FI111337B - Ihmisen serotoniinireseptoria (5-HT4B) koodaava DNA ja sen käyttö - Google Patents
Ihmisen serotoniinireseptoria (5-HT4B) koodaava DNA ja sen käyttö Download PDFInfo
- Publication number
- FI111337B FI111337B FI952094A FI952094A FI111337B FI 111337 B FI111337 B FI 111337B FI 952094 A FI952094 A FI 952094A FI 952094 A FI952094 A FI 952094A FI 111337 B FI111337 B FI 111337B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- receptor
- ht4b
- chemical compound
- nucleic acid
- human
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 180
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 title description 36
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 title description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 85
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 391
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 383
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 191
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 122
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 112
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 73
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 65
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 62
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 47
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 47
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 40
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 28
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 22
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 21
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 21
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 claims description 20
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 claims description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 13
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 6
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000944 neurotransmitter response Effects 0.000 claims 13
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical class OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 claims 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 39
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 35
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 29
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 25
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 25
- WKZLNEWVIAGNAW-UHFFFAOYSA-N 5-Carboxyamidotryptamine Chemical compound C1=C(C(N)=O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 WKZLNEWVIAGNAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 22
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 22
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 17
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 16
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 15
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 15
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 14
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 13
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 102100027499 5-hydroxytryptamine receptor 1B Human genes 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091005482 5-HT4 receptors Proteins 0.000 description 9
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 9
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 8
- 230000000862 serotonergic effect Effects 0.000 description 8
- JTEJPPKMYBDEMY-UHFFFAOYSA-N 5-methoxytryptamine Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCN)C2=C1 JTEJPPKMYBDEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- RLJFTICUTYVZDG-UHFFFAOYSA-N Methiothepine Chemical compound C12=CC(SC)=CC=C2SC2=CC=CC=C2CC1N1CCN(C)CC1 RLJFTICUTYVZDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 102100022738 5-hydroxytryptamine receptor 1A Human genes 0.000 description 6
- 101710138639 5-hydroxytryptamine receptor 1B Proteins 0.000 description 6
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N tryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN)=CNC2=C1 APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 5-HT1Da Proteins 0.000 description 5
- 101710138638 5-hydroxytryptamine receptor 1A Proteins 0.000 description 5
- 206010008479 Chest Pain Diseases 0.000 description 5
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 5
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 102000056834 5-HT2 Serotonin Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108091005479 5-HT2 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102100036312 5-hydroxytryptamine receptor 1E Human genes 0.000 description 4
- 101710138085 5-hydroxytryptamine receptor 1E Proteins 0.000 description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 4
- 101000724725 Homo sapiens 5-hydroxytryptamine receptor 1B Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 4
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 4
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 4
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 4
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 4
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- FPCCSQOGAWCVBH-UHFFFAOYSA-N ketanserin Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1CCN(CCN2C(C3=CC=CC=C3NC2=O)=O)CC1 FPCCSQOGAWCVBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005417 ketanserin Drugs 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- WZHJKEUHNJHDLS-QTGUNEKASA-N metergoline Chemical compound C([C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4N(C)C=C(C=34)C2)C1)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 WZHJKEUHNJHDLS-QTGUNEKASA-N 0.000 description 4
- 229960004650 metergoline Drugs 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- WYWIFABBXFUGLM-UHFFFAOYSA-N oxymetazoline Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C)=C1CC1=NCCN1 WYWIFABBXFUGLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- KPJZHOPZRAFDTN-ZRGWGRIASA-N (6aR,9R)-N-[(2S)-1-hydroxybutan-2-yl]-4,7-dimethyl-6,6a,8,9-tetrahydroindolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)CC)C2)=C3C2=CN(C)C3=C1 KPJZHOPZRAFDTN-ZRGWGRIASA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035038 5-HT1 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108091005478 5-HT1 receptors Proteins 0.000 description 3
- 108091005477 5-HT3 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000035037 5-HT3 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108091005436 5-HT7 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102100036311 5-hydroxytryptamine receptor 1F Human genes 0.000 description 3
- 101710138086 5-hydroxytryptamine receptor 1F Proteins 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 3
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 3
- GAAKALASJNGQKD-UHFFFAOYSA-N LY-165163 Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1CCN1CCN(C=2C=C(C=CC=2)C(F)(F)F)CC1 GAAKALASJNGQKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 3
- 230000037424 autonomic function Effects 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229960004170 clozapine Drugs 0.000 description 3
- QZUDBNBUXVUHMW-UHFFFAOYSA-N clozapine Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=NC2=CC(Cl)=CC=C2NC2=CC=CC=C12 QZUDBNBUXVUHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 3
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012051 hydrophobic carrier Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229960001186 methysergide Drugs 0.000 description 3
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 3
- 229960002508 pindolol Drugs 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- JZQKKSLKJUAGIC-NSHDSACASA-N (S)-(-)-pindolol Chemical compound CC(C)NC[C@H](O)COC1=CC=CC2=C1C=CN2 JZQKKSLKJUAGIC-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- VNICFCQJUVFULD-UHFFFAOYSA-N 1-(1-naphthalenyl)piperazine Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=CC2=CC=CC=C12 VNICFCQJUVFULD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VKRAXSZEDRWLAG-SJKOYZFVSA-N 2-bromo-lsd Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N(CC)CC)C2)=C3C2=C(Br)NC3=C1 VKRAXSZEDRWLAG-SJKOYZFVSA-N 0.000 description 2
- DPXOFRGRKPFZOD-UHFFFAOYSA-N 3-[2-(dipropylamino)ethyl]-1H-indole-5-carboxamide Chemical compound C1=C(C(N)=O)C=C2C(CCN(CCC)CCC)=CNC2=C1 DPXOFRGRKPFZOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEROPKNOYKURCJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-N-(1-azabicyclo[2.2.2]octan-3-yl)-5-chloro-2-methoxybenzamide Chemical compound COC1=CC(N)=C(Cl)C=C1C(=O)NC1C(CC2)CCN2C1 FEROPKNOYKURCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZSTKHSQDNIGFLM-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-N,N-dimethyltryptamine Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 ZSTKHSQDNIGFLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASXGJMSKWNBENU-UHFFFAOYSA-N 8-OH-DPAT Chemical compound C1=CC(O)=C2CC(N(CCC)CCC)CCC2=C1 ASXGJMSKWNBENU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- KBQOUDLMWYWXNP-YDHLFZDLSA-N Asn-Val-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N KBQOUDLMWYWXNP-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- XPGVTUBABLRGHY-BIIVOSGPSA-N Asp-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N XPGVTUBABLRGHY-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- ILJQISGMGXRZQQ-IHRRRGAJSA-N Asp-Arg-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ILJQISGMGXRZQQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N Asp-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFYGNOJUTMXQIG-FXQIFTODSA-N Cys-Met-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)N AFYGNOJUTMXQIG-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- IMRNSEPSPFQNHF-STQMWFEESA-N Gly-Ser-Trp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C12)C(=O)O IMRNSEPSPFQNHF-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N H-Lys-Trp-OH Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CCCCN)C(O)=O)=CNC2=C1 RVKIPWVMZANZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SVBJIZVVYJYGLA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HGLKOTPFWOMPOB-MEYUZBJRSA-N Leu-Thr-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HGLKOTPFWOMPOB-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 2
- VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N Lysergic acid diethylamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N(CC)CC)C2)=C3C2=CNC3=C1 VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 2
- JLVHTNZNKOSCNB-YSVLISHTSA-N Mesulergine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@@H](CN(C)[C@@H]2C2)NS(=O)(=O)N(C)C)=C3C2=CN(C)C3=C1 JLVHTNZNKOSCNB-YSVLISHTSA-N 0.000 description 2
- JKXVPNCSAMWUEJ-GUBZILKMSA-N Met-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O JKXVPNCSAMWUEJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- PBWNICYZGJQKJV-BZSNNMDCSA-N Phe-Phe-Cys Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PBWNICYZGJQKJV-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRKAXLDECUGLFE-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O DRKAXLDECUGLFE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- CNUIHOAISPKQPY-HSHDSVGOSA-N Pro-Thr-Trp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O CNUIHOAISPKQPY-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Cys Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- GZYNMZQXFRWDFH-YTWAJWBKSA-N Thr-Arg-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O GZYNMZQXFRWDFH-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N Thr-Leu-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O NCXVJIQMWSGRHY-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N Yohimbine Natural products C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@@H](O)[C@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 2
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 2
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 2
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 2
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 2
- BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N beta-Yohimbin Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(O)C(C4CC33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000001593 cAMP accumulation Effects 0.000 description 2
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 2
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 2
- LUZRJRNZXALNLM-JGRZULCMSA-N dihydroergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C2)C1)C)C1=CC=CC=C1 LUZRJRNZXALNLM-JGRZULCMSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N ginsenoside K Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 229950002454 lysergide Drugs 0.000 description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229950008693 mesulergine Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 229960001528 oxymetazoline Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- JZQKKSLKJUAGIC-UHFFFAOYSA-N pindolol Chemical compound CC(C)NCC(O)COC1=CC=CC2=C1C=CN2 JZQKKSLKJUAGIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000003653 radioligand binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108010010573 serotonin 1C receptor Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- DKGZKTPJOSAWFA-UHFFFAOYSA-N spiperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCC2(C(NCN2C=2C=CC=CC=2)=O)CC1 DKGZKTPJOSAWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950001675 spiperone Drugs 0.000 description 2
- KQKPFRSPSRPDEB-UHFFFAOYSA-N sumatriptan Chemical compound CNS(=O)(=O)CC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 KQKPFRSPSRPDEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003708 sumatriptan Drugs 0.000 description 2
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- ZNRGQMMCGHDTEI-ITGUQSILSA-N tropisetron Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O[C@H]3C[C@H]4CC[C@@H](C3)N4C)=CNC2=C1 ZNRGQMMCGHDTEI-ITGUQSILSA-N 0.000 description 2
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N yohimbine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@H](O)[C@@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N 0.000 description 2
- 229960000317 yohimbine Drugs 0.000 description 2
- AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N yohimbine carboxylic acid Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(C(C4CC33)C(O)=O)O)=C3NC2=C1 AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229950004681 zacopride Drugs 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- KKIMDKMETPPURN-UHFFFAOYSA-N 1-(3-(trifluoromethyl)phenyl)piperazine Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(N2CCNCC2)=C1 KKIMDKMETPPURN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYWNEDARFVJQSG-UHFFFAOYSA-N 2-methylserotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=C(C)NC2=C1 WYWNEDARFVJQSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKZLNEWVIAGNAW-DOMYTETQSA-N 3-(2-amino-1,1,2,2-tetratritioethyl)-1h-indole-5-carboxamide Chemical compound C1=C(C(N)=O)C=C2C(C([3H])([3H])C([3H])(N)[3H])=CNC2=C1 WKZLNEWVIAGNAW-DOMYTETQSA-N 0.000 description 1
- QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 3-[(1r)-1-[(2r,6s)-2,6-dimethylmorpholin-4-yl]ethyl]-n-[6-methyl-3-(1h-pyrazol-4-yl)imidazo[1,2-a]pyrazin-8-yl]-1,2-thiazol-5-amine Chemical compound N1([C@H](C)C2=NSC(NC=3C4=NC=C(N4C=C(C)N=3)C3=CNN=C3)=C2)C[C@H](C)O[C@H](C)C1 QBWKPGNFQQJGFY-QLFBSQMISA-N 0.000 description 1
- WKPDXBXNJWWWGQ-UHFFFAOYSA-N 5-benzyloxytryptamine Chemical compound C1=C2C(CCN)=CNC2=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 WKPDXBXNJWWWGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710138068 5-hydroxytryptamine receptor 1D Proteins 0.000 description 1
- 102100027493 5-hydroxytryptamine receptor 1D Human genes 0.000 description 1
- 229940097276 5-methoxytryptamine Drugs 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000009346 Adenosine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050000203 Adenosine receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000035121 Adrenergic receptor subfamily Human genes 0.000 description 1
- 108020000586 Adrenergic receptor subfamily Proteins 0.000 description 1
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- NHLAEBFGWPXFGI-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N NHLAEBFGWPXFGI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VHEVVUZDDUCAKU-FXQIFTODSA-N Ala-Met-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VHEVVUZDDUCAKU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JPAWCMXVNZPJLO-IHRRRGAJSA-N Arg-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JPAWCMXVNZPJLO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N Arg-Val-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Asp Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N RZVVKNIACROXRM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N Asp-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O OMMIEVATLAGRCK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MYOHQBFRJQFIDZ-KKUMJFAQSA-N Asp-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MYOHQBFRJQFIDZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N Asp-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DINOVZWPTMGSRF-QXEWZRGKSA-N Asp-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DINOVZWPTMGSRF-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N Asp-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSHWXQIZOCVWIA-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001072256 Boraginaceae Species 0.000 description 1
- 235000007689 Borago officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100505161 Caenorhabditis elegans mel-32 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000017063 Catecholamine Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010013659 Catecholamine Receptors Proteins 0.000 description 1
- OXOQBEVULIBOSH-ZDLURKLDSA-N Cys-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OXOQBEVULIBOSH-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UWVGGRQHSA-N Cys-Phe Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- NRVQLLDIJJEIIZ-VZFHVOOUSA-N Cys-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N)O NRVQLLDIJJEIIZ-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- MSWBLPLBSLQVME-XIRDDKMYSA-N Cys-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS)=CNC2=C1 MSWBLPLBSLQVME-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 102000015554 Dopamine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050004812 Dopamine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 208000017228 Gastrointestinal motility disease Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Cys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N DJTXYXZNNDDEOU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N Gly-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- IEGFSKKANYKBDU-QWHCGFSZSA-N Gly-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)CN)C(=O)O IEGFSKKANYKBDU-QWHCGFSZSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- RCHFYMASWAZQQZ-ZANVPECISA-N Gly-Trp-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CN)=CNC2=C1 RCHFYMASWAZQQZ-ZANVPECISA-N 0.000 description 1
- UQABYHGXWYXDTK-UUOKFMHZSA-N GppNP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)NP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UQABYHGXWYXDTK-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 102000000543 Histamine Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002059 Histamine Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000822895 Homo sapiens 5-hydroxytryptamine receptor 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000801195 Homo sapiens TLE family member 5 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FZIJIFCXUCZHOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N Lys-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ULUQBUKAPDUKOC-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- MYZMQWHPDAYKIE-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MYZMQWHPDAYKIE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N Lys-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HVAUKHLDSDDROB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- AEIIJFBQVGYVEV-YESZJQIVSA-N Lys-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O AEIIJFBQVGYVEV-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN HKXSZKJMDBHOTG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N Lys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N Met-Asp-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- TWTNGJMBFRTKEX-FXQIFTODSA-N Met-Cys-Cys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TWTNGJMBFRTKEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QQPMHUCGDRJFQK-RHYQMDGZSA-N Met-Thr-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QQPMHUCGDRJFQK-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 208000019022 Mood disease Diseases 0.000 description 1
- 241001455073 Murine herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N OOOO Chemical compound OOOO RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- DPWPWRLQFGFJFI-UHFFFAOYSA-N Pargyline Chemical compound C#CCN(C)CC1=CC=CC=C1 DPWPWRLQFGFJFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEXSSIBQYNKFBX-KBPBESRZSA-N Phe-Gly-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 XEXSSIBQYNKFBX-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N Phe-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- MSSXKZBDKZAHCX-UNQGMJICSA-N Phe-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MSSXKZBDKZAHCX-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N Pro-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GLEOIKLQBZNKJZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CJZTUKSFZUSNCC-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 CJZTUKSFZUSNCC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N Pro-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KPDRZQUWJKTMBP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N Pro-Glu-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N Pro-Glu-Phe Chemical compound N([C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- STASJMBVVHNWCG-IHRRRGAJSA-N Pro-His-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 STASJMBVVHNWCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- SRBFGSGDNNQABI-FHWLQOOXSA-N Pro-Leu-Trp Chemical compound N([C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 SRBFGSGDNNQABI-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- BUEIYHBJHCDAMI-UFYCRDLUSA-N Pro-Phe-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BUEIYHBJHCDAMI-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 206010037211 Psychomotor hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- XSYJDGIDKRNWFX-SRVKXCTJSA-N Ser-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O XSYJDGIDKRNWFX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N Ser-Gly-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O AEGUWTFAQQWVLC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CO ADJDNJCSPNFFPI-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N Ser-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O MQCPGOZXFSYJPS-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N Thr-Ala-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWYAUVCQDTZIJI-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ODXKUIGEPAGKKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- WNQJTLATMXYSEL-OEAJRASXSA-N Thr-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WNQJTLATMXYSEL-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- GRIUMVXCJDKVPI-IZPVPAKOSA-N Thr-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O GRIUMVXCJDKVPI-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N Trp-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- CCZXBOFIBYQLEV-IHPCNDPISA-N Trp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O CCZXBOFIBYQLEV-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- XGEUYEOEZYFHRL-KKXDTOCCSA-N Tyr-Ala-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 XGEUYEOEZYFHRL-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 1
- JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N Tyr-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 JXNRXNCCROJZFB-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- KLGFILUOTCBNLJ-IHRRRGAJSA-N Tyr-Cys-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O KLGFILUOTCBNLJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- LUMQYLVYUIRHHU-YJRXYDGGSA-N Tyr-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LUMQYLVYUIRHHU-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- NZBSVMQZQMEUHI-WZLNRYEVSA-N Tyr-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N NZBSVMQZQMEUHI-WZLNRYEVSA-N 0.000 description 1
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- AUMNPAUHKUNHHN-BYULHYEWSA-N Val-Asn-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N AUMNPAUHKUNHHN-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- JLFKWDAZBRYCGX-ZKWXMUAHSA-N Val-Asn-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JLFKWDAZBRYCGX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- BRPKEERLGYNCNC-NHCYSSNCSA-N Val-Glu-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N BRPKEERLGYNCNC-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N Val-Glu-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N WDIGUPHXPBMODF-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 1
- CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CELJCNRXKZPTCX-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N Val-Gly-Arg Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N JTWIMNMUYLQNPI-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- ZRSZTKTVPNSUNA-IHRRRGAJSA-N Val-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O ZRSZTKTVPNSUNA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- YMTOEGGOCHVGEH-IHRRRGAJSA-N Val-Lys-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YMTOEGGOCHVGEH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IOETTZIEIBVWBZ-GUBZILKMSA-N Val-Met-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N IOETTZIEIBVWBZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CEKSLIVSNNGOKH-KZVJFYERSA-N Val-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O CEKSLIVSNNGOKH-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N Val-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N LLJLBRRXKZTTRD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 108010086434 alanyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000000949 anxiolytic effect Effects 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010059459 arginyl-threonyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000003693 atypical antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127236 atypical antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 229940054066 benzamide antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 150000003936 benzamides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- DCSUBABJRXZOMT-IRLDBZIGSA-N cisapride Chemical compound C([C@@H]([C@@H](CC1)NC(=O)C=2C(=CC(N)=C(Cl)C=2)OC)OC)N1CCCOC1=CC=C(F)C=C1 DCSUBABJRXZOMT-IRLDBZIGSA-N 0.000 description 1
- 229960005132 cisapride Drugs 0.000 description 1
- DCSUBABJRXZOMT-UHFFFAOYSA-N cisapride Natural products C1CC(NC(=O)C=2C(=CC(N)=C(Cl)C=2)OC)C(OC)CN1CCCOC1=CC=C(F)C=C1 DCSUBABJRXZOMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229940125846 compound 25 Drugs 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010004073 cysteinylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000001731 descending colon Anatomy 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229960004704 dihydroergotamine Drugs 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L disulfate(2-) Chemical compound [O-]S(=O)(=O)OS([O-])(=O)=O VFNGKCDDZUSWLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000010491 emotional process Effects 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000002599 gastric fundus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-histidyl-L-phenylalanine Natural products C=1C=CC=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)CN)CC1=CN=CN1 HPAIKDPJURGQLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010075431 glycyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010048994 glycyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 1
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 1
- 102000056245 human TLE5 Human genes 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000002197 limbic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003715 limbic system Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006284 nylon film Polymers 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229960001779 pargyline Drugs 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 108010009779 peptide 32 Proteins 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010089198 phenylalanyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000003518 presynaptic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 1
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003346 radioligand binding method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004648 relaxation of smooth muscle Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 108010053303 serotonin 1F receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000002868 serotonin 5-HT1 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000050 smooth muscle relaxant Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001300 stimulation of adenylate cyclase Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000000542 thalamic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical class [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013334 tissue model Methods 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 1
- 238000012301 transgenic model Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
Description
111337
Ihmisen serotoniinireseptoria (5-HT4B) koodaava DNA ja sen käyttö t
Keksinnön tausta . 5 Koko tässä patenttihakemuksessa viitataan eri jul kaisuihin suluissa olevilla osittaisilla viitetiedoilla. Näiden julkaisujen täydelliset viitetiedot voi löytää selitysosan lopusta juuri patenttivaatimusten edeltä. Näissä julkaisuissa esitetty sisällytetään täten kokona!suudes-10 saan viitteeksi tähän patenttihakemukseen, jotta kuvattaisiin täydellisemmin tekniikan taso, johon tämä keksintö kuuluu.
Tämän patenttihakemuksen kohteena oleva keksintö, ihmisen serotoniinireseptoria (5-HT4B) koodittava DNA ja 15 sen käyttöjä, viittaa "5-HT4B-reseptoriin", jonka IUPHAR:in serotoniinireseptorien nimistökomitea ( "Serotonin Receptor Nomenclature Committee") on uudelleennimennyt "5-HT7-reseptoriksi". Niinpä kaikki tässä olevat patenttivaatimukset, jotka liittyvät suoraan tai epäsuorasti 5-HT4B-reseptoriin 20 ja 5-HT4B-reseptoria koodittaviin nukleiinihappomolekyylei- hin, koskevat myös 5-HT7-reseptoria ja 5-ht7-reseptori a koodittavia nukleiinihappomolekyylejä.
Primaariaminohapposekvenssit ja tietoja signaalin-välityksestä on nyt julkaistuna neljästä kloonatusta 25 5-HT1:n kaltaisesta reseptorista, kolmesta kloonatusta 5-HT2-reseptorista ja yhdestä 5-HT3-reseptorista. Näiden reseptorien sekvenssihomologian ja myös signaalinvälitys-reittien analyysi johtaa niiden ryhmittelyyn näiden ominaisuuksien perusteella: 5-HT1-alaperheeseen kuuluu: 5-HTlÄ 30 (Fargin 1988, Kobilka 1989), 5-HTlB/5-HT1DB (Weinshank ym.
: 1991 ja loput), 5-HT1Da (Branchek ym. 1991, Hamblin ja Met calf 1991 Weinshank ym. 1992), 5-HT1E (Levy ym. 1992, McAllister ym. 1992, Zgombick ym. 1992) ja 5-HT1F (Adham ym. 1993). Näillä alatyypeillä on keskenään yhteistä yli 35 50 %:n aminohappoidenttisyys membraanin läpäisevissä BNSDOCID:<FI 111337β1 I > 2 111337 alueissa, ja ne kytkeytyvät adenylaattisyklaasin inhibi-tioon. 5-HT2-perheeseen kuuluu 5-HT2-reseptori (Pritchett ym. 1988), 5-HTlc (Julius ym. 1989) ja 5-HT2f (rotan mahalaukun fundus, Foquet ym. 1992, Kursar ym. 1992). Näillä 5 reseptoreilla on keskenään yhteistä yli 70 %:n aminohap-poidenttisyys ja kytkeytyminen fosfoinositidien hydrolyy-siin. 5-HT3-reseptorin on osoitettu olevan ligandin ohjaama ionikanava (Maricq ym. 1991). 5-HT3-reseptorien heterogeenisyys on kiistanalainen, vaikkakin muissa ligandin ohjaa-10 missä ionikanavissa nähdään merkittävää heterogeenisyyttä. Tästä sarjasta puuttuvat huomiotaherättävästi 5-HT4-resep-torit. Toisiolähettikytkentä kudostutkimuksista viittaa adenylaattisyklaasin aktivoitumiseen primaarisena signaa-linvälitystapana (Dumius ym. 1988, Bockaert ym. 1990). II-15 moitamme tässä ensimmäisen adenylaattisyklaasin aktiivisuuden stimulointiin kytkeytyvän nisäkkään 5-HT-reseptorin kloonauksen, ja esitämme sille nimeä 5-HT4B. Tämän reseptorin farmakologiset ominaisuudet viittaavat siihen, että se voi olla samankaltainen joukon funktionaalisesta määritel-20 tyjä 5-HT-reseptoreja kanssa, joita on kuvattu sian ontto-laskimossa (Trevethick ym. 1984), kissan jalkavarren iho-laskimossa, sepelvaltimoissa [Cushing ja Cohen 1992, ja useissa verisuonten laajenemisvaikutuksissa (Mylecharane ja Phillips 1989). Nämä reseptorit vaikuttavat olevan su-. 25 pistus- ja rentoutumisvasteiden takana eristetyissä veri suonissa, mikä viittaa potentiaaliseen hoitohyötyyn rintakivussa, sepelvaltimotaudissa, ateroskleroosissa ja mahdollisesti aivoinfarktiin johtavissa aivojen verisuonten häiriöissä. Tämän alatyypin esiintyminen keskushermostossa 30 viittaa myös potentiaaliseen käyttöön korkeampien kognitiivisten prosessien häiriöissä sekä myös autonomisen toiminnan säätelyssä.
Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö tuo käytettäväksi nisäkkään 5-HT4B-re-35 septoria koodittavan eristetyn nukleiinihappomolekyylin.
BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 3 111337 Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa eristetty nukleiinihappo koodittaa ihmisen 5-HT4B-reseptoria. Toisessa tämän keksinnön suoritusmuodossa nukleiinihappomolekyy-li käsittää plasmidin, josta käytetään nimeä pcEXV-5-HT4B ' 5 (ATCC:n hakunumero 75 332).
Tämä keksintö tuo käytettäväksi nukleiinihappokoet-timen, joka käsittää ainakin 15 nukleotidia, joka kykenee spesifisesti hybridisoitumaan sellaisen sekvenssin kanssa, joka sisältyy nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan nuk-10 leiinihappomolekyylin sekvenssiin. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi nukleiinihappokoettimen, joka käsittää ainakin 15 nukleotidia, joka kykenee spesifisesti hybridisoitumaan sellaisen sekvenssin kanssa, joka sisältyy ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan nukleiinihappomolekyylin sek-15 venssiin.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi antisense-oligonuk-leotidin, jolla on sekvenssi, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavaan mRNA-molekyyliin niin, että se estää tämän mRNA-molekyylin 20 translaation. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi anti- sense-oligonukleotidin, jolla on sekvenssi, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodit-tavaan mRNA-molekyyliin niin, että se estää tämän mRNA-molekyylin translaation.
25 Tämä keksintö tuo käytettäväksi nisäkkään 5-HT4B-re- septorin vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi ihmisen 5-HT4B-reseptorin vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi farmaseuttisen 30 koostumuksen, joka käsittää määrän ainetta, joka on teho-kas lievittämään nisäkkään 5-HT4B-reseptorin yliekspres-siosta seuraavia poikkeavuuksia, ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan, kuin myös farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää määrän ainetta, joka on tehokas lievittämään BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 4 111337 nisäkkään 5-HT4B-reseptorin aliekspressiosta seuraavia poikkeavuuksia, ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää määrän ainetta, joka on teho-5 kas lievittämään ihmisen 5-HT4B-reseptorin yliekspressios-ta johtuvia poikkeavuuksia, ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää määrän ainetta, joka on tehokas lievittämään ihmisen 5-HT4B-reseptorin aliekspres-10 siosta johtuvia poikkeavuuksia, ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi siirtogeenisen eläimen, joka ei ole ihminen, jonka genomi käsittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta niin sijoitettuna 15 tällaiseen genomiin, että siitä tuotetaan transkriptiossa antisense-mRNA:ta, joka on komplementaarinen nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodattavan mRNA:n kanssa, ja kun tämä komplementaarinen mRNA saatetaan hybridisoitumaan nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n kanssa, se vähen-20 tää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n translaatiota.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi siirtogeenisen eläimen, joka ei ole ihminen, jonka genomi käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta niin sijoitettu- ,·. 25 na tällaiseen genomiin, että siitä tuotetaan transkrip tiossa antisense-mRNA:ta, joka on komplementaarinen ihmisen 5-HT4B:tä koodittavan mRNA:n kanssa, ja kun tämä komplementaarinen mRNA saatetaan hybridisoitumaan ihmisen 5-HT4B:tä koodittavan mRNA:n kanssa, se vähentää ihmisen 30 5-HT4B:tä koodittavan mRNA:n translaatiota.
