HU221822B1 - Humán szerotonin receptort (5-HT4B-receptort) kódoló DNS és alkalmazása - Google Patents
Humán szerotonin receptort (5-HT4B-receptort) kódoló DNS és alkalmazása Download PDFInfo
- Publication number
- HU221822B1 HU221822B1 HU9501261A HU9501261A HU221822B1 HU 221822 B1 HU221822 B1 HU 221822B1 HU 9501261 A HU9501261 A HU 9501261A HU 9501261 A HU9501261 A HU 9501261A HU 221822 B1 HU221822 B1 HU 221822B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- receptor
- nucleic acid
- chemical compound
- human
- cell
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 185
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 title description 49
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 title description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 107
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 59
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 8
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 742
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 139
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 110
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 85
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 74
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 68
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 64
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 61
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 61
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 30
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 25
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 claims description 20
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 claims description 20
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 19
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 3
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 claims description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical class OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 claims 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 claims 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 416
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 405
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 67
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 66
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 42
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 42
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 40
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 35
- WKZLNEWVIAGNAW-UHFFFAOYSA-N 5-Carboxyamidotryptamine Chemical compound C1=C(C(N)=O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 WKZLNEWVIAGNAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 19
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 19
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 17
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 15
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 14
- RLJFTICUTYVZDG-UHFFFAOYSA-N Methiothepine Chemical compound C12=CC(SC)=CC=C2SC2=CC=CC=C2CC1N1CCN(C)CC1 RLJFTICUTYVZDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 13
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 13
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- JTEJPPKMYBDEMY-UHFFFAOYSA-N 5-methoxytryptamine Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCN)C2=C1 JTEJPPKMYBDEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 8
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 7
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- VKRAXSZEDRWLAG-SJKOYZFVSA-N 2-bromo-lsd Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N(CC)CC)C2)=C3C2=C(Br)NC3=C1 VKRAXSZEDRWLAG-SJKOYZFVSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 6
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- ASXGJMSKWNBENU-UHFFFAOYSA-N 8-OH-DPAT Chemical compound C1=CC(O)=C2CC(N(CCC)CCC)CCC2=C1 ASXGJMSKWNBENU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 5
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 5
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 5
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 5
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- LUZRJRNZXALNLM-JGRZULCMSA-N dihydroergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4NC=C(C=34)C2)C1)C)C1=CC=CC=C1 LUZRJRNZXALNLM-JGRZULCMSA-N 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 5
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 5
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 5
- WZHJKEUHNJHDLS-QTGUNEKASA-N metergoline Chemical compound C([C@H]1CN([C@H]2[C@@H](C=3C=CC=C4N(C)C=C(C=34)C2)C1)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 WZHJKEUHNJHDLS-QTGUNEKASA-N 0.000 description 5
- 229960004650 metergoline Drugs 0.000 description 5
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 5
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 5
- 230000000862 serotonergic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091005478 5-HT1 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000035038 5-HT1 receptors Human genes 0.000 description 4
- ZSTKHSQDNIGFLM-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-N,N-dimethyltryptamine Chemical compound COC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 ZSTKHSQDNIGFLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GAAKALASJNGQKD-UHFFFAOYSA-N LY-165163 Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1CCN1CCN(C=2C=C(C=CC=2)C(F)(F)F)CC1 GAAKALASJNGQKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- JLVHTNZNKOSCNB-YSVLISHTSA-N Mesulergine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@@H](CN(C)[C@@H]2C2)NS(=O)(=O)N(C)C)=C3C2=CN(C)C3=C1 JLVHTNZNKOSCNB-YSVLISHTSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 210000004727 amygdala Anatomy 0.000 description 4
- 230000037424 autonomic function Effects 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 4
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 4
- FPCCSQOGAWCVBH-UHFFFAOYSA-N ketanserin Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1CCN(CCN2C(C3=CC=CC=C3NC2=O)=O)CC1 FPCCSQOGAWCVBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005417 ketanserin Drugs 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229950008693 mesulergine Drugs 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- WYWIFABBXFUGLM-UHFFFAOYSA-N oxymetazoline Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C)=C1CC1=NCCN1 WYWIFABBXFUGLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JZQKKSLKJUAGIC-UHFFFAOYSA-N pindolol Chemical compound CC(C)NCC(O)COC1=CC=CC2=C1C=CN2 JZQKKSLKJUAGIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002508 pindolol Drugs 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- KQKPFRSPSRPDEB-UHFFFAOYSA-N sumatriptan Chemical compound CNS(=O)(=O)CC1=CC=C2NC=C(CCN(C)C)C2=C1 KQKPFRSPSRPDEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003708 sumatriptan Drugs 0.000 description 4
- APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N tryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN)=CNC2=C1 APJYDQYYACXCRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710138068 5-hydroxytryptamine receptor 1D Proteins 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 150000003936 benzamides Chemical class 0.000 description 3
- BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N beta-Yohimbin Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(O)C(C4CC33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 230000001593 cAMP accumulation Effects 0.000 description 3
- 230000003491 cAMP production Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 229960004170 clozapine Drugs 0.000 description 3
- QZUDBNBUXVUHMW-UHFFFAOYSA-N clozapine Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=NC2=CC(Cl)=CC=C2NC2=CC=CC=C12 QZUDBNBUXVUHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 3
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004884 grey matter Anatomy 0.000 description 3
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 3
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012051 hydrophobic carrier Substances 0.000 description 3
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 150000003906 phosphoinositides Chemical class 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- DKGZKTPJOSAWFA-UHFFFAOYSA-N spiperone Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1C(=O)CCCN1CCC2(C(NCN2C=2C=CC=CC=2)=O)CC1 DKGZKTPJOSAWFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950001675 spiperone Drugs 0.000 description 3
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KPJZHOPZRAFDTN-ZRGWGRIASA-N (6aR,9R)-N-[(2S)-1-hydroxybutan-2-yl]-4,7-dimethyl-6,6a,8,9-tetrahydroindolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)CC)C2)=C3C2=CN(C)C3=C1 KPJZHOPZRAFDTN-ZRGWGRIASA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYWNEDARFVJQSG-UHFFFAOYSA-N 2-methylserotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=C(C)NC2=C1 WYWNEDARFVJQSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FEROPKNOYKURCJ-UHFFFAOYSA-N 4-amino-N-(1-azabicyclo[2.2.2]octan-3-yl)-5-chloro-2-methoxybenzamide Chemical compound COC1=CC(N)=C(Cl)C=C1C(=O)NC1C(CC2)CCN2C1 FEROPKNOYKURCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027493 5-hydroxytryptamine receptor 1D Human genes 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NPAVRDPEFVKELR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 206010003211 Arteriosclerosis coronary artery Diseases 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- SZNGQSBRHFMZLT-IHRRRGAJSA-N Asn-Pro-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SZNGQSBRHFMZLT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N Asp-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QJHOOKBAHRJPPX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- UXIPUCUHQBIQOS-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O UXIPUCUHQBIQOS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 2
- -1 DP-5CT Chemical compound 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- 208000017228 Gastrointestinal motility disease Diseases 0.000 description 2
- MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N Glu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N MPZWMIIOPAPAKE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N Glu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- UDEPRBFQTWGLCW-CIUDSAMLSA-N Glu-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UDEPRBFQTWGLCW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N Gly-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O FUESBOMYALLFNI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000862 Ion Channels Proteins 0.000 description 2
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RXGLHDWAZQECBI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N Lysergic acid diethylamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N(CC)CC)C2)=C3C2=CNC3=C1 VAYOSLLFUXYJDT-RDTXWAMCSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 208000019022 Mood disease Diseases 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- OWSLLRKCHLTUND-BZSNNMDCSA-N Phe-Phe-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N OWSLLRKCHLTUND-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N Pro-Glu-Phe Chemical compound N([C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 WFHYFCWBLSKEMS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- CNUIHOAISPKQPY-HSHDSVGOSA-N Pro-Thr-Trp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O CNUIHOAISPKQPY-HSHDSVGOSA-N 0.000 description 2
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N Thr-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NLSNVZAREYQMGR-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N Thr-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O MEJHFIOYJHTWMK-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- CCZXBOFIBYQLEV-IHPCNDPISA-N Trp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O CCZXBOFIBYQLEV-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 JAQGKXUEKGKTKX-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 2
- 229940054066 benzamide antipsychotics Drugs 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- OZVBMTJYIDMWIL-AYFBDAFISA-N bromocriptine Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@]2(C(=O)N3[C@H](C(N4CCC[C@H]4[C@]3(O)O2)=O)CC(C)C)C(C)C)C2)=C3C2=C(Br)NC3=C1 OZVBMTJYIDMWIL-AYFBDAFISA-N 0.000 description 2
- 229960002802 bromocriptine Drugs 0.000 description 2
- VTTONGPRPXSUTJ-UHFFFAOYSA-N bufotenin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN(C)C)=CNC2=C1 VTTONGPRPXSUTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229960004704 dihydroergotamine Drugs 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 229950002454 lysergide Drugs 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 229960001186 methysergide Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 2
- 229960001528 oxymetazoline Drugs 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 108010089198 phenylalanyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000002295 serotoninergic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N yohimbine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@H](O)[C@@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-SCYLSFHTSA-N 0.000 description 2
- 229960000317 yohimbine Drugs 0.000 description 2
- 229950004681 zacopride Drugs 0.000 description 2
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NTUPOKHATNSWCY-PMPSAXMXSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NTUPOKHATNSWCY-PMPSAXMXSA-N 0.000 description 1
- ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;(2s)-2,6-diaminohexanoic acid Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ALBODLTZUXKBGZ-JUUVMNCLSA-N 0.000 description 1
- UNBRKDKAWYKMIV-QWQRMKEZSA-N (6aR,9R)-N-[(2S)-1-hydroxybutan-2-yl]-7-methyl-6,6a,8,9-tetrahydro-4H-indolo[4,3-fg]quinoline-9-carboxamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)CC)C2)=C3C2=CNC3=C1 UNBRKDKAWYKMIV-QWQRMKEZSA-N 0.000 description 1
- JZQKKSLKJUAGIC-NSHDSACASA-N (S)-(-)-pindolol Chemical compound CC(C)NC[C@H](O)COC1=CC=CC2=C1C=CN2 JZQKKSLKJUAGIC-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- JRZGPXSSNPTNMA-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(N)CCCC2=C1 JRZGPXSSNPTNMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VNICFCQJUVFULD-UHFFFAOYSA-N 1-(1-naphthalenyl)piperazine Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=CC2=CC=CC=C12 VNICFCQJUVFULD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKIMDKMETPPURN-UHFFFAOYSA-N 1-(3-(trifluoromethyl)phenyl)piperazine Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(N2CCNCC2)=C1 KKIMDKMETPPURN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHFVKMTVMIZMIK-UHFFFAOYSA-N 1-(3-chlorophenyl)piperazine Chemical compound ClC1=CC=CC(N2CCNCC2)=C1 VHFVKMTVMIZMIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001637 1-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(*)=C([H])C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- IHWDSEPNZDYMNF-UHFFFAOYSA-N 1H-indol-2-amine Chemical class C1=CC=C2NC(N)=CC2=C1 IHWDSEPNZDYMNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNRGQMMCGHDTEI-UHFFFAOYSA-N 1H-indole-3-carboxylic acid (8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-3-yl) ester Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)OC3CC4CCC(C3)N4C)=CNC2=C1 ZNRGQMMCGHDTEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNRGQMMCGHDTEI-FUNVUKJBSA-N 1H-indole-3-carboxylic acid [(1R,5S)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-3-yl] ester Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)OC3C[C@H]4CC[C@@H](C3)N4C)=CNC2=C1 ZNRGQMMCGHDTEI-FUNVUKJBSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 2-(diethylamino)ethyl 4-aminobenzoate;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid;hydrate Chemical compound O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 KZDCMKVLEYCGQX-UDPGNSCCSA-N 0.000 description 1
- WKZLNEWVIAGNAW-DOMYTETQSA-N 3-(2-amino-1,1,2,2-tetratritioethyl)-1h-indole-5-carboxamide Chemical compound C1=C(C(N)=O)C=C2C(C([3H])([3H])C([3H])(N)[3H])=CNC2=C1 WKZLNEWVIAGNAW-DOMYTETQSA-N 0.000 description 1
- DPXOFRGRKPFZOD-UHFFFAOYSA-N 3-[2-(dipropylamino)ethyl]-1H-indole-5-carboxamide Chemical compound C1=C(C(N)=O)C=C2C(CCN(CCC)CCC)=CNC2=C1 DPXOFRGRKPFZOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKPDXBXNJWWWGQ-UHFFFAOYSA-N 5-benzyloxytryptamine Chemical compound C1=C2C(CCN)=CNC2=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 WKPDXBXNJWWWGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710138638 5-hydroxytryptamine receptor 1A Proteins 0.000 description 1
- 102100022738 5-hydroxytryptamine receptor 1A Human genes 0.000 description 1
- 101710138639 5-hydroxytryptamine receptor 1B Proteins 0.000 description 1
- 102100027499 5-hydroxytryptamine receptor 1B Human genes 0.000 description 1
- 229940097276 5-methoxytryptamine Drugs 0.000 description 1
- JVGBTTIJPBFLTE-UHFFFAOYSA-N 8-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-3-ylmethyl)-1-phenyl-1,3,8-triazaspiro[4.5]decan-4-one Chemical compound C1CN(CC2OC3=CC=CC=C3OC2)CCC11C(=O)NCN1C1=CC=CC=C1 JVGBTTIJPBFLTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003345 Adrenergic Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000017910 Adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N Arg-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OQCWXQJLCDPRHV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O LQJAALCCPOTJGB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N Arg-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NGYHSXDNNOFHNE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N Arg-Pro-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N Arg-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZPWMEWYQBWSGAO-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N Arg-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SEKBHZJLARBNPB-GHCJXIJMSA-N Asn-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SEKBHZJLARBNPB-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HXWUJJADFMXNKA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNYCNNPOFYBCEK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- ILJQISGMGXRZQQ-IHRRRGAJSA-N Asp-Arg-Tyr Chemical group [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ILJQISGMGXRZQQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N Asp-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O AYFVRYXNDHBECD-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N Asp-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O UKGGPJNBONZZCM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071131 Autoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007527 Autoreceptors Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 102000017063 Catecholamine Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010013659 Catecholamine Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000018152 Cerebral disease Diseases 0.000 description 1
- 102100025840 Coiled-coil domain-containing protein 86 Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS NXTYATMDWQYLGJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VPQZSNQICFCCSO-BJDJZHNGSA-N Cys-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VPQZSNQICFCCSO-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- MSWBLPLBSLQVME-XIRDDKMYSA-N Cys-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CS)=CNC2=C1 MSWBLPLBSLQVME-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N Ergometrine Natural products C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N 0.000 description 1
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- VPKBCVUDBNINAH-GARJFASQSA-N Glu-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O VPKBCVUDBNINAH-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N Gly-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N RJIVPOXLQFJRTG-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N Gly-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IEFJWDNGDZAYNZ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN QITBQGJOXQYMOA-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N Gly-Ile-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O AAHSHTLISQUZJL-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- VLIJYPMATZSOLL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Cys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN VLIJYPMATZSOLL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- IMRNSEPSPFQNHF-STQMWFEESA-N Gly-Ser-Trp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C12)C(=O)O IMRNSEPSPFQNHF-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- UQABYHGXWYXDTK-UUOKFMHZSA-N GppNP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)NP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UQABYHGXWYXDTK-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 108010078321 Guanylate Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000014469 Guanylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150004776 HTR1E gene Proteins 0.000 description 1
- VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N His-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 VHOLZZKNEBBHTH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000000543 Histamine Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002059 Histamine Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000932708 Homo sapiens Coiled-coil domain-containing protein 86 Proteins 0.000 description 1
- 101150039275 Htr1f gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N Ile-Asn-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N Ile-Cys-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)O)N PFTFEWHJSAXGED-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N Ile-Leu-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N GVKKVHNRTUFCCE-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- LRAUKBMYHHNADU-DKIMLUQUSA-N Ile-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CC=CC=C1 LRAUKBMYHHNADU-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N Ile-Pro-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- ZUWSVOYKBCHLRR-MGHWNKPDSA-N Ile-Tyr-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N ZUWSVOYKBCHLRR-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N Ile-Tyr-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N ZGKVPOSSTGHJAF-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N Leu-Gly-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UCDHVOALNXENLC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INCJJHQRZGQLFC-KBPBESRZSA-N Leu-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O INCJJHQRZGQLFC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O VULJUQZPSOASBZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XXXXOVFBXRERQL-ULQDDVLXSA-N Leu-Pro-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XXXXOVFBXRERQL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N Leu-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PPGBXYKMUMHFBF-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C QWWPYKKLXWOITQ-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- HGLKOTPFWOMPOB-MEYUZBJRSA-N Leu-Thr-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HGLKOTPFWOMPOB-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N Leu-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O WFCKERTZVCQXKH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 UETQMSASAVBGJY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N Lys-Phe Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QCZYYEFXOBKCNQ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN YQAIUOWPSUOINN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N Lysergic acid propanolamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N Met-Asp-Val Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O FVKRQMQQFGBXHV-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- SNIXRMIHFOIVBB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxyl-tryptamine Chemical compound C1=CC=C2C(CCNO)=CNC2=C1 SNIXRMIHFOIVBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- DPWPWRLQFGFJFI-UHFFFAOYSA-N Pargyline Chemical compound C#CCN(C)CC1=CC=CC=C1 DPWPWRLQFGFJFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 GLUBLISJVJFHQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- HQPWNHXERZCIHP-PMVMPFDFSA-N Phe-Leu-Trp Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 HQPWNHXERZCIHP-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N Phe-Pro-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=CC=C1 MMJJFXWMCMJMQA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N Phe-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NYQBYASWHVRESG-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N Phe-Tyr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O MMPBPRXOFJNCCN-ZEWNOJEFSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N Pro-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 SGCZFWSQERRKBD-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N Pro-Glu-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PULPZRAHVFBVTO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XQSREVQDGCPFRJ-STQMWFEESA-N Pro-Gly-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O XQSREVQDGCPFRJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- DRKAXLDECUGLFE-ULQDDVLXSA-N Pro-Leu-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O DRKAXLDECUGLFE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- SRBFGSGDNNQABI-FHWLQOOXSA-N Pro-Leu-Trp Chemical compound N([C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 SRBFGSGDNNQABI-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- BUEIYHBJHCDAMI-UFYCRDLUSA-N Pro-Phe-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BUEIYHBJHCDAMI-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 RWCOTTLHDJWHRS-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FHZJRBVMLGOHBX-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O FHZJRBVMLGOHBX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ICHZYBVODUVUKN-SRVKXCTJSA-N Ser-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ICHZYBVODUVUKN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Cys Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SVWQEIRZHHNBIO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N Ser-Ile-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ZOPISOXXPQNOCO-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LZLREEUGSYITMX-JQWIXIFHSA-N Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(O)=O)=CNC2=C1 LZLREEUGSYITMX-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO ILVGMCVCQBJPSH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- GZYNMZQXFRWDFH-YTWAJWBKSA-N Thr-Arg-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O GZYNMZQXFRWDFH-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N Trp-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N UJRIVCPPPMYCNA-HOCLYGCPSA-N 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- AKFLVKKWVZMFOT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AKFLVKKWVZMFOT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N Tyr-Arg-Ser Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O IIJWXEUNETVJPV-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N Tyr-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ONWMQORSVZYVNH-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PMDWYLVWHRTJIW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N Tyr-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O DWAMXBFJNZIHMC-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N Yohimbine Natural products C1=CC=C2C(CCN3C[C@@H]4CC[C@@H](O)[C@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-CCZXDCJGSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000010457 affective process Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N alpha-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000949 anxiolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 108010059459 arginyl-threonyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 239000003693 atypical antipsychotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940127236 atypical antipsychotics Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000019994 cava Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 241000902900 cellular organisms Species 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- DCSUBABJRXZOMT-IRLDBZIGSA-N cisapride Chemical compound C([C@@H]([C@@H](CC1)NC(=O)C=2C(=CC(N)=C(Cl)C=2)OC)OC)N1CCCOC1=CC=C(F)C=C1 DCSUBABJRXZOMT-IRLDBZIGSA-N 0.000 description 1
- 229960005132 cisapride Drugs 0.000 description 1
- DCSUBABJRXZOMT-UHFFFAOYSA-N cisapride Natural products C1CC(NC(=O)C=2C(=CC(N)=C(Cl)C=2)OC)C(OC)CN1CCCOC1=CC=C(F)C=C1 DCSUBABJRXZOMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012059 conventional drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- JJCFRYNCJDLXIK-UHFFFAOYSA-N cyproheptadine Chemical compound C1CN(C)CCC1=C1C2=CC=CC=C2C=CC2=CC=CC=C21 JJCFRYNCJDLXIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001140 cyproheptadine Drugs 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000001731 descending colon Anatomy 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- RHGUXDUPXYFCTE-ZWNOBZJWSA-N ergoline Chemical class C1=CC([C@@H]2[C@H](NCCC2)C2)=C3C2=CNC3=C1 RHGUXDUPXYFCTE-ZWNOBZJWSA-N 0.000 description 1
- 229960001405 ergometrine Drugs 0.000 description 1
- 229960003133 ergot alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N ginsenoside K Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O FVIZARNDLVOMSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001905 globus pallidus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010085059 glutamyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010084389 glycyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000012296 in situ hybridization assay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000000670 ligand binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000002197 limbic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003715 limbic system Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010038320 lysylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229960000328 methylergometrine Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000754 myometrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008058 pain sensation Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229960001779 pargyline Drugs 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 210000003899 penis Anatomy 0.000 description 1
- 108010009779 peptide 32 Proteins 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- XRXDAJYKGWNHTQ-UHFFFAOYSA-N quipazine Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C=CC=C2)C2=N1 XRXDAJYKGWNHTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950002315 quipazine Drugs 0.000 description 1
- BLGXFZZNTVWLAY-DIRVCLHFSA-N rauwolscine Chemical compound C1=CC=C2C(CCN3C[C@H]4CC[C@H](O)[C@H]([C@H]4C[C@H]33)C(=O)OC)=C3NC2=C1 BLGXFZZNTVWLAY-DIRVCLHFSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000004648 relaxation of smooth muscle Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005316 response function Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- JUQLTPCYUFPYKE-UHFFFAOYSA-N ritanserin Chemical compound CC=1N=C2SC=CN2C(=O)C=1CCN(CC1)CCC1=C(C=1C=CC(F)=CC=1)C1=CC=C(F)C=C1 JUQLTPCYUFPYKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950009626 ritanserin Drugs 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 239000002868 serotonin 5-HT1 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 150000003377 silicon compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 229950001330 spiroxatrine Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000542 thalamic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004001 thalamic nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013334 tissue model Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 1
- 238000012301 transgenic model Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNRGQMMCGHDTEI-ITGUQSILSA-N tropisetron Chemical compound C1=CC=C2C(C(=O)O[C@H]3C[C@H]4CC[C@@H](C3)N4C)=CNC2=C1 ZNRGQMMCGHDTEI-ITGUQSILSA-N 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
- AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N yohimbine carboxylic acid Natural products C1=CC=C2C(CCN3CC4CCC(C(C4CC33)C(O)=O)O)=C3NC2=C1 AADVZSXPNRLYLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0375—Animal model for cardiovascular diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát a humán szerotoninreceptort (az 5–HT4B-receptortvagy más elnevezés szerint 5–HT7-receptort) kódolónukleinsavmolekulák, előnyösen DNS, a nukleinsavmolekulákkalhibridizálódni képes oligonukleotidok (nukleinsavpróbák) és amolekulák által kódolt receptorprotein képezik. A találmány tárgyátképezik továbbá a nuk- leinsavmolekulákat tartalmazó vektorok éssejtek, valamint eljárások az 5–HT4B-receptorhoz kötődő, azt aktiválóvagy aktiválódását gátló kémiai vegyületek azonosítására éselőállítására, továbbá ilyen vegyületeket tartalmazó gyó- gyászatikészítmények előállítására. A találmány szerinti megoldás egyebekközött alkalmas a humán szerotoninreceptor rendellenes expressziójábólfakadó rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyászati készítményekelőállítására és a szerotoninreceptor alkalmazásán alapulókötődésvizsgálati eljárások kifejlesztésére, például új receptorkötőhatóanyagok izolálásának céljából. ŕ
Description
KIVONAT
A találmány tárgyát a humán szerotoninreceptort (az 5-HT4B-receptort vagy más elnevezés szerint 5-HT7receptort) kódoló nukleinsavmolekulák, előnyösen DNS, a nukleinsavmolekulákkal hibridizálódni képes oligonukleotidok (nukleinsavpróbák) és a molekulák által kódolt receptorprotein képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a nukleinsavmolekulákat tartalmazó vektorok és sejtek, valamint eljárások az 5-HT4B-receptorhoz kötődő, azt aktiváló vagy aktiválódását gátló kémiai vegyületek azonosítására és előállítására, továbbá ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.
A találmány szerinti megoldás egyebek között alkalmas a humán szerotoninreceptor rendellenes expressziójából fakadó rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására és a szerotoninreceptor alkalmazásán alapuló kötődés vizsgálati eljárások kifejlesztésére, például új receptorkötő hatóanyagok izolálásának céljából.
HU 221 822 B1
A leírás terjedelme 44 oldal (ezen belül 12 lap ábra)
HU 221 822 Β1
A találmány tárgyát a humán szerotoninreceptort (az 5-HT4B-receptort vagy más elnevezés szerint 5-HT7receptort) kódoló nukleinsavmolekulák, előnyösen DNS, a nukleinsavmolekulákkal hibridizálódni képes oligonukleotidok (nukleinsavpróbák) és a molekulák által kódolt receptorprotein képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a nukleinsavmolekulákat tartalmazó vektorok és sejtek, valamint eljárások az 5-HT4B-receptorhoz kötődő, azt aktiváló vagy aktiválódását gátló kémiai vegyületek azonosítására és előállítására, továbbá ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.
A leírásban az 5-HT4B-receptor elnevezést használtuk, mely elnevezést az IUPHAR „Serotonin-Receptor Nomenclature Comittee” 5-HT7-receptorra változtatott. Tehát valamennyi, az 5-HT4B-receptorra és az 5-HT4B-receptort kódoló nukleinsavmolekulákra közvetlenül vagy közvetett módon vonatkozó igénypont vonatkozik az 5-HT7-receptorra és az 5-HT7-receptort kódoló nukleinsavmolekulákra is.
A találmány szerinti megoldás egyebek között alkalmas a humán szerotoninreceptor rendellenes expressziójából fakadó rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására és a szerotoninreceptor alkalmazásán alapuló kötődésvizsgálati eljárások kifejlesztésére, például új receptorkötő hatóanyagok izolálásának céljából.
A találmány tárgyát képezik közelebbről az említett DNS-szekvenciával hibridizálódni képes oligonukleotidok, az oligonukleotidok alkalmazásán alapuló receptorprotein-kimutatási eljárások, a szekvenciához képest antiszensz oligonukleotidok, a DNS-szekvenciát hordozó vektorok, a vektorokkal transzformált gazdasejtek és transzgenikus állatok, a DNS által kódolt receptorprotein, a receptorprotein ellen termeltetett ellenanyagok, a DNS rendellenes expressziójából fakadó rendellenességek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények, eljárások a receptorprotein előállítására, a receptorprotein alkalmazásán alapuló új receptorkötő hatóanyagok kifejlesztésére is alkalmas kötődésvizsgálati eljárások, az ilyen eljárásokkal kifejlesztett hatóanyagok, valamint a találmány szerinti gyógyászati készítmények alkalmazásán alapuló kezelési eljárások.
A leírásban számos publikációra zárójelbe téve hivatkozunk. Az utalások teljes irodalomjegyzéke alfabetikus sorrendben megtalálható a leírás végén, az igénypontokat közvetlenül megelőzően. Az idézett publikációkat teljes egészükben a technika állásához tartozó kitanítás részeként kell tekinteni.
