Die Gewebe wurden anschließend auf Kryostatstücken gestapelt und serienmäßig bei 11 um für die In Situ Hybridisierung oder bei 20 um für die Rezeptor- Autoradiographie in einem Kryostat, das bei -20ºC gehalten wurde, unterteilt. Die Abschnitte wurden auf Mikroskopscheiben, die mit Poly-L-Lysin beschichtet sind, zum Auftauen aufgetragen eine Stunde bei Raumtemperatur luftgetrocknet und bis zur Verwendung bei -80ºC aufbewahrt.
Antisinn- und Sinnoligonucleotide (45 mere) für die Ratten 5- HT4B mRNA wurden mittels eines Cyclone Plus DNA Synthetisierers (Milligen/Biosearch) synthetisiert. Die Sonden wurden am 3' Ende mit ³&sup5;S-dATP (1200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) auf eine spezifische Aktivität von 10&sup9; dpm/ug unter Verwendung der terminalen Desoxynucleotidyl Transferase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) markiert. Die radiomarkierten Sonden wurden auf Biospin 6 Chromatographiesäulen (Bio-Rad, Richmond, CA) gereinigt und mit Hybridisierungspuffer auf eine Konzentration von 1,5 · 10&sup4; cpm/ul verdünnt. Der Hybridisierungspuffer bestand aus 50% Formamid, 4 · Natriumcitratpuffer (SSC, 1 · = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat), 1 · Denhardts-Lösung (0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll, 0,2% Rinderserumalbumin), 50 mM Dithiothreitol, 0,5 mg/ml Lachsspermien-DNA, 0,5 mg/ml Hefe-tRNA und 10% Dextransulfat.
Die Gewebeabschnitte wurden eine Stunde vor der Verwendung auf Raumtemperatur aufgewärmt. Die Abschnitte wurden fixiert in 4% (G/V) Paraformaldehyd in 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), zweimal in PBS gewaschen, mit 5 mM DTT in Wasser gespült, 10 Minuten mit 0,25% (V/V) Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin acetyliert und zweimal in 2 · SSC gewaschen. Die Abschnitte wurden anschließend in Ethanol dehydriert, mit Chlorform von Fett gereinigt und luftgetrocknet. 100 ul der verdünnten Sonde wurden auf jeden Abschnitt aufgetragen, der anschließend mit einer Deckplatte aus Parafilm bedeckt wurde. Die Hybridisierung wurde über Nacht in Feuchtkammern bei 40 bis 55ºC durchgeführt. Am folgenden Tag wurden die Abschnitte 1 Stunde bei Raumtemperatur in 2 · SSC gewaschen, wobei einmal gewechselt wurde, in 2 · SSC 30 Minuten bei 60ºC und schließlich in 0,1 · SSC 30 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Die Gewebe wurden in Ethanol dehydriert und einem Kodak KAR Film 3 Tage bis 2 Wochen bei -20ºC ausgesetzt, dann in eine Kodak NTB3 Autoradiographie-Emulsion, die 1 : 1 mit 0,2 % Glycerolwasser verdünnt wurde, eingetaucht. Nach der 2 bis 4-wöchigen Aussetzung bei 4ºC wurden die Abschnitte in einem Kodak Entwickler D-19 entwickelt, fixiert und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt.
Microlokalisierung (Rezeptor-Autoradiographie): [³H]5-CT Bindung wurde wie folgt durchgeführt. Gestapelte Gewebeabschnitte (20 um) wurden auf Raumtemperatur gebracht und 15 Minuten in einem Puffer inkubiert, der 0,17 M Tris- HCl, 4,0 mM CaCl&sub2;, 0,01 (G/V) Ascorbinsäure und 10 uM Pargylin enthielt. Die Abschnitte wurden in 0,5 nM [³H]5- Carboxamidotryptamin (NEN, 50,4 Cl/mmol) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Unterscheidung des 5-HT4B Rezeptors von den anderen Serotoninrezeptoren, die auch [³H]5-CT binden, wurden 100 nM PAPP und 160 nM (-) Pindolol als Masken verwendet. Da der 5-HT4B Rezeptor eine hohe Affinität für Methiothepin hat, wurden 5 nM Methiothepin zu dem Radioliganden gegeben, um die [³H]5-CT Bindung an den 5- HTas Rezeptor zu verhindern. Unspezifische Bindung wurde bestimmt durch Zugabe von 1 uM Ergotamin zu dem Radioliganden. Nach der Inkubation in dem Radioliganden wurden die Abschnitte 2 · 20 Minuten in dem obigen Puffer bei 4ºC gewaschen, in eiskaltem Wasser kurz gespült und bei einem schwachen Wärmestrom getrocknet. Die Abschnitte wurden dem Hyperfilm (Amersham) bei Raumtemperatur 4 bis 6 Wochen ausgesetzt, woraufhin die Filme mit D-19 (Kodak) entwickelt, fixiert und luftgetrocknet wurden.
Membranherstellung: COS-7 Zellen, die transient mit dem humanen 5-HT4B Rezeptorgen transfiziert sind, wurden 48 Stunden wachsen gelassen und die Membranen wurden, wie zuvor beschrieben, geerntet (Branchek et al., 1990). Membranhomogenate wurden auf Eis liegen gelassen und innerhalb einer Stunde für die Radioliganden- Bindungsexperimente verwendet. Die Proteinkonzentrationen wurden durch das Bradford-Verfahren (Bradford, 1976) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt.
Radioliganden-Bindungsuntersuchungen: Bindungsexperimente wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung von [³H]5-HT als Radioligariden (Zgombick et al., 1991). Acht [³H]5-HT (1-100 nM) Konzentrationen wurden in Sättigungsuntersuchungen verwendet. Sieben Konzentrationen der nicht markierten Verbindung und 5 nM [³H]5-HT wurden in kompetitiven Experimenten verwendet. Nicht markiertes 5-HT (10 uM) wurde verwendet, um die unspezifische Bindung zu definieren. Die Assays wurden durch Vakuumfiltration (Brandel, Gaithersburg, MD) beendet und die verbleibende Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Beckman 500TA flüssigen Scintillatonszählers quantifiziert (Beckman Instruments, Fullerton, CA).
Messung der cAMP-Bildung: Transiente transfizierte Cos-7 Zellen, die das humane 5-HT4B Rezeptorgen exprimieren, scheintransfizierte COS-7 Zellen, nicht-transfizierte COS-7 Zellen und stabil transfizierte LM(tk-)-Zellen wurden auf die Fähigkeit von 5-HT untersucht, intrazelluläre cAMP-Gehalte zu modifizieren. Sowohl die 5-HT ausgelöste Inhibition als auch die Stimulierung der cAMP-Gehalte wurde in diesen drei intakten Zellpräparationen untersucht. Die intrazelluläre cAMP-Bildung wurde durch ein Radioimmungssay (cAMP Radioimmungssaykit, Advanced Magnetics, Cambridge, MA) unter Verwendung der von Zgombick et al. (1991) beschriebenen Methodik gemessen. Die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Packard COBRA Auto Gamma Zählers (ausgestattet mit Software für die Datenauflösung) quantifiziert.
Datenanalyse: Die Bindungsdaten wurden durch nicht lineare Regressionsanalyse analysiert (Accufit und Accucomp, Lundon Software, Chagrin Falls, OH). Die Cheng-Prusoff-Gleichung wurde verwendet, um ICso-Werte in Ki-Werte umzuwandeln. Funktionelle Daten wurden in eine logistische Gleichung mit vier Parametern übertragen, um Responseparameter zu erhalten (ECso, Emax, NH, Inplot, GraphPad, San Diego, CA). Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt.
Medikamente: Die Medikamente wurden von den folgenden Firmen bezogen: [³H]5-HT spezifische Aktivität = 20,4-28,0 Ci/mMol (New England Nuclear, Boston, MA), 5-HT, Ergotamin, Ergonovine, Oxymetazolin, (±)-Pindolol, 5- Guanylylimidodiphosphat (Sigma, St. Louis, MO), 5-CT, DP-5- CT, 5-MeOT, 5-MeO-DMT, (±)-α-Me-5-HT, 2-Me-5-HT, Tryptamin, DPAT, DOI, Ketanserin, Methysergid, 1-Naphthylpiperazin, PAPP, Spiperon, TFMPP, Yohimbin, Zacoprid (Research Biochemical Inc., Natick, MA), Lysergol, Methylergonovin (Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI), Rauwolscine (Accurate Chemicals, Westbury, N. Y.), Methiothepin (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA). Alle anderen Chemikalien besaßen den höchsten gewerblich erhältlichen Reinheitsgrad.

