DE69531190T2 - Verfahren zur veränderung des essverhaltens, dafür verwendbare verbindungen und dna, die einen hypothalamischen atypischen neuropeptid y/peptid yy rezeptor (y5) kodiert - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • In dieser Anmeldung finden sich verschiedene Querverweise in Klammern. Die Offenbarungen dieser Publikationen in ihrer Gänze sind hiermit durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeschlossen; sie dienen zur vollständigeren Beschreibung des Standes der Technik auf dem Fachgebiet der Erfindung. Die vollständige bibliographische Zitierung dieser Verweise findet sich am Ende dieser Anmeldung, vor dem Sequenzprotokoll und den Patentansprüchen.
  • Neuropeptid Y (NPY) ist ein Mitglied der pankreatischen Polypeptidfamilie mit weiter Verbreitung im Nervensystem von Säugern. NPY und seine Verwandten (das Peptid YY oder PYY und das pankreatische Polypeptid oder PP) rufen eine breites Spektrum physiologischer Wirkungen hervor, indem sie wenigstens fünf G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Subtypen aktivieren, die als Y1, Y2, Y3, Y4 (oder PP), sowie als „atypischer Y1" bekannt sind. Man nimmt an, daß die Rolle von NPY als stärkster bisher beschriebener Stimulant des Eßverhaltens primär durch Aktivierung des hypothalamischen „atypischen Y1"-Rezeptors zustandekommt. Dieser Rezeptor ist insofern einmalig, als seine Klassifizierung einzig auf Daten des Eßverhaltens, statt auf Bindungsdaten von Radioliganden basiert, im Gegensatz zu den Rezeptoren Y1, Y2, Y3, Y4 (oder PP), die bisher alle sowohl in Radioligandenbindungs- als auch in Funktionstests beschrieben wurden. Die Patentanmelder berichten jetzt von der Anwendung eines auf 125I-PYY beruhenden Expressionsclonierungsverfahrens, um eine cDNA aus Rattenhypothalamus zu isolieren, die einen „atypischen Y1"-Rezeptor codiert, der im Zusammenhang dieser Arbeit als Y5-Subtyp bezeichnet wird. Die Anmelder berichten auch von der Isolierung und Charakterisierung eines Y5-Homologen aus menschlichem Hippocampus. Die Proteinsequenzanalyse zeigt, daß der Y5-Rezeptor zur G-Protein-gekoppelten Rezeptorüberfamilie gehört. Sowohl der menschliche Homologe als auch der der Ratte weisen ≤42% Identität ihrer Transmembrandomänen mit dem vorher clonierten „Y-Typ"-Rezeptor auf. Gehirnlokalisierungsstudien an Ratten, die in-situ-Hybridisierungstechniken anwendeten, bestätigten das Vorhandensein von Y5-mRNA im Ratten-Hypothalamus. Die pharmakologische Auswertung ergab die folgenden Ähnlichkeiten zwischen dem Y5 und dem „atypischen Y1"-Rezeptor: 1.) Peptide banden an den Y5-Rezeptor in einer Reihenfolge der Stärke, die mit jener identisch war, die für die Nahrungsaufnahmereaktion beschrieben wurde: NPY ≥ NPY2–36 = PYY = [Leu31, Pro34] NPY >> NPY13–36. 2.) Der Y5-Rezeptor war negativ mit der cAMP-Akkumulierung gekoppelt, wie es für den „atypischen Y1"-Rezeptor vorgeschlagen worden war. 3.) Peptide aktivierten den Y5-Rezeptor in einer Reihenfolge der Stärke, die mit jener identisch war, die für die Nahrungsaufnahmereaktion beschrieben wurde. 4) Der Nahrungsaufnahme-„Modulator" [D-Trp32] NPY, von dem berichtet wurde, band selektiv an den Y5-Rezeptor und aktivierte diesen anschließend. 5.) Sowohl der Y5- als auch der „atypische Y1"-Rezeptor waren empfindlich gegen Deletionen und Modifikationen in der Mittelregion von NPY und verwandten Peptidliganden. Diese Daten stützen die Annahme, daß der Y5-Rezeptor mit dem vorstehend beschriebenen „atypischen Y1" identisch ist, und sie lassen darüberhinaus auch eine Rolle des Y5-Rezeptors als potentielles Ziel für die Behandlung von Fettleibigkeit, Stoffwechsel- und Appetitstörungen erkennen.
  • Der Peptid-Neurotransmitter Neuropeptid Y (NPY) ist ein 36-Aminosäuren-Mitglied der pankreatischen Polypeptidfamilie mit weiter Verbreitung im Nervensystem von Säugern. NPY gilt als stärkster bisher beschriebener Stimulant des Eßverhaltens (Clark et al., 1984; Levine und Morley, 1984; Stanley und Leibowitz, 1984). Eine direkte Injizierung in den Hypothalamus von gesättigten Ratten beispielsweise kann die Nahrungsaufnahme über einen 4-Stunden-Zeitraum bis auf das 10fache erhöhen (Stanley et al., 1992). Die Rolle von NPY bei normalem und bei abnormalem Eßverhalten und die Fähigkeit, zum Zweck der Appetits- und Gewichtskontrolle in NPY-abhängige Abläufe einzugreifen, sind Gebiete von großem Interesse in der pharmakologischen und pharmazeutischen Forschung (Sahu und Kalra, 1993; Dryden et al., 1994). Jedes glaubwürdige Mittel zum Studium oder zur Kontrolle des NPYabhängigen Nahrungsaufnahmeverhaltens muß jedoch hochspezifisch sein, da NPY durch wenigstens fünf pharmakologisch definierte Rezeptor-Subtypen wirken kann, und dadurch eine große Vielzahl physiologischer Funktionen auslöst (Dumont et al., 1992). Es ist daher wesentlich, die Kenntnis der Molekularbiologie und der strukturellen Vielfalt der einzelnen Rezeptor-Subtypen als Teil einer rationalen Vorgehensweise der Medikamententwicklung zur Entwicklung von subtypselektiven Verbindungen anzusehen. Eine kurze Übersicht der Pharmakologie des NPY-Rezeptors wird nachstehend und in Tabelle 1 zusammenfassend dargestellt.
  • Tabelle 1: Pharmakologisch definierte Rezeptoren für NPY und verwandte pankreatische Polypeptide
  • Die Reihenfolge der Affinitäten der Schlüsselpeptide (NPY, PYY, PP, [Leu31, Pro34] NPY, NPY2–36, und NPY13–36) basieren auf Bindungs- und funktionellen Daten, von denen schon früher berichtet wurde (Schwartz et al., 1990; Wahlestedt et al., 1991; Dumont et al., 1992; Wahlestedt und Reis, 1993). Die Daten des Y2-Rezeptors wurden in der derzeit anhängigen U.S.-Patentanmeldung 08/192,288, eingereicht am 3.2.94 offenbart, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Daten des Y4-Rezeptors wurden in der derzeit anhängigen U.S.-Patentanmeldung 08/176,412, eingereicht am 28.12.93 offenbart, deren Inhalt hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Das Fehlen von Peptiden in der Reihe ist auf das Nichtvorhandensein von veröffentlichter Information zurückzuführen.
  • Tabelle 1
    Figure 00030001
  • Figure 00040001
  • Pharmakologie des NPY Rezeptors
  • Die Pharmakologie des NPY-Rezeptors basierte ursprünglich auf Struktur/Aktivitäts-Verwandtschaft innerhalb der Familie der pankreatischen Polypeptide. Die ganze Familie umfaßt den Namensgeber, das pankreatische Polypeptid (PP), das in erster Linie von endokrinen Zellen in der Pankreas synthetisiert wird; das Peptid YY (PYY), das in erster Linie von endokrinen Zellen im Darm synthetisiert wird; und NPY, das in erster Linie in Neuronen synthetisiert wird (Michel, 1991; Dumont et al., 1992; Wahlestedt und Reis, 1993). Allen Mitgliedern der Familie der pankreatischen Polypeptide gemeinsam ist eine kompakte Struktur, die eine „PP-Faltung" und ein konserviertes C-terminales Hexapeptid, das mit Tyr36 (oder Y36 im Einzelbuchstabencode) endet, beinhaltet. Die auffallende Konservierung von Y36 hat dazu geführt, die Rezeptoren pankreatischer Polypeptide als „Y-Typ"-Rezeptoren (Wahlestedt et al., 1987) zu bezeichnen; von denen allen vorgeschlagen wird, daß sie als sieben Transmembranspannende, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren funktionieren (Dumont et al., 1992).
  • Der Y1-Rezeptor erkennt NPY > PYY » PP (Grundemar et al., 1992). Der Rezeptor erfordert sowohl die N- als auch die C-terminale Region der Peptide für eine optimale Erkennung. Ein Austausch von Gln34 in NPY oder PYY gegen den analogen Rest von PP (Pro34) wird jedoch gut toleriert. Der Y1-Rezeptor wurde aus verschiedenen Arten cloniert, darunter Menschen, Ratten und Mäusen (Larhammar et al., 1992; Herzog et al., 1992; Eva et al., 1990; Eva et al., 1992). Der Y2-Rezeptor erkennt PYY ~ NPY >> PP und ist relativ tolerant gegen N-terminale Deletion (Grundemar et al., 1992). Der Rezeptor erfordert zwingend Struktur im C-Terminus (Arg33-Gln34-Arg35-Tyr36-NH2); ein Austausch von Gln34 gegen Pro34, wie bei PP, wird nicht gut toleriert. Der Y2-Rezeptor wurde neuerdings cloniert (offenbart in US-Patentanmeldung Seriennr. 08/192,288, eingereicht am 3. Februar 1994). Der Y3-Rezeptor ist durch eine starke Präferenz für NPY gegenüber PYY und PP charakterisiert (Wahlestedt et al., 1991). [Pro34] NPY wird ziemlich gut toleriert, obwohl PP, das ebenfalls Pro34 enthält, nicht gut an den Y3-Rezeptor bindet. Dieser Rezeptor (Y3) wurde noch nicht cloniert. Der Y4-Rezeptor (offenbart in US-Patentanmeldung Seriennr. 08/176,412, eingereicht am 28. Dezember 1993) bindet PP > PYY > NPY. Wie der Y1, erfordert der Y4 für ein optimales Erkennen sowohl die N- als auch die C-terminalen Regionen der Peptide (Y4-Patent Fa. Synaptic). Der „atypische Y1"- oder „Nahrungsaufnahme"-Rezeptor wurde ausschließlich durch Injektion verschiedener pankreatischer Polypeptidanaloga in den paraventrikulären Kern des Ratten-Hypothalamus definiert, was das Nahrungsaufnahmeverhalten in folgender Reihenfolge stimulierte: NPY2–36 ≥ NPY ~ PPY ~ [Leu31, Pro34] NPY > NPY13–36 (Kalra et al., 1991; Stanley et al., 1992). Das Profil ähnelt jenem eines Y1-artigen Rezeptors, mit Ausnahme der anomalen Fähigkeit des NPY2_36 die Nahrungsaufnahme mit der gleichen oder mit höherer Wirksamkeit als NPY zu stimulieren. Ein späterer Bericht von Balasubramaniam und Mitarbeitern (1994) in J. Med. Chem. zeigte, daß die Nahrungsaufnahme durch [D-Trp32] NPY gesteuert werden kann. Obwohl dieses Peptid als NPY-Antagonist vorgestellt wurde, legen die veröffentlichten Daten wenigstens teilweise eine stimulierende Wirkung von [D-Trp32] NPY auf das Eßverhalten nahe. Somit stellt [D-Tip32] NPY ein weiteres Diagnosewerkzeug für die Identifizierung von Rezeptoren dar. Im Gegensatz zu anderen NPY-Rezeptor-Subtypen wurde der „Eßverhaltens"-Rezeptor niemals mit Radioliganden-Bindungstests hinsichtlich seiner Peptidbindungsaffinität charakterisiert, und die Tatsache, daß ein einzelner Rezeptor für die Nahrungsaufnahmereaktion verantwortlich sein könnte, konnte in Abwesenheit eines einzelnen Rezeptorproteins nicht überprüft werden; es besteht zum Beispiel die Möglichkeit, daß die Nahrungsaufnahmereaktion ein zusammengesetztes Profil von Y1 und Y2 sein könnte.
  • Patentanmelder berichten nun von der Isolation eines neuartigen Y-Typ-Rezeptors aus einer cDNA-Bank aus Rattenhypothalamus durch Expressionsclonieren, von dessen pharmakologischer Charakterisierung, in-situ-Lokalisierung, und seinen menschlichen Homologen. Die gelieferten Daten rücken diesen neu clonierten Rezeptor-Subtyp, der von jetzt an als Y5-Subtyp bezeichnet wird, in die Nähe der „atypischen Y1-Nahrungsaufnahmereaktion". Deshalb lieferte diese Entdeckung einen neuartigen Weg, durch Verwendung eines heterologen Expressionssystems einen subtypselektiven Antagonisten gegen Fettleibigkeit und für andere Indikationen zu entwickeln.
  • Patentanmelder berichten weiterhin von der Isolation eines Y5-Rezeptors von Hunden. Darüber hinaus berichten Patentanmelder von der Entdeckung chemischer Verbindungen, die selektiv an den Y5-Rezeptor der vorliegenden Erfindung binden, und die als Antagonisten des Y5-Rezeptors wirken. Es wurde gezeigt, daß mehrere diese Verbindungen außerdem noch die Nahrungsaufnahme bei Ratten hemmen.
  • Die Behandlung von Funktionsstörungen oder Krankheiten, die mit der Hemmung des Y5-Rezeptor-Subtyps zusammenhängen, insbesondere von Krankheiten, die mit Eßstörungen zusammenhängen, wie Fettleibigkeit, Bulimia nervosa, Diabetes und Dislipidimie, kann durch die Verabreichung von Zusammensetzungen beeinflußt werden, die selektiv an den Y5-Rezeptor binden und dessen Aktivierung hemmen. Weiterhin können alle Krankheitszustände, an denen der Y5-Rezeptor-Subtyp beteiligt ist, z. B. Gedächtnisverlust, epileptische Anfälle, Migräne, Schlafstörungen und Schmerzen ebenfalls mit Verbindungen behandelt werden, die selektiv an den Y5-Rezeptor von 125I-PYY binden.
  • Diese Erfindung liefert eine Nucleinsäure, die einen Säuger-Y5-Rezeptor codiert. Diese Erfindung liefert auch ein gereinigtes Y5-Rezeptor-Protein. Diese Erfindung liefert einen Vektor, der die vorstehend beschriebene Nucleinsäure umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert einen Vektor, der die zur Expression von DNA in einer Säugerzelle benötigten regulatorischen Elemente, funktionell mit der den menschlichen Y5-Rezeptor codierenden DNA verbunden, enthält, um deren Expression zu ermöglichen; der Vektor ist als pcEXV-hY5 bezeichnet (ATCC-Zugangsnummer 75943).
  • Diese Erfindung liefert ein Plasmid, das die zur Expression von DNA in einer Säugerzelle benötigten regulatorischen Elemente, funktionell mit der den Y5-Rezeptor der Ratte codierenden DNA verbunden, enthält, um deren Expression zu ermöglichen; das Plasmid ist als pcEXV-rY5 bezeichnet (ATCC-Zugangsnummer 75944).
  • Diese Erfindung liefert eine Säugerzelle, die das vorstehend beschriebene Plasmid oder den vorstehend beschriebenen Vektor umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert eine Nucleinsäurensonde, die eine Nucleinsäure von wenigstens 15 Nucleotiden umfaßt, die in der Lage sind, spezifisch mit einer spezifischen Sequenz innerhalb der Sequenz einer Nucleinsäure, die einen Y5-Rezeptor codiert, zu hybridisieren.
  • Diese Erfindung liefert ein Gegensinn-Oligonucleotid, das eine Sequenz hat, die in der Lage ist, spezifisch mit einer mRNA, die einen Y5-Rezeptor-codiert, zu hybridisieren, um die Translation der mRNA zu verhindern.
  • Diese Erfindung liefert einen Antikörper gegen einen Y5-Rezeptor.
  • Diese Erfindung liefert ein Arzneimittel, das den vorstehend beschriebenen Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Arzneimittel, das eine Menge eines Antagonisten, die die Aktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors verringert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Arzneimittel, das eine Menge eines Agonisten, die die Aktivität eines Y5-Rezeptors erhöht, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert das vorstehend beschriebene Arzneimittel, das eine Menge des Antikörpers, die die Bindung eines Liganden an den Y5-Rezeptor blockiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein transgenes, nicht-menschliches Säugetier, welches DNA, die einen menschlichen Y5-Rezeptor codiert, exprimiert.
  • Diese Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet, welches das Inkontaktbringen von Wirtszellen oder Membranpräparationen mit der chemischen Verbindung, unter Bedingungen, die zum Binden geeignet sind, und das Nachweisen der spezifischen Bindung der chemischen Verbindung an den Y5-Rezeptor umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Agonist ist, welches das Inkontaktbringen von Wirtszellen oder Membranpräparationen mit der chemischen Verbindung unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und das Nachweisen eines Anstiegs der Y5-Rezeptor-Aktivität umfaßt, um dadurch zu bestimmen, ob die chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Agonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist, welches das Inkontaktbringen einer Zelle, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit dem Liganden, in der Gegenwart eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten, wie PYY oder NPY, unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und das Nachweisen eines Rückgangs der Y5-Rezeptor-Aktivitätumfaßt, um dadurch zu bestimmen, ob der Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren, das kompetitive Bindung einschließt, zum Bestimmen einer chemischen Verbindung, die spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet, welches umfaßt: Getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats mit sowohl einer chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet, als auch einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie spezifisch an den Y5-Rezeptor binden, und nur mit der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie an den Y5-Rezeptor bindet, unter Bedingungen, die für die Bindung der Verbindungen geeignet sind, und Nachweisen der spezifischen Bindung der Vielzahl der chemischen Verbindungen; wobei eine Abnahme der Bindung der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen in der Gegenwart der Vielzahl chemischer Verbindungen an den Y5-Rezeptor bindet, anzeigt, daß mindestens eine chemische Verbindung aus der Vielzahl der Verbindungen an den Y5-Rezeptor bindet; und getrenntes Nachweisen der Bindung einer jeden Verbindung aus der Vielzahl von Verbindungen an den Y5-Rezeptor.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen einer Vielzahl chemischer Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie an einen Y5-Rezeptor binden, um eine Verbindung herauszufinden, die spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet, das umfaßt: (a) Herstellung eines Zellextraktes aus Zellen, die mit DNA, die den Y5-Rezeptor codiert, transfiziert wurden und diese exprimieren, Isolieren einer Membranfraktion aus dem Zellextrakt, Inkontaktbringen der Membranfraktion mit einer Verbindung, von der bekannt ist, daß sie spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet; (b) Inkontaktbringen des Präparates aus Schritt (a) mit der Vielzahl von Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie spezifisch an den Y5-Rezeptor binden, unter Bedingungen, die eine Bindung der Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie an den Y5-Rezeptor binden, erlauben; (c) Bestimmung, ob die Bindung der Verbindung, von der bekannt ist, daß sie an den Y5-Rezeptor bindet, in Gegenwart der Verbindungen gegenüber ihrer Bindung in Abwesenheit der Vielzahl von Verbindungen verringert ist; und wenn dies der Fall ist (d) getrenntes Nachweisen der Bindung einer jeden Verbindung aus der Vielzahl von Verbindungen an den Y5-Rezeptor, um so die Verbindung herauszufinden, die spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet und diesen aktiviert, das umfaßt: Inkontaktbringen von Wirtszellen oder Membranpräparaten mit einer Vielzahl chemischer Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie an den Y5-Rezeptor binden und diesen aktivieren, unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind, Messen einer Second-Messenger-Antwort in der Gegenwart und in der Abwesenheit der Vielzahl chemischer Verbindungen, wobei eine Änderung der Second-Messenger-Antwort in Gegenwart der Vielzahl chemischer Verbindungen anzeigt, daß mindestens eine chemische Verbindung aus dieser Vielzahl den Y5-Rezeptor aktiviert, und getrenntes Bestimmen, ob jede Verbindung aus der Vielzahl an den Y5-Rezeptor bindet und ihn aktiviert.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist, das umfaßt: Inkontaktbringen von Wirtszellen oder Membranpräparaten mit der chemischen Verbindung in Gegenwart eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und Nachweis einer Abnahme der Y5-Rezeptor-Aktivität, um dadurch zu bestimmen, ob die chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet und dessen Aktivierung hemmt, das umfaßt: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen oder Membranpräparationen sowohl mit der chemischen Verbindung und mit einer zweiten chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, als auch mit der zweiten chemischen Verbindung allein, unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind, und Messen einer Second-Messenger-Antwort in der Gegenwart der zweiten chemischen Verbindung allein und in der Gegenwart von sowohl der zweiten chemischen Verbindung als auch der chemischen Verbindung selbst, wobei eine kleinere Veränderung der Second-Messenger-Antwort in der Gegenwart sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung anzeigt, daß die chemische Verbindung die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet und dessen Aktivierung hemmt, das umfaßt: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen oder Membranpräparationen sowohl mit einer chemischen Verbindung, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert, und einer Vielzahl von Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmen, als auch mit der chemischen Verbindung allein, die den Y5-Rezeptor bekanntermaßen aktiviert, unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind, und Messung einer Second-Messenger-Antwort in der Gegenwart der chemischen Verbindung allein, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert und in der Gegenwart von sowohl der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert, und der Vielzahl von chemischen Verbindungen; wobei eine kleinere Veränderung der Second-Messenger-Antwort in der Gegenwart von sowohl der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert, und der Vielzahl von chemischen Verbindungen im Vergleich zu jener in der Gegenwart der chemischen Verbindung allein, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert, anzeigt, daß wenigstens eine chemische Verbindung aus der Vielzahl von chemischen Verbindungen die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmt, und separate Bestimmung, ob jede Verbindung aus der Vielzahl von chemischen Verbindungen spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet und dessen Aktivierung hemmt.
  • In einer getrennten Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens umfaßt die Second-Messenger-Antwort Adenylatcyclase-Aktivität, und die Veränderung der Second-Messenger-Antwort ist eine geringere Abnahme der Adenylatcyclase-Aktivität in Gegenwart sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert, und der Vielzahl von chemischen Verbindungen, im Vergleich zu jener in Gegenwart von nur der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu bestimmen, die als Agonisten eines Y5-Rezeptors wirken, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit einer Y5-Rezeptor-codierenden DNA transfiziert wurde, und diese exprimiert, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen unter Bedingungen, die die Aktivierung einer funktionellen Y5-Rezeptorantwort erlauben, Bestimmung jener Wirkstoffe, die solche Rezeptoren in der Zelle aktivieren, und dadurch Bestimmung der Wirkstoffe, die als Y5-Rezeptor-Agonisten wirken.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu bestimmen, die als Y5-Rezeptor-Antagonisten wirken, das umfaßt: Inkontaktbringen von Zellen, die mit einer Y5-Rezeptor-codierenden DNA transfiziert wurden, und diese exprimieren, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen in Gegenwart eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten, wie etwa PYY oder NPY unter Bedingungen, die die Aktivierung einer funktionellen Y5-Rezeptor-Antwort erlauben, Bestimmung jener Wirkstoffe, die die Aktivierung des Rezeptors in der Säugerzelle hemmen, und dadurch Bestimmung der Wirkstoffe, die als Y5-Rezeptor-Antagonisten wirken.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Diagnose einer Prädisposition für eine Störung, die mit der Aktivität eines spezifischen menschlichen Y5-Rezeptor-Allels zusammenhängt, die umfaßt: a) Gewinnung von DNA von Individuen, die an der Störung leiden; b) Ausführung einer Restriktionsverdauung der DNA mit einer Palette von Restriktionsenzymen; c) elektrophoretische Trennung der erhaltenen DNA-Fragmente auf einem Größenausschlußgel; d) Inkontaktbringen des so erhaltenen Gels mit einer Nucleinsäurensonde, die in der Lage ist, spezifisch mit DNA zu hybridisieren, die einen menschlichen Y5-Rezeptor codiert, und die mit einem feststellbaren Marker markiert ist; e) Feststellen markierter Banden, die mit der einen menschlichen Y5-Rezeptor codierenden und mit einem feststellbaren Marker markierten DNA hybridisiert haben und so ein einzigartiges Bandenmuster erzeugt haben, das für die DNA von Individuen spezifisch ist, die an der Störung leiden; f) Zubereitung von DNA, die durch die Schritte a bis e für die Diagnose gewonnen wurde; und g) Vergleichen des einzigartigen Bandenmusters, das für die DNA der an der Störung leidenden Individuen charakteristisch ist, aus Schritt e und derer DNA, die aus Schritt f für die Diagnose erhalten wurde, um festzustellen, ob die Muster gleich oder verschieden sind, und damit bei gleichen Mustern eine Prädisposition für die Störung festzustellen.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung des gereinigten Y5-Rezeptors von Menschen, Ratten oder Hunden, das umfaßt: a) Konstruktion eines Vektors, der für die Expression in einer Zelle angepaßt ist, die die für die Expression von Nucleinsäure nötigen regulatorischen Elemente enthält, die funktionell mit der Nucleinsäure verbunden sind, die den Y5-Rezeptor von Menschen, Ratten oder Hunden codiert und dessen Expression erlaubt; wobei die Zelle aus einer Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen ausgewählt wird; b) Einschleusen des Vektors aus Schritt a in eine geeignete Wirtszelle; c) Inkubation der Zellen aus Schritt b unter Bedingungen, die die Expression des Y5-Rezeptors von Menschen, Ratten oder Hunden erlauben; d) Wiedergewinnung des so erhaltenen Rezeptors; und e) Reinigen des wiedergewonnenen Rezeptors und damit Herstellung eines Y5-Rezeptors von Menschen, Ratten oder Hunden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1: Kompetitive Verdrängung von 125I-PYY auf Membranen von Ratten-Hypothalamus. Die Membranen wurden mit 125I-PYY und ansteigenden Konzentrationen von Peptid-Kompetitoren inkubiert. Die IC50-Werte, die 50%-iger Verdrängung entsprechen, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt. Die Daten sind für wenigstens zwei unabhängige Versuche repräsentativ. Die IC50-Werte für diese Verbindungen sind separat in Tabelle 2 aufgeführt.
  • 2: Kompetitive Verdrängung von 125I-PYY3_36 auf Membranen von Ratten-Hypothalamus. Die Membranen wurden mit 125I-PYY3_36 und ansteigenden Konzentrationen von Peptid-Kompetitoren inkubiert. Die IC50-Werte, die 50%-iger Verdrängung entsprechen, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt. Die Daten sind für wenigstens zwei un abhängige Versuche repräsentativ. Die IC50-Werte für diese Verbindungen sind separat in Tabelle 2 aufgeführt.
  • 3: Nucleotidsequenz des Y5-cDNA-Clons des Ratten-Hypothalamus (SEQ ID Nr. 1). Initiations- und Stoppcodons sind unterstrichen. Es werden nur teilweise 5'- und 3'-nichtübersetzte Sequenzen gezeigt.
  • 4: Korrespondierende Aminosäuresequenz des Y5-cDNA-Clons des Ratten-Hypothalamus (SEQ ID Nr. 2).
  • 5: Nucleotidsequenz des Y5-cDNA-Clons aus dem menschlichen Hippocampus (SEQ ID Nr. 3). Das Initiations- und das Stopcodon sind unterstrichen. Es werden nur teilweise 5'- und 3'-nichtübersetzte Sequenzen gezeigt.
  • 6: Korrespondierende Aminosäuresequenz des Y5-cDNA-Clons aus dem menschlichen Hippocampus (SEQ ID Nr. 4).
  • 7A–E: Vergleich der codierenden Nucleotidsequenzen von cDNA-Clones aus Ratten-Hypothalamus-Y5 (obere Reihe) und menschlicher hippocampaler Y5 (untere Reihe) (84,1% Nucleotidgleichheit). F–G: Vergleich abgeleiteter Aminosäuresequenzen von cDNA-Clones aus Ratten-Hypothalamus-Y5 (obere Reihe) und menschlicher hippocampaler Y5 (untere Reihe) (87,2% Gesamtgleichheit und 98,8% Gleichheit der Transmembrandomänen).
  • 8: Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz des menschlichen Y5-Rezeptors mit jenen der menschlichen Y1-, Y2-, Y4-Sequenzen. Durchgezogene Linien: die 7 mutmaßlichen membranspannenden Domänen (TM I–VII). Schraffiert: Gleichheiten zwischen Rezeptorsequenzen.
  • 9: Gleichgewichtsbindung von 125I-PYY an Membranen von COS-7-Zellen, die transient Ratten-Y5-Rezeptoren exprimieren. Die Membranen wurden für die angegebenen Zeiträume in der Gegenwart oder in Abwesenheit von 300 nM menschlichem NPY mit 125I-PYY inkubiert. Die spezifische Bindung B wurde gegen die Zeit t aufgetragen, wodurch man die maximale Zahl der Gleichgewichtsbindungsstellen Bmax und die beobachtete Assoziationsrate Kobs nach der Gleichung B = Bmax × (1 – e–(Kobs×t)) erhielt. Die Bindung wird als Prozentsatz der gesamten Gleichgewichtsbindung, Bmax, bestimmt durch nichtlineare Regressionsanalyse, dargestellt. Jeder Punkt stellt eine dreifache Determination dar.
  • 10: Sättigbare Gleichgewichtsbindung von 125I-PYY an Membranen von COS-7-Zellen, die transient Ratten-Y5-Rezeptoren exprimieren. Die Membranen wurden mit 125I-PYY in Konzentrationen von 0,4 pM bis 2,7 nM in Gegenwart oder in Abwesenheit von 300 nM menschlichem NPY inkubiert. Die spezifische Bindung B wurde gegen die freie 125I-PYY Konzentration [L] aufgetragen, wodurch man die maximale Zahl der sättigbaren Bindungsstellen Bmax und die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante von 125I-PYY, Kd gemäß der Bindungsisotherme B = Bmax [L]/([L] + Kd) erhielt. Die spezifische Bindung wird gezeigt. Die Daten sind für drei unabhängige Versuche repräsentativ, wobei ein jeder Punkt dreifach gemessen wurde.
  • 11: Kompetitive Verdrängung von 125I-PYY aus COS-7-Zellen, die transient Ratten-Y5-Rezeptor exprimieren. Die Membranen wurden mit 125I-PYY und steigenden Konzentrationen von Peptid-Wettbewerbern inkubiert. Die IC50-Werte, die 50%-iger Verdrängung entsprechen, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt und nach der Gleichung Ki = IC50/(1 + [L]/Kd) in Ki-Werte umgewandelt, wobei [L] die 125I-PYY-Konzentration und Kd die Gleichgewichts-Dissoziationskonstante von 125I-PYY ist. Die Daten sind für wenigstens zwei unabhängige Versuche repräsentativ. Die Reihenfolge der Affinitäten für diese und andere Verbindungen ist separat in Tabelle 4 aufgelistet.
  • 12: Hemmung der Forskolin-stimulierten CAMP-Emulation in intakten 293-Zellen, die Ratten-Y5-Rezeptor stabil exprimieren. Die funktionellen Daten wurden aus einem Radioimmuntest von CAMP in 293-Zellen gewonnen, die über einen Zeitraum von 5 min mit 10 μM Forskolin stimulieren wurden. Ratten-/Menschen-NPY wurde über den gleichen Zeitraum bei Konzentrationen von 0,03 pM bis 0,3 μM auf seine Antagonistenaktivität getestet. Der EC50-Wert, der 50% der maximal Aktivität entspricht, wurde durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt. Die gezeigten Daten sind für drei unabhängige Versuche repräsentativ.