Elsődleges aminosavszekvenciára és szignáltranszdukcióra vonatkozó adatokat mostanáig négy klónozott 5-HTrosztályba sorolható receptor, három klónozott 5-HT2-receptor és egy 5-HT3-receptor esetében közöltek. Ezeket a receptorokat a szekvenciahomológia, valamint a szignáltranszdukció módjának analízise alapján az alábbiak szerint csoportosították: az 5-HTralcsaládba tartoznak: az 5-HT1A [Fargin: (1988); Kobilka: (1989)], az 5-HT1B/5-HT1Dp [Weinshank és munkatársai: (1991) stb.], az 5-HT1Da [Branchek és munkatársai: (1991); Hamblin és Metcalf: (1991); Weinshank és munkatársai: (1992)], az 5-HT1E [Levy és munkatársai: (1992); McAllister és munkatársai: (1992); Zgombick és munkatársai: (1992)] és az 5-HT1F [Adham és munkatársai: (1993)]. Ezek az altípusok 50%-nál nagyobb transzmembrán-aminosavazonossággal rendelkeznek és adenilát-cikláz-gátlással kapcsolódnak. Az 5-HT2-családba tartozik az 5-HT2-receptor [Pritchett és munkatársai: (1988)], az 5-HTlc [Julius és munkatársai: (1989)], valamint az 5-HT2F [patkánygyomor fúndus; Foquet és munkatársai: (1992); Kursar és munkatársai: (1992)]. Ezek a receptorok 70%-nál nagyobb aminosavazonossággal rendelkeznek és foszfoinozitid hidrolízishez kapcsolódnak. Az 5-HT3-receptorról kimutatták, hogy az egy ligandumkapcsolódás hatására nyíló ioncsatoma [Maricq és munkatársai: (1991)]. Az 5-HT3-receptorok heterogenitása vitatott, bár más ligandumkapcsolódás hatására átjárható ioncsatomák jelentős heterogenitást mutatnak. Figyelemre méltó, hogy ebből a felsorolásból hiányoznak az 5-HT4-receptorok. A másodlagos hírvivő kapcsolódásra vonatkozó szövettani vizsgálatok arra utalnak, hogy a szignáltranszdukció elsődleges módja az adenilát-cikláz-aktiválás [Dumius és munkatársai: (1988); Bockaert és munkatársai: (1990)]. Az alábbiakban az első olyan emlőseredetű 5-HT-receptor klónozását ismertetjük, amely az adenilát-cikláz-aktivitás növekedését eredményezi, és amelynek jelölésére az 5-HT4B elnevezést javasoljuk. Ennek a receptornak a farmakológiai tulajdonságai arra utalnak, hogy hasonló lehet azokhoz a fúnkcionálisi szempontból jellemzett 5-HT-receptorokhoz, melyeket leírtak a sertés véna cava [Trevethick és munkatársai: (1984)], a macska véna saphena, a koronáriaartériák [Cushing és Cohen: (1992)] szövetében és több értágító hatás közvetítésében [Mylecharane és Phillips: (1989)]. Izolált vérereken végzett vizsgálatok alapján úgy tűnik, ezek a receptorok kontrakciós és relaxációs válaszreakciók alapját képezik, ami felveti terápiás alkalmazásuk lehetőségét anginában, koronáriaartéria-betegségekben, érelmeszesedésben, valamint feltehetően agyvérzéshez vezető agyér-rendellenességekben. Ennek az altípusnak a központi idegrendszerben való jelenléte magasabb rendű kognitív folyamatokat érintő rendellenességekben, valamint autonóm funkciók szabályozásában való alkalmazás lehetőségére is utal.
Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekula képezi. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az izolált nukleinsav humán 5-HT4B-receptort kódol. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a nukleinsavmolekula tartalmazza a pcEXV-5-HT4B elnevezésű plazmid szekvenciáját [ATCC 75 332 nyilvántartási szám).
A találmány tárgyát képezi egy legalább 15 nukleotidból álló nukleinsav hibridizációs próba, amely az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló nukleinsavmolekula szekvenciájában található szekvenciával specifikusan hibridizálódó nukleinsavmolekulát tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá egy legalább 15 nukleotidból álló nukleinsavmolekula, amely a humán 5-HT4B2
HU 221 822 Β1 receptort kódoló nukleinsavmolekula szekvenciájában található szekvenciával specifikusan hibridizálódik.
A találmány tárgyát képezi az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-molekulához specifikusan kötődő szekvenciával rendelkező antiszensz oligonukleotid, amely képes az mRNS transzlációjának megakadályozására. A találmány tárgyát képezi továbbá a humán 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-molekulához specifikusan kötődő szekvenciával rendelkező antiszensz oligonukleotid, amely képes az mRNS transzlációjának megakadályozására.
A találmány tárgyát képezik emlőseredetű 5-HT4Breceptorral szemben előállított monoklonális ellenanyagok. A találmány tárgyát képezik továbbá humán 5-HT4B-receptorral szemben előállított monoklonális ellenanyagok.
A találmány tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények, melyek elegendő mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak ahhoz, hogy hatékonyan képesek legyenek javítani az emlőseredetű 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expressziójából következő rendellenességeket, ezenkívül tartalmaznak egy a gyógyászatilag elfogadható hordozót, valamint olyan gyógyászati készítmények, melyek elegendő mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak ahhoz, hogy hatékonyan képesek legyenek javítani az emlőseredetű 5-HT4B-receptor elégtelen mennyiségben történő expressziójából következő rendellenességeket, ezenkívül tartalmaznak egy gyógyászatilag elfogadható hordozót.
A találmány tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények, melyek elegendő mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak ahhoz, hogy hatékonyan képesek legyenek javítani a humán 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expressziójából következő rendellenességeket, ezenkívül tartalmaznak egy a gyógyászatilag elfogadható hordozót. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan gyógyászati készítmények, melyek elegendő mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak ahhoz, hogy hatékonyan képesek legyenek javítani a humán 5-HT4B-receptor elégtelen mennyiségben történő expressziójából következő rendellenességeket, ezenkívül tartalmaznak egy a gyógyászatilag elfogadható hordozót.
A találmány tárgyát képezik transzgenikus nem humán emlősök, melyek genomja tartalmazza az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t oly módon elhelyezve a genomban, hogy az az emlőseredetű 5-HT4Breceptort kódoló mRNS-sel komplementer antiszenszmRNS-sé íródjon át és a komplementer mRNS az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel hibridizálódva csökkentse az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mRNS transzlációját.
A találmány tárgyát képezik továbbá transzgenikus nem humán emlősök, melyek genomja tartalmazza a humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t oly módon elhelyezve a genomban, hogy az a humán 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel komplementer antiszenszmRNS-sé íródjon át és a humán 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel hibridizálódva a komplementer mRNS csökkentse a humán 5-HT4B-receptort kódoló mRNS transzlációját.
A találmány tárgyát képezik transzgenikus nem humán emlősök, melyek genomja tartalmazza az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t oly módon elhelyezve a genomban, hogy az az emlőseredetű 5-HT4Breceptort kódoló mRNS-sel komplementer antiszenszmRNS-sé íródjon át és az 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel hibridizálva az antiszensz-mRNS akadályozza meg az 5-HT4B-receptort kódoló mRNS transzlációját.
A találmány tárgyát képezik továbbá transzgenikus nem humán emlősök, melyek genomja tartalmazza a humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t oly módon elhelyezve a genomban, hogy az a humán 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel komplementer antiszensz-mRNS-sé íródjon át és a humán 5-HT4B-receptort kódoló mRNSsel hibridizálódva az antiszensz-mRNS akadályozza meg az 5-HT4B-receptort kódoló mRNS transzlációját.
A találmány tárgyát képezik hatóanyagok vizsgálatára szolgáló eljárások, olyan hatóanyagok azonosítása céljából, melyek specifikus kölcsönhatásba lépnek és kötődnek a sejt felszínén található emlőseredetű 5-HT4B-receptorral, mely eljárásban olyan emlőseredetű 5-HT4Breceptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát tartalmazó emlőssejtet érintkeztetünk több hatóanyaggal, melynek felszínén az általa kódolt protein a sejtfelszínen expresszálódik, és meghatározzuk az emlőssejthez kötődő hatóanyagokat, ezáltal azonosítjuk az emlőseredetű 5-HT4B-receptorral specifikus kölcsönhatásba lépő és ahhoz kötődő hatóanyagokat.
A találmány tárgyát képezik hatóanyagok vizsgálatára szolgáló eljárások, olyan hatóanyagok azonosítása céljából, melyek specifikus kölcsönhatásba lépnek és kötődnek a sejt felszínén található humán 5-HT4B-receptorral, mely eljárásban olyan humán 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát tartalmazó emlőssejtet érintkeztetünk több hatóanyaggal, melynek felszínén az általa kódolt protein a sejtfelszínen expresszálódik, és meghatározzuk az emlőssejthez kötődő hatóanyagokat, ezáltal azonosítjuk azokat a hatóanyagokat, melyek specifikusan kölcsönhatásba lépnek és kötődnek a humán 5-HT4B-receptorral.
A találmány tárgyát képezi továbbá változó mennyiségű emlőseredetű 5-HT4B-receptor-expresszió fiziológiás hatásainak meghatározására szolgáló eljárás, mely eljárásban transzgenikus nem humán állatot állítunk elő, melyben az emlőseredetű 5-HT4B-receptor expressziószintje az emlőseredetű 5-HT4B-receptor expressziószintjét szabályozó indukálható promoter alkalmazásával változtatható.
A találmány tárgyát képezi továbbá változó mennyiségű humán 5-HT4B-receptor-expresszió fiziológiás hatásainak meghatározására szolgáló eljárás, mely eljárásban transzgenikus nem humán állatot állítunk elő, melyben a humán 5-HT4B-receptor expressziószintje a humán 5-HT4B-receptor expressziószintjét szabályozó indukálható promoter alkalmazásával változtatható.
Szintén a találmány tárgyát képezi változó mennyiségű emlőseredetű 5-HT4B-receptor-expresszálás fiziológiás hatásainak meghatározására szolgáló eljárás, mely eljárásban olyan transzgenikus nem humán álla3
HU 221 822 Β1 tokból álló csoportot állítunk elő, melyek mindegyike különböző mennyiségű emlőseredetű 5-HT4B-receptort expresszál.
A találmány tárgyát képezi továbbá változó mennyiségű humán 5-HT4B-receptor-expresszálás fiziológiás hatásainak meghatározására szolgáló eljárás, mely eljárásban olyan transzgenikus nem humán állatokból álló csoportot állítunk elő, melyek mindegyike különböző mennyiségű humán 5-HT4B-receptort expresszál.
A találmány tárgyát képezi humán 5-HT4B-receptorallél expressziójával kapcsolatos rendellenességre való hajlam diagnózisára szolgáló eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) a rendellenességben szenvedő egyénektől DNS-t nyerünk; b) a DNS-t restrikciós enzimekből álló kombinációval emésztjük; c) az így kapott DNS-ffagmenseket a ffagmensek méretének meghatározására alkalmas gélen elektroforetikusan szétválasztjuk; d) a kapott gélt az 5-HT4B-receptort kódoló DNS-sel specifikusan hibridizálódó és kimutatható markerrel jelölt nukleinsavpróbával érintkeztetjük; e) az 5-HT4B-receptort kódoló DNS-sel hibridizálódott, kimutatható markerrel jelölt csíkokat kimutatjuk, így a rendellenességben szenvedő egyedek DNS-ére specifikus egyedi csíkmintákat kapunk; f) a diagnózis céljára nyert DNS-t az a)-e) pontok szerint feldolgozzuk; és g) a rendellenességben szenvedő egyedek DNSére specifikus (e) pontban kapott egyedi csíkmintákat és az (f) pontban kapott diagnosztizálandó DNS-mintát összehasonlítjuk, hogy megállapítsuk, megegyezik-e a minta vagy eltér, és amennyiben a minták megegyeznek, diagnosztizáljuk a rendellenességre való hajlamot.
A találmány tárgyát képezi egy eljárás annak meghatározására, hogy egy szubsztrát, melyről nem tudjuk, hogy képes-e emlőseredetű 5-HT4B-receptorhoz kötődni, kötődik-e emlőseredetű 5-HT4B-receptorhoz, mely eljárás szerint emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát tartalmazó emlőssejtet érintkeztetünk a szubsztráttal olyan feltételek mellett, amelyek az 5-HT4B-receptorhoz ismereteink szerint kötődő szubsztrátok kötődését elősegítik, kimutatjuk az 5-HT4B-receptorhoz kötődött szubsztrát jelenlétét és ezáltal megállapítjuk, hogy a szubsztrát kötődik-e 5-HT4B-receptorhoz.
A találmány tárgyát képezi egy eljárás annak meghatározására, hogy egy szubsztrát, melyről nem tudjuk, hogy képes-e humán 5-HT4B-receptorhoz kötődni, kötődik-e humán 5-HT4B-receptorhoz, mely eljárás szerint humán 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát tartalmazó emlőssejtet érintkeztetünk a szubsztráttal olyan feltételek mellett, amelyek a humán 5-HT4B-receptorhoz ismereteink szerint kötődő szubsztrátok kötődését elősegítik, kimutatjuk az 5-HT4B-receptorhoz kötődött szubsztrát jelenlétét és ezáltal meghatározzuk, hogy a szubsztrát kötődik-e a humán 5-HT4B-receptorhoz.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábra az új humán 5-HT4B szerotoninreceptor nukleinsavszekvenciáját és kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját mutatja. A nukleotidokat 5’-3’ orientációban ábrázoltuk és a kódolórégió számozását az iniciációs metionintól kezdve és a terminációs kodonnal befejezve adtuk meg. Feltüntettük a hosszú nyílt leolvasási fázis transzlációja alapján kikövetkeztetett aminosavszekvenciát, valamint az 5’- és 3’-végi nem transzlálódó régiókat. A bal és jobb lapszélen található számok nukleotid- (a felső sorban), valamint aminosav(az alsó sorban) számozást jelentenek, a számozás az első pozícióban adeninnel (A) és az iniciációs metioninnel (M) kezdődik.
A 2. ábra a humán 5-HT4B-receptor klón (a hp78a elnevezésű klón) szekvenciájának összevetését mutatja az 5-HT1A, 5-HT1Dot, 5-HT1Dp, 5-HT1E, valamint az 5-HT1F-szekvenciával. A humán 5-HT4B-receptor kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját (első sor) a kezdő metionintól (M) a stopkodonig (*) összevetettük a humán 5-HT1A szerotoninreceptor-klón [Kobilka és munkatársai: (1987)], az 5-HT1Da szerotoninreceptor-klón [Hamblin és munkatársai:(1991); Weinshank és munkatársai: (1992); Demchyshyn és munkatársai: (1992)], az 5-HT1Dp szerotoninreceptor-klón [Jin és munkatársai: (1992); Weinshank és munkatársai: (1992)], az 5-HT1E szerotoninreceptor-klón [Zgombick és munkatársai: (1992); McAIlister és munkatársai: (1992)], valamint az 5-HT1F szerotoninreceptor-klón [Adham és munkatársai, közlés alatt] szekvenciájával. A kötőjelek a helyes összevetés kedvéért közbeiktatott helyeket képviselnek. A szürke árnyékolás a receptorklónokban azokat a nukleotidokat/aminosavakat jelöli, melyek megegyeznek a humán 5-HT4B-receptorban találhatóval. Az aminosavszekvenciák felett látható számozás a humán 5-HT4B-receptorban található aminosavpozícióknak felel meg, a számozás az iniciációs metioninnal (M) kezdődik és a stopkodonnal fejeződik be (*), a helyes összevetés kedvéért üres helyeket iktattunk közbe.
A 3. ábra az 5-HT4B-receptorgénnek megfelelő mRNS megoszlását mutatja humán szövetekben. A különböző humán szövetekből izolált össz-RNS alapján véletlenszerű láncindító oligonukleotidok felhasználásával, reverz transzkriptáz reakcióval egyszálú cDNS-t állítottunk elő. A cDNS-t PCR-technikával, funkcionális hp78a-specifikus PCR láncindító oligonukleotidok felhasználásával amplifikáltuk. A PCR-terméket 1,5%-os agarózgélen futtattuk, nejlonmembránokra blottoltuk és belső génspecifikus oligonukleotidokkal hibridizáltattuk. Pozitív kontrollként génspecifikus rekombináns plazmidot, negatív kontrollként dH2O-et használtunk. A reverz transzkriptázzal nem kezelt RNS-minták PCR-amplifikációja és Southem-blot-vizsgálata negatív eredményt adott.
A 4. ábra a klónozott humán 5-HT4B-receptort expresszáló, tranziens módon transzfektált Cos-7-sejtekben mutatja a cAMP-termelés 5-HT által történő stimulációját. A cAMP-meghatározást ép sejteken végeztük az anyagokat és módszereket ismertető fejezetben leírtak szerint. Mindegyik pontnak megfelelő adat legalább két másik kísérlet eredményeit szemléltető egyetlen kísérletben, triplikátumban vizsgált minták átlagértékének felel meg. A függőleges vonalak S. E. M.-értékeket (átlagos szórás) jelentenek. Az adatokat a bazális
HU 221 822 Β1 cAMP-kibocsátás százalékában adtuk meg (bazális cAMP-kibocsátás, 0,053±0,004 pmol/ml/10 perc).
Az 5. ábra a klónozott humán 5-HT4B-receptort expresszáló, tranziens módon transzfektált Cos-7-sejtekben mutatja az 5-CT által a cAMP-termelés stimulációját. A cAMP-mérést ép sejteken végeztük az anyagokat és módszereket ismertető fejezetben leírtak szerint. Mindegyik pontnak megfelelő adat legalább két másik kísérlet eredményeit szemléltető egyetlen kísérletben, triplikátumban vizsgált minták átlagértékének felel meg. A függőleges vonalak S. E. M.-értékeket (átlagos szórás) jelentenek. Az adatokat a bazális cAMPkibocsátás százalékában adtuk meg (bazális cAMPkibocsátás, 0,053±0,004 pmol/ml/10 perc).
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekula képezi. A találmány tárgyát képezi továbbá humán 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekula. A találmány leírásában „izolált nukleinsavmolekula” kifejezés alatt természetben elő nem forduló nukleinsavmolekulát értünk, azaz a természetben elő nem forduló formában levő molekulát értünk. Ilyen izolált nukleinsavmolekulák lehetnek például emlőseredetű 5-HT4B-receptort vagy humán 5-HT4B-receptort kódoló RNS, cDNS vagy izolált genomi eredetű DNS-molekulák. A találmány leírásában „5-HT4B-receptor” alatt olyan molekulát értünk, amely fiziológiás feltételek mellett a szerotonin neurotranszmitterre lényegében specifikus, telíthető, a szerotoninhoz nagy affinitással kötődik és aktiválása adenilát-cikláz-aktiválással jár. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát állítunk elő. A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint humán 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát állítunk elő. A fenti molekula az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében azonos kódolószekvenciával rendelkezik. Az 1. ábra szerinti DNS-molekula (1. azonosító számú szekvencia) a humán 5-HT4B-receptor szekvenciáját kódolja. Az emlőseredetű 5-HT4B-receptort oly módon izolálhatjuk, hogy emlős génkönyvtárat egy természetben előforduló vagy mesterségesen tervezett DNS-próbával hibridizáltatunk a technika állása szerint ismert eljárásokkal. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az emlőseredetű 5-HT4B-receptor egy humán protein, és a humán 5-HT4B-receptort kódoló nukleinsavmolekulát humán génkönyvtárból és humán cDNS-könyvtárból izoláljuk. Erre a célra a DR05HTR elnevezésű Drosophila szerotoninreceptor-génből származó, átfedő transzmembránoligonukleotid-próbákat alkalmazhatunk. A humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS- és cDNS-molekulák alkalmazhatók humán, emlős vagy más állati forrásból származó komplementer genomi DNS, cDNS vagy RNS előállítására, valamint az alábbiakban részletesebben ismertetett eljárás szerint, cDNS- vagy genomi eredetű génkönyvtárak átvizsgálásával a fenti receptorral kapcsolatos cDNS-klónok vagy genomi eredetű kiónok izolálására. Ezúton megkapjuk az izolált klón 5’-végén található nem transzlálódó transzkripciós szabályozóelemeket, valamint az izolált gén 5’-végi és 3’-végi nem transzlálódó régióiban található stabilitást, RNS-érést, transzkripciót, transzlációt és szövetspecificitást meghatározó egyéb régiókat.
A találmány tárgyát képezi olyan izolált nukleinsavmolekula, melyben mutációt hoztunk létre oly módon, hogy ne kódoljon normális 5-HT4B-receptor-aktivitással rendelkező molekulát és ne legyen képes natív 5-HT4Breceptor expresszálására. A találmány szerinti mutációt hordozó nukleinsavmolekula például egy olyan izolált nukleinsavmolekula, amely a kódolószekvenciában a leolvasási fázisba illesztve stopkodont tartalmaz, így az átíródott RNS-ről nem transzlálódik protein.
A találmány tárgyát képezi továbbá emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló cDNS-molekula, amelyben a cDNS-molekula az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében azonos kódolószekvenciával rendelkezik (1. azonosító számú szekvencia). A találmány tárgyát képezi továbbá humán 5-HT4B-receptort kódoló cDNS-molekula, amelyben a cDNS-molekula az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében azonos kódolószekvenciával rendelkezik (1. azonosító számú szekvencia). Ezeket a molekulákat és azok megfelelőit a fent leírtak szerint állítottuk elő.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy izolált protein, amely egy emlőseredetű 5-HT4B-receptor. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a protein humán 5-HT4B-receptorprotein, amely az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciához lényegében hasonló aminosavszekvenciával rendelkezik (1. és 2. azonosító számú szekvencia). A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a protein egy egér 5-HT4B-receptorprotein, amely az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciához lényegében hasonló aminosavszekvenciával rendelkezik (1. és 2. azonosító számú szekvencia). A leírásban „izolált protein” alatt más sejtösszetevőktől mentes proteinmolekulát értünk. Izolált emlőseredetű 5-HT4B-receptorproteint előállíthatunk például úgy, hogy az 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t szakember számára ismert eljárásokkal megfelelő gazdasejtben, például baktérium-, élesztő- vagy emlőssejtben expresszáljuk, majd miután a proteint a gazdasejtben expresszáltuk, ismét szakember számára jól ismert eljárásokkal a receptorproteint visszanyerjük. A receptort izolálhatjuk az azt expresszáló sejtekből is, közelebbről, az alábbiakban részletesebben leírt expressziós vektorokkal transzfektált sejtekből.
A találmány tárgyát képezi emlőseredetű 5-HT4Breceptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát, például DNS-t, RNS-t vagy cDNS-t tartalmazó vektor. A találmány tárgyát képezi továbbá humán 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát, például DNS-t, RNS-t vagy cDNS-t tartalmazó vektor. Vektorok lehetnek vírusok, mint például bakteriofágok (anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, lehet például lambda-bakteriofág), állati vírusok (anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, lehet például Baculovírus, egér-leukémiavírus és herpeszvírus), kozmidok, plazmidok [anélkül, hogy igényünket az alábbiakra kor5
HU 221 822 Β1 látoznánk, lehet például pUC18 (Pharmacia, Piscataway, NJ)] és lehetnek egyéb rekombináns vektorok. A nukleinsavmolekulákat szakember számára jól ismert eljárásokkal a vektor genomjába inszertáljuk. Ilyen plazmid például az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében azonos kódolószekvenciával (1. azonosító számú szekvenciával) rendelkező, pcEXV-5-HT4B elnevezésű plazmid, melyet ATCC 75 332 nyilvántartási szám alatt helyeztünk letétbe.
A fenti vektorok előállítása céljából eljárhatunk úgy, hogy az inszertet és a vektort restrikciós enzimmel emésztjük, hogy mindkét molekula végein olyan komplementervégeket alakítsunk ki, melyek egymással bázispárokat képeznek, majd ezeket ligázzal ligáljuk. Más eljárás szerint, az inszert DNS-hez a vektor-DNS-ben található restrikciós hasítási helynek megfelelő linkereket ligálhatunk, és vektort az adott helyen hasító restrikciós enzimmel emésztjük. Más eljárásokat is alkalmazhatunk.
A találmány tárgyát képezik továbbá emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát tartalmazó vektorok, valamint humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát tartalmazó vektorok, melyeket alkalmassá tettünk baktériumsejtben, élesztősejtben vagy emlőssejtben való expresszálás céljára, és amely ezenkívül a DNS baktériumsejtben, élesztősejtben, emlőssejtben vagy rovarsejtben való expresszálásához szükséges szabályozóelemeket tartalmaz az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-hez vagy a humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-hez viszonyítva oly módon elhelyezve, hogy annak expresszióját lehetővé tegye. Az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében azonos kódolószekvenciával (1. azonosító számú szekvenciával) rendelkező DNS-t a humán 5-HT4B-receptor expresszálása céljából ezekbe a vektorokba inszertálhatjuk. Az expresszáláshoz szükséges szabályozóelemek például az RNS-polimeráz-kötő promoterszekvenciák és a riboszómakötő transzkripciós iniciációs szekvenciák. Egy bakteriális expressziós vektor promoterként tartalmazhatja például a lac-promotert, transzkripciós iniciációs szekvenciaként a Shine-Dalgamo-szekvenciát és az AUGszekvenciát [Maniatis és munkatársai: „Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory” (1982)]. Hasonlóképp, egy eukarióta expressziós vektor az RNS-polimeráz-II kötéshez heterológ vagy homológ promotert, 3’irányban poliadenilezési jelet, AUG startkodont és a riboszómaleváláshoz terminációs kodont tartalmaz. Ezenkívül egy rovar expressziós vektor, például egy rekombináns Baculovírus az inszertált génnek rovarsejtben történő expresszálásához a polihedrin gén expressziós jeleket alkalmazza. Ilyen vektorok hozzáférhetők a kereskedelemben vagy a leírt szekvenciákból előállíthatok a technika állása szerint, például vektorok előállítására alkalmazható, a fentiekben általánosságban ismertetett eljárásokkal. Az expressziós vektorok alkalmazásával receptort expresszáló sejtek állíthatók elő. Ilyen sejtek alkalmazásának néhány módját az alábbiakban részletesebben ismertetjük.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint plazmidot módosítunk baktériumsejtben, élesztősejtben, rovarsejtben és különösen emlőssejtben való expresszálás céljára, mely plazmid emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát vagy humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát, valamint a DNS baktériumsejtben, élesztősejtben, rovarsejtben vagy emlőssejtben való expresszálásához szükséges szabályozóelemeket tartalmaz és az utóbbiakat az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-hez vagy a humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-hez viszonyítva oly módon helyezzük el, hogy annak expresszálódását lehetővé tegye. Emlőssejtben való expresszió céljára módosított plazmidok például, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, az EVJB és EXV-3 plazmidok. Emlőssejtben való expresszió céljára módosított plazmid például egy az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében azonos kódolószekvenciával (1. azonosító számú szekvenciával) rendelkező cDNS-t tartalmazó plazmid, amely ezenkívül a DNS-nek emlőssejtben való expressziójához szükséges szabályozóelemeket is tartalmaz. Ezt a plazmidot pcEXV-5-HT4B plazmidnak neveztük és azt ATCC 75 332 nyilvántartási szám alatt letétbe helyeztük. Szakember számára nyilvánvaló, hogy számos emlős vagy humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t, valamint az ilyen DNS-nek emlőssejtben való expressziójához szükséges szabályozóelemeket tartalmazó, emlőssejtben való expresszálás céljára módosított plazmid állítható elő már létező plazmidok felhasználásával és azokban olyan megfelelő módosítások létrehozásával, hogy a plazmidok a DNS emlőssejtben való expressziójához szükséges szabályozóelemeket tartalmazzák. A plazmidokat előállíthatjuk az expressziós vektorok és vektorok esetében a fentiekben általánosságban leírt eljárások szerint vagy a technika állása szerint ismert egyéb eljárások alkalmazásával.