Ergebnisse

Es wurde eine humane Plazentagenom-Bibliothek unter Verwendung mittlerer stringenter Bedingungen mit Oligonucleotidsonden, die gegen den dritten, fünften, sechsten und siebtem transmembranen Bereich des Drosophila- Serotoninrezeptorgens, Dro5HTR (Witz et al., 1990), gerichtet waren, gescreent. Insgesamt wurden drei positive Klone isoliert und durch Southern-Blot Analyse charakterisiert. Zwei Klone waren identisch und der andere Klon war ein überlappendes Fragment der beiden anderen. Einer der beiden identischen Klone, hp78a, enthielt ein 1,8 kb EcoRI/PstI Fragment, das mit den von Drosophila abstammenden Oligonucleotidsonden hybridisierte und wurde anschließend in einen pUC Vektor subkloniert. Die DNA-Sequenzanalyse wies darauf hin, dass die größte Homologie zu dem Drosophila 5HT Rezeptor bestand, der an einer Adenylatcyclase-Stimulierung beteiligt ist (Witz et al., 1990). Ein Hydrophobizitätsdiagramm dieses Subklons zeigte Bereiche hydrophober Aminosäurereste, die von hydrophilen Aminosäureresten flankiert sind, was damit übereinstimmt, dass er ein Mitglied der sieben transmembranen G-Protein gebundenen Rezeptorgen Superfamilie ist (Savarese et al., 1992). Außerdem enthielt dieser Klon einen Alaninrest in dem vorhergesagten fünften transmembranen Bereich in Übereinstimmung damit, dass er ein Mitglied der Serotonin- Unterfamilie ist. Dieser Alaninrest unterscheidet die Serotonin-Unterfamilie von anderen Catecholaminrezeptoren (die einen Serinrest an dieser Position aufweisen, Weinshank et al., 1992b). Dieser Klon codierte TM4 bis zum Carboxylterminus, einschließlich einem Intron stromaufwärts des vorhergesagten zweiten intrazellulären Loops.
Zum Erhalt eines vollständigen Klons wurden Aliquote der humanen cDNA-Bibliotheken, insgesamt 1,5 · 10&sup6; Rekombinante, durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung spezifischer Oligonucleotidsonden von der von dem Genomklon bestimmten Sequenz (siehe Materialien und Verfahren) gescreent. Eine positiv enthaltende humane fetale Hirn cDNA- Bibliothek (Stratagene, LaJolla, CA) in λ Zapil ( 1,5 · 10&sup6; Rekombinanten) wurde gescreent unter Verwendung traditioneller Plaque-Hybridisierung mit einer internen Sonde (siehe Materialien und Verfahren) und führte zu der Isolierung eines positiven cDNA-Teil-Klons, hFB9a, der TM3 bis zum Stopcodon enthielt und mit dem ursprünglichen Genomklon, hp78a (das Intron zwischen Tm3 und Tm4 war aufgrund von mRNA-Splicing nicht vorhanden) überlappte. Da dieser cDNA-Klon nicht die gesamte Länge aufwies, wurde die gleiche humane fetale cDNA-Bibliothek mit einer Sonde gescreent, die von dem am weitesten stromaufwärts liegenden nicht konservierten Bereich des cDNA-Klons hFB9a, entsprechend dem Tm3/4 Loop (siehe Materialien und Verfahren) abstammt. Dieser Screen führte zu der Isolierung eines weiteren positiven aber cDNA-Teil-Klons, hFB44a, der nur TM2 bis TM3 enthielt und mit den dem cDNA-Klon hFB9a innerhalb TM3 übereinstimmte. Wiederum wurde zum Erhalt von 5' cDNA- Klonen die humane fetale Hirn cDNA-Bibliothek mit einer Sonde gescreent, die von dem am weitesten stromabwärts liegenden nicht konservierten Bereich des cDNA-Klons hFB44a, entsprechend dem TM2/3 Loop (siehe Materialien und Verfahren) abstammt. Dieser Screen führte zu der Isolierung eines weiteren positiven, aber Teil cDNA-Klons, hFB41a, der einen Teil des Aminoterminus bis TM3 enthielt, aber dem ungefähr 20 Aminosäuren von dem Startmethioninrest fehlten (dieser Klon überlappte in ähnlicher Weise mit dem hFB44a cDNA-Klon von TM2 bis TM3). Letzlich wurde zum Erhalt des vollständigen Aminoterminus eine humane Plazentagenom-Bibliothek unter stark stringenten Bedingungen gescreent mit einer Sonde, die von dem nicht konservierten Aminoterminus-Bereich des cDNA- Klons hFB41a abstammt. Insgesamt wurden 2 verschiedene positive Klone aus diesem Genomscreen gescreent und durch Southern-Blot Analyse charakterisiert. Ein Klon stellte ein Scheingen des 5-HT4B Rezeptors (nicht veröffentlichte Daten) dar, wohingegen der andere Genomklon den Anfangsmethioninrest bis zu dem Intron zwischen TM3 und TM4 enthielt. Ein 0,5 kb NcoI/NcoI-Fragment, enthaltend das Anfangsmethionin bis zu der NcoI-Stelle in TM3 wurde in pGEM subkloniert.
Das vollständige Gen wurde in zwei Teilen hergestellt: der erste Teil umfasste die Ligation von zwei Fragmente aus zwei cDNA-Klonen und einem synthetischen doppelsträngigen Oligonucleotid in pBluescript, und der zweite Teil umfasste die Ligation des Aminoterminus enthaltenden Genomfragments und einem Fragment von dem ersten Teilkonstrukt in einen Expressionsvektor. Der erste Teil der Herstellung umfasste die Ligation eines 0,4 kb SalI/NcoI Fragments aus dem cDNA- Klon hFB41a (die SalI-Stelle stammt vom Vektor, wohingegen sich die NcoI-Stelle in Tm³ befindet), eines annelierten komplementären doppelsträngigen Oligonucleotidfragments, das NcoI und KpnI Termini aufweist (ungefähr 100 Bp, die Sequenz basiert auf Daten aus den cDNA-Klonen hFB9a, hFB44a und hFB41a) und eines 0,8 kb KpnI/EcoRI Fragments aus dem cDNA- Klon hFB9a (EcoRI stammt vom Vektor, wohingegen sich die KpnI-Stelle in dem TM3/4 Loop befindet) in mit SalI und EcoRI verdautem pBluescript. Der zweite Teil der Herstellung wurde durchgeführt durch Ligation des 0,5 kb SalI/NcoI Genomsubklons, enthaltend das Anfangsmethionin bis zu TM3 (SalI stammt vom Vektor, wohingegen sich die NcoI-Stelle in Tm³ befindet, dieses Fragment wurde durch Teilverdau mit NcoI und vollständigem Verdau mit SalI erhalten), mit einem 0,9 kb NcoI/EcoRI synthetischen Oligonucleotid/cDNA Fragment aus dem ersten Teilkonstrukt (enthaltend TM3 bis zum Stopcodon) in den mit SalI und EcoRI verdauten Expressionsvektor.
Das vollständige Genom/cDNA-Konstrukt in dem Expressionsvektor (hp78a/EXJ genannt) enthält einen offenen Leserahmen von 1335 Bp (mit 27 Bp am 5' UT und 50 Bp am 3' UT) und codiert ein Protein mit einer Länge von 445 Aminosäuren, das eine relative Molekularmasse von ~49.000 Daltons aufweist.
Die Hydropathie Analyse des Proteins stimmt mit einer mutmaßlichen Topographie der sieben transmembranen Domänen überein, was für die G Protein-gebundene Rezeptorfamilie bezeichnend ist. Die Anfangssequenzanalyse ergab, dass der Klon hp78a/EXJ am meisten mit einem Serotoninrezeptor verwandt war, da er eine Zahl von konservierten strukturellen Merkmalen/Resten enthielt, die bei Mitgliedern der Serotoninrezeptorfamilie zu finden sind, einschließlich der konservierten Aspartinsäurereste in TM2 und TM3, die Asp-Arg- Tyr Sequenz am Ende von TM3, des konservierten Alaninrestes in dem fünften transmembranen Bereich und der konservierten Prolinreste von TM 4-7 (Hartig, 1989, Hartig et al., 1990). Die anderen Merkmale dieses humanen 5-HT4B Rezeptorgens sind die Gegenwart der beiden potentiellen Stellen für die Ngebundene Glycosylierung in dem Aminoterminus (Asparaginreste 5 und 66, Fig. 1) und die Gegenwart von verschiedenen Serinen und Threoninen in dem Carboxylterminus sowie die intrazellulären Loops, die als Stellen der potentiellen Phosphorylierung durch Proteinkinasen dienen können.
Humane Gewebeverteilung der RNA, die das 5-HT4B Rezeptorgen codiert. Die gesamte RNA, die aus verschiedenen humanen Geweben isoliert wurde, wurde in einzelsträngige cDNA durch Primer mit Zufallsequenz unter Verwendung von reverser Transkriptase umgewandelt. cDNAs wurden durch PCR unter Verwendung von PCR Primern, die spezifisch für das humane 5- HT4B Rezeptorgen sind, amplifiziert. PCR-Produkte wurden auf einem 1,5% Agarosegel laufen gelassen, auf Nylonmembranen blottiert und mit internen genspezifischen Oligonucleotiden hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Blots unter stark stringenten Bedingungen gewaschen. Die positive Kontrolle war das genspezifische rekombinante Plasmid, dH&sub2;O diente als negative Kontrolle, enthaltend alle Reagenzien außer der cDNA-Matrize, RNA oder das Plasmid. Die PCR- Amplifizierung und das Southern-Blotting der RNA-Proben, die nicht mit reverser Transkriptase behandelt wurden, waren negativ.