  • 13: Schematische Diagramme von koronalen Schnitten durch das Rattenhirn, die die Verteilung von NPY-Y5-Rezeptor-mRNA darstellen, wie sie mikroskopisch in Schnitten in flüssiger Emulsion zu sehen ist. Die Schnitte sind von rostral (A) bis caudal (H) angeordnet. Die Unterschiede in der Silberkorndichte über einzelne Neuronen in einem bestimmten Gebiet werden mittels Hatching-Gradienten angegeben. Die vollständigen Definitionen für die Abkürzungen lauten folgendermaßen:
    Aco = Vorderer Nucleus corticalis amygdali (anterior cortical amygdaloid nucleus)
    AD = Nucleus anterodorsalis thalami (anterodorsal thalamic nucleus)
    APT = Nucleus anterioris pretectalis (anterior pretectal nucleus)
    Arc = Nucleus hypothalami arcuatus (arcuate hypothalamic nucleus)
    BLA = Vorderseite des Nucleus basolateralis amygdali (basolateral amygdaloid nucleus anterior)
    CA3 = CA3-Feld des Cornu ammonis, Hippocampus
    CeA = zentraler Nucleus amygdalae (central amygdaloid nucleus)
    Cg = Cortex cinguli (cingulate cortex)
    CL = Nucleus centrolateralis thalami (centrolateral thalamic nucleus)
    CM = Nucleus centromedialis thalami (central medial thalamic nucleus)
    DG = Gyrus dentatus, Hippocampus (dentate gyrus, hippocampus)
    DMH = Nucleus dorsomedialis hypothalami (dorsomedial hypothalamic nucleus)
    DR = Rückenraphe (dorsal raphe)
    GiA = Nucleus reticularis gigantocellularis, alpha (gigantocellular reticular nucleus, alpha)
    HDB = Nucleus horizontalis des diagonalen Bandes der Extremitäten (nucleus horizontal limb diagonal band)
    InG = Colliculus superioris der grauen Zwischenschicht (intermediate gray layer superior colliculus)
    LC= Locus coeruleus
    LH = Laterale Hypothalamusregion (lateral hypothalamic area)
    MePV = Nucleus medialis amygdali, posteroventral (medial amygdaloid nucleus, posteroventral)
    MVe = Nucleus medialis vestibularis (medial vestibular nucleus)
    MHb = Nucleus medialis habenularis (medial habenular nucleus)
    MPN = Nucleus medialis praeopticus (medial preoptic nucleus)
    PAG = Periaquaeductales Grau (periaqueductal gray)
    Pas = Parasubiculum (parasubiculum)
    PC = Nucleus paracentralis thalami (paracentral thalamic nucleus)
    PCRtA = Nucleus parvocellularis reticularis, (alpha parvocellular reticular nucleus, alpha)
    Pe = Nucleus periventricularis hypothalami (periventricular hypothalamic nucleus)
    PrS = Präsubiculum (presubiculum)
    PN = Nuclei pontis (pontine nuclei)
    PVH = Nucleus paraventricularis hypothalami (paraventricular hypothalamic nucleus)
    PVHmp = Nucleus paraventricularis hypothalami, pars parvicellularis (paraventricular hypothalamic nucleus, medial parvicellular part)
    PVT = Nucleus paraventricularis thalami (paraventricular thalamic nucleus)
    Re = Verbindungen des Nucleus thalami (reunions thalamic nucleus)
    RLi = Raphe des Nucleus rostralis linearis (rostral linear nucleus raphe)
    RSG = Cortex retrosplenialis (retrosplenial cortex)
    SCN = Nucleus suprachiasmaticus (suprachiasmatic nucleus)
    SNc = Substantia nigra, pars compacta
    SON = Nucleus supraopticus (supraoptic nucleus)
  • 14: Partialnucleotidsequenz des Y5-cDNA-Clons von Hunden, der unmittelbar stromaufwärts von TM III beginnt, bis zum Stopcodon (unterstrichen) (SEQ ID Nr. 5). Es werden nur teilweise 3'-nichtübersetzte Sequenzen gezeigt.
  • 15: Korrespondierende Aminosäuresequenz des Y5-cDNA-Clons von Hunden (SEQ ID Nr 6).
  • 16A: Northern-Blot-Analyse verschiedener Rattengewebe. B: Northern-Blot-Analyse verschiedener menschlicher Gehirnbereiche: Amygdala, Nucleus caudatus, Corpus callosum, Hippocampus, gesamtes Gehirn, Substantia nigra, Nucleus subthalami und Thalamus. C: Northern-Blot-Analyse verschiedener menschlicher Gehirnbereiche: Kleinhirn, Großhirnrinde, Medulla, Rückenmark, Hinterhauptlappen, Stirnlappen, Schläfenlappen und Putamen. Die Hybridisierung geschah unter Bedingungen von hoher Stringenz, wie bei den Versuchsdetails beschrieben.
  • 17: Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA von Menschen oder Ratten, die den Y5-Rezeptor-Subtyp codiert. Die Hybridisierung geschah unter Bedingungen von hoher Stringenz, wie bei den Versuchsdetails beschrieben.
  • 18: Zeitverlauf der Gleichgewichtsbindung von 125I-[Leu31, Pro34] PYY an den Y5-Rezeptor der Ratte. Die Membranen wurden bei Raumtemperatur über den angegebenen Zeitraum mit 0,08 nM Radioligand in Bindungspuffer entweder mit 10 mM Na+ oder mit 138 mM Na+ inkubiert.
  • 19: Guaninnucleotid-Modulation der Y5-Peptid-Bindung. Y5-Rezeptoren von Menschen oder Ratten, die transient in COS-7-Zellmembranen exprimiert wurden, oder menschliche Y5-Rezeptoren, die stabil in LM(tk-)-Zellmembranen exprimiert wurden, wurden in 0,08 nM 125I-PYY und steigenden Konzentrationen von Gpp (NH) p wie angegeben unter Standard-Bindungstest-Bedingungen inkubiert. Die Radioligandenbindung ist als 1 cpm angegeben, Effizienz = 0,8. Für das menschliche Y5 in LM(tk-) (0,007 mg Membranprotein/Probe), beträgt das maximale Δ cpm = –2343. Wenn eine spezifische Aktivität von 2200 ci/mM gegeben ist, ergibt sich rechnerisch eine Veränderung der Radioligandenbindung von – 0,6 fmol/0,007 mg Protein = –85 fmol/mg Membranprotein.
  • 20: NPY-abhängige Hemmung von Forskolin-stimulierter CAMP-Akkumulation durch clonierte Y5-Rezeptoren. Intakte Zellen, die stabil mit Y5-Rezeptoren von Menschen oder Ratten transfizierten wurden, wurden mit Forskolin plus einer Reihe von menschlichen NPY-Konzentrationen wie angegeben inkubiert. Für jedes Rezeptorsystem wird ein repräsentativer Versuch gezeigt (n ≥ 2).
  • 21: Calcium-Mobilisierung: Fura-2-Test. Clonierte menschliche Y-Typ-Rezeptoren in den angegeben Wirtszellen wurden auf intrazelluläre Calcium-Mobilisierung als Reaktion auf NPY und verwandte Peptide abgesucht. Für jedes Rezeptorsystem werden repräsentative Calcium-Übergänge gezeigt.
  • 22: Zeigt die Struktur einer Verbindung, die selektiv an die Y5-Rezeptoren von Menschen und Ratten bindet.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In dieser Anmeldung werden die folgenden Standardabkürzungen zur Bezeichnung spezifischer Nucleotidbasen verwendet:
    C = Cytosin
    T = Thymin
    A = Adenin
    G = Guanin
  • Weiterhin wird in dieser Anmeldung der Begriff „Agonist" verwendet, um ein beliebiges Peptid oder eine Nicht-Peptidylverbindung zu bezeichnen, das die Aktivität eines beliebigen Rezeptors der vorliegenden Erfindung erhöht. Der Begriff „Antagonist" wird in dieser Anmeldung verwendet, um ein beliebiges Peptid oder eine Nicht-Peptidylverbindung zu bezeichnen, das die Aktivität eines beliebigen Rezeptors der vorliegenden Erfindung vermindert.
  • Die Aktivität eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, wie ein Y5-Rezeptor, kann mittels eines beliebigen Tests aus einer Vielzahl geeigneter funktioneller Tests gemessen werden, bei dem die Aktivierung des fraglichen Rezeptors zu einer feststellbaren Veränderung des Spiegels eines Second-Messenger-Systems führt, wie unter anderen Adenylat-Cyclase, Calcium-Mobilisierung, Inositol-Phospholipid-Hydrolyse oder Guanylyl-Cyclase.
  • Diese Erfindung liefert eine Nucleinsäure, die einen Y5-Rezeptor codiert. In einer Ausführungsform ist der Y5-Rezeptor der Y5-Rezeptor eines Wirbeltieres oder eines Säugers. In einer Ausführungsform codiert die Nucleinsäure einen Säuger-Y5-Rezeptor, wobei die Nucleinsäure eine Nucleotidsequenz enthält, die die in den 4, 6 und 15 gezeigten Aminosäuresequenzen codiert. In einer anderen Ausführungsform hat der Y5-Rezeptor im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie in 4 beschrieben. In einer anderen Ausführungsform hat der Y5-Rezeptor im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie in 6 beschrieben.
  • Diese Erfindung liefert eine Nucleinsäure, wobei die Nucleinsäure einen Y5-Rezeptor codiert, der durch eine Aminosäuresequenz in jeder der Transmembranregionen I–VII charakterisiert wird, die mit der Aminosäuresequenz in den entsprechenden Transmembranregionen des menschlichen Y5-Rezeptors, die in 8 gezeigt wird, identisch ist.
  • Diese Erfindung liefert die vorstehend beschriebene einzelne Nucleinsäure, wobei die Nucleinsäure DNA ist. In einer Ausführungsform ist die DNA cDNA. In einer anderen Ausführungsform ist die DNA genomische DNA. In noch einer anderen Ausführungsform ist die Nucleinsäure RNA, wobei die RNA vorzugsweise mRNA ist. In einer separaten Ausführungsform codiert die Nucleinsäure einen menschlichen Y5-Rezeptor. In einer Ausführungsform hat der menschliche Y5-Rezeptor die in 6 beschriebene Aminosäuresequenz.
  • Diese Erfindung liefert weiterhin DNA, die mit jeder beliebigen der in den 3, 5 und 14 gezeigten DNAs degeneriert ist, und die Y5-Rezeptoren codiert, die die in den 4, 6 und 15 gezeigten Aminosäuresequenzen haben.
  • Diese Erfindung umfaßt auch DNAs und cDNAs, die Aminosäuresequenzen codieren, die von jenen des Y5-Rezeptors verschieden sind, die jedoch keine phänotypischen Veränderungen hervorrufen dürften. Alternativ umfaßt diese Erfindung auch die DNAs und cDNAs, die mit der DNA und cDNA der vorliegenden Erfindung hybridisieren. Hybridisierungsverfahren sind Fachleuten wohlbekannt.
  • Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung beinhalten auch DNAs, die Polypeptidanaloga, Fragmente oder Derivate antigener Polypeptide codieren, die sich von den natürlich vorkommenden Formen hinsichtlich der Identität oder der Lage eines oder mehrerer Aminosäurereste unterscheiden (Deletionsanaloga, die weniger als alle der für das Protein spezifizierten Reste enthalten, Substitutionsanaloga, bei denen einer oder mehrere der spezifizierten Reste durch andere Reste ersetzt sind, und Additionsanaloga, bei denen einer oder mehrere Aminosäurereste zum terminalen oder medianen Abschnitt der Polypeptide hinzugefügt sind), und die einige oder alle Eigenschaften mit den natürlich vorkommenden Formen gemeinsam haben. Diese Nucleinsäuren beinhalten: der Einbau von Codons, die für die Expression durch ausgewählte Nicht-Säuger-Wirte „bevorzugt" sind; die Bereitstellung von Spaltungsstellen für Restriktionsendonucleasen; und die Bereitstellung zusätzlicher Initiations-, Terminations- oder intermediärer DNA-Sequenzen, die die Konstruktion leicht exprimierbarer Vektoren erleichtern.
  • Die in dieser Anmeldung beschriebenen und beanspruchten Nucleinsäuren sind nützlich aufgrund der Information, die sie hinsichtlich der Aminosäuresequenzen des Polypeptids liefern, sowie als Produkte für die Synthese von Polypeptiden in großen Mengen mittels verschiedener rekombinanter Techniken. Die Nucleinsäure ist nützlich zur Erzeugung neuer Clonierungs- und Expressionsvektoren, transformierter und transfizierter prokaryontischer und eukaryontischer Wirtszellen, und neuer und nützlicher Verfahren zum Wachstum in Kulturen von Wirtszellen, die zur Expression des Polypeptids und verwandter Produkte in der Lage sind.
  • In einer separaten Ausführungsform codiert die Nucleinsäure einen Ratten-Y5-Rezeptor. In einer anderen Ausführungsform hat der Ratten-Y5-Rezeptor die in 4 gezeigte Aminosäuresequenz. In einer anderen Ausführungsform codiert die Nucleinsäure einen Hunde-Y5-Rezeptor. In einer weiteren Ausführungsform hat der Hunde-Y5-Rezeptor die in 15 gezeigte Aminosäuresequenz.
  • Diese Erfindung liefert auch ein gereinigtes Y5-Rezeptor-Protein. In separaten Ausführungsformen kann das Y5-Protein ein menschliches, ein Ratten- oder ein Hundeprotein sein. Diese Erfindung liefert einen Vektor, der die vorstehend beschriebene Nucleinsäure umfaßt.
  • Es werden auch Vektoren geliefert, die die in dieser Anmeldung vorstehend beschriebene isolierte Nucleinsäure enthalten. Geeignete Vektoren umfassen ein Plasmid oder ein Virus, sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, und so ein Wirtszellen-Vektor-System für die Produktion eines Polypeptids bilden, das die biologische Aktivität eines Y5-Rezeptors hat.
  • Diese Erfindung liefert den vorstehend beschriebenen Vektor, zur Expression in einer Wirtszelle angepaßt, die die zur Expression der Nucleinsäure in der Wirtszelle nötigen regulatorischen Elemente, funktionell mit der Y5-Rezeptor-codierenden Nucleinsäure verbunden enthält, so daß sie deren Expression erlaubt.
  • Diese Erfindung liefert den vorstehend beschriebenen, zur Expression in einer Wirtszelle angepaßten Vektor, wobei die Wirtszelle eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle ist. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle nicht-neuronalen Ursprungs. In einer weiteren Ausführungsform ist die Zelle eine COS-7-Zelle, eine menschliche, embryonale 293-Nieren zelle, eine NIH-3T3-Zelle oder eine LM(tk-)-Zelle. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Insektenzelle eine Sf9-Zelle oder eine Sf21-Zelle.
  • Diese Erfindung liefert den vorstehend beschriebenen Vektor, der ein Baculovirus oder ein Plasmid ist.
  • Diese Erfindung liefert ein aus den vorstehend beschriebenen Wirtszellen isoliertes Membranpräparat, wobei die Wirtszelle natürlicherweise keinen Y5-Rezeptor exprimiert.
  • In einer Ausführungsform ist der Vektor zur Expression in einer Säugerzelle angepaßt, die die zur Expression der DNA in der Säugerzelle nötigen regulatorischen Elemente, funktionell mit der Säuger-Y5-Rezeptor-codierenden DNA verbunden, enthält, so daß sie deren Expression erlaubt.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist der Vektor zur Expression in einer Säugerzelle angepaßt, die die zur Expression der DNA in der Säugerzelle nötigen regulatorischen Elemente, funktionell mit der den menschlichen Y5-Rezeptor codierenden DNA verbunden umfaßt, so daß sie deren Expression erlaubt.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Plasmid zur Expression in einer Säugerzelle angepaßt, die die zur Expression von DNA in der Säugerzelle nötigen regulatorischen Elemente, funktionell mit der den Ratten-Y5-Rezeptor codierenden DNA verbunden, umfaßt, so daß sie deren Expression erlaubt.
  • Diese Erfindung liefert das vorstehend beschriebene Plasmid, zur Expression in einer Säugerzelle angepaßt, die die zur Expression von DNA in einer Säugerzelle nötigen regulatorischen Elemente, funktionell mit der den Säuger-Y5-Rezeptor codierenden DNA verbunden, umfaßt, so daß sie deren Expression erlaubt.
  • Diese Erfindung liefert ein Plasmid, das die zur Expression von DNA in einer Säugerzelle nötigen regulatorischen Elemente, funktionell mit der den menschlichen Y5-Rezeptor codierenden DNA verbunden, umfaßt, so daß sie deren Expression erlaubt; das Plasmid ist als pcEXV-hY5 bezeichnet (ATCC-Zugangsnummer 75943).
  • Dieses Plasmid (pcEXV-hY5) wurde am 4. November 1994 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentierungsverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt, und es erhielt die ATCC-Zugangsnummer 75943.
  • Diese Erfindung liefert ein Plasmid, das die zur Expression von DNA in einer Säugerzelle nötigen regulatorischen Elemente, funktionell mit der den Ratten-Y5-Rezeptor-codierenden DNA verbunden, umfaßt, so daß sie deren Expression erlaubt; das Plasmid ist als pcEXV-rY5 bezeichnet (ATCC-Zugangsnummer 75944).
  • Dieses Plasmid (pcEXV-rY5) wurde am 4. November 1994 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentierungsverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt, und es erhielt die , ATCC-Zugangsnummer CRL 75944. Diese Erfindung liefert ein Y5-bd-5 bezeichnetes Plasmid (ATCC-Zugangsnunmmer_______). Diese Erfindung liefert auch ein Y5-bd-8 bezeichnetes Plasmid (ATCC-Zugangsnummer________). Diese Plasmide wurden am 1. Dezember 1995 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentierungsverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt, und sie erhielten die ATCC-Zugangsnummern________ bzw______.
  • Diese Erfindung liefert auch ein hY5-BB3 bezeichnetes Baculovirus (ATCC-Zugangsnummer________). Dieses Baculovirus wurde am 15. November 1995 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentierungsverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt, und es erhielt die ATCC-Zugangsnummern_________.
  • Diese Erfindung liefert eine Säugerzelle, die das vorstehend beschriebene Plasmid oder den vorstehend beschriebenen Vektor umfaßt. In einer Ausführungsform ist die Säugerzelle eine COS-7-Zelle.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die Säugerzelle eine menschliche, embryonale 293-Nierenzelle, die als 293-rY5-14 (ATCC-Zugangsnummer CRL 11757) bezeichnet wurde.
  • Diese Zelle (293-rY5-14) wurde am 4. November 1994 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganischen zum Zweck von Patentierungsverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt, und sie erhielt die ATCC-Zugangsnummer CRL 11757.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Säugerzelle eine Mäuse-Fibroblasten-(tk-)-Zelle, die das Plasmid pcEXV-hY5 enthält, und die als L-hY5-7, (ATCC-Zugangsnummer CRL 11995) bezeichnet wurde. In einer anderen Ausführungsform und ist die Säugerzelle eine embryonale Mäuse-NIH-3T3-Zelle, die das Plasmid pcEXV-hY5 enthält, und die als N-hY5-8, (ATCC-Zugangsnummer CRL 11994) bezeichnet wurde. Diese Zellen wurden am 15. November 1995 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck von Patentierungsverfahren bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA hinterlegt, und sie erhielten die ATCC-Zugangsnununern CRL 11995 bzw. CRL 11994.
  • Diese Erfindung liefert eine Nucleinsäurensonde, die eine Nucleinsäure von mindestens 15 Nucleotiden umfaßt, die in der Lage ist, spezifisch mit einer einzelnen Sequenz innerhalb der Sequenz einer Y5-Rezeptor codierenden Nucleinsäure zu hybridisieren. In einer Ausführungsform ist die Nucleinsäure DNA.
  • Die hergestellte Nucleinsäure kann entweder DNA oder RNA sein. Im Sprachgebrauch dieser Erfindung bezeichnet der Ausdruck „spezifisch hybridisieren" die Fähigkeit einer Nucleinsäure, eine zu der eigenen komplementäre Nucleinsäuresequenz zu erkennen, und durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basenpaaren Doppelhelixabschnitte zu bilden.
  • Diese Nucleinsäure von mindestens 15 Nucleotiden, die in der Lage ist, spezifisch mit einer Sequenz einer den menschlichen Y5-Rezeptor codierenden Nucleinsäure zu hybridisieren, kann als Sonde verwendet werden. Die Technologie der Nucleinsäurensonden ist den Fachleuten wohlbekannt; diese werden auch verstehen, daß die Länge solcher Sonden stark variieren kann, und daß diese mit einem feststellbaren Marker, wie einem Radioisotop oder einem Fluoreszenzfarbstoff markiert sein können, um die Feststellung der Sonde zu erleichtern. DNA-Sonden können durch die Insertion einer DNA, die den Y5-Rezeptor codiert, in geeignete Vektoren, wie Plasmide oder Bakteriophagen, und anschließender Transformation in geeignete bakterielle Wirtszellen, Replikation in den transformierten bakteriellen Wirtszellen und Gewinnung der DNA-Sonden mit auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Alternativ können Sonden mit DNA-Synthesizern chemisch generiert werden.
  • RNA-Sonden können erzeugt werden, in dem die DNA, die den Y5-Rezeptor codiert, stromabwärts eines Bakteriophagen-Promoters, wie T3, T7, oder SP6 insertiert wird. Große Mengen von RNA-Sonde können durch Inkubation der markierten Nucleotide mit dem linearisierten Fragment, wo es einen stromaufwärts-Promoter enthält, in der Gegenwart der geeigneten RNA-Polymerase gewonnen werden.
  • Diese Erfindung liefert auch eine Nucleinsäure von mindestens 15 Nucleotiden, die in der Lage ist, spezifisch mit einer Sequenz einer Nucleinsäure, die zur Säuger-Nucleinsäure, die einen Y5-Rezeptor codiert, komplementär ist. Diese Nucleinsäure kann entweder DNA oder RNA sein.
  • Diese Erfindung liefert ein Gegensinn-Oligonucleotid, das eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch mit mRNA, die einen Y5-Rezeptor codiert, zu hybridisieren und so die Translation der mRNA zu verhindern.
  • Diese Erfindung liefert ein Gegensinn-Oligonucleotid, das eine Sequenz hat, die in der Lage ist, spezifisch mit der genomischen DNA eines Y5-Rezeptors zu hybridisieren.
  • Diese Erfindung liefert ein Gegensinn-Oligonucleotid des Y5-Rezeptors, das chemische Analoga von Nucleotiden umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert einen Antikörper, der in der Lage ist, an einen Y5-Rezeptor zu binden. Diese Erfindung liefert auch einen Antikörper, der in der Lage ist, die Bindung des vorstehend beschriebenen Antikörpers an einen Y5-Rezeptor kompetitiv zu hemmen. In einer Ausführungsform ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper.
  • Diese Erfindung liefert einen monoclonalen Antikörper, der gegen ein Epitop eines menschlichen Y5-Rezeptors auf der Oberfläche einer Y5-Rezeptor-exprimierenden Zelle gerichtet ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Arzneimittel, das den vorstehend beschriebenen Antikörper und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert die vorstehend beschriebene Arzneimittelzusammensetzung, die eine Menge des Antikörpers, die die Bindung eines Liganden an den Y5-Rezeptor blockiert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
  • Im Sprachgebrauch dieser Erfindung bedeutet „pharmazeutisch verträglicher Träger" jeder beliebige standardmäßige pharmazeutisch verträgliche Träger. Beispiele sind unter anderem phosphatgepufferte Kochsalzlösung, physiologische Kochsalzlösung, Wasser und Emulsionen, wie ÖUWasser-Emulsionen.
  • Tiermodell-Systeme, die die physiologische und verhaltensmäßige Rolle des Y5-Rezeptors aufklären, werden erzeugt, indem man transgene Tiere schafft, bei denen die Aktivität des Y5-Rezeptors entweder gesteigert oder verringert oder die Aminosäuresequenz des exprimierten Y5-Rezeptors geändert ist; hierzu werden verschiedene Verfahren angewandt. Beispiele für diese Verfahren sind unter anderen: 1) Insertion normaler oder mutierter Versionen von Y5-Rezeptor-codierender DNA durch Mikroinjektion, Elektroporation, retrovirale Transfektion oder andere Mittel, die den Fachleuten wohlbekannt sind, in geeignete befruchtete Embryonen, um transgene Tiere zu erzeugen, oder 2) homologe Rekombination von mutierten oder normalen, menschlichen oder tierischen Versionen dieser Gene mit dem nativen Genlocus in transgenen Tieren, um die Regzulation der Expression oder die Struktur dieser Y5-Rezeptor-Sequenzen zu verändern. Die Technik der homologen Rekombination ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Dabei wird das native Gen durch das insertierte Gen ersetzt und so ein Tier erzeugt, daß keine nativen Y5-Rezeptoren exprimieren kann, doch zum Beispiel einen insertierten mutierten Y5-Rezeptor exprimiert, der den nativen Y5-Rezeptor im Genom des Tieres durch Rekombination ersetzt hat, was zu einer Unterexpression des Transporters führt. Die Mikroinjektion fügt dem Genom Gene hinzu, entfernt jedoch keine, und erzeugt so ein Tier, das seine eigenen und die hinzugefügten Y5-Rezeptoren exprimiert, was zu einer Überexpression der Y5-Rezeptoren führt.
  • Ein Mittel, das zur Erzeugung eines transgenen Tieres, beispielsweise mit einer Maus verfügbar ist, ist folgendes: Weibliche Mäuse werden gepaart und die so erhaltenen befruchteten Eizellen durch Sektion aus ihren Eileitern entnommen. Die Eier werden in einem geeigneten Medium, wie M2-Medium aufbewahrt. DNA oder cDNA, die einen Y5-Rezeptor codiert, wird durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, aus einem Vektor gereinigt. Es können induzierbare Promoter mit der codierenden Region der DNA fusioniert werden, um so ein experimentelles Mittel zur Regulierung der Expression des Transgens zu schaffen. Alternativ oder zusätzlich können gewebespezifische regulatorische Elemente mit der codierenden Region fusioniert werden, um die gewebespezifische Expression des Transgens zu erlauben. Die DNA wird in einer geeignet gepufferten Lösung in eine Mikroinjektionsnadel (die mit einem Pipettenzieher aus einem Kapillarröhrchen hergestellt werden kann) gegeben, und das zu injizierende Ei wird in einen eingedellten Objektträger gegeben. Die Nadel wird in den Pronucleus des Eis eingeführt und die DNA-Lösung injiziert. Das injizierte Ei wird dann in den Eileiter einer scheinträchtigen Maus (eine Maus, die durch die geeigneten Hormone zu scheinbarer Trächtigkeit stimuliert wird, die aber in Wirklichkeit nicht trächtig ist) transferiert, aus dem es in den Uterus weiterwandert, sich einnistet und sich über die normale Schwangerschaftszeit entwickelt. Wie vorstehend bemerkt, ist die Mikroinjektion nicht das einzige Verfahren zum Einschleusen von DNA in die Eizelle, und sie dient hier nur als Beispiel.
  • Diese Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet, das umfaßt: Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats mit der chemischen Verbindung unter Bedingungen, die für die Bindung geeignet sind, und Nachweisen der spezifischen Bindung der chemischen Verbindung an den Y5-Rezeptor.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren, das kompetitive Bindung einschließt, zum Bestimmen einer chemischen Verbindung, die spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet, das umfaßt: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats mit sowohl der chemischen Verbindung als auch einer zweiten chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie an den Y5-Rezeptor bindet, und nur mit der zweiten chemischen Verbindung unter Bedingungen, die für die Bindung der Verbindungen geeignet sind; und Nachweisen der spezifischen Bindung der chemischen Verbindung an den Y5-Rezeptor; wobei ein Rückgang der Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Y5-Rezeptor in Anwesenheit der chemischen Verbindung anzeigt, daß die chemische Verbindung an den Y5-Rezeptor bindet.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand spezifisch an einen Y5-Rezeptor binden kann, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit Y5-Rezeptorcodierender DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Bindung von Liganden an solche Rezeptoren erlauben, Nachweisen der Gegenwart eines beliebigen solchen, spezifisch an den Y5-Rezeptor gebundenen Liganden; und somit Bestimmung, ob der Ligand spezifisch an den menschlichen Y5-Rezeptor bindet; wobei ein solcher Y5-Rezeptor im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die in 6 gezeigte hat.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand spezifisch an einen Y5-Rezeptor binden kann, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit Y5-Rezeptorcodierender DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Bindung von Liganden an einen solchen Rezeptor erlauben, Nachweisen der Gegenwart eines beliebigen solchen, spezifisch an den Y5-Rezeptor gebundenen Liganden; und somit Bestimmung, ob der Ligand spezifisch an den menschlichen Y5-Rezeptor bindet; wobei ein solcher Y5-Rezeptor durch eine Aminosäuresequenz in der Transmembranregion gekennzeichnet ist, die 60% oder höhere Homologie mit der Aminosäuresequenz in der Transmembranregion des in 6 gezeigten Y5-Rezeptors hat.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand spezifisch an einen Y5-Rezeptor binden kann, das umfaßt: Herstellen eines Zellextraktes aus Zellen, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, Isolieren einer Membranfraktion aus dem Zellextrakt, Inkontaktbringen der Membranfraktion mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Bindung von Liganden an einen solchen Rezeptor erlauben, Nachweisen der Gegenwart des spezifisch an den Y5-Rezeptor gebundenen Liganden; und somit Bestimmung, ob der Ligand spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet.
  • In separaten Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Verfahren kann der Y5-Rezeptor ein menschlicher Y5-Rezeptor, ein Ratten-Y5-Rezeptor oder ein Hunde-Y5-Rezeptor sein.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand spezifisch an einen Y5-Rezeptor binden kann, das umfaßt: Herstellen eines Zellextraktes aus Zellen, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, Isolieren einer Membranfraktion aus dem Zellextrakt, Inkontaktbringen der Membranfraktion mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Bindung von Liganden an den menschlichen Y5-Rezeptor erlauben, Nachweisen der Gegenwart des spezifisch an den Y5-Rezeptor gebundenen Liganden; und somit Bestimmung, ob der Ligand spezifisch an den Y5-Rezeptor binden kann.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand spezifisch an einen Y5-Rezeptor binden kann, das umfaßt: Herstellen eines Zellextraktes aus Zellen, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, Isolieren einer Membranfraktion aus dem Zellextrakt, Inkontaktbringen der Membranfraktion mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Bindung von Liganden an den menschlichen Y5-Rezeptor erlauben, Nachweisen der Gegenwart des spezifisch an den Y5-Rezeptor gebundenen Liganden; und somit Bestimmung, ob der Ligand spezifisch an den Y5-Rezeptor binden kann; wobei ein solcher Y5-Rezeptor im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die in 6 gezeigte hat.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand spezifisch an einen Y5-Rezeptor binden kann, das umfaßt: Herstellen eines Zellextraktes aus Zellen, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, Isolieren einer Membranfraktion aus dem Zellextrakt, Inkontaktbringen der Membranfraktion mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Bindung von Liganden an den Y5-Rezeptor erlauben, Nachweisen der Gegenwart des spezifisch an den Y5-Rezeptor gebundenen Liganden; und somit Bestimmung, ob der Ligand spezifisch an den Y5-Rezeptor binden kann; wobei ein solcher Y5-Rezeptor durch eine Aminosäuresequenz in der Transmembranregion gekennzeichnet ist, die 60% oder höhere Homologie mit der Aminosäuresequenz in der Transmembranregion des in 6 dargestellten Y5-Rezeptors aufweist.
  • In separaten Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Verfahren kann der Y5-Rezeptor ein menschlicher Y5-Rezeptor, ein Ratten-Y5-Rezeptor oder ein Hunde-Y5-Rezeptor sein. In einer Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Verfahren ist der Ligand vorher nicht bekannt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Agonist ist, das umfaßt: Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats mit der chemischen Verbindung unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und Nachweis einer Zunahme der Y5-Rezeptor-Aktivität, und somit zu bestimmen, ob die chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Agonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet und diesen aktiviert, das umfaßt: Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind, und Messung einer Second-Messenger-Antwort in Gegenwart und in Abwesenheit der chemischen Verbindung, wobei eine Veränderung der Second-Messenger-Antwort in Gegenwart der chemischen Verbindung anzeigt, daß die chemische Verbindung den Y5-Rezeptor aktiviert.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand ein Y5-Rezeptor-Agonist ist, das umfaßt: Herstellen eines Zellextraktes aus Zellen, die mit Y5-Rezeptorcodierender DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, Isolieren einer Membranfraktion aus dem Zellextrakt, Inkontaktbringen der Membranfraktion mit dem Liganden unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und Nachweisen einer Zunahme der Y5-Rezeptor-Aktivität; und dadurch zu bestimmen, ob der Ligand ein Y5-Rezeptor Agonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit dem Liganden in Gegenwart eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten, wie PYY oder NPY, unter Bedingungen, die die Aktivierung einer funktionellen Y5-Rezeptor-Antwort erlauben, Feststellen einer Abnahme der Y5-Rezeptor-Aktivität; und dadurch Bestimmung, ob der Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit dem Liganden in Gegenwart eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten, wie PYY oder NPY, unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, Feststellen einer Abnahme der Y5-Rezeptor-Aktivität; und dadurch Bestimmung, ob der Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob ein Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist, das umfaßt: Herstellung eines Zellextraktes aus Zellen, die mit Y5-Rezeptorcodierender DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, Isolieren einer Membranfraktion aus dem Zellextrakt, Inkontaktbringen der Membranfraktion mit dem Liganden in Gegenwart eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten, wie PYY, unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben; und Nachweis einer Abnahme der Y5-Rezeptor-Aktivität; und dadurch bestimmen, ob der Ligand ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  • In separaten Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Verfahren kann der Y5-Rezeptor ein menschlicher Y5-Rezeptor, ein Ratten-Y5-Rezeptor oder ein Hunde-Y5-Rezeptor sein.