A fent említett plazmidot a „Budapesti Szerződés” (melyet a mikroorganizmusok szabadalmi eljárás céljából történő letétbe helyezése nemzetközi elismerésének tárgyában kötöttek) rendelkezései értelmében, azzal összhangban helyeztük letétbe az .American Type Culture Collection” (ATCC) intézetben (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852).
A találmány tárgyát képezik emlőseredetű 5-HT4Breceptort kódoló DNS-molekulát tartalmazó emlőssejtek, úgymint emlőssejtben való expresszálás céljára módosított plazmidot tartalmazó emlőssejtek, melyek az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát, valamint a DNS-nek emlőssejtben való expresszálásához szükséges szabályozóelemeket tartalmaznak és az utóbbiak az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-hez viszonyítva oly módon vannak elhelyezve, hogy annak expresszálódását lehetővé tegye. A találmány tárgyát képezik humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát tartalmazó emlőssejtek, úgymint emlőssejtben való expresszálás céljára módosított plazmidot tartalmazó emlőssejtek, melyek humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát, valamint a DNS-nek emlőssejtben való expresszálásához szükséges szabályozóelemeket tartalmaznak és az utóbbiak a humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-hez viszonyítva oly módon vannak elhelyezve, hogy annak expresszálódását lehetővé tegye.
HU 221 822 Β1
Számos emlőssejt alkalmazható gazdasejtként, például, de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk, NIH3T3 egér fibroblaszt sejtek, CHO-sejtek, HeLasejtek, LM(tk) -sejtek, Cos-sejtek stb. Az emlőssejteket a fent leirt expressziós plazmidokkal transzfektálhatjuk a technika állása szerinti eljárások alkalmazásával, például kalcium-foszfát precipitációs eljárással vagy a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t más módon juttathatjuk az emlőssejtekbe, például mikroinjektálással, hogy humán vagy emlőseredetű 5-HT4Breceptort kódoló DNS-t, például cDNS-t vagy plazmidot tartalmazó emlőssejteket kapjunk. A fent leírtak szerint a pcEXV-5-HT4B plazmidot expresszáló LM(tk) -sejteket CRL 11 166 nyilvántartási szám alatt letétbe helyeztük az ATCC-intézetnél.
A találmány tárgyát képezi egy legalább 15 nukleotidból álló nukleinsavmolekulát tartalmazó nukleinsav hibridizációs próba, amely az emlőseredetű 5-HT4Breceptort kódoló nukleinsavmolekula szekvenciájában található szekvenciával, például az 1. ábra szerinti szekvenciában (1. azonosító számú szekvenciában) található kódolószekvenciával specifikusan hibridizálódik. A leírásban „specifikus hibridizálódás” alatt egy nukleinsavmolekula azon képességét értjük, hogy a vele komplementer nukleinsavszekvenciát felismeije és a komplementer bázispárok közti hidrogénkötések kialakításával kettős hélixszerkezetet tartalmazó szegmenseket képezzen. Nukleinsav hibridizációs próbákat alkalmazó technológiák szakember számára jól ismertek, és szakember számára nyilvánvaló, hogy az ilyen próbák hosszúságuk tekintetében nagymértékű változatosságot mutatnak és a próba kimutatásának megkönnyítésére egy kimutatható jelölőanyaggal, például radioaktív izotóppal vagy fluoreszcens festékkel jelölhetők. Humán 5-HT4B-receptort kódoló nukleinsav kimutatása bármely olyan betegségfolyamat kimutatására szolgáló diagnosztikai vizsgáló eljárásban alkalmazható, melyben az 5-HT4B-receptor expressziójának szintje megváltozik. DNS-próbául szolgáló molekulákat előállíthatunk oly módon, hogy az 5-HT4B-receptort vagy annak ffagmensét kódoló DNS-molekulát megfelelő vektorba, például plazmidba vagy bakteriofágba inszertáljuk, azt megfelelő baktérium-gazdasejtbe juttatjuk, replikáljuk és a DNS-próbát a technika állása szerinti eljárások alkalmazásával összegyűjtjük. A DNS-t például sejtlizátumból fenollal és kloroformmal extraháljuk, a DNSnek a vektorba történő inszertálásakor alkalmazott hasítási helyeknek megfelelő restrikciós enzimekkel emésztjük (lásd fent), elektroforetizáljuk és a kapott gélből kivágjuk. Ilyen DNS-molekulát mutat az 1. ábra. A próbák alkalmazhatók „ in situ ” hibridizálásra vagy a fenti géncsaládot expresszáló szövetek lokalizálására vagy egyéb hibridizációs vizsgálatokban, különböző biológiai szövetekben ilyen gének vagy mRNS-eik jelenlétének kimutatására. Ezenkívül, szintetizált (DNSszintetizáló készülékkel előállított) emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekula szekvenciájával komplementer oligonukleotidokat vagy humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekula szekvenciájával komplementer oligonukleotidokat próbaként alkalmazhatunk ezen gének és az ezekkel kapcsolatos mRNS kimutatására, vagy azok alkalmazhatók az előbbiekkel rokonságot mutató gének izolálására genomi eredetű vagy cDNS-génkönyvtárak átvizsgálásával, azokban homológia kimutatásával vagy amplifikációs technikák, mint például polimeráz láncreakció alkalmazásával.
A találmány tárgyát képezi továbbá a sejtfelszínen humán 5-HT4B-receptor expresszálódásának kimutatására szolgáló eljárás, mely eljárásban az 5-HT4B-receptort kódoló mRNS jelenlétét mutatjuk ki. A találmány tárgyátképezi továbbá emlőseredetű 5-HT4B-receptor expresszálódásának kimutatására szolgáló eljárás, mely eljárásban az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mRNS jelenlétét mutatjuk ki. A fenti eljárásokban a technika állása szerinti módszerek alkalmazásával a sejtből össz-mRNS-t állítunk elő, az így kapott mRNSt a hibridizálódást elősegítő feltételek mellett a fent leírt nukleinsav hibridizációs próbával érintkeztetjük, kimutatjuk a próbával hibridizálódott mRNS jelenlétét, ezáltal kimutatjuk a sejtben a receptor expresszálódását. A próbákat a cél-nukleinsavmolekulákkal, például mRNS-molekulákkal a technika állása szerinti eljárások alkalmazásával hibridizáltathatjuk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint azonban, a nukleinsavakat lizált sejtekből precipitációval extraháljuk, az extraktumból az mRNS-molekulák poli-A farkát megkötő oszloppal mRNS-t izolálunk [Maniatis T. és munkatársai: „Molecular Cloning; Cold Spring Harbor Laboratory” 197 (1982)]. Az mRNS-t ezután nitrocellulóz-membránon radioaktívan jelölt próbával kezeljük, a próba hibridizálódik és ezáltal megjelöli a komplementer mRNS-szekvenciákat. A kötődést kimutathatjuk autoradiográfiával vagy szcintillációs számlálással. Szakember számára azonban ezeknek a lépéseknek a kivitelezésére szolgáló egyéb eljárások jól ismertek és a fent leírtak csupán például szolgálnak.
A találmány tárgyát képezi humán 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-molekulában található bármely szekvenciához specifikusan kötődő szekvenciával rendelkező antiszensz oligonukleotid, amely ily módon megakadályozza a humán 5-HT4B-receptor transzlációját. A találmány tárgyát képezi továbbá emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-molekulában található bármely szekvenciához specifikusan kötődő szekvenciával rendelkező antiszensz oligonukleotid, amely ily módon megakadályozza az emlőseredetű 5-HT4B-receptor transzlációját. A leírásban „specifikus kötődés” alatt egy antiszensz oligonukleotid azon képességét értjük, hogy a vele komplementer nukleinsavszekvenciát felismeije és a komplementer bázispárok közti hidrogénkötések kialakításával kettős hélixszerkezetet tartalmazó szegmenseket képezzen. Az antiszensz oligonukleotid az 1. szekvencia szerinti cDNS-molekulában található bármely szekvenciával specifikusan kötődő szekvenciával rendelkezhet. Antiszensz oligonukleotidok különleges példája lehet egy nukleotidok kémiai analógjait tartalmazó antiszensz oligonukleotid.
A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti oligonukleotidok hatékony mennyiségét tartalmazó gyógyászati
HU 221 822 Β1 készítmény, amely a sejtmembránon átjutva és a sejtben specifikusan az 5-HT4B-receptort kódoló mRNShez kötődve hatékonyan csökkenti a humán 5-HT4B-receptor expresszióját, ily módon megakadályozza a humán 5-HT4B-receptor transzlációját, valamint tartalmaz egy a sejtmembránon átjutó, gyógyszergyártásban szokásos hidrofób hordozóanyagot. A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti oligonukleotidok hatékony mennyiségét tartalmazó gyógyászati készítmény, amely a sejtmembránon átjutva és a sejtben specifikusan az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mRNShez kötődve hatékonyan csökkenti az emlőseredetű 5-HT4B-receptor expresszióját, ily módon megakadályozza az emlőseredetű 5-HT4B-receptor transzlációját, valamint tartalmaz egy a sejtmembránon átjutó, gyógyszergyártásban szokásos hidrofób hordozóanyagot. A leírás vonatkozásában „gyógyászatilag elfogadható hordozón” bármely standard gyógyászatilag elfogadható hordozót értünk, például foszfátpufferes fiziológiás sóoldatot, vizet, emulziókat, mint például „olaj a vízben” típusú emulziókat vagy „víz az olajban” típusú emulziókat, és különböző típusú nedvesítőanyagokat. Az oligonukleotidot az mRNS-t inaktiváló anyaghoz, például ribozimhoz köthetjük. A sejtmembránon átjutó gyógyszergyártásban szokásos hidrofób hordozóanyag tartalmazhat olyan struktúrát is, mely a kiválasztott sejttípusra specifikus transzportműködésű alkotórészhez kapcsolódik, ily módon meghatározott sejttípus veszi fel. A struktúra lehet egy a kiválasztott sejttípusra specifikus transzportműködésű alkotórészhez kapcsolódó protein, például inzulinmolekula része, amely célzottan a hasnyálmirigysejtekhez kötődik. A gyógyászati készítményben oligonukleotidként az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében azonos kódolószekvenciával rendelkező DNS-molekulákat alkalmazhatjuk.
A találmány tárgyát képezi az 5-HT4B-receptor expresszálódásának csökkentésével javítható rendellenességek kezelésére szolgáló eljárás. Az eljárás szerint az egyénnek a fent leírt gyógyászati készítmény hatékony mennyiségét adagoljuk, amely az egyénben hatékonyan csökkenti az 5-HT4B-receptor expresszálódását.
A találmány tárgyát képezi továbbá 5-HT4B-receptor-aktivitással kapcsolatos rendellenes állapot kezelésére szolgáló eljárás, mely eljárás szerint az egyénnek a fent leírt gyógyászati készítmény hatékony mennyiségét adagoljuk, amely az egyénben hatékonyan csökkenti az 5-HT4B-receptor expresszálódását. Ilyen rendellenes állapotok például az angina, koronáriaartéria-betegségek, érelmeszesedés, agyvérzéshez vezető agyérrendellenességek, irritábilis bél tünetegyüttes, vagy a gyomor-bél traktus egyéb motilitási zavarai, központi idegrendszeri rendellenességek, fájdalomérzékelés, affektív betegségek, magasabb rendű kognitív folyamatokat érintő rendellenességek, anélkül, hogy igényünket az alábbira korlátoznánk, szkizofrénia, valamint autonóm funkciók szabályozása.
Antiszensz oligonukleotid hatóanyagok gátolják az 5-HT4B-receptort kódoló mRNS transzlációját. Szintetikus antiszensz oligonukleotidokat vagy más antiszensz kémiai struktúrákat tervezhetünk abból a célból, hogy azok az 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-hez kötődve gátolják az mRNS transzlációját, ezek betegekben gyógyszerként alkalmazhatók az 5-HT4B-receptorgének expresszálódásának gátlására. A találmány tárgyát képezi 5-HT4B-receptort kódoló mRNS transzlációját gátló szintetikus antiszensz oligonukleotid hatóanyagok (SAOD-ok) alkalmazásával a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor expressziószintjének terápiás célú megváltoztatására szolgáló eljárás. Az mRNSt felismerő és ahhoz szelektív módon kötődő szintetikus antiszensz oligonukleotidokat vagy egyéb antiszensz kémiai struktúrákat úgy állítunk elő, hogy azok az 1. ábra szerinti DNS, RNS vagy kémiai úton módosított mesterséges nukleinsav nukleotidszekvenciájának egy részével komplementerek legyenek. A SAOD-okat úgy tervezzük, hogy azok injekcióval betegnek adagolva a véráramban vagy laboratóriumi sejttenyészeti feltételek mellett, a betegből eltávolított sejtekhez adagolva stabilak legyenek. A SAOD-okat úgy tervezzük, hogy azok képesek legyenek átjutni a sejtmembránokon, hogy a sejtek citoplazmájába kerüljenek, ez elérhető lehet a SAOD fizikai és kémiai tulajdonságai révén, melyek képessé teszik őket a sejtmembránokon való átjutásra (például kisméretű, hidrofób SAOD kémiai struktúrák tervezésével) vagy a sejt specifikus transzportrendszerének segítségével, amely felismeri és a sejtbe szállítja a SAOD-ot. A SAOD-ot megtervezhetjük továbbá egy bizonyos kiválasztott sejtcsoportnak való adagolás céljára úgy, hogy a SAOD-ot specifikus sejtfelvevő mechanizmus ismerje fel, amely csak bizonyos kiválasztott sejtcsoportban köti meg és veszi fel a SAOD-ot. A SAODot, amint azt a fentiekben ismertettük, megtervezhetjük például úgy, hogy csak bizonyos sejttípusban megtalálható transzportműködésű alkotórészhez kötődjön. A SAOD-ot úgy tervezhetjük továbbá, hogy a célzott mRNS-szekvenciát felismerje és ahhoz szelektíven kötődjön, mely szekvencia az mRNS-sel való komplementer bázispárképzés alapján megfelelhet az 1. ábra szerinti szekvencián belül található szekvenciának. Végül, SAOD-ot úgy tervezzük, hogy az alábbi három mechanizmus valamelyikével a célzott mRNS-szekvenciát inaktiválja: 1) a célzott mRNS-hez kötődve belső sejtmechanizmusok, például Ribonukleáz-I emésztés beindításával indukálja az mRNS lebomlását; 2) oly módon gátolja a célzott mRNS transzlációját, hogy gátolja a transzlációt szabályozó faktorok vagy riboszómák kötődését; vagy 3) egyéb kémiai struktúrákat, például ribozimszekvenciákat vagy reaktív kémiai csoportokat építünk be, melyek lebontják vagy kémiailag módosítják a célzott mRNS-t. Kimutatták, hogy a célzott mRNS ellen irányuló szintetikus antiszensz oligonukleotid hatóanyagok képesek a fenti tulajdonságoknak megfelelni [J. S. Cohen: Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989); H. M. Weintraub: Sci. Am. January 40. oldal (1990)]. Ezenkívül, egy ígéretes stratégia szerint, a célzott mRNS-t ribozimoknak az antiszensz oligonukleotidokhoz való kötésével inaktiváljuk. [N. Sarver és munkatársai: Science, 247, 1222 (1990)]. Egy SAOD hatékony terápiás szer lehet, amennyiben azt a betegnek injekcióval történő adagolásra tervezték, vagy ha a be8
HU 221 822 Β1 teg célzott sejtjeit eltávolították, a laboratóriumban SAOD-gal kezelték és a betegbe visszajuttatták. Ily módon a SAOD a beteg meghatározott célsejtjeiben az 5-HT4B-receptor expresszálódását csökkentő terápiaként alkalmazható bármely olyan klinikai állapotban, amely az 5-HT4B-receptor-expresszió csökkentésével javítható.
A találmány tárgyát képezi a humán 5-HT4B-receptor ellen termelt ellenanyag. A találmány tárgyát képezi továbbá az emlőseredetű 5-HT4B-receptor ellen termelt ellenanyag. Ez az ellenanyag lehet például a humán 5-HT4B-receptor sejtfelszíni epitópja ellen termelt monoklonális ellenanyag, azaz az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciában található, a humán 5-HT4B-receptor sejtfelszíni epitópjának aminosavszekvenciájával lényegében megegyező aminosavszekvenciával rendelkező epitóp ellen termelt monoklonális ellenanyag. Az aminosavszekvenciákat szakember számára jól ismert eljárásokkal analizálhatjuk annak megállapítására, hogy azok az általuk felépített proteinen belül hidrofób vagy hidrofil régiókat képeznek. A sejtmembránproteinek esetében jól ismert, hogy a hidrofób régiók a protein azon részét alkotják, amely a sejtmembránt alkotó lipid-kettősrétegbe inszertálódik, míg a hidrofil régiók a sejtfelszínen, vizes közegben találhatók. Tehát, az 1. ábra szerinti hidrofil aminosavszekvenciák ellen termelt ellenanyagok a leírtak szerint az 5-HT4B-receptor felületi epitópjaihoz fognak kötődni. A humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor ellen termelt ellenanyagok lehetnek szérumeredetűek vagy monoklonálisak és azokat a technika állása szerint állíthatjuk elő. Monoklonális ellenanyagokat előállíthatunk például hibridómatechnológiával, immunizált állatokból nyert ellenanyag-termelő B-sejtek és mielómasejtek fuzionáltatásával és a kívánt ellenanyagot termelő hibridóma sejtvonal kiválasztásával. Ilyen ellenanyagok termelésére immunogénként alkalmazhatók az NIH3T3 sejtek vagy LM(tk) -sejtek. Más eljárás szerint, kereskedelemben hozzáférhető készülékekkel az 1. ábra szerinti aminosavszekvencia alapján szintetikus peptideket állíthatunk elő. Eljárhatunk úgy is, hogy DNS-t, például cDNS-t vagy annak egy fragmensét klónozzuk és expresszáljuk, a kapott polipeptidet visszanyerjük és immunogénként használjuk. Ezeket az ellenanyagokat felhasználhatjuk az izolált DNS által kódolt 5-HT4B-receptor jelenlétének kimutatására vagy élő állatokban, emberben, vagy állatokból vagy emberből nyert biológiai szövetekben, vagy folyadékokban az 5-HT4B-receptor működésének gátlására.
A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény, amely humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor egy epitópja ellen termelt ellenanyag hatékony mennyiségét tartalmazza, és amely hatékonyan gátolja a természetben előforduló szubsztrátoknak az 5-HT4B-receptorhoz való kötődését, valamint tartalmaz egy gyógyászatilag elfogadható hordozót. Erre a célra alkalmazható egy a humán 5-HT4B-receptor sejtfelszíni epitópja ellen termelt monoklonális ellenanyag, amely az 1. ábra szerinti aminosavszekvenciában található, a humán 5-HT4B-receptor sejtfelszíni epitópjának aminosavszekvenciájával lényegében megegyező aminosavszekvenciával rendelkezik.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy egyedben a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor expresszálódásának csökkentésével javítható rendellenességek kezelésére szolgáló eljárás, mely eljárás szerint az egyednek a fent leírt gyógyászati készítmény olyan mennyiségét adagoljuk, mely az egyedben hatékonyan gátolja a természetben előforduló szubsztrátoknak a receptorhoz való kötődését és ezáltal javítja a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expresszálódása által okozott rendellenességeket. Az ellenanyagnak a receptorhoz való kötődése megakadályozza a receptor működését, ezúton közömbösíti a receptor túlzott mennyiségben történő expresszálódásának hatásait. Erre a célra alkalmazhatók a fent leírt monoklonális ellenanyagok. A találmány tárgyát képezi továbbá fokozott 5-HT4B-receptor-aktivitás által okozott rendellenes állapot kezelésére szolgáló eljárás, mely eljárás szerint az egyénnek a fent leírt gyógyászati készítmény olyan mennyiségét adagoljuk, amely az egyénben hatékonyan gátolja a természetben előforduló szubsztrátoknak az 5-HT4B-receptorhoz való kötődését és ezáltal javítja a rendellenes állapotot. Fokozott 5-HT4B-receptor-aktivitással kapcsolatos rendellenes állapotok például az angina, koronáriaartéria-betegségek, érelmeszesedés, agyvérzéshez vezető agyi érrendellenességek, magasabb rendű kognitív folyamatokat érintő rendellenességek, anélkül, hogy igényünket az alábbira korlátoznánk, szkizoffénia, valamint autonóm funkciók szabályozása.
A találmány tárgyát képezi a sejtfelszínen 5-HT4Breceptor jelenlétének kimutatására szolgáló eljárás, mely eljárás szerint a sejtet az ellenanyagnak a receptorhoz való kötődését elősegítő feltételek mellett az 5-HT4B-receptor ellen termelt ellenanyaggal érintkeztetjük, kimutatjuk a sejthez kötődött ellenanyag jelenlétét, ezáltal a sejtfelszínen az 5-HT4B-receptor jelenlétét. Az eljárás alkalmazható annak megállapítására, hogy egy adott sejtben az 5-HT4B-receptor expressziója hibás-e. A kötődött ellenanyagokat a technika állása szerinti eljárásokkal mutathatjuk ki, például oly módon, hogy az ellenanyaghoz fluoreszcens markert kapcsolunk, és a sejtmintát a sejtekben ellenanyag-kötődésre utaló fluoreszcencia kimutatása céljából fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáljuk. Erre a célra alkalmazhatók a fent leírt monoklonális ellenanyagok.
A találmány tárgyát képezi humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t expresszáló transzgenikus nem humán emlős, valamint emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t expresszáló transzgenikus nem humán emlős. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t expresszáló transzgenikus nem humán emlős, melynek receptorában olyan mutációt hoztunk létre, hogy az ne legyen képes normális receptoraktivitást kifejteni és ne expresszáljon natív 5-HT4B-receptort. A találmány tárgyát képezi továbbá transzgenikus nem humán emlős, mely genomjában tartalmazza a humán 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t oly módon elhelyezve, hogy az a hu9
HU 221 822 Β1 mán 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel komplementer antiszensz-mRNS-sé íródjon át, amely az 5-HT4Breceptort kódoló mRNS-sel hibridizálódva csökkenti annak transzlációját, valamint a találmány tárgyát képezi transzgenikus nem humán emlős, mely genomjában tartalmazza az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t oly módon elhelyezve, hogy az az emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel komplementer antiszensz-mRNS-sé íródjon át, amely az 5-HT4B-receptort kódoló mRNS-sel hibridizálódva csökkenti annak transzlációját. A DNS tartalmazhat továbbá egy indukálható promotert vagy tartalmazhat szövetspecifikus szabályozóelemeket, abból a célból, hogy az expresszió indukálhatóvá váljon vagy meghatározott sejttípusokra korlátozódjon. DNS-molekula például olyan DNS- vagy cDNS-molekula lehet, amely az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében megegyező kódolószekvenciával rendelkezik. Transzgenikus állat lehet például transzgenikus egér. Szövetspecificitást meghatározó régiók például a metallotionin promoter [Low M. J., Lechan R. M., Hammer R. E. és munkatársai: Science 231, 1002 (1986)] és az L7-promoter [Oberdick J., Smeyne R. J., Mann J. R., Jackson S. és Morgan J. I.: Science 248, 223 (1990)].
Az emlősreceptorok fiziológiai és viselkedést meghatározó szerepének felderítésére felhasználható állatmodellrendszereket különböző technikák alkalmazásával úgy állíthatunk elő, hogy olyan transzgenikus állatokat hozunk létre, melyekben a receptor expressziójának szintje fokozott vagy csökkent vagy az expresszálódott receptorprotein aminosavszekvenciája megváltozott. Ilyen technikák például, anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk: 1) humán 5-HT4B-receptort vagy ennek a génnek homológ állati változatát kódoló normális vagy mutációt hordozó DNS inszertálása mikroinjektálással, retrovírus-fertőzéssel vagy szakember számára ismert egyéb eljárásokkal erre alkalmas megtermékenyített petesejtekbe transzgenikus állatok létrehozása céljából [Hogan B. és munkatársai: „Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory” (1986)]; vagy 2) ezen gének normális vagy mutációt hordozó, humán vagy állati változatának homológ rekombinációja transzgenikus állatokban a natív génlokusszal [Capecchi M. R. : Science 244, 1288 (1989); Zimmer A. és Gruss P.: Natúré 338, 150 (1989)], hogy a receptor expressziójának szabályozását vagy szerkezetét megváltoztassuk. A homológ rekombinációs technika jól ismert a technika állása szerint. Ennek segítségével a natív gént az inszertált génnel helyettesíthetjük, így olyan állatot hozhatunk létre, amely nem képes a natív receptor expresszálására, de expresszál például egy inszertált mutáns receptort, amely a rekombináció révén az állat genomjában a natív receptort helyettesíti, ami végül a receptor elégtelen mennyiségű expressziójához vezet. Mikroinjektálással géneket juttathatunk a genomba, de nem távolíthatjuk el azokat, így az eljárás alkalmas olyan állatok létrehozására, melyek saját receptoraik mellett a bejuttatott receptort is expresszálják, ami a receptor túlzott mennyiségben történő expressziójához vezet.
Transzgenikus állatokat, például egeret, az alábbiak szerint állíthatunk elő: nőstény egereket pároztatunk és az így nyert megtermékenyített petesejteket a petevezetőből eltávolítjuk. A petesejteket megfelelő tápfolyadékban, például M2-táp folyadékban tároljuk [Hogan B. és munkatársai: „Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory” (1986)]. A technika állása szerinti eljárásokkal egy vektorból (például a fent leírt pcEXV-5-HT4Bplazmidból) receptort kódoló DNS-t vagy cDNS-t tisztítottunk. A DNS kódolórégiójával egy indukálható promotert fuzionáltathatunk, hogy a transzgén expressziója kísérleti úton szabályozhatóvá váljék. Más eljárás szerint, vagy ezenkívül, a kódolórégióval szövetspecifikus szabályozóelemeket fuzionáltathatunk, hogy lehetővé tegyük a transzgén szövetspecifikus expresszióját. A DNS-t, egy alkalmas puffereit oldatban mikroinjekciós tűbe tesszük, (melyet kapilláris csőből állíthatunk elő pipettakihúzóval) és az injektálandó petesejtet egy mélyedést tartalmazó tárgylemezre helyezzük. A tűt a petesejt pronukleuszába juttatjuk és a DNS-oldatot beinjektáljuk. Ezután az injektált petesejtet álterhes egér (olyan egér, amely valójában nem terhes, de amelyet megfelelő hormonokkal stimuláltunk a terhesség fenntartására) petevezetőjébe juttatjuk, ahonnan az a méhbe kerül, beágyazódik és a kihordási idő során kifejlődik. Amint azt fent ismertettük, a mikroinjektálás nem az egyetlen eljárás a DNS-nek petesejtbe való juttatására, a fenti példa csak a szemléltetést szolgálta.
Mivel a receptorspecifikus hatóanyagok hatásukat általában a receptor aktiválásán vagy gátlásán keresztül fejtik ki, a fent leírt transzgenikus állatmodellek felhasználhatók a receptor ellen irányuló hatóanyagok biológiai aktivitásának vizsgálatára, mielőtt az említett hatóanyagok alkalmazásra kerülnének. A fenti állati modellrendszerek segítségével a natív gén vagy a transzgén expressziójának indukálásával vagy gátlásával, ezáltal az élő állatban a normális vagy mutáns receptor expressziójának fokozásával vagy csökkentésével előre jelezhető vagy értékelhető a receptorokat aktiváló vagy gátló hatóanyagok terápiás alkalmazásának lehetősége. Olyan modellrendszert állíthatunk elő tehát, melyben a receptor ellen irányuló hatóanyagok biológiai aktivitása értékelhető, mielőtt az említett hatóanyagok alkalmazásra kerülnének. A receptort túlzott mennyiségben vagy elégtelen mennyiségben expresszáló transzgenikus állatok fiziológiás körülmények mellett jelzik, hogy a receptor túlzott mennyiségben vagy elégtelen mennyiségben történő expressziója alkalmazható-e terápiás célra.