Tabelle 1

Lokalisierung der 5-HT4B Rezeptor mRNA in humanem Gewebe

+++ = dunkel
++ = mittelmäßig
+ = vorhanden, aber schwach
- nicht vorhanden

Humane Gewebe 5-HT4B mRNA

Prostatadrüse III +
Prostatadrüse IV +
Prostatadrüse V + ¹/&sub2;
Hoden +++
Blase +++
Endometrium (Gebärmutter) ¹/&sub2; +
Myometrium (Gebärmutter) ¹/&sub2; +
Atrium ¹/&sub2; +
Mesenterium +
Nasenschleimhaut ++
Penis ++
Haut (-)
Zunge (-)
Die Expression der hp78a-Transkripte wurde durch Amplifzierung von cDNA, die aus RNA abstammt, die von verschiedenen humanen Geweben isoliert wurde, untersucht (reverse Transkription PCR oder RT-PCR) (Fig. 3). Selektiv konnte die Gewebeverteilung des funktionellen Klons hp78a (und nicht des Scheingens) unter Verwendung von genspezifischen PCR-Primern und genspezifischen internen Oligonucleotid-Sonden untersucht werden (Daten sind nicht gezeigt). Vergleichbare Mengen von Anfangs-RNA für alle Gewebe konnten gezeigt werden, indem Kontroll RT-PCR mit Primern, für die Gene, die im wesentlichen in moderaten Gehalten exprimiert wurden, Actin und Glyceraldehyd-3- phosphat Dehydrogenase, durchgeführt wurde (Clontech, Daten sind nicht gezeigt). Die mRNA, die den 5-HT4B Rezeptor (hp78a) codiert, wird in hohen Gehalten im Hirn und in niedrigen Gehalten in verschiedenen peripheren Geweben (Niere, Leber, Bauchspeicheldrüse, Prostatadrüse, Gebärmutter, Mesenterium und Milz) exprimiert. Auf Basis des pharmakologischen Profils des 5-HT4B Rezeptors und seiner Beziehung zu den zuvor charakterisierten 5-HT Rezeptoren, die die Relaxation der glatten unwillkürlichen Muskeln auslösen, wurden verschiedene andere Gewebe auf die RNA-Expression untersucht. Interessanterweise wurde entdeckt, dass hohe mRNA-Gehalte für 5-HT4B in der Koronararterie und in verschiedenen Bereichen des Magen-Darm-Kanals, einschließlich des Magens, der Blase, dem absteigenden Colon und dem Ileum, nachgewiesen wurden, was mit der möglichen Rolle von 5-HT4B als relaxierender Rezeptor der glatten unwillkürlichen Muskeln übereinstimmt (Fig. 3).
Die Ergebnisse der in situ Hybridisierungsuntersuchungen (Tabelle 2) weisen darauf hin, dass die Verteilung der 5-HT4B mRNA mit der des 5-HT4B Rezeptors in einigen Bereichen überlappte. Die intensivsten Hybridisierungssignale wurden bei Neuronen im Thalamus, dem anterieuren hippocampischen Rudiment und bei CA3 im Hippocampus beobachtet. Andere Hybridisierungssignale enthaltende Bereiche umfassen das Septum, den Hippothalamus, die centromediale Amygdala und das zentrale Höhlengrau. Interessanterweise enthielten zwei Gebiete, die kräftiges Rezeptorbindungssignal entfalteten, der Globus pallidus und das Substantia nigra, keine 5-HT4B Hybridisierungssignale, was eine präsynaptische Lokalisierung der 5-HT4B Rezeptoren in diesen beiden verwandten Strukturen vermuten lässt.
Die spezifische Bindung von [³H]5-CT wurde in vielen Bereichen des Rattenhirns beobachtet. Nach der Inkubation mit 1 uMol Ergotamin wurde die Bindung vollständig unterbunden. Die Zugabe von PAPP und (-)Pindolol zu dem Radioliganden verringerte die Bindung in einer Vielzahl von Bereichen sehr, am meisten war dies in den tiefen Schichten der Großhirnrinde, dem Hippocampus, der dorsalen Raphe und dem Rückenmark zu beobachten. In Gebieten, in denen die [³H]5-CT Bindung nach der Zugabe der Masken weiter bestand, waren die Schichten 1-3 der Großhirnrinde, Septum, Globus pallidus, Thalamus, Hippothalamus, centromediale Amygdala, Substantia nigra, das zentrale Höhlengrau und der vordere Hügel der Vierhügelplatte. Die Bindung des Radioliganden in diesen Bereichen wurde durch Zugabe von 5 uMol Methiothepin zu der Inkubation unterbunden, was darauf hinweist, dass die beobachtete Bindung auf 5-HT4B Rezeptoren zurückzuführen ist. Tabelle 2 Lokalisierung der 5-HT4B Rezeptor/mRNA im Rattenhirn
A sehr niedrige Zahl an Bindungsstellen gemäß Rezeptorautoradiographie, bei der in situ Hybridisierung wurden jedoch mittelmäßige Gehalte von 5-HT4B mRNA Transkripten beobachtet: CA3> DG> CA1. n. u. = nicht untersucht
Nierenzellen des Affen, die transient das Gen exprimieren, das den neuen humanen 5-HT4B Rezeptor codiert, wurden für pharmakologische Untersuchungen verwendet. Membranen, die aus transient transfizierten Cos-7 Zellen geerntet wurden, entfalteten eine hohe Affinität und eine sättigungsfähige [³H]5-HT Bindung. Die nicht ineare Analyse der [³H]5-HT Sättigungsdaten ergaben eine Dissoziationskonstante im Äquilibrium (Kd) von 0,5 ± 0,8 nM und eine Bindungsstellendichte (Bmax) von 6,6 ± 0,8 pMol/mg Protein. Die spezifische [³H]5-HT Bindung war größer als 90% der Gesamtbindung bei einer Radioligandenkonzentration, die dem KaWert entspricht. [³H]5-HT Bindung mit hoher Affinität an Membranen, die aus transienten Transfektanten hergestellt sind, war bedeutend verringert (75%) bei 100 uMol Gpp(NH)p, einem nicht hydrolysierbaren Analog von GTP. Nichttransfizierte Wirtszellen wiesen keine spezifische [³H]5-HT Bindung auf.
Zur weiteren Untersuchung der pharmakologischen Identität des neu isolierten Serotoninrezeptorgens wurden detaillierte Bindungseigenschaften des Klons hp78a durch nichtlineare Kompetitionsanalyse für die [³H]5-HT Bindung mit hoher Affinität bestimmt. Die spezifische [³H]5-HT Bindung wurde vollständige auf eine monophasische Weise (nH = 1) mit einer Vielzahl von strukturell unterschiedlichen serotonergen Liganden ersetzt. Die Reihenfolge der Wirksamkeit dieser Verbindungen, die spezifische [³H]5-HT Bindung zu ersetzen war 5-CT > Methiothepin > Mertergolin = DHE = 5-MeOT > 5-HT > 1-Br-LSD > DP-5-CT > DPAT > Sumatriptan > ICS 203930 (Tabellen 3 und 4). Verschiedene Derivate entfalteten eine hohe Affinität (Ki < 20 nM) für den 5-HT4B Rezeptorklon und umfassen Mertergolin, Dihydroergotamin, Ergotamin und Mesulergin. Serotonerge Liganden, die Untertyp-Selektivität aufwiesen und eine niedrige Affinität (Ki > 100 nM) für den Klon hp78a aufwiesen, umfassen DPAT (5-HT1A), Sumatriptan (5- HTID), Ketanserin (5-HT&sub2;) und Zacoprid (5-HT&sub3;). Die substitutierten Benzamide (ICS 203930, MDL 29429, Zacoprid), Verbindungen, die bei dem funktionellen 5-HT4B Rezeptor aktiv sind, wiesen auch eine niedrige Affinität (Ki > 500 nM) für den 5-HT4B Rezeptor auf. Andere biogene Amine zeigten keine bemerkenswerte Affinität (Ki > 1 uM) für den Klon hp78a (Tabellen 3 und 4).

Tabelle 3

Scheinbare Dissoziationskonstanten (Ki-Werte) der serotonergen Liganden für den Klon hp78a. Die Membranen wurden 30 Minuten bei 37ºC inkubiert mit 5 nM [³H]5-HT in der Gegenwart von sieben Konzentration (1000-facher Konzentrationsbereich) der nicht markierten Kompetitoren. Die unspezifische Bindung wurde durch 10 uM nicht markierten 5-HT definiert. Die Affinitätskonstanten (Ki-Werte) wurden aus den IC&sub5;&sub0;-Werten durch nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung der Cheng-Prusoff-Gleichung berechnet. Die Ki-Werte wurden als Durchschnittswerte ± S. E. M. von 2-5 Bestimmungen ausgedrückt.