.. Tämä keksintö tuo käytettäväksi siirtogeenisen eläimen, joka ei ole ihminen, jonka genomi käsittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta niin sijoitettuna tällaiseen genomiin, että siitä tuotetaan transkrip-35 tiossa antisense-mRNA:ta, joka on komplementaarinen nisäk- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 5 111337 kään 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n kanssa, ja kun tämä komplementaarinen mRNA saatetaan hybridisoitumaan ni-« säkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n kanssa, se si ten estää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n * 5 translaation.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi siirtogeenisen eläimen, joka ei ole ihminen, jonka genomi käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta niin sijoitettuna tällaiseen genomiin, että siitä tuotetaan transkrip-10 tiossa antisense-mRNA:ta, joka on komplementaarinen ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n kanssa, ja kun tämä komplementaarinen mRNA saatetaan hybridisoitumaan ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n kanssa, se siten estää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n 15 translaation.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän lääkeaineiden seulomiseen sellaisten lääkeaineiden tunnistamiseksi, jotka ovat spesifisessä vuorovaikutuksessa solun pinnalla olevan nisäkkään 5-HT4B-reseptorin kanssa ja sitoutu-20 vat siihen, joka menetelmä käsittää, että saatetaan sellainen nisäkässolu, joka käsittää nisäkkään 5-HT4B-resepto-ria koodittavan eristetyn DNA-molekyylin, sen koodittaman proteiinin ekspressoituessa solun pinnalla, yhteyteen monien eri lääkeaineiden kanssa, määritetään ne lääkeaineet, 25 jotka sitoutuvat nisäkässoluun ja siten tunnistetaan lää keaineet, jotka ovat spesifisessä vuorovaikutuksessa nisäkkään 5-HT4B-reseptorin kanssa ja sitoutuvat siihen.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän lääkeaineiden seulomiseen sellaisten lääkeaineiden tunnistamisek-30 si, jotka ovat spesifisessä vuorovaikutuksessa solun pin-nalla olevan ihmisen 5~HT4B-reseptorin kanssa ja sitoutuvat siihen, joka menetelmä käsittää, että saatetaan sellainen nisäkässolu, joka käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan eristetyn DNA-molekyylin, sen koodittaman prote-35 iinin ekspressoituessa solun pinnalla, yhteyteen monien BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 6 111337 eri lääkeaineiden kanssa, määritetään ne lääkeaineet, jotka sitoutuvat nisäkässoluun ja siten tunnistetaan lääkeaineet, jotka ovat spesifisessä vuorovaikutuksessa ihmisen 5-HT4B-reseptorin kanssa ja sitoutuvat siihen.
5 Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän, jolla määritetään nisäkkään 5-HT4B-reseptorin eri ekspres-siotasojen fysiologiset vaikutukset, joka menetelmä käsittää, että tuotetaan siirtogeeninen eläin, joka ei ole ihminen, jonka nisäkkään 5-HT4B-reseptorin ekpressiotasoa 10 vaihdellaan käyttämällä indusoitavaa promoottoria, joka säätelee nisäkkään 5-HT4B-reseptorin ekspressiota.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän, jolla määritetään ihmisen 5-HT4B-reseptorin eri ekspres-siotasojen fysiologiset vaikutukset, joka menetelmä käsit-15 tää, että tuotetaan siirtogeeninen eläin, joka ei ole ihminen, jonka ihmisen 5-HT4B-reseptorin ekpressiotasoa vaihdellaan käyttämällä indusoitavaa promoottoria, joka säätelee ihmisen 5-HT4B-reseptorin ekspressiota.
Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän, 20 jolla määritetään nisäkkään 5-HT4B-reseptorin eri ekspres-siotasojen fysiologiset vaikutukset, joka menetelmä käsittää, että tuotetaan sarja siirtogeenisiä eläimiä, jotka eivät ole ihmisiä, joista kukin ekspressoi eri määrää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria.
25 Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän, jolla määritetään ihmisen 5-HT4B-reseptorin eri ekspressio-tasojen fysiologiset vaikutukset, joka menetelmä käsittää, että tuotetaan sarja siirtogeenisiä eläimiä, jotka eivät ole ihmisiä, joista kukin ekspressoi eri määrää ihmisen 30 5-HT4B-reseptoria.
·., Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän, jolla diagnosoidaan taipumus häiriöön, joka liittyy ihmisen jonkin 5-HT4B-reseptorin alleelin ekspressioon, joka menetelmä käsittää: a) saadaan häiriöstä kärsivien potilaiden 35 DNA:ta, b) suoritetaan tämän DNA:n restriktiodigestio sar- BNSDOC1D: <FI 111337B1 I ? 7 111337 jalla restriktioentsyymej ä, c) erotetaan elektroforeetti-sesti saadut DNA-fragmentit koonmääritysgeelillä, d) saa- tetaan saatu geeli yhteyteen nukleiinihappokoettimen kans sa, joka kykenee spesifisesti hybridisoitumaan nisäkkään 5 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA:n kanssa ja joka on leimattu havaittavissa olevalla merkillä, e) havaitaan leimautuneet vyöhykkeet, jotka ovat hybridisoituneet 5-HT4B-reseptoria koodittavan, havaittavissa olevalla merkillä leimatun DNA:n kanssa muodostaen jäljittelemättömän vyöhy-10 kekuvion, joka on spesifinen häiriöstä kärsivien potilaiden DNA:lie, f) käsitellään diagnoosia varten saatu DNA vaiheiden a - e läpi, ja g) vertaillaan vaiheen e jäljittelemätöntä vyöhykekuviota, joka on spesifinen häiriöstä kärsivien potilaiden DNA:lie, ja vaiheen f diagnoosia var-15 ten saatua DNA:ta sen määrittelemiseksi, ovatko kuviot samat vai erilaiset ja siten häiriöön taipumuksen diagnosoimiseksi, jos kuviot ovat samat.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän sen määrittämiseksi, pystyykö substraatti, jonka ei tiedetä pys-20 tyvän sitoutumaan nisäkkään 5-HT4B~reseptoriin, sitoutumaan siihen, joka menetelmä käsittää, että saatetaan nisäkässo-lu, joka käsittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan eristetyn DNA-molekyylin, yhteyteen substraatin kanssa olosuhteissa, jotka sallivat sellaisten substraattien si-25 toutumisen, joiden tiedetään sitoutuvan 5-HT4B-reseptoriin, havaitaan 5-HT4B-reseptoriin mahdollisesti sitoutuneen substraatin läsnäolo ja siten määritetään, sitoutuuko substraatti 5-HT4B-reseptoriin.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän sen mää-30 rittämiseksi, pystyykö substraatti, jonka ei tiedetä pys- tyvän sitoutumaan ihmisen 5-HT4B-reseptoriin, sitoutumaan siihen, joka menetelmä käsittää, että saatetaan nisäkässo-lu, joka käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan eristetyn DNA-molekyylin, yhteyteen substraatin kanssa 35 olosuhteissa, jotka sallivat sellaisten substraattien si- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > β 111337 toutumisen, joiden tiedetään sitoutuvan ihmisen 5-HT4B-re-septoriin, havaitaan 5-HT4B-reseptoriin mahdollisesti sitoutuneen substraatin läsnäolo ja siten määritetään, si-toutuuko substraatti ihmisen 5-HT4B-reseptoriin.
5 Kuvioiden tekstit
Kuvio 1
Uuden ihmisen 5-HT4B-serotoniinireseptorin nukleoti-disekvenssi ja päätelty aminohapposekvenssi. Nukleotidit esitetään suunnassa 5'-päästä 3'-päähän, ja koodittava 10 alue on numeroitu alkaen aloitusmetioniinista ja päättyen lopetuskodoniin. Pitkän avoimen lukukehyksen translaatiolla saatu päätelty aminohapposekvenssi esitetään yhdessä 5'-pään ja 3'-pään alueiden kanssa, joista ei tuoteta po-lypeptidiä. Numerot vasemmassa ja oikeassa marginaalissa 15 ovat nukleotidien (ylärivi) ja aminohappojen (alarivi) numeroinnit, jotka alkavat ensimmäisestä asemasta vastaavasti adenosiinilla (A) ja aloitusmetioniinilla (M).
Kuvio 2
Ihmisen 5-HT4B-reseptorikloonin (josta käytetään 20 nimeä hp78a) sekvenssikohdennus 5-HTlÄ:n, 5-HT1Da:n, 5-HTlDB:n, 5-HT1E:n ja 5-HT1F:n kanssa. Ihmisen 5-HT4B-resep-torin päätelty aminohapposekvenssi (ensimmäinen rivi) lähtien aloitusmetioniinista (M) lopetuskodoniin (*) asti on kohdennettu ihmisen 5-HTlÄ-serotoniinireseptorikloonin .· 25 (Kobilka ym. 1987), 5-HT1Da-serotoniinireseptorikloonin (Hamblin ym. 1991, Weinshank ym. 1992, Demchyshyn ym. 1992), 5-HT1DI3-serotoniinireseptorikloonin (Jin ym. 1992, Weinshank ym. 1992), 5-HT1E-serotoniinireseptorikloonin (Zgombick ym. 1992, McAllister ym. 1992) ja 5-HT1F-seroto-30 niinireseptorikloonin (Adhamym., jätetty julkaistavaksi) ·. kanssa. Viivat ovat aukkoja, jotka on täytynyt lisätä oi kean kohdennuksen saamiseksi. Harmaa varjostus osoittaa ne aminohappotähteet reseptoriklooneissa, jotka ovat identtisiä ihmisen 5-HT4B-reseptorin kanssa. Numerot aminohappo-35 sekvenssien yläpuolella ovat aminohappoasemia ihmisen BNSDOCID:<FI 111337B1 I > <· 111337 5-HT4B-reseptorissa, alkaen aloitusmetioniinista (M) ja päättyen lopetuskodoniin (*) ja lukien mukaan aukot, joilla on saatu oikea kohdennus.
Kuvio 3 > 5 5-HT4B-reseptorigeenejä koodittavan mRNA:n jakautu minen ihmiskudoksissa. Eri ihmiskudoksista eristetty koko-nais-RNA muutettiin yksijuosteiseksi cDNA:ksi käänteis-transkriptaasilla satunnaisalukkeita käyttäen. cDNA:t monistettiin PCR:llä käyttäen funktionaalisia hp78a-spesifi-10 siä PCR-alukkeita. PCR-tuotteet ajettiin 1,5-prosenttisel-la agaroosigeelillä, blotattiin nailonkalvoille ja hybri-disoitiin alukkeiden välisiin geenispesifisiin oligonuk-leotideihin. Positiivisena kontrollina oli geenispesifinen rekombinanttiplasmidi; tislattu vesi toimi negatiivisena 15 kontrollina. RNA-näytteiden, joita ei käsitelty käänteis-transkriptaasilla, PCR-monistus ja Southernin blottaus olivat negatiiviset.
Kuvio 4 cAMP:n tuoton stimulaatio 5-HT:n vaikutuksesta 20 transientisti transfektoiduissa Cos-7-soluissa, jotka ekspressoivat kloonattua ihmisen 5-HT4B-reseptoria. Kokonaisten solujen cAMP-mittaukset olivat Menetelmät ja materiaalit -kohdassa kuvatun mukaiset. Jokainen datapiste edustaa kolmen rinnakkaisnäytteen keskiarvoa yhdestä ko-.♦ 25 keesta, joka on edustava ainakin kahdelle muulle. Pystyjä- nat osoittavat keskiarvon keskivirheen. Tulokset esitetään prosentteina vapautuvan cAMP:n perustasosta (perustaso: 0,053 ± 0,004 pmol/ml/10 minuuttia).
Kuvio 5 30 cAMP:n tuoton stimulaatio 5-CT:n vaikutuksesta transientisti transfektoiduissa Cos-7-soluissa, jotka ekspressoivat kloonattua ihmisen 5-HT4B-reseptoria. Kokonaisten solujen cAMP-mittaukset olivat Menetelmät ja materiaalit -kohdassa kuvatun mukaiset. Jokainen datapiste 35 edustaa kolmen rinnakkaisnäytteen keskiarvoa yhdestä ko- BNSD0CID: <FI 111337B1 I > 10 111337 keesta, joka on edustava ainakin kahdelle muulle. Pystyjanat osoittavat keskiarvon keskivirheen. Tulokset esitetään prosentteina vapautuvan cAMP:n perustasosta (perustaso: 0,053 ± 0,004 pmol/ml/10 minuuttia).
5 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö tuo käytettäväksi nisäkkään 5-HT4B-re-septoria koodittavan eristetyn nukleiinihappomolekyylin. Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi ihmisen 5-HT4B-re-septoria koodittavan eristetyn nukleiinihappomolekyylin. 10 Kuten termiä tässä käytetään, "eristetty nukleiinihappomo-lekyyli" tarkoittaa muualla kuin luonnossa esiintyvää nuk-leiinihappomolekyyliä, ts. molekyyliä sellaisessa muodossa, joka ei esiinny luonnossa. Esimerkkejä tällaisesta eristetystä nukleiinihappomolekyylistä ovat nisäkkään 15 5-HT4B-reseptoria tai ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittava RNA-, cDNA- tai eristetty genominen DNA-molekyyli. Kuten sanaa tässä käytetään, "5-HT4B-reseptori" tarkoittaa molekyyliä, joka fysiologisissa olosuhteissa on oleellisesti spesifinen neurotransmitterille serotoniini, on kyllästet-20 tävissä, jolla on korkea affiniteetti serotoniinille ja aktivointi, joka kytkeytyy adenylaattisyklaasin aktivointiin. Tämän keksinnön eräs suoritusmuoto on nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittava eristetty nukleiinihappomole-kyyli. Toinen, edullinen suoritusmuoto on ihmisen 5-HT4b-.· 25 reseptoria koodittava eristetty nukleiinihappomolekyyli.
Tällaisessa molekyylissä voi olla oleellisesti samat koodattavat sekvenssit kuin kuviossa 1 esitetyt koodittavat sekvenssit. Kuvion 1 mukainen DNA-molekyyli (SEQ ID nro 1) koodittaa ihmisen 5-HT4B-reseptorin sekvenssiä. Eräs keino 30 nisäkkään 5-HT4B-reseptorin eristämiseksi on on tutkia nisäkkään genomikirjastoa luonnollisella tai keinotekoisesti suunnitellulla DNA-koettimella sinänsä tunnetulla tavalla. Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa nisäkkään 5-HT4b-reseptori on ihmisen proteiini, ja ihmisen 5-HT4B-re-35 septoria koodittava nukleiinihappomolekyyli eristetään ih- BNSD0C1D: <FI 111337B1 I > n 111337 misen genomikirjastosta ja ihmisen cDNA-kirjastosta. Päällekkäiset transmembraanialueen oligonukleotidikoettimet Drosophilan serotoniinireseptorigeenistä DR05HTR ovat hyödyllisiä koettimia tähän tarkoitukseen. Ihmisen 5-HT4B-re-5 septoria koodittavia DNA- ja cDNA-molekyylejä käytetään komplementaarisen genomin DNA:n, cDNA:n tai RNA:n saamiseksi ihmis-, nisäkäs- tai muista eläinlähteistä tai sa-mansukuisten cDNA- tai genomisten kloonien eristämiseksi cDNA- tai genomikirjastojen seulonnalla menetelmillä, 10 joita kuvataan edempänä yksityiskohtaisemmin. Näin saadaan transkription säätelyelementtejä eristetyn kloonin 5'-alueesta, josta ei tuoteta polypeptidiä, ja muita stabiiliutta, prosessointia, transkriptiota, translaatiota ja kudosspesifisyyttä määrittäviä alueita eristetyn geenin 15 sellaisilta 3'- ja 5’-alueilta, joista ei tuoteta polypeptidiä.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi eristetyn nukleii-nihappomolekyylin, jota on mutatoitu sillä tavalla, että se ei kykene koodittamaan molekyyliä, jolla on normaali 20 5-HT4B-reseptoriaktiivisuus, eikä ekspressoi natiivia 5-HT4B-reseptoria. Esimerkki tämän keksinnön käytettäväksi tuomasta mutatoidusta nukleiinihappomolekyylistä on eristetty nukleiinihappomolekyyli, jossa koodittavaan sekvenssiin on sijoitettu samassa lukukehyksessä oleva pysäytys-,·, 25 kodoni siten, ettei transkriptiossa tuotetusta RNA:sta tuoteta proteiinia translaatiossa.
Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan cDNA-molekyylin, jossa cDNA-molekyylillä on oleellisesti sama koodittava sekvenssi 30 kuin kuviossa 1 esitetty koodittava sekvenssi (sekvenssin ID nro 1). Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan cDNA-molekyylin, jossa cDNA-molekyylillä on oleellisesti sama koodittava sekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty koodittava sekvenssi (sekvenssin BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 12 111337 ID nro 1). Nämä molekyylit ja niiden ekvivalentteja saatiin edellä kuvatuilla keinoilla.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi eristetyn proteiinin, joka on nisäkkään 5-HT4B-reseptori. Tämän kek-5 sinnön edullisessa suoritusmuodossa proteiini on ihmisen 5-HT4B-reseptoriproteiini, jolla on oleellisesti samankaltainen aminohapposekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi (SEQ ID nrot 1 ja 2). Toisessa tämän keksinnön suoritusmuodossa proteiini on hiiren 5-HT4B-resepto-10 riproteiini, jolla on oleellisesti samankaltainen aminohapposekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi (SEQ ID nrot 1 ja 2). Kuten termiä tässä käytetään, "eristetyn proteiinin" on tarkoitus käsittää proteiinimo-lekyyli, joka on ilman muita solun komponentteja. Eräs ta-15 pa eristetyn nisäkkään 5-HT4B-reseptoriproteiinin saamiseksi on ekspressoida 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta sopivassa isännässä, kuten bakteeri-, hiiva- tai nisäkässo-lussa, käyttäen ammattimiesten hyvin tuntemia menetelmiä ja ottaa talteen reseptoriproteiini sen jälkeen, kun se on 20 ekspressoitunut tällaisessa isännässä, jälleen sinänsä tunnetulla tavalla. Reseptori voidaan myös eristää sitä ekspressoivista soluista, erityisesti soluista, jotka on transfektoitu edempänä yksityiskohtaisemmin kuvattavilla ekspressiovektoreilla.
.· 25 Tämä keksintö tuo käytettäväksi vektorin, joka kä sittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan eristetyn nukleiinihappomolekyylin, kuten DNA-, RNA- tai cDNA-mole-kyylin. Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi vektorin, joka käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan eriste-30 tyn nukleiinihappomolekyylin, kuten DNA-, RNA- tai cDNA-molekyylin. Esimerkkejä vektoreista ovat virukset, kuten bakteriofaagit (mukaan luettuna, mutta tähän rajoittumatta, lambda-faagi), eläinvirukset (mukaan luettuina, mutta näihin rajoittumatta, baculovirus, hiiren leukemiavirus ja 35 herpesvirus), kosmidit, plasmidit (kuten pUC18, saatavana BNSDOCIO: <FI 111337B1 I > 111337 13 yhtiöltä Pharmacia New Jerseyn Piscatawaysta) ja muut re-kombinaatiovektorit. Nukleiinihappomolekyylit sijoitetaan vektorien genomeihin ammattimiesten hyvin tuntemilla menetelmillä. Esimerkkejä tällaisista plasmideista ovat plas-5 midit, jotka käsittävät cDNA:n, jolla on olennaisesti sama koodittava sekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty koodittava sekvenssi (SEQ ID nro 1) ja josta käytetään nimeä klooni pcEXV-5HT4B, talletettu ATCC:n hakunumerolla 75 332.
Vaihtoehtoisesti näiden vektorien saamiseksi inser-10 tin ja vektorin DNA voidaan molemmat altistaa restriktio-entsyymille sellaisten komplementaaristen päiden luomiseksi molempiin molekyyleihin, jotka emäspariutuvat keskenään ja sitten ligatoidaan yhteen ligaasilla. Vaihtoehtoisesti insertin DNA:han voidaan ligatoida liitososat ("linkke-15 rit"), jotka vastaavat restriktiokohtaa vektori-DNA:ssa, jotka sitten digestoidaan siitä kohdasta katkaisevalla restriktioentsyymillä. Myös muita keinoja on käytettävissä.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi vektoreita, 20 jotka käsittävät nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyylin, ja vektoreita, jotka käsittävät ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyylin, jotka vektorit on sovitettu bakteeri-, hiiva- tai nisäkässolussa ekspressiota varten, jotka lisäksi käsittävät DNA:n bak-,·. 25 teeri-, hiiva-, nisäkäs- tai hyönteissoluissa ekspressiota varten tarpeelliset säätelyelementit siten sijoitettuina nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA:n tai ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA:n suhteen, että ne sallivat sen ekspression. DNA:ta, jossa on oleel-30 lisesti samat koodittavat sekvenssit kuin kuviossa 1 esi-tetty koodittava sekvenssi, voidaan edullisesti sijoittaa näihin vektoreihin ihmisen 5-HT4B-reseptorin ekspressoimi-seksi. Ekspressioon tarvittaviin säätelyelementteihin kuuluvat promoottorisekvenssit RNA-polymeraasin sitomiseksi 35 ja transkription aloitussekvenssit ribosomin sitomiseksi.
BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 14 111337
Esimerkiksi bakteeriekspressiovektoriin kuuluu promoottori, kuten lac-promoottori, ja transkription aloittamiseksi Shine-Dalgarno-sekvenssi ja aloituskodoni AUG (Maniatis ym., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 5 1982). Samaan tapaan eukaryoottiekspressiovektoriin sisäl tyy heterologinen tai homologinen promoottori RNA-polyme-raasi II:lie, alavirtaan tuleva polyadenylaatiosignaali, aloituskodoni AUG ja lopetuskodoni ribosomin irtautumista varten. Lisäksi hyönteisekspressiovektorissa, kuten rekom-10 binanttibaculoviruksessa, käytetään polyhedriinigeenin ekspressiosignaaleja insertoidun geenin hyönteissoluissa ekspressiota varten. Tällaisia vektoreita voidaan saada kaupallisesti tai koota kuvatuista sekvensseistä sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi menetelmillä, joita edellä 15 on kuvattu vektorien konstruointiin yleensä. Ekspressio-vektorit ovat hyödyllisiä reseptoreita ekspressoivien solujen tuottamiseksi. Tiettyjä käyttöjä tällaisille soluille kuvataan yksityiskohtaisemmin edempänä.
Eräässä tämän keksinnön suoritusmuodossa plasmidi 20 sovitetaan bakteeri-, hiiva-, hyönteis- tai erityisesti nisäkässolussa tapahtuvaa ekspressiota varten, jossa suoritusmuodossa plasmidi käsittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyylin tai ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyylin ja DNA:n bakteeri-, hiiva-, ,· 25 hyönteis- tai nisäkässoluissa ekspressiota varten tar- ♦ peelliset säätelyelementit siten sijoitettuina nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA:n tai ihmisen 5-HT4B-re-septoria koodittavan DNA:n suhteen, että ne sallivat sen ekspression. Sopiviin plasmideihin voivat kuulua, näihin 30 rajoittumatta, nisäkässoluekspressioon sovitetut plasmi-dit, esim. EVJB, EXV-3. Esimerkki tällaisesta nisäkässoluekspressioon sovitetusta plasmidista on plasmidi, joka käsittää cDNA:n, jossa on oleellisesti samat koodittavat sekvenssit kuin kuviossa 1 esitetty koodittava sekvenssi 35 (SEQ ID nro 1) ja DNA:n nisäkässolussa ekspressiota varten BNSDOCID: <Fl 111337B1 I > 15 111337 tarpeelliset säätelyelementit. Tälle plasmidille on annettu nimitys pcEXV-5-HT4B ja se on talletettu ATCC-hakunume-rolla 75 332. Ammattimiehet ymmärtävät helposti, että lukuisia nisäkässoluekspressioon sovitettuja plasmideja, 5 jotka käsittävät nisäkkään tai ihmisen 5-HT4B-resepto-ria koodittavan DNA:n ja tällaisen DNA:n nisäkässolussa ekspressoimiseen tarpeelliset säätelyelementit, voidaan konstruoida käyttäen olemassaolevia plasmideja sovitettuina tarpeen mukaan sisältämään DNA:n nisäkässolussa 10 ekspressiota varten tarpeelliset säätelyelementit. Plasmideja voidaan konstruoida menetelmillä, joita edellä on kuvattu ekspressiovektoreille ja vektoreille yleensä tai muulla sinänsä tunnetulla tavalla.
Edellä käsitelty talletus tehtiin mikroeliöiden pa-15 tentinhakua varten tapahtuvan tallettamisen kansainvälistä tunnustamista koskevan Budapestin sopimuksen määräysten noudattamiseksi ja ne täyttäen laitokseen American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852.
20 Tämä keksintö tuo käytettäväksi nisäkässolun, joka käsittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-mole-kyylin, kuten nisäkässolu, joka käsittää sellaisen nisäkässoluekspressioon sovitetun plasmidin, joka käsittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyylin ja 25 DNA:n nisäkässoluekspressiota varten tarpeelliset säätely- * elementit siten sijoitettuina nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA:n suhteen, että ne sallivat sen ekspression. Tämä keksintö tuo käytettäväksi nisäkässolun, joka käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyy-30 Iin, kuten nisäkässolu, joka käsittää sellaisen nisäkässo-luekspressioon sovitetun plasmidin, joka käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyylin ja DNA:n nisäkässoluekspressiota varten tarpeelliset säätelyelementit siten sijoitettuina ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan 35 DNA:n suhteen, että ne sallivat sen ekspression. Lukuisia BNSDOCIDkFI 111337B1 I > ie 111337 nisäkässoluja voidaan käyttää isäntinä, mukaan luettuina, mutta näihin rajoittumatta, hiiren fibroblastisolu NIH 3T3, CHO-solut, HeLa-solut, LM(tk“)-solut, Cos-solut jne. Ekpressioplasmideja, kuten edellä kuvattu, voidaan käyttää 5 nisäkässolujen transfektoimiseen sinänsä tunnetulla tavalla, kuten kalsiumfosfaattisaostuksella, tai ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta voidaan muuten viedä nisäkässoluihin, esim. mikroinjektiolla, jotta saadaan nisäkässoluja, jotka käsittävät DNA:ta, esim. 10 cDNA:ta tai plasmidin, joka koodittaa ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria. Plasmidin pcEXV-5HT4B käsittävät ja sitä ekspressoivat LM( tk')-solut talletettiin edellä kuvatun mukaisesti ATCC:hen, ja niille annettiin ATCC:n haku-numero CRL 11 166.