A transzgenikus modellrendszer alkalmazható tehát egy hatóanyag hatásának megállapítására. Egy alkalmazási mód azon a technika állása szerint jól ismert tényen alapul, hogy egyes hatóanyagok, mint például antidepresszánsok, a neurotranszmitter felvételének gátlásán keresztül fejtik ki hatásukat, ily módon növelik a szinaptikus résben a neurotranszmitter mennyiségét. Ennek a hatásnak a fiziológiás következménye az, hogy az érintett sejtekben kevesebb receptor termelődése indukálódik, ami végső soron a receptor elégtelen mennyiségben történő expressziójához vezet. Egy
HU 221 822 Β1 olyan állat tehát, amelyben a receptor elégtelen mennyiségben expresszálódik, felhasználható vizsgálati rendszerként annak megállapítására, hogy az elégtelen mennyiségben történő expressziót kiváltó hatóanyagok alkalmazhatók-e terápiás célra. Egy másik alkalmazási mód szerint, amennyiben a receptor túlzott mennyiségben történő expressziója vezet rendellenességhez, érdemes olyan hatóanyagot kifejleszteni, amely a receptor szabályozásában gátló szerepet tölt be vagy antagonistaként hat, és ha a fenti állati modellrendszerekben annak terápiás alkalmazása ígéretesnek látszik, a 5-HT4B-receptorral szemben előállított agonista vagy antagonista hatóanyagok előállításával vagy bármely olyan eljárással, amely emberben növeli vagy csökkenti ennek a receptornak az expresszióját, terápiás céllal elérhetjük az 5-HT4B-receptor aktiválását vagy gátlását.
A találmány tárgyát képezi továbbá változó mennyiségű humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor-expresszálás fiziológiás hatásainak meghatározására szolgáló eljárás, mely eljárásban transzgenikus nem humán állatot állítunk elő, melyben a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor expressziójának szintje a receptor expressziószintjét szabályozó indukálható promoter alkalmazásával változtatható. Szintén a találmány tárgyát képezi változó mennyiségű humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor-expresszálás fiziológiás hatásainak meghatározására szolgáló eljárás, mely eljárásban olyan transzgenikus nem humán állatokból álló csoportot állítunk elő, melyek mindegyike különböző mennyiségű humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort expresszál. Ilyen állatokat előállíthatunk oly módon, hogy az oocitákba, melyekből a transzgenikus állatot létrehozzuk, különböző mennyiségű humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-t juttatunk.
A találmány tárgyát képezi továbbá olyan hatóanyagok azonosítására szolgáló eljárás, melyek javítják a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expressziójának következtében kialakuló rendellenességeket, mely eljárás szerint a hatóanyagot legalább egy humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló mesterségesen bejuttatott DNS-molekulát expresszáló transzgenikus nem humán emlősnek adagoljuk, és megállapítjuk, hogy a hatóanyag javítja-e a transzgenikus nem humán emlősben a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expressziójának következtében kialakult fizikai és viselkedési rendellenességeket. A leírásban „hatóanyag” alatt olyan vegyületet vagy készítményt értünk, amely lehet természetes, szintetikus vagy vegyületek átvizsgálásából származó. DNS-molekulák lehetnek például az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében megegyező kódolószekvenciával rendelkező DNS- vagy cDNS-molekulák.
A találmány tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények, melyek elegendő mennyiségű fent leírt hatóanyagot tartalmaznak ahhoz, hogy hatékonyan képesek legyenek javítani az 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expressziója által okozott rendellenességeket, ezenkívül tartalmaznak egy gyógyászatilag elfogadható hordozót.
A találmány tárgyát képezi továbbá a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expressziójának következtében kialakuló rendellenességek kezelésére szolgáló eljárás, mely eljárás szerint az egyénnek a fent leírt gyógyászati készítmény olyan mennyiségét adagoljuk, amely hatékonyan javítja a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor túlzott mennyiségben történő expressziójának következtében kialakuló rendellenességeket.
A találmány tárgyát képezi olyan hatóanyagok azonosítására szolgáló eljárás, amely képes a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor elégtelen mennyiségben történő expressziójának következtében kialakuló rendellenességek javítására, mely eljárás szerint a hatóanyagot olyan fent leírt transzgenikus nem humán emlősnek adagoljuk, amely csak működésképtelen humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort expresszál, és megállapítjuk, hogy az hatóanyag javítja-e a transzgenikus nem humán emlősben a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor elégtelen mennyiségben történő expressziójának következtében kialakult fizikai és viselkedési rendellenességeket.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan gyógyászati készítmények, melyek elegendő mennyiségű hatóanyagot tartalmaznak ahhoz, hogy hatékonyan képesek legyenek javítani a humán vagy emlőseredetű 5-HT4Breceptor elégtelen mennyiségben történő expressziójából következő rendellenességeket, ezenkívül tartalmaznak egy gyógyászatilag elfogadható hordozót.
A találmány tárgyát képezi továbbá a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor elégtelen mennyiségben történő expressziójából következő rendellenesség kezelésére szolgáló eljárás, mely eljárás szerint az egyénnek a fent leírt gyógyászati készítmény olyan mennyiségét adagoljuk, amely hatékonyan javítja a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptor elégtelen mennyiségben történő expressziójának következtében kialakuló rendellenességet.
A találmány tárgyát képezi humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptorallél expressziójával kapcsolatos rendellenességre való hajlam diagnózisára szolgáló eljárás, amely az alábbi lépéseket tartalmazza: a) a rendellenességben szenvedő egyénektől DNS-t nyerünk; b) a DNS-t restrikciós enzimekből álló sorozattal emésztjük; c) az így kapott DNS-fragmenseket a méret meghatározására alkalmas gélen elektroforetikusan szétválasztjuk; d) a kapott gélt a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-sel specifikusan hibridizálódó és kimutatható markerrel jelölt nukleinsav hibridizációs próbával érintkeztetjük; e) a humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-sel hibridizálódott, kimutatható markerrel jelölt csíkokat kimutatjuk, hogy a rendellenességben szenvedő egyének DNSére jellemző specifikus egyedi csíkmintákat kapjunk; f) a diagnózis céljára nyert DNS-t az a)-e) pontok szerint feldolgozzuk; majd g) a rendellenességben szenvedő egyének DNS-ére specifikus (e) pontban kapott egyedi csíkmintákat és az (f) pontban kapott diagnosztizálandó DNS mintáját összehasonlítjuk, hogy megállapítsuk, megegyezik-e a minta vagy eltér, és amennyiben a min11
HU 221 822 Β1 ták megegyeznek, diagnosztizáljuk a rendellenességre való hajlamot. A fenti eljárást alkalmazhatjuk meghatározott humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptorallél expressziójával kapcsolatos rendellenesség diagnózisára is.
A találmány tárgyát képezi az izolált 5-HT4B-receptor előállítására szolgáló eljárás, mely eljárás szerint a sejtekben indukáljuk a receptor expresszióját, az így kapott sejtekből visszanyeljük a receptort és az így kapott receptort tisztítjuk. 5-HT4B-receptor például az 1. szekvencia szerinti aminosavszekvenciával lényegében megegyező aminosavszekvenciával rendelkező izolált protein. A sejtekben a receptor expresszálódását olyan anyagokkal indukálhatjuk, mint például a hormonok. A sejteket ezt követően homogenizáljuk és a receptort a homogenizátumból például szerotonint vagy más, igazoltan az 5-HT4B-receptorhoz kötődő anyagot tartalmazó affinitásos oszloppal izoláljuk. A kapott frakciókat ezután ioncserélő oszloppal érintkeztetve tisztítjuk, majd meghatározzuk mely frakció tartalmaz 5-HT4B-receptoraktivitást vagy köt antireceptor ellenanyagokat.
A találmány tárgyát képezi az izolált 5-HT4B-receptor előállítására szolgáló eljárás, mely eljárás szerint az 5-HT4B-receptort kódoló nukleinsavat megfelelő vektorba inszertáljuk, a kapott vektort megfelelő gazdasejtbe juttatjuk, a kapott sejtek által termelt receptort visszanyerjük és az így kapott receptort tisztítjuk. Ilyen izolált 5-HT4B-receptor például az 1. szekvencia szerinti aminosavszekvenciával lényegében megegyező aminosavszekvenciával rendelkező izolált protein. Az 5-HT4B-receptor előállítására a technika állása szerinti rekombináns DNS-technológiák alkalmazhatók. Az 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavat például alkalmas vektorba, például expressziós vektorba inszertálhatjuk. A vektorral alkalmas gazdasejtet, például baktériumsejtet vagy eukarióta sejtet, például élesztősejtet transzformálunk. A tenyésztőfolyadékból affinitásos kromatográfiával vagy más, a technika állása szerint ismert eljárással 5-HT4B-receptort izolálunk.
A találmány tárgyát képezi annak meghatározására szolgáló eljárás, hogy egy ligandum, melyről nem tudjuk, hogy képes-e humán 5-HT4B-receptorhoz kötődni, kötődik-e humán 5-HT4B-receptorhoz, mely eljárás szerint humán 5-HT4B-receptort kódoló izolált nukleinsavmolekulát tartalmazó, a sejtfelszínen a kódolt proteint expresszáló emlőssejtet érintkeztetünk a ligandummal olyan feltételek mellett, amelyek a humán 5-HT4B-receptorhoz ismereteink szerint kötődő ligandumok kötődését elősegítik, kimutatjuk az 5-HT4B-receptorhoz kötődött ligandum jelenlétét és ezáltal meghatározzuk, hogy a ligandum kötődik-e a humán 5-HT4B-receptorhoz. Szintén a találmány tárgyát képezi annak meghatározására szolgáló eljárás, hogy egy ligandum, melyről nem tudjuk, hogy képes-e a humán 5-HT4B-receptorhoz kötődni, funkcionálisan kiváltja-e annak aktivitását vagy gátolja a receptort aktiváló ligandum hatását. Ez az eljárás tartalmazza humán 5-HT4Breceptort kódoló izolált DNS-molekulát tartalmazó emlőssejt érintkeztetését a ligandummal olyan feltételek mellett, amelyek lehetővé teszik egy válaszfunkció aktiválását vagy gátlását, melyet az emlőssejteken végzett biológiai vizsgáló eljárással, például a másodlagos hírvivő válasz alapján mutathatunk ki, ezáltal meghatározzuk, hogy a ligandum kiváltja vagy megakadályozza a humán 5-HT4B-receptor aktivitásának megfelelő funkció kifejtését. A sejtben található DNS-szekvencia az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében megegyező szekvenciával rendelkezhet, előnyösen, az emlőssejt nem idegsejt-eredetű. Nem idegsejt-eredetű emlőssejt például az Ltk-sejt, közelebbről az L-5-HT4Belnevezésű Ltk-sejt. Funkcionális vizsgálati eljárásokban alkalmazható további nem idegsejt-eredetű emlőssejt egy egér fibroblaszt sejtvonal, közelebbről az NIH3T3-sejtvonal. Annak megállapítására szolgáló előnyös eljárás szerint, hogy egy ligandum képes-e a humán 5-HT4B-receptorhoz kötődni, felületén 5-HT4Breceptort expresszáló transzfektált, nem idegsejt-eredetű emlőssejtet (például olyan sejtet, amely eredetileg semmilyen 5-HT-proteinnel vagy G-proteinnel kapcsolatos receptort nem expresszál, amely tehát csak abban az esetben expresszál ilyen receptort, ha azzal a sejtet transzfektáltuk) vagy a fenti transzfektált sejtekből származó membránkészítményt érintkeztetünk a ligandummal az in vivő fennálló feltételek mellett, melyek mellett tehát in vivő a ligandum az 5-HT4B-receptorhoz kötődik, kimutatjuk a sejtek felszínén az 5-HT4Breceptorhoz kötődött vizsgálandó ligandum jelenlétét, ezáltal meghatározzuk, hogy a ligandum kötődik-e a receptorhoz, aktiválja-e a receptort vagy megakadályozza az 5-HT4B-receptor aktiválását. A fenti válaszrendszert úgy állíthatjuk elő, hogy olyan alkalmas sejteket transzfektálunk az izolált DNS-sel, melyek tartalmazzák a kívánt másodlagos hírvivő rendszert, például foszfoinozitid hidrolízist, adenilát-ciklázt, guanilát-ciklázt vagy ioncsatomákat. Ilyen gazdarendszereket izolálhatunk már létező sejtvonalakból vagy előállíthatunk oly módon, hogy másodlagos hírvivő rendszerek megfelelő komponenseit már létező sejtvonalakba juttatjuk. A fenti transzfekciós rendszer a fent leírtak szerint teljes értékű válaszrendszerként alkalmazható humán 5-HT4B-receptor ligandumok által történő aktiválásának kutatására vagy vizsgálatára. A transzfekciós rendszerek élő sejttenyészetekként alkalmazhatók a receptorhoz kötődő, radioaktív, spektroszkópiás eljárással kimutatható vagy más reagenssel jelölt ismert hatóanyagok/ligandumok vagy hatóanyag/ligandum jelöltek közti kompetitív kötődésvizsgálati eljárások végzésére. A fenti kompetitív kötődésvizsgálati eljárásokat a transzfektált sejtekből izolált receptort tartalmazó membránkészítmények alkalmazásával is elvégezhetjük. Transzfekciós rendszerekben a másodlagos hírvivő rendszereken vagy az általuk kiváltott hatások mérésén alapuló funkcionális vizsgálati eljárások a receptorkötődés affinitását és a receptorműködés aktiválásának hatékonyságát jellemző vizsgálati eljárásokként működnek. Egy transzfekciós rendszer olyan „új hatóanyagok felfedezésére alkalmas rendszert” képez, amely hatóanyagok kifejlesztésére alkalmas természetes vagy szintetikus vegyületek azonosítására alkalmazható, melyeket tovább módosíthatunk vagy közvetlenül alkalmazhatunk terá12
HU 221 822 Β1 piás vegyületként a humán 5-HT4B-receptor természetes funkcióinak aktiválására vagy gátlására. A transzfekciós rendszer alkalmazható továbbá, ismert hatóanyagok humán 5-HT4B-receptor helyekhez való kötődése affinitásának és hatékonyságának meghatározására.
A találmány tárgyát képezi továbbá hatóanyagok vizsgálatára szolgáló eljárás a sejt felszínén specifikusan humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptorral kölcsönhatásba lépő és ahhoz kötődő hatóanyagok azonosítására, mely eljárás szerint a felületén humán vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptort kódoló DNS-molekulát expresszáló emlőssejtet érintkeztetünk több hatóanyaggal, kimutatjuk az emlőssejthez kötődő hatóanyagok jelenlétét, ezáltal azonosítjuk a specifikusan humán és/vagy emlőseredetű 5-HT4B-receptorral kölcsönhatásba lépő és ahhoz kötődő hatóanyagokat. A kimutatásra különböző eljárásokat alkalmazhatunk. A hatóanyagot „megjelölhetjük” oly módon, hogy egy kimutatható markert (például radioaktív vagy nem izotóp természetű jelölőanyagot, például biotint) kapcsolunk hozzá. A sejtben található DNS az 1. ábra szerinti kódolószekvenciával lényegében megegyező kódolószekvenciával rendelkezhet. Előnyösen, az emlőssejt nem idegsejteredetű sejt. Nem idegsejt-eredetű emlőssejt például a Cos-7-sejt. Hatóanyagjelölteket a transzfektált sejtekben az expresszált 5-HT4B-receptorproteinhez nagy affinitással kötődő kémiai vegyületek kiválasztásával azonosíthatunk a technika állása szerint jól ismert, radioaktívan jelölt ligandum kötődését kimutató vizsgálati eljárások alkalmazásával, melyeket az itt leírt kötődésvizsgálati eljárásokkal szemléltetünk. A hatóanyagjelöltek szelektivitását is megvizsgáljuk, oly módon, hogy olyan vegyületeket azonosítunk, melyek egy meghatározott receptorhoz nagy affinitással kötődnek, de semmilyen más receptoraltípushoz vagy más ismert receptorhoz nem kötődnek nagy affinitással. Mivel szelektív és nagy affinitással kötődő vegyületek a betegnek történő adagolást követően elsősorban a célzott 5-HT4B-receptor-helyekkel lépnek kölcsönhatásba, ezzel a megközelítéssel minimálisra csökkentjük annak az esélyét, hogy nemkívánatos mellékhatásokkal rendelkező hatóanyagot állítsunk elő. A találmány tárgyát képezi a fenti eljárással azonosított hatóanyagot és egy a gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyászati készítmény. A leírásban „gyógyászatilag elfogadható hordozón” bármely szokásos gyógyszergyártásban alkalmazott hordozóanyagot értünk, például foszfátpufferes fiziológiás sóoldatot, vizet és emulziókat, mint például „olaj a vízben” típusú emulziókat vagy „víz az olajban” típusú emulziókat, és különböző típusú nedvesítőanyagokat. Miután a hatóanyagjelöltről kimutattuk, hogy az meghatározott adagolási módot követően, például szájon át történő adagolást vagy injektálást követően biológiailag megfelelően hozzáférhető (a kívánt terápiás hatás elérése céljából, a hatás helyén megfelelő ideig megfelelő terápiás koncentrációt kell fenntartanunk), valamint kimutattuk róla, hogy nem toxikus és megfelelő betegségmodellekben hatékony, a hatóanyagot az adott adagolási mód szerint, melyről kimutattuk, hogy azzal a hatóanyag biológiailag hozzáférhető, megfelelő szilárd vagy folyékony készítményben betegeknek adagolhatjuk, hogy a kívánt terápiás hatást elétjük.
Új, humán 5-HT4B-receptor-altípusba tartozó proteint azonosítottunk, melyet 5-HT4B-nek neveztünk, valamint terápiásán alkalmazható gyógyászati készítmények azonosítására szolgáló eljárásokat írtunk le. A specifikus receptoraltípusok ellen irányuló gyógyászati készítmények minimális mellékhatással járó, hatékony, új terápiás lehetőséget jelentenek.
A neuronális szerotoninreceptorok molekuláris szerkezetének felderítése fontos lépést jelent a szerotoninerg neurotranszmisszió megértésében. A találmány humán 5-HT4B-receptort kódoló új cDNS-klón izolálását, az általa kódolt aminosavszekvenciát, és annak funkcionális expresszióját ismerteti. Az 5-HT4B-receptor-altípusok azonosítása központi szerepet játszik a szerotoninerg neurotranszmisszió alapját képező molekuláris mechanizmusok felderítésében, és elősegítheti új terápiás hatóanyagok kifejlesztését is.
Humán cDNS-könyvtárból és genomi génkönyvtárból szerotoninreceptor-altípust kódoló (hp78-elnevezésű) komplementer DNS-klónt izoláltunk és annak funkcionális sajátságait emlőssejtekben vizsgáltuk. A nukleotidszekvencia alapján megállapítottuk, hogy az egy 445 aminosavból álló proteint kódol, amely 7, a membránon áthaladó doménoknak megfelelő igen hidrofób régiót tartalmaz. Az 5-HT4B szerkezetének és működésének analízise modellként szolgál az angina, koronáriaartéria-betegségek, érelmeszesedés, agyvérzéshez vezető agyi érrendellenességek, irritábilis bél tünetegyüttes, vagy a gyomor-bél traktus egyéb motilitási zavarai, központi idegrendszeri rendellenességek, fájdalomérzékelés, affektív betegségek, magasabb rendű kognitív folyamatokat érintő rendellenességek, anélkül, hogy igényünket az alábbira korlátoznánk, szkizofrénia, valamint autonóm funkciók szabályozását érintő rendellenességek kezelésére alkalmazható hatóanyagok kifejlesztésére.
Elsőként írjuk le emlős szerotoninreceptor izolálását, annak aminosavszekvenciáját, az emlősreceptor génjét, valamint a receptor aktiválását, mely felismerések alapján szerzett információk és a találmány szerinti kísérleti elrendezések alkalmasak új terápiás hatóanyagok előállítására, a fenti receptorproteinen alapuló új terápiás és diagnosztikai vizsgálati eljárásokat, az azzal kapcsolatos mRNS-molekulát, valamint az azzal kapcsolatos genomi DNS-t. A találmány szerinti információk és kísérleti eszközök alkalmazhatók a fenti új szeronotinreceptor-altípust, az azzal kapcsolatos mRNSmolekulát, valamint az azzal kapcsolatos genomi DNSt alkalmazó új terápiás hatóanyagok és új terápiás és diagnosztikai vizsgálati eljárások előállítására.
Közelebbről, a találmány tárgyát képezi új, 5-HT4B elnevezésű, szeronotinreceptort kódoló emlős cDNS-klónok és genomi-klónok izolálása. Izoláltuk és jellemeztük a receptort kódoló új humán gént, melyet hp78aklónnak neveztünk, és egy sor azzal kapcsolatos cDNSklónt és genomi DNS-klónt izoláltunk. Ezenkívül a humán 5-HT4B-receptort Cos-7-sejtekben expresszáltuk,
HU 221 822 Β1 oly módon, hogy a sejteket a pcEXV-5-HT4B-plazmiddal transzfektáltuk. Meghatároztuk a kódolt 5-HT4B-receptor farmakológiai kötőtulajdonságait, a kötőtulajdonságok alapján megállapítottuk, hogy egy új szerotoninreceptorról van szó. A sejtfelszínen humán 5-HT4B-receptort expresszáló emlőssejtvonalakat állítottunk elő, tehát előállítottuk az első jól meghatározott, az új 5-HT4B-receptor vizsgálatára alkalmas tenyésztett sejtvonalakat.
A találmány szerinti megoldást a továbbiakban a pontosabb értelmezhetőség céljából konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy az alább részletezett kísérletek csupán a szemléltetést szolgálják, anélkül azonban, hogy igényünket, melyet a leírást követő igénypontokban fogalmaztunk meg, az ismertetettekre korlátoznánk.
Az alábbiakban ismertetjük a felhasznált módszereket és anyagokat.
Klónozás és szekvenálás: λ-dash-II-ben létesített (összesen »1,5 xlO6 rekombinánst tartalmazó) humán placenta genomi génkönyvtárat (Stratagene, LaJolla, CA) vizsgáltunk át a Dro5HTR Drosophila szerotoninreceptor-génből, [Witz és munkatársai: (1990)] származó átfedő transzmembrán- (TM) oligonukleotid-próbák (TM 3, 5, 6 és 7) alkalmazásával. Az átfedő oligomereket DNS-polimeráz nagyméretű fragmensével végzett szintézissel, [32P]dATP-vel és [32P]dCTP-vel jelöltük. A hibridizációt közepesen sztringens feltételek mellett végeztük: 45 °C-on, 37,5% formaldehidet, 10% dextrán-szulfátot, 5xSSC-t (lxSSC: 0,15 mol/1 nátrium-klorid, 0,015 mol/1 nátrium-citrát), lxDenhardtoldatot [0,02% poli(vinil-pirrolidon), 0,02% Fikoll, 0,02% szarvasmarha-szérumalbumin] és 200 pg/μΐ ultrahanggal kezelt lazacsperma-DNS-t tartalmazó oldatban. A filtereket 45 °C-on, 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,1 χ SSC-oldatban mostuk és -70 °Con, erősítő szűrő jelenlétében Kodak-XAR filmre exponáltuk. A próbával hibridizálódó λ-fág kiónokat plakktisztítottuk és Southern-blot-analízis céljára [Southern: (1975); Sambrook és munkatársai: (1989)] DNS-t állítottunk elő. Szubklónozás és további Southern-blot-analízis céljára a DNS-t pUCl 8-plazmidba (Pharmacia, Piscataway, NJ), pGEM5Zf-plazmidba (Promega, Madison, WI) vagy pBluescriptII-plazmidba (Stratagene, LaJolla, CA) szubklónoztuk. A nukleotidszekvencia-analízist Sanger-féle didezoxi-nukleotidláncterminációs eljárással végeztük [Sanger és munkatársai: (1977)] denaturált kettős szálú plazmidtemplátokon, Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland, OH), Bst-DNS-szekvenáló reagenskészlet (BioRad Laboratories, Richmond, CA) vagy TaqTrack-szekvenáló reagenskészlet (Promega Corporation, Madison, WI) felhasználásával.
Teljes hosszúságú klón izolálása céljából humán cDNS-génkönyvtárat vizsgáltunk át polimeráz-láncreakcióval (PCR-ral), az izolált genomi klón alapján tervezett specifikus láncindító oligonukleotidok mindegyikéből 1 pmol/l felhasználásával, melyek az alábbiak voltak: a szenszszálról (az 512-535. nukleotidoknak megfelelően) az 5’-TGACCCTGTGCGTGATCAGCATTG-3’ oligonukleotid, az antiszenszszálról (a 945-974. nukleotidoknak megfelelően) az 5’-GCTTTCTGTTCTCGCTTAAAGATGGAGATG-3 ’ oligonukleotid (lásd 1. ábra). 5’-, valamint 3’-láncindító oligonukleotidokként a Tm3, valamint a Tm5/Tm6 hurokrégiók 3’-végének megfelelő láncindító oligonukleotidokat alkalmaztunk. A cDNS-könyvtárból (λ ZapII; Stratagene, LaJolla, CA) 1-2 μΐ, körülbelül 106-107 plakkformáló egységet tartalmazó fág-DNS-t amplifikáltunk az alábbi összetételű oldatban: 10 mmol/1 TrisHC1 (pH 8,3), 50 mmol/1 KC1, 1,5 mmol/1 MgCl2, 0,01% zselatin, 200 pmol/l dATP, dCTP, dGTP és dTTP, valamint 2,5 egység Thermus aquaticus DNS-polimeráz (Taq-polimeráz; Perkin-Elmer-Cetus, Norwalk, CT). Az amplifikációs reakciót 30 cikluson át folytattuk: a DNS-t először 95 °C-on, 5 percig denaturáltuk (1. ciklus), majd a 2 percig 94 °C-on, 2 percig 68 °C-on, és 3 percig 72 °C-on végzett amplifikációs ciklust ismételtük (3 másodperc láncnövesztés), végül 10 percig, 72 °C-on végzett láncnövesztéssel fejeztük be. A PCR-termékeket etidium-bromiddal (EtBr) festett agarózgéleken analizáltuk és az EtBr-dal festett gélen csíkot adó bármely mintát pozitívként értékeltünk.
Egy pozitív génkönyvtárat ezután kioltottunk és azt [a-32P]dCTP, [a-32P]dATP és DNS-polimeráz Klenow-fragmensének felhasználásával feltöltött, 45 nukleotidot tartalmazó átfedő oligonukleotidpróbákkal vizsgáltuk. Ez a próba a fenti amplifikációs láncindító oligonukleotidokhoz képest belül található, az alábbi oligonukleotidokat alkalmaztuk: a szenszszálról (az 864-908. nukleotidoknak megfelelően) az 5’-CCTGAATGGCATAGTGAAGCTCCAGAAGGAGGTGGAAGAGTGTGC-3’ oligonukleotid, az antiszenszszálról (a 889-933. nukleotidoknak megfelelően) az 5’-ATGCTTGAGGAGTCTCGAAAGGTTTGCACACTCTTCCACCTCCTT-3’ oligonukleotidot (lásd 1. ábra). Pozitív cDNS-fágklónokat plakktisztítottunk és a rekombináns DNS-t λ ZapII-ből R408 „helperfág” segítségével kivágtuk és pBluescript-plazmidba mentettük át a gyártó utasításai szerint eljárva (Stratagene, LaJolla, CA). Az inszert méretét restrikciós enzimekkel végzett emésztést követő analízissel meghatároztuk és a rekombinánsokat a fent leírtak szerint szekvenáltuk.