  • In einer Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Verfahren ist die Zelle nichtneuronalen Ursprungs. In einer weiteren Ausführungsform ist die nichtneuronale Zelle eine COS-7-Zelle, eine menschliche embryonale 293-Nierenzelle, eine NIH-3T3-Zelle oder eine LM(tk-)-Zelle.
  • In einer Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Verfahren ist der Ligand vorher nicht bekannt.
  • Diese Erfindung liefert einen Y5-Rezeptor-Agonisten, der mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren nachgewiesen wird. Diese Erfindung liefert einen Y5-Rezeptor-Antagonisten, der mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren nachgewiesen wird.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie an den Y5-Rezeptor binden, um eine Verbindung zu bestimmen, die spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet, das umfaßt: (a) Inkontaktbringen einer Zelle, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit einer Verbindung, von der bekannt ist, daß sie spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet; (b) Inkontaktbringen des Präparates aus Schritt (a) mit der Vielzahl von Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie spezifisch an den Y5-Rezeptor binden, unter Bedingungen, die die Bindung von Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie an den Y5-Rezeptor binden, erlauben; (c) Feststellen, ob die Bindung der Verbindung, die bekanntermaßen, an den Y5-Rezeptor bindet, in Gegenwart der Verbindungen gegenüber der Bindung der Verbindung in Abwesenheit der Vielzahl von Verbindungen verringert ist; und wenn ja (d) getrenntes Bestimmen der Bindung jeder einzelnen Verbindung aus der Vielzahl von Ver bindungen an den Y5-Rezeptor; und dadurch Bestimmen der Verbindung, die spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren, das kompetitive Bindung einschließt, zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, die spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet, das umfaßt: Getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparates mit sowohl einer chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie spezifisch an den Y5-Rezeptor bindet, als auch einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie spezifisch an den Y5-Rezeptor binden, und nur mit der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie an den Y5-Rezeptor bindet, unter Bedingungen, die für die Bindung der Verbindungen geeignet sind; Nachweisen der spezifischen Bindung der Vielzahl von chemischen Verbindungen; wobei ein Rückgang der Bindung der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen an den Y5-Rezeptor bindet, in Anwesenheit der Vielzahl von chemischen Verbindungen anzeigt, daß mindestens eine chemische Verbindung aus der Vielzahl der chemischen Verbindungen an den Y5-Rezeptor bindet; und getrenntes Nachweisen der Bindung jeder chemischen Verbindung aus der Vielzahl der chemischen Verbindungen an den Y5-Rezeptor.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet und ihn aktiviert, das umfaßt: Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpraparats mit einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie an den Y5-Rezeptor binden und ihn aktivieren, unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind; Messen einer Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit und Abwesenheit der Vielzahl von chemischen Verbindungen; wobei eine Änderung der Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit der Vielzahl von chemischen Verbindungen anzeigt, daß mindestens eine chemische Verbindung aus der Vielzahl von chemischen Verbindungen den Y5-Rezeptor aktiviert; und getrenntes Bestimmen, ob jede Verbindung aus der Vielzahl von Verbindungen an den Y5-Rezeptor bindet und ihn aktiviert.
  • In einer Ausführungsform umfaßt die Second-Messenger-Antwort Adenylatcyclase-Aktivität, und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ist eine Abnahme der Adenylatcyclase-Aktivität. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Second-Messenger-Antwort die intrazelluläre Calciumkonzentration, und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ist eine Zunahme der intrazellulären Calciumkonzentration.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist, das umfaßt: Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats mit der chemischen Verbindung in Anwesenheit eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und Nachweisen eines Rückgangs der Y5-Rezeptor-Aktivität, um dadurch zu bestimmen, ob die chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet und seine Aktivierung hemmt, das umfaßt: Getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats mit sowohl der chemischen Verbindung und einer zweiten chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, als auch nur mit der zweiten chemischen Verbindung unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind, und Messen einer Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von nur der zweiten chemischen Verbindung und in Anwesenheit von sowohl der zweiten chemischen Verbindung als auch der chemischen Verbindung, wobei eine kleinere Änderung der Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung anzeigt, daß die chemische Verbindung die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen, ob eine chemische Verbindung spezifisch an einen Y5-Rezeptor bindet und seine Aktivierung hemmt, das umfaßt: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen oder des Membranpräparats mit sowohl einer chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, als auch einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmen, und mit nur der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind, und Messen einer Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von nur der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, und in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, als auch der Vielzahl von chemischen Verbindungen; wobei eine kleinere Änderung der Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert, als auch der Vielzahl von chemischen Verbindungen gegenüber jener bei Anwesenheit von nur der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen den Y5-Rezeptor aktiviert, anzeigt, daß mindestens eine chemische Verbindung aus der Vielzahl von chemischen Verbindungen die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmt; und getrenntes Bestimmen ob jede Verbindung aus der Vielzahl der chemischen Verbindungen an den Y5-Rezeptor spezifisch bindet und seine Aktivierung hemmt.
  • In separaten Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist der Y5-Rezeptor ein menschlicher Y5-Rezeptor, ein Ratten-Y5-Rezeptor oder ein Hunde-Y5-Rezeptor. In einer Ausführungsform ist die Zelle eine Säugerzelle. In einer weiteren Ausführungsform ist die Zelle nicht-neuronalen Ursprungs. In einer weiteren Ausführungsform ist die Zelle eine COS-7-Zelle, eine menschliche embryonale 293-Nierenzelle, eine LM(tk-)-Zelle oder eine NIH-3T3-Zelle.
  • In separaten Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen Verfahrens umfaßt die Second-Messenger-Antwort Adenylatcyclase-Aktivität, und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ist ein geringeres Absinken des Adenylatcyclase-Aktivitätsspiegels in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, und der Vielzahl von chemischen Verbindungen, gegenüber jener bei Anwesenheit von nur der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Second-Messenger-Antwort die intrazelluläre Calciumkonzentration, und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ist ein geringerer Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert, und der Vielzahl von chemischen Verbindungen, gegenüber jener bei Anwesenheit von nur der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, daß sie den Y5-Rezeptor aktiviert.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu bestimmen, die spezifisch an einen menschlichen Y5-Rezeptor auf der Oberfläche einer Zelle binden, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen unter Bedingungen, die die Bindung von Wirkstoffen an den menschlichen Y5-Rezeptor erlauben, Bestimmen jener Wirkstoffe, die spezifisch an die transfizierte Zelle binden; und dadurch Bestimmung von Wirkstoffen, die spezifisch an den menschlichen Y5-Rezeptor binden.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu bestimmen, die als Agonisten eines Y5-Rezeptors agieren, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit einer Y5-Rezeptor-codierenden DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen unter Bedingungen, die die Aktivierung einer funktionellen Y5-Rezeptor-Antwort erlauben, Bestimmen jener Wirkstoffe, die einen solchen Rezeptor in der Zelle aktivieren; und dadurch Bestimmung von Wirkstoffen, die als Y5-Rezeptor-Agonisten wirken.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu bestimmen, die als Agonisten eines menschlichen Y5-Rezeptors agieren, das umfaßt: Inkontaktbringen einer Zelle, die mit einer menschlichen Y5-Rezeptor-codierenden DNA transfiziert wurde und diese exprimiert, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen unter Bedingungen, die die Aktivierung einer funktionellen menschlichen Y5-Rezeptor-Antwort erlauben, Bestimmen jener Wirkstoffe, die einen solchen Rezeptor in der Zelle aktivieren; und dadurch Bestimmen von Wirkstoffen, die als menschliche Y5-Rezeptor-Agonisten wirken.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu bestimmen, die als Y5-Rezeptor-Antagonisten wirken, das umfaßt: Inkontaktbringen von Zellen, die mit Y5-Rezeptor-codierender DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen in Gegenwart eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten, wie PYY oder NPY, unter Bedingungen, die die Aktivierung einer funktionellen Y5-Rezeptor-Antwort erlauben, Bestimmen jener Wirkstoffe, die die Aktivierung des Rezeptors in der Säugerzelle hemmen; und dadurch Bestimmen der Wirkstoffe, die als Y5-Rezeptor-Antagonisten wirken.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Absuchen von Wirkstoffen, um Wirkstoffe zu bestimmen, die als menschliche Y5-Rezeptor-Antagonisten wirken, das umfaßt: Inkontaktbringen von Zellen, die mit einer menschlichen Y5-Rezeptor codierenden DNA transfiziert wurden und diese exprimieren, mit einer Vielzahl von Wirkstoffen in Gegenwart von einem bekannten menschlichen Y5-Rezeptor-Agonisten, wie PYY oder NPY, unter Bedingungen, die die Aktivierung einer funktionellen menschlichen Y5-Rezeptor-Antwort erlauben, Bestimmen jener Wirkstoffe, die die Aktivierung des Rezeptors in der Säugerzelle hemmen; und dadurch Bestimmung von Wirkstoffen, die als menschliche Y5-Rezeptor-Antagonisten wirken. In einer Ausführungsform ist die Zelle nicht-neuronalen Ursprungs. In einer weiteren Ausführungsform ist die Zelle eine COS-7-Zelle, eine menschliche embryonale 293-Nierenzelle, eine LM(tk-)-Zelle oder eine NIH-3T3-Zelle.
  • Diese Erfindung liefert eine Arzneimittelzusammensetzung, die einen Wirkstoff, der mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt wurde, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Nachweisen der Expression des Y5-Rezeptors durch Nachweisen von mRNA, die den Y5-Rezeptor codiert, das umfaßt: Gewinnung der Gesamt-mRNA der Zelle und Inkontaktbringen der so erhaltenen mRNA mit der vorstehend beschriebenen Nucleinsäurensonde unter hybridisierenden Bedingungen, Nachweisen der Gegenwart von mit der Sonde hybridisierter mRNA; und dadurch Nachweis der Expression des Y5-Rezeptors durch die Zelle.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung einer Abnormität bei einem Individuum, bei dem die Abnormität durch die Hemmung eines Y5-Rezeptors gelindert wird, das die Verabreichung an ein Individuum einer wirksamen Menge der vorstehend beschriebenen Arzneimittelzusammensetzung, die eine Hemmung des Y5-Rezeptors bei dem Individuum bewirkt, umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung einer Abnormität bei einem Individuum, bei dem die Abnormität durch die Aktivierung eines Y5-Rezeptors gelindert wird, das die Verabreichung an ein Individuum einer wirksamen Menge der vorstehend beschriebenen Arzneimittelzusammensetzung, die eine Aktivierung des Y5-Rezeptors bei dem Individuum bewirkt, umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung einer Abnormität bei einem Individuum, bei dem die Abnormität durch die Hemmung eines Y5-Rezeptors gelindert wird, das die Verabreichung an das Individuum einer wirksamen Menge von Y5-Rezeptor-Antagonist umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung einer Abnormität bei einem Individuum, bei dem die Abnormität durch die Aktivierung eines Y5-Rezeptors gelindert wird, das die Verabreichung an das Individuum einer wirksamen Menge eines Y5-Rezeptor-Agonisten umfaßt. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Anorexie. In einer separaten Ausführungsform ist der abnorme Zustand eine sexuelle/Vermehrungs-Störung. In einer anderen Ausführungsform ist der abnorme Zustand eine Depression. In einer anderen Ausführungsform ist der abnorme Zustand Angstzustand.
  • In einer Ausführungsform ist der abnorme Zustand ein Magengeschwür. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Gedächtnisverlust. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Migräne. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Schmerz. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand ein epileptischer Anfall. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Bluthochdruck. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Gehirnblutung. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Schock. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand kongestives Herzversagen. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Schlafstörung. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Nasenkongestion. In einer weiteren Ausführungsform ist der abnorme Zustand Durchfall.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung von Fettleibigkeit bei einem Individuum, das die Verabreichung an das Individuum einer wirksamen Menge eines Y5-Rezeptor-Antagonisten umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung von Anorexie bei einem Individuum, das die Verabreichung an das Individuum einer wirksamen Menge eines Y5-Rezeptor-Agonisten umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung von Bulimia nervosa bei einem Individuum, das die Verabreichung an das Individuum einer wirksamen Menge eines Y5-Rezeptor-Antagonisten umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren, um ein Individuum zum Essen zu verleiten, das die Verabreichung an das Individuum einer wirksamen Menge eines Y5-Rezeptor-Agonisten umfaßt. In einer Ausführungsform ist das Individuum ein Wirbeltier. In einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Mensch.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Erhöhung der Aufnahme eines Nahrungsmittels durch ein Individuum, das eine Zusammensetzung aus dem Nahrungsmittel und einer wirksamen Menge eines Y5-Rezeptor-Agonisten umfaßt. In einer Ausführungsform ist das Individuum ein Wirbeltier. In einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Mensch.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung von Abnormitäten, die durch Verringerung der Aktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors gelindert werden, das die Verabreichung an ein Individuum einer Menge der vorstehend beschriebenen Arzneimittelzusammensetzung, die die Verringerung der Aktivität von menschlichem Y5-Rezeptor bewirkt, umfaßt, und dadurch Abnormitäten zu lindern, die von der Überaktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors herrühren.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart eines menschlichen Y5-Rezeptors auf der Oberfläche einer Zelle in vitro, das umfaßt: Inkontaktbringen der Zelle mit dem Antikörper, der an den menschlichen Y5-Rezeptor binden kann, unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an den Rezeptor erlauben, Nachweisen der Gegenwart des an die Zelle gebundenen Antikörpers; und dadurch Nachweis der Gegenwart eines menschlichen Y5-Rezeptors auf der Oberfläche der Zelle.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen der physiologischen Auswirkungen eines variierenden Aktivitätsspiegels eines menschlichen Y5-Rezeptors, das die Erzeugung eines transgenen, nicht-menschlichen Säugers, dessen Spiegel menschlicher Y5-Rezeptor-Aktivität durch Verwendung eines induzierbaren Promoters, der die menschliche Y5-Rezeptor-Expression reguliert, variiert wird.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen der physiologischen Auswirkungen eines variierenden Aktivitätsspiegels eines menschlichen Y5-Rezeptors, das die Erzeugung einer Palette von transgenen, nicht-menschlichen Säugern umfaßt, die alle verschiedene Mengen menschlichen Y5-Rezeptors exprimieren.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen einer Substanz, die in der Lage ist, die Abnorntäten zu lindern, die aus der Überaktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors herrühren, das die Verabreichung einer Substanz an die vorstehend beschriebenen transgenen, nicht-menschlichen Säuger und die Bestimmung, ob die Substanz die physischen und Verhaltensabnormitäten lindert, die die transgenen nicht-menschlichen Säuger infolge von Überaktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors aufweisen.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zum Bestimmen einer Substanz, die in der Lage ist, die Abnormitäten zu lindern, die aus der Unteraktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors herrühren, das umfaßt: Verabreichung der Substanz an die vorstehend beschriebenen transgenen nicht-menschlichen Säuger und Bestimmen, ob die Substanz die physischen und Verhaltensabnormitäten lindert, die die transgenen nicht-menschlichen Säuger infolge von Unteraktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors aufweisen.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Behandlung der Abnormitäten, die aus der Unteraktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors herrühren, das die Verabreichung an ein Individuum einer Menge der vorstehend beschriebenen Arzneimittelzusammensetzung, die eine Linderung der von einer Unteraktivität eines menschlichen Y5-Rezeptors herrührenden Abnormitäten bewirkt, umfaßt.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Diagnose einer Veranlagung zu einer Krankheit, die mit der Aktivität eines spezifischen menschlichen Y5-Rezeptor-Allels einhergeht, das umfaßt: a) Gewinnung von DNA von Individuen, die an der Krankheit leiden; b) Durchführung einer Restriktionsverdauung der DNA mit einer Palette von Restriktionsenzymen; c) elektrophoretische Trennung der so erhaltenen DNA-Fragmente auf einem Größenausschlußgel; d) Inkontaktbringen des erhaltenen Gels mit einer Nucleinsäurensonde, die in der Lage ist, spezifisch mit DNA zu hybridisieren, die einen menschlichen Y5-Rezeptor codiert, und die mit einem feststellbaren Marker markiert ist; e) Feststellung markierter Banden, die mit der einen menschlichen Y5-Rezeptor codierenden, mit einem feststellbaren Marker markierten DNA hybridisiert haben und so ein einzigartiges Bandenmuster erzeugt haben, das für die DNA von Personen spezifisch ist, die an der Krankheit leiden; f) Präparation der durch die Schritte a–e erhaltenen DNA für die Diagnose; und g) Vergleichen des einzigartigen, für die DNA von Personen, die an der Krankheit leiden, spezifischen Bandenmusters aus Schritt e mit der aus Schritt f für die Diagnose gewonnenen DNA um festzustellen, ob die Muster gleich oder verschieden sind, und dadurch die Veranlagung für die Krankheit zu diagnostizieren, wenn die Muster die gleichen sind. In einer Ausführungsform wird eine Krankheit, die mit der Aktivität eines spezifischen menschlichen Y5-Rezeptor-Allels assoziiert ist, diagnostiziert.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Y5-Rezeptors, das umfaßt: a) Plazieren der Wirtszelle in geeignete Bedingungen, die die Produktion des Y5-Rezeptors erlauben; b) Wiedergewinnung des so von den Wirtszellen erzeugten Rezeptors; und c) Reinigung des so wiedergewonnenen Rezeptors.
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Herstellung des gereinigten menschlichen, Ratten-, oder Hunde-Y5-Rezeptors, das umfaßt: a) Konstruktion eines Vektors, der an die Expression in einer Zelle angepaßt ist, die die regulatorischen Elemente, die für die Expression von Nucleinsäuren in der Zelle nötig sind und funktionell mit der den menschlichen, Ratten-, oder Hunde-Y5-Rezeptor codierenden Nucleinsäure verbunden sind, um deren Expression zu erlauben; wobei die Zelle aus der Gruppe bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen ausgewählt wird; b) Einschleusen des Vektors aus Schritt a in eine geeignete Wirtszelle; c) Inkubation der Zellen aus Schritt b unter Bedingungen, die die Expression von menschlichem, Ratten- oder Hunde-Y5-Rezeptor erlauben; d) Wiedergewinnung des so hergestellten Rezeptors; und e) Reinigen des so wiedergewonnenen Rezeptors; und dadurch Herstellung eines menschlichen, Ratten- oder Hunde-Y5-Rezeptors.
  • Diese Erfindung wird durch die im folgenden dargelegten Versuchsdetails besser verstanden werden. Jedoch wird der Fachmann leicht begreifen, daß die spezifischen Verfahren und Ergebnisse nur zur Veranschaulichung der Erfindung, die vollständiger in den anschließendem Patentansprüchen beschrieben ist, dienen.
  • Versuchsdetails
  • Materialien und Methoden
  • cDNA-Clonierung
  • Die Gesamt-RNA wurde durch eine Modifikation des Guanidin-Thiocyanat-Verfahrens (Kingston, 1987) aus 5 g Ratten-Hypothalamus (Rocklund, Gilbertsville, PA) gewonnen. Poly-A+-RNA wurde mit einem FastTrack-Kit (Invitrogen Corp., San Diego, CA) gereinigt. Doppelsträngige (ds-) cDNA wurde aus 7 μg Poly-A+-RNA gemäß Gubler und Hoffman (Gubler und Hoffman, 1983) synthetisiert, mit Ausnahme der Tatsache, daß die Ligase bei der Synthese des zweiten cDNA-Stranges weggelassen wurde. Die so erhaltene ds-cDNA wurde an BstxUEco RI-Adapter (Invitrogen Corp.) ligiert, der Adapterüberschuß wurde durch Chromatographie auf Sephacryl 500 HR (Pharmacia-LKB) entfernt, und die ds-cDNA-Größe auf einer Gen-Pak Fax HPLC-Säule (Millipore Corp., Milford, MA) selektiert. Die Fraktionen mit hohem Molekulargewicht wurden in pEXJ.BS (ein cDNA Clonierungs-Expressionsvektor, der von pcEXV-3 abgeleitet ist; Okayama und Berg, 1983; Miller und Germain, 1986) ligiert, mit Bstxl wie von Aruffo und Seed beschrieben (Aruffo und Seed, 1987) geschnitten. Die ligierte DNA wurde in E. Coli MC 1061 F+ (Gene Pulser, Biorad) elektroporiert. Insgesamt konnten 3,4 × 106 unabhängige Clone mit einer mittleren Insertgröße von 2,7 kb erzeugt werden. Die Bank wurde in Zusammenfassungen (Pools) von 6,9 bis 8,2 × 103 unabhängigen Clonen auf Petrischalen ausplattiert (Ampicillinselektion). Nach 18-ständiger Amplifikation wurden die Bakterien von jeder Zusammenfassung abgeschabt, in 4 ml LB-Medium resuspendiert, und 1,5 ml wurden zur Plasmidreinigung mit einem QIAprep-8-Plasmidkit (Qiagen Inc, Chatsworth, CA) behandelt. Von jeder bakteriellen Zusammenfassung wurden 1 ml-Aliquote bei –85°C in 20% Glycerin aufbewahrt.
  • Isolierung eines cDNA Clons, der einen atypischen Ratten-Hypothalamus-NPY5-Rezeptor codiert
  • DNA aus Zusammenfassungen von ≅ 7500 unabhängigen Clones wurde durch ein modifiziertes DEAE-Dextran-Verfahren (Warden und Thorne, 1968) in COS-7-Zellen transfiziert. Die COS-7-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), angereichert mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin (DMEM-C) bei 37°C in 5% CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden einen Tag vor der Transfekti on bei einer Dichte von 30 000 Zellen/cm2 auf Lab-Tek-Kammerobjektträgern (1 Kammer, Permanox Objektträger von Nunc Inc., Naperville, IL) ausgebracht. Am nächsten Tag wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, und 735 μl der Transfektionsflüssigkeit, die 1/10 der DNA von jeder Zusammenfassung und DEAE-Dextran (500 μg/ml) in serumfreiem Medium Opti-MEM I (Gibco® BRL LifeTechnologies Inc. Grand Island, NY) enthielt, wurden hinzugefügt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37°C wurden 3 ml Chloroquin (80 μM in DMEM-C) hinzugefügt und die Zellen weitere 2,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde aus der Kammer abgesaugt, und 2 ml 10% DMSO in DMEM-C wurden hinzugefügt. Nach 2,5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Medium abgesaugt, jede Kammer einmal mit 2 ml PBS gespült die Zellen 48 Stunden in DMEM-C inkubiert und der Bindungstest auf den Objektträgern durchgeführt. Nach einem Waschvorgang mit PBS wurden positive Zusammenfassungen durch einstündige Inkubation der Zellen bei Raumtemperatur mit 1 nM (3 × 106 cpm pro Objektträger) Schweine-[125I]-PYY (NEN; spezifische Aktivität = 2200 Ci/mmol) in 20 mM Hepes-NaOH, pH 7.4, CaCl2 1,26 mM, MgSO4 0,81 mM, KHP2O4 0,44 mM, KCl 5,4, NaCl 10 mM, ,1% BSA, 0,1% Bacitracin bestimmt. Nach sechs Waschgängen (je drei Sekunden) in Bindungspuffer ohne Ligand wurden die einzelligen Schichten in 2,5% Glutaraldehyd in PBS fünf Minuten lang fixiert, zweimal zwei Minuten in PBS gewaschen, je zwei Minuten lang in Ethanolbädern (70, 80, 95, 100%) entwässert und an der Luft getrocknet. Die Objektträger wurden dann bei 42°C in 100% Photoemulsion (Kodak Typ NTB2) getaucht und im Dunkel 48 Stunden lang bei 4°C in lichtdichten Boxen mit Drierit belichtet. Die Objektträger wurden drei Minuten lang in Kodak D19 Entwickler (32 g/l Wasser) entwickelt, in Wasser gespült, 5 Minuten lang in Kodak-Fixierer fixiert, in Wasser gespült, an der Luft getrocknet und mit Aqua-Mount (Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA) auf Objektträger aufgezogen. Die Objektträger wurden bei 25 × Gesamtvergrößerung abgesucht. Ein einzelner Clon, CG-18, wurde durch SIB-Selektion wie beschrieben isoliert (Mc Cormick, 1987). Die ds-DNA wurde mit einem Sequenase-Kit (US Biochemical, Cleveland, OH) nach Angaben des Herstellers sequenziert. Die Nucleotid- und Peptid-Sequenzanalyse geschahen mit GCG-Programmen (Genetics Computer Group, Madison, WI).
  • Isolation des menschlichen Y5-Homologen
  • Unter Verwendung von Ratten-Oligonucleotid-Primern in TM 3 (Sinn-Primer; Position 484-509 in 1A) und in TM 6 (Gegensinn-Primer; Position 1219–1243 in 3A), suchten die Patentanmelder eine menschliche hippocampale cDNA-Bank mittels Polymerase- Kettenreaktion ab. 1 μl (4 × 106 Bakterien) von jeder von 450 amplifizierten Zusammenfassungen, die jeweils = 5000 unabhängige Clone enthielten, was einer Geamtzahl von 2,2 × 106 entsprach, wurden direkt 40 Zyklen PCR unterworfen und die so erhaltenen Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Eine von drei positiven Zusammenfassungen wurde weiter analysiert, und durch SIB-Selektion wurde ein einzelner cDNA-Clon isoliert und charakterisiert. Es zeigte sich, daß diese cDNA die volle Länge und die korrekten Anordnung für eine Expression hatte. Die ds-DNA wurde mit einem Sequenase-Kit (US Biochemical, Cleveland, OH) nach Herstellerangaben sequenziert.
  • Isolation des Hunde-Y5-Homologen
  • Eine Anordnung der codierenden Nucleotidsequenzen der Ratten- und Menschen-Y5-Rezeptoren wurde zum Synthetisieren eines Paares PCR-Primer verwendet. Eine Region stromaufwärts von TM III, die zwischen Ratten und Menschen zu 100% konserviert ist, wurde zum Synthetisieren des Vorwärts-Primers CH 156 gewählt:
  • Figure 00380001
  • Eine Region am Carboxy-Ende der 5-6-Loop, unmittelbar stromaufwärts von TM6, die zwischen Ratten und Menschen ebenfalls zu 100% konserviert ist, wurde zum Synthetisieren des Rückwärts-Primers CH 153 gewählt:
  • Figure 00380002
  • Die Primer CH 156-CH 153 wurden zur Amplifikation von 10 ng Poly-(A+)-RNA aus Rattenhirn benützt, die mit Hilfe der reversen Transkriptase SSII (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) revers transkribiert wurde. Die PCR wurde an einzelsträngiger cDNA mit Taq-Polymerase (Perkin Elmer – Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) unter folgenden Bedingungen vorgenommen: 1 min bei 94°C, 1 min bei 60°C und 1 min bei 72°C für 40 Zyklen. Das so erhaltene 798 bp-PCR-DNA-Fragment wurde in pCR Script (Stratagene, La Jolla, CA) subcloniert und mit einem Sequenase-Kit (USB, Cleveland, OH) sequenziert; es wird als Y5-bd-5 bezeichnet.
  • 3'- und 5'-RACE
  • Die fehlenden 3'- und 5'-Enden der Y5-Rezeptor-Sequenzen von Beagle-Hunden wurden durch 3'- und 5'-RACE mit einem Marathon cDNA-Amplifikations-Kit (Clontech, Palo Alto, CA) isoliert. Aus der Sequenz des vorstehend beschriebenen Beagle-PCR-DNA-Fragmentes wurden folgende PCR-Primer synthetisiert:
  • (3'-RACE)
    Figure 00390001
  • (5'-RACE)
    Figure 00390002
  • Die 3'- und 5'-RAGE-Reaktionen wurden an Thalamus-cDNA von Beagle-Hunden nach den Spezifikationen des Kits mit den vorstehend beschriebenen Primern ausgeführt. Die so erhaltenen PCR-DNA Produkte (Schmier von 0,7 bis 10 kb) wurden von einem Agarosegel gereinigt und mit den vorstehend beschriebenen „nested" Primern reamplifiziert. Die so erhaltene DNA-Banden wurden wieder von einem Agarosegel gereinigt und in pCR Script (Stratagene, La Jolla, CA) subcloniert.
  • Es wurde die dem 3'-Ende der cDNA entsprechende Nucleotidsequenz bestimmt, und das Plasmid als Y5-bd-8 bezeichnet. Die dem 5'-Ende entsprechende Nucleotidsequenz wird in naher Zukunft bestimmt werden. Jene Nucleotidsequenzen werden dann dazu benützt werden, um mit Hilfe der Expand High Fidelity Polymerase (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN) exakte Primer gegen die Initiations- und Stoppcodon-Regionen zu synthetisieren, und jene exakten Primer werden dann zur Amplifikation von Hunde-Thalamus-cDNA benützt werden, um so ein PCR-Produkt erzeugen, das der vollen Länge der codierenden Region des Hunde-Y5-Rezeptors entspricht. Das so erhaltene PCR-DNA-Produkt wird im Expressionsvektor pEXJ subcloniert werden, und die ganze codierende Region der Hunde-Y5-Nucleotidsequenz wird mit einem Sequenase-Kit (USB, Cleveland, OH) bestimmt werden.
  • Northern Blots
  • Mehrfach-Northern-Blots aus menschlichem Hirngewebe (MTN blots II und III, Clontech, Palo Alto, CA), die aus verschiedenen menschlichen Gehirnzonen gereinigte mRNA enthiel ten, wurden mit hoher Stringenz gemäß den Spezifikationen des Herstellers hybridisiert. Die Sonde war ein 0,8 kb-DNA-PCR-Fragment, das dem TM III-Carboxy-Ende der 5-6-Loop in der codierenden Region des menschlichen Y5-Rezeptor Subtyps entspricht.
  • Ein Mehrfach-Northern-Blot aus Rattengewebe (rat MTN blot, Clontech, Palo Alto, CA), der aus verschiedenen Rattengeweben gereinigte mRNA enthielt, wurde mit hoher Stringenz gemäß den Spezifikationen des Herstellers hybridisiert. Die Sonde war ein 0,8 kb-DNA-PCR-Fragment, das dem TM III-Carboxy-Ende der 5-6-Loop in der codierenden Region des Ratten-Y5-Rezeptor-Subtyps entspricht.
  • Southern Blot
  • Southern Blots (Geno-Blot, Clontech, Palo Alto, CA), die mit fünf verschiedenen Enzymen (8 μg DNA pro Reihe) geschnittene, genomische menschliche oder Ratten-DNA enthielten, wurden bei hoher Stringenz gemäß den Spezifikationen des Herstellers hybridisiert. Die Sonde war ein, 8 kb-DNA-PCR-Fragment, das dem TM III-Carboxy-Ende der 5-6-Loop in der codierenden Region des menschlichen und Ratten-Y5-Rezeptor-Subtyps entspricht.
  • Erzeugung von rekombinantem Baculovirus
  • Eine Bam HI-Stelle unmittelbar 5' vom Start-Methionin des menschlichen Y5 wurde gentechnisch behandelt, indem die anfänglichen ≅ 100 Basenpaare von hY5 (d. h. vom Startmethionin bis zu einer internen EcoR-Stelle) durch zwei überlappende, synthetisch abgeleitete Oligonucleotide (jeweils = 100 Basen), die eine 5'-Bam HI- und eine 3'-Eco RI-Stelle enthalten. Dies erlaubte die Isolation eines ≅ 1,5 kb Bam HI/Hind III-Fragmentes, das die codierende Region von hY5 enthielt. Dieses Fragment wurde in pBlueBacIIITM in die im Polylinker vorkommenden Bam HUHind III-Stellen subcloniert (das Konstrukt wurde pBB/hY5 benannt). Zur Erzeugung von Baculovirus wurden 0,5 g viraler DNA (BaculoGoldTM) und 3 μg pBB/hY5 durch Calciumphosphat-Co-Präzipitationsverfahren in 2 × 106 Spodoptera frugiperda Sf9-Insektenzellen co-transfiziert, wie in „Baculovirus Expression Vector System: Procedures and Methods Manual" von Pharmingen umrissen. Die Zellen wurden 5 Tage lang bei 27°C inkubiert. Der Überstand der Co-Transfektionsschale wurde durch Zentrifugieren aufgenommen und das rekombinante Virus (hY5BB3) plaquegereinigt. Die Vorgehensweisen, Zellen mit Viren zu infizieren, Virenvorräte anzulegen und die Virenvorräte zu titrieren, entsprachen der Beschreibung im Pharmingen-Handbuch.