15 Tämä keksintö tuo käytettäväksi nukleiinihappokoet- timen, joka käsittää ainakin 15 nukleotidia, joka kykenee spesifisesti hybridisoitumaan sellaisen sekvenssin kanssa, joka sisältyy ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan nuk-leiinihappomolekyylin sekvenssiin, esimerkiksi koodittavan 20 sekvenssin kanssa, joka sisältyy kuviossa 1 esitettyihin sekvensseihin (SEQ ID nro 1). Kuten termiä tässä käytetään, "spesifisesti hybridisoituva" tarkoittaa nukleiini-happomolekyylin kykyä tunnistaa sen omalle sekvenssille komplementaarinen nukleiinihapposekvenssi ja muodostaa 25 kaksoiskierteisiä jaksoja vetysidoksilla komplementaaris- ten emäsparien välillä. Ammattimiehet tuntevat hyvin nuk-leiinihappokoetinteknologian, ja he ymmärtävät helposti, että tällaisten koettimien pituus voi vaihdella suuresti, ja ne voidaan leimata havaittavissa olevalla leimalla, ku-30 ten radioisotoopilla tai fluoresoivalla väriaineella koet-timen havaitsemisen helpottamiseksi. Ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan nukleiinihapon havaitseminen on hyödyllistä diagnostisena testinä mille tahansa tautitilalle, jossa 5-HT4B-reseptorin ekspressiotasot ovat muuttuneet. 35 DNA-koetinmolekyylejä tuotetaan sijoittamalla 5-HT4B-resep- BNSDOCID: <FI 111337B1 I r 111337 17 toria tai sen fragmentteja koodittava DNA-molekyyli sopiviin vektoreihin, kuten plasmideihin tai bakteriofaagei-hin, jotka sitten sijoitetaan sopiviin bakteeri-isäntäso-luihin, minkä jälkeen DNA-koettimet replikoituvat, ja ne 5 kerätään talteen, kaikki sinänsä tunnetulla tavalla. Esimerkiksi DNA voidaan uuttaa solulysaatista fenolia ja etanolia käyttäen, digestoida DNA:n vektoriininsertiokohtia vastaavilla restriktioentsyymeillä (käsitelty edellä), ajaa elektroforeesissa ja leikata irti saadusta geelistä. 10 Esimerkki tällaisesta DNA-molekyylistä esitetään kuviossa 1. Koettimet ovat hyödyllisiä ”in situ" -hybridisaatioon eli sellaisten kudosten paikallistamiseen, jotka ekspres-soivat tätä geeniperhettä, tai muihin hybridisaatiomääri-tyksiin, joissa määritetään näiden geenien tai niiden 15 mRNA:n läsnäoloa erilaisissa biologissa kudoksissa. Lisäksi synteetisoidut oligonukleotidit (DNA-syntetisaattorilla tuotetut), jotka ovat komplementaarisia nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA-molekyylin sekvenssille tai komplementaarisia ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan 20 DNA-molekyylin sekvenssille, ovat hyödyllisiä koettimina näille geeneille, niihin liittyvälle mRNA:lle, tai saman-sukuisten geenien eristämiseen genomi- tai cDNA-kirjestojen homologiaseulonnalla tai käyttämällä monistusmenetel-miä, kuten polymeraasiketjureaktio.
25 Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän ih misen 5-HT4B-reseptorin ekspression havaitsemiseksi solun pinnalla havaitsemalla 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA: n esiintyminen. Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän nisäkkään 5-HT4B-reseptorin ekspression havaitse-30 miseksi solun pinnalla havaitsemalla nisäkkään 5-HT4B-re-septoria koodittavan mRNA:n esiintyminen. Nämä menetelmät käsittävät sen, että saadaan kokonais-mRNA solusta sinänsä tunnetulla tavalla ja saatetaan näin saatu mRNA yhteyteen edellä kuvatun mukaisen nukleiinihappokoettimen kanssa 35 hybridisointiolosuhteissa, havaitaan koettimeen hybridi- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > ia 111337 soituneen mRNA:n esiintyminen ja siten havaitaan reseptorin ekspressio solussa. Koettimet hybridisoidaan kohdenuk-leiinihappomolekyyleihin, kuten mRNA-molekyyleihin, sinänsä tunnetulla tavalla. Kuitenkin eräässä tämän keksinnön 5 suoritusmuodossa nukleiinihapot uutetaan hajotetuista soluista saostuksella, ja mRNA eristetään uutoksesta käyttäen pylvästä, joka sitoo mRNA-molekyylien poly-A-hännät (Maniatis, T. ym., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 197-98 (1982)). Sitten mRNA saatetaan yh-10 teyteen radioaktiivisen koettimen kanssa nitroselluloosa-kalvolla, ja koetin hybridisoituu komplementaarisiin mRNA-sekvensseihin ja siten leimaa ne. Sitoutuminen voidaan havaita autoradiografiällä tai tuikelaskennalla. Kuitenkin ammattimiehet tuntevat hyvin muita menetelmiä näiden vai-15 heiden suorittamiseen, ja edellä käsitelty on vain esimerkki .
Tämä keksintö tuo käytettäväksi antisense-oligonuk-leotidin, jolla on sekvenssi, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA-mo-20 lekyylin mihin tahansa sekvensseihin niin, että se estää ihmisen 5-HT4B-reseptorin translaation. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi antisense-oligonukleotidin, jolla on sekvenssi, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA-molekyylin mihin tahansa 25 sekvensseihin niin, että se estää nisäkkään 5-HT4B-resepto-rin translaation. Kuten termiä tässä käytetään, "spesifisesti sitoutuminen" tarkoittaa antisense-oligonukleotidin kykyä tunnistaa sen omalle sekvenssille komplementaarinen nukleiinihapposekvenssi ja muodostaa kaksoiskierteisiä 30 jaksoja vetysidoksilla komplementaaristen emäsparien vä-.. Iillä. Antisense-oligonukleotidilla voi olla sekvenssi, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti kuviossa 1 esitetyn cDNA-molekyylin mihin tahansa sekvensseihin. Erityinen esimerkki antisense-oligonukleotidista on antisense-oligo- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > i9 111337 nukleotidi, joka käsittää nukleotidien kemiallisia analogeja.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää tehokkaan määrän sellaista 5 edellä kuvattua oligonukleotidia, joka on tehokas vähentämään ihmisen 5-HT4B-reseptorin ekspressiota kulkemalla solukalvon läpi ja sitoutumalla spesifisesti 5-HT4B-resepto-ria koodittavaan mRNAihan solussa siten, että sen translaatio estyy, ja farmaseuttisesti soveliaan hydrofobisen 10 kantajan, joka kykenee kulkeutumaan solukalvon läpi. Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää tehokkaan määrän sellaista edellä kuvattua oligonukleotidia, joka on tehokas vähentämään nisäkkään 5-HT4B-reseptorin ekspressiota kulkemalla solukal-15 von läpi ja sitoutumalla spesifisesti nisäkkään 5-HT4B—reseptoria koodattavaan mRNAthan solussa siten, että sen translaatio estyy, ja farmaseuttisesti soveliaan hydrofobisen kantajan, joka kykenee kulkeutumaan solukalvon läpi. Kuten termiä tässä käytetään, "farmaseuttisesti sovelias 20 kantaja" kattaa mitkä tahansa tavanomaisista farmaseuttisista kantajista, kuten fosfaattipuskuroitu suolaliuos, vesi ja emulsiot, kuten öljy/vesi- ja vesi/öljyemulsiot, sekä eri tyyppiset kostutusaineet. Oligonukleotidi voidaan kytkeä aineeseen, joka inaktivoi mRNA:ta, kuten ribotsyy-25 miin. Farmaseuttisesti sovelias hydrofobinen kantaja, joka > kykenee kulkeutumaan solukalvojen läpi, voi myös käsittää rakenteen, joka sitoutuu valitulle solutyypille spesifiseen kuljettajaan ja otetaan siten sisään valitun solutyypin soluihin. Rakenne voi olla osa proteiinia, jonka tie-30 detään sitoutuvan solutyyppispesifiseen kuljettajaan, esi merkiksi insuliinimolekyyliä, joka ohjaisi haimasoluihin. DNA-molekyylejä, joilla on oleellisesti sama koodittava sekvenssi kuin kuviossa 1 esitetyt koodattavat sekvenssit, voidaan käyttää farmaseuttisten koostumusten oligonukleo-35 tideina.
BNSDOCID: <FI 111337B1 1 > 111337 20 Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän, jolla hoidetaan poikkeavuuksia, joita helpottaa 5-HT4B-reseptorin ekspression väheneminen. Tämä menetelmä käsittää sen, että potilaalle annetaan tehokas määrä sellaista edellä kuvat-5 tua farmaseuttista koostumusta, joka on tehokas vähentämään potilaan 5-HT4B-reseptorin ekspressiota.
Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän, jolla hoidetaan poikkeavaa tilaa, joka liittyy 5-HT4B-re-septoriaktiivisuuteen, joka menetelmä käsittää sen, että 10 potilaalle annetaan sellainen määrä edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta, joka on tehokas vähentämään potilaan 5-HT4B-reseptorin ekspressiota. Esimerkkejä tällaisista poikkeavista tiloista ovat rintakipu, sepelvaltimotauti, ateroskleroosi, aivoinfarktiin johtavat aivoverisuoni-15 häiriöt, ärtynyt paksusuoli -syndrooma ja muut ruoansula tuskanavan liikkuvuushäiriöt, keskushermostohäiriöt, kivun aistiminen, tunnetilahäiriöt, korkeampien kognitiivisten prosessien häiriöt, mukaan luettuna, mutta tähän rajoittumatta, skitsofrenia, sekä myös autonomisen toiminnan sää-20 tely.
Antisense-oligonukleotidilääkeaineet estävät 5-HT4b-reseptoria koodittavan mRNA:n translaatiota. Synteettiset antisense-oligonukleotidit tai muut kemialliset antisense-rakenteet suunnitellaan sitoutumaan 5-HT4B-reseptoria koo-25 dittavaan mRNA:han ja estämään mRNA:n translaatiota, ja ne ovat lääkeaineina hyödyllisiä estämään 5-HT4B-reseptorigee-nien ekspressiota potilaissa. Tämä keksintö tuo käytettäväksi keinon, jolla muutetaan terapeuttisesti ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin ekspressiotasoja käyttämällä 30 synteettistä antisense-oligonukleotidilääkeainetta (SAOD), joka estää 5-HT4B-reseptoria koodittavan mRNA:n translaatiota. Synteettiset antisense-oligonukleotidit tai muut kemialliset antisense-rakenteet, jotka on suunniteltu tunnistamaan mRNA ja sitoutumaan siihen selektiivisesti, 35 konstruoidaan komplementaarisiksi osille kuviossa 1 esi- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 21 111337 tettyä nukleotidisekvenssiä DNA:sta, RNA:sta tai kemiallisesti muunnetuista keinotekoisista nukleiinihapoista. SAOD suunnitellaan olemaan stabiili verenkierrossa potilaille injektiona antamista varten tai laboratorion soluviljely-5 olosuhteissa potilaasta otetuille soluille antamista varten. SAOD suunnitellaan kykeneväksi kulkeutumaan solukalvojen läpi, jotta se pääsisi sisään solun sytoplasmaan johtuen SAOD:n fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista, jotka saavat sen kykeneväksi kulkeutumaan solukal-10 vojen läpi (esim. suunnittelemalla pieniä ja hydrofobisia SAOD-rakenteita), tai johtuen spesifisistä kuljetusjärjestelmistä solussa, jotka tunnistavat ja kuljettavat SAOD:n soluun. Lisäksi SAOD voidaan suunnitella annettavaksi vain tietyille valituille solupopulaatioille kohdentamalla SAOD 15 tunnistettavaksi spesifisillä solun sisäänottomekanismeil-la, jotka sitovat ja ottavat sisään SA0D:tä vain tietyissä valituissa solupopulaatioissa. Esimerkiksi SAOD voidaan suunnitella sitoutumaan kuljettajaan, joka esiintyy vain tietyssä solutyypissä, kuten edellä pohdittiin. SAOD suun-20 niteilaan myös tunnistamaan kohde-mRNA-sekvenssi, joka voi vastata kuviossa 1 esitettyyn sekvenssiin sisältyvää sekvenssiä, ja sitoutumaan siihen selektiivisesti johtuen komplementaarisesta emäspariutumisesta mRNA:han. Lopuksi SAOD suunnitellaan inaktivoimaan kohde-mRNA-sekvens-.·, 25 si jollakin kolmesta mekanismista: 1) sitoutumalla kohde- mRNA:han ja siten indusoimalla mRNA:n hajotus solun omilla mekanismeilla kuten RNAasi I -digestio, 2) estämällä koh-de-mRNA:n translaatiota häiritsemällä translaatiota säätelevien tekijöiden tai ribosomien sitoutumista tai 3) otta-30 maila mukaan muita kemiallisia rakenteita, kuten ribotsyy-misekvenssejä tai reaktiivisia kemiallisia ryhmiä, jotka joko hajottavat tai muuntavat kemiallisesti kohde-mRNA:ta. Synteettisillä antisense-oligonukleotidilääkeaineilla on osoitettu voivan olla edellä kuvattuja ominaisuuksia, kun 35 ne suunnataan mRNA-kohteita vastaan (J. S. Cohen, Trends BNSDOCID:<FI 111337B1 I > 22 111337 in Pharm. Sei. 19, 435, (1989), H. M. Weintraub Sei. Am., tammikuu (1990) s. 40). Lisäksi ribotsyymien kytkeminen antisense-oligonukleotideihin on lupaava strategia kohde-mRNA:n inaktivoimiseksi (N. Sarver ym., Science 247, 1222 5 (1990)). SAOD toimii tehokkaana hoitavana aineena, jos se on suuniteltu annettavaksi potilaalle injektiona, tai jos potilaan kohdesolut otetaan pois, käsitellään SA0D:llä laboratoriossa ja palautetaan potilaaseen. Tällä tavalla SAOD toimii hoitona, jolla vähennetään 5-HT4B-reseptorin 10 ekspressiota tietyissä kohdesoluissa potilaassa missä tahansa kliinisessä tilassa, joka voi hyötyä 5-HT4B-resepto-rin vähenneestä ekspressiosta.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi ihmisen 5-HT4B-re-septorin vastaisen vasta-aineen. Tämä keksintö tuo myös 15 käytettäväksi nisäkkään 5-HT4B-reseptorin vastaisen vasta-aineen. Tämä vasta-aine voi käsittää esimerkiksi monoklo-naalisen vasta-aineen, joka kohdistuu ihmisen 5-HT4B-resep-torin epitooppiin, joka esiintyy solun pinnalla, jolla epitoopilla on oleellisesti sama aminohapposekvenssi kuin 20 kuviossa 1 esitettyyn aminohapposekvenssiin sisältyvä ihmisen 5-HT4B-reseptorin solun pinnalla olevan epitoopin aminohapposekvenssi. Aminohapposekvenssejä voidaan analysoida ammattimiesten hyvin tuntemilla menetelmillä sen määrittämiseksi, tuottavatko ne hydrofobisia tai hydrofii-25 lisiä jaksoja muodostamissaan proteiineissa. Solukalvolla olevien proteiinien tapauksessa hydrofobisten alueiden tiedetään hyvin muodostavan sen osan proteiinia, joka on sijoittuneena solukalvon muodostavan lipidikaksoiskalvon sisään, kun taas hydrofiiliset alueet sijaitsevat solun 30 pinnalla vesiympäristössä. Siksi kuviossa 1 esitettyjen hydrofiilisten aminohapposekvenssien vastaiset vasta-aineet sitoutuvat 5-HT4B-reseptorin pintaepitooppiin kuvatun mukaisesti. Ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin vastaiset vasta-aineet voivat olla seerumiperäisiä tai monoklo-35 naalisia, ja ne valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla.
BNSD0CID: <FI 111337B1 I > 23 111337
Esimerkiksi monoklonaalisia vasta-aineita valmistetaan käyttäen hybridoomateknologiaa fuusioimalla vasta-ainetta tuottavia B-soluja immunisoiduista eläimistä myeloomasolu-jen kanssa ja valikoimalla haluttua vasta-ainetta tuottava 5 hybridoomasolulinja. Sellaisia soluja kuten NIH 3T3 -solut tai LM(tk")-solut voidaan käyttää immunogeeneinä tällaisen vasta-aineen tuotannon aikaansaamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan valmistaa synteettisiä peptidejä käyttäen kaupallisesti saatavina olevia koneita ja kuviossa 1 esitettyjä 10 aminohapposekvenssejä. Vielä eräänä vaihtoehtona DNA:ta, kuten cDNA:ta tai sen fragmenttia, voidaan kloonata ja ekspressoida ja saatu polypeptidi ottaa talteen ja käyttää immunogeeninä. Nämä vasta-aineet ovat hyödyllisiä eristetyn DNA:n koodittaman 5-HT4B-reseptorin läsnäolon havaitse-15 miseen tai 5-HT4B-reseptorin toiminnan estämiseen eläväissä eläimissä, ihmisissä tai eläimistä tai ihmisistä eristetyissä biologisissa kudoksissa tai nesteissä.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää tehokkaan määrän vasta-ainet-20 ta, joka kohdistuu ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin epitooppiin, joka on tehokas estämään luonnossa esiintyvien substraattien sitoutumisen 5-HT4B-reseptoriin, ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan. Monoklonaalinen vasta-aine, joka kohdistuu ihmisen 5-HT4B-reseptorin epitooppiin, . 25 joka esiintyy solun pinnalla, jolla epitoopilla on oleel- lisesti sama aminohapposekvenssi kuin kuviossa 1 esitettyyn aminohapposekvenssiin sisältyvä ihmisen 5-HT4B-resep-torin solun pinnalla olevan epitoopin aminohapposekvenssi, on hyödyllinen tähän tarkoitukseen.
30 Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän, jolla hoidetaan potilaassa poikkeavuuksia, joita helpottaa ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin ekspression väheneminen, joka menetelmä käsittää sen, että potilaalle annetaan tehokas määrä sellaista edellä kuvattua farmaseuttis-35 ta koostumusta, joka on tehokas estämään luonnossa esiin- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 24 1 11337 tyvien substraattien sitoutumista reseptoriin ja siten helpottamaan ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin yli-ekspressiosta johtuvia poikkeavuuksia. Vasta-aineen sitoutuminen reseptoriin estää reseptoria toimimasta, siten 5 neutraloiden yliekspression vaikutukset. Edellä kuvatut monoklonaaliset vasta-aineet ovat hyödyllisiä tähän tarkoitukseen. Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän, jolla hoidetaan poikkeavaa tilaa, joka liittyy 5-HT4B-reseptorin liialliseen aktiivisuuteen, joka menetel-10 mä käsittää sen, että potilaalle annetaan sellainen määrä edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta, joka on tehokas estämään luonnossa esiintyvien substraattien sitoutumista reseptoriin ja siten helpottamaan poikkeavaa tilaa. Joitakin esimerkkejä liialliseen 5-HT4B-reseptorin aktiivi-15 suuteen liittyvistä poikkeavista tiloista ovat rintakipu, sepelvaltimotauti, ateroskleroosi, aivoinfarktiin johtavat aivoverisuonihäiriöt, korkeampien kognitiivisten prosessien häiriöt (esim. skitsofrenia), sekä myös autonomisen toiminnan säätely.
20 Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmiä 5-HT4B- reseptorin esiintymisen havaitsemiseksi solun pinnalla, jotka menetelmät käsittävät sen, että solu saatetaan yhteyteen vasta-aineen kanssa, joka kohdistuu 5-HT4B-resepto-riin, sellaisissa olosuhteissa, jotka sallivat vasta-ai-25 neen sitoutumisen reseptoriin, havaitaan soluun sitoutuneen vasta-aineen läsnäolo ja siten 5-HT4B-reseptorin läsnäolo solun pinnalla. Tällaiset menetelmät ovat hyödyllisiä sen määrittämiseksi, onko tietyllä solulla vikaa 5-HT4B-reseptorien ekspressiossa. Sitoutuneet vasta-aineet 30 havaitaan sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi sitomal-la fluoresoivia merkkiaineita vasta-aineisiin ja tarkastelemalla solunäytettä fluoresenssimikroskoopissa, jotta solussa havaittaisiin fluoresenssi, joka osoittaa vasta-aineen sitoutumisen. Edellä kuvatut monoklonaaliset vasta-35 aineet ovat hyödyllisiä tähän tarkoitukseen.
BNSDOCID:<FI 111337B1 I > 25 111337 Tämä keksintö tuo käytettäväksi siirtogeenisen nisäkkään, joka ei ole ihminen, joka ekspressoi ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta, ja siirtogeenisen nisäkkään, joka ei ole ihminen, joka ekspressoi nisäkkään 5 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA: ta. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi siirtogeenisen nisäkkään, joka ei ole ihminen, joka ekspressoi ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta, johon on aiheutettu sellainen mutaatio, ettei reseptori kykene normaaliin reseptoriak-10 tiivisuuteen, ja joka ei ekspressoi natiivia 5-HT4B-resep-toria. Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi siirtogeenisen nisäkkään, joka ei ole ihminen, jonka genomi käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptori a koodittavan DNA: n niin sijoitettuna, että siitä tuotetaan transkriptiossa antisense-15 mRNA;ta, joka on komplementaarinen ihmisen 5-HT4B-resepto-ria koodattavalla DNA:lie, ja joka hybridisoituu 5-HT4B-reseptoria koodittavaan DNA:han siten vähentäen sen translaatiota, sekä siirtogeenisen nisäkkään, joka ei ole ihminen, joka genomi käsittää nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koo-20 dittavan DNA:n niin sijoitettuna, että siitä tuotetaan transkriptiossa antisense-mRNA:ta, joka on komplementaarinen nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodattavalla DNA:lie, ja joka hybridisoituu nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavaan DNA:hän siten vähentäen sen translaatiota. DNA voi lisäksi 25 käsittää indusoitavan promoottorin tai lisäksi käsittää kudosspesifisiä säätelyelementtejä siten, että ekspressio voidaan indusoida tai rajoittaa tiettyihin solutyyppeihin. Esimerkkejä DNA:sta ovat DNA- tai cDNA-molekyylit, joissa on oleellisesti sama koodattava sekvenssi kuin kuviossa 1 30 esitetyt koodattavat sekvenssit. Esimerkki siirtogeenises-. tä eläimestä on siirtogeeninen hiiri. Esimerkkejä kudos- spesifisyyden määrittävistä alueista ovat metallotioneii-nipromoottori (Low, M. J., Lechan, R. M., Hammer, R. E. ym., Science 231:1002-1004 (1986)) ja L7-promoottori BNSDOCID:<R 111337B1 I > 26 1113 3 7 (Oberdick, J., Smeyne, R. J., Mann, J. R., Jackson, S. ja Morgan, J. I., Science 248:223-226 (1990)).
Eläinmallisysteemejä, jotka selvittävät nisäkkäiden reseptorien tehtäviä fysiologiassa ja käyttäytymisessä, 5 tuotetaan luomalla siirtogeenisiä eläimiä, joissa reseptorin ekspressio on joko lisääntynyt tai vähentynyt, tai ekspressoitavan reseptoriproteiinin aminohapposekvenssi on muutettu, erilaisilla menetelmillä. Esimerkkeihin näistä menetelmistä kuuluvat, mutta näihin rajoittumatta: 1) ih-10 misen 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA:n tai tämän geenin homologisten eläinversioiden normaalien tai mutanttiver-sioiden vieminen mikroinjektiolla, retrovirusinfektiolla tai muilla ammattimiehen hyvin tuntemilla menetelmillä asianmukaisiin hedelmöitettyihin alkioihin siirtogeeni-15 sen eläimen tuottamiseksi (Hogan B. ym., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)) tai 2) näiden geenien mutantti- tai normaali-, ihmis- tai eläinversioiden homologinen rekombinaatio (Capecchi M. R., Science 244:1288-1292 (1989), 20 Zimmer, A. ja Gruss. P., Nature 338:150-153 (1989)) natii-vin geenilokuksen kanssa siirtogeenisissä eläimissä, reseptorin ekspression säätelyn tai sen rakenteen muuttamiseksi . Homologisen rekombinaation tekniikka on sinänsä tunnettu. Siinä natiivi geeni korvataan insertoidulla gee-25 nillä ja siten se on hyödyllinen sellaisen eläimen tuottamiseen, joka ei voi tuottaa natiivia reseptoria, mutta ekspressoi esimerkiksi insertoitua mutanttireseptoria, joka on korvannut natiivin reseptorin eläimen genomissa re-kombinaatiolla, mikä johtaa reseptorin aliekspressioon.
30 Mikroinjektio lisää geenejä genomiin, mutta ei poista nii-tä, ja niinpä se on hyödyllinen sellaisen eläimen tuottamiseksi, joka ekspressoi omaansa ja lisättyjä reseptoreja, mikä johtaa reseptorin yliekspressioon.
Eräs tarjolla oleva keino siirtogeenisen eläimen 35 tuottamiseksi, hiiri esimerkkinä, on seuraavanlainen: naa- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > v 111337 rashiirten annetaan pariutua, ja saadut hedelmöitetyt munasolut poistetaan leikkauksella niiden munajohtimista. Munasoluja säilytetään sopivassa elatusaineessa, kuten M2-elatusaine (Hogan B. ym., Manipulating the Mouse 5 Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)). Reseptoria koodittava DNA tai cDNA puhdistetaan vektorista (kuten edellä kuvatusta plasmidista pcEXV-5-HT4b) sinänsä tunnetulla tavalla. Indusoitavia promoottoreja voidaan fuusioida DNA:n koodittavaan alueeseen kokeel-10 lisen keinon tarjoamiseksi siirtogeenin ekspression säätelyyn. Vaihtoehtoisesti tai sen lisäksi kudosspesifisiä säätelyelementtejä voidaan fuusioida koodittavaan alueeseen siirtogeenin kudosspesifisen ekspression mahdollistamiseksi . Asianmukaisesti puskuroidussa liuoksessa oleva 15 DNA pannaan mikroinjektioneulaan (joka voidaan tehdä ka-pillaariputkesta pipetinvetäjää käyttäen), ja injektoitava munasolu pannaan kuopalliselle objektilasille. Neula viedään munasolun esitumaan, ja DNA-liuos injektoidaan. Sitten injektoitu munasolu siirretään valeraskaan hiiren 20 (hiiren, jota on stimuloitu asianmukaisilla hormoneilla raskauden pitämiseksi yllä, mutta joka ei itse asiassa ole raskaana) munajohtimeen, josta se jatkaa kohtuun, kiinnittyy ja kehittyy täysiaikaiseksi. Kuten edellä huomautettiin, mikroinjektio ei ole ainoa keino DNA:n viemiseksi 25 munasoluun, ja sitä käytettiin tässä vain esimerkin vuoksi.
Koska reseptorispesifisten lääkeaineiden normaali toiminta on aktivoida tai inhiboida reseptoria, edellä kuvatut siirtogeenisten eläinten mallisysteemit ovat hyödyl-30 lisiä reseptoreita vastaan suuntautuvien lääkeaineiden biologisen aktiivisuuden testaamiseksi jopa ennen kuin tällaisia lääkeaineita tulee saataville. Nämä eläinmalli-systeemit ovat hyödyllisiä ennustettaessa tai arvioitaessa sellaisten lääkeaineiden mahdollisia hoitosovelluksia, 35 jotka aktivoivat tai inhiboivat reseptoreita indusoimalla BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 28 111337 tai inhiboimalla natiivin tai siirtogeenin ekspressiota ja siten lisäävät tai vähentävät normaalien tai mutanttire-septoreiden ekspressiota elävässä eläimessä. Niin tuotetaan mallisysteemi, jossa reseptoreja vastaan suunnattujen 5 lääkeaineiden biologinen aktiivisuus arvioidaan ennen kuin tällaiset lääkeaineet tulevat saataville. Siirtogeeniset eläimet, jotka yli- tai alituottavat reseptoria, osoittavat fysiologisella tilallaan, onko reseptorin yli- tai alituotanto terapeuttisesti hyödyllistä.
10 Siksi on hyödyllistä arvioida lääkeaineen toimintaa siirtogeeniseen mallisysteemiin perustuen. Eräs käyttö perustuu siihen sinänsä tunnettuun seikkaan, että sellainen lääkeaine kuten antidepressantti toimii estämällä neuro-transmitterin sisäänottoa ja siten lisää neurotransmitte-15 rin määrää synapsiraossa. Tämän toiminnan fysiologinen seuraus on stimuloida vaikutuksen kohteena olevat solut tuottamaan vähemmän reseptoria, mikä lopulta johtaa ali-ekspressioon. Siksi eläinsysteemi, joka aliekspressoi reseptoria, on hyödyllinen koesysteeminä sen tutkimiseen, 20 ovatko tällaisten aliekspressioon johtavien lääkeaineiden toiminnat itse asiassa terapeuttisia. Toinen käyttö on se, että jos yliekspression havaitaan johtavan poikkeavuuksiin, silloin on aihetta olettaa sellaisen lääkeaineen, joka alasajaa reseptoria tai toimii sille antagonistina, 25 olevan kehittämisen arvoinen, ja jos lupaava hoitosovellus » löydetään näiden eläinmallisysteemien avulla, 5-HT4B-resep-torin aktivointi tai inhibitio saadaan aikaan hoidossa joko tuottamalla 5-HT4B-reseptoriin kohdistuvia agonisti- tai antagonistilääkeaineita tai millä tahansa menetelmällä, 30 joka lisää tai vähentää tämän reseptorin ekspressiota ihmisessä.
» « Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän, jolla määritetään ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorien eri tasojen ekspressoimisen fysiologiset vaikutukset, joka 35 menetelmä käsittää, että tuotetaan siirtogeeninen eläin, 3NSD0CID: <FI 111337B1 I > 29 111337 joka ei ole ihminen, jonka ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-re-septorien ekspressiotasoja vaihdellaan käyttäen indusoituvaa promoottoria, joka säätelee reseptorin ekspressiota. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän, jolla 5 määritetään ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorien eri tasojen ekspressoimisen fysiologiset vaikutukset, joka menetelmä käsittää, että tuotetaan sarja siirtogeenisiä eläimiä, jotka eivät ole ihmisiä, joista kukin ekspressoi eri määrää ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria. Tällai-10 siä eläimiä voidaan tuottaa viemällä eri määriä ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavaa DNA:ta munaso-luihin, joista siirtogeeniset eläimet kehittyvät.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän, jolla tunnistetaan aine, joka kykenee lievittämään poik-15 keavuuksia, jotka johtuvat ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-re-septorin yliekspressiosta, joka menetelmä käsittää, että annetaan ainetta siirtogeeniselle nisäkkäälle, joka ei ole ihminen, ja joka ekspressoi ainakin yhtä siihen keinotekoisesti vietyä DNA-molekyyliä, joka koodittaa ihmisen tai 20 nisäkkään 5-HT4B-reseptoria, ja määritetään, lievittääkö aine fyysisiä ja käyttäytymispoikkeavuuksia, joita nähdään siirtogeenisellä nisäkkäällä, joka ei ole ihminen, ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin yliekspression seurauksena. Kuten termiä tässä käytetään, "aine" tarkoittaa yhdistettä 25 tai koostumusta, joka voi olla luonnollinen, synteettinen tai seulonnan tuloksena saatu tuote. Esimerkkejä DNA-mole-kyyleistä ovat DNA- tai cDNA-molekyylit, joissa on oleellisesti sama koodittava sekvenssi kuin kuviossa 1 esitetyt koodattavat sekvenssit.
30 Tämä keksintö tuo käytettäväksi farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää määrän edellä kuvattua ainetta, joka on tehokas lievittämään 5-HT4B-reseptorin yliekspressiosta aiheutuvia poikkeavuuksia, ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan.
BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 30 111337 Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin yliekspressiosta aiheutuvien poikkeavuuksien hoitamiseksi, joka menetelmä käsittää, että hoidon kohteelle annetaan sellainen määrä 5 edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta, joka on tehokas lievittämään ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin yliekspressiosta aiheutuvia poikkeavuuksia.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän, jolla tunnistetaan aine, joka kykenee lievittämään poikkeavuuk-10 siä, jotka johtuvat ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin aliekspressiosta, joka menetelmä käsittää, että annetaan ainetta edellä kuvatulle siirtogeeniselle nisäkkäälle, joka ei ole ihminen, ja joka ekspressoi vain ei-toimivaa ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria, ja määritetään, lie-15 vittääkö aine fyysisiä ja käyttäytymispoikkeavuuksia, joita nähdään siirtogeenisellä nisäkkäällä, joka ei ole ihminen, ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin aliekspression seurauksena.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi farmaseuttisen 20 koostumuksen, joka käsittää määrän ainetta, joka on tehokas lievittämään ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin aliekspressiosta aiheutuvia poikkeavuuksia, ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan.
Tämä keksintö tuo lisäksi käytettäväksi menetelmän 25 ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin aliekspressiosta aiheutuvien poikkeavuuksien hoitamiseksi, joka menetelmä käsittää, että hoidon kohteelle annetaan sellainen määrä edellä kuvattua farmaseuttista koostumusta, joka on tehokas lievittämään ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin 30 aliekspressiosta aiheutuvia poikkeavuuksia.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän, jolla diagnosoidaan taipumus häiriöön, joka liittyy ihmisen tai nisäkkään jonkin 5-HT4B-reseptorin alleelin ekspressioon, joka menetelmä käsittää että: a) saadaan häiriöstä kärsi-35 vien potilaiden DNA:ta, b) suoritetaan tämän DNA:n rest- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 3i 111337 riktiodigestio sarjalla restriktioentsyymejä, c) erotetaan elektroforeettisesti saadut DNA-fragmentit koonmääritys-geelillä, d) saatetaan saatu geeli yhteyteen nukleiinihap-pokoettimen kanssa, joka kykenee spesifisesti hybridisoi-5 tumaan ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan DNA:n kanssa ja joka on leimattu havaittavissa olevalla merkillä, e) havaitaan leimautuneet vyöhykkeet, jotka ovat hybridisortuneet ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptoria koodittavan, havaittavissa olevalla merkillä leimatun 10 DNA:n kanssa muodostaen jäljittelemättömän vyöhykekuvion, joka on spesifinen häiriöstä kärsivien potilaiden DNA:lie, f) käsitellään diagnoosia varten saatu DNA vaiheiden a - e läpi, ja g) vertaillaan vaiheen e jäljittelemätöntä vyöhy-kekuviota, joka on spesifinen häiriöstä kärsivien potilai-15 den DNA:lie, ja vaiheen f diagnoosia varten saatua DNA:ta sen määrittelemiseksi, ovatko kuviot samat vai erilaiset ja siten häiriöön taipumuksen diagnosoimiseksi, jos kuviot ovat samat. Tätä menetelmää voidaan myös käyttää sellaisen häiriön diagnosoimiseksi, joka liittyy ihmisen tai nisäk-20 kään 5-HT4B-reseptorin jonkin tietyn alleelin ekspressioon.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän, jolla valmistetaan eristetty 5-HT4B-reseptori, joka menetelmä käsittää, että indusoidaan soluja ekspressoimaan reseptoria, kerätään talteen reseptori saaduista soluista ja puhdiste-25 taan näin talteen kerätty reseptori. Esimerkki 5-HT4B-re-septorista on eristetty proteiini, jolla on oleellisesti sama aminohapposekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi. Soluja voidaan indusoida ekspressoimaan reseptoreja esimerkiksi altistamalla ne sellaisille ai-30 neille kuten hormonit. Sitten solut voidaan homogenisoida, ja reseptori eristää homogenaatista käyttäen affiniteetti-pylvästä, joka käsittää esimerkiksi serotoniinia tai muuta ainetta, jonka tiedetään sitoutuvan 5-HT4B-reseptoriin. Sitten saadut fraktiot voidaan puhdistaa saattamalla ne 35 yhteyteen ioninvaihtopylvään kanssa ja määrittämällä, mikä BNSD0C1D: <FI 111337B1 I > 32 1 1 1337 fraktio sisältää 5-HT4B-reseptoriaktiivisuuden tai sitoutuu reseptorin vastaisiin vasta-aineisiin.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän, jolla valmistetaan eristetty 5-HT4B-reseptori, joka menetelmä 5 käsittää, että sijoitetaan 5-HT4B-reseptoria koodittava nukleiinihappo sopivaan vektoriin, sijoitetaan saatu vektori sopivaan isäntäsoluun, kerätään talteen saadun solun tuottama reseptori, ja puhdistetaan näin talteen kerätty reseptori. Esimerkki eristetystä 5-HT4B~reseptorista on 10 eristetty proteiini, jolla on oleellisesti sama aminohap posekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi. Näissä 5-HT4B-reseptorin valmistusmenetelmissä käytetään sinänsä tunnettuja yhdistelmä-DNA-menetelmiä. Esimerkiksi 5-HT4B-reseptoria koodittava eristetty nukleiinihappo si-15 joitetaan sopivaan vektoriin, kuten ekspressiovektoriin.
Sopiva isäntäsolu, kuten bakteerisolu tai eukaryoottisolu, kuten hiivasolu, transfektoidaan vektorilla. 5-HT4B-resep-tori eristetään elatusaineesta affiniteettipuhdistuksella tai kromatografialla tai muulla sinänsä tunnetulla taval-20 la.
Tämä keksintö tuo käytettäväksi menetelmän sen määrittämiseksi, pystyykö ligandi, jonka ei tiedetä pystyvän sitoutumaan ihmisen 5-HT4B-reseptoriin, sitoutumaan ihmisen 5-HT4B-reseptoriin, joka menetelmä käsittää, että saatetaan ,· 25 nisäkässolu, joka käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koo- dittavan DNA-molekyylin, ja jossa kooditettu proteiini siten ekspressoituu solun pinnalla, yhteyteen ligandin kanssa olosuhteissa, jotka sallivat sellaisten ligandien sitoutumisen, joiden tiedetään sitoutuvan 5-HT4B-reseptoriin, 30 havaitaan 5-HT4B-reseptoriin mahdollisesti sitoutuneen li- V gandin läsnäolo ja siten määritetään, sitoutuuko ligandi 5-HT4B-reseptoriin. Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän sen määrittämiseksi, pystyykö ligandi, jonka ei tiedetä pystyvän sitoutumaan ihmisen 5-HT4B-reseptoriin, 35 aktivoimaan funktionaalisesta sen aktiivisuuden tai estä- BNSDOCID: <FI 111337B1 l> 33 11 13 3 7 mään sellaisen ligandin toiminnan, joka niin tekee. Tämä käsittää sen, että saatetaan nisäkässolu, joka käsittää ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan eristetyn DNA-mole-kyylin, yhteyteen ligandin kanssa sellaisissa olosuhteis-5 sa, jotka sallivat funktionaalisen vasteen aktivoinnin tai estymisen, joka havaitaan tästä nisäkässolusta biologisella määrityksellä, kuten toisiolähettivasteella, ja siten määritetään, aktivoiko ligandi ihmisen 5-HT4B-reseptorin funktionaalisen tuotoksen vai estääkö se sen aktivoinnin. 10 Solussa olevalla DNA:11a voi olla oleellisesti sama koo-dittava sekvenssi kuin kuviossa 1 esitetty koodittava sekvenssi, edullisesti nisäkässolu on muuta kuin neuronialku-perää. Esimerkki nisäkässolusta, joka ei ole neuronaali-nen, on Ltk-solu, erityisesti Ltk-solu, josta käytetään 15 nimitystä L-5-HT4B. Toinen esimerkki nisäkässolusta, joka ei ole neuronaalinen, toiminnallisissa määrityksissä käytettäväksi on hiiren fibroblastisolulinja, erityisesti NIH 3T3 -solu. Edullinen menetelmä sen määrittämiseksi, pystyykö ligandi sitoutumaan ihmisen 5-HT4B-reseptoriin, kä-20 sittää sen, että saatetaan transfektoitu nisäkässolu, joka ei ole neuronaalinen (ts. solu, joka ei luonnostaan ekspressoi minkääntyyppistä 5-HT-reseptoria tai G-proteii-niin kytkettyä reseptoria, ja siis ekspressoi tällaista reseptoria vain, jos se on transfektoitu soluun), ja joka ,· 25 ekspressoi 5-HT4B-reseptoria pinnallaan, tai tällaisesta transfektoidusta solusta saatu membraanipreparaatti, yhteyteen ligandin kanssa sellaisissa olosuhteissa, joiden tiedetään vallitsevan ligandin 5-HT4B-reseptoriin in vivo -sitoutumisen aikana ja siten liittyvän siihen, havaitaan 30 testattavan ligandin mahdollinen esiintyminen sitoutuneena ·. 5-HT4B-reseptoriin solun pinnalla ja siten määritetään, si- toutuuko ligandi 5-HT4B-reseptoriin, aktivoiko se sen vai estääkö se 5-HT4B-reseptorin aktivoinnin. Tämä vastesystee-mi saadaan transfektoimalla eristetty DNA sopivaan isäntä-35 soluun, joka sisältää halutun toisiolähettisysteemin, ku- BNSDOCIDkFI 111337B1 I > 34 111337 ten fosfoinositidihydrolyysin, adenylaattisyklaasin, gua-nylaatisyklaasin tai ionikanavia. Tällainen isäntäsysteemi eristetään olemassa olevista solulinjoista tai voidaan luoda viemällä asiaankuuluvat toisiolähettisysteemien kom-5 ponentit olemassa oleviin solulinjoihin. Tällaisella transfektiosysteemillä tuodaan käytettäväksi täydellinen vastesysteemi ihmisen 5-HT4B-reseptorin aktiivisuuden tutkimista tai määrittämistä varten edellä kuvatun mukaisten ligandien kanssa. Transfektiosysteemit ovat hyödyllisiä 10 elävinä soluviljelminä sitoutumisen kilpailumäärityksiin tunnettujen tai ehdokaslääkeaineiden ja reseptoriin sitoutuvien, radioaktiivisilla, spektroskoopisilla tai muilla reagensseilla leimattujen ligandien välillä. Transfektoi-duista soluista eristetyt, reseptorin sisältävät membraa-15 nipreparaatit ovat myös hyödyllisiä näitä sitoutumisen kilpailumäärityksiä varten. Toisiolähettisysteemien tai niiden seurauksien toiminnalliset määritykset transfektio-systeemeissä toimivat määrityksinä sitoutumisaffiniteetil-le ja reseptorifunktion aktivoinnin tehokkuudelle. Trans-20 fektiosysteemi muodostaa "lääkeaineen löytösysteemin", joka on hyödyllinen sellaisten luonnollisten tai synteettisten yhdisteiden tunnistamiseksi, joilla on potentiaalia lääkeaineiden kehittämiseen, ja joita voidaan edelleen muuntaa tai käyttää suoraan terapeuttisina yhdisteinä ih-25 misen 5-HT4B-reseptorin luonnollisten toimintojen aktivoi-miseksi tai inhiboimiseksi. Transfektiosysteemi on myös hyödyllinen tunnettujen lääkeaineiden affiniteetin ja tehokkuuden määrittämiseksi ihmisen 5-HT4B-reseptorikohdissa.
Tämä keksintö tuo myös käytettäväksi menetelmän 30 lääkeaineiden seulomiseen sellaisten lääkeaineiden tunnis-tamiseksi, jotka ovat spesifisessä vuorovaikutuksessa solun pinnalla olevan ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-reseptorin kanssa ja sitoutuvat siihen, joka menetelmä käsittää, että saatetaan sellainen nisäkässolu, joka käsittää DNA-mole-35 kyylin, joka koodittaa ihmisen tai nisäkkään 5-HT4B-resep- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 35 1113 3 7 toria solun pinnalla, yhteyteen monien eri lääkeaineiden kanssa, havaitaan ne lääkeaineet, jotka sitoutuvat nisä-kässoluun ja siten tunnistetaan lääkeaineet, jotka ovat spesifisessä vuorovaikutuksessa ihmisen ja/tai nisäkkään 5 5-HT4B-reseptorin kanssa ja sitoutuvat siihen. Erilaisia havaitsemismenetelmiä voidaan käyttää. Lääkeaineet voivat olla "leimattuja" havaittavaan merkkiaineeseen (esim. ra-dioleimaan tai ei-isotooppiseen leimaan, kuten biotiiniin) liittämisen ansiosta. Solussa olevalla DNA:11a voi olla 10 koodittava sekvenssi, joka on oleellisesti sama kuin kuviossa 1 esitetty koodittava sekvenssi. Edullisesti ni-säkässolu on muuta kuin neuronialkuperää. Esimerkki nisä-kässolusta, joka ei ole neuronaalinen, on Cos-7-solu. Lääkeaine-ehdokkaat tunnistetaan valitsemalla kemiallisia 15 yhdisteitä, jotka sitoutuvat korkealla affiniteetilla ekspressoituun 5-HT4B-reseptoriproteiiniin transfektoituissa soluissa, käyttäen sinänsä tunnettuja radioligandisi-toutumismenetelmiä, joista esimerkkejä esitetään tässä kuvatuissa sitoutumismäärityksissä. Lääkeaine-ehdokkaat seu-20 lotaan myös selektiivisyyden suhteen tunnistamalla yhdisteet, jotka sitoutuvat korkealla affiniteetilla yhteen tiettyyn reseptoriin, mutta eivät sitoudu korkealla affiniteetilla mihinkään muihin reseptorialatyyppeihin tai mihinkään muuhun tunnettuun reseptoriin. Koska selektiiviset . 25 yhdisteet, joilla on korkea affiniteetti, ovat pääasiassa I ‘ · vuorovaikutuksessa kohteena olevan 5-HT4B-reseptorikohdan kanssa sen jälkeen, kun niitä on annettu potilaalle, mahdollisuus siihen, että tuotetaan lääke, jolla on ei-toi-vottuja sivuvaikutuksia, minimoidaan tällä lähestymista-30 valla. Tämä keksintö tuo käytettäväksi farmaseuttisen koostumuksen, joka käsittää edellä kuvatulla menetelmällä tunnistetun lääkeaineen ja farmaseuttisesti soveliaan kantajan. Kuten termiä tässä käytetään, "farmaseuttisesti sovelias kantaja" kattaa mitkä tahansa tavanomaisista farma-35 seuttisista kantajista, kuten fosfaattipuskuroitu suola- BNS00CID: <FI 111337B1 I > 36 1 1 13 3 7 liuos, vesi ja emulsiot, kuten öljy/vesi- ja vesi/öljy-emulsiot, sekä eri tyyppiset kostutusaineet. Sen jälkeen, kun lääkeaine-ehdokkaalla on osoitettu olevan riittävä biologinen hyötyosuus tietyn antoreitin kautta, esimerkik-5 si suun kautta tai injektiona (riittävien terapeuttisten pitoisuuksien täytyy säilyä vaikutuskohdassa riittävän kauan halutun terapeuttisen hyödyn saamiseksi), ja sen on osoitettu olevan ei-toksinen ja terapeuttisesti tehokas asianmukaisissa tautimalleissa, lääkeainetta voidaan antaa 10 potilaille sitä antoreittiä, jossa lääkeaineella on osoitettu olevan biologinen hyötyosuus, asianmukaisena kiinteänä tai liuosformulaationa, halutun terapeuttisen hyödyn saamiseksi.
Patentin hakijat ovat tunnistaneet uuden ihmisen 15 5-HT-reseptorialatyypin proteiinin, jolle on annettu nimitys 5-HT4b, ja ovat kuvanneet menetelmiä terapeuttisiin hoitoihin tarkoitettujen farmakologisten yhdisteiden tunnistamiseksi. Spesifisiin reseptorialatyyppeihin kohdistuvat farmakologiset yhdisteet tuovat tarjolle uusia hoito-20 ja, joilla on mahdollisimman pienet sivuvaikutukset.
Neuronien serotoniinireseptorien molekyylirakenteiden selvitäminen on tärkeä askel serotonergisen neurotransmission ymmärtämisessä. Tämä esitys raportoi ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavan uuden cDNA-kloonin eristyk-25 sen, aminohapposekvenssin ja funktionaalisen ekspression.
* 5-HT4B-reseptorien alatyyppien tunnistamisella on keskeinen osa serotonergisen neurotransmission taustalla olevien mo-lekyylimekanismien selvittämisessä, ja sen pitäisi myös auttaa uusien terapeuttisten aineiden kehittämisessä.
30 Serotoniinireseptorialatyyppiä koodittava komple- mentaarisen DNA:n klooni (nimeltään hp78a) on eristetty ihmisen cDNA- ja genomi-DNA-kirjastosta, ja sen toiminnallisia ominaisuuksia on tutkittu nisäkässoluissa. Nukleoti-disekvenssistä ennustetaan proteiini, jossa on 445 amino-35 happoa ja 7 erittäin hydrofobista, membraanin läpäiseviksi BNSDOCID: <FI 111337B1 I ;> 37 1 1 1337 doraeeneiksi sopivaa aluetta. 5-HT4B:n rakenteen ja toiminnan analyysi tarjoaa mallin sellaisten lääkeaineiden kehittämiseen, jotka ovat hyödyllisiä rintakivun, sepelvaltimotaudin, ateroskleroosin, aivoinfarktiin johtavien aivove-5 risuonihäiriöiden, ärtynyt paksusuoli -syndrooman ja muiden ruoansulatuskanavan liikkuvuushäiriöiden, keskushermosto-häiriöiden, kivun aistimisen, tunnetilahäiriöiden, ja korkeampien kognitiivisten prosessien häiriöiden, mukaan luettuna, mutta tähän rajoittumatta, skitsofrenian, sekä myös 10 autonomisen toiminnan säätelyn hoitoon.
Tämä keksintö tunnistaa ensimmäistä kertaa sellaisen nisäkkään serotoniinireseptorin, sen aminohapposekvenssin ja sen nisäkäsgeenin, jonka aktivointi kytkeytyy adenylaattisyklaasin aktivaatioon. Tämän löydön tarjolle 15 tuomat tiedot ja kokeelliset apuneuvot ovat hyödyllisiä uusien terapeuttisten aineiden ja tähän reseptoriproteiiniin, siihen liittyvään mRNA-molekyyliin tai siihen liittyvään, genomin DNA:hän kohdistuvien uusien terapeuttisten tai diagnostisten määritysten luomiseen. Tämän löydön tarjolle 20 tuomat tiedot ja kokeelliset apuneuvot ovat hyödyllisiä uusien terapeuttisten aineiden ja tähän reseptoriproteiiniin, siihen liittyvään mRNA-molekyyliin tai siihen liittyvään genomin DNA:hän kohdistuvien uusien terapeuttisten tai diagnostisten määritysten luomiseen.
: 25 Tämä keksintö koskee spesifisesti uutta serotonii- nireseptoria, nimeltään 5-HT4B, koodittavien nisäkkään cDNA- ja genomisen DNA:n kloonien eristämistä. Tämän reseptorin uusi ihmisgeeni, josta tässä käytetään nimeä hp78a, on tunnistettu ja karakterisoitu, ja sarja siihen . 30 liittyviä cDNA- ja genomisen DNA:n klooneja on eristetty.
. ‘ Lisäksi ihmisen 5-HT4B-reseptoria on ekspressoitu Cos-7- soluissa transfektoimalla solut plasmidilla pcEXV-5HT4B. Sen koodittaman 5-HT4B-reseptorin farmakologiset sitoutu-misominaisuudet on määritetty, ja nämä sitoutumisominai-35 suudet luokittelevat tämän reseptorin uudeksi serotonii- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 38 111337 nireseptoriksi. Ihmisen 5-HT4B-reseptoria solun pinnalla ekspressoivia nisäkässolulinjoja on muodostettu, siten perustaen ensimmäiset hyvin määritellyt viljellyt solulin-jat, joilla uutta 5-HT4B-reseptoria voidaan tutkia.
5 Keksintö ymmärretään paremmin tutkimalla seuraavaa kokeiden yksityiskohtia koskevaa jaksoa, mutta ammattimiehet ymmärtävät helposti, että spesifiset kokeet, joista yksityiskohdat esitetään, ovat vain kuvaavia, eikä niiden ole tarkoitus rajoittaa tässä kuvattua keksintöä, jonka 10 määrittävät myöhemmin seuraavat patenttivaatimukset.
Menetelmät ja materiaalit
Kloonaus ja sekvensointi
Ihmisen istukan genominen kirjasto viiva II:ssa (yhteensä n. 1,5 x 106 rekombinanttia, Stratagene, La Jol-15 la, Kalifornia) seulottiin käyttäen päällekkäisiä trans-membraani- (TM-) -oligonukleotidikoettimia (TM 3, 5, 6 ja 7), jotka olivat peräisin Drosophilan serotoniinireseptorigeenistä Dro5HTR (Witz ym. 1990). Päällekkäiset oligo-meerit leimattiin [32P]dATP:llä ja [3ZP]dCTP:llä käyttäen 20 synteesiä DNA-polymeraasin suurella fragmentilla. Hybridisaatio suoritettiin keskivaativissa olosuhteissa: 45 °C, liuoksessa, joka sisälsi 37,5 % formamidia, 10 % dekstraa-nisulfaattia, 5X SSC:n (IX SSC on 0,15 M natriumkloridi, 0,015 M natriumsitraatti), IX Denhardtin liuoksen (0,02 % 25 polyvinyylipyrrolidoni, 0,02 % Ficoll, 0,02 % naudan seerumin albumiini) ja 200 pg/μΐ sonikoitua lohen siittiön DNA:ta. Suodattimet pestiin 45 °C:n lämpötilassa liuoksessa 0,1X SSC, joka sisälsi 0,1 % natriumdodekyylisulfaat-tia, ja valotettiin -70 °C:n lämpötilassa Kodakin XAR-fil-30 mille tehostuslevyn kanssa. Koettimen kanssa hybridisoi-tuvat lambda-faagikloonit plakkipuhdistettiin, ja DNA:ta valmistettiin Southernin blottausanalyysiä varten (Southern 1975, Sambrook ym. 1989). Alikloonausta ja myöhempää Southernin blottausanalyysiä varten DNA kloonattiin 35 pU18:aan (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), pGEM-5Zf:ään BNSDOCID: <FI 111337B1 I j.
39 111337 (Promega, Madison, Wisconsin) tai pBluescriptlI:een (Stra-tagene, La Jolla, Kalifornia). Nukleotidisekvenssianalyysi suoritettiin Sangerin dideoksinukleotidiketjunterminaatio-menetelmällä (Sanger ym. 1977) denaturoiduista kaksijuos-5 teisista plasmiditemplaateista käyttäen Sequenasea (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio), Bst-DNA-sekvensointi-tarvikesarjaa (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia) tai TaqTrack-sekvensointitarvikesarjaa (Promega Corporation, Madison, Wisconsin).
10 Täysipituisen kloonin eristämiseksi ihmisen cDNA- kirjastoja seulottiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen pitoisuutta 1 μΜ kutakin spesifisistä oligo-nukleotidialukkeista, jotka oli suunniteltu eristetyn genomisen kloonin mukaan: "sense"-juosteelta 15 (nukleotidit 512 - 535) 5' TGACCCTGTGCGTGATCAGCATTG 3', ja "antisense"-juosteelta (nukleotidit 945 - 974) 5' GCTTTCTGTTCTCGCTTAAAGATGGAGATG 3* (ks. kuvio 1). Ylävirtaan ja alavirtaan alustavat alukkeet olivat vastaavasti Tm3:n 3'-päästä ja Tm5/Tm6-silmukasta. 1 - 2 pl:a 20 £aagi-DNA:ta cDNA-kirjastoista (7\ ZapII, Stratagene, La Jolla, Kalifornia), joka vastasi n. 106 - 107 pfu:ta, monistettiin liuoksessa, jossa oli 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgClz, 0,01 % gelatiinia, 200 μΜ kutakin dATPttä, dCTPitä, dGTP:tä ja dTTPitä, ja 2,5 yksikköä ,·, 25 Thermus aquaticvksen DNA-polymeraasia (Taq-polymeraasi,
Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, Connecticut). Monistusprofii-lia ajettiin 30 sykliä: alussa 5 minuutin (ts. 1 sykli) denaturaatio 95 °C:n lämpötilassa, sen jälkeen 2 minuuttia 94 °C:n lämpötilassa, 2 minuuttia 68 °C:n lämpötilassa ja 30 3 minuuttia 72 °C:n lämpötilassa, jossa oli 3 sekunnin ketjunkasvatus, jota seurasi lopullinen 10 minuutin ket-junkasvatus 72 eC:n lämpötilassa. PCR-tuotteet analysoitiin etidiumbromidivärjätyissä agaroosigeeleissä, ja mitä tahansa näytettä, jossa nähtiin vyöhyke etidiumbromidivär-35 jätyssä geelissä, pidettiin positiivisena. Sitten eräs BNSD0CID: <FI 111337B1 I > 40 11 13 3 7 positiivinen kirjasto maljättiin ja seulottiin päällekkäisillä 45-meerioligonukleotidikoettimilla, jotka oli täytetty käyttäen [a-32P]dCTP: tä ja [a-32P]dATP: tä ja DNA-polymeraasin Klenowin fragmenttia. Tämä koetin 5 sijoittuu edellä käsiteltyjen monistusalukkeitten välille: "sense"-juosteelta (nukleotidit 864 - 908), 5' CCTGAATGGCATAGTGAAGCTCCAGAAGGAGGTGGAAGAGTGTGC 3' ja "antisense"-juosteelta (nukleotidit 889 - 933), 5' ATGCTTGAGGAGTCTCGAAAGGTTTGCACACTCTTCCACCTCCTT 3' (ks. 10 kuvio 1). Positiiviset cDNA-faagikloonit plakkipuhdistet- tiin, ja pBluescriptissä olevat yhdistelmä-DNA:t saatiin talteen irrottamalla^ Zap II:sta apufaagia R408 käyttäen valmistajan menettelyohjeissa kuvatun mukaisesti (Strata-gene, La Jolla, Kalifornia). Insertin koko varmistettiin 15 restriktioentsyymidigestiodigestioanalyysillä, ja rekom- binantit sekvensoitiin kuten edellä on kuvattu.