Három további átfedő oligonukleotid kombinációval összesen három részleges, de átfedő cDNS-klónt izoláltunk. Ezek az oligonukleotidok és a megfelelő cDNS-klónok az alábbiak voltak: a hFB9a, (amely a Tm3/4 hurokban található szekvenciát tartalmaz), és amelyet a szenszszálhoz tartozó, (az 529-573. nukleotidoknak megfelelő) 5’-AGCATTGACAGGTACCTTGGGATCACAAGGCCCCTCACATACCCT-3’ és az antiszenszszálhoz tartozó, (az 554-599. nukleotidoknak megfelelő) 5’-CCATGCATTTCCCATTCTGCCTCACAGGGTATGTGAGGGGCCTTG-3 ’ oligonukleotiddal kaptunk, a hFB44a, (amely a Tm2/3 hurokban található szekvenciát tartalmaz), és amelyet a szenszszálhoz tartozó, (a 412-456. nukleotidoknak megfelelő) 5’-GTCAGCGTCACCGACCTCATCGGGGGCAAGTGGATCTTTGGACAC-3’ és az antiszenszszál14
HU 221 822 Β1 hoz tartozó, (a 437-481. nukleotidoknak megfelelő) 5 ’-TGGCGATGAAG ACATTAC AGAAAAAGTGTCCAAAGATCCACTTGC-3 ’ oligonukleotidokkal kaptunk, valamint a hFB41a, (amely az NH2-terminális részben található szekvenciát tartalmaz), és amelyet a szenszszálhoz tartozó, (az 107-150. nukleotidoknak megfelelő) 5’-GGCGCCGACCCGGTCGCGGGCTCCTGGGCACCGCACCTGCTGAGC-3’ és az antiszenszszálhoz tartozó, (a 131-175. nukleotidoknak megfelelő) 5 ’-TGGGCGCCGGGCTGGCTGTCACCTCGCTCAGCAGGTGCGGTGCCC-3 ’ oligonukleotiddal kaptunk.
Expresszió: A humán 5-HT4B-receptor (1338 bázispárból álló) teljes kódolószekvenciáját, ezen belül a 27 bázispárból álló 5 ’-irányú nem transzlálódó szekvenciát (5’-UT) és 50 bázispárból álló 3’-irányú nem transzlálódó szekvenciát (3’-UT), az EXJ.HR elnevezésű polilinkerrel módosított pCEXV-3 eukarióta expressziós vektor [Miller és munkatársai: (1986)] Sáli és EcoRI hasítási helyei közé klónoztuk (nem közölt adat). A konstrukciót oly módon állítottuk elő, hogy humán placentából és fötális agyból előállított három részleges átfedő genomi cDNS-klónból származó fragmenst ligáltunk, melyek az alábbiak voltak: egy 0,5 kb. hosszúságú Ncol-Ncol genomi fragmens, mely a startkodontól a IM3-ig tartott (a szubklónozásnál az 5’végen található inszert eredetű belső Ncol-hely helyett a vektoreredetű Sall-helyet használtuk), az Ncol- és ΚρηΙ-végekkel rendelkező, csupán a TM3-at tartalmazó fragmens, melyet átfedő oligonukleotidok alkalmazásával szintetizáltunk (az előzőekben meghatározott cDNS-szekvencia alapján), valamint a TM3/4 hurkot, a stopkodont, valamint a 3’ UT-régiót tartalmazó 0,8 kb hosszúságú KpnI- EcoRI cDNS-fragmens. Majomvesesejteket transzfektáltunk tranziens módon a hp78a/EXJ-pIazmiddaI (a humán 5-HT4B-receptorgént kódoló expressziós vektorral), DEAE-dextrán eljárással (a reagenseket a Specialty média cégtől szereztük be, Lavelette, NJ). A sejteket egy rétegben tenyésztettük Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadékban (Gibco, Grand Island, N. Y.; 23), kontrollált feltételek mellett (37 °C-on, 5% CO2-atmoszférában). Stabil sejtvonalakat nyertünk oly módon, hogy kalcium-foszfáttechnikával LM(tk) -sejteket a hp78a/EXJ-plazmiddal (a humán 5-HT4B-receptorgént tartalmazó expressziós vektorral), valamint az amino-glikozid-transzferázgént tartalmazó pGCos3neo-plazmiddal transzfektáltuk. A sejteket ellenőrzött feltételek mellett (37 °Con, 5% C02-atmoszférában), 25 mmol/1 glükózt tartalmazó, 10% boqú szérumalbuminnal, 100 egység/ml penicillin-G-vel és 100 pg/ml streptomycin-szulfáttal kiegészített Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadékban (Gibco, Grand Island, N. Y.) tenyésztettük. A korábbiakban ismertettek szerint [Weinshank és munkatársai: (1990)] a G-418 antibiotikumrezisztencia alapján (1 mg/ml) stabil kiónokat válogattunk, a membránt összegyűjtöttük és azt az alább leírtak szerint [3H]hidroxi-triptamin-kötésre nézve vizsgáltuk (lásd, a radioaktívan jelölt ligandum kötődésére vonatkozó vizsgálati eljárásokat).
Makrolokalizáció (PCR/szövet transzkripciós expresszióvizsgálatok): Humán szöveteket (NDRI) homogenizáltunk és abból guanidin-izotiocianát/CsCl párna módszerrel össz-RNS-t extraháltunk a korábbiakban ismertettek szerint [Kingston: (1987)]. 5 pg össz-RNS-ből cDNS-t állítottunk elő véletlenszerű hexanukleotid láncindító oligonukleotidok (500 pmol/1) és Superscript reverz transzkriptáz (BRL) felhasználásával, 40 egység ribonukleazint, 2,5 mmol/1 MgCl2-ot, 50 mmol/1 KCl-ot és mindegyik dNTP-ből 1 mmol/1 mennyiséget tartalmazó 50 mmol/1 Tris/HCl (pH 8,3) pufferben, a reakciót 42 °C-on, 1 órán át végezve. Az elegyhez ribonukleázH-t adtunk (2 egységet), 20 percig, 37 °C-on inkubáltuk, majd 5 percig 95 °C-ra melegítettük és jégen lehűtöttük. A PCR-eljáráshoz egy az első cDNS-szálat tartalmazó mintát 50 μΐ térfogatú, 1,25 egység Taq polimerázt és
I pmol/1 láncindító oligonukleotidot tartalmazó PCRreakcióelegyben hígítottunk (1:5 arányban) a gyártó (Cetus Corp.) által mellékelt pufferben, (a dNTP-ok végkoncentrációja 200 pmol/1 volt) (az 5’- és 3’ oligonukleotidok megegyeztek a cDNS-könyvtárak átvizsgálásánál alkalmazottakkal, lásd fent). A PCR-amplifikációs reakciót az alábbiak szerint végeztük: a DNS-t először 5 percig, 95 °C-on inkubáltuk, majd 30 cikluson át az alábbi ciklust követtük: 2 perc 94 °C-on, 2 perc 68 °C-on, és 3 perc 72 °C-on, a reakciót végül 10 percig, 72 °C-on végzett inkubálással fejeztük be. Annak érdekében, hogy az RNS-extrakció során szennyeződésként továbbvitt DNS esetleges amplifikálódását ellenőrizni tudjuk, párhuzamosan kontroll-PCR-reakciót futtattunk, a cDNSmintával azonos módon hígított RNS-preparátumot templátként alkalmazva. A PCR-termékeket 1,5%-os agarózgélen futtattuk és töltéssel rendelkező nejlonmembránra (ZetaProbe, BioRad) vittük át. A filtereket a PCR láncindító oligonukleotidoknak megfelelő, a végén ([X-32P]ATP-vel) megjelölt belső próbával hibridizáltattuk, (ez az oligonukleotid megegyezett a kiindulásul szolgáló humán fötális agyból származó cDNS-génkönyvtár átvizsgálásánál alkalmazottal, lásd fent), nagymértékben sztringens feltételek mellett (50 °C-on) mostuk, és azzal a fent leírtak szerint erősítő szűrő jelenlétében, -70 °Con, Kodak-XAR filmet exponáltunk.
Mikrolokalizáció („in situ” hibridizáció): Az „in situ ” hibridizációs és receptor-autoradiográfiás vizsgálatokban alkalmazott patkányokat CO2-dal fájdalommentesen leöltük, fejüket levágtuk, az agyat kiszedtük és hideg izopentánban lefagyasztottuk. Ezt követően a szöveteket kriosztátfogóba fogtuk és a -20 °C-os kriosztátban az „in situ” hibridizációs vizsgálat céljára
II pm vastagságú metszetsorozatot vagy a receptorautoradiográfiás vizsgálat céljára 20 pm vastagságú metszetsorozatot készítettünk. A metszeteket felolvasztva poli-L-lizinnel bevont mikroszkóptárgylemezre helyeztük, 1 órán át, szobahőmérsékleten levegőn szárítottuk, és felhasználásig -80 °C-on tároltuk.
A patkány 5-HT4B-mRNS alapján „Cyclon Plus” DNS-szintetizáló készülékkel (Milligen/Biosearch) antiszensz és szensz oligonukleotidokat (45 nukleotidból álló oligonukleotidokat) szintetizáltunk. A próbákat a 3’-végen terminális dezoxinukleotid-transzferázzal
HU 221 822 Β1 (Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN) 35S-dATPtal jelöltük (1200 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, MA), így 109 dpm/pg specifikus aktivitást értünk el. A radioaktívan jelölt próbákat Biospin-6 kromatográfiás oszlopon (BioRad; Richmond, CA) tisztítottuk és hibridizációs pufferben 1,5 χ 104 cpm/μΐ koncentrációig hígítottuk. A hibridizációs puffer 50% formaldehidet, 4 χ nátrium-citrát-puffert (SSC; lxSSC=0,15 mol/1 NaCl és 0,015 mol/1 nátrium-citrát), 1 χ Denhardt-féle oldatot [0,2% poli(vinil-pirrolidin), 0,2% Fikoll, 0,2% szarvasmarha-szérumalbumin] 50 mmol/1 ditiothreitolt, 0,5 mg/ml lazacsperma-DNS-t, 0,5 mg/ml élesztőtRNS-t és 10% dextránszulfátot tartalmazott.
A szövetmetszeteket a felhasználás előtt egy órával szobahőmérsékletre melegítettük. A metszeteket 10 mmol/1 foszfátpufferes fiziológiás sóoldatban (PBSben) oldott 4% (vegyes%) paraformaldehiddel fixáltuk, PBS-ben kétszer mostuk, 5 mmol/1 vízben oldott DTTvel öblítettük, 10 percig 0,1 mol/1 trietanol-aminban oldott 0,25% (térfogat%) jégecetben acetileztük és 2 χ SSC-ben kétszer mostuk. Ezután a metszeteket felszálló alkoholsorban dehidráltuk, kloroformmal lipidmentesítettük és levegőn szárítottuk. Mindegyik metszetre 100 pl hígított próbát tettünk, majd Parafilmmel lefedtük. A hibridizálást éjszakán át végeztük nedveskamrában, 40-55 °C-on. A következő napon a metszeteket egy órán át, szobahőmérsékleten kétszer váltott 2 χ SSC-ben, 30 percig, 50-60 °C-on 2 χ SSC-ben, végül szobahőmérsékleten, 30 percig, 0,1 χ SSC-ben mostuk. A szöveteket felszálló alkoholsorban dehidráltuk és azokkal 3 naptól 2 hétig terjedő ideig, -20 °C-on Kodak-XAR-5 filmet exponáltunk, majd a metszeteket 0,2%-os vizes glicerinoldattal 1:1 arányban hígított Kodak-NTB3 autoradiográfiás emulzióba mártottuk. Miután a metszeteket 2-4 hétig, 4 °C-on exponáltuk, a lemezeket Kodak-D-19 előhívóban előhívtuk, fixáltuk és hematoxilin-eozinnel a hátteret megfestettük.
Mikrolokalizáció (receptor-autoradiográfia): Az [3H]5-CT-kötődés vizsgálatát az alábbiak szerint végeztük. A tárgylemezre erősített szövetmetszeteket (20 pm) szobahőmérsékletre melegítettük és 15 percig, 0,17 mol/1 Tris-HCl-ot, 4,0 mmol/1 CaCl2-ot, 0,01% (vegyes%) aszkorbinsavat és 10 pmol/l pargylint tartalmazó pufferben előinkubáltuk. A lemezeket 1 óráig, szobahőmérsékleten, 0,5 nmol/1 [3H]5-karboxamido-triptamin-oldatban (NEN, 50,4 Ci/mmol) inkubáltuk. Abból a célból, hogy az 5-HT4B-receptort a [3H]5-CT-t szintén kötő egyéb szerotoninreceptoroktól el tudjuk különíteni, azok fedésére (masking) 100 nmol/1 PAPP-ot és 160 nmol/1 (—)pindololt használtunk. Mivel az 5-HT4B-receptor nagy affinitással kötődik methiothepinhez, a radioaktív ligandumhoz 5 nmol/1 methiothepint adtunk, hogy a [3H]5-CT-nek az 5-HT4B-receptorhoz történő kötődését kiküszöböljük. A nem specifikus kötődést úgy határoztuk meg, hogy a radioaktív ligandumhoz 1 pmol/l ergotamint adtunk. Miután a lemezeket a radioaktív ligandum jelenlétében inkubáltuk, azokat 20 percig, 4 °C-on a fenti pufferben kétszer mostuk, rövid ideig jéghideg vízben öblítettük és gyenge meleg légáramlás alatt szárítottuk. A lemezeket 4-6 hétig, szobahőmérsékleten Hyperfilmre tettük, majd a filmeket D-19-cel (Kodak) előhívtuk, fixáltuk és levegőn szárítottuk.
Membránkészítmény előállítása: A humán 5-HT4Breceptorgénnel tranziens módon transzfektált Cos-7sejteket tenyésztettünk 48 órán át és a korábbiakban leírtak szerint [Branchek és munkatársai: (1990)] a membránokat összegyűjtöttük. A membrán-homogenizátumokat jégen tároltuk és egy órán belül felhasználtuk a radioaktív ligandumkötődés vizsgálatára. A proteinkoncentrációt Bradford eljárásával határoztuk meg [Bradford: (1976)], standardként szarvasmarha-szérumalbumint használtunk.
Radioaktív ligandum kötődésének vizsgálata: A kötődésvizsgálatokat a korábbiakban leírtak szerint végeztük [Zgombick és munkatársai: (1991)], radioaktív ligandumként [3H]5-HT-t használtunk. A telítési vizsgálat során nyolc [3H]5-HT-koncentrációt alkalmaztunk (1-100 nmol/1); a kompetíciós vizsgálat során a jelöletlen ligandum hét koncentrációját, valamint 5 nmol/1 [3H]5-HT-t alkalmaztunk. A nem specifikus kötődés meghatározására jelöletlen [3H]5-HT-t használtunk (10 pmol/l). A reakciókat vákuumos leszívással fejeztük be (Brandel, Gaithersburg, MD) és a maradék radioaktivitás mennyiségét Beckman 500TA folyadékszcintillációs számlálóval (Beckman Instruments, Fullerton, CA) határoztuk meg.
A cAMP-képződés meghatározása: A humán 5-HT4B-receptorgént expresszáló tranziens módon transzfektált Cos-7-sejtekben, áltranszfektált Cos-7-sejtekben, nem transzfektált Cos-7-sejtekben és stabilan transzfektált LM(-) -sejtekben vizsgáltuk az 5-HT-nek a sejten belüli cAMP-szintre kifejtett hatását. A három fenti ép sejtkészítményben mind az 5-HT által közvetített cAMP-szint-gátlást, mind a stimulációt vizsgáltuk. A sejten belüli cAMP-képződést radio-immunvizsgálati eljárással mértük (’cAMP Radioimmunoassay kit”, Advanced Magnetics, Cambridge, MA) Zgombick és munkatársai eljárása szerint (1991). A radioaktivitás mennyiségét „Packard COBRA Autó Gamma Counter” (adatértékelési programcsomaggal ellátott) készülékkel határoztuk meg.
Az adatok analízise: A kötési adatokat nem lineáris regressziós analízissel analizáltuk (Accufit and Accucomp, Lundon Software, Chargin Falls, OH). Az IC50értékeket a Cheng-Prusoff-egyenlettel alakítottuk Kiértékekké. A funkcionális adatokat egy négy paraméteres egyenletbe helyettesítettük be, hogy megkapjuk a válaszparamétereket (EC50, Emax, nH; Inplot GraphPad, SanDiego, CA). Mindegyik kísérletet legalább háromszor végeztünk el.
Hatóanyagok: A hatóanyagokat az alábbi cégektől szereztük be: [3H]5-HT (specifikus aktivitás=20,4-28,0 Ci/mmol) (New England Nuclear, Boston, MA); 5-HT, ergotamin, ergonovin, oximetazolin, (±)pindolol, 5’-guanilil-imido-difoszfát (Sigma, St. Louis, MO); 5-CT, DP-5CT, 5-MeOT, 5-MeO-DMT, (±>a-Me-S-HT, 2-Me-5-HT, triptamin, DPAT, DÓI, ketanserin, metisergid, 1-naftil-piperazin, PAPP, spiperone, TFMPP, yohimbin, zacoprid, (Research Biochemical Inc., Natick, MA); lisergol, metilergonovin (Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI) rau16
HU 221 822 Β1 wolscine (Accurate Chemicals, Westbury, N. Y.) methiothepin (Biomol Research Laboratories, Pylmouth Meeting, PA). Valamennyi egyéb felhasznált vegyszer a kereskedelemben hozzáférhető legnagyobb tisztaságú anyag volt.
Az alábbiakban összefoglaljuk az eredményeket.
Humán genomi placenta génkönyvtárat vizsgáltunk át közepesen sztringens feltételek mellett a DroSHTR Drosophila szerotoninreceptor-gén [Witz és munkatársai: (1990)] harmadik, ötödik, hatodik és hetedik transzmembránrégiójával szemben előállított oligonukleotidpróbákkal. Összesen három pozitív kiónt izoláltunk és jellemeztünk Southem-blot-analízissel. Két klón azonos volt, a harmadik klón a másik kettővel átfedő fragmenst tartalmazott. A két egymással megegyező klón közül az egyik, melyet hp78a-nak neveztünk, egy 1,8 kb hosszúságú EcoRI/Pstl-ffagmenst tartalmazott, amely a Drosophila eredetű oligonukleotidpróbákkal hibridizálódott, és amelyet ezután pUC-vektorba szubklónoztunk. A DNS-szekvencia-analízis szerint a legnagyobb mértékű homológia az adenilát-cikláz-stimulációval kapcsolt Drosophila 5HT-receptorral [Witz és munkatársai: (1990)] volt kimutatható. A fenti szubklón hidrofobicitásgörbéje hidrofil aminosavakból álló szegmenseket határoló hidrofób aminosavakból álló régiókat mutatott ki, ami összhangban van azzal, hogy ez a protein a hét transzmembrán G-proteinnel kapcsolt receptorgén főcsalád tagja [Savarsene és munkatársai: (1992)]. Ezenkívül, ez a klón a várakozásnak megfelelően, az ötödik transzmembránrégióban tartalmazott egy alanint, ami összhangban van azzal, hogy ez a protein a szerotonin-alcsalád tagja; ez az alanin különbözteti meg a szerotonin-alcsaládot az egyéb katekolaminreceptoroktól, (melyek ebben a pozícióban szerint tartalmaznak; Weinshank és munkatársai: (1992b). A fenti klón a karboxiterminális véggel bezárólag a TM4-régiót, valamint a várakozásnak megfelelő második sejten belüli huroktól 5’-irányban egy intront kódolt.
Teljes hosszúságú klón izolálása céljából összesen «1,5 χ 106 rekombinánst tartalmazó humán cDNS-génkönyvtárat vizsgáltunk át polimeráz láncreakcióval a genomi klón szekvenciája alapján tervezett specifikus láncindító oligonukleotidpróbákkal (lásd az anyagokat és módszereket ismertető fejezetet).
Egy pozitív kiónokat is tartalmazó λ-Zap-II-ben létesített, («1,5 xlO6 rekombinánst tartalmazó) humán fötális agy cDNS-génkönyvtárat (Stratagene, LaJolla, CA) vizsgáltunk át hagyományos plakkhibridizációs eljárással, egy belső próba alkalmazásával (lásd a felhasznált anyagokat és módszereket ismertető részt), egy pozitív, részleges hosszúságú cDNS-klónt izoláltunk, melyet hFB9a-klónnak neveztünk, és amely a TM3-régiótól a stopkodonig tartó fragmenst tartalmazott és az eredeti hp78a-klónnal átfedést mutatott (az „mKNS-splicing” következtében a TM3 és TM4 közti intron hiányzott). Mivel ez a klón nem tartalmazta a teljes hosszúságú kiónt, ugyanezt a fötális humán agy cDNS-génkönyvtárat a hFB9a cDNS-klónban a TM3/TM4-huroknak megfelelő, az 5’-véghez legközelebb található nem konzervált régió alapján tervezett próbával vizsgáltuk át (lásd a felhasznált anyagokat és módszereket ismertető részt). Ez a vizsgálat egy másik pozitív, de szintén részleges hosszúságú cDNS-klón izolálásához vezetett, melyet hFB44a-klónnak neveztünk, ez csak a TM2-TM3 régiót kódoló fragmenst tartalmazott és a hFB9a cDNS-klónnal a TM3 régióban átfedést mutatott. Az 5’-irányú fragmenst tartalmazó cDNS-klónok izolálása céljából a humán fötális agy cDNS-génkönyvtárat ismételten átvizsgáltuk a hFB44a cDNS-klónban a TM2/3-huroknak megfelelő, az 5’-véghez legközelebb található nem konzervált régió alapján tervezett próba alkalmazásával (lásd a felhasznált anyagokat és módszereket ismertető részt). Ez a vizsgálat egy másik pozitív, de részleges hosszúságú cDNS-klón izolálásához vezetett, melyet hFB41a-klónnak neveztünk, és amely az aminoterminális vég egy részét tartalmazta a TM3-régióig, amely klónból azonban a kezdő metionintól körülbelül 20 aminosav hiányzott (az előzőhöz hasonló módon, ez a klón a hFB44a cDNS-klónnal a TM2-TM3 régióban átfedést mutatott). Végül, hogy a teljes aminoterminális véget megkapjuk, humán genomi placenta génkönyvtárat vizsgáltunk át nagymértékben sztringens feltételek mellett a hFB41a cDNS-klón nem konzervált aminoterminális régiója alapján tervezett próbával. A fenti genomi génkönyvtár átvizsgálásából összesen két különböző pozitív kiónt izoláltunk, melyeket Southem-blot-analízissel jellemeztünk. Az egyik klón az 5-HT4B-receptor egy pszeudogénjét képviselte (nem közölt adat), míg a másik genomi klón tartalmazta a kezdő metionintól a TM3- és TM4-régiók közti intronig tartó fragmenst. A kezdő metionintól a TM3-régióban található Ncol-hasítási helyig tartó 0,5 kb hosszúságú NcoI/NcoI-fragmenst pGEMplazmidba szubklónoztuk.
A komplett, teljes hosszúságú gént két lépésben állítottuk elő: Az első lépésben két cDNS-klónból származó két fragmenst és egy szintetikus kettős szálú oligonukleotidot ligáltunk pBluescript-plazmidba, a második lépésben az aminoterminális véget tartalmazó genomi fragmenst és egy az első lépésben kapott konstrukcióból származó fragmenst ligáltunk egy expressziós vektorba. Az előállítás első lépésében egy a hFB41a cDNS-klónból származó 0,4 kb Sall/NcoI-fragmenst (a Sáli hasítási hely vektoreredetű volt, míg az Ncol-hely a TM3-régióban található), egy megtervezett Ncol- és KpnI-végekkel rendelkező komplementer hibridizálódott kettős szálú oligonukleotidfragmenst (körülbelül 100 bázispár hosszúságú fragmenst; melynek szekvenciája a hFB9a, hFB44a és a hFB41a cDNS-klónok adatain alapult), valamint a hFB9a cDNS-klónból származó 0,8 kb hosszúságú KpnI/EcoRI-fragmenst (az EcoRI hasítási hely vektoreredetű volt, míg az KpnI-hely a TM3/4-hurokban található) ligáltunk Sáli- és EcoRIenzimekkel emésztett pBluescript-plazmidba, Az előállítás második lépésében a kezdő metionintól a TM3-régióig tartó fragmenst tartalmazó 0,5 kb Sall/Ncol genomi szubklónt (a Sáli hasítási hely vektoreredetű volt, míg az Ncol-hely a TM3-régióban található; ezt a fragmenst Ncol-enzimmel végzett részleges, és Sall-enzimmel végzett teljes emésztéssel kaptuk), valamint egy az első lépésben kapott konstrukcióból származó 0,9 kb
HU 221 822 Β1
NcoI/EcoRI szintetikus oligonukleotid/cDNS fragmenst, (amely tartalmazta a TM3-régiótól a stopkodonig tartó fragmenst), Sáli- és EcoRI-enzimekkel emésztett expressziós vektorba ligáltuk.
Az expressziós vektorban található genomi/cDNS eredetű teljes hosszúságú konstrukció, (melyet hp78a/EXJnek neveztünk), egy 1335 bázispárból álló nyitott olvasási fázist tartalmazott (27 bázispárból álló 5’-UT- és 50 bázispárból álló 3’-UT-régióval) és egy 445 aminosavból álló, körülbelül 49 000 dalton molekulatömeggel rendelkező proteint kódolt. A protein hidrofobicitásvizsgálata a hét transzmembrándomén feltételezett elhelyezkedésének megfelelő képet mutatott, ami a G-proteinnel kapcsolt receptorcsaládra jellemző. Az előzetes szekvenciaanalízis azt mutatta, hogy a hp78a/EXJ-klón a szerotoninreceptorhoz állt legközelebb, mivel az számos, a szerotoninreceptor-család tagjaira jellemző konzervált strukturális tulajdonsággal/aminosawal rendelkezett, például a TM2- és TM3-régiókban konzervált aszparaginsavakat, a TM3-régió végén az Asp-Arg-Tyr szekvenciát az ötödik transzmembránrégióban konzervált alanint és a TM 4-7 régiókban konzervált prolinokat tartalmazott [Hartig és munkatársai: (1990)]. A fenti humán 5-HT4B-receptorgén további sajátsága az aminoterminális részen két N-kötésű glikozilezést lehetővé tevő hely (az 5 és 66, aszparagin; 1. ábra), valamint a karboxiterminális részen és a sejten belüli hurkokban több szerin és treonin jelenléte, melyek a protein-kinázok számára foszforilezési helyekül szolgálhatnak.
Megvizsgáltuk az 5-HT4B-receptorgént kódoló RNS szöveti megoszlását. Különböző humán szövetekből izolált össz-RNS-t véletlenszerű láncindító oligonukleotidok és reverz transzkriptáz felhasználásával egyszálú cDNS-sé alakítottunk. A cDNS-t humán 5-HT4B-receptorgénre specifikus PCR láncindító oligonukleotidok felhasználásával, PCR-eljárással amplifikáltuk. A PCRtermékeket 1,5%-os agarózgélen futtattuk, nejlonmembránra blottoltuk és belső génspecifikus oligonukleotidokkal hibridizáltattuk. A hibridizációt követően a biotokat nagymértékben sztringens feltételek mellett mostuk. Pozitív kontrollként génspecifikus rekombináns plazmidot alkalmaztunk, negatív kontrollként valamennyi reagenst, kivéve templát cDNS-t, RNS-t vagy plazmidot tartalmazó dH2O-et használtunk. A reverz transzkriptázzal nem kezelt RNS-minták PCR-amplifikációja és Southem-blot-analízise negatív eredményt adott.