Verbindung Ki(nM)

5-Carboxyamidotryptamin 0,93 ± 0,20
Methiothepin 3,7 ± 1,0
5-Methoxytryptamin 5,1 ± 0,4
Metergolin 6,4 ± 1,4
Dihydroergolin 6,9 ± 0,9
5-Hydroxytryptamin 8,1 ± 1,3
Ergotamin 15
Mesulergin 18 ± 5
Bufotenin 26
2-Brom-LSD 30 ± 10
Dipropyl-5-carboxyamidotryptamin 37 ± 21
5-Methoxy-N,N-dimethyltryptamin 43
Ritanserin 45 ± 10
Clozapin 78 ± 10
Methysergid 83 ± 5
1-Naphthylpiperazin 83 ± 19
Spiperon 110 ± 17
Cyproheptadin 123 ± 16
Bromcriptin 137 ± 2
Tryptamin 149 ± 20
m-Chlorphenylpiperazin 312
8-Hydroxy-N,N- dipropylaminotetralin 466 ± 46
α-Methyl-5-hydroxytryptamin 509
5-Benzyloxytryptamin 729

Verbindung Ki (nM)

Sumatriptan 951 ± 118
Ketanserin 1334 ± 241
Yohimbin 2850 ± 354
2-Methyl-5-hydroxytryptamin 3400
Pindolol > 5000
Zacoprid > 5000

Tabelle 4

Prozentualer Austausch der spezifischen [³H]5-HT Bindung an Membranen, die von Zellen abstammen, die transient das Gen hp78a exprimieren, durch serotonerge Liganden. Die Membranen wurden 30 Minuten bei 37ºC mit 5 nM [³H]5-HT und einer Konzentration des nicht markierten Kompetitors inkubiert. Die unspezifische Bindung wurde definiert durch 10 uM nicht markiertes 5-HT.
Die Fähigkeit des Klons hp78a funktionell an Adenylatcyclase zu binden wurde untersucht unter Verwendung von intakten COS- 7 Zellen, die transient das codierende Gen hp78a exprimieren. Sowohl die Stimulierung der cAMP-Grundabgabe als auch die Inhibition der FSK-stimulierten cAMP-Response wurde untersucht. 5-HT (1 uM) hatte keine Wirkung sowohl auf die Grund- als auch auf die FSK-stimulierte Adenylatcyclase- Aktivität in nicht-transfizierten oder scheintransfizierten COS-7 Zellen (Daten sind nicht gezeigt), was darauf hinweist, dass endogene Cyclase-gebundene Serotoninrezeptoren nicht in nicht-transfizierten Zellen exprimiert werden. Die Zugabe von 5-HT (1 uM) zu transfizierten COS-7 Zellen ergab eine 7- fache Stimulierung der cAMP-Grundabgabe (0,035 ± 0,004 pmol/ml/10 Minuten), die Inhibition weder der Grund- noch der FSK-stimulierten wurde nicht beobachtet. Die Inkubation von 1 uM FSK und 1 uM 5-HT rief eine synergistische cAMP-Response hervor, was zu einer 75-fachen Stimulierung der intrazellulären cAMP-Anhäufung führte (Daten sind nicht gezeigt). 5-CT und 5-MeOT waren ebenfalls wirksame Agonisten bei 1 uM, wobei 5-CT interessanterweise wirksamer zu sein schien, als 5-HT selbst, wohingegen 8-OH-DPAT bei 1 uM die cAMP-Response nur ungefähr 2-fach stimulierte. Methysergid, Metergolin und Methiothepin bei 10 uM antagonisierten die 5- HAT-Response fast vollständig, wohingegen ICS-205-930 eine schwach inhibitorische Wirkung bei 100 uM aufwies. Die Kurven der vollständigen Dosisresponse wurden für 5-HT und 5- CT bestimmt. 5-HT entfaltete einen EC&sub5;&sub0;-Wert von 929 ± 345 nM und eine maximale Stimulation (Emx-Wert) von 2191 ± 715% cAMP-Grundabgabe (n = 4), wohingegen 5-CT eine höhere Affinität ECso = 75 ± 15 nM) mit einem ähnlichen Emax (2029 ± 47% cAMP-Grundabgabe, n = 4) aufwies (Tabelle 5, Fig. 4 und 5).

Tabelle 5

Pharmakologisches Profil der cAMP-Response unter Verwendung des humanen 5-HT4B Rezeptors, der transient in COS-7 Zellen exprimiert wird. cAMP-Messungen auf intakten Zellen wurden wie in Verfahren und Materialien beschrieben durchgeführt. Die Aktivität des Medikaments wurde 3-fach gemessen. Die Ergebnisse für die Agonisten sind als cAMP-fache Stimulierung im Verhältnis zu den Grundwerten (Grund: 0,053 ± pmol/ml/10 Minuten) ausgedrückt. Die Daten der Antagonisten sind als prozentuale Inhibition der cAMP-Response in Bezug auf 1 uM 5- HT ausgedrückt.
In stabil transfizierten LM (tk&supmin;) Zellen wurde eine maximale Stimulierung von 400% der cAMP-Grundanhäufung durch 5-HT festgestellt. Die Inhibition entweder der Grund- oder FSK stimulierten cAMP-Abgabe wurde nicht beobachtet. Die Affinitätswerte der verschiedenen untersuchten Verbindungen sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Im allgemeinen waren die ECso-Werte der aus den funktionellen Studien erhaltenen Agonisten ungefähr eine Größenordnung niedriger als die Ki- Werte, die in den Bindungsassays erhalten wurden. 5-CT und 5-MeOT waren wirksame Agonisten mit vergleichbarer intrinsischer Aktivität für 5-HAT; 5-CT wies jedoch eine wesentlich größere Affinität (ungefähr 10-fach) als 5-HT auf. 8-OH-DPAT war ein schwacher Agonist, der ungefähr die Hälfte der maximalen Response verursachte, die von 5-HT ausgelöst wird. Alle untersuchte Alkaloide verhielten sich als stille Antagonisten mit KB-Werten, die sich nicht wesentlich von den Ki-Werten unterschieden, die in den Bindungsassays erhalten wurden. Methiothepin war außerdem ein wirksamer stiller Antagonist (Tabelle 6).

Tabelle 6

Pharmakologisches Profil der cAMP-Response unter Verwendung des humanen 5-HT4B Rezeptors, der stabil in LM(tk-) Zellen exprimiert wird. Die cAMP-Messungen auf intakten Zellen wurden wie in Verfahren und Materialien beschrieben durchgeführt. Die durchschnittliche maximale Response für 5- HT in diesen Zellen ist eine 400%ige Stimulierung der cAMP Grundherstellung. Die Emax-Werte sind auf die 5-HT maximale Response normalisiert. Agonist bedeutet, dass die maximale Response für das Medikament zumindest 80% der maximalen Response, die mit 5-HT erhalten wird, ist (400% Stimulierung der cAMP Grundanhäufung). Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte ± S. E. M. von mindestens 3 Experimenten, die dreimal durchgeführt wurden. Die Dissoziationskonstante des Antagonisten (Ka) wurde gemäß der Formel: KB = [B]/(A'/A)-1] berechnet, wobei [B] die Konzentration des Antagonisten, A' und A die EC&sub5;&sub0;-Werte des Agonisten ist, die jeweils in Gegenwart und Abwesenheit des Antagonisten gemessen wurden (Furchgott, 1972), sind.

