JPH10510709A - 摂食行動を変える方法、該方法に有用な化合物、および視床下部の異型神経ペプチドｙ／ペプチドｙｙ受容体（ｙ５）をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、例えば肥満、加速症または食欲不振の治療に関連して、食物の消費の増大または減少を含む摂食挙動を改善す方法を提供する。これらの方法は、選択された作動剤または拮抗剤またはＹ５受容体の投与を含む。このような拮抗剤の一つは、構造(I)を有する。加えて、本発明は、Ｙ５受容体をコードする単離された核酸分子、単離されたＹ５受容体タンパク、Ｙ５受容体をコードするコードする単離された核酸分子を含むベクター、かかるベクターを含む細胞、Ｙ５受容体に向けられた抗体、Ｙ５受容体をコードする核酸を検出するために有用な核酸プローブ、Ｙ５受容体をコードする核酸分子の何れかのユニークな配列に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、および正常または変異体のＹ５受容体ＤＮＡを発現する非ヒト遺伝子導入動物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 摂食行動を変える方法、該方法に有用な化合物、 および視床下部の異型神経ペプチドＹ／ペプチドＹＹ受容体(Ｙ５) をコードするＤＮＡ 本出願は、1994年12月２日に提出された米国特許出願08／349,025号の一部継 続出願であり、その内容は、ここでは参考文献によって主題出願に包含されてい る。 〔発明の背景〕 本出願全体にわたって、種々の参考文献が、括弧内に引用されている。これら の公表出版物の全開示内容は、本出願に関連する従来技術をより完全に記載する ため、ここでは参考文献によって本出願に包含されている。これらの参考文献の 完全な書誌引用は、本出願の最後において、配列表および特許請求の範囲の前に 見られる。 神経ペプチドＹ(ＮＰＹ)は、哺乳類神経系全体にわたって広い分布を持つ膵臓 ポリペプチド属のメンバーである。ＮＰＹおよびその関連物(ペプチドＹＹまた はＰＹＹ、および膵臓のポリペプチド又はＰＰ)は、Ｙ１,Ｙ２,Ｙ３,Ｙ４(又は ＰＰ)として知られる、少なくとも５つのＧ蛋白連結受容体のサブタイプ、およ び“異型Ｙ１”を活性化することによって広範な生理学的効果を引き出す。記載 された摂食行動の最も有力な作用物質であるＮＰＹの作用は、初めは視床下部の "異型Ｙ１"受容体の活性化を通して引き起こされると考えられている。当該受容 体は、Ｙ１,Ｙ２,Ｙ３,およびＹ４(又はＰＰ)受容体(各々については前記記載済 み)が放射線リガンド結合および作用性分析の両方で分類されるのと違い、その 分類が放射線リガンド結合データよりもむしろ、単に摂食行動に基づいて行われ る点で、ユニークである。出願人は、Ｙ５サブタイプとここで呼称される異型Ｙ １受容体をコードするラットの視床下部ｃＤＮＡを単離するために、¹²⁵Ｉ─Ｐ ＹＹをもとにした発現クローニング技術の利用についてここに報告する。出願人 は、またヒト海馬起源のＹ５相同体の単離および特徴の解明を報告する。蛋白配 列分析によって、Ｙ５受容体が、Ｇ蛋白連結受容体・スーパー・ファミリーに属す ることを解明している。ヒトおよびラットの相同体は両者共、膜内外ドメインで 、先にクローンした"Ｙ型"受容体と42％以下の同一性を示す。in situハイブリ デイゼーション技術を使用したラットの脳 局在化研究では、視床下部におけるＹ５受容体ｍＲＮＡの存在が解明された。薬 理学的評価では、Ｙ５と"異型Ｙ１受容体"の間に下記相同性のあることがわかっ た。１)摂食反応について記載されていた有効性:ＮＰＹ≧ＮＰＹ_2ー36＝ＰＹＹ＝「 Ｌeu³¹、Ｐro³⁴」ＮＰＹ＞＞ＮＰＹ_13-36，と同等のランク・オーダーの有効性を もって、ペプチドはＹ５受容体に結合した。２)該Ｙ５受容体は、"異型Ｙ１受容 体について提案されていたように、ｃＡＭＰ蓄積とはネガテイブな関係にあった 。３)摂食反応について記載されていたものと同等のランクオーダーの有効性を もって、ペプチドはＹ５受容体を活性化した、４)報告された摂食モジュレータ[ Ｄ−Ｔrp³²]ＮＰＹは、該Ｙ５受容体に選択的に結合し、続けて受容体を活性化 した。５)Ｙ５および"異型Ｙ１"受容体の両者は、ＮＰＹおよび関連ペプチドリ ガンドの中間領域における欠損又は変異について感受性が高い。これらのデータ は、Ｙ５受容体と先に述べた"異型Ｙ１"が同一であることを支持し、更に、肥満 、代謝、および食欲疾患の治療において、Ｙ５受容体の役割が、有望なターゲッ トとなる事が示唆される。 ペプチド神経伝達物質、神経ペプチドＹ(ＮＰＹ)は、哺乳類神経系にわたって 広い分布を持つ膵臓ポリペプチド族の３６アミノ酸メンバーである。ＮＰＹは、 記載された摂食行動の最も有力な作用物質である(Ｃlark et al.，1984; Ｌevin e and Ｍorley，1984; Ｓtanley and Ｌeibowitz，1984)。飽食ラットの視床下 部に直接注入すると、例えば、食物取り込みを４時間にわたり１０倍に増やす事 ができる(Ｓtanley et al.，1992)。通常および異常摂食行動におけるＮＰＹの 役割、および食欲および体重を制御するための手段としてのＮＰＹ依存経路を阻 害する事の可能性は、薬理学的および医学的研究の大いに興味ある領域である( Ｓahu and Ｋalra，1993; Ｄryden et al.，1994)。しかしながら、ＮＰＹ依存 摂食行動を研究又は制御する確かな手段はいづれも、ＮＰＹが少なくとも５つの 薬理学的に規定された受容体のサブタイプを通して作用し、多種の生理学的作用 を誘導するように、高度に特異的である必要がある(Ｄumont et al.，1992)。そ れゆえ、サブタイプ選択性化合物を開発するための論理的ドラッグデザインアプ ローチの一部として、分子生物学的知識および個々の受容体サブタイプの構造的 多様性を理解することが重要である。ＮＰＹ受容体薬理学の簡単なレビューは要 約して、下記および表１に示す。 ＮＰＹ受容体薬理学 ＮＰＹ受容体薬理学は、歴史的に膵臓ポリペプチド族内での構造／活性の関係 を基にしていた。この族全体には、膵臓における内分泌細胞によって主に合成さ れる、名前通りの膵臓ペプチド(ＰＰ);腸における内分泌細胞によって主に合成 されるペプチドＹＹ(ＰＹＹ)、神経で主に合成されるＮＰＹが含まれる(Ｍichel ，1992; Ｄumont et al.，1992; Ｗahlestedt and Ｒeis，1993)。膵臓ポリペプ チド族の全てのメンバーは、"ＰＰ折り"をはじめとする圧縮構造およびＴyr³⁶( 又は一文字コードではＹ³⁶)で終わる保存Ｃ末端ヘキサペプチドの末端を共通に 持つ。Ｙ³⁶の保存が顕著であることによって、"Ｙ型"受容体が膵臓ポリペプチド であるという言及が支持されてきた(Ｗahlestedt et al.1987)。これらすべてに よって、７つの膜内外にわたるＧ蛋白連結受容体として作用が提示される(Ｄumo nt et al.，1992)。 Ｙ受容体は、ＮＰＹ≧ＰＹＹ＞＞ＰＰを認識する(Ｇrundemar et al.，1992) 。該受容体による最適認識のためには、該ペプチドのＮ−およびＣ−末端領域の 両方が必要とされる。しかし、ＮＰＹ又はＰＹＹ中でＧln３４がＰＰ起源の類似 残基と交換されていても十分許容される。Ｙ１受容体は、ヒト、ラットおよびマ ウスを含む多くの種からクローンされている(Ｌarhammar et al，1992; Ｈerzog et al，1992; Ｅva et al.、1990; Ｅva et al，1992)。Ｙ２受容体はＰＹＹ─ ＮＰＹ＞＞ＰＰを認識し、Ｎ末端に欠損があっても比較的許容される(Ｇrundema r et al.，1992)。該受容体は、そのＣ末端における構造がＡrg³³−Ｇln³⁴−Ａr g³⁵−Ｔyr³⁶−ＮＨ₂である事が厳密に要求される; ＰＰ中におけるように、Ｇln³⁴ をＰro³⁴を置換する事はあまり許容できない。該Ｙ２受容体は、最近クローン された(1994年２月３日に提出されたＵＳ特許出願シリーズ番号08/192,288)。該 Ｙ３受容体は、ＰＹＹおよびＰＰよりもＮＰＹに対する選択性が強いという特徴 がある(Ｗahlestedt et al.，1991)。[Ｐro³⁴]ＮＰＹは、やはりＰro³⁴を含んで いるＰＰが該Ｙ３受容体には十分結合しなくても、かなり十分な許容性がある。 この受容体(Ｙ３)は、まだクローンされていない。Ｙ４受容体(1993年12月28日 に提出されたＵＳ特許出願シリーズ番号08/176,412に開示されている)は、ＰＰ ＞ＰＹＹ＞ＮＰＹに結合する。Ｙ１と同様に、Ｙ４が最適認識を行なうためには 、該ペプチドのＮ−およびＣ−末端領域の両方が必要である(シナプチックＹ４ 特許)。該"異型Ｙ１"すなわち摂食受容体は、幾つかの膵臓ポリペプチド類似物 を、ラットの視床下部の室傍核(ここでは、下記ランクオーダー: ＮＰＹ≧ＮＰＹ_2-36＝ＰＹＹ＝「Ｌeu³¹、Ｐro³⁴」ＮＰＹ＞＞ＮＰＹ_13-36をもっ て摂食行動を刺激する)へ注入することによってのみ規定される(Ｋalra et al. ，1991; Ｓtanley et al.，1992)。該プロフィルは、ＮＰＹと同等がより高い有 効性をもって食物の取り入れを刺激するＮＰＹ_2-36の例外的な能力を除いては、 Ｙ１様受容体のプロフィルと同様である。Ｂalasubramanianおよび共同研究者( １９９４)によるＪ.Ｍed.Ｃhem.におけるその後のレポートで、摂食は、[Ｄ−Ｔ rp³²]ＮＰＹによって調整できる事が分かった。このペプチドは、ＮＰＹ拮抗的 阻害物質として提供される一方、公表されたデータの少なくとも一部によって、 [Ｄ−Ｔrp³²]ＮＰＹが摂食を刺激する効果があることが支持された。それによっ て、[Ｄ−Ｔrp³²]ＮＰＹは、受容体認識を診断するもう一つの道具である事が分 かる。他のＮＰＹ受容体サブタイプとは対照的に、該摂食受容体は、放射性リガ ンド分析におけるペプチド結合親和性によって特徴づけされたことはなく、単一 の受容体が、摂食反応に関与しうるという事実は、単離された受容体蛋白無しで は確認することは不可能であった。例えば、摂食反応がＹ１およびＹ２サブタイ プの複合プロフィルであるというもありうるからである。 出願人は、ラット視床下部ｃＤＮＡライブラリーから新規Ｙ型受容体を発現ク ローニングによって単離することについて、その薬理学的特徴およびin-situ局 在化、ヒト相似物と共にここに報告する。この得られたデータによって、この新 規クローンされた受容体のサブタイプ(現時点より、Ｙ５サブタイプと呼ばれる) と"異型Ｙ１"摂食反応とが関連付けられる。それゆえ、この発見は、異種発現シ ステムを使用を通して、肥満および他の指標に対するサブタイプ選択性拮抗的阻 害物を開発するための新規アプローチを提供する。 出願人は、更に、イヌＹ５受容体の単離を報告する。加えて、出願人は、本願 のＹ５受容体に選択的に結合し、Ｙ５受容体の拮抗的阻害物質として働く化合物 を発見したことを報告する。ラットにおいて、食物の取り入れを阻害するように 見える幾つかの化合物が、更に提示される。 Ｙ５受容体サブタイプの阻害に関係する疾患又は疾病、特に肥満、大食症、神 経症(nervosa)、糖尿病、非脂肪血症(dislipidimia)等の摂食疾患によって引き 起こされる疾病の処置は、Ｙ５受容体に選択的に結合し、Ｙ５受容体の活性化を 阻害する化合物を投与によって行われる。更に、Ｙ５受容体サブタイプが関与す る疾病、例えば、記憶喪 失、癲癇発作、片頭痛、睡眠障害、および痛み等の疾病状態はどれも、Ｙ５受容 体に選択的に結合する化合物を使用して治療でき得る。 〔発明の概要〕 本発明は、被験者の摂食行動を変える方法を提供するものであって、該方法は 、Ｙ５受容体の作用物質(agonist)又は拮抗的阻害物質(antagonist)である化合 物をある量被験者に投与し、該被験者による食物の消費を増やしたり、減らした りし、これによって被験者の摂食行動を変える事を包含する。 本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、 該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を阻害するのに効果的な、Ｙ５受容体拮抗 的阻害物質である非ペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、 ヒト受容体に対する該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場合 、Ｋiが１００ナノメータ未満である事を特徴とする。 本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、 該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を阻害するのに効果的な、Ｙ５受容体拮抗 的阻害物質であるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、ヒ トＹ５受容体に対する該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場 合に、Ｋiが１０ナノメータ未満であることを特徴とする。 本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、 該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作 用物質である非ペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、(a) ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した 場合、Ｋiが１００ナノメータ未満であることを特徴とし、(b)他のヒトＹ型受容 体に対する化合物の結合が、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋiが１０ ００ナノメータより大きいことを特徴とする。 本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、 該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作 用物質である非ペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、(a) ヒトＹ５受容体に対する該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した 場合、Ｋiが１ナノメータ未満であることを特徴とし、(b)他のヒトＹ型受容体に 対する化合物の結合が、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋiが１００ナ ノメータより大きい事を特徴とする。 本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、 該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作 用物質で あるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、(a)ヒトＹ５受 容体に対する該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋiが １ナノメータ未満であることを特徴とし、(b)他のヒトＹ型受容体に対する化合 物の結合が、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋiが２５ナノメータより 大きい事を特徴とする。 本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、 該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作 用物質であるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、(a)ヒ トＹ５受容体に対する該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場 合、kiが０.１ナノメータ未満であることを特徴とし、(b)他のヒトＹ型受容体に 対する化合物の結合が、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋiが１ナノメ ータより大きい事を特徴とする。 本発明は、被験者における摂食疾患を治療する方法を提供するものであって、 該方法は、被験者のＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な、Ｙ５受容体作 用物質であるペプチジル化合物をある量被験者に投与することを包含し、(a)ヒ トＹ５受容体に対する該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場 合、Ｋiが0.01ナノメータ未満であること特徴とし、(b)他のヒトＹ型受容体に対 する化合物の結合が、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの存在下で測定した場合、Ｋiが１ナノメー タより大きい事を特徴とする。 本発明は、Ｙ５受容体をコードしている単離された核酸を提供する。本発明は 、またＹ５受容体蛋白を提供する。本発明は、上記記載の核酸からなるベクター を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡに効果的に連結されている 、哺乳類細胞中での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を包含し、その発現をさせ る、pcＥＸＶ−hＹ５(ＡＴＣＣ 認可番号７５９４３)と呼称されるプラスミドを 提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡに操作上連結されている、 哺乳類細胞中での該ＤＮＡの発現に必要な調節要素を包含し、その発現をさせる 、pcＥＸＶ−rＹ５(ＡＴＣＣ 認可番号７５９４４)と呼称されるプラスミドを提 供する。 本発明は、上記プラスミド又はベクターを包含する哺乳類細胞を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体をコードしている核酸の配列内に含まれる特異配列によ って特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの核 酸からなる核酸プローブを提供する。 本発明は、Ｙ５受容体をコードしているｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズす ることができ、該ｍＲＮＡの翻訳を阻止する配列を但持するアンチセンス・オリ ゴヌクレオチドを提供する。 本発明は、Ｙ５受容体に向けられる抗体を提供する。 本発明は、細胞膜を通過し該細胞内でヒトＹ５受容体をコードしているｍＲＮ Ａと特異的に結合させる事によって、ヒトＹ５受容体の活性を減少させるのに効 果的なオリゴヌクレオチドをある量包含する薬学組成物、および細胞膜を通過す ることが可能な、薬学的に許容可能な担体を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を減らすに効果的な拮抗的阻害物質をある量 包含する薬学組成物および薬学的に許容可能な担体を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を増加させるのに効果的な作用物質をある量 包含する薬学組成物および薬学的に許容可能な担体を提供する。 本発明は、該Ｙ５受容体に対するリガンドの結合を阻害するに効果的な抗体を ある量包含する上記記載の薬学組成物および薬学的に許容可能な担体を提供する 。 本発明は、ヒトＹ５受容体をコードしているトランスジェニックな非ヒト哺乳 類発現ＤＮＡを提供する。 本発明は、リガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するた めの方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコードしているＤＮ Ａでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、このような受容体に対し てリガンドの結合を許容するような条件下で、リガンドと接触させ、Ｙ５受容体 に特異的に結合したこのようなリガンドの存在をいづれも検出し、これによって 該リガンドがＹ５受容体に特異的に結合するかどうかを決定する事を包含する。 本発明は、リガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定するた めの方法を提供する物であり、該方法は、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡで トランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞から細胞抽出物を調整し、該細胞 抽出物から膜分画を単離し、該膜分画を、このような受容体に対するリガンドの 結合を許容するような条件下で該リガンドに接触させ、Ｙ５受容体に特異的に結 合したこのようなリガンドの存在を検出し、これによって該リガンドがＹ５受容 体に特異的に結合するかどうかを決定する事を包含する。 本発明は、リガンドがＹ５受容体作用物質であるかどうかを決定するための方 法を提供するものであって、該方法は、ヒトＹ５受容体をコードしている核酸で トランスフェクトされ該核酸を発現する細胞を、該Ｙ５受容体の活性化が許容さ れる条件下で、リガンドに接触させ、Ｙ５受容体活性の増加を検出し、これによ って該リガンドがヒトＹ５受容体作用性物質であるかどうかを決定する事を包含 する。 本発明は、リガンドがＹ５受容体拮抗的阻害剤であるかどうかを決定するため の方法を提供するものであって、Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトランス フェクトされ、該ＤＮＡを発現する細胞を、ＰＹＹ又はＮＰＹのような既知のＹ ５受容体作用性物質存在下、該Ｙ５受容体の活性化が許容される条件下で、該リ ガンドと接触させ、Ｙ５受容体活性の低下を検出し、これによって該リガンドが ヒトＹ５受容体拮抗的阻害物質であるかどうかを決定する事を包含する。 本発明は、Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を確認するために該Ｙ５受容 体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提 供するものであって、該方法は、(a)Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトラ ンスフェクトされ、該ＤＮＡを発現する細胞を、該Ｙ５受容体に特異的に結合す る事が知られる化合物と接触させ、(b)ステップ(a)の調整物を、該Ｙ５受容体に 特異的に結合する事が知られていない複数の化合物と、該Ｙ５受容体が結合する と知られている化合物の結合を許容する条件下で、接触させ、(c)該複数化合物 の非存在下での該化合物の結合と比較して、Ｙ５受容体に結合することが知られ る化合物が、該化合物の存在下で減少するかどうかを決定し、もしそうであれば 、(d)複数の化合物中に含まれる各化合物のＹ５受容体に対する結合を別々に確 認し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合する化合物を確認する事を包 含する。 本発明は、Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を確認するために該Ｙ５受容 体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提 供するものであって、該方法は、(a)Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトラ ンスフェクトされ、該ＤＮＡを発現する細胞から細胞抽出物を調整し、該細胞抽 出物から膜分画を単離し、該膜分画を、Ｙ５受容体と特異的に結合することが知 られる化合物と接触させ、(b)ステップ(a)の調整物を、該Ｙ５受容体に特異的に 結合する事が知られていない複数の化合物と、該Ｙ５受容体が結合すると知られ ている化合物の結合を許容する条件下で、 接触させ、(c)該複数化合物の非存在下での該化合物の結合と比較して、Ｙ５受 容体に結合することが知られる化合物が、該化合物の存在下で減少するかどうか を決定し、もしそうであれば、(d)複数の化合物中に含まれる各化合物のＹ５受 容体に対する結合を別々に確認し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合 する化合物を確認する事を包含する。 本発明は、Ｙ５受容体を活性化する化合物を確認するために、Ｙ５受容体を活 性化することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供す るものであって、該方法は、(a)Ｙ５受容体でトランスフェクトされ、該Ｙ５受 容体を発現する細胞とＹ５受容体と特異的に結合することが知られる複数の化合 物とを、該Ｙ５受容体の活性化を許容する条件下で接触させ、(b)該化合物の存 在下でＹ５受容体の活性が増加するかどうかを決定し、もしそうであれば、(c) Ｙ５受容体の活性化が、複数の化合物中に含まれる各化合物によって増加するか どうかを別個に決定し、これによって、該Ｙ５受容体を活性化する化合物を確認 する事を包含する。 本発明は、Ｙ５受容体を活性化する化合物を確認するために、該Ｙ５受容体を 活性化することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法を提供 するものであって、該方法は、(a)Ｙ５受容体をコードしているＤＮＡでトラン スフェクトされ、該ＤＮＡを発現する細胞から細胞抽出物を調整し、該細胞抽出 物から膜分画を単離し、該膜分画を、Ｙ５受容体と特異的に結合することが知ら れていない複数の化合物と、該Ｙ５受容体の活性化を許容する条件下で接触させ 、(b)該化合物の存在下で、Ｙ５受容体の活性が増加するかどうかを決定し、も しそうであれば、(c)複数の化合物中に含まれる各化合物によって、Ｙ５受容体 の活性が増加するかどうかを別々に決定し、これによってＹ５受容体を活性化す る化合物を確認することを包含する。 