1. táblázat
5-HT4B-receptor-mRNS lokalizációja humán szövetekben.
+ + + =sötét + + =mérsékelt + = kimutatható, de gyenge
- = hiányzik
| Humán szövet | 5 - HT 4B-receptor-mRNS |
| Prosztata III | + |
| Prosztata IV | + |
| I Humán szövet | 5-HT4B-receptor-mRNS |
| Prosztata V | + ” |
| Herék | + + + |
| Hólyag | + + + |
| Méhnyálkahártya | ” + |
| Méhizomzat | ” + |
| Pitvar | ” + |
| Mezentérium (bélfodor) | + |
| Ormyálkahártya | + + |
| Pénisz | + + |
| Bőr | (-) |
| Nyelv | (-) |
A hp78a-transzkript expresszióját különböző humán szövetekből izolált RNS-alapján előállított cDNS amplifikációjával analizáltuk (reverztranszkripciós PCR- vagy RT-PCR-eljárással) (3. ábra). Olyan génspecifikus PCR láncindító oligonukleotidok és génspecifikus belső oligonukleotidpróbák alkalmazásával, melyek a pszeudogént nem ismerték fel, szelektív módon tudtuk vizsgálni a funkcionális hp78a-klón szöveti megoszlását (az adatokat nem tüntettük fel). A közepesen magas szinten folyamatosan expresszálódó aktin és glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz génekkel szemben előállított láncindító oligonukleotidokkal végzett kontroll RT-PCR-eljárás alkalmazásával a kiindulási RNS-szint mennyisége valamennyi szövetben összehasonlítható volt (Clontech; az adatokat nem tüntettük fel). Az 5-HT4B-receptort (hp78a-t) kódoló mRNS magas szinten expresszálódik az agyban és alacsony szinten expresszálódik különböző perifériás szövetekben (vesében, májban, hasnyálmirigyben, prosztatában, méhben, bélfodorban és lépben). Az 5-HT4B-receptor farmakológiai sajátságai és annak a korábbiakban jellemzett, simaizom-relaxációt létrehozó 5-HT-receptorokkal való kapcsolata alapján számos további szövetben vizsgáltuk az RNS-expressziót. Érdekes módon, az 5-HT4B-receptort kódoló RNS magas szintű jelenlétét mutattuk ki koronáriaartériákban és a gyomor-bél rendszer különböző részeiben, például a gyomorban, a hólyagban, a leszálló vastagbélben és a csípőbélben, ami összhangban van az 5-HT4B simaizom-relaxációban betöltött feltételezett receptorszerepével (3. ábra).
Az in süti hibridizációs vizsgálatok eredményei (2. táblázat) azt mutatták, hogy az 5-HT4B-mRNS megoszlása egyes területeken átfedést mutatott az 5-HT4B-receptor megoszlásával. A legerősebb hibridizációs jelet a talamusz, az elülső hippokampális rudimentum, és a hippokampusz CA3-régiójában található neuronokon figyeltük meg. Hibridizációs jelet tartalmazó további régiók a szeptum, a hipotalamusz, a centromediális amigdala, és az aquaeductus cerebri körüli szürkeállomány. Érdekes módon, két erős receptorkötési jelet tartalmazó területen, a glóbus pallidus és a substantia nigra (feketeállomány) területén, nem sikerült 5-HT4B jelenlétére utaló hibridizációs jelet kimutatni, ami arra utal, hogy a
HU 221 822 Β1 két érintett struktúrában az 5-HT4B-receptor preszinaptikusan található.
A patkányagy számos területén mutattunk ki specifikus [3H]5-CT-kötődést. Ez a kötődés 1 pmol/l ergotaminnal történő inkubálást követően teljesen megszűnt. PAPP és (~)pindolol hozzáadása a radioaktív ligandumhoz számos területen jelentősen csökkentette a kötődést, legjelentősebben az agykéreg mélyebb rétegeiben, a hippokampuszban, a raphe dorsalis-ban és a gerincvelő területén. Az egyéb szerotoninreceptorok fedését követően továbbra is [3H]5-CT-t kötő területek maradtak a kéreg 1-3. rétege, a szeptum, a glóbus pallidus, a talamusz, a hipotalamusz, a centromediális amigdala, a feketeállomány, az aquaeductus cerebri körüli szürkeállomány, és a colliculus superior. Öt pmol/l methiothepin hozzáadása az inkubációs elegyhez valamennyi fenti területen megszüntette a radioaktív ligandum kötődését, ami arra utal, hogy a megfigyelt kötődés 5-HT4B-receptomak tulajdonítható.
2. táblázat
Az 5-HT4B-receptor/mRNS lokalizációja patkányagyban.
| 1 Régió | [3H]5-CT- kötőhelyek | 5-HT4B- mRNS |
| Agykéreg I., II. és III. réteg | + | + |
| Szeptum | + | + |
| 1 Glóbus pallidus | + | - |
| A stria terminális alapjá1 nak sejtmagjai | + | + |
| | Talamikus magok | + | + |
| Hipotalamikus magok | + | + |
| Amigdala (centromediális komplex) | + | + |
| HippokampuszA | + | + |
| | Központi szürkeállomány | + | + |
| Feketeállomány | + | - |
| Colliculus superior | + | + - |
| Dorzális kéreg colliculcus | + | nem vizsgáltuk |
| | Inferior | ||
| Kisagy | - | + |
A=receptor-autoradiográfiával nagyon kis számú kötőhelyet tudtunk kimutatni, azonban in situ hibridizációval közepes szintű 5-HT4BmRNS transzkript jelenlétét mutattuk ki a CA3, DG, CA1 régiókban.
A farmakológiai tulajdonságok értékelésére az új, humán 5-HT4B-receptort kódoló gént tranziens módon expresszáló majomvesesejteket alkalmaztunk. Tranziens módon transzfektált Cos-7-sejtekből gyűjtött membránok nagy affinitású, telíthető [3H]5-HT-kötődést mutattak. Az [3H]5-HT-telítés adatainak nem lineáris analízise alapján az egyensúlyi disszociációs állandó (Kd) értéke 8,5±0,8 nmol/1 a kötőhelyek sűrűsége (Bmax) pedig 6,6±0,8 pmol/mg protein volt. A specifikus [3H]5-HT-kötődés a Kj-értéknek megfelelő radioaktív ligandumkoncentráció mellett az összkötődésnek több mint 90%-a volt. A tranziens módon transzfektált sejtekből előállított membránokhoz való nagy affinitású [3H]5-HT-kötődést 100 pmol/l Gpp(NH)p, a GTP egy nem hidrolizálható analógja lényegesen csökkentette (75%). A nem transzfektált gazdasejtek nem mutattak specifikus [3H]5-HT-kötődést.
Az újonnan izolált szerotoninreceptor-gén farmakológiai azonosságának megállapítása céljából a nagy affinitású [3H]5-HT-kötődéssel való kompetíció nem lineáris analízise alapján meghatároztuk a hp78a-klón pontos kötőtulajdonságait. A specifikus [3H]5-HTkötődést monofázisos módon (nH=l), különböző, szerkezetileg eltérő szerotoninerg ligandumokkal teljes egészében leszorítottuk. Az említett vegyületek specifikus [3H]5-HT-kötődést leszorító képességének a rangsora a következő volt: 5-CT>methiothepin, metergolin, =DHE=5-MeOT> 5-HT>2-Br-LSD> DP5-CT>DPAT>sumatriptan>ICS 203930 (3. és 4. táblázat). Néhány ergotszármazék nagy affinitással (Kj=20 nmol/1) kötődött a klónozott 5-HT4B-receptorhoz, ezek közé tartozott a metergolin, dihidroergotamin, ergotamin, és mesulergin. Altípus-szelektivitást mutató és a hp78a-klónhoz kis affinitással (Kj>100 nmol/1) kötődő szerotoninerg ligandumok a DPAT (5-HTja), a sumatriptan (5-HT1D), a ketanserin (5-HT2) és zacopride (5-HT3). A szubsztituált benzamidok (ICS 203930, MDL 29429, zacoprid), melyek a funkcionális 5-HT4-receptoron aktív vegyületek, szintén kis affinitással (Kj>500 nmol/1) kötődtek az 5-HT4B-receptorhoz.
Más biogén aminok (nem mutattak értékelhető affinitást a hp78a-klónhoz (Kj>l pmol/l) (3. és 4. táblázat).
3. táblázat
Szerotoninerg ligandumok hp78a-klónhoz viszonyított disszociációs állandói (Kj-értékei) a meghatározások alapján. A membránokat 30 percig, 37 °C-on, 5 nmol/1 [3H]5-HT-nal inkubáltuk jelöletlen kompetitor vegyületek hét különböző koncentrációjának jelenlétében (1000-szeres koncentrációléptékek alkalmazásával). A nem specifikus kötődést 10 pmol/l jelöletlen 5-HTnal való inkubálással határoztuk meg. Az affinitásos állandókat (Kj-értékeket) a CI50-értékekből számítottuk ki nem lineáris regressziós analízissel, a Cheng-Prusoffegyenlet alkalmazásával. A Kj-értékeket 2-5 meghatározás alapján, átlagértékekként adtuk meg (±S. E. M).
| I Vegyület | K; (nmol/1) |
| 5-Karboxi-amido-triptamin | 0,93±0,20 |
| Methiothepin | 3,7±l,0 |
| 5-Metoxi-triptamin | 5,1 ±0,4 |
| Metergolin | 6,4±1,4 |
HU 221 822 Β1
3. táblázat (folytatás)
| Vegyület | Kj (nmol/1) |
| Dihidroergotamin | 6,9+0,9 |
| 5-Hidroxi-triptamin | 8,1+1,3 |
| Ergotamin | 15 |
| Mesulergin | 18+5 |
| Bufotenin | 26 |
| 2-Bromo-LSD | 30+10 |
| Dipropil-5-karboxi-amido-triptamin | 37+21 |
| 5-Metoxi-N,N-dimetil-triptamin | 43 |
| Ritanserin | 45+10 |
| Clozapin | 78+10 |
| Metil-sergid | 83+5 |
| 1-Naftil-piperazin | 83+19 |
| Spiperone | 110+17 |
| Ciproheptadin | 123+16 |
| Bromokriptin | 137+2 |
| Triptamin | 149+20 |
| m-Klorofenil-piperazin | 312 |
| 8-Hidroxi-N,N-dipropil-amino- tetralin | 466+46 |
| a-Metil-5-hidroxi-triptamin | 509 |
| 5-Benzil-oxi-triptamin | 729 |
| Sumatriptan | 951 + 118 |
| Ketanserin | 1334+241 |
| Yohimbin | 2850+354 |
| 2-Metil-5-hidroxi-triptamin | 3400 |
| Pindolol | >5000 |
| Zacopride | >5000 |
4. táblázat
A hp78a-gént tranziens módon expresszáló sejtekből nyert membránhoz történő specifikus [3H]5-HTkötődés leszorítása szerotoninerg ligandumokkal százalékos arányban kifejezve. A membránokat 30 percig, 37 °C-on, 5 nmol/1 [3H]5-HT-nal inkubáltuk jelöletlen kompetitor vegyületek egyetlen koncentrációjának jelenlétében. A nem specifikus kötődést 10 pmol/l jelöletlen 5-HT-nal való inkubálással határoztuk meg.
| Vegyület | Vizsgált koncentráció | Gátlás, százalékos arányban kifejezve |
| d-LSD | 30 nmol/1 | 77 |
| BRL 29 429 | 100 nmol/1 | 8 |
| 1 Vegyület | Vizsgált koncentráció | Gátlás, százalékos aranyban kifejezve |
| ICS 203 930 | 1000 nmol/1 | 10 |
| Spiroxatrin | 30 nmol/1 | 12 |
| Propranolol | 100 nmol/1 | 0 |
| PAPP | 100 nmol/1 | 21 |
| CGS 12 660B | 100 nmol/1 | 15 |
| Quipazine | 100 nmol/1 | 3 |
| Rauwolscine | 100 nmol/1 | 8 |
| DÓI | 100 nmol/1 | 20 |
| Oxi-metazolin | 10 nmol/1 | 6 |
| Dopamin | 30 nmol/1 | 0 |
| Norepinefrin | 30 nmol/1 | 0 |
| Hisztamin | 100 nmol/1 | 10 |
A hp78a-klón és az adenilát-cikláz funkcionális kapcsolatát a hp78a-gént tranziens módon expresszáló, ép Cos-7-sejteken vizsgáltuk. Vizsgáltuk a bazális cAMP-kibocsátást, valamint az FSK által stimulált cAMP-válasz gátlását is. Nem transzfektált vagy kontrollként transzfektált Cos-7-sejtekben az 5-HT (1 pmol/l) nem volt hatással sem a bazális, sem az FSK által stimulált adenilát-cikláz-aktivitásra (az adatokat nem tüntettük fel), ami azt mutatja, hogy a nem transzfektált sejtekben endogén, ciklázaktiválással kapcsolt szerotoninreceptorok nem expresszálódtak. 5-HT (1 pmol/l) hozzáadása a transzfektált Cos7- sejtekhez hétszeresére növelte a bazális cAMP-kibocsátást (0,035±0,004 pmol/1 /10 perc); sem a bazális, sem az FSK által stimulált cAMP-kibocsátás gátlása nem volt megfigyelhető. 1 pmol/l FSK és 1 μτηοΐ/l 5-HT együtt inkubálása szinergista módon fokozta a cAMP-választ, ami a sejten belüli cAMPfelhalmozódás 75-szörös növekedéséhez vezetett (az adatokat nem tüntettük fel). Az 5-CT és 5-MeOT 1 pmol/l koncentrációban alkalmazva szintén hatásos agonistának bizonyult, érdekes módon, az 5-CT sokkal hatásosabb volt, mint maga az 5-HT, míg a
8- OH-DPAT 1 pmol/l koncentrációban alkalmazva a bazális cAMP-választ csak körülbelül kétszeresére növelte. A metil-sergid, a metergolin és a methiothepin 10 pmol/l koncentrációban alkalmazva az 5-HTválaszt csaknem teljesen gátolta, míg az ICS-205930 100 pmol/l koncentrációban alkalmazva gyenge gátló hatással rendelkezett. Az 5-HT és 5-CT esetében meghatároztuk a teljes dózis-válasz görbét. Az 5-HT EC50-értéke 992+345 nmol/1 volt, a maximális stimuláció (Emax-érték) 2,191+715% bazális cAMPkibocsátás volt (n=4), míg az 5-CT nagyobb affinitással (EC5O-érték=75±15 nmol/1) és hasonló Emax-értékkel rendelkezett (2029+47% bazális cAMP-kibocsátás, n=4) (5. táblázat; 4. és 5. ábra).
HU 221 822 Β1
5. táblázat
A cAMP-válasz farmakológiai profilja a humán 5-HT4B-receptort tranziens módon expresszáló Cos-7-sejtekben. A cAMP-meghatározást ép sejteken végeztük az anyagokat és módszereket leíró részben ismertetettek szerint. A hatóanyag-aktivitás meghatározását triplikátumban végeztük egyetlen megadott koncentráció alkalmazásával. Az agonisták esetében az eredményeket a bazális cAMP-szint többszöröseként adtuk meg. Az antagonisták esetében az eredményeket 1 pmol/l 5-HT-ra adott cAMP-válasz gátlásának százalékban kifejezett értékével adtuk meg.
| Hatóanyag | [Hatóanyag] | A cAMP-stimuláció többszöröse | cAMP-válasz gátlása %-ban megadva | |
| Indol-aminok | 5-HT | 1 pmol/l | 6,7±0,65 | |
| 5-CT | 1 pmol/l | 28±5,5 | ||
| 5-MeOT | 1 pmol/l | 6,Ö±0,08 | ||
| ICS-205-930 | 100 μτηοΐ/ΐ | 0 | 36±3,0 | |
| Ergolinok | metil-sergid | 10 pmol/l | l,7±0,43 | 82±1,5 |
| metergolin | 10 pmol/l | 0 | 96±l,0 | |
| Piperazinok | methiothepin | 10 pmol/l | 0 | 100±0 |
| 2-bromo-LSD | 1 pmol/l | 0 | 95 ±4,5 | |
| Benzamidok | BRL 29 429 | 10 pmol/l | 0 | |
| Aminotetralin | DPAT | 1 pmol/l | 1,7+/-0,4 |
Stabilan transzfektált LM(tk-) -sejtekben az 5-HT a bazális cAMP-felhalmozódás maximálisan 400%-os növekedését eredményezte. Sem a bazális, sem az FSK által stimulált cAMP-kibocsátás gátlása nem volt megfigyelhető. A különböző vizsgált vegyületekre vonatkozó affinitásos értékeket a 6. táblázatban összegeztük. Általánosságban, az agonisták esetében a funkcionális vizsgálatokban kapott EC50-értékek körülbelül egy nagyságrenddel kisebbek voltak, mint a kötődésvizsgálati eljárásokban kapott Κ,-értékek. Az 5-CT és 5-MeOT hatásos agonistáknak bizonyultak, melyek az 5-HT-nal összehasonlítható mértékű belső aktivitással rendelkeztek, az 5-CT azonban, az 5-HT-nál szignifikánsan nagyobb (körülbelül 10-szeres) affinitást mutatott. A 8-OH-DPAT gyenge agonista volt, amely az 5-HT által kiváltott maximális válaszhoz képest körülbelül fele akkora reakciót váltott ki. Valamennyi vizsgált ergot-alkaloida „csendes antagonistaként” (silent antagonist) viselkedett, ezek KB-értékei nem tértek el szignifikánsan a kötődésvizsgálatokban kapott Kj-értékektől.
A methiothepin szintén hatásos csendes antagonistának bizonyult (6. táblázat).
6. táblázat
A cAMP-válasz farmakológiai profilja a humán 5-HT4B-receptort stabilan expresszáló LM(tk-) -sejtekben. A cAMPmeghatározást ép sejteken végeztük az anyagokat és módszereket leíró részben ismertetettek szerint. Ezekben a sejtekben 5-HT-adagolásra a bazális cAMP-termelés növekedésének maximuma átlagosan 400% volt. Az Emax-értékeket a maximális 5-HT-válasz értékére normalizáltuk. Agonistának akkor minősült egy hatóanyag, ha az általa kiváltott maximális válasz az 5-HT által kiváltott maximális válasznak (a bazális cAMP-felhalmozódás 400%-os növekedésének) legalább 80%-a volt. Az eredmények legalább három, triplikátumban elvégzett kísérlet során kapott átlagértékeket képviselnekiS. E. M. Az antagonisták disszociációs állandóját (KB) az alábbi képlet alapján számítottuk ki: Kb=[B]/(A7A)-1], ahol [B] az antagonista koncentrációja, A’ és A az antagonista jelenlétében, valamint hiányában az agonistára meghatározott EC50-értékeket jelent [Furchgott: (1972)].
| Hatóanyag | EC50 (nmol/1) | Emax* (az 5-HT-válasz %-ában) | KB (nmol/1) | Belső (intrinsic) aktivitás |
| 5-CT | 17±2 | 110±19 | agonista | |
| 5-MeOT | 173±1 | 100±5 | agonista | |
| 5-HT | 189±17 | 100 | agonista | |
| DP-5-CT | 2,398±49 | 86±12 | agonista | |
| 8-OH-DPAT | 17,160± 1,254 | 51±14 | agonista | |
| d-LSD | 0 | 2,7±0,5 | antagonista | |
| Methiothepin | 0 | Ilii | antagonista |
HU 221 822 Β1
6. táblázat (folytatás)
| Hatóanyag | EC50 (nmol/1) | Emax* (az 5-HT-válasz %-ában) | KB (nmol/1) | Belső (intrinsic) aktivitás |
| 2-Br-LSD | 0 | 12±3 | antagonista | |
| DHE | 0 | 20±4 | antagonista | |
| Mesulergin | 0 | 20±l | antagonista | |
| Bromokriptin | 0 | 240±10 | antagonista |
Az alábbiakban összefoglaljuk az eredmények értékelését.
Egy új, humán szerotoninreceptort (hp78a- vagy 5-HT4B-receptort) képviselő DNS-t klónoztunk humán agy cDNS- és genomi DNS-könyvtárakból. Az összes G-proteinnel kapcsolt receptorszekvenciák közül (EMBL/Genbank, Data Base) a legnagyobb mértékű homológiát a hp78a-receptorgén klónnal a Drosophila 5HTR szerotoninreceptor-gén mutatta [Witz és munkatársai: (1990)]. A hp78a-klón kikövetkeztetett szekvenciájának ismert G-proteinnel kapcsolt receptorszekvenciákkal való összehasonlítása azt mutatta, hogy az azonos aminosavak legnagyobb sűrűségben a transzmembrándoménokban fordulnak elő. Ezekben a transzmembránrégiókban (TM-régiókban) a hp78a-klón a Dro5HTRl-génnel összehasonlítva 57%, a szerotoninreceptor-alosztállyal összehasonlítva 39-53% (lásd, 2. ábra), az adrenerg receptor alosztállyal összehasonlítva 40-50%, a dopaminreceptor alosztállyal összehasonlítva 44-49%, a hisztaminreceptor alosztállyal összehasonlítva 37-41%, a peptidreceptorokkal összehasonlítva 27-28% és az adenzinreceptorokkal összehasonlítva 32-33%, azonosságot mutat. Ennek a humán hp78a-szekvenciának az egyéb G-proteinnel kapcsolt receptorokkal vagy a szerotoninerg alosztály egyéb tagjaival történő összevetése, valamint a szekvenciaazonosság százalékban kifejezett értéke arra utal, hogy új receptorról van szó. Annak alapján, hogy a hp78a-klón által kódolt receptor és bármely ismert szerotoninreceptor közti TM-homológia 55% alatt marad és annak a ténynek alapján, hogy ez a receptor adenilát-cikláz-aktiválással kapcsolt (lásd az eredmények ismertetését és az alábbiakat), a fenti kiónt 5-HT4B-klónnak neveztük.
A receptort kódoló transzkriptek lokalizációja viszonylag széles szöveti megoszlást mutat. A vizsgált szövetek közül a humán 5-HT4B (hp78a-klón eredetű) receptor-mRNS-t legnagyobb mennyiségben az agyban, a herékben és a hólyagban mutattuk ki, közepestől alacsony szintig megtalálható egyéb perifériás szövetekben, nem mutatható ki a bőrben és nyelvben.
A találmány szerinti 5-HT4B-receptor és az azt kódoló mRNS megoszlása arra utal, hogy a fenti új szerotoninreceptor több agyi idegrendszeri területen szerepet játszhat. Különösen sok található a limbikus rendszerben (szeptumban, centromediális amigdalában, anterior hippokampális rudimentumban, hipotalamuszban), ami az 5-HT4B-receptor affektív folyamatokban betöltött lehetséges szerepére utal. Jól alátámasztja a fenti feltevést az a tény, hogy a receptor klozapint köt, mindez arra utal, hogy az 5-HT4B-receptor szerepet játszhat skizofréniában vagy egyéb neurológiai alapú affektív rendellenességekben. Ezenkívül, a hp78a-klón-eredetű mRNS jelenléte a neokortex felé rostokat kibocsátó talamikus magokban azt jelentheti, hogy ez a receptor szenzoros folyamatokban is szerepel. A raphe magokban való jelenlét esetleges autoreceptorműködésre utalhat, ezek a receptorok az 5-HT4B-működésen keresztül ható új terápiás anxiolitikus (szorongásoldó) vagy antidepresszáns szerekkel célozhatok meg. Mivel az 5-HT4B-receptorok megoszlása általában a fajok között megtartott, nem humán fajok, például patkány vagy tengerimalac esetében kapott lokalizációs eredmények valószínűleg megegyeznek a humán agyban kimutathatókkal.
A hp78a-klón által kódolt receptor a kapott kötődési profil egyedi farmakológiai jellemzői alapján külön szerotoninreceptor-altípust képvisel. Az [3H]5-HT kötődést leszorító vegyületek rangsora (3. táblázat) nem egyezik más [3H]5-HT-jelölt kötőhelyek kötődési sajátságaival [Xiong és Nelson: (1989); Zemlin és munkatársai: (1991)] vagy különböző funkcionális készítményekben leírt farmakológiailag meghatározott szerotoninreceptorok farmakológiai tulajdonságaival (lásd az alábbiakban). A hp78a-klón által kódolt receptorhoz az 5-CT nagy affinitása (Kj=0,5 nmol/1) és a sumatriptan alacsony affinitása (Kj>750 nmol/1) egyezik a nemrégiben tengerimalac striatalis homogenizátumában kimutatott [3H]5-CT-kötőhely kötőtulajdonságaival [Mahle és munkatársai: (1992)]. A hp78a-klón által kódolt receptor és a fenti [3H]5-CT-kötőhely farmakológiai tulajdonságainak közvetlen összehasonlítása azonban, nem végezhető el, mivel a kötőhely teljes jellemzése hiányzik és funkcionális választ sem mutattak ki.
Az 5-HT,-receptor-altípusok osztályozásánál használt kötődési jellemzők a nagy affinitású 5-HT- és 5-CT-kötődés. Ez a két vegyület nagy affinitással kötődött a hp78a-klón által kódolt receptorhoz (3. táblázat). A nemrégiben klónozott humán 5-HT1E [Me Allister és munkatársai: (1992); Zgombick és munkatársai: (1992)] és 5-HT1F [Adham és munkatársai: (1992)] -receptorok azonban, nagy affinitást mutatnak 5-HT iránt (Kj<10 nmol/1) és alacsony affinitást 5-CT iránt (Kj=>700 nmol/1). Az 5-HT1E- és 5-HT,F-receptorokat az 5-HTt-receptorcsaládba soroljuk ennek a receptorcsaládnak további tagjaival (5-ΗΤ1Α-, 5-HT1B-, 5-ΗΤ10α-, 5-HT1Dp-receptorokkal) kimutatható TM-homológia és második hírvivővel (adenilát-cikláz-gátlás22
HU 221 822 Β1 sál) való kapcsolat alapján. Ezenkívül, míg a klónozott 5-HTlc-receptor nagy affinitással köt [3H]5-HT-t, a klónozott 5-HT2-receptorral kimutatható nagyfokú TMhomológia (75%), valamint foszfolipáz C-vel való funkcionális kapcsolata alapján ez a receptor az 5-HT2-receptorok közé sorolható [Hartig és munkatársai: (1990); Julius: (1992)]. A fenti megfigyelések alapján, a hp78aklón által kódolt receptort nehéz csupán annak radioaktív ligandumkötési tulajdonságai alapján 5-HT,-receptor altípusba sorolni.
A hp78a-klón által kódolt receptoron át létrejövő funkcionális válaszok további felvilágosítást adnak a receptor hovatartozásáról. A hp78a-klón által kódolt receptorgén a gént tranziens módon expresszáló Cos-7-sejtekben az adenilát-cikláz aktiválását eredményezi. Mind az 5-HT7 mind az 5-CT a bazális szint 20-szorosára növelte a cAMP-szintet. A kötődésvizsgálati eljárásokban az 5-HT7, valamint 5-CT Kj-értékei körülbelül 100-szor nagyobb affinitást mutattak, mint a fenti agonisták funkcionális vizsgálatok során kapott EC50-értékei. A funkcionális vizsgálatokban az agonisták hatásának rangsora a következő volt:
5-CT>5-HT>/=5-MeOT>8-OH-DPAT, mely sorrend igen hasonló a fenti vegyületek specifikus [3H]5-HT-t leszorító képességének rangsorával. Az 5-HT4B-receptort stabilan expresszáló LM(tk-) -sejtek a tranziens módon transzfektált Cos-7-sejtekhez nagyon hasonló farmakológiai képet mutattak, az agonisták hatékonysága lényegében azonos rangsort eredményezett, az agonisták által kiváltott maximális cAMP-válasz azonban LM(tk-) -sejtekben alacsonyabb volt. Az antagonisták a következő hatékonysági rangsort mutatták: dLSD>methiothepin>2-Br-LSD>mesulergin=DHE.