Kolmea muuta sarjaa päällekkäisiä oligonukleotide-ja käytettiin yhteensä kolmen osittaisen, mutta päällekkäisen cDNA-kloonin eristämiseksi. Näiden oligonukleoti-20 dien ja vastaavien cDNA-kloonien nimet ovat: hFB9a:sta (Tm3/4-silmukassa) "sense"juoste (nukleotidit 529 - 573) 5' AGCATTGACAGGTACCTTGGGATCACAAGGCCCCTCACATACCCT 3' ja "antisense"-juoste (nukleotidit 554 - 599) 5' CCATGCAT-TTCCCATTCTGCCTCACAGGGTATGTGAGGGGCCTTG 3', hFB44a:sta (Tm 25 2/3-silmukassa) "sense"-juoste (nukleotidit 412 - 456) 5' GTCAGCGTCACCGACCTCATCGGGGGCAAGTGGATCTTTGGACAC 3' ja "antisense"-juoste (nukleotidit 473 - 481) 5' TGGCGATGAAG-ACATTACAGAAAAAGTGTCCAAAGATCCACTTGC 3', hFB41a:sta (amino-päässä) "sense"-juoste (nukleotidit 107 - 150) 5' GGCGCCG-30 ACCCGGTCGCGGGCTCCTGGGCACCGCACCTGCTGAGC 3' ja "antisense"-juoste (nukleotidit 131 - 175) 5' TGGGCGCCGGGCTGGCTGTCACC-TCGCTCAGCAGGTGCGGTGCCC 3'.
Ekspressio
Ihmisen 5-HT4B-reseptorin koko koodittava alue 35 (1 338 bp), mukaan luettuina 27 bp 5'-pään sekvenssiä, BNSDOCID: <FI 111337B1 I ? 4i 111337 josta ei tuoteta polypeptidiä ("5'-UT") ja 50 bp 3’-pään sekvenssiä, josta ei tuoteta polypeptidiä ("3'-UT"), kloonattiin polylinkkerillä modifioidun eukaryoottiekspressio-vektorin pCEXV-3 (Miller ym. 1986), josta käytettiin nimeä 5 EXJ.HR (julkaisemattomia tuloksia), Sali- ja EcoRI-koh-tiin. Konstruktioon tarvittiin kolmen fragmentin ligaatio osittain päällekkäisistä ihmisen istukan genomin klooneista ja sikiön aivojen cDNA-klooneista: aloituskodonista TM 3:een asti 0,5 kb:n NcoI-NcoI-genomifragmenttina (vekto-10 rista peräisin olevaa Sali-kohtaa käytettiin alikloonaami-seen, eikä insertissä itsessään sisempänä 5'-päässä olevaa Ncol-kohtaa), TM 3 yksinään syntetisoitiin päällekkäisinä oligonukleotideina (aikaisemmin määritettyyn cDNA-sekvens-siin perustuen), joissa oli Ncol- ja Kpni-päät, ja TM 3/4 15 -silmukasta lopetuskodoniin ja 3' -UT-alueeseen asti 0,8 kb:n Kpnl-EcoRI-cDNA-fragmenttina. Apinan munuaissoluja (Cos-7) transfektoitiin transientisti plasmidilla hp78a/ EXJ (ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittava ekspressiovekto-ri) DEAE-dekstraanimenetelmää käyttäen (reagenssit saatiin 20 yhtiöltä Specialty Media, Lavellette, New Jersey). Soluja kasvatettiin yksikerrosviljelminä Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (Gibco, Grand Island, New York, 23) kontrolloidussa ympäristössä (37 °C, 5 % C02). Stabiileja solulinjoja saatiin transfektoimalla samanaikaisesti plas-25 midilla hp78a/EXJ (ihmisen 5-HT4B-reseptorigeenin sisältävä ekspressiovektori) ja plasmidilla pGCcos3neo (aminoglyko-siditransferaasigeenin sisältävä plasmidi) LM(tk')-soluihin kalsiumfosfaattitekniikkaa käyttäen. Soluja kasvatettiin kontrolloidussa ympäristössä (37 eC, 5 % C02) yksiker-30 rosviljelminä Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusainees-sa (Gibco, Grand Island, New York), joka sisälsi 25 mM glukoosin ja jota oli täydennetty 10 %:lla naudan vasikan seerumia, 100 yksiköllä/ml penisilliini G:tä ja 100 pg:lla/ml streptomysiinisulfaattia. Sitten stabiileja 35 klooneja selektoitiin antibiootille G-418 (1 mg/ml) resis- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 42 111337 tenssin perusteella kuten aikaisemmin on kuvattu (Wein-shank ym. 1990), ja membraanit kerättiin talteen, ja niiden kyky sitoa [3H]-hydroksitryptamiinia määritettiin kuten edempänä kuvataan (ks. kappale Radioligandisitoutumismää-5 ritykset).
Makrolokalisaatio (PCR/kudostranskriptioekspressio-kokeet)
Ihmisen kudoksia (NDRI) homogenisoitiin, ja koko-nais-DNA uutettiin käyttäen guanidiini-isotiosyanaatti/-10 CsCl-kerrosmenetelmää kuten aikaisemmin on kuvattu (Kingston 1987). cDNAita valmistettiin 5 pg:sta kokonais-RNA:ta satunnaisheksanukleotidialukkeilla (500 pmol) käyttäen Superscript-käänteistranskriptaasia (BRL) 50 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 8,3, joka sisälsi 40 U RNasiinia, 2,5 mM 15 MgCl2:n, 50 mM KCl:n ja 1 mM dNTPrt, 42 °C:n lämpötilassa tunnin ajan. RNaasi H:ta (2 U) lisättiin, inkuboitiin 20 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen kuumennettiin 95 °C:seen 5 minuutiksi ja jäähdytettiin jäillä. Pieni erä ensimmäisen juosteen cDNA:ta laimennettiin (1:5) 50 20 μ1:η PCR-reaktioseokseen (dNTP:iden lopullinen pitoisuus 200 μΜ), jossa oli 1,25 U Taq-polymeraasia valmistajan (Cetus Corp.) toimittamassa puskurissa ja 1 μΜ alukkeita PCR-protokollan mukaisesti (5'- ja 3'-oligonukleotidit olivat samat, joita käytettiin cDNA-kirjastojen seulon-.· 25 taan, ks. edeltä). PCR-monistusreaktio suoritettiin inku- boimalla aluksi 5 minuuttia 95 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen tuli 30 kertaa seuraava sykli: 2 minuuttia 94 °C:n lämpötilassa, 2 minuuttia 68 °C:n lämpötilassa, 3 minuuttia 72 °C:n lämpötilassa, ja sen jälkeen lopuksi 10 minuu-30 tin inkubaatio 72 °C:n lämpötilassa. DNA:n (RNA-uuton mu-·. kana kulkeutuneen) monistumisen kontrolloimiseksi tehtiin samanaikaisesti kontrolli-PCR-reaktiot RNA:11a, joka oli laimennettu samalla tavalla kuin cDNA-näyte. PCR-tuotteet ajettiin 1,5-prosenttisella agaroosigeelillä ja siirret-35 tiin varatulle nailonkalvolle (ZetaProbe, Bio-Rad). Suo- BNSOOCIDkFI 111337ΒΊ I > 43 1 11337 dattimet hybridisoitiin pääteleimatun (Tlr-32P]-ATP:llä)/ PCR-alukkeitten väliin tulevan koettimen kanssa (tämä oli-gonukleotidi oli sama, jota käytettiin ihmisen sikiön aivojen cDNA-kirjaston seulontaan alussa, ks. edeltä), 5 pestiin vaativissa olosuhteissa (50 °C) ja valotettiin -70 °C:n lämpötilassa Kodakin XAR-filmille tehostuslevyn kanssa, kuten edellä on kuvattu.
Mikrolokalisointi (in situ -hybridisaatio)
In situ -hybridisaatioon ja reseptoriautografiatut-10 kimuksiin käytetyt rotat lopetettiin C02:lla ja niiden kaulat katkaistiin, ja aivot irrotettiin ja jäädytettiin kylmässä isopentaanissa. Sitten kudokset kiinnitettiin kryos-taatin istukkaan ja sarjasektioitiin 11 pm paksuisiksi in situ -hybridisaatiota varten tai 20 pm paksuisiksi re-15 septoriautoradiografiaan kryostaatissa, jota pidettiin -20 °C:n lämpötilassa. Leikkeet kiinnitettiin sulattaen poly-L-lysiinillä pinnoitetuille objektilaseille, il-makuivattiin tunnin ajan huoneenlämmössä ja pidettiin -80 °C:n lämpötilassa käyttöön asti.
20 Rotan 5-HT4B-mRNA:n tunnistavat "antisense"- ja "sense"-oligonukleotidit (45-meerit) syntetisoitiin Cyclone Plus -DNA-syntetisaattorilla (Milligen/Biosearch). Koettimet olivat 3'-päästä leimattuja 35S-dATP:llä (1 200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, Massachusetts) spe-25 sifiseen aktiivisuuteen 109 dpm/pg terminaalista deoksinuk-leotidyylitransferaasia (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) käyttäen. Radioleimatut koettimet puhdistettiin Biospin 6 -kromatografiapylväillä (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia) ja laimennettiin hybridisaatiopuskuriin pitoi-30 suuteen 1,5 x 104 cpm/pl. Hybridisaatiopuskurin koostumus oli 50 % formamidi, 4X natriumsitraattipuskuri (SSC, IX = 0,15 M NaCl ja 0,015 M natriumsitraatti), IX Denhardtin liuos (0,2 % polyvinyylipyrrolidoni, 0,2 % Ficoll, 0,2 % naudan seerumin albumiini), 50 mM ditiotreitoli, 0,5 mg/ml BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 44 1 11337 lohen siittiön DNA, 0,5 mg/ml hiivan tRNA ja 10 % dekst-raanisulfaatti.
Kudosleikkeet lämmitettiin huoneenlämpöön tuntia ennen käyttöä. Leikkeet kestävöitiin 4-prosenttisella 5 (w/v) paraformaldehydillä liuoksessa 10 mM fosfaattipusku-
roitu suolaliuos (PBS), pestiin kahdesti PBS:llä, huuhdeltiin DTT:n 5 mM vesiliuoksella, asetyloitiin 10 minuuttia 0,25-prosenttisella (v/v) etikkahappoanhydridillä 0,1 M trietanoliamiinissa ja huuhdottiin kahdesti 2X SSCrllä. 10 Sitten leikkeet dehydroitiin etanolisarjassa, niistä poistettiin lipidit kloroformilla ja ilmakuivattiin. 100 μΐ laimennettua koetinta pantiin kullekin leikkeelle, joka peitettiin sitten Parafilm-liuskalla. Hybridisaatio tapahtui yön yli kosteissa kammioissa 40 - 55 °C:n lämpötilas-15 sa. Seuraavana päivänä leikkeitä pestiin kahdessa erässä 2X SSC:tä tunnin ajan huoneenlämpötilassa, 2X SSC:ssä 30 minuuttia 50 - 60 °C:n lämpötilassa ja lopuksi 0,1X
SSCissä 30 minuuttia huoneenlämmössä. Kudokset dehydroitiin etanolisarjassa ja pantiin Kodakin XAR-5-filmiä vas-20 ten 3 päivän - 2 viikon ajaksi -20 °C:n lämpötilaan, sitten kastettiin Kodakin NTB3-autoradiografiaemulsioon, joka oli laimennettu 1:1 glyserolin 0,2-prosenttisella vesi-liuoksella. Kun oli valotettu 4 °C:n lämpötilassa 2-4 viikkoa, objektilasit kehitettiin Kodakin D-19-kehittees-25 sä, kiinnitettiin ja vastavärjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla.
Mikrolokalisointi (reseptoriautoradiografia) [3H]5-CT:n sitoutuminen suoritettiin seuraavasti. Lasille kiinnitetyt kudosleikkeet (20 pm) tuotiin huoneen-30 lämpötilaan ja esi-inkuboitiin 15 minuuttia puskurissa, jonka sisältö oli 0,17 M Tris-HCl, 4,0 mM CaCl2, 0,01 % (w/v) askorbiinihappo ja 10 pM pargyliini. Objektilaseja inkuboitiin 0,5 nM [3H]5-karboksiamidotryptamiinissa (NEN, 50,4 Ci/mmol) tunnin ajan huoneenlämpötilassa. 5-HT4B-re-35 septorin erottamiseksi muista serotoniinireseptoreista, BNSDOCID: <FI 111337B1 I? 45 1113 3 7 jotka myös sitovat [3H]5-CT:tä, 100 nM PAPP:tä ja 160 nM (-)pindololia käytettiin naamioivina aineina. Koska 5-HT4B-reseptorilla on erittäin korkea affiniteetti metiotepiiniä kohtaan, 5 nM metiotepiini lisättiin radioligandiin [3H]5-5 CT:n 5-HT4B-reseptoriin sitoutumisen eliminoimiseksi. Epäspesifinen sitoutuminen määritettiin lisäämällä 1 μΜ ergo-tamiini radioligandiin. Radioligandin kanssa inkubaation jälkeen objektilasit pestiin kahdesti 20 minuutin ajan edellä mainitussa puskurissa 4 °C:n lämpötilassa, huuhdel-10 tiin nopeasti jääkylmässä vedessä ja kuivattiin kevyessä lämminilmapuhalluksessa. Objektilasit pantiin Hyperfilm-filmiä (Amersham) vasten huoneenlämpötilassa 4-6 viikon ajaksi, minkä jälkeen filmit kehitettiin D-19:llä (Kodak), kiinnitettiin ja ilmakuivattiin.
15 Membraanien preparointi
Ihmisen 5-HT4B-reseptorigeenillä transientisti transfektoitujen Cos-7-solujen annettiin kasvaa 48 tuntia, ja membraanit otettiin talteen kuten aikaisemmin on kuvattu (Branchek ym. 1990). Membraanihomogenaatteja pidettiin 20 jäillä, ja ne käytettiin tunnin sisällä radioligandisitou-tumiskokeisiin. Proteiinikonsentraatiot määritettiin Brad-fordin menetelmällä (Bradford 1976) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.
Radioligandisitoutumistutkimukset . 25 Sitoutumiskokeet suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu käyttäen [3H]5-HT:tä radioligandina (Zgombick ym. 1991). Kahdeksaa [3H]5-HT:n konsentraatiota (1 - 100 nM) käytettiin saturaatiotutkimuksissa; seitsemää konsentraatiota leimaamatonta yhdistettä ja 5 nM [3H]5-HT:tä käytet-30 tiin kilpailukokeissa. Leimaamatonta 5-HT:tä (10 μΜ) käy-tettiin epäspesifisen sitoutumisen määrittämiseen. Määritykset lopetettiin vakuumisuodatuksella (Brandel, Gaithersburg, Maryland), ja jäljellä oleva radioaktiivisuus kvantitoitiin käyttäen Beckmanin 500TA-nestetuikelaskuria 35 (Beckman Instruments, Fullerton, Kalifornia).
BNSD0CID:<FI 111337B1 I > *« 111337 cAMP:n muodostumisen mittaus
Ihmisen 5-HT4B-reseptorigeeniä ekspressoivista tran-sientisti transfektoiduista Cos-7-soluista, valetransfek-toiduista Cos-7-soluista, transfektoimattomista Cos-7-so-5 luista sekä stabiilisti transfektoiduista LM( tk‘)-soluista testattiin 5-HT:n kyky muuttaa solunsisäisiä cAMP-tasoja. Sekä 5-HT:n välittämä cAMP-tasojen inhibitio että niiden stimulaatio arvioitiin näistä kolmesta ehjien solujen preparaatista. Solunsisäistä cAMP:n muodostumista mitattiin 10 radioimmunologisella määrityksellä (cAMP:n radioimmunologisen määrityksen tarvikesarja, Advanced Magnetics,
Cambridge, Massachusetts) käyttäen Zgombickin ym. (1991) hahmottelemaa menetelmää. Radioaktiivisuus kvantitoitiin käyttäen Packard COBRA Auto -gammalaskinta (joka oli va-15 rustettu tulosten redusointiohjelmistolla).
Tulosten analyysi
Sitoutumistulokset analysoitiin epälineaarisella regressioanalyysillä (Accufit ja Accucomp, Lundon Software, Chagrin Falls, Ohio). Chengin-Prusoffin yhtälöä käy-20 tettiin IC50-arvojen muuttamiseksi Kj-arvoiksi. Funktio naaliset tulokset sovitettiin neljän parametrin logistiseen yhtälöön vasteparametrien saamiseksi (EC50, Emax, nH; Inplot, GraphPad, San Diego, Kalifornia). Kaikki kokeet tehtiin vähintään kolmesti.
.· 25 Lääkeaineet Lääkeaineet saatiin seuraavilta yhtiöiltä: [3H]5-HT spesifinen aktiivisuus = 20,4 - 28,0 Ci/mmol New England Nuclear, Boston, Massachusetts), 5-HT, ergotamiini, ergo-noviini, oksimetatsoliini, (±)-pindololi, 5'-guanylyyli- 30 imidodifosfaatti (Sigma, St. Louis, Missouri), 5-CT, DP-5- \ CT, 5-MeOT, 5-MeO-DMT, (±)-a-ME-5-HT, 2-Me-5-HT, trypta- miini, DPAT, DOI, ketanseriini, metysergidi, 1-naftyylipi-peratsiini, PAPP, spiperoni, TFMPP, johimbiini, tsakopridi (Research Biochemical Inc, Natick, Massachusetts), lyser-35 goli, metyyliergoviini (Aldrich Chemicals, Milwaukee, Wis- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 47 11 1337 consin), rauwolsiini (Accurate Chemicals, Westbury, New York), metiotepiini (Biomol Researchs Laboratories, Plymouth Meeting, Pennsylvania). Kaikki muut kemikaalit olivat korkeinta kaupallisesti saatavana olevaa puhtausluok-5 kaa.
Tulokset
Seuloimme ihmisen istukan genomikirj aston keskivaa-tivissa olosuhteissa oligonukleotidikoettimilla, jotka kohdistuivat Drosophilan serotoniinireseptorigeenin, Dro-10 5HTR (Witz ym. 1990), kolmanteen, viidenteen, kuudenteen ja seitsemänteen transmembraanialueeseen. Yhteensä kolme positiivista kloonia eristettiin ja karakterisoitiin Sout-hernin blottausanalyysillä. Kaksi klooneista oli identtisiä ja kolmas oli toisten kanssa päällekkäinen fragmentti.
15 Toinen identtisistä klooneista, nimeltään hp78a, sisälsi 1,8 kb:n EcoRI/Pstl-fragmentin, joka hybridisoitui Dro-sophilasta peräisin olevien oligonukleotidikoettimien kanssa ja joka myöhemmin alikloonattiin pUC-vektoriin. DNA-sekvenssianalyysi osoitti suurimman homologian Dro-20 sophilan 5-HT-reseptorin kanssa, joka on kytketty adeny-laattisyklaasin stimulaatioon (Witz ym. 1990). Tämän ali-kloonin hydrofobisuuskuvaaja osoitti hydrofobisten aminohappotähteiden alueiden tulevan hydrofiilisten aminohappotähteiden segmenttien kanssa vierekkäin, yhtäpitävästi sen . 25 kanssa, että se kuuluu seitsemän transmembraanialuetta si- sältävien, G-proteiiniin kytkettyjen reseptorigeenien su-perperheeseen (Savarese ym. 1992). Lisäksi tämä geeni sisälsi alaniinitähteen ennustetussa viidennessä transmemb-raanialueessa, mikä sopii yhteen sen kanssa, että se kuu-30 luu serotoniinialaperheeseen; tämä alaniinitähde erottaa f serotoniinialaperheen muista katekolamiinireseptoreista (joissa on seriinitähde tässä asemassa, Weinshank ym. 1992b). Tämä klooni kooditti TM4:stä karboksyylipäähän asti, mukaan lukien intronin ennustetusta toisesta solun-35 sisäisestä silmukasta ylävirtaan.
BNSDOCIDkFI 111337B1 I > 48 1 1 13 3 7 Täysipituisen kloonin saamiseksi ihmisen cDNA-kir-jastojen näytteitä, joissa oli noin 1,5 x 106 rekombinant-tia, seulottiin polymeraasiketjureaktiolla käyttäen spesifisiä oligonukleotidikoettimia genomisesta kloonista mää-5 ritetystä sekvenssistä (ks. Materiaalit ja menetelmät). Positiivisen sisältävä ihmisen sikiön aivojen cDNA-kir-jasto (Stratagene, La Jolla, Kalifornia) ZapII:ssa (n. 1,5 x 106 rekombinanttia) seulottiin tavanomaista plak-kihybridisaatiota käyttäen keskelle tulevalla koettimella 10 (ks. Materiaalit ja menetelmät), ja tuloksena saatiin eristetyksi yksi positiivinen vajaarnittainen cDNA-klooni, hFB9a, johon sisältyi TM3:sta lopetuskodoniin asti ja joka oli päällekkäinen alkuperäisen genomisen klooni, hp78a:n, kanssa (introni Tm3:n ja Tm4:n välillä puuttui mRNA:n sil-15 mukoitumisen takia). Koska tämä cDNA-klooni ei ollut täysimittainen, sama sikiön aivojen cDNA-kirjasto seulottiin koettimella, joka oli peräisin cDNA-kloonin hFB9a eniten ylävirtaan sijaitsevasta ei-konservoituneesta alueesta, joka vastasi Tm3/4-silmukkaa (ks. Materiaalit ja menetel-20 mät). Tästä seulonnasta saatiin eristetyksi toinen positiivinen, mutta vajaamittainen cDNA-klooni, hFB44a, johon sisältyi vain TM2:sta TM3:een ja joka oli päällekkäinen cDNA-kloonin hFB9a kanssa TM3:n sisällä. Jälleen 5'-cDNA~ kloonien saamiseksi ihmisen sikiön aivojen cDNA-kirjasto .·. 25 seulottiin koettimella, joka oli peräisin cDNA-kloonin hFB44a eniten ylävirtaan sijaitsevasta ei-konservoituneesta alueesta, joka vastasi TM2/3-silmukkaa (ks. Materiaalit ja menetelmät). Tästä seulonnasta saatiin eristetyksi toinen positiivinen, mutta vajaamittainen cDNA-klooni, 30 hFB41a, johon sisältyi osa aminopäätä ja siitä TM3:een asti, mutta josta puuttui noin 20 aminohappoa aloitusme-tioniitähteestä lähtien (samaan tapaan tämä klooni oli päällekkäinen cDNA-kloonin hFB44a kanssa TM2:sta TM3:een). Lopuksi täydellisen aminopään saamiseksi ihmisen istukan 35 genomikirjasto seulottiin vaativissa olosuhteissa koetti- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 49 111337 mella, joka oli peräisin cDNA-kloonin hFB41a ei-konservoi-dusta aminopään alueesta. Yhteensä 2 erilaista positiivista kloonia eristettiin tästä genomiseulonnasta, ja ne karakterisoitiin Southernin blottausanalyysillä. Toinen 5 klooni edusti 5-HT4B-reseptorin pseudogeeniä (julkaisemattomia tuloksia), kun taas toiseen genomiklooniin sisältyi aloitusmetioniinista TM3:n ja TM4:n väliseen introniin asti. 0,5 kb:n NcoI/NcoI-fragmentti, johon sisältyi aloitusmetioniinista TM3:ssa olevaan Ncol-kohtaan asti, alikloo-10 nättiin pGEMriin.
Täydellinen täysipituinen geeni konstruoitiin kahdessa osassa: Ensimmäiseen osaan kuului, että ligatoitiin kaksi fragmenttia kahdesta cDNA-kloonista ja synteettinen kaksijuosteinen oligonukleotidi pBluescriptiin, ja toiseen 15 osaan kuului, että aminopään sisältävä genomifragmentti ja fragmentti ensimmäisen osan konstruktista ligatoitiin eks-pressiovektoriin. Konstruktion ensimmäiseen osaan kuului, että ligatoitiin 0,4 kb:n SaiI/Ncol-fragmentti cDNA-kloo-nista hFB41a (Sali-kohta on peräisin vektorista, kun taas 20 Ncol-kohta on Tm3:ssa), emäspartutumaan saatettu komple mentaarinen kaksijuosteinen oligonukleotidifragmentti, jossa oli suunnitellut Ncol- ja Kpnl-päät (n. 100 bp, sekvenssi perustuu tietoihin cDNA-klooneista hFB9a, hFB44a ja hFB41a), ja 0,8 kb:n Kpnl/EcoRI-fragmentti cDNA-kloonista ,·. 25 hFB9a (EcoRI on peräisin vektorista, kun taas Kpnl-kohta on TM3/4-silmukassa) pBluescriptiin, joka oli digestoitu Sällillä ja EcoRI:llä. Konstruktion toinen osa suoritettiin ligatoimalla 0,5 kb:n genominen Sall/NcoI-aliklooni, johon sisältyi aloitusmetioniinista TM3:een asti (Sali on 30 peräisin vektorista, kun taas Ncol on TM3:ssa; tämä frag-mentti saatiin osittaisella digestiolla Ncolillä ja täydellisellä digestiolla Sällillä), 0,9 kb:n NcoI/EcoRI-fragmentin kanssa, jossa oli synteettinen oligonukleotidi ja cDNA ensimmäisen osan konstruktista, (johon sisältyi BNSDOCID:<Fl 111337B1 I > 111337 50 TM3:sta lopetuskodoniin asti), ekspressiovektoriin, joka oli digestoitu Sällillä ja EcoRl:llä.
Genomisen DNA:n ja cDNA:n täysipituinen konstruk-ti ekspressiovektorissa (jota nimitettiin hp78a/EXJ:ksi) 5 sisältää 1 335 bp:n avoimen lukukehyksen (ja 27 bp:tä 5-UT:tä ja 50 bp:tä 3’-UT:tä) ja koodittaa proteiinia, joka on pituudeltaan 445 aminohappoa ja suhteelliselta molekyylimassaltaan n. 49 000 daltonia. Proteiinin hydro-patia-analyysi on yhtäpitävä otaksutun seitsemän membraa-10 nin läpäisevän domeenin topografian kanssa, mikä viittaa G-proteiiniin kytkettyyn reseptoriperheeseen. Alustava sekvenssianalyysi paljasti, että klooni hp78a/EXJ oli eniten sukua serotoniinireseptorille, koska se sisälsi joukon konservoituneita rakennepiirteitä/aminohappotähteitä, joi-15 ta tavataan serotoniinireseptoriperheen jäsenillä, mukaan luettuina konservoituneet asparagiinihappotähteet TM2:ssa ja TM3:ssa, Asp-Arg-Tyr-sekvenssi TM3:n lopussa, konser-voitunut alaniinitähde viidennessä transmembraanialueessa sekä konservoituneet proliinitähteet Tm 4-7:ssä (Hartig 20 1989, Hartig ym. 1990). Muita tämän ihmisen 5-HT4B-resepto- rigeenin piirteitä ovat kahden potentiaalisen N-sidoksel-lisen glykosylaatiokohdan esiintyminen aminopäässä (aspa-ragiinitähteet 5 ja 66, kuvio 1) ja useiden sellaisten seriinien ja treoniinien esiintyminen karboksipäässä ja ,·, 25 solunsisäisissä silmukoissa, jotka voivat toimia potenti- aalisina proteiinikinaasien fosforylaatiokohtina.
5-HT4B-reseptoria koodattavan RNA:n jakautuminen ihmisen kudoksissa
Ihmisen eri kudoksista eristettyä kokonais-RNA:ta 30 muutettiin yksijuosteiseksi cDNAiksi käänteistranskriptaa-·.. silla satunnaisalukkeita käyttäen. cDNArta monistettiin PCRrllä ihmisen 5-HT4B-reseptorigeenille spesifisiä PCR-alukkeita käyttäen. PCR-tuotteet ajettiin 1,5-prosentti-sella agaroosigeelillä, blotattiin nailonkalvoille ja hyb-35 ridisoitiin alukkeiden välisten geenispesifisten oligonuk- BNSDOCID: <F! 111337B1 I > 5i 111337 leotidien kanssa. Hybridisaation jälkeen blotit pestiin vaativissa olosuhteissa. Positiivinen kontrolli oli geeni-spesifinen rekombinanttiplasmidi; tislattu vesi toimi negatiivisena kontrollina, mukana kaikki reagenssit paitsi 5 templaatti-cDNA, -RNA tai -plasmidi. RNA-näytteiden, joita ei ollut käsitelty käänteistranskriptaasilla, PCR-monistus ja Southernin blottaus olivat negatiivisia.