本発明は、Ｙ５受容体を活性化を阻害する化合物を確認するために、Ｙ５受容 体を活性化を阻害することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする 方法を提供するものであって、該方法は、(a)Ｙ５受容体でトランスフェクトさ れ、該Ｙ５受容体を発現する細胞と、複数の化合物とを該Ｙ５受容体作用性物質 存在下、該Ｙ５受容体の活性化を許容する条件下で接触させ、(b)該複数化合物 の非存在下でのＹ５受容体の活性化と比較して、該複数の化合物の存在下で、Ｙ ５受容体の活性化が減少するかどうかを決定し、もしそうであれば、(c)複数の 化合物中に含まれる各化合物のＹ５ 受容体の活性化阻害を別個に決定し、これによってヒトＹ５受容体の活性化を阻 害する化合物を確認する事を包含する。 本発明は、Ｙ５受容体を活性化を阻害する化合物を確認するために、該Ｙ５受 容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化合物をスクリーニングす る方法を提供するものであって、該方法は、(a)Ｙ５受容体をコードしているＤ ＮＡでトランスフェクトされ、該ＤＮＡを発現する細胞から細胞抽出物を調整し 、該細胞抽出物から膜分画を単離し、該膜分画を、既知Ｙ５受容体作用性物質の 存在下で複数の化合物と接触させ、(b)該複数化合物の非存在下におけるＹ５受 容体の活性化と比較して、該複数化合物の存在下で、該Ｙ５受容体の活性化が減 少するかどうかを決定し、もしそうならば、(c)複数の化合物中に含まれる各化 合物がＹ５受容体の活性を阻害するかどうかを別々に決定し、これによってＹ５ 受容体の活性化を阻害する化合物を確認する事を包含する。 本発明は、細胞表面のＹ５受容体に特異的に結合する薬剤を確認するために薬 剤をスクリーニング方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコー ドしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、該Ｙ５受 容体に対して薬剤の結合を許容するような条件下で、複数の薬剤に接触させ、ト ランスフェクトされた細胞に特異的に結合するそれらの薬剤を決定し、これによ ってＹ５受容体に特異的に結合する薬剤を確認することを包含する。 本発明は、Ｙ５受容体の作用性物質として作用する薬剤を確認するために薬剤 スクリーニングする方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコー ドしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、機能的な 該Ｙ５受容体反応を活性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させ、該細胞中で このような受容体を活性化する薬剤を決定し、これによって該Ｙ５受容体の作用 性物質として働く薬剤を確認することを包含する。 本発明は、Ｙ５受容体の拮抗的阻害物質として作用する薬剤を確認するための 薬剤スクリーニング方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体をコー ドしているＤＮＡでトランスフェクトされ該ＤＮＡを発現する細胞を、ＰＹＹ又 はＮＰＹ等の既知Ｙ５受容体作用性物質存在下、機能的な該Ｙ５受容体反応を活 性化させる条件下で、複数の薬剤と接触させ、哺乳類細胞中で該受容体の活性化 を阻害する薬剤を決定し、こ れによって該Ｙ５受容体拮抗的阻害物質として働く薬剤を確認することを包含す る。 本発明は、Ｙ５受容体の阻害によって異常性を軽減する、被験者において異常 性を治療する方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体の拮抗的阻害 物質を有効量被験者に投与することを包含する。 本発明は、Ｙ５受容体の活性化によって異常性を軽減する、被験者において異 常性を治療する方法を提供するものであって、該方法は、Ｙ５受容体の作用性物 質を有効量被験者に投与することを包含する。 本発明は、ヒトＹ５受容体対立遺伝子の活性に関与する疾病に対する疾病素因 を診断するための方法を提供するものであって、該方法は、a.該疾病に罹患した 被験者のＤＮＡを得、b.制限酵素類のパネルによって、該ＤＮＡの制限消化を行 い、c.得られたＤＮＡ断片を、選別基準ゲル上で、電気泳動的に分離し、d.得ら れたゲルを、ヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡと特異的にハイブリダイズ できる核酸プローブと接触させ、検出可能なマーカーで標識し、e.検出可能なマ ーカーで標識されたヒトＹ５受容体をコードしているＤＮＡとハイブリダイズさ れた標識バンドを検出し、該疾病に罹患している被験者のＤＮＡに特異的なユニ ークなバンドを作り、f.工程a−eによって得られる診断用のＤＮＡを調整し、g. ステップeからの該疾病罹患患者のＤＮＡと、工程fからの診断用ＤＮＡに特異的 なバンドパターンを比較して、該パターンが同一か異なるかを決定し、それによ って、もしパターンが同一であれば、疾病の疾病素因が診断される、事を包含す る。 本発明は、該単離Ｙ５受容体を調整する方法を提供する。該方法は、 a.Ｙ５受容体をコードしている核酸を、Ｙ５受容体をコードしている核酸に有 効に連結している核酸の発現に必要な調整因子を包含する適切なベクター中に挿 入し、b.得られたベクターを適切なホスト細胞に挿入し、Ｙ５受容体を産生する 細胞を得、c.得られた細胞によって産生される受容体を回収し、d.このように回 収した該受容体を精製する、事を包含する。 〔図面の簡単な説明〕 図 １ ラット視床下部起源の¹²⁵Ｉ─ＰＹＹの競合置換。膜は、競合ペプチド の濃度をあげながら¹²⁵Ｉ─ＰＹＹでインキュベートした。50％置換に匹敵する ＩＣ₅₀は、非直線 回帰分析によって決定された。データは少なくとも二つの独立して行われた実験 のものを示す。これらの化合物のＩＣ₅₀値は、表２に別々に掲載されている。 図 ２: ラット視床下部起源の¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36の競合置換。膜は、競合ペプ チドの濃度をあげながら、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹ_3-36と共にインキュベートした。５０ ％置換に匹敵するＩＣ₅₀は、非直線回帰分析によって決定された。データは少な くとも二つの独立実験のものを示す。これらの化合物のＩＣ₅₀値は、表２に別々 に掲載されている。 図 ３: ラットの視床下部Ｙ５ ｃＤＮＡクローン(配列認識番号１)のヌクレオ チド配列。開始コドンおよび停止コドンには下線が施してある。部分的５'およ び３'未翻訳配列のみ示されている。 図 ４: ラット視床下部Ｙ５ ｃＤＮＡクローン(配列認識番号２)の対応アミノ 酸配列。 図 ５: ヒト海馬交連Ｙ５ ｃＤＮＡクローン(配列認識番号３)のヌクレオチド 配列。開始コドンおよび停止コドンには下線が施してある。部分的５'および３' 未翻訳配列のみ示されている。 図 ６: ヒト海馬交連Ｙ５ ｃＤＮＡクローン(配列認識番号４)の対応アミノ酸 配列。 図 ７: Ａ−Ｅラット視床下部Ｙ５(上列)およびヒト海馬交連Ｙ５(下列)のｃ ＤＮＡクローン(８４.１％ヌクレオチド認識)間のヌクレオチド配列コードの比 較。 Ｆ−Ｇ ラット視床下部Ｙ５(上列)およびヒト海馬交連Ｙ５(下列)のｃＤＮ Ａクローン(全体では８７.２％、膜内外ドメイン98.8％の同一性)の推定アミノ 酸配列の比較。 図 ８: ヒトＹ１，Ｙ２，Ｙ４配列の推定アミノ酸配列とヒトＹ５受容体の推 定アミノ酸配列との比較。黒線は、７つの推定膜通過ドメイン(ＴＭＩ−ＶII)。 影を付けた部分は、同一受容体配列部を示す。 図 ９: ラットＹ５受容体を一時的に発現するＣＯＳ─７細胞起源の膜に対す る¹²⁵Ｉ-ＰＹＹの平衡結合。膜は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹで３００nmヒトＮＰＹの存在 下又は非存在下で、表示回数インキュベートされた。特異的結合Ｂを、時間tに 対してプロットし、等式Ｂ＝Ｂ_max＊(１─ｅ^-(kobs*t))に従って、最大数の平衡 結合部位Ｂ_maxおよび観察される連合率Ｋ_obsを得た。結合は、非直線回帰分析に よって決定された全平衡結合Ｂ_maxのパーセンテージとし表示される。各ポイン トは、測定三回の代表値を示す。 図 １０: ラットＹ５受容体を一時的に発現するＣＯＳ─７細胞起源の膜に対 する¹²⁵Ｉ-ＰＹＹの飽和平衡結合。膜は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹで、0.4ｐＭから2.7nＭ の濃度範囲で，３００nmヒトＮＰＹの存在下又は非存在下でインキュベートされ た。特異的結合Ｂを、遊離¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ濃度[Ｌ]に対してプロットし、結合等 式Ｂ＝Ｂ_max[Ｌ]/([Ｌ]+Ｋd)に従って、最大数の飽和平衡結合部位Ｂ_max、¹²⁵Ｉ −ＰＹＹ平衡解離定数をＫdを得た。特異結合が示されている。データは、３つ の独立した実験を代表する物を示し、各ポイントは三回測定された。 図 １１: ラットＹ５受容体を一時的に発現するＣＯＳ─７細胞起源の¹²⁵Ｉ- ＰＹＹの競合置換。膜は、¹²⁵Ｉ─ＰＹＹで、競合ペプチドの濃度をあげながら 印キュベートされた。５０％の置換に相当するＩＣ₅₀値は、非直線回帰分析によ って決定され、等式:Ｋi＝ＩＣ₅₀(１＋[1]/Ｋd)(ここで、[Ｌ]は、¹²⁵Ｉ−ＰＹ Ｙ濃度、Ｋdは、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの平衡解離定数)に従って、Ｋi値に変換された。 これらおよび他の化合物の親和性のランクオーダーが、表４に別個に掲載されて いる。 図 １２: ラットＹ５受容体を安定的に発現する完全な２９３細胞におけるフ ォルスコリンに刺激されたｃＡＭＰの蓄積の阻害。１０μＭのフォルスコリンで ５分間に渡って刺激された２９３細胞におけるｃＡＭＰのラジオイムノアッセイ から得られた関数データ。ラット／ヒトＮＰＹを、0.03pＭから0.3μＭの範囲の 濃度で、作用物質活性につい、同一期間に渡ってテストした。５０％の最高活性 に相当するＥＣ₅₀値は、非直線回帰分析によって決定された。該データは、３つ の独立した実験を代表させたものを示す。 図 １３: ＮＰＹ Ｙ５受容体ｍＲＮＡの分布を示すラット脳の冠状断片の概略 図。ここでは、液体エマルジョンに浸した断片が微視的に視覚化されている。該 断片は、吻側(Ａ)から尾側(Ｈ)に並べらている。任意領域での個々のニューロン を覆う銀粒子の密度の差は、陰影勾配で表示されている。省略記号の完全な定義 は次の通りである: Ａco ＝ 前皮質扁桃核 ＡＤ ＝ 前背側核 ＡＲＴ ＝ 前プレテクタル(背十二指腸の隠れた部分より口側)の核 Ａrc ＝ 弓状視床下部核 ＢＬＡ ＝ 基底外側扁桃核前部 ＣＡ３ ＝ アモンの角のフィールドＣＡ３、海馬 ＣeＡ ＝ 中央扁挑核 Ｃg ＝ 帯状皮質 ＣＬ ＝ 中央外側視床核 ＣＭ ＝ 中央視床内側核 ＤＧ ＝ 歯状回、海馬 ＤＭＨ ＝ 背側内側視床下部核 ＤＲ ＝ 背面線 ＧiＡ ＝ 巨大細胞性網様体核、アルファ ＨＤＢ ＝ 核状水平四肢対角帯 ＩnＧ ＝ 中間灰層上丘 ＬＣ ＝ 青斑 ＬＨ ＝ 外側視床下部領域 ＭeＰＶ ＝ 中央扁桃核、後方腹部側 ＭＶe ＝ 前庭神経内側核 ＭＨb ＝ 内側小帯核 ＭＰＮ ＝ 内側視索前核 ＰＡＧ ＝ ペリアクエダクタル・グレイ(periaqueductal gray) ＰaＳ ＝ 傍鉤状回 ＰＣ ＝ 視床中心傍核 ＰＣＲtＡ ＝パルヴォセルラー(parvocellular)網様体核、アルファ Ｐe ＝ 脳室周囲視床下部核 ＰrＳ ＝ 前鉤状核 ＰＮ ＝ ポンテイン(pontine)核 ＰＶＨ ＝ 室傍視床下部核 ＰＶＨmp ＝ 室傍視床下部核、内側小細胞部 ＰＶＴ ＝ 室傍視床核 Ｒe ＝ 再結成視床核 ＲＬi ＝ 吻状直線縫線核 ＲＳＧ ＝ 膨大後方皮質 ＳＣＮ ＝ 交叉上核 ＳＮc ＝ 黒質、緻密部、および ＳＯＮ ＝ 視索上核 図 １４: ＴＭ111のすぐ上流から始まって停止コドンまでの(下線部)(配列番 号５)イヌＹ５ ｃＤＮＡクローンの部分ヌクレオチド配列。３'未翻訳配列のみ が部分的に示す。 図 １５: イヌＹ５ ｃＤＮＡクローン(配列認識番号６)の対応アミノ酸配列。 図 １６: Ａ．種々ラット組識のノーザレン・ブロット分析。Ｂ．種々のヒト 脳領域のノーザレン・ブロット分析: 扁挑、尾状核、脳梁、海馬、全脳、黒質、 視床腹部核、視床。Ｃ．別のヒト脳の種々領域のノーザレン・ブロット分析: 小 脳、大脳皮質、延髄、脊椎、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻。実験の詳細に記載 されたように、高度に厳密な条件のもとにハイブリデイゼーションが行われた。 図 １７: ヒトＹ５受容体・サブタイプをコードする、ヒトおよびラットのゲノ ムＤＮＡのサザン・ブロット分析。実験の詳細に記載されたように、高度に厳密 な条件のもとに、ハイブリデイゼーションが行われた。 図 １８: ¹²⁵Ｉ─Ｌeu₃₁、Ｐro₃₄─ＰＹＹのラットＹ５受容体に対する平衡結 合の時間的変化。膜は、0.08nＭ放射線リガンドで室温にて、１０mＭ Ｎa＋又は １３８mＭ Ｎa＋のいづれかを含む結合緩衝液中で、表示された時間インキュベ ートされた。 図 １９: Ｙ５ペプチド結合のグアニン・ヌクレオチドの変更。ＣＯＳ−７細胞 膜中で一時的に発現するヒトおよびラットのＹ５受容体、又はＬＭ(tk)細胞膜中 で安定的に発現するヒトＹ５受容体を、標準結合分析条件下で、表示されたよう に、Ｇpp(ＮＨ)pの濃度を増しながら、０.０８nＭ ¹²⁵Ｉ−ＰＹＹでインキュベ ートした。放射線リガンド結合はcpmで、効率＝０.８との報告である。 ＬＭ(tk-)中のヒトＹ５(0.007mg 膜蛋白／サンプル)では、最大Δcpmは-2343。 それゆえ、任意の２２００Ｃi／ミリモルの特異活性では、放射線リガンド結合 における変化は、-0.6fモル／0.007mg蛋白＝-85fモル／mg膜蛋白になると計算さ れる。 図 ２０: クローンされたＹ５受容体によるフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積 のＮＰＹ依存阻害。ヒト又はラットＹ５受容体で、安定的にトランスフェクトさ れた完全細胞は、フォルスコリン＋表示された濃度の範囲のヒトＮＰＹで、イン キュベートされた。各受容体システム(ｎ≧２)について代表的な実験を示す。 図 ２１: カルシウム移動: フラ２(Ｆura-2)分析。表示したホスト細胞中でク ローンされたヒトＹ型受容体を、ＮＰＹおよび関連ペプチドに反応して起こる細 胞内カルシウム移動についてスクリーンニングした。 図 ２２: ヒトおよびラットＹ５受容体に選択的に結合する化合物の構造を示 す。 〔発明の詳細な説明〕 この巣津眼の全体を通して、特定のヌクレオチド塩基を示すために、下記の標 準的な略記号を用いた。 Ｃ＝シトシン、 Ａ＝アデニン Ｔ＝チミン、 Ｇ＝グアニン 更に、「拮抗剤」の用語は、この出願の全体を通して、本発明の受容体の何れ かの活性を増大する何れかのペプチドまたは非ペプチジル化合物を示すために用 いられる。 Ｙ５受容体のようなＧタンパク結合受容体の活性は、問題の受容体の活性化に よって、何らかのセカンドメッセンジャー系のレベルに観察され得る変化が生じ るような種々の適切な機能試験の何れかを用いて測定すればよい。このようなセ カンドメッセンジャー系には、アデニル酸サイクラーゼ、カルシウム可動化、イ ノシトールリン脂質加水分解またはグアニリルサイクラーゼが含まれるが、これ らに限定されるものではない。 本発明は、患者の摂食挙動を改善する方法であって、患者に対して、患者によ る食物の消費を増大または減少させ、それによって患者の摂食挙動を改善するの に有効な量の、Ｙ５受容体の作動剤または拮抗剤である化合物を投与することを 具備した方法を提供する。一つの態様において、この化合物はＹ５受容体の拮抗 剤であり、その量は、患者による食物の消費を減少させるのに有効な量である。 もう一つの態様において、該化合物は食物と組み合わせて投与される。更なる態 様において、この化合物はＹ５受容体の作動剤であり、その量は、患者による食 物の消費を増大させるのに有効な量である。他の態様において、該化合部は食物 と共に投与される。患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、またはイヌの患者であ り得る。 本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、患 者のＹ５受容体の活性を阻害するのに有効な量の、Ｙ５受容体拮抗剤である非ペ プチジル化合物を投与することを具備した方法であって、前記化合物のヒト受容 体に対する結合が、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモル未満の Ｋｉであることを特徴とする方法を提供する。一態様において、当該化合物は ５ナノモル未満のＫ_iを有する。他の態様において、当該化合物は１ナノモル未 満のＫｉを有する。更なる態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体への当該 化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも大 きいＫ_iを有することを特徴とする。更なる態様において、ヒトＹ１、ヒトＹ２ およびヒトＹ４受容体の夫々に対する当該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存 在下で測定したときに10ナノモルよりも大きいＫ_iを有することを特徴とする。 他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、 50ナノモルよりも大きいＫｉを特徴とする。他の態様において、他の何れかのヒ トＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、100ナノモルよりも大きいＫｉを特 徴とする。一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が 他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結 合する。他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が ヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性の１０倍より も大きな親和性で結合する。 更なる態様において、前記摂食障害は過食症(bulimia)である。前記患者は、 脊椎動物、哺乳動物、ヒトまたはイヌの患者であり得る。 本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該 患者のＹ５受容体の活性を阻害するのに有効な量の、Ｙ５受容体拮抗剤であるペ プチジル化合物を投与することを具備し、ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の 結合が、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモル未満のＫｉである ことを特徴とする方法を提供する。一態様において、当該化合物は１ナノモル未 満のＫ_iを特徴とする。他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体への当 該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも 大きいＫ_iによって特徴付けられる。更なる態様において、ヒトＹ１、ヒトＹ２ およびヒトＹ４受容体の夫々に対する当該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存 在下で測定したときに10ナノモルよりも大きいＫ_iによって特徴付けられる。他 の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合物の結合は、^{12 5} Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに50ナノモルよりも大きいＫｉによって特 徴付けられる。他の態様において、他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化 合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモルよりも大き いＫｉによって特徴付けられる。他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容 体に対して、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍 よりも大きな親和性で結合する。一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体 に対して、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合す る親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。 上記方法の一態様において、摂食障害は肥満である。他の態様において、摂食 障害は過食症である。前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒトまたはイヌの患者 であり得る。 本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該 患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤である非 ペプチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該 化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモル未満のＫ ｉによって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該 化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに1000ナノモルよりも 大きいＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。 一態様において、ヒトＹ５受容体に対する当該化合物の結合は、10ナノモル未 満のＫｉによって特徴付けられる。 本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該 患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤である非 ペプチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該 化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに1ナノモル未満のＫ_i によって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化 合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモルよりも大き いＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。 一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が他の何れ かのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。 他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物のヒトＹ１ 、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性の１０倍よりも大きな 親 和性で結合する。 上記方法の一態様において、摂食障害は食欲不振である。前記患者は、脊椎動 物、哺乳動物、ヒトまたはイヌの患者であり得る。 本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該 患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペ プチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化 合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに１ナノモル未満のＫ_iに よって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化合 物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに25ナノモルよりも大きい Ｋｉによって特徴付けられる方法を提供する。 本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該 患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペ ブチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化 合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに0.1ナノモル未満のＫ_i によって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当該化 合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに１ナノモルよりも大き いＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。 一態様において、当該作動剤の他の何れかのヒトＹ型受容体に対する結合は、 10ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる。 本発明は、患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該 患者のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペ プチジル化合物を投与することを具備し、（ａ）ヒトＹ５受容体に対する当該化 合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときには0.01ナノモル未満の Ｋ_iによって特徴付けられ；また（ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する当 該化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに１ナノモルよりも 大きいＫｉによって特徴付けられる方法を提供する。 