  • Zellkulturen
  • COS-7-Zellen wurden auf 150 mm-Schalen in D-MEM mit Zusätzen (Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10% Kälberserum, 4 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin/100 μg/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 gezüchtet. Die eingelagerten Schalen mit COS-7-Zellen wurden trypsinisiert und alle 3–4 Tage 1 : 6 aufgeteilt. Menschliche embryonale 293-Nierenzellen wurden auf 150 mm-Schalen in D-MEM mit Zusätzen (minimales essentielles Medium) mit Hank'schem Salz und Zusätzen (Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10% Kälberserum, 4 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin/100 μg/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 gezüchtet. Die eingelagerten Schalen von 293-Zellen wurden trypsinisiert und alle 311 Tage 1 : 6 aufgeteilt. Mäuse-Fibroblasten-LM(tk-)-Zellen wurden auf 150 mm-Schalen in D-MEM mit Zusätzen (Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10% Kälberserum, 4 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin/100 μg/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 gezüchtet. Die eingelagerten Schalen mit LM(tk-)-Zellen wurden trypsinisiert und alle 3–4 Tage 1 : 10 aufgeteilt.
  • Stabil mit dem menschlichen Y5-Rezeptor transfizierte LM(tk-)-Zellen wurden routinemäßig von einer anhaftenden Einzelzellschicht in eine lebensfähige Suspension umgewandelt. Die anhaftenden Zellen wurden am Konfluenzpunkt mit Trypsin geerntet, in einem Minimalvolumen von vollständigem DMEM für eine Zellzählung resuspendiert, und weiter bis zu einer Konzentration von 106 Zellen/ml in Suspensionsmedium (10% Kälberserum, 10% 10 × Medium 199 (Gibco), 9 mM NaHCO3, 25 mM Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin/100 μg/ml Streptomycin, und 0,05% Methylcellulose). Die Zellsuspension wurde 24 Stunden lang bei 37°C, 5% CO2 in einem Schüttelinkubator belassen. Die Membranen, die von so gezüchteten Zellen gewonnen werden, können als große, gleichförmige Chargen in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Alternativ können die Zellen in komplettem DMEM in die anhaftenden Zellkultur zurückgebracht werden, indem sie in Poly-D-Lysin- (0,01 mg/ml) beschichtete Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verteilt und anschließend 24 Stunden bei 37°C, 5% CO2 inkubiert werden. Auf diese Weise behandelte Zellen ergaben in cAMP-Radioimmuntests eine robuste und zuverlässige NPY-abhängige Reaktion, wie hier nachstehend beschrieben.
  • Embryonale Mäuse-Fibroblastenzellen NIH-3T3 wurden auf 150 mm-Schalen in D-MEM mit Zusätzen (Dulbecco's Modified Eagle Medium mit 10% Kälberserum, 4 mM Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin/100 μg/ml Streptomycin) bei 37°C, 5% CO2 gezüchtet. Die ein gelagerten Schalen mit NIH-3T3 Zellen wurden trypsinisiert und alle 3–4 Tage 1 : 15 aufgeteilt.
  • Sf9- und Sf21-Zellen wurden in Einzelzellschichten auf 150 mm-Zellkulturschalen in TMN-FH Medium, angereichert mit 10% fötalem Kälberserum, bei 27°C ohne CO2 gezüchtet. High-Five-Insektenzellen wurden auf 150 mm-Zellkulturschalen in Ex-Cell 400TM-Medium, angereichert mit L-Glutamin, ebenfalls bei 27°C, ohne CO2, gezüchtet.
  • Transiente Transfektion
  • Alle untersuchten Rezeptor-Subtypen (menschliche und Ratten-Y1, menschliche und Ratten-Y2, menschliche und Ratten-Y4, menschliche und Ratten-Y5) wurden unter Verwendung von 1 μg DNA/106 Zellen (Cullen, 1987) mit dem DEAE-Dextran-Verfahren transient in COS-7-Zellen transfiziert. Der menschliche Y1-Rezeptor wurde mittels bekannter Verfahren (Larhammar, et al., 1992) hergestellt.
  • Stabile Transfektion
  • Der menschliche Y1-, der menschliche Y2-, und der Ratten-Y5-Rezeptor wurden mit einem G-418-resistenten Gen mittels eines Calciumphosphat-Transfektionsverfahrens (Cullen, 1987) in die menschliche embryonale Nierenzellinie 293 transfiziert. Die stabil transfizierten Zellen wurden mit G-418 selektiert. In ähnlicher Weise wurden menschliche Y4- und menschliche Y5-Rezeptoren in LM(tk-)-Mäuse-Fibroblastenzellen und in NIH-3T3-Zellen transfiziert.
  • Expression anderer G-Protein gekoppelter Rezeptoren
  • Menschliche adrenergische α1-Rezeptoren: Um die Bindung von Verbindungen an menschliche α1-Rezeptoren zu bestimmen, wurden stabil mit den die α1a-, α1b- und α1dRezeptoren codierenden Genen transfizierte LM(tk-)-Zellinien verwendet. Die Nomenklatur der α1-Rezeptoren wurde neuerdings geändert, so daß der vorher α1a bezeichnete Rezeptor jetzt als α1d bezeichnet wird, und der vorher α1c bezeichnete Rezeptor jetzt als α1a (ref.) bezeichnet wird. Die Zellinien, die diese Rezeptoren exprimieren, wurden vor der Änderung der Nomenklatur bei der ATCC hinterlegt und tragen die früher verliehenen Subtypbezeichnungen dieser Rezeptoren. So wurde die Zellinie, die den hier als α1a-Rezeptor bezeichneten Rezeptor exprimiert, am 25. September 1992 under der ATCC-Zugangsnummer CRL 11140 unter der Bezeichnung L-α1c bei der ATCC hinterlegt. Die Zellinie, die den hier als α1d-Rezeptor bezeichneten Rezeptor exprimiert, wurde am 25. September 1992 under der ATCC- Zugangsnummer CRL 11138 unter der Bezeichnung L-α1A bei der ATCC hinterlegt. Die Zellinie, die den α1b-Rezeptor exprimiert, wurde als L-α1B am 25. September 1992 under der ATCC-Zugangsnummer CRL 11139 bei der ATCC hinterlegt.
  • Menschliche adrenergische α2-Rezeptoren: Um die Bindung von Verbindungen an menschliche α2-Rezeptoren zu bestimmen, wurden stabil mit den die α2a-, α2- und α2cRezeptoren codierenden Genen transfizierte LM(tk-)-Zellinien verwendet. Die Zellinie, die den α2a Rezeptor exprimiert, wurde L-α2a genannt und wurde am 6. November 1992 under der ATCC-Zugangsnummer CRL 11180 hinterlegt. Die Zellinie, die den α2b-Rezeptor exprimiert, wurde L-NGC-α2b genannt und wurde am 25. October 1989 under der ATCC-Zugangsnummer CRL 10275 hinterlegt. Die Zellinie, die den α2c Rezeptor exprimiert, wurde L-α2c genannt und wurde am 6. November 1992 under der ATCC-Zugangsnummer CRL 11181 hinterlegt. Die Zellysate wurden wie vorstehend beschrieben (vgl. „Radioligandenbindung an Membransuspensionen") hergestellt und in 25 mM Glycylglycinpuffer (pH 7.6 bei Raumtemperatur) resuspendiert. Die Gleichgewichts-Kompetitions-Bindungstests wurden mit [3H]-Rauwolscin (0,5 nM) ausgeführt, und die nichtspezifische Bindung wurde durch Inkubation mit 10 μM Phentolamin bestimmt. Der gebundene Radioligand wurde durch Filtrierung durch GF/B-Filter unter Verwendung eines Zellernters abgetrennt.
  • Menschlicher H1-Histaminrezeptor: Die codierende Sequenz des menschlichen H1-Histaminrezeptors, die jener des Rinder-H1-Rezeptors homolog ist, wurde aus einer menschlichen hippocampalen cDNA-Bank gewonnen und in den eukaryontischen Expressionsvektor pCEXV-3 cloniert. Die Plasmiden-DNA für den H1-Rezeptor wird als pcEXV-H1 bezeichnet und wurde am 6. November 1992 under ATCC-Zugangsnummer 75346 hinterlegt. Dieses Konstrukt wurde mit dem DEAE-Dextran-Verfahren in COS-7-Zellen transfziert. Die Zellen wurden nach 72 Stunden geerntet und durch Ultraschallzertrümmerung in 5 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5 lysiert. Die Zell-Lysate wurden 5 min lang bei 4°C bei 1000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde 20 min lang bei 4°C bei 30 000 × g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 37,8 mM NaHPO4, 12,2 mM KHP2O4, pH 7.5 suspendiert. Die Bindung des Histamin-H1-Antagonisten [3H]-Mepyramin (1 nM, spezifische Aktivität: 24,8 Ci/mM) wurde in einem Endvolumen von 0,25 ml ausgeführt und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die nichtspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10 μM Mepyramin bestimmt. Der gebundene Radioligand wurde durch Filtrierung durch GF/B-Filter unter Verwendung eines Zellernters abgetrennt.
  • Menschlicher H2-Histaminrezeptor: Die codierende Sequenz des menschlichen H2-Histaminrezeptors wurde aus einer menschlichen Placenta-Genombank gewonnen und in die Clonierungsstelle des eukaryontischen Expressionsvektor pCEXV-3 cloniert. Die Plasmiden-DNA für den H2-Rezeptor wird als pcEXV-H2 bezeichnet und wurde am 6. November 1992 under ATCC-Zugangsnummer 75345 hinterlegt. Dieses Konstrukt wurde mit dem DEAE-Dextran-Verfahren in COS-7-Zellen transfziert. Die Zellen wurden nach 72 Stunden geerntet und durch Ultraschallzertrümmerung in 5 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5 lysiert. Die Zell-Lysate wurden 5 min lang bei 4°C bei 1000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde 20 min lang bei 4°C bei 30 000 × g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 37,8 mM NaHPO4, 12,2 mM KHP2O4, pH 7.5 suspendiert. Die Bindung des Histamin-H1-Antagonisten [3H]-Thiotidin (5 nM, spezifische Aktivität: 70 Ci/mM) wurde in einem Endvolumen von 0,25 ml ausgeführt und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die nichtspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10 μM Histamin bestimmt. Der gebundene Radioligand wurde durch Filtrierung durch GFB-Filter unter Verwendung eines Zellernters abgetrennt.
  • Menschliche Serotoninrezeptoren:
  • 5HT1Dα-, 5HT1Dβ-, 5HT1E-, 5HT1F-Rezeptoren: Clonale LM(tk-)-Zellinien, die stabil mit Genen, die jeden dieser 5HT-Rezeptor-Subtypen codieren, transfiziert worden waren, wurden wie vorstehend beschrieben behandelt. Die Zellinie für den 5HT1Dα-Rezeptor, die als Ltk-8-30–84 bezeichnet wurde, wurde am 17. April 1990 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer CRL 10421. Die Zellinie für den 5HT1Dβ-Rezeptor, die als Ltk-11 bezeichnet wurde, wurde am 17. April 1990 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer CRL 10422. Die Zellinie für den 5HT1E-Rezeptor, die als 5-HT1E-7 bezeichnet wurde, wurde am 6. November 1991 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer CRL 10913. Die Zellinie für den 5HT1F-Rezeptor, die als L-5-HT1F bezeichnet wurde, wurde am 27. Dezember 1991 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer ATCC 10957. Die diese Rezeptoren umfassenden Membranpräparate wurden wie nachstehend beschrieben hergestellt und in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.4 bei 37°C) mit 10 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 10 μM Pargylin, und 0,1% Ascorbat suspendiert. Die Bindung von Verbindungen wurde mit kompetitiven Bindungstests durch 30-minütige Inkubation bei 37°C in der Gegenwart von 5 nM [3H]-Serotonin bestimmt. Die nichtspezifische Bindung wurde in der Gegenwart von 10 μM Serotonin bestimmt. Der gebundene Radioligand wurde durch Filtrierung durch GFB-Filter unter Verwendung eines Zellernters abgetrennt.
  • Menschlicher 5HT2-Rezeptor: Die codierende Sequenz des menschlichen 5HT2-Rezeptors wurde aus einer menschlichen Gehirncortex-cDNA-Bank gewonnen und in die Clonierungsstelle des eukaryontischen Expressionsvektor pCEXV-3 cloniert. Dieses Konstrukt wurde mit dem DEAE-Dextran-Verfahren in COS-7-Zellen transfziert. Die Zellen wurden nach 72 Stunden geerntet und durch Ultraschallzertrümmerung in 5 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5 lysiert. Diese Zellinie wurde am 31. Oktober 1989 bei der ATCC hinterlegt, als L-NGC-5HT2 bezeichnet, und erhielt die ATCC-Zugangsnummer CRL 10287. Die Zell-Lysate wurden 5 min lang bei 4°C bei 1000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde 20 min lang bei 4°C bei 30 000 × g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7.7 bei Raumtemperatur) mit 10 mM MgSO4, 0,5 mM EDTA und 0,1% Ascorbat suspendiert. Die Stärke der Alpha-1-Antagonisten an 5HT2-Rezeptoren wurde mit Gleichgewichts-Kompetitions-Bindungstests mit [3H]-Ketanserin (1 nM) bestimmt. Die nichtspezifische Bindung wurde durch Inkubation mit 10 μM Mianserin bestimmt. Der gebundene Radioligand wurde durch Filtrierung durch GF/B-Filter unter Verwendung eines Zellernters abgetrennt.
  • Menschlicher 5-HT7-Rezeptor: Es wurde wie vorstehend beschrieben eine clonale LM(tk)-Zellinie hergestellt, die stabil mit dem den 5HT7-Rezeptor-Subtyp codierenden Gen transfiziert war. Die Zellinie für den 5HT7-Rezeptor-Subtyp wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Die Zellinie für den 5HT7-Rezeptor-Subtyp wurde als L-5HT4B bezeichnet, am 20. Oktober 1992 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer CRL 11166.
  • Menschlicher Dopamin D3-Rezeptor: Die Bindung von Verbindungen an den menschlichen D3-Rezeptor wurde mit Membranpräparaten von COS-7-Zellen bestimmt, die mit dem den menschlichen D3-Rezeptor codierenden Gen transfiziert worden waren. Der menschliche Dopamin D3-Rezeptor wurde nach bekannten Verfahren (Sokoloff, P. et al., Nature 347, 146, 1990) hergestellt und bei der EMBL-Genbank als X53944 hinterlegt. Die Zellen wurden nach 72 Stunden geerntet und durch Ultraschallzertrümmerung in 5 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.5 lysiert. Die Zell-Lysate wurden 5 min lang bei 4°C bei 1000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde 20 min lang bei 4°C bei 30 000 × g zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) mit 1 mM EDTA, 5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2 4 mM MgCl2, und 0,1% Ascorbinsäure suspendiert. Die Zell-Lysate wurden mit [3H]-Spiperon (2 nM) inkubiert, und 10 μM (+)Butaclamol zur Bestimmung der nichtspezifischen Bindung verwendet.
  • Gewinnung der Membranen
  • Die Membranen wurden von COS-7-Zellen 48 Stunden nach der transienten Transfektion gewonnen. Anhaftende Zellen wurden zweimal in eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (138 mM NaCl, 8,1 mM NaHP2O4, 2,5 mM KCl, 1,2 mM KHP2O4, 0,9 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, pH 7.4) gewaschen und durch Ultraschallzertrümmerung in eiskaltem Ultraschallzertrümmerungspuffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 7.7) lysiert. Große Teilchen und Zellreste wurden durch Zentrifugierung bei niedriger Geschwindigkeit (200 × g, 5 min, 4°C) beseitigt. Die Membranen wurden aus der Überstandsfraktion durch Zentrifugieren (32 000 × g, 18 min, 4°C) gewonnen, in eiskaltem hypotonischem Puffer gewaschen und nochmals durch Zentrifugieren gewonnen (32 000 × g, 18 min, 4°C). Das zum Schluß erhaltene Membranpräzipitat wurde durch Ultraschallzertrümmerung in ein kleines Volumen eiskalten Bindungspuffers resuspendiert (≅ 1 ml für jede der 5 Schalen: 10 mM NaCl, 20 mM Hepes, 0,22 mM KHP2O4, 1,26 mM CaCl2, 0,81 mM MgSO4, pH 7.4). Die Proteinkonzentration wurde mit dem Bradford-Verfahren (Bradford, 1976) unter Verwendung von Bio-Rad Reagens, mit Rinderserumalbumin als Standard gemessen. Die Membranen wurden bis zu einer Stunde auf Eis bereitgehalten und entweder frisch oder blitzgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert verwendet.
  • Die Membranen der 293-, LM(tk-)-, und NIH-3T3-Zellen wurden in ähnlicher Weise präpariert. Zur Präparation von Membranen von Baculovirus-infizierten Zellen, wurden 2 × 107 Sf21-Zellen in 150 mm-Gewebekulturschalen gezüchtet und mit einem Vorrat hY5BB3 von hohem Titer infiziert. Die Zellen wurden 2–4 Tage bei 27°C ohne CO2 inkubiert, bevor die Membranen wie vorstehend beschrieben gewonnen und präpariert wurden.
  • Die Zellmembranen von seziertem Ratten-Hypothalamus wurden in ähnlicher Weise präpariert. Die gefrorenen Hypothalami wurden 20 Sekunden lang in eiskaltem Ultraschallzertrümmerungspuffer mit der schmalen Sonde eines Virtishear-Homogenisierers (Virtis, Gardiner, NY) bei 1000 U/min homogenisiert. Große Teilchen und Zellreste wurden durch Zentrifugierung (200 × g, 5 min, 4°C) beseitigt, und die Überstandsfraktion auf Eis bereitgehalten. Die Membranen wurden durch zwei weitere Wiederholungen des Homogenisierungs- und Zentrifugierungsvorgangs aus dem Präzipitat extrahiert. Die Überstandsfraktionen wurden vereinigt und der Hochgeschwindigkeits-Zentrifugierung unterworfen (100 000 × g, 20 min, 4°C). Das zum Schluß erhaltene Membranpräzipitat wurde durch sanftes Homogenisieren in ein kleines Volumen eiskalten Bindungspuffers (1 ml/g Gewebe-Naßgewicht) und bis zu einer Stunde auf Eis bereitgehalten oder blitzgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.
  • Bindung der Radioliganden an Membransuspensionen
  • Die Membransuspensionen wurden mit 0,1% Rinderserumalbumin angereichertem Bindungspuffer verdünnt und ergaben so eine optimale Membranprotein-Konzentration, so daß 125I-PYY (oder ein alternativer Radioligand, wie 125I-NPY, 125I-PYY3–36, oder 125I-[Leu31 Pro34] PYY), der von den Membranen im Test gebunden wurde, weniger als 10% des 125I-PYY (oder des alternativen Radioliganden) betrug, der der Probe zugeführt worden war (100 000 dpm/Sonde = 0,08 nM für kompetitive Bindungstests). 125I-PYY (oder die alternativen Radioliganden) und die Peptid-Wettbewerber wurden mit hinzugefügtem Bindungspuffer ebenfalls bis zu den gewünschten Konzentrationen verdünnt. Die einzelnen Proben wurden dann in Mikrotiterplatten aus Polypropylen mit 96 Vertiefungen präpariert, indem 125I-PYY (25 μl) (oder alternativer Radioligand), konkurrierende Peptide oder hinzugefügter Bindungspuffer (25 μl) und schließlich Membransuspension (200 μl) vermischt wurden. Die Proben wurden 120 min lang in einem 30°C warmen Wasserbad unter konstantem Schütteln inkubiert. Die Inkubation wurde durch Filtrierung über Whatman GF/C-Filter (mit 1% Polyethylenimin vorbeschichtet und vor der Anwendung luftgetrocknet) beendet, anschließend folgte ein Waschen mit 5 ml eiskaltem Bindungspuffer. Die Membranen, die im Filter hängen geblieben waren, wurden mit MultiLex Feststoffszintillans (Wallac, Turku, Finnland) imprägniert und mit einem Wallac Beta-Schalenzähler auf 125I gemessen. Die nichtspezifische Bindung wurde für alle Rezeptoren außer den Y4-Subtypen mit 300 nM menschlichem NPY bestimmt; für das menschliche Y4 wurden 100 nM menschliches PP und für das Ratten-Y4 100 nM Ratten-PP benützt. Die spezifische Bindung im Zeitverlauf und bei Kompetitionsstudien betrug typischerweise 80%; der größte Teil der nichtspezifischen Bindung war mit dem Filter assoziiert. Die Bindungsdaten wurden mit nichtlinearer Regression und mit den statistischen Verfahren des GraphPAD Prism-Paketes (San Diego, CA) analysiert.
  • Funktionstest: Radioimmuntest von cAMP
  • Stabil transfizierte Zellen wurden in Mikrotiterschalen mit 96 Vertiefungen ausgebracht und bis zur Konfluenz gezüchtet. Um das Potential für einen Empfindlichkeitsverlust des Rezeptors zu verringern, wurde die Serumkomponente des Mediums für einen Zeitraum von 4 bis 16 Stunden vor dem Test auf 1,5% reduziert. Die Zellen wurden in Hank'scher gepufferter Kochsalzlösung oder in HBS (150 mM NaCl, 20 mM Hepes, 1 mM CaCl2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 und 10 mM Glucose) gewaschen, das mit 0,1% Rinderserumalbumin plus 5 mM Theophyllin angereichert und in der gleichen Lösung 20 min lang bei 37°C in 5% CO2 voräquilibriert worden war. Die Zellen wurden dann 5 min mit 10 μM Forskolin und verschiedenen Konzentrationen von Rezeptor-selektiven Liganden inkubiert. Der Test wurde durch die Entfernung des HBS und die Übersäuerung der Zellen mit 100 mM HCl beendet. Das intrazelluläre cAMP wurde extrahiert und mit einer modifizierten Version eines Radioimmuntests auf Basis von Magnetkügelchen (Advanced Magnetics, Cambridge, MA) quantifiziert. Der schließlich erhaltene Antigen/Antikörper-Komplex wurde von freiem 125I-cAMP durch Vakuumfiltrierung und durch einen PVDF-Filter in einer Mikrotiterschale (Millipore, Bedford, MA) abgetrennt. Die Filter wurden gelocht und in einem Packard Gammazähler auf 125I gemessen. Die Bindungsdaten wurden mit nichtlinearer Regression und mit den statistischen Verfahren des GraphPAD Prism-Paketes (San Diego, CA) analysiert.
  • Funktionstest: Intrazelluläre Calciummobilisierung
  • Die intrazelluläre freie Calciumkonzentration wurde mittels Mikrospektrofluorometrie unter Verwendung des Fluoreszenzindikatorfarbstoffes Fura-2/AM (ref.) gemessen. Stabil transfizierte Zellen wurden auf ein 35-mm-Kulturgefäß mit einem eingelegten Glasdeckglas ausplattiert. Die Zellen wurden mit HBS gewaschen und 20 bis 40 min lang mit 100 μl Fura-2/AM (10 μM) behandelt. Nach dem Waschen mit HBS, um die Fura-2/AM-Lösung zu entfernen, wurden die Zellen 10 bis 20 min lang in HBS äquilibriert. Dann wurden die Zellen unter dem 40×-Objektiv eines Leitz Fluovert FS-Mikroskopes sichtbar gemacht und die Fluoreszenzemission bei 510 nm mit zwischen 340 nm und 380 nm abwechselnden Exzitationswellenlängen bestimmt. Die Rohdaten der Fluoreszenz wurden mit Hilfe von Standard-Calciumkonzentrationskurven und Software-Analysetechniken in Calciumkonzentrationen umgerechnet.
  • Gewebepräparation für neuroanatomische Studien
  • Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles Rivers) wurden dekapitiert und ihre Gehirne schnell entnommen und in Isopentan tiefgefroren. Auf einem Kryostaten wurden koronare 11 μm-Schnitte geschnitten, diese aufgetaut und auf Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger aufgezogen und bis zu ihrer Verwendung bei –80°C gelagert. Vor der Hybridisierung wurden die Gewebe in 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 5 mM Dithiothreitol behandelt, in 0,1 M Triethanolamin mit 0,25% Essigsäureanhydrid acetyliert, mit Chloroform entfettet und in abgestuften Ethanolen dehydriert.
  • Sonden
  • Die zur Charakterisierung der Verteilung der Y5-mRNA des Ratten-NPY verwendeten Oligonucleotidsonden waren zu den Nucleotiden 1121 bis 1165 in der 5-6-Loop der Ratten-Y5mRNA komplementär (3A). Auf einem Millipore Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesis System wurden 45mere Gegensinn- und Sinn-Oligonucleotidsonden synthetisiert. Die Sonden wurden dann lyophilisiert, in keimfreiem Wasser rekonstituiert und auf einem 12%-Polyacrylamid-Denaturierungsgel gereinigt die gereinigten Sonden wurden nochmals bis zu einer Konzentration von 100 ng/μl rekonstituiert und bei –20°C gelagert.
  • In-Situ-Hybridisierung
  • Die Sonden wurden unter Verwendung von terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase (Pharmacia) mit 35S-dATP (1200 Ci/mM, New England Nuclear, Boston, MA) bis zu einer spezifischen Aktivität von 109 dpm/μg 3'-endmarkiert. Die radioaktiv markierten Sonden wurden auf Biospin 6-Chromatographiesäulen (Bio-Rad; Richmond, CA) gereinigt und in Hybridisierungspuffer bis zu einer Konzentration von 1,5 × 104 cpm/μl verdünnt. Der Hybridisierungspuffer bestand aus 50% Formamid, 4 × Natriumcitratpuffer (1 × SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Natriumcitrat), 1 × Denhardt'sche Lösung (0,2% Polyvinylpyrrolidin, 0,2% Ficoll, 0,2% Rinderserumalbumin), 50 mM Dithiothreitol, 0,5 mg/ml Lachssamen-DNA, 0,5 mg/ml Hefe-tRNA, und 10% Dextransulfat. Zu jedem Abschnitt wurden 100 μl der verdünnten radioaktiv markierten Sonde hinzugefügt, und dieser dann mit Parafilm-Abdeckstreifen verschlossen. Die Hybridisierung wurde über Nacht in feuchten Kammern bei 40 bis 55°C ausgeführt. Am nächsten Tag wurden die Abschnitte in zwei Waschgängen von 2 × SSC 1 h lang bei Raumtemperatur gewaschen, in 2 × SSC 30 min lang bei 50–60°C, und schließlich in 0,1 × SSC 30 min lang bei Raumtemperatur. Die Gewebe wurden in abgestuften Ethanolen dehydriert und 3 Tage bis 3 Wochen bei –20°C auf Kodak XAR-S-Film gelegt, dann in 1 : 1 mit 0,2% Glycerinwasser verdünnte Kodak NTB3-Autoradiographieemulsion getaucht. Nach 2- bis 8-wöchiger Belichtung bei 4°C wurden die Objektträger in Kodak D-19 Entwickler entwickelt, fixiert, und mit Chresylviolett gegengefärbt.
  • Hybridisierungskontrollen
  • Die Kontrolle der Sonden/Hybridisierungs-Spezifität beinhaltete die Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sinn-Sonde und die Anwendung transfizierter Zellinien. Kurz gesagt, wurden COS-7-Zellen mit Rezeptor-cDNAs für die Ratten-Y1, -Y2 (offenbart in U. S.-Patentanmeldung Seriennr. 08/192,288, eingereicht am 3. Februar 1994), -Y4 (offenbart in U. S.-Patentanmeldung Seriennr. 08/176,412, eingereicht am 28. Dezember 1993), oder -Y5 transfiziert (vgl. vorst). Wie vorstehend beschrieben, wurden die transfizierten Zellen mit den radioaktiv markierten Y5-Gegensinn- und Sinn-Oligonucleotidsonden behandelt und hybridisiert, gewaschen und 1 bis 7 Tage auf Film gelegt.
  • Analyse der Hybridisierungssignale
  • Die Schnitte durch das Rattenhirn wurden in folgender Weise auf Hybridisierungssignale untersucht: „Hybridisierungssignal" bedeutet in diesem Zusammenhang die relative Zahl von Silberkörnchen, die in einer ausgewählten Region des Rattenhirns auf den Neuronen beobachtet werden können. Zwei unabhängige Beobachter bewerteten die Intensität des Hybridisierungssignals in einer gegebenen Zone des Gehirns als inexistent, niedrig, mäßig oder hoch. Diese Einschätzungen wurden dann in eine subjektive numerische Einstufung umgewandelt, wie 0, + 1, + 2, oder + 3 (vgl. Tabelle 10), und in schematische Diagramme der koronaren Schnitte durch das Rattenhirn eingetragen (vgl. 11).
  • Chemisch-synthetische Verfahren
  • Verbindung 28
  • 2-(Naphthalin-1-ylamino)-3-Phenylpropionitril
  • Zu einer Lösung von 1-Naphthalinmethylamin (2,9 g, 20 mM) und Benzylaldehyd (2,0 g, 17 mmol) in 30 ml CHCl3 und 10 ml McOH wurde TMSCN (6,6 ml, 51 mM) hinzugefügt und die so erhaltene Lösung 12 h lang bei 25°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in vacuo konzentriert und ergab ein Öl, das der Säulenchromatographie (EtOAc, rein) unterworfen wurde und 3,5 g (74%) des gewünschten Produktes als farbloses Öl ergab. Das Produkt wurde mittels NMR identifiziert.
  • 2-(Naphthalin-1-yl)-3-phenylpropan-l,2-diamin
  • Zu einer Lösung des Nitrils (0,5 g, 1,8 mM) in THF wurden tropfenweise 6,9 ml 1 N LiAlH4 in THF hinzugefügt und die so erhaltene Lösung 2 h lang gerührt. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen von einigen Eisstückchen gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit EtOAc verdünnt und durch ein Stück Celite gefiltert. Das organische Filtrat wurde in vacuo konzentriert und ergab ein Öl, das der Säulenchromatographie (EtOAc, rein) unterworfen wurde und 0,28 g (57%) des gewünschten Produktes als farbloses Öl ergab. Das Produkt wurde mittels NMR identifiziert.
  • In-vivo-Studien an Ratten
  • Nahrungsaufnahme gesättigter Ratten
  • Für diese Bestimmungen kann die Nahrungsaufnahme bei normalen, gesättigten Ratten nach intracerebroventrikulärer (i.c.v.) Verabreichung von NPY in in Gegenwart oder in Abwesenheit der Testverbindung gemessen werden. Für alle Versuche wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (Ciba-Geigy AG, Sisseln, Schweiz) verwendet, die zwischen 180 und 220 g wogen. Die Ratten wurden einzeln in Edelstahlkäfigen und bei einem 11:13 h Hell-Dunkel-Zyklus (Licht aus um 18:00 Uhr), bei einer kontrollierten Temperatur von konstant 21–23°C gehalten. Wasser und Futter (NAFAG lab chow Pellets, NAFAG, Gossau, Schweiz) waren ad libidum verfügbar.
  • Den Ratten wurden unter pentobarbitaler Anästhesie stereotaktisch eine Edelstahl-Führungskanüle in Richtung auf denen rechten Lateralventrikel implantiert. Die stereotaktischen Koordinaten, bei –2,0 mm unterhalb der Interauralline angesetzter Einschnittlinie waren: –0,8 mm anterior und +1,3 mm lateral zum Bregma. Die Führungskanüle wurde auf der Hirnhaut plaziert. Die Injektionskanülen verlängerten die Führungskanüle um –3,8 mm ventral zur Schädeloberfläche. Den Tieren wurden postoperativ wenigstens 4 Erholungstage gegönnt, bevor sie für die Versuche verwendet wurden. Die Kanülenplazierung wurde postoperativ durch Testen der Trinkreaktion auf eine intracerebroventrikuläre (i.c.v.) 50 ng-Injektion von Angiotensin II überprüft. Nur die Ratten, die innerhalb von 30 min nach der Angiotensin II-Injektion wenigstens 2,5 ml Wasser tranken, wurden für die Nahrungsaufnahmestudien verwendet.
  • Alle Injektionen wurden morgens 2 Stunden nach dem Einschalten des Lichtes gegeben. Die Peptide wurden in künstlicher Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (ACSF) in einem Volumen von 5 μl injiziert. ACSF enthält: NaCl 124 mM, KCl 3,75 mM, CaCl2 2,5 mM, MgSO4 2,0 mM, KHP2O4 0,22 mM, NaHCO3 26 mM und Glucose 10 mM. Schweine-NPY wurde in künstlicher Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (ACSF) aufgelöst Für i.c.v. Injektion wurden die Testverbindungen vorzugsweise in DMSO/Wasser (10%, v/v) aufgelöst. Das für intraperitoneale (i.p.), subcutane (s.c.) oder orale (p.o.) Verabreichung von Verbindungen verwendete Vehikel ist vorzugsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung, oder DMSO/Wasser (10%, v/v) bzw. Cremophor/Wasser (20% v/v).