Taulukko 1 5-HT4B-reseptori-mRNA:n lokalisaatio ihmiskudoksissa 10 +++ = tumma ++ = kohtalainen + = näkyy, mutta himmeänä - = ei näy
15 Ihmiskudokset 5-HT4B mRNA
aanns^sss=aaaa^B=
Eturauhanen III + n Eturauhanen IV +
Eturauhanen V + k 20--—
Kiveä + + +
Virtsarakko + + +
Endometrium (kohtu) ½ + 25 Myometrium (kohtu) ^ +
Sydämen eteinen k +
Suolilieve +
Nenän limakalvo + + 30--
Penis + +
Iho (-)
Kieli (-) BNSDOCIDkFI 111337B1 I > 52 111337 hp78a-transkriptien ekspressiota analysoitiin monistamalla cDNA:ta, joka oli saatu eri ihmiskudoksista eristetystä RNA:sta (käänteistranskriptio-PCR eli RT-PCR). Pystyimme tutkimaan selektiivisesti funktionaalisen hp78a-5 kloonin (eikä pseudogeenin) jakautumista kudoksiin käyttämällä geenispesifisiä PCR-alukkeita ja geenispesifisiä alukkeiden välisiä oligonukleotidikoettimia, joilla ei saatu tunnistetuksi pseudogeeniä (tuloksia ei esitetä). Osoitimme lähtö-RNA:ta olevan vertailukelpoiset määrät 10 kaikista kudoksista suorittamalla kontrolli-RT-PCR:t aluk-keilla, jotka kohdistuivat kohtalaisen korkealla tasolla konstitutiivisesti ekspressoitaviin geeneihin, aktiiniin ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasiin (Clontech, tuloksia ei esitetä). 5-HT4B-reseptoria koodittavaa mRNA:ta 15 (hp78a) ekspressoidaan runsaasti aivoissa ja niukasti jou kossa perifeerisiä kudoksia (munuainen, maksa, haima, eturauhanen, kohtu, suolilieve ja perna). Perustuen 5-HT4B-re-septorin farmakologiseen profiiliin ja sen suhteeseen aikaisemmin karakterisoituihin 5-HT-reseptoreihin, jotka vä-20 littävät sileän lihaksen rentoutumista, testasimme RNA-ekspression joukosta muita kudoksia. Mielenkiintoisesti havaitsimme korkeita tasoja 5-HT4B:n mRNA:ta sepelvaltimossa ja eri alueilla ruoansulatuskanavaa, mukaan lukien mahalaukku, rakko, laskeva paksusuoli ja sykkyräsuoli, mikä • t 25 sopii yhteen 5-HT4B:n mahdollisen roolin kanssa sileän li haksen relaksanttireseptorina (kuvio 3).
In situ -hybridisaatiotutkimusten tulokset (taulukko 2) osoittivat, että 5-HT4B-mRNA:n jakauma on päällekkäinen 5-HT4B-reseptorin kanssa joillakin alueilla. Intensii-30 visimmät hybridisaatiosignaalit havaitttiin neuroneissa ... talamuksessa, hippocampuksen edemmässä rudimentissa ja CA3:ssa hippocampuksessa. Muihin hybridisaatiosignaaleja sisältäviin alueisiin kuuluvat septum, hypotalamus, sent-romediaalinen amygdala ja akveduktia ympäröivä harmaa ai-35 ne. Mielenkiintoisesti kaksi aluetta, joissa nähtiin voi- BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 53 1 11337 makas reseptoriinsitoutumissignaali, linssitumakkeen pallo ja mustatumake, eivät sisältäneet 5-HT4B-hybridisaatiosig-naaleja, mikä viittaa 5-HT4B-reseptorien presynaptiseen sijaintiin näissä kahdessa toistensa sukuisessa rakenteessa.
5 [3H]5-CT:n spesifinen sitoutuminen havaittiin monil la alueilla rotan aivoissa. Kun oli inkuboitu 1 μΜ ergo-tamiinin kanssa, tämä sitoutuminen eliminoitui täysin. PAPP:n ja (-)pindololin lisääminen radioligandiin vähensi huomattavasti sitoutumista monilla alueilla, erityisesti 10 aivokuoren syvissä kerroksissa, hippocampuksessa, dorsaalisella keskiviivalla ja selkäytimessä. Alueet, joissa [3H]5-CT:n sitoutuminen säilyi naamiointiaineiden lisäämisen jälkeen, olivat aivokuoren kerrokset 1-3, septum, linssitumakkeen pallo, hypotalamus, sentromediaalinen 15 amygdala, akveduktia ympäröivä harmaa aine ja colliculus superior. Kaikilla näillä alueilla radioligandin sitoutumisen esti 5 pM metiotepiinin lisäys inkubaatio-oloihin, mikä viittaa siihen, että havaittu sitoutuminen voidaan viedä 5-HT4b-reseptorien tiliin.
« ♦ « BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 54 1 113 3 7
Taulukko 2 5-HT4B-reseptorin/mRNÄ:n lokalisaatio rotan aivoissa
Alue t3®] 5—CT:n 5-HT*,
5 sitoutumis- BXRNA
__kohdat__
Isoaivokuoren kerrokset I, + + II ja III___ _Septum__+__+ ^ Linssitumakkeen pallo + ~
Stria terminaliksen bed nucleus_;__*_ +_
Talamuksen tumakkeet + +
Hypotalamuksen tumakkeet + +
Amygdala (sentromediaali- + -f nen kompleksi) _Hippocampus*__+__+
Keskinen harmaa-aine + +
Mustatumake + _
Colliculus superior + + 20 Dorsaalinen aivokuori + ^ colliculus inferior
Pikkuaivot _ 4.
A Erittäin pieni määrä sitoutumiskohtia reseptoriautoradio- . 25 grafian mukaan, kuitenkin in situ -hybridisaatiolla ha- • < vaittiin kohtalaisia tasoja 5-HT4B-mRNA~transkriptejä: CA3, DG, CAI. nd = ei tehty.
Uutta ihmisen 5-HT4B-reseptoria koodittavaa geeniä 30 transientisti ekspressoivia apinan munuaissoluja käytet-tiin farmakologiseen arviointiin. Transientisti transfek-toiduista Cos-7-soluista kerätyissä membraaneissa nähtiin korkea-affiniteettinen, saturoituva [3H]5-HT:n sitoutuminen. [3H] 5-HT: n saturaatiotulosten epälineaarisesta analyy-35 sistä saatiin tasapainodissosiaatiovakio (Kd) 8,5 ± 0,8 nM
BNSDOCID: <FI 111337B1 l > 55 111337 ja sitoutumiskohtien tiheys (Bmax) 6,6 ± 0,8 pmol/mg proteiinia. [3Hj5-HT:n spesifinen sitoutuminen oli yli 90 % ko-konaissitoutumisesta radioligandikonsentraatiolla, joka oli yhtä suuri kuin Kd-arvo. 100 μΜ Gpp(NH)p, GTP:n hydro-5 lysoitumaton analogi, vähensi merkitsevästi (75 %) [3H]5-HT:n korkea-affiniteettistä sitoutumista transienteistä transfektanteista preparoituihin membraaneihin. Transfek-toimattomilla isäntäsoluilla ei nähty [3H]5-HT:n spesifistä sitoutumista.
10 Vasta eristetyn serotoniinireseptorigeenin farmako logisen identiteetin arvioimiseksi edelleen kloonin hp78a tarkat sitoutumisominaisuudet määritettiin [3H]5-HT:n kor-kea-affiniteettisen sitoutumisen kilpailun epälineaarisesta analyysistä. [3H]5-HT:n spesifinen sitoutuminen syrjäy-15 tyi monofaasisesti (nH = 1) täysin useiden rakenteeltaan erilaisten serotonergisten ligandien vaikutuksesta. Näiden yhdisteiden tehokkuusjärjestys spesifisen [3H]5-HT:n sitoutumisen syrjäyttämisessä oli 5-CT > metiotepiini > meter-goliini - DHE = 5-MeOT > 5-HT > 2-Br-LSD > DP-5-CT > DPAT 20 > sumatriptaani > ICS 203 930 (taulukot 3 ja 4). Usealla tora jyvä johdannaisella nähtiin korkea affiniteetti (K* < 20 nM) kloonin 5-HT4B-reseptoria kohtaan, ja niihin kuuluvat metergoliini, dihydroergotamiini, ergotamiini ja mesuler-giini. Serotonergisiin ligandeihin, joilla nähdään ala-25 tyyppiselektiivisyyttä ja joilla havaitaan matala affiniteetti (K± > 100 nM) kloonia hp78a kohtaan, kuuluvat DPAT (5-HT1Ä), sumatriptaani (5-HTlD), ketanseriini (5-HT2) ja tsakopridi (5-HT3). Substituoiduilla bentsamideilla (ICS 203 930, MDL 29 429, tsakopridi), yhdisteillä, jotka ovat 30 aktiivisia funktionaalisella 5-HT4-reseptorilla, nähtiin .. myös matala affiniteetti (Κλ > 500 nM) 5-HT4B-reseptoria kohtaan. Muilla biogeenisillä amiineilla ei nähty huomionarvoista affinitteetia (Kf > 1 μΜ) kloonia hp78a kohtaan (taulukot 3 ja 4).
BNSD0CID: <FI 111337B1 I > ^ 111337
Taulukko 3
Serotonergisten ligandien näennäiset dissosiaatio-vakiot (KA-arvot) kloonia hp78a kohtaan
Membraaneja inkuboitiin 5 nM [3H]5-HT:n kanssa seit-5 semän konsentraation (1 OOO-kertainen konsentraatioiden vaihteluväli) leimaamattomia kilpailevia yhdisteitä ollessa läsnä 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa. Epäspesifinen sitoutuminen määriteltiin 10 yM leimaamattomalla 5-HT:llä.
Affiniteettivakiot (I^-arvot) laskettiin IC50-arvoista epä-10 lineaarisella regressioanalyysillä Chengin-Prusoffin yhtä löä käyttäen. K^-arvot ilmaistaan keskiarvoina ± keskiarvon keskivirhe 2-5 määrityksestä.
Yhdiste__K, (nM) _ 5-karboksiamidotryptamiini 0.93 + 0.20 15 -———————. -------
Metiotepiini___3.7 + 1.0_ 5-metoksitryptamiini 5.1 ± 0.4
Metergoliini 6.4 1 1.4_
Dihydroergotamiini_. _6.910.9 20 5-hydroksitryptamiini_ 8.1 ± 1.3_
Ergotamiini 15
Mesulergiini 18 i 5_
Bufoteniini_ 26_ 2-bromi-LSD 30 t 10_ . 25 Dipropyyli-5-karboksiamido- 37+21 » * ‘ tryptamiini_:__ 5-metoksi-N,N-dimetyyli- 43 tryptamiini
Ritanseriini__45 + 10_
Klotsapiini 78+10 30 --e-“---Γ—---
Metysergidi__83 + 5_ ** 1-naftyylipiperatsiini__83 i 19 _
Spiperoni___110 i 17_
Syproheptadiini____123 ± 16_
Bromikriptiini 137 ± 2 35 -——---——-— —— "
Tryptamiini__149 + 20 im-kloorifenyylipiperatsiini·__312___ BNSDOCID: <FI (11337B1 I > 57 11 1337
Taulukko 3 (jatkuu)
Yhdiste__Kj_ (nM)_ 8-hydroksi-N,N-dipropyyli- 466 ± 46 5 aminotetraliini _ C>i-metyyli-5-hydroksitryp- 509 .
torniini 5-bentsyylioksitryptamiini _729_
Sumatriptaani_ 951 i 118_
Ketanseriini 1334 ± 241
Johimbiini 2850 ± 354 2-iuetyyli-5-hydroksitrypta- 3400 miini
Pindololi > 5000
Tsakopridi >5000 * « 6 BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 58 11 1337
Taulukko 4
Serotonergisten ligandien aikaansaama syrjäytymis-prosentti spesifiselle sitoutumiselle membraaneihin, jotka olivat peräisin soluista, jot-5 ka ekspressoivat transientisti hp78a-geeniä
Membraaneja inkuboitiin 5 nM [3H]5-HT:n kanssa yhden konsentraation leimaamatonta kilpailevaa yhdistettä ollessa läsnä 30 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa. Epäspesifinen sitoutuminen määriteltiin 10 μΜ leimaamattomalla 5-HT:llä.
10 __
Yhdiste Testattu konsent- Inhibitiopro- raatio sentti _d-LSD__30 nM__77_ _BRL 29429__100 nM__8_ 15 _ICS 203930__1000 nM__10
Spiroksatriini 30 nM 12
Propanololi 100 nM 0 _PAPP__100 nM__21 CGS 12660B 100 nM 15 20---
Kipatsiini 1QQ nM__3_
Rauwolsiini 100 nM 8 _DOI__100 JQM -__20
Oksimetatsoliini 10 nM 6 25 Dopamiini 30 nM__0_ •
Norepinefriini 30 nM 0
Histamiini 100 nM 10 30 Kloonin hp78a kykyä kytkeytyä toiminnallisesti ade- „ nylaattisyklaasiin testattiin käyttäen kokonaisia Cos-7- soluja, jotka ekspressoivat transientisti hp78a:ta koodit-tavaa geeniä. Sekä perustason cAMP:n vapautumisen stimulaatiota että FSKrlla stimuloidun cAMP-vasteen inhibitiota 35 tutkittiin. 5-HT:llä (1 pM) ei ollut vaikutusta sen enem- BNSD0C1D: <FI 111337B1 I ? 59 111ό3 7 pää perustasoiseen kuin FSK:11a stimuloituun adenylaatti-syklaasiaktiivisuuteen transfektoimattomissa tai vale-transfektoiduissa Cos-7-soluissa (tuloksia ei esitetä), mikä viittaa siihen, että transfektoimattomissa soluissa 5 ei ekspressoida endogeenisia adenylaattisyklaasiin kytkettyjä serotoniinireseptoreita. 5-HT:n (1 μΜ) lisäys trans-fektoiduille Cos-7-soluille sai aikaan 7-kertaisen stimulaation cAMP:n vapautumisen perustasossa (0,053 + 0,04 pmol/ml/10 minuuttia); sen enempää perustasoisen kuin 10 FSK:11a stimuloidun cAMP:n vapautumisen inhibitiota ei havaittu. Inkubointi samanaikaisesti 1 μΜ FSK:n ja 1 μΜ 5-HT:n kanssa sai aikaan synergistisen cAMP-vasteen, mikä johti solunsisäisen cAMP:n kertymisen 75-kertaiseen stimulaatioon (tuloksia ei esitetä). 5-CT ja 5-MeOT olivat myös 15 voimakkaita agonisteja 1 μΜ konsentraatiossa, ja mielenkiintoista kyllä, 5-CT vaikutti olevan voimakkaampi kuin 5-HT itse, kun taas 8-OH-DPAT stimuloi perustasoista cAMP-vastetta vain noin 2-kertaisesti 1 μΜ konsentraatiossa. Metysergidi, metergoliini ja metiotepiini antagonisoivat 20 konsentraatiossa 10 μΜ 5-HT-vasteen lähes täydellisesti, kun taas ICS-205-930:llä oli heikko inhiboiva teho konsentraatiossa 100 μΜ. Täydet annos-vaste-käyrät määritettiin 5-HT:lle ja 5-CT:lle. 5-HT:llä nähtiin EC50-arvo 992 ± 345 nM ja maksimaalinen stimulaatio (Emax-arvo) 2 191 ± ·' 25 715 % perustason cAMPm vapautumisesta (n = 4) , kun taas 5-CT:llä oli korkeampi affiniteetti (EC50 = 75 ± 15 nM) , mutta samaa luokkaa Emax (2 029 ± 47 % perustason cAMP:n vapautumisesta, n = 4) (taulukko 5, kuviot 4 ja 5). 1 BNSDOCIDkFI 111337B1 I > « 60 111337 Αι Ί I '1 ' ΤΗ
-P
4->
G
n) iiCii gw ° 10 ° o ,η 2 -Η-ΗΦ-UO aio 1" - _** 1 V (0 0 d 3 -h ω μ *-< Ή +, „ H g -H 3 44 44 04 o | 1 rö S -H ® O +· -H +1 o +, m ε -h 4J -h λ § ;d „ 0 03 M E -H ? Λ ® 2 Ϊ rt in Φ G φ Φ .£ H ·Η η««Λ ^ k 3 m ϋ o C ΚΛ ft 4-> CO £ H -H 15
m co ai -h \ 10 H
U t> O S Ή φ ----------- ® 3 ö s ε γη 14 τ-ί £ \ ί—ί o ^ (0 rH " χ; in to o ,-.
•H $ rö Q H njvoinou· - 4-) W:f0jsiHW <0 * o raWwc&i f-c o m o o 4 « S '5 +i 10 1 +,+,+,0+,0°°° +i ö d t5 λ; s p p.
Φ Φ ;C m :¾ tnnsr^eo r- ^ •nros^Ln ί m v <n 1 ,+ 2 . G ° H § M * 1 ^ 5 ίη S3 <β —Τ’ ^ ω s ; js° g °*___________ 44 jjj ra φ o' « ~-- S -I 1 S g I 555^555¾¾¾ .+ :(Ö G X] 3 S r4rHr-40000r+0^4 ί _<___________ 4 ! J ί « “ s § I $ s s Ο P ° G 4-) «J r) -+ ·+ O' ^ ^ Ω ^ -. σ> ·Ρ G G‘ Q 04 , 2, u φ Η ί ή ·4 ·4 ω +· _ .+ "5 G ζΡ μ, 44
Jj Λ ζ ιί S ·η ω :π u Φ 2! en ^ A 1 λ!''1? H >‘H G IISOMOQJ-P^ft -H .+ -H . > Q ·+ in in I Ν <1) tri 4-> e , q H 1 4J rö £ (Ö ΙΩΐη ΐ, U] + O O .3 ^
Ή o p 5 C ·1 2 w ^ S Xl n S
0^ rrt *H n Ή Αί f» J-' ^ rM CQ
IV m S 1Φ Si (D <D (D l *** m fö j-3 H o «c Masses :«J .+ d 4.) Γ-} ö +) + m P. ra ·η S S % 3 ^ P ®--——------- Ö >1 o 3 £ •H :Rj (j m · 5 o υ -h <ö d * O :(Ö k" ® 5
H (O g) -H rä O O
O Ή 0} ·+ O -+ tJ) 14 μ .+ 44 -H 4J (β m O -|—, -M 4-> n5 -PJ .
h i) rt ui ui ϋ ζ e;
H Pl φ <Ö d ^ (04J P -H
(β Φ C M 3 M ·+ -H -+ ή ra + Φ -5 £ ro x π n +d φ φ a) e -h ö 2 .5 d '4 2
d,f^-H2WC0 d) § .H 4J
S«+(0Sl! C-P -H (ö . inSfJcoOJOCO. e Ή -H P » o ί “1 ,1 K 2 ^ li Vl Γ-, I) 0) O O ei) 44. e
ή M Ό Cn a G-P
0®G:5g4P-H (Q e + -H <L)E
jiHS’ri^uSr'jJ k h h e- m< u^SJgJto^ e 0 I ra i M o . dl h a -h a — m
GSHg4J4-)-H(ÖO
(ö 5j ,2 2] d) Φ·—i -r, μ H0-H0CD4-)04Jft 11 BNSD0C1D: <FI 111337B1 I ? fil 111337 61
Stabiilisti transfektoiduissa LM(tk‘)-soluissa 5-HT tuotti maksimistimulaation, joka oli 400 % cAMP:n perus-tasoisesta kertymisestä. Sen enempää perustasoisen kuin FSK:lla stimuloidun cAMP:n vapautumisen inhibitiota ei 5 havaittu. Eri testattujen yhdisteiden affiniteettiarvoista esitetään yhteenveto taulukosssa 6. Yleensä funktionaalisista tutkimuksista saadut agonistien EC5q-arvot olivat noin yhtä suuruusluokkaa alemmat kuin sitoutumismäärityk-sistä saadut K^arvot. 5-CT ja 5-MeOT olivat voimakkaita 10 agonisteja, joilla oli 5-HT:n kanssa vertailukelpoinen ominaisaktiivisuus, kuitenkin 5-CT:llä oli merkittävästi korkeampi affiniteetti (noin 10-kertaisesti) kuin 5-HT:llä. 8-OH-DPAT oli heikko agonisti, joka tuotti noin puolet 5-HT: n aikaansaamasta maksimi vasteesta. Kaikki tes-15 tatut torajyväalkaloidit toimivat hiljaisina antagonisteina, joiden KB-arvot eivät poikenneet merkitsevästi sitoutu-mismäärityksissä saaduista ^-arvoista. Metiotepiini oli myös voimakas hiljainen antagonisti (Taulukko 6) • < 1 BNSDOCID: <FI 111337B1 I > · 62 Ί11337 (O G G · <H> I 1. I I μ 3 3 ·1 G μ <0 iO G 3 +> μα«<ι>ο6μ<ϋθμ •H(OS(DoO>»tOHM(0 0 > < μ -μ ο) μ --- .......ί- , , μ 3ομΰμα)—'£μ m ^ 3 ·η a> 1 j0 μ ε v βωΑί^ο^μ M μ S' S ä S S g Ϊ ; -H 5 g ! -Η Ή -Η Ή I.H “ 1 “SS”&SS|'S .5 S S ΐί S Ϊ 'S ϋ § <U m i2 Tn 2 S ί 01 “ d .2 -Η -Η -Η -Η -P -H Cn ^310.^(50)^(0 SI 0CCC+JCn3
^^(0ΐ]ϋε>μ0 .5 Jj OOOO'HO+J
•H Cömsv Ur-|Oc<0 dv Cn Cr> Oi O' (0 Oi S
μ 5a-H°G O -H s I o 1 ^cc<o^< " ί C S j S “ ί C s ------— 3“°.Ϊ8£·530β " · 5 « ä s ^ s “ g λ • 1 .3 έ: S s, · 3 S !
s - 8 ? I S I c g S
S !,“8 ij°1 —T------- 3 g ω μ μ <3 ·Η .¾ ,-, .5 ? 'd Ή ·>-} ·>Η (0 G --Ι μ 10 22° ro S ^^SSSeiiio'w 1i« H hm « μ G (0 (0 5 0) a ,-. r, -H c +t Λ δβΰ,,μ·1»1^ 5 S μ +l 2 + + o p c di d Γ-μ^ο 1 -H w ^ o 2
x g H § ^ o S a W§S SO VDrH
t 8^β®Ρ. fc**# § h H “ 10 a pace^loj^c o, g >mC ------- ^3o)°®°SS s· 3 _ o. s •H m s :(0 (0 +ι Λ; -J° S O'" »1 ti <o 5 μ ^ μ “** £ σι 5 ro ^ h h ΡΓ,ω-Η(0^0)<®(0··(0,Η — +i +l μ G to p i :<0 m 1o c g S +1 +' -H +i i 31 i s s g .s § g $ o . p <1 s o g£33wa,säM!>g> 1 H s s vs 3 a " § d e > 3 s i 1 -s :‘ 1 S5 5 S 8 S S > ^ H .2 § § 8^ » ^ ^------- I S 5 =s r-1 s s 3 < ;
Ε&φ3|δ„δ«ββ§ H h S
-SpBtijisgig ia s S|^3;H-§j2^g<'s 1 J,a^^g ^ Λ i 1 a1 "s «5 -h s . a I « s · vOOJEjGo^Wa^OJO «0 ro μ M μ . o ^ o to 1h c ^ o «μμ^ίμίο μμ-Η x to g -h cd ton · to c <o μ L_^_____ __ __ i >3><l)6MC1HH·—' ·Η(0(0 3 I W I μ O G ** :(0 (0 ·Η μ ·Η η &< ·π a ιομ ο η μ λ μ μ c 3ξΒ2^;οοΐΚ(ομμσο (0«Λί<33<ια)00)0)σ) H U ·Η U £ μ = in . W ·η J0 Μ (0 5NSDOCID: <FI 111337Β1 | > 2 111337 (Ο Ή -Η Ή -Η Ή 3 4-) 4-> 4-) 4-) 4-> β 3 <0 (Ο 10 UI (0 φ (Ο ·Η -Η ·Η -H -rt β -r4 β β β β β Η > Ο Ο Ο Ο Ο
10 -H CO Ö) CO
β -r4 (0 <0 (0 rö ιΟ HP Ρ Ρ 4-) 4-4 4-> a Μ β β β β β <0 s, < <, < λ: ο Η Π τΓ Η Η j»!? +1 +1 +1 +1 +1 Η Ν Ο Ο Ο
r-t H Ci «M
ΓΜ -I-— ——-——- ti
X
in 0 ίϋ •η (ΰ # ϊ ϋ « ο ο ο ο ο *τ g 8 (0 -Ρ Ο 10 Μ <0 a >
S
c «M*
O
—s tn 3 o
l P
rd •n VO 1 2 BNSD0CJD: <FI H1337S1 I >
.OB
3 Φ β 2 'ö *H
d β -H M -H 4J
2 -H -H I S -H a φ <0 a vt S co -h E-1 Φ Φ m U n ^
M 4-) | Φ M
: WJ O ' H -rt . 110 -H i'J 3 ε ►3 4-) 10 o Φ Φ 44 s s cq 64 11 1337
Tulosten tarkastelu
Olemme kloonanneet DNA:n, joka edustaa uutta ihmisen serotoniinireseptoria (hp78a eli 5-HT4B) ihmisen aivojen cDNA:sta ja genomin DNArsta. Kaikista tunnetuista 5 G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien sekvensseistä (EMBL/GenBank-tietokanta), suurin homologia oli kloonin hp78a reseptorigeenin ja Drosophilan 5HTR-serotoniinire-septorigeenin (Witz ym. 1990) välillä. Kloonin hp78a päätellyn aminohapposekvenssin vertailu tunnettujen G-pro-10 teiiniin kytkettyjen reseptorien kanssa osoittaa suurimman identtisten aminohappojen tiheyden olevan transmembraani-alueissa. Näissä TM-alueissa kloonin hp78a identtisyyspro-sentti on 57 % verrattaessa Dro5HTRlreen, 39 - 53 % sero-toniinireseptorialaperheen kanssa (ks. kuvio 2), 40 - 50 % 15 adrenergisten reseptorien alaperheen kanssa, 44 - 49 % do-pamiinireseptorialaperheen kanssa, 37 - 41 % histamiinire-septorialaperheen kanssa, 27 - 28 % peptidireseptorien kanssa ja 32 - 33 % adenosiinireseptorien kanssa. Sekä tämän ihmisen hp78a-sekvenssin kohdennus että identtisyys-20 prosentti muiden G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien kanssa tai muiden serotonergisten reseptorien alaperheen jäsenten kanssa viittaavat vahvasti siihen, että tämä on uusi reseptori. Koska TM-homologia kloonin hp78a reseptorin ja minkä tahansa tunnetun serotoniinireseptorin kans-,·. 25 sa on alle 55 % ja koska tämä reseptori on positiivisesti kytketty adenylaattisyklaasiin (ks. Tulokset ja seuraavas-sa), annamme tälle kloonille nimeksi 5-HT4B.
Tämän reseptorin transkriptien lokalisaatio osoittaa suhteellisen laajan kudosjakauman. Tutkituista kudok-30 sista ihmisen 5-HT4B-reseptori-DNA:ta (klooni hp78a) havaittiin runsaimmin aivoissa, kiveksissä ja rakossa, muissa perifeerisissä kudoksissa nähtiin kohtalaisista alhaisiin tasoja, ja ihossa ja kielessä ei havaittu lainkaan signaalia.