Diskussion

Es wurde aus humaner Hirn-cDNA und aus Genom-DNA eine DNA kloniert, die einen neuen humanen Serotoninrezeptor (hp78a oder 5-HT4B) darstellt. Unter den bekannten G Proteingebundenen Rezeptorsequenzen (EMBL/Genbank Datenbank) bestand die größte Homologie zwischen dem Rezeptorgen des Klons hp78a und dem Drosophila Serotoninrezeptorgen 5HTR (Witz et al., 1990). Ein Vergleich zwischen der vom Klon hp78a abgeleiteten Aminosäuresequenz mit bekannten G Proteingebundenen Rezeptorsequenzen weist darauf hin, dass sich die höchste Konzentration identischer Aminosäuren in den transmembranen Bereichen befindet. In diesen TM Bereichen ist für den Klon hp78a die prozentuale Identität im Vergleich zu Dro5HTR1 57%, zu dem Serotoninrezeptor-Unterfamilie 39-53 % (siehe Fig. 2), zu der adrenergenen Rezeptor-Unterfamilie 40-50%, zu der Dopaminrezeptor-Unterfamilie 54-49%, zu der Histaminrezeptor-Unterfamilie 37-41%, zu den Peptidrezeptoren 27-28% und zu den Adensinrezeptoren 32-33%. Sowohl die Aneinanderreihung als auch die prozentuale Identität dieser humanen Sequenz hp78a im Verhältnis zu anderen G Proteingebundenen Rezeptoren oder anderen Mitgliedern der serotonergen Unterfamilie lässt deutlich vermuten, dass dies ein neuer Rezeptor ist. Aufgrund der TM Homologie zwischen dem Rezeptor des Klons hp78a und den anderen Serotoninrezeptoren, die weniger als 55% beträgt, und der Tatsache, dass dieser Rezeptor positiv an Adenylatcyclase gebunden ist (siehe Ergebnisse und nachfolgenden Text), wurde dieser Klon 5-HT4B genannt.
Die Lokalisierung der Transkripte dieses Rezeptors zeigt eine verhältnismäßig breite Gewebeverteilung an. Von den untersuchten Geweben wurde die humane 5-HT4B (Klon hp78a) Rezeptor mRNA am häufigsten im Gehirn, den Hoden und der Blase nachgewiesen, wobei mäßige bis niedrige-Werte in anderen peripheren Geweben festgestellt wurden und kein Signal in der Haut und der Zunge nachgewiesen wurde.
Die Verteilung des 5-HT4B Rezeptors und seine hier beschriebene mRNA deuten darauf hin, dass dieser neue Serotoninrezeptor in verschiedenen Hirnsystemen Wirkungen entfalten kann. Das Limbische System (Septum, centromediale Amygdala, ...., Hippothalamus) ist besonders gut dargestellt, was auf eine Rolle des 5-HT4B Rezeptors in affektiven Verfahren schließen lässt. Die Feststellung, dass dieser Rezeptor sehr gut Clozapin bindet, lässt vermuten, dass der 5-HT4B Rezeptor an Schizophrenie oder anderen neurologischen Störungen, die auf affektiven Psychosen basieren, beteiligt sein kann. Außerdem lässt die Lokalisierung der mRNA des Klons hp78a in thalamischen Nuclei, die sich auf die Neocortex projizieren, vermuten, dass dieser Rezeptor an Verfahren, die die Sinne betreffen, beteiligt ist. Die Lokalisierung in den raphe Nuclei deutet auf eine mögliche Wirkung als Autorezeptor hin, wodurch neue Therapien durch die 5-HT4B Wirkung in Anxiolytika und Antidepressiva angestrebt werden können. Da die Verteilung der 5-HT4B Rezeptoren im allgemeinen durch die Arten hinweg erhalten ist, wobei die Lokalisierung auf nicht humane Arten zurückzuführen ist, wie bei der Ratte oder dem Meerschweinchen, werden sie am ehesten als analog zum humanen Gehirn angesehen.
Das Bindungsprofil, das für den Rezeptor des Klons hp78a erhalten wurde, scheint einen bestimmten Serotoninrezeptor Untertyp darzustellen, basierend auf seinem einzigartigen pharmakologischen Profil. Die Reihenfolge der Verbindungen, durch die die [³H]5-HT Bindung ausgetauscht wird (Tabelle 3), stimmt nicht mit den Bindungseigenschaften überein, die für andere [³H]5-HT Bindungsstellen (Xiong und Nelson, 1989, Zemlin et al., 1991) oder für pharmakologische Eigenschaften von pharmakologisch definierten Serotoninrezeptoren, die in einer Vielzahl von funktionellen Präparaten beschrieben sind (siehe unten) überein. Die hohe Affinität von 5-CT (Ki = 0,5 nM) und die niedrige Affinität von Sumatriptan (Ki > 750 nM) für den Rezeptor des Klons hp78a stimmt mit den Bindungseigenschaften einer [³H]5-CT Bindungsstelle überein, die kürzlich in Striatum Homogenaten des Meerschweinchens identifiziert wurden (Mahle et al., 1992). Ein direkter Vergleich der pharmakologischen Eigenschaften von dem Rezeptor des Klons hp78a mit der [³H]5-CT Bindungsstelle kann jedoch nicht gemacht werden, da eine vollständige Charakterisierung der Bindungsstelle fehlt und keine funktionelle Response gezeigt worden ist.
Die Bindungskriterien, die zur Klassifizierung von 5-HT&sub1; Rezeptor-Untertypen verwendet werden, umfassen hohe Affinitäten für 5-HT und 5-CT. Diese beiden Verbindungen entfalteten eine hohe Affinität für den Rezeptor des Klons hp78a (Tabelle 3). Sowohl der kürzlich klonierte humane 5- HTlE (McAllister et al., 1992; Zgombick et al., 1992) und der 5-HT1F (Adham et al., 1992) Rezeptor zeigen eine hohe Affinität für 5-HT (Ki < 10 nM) und eine niedrige Affinität für 5-CT (Ki > 700 nM). Der 5-HT1E und 5-HT1F Rezeptor sind Mitglieder der 5-HT&sub1; Rezeptorfamilie, basierend auf ihren TM- Homologien mit den von anderen klonierten Mitgliedern dieser Rezeptorfamilie (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1Dund 5-HT1D) und der-Second Messenger Bindung (Inhibition von Adenylatcyclase). Während der klonierte 5-HTtc Rezeptor [³H]5-HT mit hoher Affinität bindet, wird er als 5-HT&sub2; Rezeptor angesehen, basierend auf seiner hohen TM Homologie (75%) gegenüber dem klonierten 5-HT&sub2; Rezeptor und der funktionellen Bindung an Phospholipase C (Hartig et al., 1990, Julius, 1992). Basierend auf diesen Beobachtungen ist es schwierig, einen Rezeptor für den Klon hp78a als einen 5-HT&sub1; Rezeptor Subtyp zu klassifizieren, wenn nur die Bindungseigenschaften für Radioliganden berücksichtigt werden.
Funktionelle Responses des Rezeptors des Klons hp78a liefern weitere Einsicht in seine Identität. Das Rezeptorgen des Klons hp78a, das transient in COS-7 Zellen exprimiert wird, ist mit der Stimulierung von Adenylatcyclase verbunden. Sowohl 5-HT als auch 5-CT zeigten eine 20-fache Erhöhung der cAMP Abgabe im Verhältnis zu den Grundwerten. Die in den Bindungsassays erhaltenen Ki-Werte von 5-HT und 5-CT wiesen eine 100-fache höhere Affinität auf, als die EC&sub5;&sub0;-Werte dieser Agonisten, die in funktionellen Assays erhalten wurden. Die Reihenfolge der Wirksamkeit der Agonisten, die in dem funktionellen Assay beobachtet wurde, 5-CT > 5-HT 5- -MeOT > 8-OH-DPAT ist sehr ähnlich wie die Reihenfolge dieser Verbindungen, die spezifische [³H]5-HT Bindung auszutauschen. Stabile LM(tk-) Zellen, die den 5-HT4B Rezeptor exprimieren, ergaben sehr ähnliche Pharmakologie-Daten wie die mit den Antagonisten transient transfizierten Cos7-Zellen, die im wesentlichen eine identische Reihenfolge der Wirksamkeit aufwiesen, wobei die maximale cAMP-Response, die von diesen Agonisten verursacht wird, in den LM(tk-) Zellen jedoch niedriger war. Die Agonisten hatten die folgende Wirksamkeitsreihenfolge: d-LSD > Methiothepin 2-Br-LSD > Mesulergin = DHE.
Die Fähigkeit von Serotonin, Adenylatcyclase zu aktivieren, ist in verschiedenen Systemen gezeigt worden, einschließlich: embryonale Colliculi der Maus (5-HT&sub4;, Dumius et al., 1988), gliale Membranen des Pferdehirns (5-HT&sub1;-ähnlich, Fillion et al., 1980), Hippocampusmembran der Ratte und des Meerschweinchens (5-HT1A, Shenker et al., 1987), humane Vorkammern (5-HT&sub4;, Kaumann et al., 1989), NCB20 Neuroblastomhybridzellen (5-HT&sub4;-ähnlich, Conner und Mansour, 1990, Cossery et al., 1990) und neonatale Hohlvene des Schweins (5-HT&sub1;--ähnlich, Trevethick et al., 1989). Der vom HTa-Gen codierte Rezeptor unterscheidet sich von dem 5-HT&sub4;- Rezeptor, der in diesen Präparaten identifiziert wurde, obgleich einige gemeinsame Eigenschaften bestehen. Sowohl die 5-HT&sub4;-Rezeptoren, die in den Colliculi, den Vorkammern und auf den NCB20 Zellen und dem Rezeptor des Klons hp78a identifiziert wurden, besitzen eine gemeinsame Wirksamkeit für 5-HT und 5-MeOT, die die cAMP-Abgabe mit niedriger Affinität stimulieren. Außerdem sind sie beide nicht besonders empfindlich für 8-OH-DPAT, Spiperon, Ketanserin und Pindolol. Methiothepin ist jedoch ein wirksamer Antagonist der funktionellen Responses, die durch den Rezeptor des Klons hp78a ausgelöst werden, aber nicht für die 5-HT&sub4;- Rezeptorresponses der Colliculi und der Vorkammern. Am kritischsten ist, dass Verbindungen, die verwendet wurden, um den "klassischen" 5-HT&sub4;-Rezeptor zu identifizieren (Agonisten: Cisaprid, Zacoprid, BRL 29429, schwacher Antagonist: ICS-205-930) sind entweder fast nicht aktiv oder inaktiv hinsichtlich des Rezeptors des Klons hp78a
Eine etwas engere pharmakologische Verwandtschaft besteht zwischen dem Rezeptor des Klons hp78a und dem 5-HT4-ähnlichen Rezeptor auf NCB20 Zellen, einschließlich der wirksamen Aktivität des Antagonisten Methiothepin. Es gibt jedoch die folgenden Unterschiede: a) [³H]5-HT bindet mit hoher Affinität (Kd = 8,5 nM) an den Rezeptor des Klons hp78a, hat aber eine sehr niedrige Affinität (-200 nM) für die 5-HT Rezeptoren auf NCB20 Zellen (Berry-Kravis und Dawson, 1983), b) die Reihenfolge der Wirksamkeit der Agonisten bei hp78a ist 5-CT > 5-HT 5-MeOT, wohingegen auf NCB20 Zellen die -Reihenfolge 5-HT ≥ 5-MeOT > 5-CT ist (Connor und Mansour, 1990). Außerdem teilt der Rezeptor des Klons hp78a verschiedene Eigenschaften mit dem 5-HT Rezeptor, der in glialen Membranen vorkommt (Fillion et al., 1980). Diese umfassen: a) die Dissoziationskonstante im Äquilibrium von [³H] 5-HT, Kd = 10 Nm, b) den EC&sub5;&sub0;-Wert für die 5-HT Stimulierung von cAMP ist 500-1000 nM und c) wirksamen Antagonismus bei: 2-BromLSD, Methysergid und Methiothepin.
Kriterien, die zur Klassifizierung der Serotoninrezeptoren in vier unterschiedliche Klassen, die 5-HT&sub1;,5-HT&sub2;, 5-HT&sub3; und 5-HT&sub4; genannt werden, verwendet werden, basieren auf den Bindungseigenschaften, den Signaltransduktionsmechanismen und abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Nach dem von Bradley et al. (1986) vorgeschlagenen Klassifizierungsschema des Serotoninrezeptors könnte der Rezeptor des Klons hp78a als ein Mitglied der 5-HT&sub1; Rezeptorfamilie angesehen werden, da 5-CT als Agonist wirkt und diese Response wirksam durch die nicht-selektiven 5-HT Antagonisten Methiothepin antagonisiert wird. Die positive Bindung des Rezeptors von dem Klon hp78a an Adenylatcyclase, die hier beobachtet wird, stimmt jedoch nicht für die klonierten Mitglieder der die 5-HT Rezeptor- Unterfamilie berichtet wurde, die mit der Inhibition der FSK- Stimulierung der cAMP Abgabe assoziiert werden und umfassen 5-HT1A (Fargin, 1988, Kobilka, 1989), 5-HT1B (Adham et al., 1992, Maroteaux et al., 1992), 5-HT1Dα (Hamblin and Metcalf, 1991, Weinshank et al., 1992), 5-HT1Dβ (Demchyshyn et al., 1992, Jin et al., 1992; Weinshank et al., 1992), 5-HT1E (Levy et al., 1992, McAllister et al., 1992, Zgombick et al., 1992) und 5-HT1F (Adham et al., eingereicht).
Obgleich ein nützliches Hilfsmittel kann die Klassifizierung der Serotoninrezeptoren allein auf der Basis der Bindungseigenschaften irreführend sein. Zum Beispiel wird der durch die Bindungskriterien ursprünglich genannte 5-HT1C Rezeptor ([³H]5-HT bindet mit hoher Affinität an diesen Untertyp) als 5-HT&sub2; Untertyp angesehen, auf Basis des hohen Homologiegrades (75%) in den TM Domänen mit dem 5-HT&sub2; Rezeptor und der Second Messenger Bindung (Phosphoinositidhydrolyse) (Harting et al., 1990, Julius, 1992). Obgleich der Rezeptor des Klons hp78a an [³H]5-HT mit hoher Affinität bindet, scheint seine positive Bindung an Adenylatcyclase und die niedrige TM Homologie (~ 50%) mit anderen klonierten Mitgliedern der 5-HT&sub1; Rezeptorfamilie die Möglichkeit auszuschließen, dass der Klon hp78a einen 5-HT&sub1; Untertyp codiert. Folglich scheinen TM Homologievergleiche und die Second Messenger Bindung genauere Informationen über die Rezeptorklassifizierung als die Bindungseigenschaften von Radioliganden zu bieten. Basierend auf diesen Analysen wird vorgeschlagen, dass der Klon hp78a in die erste Gruppe der 5- HTa Rezeptor-Unterfamilie eingeordnet wird. Das pharmakologische Profil des Klons hp78a unterscheidet sich von dem des pharmakologisch definierten 5-HT&sub4; Rezeptors. Der Klon hp78a wird daher 5-HT4B genannt, wobei die 5-HT4A Bezeichnung für einen Klon reserviert wird, der das pharmakologische Profil des 5-HT&sub4; Rezeptors aufweist, der in einer Vielzahl von isolierten Gewebepräparaten beschrieben wurde (Bokaert et al., 1992).
Schließlich weist die Primärstruktur des hp78a Gens, sein einzigartiges pharmakologisches Profil sowie die positive an von transient transfizierten Zellen erhaltene Adenylatcyclase darauf hin, dass dieses Gen das erste Mitglied der 5-HT&sub4; Rezeptorfamilie codieren kann. Es wird vorgeschlagen, den Klon hp78a als 5-HT4B Rezeptor-Untertyp zu bezeichnen, da er nicht die pharmakologischen Eigenschaften des pharmakologisch definierten 5-HT&sub4; Rezeptors aufweist. Weitere Klonierungsuntersuchungen sind erforderlich, um zusätzliche Mitglieder dieser neu erkannten Serotoninrezeptorfamilie zu isolieren (Bokaert et al., 1992). Der Vergleich der pharmakologischen Beziehung von 5-HT4B mit Serotoninrezeptoren, die in Gewebemodellen definiert wurden, weist auf eine mögliche Identität mit einer Sammlung von verwandten Rezeptoren hin, die im Gefäßsystem beschrieben wurden. Verschiedene dieser Rezeptoren scheinen als relaxierende Responses in isolierten Blutgefäßen zu wirken, was auf einen potentiellen therapeutischen Nutzen bei Angina, koronarer Herzkrankheit, Arteriosklerose und möglicherweise zerebralen Blutgefäßstörungen, die zum Schlaganfall führen, anzeigt. Die Gegenwart dieses Untertyps im ZNS deutet außerdem auf die Verwendung bei Störungen kognitiver Abläufe sowie der Kontrolle autonomer Wirkung hin. Darüber hinaus deutet die verhältnismäßig hohe Affinität (Ki = 78 nN) des atypischen Antipsychotikums Clozapin für den 5-HT&sub7; Rezeptor sowie die Lokalisierung dieses Untertyps in Rand- und Rindenbereichen auf eine potentielle Rolle des 5-HT&sub7; Untertyps bei neuropsychiatrischen Störungen, wie Schizophrenie, die die serotonerge Neurotransmission umfassen, hin.