一態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物が他の何れ かのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。 他の態様において、当該化合物はヒトＹ５受容体に対して、該化合物のヒトＹ１ 、 ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性の１０倍よりも大きな親 和性で結合する。 一態様において、前記摂食障害は食欲不振である。前記患者は、脊椎動物、哺 乳動物、ヒトまたはイヌの患者であり得る。 本発明は、患者の摂食挙動を改善するための薬学的組成物、医薬または薬物を 製造するための、ここに開示する化合物の使用を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体の拮抗阻害が有用であるような摂食障害、特に、肥満ま たは過食症を治療するための薬学的組成物、医薬または薬物を製造するための、 ここに開示する化合物の使用を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体の拮抗阻害が有用であるような疾患、特に、食欲不振の ような摂食障害を治療するための薬学的組成物、医薬または薬物を製造するため の、ここに開示する化合物の使用を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体をコードする単離された核酸配列を提供する。一態様に おいて、このＹ５受容体は脊椎動物または哺乳動物のＹ５受容体である。一つの 態様において、前記単離された核酸は、膜貫通領域におけるアミノ酸配列によっ て特徴付けられる受容体をコードし、このアミノ酸配列は図６に示すヒトＹ５受 容体の膜貫通領域におけるアミノ酸配列に対して60％以上の相同性を有する。他 の態様において、当該Ｙ５受容体は図４に記載したアミノ酸配列と実質的に同じ アミノ酸配列を有する。 本発明は、前記核酸がＤＮＡであるような上記の単離された核酸を提供する。 一態様において、前記ＤＮＡはｃＤＮＡである。更に別の実施例において、前記 核酸はＲＮＡである。別の実施例において、前記核酸はヒトＹ５受容体をコード する。一態様において、このヒトＹ５受容体は、図６に記載したアミノ酸配列を 有する。 本発明は更に、図３，５および１４に示したＤＮＡの何れかと縮重したＤＮＡ を提供し、このＤＮＡは、夫々図４，６および１５に示すアミノ酸配列を有する Ｙ５受容体をコードする。 本発明はまた、Ｙ５受容体のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列をコードす るＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含するが、これらは発現型の変化を生じてはならな い。或いは、本発明はまた、本発明のＤＮＡおよびｃＤＮＡとハイブリダイズす るＤＮＡおよびｃＤＮＡをも包含する。ハイブリダイゼーションの方法は、当業 者に周知である。 本発明のＤＮＡ分子はまた、１以上のアミノ酸残基の種類または位置において 天然に存在する形とは異なり且つ天然に存在する型の特性の幾つか又は全部を共 有する、抗原性ポリペプチドのポリペプチド類縁体、フラグメントまたは誘導体 （当該タンパクについて特定された残基の全部よりも少ない残基を含有する欠失 類縁体、１以上の特定された残基が他の残基で沖かえつれた置換類縁体、および 当該ポリペプチドの末端および中間部分に１以上のアミノ酸残基が不可された不 可類縁体）をコードするＤＮＡをも包含する。これらの核酸には、選択された非 哺乳動物宿主による発現にとって「好ましい」コドンの組み込み；制限エンドヌ クレアーゼ酵素による開裂部位の提供；および、追加の開始ＤＮＡ配列、末端Ｄ ＮＡ配列または中間ＤＮＡ配列の提供が含まれる。 ここに記載され、また請求の範囲に記載された核酸は、当該ポリペプチドのア ミノ酸配列に関してそれらが提供する情報の故に有用であり、また種々の組み替 え技術によるポリペプチドの大規模な合成のための物として有用である。当該核 酸は、新たなクローニングベクターおよび発現ベクター、形質転換およびトラン スフェクトされた原核および真核宿主細胞を作製するために有用であり、また、 このようなポリペプチドおよび関連生成物を発現できる宿主細胞を培養増殖する ための新しく且つ有用な方法として有用である。 別の態様において、当該核酸はラットＹ５受容体をコードする。他の態様にお いて、ラットＹ５受容体は、図４に示したアミノ酸配列を有している。他の態様 において、当該核酸はイヌＹ５受容体をコードする。更なる態様において、イヌ Ｙ５受容体は図１５に示したアミノ酸配列を有する。 本発明はまた、単離されたＹ５受容体タンパクを提供する。別の態様において 、Ｙ５タンパクはヒト、ラットまたはイヌのタンパクであり得る。 本発明は、上記の核酸を含むベクターを提供する。 また、上記の単離された核酸を含むベクター類が提供される。適切なベクター 類にはプラスミド又はウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない 。 こられベクターは、Ｙ５受容体の生物学的仮性を有するポリペプチドの製造のた めの宿主ベクター系を形成するために、適切な宿主細胞に形質転換され得る。 本発明は、バクテリア細胞内での発現に適用される上記ベクターであって、更 に、バクテリア細胞内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコード する前記核酸に機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素をも含んだベクタ ーを提供する。 本発明は、酵母細胞内での発現に適用される上記ベクターであって、更に、酵 母細胞内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコードする前記核酸 に機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素をも含んだベクターを提供する 。 本発明は、昆虫細胞内での発現に適用される上記ベクターであって、昆虫細胞 内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコードする前記核酸に機能 的にリンクしてこれを発現させる調節要素をも含んだベクターを提供する。 一態様において、当該ベクターは哺乳類細胞内での発現に適用されるものであ り、哺乳類細胞内での当該ＤＮＡの発現のために必要な、哺乳類Ｙ５受容体をコ ードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んでい る。 更なる態様において、当該ベクターは哺乳類細胞内での発現に適用されるもの であり、哺乳類細胞内での当該ＤＮＡの発現のために必要な、ヒトＹ５受容体を コードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んで いる。 更なる態様において、当該ベクターは哺乳類細胞内での発現に適用されるもの であり、哺乳類細胞内での当該ＤＮＡの発現のために必要な、ラットＹ５受容体 をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含ん でいる。 本発明は、哺乳類細胞内での発現に適用される上記プラスミドであって、哺乳 類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、哺乳類Ｙ５受容体をコードする前記 ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだベクターを提供 する。 本発明は、哺乳類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、ヒトＹ５受容体を コードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだ 、ｐｃＥＸＶ−ｈＹ５と命名されたベクターを提供する（ＡＴＣＣ受付番号第75 943号）。 このプラスミド（ｐｃＥＸＶ−ｈＹ５）は、特許手続上の微生物の寄託の国際 的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９４年１１月４日に、アメ リカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号208 52）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され 、ＡＴＣＣ受付番号第75943号が付与された。 本発明は、哺乳類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、ラットＹ５受容体 をコードする前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含ん だ、ｐｃＥＸＶ−ｒＹ５と命名されたベクターを提供する（ＡＴＣＣ受付番号第 75944号）。 このプラスミド（ｐｃＥＸＶ−ｈＹ５）は、特許手続上の微生物の寄託の国際 的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９４年１１月４日に、アメ リカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵便番号208 52）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され 、ＡＴＣＣ受付番号第ＣＲＬ 75944号が付与された。本発明は、Ｙ５−ｂｄ−５ と命名されたプラスミド（ＡＴＣＣ受付番号第 号）を提供する。 本発明はまた、Ｙ５−ｂｄ−８と命名されたプラスミド（ＡＴＣＣ受付番号第 号）を提供する。これらのプラスミドは、特許手続上の微生物の寄 託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９５年１２月１日 に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301（郵 便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ） に寄託され、夫々、ＡＴＣＣ受付番号第 号および第 号が付与された。 本発明は、ｈＹ５−ＢＢ３と命名されたバキュウロウイルス（ＡＴＣＣ受付番 号第 号）を提供する。このバキュウロウイルスは、特許手続上の 微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９５年 １１月１５日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライ ブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴＣＣ受付番号第 号が付与された。 本発明は、上記プラスミドまたはベクターを含む哺乳類細胞を提供する。一態 様において、この哺乳類細胞はＣＯＳ−７細胞である。 他の態様において、該哺乳類細胞は２９３−ｒＹ５−１４と命名された２９３ ヒト胎児腎臓細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ 11757号）である。 この細胞（２９３−ｒＹ５−１４）は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承 認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９９４年１１月４日に、アメリカ 合衆国メリーランド州ロックビルパークローンドライブ12301(郵便番号20852)の アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＡＴ ＣＣ受付番号ＣＲＬ 11757号が付与された。 更なる態様において、当該哺乳類細胞は、Ｌ−ｈＹ５−７と命名された、プラ スミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５を含むマウス繊維芽（ｔｋ−）細胞（ＡＴＣＣ受付番 号ＣＲＬ−11995）である。他の態様において、当該哺乳類細胞は、Ｎ−ｈＹ５ −８と命名された、プラスミドｐｃＥＸＶ−ｈＹ５を含むマウス胎児ＮＩＨ−３ Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ−11994）である。これらの細胞は、特許手 続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、１９ ９５年１１月１５日に、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビルパークローン ドライブ12301（郵便番号20852）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（ＡＴＣＣ）に寄託され、夫々ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ-11995号およびＣＲ Ｌ-11994号が付与された。 本発明は、Ｙ５受容体をコードする核酸の配列内に含まれるユニークな配列と 特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５ヌクレオチドの核酸を含んだ核酸 プローブを提供する。一態様において、該核酸はＤＮＡである。 この製造された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの何れかである。ここで用いられ る「特異的にハイブリダイズする」の語は、それ自身の配列に対して相補的な核 酸配列を認識して、相補的な塩基対間の水素結合を介して二重螺旋セグメントを 形成する能力を意味する。 ヒトＹ５受容体をコードする核酸の配列と特異的にハイブリダイズできる少な くとも１５ヌクレオチドの核酸は、プローブとして用いることができる。核酸プ ローブ技術は当業者に周知であり、かかる当業者は、このようなプローブはその 長さが非常に大きく変化する可能性があり、また該プローブの検出を容易にする ために、放射性アイソトープまたは蛍光色素のような検出可能なラベルで標識さ れ得ることを容易に理解するであろう。ＤＮＡプローブは、当該技術で周知の方 法を用いて、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをプラスミド又はバクテリオファー ジのような適切なベクターに挿入し、続いてこれを適切なバクテリア宿主細胞に 形質転換し、形質転換されたバクテリア宿主細胞中で複製し、ＤＮＡプローブを 回収することによって製造すればよい。或いは、プローブはＤＮＡ剛性によって 化学的に作製すればよい。 ＲＮＡプローブは、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６のようなバクテリオファージの下 流に、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡを挿入することによって作製すればよい。 大量のＲＮＡプローブは、ラベルされたヌクレオチドを、上流プロモータを含む 線形化したフラグメントと共に、適切なＲＮＡポリメラーゼの存在下でインキュ ベートすることによって製造すればよい。 本発明はまた、Ｙ５受容体をコードする哺乳類核酸に対して相補的な核酸配列 と特異的にハイブリダイズすることができる、少なくとも15ヌクレオチドの核酸 を提供する。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの何れであってもよい。 本発明は、Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、 該ｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる配列を有するアンチセンスオリゴヌク レオチドを提供する。 本発明は、Ｙ５受容体のゲノムＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズできる 配列をもったアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。 本発明は、ヌクレオチドの化学的類縁体を含む、Ｙ５受容体のアンチセンスオ リゴヌクレオチドを提供する。 本発明は、Ｙ５受容体に向けられた抗体を提供する。また、本発明はヒトＹ５ 受容体に向けられた抗体を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体を発現する細胞の表面に存在するヒトＹ５受容体のエピ トープに向けられたモノクローナル抗体に関する。 本発明は、細胞膜を通過して細胞内のヒトＹ５受容体をコードするｍＲＮＡと 特異的に結合し、その翻訳を阻止することによってヒトＹ５受容体の活性を低下 させるのに有効な量のオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過できる薬学的に許容 可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。一態様において、このオ リゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを不活性化する物質に結合される。他の態様にお いて、ｍＲＮＡを不活性化する物質はリボザイムである。 本発明は、上記の薬学的組成物であって、細胞膜を通過できる前記薬学的に許 容され得るキャリアは選択された細胞タイプに特異的な受容体に結合し、これに より該選択された細胞タイプに取り込まれる構造を具備した薬学的組成物を提供 する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を低減するのに有効な量の拮抗剤と、薬学的 に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体活性を増大するのに有効な量の作動剤と、薬学的に許容 可能なキャリアとを含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は、上記の薬学的組成物であって、Ｙ５受容体へのリガンドの結合を阻 止するのに有効な量の抗体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する組成物 を提供する。 ここで用いる「薬学的に許容可能なキャリア」とは、何れかの標準的な薬学的 に許容され得ろキャリアを意味する。その例には、リン酸緩衝食塩水、生理的食 塩水、水、および油／水エマルジョンのようなエマルジョンが含まれるが、これ らに限定されるものではない。 本発明は、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡを発現する非ヒト遺伝子導入哺 乳動物を提供する。 本発明は、相同的組換えによる本来のＹ５受容体のノックアウトを含む、非ヒ ト遺伝子導入哺乳動物を提供する。 本発明は、非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、そのゲノムが、Ｙ５受容体を コードするｍＲＮＡに対して相補的で且つＹ５受容体をコードするｍＲＮＡとハ イブリダイズしてその翻訳を低減するようなアンチセンスｍＲＮＡ中に転写され るように配置された、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡに対して相補的なアン チセンスＤＮＡを含む非ヒト遺伝子導入哺乳動物を提供する。 本発明は、上記の非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、ヒトＹ５受容体をコー ドする前記ＤＮＡが更に誘導性プロモータを具備する非ヒト遺伝子導入哺乳動物 を提供する。 本発明は、非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、ヒトＹ５受容体をコードする 前記ＤＮＡが、更に組織特異的な調節要素を具備する非ヒト遺伝子導入哺乳動物 を提供する。 一態様において、前記非ヒト遺伝子導入哺乳動物はマウスである。 Ｙ５受容体の生理学的および行動上の役割を解明する動物モデル系は、種々の 技術によりＹ５受容体の活性が増大または減少され、或いは発現されたＹ５受容 体のアミノ酸配列が変わるような、遺伝子導入動物を創出することによって製造 される。これらの技術の例には、１）遺伝子導入動物を製造するために、Ｙ５受 容体をコードするＤＮＡの正常または変異種を、マイクロ注入、電気穿孔、レト ロウイルストランスフェクションまたは当業者に周知の他の手段によって適切な 受精胚の中に導入すること；および２）これら遺伝子の変異体または正常なヒト または動物種の、遺伝子導入動物の本来の遺伝子座との相同組換えにより、これ らＹ５受容体配列の発現の調節または構造を変化させることが含まれるが、これ に限定されるものではない。相同組換えの技術は当業者に周知である。この技術 は、本来の遺伝子を挿入された遺伝子で置き換えるものであり、従って、本来の Ｙ５受容体は発現できないが、例えば、組換えによって動物ゲノムの本来の受容 体を置換することにより挿入された突然変異Ｙ５受容体を発現させ、これにより そのトランスポータの過小発現をもたらす動物を製造するために有用である。マ イクロ注入はゲノムに遺伝子を追加するが、これを取り除かないから、それ自身 のものおよび追加されたＹ５受容体を発現死、Ｙ５受容体の過剰発現をもたらす ような動物を製造するために有用である。 例えばマウスを用いて、遺伝子導入動物を製造するために利用できる一つの手 段は次の通りである。即ち、雌のマウスを交配させ、得られた受精卵を輸卵管か ら切除する。この卵を、Ｍ２培地のような適切な培地中に保存する。導入遺伝子 の発現を調節するための実験的手段を与えるために、誘導性プロモータをＤＮＡ のコード化領域に融合させる。その代わりに或いはこれに加えて、組織特異的な 調節要素をコード化領域に融合して、導入遺伝子を組織特異的に発現させてもよ い。このＤＮＡを、適切な緩衝溶液中でマイクロ注入針（ピペット引き機を使用 して毛細管から作製すればよい）の中に採取し、注入されるべき卵を凹部スライ ドの中に置く。この針を上記卵の前核中に挿入し、ＤＮＡ溶液を注入する。次い で、こうして注入された卵は擬妊娠マウス（適切なホルモンによる刺激で妊娠を 維持するが実際には妊娠していないマウス）の卵管の中に移され、そこでは子宮 に進み、着床し、分娩日まで発生を続ける。上記のように、マイクロ注入は卵細 胞中にＤＮＡを挿入する唯一の方法ではなく、ここでは単に例示のみの目的で用 いられている。 本発明はまた、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決 定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクト されてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対して リガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特 異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リ ガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを 具備した方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがヒトＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決 定するための方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェ クトされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対 してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体 に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前 記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定すること とを具備した方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定す るための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ てこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガ ンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的 に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガン ドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備 し、このようなＹ５受容体は図６に示したアミノ酸配列と実質的に同じ配列を有 する方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定す るための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ てこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガ ンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的 に結合した何等がのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガン ドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するがどうかを決定することとを具備 し、このようなＹ５受容体は、図６に示したＹ５受容体の膜貫通領域のアミノ酸 配列に対して60％以上の相同性をもった、膜貫通領域のアミノ酸配列によって特 徴付けられる方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定す るための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ てこれを発現している細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から 膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、この ような受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと 、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと 、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどう かを決定することとを具備した方法を提供する。 