  • Die Tiere, die mit beiden Testverbindungen und p-NPY behandelt wurden, wurden zuerst mit der Testverbindung behandelt. Dann, 10 min. Nach i.c.v.-Verabreichung der Testverbin dung oder des Vehikels (Kontrolle), oder 30–60 min nach der i.p.–, s.c.- und p.o.-Verabreichung der Testverbindung oder des Vehikels, wurden 300 pM NPY intracerebroventrikulär (i.c.v.) verabreicht.
  • Die Nahrungsaufnahme kann gemessen werden, indem zum Zeitpunkt der NPY-Injektion vorab gewogene Futterbrocken in die Käfige gelegt werden. Die Futterbrocken werden dann zu jedem ausgewählten Zeitpunkt aus dem Käfig entnommen und durch einen neuen Satz vorab gewogener Futterbrocken ersetzt. Die Nahrungsaufnahme der mit der Testverbindung behandelten Tiere kann als Prozentsatz der Nahrungsaufnahme der Kontrolltiere, das heißt der mit dem Vehikel behandelten Tiere berechnet werden. Alternativ kann die Nahrungsaufnahme einer Gruppe von Tieren, die den gleichen Versuchsbedingungen unterworfen wurden als Mittelwert ± S.E.M. (Standardabweichung) ausgedrückt werden. Die statistische Analyse erfolgt durch Varianzanalyse mit Hilfe des Student-Newman-Keuls-Tests.
  • Nahrungsaufnahme bei nahrungsdeprivierten Ratten
  • Die Nahrungsdeprivationsversuche erfolgen mit männlichen Sprague-Dawley-Ratten, die zwischen 220 und 250 g wiegen. Nach dem Eintreffen werden die Tiere für den Zeitraum der Studie einzeln untergebracht und erhalten freien Zugang zu normalem Futter und Trinkwasser. Die Tiere werden in einem Raum mit 12 h Hell/Dunkel-Zyklus (Licht von 8:00 bis 20:00 Uhr) bei 24°C und kontrollierter Luftfeuchtigkeit gehalten. Nach dem Übergang zur Einzelhaltung folgt eine viertägige Ausgleichsperiode, während derer sie an ihre neue Umgebung und an eine Ernährung in Form von Pulver oder Futterbrocken (NAFAG, Gossau, Schweiz) gewöhnt werden. Gegen Ende der Ausgleichsperiode wird den Tieren beginnend um 8:00 Uhr morgens für 24 h das Futter weggenommen. Am Ende der Fastenperiode kann die Verbindung oder das Vehikel den Tieren oral oder durch Injektion intraperitoneal oder intravenös verabreicht werden. Nach 10–60 min wird den Tieren wieder Futter gegeben, und ihre Nahrungsaufnahme wird zu verschiedenen Zeitpunkten über die folgenden 24 h festgehalten. Die Nahrungsaufnahme der mit der Testverbindung behandelten Tiere kann als Prozentsatz der Nahrungsaufnahme der Kontrolltiere (das heißt der mit dem Vehikel behandelten Tiere) berechnet werden. Alternativ kann die Nahrungsaufnahme einer Gruppe von Tieren, die den gleichen Versuchsbedingungen unterworfen wurden, als Mittelwert ± S.E.M. ausgedrückt werden.
  • Nahrungsaufnahme von fettleibigen Zucker-Ratten
  • Die Wirksamkeit der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung gegen Fettleibigkeit könnte sich auch bei fettleibigen Zucker-Ratten manifestieren, die auf dem Fachgebiet als Tiermodell für Fettleibigkeit bekannt sind. Die Studien wurden mit männlichen fetten Zucker-Ratten (fa/fa Harlan CPB, Austerlitz NL) ausgeführt, die zwischen 480 und 500 g wogen. Die Tiere werden für den Zeitraum der Studie einzeln in Stoffwechsel-Käfigen untergebracht und erhalten freien Zugang zu normalem Futter in Pulverform und Trinkwasser. Die Tiere werden in einem Raum mit 12 h Hell/Dunkel-Zyklus (Licht von 8:00 bis 20:00 Uhr) bei 24°C und kontrollierter Luftfeuchtigkeit gehalten. Nach der Versetzung in die Stoffwechsel-Käfige folgt eine sechstägige Ausgleichsperiode, während derer sie an ihre neue Umgebung und an eine Ernährung in Pulverform gewöhnt werden. Nach Beendigung der Ausgleichsperiode wird die Nahrungsaufnahme während der Helligkeits- und der Dunkel-Phasen bestimmt. Nach einer dreitägigen Kontrollperiode werden die Tiere mit Testverbindungen oder mit Vehikel (vorzugsweise Wasser oder physiologische Kochsalzlösung oder DMSO/Wasser (10%, v/v) oder Cremophor/Wasser (20%, v/v)) behandelt. Die Nahrungsaufnahme wird dann während der folgenden drei Tage überwacht, um die Wirkung der Verabreichung der Testverbindung oder des Vehikels allein zu bestimmen. Wie in den vorstehend beschriebenen Studien, kann die Nahrungsaufnahme der Ratten in Gegenwart des Wirkstoffes als Prozentsatz der Nahrungsaufnahme der mit dem Vehikel behandelten Tiere ausgedrückt werden.
  • Materialien
  • Zellkulturmedien und Zusätze waren von Specialty Media (Lavallette, NJ). Zellkulturschalen (150 mm-Schalen und Mikrotiterschalen mit 96 Vertiefungen) waren von Corning (Corning, NY). Sf9-, Sf21-, und High Five-Insektenzellen, wie auch das Baculovirus-Transferplasmid pBlueBacIIITM, wurden von Invitrogen (San Diego, CA) bezogen. TMN-FH-Insektenmedium, mit 10% fötalem Kälberserum komplementiert, und die Baculovirus-DNA BäculoGoldTM, wurden von Pharmingen (San Diego, CA.) bezogen. Ex-Cell 400TM-Medium mit L-Glutamin wurde von JRH Scientific bezogen. Mikrotiterschalen mit 96 Vertiefungen aus Polypropylen waren von Co-star (Cambridge, MA). Alle Radioliganden waren von New England Nuclear (Boston, MA). Im Handel erhältliches NPY und verwandte Peptidanaloga waren entweder von Bachem California (Torrance, CA) oder Peninsula (Belmont, CA); die C-terminalen Fragmente [D-Trp32] NPY und PP wurden auf individuelle Bestellung von Chiron Mimotopes Peptide Systems (San Diego, CA) synthetisiert. Das Bio-Rad Reagens war von Bio-Rad (Her cules, CA). Das Rinderserumalbumin (ultra-fettfrei, A-7511) war von Sigma (St. Louis, MO). Alle übrigen Materialien waren von Reagenzqualität.
  • Versuchsergebnisse
  • cDNA-Clonierung
  • Um einen „atypischen" NPY-Rezeptor-Subtyp des Ratten-Hypothalamus zu clonieren, verwendeten die Patentanmelder eine Expressionsclonierungs-Strategie in COS-7-Zellen (Gearing et al., 1989; Kluxen et al., 1992; Kiefer et al., 1992). Diese Strategie wurde wegen ihrer extremen Empfindlichkeit ausgewählt, da sie den Nachweis einer einzelnen „rezeptorpositiven" Zelle durch direkte mikroskopische Autoradiographie erlaubt. Da der „atypische" Rezeptor nur in Studien, die das Nahrungsaufnahmeverhalten betreffen, und die Injektion von NPY und NPY-verwandten Liganden in Ratten-Hypothalamus beinhalten (vgl. Einleitung) beschrieben wurde, untersuchten die Patentanmelder zuerst dessen Bindungsprofil, indem sie kompetitive Verdrängungsversuche von 125I-PYY und 125I-PYY3–36 auf Membranen vornahmen, die aus Ratten-Hypothalamus präpariert worden waren. Die Daten der kompetitiven Verdrängung zeigen: 1) Menschliches PP ist in der Lage, 20% des gebundenen 125I-PYY mit einem IC50 von 11 nM (1 und Tabelle 2) zu verdrängen. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, gilt dieser Wert nicht für die isolierten Ratten-Y1, -Y2 und -Y4-Clone, und könnte deshalb einem anderen NPY/PYY-Rezeptor-Subtyp prechen. 2) [Leu31, Pro34] NPY (ein Y1-spezifischer Ligand) ist in der Lage, 27% des gebundenen 125I-PYY3_36-Liganden (ein Y2-spezifischer Ligand) mit hoher Affinität (IC50 von 0,38) zu verdrängen (2 und Tabelle 2). Diese Daten liefern den ersten auf einem Bindungsversuch fußenden Hinweis darauf, daß die Ratten-Hypothalamus-Membranen einen NPY-Rezeptor-Subtyp mit einer gemischten Y1/Y2-Pharmakologie (als der „atypische" Subtyp bezeichnet) enthalten könnten, die mit der in den Studien zum Nahrungsaufnahmeverhalten definierten Pharmakologie übereinstimmt.
  • Tabelle 2: Pharmakologisches Profil des Ratten-Hypothalamus
  • Die Bindungsdaten spiegeln die kompetitive Verdrängung von 125I-PYY und 125I-PYY3–36 aus Membranen des Ratten-Hypothalamus wider. Die Peptide wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Konzentrationen von 0,001 nM bis 100 nM getestet. Der IC50-Wert, der 50%-iger Verdrängung entspricht, und der Prozentsatz der Verdrängung gegenüber jener, die von 300 nM menschlichem NPY bewirkt wird, wurde durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt. Die gezeigten Daten sind für wenigstens zwei unabhängige Versuche repräsentativ.
  • TABELLE 2
    Figure 00560001
  • Auf der Basis der vorstehenden Daten wurde einer Ratten-Hypothalamus-cDNA-Bank von 3 × 106 unabhängigen Rekombinanten mit einer mittleren Insertgröße von 2,7 kb in 450 Zusammenfassungen (Pools) von ≅ 7500 unabhängigen Clones fraktioniert. Alle Pools wurden wie vorstehend beschrieben (U.S.-Seriennr. 08/192/288) in einem Bindungstest mit 125I-PYY getestet. Sieben Pools erzeugten bei dem Absuchtest positive Zellen (Nrn. 81, 92, 147, 246, 254, 290, 312). Da die Y1-, Y2-, Y4- und Y5-Rezeptor Subtypen (durch PCR oder Bindungsanalyse) im Ratten-Hypothalamus exprimiert werden, analysierten die Patentanmelder die DNA der positiven Pools mittels PCR mit Y1-, Y2- und Y4-spezifischen Primern von Ratten. Es stellte sich heraus, daß die Pools Nr. 147, 246, 254 und 312 cDNAs enthielten, die einen Y1-Rezeptor codieren, Pool Nr. 290 enthielt cDNA, die einen Y2-Rezeptor codiert, doch die Pools Nr. 81 und 92 waren der PCR-Analyse zufolge Y1-, Y2- und Y4-negativ und enthielten deshalb wahrscheinlich eine cDNA, die einen neuen Ratten-Hypothalamus-NPY-Rezeptor (Y5) codiert. Später stellte sich heraus, daß die Pools Nr. 81 und 92 eine identische NPY-Rezeptor-cDNA enthielten. Der Pool Nr. 92 wurde der SIB-Selektion, wie in U.S.- Seriennr. 08/192,288 beschrieben, unterworfen, bis ein einzelner (als CG-18 bezeichneter) Clon isoliert wurde.
  • Der isolierte Clon enthält eine 2,8 kB-cDNA. Diese cDNA enthält einen offenen Leserahmen zwischen den Nucleotiden 779 und 2146, der ein Protein von 456 Aminosäuren codiert. Die lange 5'-nichtübersetzte Region könnte an der Regulation der Translationseffizienz oder der mRNA-Stabilität beteiligt sein. Die flankierende Sequenz um das mutmaßliche Initiationscodon entspricht nicht der Kozak-Konsenssequenz für optimale Translationsinitiation (Kozak, 1989, 1991). Die Darstellung der Hydrophobie zeigte sieben hydrophobe, wahrscheinlich membranspannende Regionen, was den Y5-Rezeptor des Ratten-Hypothalamus als Mitglied der G-Protein-gekoppelten Überfamilie ausweist. Die Nucleotid- und die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in den 3 bzw. 4 gezeigt. Wie die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, enthält der Y5-Rezeptor Konsenssequenzen für N-gebundene Glykosylierung im Aminoende (Position 21 und 28), die an der richtigen Expression von Membranproteinen beteiligt sind (Kornfeld und Kornfeld, 1985). Der Y5-Rezeptor enthält zwei hochgradig konservierte Cysteinreste in den ersten zwei extrazellulären Loops, von denen man annimmt, daß sie eine Disulfidbindung bilden, die die funktionale Proteinstruktur stabilisiert (Probst et al., 1992). Der Y5-Rezeptor weist neun potentielle Phosphorylierungsstellen für Proteinkinase C an den Positionen 204, 217, 254, 273, 285, 301, 328, 336 und 409 auf; sowie zwei cAMP- und cGMP-abhängige Proteinkinase-Phosphorylierungsstellen an den Positionen 298 und 370. Man beachte, daß acht von diesen elf potentiellen Phosphorylierungsstellen sich in der dritten intrazellulären Loop befinden, zwei in der zweiten intrazellulären Loop und eine im Carboxy-Ende des Rezeptors, und daß sie deshalb eine Rolle bei der Steuerung funktioneller Charakteristika des Y5-Rezeptors spielen könnten (Probst et al., 1992). Weiterhin enthält der Ratten-Y5-Rezeptor ein Leuzin-Reißverschluß-Motiv in seiner ersten mutmaßlichen Transmembrandomäne (Landschulz et al., 1988). Eine Tyrosinkinase-Phosphorylierungsstelle findet sich in der Mitte des Leuzin-Reißverschlusses.
  • Lokalisierungsstudien (vgl. nachstehend) zeigen, daß die Y5-mRNA in mehreren Gebieten des Ratten-Hippocampus vorhanden ist. Unter der Annahme einer vergleichbaren Lokalisierung im menschlichen Gehirn, suchten die Patentanmelder eine menschliche hippocampale cDNA-Bank mit Ratten-Oligonucleotidprimern, von denen gezeigt wurde, daß sie eine DNA-Bande der erwarteten Größe ergaben, wie in U.S.-Seriennr. 08/192,288 beschrieben, in einem PCR-Reaktionsdurchlauf auf menschlicher hippocampaler DNA ab (C. Gerald, unveröffentlichte Ergebnisse). Mit dieser PCR-Absuchstrategie (Gerald et al., 1994, zur Veröffentlichung eingereicht) konnten drei positive Pools festgestellt werden. Einer dieser Pools wurde weiter analysiert, und ein einzelner Clon wurde durch SIB-Selektion gereinigt. Es stellte sich heraus, daß der isolierte Clon (CG-19) eine cDNA voller Länge enthielt, die in der korrekten Anordnung für eine funktionelle Expression angeordnet war (vgl. nachstehend). Die menschlichen Y5-Nucleotide und abgeleiteten Aminosäuresequenzen werden in den 5 bzw. 6 gezeigt. Im Vergleich zum Ratten-Y5-Rezeptor weist die menschliche Sequenz 84,1% Nucleotididentität (7A bis 7E) und 87,2% Aminosäurenidentität (7F und 7G) auf. Die Proteinsequenz der Ratten ist im Vergleich zu der der Ratten am äußersten Ende sowohl des Amino- als auch des Carboxylschwanzes des Rezeptors eine Aminosäure länger. Die menschliche 5-6-Loop ist eine Aminosäure länger als die der Ratte und weist mehrfach nichtkonservative Substitutionen auf. Obwohl die 5-6-Loops signifikante Veränderungen zwischen den Homologen der Ratte und des Menschen aufweisen, sind alle Proteinmotive des Rattenrezeptors auch im menschlichen Homologen zu finden. Alle mutmaßlichen Transmembrandomänen und extrazellulären Loop-Regionen sind hochgradig konserviert (7F und 7G). Daher kann erwartet werden, daß sowohl die pharmakologischen Profile als auch die funktionalen Charakteristika des Ratten- und des menschlichen Y5-Rezeptor-Subtyp-Homologen einander stark ähneln.
  • Im Vergleich zu anderen NPY-Rezeptor-Subtypen oder zu anderen menschlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Subtypen sind sowohl die Gesamtidentität als auch die Identität der Transmembrandomänen der menschlichen und der Ratten-Y5-Rezeptor-Sequenzen sehr niedrig, was zeigt, daß die Y5-Rezeptor-Gene mit keinen anderen bisher beschriebenen cDNAs nahe verwandt sind. Selbst innerhalb der menschlichen NPY-Familie zeigen Y1-, Y2-, Y4-, und Y5-Mitglieder eine ungewöhnlich niedrige Aminosäureidentität (8A bis 8C).
  • Tabelle 3: Menschliche Y5-Transmembrandomänen-Identität mit anderen menschlichen NPY-Rezeptor-Subtypen und anderen menschlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
    Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Northern Blot-Analyse
  • Bei Verwendung der Ratten-Y5-Sonde zeigen Northern-Hybridisierungen ein starkes Signal bei 2,7 kb und eine schwache Bande bei 8 kb in Ratten-Gesamthirn. Ein schwaches Signal wird bei 2,7 kb in den Hoden beobachtet. In Herz, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskulatur und Nieren wurde nach dreitägiger Exposition kein Signal beobachtet (16A). Dies ist in guter Übereinstimmung mit der 2,7 kb-c DNA, die wir durch Expressionsclonieren aus Ratten-Hypothalamus isolierten, und es zeigt, daß unser cDNA-Clon die volle Länge hat. Die 8 kb-Bande, die in Gesamthirn zu sehen ist, entspricht nichtgespleißter Vor-mRNA.
  • Mit der menschlichen Y5 Sonde zeigten die Northern-Hybridisierungen (16B und 16C) ein starkes Signal bei 3,5 kb mit einer viel schwächeren Bande bei 2,2 und 1,1 kb in Nucleus caudatus, Putamen und Gehirncortex, ein mittelstarkes Signal in Frontallappen und Amygdala und ein schwaches Signal in Hippocampus, Hinterhaupts- und Schläfenlappen, Rückenmark, Medulla, Thalamus, Nucleus subthalamis, und Substantia nigra. In Kleinhirn oder Corpus callosum war nach einer 48-ständigen Exposition kein Signal bei 3,5 kb feststellbar. Man beachte, daß Clontechs MTN II- und III-Blots keine mRNA aus dem Hypothalamus, Periaquaeductalen Grau, oberen Colliculus und der Raphe enthalten.
  • Die Southern-Blot-Analyse von menschlicher genomischer DNA ergibt bei vier der fünf Restriktionsverdauungen ein Ein-Banden-Muster (17A). Die bei der PstI-Verdauung beobachteten zwei Banden können durch die Gegenwart einer PstI-Stelle in der codierenden Region des menschlichen Y5-Gens erklärt werden. Die Southern-Blot-Analyse bei Ratten zeigte ein Ein-Banden-Muster bei allen fünf getesteten Restriktionsverdauungen (17B). Diese Analysen stimmen mit den menschlichen und den Ratten-Genomen überein, die eine einzige Kopie des Y5-Rezeptor Gens enthalten.
  • Y5-Homolog von Hunden
  • Die Hunde-Nucleotidsequenz, die bisher gewonnen wurde, (PCR und 3'-RACE-Produkte) erstreckt den Hunde-Y5-Rezeptor von dem ersten extrazellulären Loop unmittelbar stromaufwärts von TM III in die 3'-nichtübersetzte Region (14). In der codierenden Region ist diese Nucleotidsequenz hochgradig identisch mit sowohl den menschlichen als auch den Ratten-Sequenzen (91% bzw. 83,3%). Die abgeleitete Hunde-Y5-Aminosäuresequenz wird in 15 gezeigt. Diese Aminosäuresequenz ist wiederum hochgradig identisch sowohl mit den menschlichen als auch mit den Ratten-Y5-Sequenzen (94,6% beziehungsweise 89,5%), wobei die meisten Aminosäureänderungen im 5-6-Loop liegen. Daher ist zu erwarten, daß das pharmakologische Profil des Hunde-Y5-Rezeptor-Subtyps den menschlichen und den Ratten-Y5-Profilen stark ähneln wird.
  • Bindungsstudien
  • Die cDNA für den Ratten-Hypothalamus-Y5-Rezeptor wurde zum Zweck einer vollen pharmakologischen Auswertung transient in COS-7-Zellen exprimiert. 125I-PYY band spezifisch an Membranen des transient mit dem Ratten-Y5-Rezeptor transfizierten Rezeptorkonstruktes. Der zeitliche Verlauf der spezifischen Bindung wurde in Gegenwart von 0,08 nM 125I-PYY bei 30°C (9) gemessen. Die Assoziationskurve war monophasisch, mit einer beobachteten Assoziationsrate (Kobs) von 0,06 min–1 und einer t1/2 von 11 min; die Gleichgewichtsbindung war innerhalb von 71 min zu 99% komplett und über mindestens 180 min stabil. Alle nachfolgenden Bindungstests wurden über 120 min bei 30°C ausgeführt. Die Bindung von 125I-PYY an transient exprimierten Ratten-Y5-Rezeptor war über einen Radioliganden-Konzentrationsbereich von 0,4 pM bis 2,7 nM sättigbar. Die Bindungsdaten entsprachen einem Einstellen-Bindungsmodell mit einer scheinbaren Kd von 0,29 nM (pKd = 9,54 ± 0,13, n = 4). Auf den Membranen, die in flüssigem Stickstoff gelagert worden waren (10), wurde eine Rezeptorendichte von zwischen 5 und 10 pmol/mg eine Rezeptorendichte von zwischen 5 und 10 pmol/mg Membranprotein gemessen. Die Membranen von scheintransfizierten Zellen zeigten, wenn sie wie die CG-18-transfizierten Zellen präpariert und analysiert wurden, keine spezifische Bindung von 125I-PYY (Daten nicht dargestellt) die Patentanmelder schließen daraus, daß die unter dem beschriebenen Umständen beobachteten 125I-PYY-Bindungsstellen vom Ratten-Y5-Rezeptor-Konstrukt stammen.
  • Ein nahe verwandtes Peptid-Analogon, Schweine-125I-[Leu31, Pro34] PYY, band ebenfalls spezifisch an Membranen von transient mit Ratten-Y5-Rezeptor-cDNA transfizierten COS-7-Zellen. Der zeitliche Verlauf der spezifischen Bindung wurde bei Raumtemperatur sowohl in Standard-Bindungspuffer ([Na+] = 10 mM) und isotonischem Bindungspuffer ([Na+] = 138 mM) unter Verwendung von 0,08 nM nM 125I-[Leu31, Pro34] PYY nM gemessen ( 18). Die Assoziationskurve in 10 mM [Na+] war monophasisch, mit einer beobachteten Assoziationsrate (Kobs) von 0,042 min–1 und einer t1/2 von 17 min; die Gleichgewichtsbindung war innerhalb von 110 min zu 99% komplett und blieb über wenigstens 210 min stabil (die spezifische Bindung war maximal bei 480 fmol/mg Membranprotein). Die Assoziationskurve in 138 mM [Na+] war ebenfalls monophasisch, mit einem etwas niedrigeren Zeitverlauf: (Kobs) von 0,029 min–1 und einer t1/2 von 24 min; die Gleichgewichtsbindung war innerhalb von 160 min zu 99% komplett und blieb über wenigstens 210 min stabil (die spezifische Bindung war maximal bei 330 fmol/mg Membranprotein). Man beachte, daß die spezifische Bindung abnahm, wenn [Na+] erhöht wurde; ein ähnliches Phänomen wurde bei anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beobachtet und könnte eine allgemeine Eigenschaft dieser Rezeptorenfamilie, nämlich durch Na+ gesteuert zu werden (Horstman et al., 1990), widerspiegeln. Die Sättigungs-Bindungsstudien wurden mit 125I-[Leu31, Pro34] PYY in isotonischem Puffer bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 120 min ausgeführt. Die spezifische Bindung an transient exprimierten Ratten-Y5-Rezeptor war über einen Radioliganden-Konzentrationsbereich von 0,6 pM bis 1,9 nM sättigbar. Die Bindungsdaten entsprachen einem Ein-Stellen-Bindungsmodell mit scheinbarer Bindungs-Kd von 0,072 nM (pKd = 10,14 + 0,07, n = 2). Auf den Membranen, die in flüssigem Stickstoff gelagert worden waren, betrug die Rezeptorendichte 560 ± 150 pmol/mg. Die Tatsache, daß 125I-[Leu31, Pro34] PYY bei Raumtemperatur in isotonischem Puffer mit hoher Affinität an den Ratten-Y5-Rezeptor binden kann, macht es zu einem potentiell nützlichen Liganden zur Charakterisierung des nativen Y5-Rezeptors in Rattengeweben bei der Anwendung von Autoradiographieverfahren. Es muß jedoch darauf geachtet werden, geeignete Maskierungsmittel zu verwenden, um eine mögli che radioaktive Markierung anderer Rezeptoren, wie die Y1- und Y4-Rezeptoren zu blockieren (beachte in Tabelle 5, daß Ratten-Y1 und -Y4 das strukturell homologe [Pro34] PYY binden). Bisher veröffentlichte Berichte von 125I-[Leu31, Pro34] PYY als Y1-selektiver Radioligand sollten im Licht der mit dem Ratten-Y5-Rezeptor erhalten neuen Daten neu bewertet werden (Dumont, et al., 1995).
  • Das pharmakologische Profil des Ratten-Y5-Rezeptors wurde zuerst unter Verwendung von pankreatischen Polypeptid-Analoga im Membran-Bindungstests untersucht. Die Reihenfolge der Affinität für ausgewählte Verbindungen wurde aus der kompetitiven Verdrängung von 125I-PYY abgeleitet (11). Der Ratten-Y5-Rezeptor wurde mit clonierten Y1-, Y2-, und Y4-Rezeptoren von Menschen (Tabelle 4) und Ratten (Tabelle 5), die alle transient in COS-7-Zellen exprimiert wurden, verglichen. Ein Rezeptor-Subtyp, der aus unserer Palette fehlte, war der Y3 von Menschen oder Ratten, da für ihn bisher noch kein geeignetes Modell für Radioligandenabsuchung bestimmt wurde.
  • Tabelle 4: Pharmakologisches Profil des Ratten-Y5-Rezeptors im Vergleich zu aus Menschen clonierten Y-Typ Rezeptoren
  • Die Bindungsdaten spiegeln die kompetitive Verdrängung von 125I-PYY von Membranen von COS-7-Zellen, die transient Ratten-Y5 und menschliche Subtyp-Clone exprimieren, wider. Die Peptide wurden, wenn nicht anders angegeben, bei Konzentrationen getestet, die von 0,001 nM bis 1000 nM reichten. Die IC50-Werte, die 50%-iger Verdrängung entsprechen, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt und nach der Cheng-Prusoff-Gleichung in Ki-Werte umgewandelt. Die gezeigten Daten sind für wenigstens zwei unabhängige Versuche repräsentativ.
  • TABELLE 4
    Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Tabelle 5: Pharmakologisches Profil des Ratten-Y5-Rezeptors im Vergleich zu aus Ratten clonierten Y-Typ Rezeptoren
  • Die Bindungsdaten spiegeln die kompetitive Verdrängung von 125I-PYY von Membranen von COS-7-Zellen, die transient Ratten-Y5 und Ratten-Subtyp-Clone exprimieren, wider. Die Peptide wurden bei Konzentrationen getestet, die von 0,001 nM bis 1000 nM reichten. Die IC50-Werte, die 50%-iger Verdrängung entsprechen, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt und nach der Cheng-Prusoff-Gleichung in Ki-Werte umgewandelt. Die gezeigten Daten sind für wenigstens zwei unabhängige Versuche repräsentativ. Ausnahme: neue Peptide (mit ** markiert) wurden in einem oder mehreren unabhängigen Versuchen getestet.
  • TABELLE 5
    Figure 00640001
  • Der Ratten-Y5-Rezeptor besaß im Vergleich zu menschlichen und Ratten-Y-Typ Rezeptoren ein einzigartiges pharmakologisches Profil. Er wies eine Präferenz für strukturelle Analoga von Ratten/Menschen-NPY (Ki = 0,68 nM) und Ratten/Schweine-PYY (Ki = 0,64 nM) gegenüber den meisten PP-Derivaten auf. Die hohe Affinität für Lachs-PP (Ki = 0,31 nM) spiegelt die starke Ähnlichkeit zwischen Lachs-PP und Ratten-NPY wider, die 81% ihre Aminosäuresequenz gemeinsam haben und Identität in Schlüsselpositionen aufweisen: Tyr1, G1n34 und Tyr36. Beide N- und C-terminalen Peptiddomänen sind anscheinend für die Rezeptorerkennung wichtig. Das N-terminale Tyrosin von NPY oder PYY könnte ohne merklichen Verlust an Bindungsaffinität (Ki = 0,86 nM für Ratten/Menschen-NPY2_36) deletiert werden, eine weitere N-terminale Deletion jedoch war zerstörend (Ki = 73 nM für Schweine-NPYi3–36). Dieses Muster siedelt das Bindungsprofil des Y5-Rezeptors irgendwo zwischen dem des Y2-Rezeptors (der extremer N-terminaler Deletion widerstehen kann) und dem des Y1-Rezeptors (der schon gegen die N-terminale Deletion eines einzigen Restes empfindlich ist) an. Man beachte, daß der menschliche Y4-Rezeptor ähnlich beschrieben werden kann (Ki = 0,06 nM für menschliches PP, 0,06 nM für menschliches PP2–36, und 39 nM für menschliches PPi3–36). Der Y5-Rezeptor ähnelte sowohl dem Y1- als auch dem Y4-Rezeptor hinsichtlich seiner Toleranz für Pro34 enthaltende Liganden (wie in menschlichem [Leu31, Pro34] NPY, menschlichem [Pro34]-PYY, und menschlichem PP). Interessanterweise zeigte der Ratten-Y5-Rezeptor eine Präferenz für menschliches PP (Ki = 5,0 nM) gegenüber Ratten-PP (Ki = 180 nM). Dieses Muster unterscheidet den Ratten-Y5- vom Ratten-Y4-Rezeptor, der sowohl menschliches als auch Ratten-PP mit Ki-Werten < 0,2 nM bindet. Die Hydrolyse der Carboxy-terminalen Amide zu freier Carboxylsäure, wie in NPY-freier Säure, war für die Bindungsaffinität des Ratten-Y5-Rezeptors vernichtend (Ki = 480 nM). Das terminale Amid scheint ein gemeinsames strukturelles Erfordernis für pankreatische Polypeptidfamilien/Rezeptor-Wechselwirkungen zu sein.
  • Mehrere Peptide, von denen bisher gezeigt worden war, daß sie das Nahrungsaufnahmeverhalten bei Ratten stimulieren, banden an den Ratten-Y5-Rezptor mit Ki ≤ 5,0 nM. Dazu zählen Ratten-/menschliches NPY (Ki = 0,68 nM), Ratten-/Schweine-PYY (Ki = 0,64 nM), Ratten-/menschliches NPY2_36 (Ki = 0,86 nM), Ratten-/menschliches [Leu31, Pro34] NPY (Ki = 1,0 nM), und menschliches PP (Ki = 5,0 nM). Umgekehrt banden Peptide, die als orexigene Agentien weniger wirkungsvoll waren, schwach an CG-18, Dazu zählten Schweine-NPYi3–36 (Ki = 73 nM), Schweine-C2-NPY (Ki = 470 nM) und menschliche freie NPY-Säure (Ki = 480 nM). Die Reihenfolge der Ki-Werte stimmt mit der Reihenfolge der Stärke und Ak tivität der stimulierenden Wirkung auf das Nahrungsaufnahmeverhalten bei i.c.v. oder direkter Injektion in den Ratten-Hypothalamus überein (Clark et al., 1984; Stanley et al., 1985; Kalra et al., 1991; Stanley et al., 1992). Der Ratten-Y5-Rezeptor wies auch eine mäßige Bindungsaffinität für [D-Trp32] NPY (Ki = 53 nM) auf, jenes modifizierte Peptid, das den Berichten von Balasubramaniam und Mitarbeitern (1994) nach das NPY-induzierte Nahrungsaufnahmeverhalten reguliert. Es ist bemerkenswert, daß [D-Trp32] NPY für CG-18 ≥ 10-fach selektiver war, als die anderen untersuchten clonierten Rezeptoren, seien sie nun vom Menschen oder von Ratten. Diese Daten verbinden den clonierten Y5-Rezeptor eindeutig und definitiv mit der Nahrungsaufnahmereaktion.