REFERENZEN

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(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER: Bard A. Jonathan
Branchek A. Theresa
Weinshank L. Richard
(ii) BEZEICHNUNG DER FÜR EINEN HUMANEN SEROTONINREZEPTOR (5-HT4B)
ERFINDUNG: KODIFRENDE DNS UND IHRE VERWENDUNG
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZANSCHRAFT:
(A) NAME: uoo er & Dunham
(B) STRASSE: 30 Rockefeller Plaza
(C) New York
(D) Qys New York
(E) LAND: U. S. A.
(P) PLZ: 10112
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: DIS TE
(G) SYSTEM: PC-DOS/HS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln 1.24
(vi) ANGABEN ZUR ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANGABEN ZUM ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: White P., John
(B) ZULASSÜNGSNUMMER: 28,678
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 41908-A-PCT/JPW/TEP
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: (212) 977-9550
(B) TELEFAX: (212) 315-1931
(C) TELEX: 422523 COOP UI

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1406 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: doppelt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
ART DES
(ii) MOLEKULS: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: N
(iv) ANTI-SINN: 14
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: humanes Gehirn
(B) KLON: hp78a
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE. 28..1362
(D) ANDERE INFORMATION: (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 2:

(1) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 445 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Claims

1. Nucleinsäuremolekül, das (a) einen menschlichen 5-HT4B- Rezeptor, wobei der Rezeptor die in Fig. 1 gezeigte Aminosäure aufweist, oder (b) ein Teil des Rezeptors, der die gleichen Bindungseigenschaften wie die in den Tabellen 3 und 4 gezeigten aufweist, codiert.

2. Nucleinsäuremolekül, das (a) einen menschlichen 5-HT4B- Rezeptor, wobei der Rezeptor die Aminosäure aufweist, die durch die im Plasmid pcEXV-5HT4B (ATCC- Hinterlegungsnr. 75332) enthaltene DNA-Sequenz codiert ist, oder (b) ein Teil des Rezeptors, der die gleichen Bindungseigenschaften wie die in den Tabellen 3 und 4 gezeigten aufweist, codiert.

3. Nucleinsäuremolekül, das in bezug auf ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 degeneriert ist.

4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 bis 3, worin das Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül, cDNA-Molekül oder RNA-Molekül ist.

5. DNA-Molekül nach Anspruch 4, wobei das DNA-Molekül von genomischer DNA stammt.

6. Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4 umfaßt.

7. Vektor nach Anspruch 6, der ein Plasmid ist.

8. Vektor nach Anspruch 6 oder 7, der zur Expression in einer Bakterienzelle angepasst ist und die für die Expression der Nucleinsäure nach Anspruch 4 in der Bakterienzelle notwendigen regulatorischen Elemente so relativ zu der Nucleinsäure gelegen umfasst, dass deren Expression ermöglicht wird.

9. Vektor nach Anspruch 6 oder 7, der zur Expression in einer Hefezelle angepasst ist, und die für die Expression der Nucleinsäure nach Anspruch 4 in der Hefezelle notwendigen regulatorischen Elemente so relativ zu der Nucleinsäure gelegen umfasst, dass deren Expression ermöglicht wird.

10. Vektor nach Anspruch 6 oder 7, der zur Expression in einer Säugerzelle angepasst ist und die für die Expression der einen 5-HT4B-Rezeptor codierenden Nucleinsäure in der Säugerzelle notwendigen regulatorischen Elemente so relativ zu der Nucleinsäure gelegen umfasst, dass deren Expression ermöglicht wird.

11. Vektor nach Anspruch 7 oder 10 mit der Bezeichnung pcEXV-5HT4B (ATCC-Hinterlegungsnr. 75332).

12. Säugerzelle, umfassend den Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 11.

13. Säugerzellen nach Anspruch 12, wobei die Säugerzelle eine LM(tk-) Zelle ist.

14. LM(tk-) Zelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 11 mit der Bezeichnung L-5-HT4B (ATCC-Hinterlegungsnr. CRL 11166).

15. Nucleinsäuresonde, umfassend ein Nucleinsäuremolekül aus mindestens 15 Nucleotiden, das mit einer Sequenz spezifisch hybridisieren kann, die in der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach Ansprüchen 1 bis 3 enthalten ist.

16. Nucleinsäuresonde, umfassend ein Nucleinsäuremolekül aus mindestens 15 Nucleotiden, das mit einer Sequenz spezifisch hybridisieren kann, die in der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 4 enthalten ist.