上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体は、ヒトＹ５受容体、ラットＹ ５受容体、またはイヌＹ５受容体であり得る。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるがどうかを決定す るための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ てこれを発現している細胞細から胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から 膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、ヒト Ｙ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、 前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、 これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するがどうか を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定す るための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ てこれを発現している細胞から細胞抽出物を調整することと、該細胞抽出物から 膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、前記 Ｙ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、 前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、 これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうか を決定することとを具備し、このようなＹ５受容体は、図６に示したのと実質的 に同じアミノ酸配列を有する方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定す るための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ てこれを発現している細胞から細胞抽出物を調整することと、該細胞抽出物から 膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、前記 Ｙ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、 前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、 これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうか を決定することとを具備し、このようなＹ５受容体は、図６に示したＹ５受容体 の膜貫通領域のアミノ酸配列に対して60％以上の相同性をもった、膜貫通領域の アミノ酸配列によって特徴付けられる方法を提供する。 上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体はヒトＹ５受容体、ラットＹ５ 受容体、またはイヌＹ５受容体であり得る。上記方法の一態様において、前記リ ガンドは予め知られているものである。 本発明は更に、上記方法の何れか一つによって同定されたリガンドを提供する 。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるかどうかを決定する方法 であって、Ｙ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされてこれを発現し ている細胞と前記リガンドとを、機能的なＹ５受容体応答を活性化させる条件下 で接触させることと、Ｙ５受容体活性における機能増大を検出することと、これ によって前記リガンドがＹ５受容体作動剤であるがどうかを決定することとを具 備した方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるがどうかを決定する方法 であって、ヒトＹ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされてこれを発 現している細胞と前記リガンドとを、前記Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接 触させることと、Ｙ５受容体活性における増大を検出することと、これによって 前記リガンドがヒトＹ５受容体作動剤であるかどうかを決定することとを具備し た方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるかどうかを決定する方法 であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現 している細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクショ ンを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、前記Ｙ５受容体を 活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における増大を検出す ることと、これによって前記リガンドがＹ５受容体作動剤であるかどうかを決定 することとを具備した方法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法 であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現 している細胞と前記リガンドとを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容 体作動剤の存在下において、機能的なＹ５受容体応答を活性化させる条件下で接 触させることと、Ｙ５受容体活性における低下を検出することと、これによって 前記リガンドがＹ５受容体拮抗剤であるかどうかを決定することとを具備した方 法を提供する。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法 であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現 している細胞と前記リガンドとを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容 体作動剤の存在下において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接触させること と、Ｙ５受容体活性における低下を検出することと、これによって前記リガンド がＹ５受容体拮抗剤であるかどうかを決定することとを具備した方法を提供する 。 本発明は、或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法 であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現 している細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクショ ンを単離することと、該膜フラクションとと前記リガンドとを、ＰＹＹまたはＮ ＰＹのような公知のＹ５受容体作動剤の存在下において、Ｙ５受容体を活性化さ せる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における低下を検出することと 、これによって前記リガンドがＹ５受容体拮抗剤であるかどうかを決定すること とを具備した方法を提供する。 上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体はヒトＹ５受容体、ラットＹ５ 受容体またはイヌＹ５受容体である。 上記方法の一態様において、前記細胞は非神経起源である。更なる態様におい て、この非神経細胞はＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３ 細胞、またはＬＭ（ｔｋ−）細胞である。 上記方法の一つの態様において、前記リガンドは予め既知ではない。 本発明は、上記方法によって検出されるＹ５受容体作動剤を提供する。本発明 は、上記方法によって検出されるＹ５受容体拮抗剤を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、該Ｙ５受 容体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法で あって、(a)Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮ Ａを発現している細胞を、該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られる化合 物と接触させる工程と; (b)工程(a)の調製物と該Ｙ５受容体に特異的に結合する 事が知られていない複数の化合物とを、該Ｙ５受容体に結合することが知られて いる化合物の結合を許容する条件下で接触させる工程と;（c）Ｙ５受容体に結合 することが知られる化合物の結合が、前記複数の化合物の非存在下での当該化合 物の結合と比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを決 定する工程と; もしそうであれば、(d)前記複数の化合物中に含まれる夫々の化 合物のＹ５受容体に対する結合を別々に測定し、これによってヒトＹ５受容体と 特異的に結合する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、該Ｙ５受 容体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法で あって、(a)Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮ Ａを発現している細 胞から細胞抽出物を調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを単離し、該膜フ ラクションを前記Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られる化合物と接触さ せる工程と; (b)工程(a)の調製物と該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知ら れていない複数の化合物とを、該Ｙ５受容体に結合することが知られている化合 物の結合を許容する条件下で接触させる工程と; (c)Ｙ５受容体に結合すること が知られる化合物の結合が、前記複数の化合物の非存在下での当該化合物の結合 と比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを決定する工 程と; もしそうであれば、(d)前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物のＹ ５受容体に対する結合を別々に測定し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に 結合する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物 をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体を活性化する化合物を同定する方法であ って、(a)Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡ を発現している細胞を、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、該Ｙ５受容体に特 異的に結合することが知られていない複数の化合物と接触させる工程と; (b)前 記化合物の存在下で、前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを決定する工程 と; もしそうであれば、(c)前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物によっ て前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを別々に決定し、これによってヒト Ｙ５受容体を活性化する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物 をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体を活性化する化合物を同定する方法であ って、(a)Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡ を発現している細胞から細胞抽出物調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを 単離し、該膜フラクションを、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、該Ｙ５受容 体に特異的に結合することが知られていない複数の化合物と接触させる工程と; (b)前記化合物の存在下で、前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを決定す る工程と; もしそうであれば、(c)前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物 によって前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを別々に決定し、これによっ てヒトＹ５受容体を活性化する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供す る。 本発明は、Ｙ５受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的 化合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定 する方法であって、(a)Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ 且つ該ＤＮＡを発現している細胞を、公知のＹ５受容体拮抗剤の存在下において 、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、前記複数の化合物に接触させる工程と; (b)前記Ｙ５受容体の活性化が、前記複数の化合物の非存在下でのＹ５受容体の 活性化に比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを決定 する工程と; もしそうであれば、(c)前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合 物について、前記Ｙ５受容体の活性化の阻害を別々に決定し、これによってヒト Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定する工程とを具備する方法を提供す る。 本発明は、Ｙ５受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的 化合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定 する方法であって、(a)Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ 且つ該ＤＮＡを発現している細胞から細胞抽出物を調製し、該細胞抽出物から膜 フラクションを単離し、該膜フラクションを、公知のＹ５受容体拮抗剤の存在下 において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、前記複数の化合物に接触させる 工程と; (b)前記Ｙ５受容体の活性化が、前記複数の化合物の非存在下でのＹ５ 受容体の活性化に比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどう かを決定する工程と; もしそうであれば、(c)前記複数の化合物中に含まれる夫 々の化合物について、前記Ｙ５受容体の活性化の阻害を別々に決定し、これによ ってヒトＹ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定する工程とを具備する方法 を提供する。 上記方法の別の態様において、前記Ｙ５受容体は、ヒトＹ５受容体、ラットＹ ５受容体、またはイヌＹ５受容体である。一態様において、前記細胞は哺乳類細 胞である。更なる態様において、前記細胞は非神経起源である。更なる態様にお いて、前記細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎細胞、ＬＭ(tk−)細胞、 またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。 本発明は、薬物をスクリーニングして、細胞表面のＹ５受容体に対して特異的 に結合する薬物を同定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトラ ンスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、薬物を前記Ｙ ５受容体に結合させる条件下で接触させることと、前記トランスフェクトされた 細胞に特異的に結合した薬剤を 決定し、これによって前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合する薬物を同定する こととを具備した方法を提供する。 本発明は、薬物をスクリーニングして、細胞表面のヒトＹ５受容体に対して特 異的に結合する薬物を同定する方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮ Ａをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、薬物 が前記ヒトＹ５受容体に結合される条件下で接触させることと、前記トランスフ ェクトされた細胞に特異的に結合した薬剤を決定し、これによって前記ヒトＹ５ 受容体に対して特異的に結合する薬物を同定することとを具備した方法を提供す る。 本発明は、薬物をスクリーニングして、Ｙ５受容体の作動剤として作用する薬 物を同定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクト され且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、機能的Ｙ５受容体応答を活 性化させる条件下で接触させることと、細胞におけるこのような受容体を活性化 する薬物を決定し、これによってＹ５受容体の作動剤として作用する薬物を同定 することとを具備した方法を提供する。 本発明は、薬物をスクリーニングして、ヒトＹ５受容体の作動剤として作用す る薬物を同定する方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランス フェクトされ且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、機能的ヒトＹ５受 容体応答を活性化させる条件下で接触させることと、細胞におけるこのような受 容体を活性化する薬物を決定し、これによってヒトＹ５受容体の作動剤として作 用する薬物を同定することとを具備した方法を提供する。 本発明は、薬物をスクリーニングして、Ｙ５受容体の拮抗剤として作用する薬 物を同定する方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクト され且つこれを発現している細胞と複数の薬物とを、ＰＹＹまたはＮＰＹのよう な公知のＹ５受容体作動剤の存在下において、機能的Ｙ５受容体応答を活性化さ せる条件下で接触させることと、哺乳類細胞における前記受容体の活性化を阻害 する薬物を決定し、これによってＹ５受容体の拮抗剤として作用する薬物を同定 することとを具備した方法を提供する。本発明は、薬物をスクリーニングして、 ヒトＹ５受容体の拮抗剤として作用する薬物を同定する方法であって、ヒトＹ５ 受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つこれを発現している細胞 と複数の薬物とを、ＰＹＹまたはＮＰＹのような公知のＹ５受容体作 動剤の存在下において、機能的Ｙ５受容体応答を活性化させる条件下で接触させ ることと、哺乳類細胞における前記受容体の活性化を阻害する薬物を決定し、こ れによってヒトＹ５受容体の拮抗剤として作用する薬物を同定することとを具備 した方法を提供する。一態様において、前記細胞は非神経起源である。更なる態 様において、前記細胞は、ＣＯＳ−７細胞、２９３ヒト胎児腎細胞、ＬＭ(tk−) 細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である。 本発明は、上記方法によって同定された薬物と、薬学的に許容され得るキャリ アとを含有する薬学的組成物を提供する。 本発明は、Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡ存在を検出することによりＹ５受 容体の発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、こうし て得たｍＲＮＡをハイブリダイズ条件下で上記の核酸プローブと接触させる工程 と、これによって細胞によるＹ５受容体の発現を検出することとを具備した方法 を提供する。 本発明は、患者において、Ｙ５受容体の阻害によって緩和される異常を治療す る方法であって、患者に対し、該患者のＹ５受容体を阻害するのに有効な量の上 記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、患者において、Ｙ５受容体の活性化によって緩和される異常を治療 する方法であって、患者に対し、該患者のＹ５受容体を活性化するのに有効な量 の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、患者において、Ｙ５受容体の阻害によって緩和される異常を治療す る方法であって、患者に対し、有効量のＹ５受容体拮抗剤を投与することを具備 した方法を提供する。 本発明は、患者において、Ｙ５受容体の活性化によって緩和される異常を治療 する方法であって、患者に対し、有効量のＹ５受容体作動剤を投与することを具 備した方法を提供する。更なる態様において、前記異常な症状は食欲不振である 。別の態様において、前記異常な症状は性的／再生障害である。別の態様におい て、前記異常症状は抑鬱症である。他の態様において、前記異常症状は不安症で ある。 一態様において、前記異常症状は胃潰瘍である。更なる態様において、前記異 常症状は記憶喪失である。更なる態様において、前記異常症状は偏頭痛である。 更なる態様において、前記異常症状は疼痛である。更なる態様において、前記異 常症状は 癲癇性の発作である。更なる態様において、前記異常症状は高血圧である。更な る態様において、前記異常症状は脳出血である。更なる態様において、前記異常 症状はショックである。更なる態様において、前記異常症状は鬱血性心不全であ る。更なる態様において、前記異常症状は睡眠障害である。更なる態様において 、前記異常症状は鼻鬱血である。更なる態様において、前記異常症状は下痢であ る。 本発明は、患者における肥満を治療する方法であって、前記患者に対して、有 効量のＹ５受容体拮抗剤を投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、患者における食欲不振を治療する方法であって、前記患者に対して 、有効量のＹ５受容体作動剤を投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、患者における神経性過食症を治療する方法であって、前記患者に対 して、有効量のＹ５受容体拮抗剤を投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、患者が食事をするように誘導する方法であって、患者に対して、有 効量のＹ５受容体作動剤を投与することを具備した方法。一態様において、前記 患者は脊椎動物である。他の態様において、前記患者はヒトである。 本発明は、患者による食物の消費を増大させる方法であって、患者に対して、 食物および有効量のＹ５受容体作動剤の組成物を投与することを具備した方法。 一態様において、前記患者は脊椎動物である。他の態様において、前記患者はヒ トである。 本発明は、ヒトＹ５受容体の活性を低減することによって緩和される異常を治 療する方法であって、患者に対し、ヒトＹ５受容体の活性を低減し、これにより ヒトＹ５受容体の過剰活性からもたらされる異常を緩和するのに有効な量の上記 薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の過剰活性に関連した異常症状を治療する方法であ って、患者に対し、Ｙ５受容体へのリガンドの結合をブロックて前記異常症状を 緩和するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供 する。 本発明は、細胞表面のヒトＹ５受容体の存在を検出する方法であって、前記細 胞とヒトＹ５受容体に結合することができる抗体とを、該抗体の当該受容体への 結合を可能にする条件下で接触させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存 在を検出することと、これによって前記細胞表面におけるヒトＹ５受容体の存在 を検出することとを具備した方法。 