BNSDOC1D: <FI 111337B1 I > 65 1 113 3 7 Tässä kuvattujen 5-HT4B-reseptorin ja sen mRNA:n jakautuminen viittaa siihen, että tämä uusi serotoniinire-septori voi toimia monissa järjestelmissä aivoissa. Limbi-nen järjestelmä (septum, sentromediaalinen amygdala, edem-5 pi hippocampusrudimentti, hypotalamus) on erityisen hyvin edustettuna, mikä viittaa siihen, että 5-HT4B-reseptorilla olisi rooli tunneprosesseissa. Havainto, että tämä reseptori sitoo klotsapiinia erittäin hyvin tukee tätä ajatusta, vihjaten, että 5-HT4B-reseptori voi liittyä skitsofre-10 niaan tai muihin neurologisperäisiin tunnehäiriöihin. Lisäksi kloonin hp78a sijoittuminen talamuksen tumakkeisiin, jotka suuntautuvat neocortexiin, viittaa siihen, että tämä reseptori littyy aistinprosesseihin. Sijoittuminen keski-viivatumakkeisiin viittaa mahdolliseen toimintaan autore-15 septoreina, jotka voidaan ottaa uusien anksiolyytti- tai antidepressanttihoitojen kohteeksi 5-HT4B-toiminnan kautta. Koska 5-HT-reseptorien jakauma yleensä on samankaltainen eri lajeissa, lokalisaatiotuloksia muista lajeista kuin ihmisestä, kuten rotasta tai marsusta, pidetään mitä luul-20 tavimmin analogisina ihmisaivojen kanssa.
Kloonin hp78a reseptorilla saatu sitoutumisprofiili näyttää edustavan erillistä serotoniinireseptorialatyyp-piä, perustuen sen jäljittelemättömään farmakologiseen profiiliin. Yhdisteiden tehokkuusjärjestys [3H]5-HT:n si-25 toutumisen syrjäyttämisessä (taulukko 3) ei sovi yhteen muilla [3H]5-HT-leimautuvilla sitoutumiskohdilla saatujen sitoutumisominaisuuksien kanssa (Xiong ja Nelson 1989, Zemlin ym. 1991) tai erilaisissa funktionaalisissa preparaateissa (ks. edempää) farmakologisesti määriteltyjen se-30 rotoniinireseptoreiden farmakologisten ominaisuuksien kanssa. 5-CT:n korkea affiniteetti (Κ4 = 0,5 nM) ja sumat-riptaanin matala affiniteetti (K* > 750 nM) kloonin hp78a reseptoria kohtaan sopii yhteen äskettäin marsun striatum-homogenaateissa tunnistetun [3H] 5-CT-sitoutumiskohdan (Mah-35 le ym. 1992) sitoutumisominaisuuksien kanssa. Kuitenkaan BNSDOCID: <FI 111337B1 I >
Sfi 111337 66 kloonin hp78a reseptorin farmakologisia ominaisuuksia ei voida vertailla suoraan tämän [3H]5-CT-sitoutumiskohdaan ominaisuuksiin, koska sitoutumiskohtaa ei ole karakterisoitu täydellisesti eikä funktionaalista vastetta ole 5 osoitettu.
Sitoutumiskriteereihin, joita käytetään 5-HTj-resep-torialatyyppien luokittelussa, kuuluu korkea affiniteetti 5-HT:tä ja 5-CT:tä kohtaan. Näillä kahdella yhdisteellä nähtiin korkea affinitetti kloonin hp78a reseptoria koh-10 taan (taulukko 3). Kuitenkin hiljattain kloonatuilla ihmisen sekä 5-HT1e- (McAllister ym. 1992, Zgombick ym. 1992) että 5-HT1F-reseptorilla (Adham ym. 1992) nähdään korkea affiniteetti 5-HT:tä kohtaan (Kj < 10 nM) ja matala affiniteetti 5-CT:tä kohtaan (Kf > 700 nM). 5-HT1E- ja 5-HT1F-re-15 septorit ovat 5-HT1-reseptoriperheen jäseniä perustuen nii den TM-aluehomologiaan tämän reseptoriperheen muiden kloonattujen jäsenten (5-HTlÄ, 5-HT1B, 5-HTlr)a, 5-HT1DB) vastaavan kanssa ja toisiolähettikytkentään (adenylaattisyklaa-sin inhibitio). Lisäksi, vaikka kloonattu 5-HTlc-reseptori 20 sitoo [3H]5-CT:tä korkealla affiniteetilla, sen katsotaan olevan 5-HT2-reseptori perustuen sen korkeaan TM-aluehomologiaan (75 %) kloonatun 5-HT2-reseptorin kanssa ja funktionaaliseen kytkentään fosfolipaasi C:hen (Hartig ym. 1990, Julius 1992). Näiden havaintojen perusteella on vai-.·. 25 kea luokitella kloonin hp78a reseptoria 5-HT^reseptoriala- tyypiksi perustuen vain sen radioligandinsitomisominai-suuksiin.
Kloonin hp78a reseptorin funktionaalisista vasteista saadaan enemmän näkemystä siihen, mikä se on. Cos-7-so-30 luissa transientisti ekspressoitu kloonin hp78a reseptori-geeni kytkeytyi adenylaattisyklaasin stimulaatioon. Sekä 5-HT että 5-CT saivat aikaan 20-kertaisen lisäyksen cAMP:n vapautumisessa perustasoon verrattuna. K^arvot, jotka 5-HT ja 5-CT saivat sitoutumismäärityksissä, olivat noin 100 35 kertaa korkeampaa affinitettia kuin näiden agonistien BNSD0CID: <FI 111337B1 I y 67 1 1 1337 funktionaalisista määrityksistä saadut EC50-arvot. Agonis-tien funktionaalisessa määrityksessä havaittu tehokkuus-järjestys on hyvin samankaltainen kuin näiden yhdisteiden paremmuusjärjestys spesifisen [3H]5-HT-sitoutumisen syr-5 jäyttämisessä. 5-HT4B-reseptoria ekspressoivilla stabiileilla LM(tk*)-soluilla saatiin varsin samanlainen farmakologia kuin transientisti transfektoiduilla Cos-7-soluilla, agonistien tuottaessa oleellisesti identtisen tehokkuus-järjestyksen, agonistien tuottaman maksimi-cAMP-vasteen 10 ollessa kuitenkin alempi LM(tk‘)-soluissa. Antagonisteilla oli seuraava tehokkuusjärjestys: d-LSD > metiotepiini ä 2-Br-LSD'> mesulergiini = DHE.
Serotoniinin kyky aktivoida adenylaattisyklaasia on osoitettu useissa systeemeissä, mukaan luettuina: hiiren 15 alkion colliculukset (5-HT4, Dumius ym. 1988), hevosten aivojen glia-membraanit (δ-ΗΊ^:n kaltainen, Fillion ym. 1980), rotan ja marsun hippocampus-membraanit (5-HT1A, Shenker ym. 1987), ihmisen sydämen eteinen (5-KT4, Kaumann ym. 1989), NCB20-neuroblastoomahybridisolut (5-HT4:n kal-20 täinen, Conner ja Mansour 1990, Cossery ym. 1990) ja vastasyntyneen porsaan onttolaskimo (5-HT1:n kaltainen, Tra-vethick ym. 1984). 5-HT4B-geenin koodittama reseptori on eri kuin näissä preparaateissa tunnistettu 5-HT4-reseptori, vaikka niissä on joitakin yhteisiä ominaisuuksia. 5-HT ·, 25 ja 5-MeOT, jotka stimuloivat cAMP:n vapautumista matalalla affiniteetilla, ovat yhtä tehokkaita colliculuksissa, sydämen eteisessä ja NCB20-soluissa esiintyvien 5-HT4-resep-torien ja kloonin hp78a reseptorin suhteen. Lisäksi molemmat ovat suhteellisen epäherkkiä 8-0H-DPAT:lle, spipero-30 nille, ketanseriinille ja pindololille. Kuitenkin metiote-... piini on kloonin hp78a reseptorin välittämien funktionaa listen vasteiden voimakas antagonisti, mutta ei collicu-lusten ja sydämen eteisen 5-HT4-reseptorivasteiden. Ennen kaikkea yhdisteet, joita käytetään "klassisen" 5-HT4-resep-35 torin määrittelemiseen (agonistit: sisapridi, tsakopridi, BNSDOCID: <FI 111337B1 I ? 68 1 11337 BRL 29429, heikko antagonisti: ICS-205-930), ovat kaikki joko heikosti aktiivisia tai inaktiivisia kloonin hp78a reseptoria kohtaan.
Kloonin hp78a reseptorin ja NCB20-soluissa olevan 5-HT4-.n kaltaisen reseptorin välillä on jonkin verran läheisempi farmakologinen sukulaisuus, mukaan luettuna me-tiotepiinin voimakas antagonistiaktiivisuus. Kuitenkin ne ovat eri olioita seuraavien erojen perusteella: a) [3H]5-HT sitoutuu korkealla affiniteetilla (Ka = 8,5 nM) kloonin hp78a reseptoriin, mutta sillä on hyvin matala affiniteetti (n. 200 nM) NCB20-soluissa oleviin 5-HT-reseptoreihin (Ber-ry-Kravis ja Dawson 1983), b) agonistien tehokkuusjärjestys on hp78a*.n suhteen on 5-CT > 5-HT > 5-MeOT, kun taas NCB20-solujen suhteen järjestys on 5-HT > 5-MeOT > 5-CT (Conner ja Mansour 1990). Lisäksi kloonin hp78a reseptorilla on useita yhteisiä ominaisuuksia glia-membraaneissa esiintyvän 5-HT-reseptorin kanssa (Fillion ym. 1980). Näihin kuuluvat: a) [3H] -5-HT:n tasapainodissosiaatiovakio, K<j = 10 nM, b) cAMP:n 5-HT-stimulaation ECS0-arvo (500 - 1 000 nM), ja c) voimakas antagonismi 2-bromi-LSD:n metysergidin ja metiote-piinin vaikutuksesta.
Kriteerit, joita käytetään serotoniinireseptorien luokitteluun neljään eri luokkaan, joista käytetään nimityksiä 5-HTi, 5-HT2, 5-HT3 ja 5-HT4, perustuu sitoutumisomi- - ' naisuuksiin, signaalinvälitysmekanismeihin ja pääteltyihin aminohapposekvensseihin. Bradleyn ym. (1986) esittämän serotoniinireseptorien luokittelutavan mukaan kloonin hp78a reseptoria voitaisiin pitää 5-HTi-reseptoriperheen jäsenenä, koska 5-CT toimii agonistina, ja tälle vasteelle on voimakkaana antagonistina epäselektiivinen 5-HTi-antagonisti metiotepiini. Kuitenkin kloonin hp78a reseptorin tässä nähty positiivinen kytkentä adenylaattisyklaasiin ei sovi yhteen sen kanssa, mitä on raportoitu 5-HTi-alaperheen kloonatuista jäsenistä, jotka kytkeytyvät FSK:lla stimuloidun cAMP:n vapautumisen inhibitioon, ja joihin kuuluvat BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 69 111337 5-HT1Ä (Kobilka ym. 1987, Fargin ym. 1988), 5-HT1B (Adham ym. 1992, Maroteaux ym. 1992), 5-HT10a (Hamblin ja Metcalf 1991, Weinshank ym. 1992), 5-HT1DB (Demchysyn ym. 1992, Jin ym. 1992, Weinshank ym. 1992), 5-ΗΤιε (Levy ym. 1992, Mc-5 Allister ym. 1992, Zgombick ym. 1992) ja 5-HT1F (Adham ym., j ätetty j ulkaistavaksi).
Vaikkakin rakennelmana hyödyllinen, serotoniinire-septorien luokittelu vain sitoutumisominaisuuksien perusteella voi olla harhaanjohtavaa. Esimerkiksi 5-HTlc-resep-10 torin, joka alunperin nimettiin sitoutumiskriteereillä ([3H)5-HT sitoutuu korkealla affiniteetilla tähän alatyyppiin ), katsotaan nyt olevan 5-HT2-alatyyppi perustuen sen korkeaan TM-aluehomologiaan (75 %) 5-HT2-reseptorin kanssa ja toisiolähettikytkentään (fosfoinositidien hydrolyysi) 15 [Hartig ym. 1990, Julius 1992]. Samaan tapaan, vaikka kloonin hp78a reseptori sitoo [3H]5-HT:tä korkealla affiniteetilla, sen positiivinen kytkeytyminen adenylaattisyk-laasiin ja alempi TM-alueiden homologia (n. 50 %) muiden 5-HT1-reseptoriperheen kloonattujen jäsenten kanssa näyt-20 täisi sulkevan pois sen mahdollisuuden, että klooni hp78a koodittaa 5-HTx-alatyyppiä. Niinpä vaikuttaa siltä, että TM-alueiden homologiavertailut ja toisiolähettikytkentä ennustavat tarkemmin reseptori luokittelua kuin radioi igan-dien sitomisominaisuudet. Näiden analyysien perusteella ·' 25 esitämme, että klooni hp78a nimetään ensimmäiseksi jäse neksi 5-HT4-reseptorialaperheessä. Kloonin hp78a farmakologinen profiili poikkeaa farmakologisesti määritellystä 5-HT4-reseptorista. Siksi kloonista hp78a käytetään termiä 5-HT4b, varaten nimitys 5-HT4Ä kloonille, jolla nähdään sel-30 lainen 5-HT4-reseptorin farmakologinen profiili, joka on kuvattu joukossa eristettyjä kudospreparaatteja (Bokaert ym. 1992).
Loppupäätelmänä hp78a~geenin primaarirakenne sekä myös sen ainutlaatuinen farmakologinen profiili ja posi-35 tiivinen kytkentä adenylaattisyklaasiin, joka saatiin BNSD0CID: <FI 111337B1 I > 70 1 11337 transientisti transfektoiduissa soluissa, viittaavat siihen, että tämä geeni voi koodittaa 5-HT4-reseptoriperheen ensimmäistä jäsentä. Klooni hp78a esitetään nimitettäväksi 5-HT4B-reseptorialatyypiksi, koska sillä ei nähdä farmako-5 logisesti määritellyn 5-HT4-reseptorin farmakologisia ominaisuuksia. Uusia kloonausponnisteluja tarvitaan, jotta eristettäisiin lisää tämän hiljattain tunnustetun seroto-niinireseptoriperheen (Bockaert ym. 1992) jäseniä. 5-HT4B:n farmakologisen sukulaisuuden vertailu kudosmalleissa mää-10 riteltyihin serotoniinireseptoreihin viittaa mahdolliseen identiteettiin joukon samansukuisia, verisuonistossa kuvattuja reseptoreja kanssa. Useat näistä reseptoreista näyttävät olevan vastuussa relaksanttivasteista eristetyissä verisuonissa, mikä viittaa potentiaaliseen hyötyyn 15 rintakivun, sepelvaltimotaudin, ateroskleroosin ja mahdollisesti aivoinfarktiin johtavien aivoverisuonihäiriöiden hoidossa. Tämän alatyypin esiintyminen keskushermostossa viittaa myös potentiaaliseen käyttöön korkeampien kognitiivisten prosessien häiriöissä sekä myös autonomisen 20 funktion säätelyssä. Lisäksi epätyypillisen antipsykootin klotsapiinin korkea af f initteetti (KA = 78 nM) 5-HT7-resep-toria kohtaan sekä myös tämän alatyypin sijoittuminen lim-bisiin ja kortikaalisin alueisiin viittaa 5-HT7-alatyypin potentiaaliseen tehtävään sellaisissa neuropsykiatrisissa 25 häiriöissä kuten skitsofrenia, joihin liittyy serotonergi-nen neurotransmissio.
3NSD0CID: <FI 111337B1 ! > 71 111337
Viitteet
Adham, N., H.-T. Kao, L. E. Schechter, J. Bard, M.
Olsen, D. Urquhart, M. Durkin, P. R. Hartig, R. L. Weinshank, and T. Branchek. cloning of a novel human serotonin receptor (5-HT1F): A . fifth 5-HT, receptor subtype coupled to the inhibition of adenylate cyclase. Submitted.
Berry-Kravis, E., and G. Dawson. Characterization of an adenylate cyclase-linked serotonin (5-HT,) receptor in a neuroblastoma X brain explant hybrid cell line (NCB- 20). J. Neurochem. 40:977-985 (1983).
Bockaert, J., J.R. Fozard, A. Dumuis, D. £. Clarke. The 5-HT4 receptor: a place in the sun. Trends Pharmacol.
Sci. 13:141-145 (1992).
Bockaert, J., H. Sebben, and A. Dumius. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine4 (5-HT4) receptors positively coupled to adenylate cyclase in adult guinea-pig hippocampal membranes: Effect of substituted benzamide derivatives. Mol. Pharmacol. 37:408-411.
,\ Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.
Biochem. 72:248-254 (1976).
Bradley, P. B., G. Engel.,· w. Fenuik, J. R. Fozard, P.
.. P. Humphrey et al. Proposals for the nomenclature of functional receptors for 5-hydroxytryptamine.
Neuropharmacology 25:563-576 (1986).
Branchek, T., N. Adham, M. Macchi, H.-T. Kao, and P. R. Hartig. [3H]-DOB (4-bromo-2,5-dimethoxyphenylisopropylamine) and [3H]ketanserin label BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 72 111337 two affinity states of the cloned human 5-hydroxytryptamine2 receptor. Mol. Pharmacol. 38:604-609 (1990)..
Cheng, Y. c., and W. H. Prusoff. Relationship between the inhibition constant (K{) and the concentration of the inhibitor which causes 50 per cent inhibition (IC50) of an enzyme reaction. Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108 (1973).
Connor, D. A., and T. E. Mansour. Serotonin receptor-mediated activation of adenylate cyclase in neuroblastoma NCB-20: a novel 5-hydroxytryptamine receptor. Mol. Pharmacol. 37:742-751 (1990).
Cossery, J. M., J.-M. Mienville, P. A. Sheehy, A. M.
Mellow, and D.-M. Chuang. Characterization of two distinct 5-HT receptors coupled to adenylate cyclase activation and ion current generation in NCB-20 cells. Neurosci. Lett. 108:149-154 (1$90).
Cushing, D. and Cohen, M.L. Comparison of the serotonin receptors that mediate smooth muscle contraction in canine and porcine coronary artery. J.Pharmacol. Exp.
The. 261: 856-861, 1992.
* ft
Demchyshyn, L., R. K. Sunahara, K. Miller, M. Teitler, B. J. Hoffman, J. L. Kennedy, P. Seeman, H. H. M. Van Tol, and H. B. Niznik. A human serotonin ID receptor variant (5-HT1D0) encoded by an intronless gene on chromosome 6. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5522-5526 :. (1992).
Dumuis, A., R. Bouhelal, M. Sebben, R. Cory, and J. Bockaert. A nonclassical 5-hydroxytryptamine receptor positively coupled with adenylate cyclase in the central nervous system. Mol. Pharmacol. 34:880-887 (1988).
NSD0CID: <FI 111337B1 I > 73 111337
Fargin, A., J. R. Raymond, J. R. Regan, S. Cotecchia, R. J. Lefkowitz, and M. G, Caron. Effector coupling mechanisms of the cloned 5-HT1A receptor. J. Biol.
Chem. 264:14848-14852 (1989).
Fillion G., D. Beaudoin, J. C. Rousselle, and J. Jacob.
(3H]5-HT binding sites and 5-HT-sensitive· adenylate cyclase in glial cell membrane fraction. Brain Res. 198:361-374 (1980).
Foquet, M., D. Hoyer, L. A. Pardo, A. Parekh, F. W.
Kluxen, H. O. Kalkutan, W. Stuhmer, and H. Liibbert.
Cloning and functional characterization of the rat stomach fundus serotonin receptor. EMBO J. 11(3):3481-3487 (1992).
Frazier, A., S. Haayani, and B. B. Wolfe. Subtypes of receptors for serotonin. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 30:307-348 (1990).
Furchgott, R. F. The classification of adrenoceptors (adrenergic receptors). An evaluation from the standpoint of receptor theory, in Catecholamines (H. Blaschko, and E. Muscholl, eds.). Springer Press,
Berlin, Heidelberg, New York and Tokyo, 283-335 (1972).
Hamblin, M. w., and M. A. Metcalf. Primary structure and functional characterization of a human 5-HT10-type serotonin receptor. Mol. Pharmacol. 40:143-148 (1991).
« »
» I
Hartig, P. R. TIPS 10:64-69 (1989).
BNSD0CID: <F| 111337B1 I > 74 ' 111337
Hartig, P.R., H.-T. Kaof M. Macchi, N. Adham, J.
Zgombick, R. Weinshank, and T. Branchek. The molecular biology of serotonin receptors: an overview.
Neuropsychophannacol. 3:335-347 (1990).
Jin, H., D. Oskenberg, A. Askenazi, s. Peroutka, A.M.V.
Duncan, R. Rozmahel, Y.Yang, G. Mengod, J·. Palacios, B. O'Dowd. J. Biol. Chem. 267: 5736-5738 (1992)
Julius, D., A. B. MacDermott, R. Axel, T. Jessel.
Molecular characterization of a functional cDNA encoding the serotonin lc receptor. Science 241:558-564 (1988).
Julius, D. Molecular biology of serotonin receptors.
Ann. Rev. Neurosci. 14:335-360 (1991).
Kingston, R. E., In: Current Protocols in Molecular Biology, Voi. I (John Wiley and Sons, N.Y.), 1987.
Levy, F. 0., T. Gudermann, M. Birnbaumer, A. J.
Kaumann, and L. Birnbaumer. Molecular cloning of a human gene (S31) encoding a novel serotonin receptor mediating inhibition of adenylyl cyclase. FEBS. Lett. 296:201-206 (1992).
«
Lubbert, Η., T. P. Snutch, N. Dascal, H. A. Lester, and N. Davidson. Rat brain 5-HT1c receptors are encoded by a 5-6 kbase mRNA size class and are functionally expressed in injected Xenopus oocytes. J. Neurosci.
:.. 7:1159-1165 (1987).
BNSDOCID: ^Fl 111337B1 I > 75 ' 111337
Mahle, C. D., H. P. Nowak, R. J. Mattson, S. D. Hurt, and F. D. Yocca. [3H)5-Carboxamidotryptamine labels multiple high affinity 5-HT10-like sites in guinea pig brain. Eur. J. Pharmacol. 205:323-324 (1991).
Maricq, λ. V., A. V. Peterson, A. J. Brake, R. M. Myers, and D. Julius. Primary structure and functional expression of the 5-HT3 receptor, a serotonin-gated ion channel. Science 254:432-436 (1991).
Maroteaux, L., F. Saudou, N. Amiaiky, U. Boschert, J.
L. Plassat, R. Hen. Mouse 5-HT1B serotonin receptor: cloning, functional expression, and localization in motor control centers. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:3020-3024 (1992).
McAllister, G., A. Charlesworth, C. Snodin, M.S. Beer, A. J. Noble, D. N. Middlemiss, L. L. Iverson, and P. Whiting. Molecular cloning of a serotonin receptor from human brain (5-HT1E); A fifth 5-HTl-like subtype. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89:5517-5521, 1992
Miller, J., and R.N. Germain. Efficient cell surface expression of class II MHC molecules in the absence of , associated invariant chain. J.Exp.Med. 164:1478-
• I
1489 (1986).
Mylecharane, E. and Phillips, C. Mechanisms of 5-hydroxytryptamine-induced vasodilation. In: The
Peripheral Actions of 5-hy.droxytryptamine, J.R. Fozard, ed. Oxford University Press, Oxford, pp. 147-181 • * (1989).
Pritchett, D. B., A. W. J. Bach, M. Wozny, o. Taleb, R.
Dal Toso, J. c. Shih, and P. H. Seeburg. Structure and functional expression of a cloned rat serotonin 5-HT-2 receptor. EMBO J. 7:4135-4140 (1988).
BNSDOCIDkFI 111337B1 I > 111337 76
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. , In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), 1989.
Sanger, F., Nicklen, S. and coulsen, A. R. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977).
Savarese, T. M. and Fraser, L. M. Biochem. J. 283:1-· 19 (1992) shenker, A., S. Maayani, H. Weinstein, and J. P. Green, Pharmacological characterization of two 5-hydroxytryptamine receptors coupled to adenylate cyclase in guinea pig hippocampal membranes. Mol. Pharmacol. 31:357-367 (1987).
Southern, E. M. J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975).
Trevethick, M. A., W. Feniuk, and P. P. A. Humphrey. 5-hydroxytryptamine induced relaxation of neonatal porcine vena cava in vitro. Life Sci. 35:477-486 (1984).
.· Weinshank, R. L., Zgombick, J. M., Macchi, M., Adham, N., Lichtblau, H., Branchek, T. A. and Hartig, P. R.
Mol. Pharmacol. 38:681-688 (1990).
Weinshank, R. L., J. M. Zgombick, M. Macchi, T. A. Branchek, and P. R. Hartig. The human serotonin ID \ receptor is encoded by a subfamily of two distinct genes: 5-HT1De and 5-HTlw· Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3630-3634 (1992a).
BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 77 ' 111337
Weinshank, R. L., Adham, N., Zgombick, J., Bard, J., Branchek, T. and Hartig, P. R., In: Serotonin Receptor Subtypes: Pharmacological Significance and Clinical
Implications, Voi. I. Int. Acad. Biomed. Drug Res. (S.
Krager, Basel, Switzerland), (1992b).
Witz, P., Amlaiky, N., Plassat, J.-L., Maroteaux, L.,
Borrelli, E. and Hen, R. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:8940-8944 (1990).
Zemlan, F. P., and E. F. Schwab. Characterization of a novel serotonin receptor subtype (5~HT1S) in rat CNS: interaction with a GTP binding protein. J. Neurochem. 57:2092-2099 (1991).
Zgombick, J. M., R. L. Weinshank, M. Macchi, L. E. Schechter, T. A. Branchek, and P. R Hartig. Expression and pharmacological characterization of a canine 5-hydroxytryptaraine1D receptor subtype. Mol. Pharmacol.
40: 1036-1042 (1991).
Zgombick, J. M., L. E. Schechter, M. Macchi, P. R.
Hartig, T. A. Branchek, and R. L. Weinshank. Human gene S31 encodes the pharmacologically defined serotonin 5- * hydroytryptamine1£ receptor. Mol. Pharmacol. (1992), in press.
BNSQOCID:<FI 111337B1 I > 78 Λ Λ Λ 7 717 11 100/
Sekvenssilista (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Bard A. Jonathan
Branchek A. Tharasa Weinshank L. Richard
(ii) TITLE OF INVENTION: DNA ENCODING A HUMAN SEROTONIN RECEPTOR
(5-HT4B) AND USES THEREOF
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Cooper & Dunham (B) STREET: 30 Rockefeller Plaza (C) CITY: New York (D) STATE: New York (E) COUNTRY: U.S.A.
(F) ZIP: 10112 (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Πορργ dizk (B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.2« (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING DATE: (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: White P.r John (B) REGISTRATION NUMBER: 28,«78
(C) REFERENCE/DOCXET NUMBER: «1908-A-PCT/JPW/TEP
(ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (212) 977-9550 (B) TELEFAX: (212) 315-1931
(C) TELEX: «22523 COOP UI
• : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:l: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 1406 baza pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: unknown
(ii) MOLECULE TYPE: CDNA
(iii) HYPOTHETICAL: N
(iv) ANTI-SENSE: N
(vii) IMMEDIATE SOURCE: (A) LIBRARY: human brain (B) CLONE: hp78a BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 79 1 113 3 7 (ix) FEATURE:
(λ) NAME/KEY: CDS
(B) LOCATION: 28..1362 (D) OTHER INFORMATION: (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:l:
CCATGGGCAG COGCACACGO COOCOCG ATO ATG OAC OTT AAC AGC AOC OOC SI
Met Met Asp Vel Aen Ser Ser Gly 1 5 COC CCO OAC CTC TAC GOG CAC CTC COC TCT TIC CTT CTO CCA GAA GTG 99
Arg Fro Asp Leu Tyr Gly Bis Leu Arg Ser Phe Leu Leu Pro Olu Val 10 IS 20 GOG CGC GGG CTO CCC GAC TTO AGC CCC OAC GOT OOC GCC OAC CCG OTC 147
Gly Arg Gly Leu Pro Asp Leu Ser Pro Asp Gly Gly Ale Asp Pro Vel 25 30 35 40 GCG GGC TCC TOG GCG CCG CAC CTO CTO AGC GAG GTG ACA GCC AGC CCG 195
Ale Gly Ser Trp Ale Pro His Leu Leu Ser Glu Vel Thr Ale Ser Pro 45 50 55 GCG CCC ACC TOO GAC GCG CCC CCO GAC ΑΛΤ GCC TCC OOC TOT GOG GAA 243
Ale Pro Thr Trp Asp Ala Pro Pro Asp Asn Ale Ser Gly Cys Oly Glu 60 65 70 CAG ATC AAC TAC GGC AGA CTC GAG AAA OTT GTG ATC OOC TCC ATC CTO 291
Gin Ile Asn Tyr Gly Arg Vei Glu Lys Vei Vel lie Oly. Ser He Leu 75 80 85 ACO CTC ATC AGO CTO CTO AGO ATC GCG GGC AAC TOC CTO OTG GTG ATC 339
Thr Leu He Thr Leu Leu Thr He Ala Gly Asn Cys Leu Vel Val He 90 95 100 TCC OTG TOC TTC OTC AAO AAO CTC CGC CAG CCC TCC AAC TAC CTO ATC 387
Ser Vel Cys Phe Vel Lys Lys Leu Arg Gin Pro Ser Asn Tyr Leu He 105 110 115 120 GTG TCC CTO GCG CTO GCC GAC CTC TCG OTG OCT GTG GCG GTC ATO CCC 435
Val Ser Leu Ale Leu Ala Asp Leu Ser Val Ala Val Ale Vel Met Pro ( 125 130 135 « .