17. Nucleinsäuresonde nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Nucleinsäure eine DNA ist.

18. Gemisch von Nucleinsäuresonden nach Ansprüchen 15 bis 17, wobei die Sonden Sequenzen aufweisen, die sich voneinander an vorher festgelegten Positionen unterscheiden.

19. Antisense-Oligonucleotid mit einer Sequenz, die an ein einen Säuger-5-HT4B-Rezeptor codierendes mRNA-Molekül zur Verhinderung der Translation des mRNA-Moleküls spezifisch binden kann, wobei der 5-HT4B-Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der Aminosäuresequenz entspricht, die durch die Nucleinsäuresequenz der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.

20. Antisense-Oligonucleotid mit einer Sequenz, die an ein einen menschlichen 5-HT4B-Rezeptor codierendes mRNA- Molekül zur Verhinderung der Translation des mRNA- Moleküls spezifisch binden kann, wobei der 5-HT4B- Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der Aminosäuresequenz entspricht, die durch die Nucleinsäuresequenz der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.

21. Antisense-Oligonucleotid nach Anspruch 19 oder 20, umfassend chemische Nucleotidanaloga der Oligonucleotide.

22. Gemisch der Antisense-Oligonucleotide nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Oligonucleotide Sequenzen aufweisen, die sich voneinander an vorher festgelegten Positionen unterscheiden.

23. Verfahren zum Nachweis der Expression eines Säuger-5- HTaa-Rezeptors, umfassend Erhalten von RNA aus Zellen oder Gewebe, in Kontakt bringen der so erhaltenen RNA mit einer Nucleinsäuresonde nach Anspruch 15 oder 16 unter Hybridisierungsbedingungen, Nachweisen des Vorhandenseins einer mit der Sonden hybridisierten mRNA, wobei das Vorhandensein von mit der Sonde hybridisierter mBNA die Expression des Säuger-5-HT4B-Rezeptors anzeigt, und dadurch Nachweisen des Säuger-5-HT4B-Rezeptors.

24. Verfahren zum Nachweis der Expression eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors, umfassend Erhalten von RNA aus Zellen oder Gewebe, in Kontakt bringen der so erhaltenen RNA mit einer Nucleinsäuresonde nach Anspruch 16 oder 17 unter Hybridisierungsbedingungen, Nachweisen des Vorhandenseins einer mit der Sonde hybridisierten mRNA, wobei das Vorhandensein von mit der Sonde hybridisierter mRNA die Expression des menschlichen 5-HT4B-Rezeptors anzeigt, und dadurch Nachweisen des menschlichen 5-HT4B- Rezeptors.

25. Verfahren zum Nachweis der Expression eines Säuger-5- HT4B-Rezeptors in einer Zelle oder Gewebe durch in situ- Hybridisierung, umfassend in Kontakt bringen der Zelle oder des Gewebes mit einer Nucleinsäuresonde nach Anspruch 15 oder 17 unter Hybridisierungsbedingungen, Nachweisen des Vorhandenseins einer mit der Sonde hybridisierten mRNA, wobei das Vorhandensein von mit der Sonde hybridisierter mRNA die Expression eines Säuger-5- HT4B-Rezeptors anzeigt, und dadurch Nachweisen der Expression eines Säuger-5-HT4B-Rezeptors.

26. Verfahren zum Nachweis der Expression eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors in einer Zelle oder Gewebe durch in situ-Hybridisierung, umfassend in Kontakt bringen der Zelle oder des Gewebes mit einer Nucleinsäuresonde nach Anspruch 16 oder 17 unter Hybridisierungsbedingungen, Nachweisen des Vorhandenseins einer mit der Sonde hybridisierten mRNA, wobei das Vorhandensein von mit der Sonde hybridisierter mRNA die Expression eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors anzeigt, und dadurch Nachweisen der Expression eines menschlichen 5-HT4B- Rezeptors.

27. Verwendung einer Sonde nach Anspruch 17 zum Isolieren eines Gens, das einen Rezeptor außer dem in Anspruch 1 definierten 5-HT4B-Rezeptor codiert, aus einer Genbibliothek, umfassend: in Kontakt bringen der Bibliothek mit der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen und Isolieren jedes Gens, mit dem die Sonde hybridisiert.

28. Verwendung nach Anspruch 27, umfassend außerdem gleichzeitiges in Kontakt bringen der die Bibliothek umfassenden DNA unter Hybridisierungsbedingungen mit einer zweiten Nucleinsäuresonde, die eine Sequenz umfasst, die an ein DNA-Molekül des komplementären Stranges der DNA des Gens hybridisieren kann, an das die erste Sonde hybridisiert, Behandeln jeder Gensequenz an die beide Sonden hybridisieren zur Herstellung von Mehrfachkopien der Gensequenz, Isolieren der amplifizierten Gensequenz und Verwenden der isolierten Gensequenz als Sonde, um aus einer Genbibliothek das Gen zu isolieren, das mit der amplifizierten DNA-Sequenz hybridisiert.

29. Synthetisches Gen, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und mindestens ein daran geknüpftes regulatorisches Element zur Verringerung der Anzahl von RNA-Molekülen, die von dem synthetischen Gen transkribiert werden.

30. 5-HT4B-Rezeptorprotein, das von einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.

31. Verfahren zur Herstellung des 5-HT4B-Rezeptors nach Anspruch 30, das die Induktion von Zellen zur Expression des 5-HT4B-Rezeptors und Gewinnung des 5-HT4B-Rezeptors aus den erhaltenen Zellen umfasst.

32. Verfahren zur Herstellung des 5-HT4B-Rezeptors nach Anspruch 30, umfassend Einführen eines den 5-HT4B- Rezeptor codierenden Nucleinsäuremoleküls in einen geeigneten Vektor, Einschleusen des erhaltenen Vektors eine geeignete Wirtszelle, Platzieren der resultierenden Zelle unter geeigneten Bedingungen des 5-HT4B-Rezeptors, und Gewinnen des von der erhaltenen Zelle erzeugten Säuger-5-HT4B-Rezeptors.

33. Verfahren zur Herstellung des 5-HT4B-Rezeptors nach Anspruch 30, das die Induktion von Zellen zur Expression des 5-HT4B-Rezeptors und Gewinnung des menschlichen 5- HT4B-Rezeptors aus den erhaltenen Zellen umfasst.

34. Antikörper, der einen durch das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 codierten menschlichen 5-HT4B-Rezeptor bindet.

35. Antikörper nach Anspruch 34, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

36. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 35, wobei der 5- HT4B-Rezeptor von einem Säuger stammt.

37. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 35, wobei der Säuger ein Mensch ist.

38. Arzneimittel, umfassend eine Menge einer Substanz, die die aus Überexpression eines menschlichen 5-HT4B- Rezeptors resultierenden Anomalien wirksam lindern kann, wobei der menschliche 5-HT4B-Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der Aminosäuresequenz entspricht, die durch die Nucleinsäure nach Ansprüchen 1 bis 3 codiert ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

39. Arzneimittel, umfassend eine Menge einer Substanz, die die aus Unterexpression eines menschlichen 5-HT4B- Rezeptors resultierenden Anomalien wirksam lindern kann, wobei der 5-HT4B-Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der Aminosäuresequenz entspricht, die durch die Nucleinsäure nach Ansprüchen 1 bis 4 codiert ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

40. Arzneimittel, umfassend eine Menge eines Oligonucleotids nach Anspruch 21 oder 22 zur wirksamen Reduktion der Expression eines menschlichen 5-HT4B--Rezeptors nach Anspruch 30, wobei der 5-HT4B-Rezeptor ein menschlicher 5-HT4B-Rezeptor ist, indem es eine Zellmembran passiert und an eine einen menschlichen 5-HT4B-Rezeptor codierende mRNA in der Zelle spezifisch bindet, zur Verhinderung deren Translation, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, der eine Zellmembran passieren kann.

41. Arzneimittel nach Anspruch 40, wobei das Nucleotid an eine Substanz gekoppelt ist, die mRNA inaktiviert.

42. Arzneimittel nach Anspruch 41, wobei die Substanz, die mRNA inaktiviert, ein Ribozym ist.

43. Arzneimittel nach Ansprüchen 40 bis 42, wobei der pharmazeutisch verträglichen Träger, der eine Zellmembran passieren kann, eine Struktur umfasst, die einen für einen ausgewählten Zelltyp spezifischen Transporter bindet und dadurch von den Zellen des ausgewählten Zelltyps aufgenommen wird.

44. Arzneimittel, umfassend eine Menge eines Antikörpers nach Anspruch 34 oder 35, die die Bindung natürlich vorkommender Substrate an einen menschlichen 5-HT4B- Rezeptor wirksam blockieren kann, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

45. Verfahren zur Bestimmung der physiologischen Wirkungen der Veränderung der Expressionsniveaus eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors, umfassend Erzeugen eines transgenen, nicht menschlichen-Säugers, dessen Expressionsniveaus eines menschlichen 5-HT4B--Rezeptors nach Anspruch 30 durch Verwendung eines induzierbaren Promotors geändert werden können.

46. Verfahren zur Bestimmung der physiologischen Wirkungen der Veränderung der Expressionsniveaus eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors, umfassend Erzeugen einer Reihe von transgenen, nicht-menschlichen Säugern, von denen jeder eine unterschiedliche Menge eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors nach Anspruch 30 exprimiert.