本発明は、ヒトＹ５受容体の活性レベルを変化させることの生理学的効果を決 定する方法であって、ヒトＹ５受容体の発現を調節する誘導性プロモータの使用 によりヒトＹ５受容体活性のレベルが変化するような、非ヒト遺伝子導入哺乳動 物を製造することを具備した方法を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の活性レベルを変化させることの生理学的効果を決 定する方法であって、夫々が異なった量のヒトＹ５受容体を発現する複数の非ヒ ト遺伝子導入哺乳動物のパネルを製造することを具備した方法を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の過剰活性からもたらされる異常を緩和することが できる物質を同定する方法であって、或る物質を上記の非ヒト遺伝子導入動物に 投与することと、該物質が、ヒトＹ５受容体の過剰活性の結果として前記非ヒト 遺伝子導入動物の示す生理学的および挙動的な異常を緩和するかどうかを決定す ることとを具備した方法を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の過剰活性からもたらされる異常を治療する方法で あって、患者に対し、ヒトＹ５受容体の過剰活性の結果としてもたらされる異常 を緩和するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提 供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の過小活性からもたらされる異常を緩和することが できる物質を同定する方法であって、或る物質を上記の非ヒト遺伝子導入動物に 投与することと、該物質が、ヒトＹ５受容体の過小活性の結果として前記非ヒト 遺伝子導入動物が示す生理学的および挙動的な異常を緩和するかどうかを決定す ることとを具備した方法を提供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体の過小活性からもたらされる異常を治療する方法で あって、患者に対し、ヒトＹ５受容体の過小活性の結果としてもたらされる異常 を緩和するのに有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提 供する。 本発明は、ヒトＹ５受容体対立遺伝子の活性に関連した疾患に対する疾病素因 を診断するための方法であって、該方法は、a.該疾患に罹患している患者のＤＮ Ａを採取する工程と; b.制限酵素類のパネルを用いて、該ＤＮＡの制限消化をお こなう工程と; c.得られたＤＮＡ断片を、サイジングゲル上で電気泳動的に分離 する工程と; d.得られたゲルを、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡと特異的に ハイブリダイズでき且つ検出可能なマーカーで標識された核酸プローブと接触さ せる工程と; e.検出可能 なマーカーで標識されたヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡとハイブリダイズし た標識バンドを検出して、該疾患に罹患している患者のＤＮＡに特異的なユニー クなバンドを作製する工程と; f.工程a〜eによって、診断用に採取したＤＮＡを 調製する工程と; g.工程eで得られた前記疾患に罹患している患者のＤＮＡおよ び工程fで得られた診断用のＤＮＡに特異的なバンドパターンを比較して、両パ ターンが同一であるか異なるかを決定し、それによって、もしパターンが同一で あれば、当該疾患の疾病素因ありと診断する工程とを具備した方法を提供する。 一態様では、特異的なヒトＹ５受容体対立遺伝子の活性に関連した疾患が診断さ れる。 本発明は、単離されたＹ５受容体を調製する方法であって、a.細胞に対して前 記Ｙ５受容体の発現を誘導する工程と; b.得られた細胞から前記受容体を回収す る工程と; c.こうして回収された前記受容体を精製する工程とを具備する方法を 提供する。 本発明は、単離されたＹ５受容体を調製する方法であって、a.Ｙ５受容体をコ ードする核酸を、該Ｙ５受容体をコードする核酸に機能的にリンクした該核酸の 発現に必要な調節因子を有する適切なベクター中に挿入する工程と; b.得られた ベクターを適切なホスト細胞に挿入し、Ｙ５受容体を産生する細胞を取得する工 程と; c.得られた細胞によって産生された受容体を回収する工程と; d.こうして 回収された前記受容体を精製する工程とを具備する方法を提供する。 本発明は、下記の実験の詳細を参照することによって更に良く理解されるであ ろう。しかしながら、そこで議論されている特定の方法および結果は、後述の請 求の範囲に更に完全に記載されている本発明の単なる例示に過ぎないことを、当 業者は容易に承認するであろう。 〔実験の詳細〕 材料と方法ｃＤＮＡクローニング 総ＲＮＡは、グアニジンチオシアネート法（Ｋingston,1987）を修飾して、５ ｇのラット視床下部(ロックランド(Ｒockland)、ギルバーツビル(Ｇilbertsvill e)、ペンシルバニアリ州)から調製した。ポリＡ⁺ＲＮＡは、ファーストトラック （ＦastＴrack）キット（インビトロゲン社（Ｉnvitrogen,Ｉnc）、サンジエゴ 、カリホルニア州）で精製した。２本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡは、第２の鎖のｃＤＮ Ａ合成でリガーゼを省略した以外は、ＧublerとＨoffman法（ＧublerとＨoffman ,1983）に従って、７μｇのポリＡ⁺ＲＮＡから合成した。得られたＤＳ ｃＤＮ ＡをＢｓｔＥｘＩ／ＥｃｏＲＩアダプター(インビトロゲン社(Ｉnvitrogen,Ｉnc ))に連結し、過剰のアダプターをセファクリル（Ｓephacryl）５００ＨＲ（ファ ルマシア（Ｐharmacia）−ＬＫＢ）でクロマトグラフィーにより除去し、ｄｓ− ｃＤＮＡを、ジーンパック・ファックス（Ｇen-Ｐak Ｆax）ＨＰＬＣカラム（ミ リポア社（Ｍillipore Ｃorp.）、ミルフォード、マサチューセッツ州）でサイ ズ選択した。高分子量画分を、ＡruffoとＳeedの記載したように(ＡruffoとＳee d,1987)ＢｓｔｘＩで切断したｐＥＸＪ．ＢＳ（ｐｃＥＸＶ−３由来のｃＤＮＡ クローニング発現ベクター；ＯkayamaとＢerg,1983；ＭillerとＧermain，1986 ）中で連結した、連結したＤＮＡを、大腸菌（Ｅ.coli）ＭＣ１０６１Ｆ⁺（ジー ンパルサー（Ｇene Ｐulser）、バイオラッド（Ｂio-Ｒad））中で電気泳動した 。挿入体の平均サイズが２．７kbの全部で３．４×１０⁶個の独立のクローンが 作成された。ライブラリーを、６．９〜８．２×１０³個の独立のクローンのプ ールでシャーレ（アンピシリン選択）上に蒔いた。１８時間増幅後、各プールの 細菌を掻き取り、４mlのＬＢ培地に再懸濁し、プラスミド精製のために１．５ml をキアプレップ−８（ＱＩＡprep-8）プラスミドキット（キアゲン社（Ｑiagen Ｉnc）、チャツワース（Ｃhatsworth）、カリホルニア州）を用いて、プラスミ ド精製のために処理した。各細菌プールの１mlアリコートを、２０％グリセロー ル中で−８５℃で保存した。非定型ラット視床下部ＮＰＹ５受容体をコードするｃＤＮＡクローンの単離 約７０００個の独立したクローンのプールからのＤＮＡを、ＤＥＡＥ−デキス トラン法（ＷardenとＴhorne,1968）を修飾して、ＣＯＳ−７細胞中にトランス フェクションした。１０％胎児牛血清、１００単位/mlのペニシリン、１００μg /mlのストレプトマイシン、２mＭのＬ−グルタミンを補足したダルベッコー改変 イーグル培地（ＤＭＥＭ−Ｃ）中で、５％ＣＯ₂中で３７℃で増殖させた。トラ ンスフェクションの１日前に、３０，０００細胞／cm²の密度で、ラボ−テック （Ｌab-Ｔek）チャンバースライド（１チャンバー、ヌンク社（Ｎunc Ｉnc.）、 ナパービル（Ｎaperville）、イリノイ州のパーマノックス（Ｐermanox）スライ ド）上に接種した。翌日、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ無 血清培地(ギブコ（登録商標）ビーアールエル・ライフテクノロジーズ社（Ｇibc o ＢＲＬ Ｌife Ｔechnologies Ｉnc.）、グランドアイランド（Ｇrand Ｉsland ）、ニューヨーク州)中の各プールからのＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストラン(５０ ０μg/ml)の１／１０を含有するトランスフェクションカクテル７３５μlを加え た。３７℃で３０分インキュベーション後、３mlのクロロキン（ＤＭＥＭ−Ｃ中 ８０μＭ）を加え、細胞を３７℃でさらに２．５時間インキュベートした。各チ ャンバーから培地を吸引し、各チャンバーを２mlのＰＢＳで１回洗浄し、細胞を ＤＭＥＭ−Ｃ中で４８時間インキュベートし、スライド上で結合測定法を行なっ た。ＰＢＳで１回洗浄後、細胞を、２０mＭのヘペス−ＮａＯＨ（ｐＨ７．４） 、ＣａＣｌ₂ １．２６mＭ、ＭｇＳＯ４ ０．８１mＭ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．４４mＭ 、ＫＣＬ ５．４、ＮａＣｌ １０mＭ、０．１％ＢＳＡ、０．１％バシトラシ ン（bacitracin）中の１nＭ（３×１０⁵cpm／スライド）のブタ［¹²⁵Ｉ］−ＰＹ Ｙ（ＮＥＮ；ＳＡ＝２２００Ｃi/ミリモル）と、室温で１時間インキュベートし て陽性プールを同定した。リガンドを含まない結合緩衝液中で６回洗浄後（各回 ３秒間）単層をＰＢＳ中２．５％のグルタルアルデヒドで固定し、エタノール浴 （７０、８０、９５、１００％）中で各２分間脱水し、空気乾燥した。次にスラ イドを、４２℃で１００％の写真乳剤（コダックＮＴＢ２型）に浸し、ドリエラ イト（dnerite）を含有する遮光箱中で、４℃で４８時間感光させた。スライド をコダックＤ１９展開液（３２g/l水）中で３分間現像し、水で洗浄し、コダッ ク固定液中で５分間固定し、水で洗浄し、空気乾燥し、アクア−マウント（ラー ナー・ ラボラトリーズ（Ｌerner Ｌaboratories）、ピッツバーグ、ペンシルバニア州 ）でマウントした。スライドを２５×の全倍率でスクリーニングした。既に記載 されているように（マコーミック（ＭcＣormick）、1987）ＳＴＢ選択により、 １つのクローン（ＣＧ−１８）を単離した。製造業者の方法に従ってシーケナー ゼ（Ｓequenase）キット（ユーエスバイオケミカル（ＵＳ Ｂiochemical）、ク リーブランド、オハイオ）州で、ＤＳ−ＤＮＡの配列を決定した。ＧＣＧプログ ラム（ジェネティックスコンピューターグループ（Ｇenetics Ｃompute group） 、マジソン、ウィスコンシン州）を用いて、ヌクレオチドとペプチド配列解析を 行なった。ヒトＹ５同族体の単離 ＴＭ３（センスプライマー；図１Ａ中の４８４〜５０９位）およびＴＭ６（ア ンチセンスプライマー；図３Ａ中の１２１９〜１２４３位）中のラットのオリゴ ヌクレオチドプライマーを用いて、本出願人は、ポリメラーゼチェイン反応によ りヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。約５０００の独立した クローンを含有する４５０の増幅したプール（全部で２．２×１０⁶）の各１μ ｌ（４×１０⁶個の細菌）を、直接４０サイクルのＰＣＲにかけ、得られた生成 物をアガロースゲル電気泳動で解析した。３つの陽性プールのうちの１つをさら に解析し、同胞選択（sib selection）により、単一のｃＤＮＡクローンを単離 し性状解析した。このｃＤＮＡは、全長であることが判明し、発現のために正し い配向にあった。製造業者の方法に従ってシーケナーゼ（Ｓequenase）キット（ ユーエスバイオケミカル（ＵＳ Ｂiochemical）、クリーブランド、オハイオ州 ）で、ＤＳ−ＤＮＡの配列を決定した。イヌＹ５同族体の単離 一対のＰＣＲプライマーを合成するのに、ラットとヒトのＹ５受容体のコード ヌクレオチド配列を使用した。ラットとヒトで１００％保存されているＴｍ III の上流の領域を、前進プライマーＣＨ１５６を合成するのに選択した： ５’−ＴＧＧＡＴＣＡＧＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧ−３’（配列番号： ７）。 ＴＭ６のすぐ上流の５−６ループのカルボキシ末端の領域（これもラットとヒ トの配列で１００％保存されている）を、逆プライマーＣＨ１５３を合成するの に選択した： ５’−ＧＴＣＴＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＴＴ−３’（配 列番号：８）。 ＳＳＩＩ逆転写酵素（ギブコ・ビーアールエル（Ｇibco ＢＲＬ）、ゲイサー ズバーグ（Ｇaithersburg）、メリーランド州）を用いて逆転写したラット脳の ポリ（Ａ＋）ＲＮＡの１０ngを増幅するのに、プライマーＣＨ１５６−ＣＨ１５ ３を使用した。Ｔａｑポリメラーゼ（パーキン・エルマー−ロッシュモレキュラ ーシステムズ（Ｐerkin-Ｅlmer-Ｒoche Ｍolecular Ｓystems）、ブランチバー グ（Ｂranchburg）、ニュージャージー州）を用いて、１本鎖ｃＤＮＡについて 以下の条件でＰＣＲを行なった：９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分を ４０サイクル。得られた７９８塩基対のＰＣＲ ＤＮＡ断片を、ｐＣＲスクリプ ト（pＣＲ Ｓcript）（ストラタジーン（Ｓtratagene）、ラホイア（Ｌa Ｊolla ）、カリホルニア州）中でサブクローニングし、シーケナーゼ（Ｓequenase）キ ット（ユーエスバイオケミカル（ＵＳ Ｂiochemical）、クリーブランド、オハ イオ州）で配列を決定し、Ｙ５−ｂｄ−５と名付けた。３’と５’ＲＡＣＥ ビーグル犬Ｙ５受容体配列の欠失している３’末端と５’末端を、マラソン（ Ｍarathon）ｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック（Ｃlontech）、パロアルト（Ｐ alo Ａlto）、カリホルニア州）を用いて、３’と５’ＲＡＣＥにより単離した 。上記のビーグル犬ＰＣＲ ＤＮＡ断片の配列から、以下のＰＣＲプライマーを 合成した: （３’ＲＡＣＥ） ＣＨ２０４： ５'−ＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＴＧＧ−３'(配列番号： ９)； ＣＨ２１８（重なり（nested）プライマー）： ５'−ＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴＡＴＧＴＧＴＴＧ−３'(配列番号： １０)； （５’ＲＡＣＥ） ＣＨ２１９： ５’−ＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＡＣＡＧ−３’（配 列番号：１１）； ＣＨ２４５（重なりプライマー）： ５’−ＴＴＣＴＴＧＡＧＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＡＧＧＡＧＧ−３’(配列番号 ：１２)； 前述のプライマーを用いて、キット説明書に従って、ビーグル犬の視床ｃＤＮ Ａについて、３’と５’ＲＡＣＥ反応を行なった。得られたＰＣＲ ＤＮＡ（０ ．７〜１０kbの塗末）をアガロースゲルから精製し、前述の重なりプライマーを 用いて再度増幅した。得られたＤＮＡバンドをアガロースゲルから再度精製し、 ｐＣＲスクリプト（pＣＲ Ｓcript）（ストラタジーン（Ｓtratagene）、ラホイ ア（Ｌa Ｊolla）、カリホルニア州）中でサブクローニングした。 ｃＤＮＡの３’末端に対応するヌクレオチド配列を決定し、プラスミドをＹ５ −ｂｄ−８と名付けた。近い将来５’末端に対応するヌクレオチド配列が決定さ れるであろう。次にこれらのヌクレオチド配列を用いて、開始コドンおよび停止 コドン領域に対する正確なプライマーを合成し、次にこれらの正確なプライマー を用いてイヌの視床ｃＤＮＡが増幅されて、エキスパンドハイフィデリティ（Ｅ xpand Ｈigh Ｆidelity）ポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム（Ｂoehring er-Ｍannheim）、インディアナポリス、インディアナ州）を用いて、イヌＹ５受 容体の全長コード配列に対応するＰＣＲ産物が作成されるであろう。得られたＰ ＣＲ ＤＮＡは、発現ベクターｐＥＸＪにサブクローニングされて、シーケナー ゼ(Ｓequenase)キット（ユーエスバイオケミカル(ＵＳ Ｂiochemical)、クリー ブランド、オハイオ州）を用いて、イヌＹ５ヌクレオチド配列の全コード配列が 決定されるであろう。ノーザンブロット 製造業者の説明書に従って高厳密性条件下で、種々のヒト脳領域から精製した ｍＲＮＡを有するヒト脳の複数の組織ノーザンブロット(ＭＴＮブロットIIとIII 、クロンテック（Ｃlontech）、パロアルト（Ｐalo Ａlto）、カリホルニア州) をハイ ブリダイズさせた。プローブは、ヒトＹ５受容体サブタイプのコード領域中の５ −６ループのＴＭ III−カルボキシ末端に対応する０．８kbのＤＮＡ ＰＣＲ断 片であった。 製造業者の説明書に従って高厳密性条件下で、種々のラット組織から精製した ｍＲＮＡを有するラットの複数の組織ノーザンブロット(ラットＭＴＮブロット 、クロンテック（Ｃlontech）、パロアルト（Ｐalo Ａlto）、カリホルニア州) をハイブリダイズさせた。プローブは、ラットＹ５受容体サブタイプのコード領 域中の５−６ループのＴＭ III−カルボキシ末端に対応する０．８kbのＤＮＡ ＰＣＲ断片であった。サザンブロット ５つの異なる酵素（１レーンにつき８μｇのＤＮＡ）で切断したヒトまたはラ ットのゲノムＤＮＡを含有するサザンブロット（ゲノ−ブロット（Ｇeno-Ｂlot ）、クロンテック（Ｃlontech）、パロアルト（Ｐalo Ａlto）、カリホルニア州 ）を、製造業者の説明書に従って高厳密性条件下で、ハイブリダイズさせた。プ ローブは、ヒトおよびラットＹ５受容体サブタイプのコード領域中の５−６ルー プのＴＭ III-カルボキシ末端に対応する０．８kbのＤＮＡ ＰＣＲ断片であっ た。組換えバキュロウイルスの産生 ｈＹ５の初めの約１００塩基対（すなわち、開始メチオニンから内部ＥｃｏＲ Ｉ部位まで）を、５’ＢａｍＨＩ部位と３’ＥｃｏＲＩ部位を含有する２つの重 複する合成したオリゴヌクレオチド（各、約１００塩基対）で置換して、ヒトＹ ５の開始メチオニンのすぐ５’のＢａｍＨＩ部位を、遺伝的に作成した。これに より、ｈＹ５のコード領域を含有する約１．５kbのＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ III断 片が単離された。この断片を、ポリリンカーに存在するｐＢｌｕｅＢａｃ III（ 登録商標）中のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ III部位にサブクローニングした（ｐＢＢ ／ｈＹ５と呼ぶ作製体）。バキュロウイルスを作成するために、０．５μｇのウ イルスＤＮＡ（バキュロゴールド（Ｂaculogold）（登録商標））と３μｇのｐ ＢＢ／ｈＹ５を、ファルミンゲン（Ｐharmingen）（「バキュロウイルス発現ベ クター系：操作と方法マニュアル」（"Ｂaculovirus Ｅxpression Ｖector Ｓys tem:Ｐrocedures and Ｍethods Ｍanual"）中）に要約されているように、リン 酸カル シウム共沈殿法により２×１０⁶のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓpodoptera f rugiperda）昆虫Ｓｆ９細胞中に同時トランスフェクションした。細胞を２７℃ で５日間インキュベートした。同時トランスフェクションプレートの上清を遠心 分離して集め、組換えウイルス（ｈＹ５ＢＢ３）をプラーク精製した。ウイルス で感染させる方法、ウイルスのストックを調製する方法、およびウイルスストッ クを力価測定する方法は、ファルミンゲン（Ｐharmingen）のマニュアルに記載 のように行なった。細胞培養 ＣＯＳ−７細胞を、補足Ｄ−ＭＥＭ（１０％胎児牛血清、４mＭグルタミン、 １００単位/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシンを含有するダ ルベッコー改変イーグル培地）中でプレート上で、５％ＣＯ₂で３７℃で増殖さ せた。ＣＯＳ−７細胞のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１ ：６に分けた。ヒト胚腎２９３細胞を、ハンクス塩と補足物を有する補足Ｄ−Ｍ ＥＭ（最小基本培地）（１０％胎児牛血清、４mＭグルタミン、１００単位/mlの ペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシンを含有するダルベッコー改変イ ーグル培地）中でプレート上で、５％ＣＯ₂で３７℃で増殖させた。２９３細胞 のストックプレートをトリプシン処理し、３〜４日毎に１：６に分けた。マウス 繊維芽細胞ＬＭ（ｔｋ−）細胞を、補足Ｄ−ＭＥＭ（１０％胎児牛血清、４mＭ グルタミン、１００単位/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプトマイシン を含有するダルベッコー改変イーグル培地）中で１５０mmプレート上で、５％Ｃ Ｏ₂で３７℃で増殖させた。ＬＭ（ｔｋ−）細胞のストックプレートをトリプシ ン処理し、３〜４日毎に１：１０に分けた。 ヒトＹ５受容体で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞を、粘 着性単層から生育能を有する懸濁液に日常的に変換した。コンフルエンスの時点 で、粘着性細胞をトリプシンで集め、完全ＤＭＥＭの最小量に再懸濁して細胞数 を数え、懸濁培地（１０％子牛血清、１０％１０×培地１９９（ギブコ(Ｇibco) ）、９mＭ ＮａＨＣＯ₂、２５mＭグルコース、２mＭ Ｌ−グルタミン、１００ 単位/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシン、および０．０５％メチ ルセルロース）中に１０⁶細胞/mlの濃度でさらに希釈した。細胞懸濁液を浸透 培養器中で３７℃で５％ＣＯ₂中で２４時間維持した。こうして増殖させた細胞 から集めた膜は、大きな均一のバッチで液体窒素中で保存できる。あるいは、細 胞を、ポリ−Ｄ−リジン（０．０１mg/ml）でコーティングした９６ウェルマイ クロタイタープレート中に分散させて、次に３７℃で５％ＣＯ₂中で２４時間イ ンキュベートして、完全ＤＭＥＭ中の粘着性細胞培養物にもどすことができる。 こうして調製した細胞は、後述するｃＡＭＰのラジオイムノアッセイで確実な信 頼できるＮＰＹ−依存性応答を与えた。 マウス胚繊維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、補足物（１０％胎児牛血清、４m ＭのＬ−グルタミン、１００単位/mlのペニシリン、１００μg/mlのストレプト マイシン）を有するダルベッコー改変イーグル培地中で、１５０mmプレートで増 殖させた、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞のストックプレートをトリプシン化し、３〜４日 毎に１：１５に分けた。 Ｓｆ９とＳｆ２１細胞を、１０％胎児牛血清を補足したＴＭＮ−ＦＨ培地中で １５０mm組織培養プレートで単層で２７℃でＣＯ₂無しで増殖させた。ハイファ イブ(Ｈigh Ｆive)昆虫細胞を、Ｌ−グルタミンを補足したＥｘ−Ｃｅｌｌ ４ ００(登録商標)培地中で１５０mm組織培養プレートで単層で２７℃でＣＯ₂無し で増殖させた。一過性トランスフェクション 試験したすべての受容体サブタイプ（ヒトおよびラットＹ１、ヒトおよびラッ トＹ２、ヒトおよびラットＹ４、ヒトおよびラットＹ５）を、１μｇ ＤＮＡ／ １０⁶細胞（Ｃullen，1987）を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ −７細胞中に一過性トランスフェクションを行なった。ヒトＹ１受容体は、既知 の方法を用いて調製した（Ｌarhammarら、1992）。安定なトランスフェクション ヒトＹ１、ヒトＹ２、およびラットＹ５受容体を、Ｇ−４１８耐性遺伝子とと もに、ヒト胚腎２９３細胞株中に、リン酸カルシウム法（Ｃullen，1987）によ り同時トランスフェクションを行なった。安定にトランスフェクションされた細 胞を、Ｇ−４１８で選択した。ヒトＹ４およびヒトＹ５受容体を同様にマウス繊 維芽細胞ＬＭ（ｔｋ−）細胞とＮＩＨ−３Ｔ３細胞中にトランスフェクションし た。他のＧタンパク質結合受容体の発現 α₁ヒトアドレナリン作用性受容体：ヒトα₁受容体への化合物の結合を測定す るために、α_1a、α_1b、およびα_1d受容体をコードする遺伝子で安定にトランス フェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞株を使用した。α₁受容体の命名法は最近 変更され、以前α_1aと呼ばれていた受容体は現在α_1dと呼ばれ、以前α_1cと呼ば れていた受容体は現在α_1aと呼ばれる（参考文献）。これらの受容体を発現する 細胞株は、命名法が変わる前にＡＴＣＣに寄託されているため、これらの受容体 に以前採用されていたサブタイプ名を反映している。すなわち、本明細書でα_1a 受容体として表現される受容体を発現する細胞株は、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １１１４０でＬ−α_1cして、１９９２年９月２５日にＡＴＣＣに寄託された。本 明細書でα_1d受容体として表現される受容体を発現する細胞株は、ＡＴＣＣ受託 番号ＣＲＬ １１１３８でＬ−α_1Aとして、１９９２年９月２５日にＡＴＣＣに 寄託された。α_1b受容体を発現する細胞株は、Ｌ−α_1Bと命名され、ＡＴＣＣ受 託番号ＣＲＬ １１１３９で１９９２年９月２５日に寄託された。 α₂ヒトアドレナリン作用性受容体：ヒトα₂受容体への化合物の結合を測定す るために、α_2A、α_2B、およびα_2C受容体をコードする遺伝子で安定にトランス フェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞株を使用した。α_2A受容体を発現する細胞 株は、Ｌ−α_2Aと命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １１１８０で１９９２年 １１月６日に寄託された。α_2B受容体を発現する細胞株は、Ｌ−ＮＧＣ−α_2Bと 命名され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １０２７５で１９８９年１０月２５日に寄 託された。α_2C受容体を発現する細胞株は、Ｌ−α_2Cと命名され、ＡＴＣＣ受託 番号ＣＲＬ １１１８１で１９９２年１１月６日に寄託された。