  • Die dem aus menschlichem Hippocampus isolierten menschlichen Y5-Homologen entsprechende cDNA wurde für Membranbindungsstudien transient in COS-7-Zellen exprimiert. Die Bindung von 125I-PYY an den menschlichen Y5-Rezeptor (CG-19) war über einen Radioliganden-Konzentrationsbereich von 8 pM bis 1,8 nM sättigbar. Die Bindungsdaten waren passend für ein Ein-Stellen-Bindungsmodell mit scheinbarer Kd von 0,10 nM im ersten Versuch. Wiederholte Tests ergaben eine scheinbare Kd von 0,18 nM (pKd = 9,76 ± 0,11, n = 4). Auf frischen Membranen wurde eine maximale Rezeptordichte von 500 fmol/mg Membranprotein gemessen. Wie mit Peptidanaloga innerhalb der pankreatischen Polypeptidfamilie bestimmt, zeigt das pharmakologische Profil des menschlichen Y5 eine frappierende Ähnlichkeit mit dem Ratten-Y5-Rezeptor (Tabellen 6 und 7).
  • Tabelle 6: Pharmakologisches Profil des Ratten-Y5-Rezeptors im Vergleich zum menschlichen Y5-Rezeptor, wenn sie beide transient in COS-7- und stabil in LM(tk-)-Zellen exprimiert werden
  • Die Bindungsdaten spiegeln eine kompetitive Verdrängung von Radioliganden (entweder 125I-PYY oder 125I-PYY3_36, wie angegeben) von Membranen von COS-7-Zellen, die den Ratten-Y5-Rezeptor und seinen menschlichen Homologen transient exprimieren, oder von LM(tk-)-Zellen, die den menschlichen Y5-Rezeptor stabil exprimieren, wider. Die Peptide wurden bei Konzentrationen von 0,001 nM bis 1000 nM getestet. Die IC50-Werte, die 50%iger Verdrängung entsprechen, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt und nach der Cheng-Prusoff-Gleichung in Ki-Werte umgewandelt. Neue Peptide sind mit ** markiert
  • TABELLE 6
    Figure 00670001
  • Tabelle 7: Pharmakologisches Profil des menschlichen Y5-Rezeptors im Vergleich zu aus Menschen clonierten Y-Typ-Rezeptoren
  • Die Bindungsdaten spiegeln eine kompetitive Verdrängung von 125I-PYY von den Membranen von COS-7-Zellen, die transient andere menschliche Y5 Subtypen-Clone exprimieren, wider. Die Peptide wurden, sofern nicht anders angegeben, bei Konzentrationen von 0,001 nM bis 1000 nM getestet. Die IC50-Werte, die 50%-iger Verdrängung entsprechen, wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse bestimmt und nach der Cheng-Prusoff-Gleichung in Ki-Werte umgewandelt. Die gezeigten Daten sind für wenigstens zwei unabhängige Versuche repräsentativ.
  • TABELLE 7
    Figure 00680001
  • Bindungsstudien an in Insektenzellen exprimiertem hY5
  • Die Tests wurden anfänglich ausgeführt, um die Expression des hY5-Rezeptors zu optimieren. Wenn wir Sf9-, Sf21-, und High Five-Zellen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 mit hY5BB3-Viren infizierten und die Membranen 45 Stunden nach der Infektion für die Bindungsanalysen präparierten, stellten wir Bmax-Bereiche von 417 bis 820 fmol/mg Protein fest, wobei die höchste Expression die von hY5BB3 in Sf21-Zellen war. Deshalb verwendeten wir für unsere nächste Versuchsreihe Sf21-Zellen. Als nächstes untersuchten wir die optimale Multiplizität der Infektion (MOI; das Verhältnis von Virenpartikeln zu Zellen), in dem wir MOI von 1, 2, 5 und 10 testeten. Die Bmax Werte waren ≅ 1,1 – 1,2 pmol/mg Protein für für jede beliebige MOI, was die Annahme nahelegt, daß die Erhöhung der Zahl der Virenpartikeln pro Zelle weder schädlich noch vorteilhaft ist. Da die Berechnungen des Virentiters annähernd sind, verwendeten wir für die weiteren Versuche MOI = 5. Der letzte Parameter, den wir testeten, war die Zahl der Stunden der Proteinexpression nach der Infektion, die von 45 bis 96 Stunden reichte. Wir fanden, daß eine optimale Expression 45 bis 73 Stunden nach der Infektion stattfand. Zusammenfassend haben wir einen rekombinanten hY5-Baculovirus geschaffen, der 125I-PYY mit einer Bmax von ≅ 1,2 pM/mg Protein bindet.
  • Menschliches Y5-Homolog: Transiente Expression in Baculovirus-infizierten Sf21-Insektenovarien-Zellen
  • Mit einem menschlichen Y5-Baculovirus-Konstrukt infizierte Sf21-Zellen wurden als Membranhomogenate gewonnen und mit 0,08 nM Radioligand auf die spezifische Bindung von 125I-PYY abgesucht. Die spezifische Bindung war für die aus Sf-21-Zellen abgeleitete Probe D-2/[4] am größten (500 fmol/mg Membranprotein). Nach einer Infektion nur mit dem Baculovirus-Plasmid allein wurde keine spezifische Bindung beobachtet (Daten nicht dargestellt). Wenn wir annehmen, daß die Bindungsaffinität von Schweine-125I-PYY für den menschlichen Y5-Rezeptor die gleiche ist, ob nun das Expressionssystem COS-7 oder Baculovirus/Sf-21 (0,18 nM) ist, läßt die spezifische Bindung bei Probe D-2/[4] einen scheinbaren Bmax von 1600 fmol/mg Membranprotein voraussagen. Die Ausbeute von Y5-Rezeptor im Baculovirus/Sf21-Expressionssystem ist deshalb ebenso gut oder besser als jene in COS-7. Wir schließen daraus, daß das Baculovirus eine alternative Transfektionstechnik bietet, die sich für die Produktion von menschlichem Y5-Rezeptor in großen Mengen eignet.
  • Stabile Expressionssysteme für Y5-Rezeptoren: Charakterisierung in Bindungstests
  • Die cDNA für den Ratten-Y5-Rezeptor wurde stabil in 293-Zellen transfiziert, die vorher auf die Abwesenheit von spezifischer 125I-PYY-Bindung abgesucht wurden (Daten nicht gezeigt). Nach Co-Transfektion mit der Ratten-Y5-cDNA plus einem G-418-Resistenzgen und Selektion mit G-418, wurden die überlebenden Kolonien als Membranhomogenate mit 0,08 nM Radioligand auf spezifische Bindung von 125I-PYY abgesucht. Ein ausgewählter Clon (293-Clon Nr. 12) band 65 fmol 125I-PYY/mg Membranprotein und wurde zur weiteren Untersuchung in Funktionstests isoliert.
  • Die cDNA für den menschlichen Y5-Rezeptor wurde stabil sowohl in NIH-3T3 als auch in LM(tk-)-Zellen transfiziert, von denen alle auf das Fehlen von spezifischer 125I-PYY-Bindung abgesucht worden waren (Daten nicht gezeigt). Nach Co-Transfektion mit der menschlichen Y5-cDNA plus einem G-418-Resistenzgen und Selektion mit G-418, wurden die überlebenden Kolonien als Membranhomogenate mit 0,08 nM Radioligand auf spezifi sche Bindung von 125I-PYY abgesucht. Der NIH-3T3-Clon Nr. 8 band 46 fmol 125I-PYY/mg Membranprotein und der LM(tk-)-Clon Nr. 7 band 32 fmol 125I-PYY/mg Membranprotein. Diese beiden Clone wurden zur weiteren Untersuchung in Bindungs- und cAMP-Funktionstests isoliert. Ein dritter Clon, LM(tk-) Nr. 3, der 25 fmol/mg Membranprotein band, wurde mit Calcium-Mobilisierungstests untersucht.
  • Das in NIH-3T3-Zellen (Clou Nr. 8) stabil exprimierte menschliche Y5 wurde in Sättigungs-Bindungstests unter Verwendung von 125I-PYY weiter untersucht. Die Bindung war über einen Konzentrationsbereich von 0,4 pM bis 1,9 nM sättigbar. Die Bindungsdaten waren passend zu einem Ein-Stellen-Bindungsmodell mit einer scheinbaren Kd von 0,30 nM (pKd = 9,53, n = 1) und einen scheinbaren Bmax von 2100 fmol/mg Membranprotein bei Verwendung frischer Membranen.
  • Der in LM(tk-)-Zellen (Clon Nr. 7) stabil exprimierte menschliche Y5 wurde in Sättigungs-Bindungstests unter Verwendung von 125I-PYY, 125I-PYY3–36 und 125I-NPY weiter untersucht. Die 125I-PYY-Bindung war gemäß einem Ein-Stellen-Modell über einen Konzentrationsbereich von 0,4 pM bis 1,9 nM sättigbar, mit einer scheinbaren Kd von 0,47 nM (pkd = 9,32 ± 0,07, n = 5) und einen scheinbaren Bmax von bis zu 8 pmol/mg Membranprotein, wenn die Membranen tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert worden waren. Die Ki-Werte der Peptide, die aus der Bindung des 125I-PYY an menschliche Y5-Rezeptoren von LM(tk-) abgeleitet wurden, waren jenen vergleichbar, die aus den vorstehend beschriebenen menschlichen und Ratten-Y5-Expressionssystemen abgeleitet wurden (Tabelle 6). An menschliches Y5 in LM(tk-)-Zellen gebundenes 125I-PYY3_36 war gemäß einem Ein-Stellen-Modell über einen Konzentrationsbereich von 0,5 pM bis 2,09 nM sättigbar, mit einer scheinbaren Kd von 0,40 nM (pKd = 9,40 ± 0,07, n = 1) und einem scheinbaren Bmax von 490 fmol/mg Membranprotein, wenn die Membranen tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert worden waren. Die Peptidliganden schienen in LM(tk-)-Zellen mit vergleichbarer Affinität an menschliche Y5-Rezeptoren zu binden, ob nun der verwendete Radioligand 125I-PYY oder 125I-PYY3_36 war (Tabelle 6). Schließlich war an menschliches Y5 in LM(tk-)-Zellen gebundenes 125I-NPY gemäß einem Ein-Stellen-Modell über einen Konzentrationsbereich von 0,4 pM bis 1,19 nM sättigbar, mit einer scheinbaren Kd von 0,28 und einem scheinbaren Bmax von 360 fmol/mg Membranprotein, wenn die Membranen tiefgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert worden waren.
  • Betrachtet man die Sättigungsbindungstests für den menschlichen und Ratten-Y5-Rezeptor-Homologen als Ganzes, liefern die Daten Hinweise darauf, daß der Y5-Rezeptor ein Ziel für mehrere radiojodierte Peptidanaloga der pankreatischen Polypeptidfamilie ist, darunter 125I-PYY, 125I-NPY, 125I-PYY3–36 und 125I-[Leu31, Pro34] PYY. Die sogenannten Y1- und Y2-selektiven Radioliganden, wie 125I-[Leu31, Pro34] PYY bzw. 125I-PYY3–36 (Dumont et al., 1995) sollten beim Sondieren von nativen Geweben auf Y-Typ-Rezeptor-Expression mit Vorsicht eingesetzt werden.
  • Rezeptor/G-Protein-Wechselwirkungen: Wirkungen von Guaninnucleotiden
  • Für einen gegebenen G-Protein-gekoppelten Rezeptor kann ein Anteil der Rezeptorpopulation typischerweise durch die Hochaffinitäts-Ligandenbindungsstelle charakterisiert werden, indem man unterscheidende Antagonisten verwendet. Die Bindung von GTP oder eines nichthydrolysierbaren Analogons an das G-Protein verursacht eine Veränderung der Konformation des Rezeptors, die einen Ligandenbindungszustand niedriger Affinität bevorzugt. Wir untersuchten, ob das nicht-hydrolysierbare GTP-Analogon Gpp (NH) p die Bindung von 125I-PYY an Y5 in COS-7- und LM(tk-)-Zellen verändert (19). 125I-PYY, und das sowohl an menschliche als auch an Ratten-Y5-Rezeptoren in COS-7-Zellen bindet, war relativ unempfindlich gegen steigende Konzentrationen von Gpp (NH) p, die von 1 nM bis 100 μM reichten. Der menschliche Y5-Rezeptor in LM(tk-) Zellen jedoch wies eine konzentrationsabhängige Abnahme von Radioliganden-bindendem Membranprotein auf (–85 fmol/mg Membranprotein über den ganzen Konzentrationsbereich). Der Unterschied zwischen den Rezeptor-Präparationen konnte mit verschiedenen Faktoren erklärt werden, darunter 1) die Typen von G-Proteinen, die in der Wirtszelle zur Unterstützung eines Hochaffinitäts-Rezeptor-Agonist-Komplexes verfügbar sind, 2) der Spiegel der Rezeptor-Reserve in der Wirtszelle, 3) die Wirksamkeit der Rezeptor/G-Protein-Kopplung, und 4) die inwohnende Fähigkeit des Agonisten (in diesem Fall 125I-PYY), zwischen verschiedenen Konformationen des Rezeptors zu unterscheiden.
  • Funktionstest
  • Man nimmt an, daß die Aktivierung aller bisher beschriebener Y-Typ-Rezeptoren mit einer Kopplung an G-Proteine einhergeht, die Adenylatcyclasektivität (Gi oder Go) hemmen (Wahlestedt und Reis, 1993), und die gegen Pertussisches Toxin sensitiv sind. Der Gedanke, daß der atypische Y1-Rezeptor mit der Cyclase-Hemmung in Verbindung stehen könnte, wurde durch die Beobachtung geliefert, daß Pertussisches Toxin die NPY-induzierte Nahrungsaufnahme in vivo hemmte (Chance et al., 1989); eine definitivere Analyse war in Ermangelung des isolierten Rezeptors nicht möglich. Gestützt auf diese vorhergehenden Beobachtungen, untersuchten die Patentanmelder die Fähigkeit von NPY, die Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation in menschlichen embryonalen 293-Nierenzellen zu hemmen, die stabil mit Ratten-Y5-Rezeptoren transfiziert waren. Die Inkubation von intakten Zellen mit 10 μM Forskolin bewirkte eine 10fache Steigerung der cAMP-Akkumulation über einen Zeitraum von 5 Minuten, wie mit einem Radioimmnuntest festgestellt wurde. Simultane Inkubation mit Ratten-/menschlichem NPY verringerte die Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation um 67% in stabil transfizierten Zellen (12), doch nicht in nichttransfizierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Die Patentanmelder schließen daraus, daß die Ratten-Y5-Rezeptor-Aktivierung zu einer verringerten CAMP-Akkumulation führt, sehr wahrscheinlich durch die Hemmung der Aktivität der Adenylatcyclase. Dieses Ergebnis stimmt mit dem vorgeschlagenen Signalisierungsweg für alle Y-Typ Rezeptoren und für den atypischen Y1-Rezeptor im besonderen überein.
  • Peptide, die aufgrund ihrer Fähigkeit, das Nahrungsaufnahmeverhalten bei Ratten zu stimulieren, ausgewählt wurden, waren auch in der Lage, den Ratten-Y5-Rezeptor mit EC50 < 10 nM zu aktivieren (Kalra et al., 1991; Stanley et al., 1992; Balasubramaniam et al., 1994). Dazu zählen Ratten-/menschliches NPY (EC50 = 1,8 nM), Ratten-/menschliches NPY2_36 (EC50 = 2,0 nM), Ratten-/menschliches [Leu31, Pro34] NPY (EC50 = 0,6 nM), Ratten-/Schweine-PYY (EC50 = 4,0 nM), und Ratten-/menschliches [D-Trp32] NPY (EC50 = 7,5 nM) (Tabelle 8). Die von der Ratten-Y5-abhängigen Bindung von 125I-PYY und Peptidliganden abgeleiteten Ki-Werte (Tabelle 5) waren in der Nähe der aus der Ratten-Y5abhängigen Regulierung der cAMP-Akkumulation abgeleiteten EC50-Werte (Tabelle 8). Die maximale Suppression von cAMP, die von allen Peptiden in Tabelle 6 hervorgerufen wurde, betrug zwischen 84% und 120% der von menschlichem NPY hervorgerufenen, außer im Fall des FLRFamids (42%). Von besonderem Interesse ist das Y5-selektive Peptid [D-Trp32] NPY. Dies ist ein Peptid, von dem gezeigt wurde, daß es die Nahrungsaufnahme stimuliert, wenn es in den Ratten-Hypothalamus injiziert wird, und das unter den gleichen Bedingungen auch die NPY-induzierte Nahrungsaufnahme abschwächte (Balasubramaniam, 1994). Die Patentanmelder beobachteten, daß [D-Trp32] NPY schwach an andere Y-Typ-Clone band, mit Ki > 500 nM (Tabellen 4 und 5) und in Funktionstests keine Aktivität aufwies (Tabelle 10). In frappierendem Gegensatz dazu band [D-Trp32] NPY an den Ratten-Y5-Rezeptor mit einer Ki = 53 nM und war mit einem EC50 von 25 nM und einem Emax = 72% uneingeschränkt dazu in der Lage, die Inhibitionswirkung von NPY auf die Forskolin-stimulierte cAMP-Akku mutation zu mimen. Daß [D-Trp32] NPY dazu in der Lage war, selektiv den Y5-Rezeptor zu aktivieren, während es auf andere Subtyp-Clone keine feststellbare Wirkung hatte, legt die Vermutung sehr nahe, daß die Y5-Rezeptor-Aktivierung für die stimulierende Wirkung von [D-Trp32] NPY auf das Nahrungsaufnahmeverhalten in vivo verantwortlich ist.
  • Tabelle 8: Funktionsaktivierung des Ratten-Y5-Rezeptors
  • Die Funktionsdaten wurden aus einem Radioimmuntest der cAMP-Akkumulation in mit 10 μM Forskolin stimulierten, stabil transfizierten 293-Zellen abgeleitet. Die Peptide wurden bei Konzentrationen von 0,03 pM bis 0,3 μM auf ihre Antagonistenaktivität geprüft. Die maximale Hemmung von cAMP-Akkumulation (Emax) und die Konzentration, die eine halbmaximale Wirkung hervorruft (EC50) wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse nach einer 4-Parameter logistischen Gleichung bestimmt. Neue Peptide sind mit ** markiert.
  • TABELLE 8
    Figure 00730001
  • Die Fähigkeit des menschlichen Y5-Rezeptors, die cAMP Akkumulation zu hemmen, wurde in NIH-3T3- und LM(tk-)-Zellen bewertet, von denen keine eine NPY-abhängige Regulierung von [cAMP] ohne das Y5-Konstrukt aufweist. Intakte, stabil mit dem menschlichen Y5-Rezeptor transfizierte Zellen wurden wie vorstehend beim Ratten-Y5-cAMP-Test be schrieben untersucht. Die Inkubation stabil transfizierter NIH-3T3-Zellen mit 10 μM Forskolin führte zu einer durchschnittlich 21-fachen Steigerung der [cAMP] (n = 2). Die simultane Inkubation mit menschlichem NPY verringerte die Forskolin-stimulierte [cAMP] mit einem Emax von 42% und einem EC50 von 8,5 nM (20). Die Technik des Suspendierens und anschließenden Wiederausplattierens der Y5-transfizierten LM(tk-)-Zellen ging mit einer kräftigen und verläßlichen Zellreaktion auf NPY-artige Peptide einher wurde deshalb in die Standard-Methodologie für die funktionelle Bewertung des menschlichen Y5 in LM(tk-) einbezogen. Die Inkubation stabil transfizierter LM(tk-)-Zellen, die auf diese Weise präpariert waren, führte zu einer durchschnittlich 7,4-fachen Zunahme von [cAMP] (n = 87). Simultane Inkubation mit menschlichem NPY verringerte die Forskolin-stimulierte [cAMP] mit einem Emax von 72% und einem EC50 von 2,4 nM (21). Der menschliche Y5-Rezeptor unterstützte eine zelluläre Antwort auf NPY-artige Peptide in einer Reihenfolge, die jener entspricht, die für den Ratten-Y5-Rezeptor (Tabelle 8, 9) beschrieben wurde. Da der Ratten-Y5-Rezeptor durch D-Trp32-NPY und andere pharmakologische Mechanismen klar mit der NPYabhängigen Regulierung des Nahrungsaufnahmeverhaltens verbunden ist, kann dies in ähnlicher Weise auch für den menschlichen Y5-Rezeptor vorhergesagt werden. Sowohl der menschliche Rezeptor als auch die Rezeptor-Homologen stellen nützliche Modelle zum Absuchen von Verbindungen dar, die zur Beeinflussung des Nahrungsaufnahmeverhaltens durch Einwirkung auf die NPY-abhängigen Regulierungswege gedacht sind.
  • TABELLE 9: Funktionsaktivierung des menschlichen Y5-Rezeptors in einem cAMP-Radioimmuntest
  • Die Funktionsdaten wurden aus einem Radioimmuntest der cAMP-Akkumulation in stabil transfizierten, mit 10 μM Forskolin stimulierten LM(tk-)-Zellen abgeleitet. Die Peptide wurden in einem Konzentrationsbereich von 0,03 pM bis 0,3 μM auf Agonistenaktivität getestet. Die maximale Hemmung der cAMP-Akkumulation (Emax) und die Konzentration, die eine halbmaximale Wirkung hervorruft (EC50) wurden durch nichtlineare Regressionsanalyse nach einer 4-Parameter logistischen Gleichung bestimmt.
  • TABELLE 9
    Figure 00740001
  • Figure 00750001
  • Tabelle 10: Bindungs- und funktionelle Charakterisierung von [D-Trp32] NPY.
  • Die Bindungsdaten wurden wie in den Tabellen 4 und 5 beschrieben generiert. Die Funktionsdaten wurden aus dem Radioimmuntest der cAMP-Akkumulation in stabil transfizierten, mit 10 μM Forskolin stimulierten Zellen abgeleitet. [D-Trp32] NPY wurde in einem Konzentrationsbereich von 0,03 pM bis 0,3 μM auf Agonistenaktivität getestet. Alternativ wurde [D-Trp32] NPY als einzelne Spitze (0,3 μM) in die Konzentrationskurve des menschlichen PYY für den menschlichen Y1- und den menschlichen Y2-Rezeptor oder in die Konzentrationskurve des menschlichen PP für die menschlichen Y4-Rezeptoren beigegeben, und die Agonistenaktivität wurde durch Auftreten einer Rechtsverschiebung (von EC50 zu EC50') festgestellt. Die Kb-Werte wurden nach folgender Gleichung berechnet: Kb = [[D-Trp32] NPY/((EC50/ EC50') – 1).
  • Die gezeigten Daten sind für wenigstens zwei unabhängige Versuche repräsentativ.
  • TABELLE 10
    Figure 00750002
  • Figure 00760001
  • Funktionstest: Intrazelluläre Calciummobilisierung
  • Die intrazelluläre Konzentration des freien Calciums war in stabil mit dem menschlichen Y5-Rezeptor transfizierten LM(tk-)-Zellen innerhalb von 30 Sekunden nach der Inkubation mit 100 nM menschlichem NPY (Δ Ca2+ = 34, 21D) erhöht. Nichttransfizierte LM(tk-)-Zellen reagierten nicht auf menschliches NPY (Daten nicht gezeigt). Die Calciummobilisierung liefert einen zweiten Weg, auf dem die Aktivierung des Y5-Rezeptors gemessen werden kann. Diese Daten dienen auch dazu, den Y5-Rezeptor mit anderen clonierten menschlichen Y-Typ-Rezeptoren zu verbinden, von denen gezeigt wurde, daß sie alle das intrazelluläre Calcium in verschiedenen Expressionssystemen mobilisieren (21).
  • Lokalisierungsstudien
  • Die mRNA für den NPY-Y5-Rezeptor war in weiten Bereichen des Rattenhirns zu finden und schien mäßig häufig zu sein (Tabelle 11 und 13). Der Mittellinienthalamus enthielt viele Neurone mit Silberkörnchen, besonders der Nucleus paraventricularis thalami, der Nucleus rhomboideus, und die Nucleus-Verbindungen. Weiterhin wurden mittelintensive Hybridisierungssignale auf Neuronen sowohl in den centromedialen als auch in den anterodorsalen Nuclei thalami beobachtet. Im Hypothalamus war ein mäßiges Hybridisierungssignal auf verstreuten Neuronen im lateralen Hypothalamus, in den paraventrikulären, supraoptischen, arcuaten, und dorsomedialen Nuclei zu sehen. Sowohl im medialen präoptischen Nucleus als auch im suprachiasmatischen Nucleus waren schwache oder mäßige/mittlere Ansammlungen von Silberkörnchen vorhanden. Im suprachiasmatischen Nucleus war das Hybridisierungssignal hauptsächlich auf die ventrolaterale Unterabteilung beschränkt. Im paraventrikulären Hypothalamus wurden positive Neuronen in erster Linie in der medialen parvizellulären Unterabteilung beobachtet.
  • Tabelle 11: Verteilung von NPY-Y5-mRNA im Ratten-ZNS
    Figure 00770001
  • Mäßige Hybridisierungssignale wurden auf den meisten Neuronen in der polymorphen Region des Gyrus dentatus im Hippocampus gefunden, während auf den verstreuten Neuronen der CA3-Region niedrigere Spiegel zu sehen waren. In der Amygdala enthielten der Nucleus centralis und der vordere Nucleus corticalis Neuronen mit einem mäßigen Spiegel von Hybridisierungssignal. Im Mittelhirn wurden Hybridisierungssignale in einer Anzahl von Re gionen beobachtet. Die intensivsten Signale wurden auf den Neuronen in den Nuclei olivares anterioris und pretectalis, im periaquaeductalen Grau und über der rostralen Linearraphe beobachtet. Mäßige Hybridisierungssignale wurden auf den Neuronen in der inneren grauen Schicht des oberen Colliculus, der Substantia nigra, pars compacta, der Rückenraphe und der Nuclei pontis beobachtet. Die meisten Neuronen des unteren Colliculus zeigten einen niedrigen Signalspiegel. In der Medulla und der Pons zeigten nur wenige Regionen substantielle Hybridisierungssignale. Der Nucleus vestibularis medialis war mäßig markiert, ebenso der Nucleus reticularis parvicellularis, pars alpha und der Nucleus reticularis gigantocellularis.
  • Ein geringes oder gar kein Hybridisierungssignal wurde in Abschnitten beobachtet, die mit der radioaktiv markierten Sinn-Oligonucleotid-Sonde hybridisiert hatten. Wichtiger noch, in den transfizierten COS-7-Zellen hybridisierte die Gegensinn-Sonde nur mit den Ratten-Y5cDNA transfizierten Zellen (Tabelle 12). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Sonde, die zur Charakterisierung der Verteilung von Y5-mRNA in Rattenhirn verwendet wurde, für diese mRNA spezifisch ist und mit keiner der anderen bekannten NPY-Rezeptor-mRNAs kreuzhybridisiert.
  • Tabelle 12: Hybridisierng von Gegensinn-Oligonucleotidsonden mit transfizierten COS-7-Zellen.
  • Die Hybridisierung wurde wie in „Methoden" beschrieben ausgeführt. Die NPY-Y5-Sonde hybridisiert nur mit Zellen, die mit der Y5-cDNA transfiziert sind. ND = nicht ausgeführt.
  • Figure 00780001
  • In vivo-Studien mit Y5-selektiven Verbindungen
  • Die vorstehend dargelegten Ergebnisse sprechen sehr dafür, daß der Y5-Rezeptor eine Rolle bei der Regulation des Nahrungsaufnahmeverhaltens spielt. Dementsprechend haben die Patentanmelder die Bindungs- und funktionalen Eigenschaften von mehreren Verbindungen an die clonierten menschlichen Y1-, menschlichen Y2-, menschlichen Y4- und menschlichen Y5-Rezeptoren synthetisiert und bewertet. Wie in Tabelle 13 gezeigt, haben die Patent anmelder mehrere Verbindungen entdeckt, die nicht nur selektiv an den menschlichen Y5-Rezeptor binden, sondern auch als Y5-Rezeptor-Antagonisten wirken, ausweislich ihrer Fähigkeit, die NPY-induzierte Hemmung von cAMP-Akkumulation in Forskolin-stimulierten, mit dem clonierten menschlichen Y5-Rezeptor stabil transfizierten LM(tk-)-Zellen zu blockieren. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist in 22 gezeigt. Vorab durchgeführte Versuche deuten darauf hin, daß die Verbindung 28 ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  • Tabelle 13: Bewertung von menschlichen Y5-Rezeptor Antagonisten
  • Die Fähigkeit von Verbindungen, den Y-Typ Rezeptor zu antagonisieren, wird als Kb-Wert bezeichnet. Der Kb ist vom EC50, der Konzentration der halbmaximalen Wirkung in Gegenwart (EC50) und in Abwesenheit (EC50') von Verbindung abgeleitet, und zwar gemäß der Gleichung: Kb = [NPY]/((EC50/EC50') – 1).
  • Die gezeigten Ergebnisse sind für wenigstens drei unabhängige Versuche repräsentativ. N.D. = Nicht bestimmt.
  • TABELLE 13
    Figure 00790001
  • Diese Verbindungen wurden mit in vivo-Tiermodellen für das Nahrungsaufnahmeverhalten weiter getestet. Da NPY das stärkste bekannte Stimulans des Nahrungsaufnahmeverhaltens ist, wurden die Versuche mit mehreren Verbindungen ausgeführt, um die Wirkung der vorstehend beschriebenen Verbindungen auf NPY-induziertes Nahrungsaufnahmeverhalten bei gesättigten Ratten zu bewerten.
  • Zuerst wurden 300 pmole Schweine-NPY in Vehikel (A.C.S.F.) durch intracerebroventriculäre (i.c.v.) Injektion verabreicht, zusammen mit i.p. Verabreichung von Verbindungsvehikel (10% DMSO/Wasser), und die Nahrungsaufnahme der NPY-stimulierten Tiere wurde mit der Nahrungsaufnahme der mit den Vehikeln behandelten Tiere verglichen. Es zeigte sich, daß die 300 pmole-Injektion von NPY die Nahrungsaufnahme signifikant induzierte (p < 0,05; Student-Newman-Keuls).
  • Mit der 300 pmole-Dosis NPY, die sich als wirksam zur Stimulierung der Nahrungsaufnahme erwiesen hatte, wurden andere Tiere mit den Verbindungen durch intraperitoneale (i.p.) Verabreichung behandelt, der 30–60 Minuten später eine i.c.v. NPY-Verabreichung und die Messung der darauffolgenden Nahrungsaufnahme folgte. Wie in Tabelle 14 gezeigt, war die NPY-induzierte Nahrungsaufnahme bei Tieren, die zuerst mit den Verbindungen behandelt worden waren, signifikant reduziert (p < 0,05; Student-Newman-Keuls). Diese Versuche zeigen daß die NPY-induzierte Nahrungsaufnahme durch Verabreichung einer Verbindung, die ein selektiver Y5-Antagonist ist, signifikant reduziert wird.
  • Tabelle 14: NPY-induzierte kumulative Nahrungsaufnahme bei Ratten, die entweder mit dem i.c.v.- und dem i.p.-Vehikel (Kontrolle), 300 pmole NPY allein (NPY) behandelt wurden, oder bei Ratten, die mit der ersten Verbindung und dann mit NPY behandelt wurden (NPY+ Verbindung). Die Nahrungsaufnahme wurde 4 h nach der Stimulation mit dem NPY gemessen. Die Nahrungsaufnahme wird als Mittelwert ± S.E.M für eine Gruppe von Tieren angegeben.
  • TABELLE 14
    Figure 00800001
  • Da die Nahrungsdeprivation ein Ansteigen des Hypothalamus-NPY-Spiegels induziert, wurde postuliert, daß die Nahrungsaufnahme im Anschluß an einen Zeitraum der Nahrungsdeprivation NPY-vermittelt ist. Deshalb wurden die Y5-Antagonisten aus Tabelle 13 nach einer 24-ständigen Nahrungsdeprivation an Ratten verabreicht, die bei Bewußtsein waren. Jeder der in Tabelle 13 gezeigten menschlichen Y5-Rezeptor-Antagonisten war in der Lage, die NPY-induzierte Nahrungsaufnahme der Tiere signifikant zu verringern, wie nachstehend in Tabelle 15 gezeigt. Die Nahrungsaufnahme der mit der Testverbindung behandelten Tieren ist als Prozentsatz der Nahrungsaufnahme der Kontrolltiere (solche, die mit Vehikel behandelt wurden), das heißt, 25% bedeutet, daß die mit der Verbindung behandelten Tiere nur 25% der Futtermenge der Kontrolltiere aufnahmen. Die Messungen wurden 2 h nach der Verabreichung der Testverbindung vorgenommen.