47. Verfahren zum Nachweis einer chemischen Verbindung, die einen 5-HT4B-Rezeptor spezifisch bindet, wobei der 5-HT4B- Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der durch die Nucleinsäure nach Ansprüchen 1 bis 4 codierten Aminosäuresequenz entspricht, umfassend in Kontakt bringen von nicht euronalen Zellen, die auf ihrer Zelloberfläche den 5-HT4B-Rezeptor exprimieren, oder einer Membranfraktion aus einem Zellextrakt davon, mit der chemischen Verbindung unter Bedingungen, die sich zur Bindung eignen, und Nachweisen der spezifischen Bindung der chemischen Verbindung an den 5-HT4B-Rezeptor.

48. Verfahren, umfassend die kompetitive Bindung zum Identifizieren einer chemischen Verbindung, die spezifisch einen 5-HT4B-Rezeptor bindet, wobei der 5- HT4B-Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der durch die Nucleinsäure nach Ansprüchen 1 bis 4 codierten Aminosäuresequenz entspricht, umfassend das getrennte in Kontakt bringen nicht-neuronaler Zellen, die auf ihrer Oberfläche den 5-HT4B-Rezeptor exprimieren, oder einer Membranfraktion aus Zellextrakten davon, mit sowohl der chemischen als auch einer zweiten chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den 5-HT4B-Rezeptor binden kann, und mit nur der zweiten chemischen Verbindung unter Bedingungen, die sich zur Bindung beider Verbindungen eignen, und Nachweisen der spezifischen Bindung der chemischen Verbindung an den 5-HT4B- Rezeptor, wobei die Verringerung der Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den 5-HT4B-Rezeptor in der Gegenwart der chemischen Verbindung anzeigt, dass die chemische Verbindung an den 5-HT4B-Rezeptor bindet.

49. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung, die einen 5-HT4B-Rezeptor spezifisch bindet und ihn aktiviert, wobei der 5-HT4B-Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der durch die Nucleinsäure nach Ansprüchen 1 bis 4 codierten Aminosäuresequenz entspricht, umfassend in Kontakt bringen nicht-neuronaler Zellen, die eine "second messenger"-Antwort erzeugen und Exprimieren des 5-HT4B- Rezeptors auf deren Zelloberfläche, oder einer Membranfraktion aus einem Zellextrakt davon, mit einer chemischen Verbindung unter Bedingungen, die sich zur Aktivierung des 5-HT4B-Rezeptors eignen, und Messen der "second messenger"-Antwort in der Gegenwart und Abwesenheit der chemischen Verbindung, wobei eine Änderung der "second messenger"-Antwort in der Gegenwart der chemischen Verbindung anzeigt, dass die chemische Verbindung den 5-HT4B-Rezeptor aktiviert.

50. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung einen 5-HT4B-Rezeptor spezifisch bindet und seine Aktivierung inhibiert, wobei der 5-HT4B-Rezeptor eine Aminosäuresequenz aufweist, die der durch die Nucleinsäure nach Ansprüchen 1 bis 4 codierten Aminosäuresequenz entspricht, umfassend das getrennte in Kontakt bringen nicht-neuronaler Zellen, die eine "second messenger"-Antwort erzeugen und Exprimieren des 5-HT4B-Rezeptors auf deren Zelloberfläche, oder einer Membranfraktion aus einem Zellextrakt davon, mit sowohl der chemischen Verbindung als auch einer zweiten chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den 5-HT4B-Rezeptor aktiviert, und mit nur der zweiten chemischen Verbindung unter Bedingungen, die die Aktivierung eines 5-HT4B-Rezeptors gestatten, und Messen der "second messenger"-Antwort in der Gegenwart von nur der zweiten chemischen Verbindung und in der Gegenwart sowohl der zweiten chemischen Verbindung als auch der chemischen Verbindung, wobei eine kleinere Änderung der "second messenger"-Antwort in der Gegenwart von der chemischen Verbindung und der zweiten chemischen Verbindung als von nur der zweiten chemischen Verbindung anzeigt, dass die chemische Verbindung die Aktivierung des 5-HT4B-Rezeptors inhibiert.

51. Verfahren nach Anspruch 49, wobei die "second messenger"-Antwort Adenylatcylase-Aktivität umfasst und die Änderung der "second messenger"-Antwort eine Erhöhung der Adenylatcylase-Aktivität darstellt.

52. Verfahren nach Anspruch 50, wobei die "second messenger"-Antwort Adenylatcylase-Aktivität umfasst und die Änderung der "second messenger"-Antwort das Adenylatcylase-Aktivitätsniveau darstellt, das in der Gegenwart der chemischen Verbindung und der zweiten chemischen Verbindung weniger erhöht ist als in der Gegenwart von nur der zweiten chemischen Verbindung.

53. Verfahren nach Anspruch 49, wobei die "second; messenger"-Antwort intrazelluläre Calciummengen umfasst und die Änderung der "second messenger"-Antwort eine Erhöhung der intrazellulären Calciummengen darstellt.

54. Verfahren nach Anspruch 50, wobei die "second messenger"-Antwort intrazelluläre Calciummengen umfasst und die Änderung der "second messenger"-Antwort eine, kleinere Erhöhung der intrazellulären Calciummengen in der Gegenwart von der chemischen Verbindung und der zweiten chemischen Verbindung als in der Gegenwart von nur der zweiten chemischen Verbindung darstellt.

55. Verfahren nach Anspruch 49, wobei die "second messenger"-Antwort Inositphosphatmetabolit-Mengen sind und die Änderung der "second messenger"-Antwort eine Erhöhung der Inositphosphatmetabolit-Mengen darstellt.

56. Verfahren nach Anspruch 50, wobei die "second messenger"-Antwort Inositphosphatmetabolit-Mengen sind und die Änderung der "second messenger"-Antwort eine kleinere Erhöhung der Inositphosphatmetabolit-Mengen in der Gegenwart von der chemischen Verbindung und der zweiten chemischen Verbindung als in der Gegenwart von nur der zweiten chemischen Verbindung darstellt.

57. Verfahren nach einem der Ansprüche 47 bis 56, wobei der 5-HT4B-Rezeptor ein Säugerrezeptor oder ein menschlicher Rezeptor ist.

58. Verfahren nach einem der Ansprüche 47 bis 56, wobei die nicht-neuronale Zelle eine Säuger- oder Insektenzelle ist.

59. Verfahren nach Anspruch 58, wobei die Säugerzelle eine COS-7 Zelle oder eine LM (tk-) Zelle ist.

60. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors auf der Oberfläche einer Zelle, umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit einem Antikörper nach Anspruch 35 unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an den Rezeptor gestatten, und Nachweisen des Vorhandenseins jedes an die Zelle gebundenen Antikörpers und dadurch Nachweisen des Vorhandenseins eines menschlichen 5-HT4B-Rezeptors auf der Zelloberfläche.

61. Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition für eine Krankheit, die mit der Expression eines menschlichen 5- HT4B-Rezeptorallels assoziiert ist, umfassend

a) Erhalten von DNA von Patienten, die an einer Krankheit leiden,

b) Durchführen einer Restriktionsspaltung der DNA mit einer Reihe von Restriktionsenzymen,

c) Elektrophoretisches Trennen der erhaltenen DNA- Fragmente auf einem nach Größe trennenden Gel,

d) in Kontakt bringen des Gels mit einer Nucleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 15 bis 18 und mit einem nachweisbaren Marker markiert ist,

e) Nachweis der markierten Banden, die mit der einen 5-HT4B-Rezeptor codierenden DNA hybridisiert haben und mit dem nachweisbaren Marker markiert sind, zur Erzeugung eines einzigartigen Musters an Banden, das für die DNA eines Patienten, der an der Krankheit leidet, spezifisch ist,

f) Herstellen von DNA durch die Schritte a) - e) und

g) Vergleich des einzigartigen Musters an Banden, das für die DNA von Patienten spezifisch ist, die an der Krankheit leiden, aus Schritt e) mit der DNA, die zur Diagnose aus Schritt f) erhalten wurde, zum Nachweis, ob die Muster gleich oder unterschiedlich sind, und dadurch zur Diagnose einer Prädisposition für die Krankheit, falls die Muster gleich sind.

62. Verfahren nach Anspruch 61, wobei eine mit der; Expression eines spezifisch 5-HT4B-Rezeptorallels assoziierte Erkrankung diagnostiziert wird.

63. Vektor nach Anspruch 6 oder 7, der zur Expression in einer Insektenzelle angepasst ist und die zur Expression der Nucleinsäure nach Anspruch 4 in der Insektenzelle notwendigen regulatorischen Elemente so relativ zu der Nucleinsäure gelegen umfasst, dass deren Expression ermöglicht wird.

64. Membranpräparat isoliert aus Zellen, die gewöhnlich keinen menschlichen 5-HT4B-Rezeptor exprimieren, aber mit einer Nucleinsäure nach Ansprüchen 1 bis 3 transfiziert sind und diese exprimieren, so dass ein menschlicher 5-HT4B-Rezeptor auf den Zelloberflächen exprimiert wird.

65. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel, umfassend Erhalten einer chemischen Verbindung, Identifizieren einer chemischen Verbindung als eine, die spezifisch einen 5-HT4B-Rezeptor bindet, gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 47, 48, 49 oder 50, und Mischen der Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

66. Verfähren zum Erhalt einer chemischen Verbindung, umfassend Identifizieren einer chemischen Verbindung, die einen 5-HT4B-Rezeptor bindet, gemäß dem Verfahren nach einem Ansprüche 47, 48, 49 oder 50, und Herstellen der chemischen Verbindung.