TTC GTC AGC OTC ACC GAC CTC ATC GGG CGC AAG TOO ATC TIT GOA CAC 483
Phe Vel Ser Val Thr Asp Leu He Gly Gly Lys Trp He Phe Oly His 140 145 150 ITT TTC TOT AAT GTC TTC ATC CCC ATO GAC GTC ATO TOC TOC ACG GCC 531
Phe Phe Cys Asn Val Phe He Ala Met Asp Val Met Cys Cys Thr Ala 155 160 165 TCG ATC ATO ACC CTO TGC GTG ATC ACC ATT GAC AGO TAC CTT GGG ATC 579
Ser He Met Thr Leu Cys Val He Ser He Asp Arg Tyr Leu Oly He 170 175 180 ACA AGO CCC CTC ACA TAC CCT GTG AGG CAG AAT GOO AAA TOC ATG GCG 627
Thr Arg Pro Leu Thr Tyr Pro Val Arg Cln Asn Gly Lys Cys Met Ala 185 190 195 200 BNSDOCID: <FI 111337B1 I > so 111337 ΛΑΟ ΑΤΟ ATT CTC TCC OTC TOO CTT CTC TCC GCC TCC ATC ACC TTA CCT 675
Lye Net IXe Leu Ser Val Trp Leu Leu Ser Ala Ser He Thr Leu Pro 205 210 215 CCA CTC TTT GOA TOG OCT CAG AAT OTA AAT OAT OAT AAG OTC TCC TTG 723
Pro Leu Phe Gly Trp Ale Oln Aen Vei Aen Asp Asp Lys Vel Cys Leu 220 225 230 ATC AGC CAO OAC TTT GCC TAT ACO ATT TAC TCT ACC OCA GTO OCA TTT 771
Ile Ser Gin Asp Phe Gly Tyr Thr Ile Tyr Ser Thr Ala Val Ala Phe 235 240 245 TAT ATC CCC ATC TCC OTC ΑΤΟ CTT TTC AIO TAC TAC CAO ATT TAC AAG 819
Tyr lie Pro Net Ser Val Net Leu Phe Net Tyr Tyr Ola lie Tyr Lys 250 255 260 OCT OCC AGO AAO AGT OCT CCC AAA CAC AAG TTT CCT OOC TTC CCT CCA 867
Ala Ala Arg Lys Ser Ala Ala Lys Bis Lys Phe Pro Gly Phe Pro Arg 265 270 275 280 GTO GAG CCA OAC AGC OTC ATC OCC CTO AAT OOC ATA GTO AAG CTC CAG 915
Val Glu Pro Asp Ser Val lie Ala Leu Asa Gly lie Val Lys Leu Gin 285 290 295 AAG OAO GTO OAA GAO TOT OCA AAC CTT TCO AGA CTC CTC AAG CAT GAA 963
Lys Glu Val Glu Glu Cys Ala Asa Leu Ser Arg Leu Leu Lys Bis Glu 300 305 310 AGO AAA AAC ATC TCC ATC TTT AAG CGA GAA CAG AAA OCA GCC ACC ACC 1011
Arg Lys Asa lie Ser lie Phe Lys Arg Glu Ola Lys Ala Ala Thr Thr 315 320 325 CTO GOG ATC ATC OTC GOG GCC TTT ACC GTO TOC TOG CTO CCA TTT TTC 1059
Leu Gly lie lie Val Gly Ala Phe Thr Val Cys Trp Leu Pro Phe Phe 330 335 340 CTC CTC TCO ACA GCC AGA CCC TTC ATC TOT OOC ACT TCC TOC AGC TOC 1107
Leu Leu Ser Thr Ala Arg Pro Phe lie Cys Gly Thr Ser Cys Ser Cys 345 350 355 360 ATC CCA CTO TOG GTO GAG AGO ACA TTT CTO TOO CTA OOC TAT GCA AAC 1155 lie Pro Leu Trp Val Glu Arg Thr Phe Leu Trp Leu Gly Tyr Ala Asa 365 370 375 TCT CTC ATT AAC CCT TTT ΑΤΑ TAT OCC TTC TTC AAC COG OAC CTO AGG 1203
Ser Leu lie Asa Pro Phe lie Tyr Ala Phe Phe Asa Arg Asp Leu Arg 380 385 390 ACC ACC TAT CGC AGC CTO CTC CAG TOC CAO TAC COG AAT ATC AAC COG 1251
Thr Thr Tyr Arg Ser Leu Leu Cln Cys Gla Tyr Arg Asa lie Asa Arg 395 400 405 AAG CTC TCA OCT OCA OOC ATC CAT OAA OCC CTC AAO CTT OCT CAO AGG 1299 ·, Lys Leu Ser Ala Ala Gly Met Bis Glu Ala Leu Lys Leu Ala Glu Arg 410 415 420 CCA GAG ACA CCT GAO TTT OTC CTA CAA AAT OCT GAC TAC TOT AGA AAA 1347
Pro Glu Arg Pro Glu Phe Val Leu Gla Asn Ala Asp Tyr Cys Arg Lys 425 430 435 440 SNSDOCID:*FI 111337B1 I > -1-1-1777 81 1 1 lvjJ/ XAA OCT CAT OAT TCA TOATTOAAAO CAOAACAATO ΟΑΟΑβΟΑλΤΤ CGATATCAAG 1402
Lys 01 f Hi* A*p Ser 445 CTTA 1406 (2) INFORMATION FOR SBQ ID NOt2t (i) SEQUENCE CHARACTERISTICSt (A) LENGTHS 445 nlno acids (B) TTPEs aaino acid (D) TOPOLOOT: linear (ii) HOXaECUIiE TYPEt protein (Xi) SEQUENCE DESCRIPTIONt SEQ ID N0t2s
Met Met Asp Val Asn Ser Ser Gly Arg Pro Asp Leu Tyr Gly Hi* Leu 15 10 15
Arg Ser Phe Leu Leu Pro Qlu Val Gly Arg Gly Leu Pro Asp Leu Ser 20 25 30
Pro Asp Qly Gly Ala Asp Pro Val Ala Gly Ser Trp Ala Pro Hi* Leu 35 40 45
Leu Ser Glu Val Thr Ala Ser Pro Ala Pro Thr Trp Asp Ala Pro Pro 50 55 50
Asp Asn Ala Ser Gly Cys Gly Glu Gin lie Asn Tyr Gly Arg Val Glu «5 70 75 80
Lys Val Val lie Gly Ser lie Leu Thr Leu lie Thr Leu Leu Thr lie 85 SO 95
Ala Gly Asn Cys Leu Vai Val He Ser Val Cys Phe Val Lys Lys Leu 100 105 110
Arg Gin Pro Ser Asn Tyr Leu He Val Ser Leu Ala Leu Ala Asp Leu 115 120 125
Ser Val Ala Val Ala Val Met Pro Phe Val Ser Val Thr Asp Leu He 130 135 140
Gly Gly Lys Trp lie Phe Gly His Phe Phe Cys Asn Val Phe He Ala 145 150 155 160
Met Asp Val Met Cys Cys Thr Ala Ser He Mat Thr Leu Cys Val He 155 170 175
Ser He Asp Arg Tyr Leu Gly lie Thr Arg Pro Leu Thr Tyr Pro Val *' ISO 185 190
Arg Gin Asn Gly Lys Cys Met Ala Lys Met lie Leu Ser Val Trp Leu 195 200 205
Leu Ser Ala Ser He Thr Leu Pro Pro Leu Phe Gly Trp Ala Gin Asn 210 215 220 t
Val Asn Asp Asp Lys Val Cys Leu He Ser Gin Asp Phe Gly Tyr Thr 225 230 235 240 BNSD0C1D: <F1 111337B1 I >
Claims (34)
1. Nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa 5 (a) ihmisen 5-HT4B-reseptoria, jolloin reseptorilla on kuviossa 1 esitetty aminohapposekvenssi, tai (b) kohdan a) reseptorin osaa, jolla on samat si-toutumisominaisuudet, jotka on esitetty taulukoissa 3 ja 4.
2. Nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, 10 että se koodaa (a) ihmisen 5-HT4B-reseptoria, jolloin reseptorilla on aminohapposekvenssi, jota koodaa plasmidissa pcEXV-5HT4B (ATCC-talletusnumero 75332) oleva DNA-sekvenssi, tai (b) kohdan a) reseptorin osaa, jolla on samat si-15 toutumisominaisuudet, jotka on esitetty taulukoissa 3 ja 4.
3. Nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se on nukleiinihappomolekyyli, joka on degeneroitunut patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen nukleiinihappomolekyy-lin suhteen.
4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen nuk leiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että se on DNA-molekyyli, cDNA-molekyyli tai RNA-molekyyli.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen nukleiinihappomolekyyli, tunnettu siitä, että DNA-molekyyli on pe- : ' 25 räisin genomisesta DNA:sta.
6. Vektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 4 mukaisen nukleiinihappomolekyy-lin.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, 30 tunnettu siitä, että se on plasmidi. ‘I 8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen vektori, joka on sovitettu bakteerisolussa ilmentämistä varten, tunnettu siitä, että siinä on patenttivaatimuksen 4 mukaisen nukleiinihappomolekyylin bakteerisolussa ilmentä-35 mistä varten tarpeelliset säätelyelementit siten sijoitet- BNSDOCID: <F1 111337B1 I > 85 111337 soitumaan sekvenssin kanssa, joka sisältyy jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukaiseen nukleiinihappomolekyylin sekvenssiin.
17. Nukleiinihappokoetin, tunnettu siitä, 5 että se käsittää nukleiinihappomolekyylin, joka on vähintään 15 nukleotidiä pitkä ja pystyy spesifisesti hybridi-soitumaan sekvenssin kanssa, joka sisältyy patenttivaatimuksen 4 mukaiseen nukleiinihappomolekyylin sekvenssiin.
18. Patenttivaatimuksen 16 tai 17 mukainen nukle- 10 iinihappokoetin, tunnettu siitä, että nukleiinihappo on DNA.
19. Nukleiinihappokoetinseos, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimusten 16 - 18 mukaisten nukleiinihappokoetinten seoksen, jolloin koettimien sek- 15 venssit eroavat toisistaan ennalta määrätyissä kohdissa.
20. Menetelmä kemiallisen yhdisteen tunnistamiseksi, joka sitoutuu spesifisesti 5-HT4B-reseptoriin, jolloin
5-HT4B-reseptorilla on aminohapposekvenssi, joka on sama kuin aminohapposekvenssi, jota koodaa jonkin patenttivaati- 20 muksista 1-4 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että saatetaan ei-hermosolut, jotka ilmentävät pinnallaan 5-HT4B-reseptoria, tai niiden solu-uutteesta saatu membraanifraktio, kosketukseen kemiallisen yhdisteen kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia sitoutumiseen, ja todetaan »*· 25 kemiallisen yhdisteen spesifinen sitoutuminen 5-HT4B- reseptoriin.
21. Menetelmä, joka käsittää kompetetiivisen sitoutumisen kemiallisen yhdisteen tunnistamiseksi, joka sitoutuu spesifisesti 5-HT4B-reseptoriin, jolloin 5-HT4B- 30 reseptorilla on aminohapposekvenssi, joka on sama kuin ami-·· nohapposekvenssi, jota koodaa jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että saatetaan erikseen kosketukseen ei-hermosolut, jotka ilmentävät pinnallaan 5-HT4B-reseptoria, tai niiden solu- 35 uutteesta saatu membraanifraktio, sekä kemiallisen yhdisteen kanssa että toisen kemiallisen yhdisteen kanssa, jonka BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 111337 86 tiedetään sitoutuvan 5HT4B-reseptoriin, ja vain toisen kemiallisen yhdisteen kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia molempien yhdisteiden sitoutumiseen, ja todetaan kemiallisen yhdisteen spesifinen sitoutuminen 5-HT4B-reseptoriin, 5 väheneminen toisen kemiallisen yhdisteen sitoutumisessa 5-HT4B~reseptoriin kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa, mikä osoittaa että kemiallinen yhdiste sitoutuu 5-HT4B-reseptoriin.
22. Menetelmä sen määrittämiseksi, sitoutuuko kemi-10 allinen yhdiste spesifisesti ja aktivoiko se 5-HT4B- reseptoria, jolloin 5-HT4B-reseptorilla on aminohapposekvenssi, joka on sama kuin aminohapposekvenssi, jota koodaa jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen nukleiinihappo, tunnettu siitä, että saatetaan erikseen kosketuk-15 seen ei-hermosolut, jotka tuottavat toisen välittäjäaine-vasteen ja ilmentävät pinnallaan 5-HT4B-reseptoria, tai niiden solu-uutteesta saatu membraanifraktio, kemiallisen yhdisteen kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia 5-HT4B-reseptorin aktivoitumiseen, ja mitataan toisen välittäjäai-20 neen vaste kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa ja puuttuessa, jolloin muutos toisen välittäjäaineen vasteessa kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa osoittaa, että kemiallinen yhdiste aktivoi 5-HT4B-reseptoria.
23. Menetelmä sen määrittämiseksi, sitoutuuko kemi- _ 25 allinen yhdiste spesifisesti ja inhiboiko se 5-HT4B- reseptorin aktivoitumista, jolloin 5-HT4B-reseptorilla on aminohapposekvenssi, joka on sama kuin aminohapposekvenssi, jota koodaa jonkin patenttivaatimuksista 1-4 nukleiinihappo, tunnettu siitä, että saatetaan erikseen kos-30 ketukseen ei-hermosolut, jotka tuottavat toisen välittäjä-aineen vasteen ja ilmentävät pinnallaan 5-HT4B-reseptoria, tai niiden solu-uutteesta saatu membraanifraktio, sekä kemiallisen yhdisteen että toisen kemiallisen yhdisteen kanssa, jonka tiedetään aktivoivan 5HT4B-reseptoria, ja vain 35 toisen kemiallisen yhdisteen kanssa olosuhteissa, jotka ovat sopivia 5-HT4B-reseptorin aktivoitumiseen, ja mitataan BNSDOCIDkFI 111337B1 I > 87 111337 toisen välittäjäaineen vaste vain toisen kemiallisen yhdisteen läsnä Ollessa ja sekä toisen kemiallisen yhdisteen että kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa, jolloin pienempi muutos toisen välittäjäaineen vasteessa, kun läsnä on sekä 5 kemiallista yhdistettä että toista kemiallista yhdistettä, kuin vain toisen kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa osoittaa, että kemiallinen yhdiste inhiboi 5-HT4B-reseptorin aktivoitumista .
24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että toinen välittäjäainevaste kä sittää adenylaattisyklaasiaktiivisuuden ja muutos toisen välittäjäaineen vasteessa on lisäys adenylaattisyklaasin aktiivisuudessa.
25. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että toinen välittäjäainevaste kä sittää adenylaattisyklaasiaktiivisuuden ja muutos toisen välittäjäaineen vasteessa on pienempi lisäys adenylaat-tisyntaasiaktiivisuuden tasossa, kun läsnä on sekä kemiallista yhdistettä että toista kemiallista yhdistettä, kuin 20 vain toisen kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa.
26. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen välittäjäainevaste kä sittää solunsisäiset kalsiumtasot ja muutos toisen välittäjäaineen vasteessa on lisäys solunsisäisissä kalsiumtasois- .1 25 sa.
27. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen välittäjäainevaste kä sittää solunsisäiset kalsiumtasot ja muutos toisen välittäjäaineen vasteessa on pienempi lisäys solunsisäisissä kal- 30 siumtasoissa, kun läsnä on sekä kemiallista yhdistettä että *. toista kemiallista yhdistettä, kuin vain toisen kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa.
28. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen välittäjäainevaste kä- 35 sittää inositolifosfaattimetaboliittitasot ja muutos toisen BNSDOCID: <FI 111337B1 I > 111337 88 välittäjäaineen vasteessa on lisäys inositolifosfaattimeta-boliittitasoissa.
29. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen välittäjäainevaste kä-5 sittää inositolifosfaattimetaboliittitasot ja muutos toisen välittäjäaineen vasteessa on pienempi lisäys inositolifos-faattimetaboliittitasoissa, kun läsnä on sekä kemiallista yhdistettä että toista kemiallista yhdistettä, kuin vain toisen kemiallisen yhdisteen läsnä ollessa.
30. Jonkin patenttivaatimuksista 20 - 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5-HT4B-reseptori on nisäkkään reseptori tai ihmisen reseptori.
31. Jonkin patenttivaatimuksista 20 - 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ei-hermosolu on ni- 15 säkässolu tai hyönteissolu.
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että nisäkässolu on Cos-7-solu tai LM (tk") -solu.
33. Menetelmä farmaseuttisen koostumuksen valmista- 20 miseksi, tunnettu siitä, että otetaan kemiallinen yhdiste, identifioidaan yhdiste yhdisteeksi, joka sitoutuu spesifisesti 5-HT4B-reseptoriin, minkä tahansa patenttivaatimuksista 20 - 23 mukaisella menetelmällä ja sekoitetaan yhdiste farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa.
34. Menetelmä kemiallisen yhdisteen saamiseksi, tunnettu siitä, että identifioidaan kemiallinen yhdiste, joka sitoutuu spesifisesti 5-HT4B-reseptoriin, minkä tahansa patenttivaatimuksista 20 - 23 mukaisella menetelmällä ja valmistetaan kemiallinen yhdiste. 1 BNSDOCID: <FI 111337B1 I > « 89 111337
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US97169092A | 1992-11-03 | 1992-11-03 | |
| US97169092 | 1992-11-03 | ||
| US9310553 | 1993-10-29 | ||
| PCT/US1993/010553 WO1994009828A1 (en) | 1992-11-03 | 1993-10-29 | Dna encoding a human serotonin receptor (5-ht4b) and uses thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI952094A0 FI952094A0 (fi) | 1995-05-02 |
| FI952094A FI952094A (fi) | 1995-06-29 |
| FI111337B true FI111337B (fi) | 2003-07-15 |
Family
ID=25518691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI952094A FI111337B (fi) | 1992-11-03 | 1995-05-02 | Ihmisen serotoniinireseptoria (5-HT4B) koodaava DNA ja sen käyttö |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5985585A (fi) |
| EP (1) | EP0624100B1 (fi) |
| JP (1) | JPH08506240A (fi) |
| KR (1) | KR950704001A (fi) |
| AT (1) | ATE192490T1 (fi) |
| AU (1) | AU686580B2 (fi) |
| CA (1) | CA2127117C (fi) |
| DE (2) | DE69328549T2 (fi) |
| ES (1) | ES2070104T1 (fi) |
| FI (1) | FI111337B (fi) |
| GR (1) | GR950300029T1 (fi) |
| HU (1) | HU221822B1 (fi) |
| NO (1) | NO951689L (fi) |
| NZ (1) | NZ258320A (fi) |
| WO (1) | WO1994009828A1 (fi) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6300087B1 (en) * | 1992-11-03 | 2001-10-09 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof |
| KR950704001A (ko) | 1992-11-03 | 1995-11-17 | 캐서린 피. 멀닉스 | 인간 세로토닌 수용체(5-ht_4b)를 암호화하는 dna 및 그 용도 |
| US6228864B1 (en) * | 1997-10-28 | 2001-05-08 | Vivus, Inc. | Administration of 5-HT receptor agonists and antagonists, to treat premature ejaculation |
| FR2771741B1 (fr) * | 1997-11-28 | 2001-07-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Variants d'epissage du recepteur serotoninergique 5-ht4 humain et leurs applications, notamment pour le criblage |
| EP0998923A1 (en) * | 1998-10-30 | 2000-05-10 | Basf Aktiengesellschaft | Use of 5-HT7 receptor agonists for the treatment or prophylaxis of ischemias |
| AU4856600A (en) | 1999-05-18 | 2000-12-05 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Use of agonists or antagonists of the 5-ht7 receptor to treat disorders of the bladder |
| ATE312943T1 (de) * | 2000-02-17 | 2005-12-15 | Glaxo Group Ltd | Polymorphismen des 5- hydroxytryptamintransportergens |
| US20040023876A1 (en) * | 2000-10-31 | 2004-02-05 | Yonghong Xiao | Regulation of human serotonin receptor precursor |
| US6989239B2 (en) * | 2001-06-20 | 2006-01-24 | R.E.D. Laboratories, N.V./S.A. | Methods for diagnosis and treatment of chronic immune diseases |
| JPWO2003066672A1 (ja) * | 2002-02-08 | 2005-06-09 | 坂本 賢二 | ペプチド |
| US7463934B2 (en) * | 2002-04-12 | 2008-12-09 | Medtronic, Inc. | Implantable medical device with captivation fixation |
| FR2846559B1 (fr) | 2002-10-31 | 2007-06-15 | Centre Nat Rech Scient | Composition pharmaceutique pour la preparation d'un medicament destine a traiter et/ou a prevenir une pathologie liee a une conduite obsessionnelle |
| US20070128603A1 (en) * | 2003-05-28 | 2007-06-07 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostic and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 7 (5-ht7) |
| US9395365B2 (en) * | 2009-04-02 | 2016-07-19 | Abbott Point Of Care, Inc. | Detection of infectious disease in a human or animal by measuring specific phagocytosis in a thin film sample of their anticoagulated blood |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1208146A (en) * | 1983-10-27 | 1986-07-22 | Tai-Kin Wong | Method of transferring genes into cells |
| US4985352A (en) * | 1988-02-29 | 1991-01-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA encoding serotonin 1C (5HT1c) receptor, isolated 5HT1c receptor, mammalian cells expressing same and uses thereof |
| AU652349B2 (en) * | 1989-10-27 | 1994-08-25 | Salk Institute For Biological Studies, The | Glutamate receptor compositions and methods |
| WO1991013979A1 (en) * | 1990-03-05 | 1991-09-19 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic mouse overexpressing il-4 and method of use |
| US5155218A (en) * | 1990-05-08 | 1992-10-13 | Neurogenetic Corporation | Dna encoding human 5-ht1d receptors |
| US5225543A (en) * | 1991-03-28 | 1993-07-06 | American Cyanamid Company | Receptors method for purification of g protein-linked |
| AU672768B2 (en) * | 1991-12-02 | 1996-10-17 | Lundbeck Research Usa, Inc. | DNA encoding a human 5-HT-1E receptor and uses thereof |
| US5360735A (en) * | 1992-01-08 | 1994-11-01 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells |
| FR2693200B1 (fr) * | 1992-07-01 | 1994-08-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polypeptides et utilisations. |
| FR2693201B1 (fr) * | 1992-07-01 | 1994-08-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polyptides et utilisations. |
| WO1994010311A1 (en) * | 1992-10-26 | 1994-05-11 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | The pct-65 serotonin receptor |
| KR950704001A (ko) | 1992-11-03 | 1995-11-17 | 캐서린 피. 멀닉스 | 인간 세로토닌 수용체(5-ht_4b)를 암호화하는 dna 및 그 용도 |
| FR2699922B1 (fr) * | 1992-12-30 | 1995-02-10 | Inst Nat Sante Rech Med | Polypeptides à activité de récepteur sérotoninergique, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes vecteurs et hôtes les exprimant, et application au criblage des médicaments. |
| US5968817A (en) * | 1993-03-15 | 1999-10-19 | The Scripps Research Institute | DNA encoding serotonin receptors |
| US7980514B2 (en) * | 2008-03-14 | 2011-07-19 | Northrop Grumman Space & Mission Systems Corp. | Solar array momentum control |
-
1993
- 1993-10-29 KR KR1019950701757A patent/KR950704001A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-10-29 DE DE69328549T patent/DE69328549T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 US US08/157,185 patent/US5985585A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 WO PCT/US1993/010553 patent/WO1994009828A1/en active IP Right Grant
- 1993-10-29 DE DE0624100T patent/DE624100T1/de active Pending
- 1993-10-29 AT AT94901252T patent/ATE192490T1/de active
- 1993-10-29 HU HU9501261A patent/HU221822B1/hu active IP Right Grant
- 1993-10-29 EP EP94901252A patent/EP0624100B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 CA CA002127117A patent/CA2127117C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 NZ NZ258320A patent/NZ258320A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-10-29 ES ES94901252T patent/ES2070104T1/es active Pending
- 1993-10-29 JP JP6511402A patent/JPH08506240A/ja active Pending
- 1993-10-29 AU AU55909/94A patent/AU686580B2/en not_active Expired
-
1994
- 1994-07-27 US US08/281,526 patent/US6083749A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-02 NO NO951689A patent/NO951689L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-05-02 FI FI952094A patent/FI111337B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-06-30 GR GR950300029T patent/GR950300029T1/el unknown
-
1999
- 1999-06-14 US US09/332,837 patent/US6432655B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-29 US US09/450,790 patent/US6376243B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0624100A4 (en) | 1995-11-29 |
| NO951689L (no) | 1995-06-21 |
| ES2070104T1 (es) | 1995-06-01 |
| CA2127117C (en) | 2001-02-13 |
| DE69328549T2 (de) | 2000-08-24 |
| KR950704001A (ko) | 1995-11-17 |
| FI952094A0 (fi) | 1995-05-02 |
| WO1994009828A1 (en) | 1994-05-11 |
| DE69328549D1 (de) | 2000-06-08 |
| US6376243B1 (en) | 2002-04-23 |
| NZ258320A (en) | 1996-12-20 |
| FI952094A (fi) | 1995-06-29 |
| JPH08506240A (ja) | 1996-07-09 |
| NO951689D0 (no) | 1995-05-02 |
| GR950300029T1 (en) | 1995-06-30 |
| US6432655B1 (en) | 2002-08-13 |
| US6083749A (en) | 2000-07-04 |
| EP0624100B1 (en) | 2000-05-03 |
| HU221822B1 (hu) | 2003-01-28 |
| EP0624100A1 (en) | 1994-11-17 |
| AU5590994A (en) | 1994-05-24 |
| DE624100T1 (de) | 1995-11-09 |
| AU686580B2 (en) | 1998-02-12 |
| CA2127117A1 (en) | 1994-05-11 |
| ATE192490T1 (de) | 2000-05-15 |
| US5985585A (en) | 1999-11-16 |
| HUT72837A (en) | 1996-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU685076B2 (en) | DNA encoding 5-HT4 serotonin receptors and uses thereof | |
| EP0574579B1 (en) | Dna encoding a human 5-ht 1f receptor and uses thereof | |
| US5989834A (en) | Uses of nucleic acid encoding neuropeptide Y/peptide YY (Y2) receptors nucleic acid encoding | |
| JP4216326B2 (ja) | ヒト神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ／膵臓ポリペプチド受容体（ｙ４）をコードしたｄｎａ、及び該ｄｎａの使用 | |
| JP2002514055A (ja) | ガラニンｇａｌｒ３受容体をコードするｄｎａおよびその使用 | |
| FI111337B (fi) | Ihmisen serotoniinireseptoria (5-HT4B) koodaava DNA ja sen käyttö | |
| US6300087B1 (en) | DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof | |
| US20030166066A1 (en) | DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof | |
| US6406859B1 (en) | DNA encoding a 5-HT 1F receptor and uses thereof | |
| AU703697B2 (en) | DNA encoding a human 5-HT1F receptor and uses thereof | |
| AU667510C (en) | DNA encoding a human 5-HT-1F receptor and uses thereof | |
| Gerald et al. | DNA encoding 5-HT4A serotonin receptors | |
| US20020081661A1 (en) | DNA encoding 5-HT4 serotonin receptors and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FD | Application lapsed | ||
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: LUNDBECK RESEARCH USA, INC. Free format text: LUNDBECK RESEARCH USA, INC. |
|
| MA | Patent expired |