  • Tabelle 15: Zweistunden-Nahrungsaufnahme von NPY-stimulierten Ratten.
  • Die Nahrungsaufnahme ist als Prozentsatz der Aufnahme im Vergleich zu Kontrollratten angegeben.
  • Figure 00810001
  • Diese Versuche zeigen, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Nahrungsaufnahme bei Ratten hemmten, besonders wenn sie im Bereich von ungefähr 0,01 bis ungefähr 100 mg/kg Ratte oral, intraperitoneal or intravenös verabreicht werden. Die Tiere machten während dieser Versuche einen normalen Eindruck, und nach ihrer Beendigung wurden keine Krankheitssymptome beobachtet.
  • Die Bindungseigenschaften der Verbindungen wurden auch hinsichtlich anderer, an menschliches G-Protein gekoppelter Rezeptoren bewertet. Wie in Tabelle 16 nachstehend gezeigt, wiesen die hier vorstehend beschriebenen Y-selektiven Verbindungen für andere Rezeptoren eine niedrigere Affinität auf als für die Y-Typ-Rezeptoren.
  • Tabelle 16: Kreuz-Reaktivität von Verbindungen mit anderen clonierten menschlichen Rezeptoren
    Figure 00820001
  • Tabelle 16 (Fortsetzung)
    Figure 00820002
  • Figure 00830001
  • Diskussion der Versuchsergebnisse
  • Zur Isolierung von neuen NPY-Rezeptor-Subtypen wählten die Patentanmelder einen Weg über die Expressionsclonierung, bei der ein funktioneller Rezeptor mit Hilfe eines hochspezifischen jodierten Liganden mit außerordentlicher Empfindlichkeit auf der Oberfläche von transfizierten Zellen festgestellt wird. Mit dieser Strategie haben die Patentanmelder eine Ratten-Hypothalamus-cDNA, die einen neuartigen Y-Typ-Rezeptor (Y5) codiert, festgestellt. Die Tatsache, daß die Patentanmelder 3,5 × 106 unabhängige Clone mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 2,7 kb absuchen mußten, um zwei Clone zu finden, zeigt, daß entweder das Konstruktionsverfahren der cDNA-Bank eine starke Abneigung gegen Y5-cDNA-Clonierung birgt, oder daß die Y5-mRNA im Ratten-Hypothalamusgewebe auf sehr niedrigem Spiegel exprimiert wird. Der längste Leserahmen in der Ratten Y5-cDNA (CG-18) codiert ein Protein von 456 Aminosäuren mit einem geschätzten Molekulargewicht von 50,1 kD. In Anbetracht der Tatsache, daß sich im Aminoende zwei N-gebundene Glykosylierungsstellen befinden, könnte das scheinbare Molekulargewicht etwas höher sein. Die Patentanmelder haben den menschlichen Y5-Homologen aus einer menschlichen hippocampalen cDNA-Bank isoliert. Der längste Leserahmen in der menschlichen Y5-cDNA (CG-19) codiert ein Protein aus 455 Aminosäuren mit einem geschätzten Molekulargewicht von 50 kD. Der menschliche Y5-Rezeptor ist eine Aminosäure kürzer als der Ratten-Y5-Rezeptor und zeigt signifikante Aminosäuredifferenzen sowohl in den N-terminalen als auch in den Abschnitten in der Mitte der dritten intrazellulären Loop des Proteins. Die sieben Transmembrandomänen und die extrazellulären Loops jedoch sind so gut wie identisch, und die Proteinmotive in den Homologen der beiden Spezies sind identisch. Sowohl die menschlichen als auch die Ratten-Y5-Rezeptoren haben eine große Anzahl potentieller Phosphorylierungsstellen in ihren ren haben eine große Anzahl potentieller Phosphorylierungsstellen in ihren zweiten und dritten intrazellulären Loops, die an der Steuerung ihrer funktionellen Eigenschaften beteiligt sein könnten.
  • Sowohl der Ratten- als auch der menschliche Y5-Rezeptor tragen einen Leuzin-Reißverschluß in der ersten mutmaßlichen Transmembrandomäne. Es wurde vorgeschlagen, daß in einer solchen Struktur Abschnitte existieren, die periodische Anordnungen von Leuzinresten in alphahelikaler Anordnung enthalten. Die Leuzin-Seitenketten, die sich von einer Alphahelix weg erstrecken, interagieren mit jenen einer ähnlichen Alphahelix aus einem zweiten Polypeptid und erleichtern die Dimerbildung durch Ausbildung einer gewundenen Wicklung („coiled coil"; 0' Shea et al., 1989). Gewöhnlich werden solche Muster mit Kern-DNAbindenden Proteinen, wie c-myc, c-fos und c-jun in Verbindung gebracht, doch es ist möglich, daß in einigen Proteinen die Leuzinwiederholung einfach die Dimerbildung erleichtert und mit der Positionierung einer DNA-bindenden Region wenig zu tun hat. Weitere Hinweise, die die These, wonach die Dimerbildung von sieben spezifischen Transmembranrezeptoren vorkommen kann, ergibt sich aus Co-Expressionsversuchen mit muscarinischen/adrenergischen Rezeptoren, bei denen intermolekularer „cross-talk" zwischen chimären G-Protein-gekoppelten Rezeptoren beschrieben wurde (Maggio et al., 1993). Die Tyrosin-Phosphorylierungsstelle in der Mitte dieses Leuzinzippers in der Transmembrandomäne I (TM I) könnte an der Steuerung der Dimerbildung des Y5-Rezeptors beteiligt sein. Die physiologische Bedeutung der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Dimerbildung bleibt noch zu klären, doch aufgrund von Analogie mit der Oligomerbildung von Peptidhormonrezeptoren könnte es an der Aktivierung von Rezeptoren und an der Signalübermittlung beteiligt sein (Wells, 1994).
  • Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzanalyse von Y5 (von Ratten und Menschen) zeigt niedrige Identitätsspiegel bei allen 7 TM-Rezeptoren, einschließlich der Y1-, Y2- und Y4-Rezeptoren, selbst in den Transmembrandomänen, die normalerweise innerhalb der Rezeptor-Subfamilien hochgradig konserviert sind. Die Patentanmelder haben CG-18 und CG-19 wegen ihrer der einzigartigen Aminosäuresequenz (87,2% identisch miteinander, ≤42% Identität mit den TM-Regionen der bisher clonierten „Y"-Rezeptor-Subtypen) und ihres pharmakologischen Profils als „Y5"-Rezeptoren bezeichnet. Die Bezeichnung weist auf keinen der anderen Angehörigen der pankreatischen Polypeptidfamilie hin. Das "Y" geht auf die ursprüngliche Klassifizierung von Y1- und Y2-Rezeptor-Subtypen (Wahlestedt et al., 1987) zurück. Der Buchstabe spiegelt die Konservierung des C-terminalen Tyrosins innerhalb der pankreatischen Polypeptidfamilie, das im Einbuchstaben-Aminosäurecode als „Y" bezeichnet wird, wider. Die Zahl ist die nächste verfügbare der Y-Typen-Reihe, wobei die Nr. 3 für den pharmakologisch definierten Y3-Rezeptor reserviert ist. Die Patentanmelder bemerken, daß der clonierte menschliche Y1-Rezeptor von Larhammar und Mitarbeitern als ein „menschlicher Neuropeptid Y/Peptid YY-Rezeptor des Y1-Typs" (Larhammar et al., 1992) eingeführt wurde. Ähnlicherweise können die in dieser Arbeit beschriebenen neuartigen Clone als Ratten- und menschliche Neuropeptid Y/Peptid YY-Rezeptoren des Y5-Typs beschrieben werden.
  • Der Y5-Rezeptor aus dem Ratten-Hypothalamus zeigt ein pharmakologisches Profil, das dem als pharmakologisch „atypisch" beschriebenen Y1-Rezeptor, von dem man annimmt, daß er die NPY-induzierte Nahrungsaufnahme im Ratten-Hypothalamus steuert, sehr ähnlich ist. Sowohl der Y5-Rezeptor als auch der „Nahrungsaufnahmerezeptor" zeigen eine Präferenz für NPY und PYY-artige Analoga, eine Sensibilität gegen N-terminale Peptiddeletion und eine Toleranz für Pro34. Beide könnten als Y1-artig betrachtet werden, mit Ausnahme der anomalen Fähigkeit von NPY2–36, ebenso wie NPY an sie zu binden und sie zu aktivieren. Beide scheinen empfindlich für Veränderungen in der Mittelregion des Peptidliganden zu sein. Beispielsweise zeigte eine Studie von Kalra und Kollegen (1991), daß das Ersetzen der NPY-Mittelregion durch eine Amino-oktanoide Kette und damit Erzeugung von NPY1–4-Aca-25–36 die Aktivität in einem Versuch zum Nahrungsaufnahmeverhalten dramatisch verringerte. Ähnlicherweise bemerken die Patentanmelder, daß die beständige Differenz zwischen der menschlichen PP-Bindung (Ki = 5,0 nM) und der Ratten-PP-Bindung (Ki = 230) auf eine Reihe von 8 Aminosäuren-Veränderungen zwischen den Resten 6–30 in den Peptidliganden zurückgeführt werden kann, wobei menschliches PP die größere Ähnlichkeit zum menschlichem NPY hat. Man bemerke auch, daß FLRFAmid, ein strukturelles Analogon des FMRFAmid-Peptids, von dem berichtet wird, daß es die Nahrungsaufnahme bei Ratten stimuliert, in der Lage war, an den Ratten-Y5-Rezeptor zu binden und diesen zu aktivieren, wenn auch nur bei relativ hohen Konzentrationen (Orosco et al., 1989). Diese übereinstimmenden Profile, in Verbindung mit einer selektiven Aktivierung des Ratten-Y5 durch das als Nahrungsaufnahme-„Modulator" beschriebene [D-Trp32] NPY, stützen die Annahme der Identität des Ratten-Y5 und jenes „Nahrungsaufnahme-Rezeptors" im Ratten-Hypothalamus, der anfänglich zur Erklärung der NPY-induzierten Nahrungsaufnahme vorgeschlagen wurde. Daß der menschliche Y5-Rezeptor sowohl in Bindungs- als auch in Funktionstests ein ähnliches pharmakologisches Profil wie das des Ratten-Y5 hat, legt nahe, daß die beiden Rezeptoren in vivo ähnliche Funktionen haben könnten.
  • Die Verteilung der Y5-mRNA im Rattenhirn unterstützt weiterhin die Vermutung einer Rolle des Y5-Rezeptors beim Nahrungsaufnahmeverhalten. Beispielsweise wurde als anatomischer Ort der Nahrungsaufnahmereaktion mindestens teilweise der paraventrikuläre hypothalamische Nucleus (PVN) und auch der seitliche Hypothalamus vorgeschlagen, zwei Stellen, an denen Y5-mRNA in großen Mengen festgestellt wurde. Eine postsynaptische Lokalisierung des Y5-Rezeptors in diesen beiden Regionen kann die Reaktion auf endogen freigesetztes NPY in vivo regulieren. Der paraventrikuläre Nucleus erhält Ausstrahlungen von NPY-enthaltenden Neuronen im Nucleus arcuatus, einer weiteren Region, in der Y5-mRNA festgestellt wurde. Dies weist auf eine präsynaptische Rolle des Y5-Rezeptors bei der Steuerung der NPY-Freisetzung über die arcuato-paraventrikuläre Projektion, und folglich bei der Steuerung des Nahrungsaufnahmeverhaltens hin. Die Lokalisierung der Y5-mRNA in den Nuclei thalami der Mittellinie ist ebenfalls wichtig. Der Komplex des Nucleus thalami paraventricularis/Nucleus centromedialis strahlt stark zum paraventrikulären Hypothalamus und zur Amygdala. Als solcher ist der Y5-Rezeptor ein Substrat für die emotionalen Aspekte des Appetitverhaltens.
  • Y5-Rezeptoren sind aufgrund mehrerer Forschungslinien hochattraktive Ziele für Appetits- und Gewichtskontrolle (Sahu und Kalra, 1993). NPY ist das stärkste Stimulans des Nahrungsaufnahmeverhaltens, das bisher beschrieben wurde (Clark et al., 1984; Levine und Morley, 1984; Stanley und Leibowitz, 1984). Direkte Injektion von NPY in den Hypothalamus von Ratten kann die Nahrungsaufnahme über einen Zeitraum von 4 h um das ≅ 10fache vergrößern (Stanley et al., 1992). NPY-stimulierte Ratten zeigen eine Präferenz für Kohlenhydrate gegenüber Protein und Fett (Stanley et al., 1985). Interessanterweise sind NPY und NPY-mRNA bei nahrungsdeprivierten Ratten erhöht (Brady et al., 1990; O'Shea und Gundlach, 1991), und ebenso bei Ratten die genetisch fettleibig sind (Sanacora et al., 1990) oder durch Behandlung mit Streptozotocin diabetisch gemacht wurden (White et al., 1990). Eine mögliche Erklärung ist die, daß die Regulation von NPY, ein starkes Stimulans des Nahrungsaufnahmeverhaltens bei normalen Ratten, bei den übergewichtigen oder diabetischen Tieren gestört ist, womit Fettleibigkeit einhergeht. Der physiologische Streß der Fettleibigkeit erhöht das Risiko für Gesundheitsprobleme, wie Herz-Kreislauf-Dysfunktion, Osteoarthritis und Hyperinsulinämie, und sie verschlechtern auch die Prognose bei Erwachsenen-Diabetes. Ein Nichtpeptid-Antagonist gegen den Y5-Rezeptor könnte deshalb als Mittel zur Kontrolle nicht nur des Appetits und des Körpergewichtes sondern auch einer ganzen Reihe von mit Fettleibigkeit und Diabetes zusammenhängenden Funktionsstörungen (Dryden et al., 1994) wirkungsvoll sein. Es gibt auch neurochemische Hinweise, die kungsvoll sein. Es gibt auch neurochemische Hinweise, die nahelegen, daß NPY-vermittelte Funktionen bei Eßstörungen wie Bulimia und Anorexia nervosa gestört sind, so daß sie ebenfalls auf eine Behandlung mit einem Y5-selektiven Wirkstoff ansprechen könnten. Es wurde zum Beispiel vorgeschlagen, daß die Nahrungsaufnahme bei NPY-stimulierten Ratten die massive Nahrungsaufnahme imitiert, die bei Bulimie mit Freßsucht einhergeht (Stanley, 1993). Die CSF-Spiegel von PYY, nicht jedoch die von NPY und waren hoch bei Bulimiepatienten, die sich der Freßsucht enthielten, und nahm dann ab, wenn die Freßsucht erlaubt wurde (Berrettini et al., 1988). Im Gegensatz dazu waren die NPY-Spiegel bei untergewichtigen Anorexiepatienten erhöht und nahmen in dem Maß ab, in dem sich das Körpergewicht normalisierte (Kaye et al., 1990).
  • Wie vorstehend beschrieben, wurden die menschlichen und Ratten-in vitro-Expressionsmodelle in Kombination angewandt, um Verbindungen abzusuchen, die NPY-abhängige Nahrungsaufnahmeverhalten steuern sollten. Mit dieser Vorgehensweise haben die Patentanmelder mehrere Verbindungen entdeckt, die das Nahrungsaufnahmeverhalten bei Tiermodellen hemmen, und die zur Entdeckung weiterer Wirkstoffe führen sollten. Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung hemmten die Nahrungsaufnahme von fettleibigen Zucker-Ratten in einem Bereich von ungefähr 0,01 bis ungefähr 100 mg/kg nach oraler, intraperitonealer oder intravenöser Verabreichung.
  • Das pharmakologische Profil des Y5 bietet weiterhin einen neuen Standard, nach dem die molekulare Basis aller NPY-abhängigen Prozesse zu überprüfen ist; Beispiele sind in Tabelle 11 aufgeführt. Eine solche Übung legt nahe, daß der Y5-Rezeptor wahrscheinlich eine physiologische Bedeutung über das Nahrungsaufnahmeverhalten hinaus haben wird. Es wurde zum Beispiel berichtet, daß ein Y-Typ-Rezeptor die Ausschüttung des Luteinisierendes Hormon-Releasing-Hormons (LHRH) aus dem medianen Vorsprung von Steroidbehandelten Ratten in vitro mit dem pharmakologischen Profil eines atypischen Y1 regulieren kann. NPY, NPY2–36 und LP-NPY waren alle bei 1 μM wirksam, doch die Deletion von nur vier Aminosäuren vom N-Ende des NPY zerstörte ihre biologische Aktivität. Der Y5 kann deshalb ein Therapieziel für sexuelle oder Fortpflanzungsstörungen darstellen. Vorab-in-situ-Hybridisierungen von Ratten-Y5 mRNA im Hippocampus und anderswo legen weiterhin nahe, daß noch weitere Rollen entdeckt werden, beispielsweise bei der Regulation des Gedächtnisses. Man sollte auch in Betracht ziehen, daß das pharmakologische Profil des Y5 dem der anderen Y-Typ Rezeptoren so ähnlich ist, daß dies bisher in einer gemischten Population von Y1-, Y2- und Y4-Rezeptoren übersehen worden sein könnte. Bestimmte Funktionen, die heute noch mit diesem Subtypen assoziiert werden, könnten in dem Maß, in mit diesem Subtypen assoziiert werden, könnten in dem Maß, in dem unsere pharmakologischen Instrumente vollkommener werden, dem Y5 zugesprochen werden (Tabelle 18). Indem er einen neuen Einblick in die Pharmakologie oder NPY-Rezeptoren bietet, liefert der Y5 größere Klarheit und Fokussierung im Bereich der Medikamententwicklung.
  • TABELLE 17: Mit NPY verbundene pathophysiologische Zustände
    Figure 00880001
  • Eine erfolgreiche Strategie für die Entwicklung eines auf dem Y5-Rezeptor basierenden Arzneimittels oder eines jeden gegen einzelne G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Subtypen gerichteten Arzneimittels beinhaltet das Absuchen von Kandidaten-Verbindungen 1) in Radioliganden-Bindungstests, um eine Affinität für kreuzreaktive G-Protein-gekoppelte Rezeptoren festzustellen, und 2) in physiologischen Tests, um unerwünschte Nebeneffekte festzustellen. Im spezifischen Prozeß des Absuchens auf einen Y5-selektiven Wirkstoff enthält der Rezep tor-Subtyp, der am wahrscheinlichsten kreuzreagiert und deshalb für das Absuchen mit Radioliganden-Bindungstests am wichtigsten ist, die anderen „Y-Typ"-Rezeptoren Y1, Y2, Y3, und Y4. Kreuzreaktivität zwischen dem Y5 und jedem dieser anderen Subtypen könnte zu potentiellen Komplikationen führen, wie die in Tabelle 17 aufgelisteten pathophysiologischen Indikationen nahelegen. Bei der Entwicklung eines Y5-Antagonisten gegen Fettleibigkeit und zur Kontrolle des Appetits zum Beispiel ist es wichtig, keinen Y1-Antagonisten zu entwickeln, was zu Bluthochdruck oder erhöhter Ängstlichkeit führen könnte, keinen Y2-Antagonisten der zu Gedächtnisverlust führen könnte, und keinen Y4-Antagonisten, der zu gesteigertem Appetit führen könnte.
  • TABELLE 18: Indikationen der Y-Typ-Rezeptoren
    Figure 00890001
  • Figure 00900001
  • Die Clonierung des Y5-Rezeptors von Menschen und Ratten ist besonders wertvoll für die charakterisierung von Rezeptoren auf der Basis von in-situ-Lokalisierung, Gegensinn-Funktionsknockout und Geninduktion. Diese Studien werden wichtige Informationen in Bezug auf die Y5-Rezeptor-Funktion und deren therapeutische Bedeutung liefern. Der clonierte Y5-Rezeptor bietet sich für Mutageneseversuche an, bei denen Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen nachgebildet werden können. Der Y5-Rezeptor erlaubt uns weiterhin, durch Homologieclonierung die Möglichkeiten anderer Y-Typ-Rezeptoren zu untersuchen. Darunter könnten neue Rezeptor-Subtypen ebenso wie Homologe der Y5-Spezies zur Schaffung von Tiermodellen mit Relevanz für die menschliche Pathologie sein. Der Y5-Rezeptor stellt deshalb eine enorme Gelegenheit zur Entwicklung von neuartigen und selektiven medikamentösen Therapien dar, insbesondere solchen, die auf Appetits- und Gewichtskontrolle zielen, jedoch auch gegen Gedächtnisverlust, Depression, Angst, Magengeschwüre, epileptische Anfälle, Schmerzen, Bluthochdruck, subarachnoide Blutungen, Schlafstörungen, Nasaler Blutdrang neurogene Entleerungsdysfunktion und Durchfall.
  • Insbesondere die Entdeckung des Y5-selektiven Antagonisten, der die Nahrungsaufnahme bei Ratten hemmt, liefert ein Verfahren zur Veränderung des Eßverhaltens bei einer Vielzahl von Wirbeltieren.
  • Literatur
  • Abel, P. W., Han, C., Noe, B. D., and McDonald, J. K. (1988). Neuropeptide Y: vasoconstrictor effects and possible role in cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage. Brain Res. 463: 250–258.
  • Albers, H. E., and Ferris, C. F. (1984). Neuropeptide Y: Role in light-dark cycle entrainment of hamster circadian rhythms. Neurosci. Lett. 50: 163–168.
  • Aruffo, A. and Seed, B. (1987). Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high efficiency COS cell expression system. PNAS. 84, 8573–8577.
  • Balasubramaniam, A., Sheriff, S., Johnson, M. E., Prabhakaran, M., Huang, Y., Fischer, J. E., and Chance, W. T. (1994). [D-Trp32] Neuropeptide Y: A competitive antagonist of NPY in rat hypothalamus. J. Med. Chem. 37: 311–815.
  • Berrettini, W. H., Kaye, W. H., Gwirtsman, H., and Allbright, A. (1988). Cerebrospinal fluid peptide YY immunoreactivity in eating disorders. Neuropsychobiol. 19: 121–124. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248–254.
  • Brady, L. S., Smith, M. A., Gold, P. W., and Herkenham, M. (1990). Altered expression of hypothalamic neuropeptide Y mRNAs in food-restricted and food-deprived rats. Neuroendocrinology 52: 441–447.
  • Chance, W. T., Sheriff, S., Foley-Nelson, T., Fischer, J. E., and Balasubramaniam, A. (1989). Pert us s toxin inhibits neuropeptide Y-induced feeding in rats. Peptides 10, 1283–1286. Clark, J. T. (1994). Aging-induced decrements in neuropeptide Y: The retention of ejaculatory behavior is associated with site-selective differences. Neurobiology of Aging 15: 191–196. Clark, J. T., Kalra, P. S., Crowley, W. R., and Kalra, S. P. (1984). Neuropeptide Y and human pancreatic polypeptide stimulate feeding behavior in rats. Endocrinology 115: 427–429.
  • Cox, H., and Cuthbert, A. W. (1990). The effects of neuropeptide Y and its fragments upon basal and electrically stimulated ion secretion in rat jejunum mucosa. Br. J. Pharmac. 101: 247–252.
  • Cullen, B. (1987). Use of eurkaryotic expression technology in the functional analysis of cloned genes. Methods Enzymol. 152: 685–704.
  • Dryden, S., Prankish, H., Wang, Q., and Williams, G. (1994). Neuropeptide Y and energy balance: one way ahead for the treatment of obesity? Eur. J. Clin. Invest. 24: 293–308.
  • Dumont, Y., J. -C. Martel, A. Fournier, S. St-Pierre, and R. Quirion. (1992). Neuropeptide Y and neuropeptide Y receptor subtypes in brain and peripheral tissues. Progress in Neurobiology 38: 125–167.
  • Dumont, Y., Fournier, A., St-Pierre, S., Quiron, R. (1995). Characterization of Neuropeptide Y Binding Sites in Rat Brain Membrane Preparations Using [125I] [Leu31, Pro34] Peptide YY and [125I] Peptide YY3–36 as Selective Y1 and Y2 Radioligands. J. Pharm. Exper. Ther. 272: (2) 673–680.
  • Eva, C., Oberto, A., Sprengel, R. and E. Genazzani. (1992). The murine NPY-1 receptor gene: structure and delineation of tissue specific expression. FEBS Lett. 314: 285–288. Eva, C., Keinanen, K., Monyer, H., Seeburg, P., and Sprengel, R. (1990). Molecular cloning of a novel G protein-coupled receptor that may belong to the neuropeptide receptor family. FEBS Lett. 271, 80–84.
  • Fuhlendorff, J., U. Gether, L. Aakerlund, N. Langeland-Johansen, H. Thogersen, S. G. Melberg, U. B. Olsen, O. Thastrup, and T. W. Schwartz. (1990). [Leu31, Pro34] Neuropeptide Y: A specific Y1 receptor agonist. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 182–186.
  • Gerald, C., Adham, A., Kao, H. T., Olsen, M. A., Laz, T. M., Vaysse, P., Hartig, P. R., Branchek, T. A. and R. L. Weinshank. The 5-HT4 receptor: molecular cloning and pharmacological characterization of two splice variants (zur Veröffentlichung eingereicht).
  • Grouzman, E., Comoy, E., and Bohuon, C. (1989). Plasma neuropeptide Y concentrations in patients with neuroendocrine tumors. J Clin. Endoc. Metab. 68: 808–813.
  • Grundemar, L. and R1 Hakanson (1994). Neuropeptide Y effector systems: perspectives for drug development. Trends. Pharmacol. 15: 153–159.
  • Grundemar, L., J. L. Krstenansky, and R. Hakanson. (1992). Activation of neuropeptide Y1 and neuropeptide Y2 receptors by substituted and truncated neuropeptide Y analogs: identification of signal epitopes. Eur. J Pharmacol. 232: 271–278.
  • Gubler, U abd B. J. Hoffman. (1983). A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene. 25, 263–269 Hau, X. -Y., Boublik, J. H., Spicer, M. A., Rivier, J. E., Brown, M. R., and Yaksh, T. L. (1991). The antinociceptive effects of spinally administered neuropeptide Y in the rat: Systematic studies on structure-activity relationship. JPET 258: 243–253.
  • Hauser, G. J., Myers, A. K., Dayao, E. K., and Zukowska-Grojec, 2. (1993). Neuropeptide Y infusion improves hemodynamics and survival in rat endotoxic shock. Am. J. Physiol. 265: H 1416-H 1423.
  • Heilig, M., and Widerlov, E. (1990). Neuropeptide Y: an overview of central distribution, functional aspects, and possible involvement in neuropsychiatric illnesses. Acta Psychiatr. Scand. 82: 95–114.
  • Herzog, H., Y. J. Hort, H. J. Ball, G. Hayes, J. Shine, and L. Selbie. (1992). Cloned human neuropeptide Y receptor couples to two different second messenger systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5794–5798.
  • Herzog, H., Y. J. Hort, H. J. Ball, G. Hayes, J. Shine, and L. Selbie. (1992). Cloned human neuropeptide Y receptor couples to two different second messenger systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5794–5798.
  • Horstman, D. A., Brandon, S., Wilson A. L., Guyer, C. A., Cragoe, E. J., Jr., Limbird, L. E. (1990). An Aspartate Conserved Among G-protein Receptors Confers Allosteric Regulation of Alpha2-Adrenergic Receptors by Sodium. J. Biol. Chem. 265: (35) 21590-21595.
  • Kalra, S. P., Fuentes, M., Fournier, A., Parker, S. L., and Crowley, W. R. (1992). Involvement of the Y-1 receptor subtype in the regulation of luteinizing hormone secretion by neuropeptide Y in rats. Endocrinology 130: 3323–3330.
  • Kalra, S. P., Dube, M. G., Fournier, A., and Kalra, P. S. (1991). Structure-function analysis of stimulation of food intake by neuropeptide Y: Effects of receptor agonists. Physiology & Behavior 50: 5–9.
  • Kaye, W. H., Berrettini, W., Gwirtsman, H., and George, D. T. (1990). Altered cerebrospinal fluid neuropeptide Y and peptide YY immunoreactivity in anorexia and bulimia nervosa. Arch. Gen. Psychiat. 47: 548–556.
  • Kieffer, B., Befort, K., Gaveriaux-Ruff, C. and Hirth, C. G. (1992). The δ-opioid receptor: Isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological characterization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12048–12052.
  • Kingston, R. E. (1987) in: Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. & Struhl, K. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N. Y., Bd. 1, S. 4.2.3.2.4.
  • Kluxen, F. W., Bruns, C. and Lubbert H. (1992). Expression cloning of a rat. brain somatostatin receptor cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 46181622.
  • Kornfeld, R. and Kornfeld, S. (1985). Assembly of asparagine linked oligosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 54, 631–664.
  • Kozak, M. (1989). The scanning model for translation: an update. J. Cell Biol. 108, 229–241. Kozak, M. (1991). Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J. Biol. Chem. 266, 19867–19870.
  • Krause, J., C. Eva, P. H. Seeburg, and R. Sprengel. (1991). Neuropeptide Y1 subtype pharmacology of a recombinantly expressed neuropeptide receptor. Mol. Pharmacol. 41: 817–821.
  • Lacroix, J. S., Stjarne, P., Angard, A., and Lundberg, M. (1988). Sympathetic vascular control of the pig nasal mucosa: reserpine-resistant, non-adrenergic nervous responses in relation to neuropeptide Y and ATP. Acta Physiol. Scand. 133: 183–197.
  • Landschultz, W. H., Johnson, P. P. and S. L. McKnight. (1988). The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of DNA binding proteins. Science 240, 1759–1764.
  • Larhammar, D., A. G. Blomqvist, F. Yee, E. Jazin, H. Yoo, and C. Wahlestedt. (1992). Cloning and functional expression of a human neuropeptide Y/peptide YY receptor of the Y1 type. J. Biol. Chem. 267: 10935–10938.
  • Levine, A. S., and Morley, J. E. (1984). Neuropeptide Y: A potent inducer of consummatory behavior in rats. Peptides 5: 1025–1029.
  • Maggio, R., Vogel Z. and J. Wess. (1993). Coexpression studies with mutant muscarinic/adrenergic receptors provide evidence for intermolecular "cross-talk" between G-protein-linked receptors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3103–3107.
  • Malaise-Lagai, P., Carpentier, J. -L., Patel, Y. C., Malaise, W. J., and Orci, L. (1977). Pancreatic polypeptide: A possible role in the regulation, of food intake in the mouse. Hypothesis'. Experientia 33: 915–917.
  • McCormick, M. (1987). Sib Selection. Methods in Enzymology 151: 44549.
  • Miller, J. and Germain, R. N. (1986). Efficient cell surface expression of class II MHC molecules in the absence of associated invariant chain. J. Exp. Med. 164: 1478–1489. Michel, M. C. (1991). Receptors for neuropeptide Y: multiple subtypes and multiple second messengers. Trends Pharmacol. 12: 389–394.
  • Morley, J. E., and Flood, J. F. (1991). Neuropeptide Y and memory processing. An. N. Y. Acad. Sci. 611: 226–231.
  • Okayama, H. and P. Berg (1983). A cDNA cloning vector that permits expression of cDNA inserts in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 3: 280–289.
  • O'Shea, R. D., and Gundlach, A. L. (1991). Preproneuropeptide Y messenger ribonucleic acid in the hypothalamic arcuate nucleus of the rat is increased in food deprivation or dehydration. J. Neuroendocrinol. 3: 11–14.
  • O'Shea, E. K., Rutkowski, R. and P. S. Kirn. (1989). Evidence that the leucine zipper is a coiled coil. Science 243: 538-542.
  • Penner, S .B., Smyth, D. D., and Glavin, G. B. (1993). Effects of neuropeptide Y and [Leu31, Pro34] Neuropeptide Y on experimental gastric lesion formation and gastric secretion in the rat. JPET 266: 339–343.
  • Probst, W. C., Snyder, L. A., Schuster, D. L, Brosius, J. and Sealfon, S. C. (1992). Sequence alignment of the G-protein coupled receptor superfamily. DNA and Cell Bio. 11, 1–20. Sahu, A., and Kalra, S. P. (1993). Neuropeptidergic regulation of feeding behavior (neuropeptide Y). Trends Endocrinol. Metab 4: 217–224.
  • Robert, J. J., Orosco, M., Rouch, C., Jacquot, C., Cohen, Y. (1989) Unexpected Responses of the Obese "Cafeteria" Rat to the Peptide FMRF-Amide. Pharm. Bioch. Behavior 34: 341-344.
  • Rizzi, M., Samini, R., Sperk, G., and Vezzani, A. (1993). Electrical kindling of the hippocampus is associated with functional activation of neuropeptide Y-containing neurons. Eur. J. Neuroscience 5: 1534–1538.