A szerotonin adenilát-cikláz-aktiváló képességét több rendszerben kimutatták, például: embrionális egér colliculusban [5-HTj-receptorhoz hasonló receptor, Dumius és munkatársai: (1988)], lóagy glia-membránokban [5HTj-receptorhoz hasonló receptor, Fillion és munkatársai: (1980)], patkány és tengerimalac hippokampális membránokban [5-HT1A, Shenker és munkatársai: (1987)], humán pitvarban [5-HT4, Kaumann és munkatársai: (1989)], NCB20 neuroblasztóma hibrid sejtekben [5-HT4-receptorhoz hasonló receptor, Conner és Mansour: (1990); Cossery és munkatársai: (1990)] és neonatális sertés véna cavában [5-HTrreceptorhoz hasonló receptor, Trevethick és munkatársai : (1984)]. Az 5-HT4B-gén által kódolt receptor eltér az ezekben a készítményekben azonosított 5-HT4-receptortól, bár kimutathatók bizonyos közös vonások. Mind a colliculusban, pitvarban, valamint NCB20-sejtekben található 5-HT4-receptor, mind a hp78a-klón által kódolt receptor azonos hatásfokkal kötődik, mint a 5-HT és a 5-MeGT, melyek alacsony affinitással stimulálják a cAMP-választ. Ezenkívül, mindkettő viszonylag érzéketlen 8-OH-DPAT-ra, spiperonra, ketanserinre és pindololra. A methiothepin hatékonyan antagonizálja a hp78a-klón által kódolt receptoron át létrejövő funkcionális választ, azonban nem antagonizálja a colliculus és a pitvar 5HT4-receptoron át kiváltott választ. A legnagyobb ellentmondás az, hogy a „klasszikus” 5-HT4-receptor meghatározásánál alkalmazott vegyületek (agonisták: cisaprid, zacoprid, BRL 29429; gyenge antagonisták: ICS-205-930) vagy kismértékben aktívak, vagy inaktívak a hp78a-klón által kódolt receptoron.
Valamivel közelebbi farmakológiai rokonság mutatható ki a hp78a-klón által kódolt receptor és az NCB20sejteken található 5-HT4-receptorhoz hasonló receptor között, közös például a methiothepin hatékony antagonista aktivitása. Ezek, azonban eltérő receptorokat képviselnek az alábbi különbségek alapján: a) a [3H]5-HT igen nagy affinitással kötődik a hp78a-klón által kódolt receptorhoz (8^=8,5 nmol/1), azonban nagyon kis affinitással kötődik az NCB20-sejteken található 5-HT-receptorokhoz (körülbelül 200 nmol/1) [Berry-Kravis és Dawson: (1983)], b) az agonisták hatékonyságának rangsora a hp78a-klón által kódolt receptoron: 5-CT>5-HT>/=5-MeOT> míg az NCB20-sejteken a sorrend 5-HT>/=5-MeOT>5-CT [Conner és Mansour: (1990)]. Továbbá, a hp78a-klón által kódolt receptor néhány közös tulajdonságot mutat a gliamembránokban található 5-HT-receptorral [Fillion és munkatársai: (1980)]. Ezek az alábbiak: (a) a [3H]5-HT egyensúlyi disszociációs állandója, K,j=10 nmol/1; (b) az 5-HT által kiváltott cAMP-stimuláció EC50-értéke (500-1000 nmol/1); és (c) hatásos antagonizmus 2bromo-LSD-vel, metilsergiddel és methiothepinnel.
A szerotoninreceptomak négy, 5-HTb 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4 elnevezésű osztályba való sorolása kötődési tulajdonságokon, a szignáltranszdukciós folyamatokon és a kikövetkeztetett aminosavszekvenciákon alapul. A szerotoninreceptorok Bradley és munkatársai által javasolt osztályozási sémája szerint (1986) a hp78a-klón által kódolt receptor az 5-HTj-receptorcsaládba lenne sorolható, mivel az 5-CT agonistaként működik és ezt a választ a nem szelektív 5-HT,-antagonista methiothepin hatékonyan gátolja. A megfigyeltek szerint, a hp78aklón által kódolt receptor adenilát-cikláz-aktiváláshoz való pozitív kapcsolódása azonban, nem összeegyeztethető az 5-HTrreceptor-alcsalád klónozott tagjai esetében leírt viselkedéssel, melyek az FSK-stimulálta cAMP-kibocsátás gátlásával kapcsolódnak, ide tartoznak az 5-HT1A [Kobilka és munkatársai: (1987); Fargin és munkatársai: (1988)], az 5-HT1B [Adham és munkatársai: (1992); Maroteaux és munkatársai: (1992)], az 5-HT1Da [Hamblin és Metcalf: (1991); Weinshank és munkatársai: (1992)]; az 5-HT1Dp, [Demchyshyn és munkatársai: (1992); Jin és munkatársai: (1992); Weinshank és munkatársai: (1992)]; az 5-HT1E [Levy és munkatársai: (1992); McAllister és munkatársai: (1992); Zgombick és munkatársai: (1992)] és az 5-HT1F [Adham és munkatársai: közlés alatt].
A szerotoninreceptoroknak csupán kötődési tulajdonságai alapján történő osztályozása, bár hasznos rendszer, félrevezető lehet. Az 5-HTlc-receptort például, eredetileg a kötődési ismérvek alapján nevezték el (a [3H]5-HT nagy affinitással kötődik ehhez az altípushoz), ma az 5-HT2-receptor TM-doménjával mutatott nagyfokú (75%-os) homológia és a második hírvivővel (foszfoinozitid hidrolízissel) való kapcsolódása
HU 221 822 Β1 alapján 5-HT2-altípusnak tartjuk [Harting és munkatársai: (1990); Julius: (1992)]. Hasonló módon, bár a hp78a-klón által kódolt receptor nagy affinitással köt [3H]5-HT-t, pozitív kapcsolata az adenilát-cikláz-aktiválással és az 5-HTj-receptorcsalád egyéb klónozott tagjaival kimutatható alacsonyabb (50%-os) TM-homológia kizáija azt a lehetőséget, hogy a hp78a-klón egy 5-HT, altípust kódolna. Úgy tűnik tehát, hogy a TMhomológia összehasonlítása és a másodlagos hírvivővel történő kapcsolódás jobban alkalmazható ismérvek a receptorok osztályozásánál, mint a radioaktív ligandumkötődési sajátságok. A fenti analízis alapján, azt javasoljuk, hogy a hp78a-klónt az 5-HT4-receptoralcsalád első tagjaként soroljuk be. A hp78a-klón farmakológiai profilja különbözik a farmakológiailag meghatározott 5-HT4-receptorétól. A hp78a-klónt ezért 5-HT4B-nek neveztük el, fenntartva az 5HT4A-elnevezést a különböző izolált szövetkészítményekben leírt, az 5-HT4-receptor farmakológiai profiljával rendelkező kiónnak [Boakaert és munkatársai: (1992)].
Következésképp, a hp78a-gén elsődleges szerkezete, annak egyedi farmakológiai profilja és tranziens módon transzfektált sejtekben adenilát-cikláz-aktiválással való pozitív kapcsolódása arra utal, hogy ez a gén az 5-HT4receptorcsalád első tagját kódolja. A hp78a-klónt 5-HT4B-receptor altípusnak neveztük el, mivel az nem mutatja a farmakológiailag meghatározott 5-HT4-receptor farmakológiai tulajdonságait. További klónozási kísérletekre van szükség a fenti, újonnan felismert szerotoninreceptor-család további tagjainak izolálására [Bockaert és munkatársai: (1992)]. Az 5-HT4B farmakológiai kapcsolatának összehasonlítása szövetmodellekben kimutatott szerotoninreceptorokkal felveti számos, az érrendszerben leírt hasonló receptorral való azonosság lehetőségét. Az említett receptorok egy része izolált vérerekben úgy tűnik, relaxációs válasz alapját képezi, ami felveti a terápiás alkalmazás lehetőségét anginában, koronáriaartéria-betegségekben, érelmeszesedésben és feltehetően, agyvérzéshez vezető agyi érrendellenességekben. A fenti altípus központi idegrendszerben való jelenléte folytán ugyancsak alkalmazható lehet magasabb rendű kognitív folyamatok zavaraiban, valamint autonóm funkciók szabályozásában. Ezenkívül, az atipikus antipszichotikus szer, a klozapin viszonylag magas affinitása (Kj=78 nmol/1) az 5-HT7-receptorhoz, valamint ennek az altípusnak a limbikus és kérgi régiókban való jelenléte az 5-HT7-altípus szerotoninerg neurotranszmissziót érintő neuropszichiátriai kórképekben, például szkizofféniában betöltött lehetséges szerepére utal.
Hivatkozások:
Adham, N., H.-T. Kao, L. E. Schechter, J. Bard, M. Olsen, D. Urquhart, M. Durkin, P. R. Hartig, R. L. Weinshank, and T. Branchek. Cloning of a növel humán serotonin receptor (5-HT1F): A fifth 5-HT, receptor subtype coupled to the inhibition of adenylate cyclase. Submitted.
Berry-Kravis, E., and G. Dawson. Characterization of an adenylate cyclase-linked serotonin (5-HT,) receptor in a neuroblastoma X brain explant hybrid cell line (NCB-20). J. Neurochem. 40:977-985 (1983).
Bockaert, J., J. R. Fozard, A. Dumuis, D. E. Clarké. The 5-HT4 receptor: a piacé in the sün. Trends Pharmacol. Sci. 13:141-145 (1992).
Bockaert, J., M. Sebben, and A. Dumius. Pharmacological characterization of 5-hydroxytryptamine4 (5-HT4) receptors positively coupled to adenylate cyclase in aduit guinea-pig hippocampal membranes: Effect of substituted benzamide derivatives. Mól. Pharmacol. 37:408-411.
Bradford, Μ. M. A rapid and sensitive method fór the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254 (1976).
Bradley, P. B., G. Engel., W. Fenuik, J. R. Fozard, P. P. Humphrey et al. Proposals fór the nomenclature of functional receptors fór 5-hydroxytryptamine. Neuropharmacology 25:563-576 (1986).
Branchek, T., N. Adham, M. Macchi, H.-T. Kao, and P. R. Hartig. [3H}-DOB (4-bromo-2,5-dimethoxyphenylisopropylamine) and [3H]ketanserin label two affinity States of the cloned humán 5-hydroxytryptamine2 receptor. Mól. Pharmacol. 38:604-609 (1990).
Cheng, Y. C., and W. H. Prusoff. Relationship between the inhibition constant (K,) and the concentration of the inhibitor which causes 50 per cent inhibition (IC50) of an enzyme reaction. Biochem. Pharmacol. 22:3099-3108 (1973).
Connor, D. A., and T. E. Mansour. Serotonin receptormediated activation of adenylate cyclase in neuroblastoma NCB-20: a növel 5-hydroxytryptamine receptor. Mól. Pharmacol. 37:742-751 (1990).
Cossery, J. M., J.-M. Mienville, P. A. Sheehy, A. M. Mellow, and D.-M. Chuang. Characterization of two distinct 5-HT receptors coupled to adenylate cyclase activation and ion current generation in NCB20 cells. Neurosci. Lett. 108:149-154 (1990).
Cushing, D. and Cohen., M. L. Comparison of the serotonin receptors that mediate smooth muscle contraction in canine and porcine coronary artery. J.Pharmacol. Exp. The. 261: 856-861,1992.
Demchyshyn, L., R. K. Sunahara, K. Miller, M. Teitler, B. J. Hoffinan, J. L. Kennedy, P. Seeman, Η. H. M. Van Tol, and Η. B. Niznik. A humán serotonin 1D receptor variant (5-ΗΤ1ϋβ) encoded by an intronless gene on chromosome 6. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5522-5526(1992).
Dumuis, A., R. Bouhelal, M. Sebben, R. Cory, and J. Bockaert. A nonclassical 5-hydroxytryptamine receptor positively coupled with adenylate cyclase in the Central nervous system. Mól. Pharmacol. 34:880-887 (1988).
Fargin, A., J. R. Raymond, J. R. Regan, S. Cotecchia, R. J. Lefkowitz, and M. G. Cáron. Effector coupling mechanisms of the cloned 5-HT1A receptor. J. Bioi. Chem. 264:14848-14852 (1989).
Fillion G., D. Beaudoin, J. C. Rousselle, and J. Jacob. [3H]5-HT binding sites and 5-HT-sensitive adenylate cyclase in glial cell membráné fraction. Brain Rés. 198:361-374(1980).
Foquet, M., D. Hoyer, L. A. Pardo, A. Parekh, F. W. Kluxen, Η. O. Kalkman, W. Stühmer, and H.
HU 221 822 Β1
Lübbert. Cloning and functíonal characterization of the rat stomach fundus serotonin receptor. EMBO J. 11(3):3481-3487(1992).
Frazier, A., S. Maayani, and B. B. Wolfe. Subtypes of receptors fór serotonin. Ann. Rév. Pharmacol. Toxicol. 30:307-348(1990).
Furchgott, R. F. The classification of adrenoceptors (adrenergic receptors). An evaluation ftom the standpoint of receptor theory, in Catecholamines (H. Blaschko, and E. Muscholl, eds.). Springer Press, Berlin, Heidelberg, New York and Tokyo, 283-335 (1972).
Hamblin, M. W., and M. A. Metcalf. Primary structure and functíonal characterization of a humán 5-HT1D-type serotonin receptor. Mól. Pharmacol. 40:143-148(1991).
Hartig, P. R. TIPS 10:64-69 (1989).
Hartig, P. R., H.-T. Kao, M. Macchi, N. Adham, J. Zgombick, R. Weinshank, and T. Branchek. The molecular biology of serotonin receptors: an overview. Neuropsychopharmacol. 3:335-347 (1990).
Jin, H., D. Oskenberg, A. Askenazi, S. Peroutka, A. Μ. V. Duncan, R. Rozmahel, Y. Yang, G. Mengod, J. Palacios, B. O’Dowd. J. Bioi. Chem. 267: 5736-5738 (1992).
Julius, D., A. B. MacDermott, R. Axel, T. Jessel. Molecular characterization of a functíonal cDNA encoding the serotonin le receptor. Science 241:558-564 (1988).
Julius, D. Molecular biology of serotonin receptors. Ann. Rév. Neurosci. 14:335-360 (1991).
Kingston, R. E., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I (John Wiley and Sons, N. Y.), 1987.
Levy, F. Ο., T. Gudermann, M. Bimbaumer, A. J. Kaumann, and L. Bimbaumer. Molecular cloning of a humán gene (S31) encoding a növel serotonin receptor mediating inhibition of adenylyl cyclase. FEBS. Lett. 296:201-206(1992).
Lübbert, Η., T. P. Snutch, N. Dascal, H. A. Lester, and N. Davidson. Rat brain 5-HTlc receptors are encoded by a 5-6 kbase mRNA size eláss and are functionally expressed in injected Xenopus oocytes. J. Neurosci. 7:1159-1165 (1987).
Mahle, C. D., Η. P. Nowak, R. J. Mattson, S. D. Húrt, and F. D. Yocca. [3H]5-Carboxamidotryptamine labels multiple high affinity 5-HT1D-like sites in guinea pig brain. Eur. J. Pharmacol. 205:323-324 (1991).
Maricq, A. V., A. V. Peterson, A. J. Brake, R. M. Myers, and D. Julius. Primary structure and functíonal expression of the 5-HT3 receptor, a serotonin-gated ion channel. Science 254:432-436 (1991).
Maroteaux, L., F. Saudou, N. Amlaiky, U. Boschert, J. L. Plassat, R. Hen. Mouse 5-HT1B serotonin receptor: cloning, functíonal expression, and localization in motor control centers. Proc. Natl. Acad. Sci. 89:3020-3024(1992).
McAllister, G., A. Charlesworth, C. Snodin, M. S. Beer, A. J. Noble, D. N. Middlemiss, L. L. Iverson, and P. Whiting. Molecular cloning of a serotonin receptor írom humán brain (5-HT1E); A fifth 5-HTl-like subtype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5517-5521, 1992.
Miller, J., and R. N. Germain. Efficient cell surface expression of eláss IIMHC molecules in the absence of associated invariant chain. J.Exp.Med. 164:1478-1489 (1986).
Mylecharane, E. and Phillips, C. Mechanisms of 5hydroxytryptamine-induced vasodilation. In: The Peripheral Actions of 5-hydroxytryptamine, J. R. Fozard, ed. Oxford Univereity Press, Oxford, pp. 147-181 (1989).
Pritchett, D. B., A. W. J. Bach, M. Wozny, O. Taleb, R. Dal Toso, J. C. Shih, and P. H. Seeburg. Structure and functíonal expression of a cloned rat serotonin 5-HT-2 receptor. EMBO J. 7:4135-4140 (1988).
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.), 1989.
Sanger, F., Nicklen, S. and Coulsen, A. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977).
Savarese, T. M. and Fraser, L. M. Biochem. J. 283:1-19(1992).
Shenker, A., S. Maayani, H. Weinstein, and J. P. Green, Pharmacological characterization of two 5-hydroxytryptamine receptors coupled to adenylate cyclase in guinea pig hippocampal membranes. Mól. Pharmacol. 31:357-367 (1987).
Southern, E. M. J. Mól. Bioi. 98:503-517 (1975).
Trevethick, M. A., W. Feniuk, and P. P. A. Humphrey. 5-hydroxytryptamine induced relaxation of neonatal porcine véna cava in vitro. Life Sci. 35:477-486 (1984).
Weinshank, R. L., Zgombick, J. M., Macchi, M., Adham, N., Lichtblau, H., Branchek, T. A. and Hartig, P. R. Mól. Pharmacol. 38:681-688 (1990).
Weinshank, R. L., J. M. Zgombick, M. Macchi, T, A. Branchek, and P. R. Hartig. The humán serotonin 1D receptor is encoded by a subfamily of two distinct genes: 5-HT1Dci and 5-HT1Dp. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3630-3634 (1992a).
Weinshank, R. L., Adham, N., Zgombick, J., Bard, J., Branchek, T. and Hartig, P. R., In: Serotonin Receptor Subtypes: Pharmacological Significance and Clinical Implications, Vol. I. Int. Acad. Biomed. Drug Rés. (S. Krager, Basel, Switzerland), (1992b).
Witz, P., Amlaiky, N., Plassat, J.-L., Maroteaux, L., Borrelli, E. and Hen, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8940-8944 (1990).
Zemlan, F. P., and E. F. Schwab. Characterization of a növel serotonin receptor subtype (5-HTls) in rat CNS: interaction with a GTP binding protein. J. Neurochem. 57:2092-2099 (1991).
Zgombick, J. M., R. L. Weinshank, M. Macchi, L. E. Schechter, T. A. Branchek, and P. R Hartig. Expression and pharmacological characterization of a canine 5-hydroxytryptamine1D receptor subtype. Mól. Pharmacol. 40: 1036-1042(1991).
Zgombick, J. M., L. E. Schechter, M. Macchi, P. R. Hartig, T. A. Branchek, and R. L. Weinshank. Humán gene S31 encodes the pharmacologically defíned serotonin 5-hydroytryptamine1E receptor. Mól. Pharmacol. (1992), in press.
HU 221 822 Β1
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 1406 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős szálú TOPOLÓGIÁJA: ismeretlen
MOLEKULATÍPUS: cDNS HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem EREDETI FORRÁSA:
GÉNKÖNYVTÁR: humán agy KLÓN: hp78a
TULAJDONSÁGOK:
NÉV/KULCS: CDS ELHELYEZKEDÉS:
EGYÉB INFORMÁCIÓK:
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCATGGGCAG CGGCACACGG CGGCGCG ATG ATG GAC GTT AAC AGC AGC GGC 51
Me t Met Asp Val Asn Ser Ser Gly
5
| CGC CCG | GAC CTC | TAC Tyr | GGG CAC CTC | CGC Arg | TCT TTC CTT CTG CCA GAA GTG | 99 | ||||||||||
| Arg | Pro 10 | Asp | Leu | Gly | Hi s 15 | Leu | Ser | Phe | Leu 20 | Leu | Pro | Glu | Val | |||
| GGG | CGC | GGG | CTG | CCC | GAC | TTG | AGC | CCC | GAC | GGT | GGC | GCC | GAC | CCG | GTC | 147 |
| Gly 25 | Arg | Gly | Leu | Pro | Asp 30 | Leu | Ser | Pro | Asp | Gly 35 | Gly | A1 a | As p | Pro | Val 40 | |
| GCG | GGC | TCC | TGG | GCG | CCG | CAC | CTG | CTG | AGC | GAG | GTG | ACA | GCC | AGC | CCG | 195 |
| A1 a | G1 y | Ser | Trp | A1 a 45 | Pro | Hi s | Leu | Leu | Ser 50 | Glu | Va 1 | Thr | A1 a | Ser 55 | Pr o | |
| GCG | CCC | ACC | TGG | GAC | GCG | CCC | CCG | GAC | AAT | GCC | TCC | GGC | TGT | GGG | GAA | 243 |
| A1 a | Pro | Thr | Trp 60 | Asp | A1 a | Pro | Pro | Asp 65 | Asn | A1 a | Ser | Gly | Cy s 70 | Gly | Glu | |
| CAG | ATC | AAC | TAC | GGC | AGA | GTC | GAG | AAA | GTT | GTG | ATC | GGC | TCC | ATC | CTG | 291 |
| Gin | I le | Asn 75 | Tyr | Gly | Arg | Val | Glu 80 | Ly s | Val | Val | I le | Gly 85 | Ser | I le | Leu | |
| ACG | CTC | ATC | ACG | CTG | CTG | ACG | ATC | GCG | GGC | AAC | TGC | CTG | GTG | GTG | ATC | 339 |
| Thr | Leu 90 | I le | Thr | Leu | Leu | Thr 95 | I le | A1 a | Gly | Asn | Cy s 100 | Leu | Val | Va 1 | I le | |
| TCC | GTG | TGC | TTC | GTC | AAG | AAG | CTC | CGC | CAG | CCC | TCC | AAC | TAC | CTG | ATC | 387 |
| Ser 105 | Val | Cy s | Phe | Va 1 | Ly s 110 | Ly s | Leu | Arg | Gin | Pro 115 | Ser | Asn | Tyr | Leu | I le 120 | |
| GTG | TCC | CTG | GCG | CTG | GCC | GAC | CTC | TCG | GTG | GCT | GTG | GCG | GTC | ATG | CCC | 435 |
| Val | Ser | Leu | A1 a | Leu 125 | A1 a | As p | Leu | Ser | Val 130 | Alá | Val | A1 a | Val | Me t 135 | Pro | |
| TTC | GTC | AGC | GTC | ACC | GAC | CTC | ATC | GGG | GGC | AAG | TGG | ATC | TTT | GGA | CAC | 483 |
| Phe | Val | Ser | Val 140 | Thr | Asp | Leu | I le | Gly 145 | Gly | Ly s | Trp | I le | Phe 150 | Gly | Hi s |
HU 221 822 Β1
| TTT TTC TGT | AAT GTC | TTC ATC GCC ATG | GAC GTC | ATG Me t | TGC Cy s 165 | TGC Cy s | ACG Thr | GCC A1 a | 531 | |||||||
| Phe | Phe | Cy s 155 | Asn | Val | Phe | 1 le | A1 a 160 | Me t | As p | Val | ||||||
| TCG | ATC | ATG | ACC | CTG | TGC | GTG | ATC | AGC | ATT | GAC | AGG | TAC | CTT | GGG | ATC | 579 |
| Ser | I le 170 | Me t | Thr | Leu | Cy s | Val 175 | I le | Ser | I le | Asp | Arg 180 | Tyr | Leu | Gly | I le | |
| ACA | AGG | CCC | CTC | ACA | TAC | CCT | GTG | AGG | CAG | AAT | GGG | AAA | TGC | ATG | GCG | 627 |
| Thr 185 | Arg | Pro | Leu | Thr | Tyr 190 | Pro | Val | Arg | Gin | Asn 195 | Gly | Lys | Cy s | Me t | A1 a 200 | |
| AAG | ATG | ATT | CTC | TCC | GTC | TGG | CTT | CTC | TCC | GCC | TCC | ATC | ACC | TTA | CCT | 675 |
| Lys | Me t | I le | Leu | Ser 205 | Val | Trp | Leu | Leu | Ser 210 | Alá | Ser | I le | Thr | Leu 215 | Pro | |
| CCA | CTC | TTT | GGA | TGG | GCT | CAG | AAT | GTA | AAT | GAT | GAT | AAG | GTG | TGC | TTG | 723 |
| Pro | Leu | Phe | Gly 220 | Trp | A1 a | Gin | Asn | Val 225 | Asn | Asp | Asp | Lys | Val 230 | Cy s | Leu | |
| ATC | AGC | CAG | GAC | TTT | GGC | TAT | ACG | ATT | TAC | TCT | ACC | GCA | GTG | GCA | TTT | 771 |
| I le | Ser | Gin 235 | Asp | Phe | Gly | Tyr | Thr 240 | I le | Tyr | Se r | Thr | A1 a 245 | Val | A1 a | Phe | |
| TAT | ATC | CCC | ATG | TCC | GTC | ATG | CTT | TTC | ATG | TAC | TAC | CAG | ATT | TAC | AAG | 819 |
| Tyr | I1e Pro 250 | Me t | Ser | Val | Me t Leu 255 | Phe | Me t | Tyr | Tyr Gin 260 | I le | Tyr | Lys | ||||
| GCT | GCC | AGG | AAG | AGT | GCT | GCC | AAA | CAC | AAG | TTT | CCT | GGC | TTC | CCT | CGA | 867 |
| A1 a 265 | A1 a | Arg | Lys | Ser | A1 a 270 | A1 a | Lys | Hi s | Lys | Phe 275 | Pro | Gly | Phe | Pro | Arg 280 | |
| GTG | GAG | CCA | GAC | AGC | GTC | ATC | GCC | CTG | AAT | GGC | ATA | GTG | AAG | CTC | CAG | 915 |
| Val | Glu | Pro | Asp | Ser 285 | Val | I le | A1 a | Leu | Asn 290 | Gly | I le | Val | Lys | Leu 295 | Gin | |
| AAG | GAG | GTG | GAA | GAG | TGT | GCA | AAC | CTT | TCG | AGA | CTC | CTC | AAG | CAT | GAA | 963 |
| Lys | Glu | Val | Glu 300 | Glu | Cy s | A1 a | Asn | Leu 305 | Ser | Arg | Leu | Leu | Lys 310 | His | Glu | |
| AGG | AAA | AAC | ATC | TCC | ATC | TTT | AAG | CGA | GAA | CAG | AAA | GCA | GCC | ACC | ACC | 1011 |
| Arg | Ly s | Asn 315 | I le | Se r | I le | Phe | Lys 320 | Arg | Glu | Gin | Ly s | A1 a 325 | A1 a | Thr | Thr | |
| CTG | GGG | ATC | ATC | GTC | GGG | GCC | TTT | ACC | GTG | TGC | TGG | CTG | CCA | TTT | TTC | 1059 |
| Leu | Gly 330 | I le | I le | Va 1 | Gly | A1 a 335 | Phe | Thr | Val | Cy s | Trp 340 | Leu | Pro | Phe | Phe | |
| CTC | CTC | TCG | ACA | GCC | AGA | CCC | TTC | ATC | TGT | GGC | ACT | TCC | TGC | AGC | TGC | 1107 |
| Leu 345 | Leu | Ser | Thr | A1 a | Arg 350 | Pro | Phe | I le | Cy s | Gly 355 | Thr | Ser | Cy s | Ser | Cy s 360 | |
| ATC | CCA | CTG | TGG | GTG | GAG | AGG | ACA | TTT | CTG | TGG | CTA | GGC | TAT | GCA | AAC | 1155 |
| I le | Pro | Leu | Trp | Val 365 | Glu | Arg | Thr | Phe | Leu 370 | Trp | Leu | Gly | Tyr | A1 a 375 | Asn | |
| TCT | CTC | ATT | AAC | CCT | TTT | ATA | TAT | GCC | TTC | TTC | AAC | CGG | GAC | CTG | AGG | 1203 |
| Ser | Leu | I le | Asn | Pro | Phe | I le | Tyr | A1 a | Phe | Phe | Asn | Arg | As p | Leu | Arg |
380 385 390
HU 221 822 Β1
| ACC Thr | ACC TAT | CGC Arg | AGC CTG CTC | CAG TGC CAG TAC | CGG Arg | AAT ATC AAC | CGG Arg | 1251 | ||||||||
| Thr | Tyr 395 | Ser | Leu | Leu | Gin 400 | Cys | Gin | Tyr | Asn 405 | I le | Asn | |||||
| AAG | CTC | TCA | GCT | GCA | GGC | ATG | CAT | GAA | GCC | CTG | AAG | CTT | GCT | GAG | AGG | 1299 |
| Ly s | Leu | Ser | A1 a | A1 a | Gly | Me t | Hi s | Glu | A1 a | Leu | Lys | Leu | A1 a | Glu | Arg | |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||||
| CCA | GAG | AGA | CCT | GAG | TTT | GTG | CTA | CAA | AAT | GCT | GAC | TAC | TGT | AGA | AAA | 1347 |
| Pro | Glu | Arg | Pro | Glu | Phe | Val | Leu | Gin | Asn | A1 a | Asp | Tyr | Cys | Arg | Ly s | |
| 425 | 430 | 435 | 440 |
AAA GGT CAT GAT TCA TGATTGAAAG CAGAACAATG GAGAGGAATT CGATATCAAG 1402 Lys Gly His Asp Ser
445
CTTA 1406
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 445 bázispár TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: protein
| A 2. AZONOSÍTÓ | i SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: | |||||||||||||
| Me t Me t 1 | As p | Val | Asn 5 | Ser | Ser | Gly | Arg | Pro 10 | As p | Leu | Tyr | Gly | Hi s 15 | Leu |
| Arg Ser | Phe | Leu | Leu | Pro | Glu | Val | Gly | Arg | Gly | Leu | Pro | As p | Leu | Ser |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Pro Asp | Gly | Gly | A1 a | Asp | Pro | Val | A1 a | Gly | Ser | Trp | A1 a | Pro | Hi s | Leu |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Leu Ser | Glu | Val | Thr | A1 a | Ser | Pro | A1 a | Pro | Thr | Trp | Asp | A1 a | Pro | Pro |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Asp Asn | A1 a | Ser | Gly | Cys | Gly | Glu | Gin | I le | Asn | Tyr | Gly | Arg | Val | Glu |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
| Lys Val | Val | I le | Gly | Ser | I le | Leu | Thr | Leu | I le | Thr | Leu | Leu | Thr | I le |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| Alá Gly | Asn | Cys | Leu | Val | Val | I le | Ser | Val | Cy s | Phe | Val | Ly s | Lys | Leu |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||
| Arg Gin | Pro | Ser | Asn | Tyr | Leu | I le | Val | Ser | Leu | A1 a | Leu | Alá | Asp | Leu |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||
| Ser Val | A1 a | Val | A1 a | Va 1 | Me t | Pro | Phe | Val | Ser | Val | Thr | Asp | Leu | I le |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||
| Gly Gly | Lys | Trp | I le | Phe | Gly | Hi s | Phe | Phe | Cy s | Asn | Val | Phe | I le | A1 a |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
| Me t Asp | Val | Me t | Cys | Cys | Thr | A1 a | Ser | I le | Me t | Thr | Leu | Cy s | Val | I le |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||
| Ser I 1 e | As p | Arg | Tyr | Leu | Gly | 11 e | Thr | Arg | Pro | Leu | Thr | Tyr | Pro | Val |
| 180 | 185 | 190 |
HU 221 822 Β1
| Arg Gin | Asn 195 | Gly | Lys | Cys | Me t | A1 a 200 | Lys | Me t | Ile | Leu | Ser 205 | Val | Trp | Leu | |
| Leu | Ser | A1 a | Ser | Ile | Thr | Leu | Pro | Pro | Leu | Phe | Gly | Trp | A1 a | Gin | Asn |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Val | Asn | Asp | Asp | Ly s | Val | Cys | Leu | Ile | Ser | Gin | Asp | Phe | Gly | Tyr | Thr |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ile | Tyr | Ser | Thr | A1 a | Val | A1 a | Phe | Tyr | Ile | Pro | Me t | Ser | Va 1 | Me t | Leu |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Phe | Me t | Tyr | Tyr | Gin | Ile | Tyr | Lys | Alá | A1 a | Arg | Lys | Ser | A1 a | A1 a | Lys |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| His | Ly s | Phe | Pro | Gly | Phe | Pro | Arg | Val | Glu | Pro | Asp | Ser | Va 1 | Ile | A1 a |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Leu | Asn | Gly | Ile | Va 1 | Lys | Leu | Gin | Lys | Glu | Va 1 | Glu | Glu | Cys | Alá | Asn |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Leu | Ser | Arg | Leu | Leu | Lys | Hi s | Glu | Arg | Ly s | Asn | Ile | Ser | Ile | Phe | Lys |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Arg | Glu | Gin | Lys | A1 a | A1 a | Thr | Thr | Leu | Gly | Ile | Ile | Val | Gly | A1 a | Phe |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Thr | Val | Cys | Trp | Leu | Pro | Phe | Phe | Leu | Leu | Ser | Thr | A1 a | Arg | Pro | Phe |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Ile | Cys | Gly | Thr | Se r | Cy s | Ser | Cy s | Ile | Pro | Leu | Trp | Val | Glu | Arg | Thr |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Phe | Leu | Trp | Leu | Gly | Tyr | A1 a | Asn | Ser | Leu | I 1 e | Asn | Pro | Phe | Ile | Tyr |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| A1 a | Phe | Phe | Asn | Arg | Asp | Leu | Arg | Thr | Thr | Tyr | Arg | Ser | Leu | Leu | Gin |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Cys | Gin | Tyr | Arg | Asn | Ile | Asn | Arg | Lys | Leu | Ser | A1 a | A1 a | Gly | Me t | Hi s |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Glu | A1 a | Leu | Lys | Leu | A1 a | Glu | Arg | Pro | Glu | Arg | Pro | Glu | Phe | Val | Leu |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Gin | Asn | A1 a | Asp | Tyr | Cys | Arg | Ly s | Lys | Gly | Hi s | Asp | Ser |
435 440 445
Claims (34)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Nukleinsavmolekula, amely (a) 1. ábrán megadott aminosavszekvenciájú, emberi 5-HT4B-receptort kódol vagy amely (b) a receptor egy olyan részét kódol- 55 ja, amelynek kötési jellemzői a 3. és 4. táblázatban megadott kötési jellemzőkkel azonosak.