後述（膜懸濁物 への放射性リガンド結合を参照）するように細胞溶解物を調製し、２５mＭグリ シルグリシン緩衝液（室温でｐＨ７．６）に懸濁した。［³Ｈ］ラウオルスシン （rauwolscine）（０．５nＭ）を用いて、平衡競合結合測定法を行い、１０μＭ フェントラミン（phentolamlne）とともにインキュベートして非特異結合を測 定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィル ターでろ過して分離した。 ヒトヒスタミンＨ₁受容体：ウシＨ₁受容体と相同的なヒトヒスタミンＨ₁受 容体のコード配列を、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーから得て、真核生物発現ベ クターｐＣＥＸＶ−３中にクローン化した。Ｈ₁受容体のプラスミドＤＮＡをｐ ｃＥＸＶ−Ｈ１と命名し、ＡＴＣＣ受託番号７５３４６で１９９２年１１月６日 に寄託した。この作製体を、ＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ−７細胞に トランスフェクションした。７２時間後細胞を集め、５mＭトリス−塩酸、５mＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処理して溶解した。細胞溶解物を４℃で１ ０００rpmで５分間遠心分離して、上清を４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心 分離した。ペレットを、３７．８mＭ ＮａＨＰＯ₄、１２．２mＭ ＫＨ₂ＰＯ₄ （ｐＨ７．５）に懸濁した。ヒスタミンＨ₁アンタゴニストの［³Ｈ］メピラミン （mepyramin）（１nＭ、比活性：２４．８ Ｃi/mＭ）の結合は、最終容量０．２ ５mlで行い、室温で６０分間インキュベートした。１０μＭ メピラミンの存在 下で非特異結合を測定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスターを用 いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した。 ヒトヒスタミンＨ₂受容体：ヒトＨ₂受容体のコード配列を、ヒト胎盤ゲノムラ イブラリーから得て、真核生物発現ベクターＰＣＥＸＶ−３中にクローン化した 。Ｈ₂受容体のプラスミドＤＮＡをｐｃＥＸＶ−Ｈ２と命名し、ＡＴＣＣ受託番 号７５３４５で１９９２年１１月６日に寄託した。この作製体を、ＤＥＡＥ−デ キストラン法によりＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションした。７２時間後細 胞を集め、５mＭ トリス−塩酸、５mＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処 理して溶解した。細胞溶解物を４℃で１０００rpmで５分間遠心分離して、上清 を４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心分離した。ペレットを、３７．８mＭ ＮａＨＰＯ₄、１２．２mＭ Ｋ２ＰＯ₄（ｐＨ７．５）に懸濁した。ヒスタミン Ｈ₂アンタゴニストの［³Ｈ］チオチジン(tiotidine）（５nＭ、比活性：７０ Ｃ i/mＭ）の結合は、最終容量０．２５mlで行い、室温で６０分間インキュベート した。１０μＭ ヒスタミンの存在下で非特異結合を測定した。結合した放射性 リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した 。 ヒトセロトニン受容体： ５ＨＴ_{1D α}、５ＨＴ_{1D β}、５ＨＴ_1E、５ＨＴ_1F受容体：これらの５ＨＴ受容体サ ブ タイプのそれぞれをコードする遺伝子で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ ｔｋ−）クローン性細胞株を、前述のように調製した。Ｌｔｋ−８−３０−８４ と命名した５ＨＴ_{1D α}受容体の細胞株を、１９９０年４月１７日に寄託し、ＡＴ ＣＣ受託番号ＣＲＬ １０４２１を与えられた。Ｌｔｋ−１１と命名した５ＨＴ_{1D β} 受容体の細胞株を、１９９０年４月１７日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲ Ｌ １０４２２を与えられた。５ＨＴ_1E−７と命名した５ＨＴ_1E受容体の細胞株 を、１９９１年１１月６日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １０９１３を与 えられた。Ｌ−５−ＨＴ_1Fと命名した５ＨＴ_1Fの細胞株を、１９９１年１２月２ ７日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ１０９５７を与えられた。これらの受 容体を含有する膜調製物を前記したように調製し、１０mＭ ＭｇＣｌ₂、０．２ mＭ ＥＤＴＡ、１０μＭ パルギリン（pargyline）、および０．１％アスコル ビン酸塩を含有する５０mＭ トリス−塩酸緩衝液（３７℃でｐＨ７．４）に懸濁 した、化合物の結合は、５nＭ［³Ｈ］セロトニンの存在下で３７℃で３０分間イ ンキュベートして競合結合測定を行なって測定した。非特異結合は、１０μＭ セロトニンの存在下で測定した。結合した放射性リガンドを、細胞ハーベスター を用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した。 ヒトヒスタミン５ＨＴ₂受容体：ヒト５ＨＴ₂受容体のコード配列を、ヒト脳皮 質ｃＤＮＡライブラリーから得て、ｐＣＥＸＶ−３真核生物発現ベクター中にク ローン化した。ＤＥＡＥ−デキストラン法により、この作製体をＣＯＳ−７細胞 中にトランスフェクションした。７２時間後細胞を集め、５mＭ トリス−塩酸、 ５mＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処理して溶解した。この細胞株は、 Ｌ−ＮＧＣ−５ＨＴ₂と命名して、１９８９年１０月３１日にＡＴＣＣに寄託し 、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １０２８７を与えられた。細胞溶解物を４℃で１０ ００rpmで５分間遠心分離して、上清を４℃で３０，０００ｇで２０分間遠心分 離した。ペレットを、１０mＭ ＭｇＳＯ₄、０．５mＭ ＥＤＴＡ、および０． １％アスコルビン酸塩を含有する５０mＭ トリス−塩酸緩衝液(３７℃でｐＨ７ ．７)に懸濁した。５ＨＴ₂受容体でのアルファ−１アンタゴニストの力価を、［ ３Ｈ］ケタンセリン（１nＭ）を用いる平衡競合結合測定法で測定した。１０μ Ｍ ミアンセリン（mianserin）を添加して非特異結合を規定した。結合した放射 性 リガンドを、細胞ハーベスターを用いてＧＦ／Ｂフィルターでろ過して分離した 。 ヒト５−ＨＴ₇受容体：５ＨＴ₇受容体サブタイプをコードする遺伝子で安定に トランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）クローン性細胞株を、前述のように調 製した。Ｌ−５ＨＴ_4Bと命名した５ＨＴ₇受容体の細胞株を、１９９２年１０月 ２０日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ １１１６６を与えられた。 ヒトドパミンＤ₃受容体：ヒトＤ３受容体への化合物の結合は、ヒトＤ₃受容体 をコードする遺伝子でトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞からの膜調製物 を用いて測定した。ヒトドパミンＤ₃受容体は、公知の方法（Ｓokoloff,Ｐ.ら、 Ｎature,347,146,1990、ＥＭＢＬジーンバンク（Ｇenbank）にＸ５３９４４とし て寄託された）に従って調製した。７２時間後細胞を集め、５mＭ トリス−塩酸 、５mＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中で超音波処理して溶解した。細胞溶解物を ４℃で１０００rpmで５分間遠心分離して、上清を４℃で３０，０００ｇで２０ 分間遠心分離した。ペレットを、１mＭ ＥＤＴＡ、５mＭ ＫＣｌ、１．５mＭ ＣａＣｌ₂、４mＭ ＭｇＣｌ₂、および０．１％アスコルビン酸塩を含有する ５０mＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）に懸濁した。細胞溶解物を、１０μＭ（＋ ）ブタノールを用いて［³Ｈ］スピペロン(spiperone）（２nＭ）とともにインキ ュベートして、非特異結合を求めた。膜採集物 一過性トランスフェクションの４８時間後、ＣＯＳ−７細胞から膜を採集した 。粘着性細胞を、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（１３８mＭ ＮａＣｌ、８ ．１mＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、２．５mＭ ＫＣｌ、１．２mＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．９m Ｍ ＣａＣｌ₂、０．５mＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、氷冷した 超音波緩衝液（２０ｍＭ トリス−塩酸、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．７）で超 音波処理して溶解した。大きい粒子と破片を低速度遠心分離（２００×ｇ、５分 間、４℃）して除去した。遠心分離（３２，０００×ｇ、１８分間、４℃）して 上清画分から膜を集め、氷冷した低張緩衝液で洗浄し、再び遠心分離（３２，０ ００×ｇ、１８分間、４℃）して集めた。最終の膜ペレットを超音波処理して、 少量の氷冷結合緩衝液（プレート５枚毎に約１ml：１０mＭ ＮａＣｌ、２０mＭ ヘペス、０．２２mＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、１．２６mＭ ＣａＣｌ₂、０．８ １mＭ ＭｇＳＯ₄、ｐＨ７．４）に再懸濁した。バイオラッド（Ｂio-Ｒad）試 薬を用いてウシ血清アルブミンを標準物質として、ブラッドフォード(Ｂradford )法（Ｂradford，1976）によりタンパク質濃度を測定した。膜を１時間まで氷の 上に置き、新鮮なまま使用するか、または瞬間凍結して液体窒素中で保存した。 ２９３細胞、ＬＭ（ｔｋ−）細胞、およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞から同様に膜を 調製した。バキュロウイルス感染細胞から膜を調製し、１５０mm組織培養プレー ト中で２×１０⁷のＳｆ２１細胞を増殖させ、ｈＹ５ＢＢ３の高力価ストックで 感染させた。細胞を２７℃でＣＯ₂無しで２〜４日間インキュベートした後、細 胞を集め、膜調製を前記したように行なった。 切り出したラットの視床下部から、同様に膜を調製した。凍結視床下部を、ビ ルチシア（Ｖirtishear）ホモジナイザー（ビルティス（Ｖritis）、ガーディナ ー（Ｇardiner）、ニューヨーク州）の細いプローブで１０００rpmで氷冷した超 音波処理緩衝液中で２０秒間ホモジネートした。大きい粒子と破片を、遠心分離 （２００×ｇ、５分間、４℃）で除去し、上清画分を氷上に保存した。ホモジネ ートと遠心分離操作をさらに２回繰り返して、ペレットから膜をさらに抽出した 。上清画分をプールし、高速遠心分離（１００，０００×ｇ、２０分間、４℃） を行なった。最終の膜ペレットを、静かにホモジネートして少量の氷冷結合緩衝 液（湿潤組織１ｇ当たり１ml）に再懸濁し、１時間まで氷の上に置き、新鮮なま ま使用するが、または瞬間凍結して液体窒素中で保存した。膜懸濁物への放射性リガンド結合 膜懸濁物を、０．１％ウシ血清アルブミンを補足した結合緩衝液に希釈して、 最適の膜タンパク質濃度を得て、その結果、測定で膜が結合した¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_{2 -36} (または、¹²⁵Ｉ−ＮＰＹ、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3ー36、または¹²⁵Ｉ−[Ｌｅｕ³¹Ｐｒ ｏ³⁴]ＰＹＹのような別の放射性リガンド)は、試料に供給した¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ（ または、別の放射性リガンド）の１０％未満であった（競合結合測定法で１００ ，０００dpm/試料＝０．０８nＭ））。¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ（または、別の放射性リガ ンド）およびペプチド競合物質も、補足した結合緩衝液で所望の濃度に希釈した 。次に、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ（または、別の放射性リガンド）、競合ペプチドまたは 補足した結合緩衝液（２５μl）、そして最後に膜懸濁物（２００μl）を混合し て、各試料を９６ウェルマイクロタイタープレート中に調製した。試料を、３０ ℃水浴中で撹拌しながら１２０分間インキュベートした。ワットマンＧＦ／Ｃフ ィルター（１％ポリエチレンイミンでプレコーティングし、使用前に空気乾燥し た）でろ過してインキュベーションを停止させ、５mlの氷冷結合緩衝液で洗浄し た。フィルターに捕捉された膜に、マルチレックスソリッドシンチラント（Ｍul tiＬex solid scintillant）（ワラック（Ｗallac）、ツルク（Ｔurku）、フィ ンランド）を含浸させ、ワラックベータプレートリーダー(Ｗallac Ｂeta-Ｐlat e Ｒeader）中で¹²⁵Ｉについて計測した。Ｙ４サブタイプ以外のすべての受容体 について、非特異結合は３００nＭのヒトＮＰＹにより規定した；ヒトＹ４につ いては１００nＭのヒトＰＰを使用し、ラットＹ４については１００nＭのラット ＰＰを使用した。経時変化および競合試験の非特異結合は典型的には８０％であ り、ほとんどの非特異結合は、フィルターに結合していた。結合データは、グラ フパッドプリズム（ＧranphＰad Ｐrism）パッケージ（サンジエゴ、カリホルニ ア州）中の非線形回帰統計法を用いて解析した。機能性測定法：ｃＡＭＰのラジオイムノアッセイ 安定にトランスフェクションされた細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレ ートに接種し、コンフルエンスになるまで培養した。受容体の脱感作の可能性を 低下させるために、測定の前に４〜１６時間、培地の血清成分を１．５％に低下 させた。細胞をハンクス緩衝化食塩水、または０．１％ウシ血清アルブミン＋５ mＭテオフィリンを補足したＨＢＳ（１５０mＭ ＮａＣｌ、２０mＭヘペス、１m Ｍ ＣａＣｌ₂、５mＭ ＫＣｌ、１mＭ ＭｇＣｌ₂、１０mＭグルコース）で洗 浄し、同じ溶液中で５％ＣＯ₂中で３７℃で２０分間あらかじめ平衡化させた。 次に細胞を、１０μＭ フォルスコリン（forskolin）と種々の濃度の受容体選択 性リガンドで５分間インキュベートした。ＨＢＳを除去し、１００mＭのＨＣｌ で細胞を酸性化して、測定を停止させた。細胞内ｃＡＭＰを抽出し、磁性ビーズ 式のラジオイムノアッセイ（アドバンストマグネティクス（Ａdvance Ｍagnetic s）、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を修飾した方法により定量した。最 終の抗原／抗体複合体を、マイクロタイタープレート（ミリポア（Ｍillipore） 、ベッドフォード、マサチューセッツ州）中でＰＶＤＦフィルタ ーにより真空ろ過して、遊離の¹²⁵Ｉ−ｃＡＭＰから分離した。フィルターを穿 孔し、パッカード（Ｐackard）ガンマカウンター中で¹²⁵Ｉを計測した。結合デ ータは、グラフパッドプリズム（ＧranphＰad Ｐrism）パッケージ（サンジエゴ 、カリホルニア州）中の非線形回帰統計法を用いて解析した。機能性測定法：細胞内カルシウム動員 蛍光指示色素Ｆｕｒａ−２／ＡＭ（文献）を用いて、蛍光分光測定法により細 胞内遊離カルシウム濃度を測定した。安定にトランスフェクションした細胞を、 カバーガラスを挿入した３５mmの培養プレートに接種した。細胞をＨＢＳで洗浄 し、１００μｌのＦｕｒａ−２／ＡＭ（１０μＭ）を２０〜４０分間のせた。Ｈ ＢＳで洗浄してＦｕｒａ−２／ＡＭ溶液を除去した後、細胞をＨＢＳ中で１０〜 ２０分間ＨＢＳで平衡化させた。次にライツフルオベルト（Ｌeiz Ｆluovert） ＦＳ顕微鏡の対物レンズ４０×で細胞を検鏡し、励起波長を３４０nmと３８０nm を交互に変えて蛍光波長５１０nmで測定した。蛍光の生データを、カルシウム濃 度標準曲線とソフトウェア解析法を用いてカルシウム濃度に変換した。神経解剖学的試験のための組織調製 オスのスプラーグ−ドーレイ（Ｓprague-Ｄawley）ラット（チャールズリバー ’（Ｃharles Ｒivers））を断頭し、迅速に脳を取り出し、イソペンタンで凍結 した。凍結切片作製機で頭頂部分を１１μに切断し、ポリ−Ｌ−リジンコーティ ングしたスライドに融解マウントし、使用するまで−８０℃に保存した。ハイブ リダイゼーションの前に、組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、５mＭジ チオスレイトールで処理し、０．２５％無水酢酸を含有する０．１Ｍトリエチル アミンでアセチル化し、クロロホルムで脱脂し、段階的濃度のエタノールで脱水 した。プローブ ラットＮＰＹ Ｙ５ ｍＲＮＡの分布の性状解析に使用されるオリゴヌクレオ チドプローブは、ラットＹ５ ｍＲＮＡ（図３Ａ）の４５量体アンチセンスに相 補的であり、センスオリゴヌクレオチドプローブは、ミリポアエクスペダイト（ Ｍillipore Ｅxpedite）８９０３核酸合成システムで合成した。次にプローブを 凍結乾燥し、無菌水で復元し、１２％ポリアクリルアミド変性ゲルで精製した。 精製したプローブを再度、１００ng/μlの濃度に復元し、−２０℃で保存した。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ファルマシア（Ｐharmacia ））を用いて、比活性１０⁹dpm/μｇになるように³⁵Ｓ−ｄＡＴＰで３’末端を 標識した。放射能標識したプローブを、バイオスピン（Ｂiospin）６クロマトグ ラフィーカラム（バイオラッド（Ｂio-Ｒad）；リッチモンド、カリホルニア州 ）で精製し、ハイブリダイゼーション緩衝液で１．５×１０⁴cpm/μｌの濃度に 希釈した。ハイブリダイゼーション緩衝液は、５０％ホルムアミド、４×クエン 酸ナトリウム緩衝液（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、１×デンハルツ溶液（０．２％ポリビニルピロリドン、 ０．２％フィコール、０．２％ウシ血清アルブミン）、５０mＭジチオスレイト ール、０．５mg/ml サケ精子ＤＮＡ、０．５mg/ml 酵母ｔＲＮＡ、および１０％ デキストラン硫酸からなっていた。希釈した放射能標識プローブ１００μｌを各 切片に加え、次にこれをパラフィルムのカバーガラスでカバーした。ハイブリダ イゼーションは、４０〜５５℃で加湿チャンバー中で行なった。翌日切片を、２ ×ＳＳＣを２回交換して室温で１時間洗浄し、最後に０．１×ＳＳＣで室温で３ ０分間洗浄した。組織を段階的濃度のエタノールで脱水し、コダックＸＡＲ−５ フィルムに３日間〜３週間−２０℃で露光し、次に０．２％グリセロールで１： １に希釈したコダックＮＴＢ３オートラジオグラフィーエマルジョンに浸した。 ４℃で２〜８週間露光後、スライドをコダックＤ−１９現像液中で現像し、固定 し、クレゾールバイオレットで逆染色した。ハイブリダイゼーション対照 プローブ／ハイブリダイゼーション特異性のための対照は、放射能標識センス プローブとのハイブリダイゼーションと、トランスフェクションした細胞株の使 用をからなっていた。要約すると、ＣＯＳ−７細胞をラットのＹ１、Ｙ２（１９ ９４年２月３日出願の、米国特許出願第０８／１９２，２８８号に開示されてい る）、Ｙ４（１９９３年１２月２８日出願の、米国特許出願第０８／１７６，４ １２号に開示されている）またはＹ５の受容体ｃＤＮＡとトランスフェクション した（前述）。前記したように、トランスフェクションした細胞を処理し、放射 能標識Ｙ５アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダ イズさせ、洗浄し、１〜７日間フィルムに露光させた。ハイブリダイゼーションシグナルの解析 ラット脳の切片を、以下のようにハイブリダイゼーションシグナルについて解 析した、本明細書で使用する「ハイブリダイゼーションシグナル」とは、ラット 脳の選択された部分のニューロンの上で観察される銀粒子の相対的な数を意味す る。２人の別々の観察者が、特定の脳の部分のハイブリダイゼーションシグナル の強度を、存在せず、弱い、中程度、強いとして評価した。次にこれらを、０、 ＋１、＋２、または＋３として主観的な数値に変換し、ラット脳の頭頂切片の略 図上にマッピングした。化学合成法 化合物２８ ２−（ナフタレン−１−イルアミノ）−３−フェニルプロピオニトリル ３０mlのＣＨＣｌ₃と１０mlのＭｅＯＨ中の１−ナフタレンメチルアミン（２ ．９ｇ，２０ミリモル）とベンジルアルデヒド（２．０ｇ，１７ミリモル）の溶 液に、ＴＭＳＣＮ（６．６ml，５１ミリモル）を加え、得られた溶液を２５℃で １２時間撹拌した。反応混合物を真空下で濃縮し、油状物を得て、これをカラム クロマトグラフィー（酢酸エチル，高純度）にかけて、所望の生成物３．５ｇ（ ７４％）を無色の油状物として得た。生成物をＮＭＲで同定した。 ２−（ナフタレン−１−イル）−３−フェニルプロパン−１，２−ジアミン ＴＨＦ中のニトリル（０．５ｇ，１．８ミリモル）の溶液に、ＴＨＦ中の６． ９mlの１Ｎ ＬｉＡｌＨ₄を滴下して添加し、得られた溶液を２時間撹拌した。 数片の氷を溶液に加えて、反応を停止させた。反応混合物を酢酸エチルで希釈し て、セライトのパッドでろ過した。有機ろ液を真空下で濃縮して油状物残渣を得 て、これをカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル、高純度）にかけて、所望の 生成物０．２８ｇ（５７％）を無色の油状物として得た。生成物をＮＭＲで同定 した。ラットでのインビボ試験 食物を充分与えたラットの食物摂取 これらの測定のために食物摂取は、試験化合物の存在下でまたは非存在下でＮ ＰＹを脳室内に投与（i.c.v.）後、正常の食物を充分与えたラットで測定した。 すべての試験で、体重１８０ｇ〜２２０ｇのオスのスプラーグ−ドーレイ（Ｓpr ague-Ｄawley）ラット（ギバガイギー社（Ｃiba-Ｇeigy ＡＧ）、シセルン（Ｓi sseln）、スイス）を使用した。ラットを１匹ずつステンレスのケージに入れ、 温度を絶えず２１〜２３℃に調節して、１１：１３時間の明暗サイクル（１８： ００時に消灯）で維持した。水と食物（ナファグ（ＮＡＦＡＧ）ラボ食ペレット 、ナファグ（ＮＡＦＡＧ）、コッソー（Ｇossau）、スイス）は自由に与えた。 ペントバルビタールで麻酔したラットに、右脳側室にステンレスのガイドカニ ューレを定位移植する。耳を結ぶ線の−２．０mm下に切歯をセットした定位座標 は：ブレグマに対して前方に−０．８mm、後方に＋１．３mmである。ガイドカニ ューレを硬膜の上に置く。注入カニューレをガイドカニューレから延長させる： 頭蓋表面から横に３．８mm。手術後の回復のためにラットを少なくとも４日間放 置し、その後実験に使用した。５０ngのアンギオテンシンIIの脳室内（i.c.v.） 注入について、ラットの飲水応答を試験して、カニューレの位置を術後にチェッ クした。アンギオテンシンII注入３０分以内に少なくとも２．５mlの水を飲んだ ラットのみを、摂食実験に使用した。 すべての注入は、朝の点灯後２時間目に行なった。ペプチドは、人工脳脊髄液 （ＡＣＳＦ）中５μｌの容量で注入した。ＡＣＳＦは以下を含有する：ＮａＣｌ １２４mＭ、ＫＣｌ ３．７５mＭ、ＣａＣｌ₂ ２．５mＭ、ＭｇＳＯ₄ ２．０mＭ 、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２２mＭ、ＮａＨＣＯ₃ ２６mＭ、およびグルコース１０mＭ。 ブタ−ＮＰＹを人工脳脊髄液（ＡＣＳ）に溶解した。i.c.v.注入のために、試験 化合物をＤＭＳＯ／水（１０％、v/v）に溶解することが好ましい。化合物の腹 腔内投与（i.p.）、皮下（s.c.）、または経口（p.o.）的送達のための賦形剤に は、それぞれ水、生理食塩水もしくはＤＭＳＯ／水（１０％、v/v）、またはク レモフォール（cremophor）／水（２０％、v/v）が好ましい。 試験化合物とｐ−ＮＰＹの両方で処理するラットは、まず試験化合物で処理す る。次に試験化合物または賦形剤（対照）のi.c.v.投与１０分後、試験化合物ま たは賦形剤のi.p.、s.c.およびp.o.投与の３０〜６０分後、３００ピコモルのＮ ＰＹを脳側室内投与（i.c.v.）した。 食物摂取は、ＮＰＹ注入時にケージ内にあらかじめ秤量したペレットを入れて 測定した。次に各選択時点でケージからペレットを取り、あらかじめ秤量したペ レットの新しいセットと交換した。試験化合物で処理したラットの食物摂取は、 対照ラット（すなわち、賦形剤で処理したラット）の食物摂取のパーセントとし て計算した。あるいは、同じ実験条件においたラットの群の食物摂取を、平均± 標準誤差として表すことができる。統計解析は、スチューデント−ニューマン− ケウルス（Ｓtudent-Ｎewman-Ｋeuls）検定を用いる分散解析により行なった。食物を欠乏させたラットの食物摂取 体重２２０〜２５０ｇのオスのスプラーグ−ドーレイ（Ｓprague-Ｄawley）ラ ットで食物欠乏実験を行なった。ラットを受領後、試験の期間中１匹ずつ檻に入 れ、水道水とともに通常の食物は自由に与えた。ラットを２４℃で１２時間の明 ／暗サイクル（午前８：００〜午後８：００が明るい）で維持し、湿度を追跡し た。個別のケージに入れた後、４日間ラットの平衡期間を設け、この間新しい環 境に慣れさせ、粉末化またはペレット食を与えた（ナファグ（ＮＡＦＡＧ）、コ ッソー（Ｇossau）、スイス）。 平衡期間後、午前８：００時に開始して２４時間ラットから食物を取った。こ の絶食期間の最後に、経口的または腹腔内または静脈内投与により、ラットに化 合物または賦形剤を投与した。１０〜６０分後、食物をラットに戻し、以後２４ 時間ラットの食物摂取を種々の時間間隔で追跡した。試験化合物で処理したラッ トの食物摂取は、対照ラット（すなわち、賦形剤で処理したラット）の食物摂取 のパーセントとして計算した。あるいは、同じ実験条件においたラットの群の食 物摂取を、平均±標準誤差として表すことができる。