  • Sanacora, G., Kershaw, M., Finkelstein, J. A., and White, J. D. Increased hypothalamic content of preproneuropeptide Y messenger ribonucleic acid in genetically obese Zucker rats and its regulation by food deprivation. Endocrinology 127: 730–737 (1990).
  • Schwartz, T. W., J. Fuhlendorff, L. L.Kjems, M. S. Kristensen, M. Vervelde, M. O'Hare, J. L. Krstenansky, and B. Bjornholm. (1990). Signal epitopes in the three-dimensional structure of neuropeptide Y. Ann. N. Y. Acad. Sci. 611: 35–47.
  • Stanley, E. G., Magdalin, W., Seirafi, A., Nguyen, M. M., and Leibowitz, S. F. (1992). Evidence for neuropeptide Y mediation of eating produced by food deprivation and for a variant of the Y1 receptor mediating this peptide's effect. Peptides 13: 581–587.
  • Stanley, E. G., and Leibowitz, S. F. (1984). Neuropeptide Y: Stimulation of feeding and drinking by injection into the paraventricular nucleus. Life Sci. 35: 2635–2642. Stanley, B. G. Neuropeptide Y in multiple hypothalanvic sites controls eating behavior, endocrine, and autonomic systems for body energy balance. In: The Biology of Neuro peptide Y and Related Peptides, S. 457–509. Hrsg. W. F. Colmers and C. Wahlestedt. Humana Press, Totowa, New Jersey (1993).
  • Stanley, E. G., Daniel, D. R., Chin, A. S., and Leibowitz, S. F. (1985). Paraventricular nucleus injections of peptide YY and neuropeptide Y preferentially enhance carbohydrate ingestion. Peptides 6: 1205–1211.
  • Wahlestedt, C., L. Edvinsson, E. Ekblad, and R. Hakanson. Effects of neuropeptide Y at sympathetic neuroeffector junctions: Existence of Y1 and Y2 receptors. In: Neuronal messengers in vascular function, Fernstrom Symp. Nr. 10., S. 231–242. Hrsg. A. Nobin and C. H. Owman. Elsevier: Amsterdam (1987).
  • Wahlestedt, C., Karoum, F., Jaskiw, G., Wyatt, R. J., Larhammar, D., Ekman, R., and Reis, D. J. (1991). Cocaine-induced reduction of brain neuropeptide Y synthesis dependent on medial prefrental cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2978–2082.
  • Wahlestedt, C., Regunathan, S., and D. J. Reis (1991). Identification of cultured cells selectively expressing Y1-, Y2-, or Y3-type receptors for neuropeptide Y/peptide YY. Life Sciences 50: PL-7–PL-12.
  • Wahlestedt, C., Pich, E. M., Koob, G. F., Yee, F., and Heilig, M. (1993). Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors by antisense oligodeoxynucleotides. Science 259: 528–531.
  • Wahlestedt, C., and D. J. Reis. (1993). Neuropeptide Y-Related Peptides and Their Receptors – Are the Receptors Potential Therapeutic Targets? Ann. Rev. Pharmacol. Tox. 32: 309–352 Warden, D. and H.V. Thorne. (1968). Infectivity of polyoma virus DNA for mouse embryo cells in presence of diethylaminoethyl-dextran. I. Gen. Virol. 3, 371.
  • Wells, J. A. (1994). Structural and functional basis for hormone binding and receptor oligomerization. Current Opinion in Cell Biology 6: 163–173 White, J. D., Olchovsky, D., Kershaw, M., and Berelowitz, M. (1990). Increased hypothalamic content of preproneuropeptide-Y messenger ribonucleic acid in streptozotocin-diabetic rats. Endocrinology 126: 765–772.
  • Zoubek, J., Somogyi, G. T., and De Groat, W. C. (1993). A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. Am. I. Physiol. 265: R536–R543.
  • Zukowska-Grojec, Z., Haass, M., and Bayorh, M. (1986). Neuropeptide Y and peptide YY mediate non-adrenergic vasoconstriction and modulate sympathetic responses in rats. Reg. Pept. 15: 99–110.
  • Zukowska-Grojec, Z., Bergeson, S., Kuch-Wocial, A., and Colton, C. (1993). Mitogenic effect of neuropeptide Y in rat vascular smooth muscle cells. Neuropeptide Y Conference Abstracts, (Cambridge) C 10.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (43)

  1. Nucleinsäure, die einen Säuger-Y5-Rezeptor codiert, wobei die Nucleinsäure enthält: (a) eine Nucleotidsequenz, die die in 6 gezeigte Aminosäuresequenz codiert; oder (b) eine Nucleotidsequenz, die die in 4 gezeigte Aminosäuresequenz codiert; oder (c) eine Nucleotidsequenz, die die in 15 gezeigte Aminosäuresequenz codiert; oder (d) eine Nucleotidsequenz, die einen Y5-Rezeptor eines Säugers, der kein Mensch ist, einer Ratte oder eines Hundes codiert und die unter geeigneten Bedingungen an eine beliebige Sequenz aus (a) bis (c) hybridisiert; wobei der Rezeptor gekennzeichnet ist durch (1) ein pharmakologisches Profil, das den menschlichen Y5-Rezeptor kennzeichnet, wie in Tabelle 6 oder 7 gezeigt; oder (2) ein pharmakologisches Profil, das den Y5-Rezeptor der Ratte kennzeichnet, wie in Tabelle 4 oder 5 gezeigt.
  2. Nucleinsäure nach Anspruch 1, die DNA oder RNA ist, worin im Fall von RNA die RNA vorzugsweise mRNA ist.
  3. Nucleinsäure nach Anspruch 2, die cDNA oder genomische DNA ist.
  4. Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure einen Y5-Rezeptor codiert, der gekennzeichnet ist durch eine Aminosäuresequenz in jeder der Transmembranregionen I-VII, die zu der Aminosäuresequenz in der entsprechenden Transmembranregion des in 8 gezeigten menschlichen Y5-Rezeptors identisch ist.
  5. Gereinigtes Y5-Rezeptor-Protein, codiert durch das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
  6. Vektor, der die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
  7. Vektor nach Anspruch 6, der für die Expression in einer Wirtszelle angepasst wurde, umfassend die regulatorischen Elemente, die für die Expression der Nucleinsäure in der Wirtszelle notwendig sind, funktionell mit der Nucleinsäure verknüpft, die den Y5-Rezeptor codiert, um dessen Expression zu erlauben.
  8. Vektor nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle ist.
  9. Vektor nach Anspruch 8, der ein Baculovirus oder ein Plasmid ist.
  10. Plasmid nach Anspruch 9, das pcEXV-hY5 (ATCC-Hinterlegungsnummer 75943) oder pcEXV-rY5 (ATCC-Hinterlegungsnummer 75944) ist.
  11. Wirtszelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10 umfasst.
  12. Wirtszelle nach Anspruch 11, die. eine Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzelle ist.
  13. Wirtszelle nach Anspruch 11 oder 12, die nicht-neuronalen Ursprungs ist.
  14. Wirtszelle nach Anspruch 13, die eine COS-7-Zelle, eine menschliche embryonale Nierenzelle 293, eine NIH-3T3-Zelle oder eine LM(tk-)-Zelle ist.
  15. Menschliche embryonale Nierenzelle 293 nach Anspruch 14, die 293-rY5-14 (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11757) ist.
  16. NIH-3T3-Zelle nach Anspruch 14, die N-hY5-8 (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL-11994) ist.
  17. LM(tk-)-Zelle nach Anspruch 14, die L-hY5-7 (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL-11995) ist.
  18. Wirtszelle nach Anspruch 12, worin die Insektenzelle eine Sf9-Zelle oder eine Sf21-Zelle ist.
  19. Verfahren zur Herstellung des gereinigten Y5-Rezeptors von Mensch, Ratte oder Hund nach Anspruch 5, welches umfasst: (a) Konstruieren eines für die Expression in einer Zelle angepassten Vektors, der regulatorische Elemente umfasst, die für die Expression der Nucleinsäure in der Zelle notwendig sind, funktionell verknüpft mit der Nucleinsäure, die den Y5-Rezeptor von Mensch, Ratte oder Hund codiert, um dessen Expression zu erlauben, wobei die Zelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakterienzellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen; (b) Einschleusen des Vektors aus Schritt (a) in eine geeignete Wirtszelle; (c) Inkubieren der Zellen aus Schritt (b) unter Bedingungen, die die Expression des Y5-Rezeptors von Mensch, Ratte oder Hund erlauben; (d) Gewinnen des so hergestellten Rezeptors; und (e) Reinigen des so gewonnen Rezeptors, wodurch ein Y5-Rezeptor von Mensch, Ratte oder Hund hergestellt wird.
  20. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Y5-Rezeptors, welches umfasst: (a) Unterwerfen der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 18 unter geeignete Bedingungen, die die Herstellung des Y5-Rezeptors erlauben; (b) Gewinnen des so durch die Wirtszelle erzeugten Rezeptors; und (c) Reinigen des so gewonnenen Rezeptors.
  21. Gereinigter Y5-Rezeptor, hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 19 oder 20.
  22. Membranpräparat, isoliert aus der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 18, wobei eine solche Wirtszelle einen Y5-Rezeptor nicht von Natur aus exprimiert.
  23. Antikörper, der zur Bindung an den Rezeptor nach Anspruch 21 befähigt ist.
  24. Antikörper, der zur kompetitiven Hemmung der Bindung des Antikörpers nach Anspruch 23 an einen Y5-Rezeptor befähigt ist.
  25. Antikörper nach Anspruch 23 oder 24, der ein monoclonaler Antikörper ist.
  26. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 25, der gegen ein Epitop eines Y5-Rezeptors gerichtet ist, das auf der Oberfläche einer Y5-Rezeptor exprimierenden Zelle vorhanden ist.
  27. Arzneimittel, das den Antikörper nach einem der Ansprüche 25 bis 26 und einen pharmazeutischen verträglichen Träger umfasst.
  28. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet, welches umfasst: Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit der chemischen Verbindung unter Bedingungen, die für die Bindung geeignet sind, und Nachweisen der spezifischen Bindung der chemischen Verbindung an den Y5-Rezeptor.
  29. Verfahren, das kompetitive Bindung einschließt, zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, die an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet, welches umfasst: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit sowohl der chemischen Verbindung als auch einer zweiten chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie an den Y5-Rezeptor bindet, und nur mit der zweiten chemischen Verbindung unter Bedingungen, die für die Bindung der Verbindungen geeignet sind; und Nachweisen der spezifischen Bindung der chemischen Verbindung an den Y5-Rezeptor; wobei ein Rückgang der Bindung der zweiten chemischen Verbindung an den Y5-Rezeptor in Anwesenheit der chemischen Verbindung anzeigt, dass die chemische Verbindung an den Y5-Rezeptor bindet.
  30. Verfahren, das kompetitive Bindung einschließt, zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, die an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet, welches umfasst: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit sowohl einer chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie an den Y5-Rezeptor spezifisch bindet, als auch einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie an den Y5-Rezeptor spezifisch binden, und nur mit der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie an den Y5-Rezeptor bindet, unter Bedingungen, die für die Bindung der Verbindungen geeignet sind; Nachweisen der spezifischen Bindung der Vielzahl von chemischen Verbindungen; wobei ein Rückgang der Bindung der chemischen Verbindung, die bekanntermaßen an den Y5-Rezeptor bindet, in Anwesenheit der Vielzahl von chemischen Verbindungen anzeigt, dass mindestens eine chemische Verbindung, die in der Vielzahl der chemischen Verbindungen enthalten ist, an den Y5-Rezeptor bindet; und getrenntes Nachweisen der Bindung jeder chemischen Verbindung, die in der Vielzahl der Verbindungen eingeschlossen ist, an den Y5-Rezeptor.
  31. Verfahren für den Nachweis, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Agonist ist, welches umfasst: Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit der chemischen Verbindung unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und Nachweisen eines Anstiegs der Y5-Rezeptor-Aktivität, um dadurch zu bestimmen, ob die chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Agonist ist.
  32. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet und ihn aktiviert, welches umfasst: Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit der chemischen Verbindung unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind, und Messen einer Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit und Abwesenheit der chemischen Verbindung, wobei eine Änderung der Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit der chemischen Verbindung anzeigt, dass die chemische Verbindung den Y5-Rezeptor aktiviert.
  33. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet und ihn aktiviert, welches umfasst: Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie an den Y5-Rezeptor binden und ihn aktivieren, unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind; Messen einer Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit und Abwesenheit der Vielzahl von chemischen Verbindungen; wobei eine Änderung der Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit der Vielzahl von chemischen Verbindungen anzeigt, dass mindestens eine chemische Verbindung aus der Vielzahl von chemischen Verbindungen den Y5-Rezeptor aktiviert; und getrenntes Bestimmen, ob jede Verbindung, die in der Vielzahl von Verbindungen eingeschlossen ist, an den Y5-Rezeptor bindet und ihn aktiviert.
  34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, worin die Second-Messenger-Antwort Adenylatcyclase-Aktivität umfasst und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ein Rückgang der Adenylatcyclase-Aktivität ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, worin die Second-Messenger-Antwort die intrazelluläre Calciumkonzentration umfasst und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration ist.
  36. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist, welches umfasst: Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit der chemischen Verbindung in Anwesenheit eines bekannten Y5-Rezeptor-Agonisten unter Bedingungen, die die Aktivierung des Y5-Rezeptors erlauben, und Nachweisen eines Rückgangs der Y5-Rezeptor-Aktivität, um dadurch zu bestimmen, ob die chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist.
  37. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet und seine Aktivierung hemmt, welches umfasst: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit sowohl der chemischen Verbindung als auch einer zweiten chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, und nur mit der zweiten chemischen Verbindung unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind; und Messen einer Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von nur der zweiten chemischen Verbindung und in Anwesenheit von sowohl der zweiten chemischen Verbindung als auch der chemischen Verbindung, wobei eine kleinere Änderung der Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung als in Anwesenheit von nur der zweiten chemischen Verbindung anzeigt, dass die chemische Verbindung die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmt.
  38. Verfahren zur Bestimmung, ob eine chemische Verbindung an einen Y5-Rezeptor spezifisch bindet und seine Aktivierung hemmt, welches umfasst: getrenntes Inkontaktbringen von Wirtszellen nach Anspruch 11 oder des Membranpräparats nach Anspruch 22 mit sowohl einer chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie die Y5-Rezeptor aktiviert, als auch einer Vielzahl von chemischen Verbindungen, von denen nicht bekannt ist, ob sie die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmen, und mit nur der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, unter Bedingungen, die für die Aktivierung des Y5-Rezeptors geeignet sind; und Messen einer Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von nur der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, und in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, als auch der Vielzahl von chemischen Verbindungen; wobei eine kleinere Änderung der Second-Messenger-Antwort in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, als auch der Vielzahl von chemischen Verbindungen als bei Anwesenheit von nur der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, anzeigt, dass mindestens eine chemische Verbindung, die in der Vielzahl von chemischen Verbindungen eingeschlossen ist, die Aktivierung des Y5-Rezeptors hemmt; und getrenntes Bestimmen ob jede Verbindung, die in der Vielzahl der chemischen Verbindungen eingeschlossen ist, an den Y5-Rezeptor spezifisch bindet und seine Aktivierung hemmt.
  39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin die Second-Messenger-Antwort Adenylatcyclase-Aktivität umfasst und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ein kleinerer Rückgang des Adenylatcyclase-Aktivitätsniveaus in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, und der Vielzahl von chemischen Verbindungen ist als in Anwesenheit von nur der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert.
  40. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin die Second-Messenger-Antwort die intrazelluläre Calciumkonzentration umfasst und die Änderung der Second-Messenger-Antwort ein kleinerer Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration in Anwesenheit von sowohl der chemischen Verbindung als auch der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert, und der Vielzahl von chemischen Verbindungen ist als in Anwesenheit von nur der zweiten chemischen Verbindung oder der chemischen Verbindung, von der bekannt ist, dass sie den Y5-Rezeptor aktiviert.
  41. Verfahren für den Nachweis der Anwesenheit eines menschlichen Y5-Rezeptors auf der Oberfläche einer Zelle in vitro, welches umfasst: Inkontaktbringen der Zelle mit dem Antikörper nach einem der Ansprüche 23 bis 26 unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an den Rezeptor erlauben; Nachweisen der Anwesenheit des Antikörpers, der an die Zelle gebunden ist, und dadurch Nachweisen der Anwesenheit eines menschlichen Y5-Rezeptors auf der Oberfläche der Zelle.
  42. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, das umfasst: Bestimmen, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Agonist ist unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 31; Abtrennen der chemischen Verbindung, die als Y5-Rezeptor-Agonist bestimmt wurde, von den Wirtszellen oder dem Membranpräparat; und Einbringen der chemischen Verbindung in einen Träger.
  43. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, das umfasst: Bestimmen, ob eine chemische Verbindung ein Y5-Rezeptor-Antagonist ist unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 36; Abtrennen der chemischen Verbindung, die als Y5-Rezeptor Antagonist bestimmt wurde, von den Wirtszellen oder dem Membranpräparat; und Einbringen der chemischen Verbindung in einen Träger.
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Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5516653A (en) * 1993-12-28 1996-05-14 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY/pancreatic polypeptide receptor (Y4) and uses thereof
US5545549A (en) 1994-02-03 1996-08-13 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY (Y2) receptor and uses thereof
US6010861A (en) * 1994-08-03 2000-01-04 Dgi Biotechnologies, Llc Target specific screens and their use for discovering small organic molecular pharmacophores
US5602024A (en) * 1994-12-02 1997-02-11 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a hypothalamic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor (Y5) and uses thereof
US5989920A (en) * 1994-12-02 1999-11-23 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of modifying feeding behavior compounds useful in such methods and DNA encoding a hypothalmic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor Y5
AU772193B2 (en) * 1995-11-09 2004-04-08 Garvan Institute Of Medical Research Neuropeptide Y-Y5 receptor
AUPN646795A0 (en) 1995-11-09 1995-11-30 Garvan Institute Of Medical Research Neuropeptide Y-Y5 receptor
AU1328197A (en) 1995-12-01 1997-06-19 Synaptic Pharmaceutical Corporation Aryl sulfonamide and sulfamide derivatives and uses thereof
US5919901A (en) * 1996-04-08 1999-07-06 Bayer Corporation Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences
US5965392A (en) * 1996-04-08 1999-10-12 Bayer Corporation Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences
WO1997046250A1 (en) * 1996-06-04 1997-12-11 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of modifying feeding behavior, compounds useful in such methods, and dna encoding a hypothalamic atypical neuropeptide y/peptide yy receptor (y5)
AU723879C (en) * 1996-10-31 2003-11-06 Merck & Co., Inc. Combination therapy for the treatment of diabetes and obesity
US5908830A (en) * 1996-10-31 1999-06-01 Merck & Co., Inc. Combination therapy for the treatment of diabetes and obesity
US6048900A (en) 1998-02-13 2000-04-11 Bayer Corporation Amide derivatives and methods for using the same as selective neuropeptide Y receptor antagonists
EP0910565A1 (de) * 1997-02-14 1999-04-28 Bayer Corporation Amidderivate als selektive neuropeptid-y-rezeptoren
US6245817B1 (en) 1997-02-14 2001-06-12 Bayer Corporation NPY5 receptor antagonists and methods for using same
US6713265B1 (en) 1997-06-04 2004-03-30 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of modifying feeding behavior, compounds useful in such methods, and DNA encoding a hypothalamic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor (Y5)
US5916869A (en) * 1997-06-13 1999-06-29 North Carolina State University Method of treating birds in ovo
WO1999005911A1 (en) * 1997-07-31 1999-02-11 Bristol-Myers Squibb Company A method for modulation of circadian rhythmicity
PT896822E (pt) * 1997-08-05 2003-07-31 Pfizer Prod Inc 4-aminopirrolo (3,2-d)pirimidinas como antagonistas do receptor de neuropeptideo y
US5985616A (en) * 1998-01-07 1999-11-16 Schering Corporation Chimeric mammalian NPY Y5 receptors
US6197530B1 (en) * 1998-09-22 2001-03-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. GPR10 as a target for identifying weight modulating compounds
WO2000027845A1 (en) 1998-11-10 2000-05-18 Merck & Co., Inc. Spiro-indolines as y5 receptor antagonists
US7745216B2 (en) 1999-02-10 2010-06-29 Curis, Inc. Methods and reagents for treating glucose metabolic disorders
DE60045030D1 (de) 1999-02-10 2010-11-11 Curis Inc Peptid yy (pyy) zur behandlung von glukose stoffwechselkrankheiten
US6407120B1 (en) 1999-02-18 2002-06-18 Pfizer Inc. Neuropeptide Y antagonists
US6221660B1 (en) 1999-02-22 2001-04-24 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding SNORF25 receptor
AU3840000A (en) 1999-04-20 2000-11-02 Meiji Seika Kaisha Ltd. Tricyclic compounds
AU778393B2 (en) 1999-05-12 2004-12-02 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Pyrazole carboxamides useful for the treatment of obesity and other disorders
US20040254153A1 (en) * 1999-11-08 2004-12-16 Pfizer Inc Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
US20040053864A1 (en) * 2000-01-20 2004-03-18 Gerard Karsenty Methods and compositions for control of bone formation via modulation of neuropeptide y activity
CA2394332A1 (en) * 2000-01-28 2001-08-02 Neurogen Corporation Chimeric neuropeptide y receptors
GB0010757D0 (en) 2000-05-05 2000-06-28 Astrazeneca Ab Chemical compounds
US6566367B2 (en) * 2000-12-12 2003-05-20 Pfizer Inc. Spiro[isobenzofuran-1,4′-piperidin]-3-ones and 3H-spiroisobenzofuran-1,4′-piperidines
BR0116206A (pt) 2000-12-14 2003-12-23 Amylin Pharmaceuticals Inc Peptìdeo yy e agonistas de peptìdeo yy para tratamento de distúrbios metabólicos
WO2002051857A1 (en) * 2000-12-21 2002-07-04 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Drug target isogenes: polymorphisms in the neuropeptide y gene
US6946476B2 (en) 2000-12-21 2005-09-20 Schering Corporation Heteroaryl urea neuropeptide Y Y5 receptor antagonists
IL156157A0 (en) 2000-12-21 2003-12-23 Schering Corp Heteroaryl urea neuropeptide y y5 receptor antagonists
DE10125961A1 (de) * 2001-05-29 2002-12-12 Boehringer Ingelheim Int Carbazolderivate und deren Verwendung zur Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur Behandlung von im Zusammenhang mit NPY stehenden Leiden
AU2002355286B2 (en) 2001-07-26 2005-10-13 Schering Corporation Substituted urea neuropeptide Y Y5 receptor antagonists
GB0121709D0 (en) * 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
GB0121941D0 (en) 2001-09-11 2001-10-31 Astrazeneca Ab Chemical compounds
JP2005508324A (ja) * 2001-09-24 2005-03-31 インペリアル カレッジ イノベーションズ リミテッド 摂食行動の修正
JP2005514008A (ja) * 2001-09-24 2005-05-19 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー 摂食行動を改変する薬剤をスクリーニングするための、弓状核におけるニューロンの評価方法
CA2403307A1 (en) * 2001-10-23 2003-04-23 Neurogen Corporation Substituted 2-cyclohexyl-4-phenyl-1h-imidazole derivatives
US7877273B2 (en) * 2002-01-08 2011-01-25 Fredric David Abramson System and method for evaluating and providing nutrigenomic data, information and advice
US8058233B2 (en) * 2002-01-10 2011-11-15 Oregon Health And Science University Modification of feeding behavior using PYY and GLP-1
EP1549336B1 (de) * 2002-06-14 2011-01-05 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Prävention und/oder behandlung von colitis ulcerosa mit pyy oder pyy[3-36]
US7105526B2 (en) 2002-06-28 2006-09-12 Banyu Pharmaceuticals Co., Ltd. Benzimidazole derivatives
AU2003251739A1 (en) 2002-07-02 2004-01-23 Schering Corporation New neuropeptide y y5 receptor antagonists
GB0300571D0 (en) * 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
EP1583549A4 (de) 2003-01-17 2006-10-04 Sod Conseils Rech Applic Yy-peptid-analoga
AU2003260187A1 (en) * 2003-09-18 2005-04-06 Garvan Institute Of Medical Research Methods of modulating bone growth, bone remodeling and adiposity
EP1789440A4 (de) * 2004-02-11 2008-03-12 Amylin Pharmaceuticals Inc Pankreas-polypeptidfamilienmotive und diese enthaltende polypeptide
US20070270339A1 (en) * 2004-04-23 2007-11-22 Serono, Inc. Use of GPCR54 Ligands for the Treatment of Infertility
CA2565801A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-15 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of il-17 in the treatment of fertility-related disorders
CA2610022A1 (en) 2005-06-06 2006-12-14 Georgetown University Compositions and methods for lipo modeling
GB0511986D0 (en) * 2005-06-13 2005-07-20 Imp College Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
WO2007125952A1 (ja) 2006-04-28 2007-11-08 Shionogi & Co., Ltd. Ｎｐｙ ｙ５受容体拮抗作用を有するアミン誘導体
EP2058305A4 (de) 2006-08-30 2010-09-22 Shionogi & Co Harnstoffderivat
JP5187901B2 (ja) 2006-08-30 2013-04-24 塩野義製薬株式会社 ヒドラジンアミド誘導体
TWI428346B (zh) * 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
WO2008137270A1 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 H. Lundbeck A/S Methods of diagnosing and monitoring of npy y5 based disorders
SA08290668B1 (ar) 2007-10-25 2012-02-12 شيونوجي آند كو.، ليمتد مشتقات أمين لها نشاط مضاد لمستقبل npy y5 واستخداماتها
CL2009000904A1 (es) 2008-04-21 2010-04-30 Shionogi & Co Compuestos derivados de ciclohexil sulfonamidas que tienen actividad antagonista en el receptor npy y5, composicion farmaceutica y formulacion farmaceutica que los comprende.
WO2010101247A1 (ja) 2009-03-05 2010-09-10 塩野義製薬株式会社 Ｎｐｙ ｙ５受容体拮抗作用を有するシクロヘキサン誘導体
US8227618B2 (en) 2009-04-23 2012-07-24 Shionogi & Co., Ltd. Amine-derivatives having NPY Y5 receptor antagonistic activity and the uses thereof
KR101392942B1 (ko) 2010-12-10 2014-05-12 한국생명공학연구원 인간 신경 펩티드 수용체 형질전환 초파리를 이용한 비만 치료제 스크리닝 방법
CN111494606B (zh) * 2020-04-24 2021-12-14 广州医科大学 神经肽y的新应用
EP4366755A1 (de) * 2021-07-08 2024-05-15 Gila Therapeutics, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur aktivierung eines neuronalen rezeptors

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5026685A (en) 1988-07-15 1991-06-25 The Salk Institute For Biological Studies NPY peptide analogs
US5328899A (en) 1988-07-15 1994-07-12 The Salk Institute For Biological Studies NPY peptide analogs
ZA896374B (en) 1988-08-26 1990-05-30 Merrell Dow Pharma Neuropeptide y antagonists
ZA896376B (en) 1988-08-26 1990-05-30 Merrell Dow Pharma Neuropeptide y agonists
DK0448765T3 (da) 1990-03-30 1994-09-19 Heumann Pharma Gmbh & Co Anvendelse af guanidinderivater til fremstilling af et lægemiddel med NPY-antagonistisk virkning
SE9002278L (sv) 1990-06-28 1991-12-29 Perstorp Ab Anvaendning av inositoltrisfosfat foer framstaellning av ett laekemedel
CA2123108C (en) 1991-11-06 2003-03-25 Lisa Selbie Human neuropeptide y-y1 receptor
CA2126212A1 (en) 1991-12-19 1993-07-08 Albert Tseng A novel molecule which inhibits neuropeptide tyrosine biological function
WO1993024515A1 (en) * 1992-05-29 1993-12-09 Cornell Research Foundation, Inc. Human neuropeptide y/peptide yy receptor of the y1-type and antisense oligonucleotides thereto which inhibit vasoconstriction
GB9213215D0 (en) 1992-06-20 1992-08-05 Wellcome Found Peptides
JPH06116284A (ja) 1992-10-02 1994-04-26 Yamanouchi Pharmaceut Co Ltd 新規ペプチド
FR2701480B1 (fr) 1993-02-15 1995-05-24 Sanofi Elf Composés à groupe sulfamoyle et amidino, leur procédé de préparation et les compositions pharmaceutiques les contenant.
SK121895A3 (en) 1993-03-29 1996-10-02 Univ Cincinnati Analogues of peptide yy and uses thereof
EP0707490A1 (de) 1993-06-18 1996-04-24 University Of Cincinnati Antagonisten und agonisten des neuropeptid y
US5707798A (en) * 1993-07-13 1998-01-13 Novo Nordisk A/S Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors
US5516653A (en) * 1993-12-28 1996-05-14 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY/pancreatic polypeptide receptor (Y4) and uses thereof
US5545549A (en) * 1994-02-03 1996-08-13 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY (Y2) receptor and uses thereof
AU4426296A (en) * 1994-08-11 1996-03-07 Takeda Chemical Industries Ltd. G protein coupled receptor protein, production, and use thereof
US6562862B1 (en) 1994-10-20 2003-05-13 Eli Lilly And Company Methods of inhibiting physiological conditions associated with an excess of neuropeptide Y
AU3953795A (en) 1994-10-20 1996-05-15 Eli Lilly And Company Bicyclic neuropeptide y receptor antagonists
CA2134428A1 (en) 1994-10-26 1996-04-27 Albert Tseng Neuropeptide y y2 agonist peptides
JP3386814B2 (ja) 1994-11-07 2003-03-17 ファイザー・インコーポレーテッド ある種の置換ベンジルアミン誘導体：新種の神経ペプチドｙ１特異的リガンド
JPH10508486A (ja) * 1994-11-07 1998-08-25 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 修飾神経ペプチドｙレセプター
US5989920A (en) 1994-12-02 1999-11-23 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of modifying feeding behavior compounds useful in such methods and DNA encoding a hypothalmic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor Y5
US5602024A (en) 1994-12-02 1997-02-11 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding a hypothalamic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor (Y5) and uses thereof
US5621079A (en) * 1995-02-03 1997-04-15 Merck & Co., Inc. Neuropeptide Y receptor
US5554621A (en) 1995-06-07 1996-09-10 Bristol-Myers Squibb Company Dihydropyridine NPY antagonists: nitrogen heterocyclic derivatives
AUPN646795A0 (en) * 1995-11-09 1995-11-30 Garvan Institute Of Medical Research Neuropeptide Y-Y5 receptor
WO1997020820A1 (en) 1995-12-01 1997-06-12 Novartis Ag Heteroaryl compounds
AU7692896A (en) 1995-12-01 1997-06-27 Novartis Ag Quinazolin-2,4-diazirines as NPY receptor antagonist
US5965392A (en) 1996-04-08 1999-10-12 Bayer Corporation Neuropeptide Y receptor Y5 and nucleic acid sequences
WO1997046250A1 (en) 1996-06-04 1997-12-11 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of modifying feeding behavior, compounds useful in such methods, and dna encoding a hypothalamic atypical neuropeptide y/peptide yy receptor (y5)
US6713265B1 (en) * 1997-06-04 2004-03-30 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of modifying feeding behavior, compounds useful in such methods, and DNA encoding a hypothalamic atypical neuropeptide Y/peptide YY receptor (Y5)

Also Published As

Publication number Publication date
EP0732875A4 (de) 1997-02-26
ES2092976T1 (es) 1996-12-16
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JPH10510709A (ja) 1998-10-20
PT732875E (pt) 2003-11-28
CA2174529C (en) 2003-02-11
CA2174529A1 (en) 1996-06-03
US5602024A (en) 1997-02-11
EP1382616A3 (de) 2004-01-28
GR960300058T1 (en) 1996-11-30
US20060014242A1 (en) 2006-01-19
EP0732875A1 (de) 1996-09-25
AU713713B2 (en) 1999-12-09
US6316203B1 (en) 2001-11-13
WO1996016542A1 (en) 1996-06-06
DE69531190D1 (de) 2003-08-07
DE732875T1 (de) 1997-01-30
US5968819A (en) 1999-10-19
EP0732875B1 (de) 2003-07-02
JP2004137276A (ja) 2004-05-13
US20020103123A1 (en) 2002-08-01
AU4506396A (en) 1996-06-19
AU713713C (en) 2004-04-08
ATE244304T1 (de) 2003-07-15
US6818445B2 (en) 2004-11-16
ES2092976T3 (es) 2004-05-01

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