- 2. Nukleinsavmolekula, amely (a) a pcEXV-5HT4B jelű, az ATCC 75 332-es nyilvántartási számon letétbe helyezett plazmidban található DNS-szekvencia által 60 kódolt aminosavszekvenciájú, emberi 5-HT4B-receptort kódol vagy amely (b) a receptor egy olyan részét kódolja, amelynek kötési jellemzői a 3. és 4. táblázatban megadott kötési jellemzőkkel azonosak.
- 3. Nukleinsavmolekula, amely az 1. vagy 2. igénypont szerinti nukleinsavmolekulához képest degenerált.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nuklein savmolekula, amely DNS-molekula, cDNS-molekula vagy RNS-molekula.HU 221 822 Β1
- 5. A 4. igénypont szerinti DNS-molekula, amely genomi DNS-ből származik.
- 6. A 4. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát tartalmazó vektor.
- 7. A 6. igénypont szerinti vektor, amely plazmid.
- 8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti vektor, amely alkalmassá lett téve baktériumsejtben történő expresszióra, és a 4. igénypont szerinti nukleinsav baktériumsejtben történő expressziójához szükséges szabályozóelemeket tartalmaz, a nukleinsavhoz viszonyítva oly módon elhelyezve, hogy annak expresszióját lehetővé teszi.
- 9. A 6. vagy 7. igénypont szerinti vektor, amely alkalmassá lett téve élesztősejtben történő expresszióra, és a 4. igénypont szerinti nukleinsav élesztősejtben történő expressziójához szükséges szabályozóelemeket tartalmaz, a nukleinsavhoz viszonyítva oly módon elhelyezve, hogy annak expresszióját lehetővé teszi.
- 10. A 6. vagy 7. igénypont szerinti vektor, amely alkalmassá lett téve emlőssejtben történő expresszióra, és a 4. igénypont szerinti nukleinsav emlőssejtben történő expressziójához szükséges szabályozóelemeket tartalmaz, a nukleinsavhoz viszonyítva oly módon elhelyezve, hogy annak expresszióját lehetővé teszi.
- 11. A 6. vagy 7. igénypont szerinti vektor, amely alkalmassá lett téve rovarsejtben történő expresszióra, és a 4. igénypont szerinti nukleinsav rovarsejtben történő expressziójához szükséges szabályozóelemeket tartalmaz, a nukleinsavhoz viszonyítva oly módon elhelyezve, hogy annak expresszióját lehetővé teszi.
- 12. A 7. vagy 10. igénypont szerinti vektor, amely pcEXV-5-HT4B jelű, és az ATCC 75 332-es nyilvántartási számon hozzáférhető.
- 13. A 6., 7., 10. vagy 12. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmazó emlőssejt.
- 14. A 13. igénypont szerinti emlőssejt, amely LM(tk-) -sejt.
- 15. A 14. igénypont szerinti LM(tk-) -sejt, amely L-5HT4B jelű, az ATCC CRL 11 166 nyilvántartási számon letétbe helyezett, és amely a 12. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
- 16. Nukleinsavpróba, amely egy, legalább 15 nukleotidból álló nukleinsavmolekulát tartalmaz, és képes az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula szekvenciáján belül található szekvenciával specifikusan hibridizálódni.
- 17. Nukleinsavpróba, amely egy, legalább 15 nukleotidból álló nukleinsavmolekulát tartalmaz, és képes a 4. igénypont szerinti nukleinsavmolekula szekvenciáján belül található szekvenciával specifikusan hibridizálódni.
- 18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti nukleinsavpróba, amely nukleinsav DNS.
- 19. A 16-18. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavpróbák elegye, amelyben a próbák szekvenciája bizonyos meghatározott pozíciókban egymástól eltérő.
- 20. Eljárás az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvencia által kódol aminosavszekvenciával azonos aminosavszekvenciájú 5-HT4B-receptorhoz specifikusan kötődő kémiai vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy sejtfelszínükön 5-HT4B-receptort expresszáló, idegrendszeri eredetűtől eltérő sejteket vagy azok sejtextraktumából származó membránfrakciót érintkeztetünk a kémiai vegyülettel a kötődésre alkalmas körülmények között, és detektáljuk a kémiai vegyületnek az 5-HT4B-receptorhoz történő specifikus kötődését.
- 21. Kompetitív kötődést magában foglaló eljárás az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvencia által kódolt aminosavszekvenciával azonos aminosavszekvenciájú - 5-HT4B-receptorhoz specifikusan kötődő kémiai vegyület azonosítására, azzal jellemezve, hogy sejtfelszínükön 5-HT4B-receptort expresszáló, idegrendszeri eredetűtől eltérő sejteket vagy azok sejtextraktumából származó membránfrakciót érintkeztetünk külön egyfelől egyszerre mind a kémiai vegyülettel, mind egy másik kémiai vegyülettel - amely utóbbiról ismert, hogy az 5-HT4B-receptorhoz kötődik -, másfelől csupán a második kémiai vegyülettel, mindkét kémiai vegyület kötődésére alkalmas körülmények között; detektáljuk a kémiai vegyületnek az 5-HT4B-receptorhoz történő specifikus kötődését; és a második kémiai vegyületnek az 5-HT4B-receptorhoz való kötődése mértékének a kémiai vegyület jelenlétében beálló csökkenését annak jeleként értékeljük, hogy a kémiai vegyület kötődik az 5-HT4B-receptorhoz.
- 22. Eljárás annak megállapítására, hogy egy kémiai vegyület specifikusan kötődik-e - az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvencia által kódolt aminosavszekvenciával azonos aminosavszekvenciájú- 5-HT4B-receptorhoz és aktiválja-e azt, azzal jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-választ kiváltó, sejtfelszínükön 5-HT4B-receptort expresszáló, idegrendszeri eredetűtől eltérő sejteket vagy azok sejtextraktumából származó membránfrakciót érintkeztetünk a kémiai vegyülettel az 5-HT4B-receptor aktiválására alkalmas körülmények között; méljük a másodlagoshírvivő-választ a kémiai vegyület jelenlétében és távollétében; és a másodlagoshírvivő-válaszban a kémiai vegyület jelenlétében beálló változást annak jeleként értékeljük, hogy a kémiai vegyület aktiválja az 5-HT4B-receptort.
- 23. Eljárás annak megállapítására, hogy egy kémiai vegyület specifikusan kötődik-e - az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavszekvencia által kódolt aminosavszekvenciával azonos aminosavszekvenciájú- 5-HT4B-receptorhoz és gátolja-e annak aktiválását, azzal jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-választ kiváltó, sejtfelszínükön 5-HT4B-receptort expresszáló, idegrendszeri eredetűtől eltérő sejteket vagy azok sejtextraktumából származó membránfrakciót érintkeztetünk külön egyfelől a kémiai vegyülettel és egy második kémiai vegyülettel - amelyről ismert, hogy aktiválja az 5-HT4B-receptort -, és másfelől csupán a második kémiai vegyülettel, az 5-HT4B-receptor aktiválására alkalmas körülmények között; mérjük a másodlagoshírvivőválaszt egyfelől mind a kémiai vegyület, mind a második kémiai vegyület jelenlétében, másfelől csupán a második kémiai vegyület jelenlétében, és a másodlagoshírvivő-válaszban a mind a kémiai vegyület, mind a másodlagos kémiai vegyület jelenlétében beálló - a csupán a második kémiai vegyület jelenlétében beállónál 30HU 221 822 Β1 kisebb változást annak jeleként értékeljük, hogy a kémiai vegyület gátolja az 5-HT4B-receptor aktiválódását.
- 24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-válaszként méljük az adenilát-cikláz-aktivitást, és a másodlagoshírvivő-válaszban beálló változásként az adenilát-cikláz-aktivitásban beálló növekedést értékeljük az aktiválás jeleként.
- 25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-válaszként méljük az adenilát-cikláz-aktivitást, és a másodlagoshírvivő-válaszban beálló változásként az adenilát-cikláz-aktivitás szintjének a mind a kémiai vegyület, mind a második kémiai vegyület jelenléte esetén beálló - a csupán a második kémiai vegyület jelenléte esetén beállónál - kisebb megnövekedését értékeljük az aktiválódás gátlásának jeleként.
- 26. A 22. igénypont szerinti eljárás, αζζα/ jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-válaszként mérünk intracelluláris kalciumszinteket, és a másodlagoshírvivő-válaszban beálló változásként az intracelluláris kalciumszintekben beálló növekedést értékeljük az aktiválás jeleként.
- 27. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-válaszként mérünk intracelluláris kalciumszinteket, és a másodlagoshírvivő-válaszban beálló változásként az intracelluláris kalcium szintjének a mind a kémiai vegyület, mind a második kémiai vegyület jelenléte esetén beálló - a csupán a második kémiai vegyület jelenléte esetén beállónál - kisebb megnövekedését értékeljük az aktiválódás gátlásának jeleként.
- 28. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-válaszként inozitol-foszfát-metabolit-szinteket mérünk, és a másodlagoshírvivő-válaszban beálló változásként az inozitol-foszfátmetabolit-szintekben beálló növekedést értékeljük az aktiválás jeleként.
- 29. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy másodlagoshírvivő-válaszként inozitol-foszfátmetabolit-szinteket mérünk, és a másodlagoshírvivő-válaszban beálló változásként az inozitol-foszfát-metabolit-szintekben a mind a kémiai vegyület, mind a második kémiai vegyület jelenléte esetén beálló - a csupán a második kémiai vegyület jelenléte esetén beállónál - kisebb növekedést értékeljük az aktiválódás gátlásának jeleként.
- 30. A 20-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5-HT4B-receptorként emlőseredetű vagy humán receptort alkalmazunk.
- 31. A 20-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy idegrendszeri eredetűtől eltérő sejtként emlőssejtet vagy rovarsejtet alkalmazunk.
- 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlőssejtként COS-7-sejtet vagy LM(tk-) -sejtet alkalmazunk.
- 33. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy kémiai vegyületet nyerünk, a 20-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárással azonosítjuk a vegyületet mint olyat, amely specifikusan kötődik 5-HT4B-receptorhoz, és a vegyületet gyógyászatilag elfogadható hordozóval elegyítjük.
- 34. Eljárás kémiai vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy a 20-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárással 5-HT4B-receptorhoz specifikusan kötődő kémiai vegyületet azonosítunk, és előállítjuk a kémiai vegyületet.HU 221 822 Β1Int. Cl.7: A 61 K48/00ΓΊ
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US97169092A | 1992-11-03 | 1992-11-03 | |
| PCT/US1993/010553 WO1994009828A1 (en) | 1992-11-03 | 1993-10-29 | Dna encoding a human serotonin receptor (5-ht4b) and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT72837A HUT72837A (en) | 1996-05-28 |
| HU221822B1 true HU221822B1 (hu) | 2003-01-28 |
Family
ID=25518691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9501261A HU221822B1 (hu) | 1992-11-03 | 1993-10-29 | Humán szerotonin receptort (5-HT4B-receptort) kódoló DNS és alkalmazása |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5985585A (hu) |
| EP (1) | EP0624100B1 (hu) |
| JP (1) | JPH08506240A (hu) |
| KR (1) | KR950704001A (hu) |
| AT (1) | ATE192490T1 (hu) |
| AU (1) | AU686580B2 (hu) |
| CA (1) | CA2127117C (hu) |
| DE (2) | DE69328549T2 (hu) |
| ES (1) | ES2070104T1 (hu) |
| FI (1) | FI111337B (hu) |
| GR (1) | GR950300029T1 (hu) |
| HU (1) | HU221822B1 (hu) |
| NO (1) | NO951689L (hu) |
| NZ (1) | NZ258320A (hu) |
| WO (1) | WO1994009828A1 (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6300087B1 (en) * | 1992-11-03 | 2001-10-09 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof |
| ES2070104T1 (es) | 1992-11-03 | 1995-06-01 | Synaptic Pharma Corp | Dna que codifica para un receptor (5-ht4b) de la serotonina humana y usos del mismo. |
| US6228864B1 (en) * | 1997-10-28 | 2001-05-08 | Vivus, Inc. | Administration of 5-HT receptor agonists and antagonists, to treat premature ejaculation |
| FR2771741B1 (fr) * | 1997-11-28 | 2001-07-13 | Inst Nat Sante Rech Med | Variants d'epissage du recepteur serotoninergique 5-ht4 humain et leurs applications, notamment pour le criblage |
| EP0998923A1 (en) * | 1998-10-30 | 2000-05-10 | Basf Aktiengesellschaft | Use of 5-HT7 receptor agonists for the treatment or prophylaxis of ischemias |
| AU4856600A (en) | 1999-05-18 | 2000-12-05 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Use of agonists or antagonists of the 5-ht7 receptor to treat disorders of the bladder |
| EP1255870B1 (en) * | 2000-02-17 | 2005-12-14 | Glaxo Group Limited | 5-hydroxytryptamine transporter gene polymorphisms |
| AU2002215977A1 (en) * | 2000-10-31 | 2002-05-15 | Bayer Aktiengesellschaft | Regulation of human serotonin receptor precursor |
| US6989239B2 (en) * | 2001-06-20 | 2006-01-24 | R.E.D. Laboratories, N.V./S.A. | Methods for diagnosis and treatment of chronic immune diseases |
| AU2003211501A1 (en) * | 2002-02-08 | 2003-09-02 | Nakoshi, Hideo | Peptides |
| US7463934B2 (en) * | 2002-04-12 | 2008-12-09 | Medtronic, Inc. | Implantable medical device with captivation fixation |
| FR2846559B1 (fr) * | 2002-10-31 | 2007-06-15 | Centre Nat Rech Scient | Composition pharmaceutique pour la preparation d'un medicament destine a traiter et/ou a prevenir une pathologie liee a une conduite obsessionnelle |
| US20070128603A1 (en) * | 2003-05-28 | 2007-06-07 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostic and therapeutics for diseases associated with 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 7 (5-ht7) |
| US9395365B2 (en) * | 2009-04-02 | 2016-07-19 | Abbott Point Of Care, Inc. | Detection of infectious disease in a human or animal by measuring specific phagocytosis in a thin film sample of their anticoagulated blood |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1208146A (en) * | 1983-10-27 | 1986-07-22 | Tai-Kin Wong | Method of transferring genes into cells |
| US4985352A (en) * | 1988-02-29 | 1991-01-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA encoding serotonin 1C (5HT1c) receptor, isolated 5HT1c receptor, mammalian cells expressing same and uses thereof |
| ES2215986T3 (es) * | 1989-10-27 | 2004-10-16 | The Salk Institute For Biological Studies | Composiciones receptoras de glutamato y metodos. |
| WO1991013979A1 (en) * | 1990-03-05 | 1991-09-19 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic mouse overexpressing il-4 and method of use |
| US5155218A (en) * | 1990-05-08 | 1992-10-13 | Neurogenetic Corporation | Dna encoding human 5-ht1d receptors |
| US5225543A (en) * | 1991-03-28 | 1993-07-06 | American Cyanamid Company | Receptors method for purification of g protein-linked |
| WO1993011147A1 (en) * | 1991-12-02 | 1993-06-10 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | Dna encoding a human 5-ht1e receptor and uses thereof |
| US5360735A (en) * | 1992-01-08 | 1994-11-01 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human 5-HT1F receptor, vectors, and host cells |
| FR2693201B1 (fr) * | 1992-07-01 | 1994-08-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polyptides et utilisations. |
| FR2693200B1 (fr) * | 1992-07-01 | 1994-08-19 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux polypeptides ayant une activité de récepteur sérotoninergique, acides nucléiques codant pour ces polypeptides et utilisations. |
| WO1994010311A1 (en) * | 1992-10-26 | 1994-05-11 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | The pct-65 serotonin receptor |
| ES2070104T1 (es) | 1992-11-03 | 1995-06-01 | Synaptic Pharma Corp | Dna que codifica para un receptor (5-ht4b) de la serotonina humana y usos del mismo. |
| FR2699922B1 (fr) * | 1992-12-30 | 1995-02-10 | Inst Nat Sante Rech Med | Polypeptides à activité de récepteur sérotoninergique, médicaments les comprenant, séquences codant pour eux, sondes vecteurs et hôtes les exprimant, et application au criblage des médicaments. |
| US5968817A (en) * | 1993-03-15 | 1999-10-19 | The Scripps Research Institute | DNA encoding serotonin receptors |
| US7980514B2 (en) * | 2008-03-14 | 2011-07-19 | Northrop Grumman Space & Mission Systems Corp. | Solar array momentum control |
-
1993
- 1993-10-29 ES ES94901252T patent/ES2070104T1/es active Pending
- 1993-10-29 KR KR1019950701757A patent/KR950704001A/ko not_active Application Discontinuation
- 1993-10-29 AT AT94901252T patent/ATE192490T1/de active
- 1993-10-29 EP EP94901252A patent/EP0624100B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 JP JP6511402A patent/JPH08506240A/ja active Pending
- 1993-10-29 NZ NZ258320A patent/NZ258320A/en not_active IP Right Cessation
- 1993-10-29 AU AU55909/94A patent/AU686580B2/en not_active Expired
- 1993-10-29 DE DE69328549T patent/DE69328549T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 HU HU9501261A patent/HU221822B1/hu active IP Right Grant
- 1993-10-29 WO PCT/US1993/010553 patent/WO1994009828A1/en active IP Right Grant
- 1993-10-29 DE DE0624100T patent/DE624100T1/de active Pending
- 1993-10-29 CA CA002127117A patent/CA2127117C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-29 US US08/157,185 patent/US5985585A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-07-27 US US08/281,526 patent/US6083749A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-05-02 FI FI952094A patent/FI111337B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-05-02 NO NO951689A patent/NO951689L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-06-30 GR GR950300029T patent/GR950300029T1/el unknown
-
1999
- 1999-06-14 US US09/332,837 patent/US6432655B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-29 US US09/450,790 patent/US6376243B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6083749A (en) | 2000-07-04 |
| DE69328549T2 (de) | 2000-08-24 |
| GR950300029T1 (en) | 1995-06-30 |
| NO951689D0 (no) | 1995-05-02 |
| AU686580B2 (en) | 1998-02-12 |
| US6432655B1 (en) | 2002-08-13 |
| CA2127117C (en) | 2001-02-13 |
| US6376243B1 (en) | 2002-04-23 |
| NO951689L (no) | 1995-06-21 |
| FI952094A (fi) | 1995-06-29 |
| KR950704001A (ko) | 1995-11-17 |
| FI952094A0 (fi) | 1995-05-02 |
| EP0624100A4 (en) | 1995-11-29 |
| EP0624100A1 (en) | 1994-11-17 |
| US5985585A (en) | 1999-11-16 |
| CA2127117A1 (en) | 1994-05-11 |
| JPH08506240A (ja) | 1996-07-09 |
| DE624100T1 (de) | 1995-11-09 |
| ATE192490T1 (de) | 2000-05-15 |
| DE69328549D1 (de) | 2000-06-08 |
| FI111337B (fi) | 2003-07-15 |
| AU5590994A (en) | 1994-05-24 |
| HUT72837A (en) | 1996-05-28 |
| ES2070104T1 (es) | 1995-06-01 |
| NZ258320A (en) | 1996-12-20 |
| WO1994009828A1 (en) | 1994-05-11 |
| EP0624100B1 (en) | 2000-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU685076B2 (en) | DNA encoding 5-HT4 serotonin receptors and uses thereof | |
| US5652113A (en) | DNA encoding a human 5-HT 1F receptor and uses thereof | |
| AU702438B2 (en) | DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY/pancreatic polypeptide receptor (Y4) and uses thereof | |
| US6420532B1 (en) | Method of obtaining compositions comprising Y2 specific compounds | |
| CA2145182C (en) | Dna encoding human alpha 1 adrenergic receptors and uses thereof | |
| JP2004137276A (ja) | 摂食行動を変える方法、該方法に有用な化合物、および視床下部の異型神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ受容体（ｙ５）をコードするｄｎａ | |
| CA2248222A1 (en) | Dna encoding galanin galr3 receptors and uses thereof | |
| EP0624100B1 (en) | Dna encoding a human serotonin receptor (5-ht 4b) and uses thereof | |
| US6300087B1 (en) | DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof | |
| US20030166066A1 (en) | DNA encoding a human serotonin receptor (5-HT4B) and uses thereof | |
| AU667510C (en) | DNA encoding a human 5-HT-1F receptor and uses thereof | |
| Gerald et al. | DNA encoding 5-HT4A serotonin receptors | |
| US20020081661A1 (en) | DNA encoding 5-HT4 serotonin receptors and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20021112 |
|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: LUNDBECK RESEARCH USA, INC., US |