肥満ズッカー（Zucker）ラットの食物摂取 本発明の化合物の肥満抑制作用は、肥満の動物モデルとして知られているズッ カー（Ｚucker）肥満ラットでも現れるかも知れない。これらの実験は、体重４ ８０ｇ〜５００ｇのオスのズッカー（Ｚucker）肥満ラット（ｆａ／ｆａハーラ ン（Ｈarlan）ＣＰＢ、アウステリッツ（Ａusterlitz）、エヌエル（ＮＬ））を 用いて行なった。試験の期間中ラットを１匹ずつ代謝ケージに入れ、通常の食物 と水は自由に与えた。ラットを２４℃で１２時間の明／暗サイクル（午前８：０ ０〜 午後８：００が明るい）で維持し、湿度を追跡した。代謝ケージに入れた後、６ 日間ラットの平衡期間を設け、この間新しい環境に慣れさせ、粉末食を与えた。 平衡期間後、明期間と暗期間の食物摂取を測定した。３日間の対照期間後、ラッ トを試験化合物または賦形剤（好ましくは、水または生理食塩水またはＤＭＳＯ ／水（１０％、v/v）またはクレモフォア（cremophor）／水（２０％、v/v）で 処理した。次に以後３日間食物摂取を追跡して、試験化合物担体のみの投与の影 響を測定した。前述の試験と同様に、薬物の存在下での食物摂取は、賦形剤で処 理したラットの食物摂取のパーセントとして計算した。材料 細胞培養培地と補足物は、スペシャルティメディア（Ｓpecialty Ｍedia）（ ラバレッテ（Ｌavallette）、ニュージャージー州）から得た。細胞培養プレー ト（１５０mmプレートおよび９６ウェルマイクロタイタープレート）は、コーニ ング（Ｃorning）、ニューヨーク州）から得た。Ｓｆ９、Ｓｆ２１、およびハイ ファイブ（Ｈigh Ｆive）昆虫細胞、およびバキュロウイルス移動プラスミドで あるｐＢｌｕｅＢａｃ III（登録商標）は、インビトロゲン社（Ｉnvitrogen Ｃ orp.）、サンジエゴ、カリホルニア州）から購入した。１０％胎児牛血清を補足 したＴＭＮ−ＦＨ昆虫培地と、バキュロウイルスＤＮＡであるバキュコゴールド （ＢaculoＧold）（登録商標）は、ファルミンゲン（Ｐharmingen）（サンジエ ゴ、カリホルニア州）から得た。Ｌ−グルタミン含有Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ４００（ 登録商標）培地は、ジェイアールエィチサイエンティフィック（ＪＲＨ Ｓcient ific）から購入した。ポリプロピレン製９６ウェルマイクロタイタープレートは 、コースター（Ｃo-star）（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から得た。市 販のＮＰＹと関連ペプチド類似体は、バケムカリホルニア（Ｂachem Ｃaliforni a）（トランス（Ｔorrance）、カリホルニア州）またはペニンスラ（Ｐeninsula ）（ベルモント、カリホルニア州）から得た。［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰＹとＰＰ Ｃ−末端断片は注文によりカイロンミモトープスペプチドシステムズ（Ｃhiron Ｍimotopes Ｐeptide Ｓystems）（サンジエゴ、カリホルニア州）から合成した 。バイオラッド（Ｂio-Ｒad）試薬はバイオラッド（Ｂio-Ｒad）（ハーキュリー ズ（Ｈercules）、カリホルニア州）から得た。ウシ血清アルブミン（ウルトラ ファットフリー （ultra-fat free）、Ａ−７５１１）は、シグマ（Ｓigma）（セントルイス、ミ ズーリ州）から得た。他のすべての材料は試薬等級であった。 実験結果ｃＤＮＡクローニング ラットの視床下部「非定型」ＮＰＹ受容体サブタイプをクローン化するために、 本出願人はＣＯＳ−７細胞での発現クローニング法を使用した（Ｇearingら、19 89；Ｋluxenら、1992；Ｋieferら、1992）。この方法は、直接顕微鏡オートラジ オグラフィーにより単一の「受容体陽性」細胞の検出を可能にし、非常に感度が 高いため選択した。「非定型」受容体は、ラット視床下部のＮＰＹとＮＰＹ関連 リガンドの注入を伴う摂食行動試験で記載されているのみである（緒言参照）た め、本出願人はまず、ラットの視床下部から調製した膜上での¹²⁵Ｉ−ＰＹＹお よび¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36の競合的置換実験を行って結合プロフィールを調べた。 競合的置換データは、以下を示す。１）ヒトＰＰは、結合した¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの ２０％をＩＣ₅₀が１１nＭで置換することができる（図１と表２）。表５に示す ように、この値は、単離されたラットのＹ１、Ｙ２およびＹ４クローンと一致せ ず、従って他のＮＰＹ／ＰＹＹ受容体サブタイプに対応する可能性がある。２） ［Ｌｅｕ₃₁、Ｐｒｏ₃₄］ＮＰＹ（Ｙ１特異的リガンド）は、高親和性（ＩＣ₅₀が ０．３８）で、結合した¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36リガンド（Ｙ２特異的リガンド）の ２７％を置換することができる（図２と表２）。これらのデータは、ラットの視 床下部膜が、摂食行動試験で規定された薬理学に一致する混合Ｙ１／Ｙ２（以後 「非定型」サブタイプと呼ぶ）で、ＮＰＹ受容体サブタイプを有する可能性のあ るという結合測定法に基づく、最初の証拠を提供する。 上記データに基づき、２．７kb平均挿入体サイズの３×１０⁶の独立した組換 え体のラット視床下部ｃＤＮＡライブラリーを、約７５００の独立したクローン の４５０プールに分画した。すべてのプールは、前述のように（米国出願第０８ ／１９２，２８８号）¹²⁵Ｉ−ＰＹＹを用いる結合測定法で試験した。スクリー ニング測定法で７つのプールが陽性の細胞を与えた（第８１、９２、１４７、２ ４６、２５４、２９０、３１２）。Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４およびＹ５受容体サブタイ プ（ＰＣＲまたは結合解析による）はラット視床下部で発現されるため、本出願 人は、ラットＹ１、Ｙ２およびＹ４特異的プライマーを用いるＰＣＲにより、陽 性プールのＤＮＡを解析した。プール１４７、２４６、２５４および３１２は、 Ｙ１受容体をコードするｃＤＮＡを含有し、プール２９０はＹ２受容体サブタイ プをコードするｃＤＮＡを含有したが、プール８１と９２は、Ｙ１、Ｙ２および Ｙ４についてＰＣＲ解析で陰性であったため、従って新しいラット視床下部ＮＰ Ｙ受容体（Ｙ５）をコードするｃＤＮＡを含有する可能性がある。プール８１と ９２は後に同一のＮＰＹ受容体ｃＤＮＡを含有することが明らかになった。プー ル９２を、単一のクローン（ＣＧ−１８と命名）が単離されるまで米国出願第０ ８／１９２，２８８号に記載のように同胞選択を行なった。 単離したクローンは、２．８kbのｃＤＮＡを有する。このｃＤＮＡは、ヌク レオチド７７９と２１４６の間に読みとり枠を含有し、４５６アミノ酸のタンパ ク質をコードする。長い５’非翻訳領域は、翻訳効率またはｍＲＮＡ安定性の制 御に関係している。推定の開始コドンの周りの隣接配列は、最適の翻訳開始のた めのコザック（Ｋozak）共通配列と一致しない（コザック（Ｋozak）、１９８９ 、１９９１）。疎水性プロットは、７つの疎水性の推定の膜にまたがる領域を示 し、これはラット視床下部Ｙ５受容体をＧタンパク質結合スーパーファミリーの １つにしている。ヌクレオチドと推定アミノ酸配列をそれぞれ図３と４に示す。 ほとんどのＧタンパク質結合受容体のように、Ｙ５受容体は膜タンパク質の正し い発現（ＫornfelgとＫornfeld、１９８５）に関与するアミノ末端（２１位と２ ８位）のＮ−結合グリコシル化のための共通配列を含有する。Ｙ５受容体は、機 能性タンパク質構造（Ｐrobstら、１９９２）を安定化させるジスルフィド結合 を形成すると考えられる最初の２つの細胞外ループ中に２つの高度に保存された システイン残基を有する。Ｙ５受容体は、２０４、２１７、２５４、２７３、２ ８５、３０１、３２８、３２６、および４０９位にタンパク質キナーゼのための 可能性のある９つのリン酸化部位、および２９８と３７０位にｃＡＭＰ−および ｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位を示す。これらの１１の可能 性のああるリン酸化部位のうち８つは、第３の細胞内ループに位置し、２つは第 ２の細胞内ループに位置し、１つは受容体のカルボキシ末端に位置し、従ってＹ ５受容体の機能性特徴の制御にある役割を果たしている（Ｐrobstら、１９９２ ）。さらにラットＹ５受容体は、最初の推定膜貫通（transmembrane）ドメイン にロイシンジッパーモチーフ（leucine zipper motif）を有する（Ｌandschulz ら、１９８８）。チロシンキナーゼリン酸化部位は、ロイシンジッパーの真ん中 に存在する。 局在化試験（後述）は、ラット海馬のいくつかの領域にＹ５ ｍＲＮＡが存在 することを示す。ヒト脳において同等の局在化を仮定して、本出願人は、米国出 願第０８／１９２，２８８号に記載のように、ラットオリゴヌクレオチドプライ マーを用いてヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ヒト海馬ｃＤ ＮＡでＰＣＲ反応を行うと予測されたサイズのＤＮＡバンドが得られた（Ｃ．Ｇ erald、未公表結果）。このＰＣＲスクリーニング方策（Ｇeraldら、１９９４、 発表のために投稿中）、３つの陽性プールが同定された。これらのプールの１つ をさらに解析し、単離されたクローンを同胞選択により精製した。単離したクロ ーン（ＣＧ−１９）は、機能性発現のための正しい配向でクローン化された全長 ｃＤＮＡを含有していた（後述）。ヒトＹ５ヌクレオチドと推定されるアミノ酸 配列を、それぞれ図５と６に示す。ラットのＹ５受容体と比較すると、ヒトの配 列は、８４．１％のヌクレオチド同一性（図７Ａと７Ｅ）、および８７．２％の アミノ酸同一性（図７Ｆと７Ｇ）を示す。ラットのタンパク質配列は、ラットと 比較すると、受容体のアミノテールとカルボキシテールの両方の末端で１アミノ 酸長い。ヒト５−６ループは、ラットより１アミノ酸長く、複数の非保存的置換 を示している。５−６ループは、ラットとヒトの同族体の間で大きな変化を示す が、ラットの受容体中に存在するタンパク質モチーフのすべては、ヒトの同族体 中に存在する。すべての推定膜貫通ドメインおよび余分の細胞性ループ例は高度 に保存されている（図７Ｆと７Ｇ）。従って、ラットとヒトのＹ５受容体サブタ イプ同族体の薬理学的プロフィールと機能性特徴は、密接に一致することが予測 される。 ヒトおよびラットのＹ５受容体配列を、他の受容体サブタイプまたは他のヒト Ｇタンパク質結合受容体サブタイプと比較すると、全体的および膜貫通ドメイン の同一性は非常に低く、Ｙ５受容体遺伝子は他のすでに性状解析されているｃＤ ＮＡのいずれにも密接な関連はないことを示している。ヒトのＮＰＹ受容体ファ ミリーの中でも、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４およびＹ５メンバーは、異常に低レベルのア ミノ酸同一性を示す（図８Ａ〜８Ｃ）。 ノーザンブロット解析 ラットＹ５プローブを用いると、ノーザンハイブリダイゼーションは、ラット 脳全体で２．７kbで強いシグナルそして８kbで弱いバンドを示す。弱いシグナル は、睾丸の２．７kbで観察される。心臓、脾臓、肺、肝臓、骨格筋および腎臓で は、３日間の曝露後にシグナルは見られなかった（図１６Ａ）。これは、発現ク ローニングにより我々がラット海馬から単離した２．７kbのｃＤＮＡに一致し、 我々のｃＤＮＡクローンが全長であることを示す。脳全体で見られる８kbのバン ドは、おそらくスプライスされていないプレｍＲＮＡに対応する。 ヒトＹ５プローブでは、ノーザンハイブリダイゼーション（図１６Ｂと１６Ｃ ）は、尾状核、被殻および大脳皮質で２．２と１．１kbではるかに弱いバンド、 前葉および扁桃で中程度のシグナル、そして海馬、後頭葉、脊髄、骨髄、視床、 視床下核、および黒質で弱いシグナルを示した、小脳または脳梁では４８時間の 曝露後３．５kbにシグナルは検出されなかった。クロンテック（Ｃlontech）の ＭＴＮ IIとIIIブロットは、視床下部、水道周囲灰白質、上丘および縫線から のｍＲＮＡを含有しないことに注意すべきである。 ヒトゲノムＤＮＡに対するサザンブロット解析は、５つの制限消化物のうち４ つでユニークなバンドパターンを示す（図１７Ａ）。ＰｓｔＩ消化物で観察され ろ２つのバンドは、ヒトＹ５遺伝子のコード配列中のＰｓｔＩの存在により説明 できる。ラットのサザンブロット解析は、試験した５つの制限消化物のすべてで ユニークなバンドパターンを示した（図１７Ｂ）。これらの解析結果は、Ｙ５受 容体遺伝子濃縮単一のコピーを含有するヒトおよびラットゲノムに一致する。イヌＹ５同族体 今日までに得られているイヌのヌクレオチド配列（ＰＣＲまたは３’ＲＡＣＥ 産物）は、ＴＭ IIIのすぐ上流の最初の細胞外ループから３’非翻訳領域まで のイヌＹ５受容体にまたがる（図１４）。コード領域では、ヒトとラットの配列 の両方に、このヌクレオチド配列は高度に似ている（それぞれ、９１％と８３． ３％）。推定されるＹ５アミノ酸配列を図１５に示す。このアミノ酸配列は、再 びヒトとラットのＹ５配列の両方に非常によく似ており（それぞれ、９４．６％ と８９．５％）、ほとんどのアミノ酸の変化は５−６ループに位置している。従 って、イヌのＹ５受容体サブタイプの薬理学的プロフィールは、ヒトおよびラッ トＹ５プロフィールによく似ていると予測される。結合試験 詳細な薬理学的評価のために、ラット視床下部Ｙ５受容体のｃＤＮＡをＣＯＳ −７細胞で一過性に発現させた。¹²⁵Ｉ−ＰＹＹは、ラットＹ５受容体作製体で 一過性トランスフェクションを行なったＣＯＳ−７細胞の膜に特異的に結合した 。特異的結合の経時変化を、３０℃で０．０８nＭの¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測 定した。結合曲線は１相性であり、観察された会合速度（Ｋ_obs）は０．０６分^{- 1} でｔ_1/2は１１分であった。７１分以内に平衡結合は９９％完了し、少なくとも １８０分安定であった。以後のすべての結合測定法は、３０℃で１２０分行なっ た。一過性に発現したラットＹ５受容体への¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの結合は、放射性リ ガンド濃度０．４pＭ〜２．７nＭで飽和可能であった。結合データは、見かけの Ｋ_dが０．２９nＭ（ｐＫ_d＝９．５４±０．１３、ｎ＝４）で１部位結合モデル に一致した。５〜１０ピコモル/mg 膜タンパク質の受容体密度を、凍結し液体窒 素で保存した膜で測定した（図１０）。疑似（mock）トランスフェクション細胞 の膜はＣＧ−１８でトランスフェクションした細胞と同じ方法で調製し解析 した時、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの特異的結合は示さなかった（データは示していない） 。本出願人は、記載した条件下で観察される¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ結合部位は、ラット Ｙ５受容体作製体に由来すると結論する。 密接に関連するペプチド類似体であるブタ¹²⁵Ｉ−［Ｌｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］Ｐ ＹＹも、ラットＹ５受容体ｃＤＮＡで一過性にトランスフェクションしたＣＯＳ −７細胞の膜に特異的に結合した。標準的結合緩衝液（［Ｎａ⁺］＝１０mＭ）と 等張結合緩衝液（［Ｎａ⁺］＝１３８mＭ）の両方で、０．０８nＭの¹²⁵Ｉ−［Ｌ ｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］ＰＹＹを用いて室温で特異的結合の経時変化を測定した（図 １８）。１０mＭ［Ｎａ⁺］での結合曲線は１相性であり、観察された会合速度（ Ｋ_obs）は０．０４２分^-1でｔ_1/2は１７分であった。１１０分以内に平衡結合は ９９％完了し、少なくとも２１０分安定であった（特異的結合は、４８０フェト モル/mg 膜タンパク質で最大であった）。１３８mＭ［Ｎａ⁺］での結合曲線もま た１相性であり、経時変化は少し遅かった。（Ｋ_obs）は０．０２９分^-1でｔ_1/2 、は２４分であった。１６０分以内に平衡結合は９９％完了し、少なくとも２１ ０分安定であった（特異的結合は、３３０フェトモル/ｍg 膜タンパク質で最大 であった）。［Ｎａ⁺］が増加すると特異的結合が低下することに注意されたい 。他のＧタンパク質結合受容体についても同様の現象が観察されており、Ｎａ⁺ により調節されるこの受容体ファミリーの一般的性質を反映しているかも知れな い（Ｈorstmanら、1990）。飽和結合試験は、等張緩衝液中の¹²⁵Ｉ−［Ｌｅｕ³¹ ，Ｐｒｏ³⁴］ＰＹＹで室温で１２０分かけて行なった。一過性にトランスフェク ションしたラットＹ５受容体への特異的結合は、０．６pＭ〜１．９nＭの放射性 リガンド濃度範囲で飽和可能であった。結合データは、見かけのＫ_dが０．０７ ２nＭ（ｐＫ_d＝１０．１４±０．０７、ｎ＝２）で１部位結合モデルに一致した 。凍結し液体窒素で保存した膜上の受容体密度５６０±１５０ピコモル／mg。^{12 5} Ｉ−［Ｌｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］ＰＹＹで室温でラットＹ５受容体に高親和性で結 合できることは、オートラジオグラフィー法を用いてラット組織で未変性のＹ５ 受容体を性状解析するための有用なリガンドとなる可能性がある。しかし、Ｙ１ やＹ４受容体のような他の受容体の放射能標識の可能性を阻止するために、適当 なマスキング剤を用いることに注意すべきである（表５において、ラットＹ １とＹ４は、構造同族体［Ｐｒｏ³⁴］ＰＹＹに結合する）。Ｙ１−選択性放射性 リガンドとしての¹²⁵Ｉ−［Ｌｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］ＰＹＹのすでに公表されてい る報告は、ラットＹ５受容体で得られた新しいデータの点から再評価すべきであ る（Ｄumontら、1995）。 ラットＹ５受容体の薬理学的プロフィールを、まず膜結合測定法において膵臓 ポリペプチド類似体を用いて試験した。選択された化合物の親和性のランクオー ダーを、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの競合的置換から得た（図１１）。ラットＹ５受容体を 、ヒト（表４）およびラット（表５）からのＹ１、Ｙ２およびＹ４受容体（すべ てＣＯＳ−７細胞中で一過性に発現した）と比較した。放射性リガンドスクリー ニングに適したモデルが同定されていないため、我々のパネルにない１つの受容 体サブタイプはＹ３（ヒトまたはラット）である。 ラットＹ５受容体は、ヒトおよびラットＹ型受容体と比較するとユニークな薬 理学的プロフィールを有していた。ほとんどのＰＰ誘導体について、これはラッ ト／ヒトＮＰＹ（Ｋｉ＝０．６８nＭ）およびラット／ブタＰＹＹ（Ｋｉ＝０． ６４nＭ）の構造類似体に対して親和性を示した。サケＰＰ（Ｋｉ＝０．３１nＭ ）に対する高親和性は、８１％のアミノ酸配列を共有し、重要な点（Ｔｙｒ¹、 Ｇｌｎ³⁴、およびＹｔｒ³⁶）で同一性を保持する、サケＰＰとラットＮＰＹの間 の密接な類似性を反映している。Ｎ−末端とＣ−末端ペプチドドメインの両方が 、受容体認識に重要であると思われる。ＮＰＹまたはＰＹＹのＮ−末端チロシン を欠失させても結合親和性（ラット／ヒトＮＰＹ_2-36についてＫｉ＝０．８６_n Ｍ）は大きく低下しないが、さらにＮ−末端を欠失させると親和性がなくなる（ ブタＮＰＹ_13-36についてＫｉ＝７３nＭ）。このパターンは、Ｙ５受容体の結合 プロフィールをＹ２受容体（極端なＮ−末端欠失に耐える）とＹ１受容体（この 受容体は、たった１つのＮ−末端残基の欠失に対しても感受性がある）の結合プ ロフィールの間のどこかに位置させる。ヒトのＹ４受容体も同様に説明できるこ とに注意されたい（ヒトＰＰについてＫｉ＝０．０６nＭ、ヒトＰＰ_2-36につい てＫｉ＝ ０．０６nＭ、そしてヒトＰＰＹ_13-36についてＫｉ＝３９nＭ）。Ｙ５受容体は 、Ｐｒｏ³⁴を含有するリガンドに対する耐性において、Ｙ１受容体およびＹ４受 容体の両方に似ていた（ヒト［Ｌｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］ＮＰＹ、ヒト［Ｐｒｏ³⁴］ −ＰＹＹ、およびヒトＰＰのように）。興味深いことに、ラットＹ５受容体は、 ラットＰＰ（Ｋｉ＝１８０nＭ）よりヒトＰＰ（Ｋｉ＝５．０nＭ）に対して親和 性を示した。このパターンが、ラットＹ５受容体をラットＹ４受容体から区別し ており、後者はヒトおよびラットＰＰに対して、Ｋｉ値＜０．２nＭで結合する 。ＮＰＹ遊離酸のように、カルボキシ末端アミドを加水分解して遊離カルボン酸 にすると、ラットＹ５受容体に対する結合親和性がなくなった（Ｋｉ＝４８０n Ｍ）。またアミドは、膵臓のポリペプチドファミリー／受容体相互作用に共通に 必要な構造的要求と思われる。 Ｋｉ≦５．０nＭでラットＹ５受容体に結合するいくつかのペプチドは、ラッ トの摂食行動を刺激することがすでに証明されている。これらには、ラット／ヒ トＮＰＹ（Ｋｉ＝０．６８nＭ）、ラット／ブタＰＰＹ（Ｋｉ−０．６４nＭ）、 ラット／ヒトＮＰＹ_2-36（Ｋｉ＝０．８６nＭ）、ラット／ヒト［Ｌｅｕ³¹，Ｐ ｒｏ³⁴］ＮＰＹ（Ｋｉ＝１．０nＭ）、およびヒトＰＰ（Ｋｉ＝５．０nＭ）があ る。逆に、食欲促進剤としての作用が比較的小さいペプチドは、ＣＧ−１８への 結合は弱かった。これらには、ＮＰＹ_13-36（Ｋｉ＝７３nＭ）、ブタＣ２−ＮＰ Ｙ（Ｋｉ＝４７０nＭ）、およびヒトＮＰＹ遊離酸（Ｋｉ＝４８０nＭ）がある。 ｋｉ値のランクオーダーは、ペプチドをi.c.v.またはラットの視床下部に直接注 入して摂食行動を刺激する力価や活性のランクオーダーと一致していた（Ｃlark ら、1984；Ｓtanleyら、1985；Ｋalraら、1991；Ｓtanleyら、1992）。ラットＹ ５受容体はまた、Ｂalasubramaniamら（1994）によりＮＰＹ−誘導性摂食を制御 すると報告されている修飾ペプチドである［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰＹに対して中程 度の結合親和性を示す（Ｋｉ＝５３nＭ）。［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰＹはＣＧ−１ ８に対して、試験した他のクローン化受容体（ヒトでもラットでも）より１０倍 以上の選択性を示すことは注目すべきである。これらのデータは、クローン化Ｙ ５受容体を摂食応答に明らかにかつ明確に結びつけている。 ヒト海馬から単離したヒトＹ５同族体に対応するｃＤＮＡを、膜結合試験のた めにＣＯＳ−７細胞中で一過性にトランスフェクションさせた。ヒトＹ５受容体 （ＣＧ−１９）への¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの結合は、放射性リガンド濃度８pＭ〜１．８ nＭの範囲で飽和可能であった。最初の実験で結合データは、見かけのＫ_dが０． １０nＭで１部位結合モデルに一致した。繰り返し試験すると、見かけのＫ_dは０ ．１８nＭ（ｐＫ_d＝９．７６±０．１１、ｎ＝４）であった。新鮮な膜では最大 の受容体密度５００フェトモル/mg 膜タンパク質が測定された。膵臓ポリペプチ ドファミリーのペプチド類似体を用いて測定されるように、ヒトＹ５薬理学的プ ロフィールは、ラットＹ５受容体に著しくよく似ている（表６と７）。 昆虫細胞で発現したｈＹ５の結合試験 まずｈＹ５受容体の発現を最適化するために試験を行なった。Ｓｆ９、Ｓｆ２ １およびハイファイブ（Ｈigh Ｆive）細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）５でｈＹ ５ＢＢ３ウイルスで感染させ、感染後４５時間目に結合分析のために膜を調製す ると、４１７〜８２０フェトモル/mg タンパク質の範囲でＢ_maxが観察され、Ｓ ｆ２１細胞でのｈＹ５ＢＢ３が最大の発現を示した。従って、我々の次の実験で はＳｆ２１細胞を使用した。次に我々は、ＭＯＩ １、２、５および１０を試験 して、最適感染多重度（ＭＯＩ、細胞に対するウイルス粒子の比率）を調べた。 Ｂ_max値はいずれのＭＯＩでも約１．１〜１．２ピコモル/mg タンパク質であり 、細胞当たりのウイルス粒子の数を増加させても有害でも有益でもないことを示 唆している。ウイルス力価計算値は近似値であるため、我々は以後の実験のため にＭＯＩ＝５を選択した。我々が試験した最後のパラメータは、感染後４５〜９ ６時間の範囲の、タンパク質発現のための感染後の時間である。我々は、感染の ４５〜７３時間後に最適の発現が起きることを見いだした。要約すると我々は、 Ｂ_maxが約１．２ピコモル/mg タンパク質で¹²⁵Ｉ−ＰＹＹを結合するｈＹ５組換 えバキュロウイルスを作成した。ヒトＹ５同族体：バキュロウイルス感染したＳｆ２１昆虫卵巣細胞での一過性発 現 ヒトＹ５バキュロウイルス作製体で感染したＳｆ２１細胞を膜ホモジネートの ように採取し、０．０８nＭの放射性リガンドを用いて¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの特異的結 合についてスクリーニングした。特異的結合は、Ｓｆ２１細胞から得られた試料 Ｄ−２／［４］が最大（５００フェトモル／mg 膜タンパク質）であった。バキ ュロウイルスプラスミドのみで感染させると、非特異結合は観察されなかった（ データは示していない）。発現系がＣＯＳ−７細胞でもバキュロウイルス／Ｓｆ ２１でも、ヒトＹ５受容体に対するブタ¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの結合親和性は同じ(０． １８nＭ)であると仮定すると、試料Ｄ−２／［４］の特異的結合は、見かけのＢ_max が１６００フェトモル/mg タンパク質と予測させる。従ってバキュロウイル ス／Ｓｆ２１発現系のバキュロウイルスのＹ５受容体収率は、ＣＯＳ−７細胞中 と同等かまたはそれ以上である。我々は、バキュロウイルスはヒトＹ５受容体 の大量生産に適した代替トランスフェクション法を与えると結論する。Ｙ５受容体の安定な発現系：結合測定法における性状解析 ラットＹ５受容体のｃＤＮＡは、特異的¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ結合の欠如についてあ らかじめスクリーニングした２９３細胞に安定にトランスフェクションされた（ データは示していない）。ラットＹ５ｃＤＮＡ＋Ｇ−４１８耐性遺伝子による同 時トランスフェクションとＧ−４１８による選択後、生存しているコロニーを０ ．０８nＭの放射性リガンドを用いて¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの特異的結合について、膜ホ モジネートのようにスクリーニングした。選択されたクローン（２９３クローン ＃１２）は６５フェトモル¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ/mg タンパク質を結合し、機能性測定 法でさらに試験するために単離した。 ヒトＹ５受容体のｃＤＮＡは、それぞれ特異的¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ結合の欠如につ いてあらかじめスクリーニングしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞とＬＭ（ｔｋ−）細胞の 両方に安定にトランスフェクションされた（データは示していない）。ヒトＹ５ ｃＤＮＡ＋Ｇ−４１８耐性遺伝子による同時トランスフェクションとＧ−４１８ による選択後、生存しているコロニーを０．０８nＭの放射性リガンドを用いて^{1 25} Ｉ−ＰＹＹの特異的結合について、膜ホモジネートのようにスクリーニングし た。ＮＩＨ−３Ｔ３クローン＃８は４６フェトモル¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ/mg タンパク 質を結合し、ＬＭ(tｋ−)クローン＃７は３２フェトモル¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ/mg タン パク質を結合した。これらの２つのクローンは、機能性測定法でさらに試験する ために単離した。２５フェトモル/mg タンパク質を結合した第３のクローン（Ｌ Ｍ（ｔｋ−）＃３）は、カルシウム動員測定法で評価した。 ＮＩＨ−３Ｔ３細胞で安定に発現されたヒトＹ５（クローン＃８）は、¹²⁵Ｉ −ＰＹＹを用いて飽和結合測定法でさらに性状解析した。結合は放射性リガンド 濃度０．４pＭ〜１．９nＭの範囲で飽和可能であった。結合データは、見かけの Ｋ_dが０．３０nＭ（ｐＫ_d＝９．５３、ｎ＝１）で１部位結合モデルに一致し、 新鮮な膜を用いると見かけのＢ_maxは２１００フェトモル/mg 膜タンパク質であ った。 ＬＭ（ｔｋ−）細胞で安定に発現されたヒトＹ５（クローン＃７）はさらに、¹²⁵ Ｉ−ＰＹＹ、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36、および¹²⁵Ｉ−ＮＰＹを用いる飽和結合測 定法 で性状解析した。¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ結合は、０．４pＭ〜１．９nＭの濃度範囲で１ 部位結合モデルに従って飽和可能であり、膜を凍結し液体窒素に保存した時、見 かけのＫ_dが０．４７nＭ（ｐＫ_d＝９．３２±０．０７、ｎ＝５）で、見かけの Ｂ_maxは最大８ピコモル/mg 膜タンパク質であった。ＬＭ（ｔｋ−）からのヒト Ｙ５受容体への¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ結合から得られたペプチドＫｉ値は、既に記載し たヒトおよびラットＹ５発現系から得られたものと同様であった（表６）。ＬＭ （ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５への¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36結合は、０．５pＭ〜２．０ ９nＭの濃度範囲で１部位結合モデルに従って飽和可能であり、膜を凍結し液体 窒素に保存した時、見かけのＫ_dが０．４０nＭ（ｐＫ_d＝９．４０、ｎ＝１）で 、見かけのＢ_maxは４９０フェトモル/mg 膜タンパク質であった。使用した放射 性リガンドが¹²⁵Ｉ−ＰＹＹであっても¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36でも、ペプチドリガン ドは、ＬＭ（ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５受容体に同等の親和性で結合するようで あった（表６）。最後に、ＬＭ（ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５への¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ の結合は、０．４pＭ〜１．１９nＭの濃度範囲で１部位結合モデルに従って飽和 可能であり、膜を凍結し液体窒素に保存した時、見かけのＫ_dが０．２８nＭで、 見かけのＢ_maxは３６０フェトモル/mg 膜タンパク質であった。 全体としてのヒトおよびラットＹ５受容体の飽和結合試験を考慮すると、デー タは、Ｙ５受容体が膵臓ポリペプチドファミリー（¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ、¹²⁵Ｉ−ＮＰ Ｙ、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36、および¹²⁵Ｉ−［Ｌｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］ＰＹＹを含む） の複数の放射性リガンドペプチド類似体の標的であるという証拠を提供している 。いわゆるＹ１およびＹ２選択性放射性リガンド（例えば、それぞれ¹²⁵Ｉ−［ Ｌｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］ＰＹＹおよび¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ_3-36）（Ｄumontら、1995）は 、Ｙ型受容体発現のための未変性の組織をプローブ探索する時注意すべきである 。受容体／Ｇタンパク質相互作用：グアニンヌクレオチドの作用 特定のＧタンパク質結合受容体について、受容体集団の一部は典型的には、区 別するためのアゴニストを用いて、高親和性リガンド結合部位で性状解析するこ とができる。Ｇタンパク質へのＧＴＰまたは非加水分解性類似体の結合は、低親 和性結合状態が好ましいウイルス競合のコンフォメーション変化を引き起こす。 我々は、非加水分解性ＧＴＰであるＧｐｐ（ＮＨ）ｐが、ＣＯＳ−７細胞および ＬＭ（ｔｋ−）細胞中のＹ５への¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの結合を変化させるか否かを調 べた（図１９）。ＣＯＳ−７細胞でのヒトおよびラットＹ５受容体の両方への^{12 5} Ｉ−ＰＹＹの結合は、１nＭ〜１００μＭの範囲の増加する濃度のＧｐｐ（ＮＨ ）ｐに対して、比較的低感度であった。しかしＬＭ（ｔｋ−）細胞中のヒトＹ５ 受容体は、放射性リガンド結合において濃度依存性低下を示した（全濃度範囲で 約８５フェトモル/mg タンパク質）。受容体調製物間の差は、１）高親和性受容 体−アゴニスト複合体を支持する宿主細胞中で利用できるＧタンパク質の型、２ ）宿主細胞中の受容体貯蔵レベル、および３）受容体／Ｇタンパク質結合の効率 、および４）受容体の多数のコンフォメーションを区別するアゴニスト（この場 合、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹ）の本質的能力、を含むいくつかの要因で説明できる。機能性測定法 これまで説明したＹ型受容体の活性化は、アデニル酸シクラーゼ活性（Ｇ_iま たはＧ_o）を阻害する百日咳毒素感受性Ｇタンパク質への結合が関与すると考え られる（ＷahlestedtとＲeis、1993）。非定型Ｙ１受容体がシクラーゼ阻害に関 係していることは、百日咳毒素がインビボでのＮＰＹ誘導性摂食を阻害したとい う観察により支持される（Ｃhanceら、1989）。単離される受容体の非存在下で 、より決定的な解析は不可能であった。前記観察に基づき、本出願人は、ラット Ｙ５受容体で安定にトランスフェクションされたヒト胚腎２９３細胞中のフォル スコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積を阻害するＮＰＹの能力を試験した。完全な細胞を１ ０μＭのフォルスコリンとともにインキュベートすると、５分間でｃＡＭＰ蓄積 （ラジオイムノアッセイで測定）が１０倍増加した。ラット／ヒトＮＰＹととも に同時にインキュベートすると、安定にトランスフェクションされた細胞中でフ オルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積が６７％低下した（図１２）が、トランスフェク ションしない細胞では低下しなかった（データは示していない）。本出願人は、 ラットＹ５受容体の活性化は、おそらくアデニル酸シクラーゼ活性の阻害により 、ｃＡＭＰ蓄積を低下させると結論する。この結果は、すべてＹ型受容体そして 特に非定型Ｙ１受容体の提唱されているシグナル化経路に一致する。 ラットの摂食行動を刺激する能力について選択されたペプチドは、ＥＣ₅₀＜１ ０nＭでラットＹ５受容体を活性化することができた（Ｋalraら、1991;Ｓtanley ら、１９９２；Ｂalasubramaniamら、1994）。これらには、ラット／ヒトＮＰＹ （ＥＣ₅₀＝１．８nＭ）、ラット／ヒトＮＰＹ_2-36（ＥＣ₅₀＝２．０nＭ）、ラッ ト／ヒト［Ｌｅｕ³¹，Ｐｒｏ³⁴］ＮＰＹ（ＥＣ₅₀＝０．６nＭ）、ラット／ブタ ＰＹＹ（ＥＣ₅₀＝４．０nＭ）、およびラット／ヒト［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰＹ（ ＥＣ₅₀＝７．５nＭ）がある（表８）。¹²⁵Ｉ−ＰＹＹとペプチドリガンドのラッ トＹ５依存性結合から得られたＫｉ値（表５）は、ｃＡＭＰ蓄積のラットＹ５依 存性制御から得られたＥＣ₅₀値と近い範囲にあった（表８）。表６のすべてのペ プチドにより産生されたｃＡＭＰの最大抑制は、ＦＬＲＦアミド（ＦＬＲＦamid e）（４２％）を除いて、ヒトＮＰＹにより産生されるものの８４％〜１２０％ であった。特に興味深いのは、Ｙ５選択性ペプチド［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰＹであ る。これは、ラット視床下部に注入された時食物摂取を刺激し、同じ方法でのＮ ＰＹ誘導性摂食も減弱させることが証明されているペプチドである（Ｂalasubra maniam、1994）。本出願人は、［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰＹは、Ｋｉ＞５００nＭで 他のＹ型クローンに弱く結合し（表４と５）、機能性測定法で何の活性も示さな いことを観察した（表１０）。これとは極めて対照的に、［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰ ＹはＫｉ＝５３nＭでＹ５受容体に結合し、ＥＣ₅₀が２５nmでＥ_max＝７２％の、 フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積に及ぼすＮＰＹの阻害作用に似ていた。［Ｄ− Ｔｒｐ³²］ＮＰＹがＹ５受容体を選択的に活性化するが他のサブタイプクローン では検出可能な活性を有さないことは、Ｙ５受容体活性化は、インビボの摂食行 動に及ぼす［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ＮＰＹの刺激作用の原因であることを示唆している 。 ｃＡＭＰ蓄積を阻害するヒトＹ５受容体の能力を、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞とＬＭ （ｔｋ−）細胞（いずれも、Ｙ５作製体無しに［ｃＡＭＰ］のＮＰＹ依存性制御 を示さない）で評価した。ヒトＹ５受容体で安定にトランスフェクションした完 全な細胞を、ラットＹ５ｃＡＭＰ測定法で記載したように解析した。安定にトラ ンスフェクションしたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を１０μＭのフォルスコリンとインキ ュベートすると、［ｃＡＭＰ］が平均２１倍増加した（ｎ＝２）。ヒトＮＰＹと の同時インキュベーションでは、Ｅ_maxが４２％、ＥＣ₅₀が８．５nＭでフォルス コリン刺激［ｃＡＭＰ］が低下した（図２０）。Ｙ５−トランスフェクションし たＬＭ（ｔｋ−）細胞を懸濁し次に再度蒔く方法は、ＮＰＹ様ペプチドに対する 確実で信頼できる細胞応答と相関したため、ＬＭ（ｔｋ−）中のヒトＹ５の機能 性評価のための標準的方法として取り込んだ。こうして調製した安定にトランス フェクションされたＬＭ（ｔｋ−）細胞をインキュベートすると、［ｃＡＭＰ］ が平均７．４倍増加した（ｎ＝８７）。ヒトＮＰＹと同時にインキュベートする と、Ｅ_maxが７２％、ＥＣ₅₀が２．４nＭでフォルスコリン刺激［ｃＡＭＰ］が低 下した（図２１）。ヒトＹ５受容体は、ラットＹ５受容体について記載した応答 と同様のランクオーダーでＮＰＹ様ペプチドに対する細胞性応答を支持した（表 ８、９）。ラットＹ５受容体は、Ｄ−Ｔｒｐ３２−ＮＰＹおよび他の薬理学的手 段により摂食行動のＮＰＹ依存性制御に明らかに関係しているため、ヒトＹ５受 容体は、同様の方法で機能すると予測される。ヒトおよび受容体同族体ともに、 ＮＰＹ依存性経路を妨害して摂食行動を調節するための化合物のスクリーニング の有用なモデルである。 機能性測定法：細胞内カルシウム動員 １００nＭのヒトＮＰＹでインキュベートすると３０秒以内に、ヒトＹ５受容 体で安定にトランスフェクションしたＬＭ（ｔｋ−）細胞中で、細胞内遊離カル シウム濃度が増加した（ΔＣａ²⁺＝３４、図２１Ｄ）。トランスフェクションし なかったＬＭ（ｔｋ−）細胞は、ヒトＮＰＹに応答しなかった（データは示して いない）。カルシウム動員は、Ｙ５受容体活性化が測定できる第２の経路を提供 する。これらのデータはまた、Ｙ５受容体を他のクローン化したヒトＹ型受容体 （そのすべては、種々の発現系で細胞内カルシウムを動員することが証明されて いる）と関係付けるのにも有用である（図２１）。局在化試験 ＮＰＹ Ｙ５受容体のｍＲＮＡは、ラット脳内に広く分布しており、適度に豊 富なようである（表１１と図１３）。正中線視床（特に視床傍室核、菱形核、お よび結合核）は、その上に銀色の粒子を有する多くのニューロンを含有した。さ らに、視床中内側核および視床前背核の両方でニューロンの上に適度に強いハイ ブリダイゼーションシグナルが観察された。視床下部では、外側視床下部核、傍 室核、視索上核、弓状核、および背内側核において、分散したニューロンの上に 適度なレベルのハイブリダイゼーションシグナルが見られた。内側視索前核およ び視交叉上核の両方で、銀粒子の弱いまたは適度の蓄積があった。視交叉上核で は、ハイブリダイゼーションシグナルは主に腹側外側に限定されていた。視床下 部傍室では、陽性のニューロンが、主に内側小細胞性網様部分で観察された。 海馬の歯状回の多形部分のほとんどのニューロンの上に適度のハイブリダイゼ ーションシグナルが見られ、ＣＡ３領域の分散したニューロン上には低レベルが 見られた。扁桃体では、中心核と前皮質核は、適度なレベルのハイブリダイゼー ションシグナルを有するニューロンを含有していた。中脳では、多くの場所でハ イブリダイゼーションシグナルが観察された。最も強いシグナルは、前核および 視蓋オリーブ前核、水道周囲灰白質中のニューロン、および頭側縫線上に見られ た。適度なハイブリダイゼーションシグナルが、上丘の内部灰白層、黒質、緻密 部、背側縫線、および橋核中のニューロンの上に観察された。下丘中のほとんど のニューロンは、低レベルのハイブリダイゼーションシグナルを示した。髄質と 脳橋では、実質的なハイブリダイゼーションシグナルはほとんど見られなかった 。前庭神経内側核は、小細胞性網様核、アルファ部、および巨大細胞性網様核の ように、適度に標識された。 放射能標識したセンスオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした切片 では、ほとんどまたは全くハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった 。さらに重要なことは、トランスフェクションされたＣＯＳ−７細胞では、アン チセンスプローブは、ラットＹ５ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞にの みハイブリダイズしたことである（表１２）。これらの結果は、ラット脳のＹ５ ｍＲＮＡの分布を性状解析するために使用したプローブは、このｍＲＮＡに対 して特異的であり、他の既知のＮＰＹ受容体ｍＲＮＡのいずれともハイブリダイ ズしないことを示している。 Ｙ５選択性化合物によるインビボ試験 前述の報告結果は、摂食行動の制御におけるＹ５受容体の役割を強く支持する 。従って、本出願人は、いくつかの化合物を合成し、クローン化したヒトＹ１、 ヒトＹ２、ヒトＹ４、およびヒトＹ５受容体におけるその化合物の機能的性質を 評価した。表１３に示すように、本出願人は、ヒトＹ５受容体に選択的に結合す るのみでなく、Ｙ５受容体アンタゴニストとしても作用（クローン化したヒトＹ ５受容体で安定にトランスフェクションされたフォルスコリン刺激ＬＭ（ｔｋ− ）細胞でのｃＡＭＰ蓄積の、ＮＰＹ誘導性阻害を阻止する能力により測定）する いくつかの化合物を発見した。そのような化合物の例を図２２に示す。予備的実 験は、化合物２８はＹ５受容体アンタゴニストであることを示している。 これらの化合物を、摂食行動のインビボの動物モデルを用いてさらに試験した 。摂食行動の既知の刺激物質の中でＮＰＹが最も強いため、充分に食餌を与えた ラットのＮＰＹ誘導性摂食行動について、上記化合物の作用を評価するために、 いくつかの化合物で実験を行なった。 まず、化合物賦形剤（１０％ＤＭＳＯ／水）を腹腔内投与投与するとともに、 賦形剤（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｆ．）中の３００ピコモルのブタＮＰＹを脳室内（i.c.v. ）投与し、ＮＰＹ刺激ラットの食物摂取を、賦形剤で処理したラットの食物摂取 と比較した．３００ピコモルのＮＰＹは、食物摂取を有意に誘導した（ｐ＜０． ０５：スチューデント−ニューマン−ケウルス（Ｓtudent-Ｎewman-Ｋeuls）） 。 摂食を刺激するのに有効であることがわかった３００ピコモルのＮＰＹを用い て、他のラットを腹腔内（i.p.）投与で処理し、次に３０〜６０分後ＮＰＹをi. c.v.投与し、そして以後の食物摂取を測定した。表１４に示すように、ＮＰＹ誘 導性食物摂取は、最初に化合物で処理したラットで有意に低下した（ｐ＜０．０ ５；スチューデント−ニューマン−ケウルス（Ｓtudent-Ｎewman-Ｋeuls））。 これらの実験は、ＮＰＹ誘導性食物摂取は、Ｙ５選択性アンタゴニストである化 合物をラットに投与することにより、有意に低下することを示している。 食物欠乏は、視床下部ＮＰＹレベルの上昇を誘導するため、食物欠乏期間後の 食物摂取はＮＰＹ仲介性であると提唱されている。従って、表１３のＹ５アンタ ゴニストを、意識のあるラットに投与した。表１３に示す各ヒトＹ５受容体アン タゴニストは、下記の表１５に示すように、ラットのＮＰＹ誘導性食物摂取を有 意に低下させることができた。試験化合物で処理したラットの食物摂取は、対照 ラット（賦形剤で処理）で測定した食物摂取のパーセントとして示した。すなわ ち、２５％は、試験化合物で処理したラットは、対照ラットのわずか２５％の食 物しか消費しないことを意味する。測定は、試験化合物の投与２時間後に行なっ た。 これらの実験は、本発明の化合物は、特に約０．０１〜約１００mg/kg ラット の範囲を、経口、腹腔内投与または静脈内投与により投与した時、ラットの食物 摂取を阻害することを示す。これらの実験の間ラットは正常であると思われ、摂 食実験の後に、ラットに有害な影響は観察されなかった。 他のクローン化したヒトＧタンパク質結合受容体に関して、化合物の結合性も また評価した。以下の表１６に示すように、前述のＹ５選択性化合物は、Ｙ型受 容体以外の受容体に対して低い親和性を示した。 実験の考察 新規なＮＰＹ受容体サブタイプを単離するために、本出願人は、高特異的ヨウ 素化リガンドを使用する、トランスフェクションされた細胞の表面上に機能性受 容体が鋭敏な感度で実際に検出される発現クローニング法を選択する。この方策 を利用して、本出願人は、新規なＹ型受容体（Ｙ５）をコードするラット視床下 部ｃＤＮＡを同定した。２つのクローンを見い出すために平均２．７kbの挿入断 片の３．５×１０⁶個の独立クローンをスクリーニングする必要があったという 事実により、ｃＤＮＡライブラリー作製方法においてＹ５ ｃＤＮＡクローニン グに対する非常に強い偏りがあったか、またはラットの視床下部組織ではＹ５ｍ ＲＮＡが非常に低レベルで発現するかのいずれかであることがわかる。ラットＹ ５ ｃＤＮＡ（ＣＧ−１８）の最も長い読み取り枠は、５０．１kＤの推定分子 量を持つ４５６アミノ酸タンパク質をコードする。アミノ末端に２つのＮ結合グ リコシル化部位があるとすれば、見掛けの分子量はもう少し大きいであろう。本 出願人は、ヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーからヒトＹ５同族体を単離した。ヒト Ｙ５ ｃＤＮＡ（ＣＧ−１９）の最も長い読み取り枠は、５０kＤの推定分子量 を持つ４５５アミノ酸のタンパク質をコードする。ヒトＹ５受容体は、ラットＹ ５よりも１アミノ酸短く、タンパク質のＮ末端と３番目の細胞内ループの真ん中 の両方に重大なアミノ酸の違いを示す。しかし、７つの膜貫通ドメインおよび細 胞外ループは、実際上同一であり、かつ両方の種の同族体に見い出されるタンパ ク質モチーフは同一である。ヒトおよびラットＹ５受容体は両方とも、その２番 目および３番目の細胞内ループに多くのリン酸化可能部位を有し、そしてこの部 位が、これらの機能的特性の調節に関与しているのであろう。 ラットおよびヒトＹ５受容体は両方とも、１番目の推定膜貫通ドメインにロイ シンジッパーを有する。このような構造において、ロイシン残基の周期的配列を 含有するセグメントは、アルファらせんコンホメーションで存在することが提唱 されている、１つのアルファらせんから伸長するロイシン側鎖は、第２のポリペ プチドの同様なアルファらせんからの側鎖と相互作用して、コイル化コイルの形 成により二量体化を促進する（Ｏ'Ｓheaら,1989）。通常、このようなパターン は、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎのような核ＤＮＡ結合タンパク質 に関 連しているが、いくつかのタンパク質においてはロイシンの繰り返しが単純に二 量体化を促進し、ＤＮＡ結合領域の位置にはほとんど関係ないという可能性があ る。特異的な７つの膜貫通受容体の二量体化が起こりうるという説を指示するさ らなる証拠は、キメラＧタンパク質結合受容体間の分子間「クロストーク（cros s-talk）」が報告（Ｍaggioら，1993）されている、ムスカリン／アドレナリン 受容体の同時発現試験から得られる。膜貫通ドメイン１（ＴＭ Ｉ）のこのロイ シンジッパーの中央部にあるチロシンリン酸化部位は、Ｙ５受容体の二量体化の 調節に関与している可能性がある。Ｇタンパク結合受容体の二量体化の生理学的 意義は解明されていないが、ペプチドホルモン受容体のオリゴマー化との類似に より、これは、受容体活性化およびシグナル伝達に関与するであろう（Ｗells， 1994）。 Ｙ５（ラットおよびヒト）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列解析により、Ｙ １、Ｙ２およびＹ４受容体を含む全部で７つのＴＭ受容体では、通常受容体サブ ファミリー内では高度に保存されている膜貫通ドメイン内でさえ、同一性レベル が低いことが判る。本出願人は、ＣＧ−１８およびＣＧ−１９を、これらのユニ ークなアミノ酸配列(相互に８７.２％同一であり、以前にクローン化された「Ｙ」 受容体サブタイプのＴＭ領域とは≦４２％同一である)および薬理学的プロフィ ールのため、「Ｙ５」受容体と命名した。この名称は、膵臓ポリペプチドファミ リーの他のどのメンバーに対しても片寄らない。「Ｙ」は、Ｙ１およびＹ２受容 体サブタイプの元々に分類に基づいている（Ｗahlestedtら,1987）。この文字は 、１文字アミノ酸コードで「Ｙ」として記載される、Ｃ末端チロシンの膵臓ポリ ペプチドファミリーメンバーにおける保存を反映している。数字は、Ｙ型の一連 のもので次の利用可能なものであり、位置数の３は、薬理学的に定義されたＹ３ 受容体のためにとっておかれている。本出願人は、クローン化ヒトＹ１受容体が 、Ｌarhammarらにより「Ｙ１型のヒト神経ペプチドＹ／ペプチドＹＹ受容体」（ Ｌarhammarら，1992）として紹介されたことを注目している。同様に、本明細書 に記載される新規なクローンは、Ｙ５型のラットおよびヒト神経ペプチドＹ／ペ プチドＹＹ受容体として説明することができる。 ラット視床下部Ｙ５受容体は、ラット視床下部におけるＮＰＹ誘導性食物摂取 を仲介すると考えられる、薬理学的に記載された「非定型」Ｙ１受容体に非常に 類似した薬理学的プロフィールを示す。Ｙ５受容体および「摂食（feeding）受 容体」は、ＮＰＹおよびＰＹＹ様類似体に対する選択性、Ｎ末端ペプチド欠失に 対する感受性およびＰｒｏ³⁴に対する寛容を示す。各々、ＮＰＹ同様に結合し活 性化するＮＰＹ_2-36の変則的な能力を除いて、Ｙ１と同様であると考えらる。各 々、ペプチドリガンドの中央部の変化に敏感であるように見える。例えば、Ｋal raら（1991）による研究により、アミノ−オクタン酸鎖によるＮＰＹ中央領域の 置換によって、摂食行動測定において劇的に活性の低下したＮＰＹ_1-4−Ａｃａ −_25-36が生成することが示された。同様に、本出願人は、ラットＹ５受容体に 対するヒトＰＰ結合（Ｋ_i＝５．０nＭ）およびラットＰＰ結合（Ｋ_i＝２３０） における大きな差が、ペプチドリガンドにおける残基６〜３０の間の一連の８ア ミノ酸変化によるものであり、ヒトＰＰはヒトＮＰＹに対して類似性が高いこと を注目している。また、ラットの摂食を促進することが報告されているＦＭＲＦ アミドペプチドの構造類似体であるＦＬＲＦアミドは、比較的高濃度ではあるが 、ラットＹ５受容体に結合して活性化することができることに注意されたい(Ｏr oscoら，1989)。報告された摂食「調節物質（modulator）」の［Ｄ−Ｔｒｐ³²］ ＮＰＹによるラットＹ５の選択的活性化に関係した、これらの一致するプロフィ ールは、ラット視床下部におけるＮＰＹ誘導性摂食を説明するために最初に提案 された「摂食受容体」としてのラットＹ５の同一性を支持する。ヒトＹ５受容体 が、結合においても機能性アッセイにおいても、ラットＹ５の受容体と同様の薬 理学的プロフィールを有することは、２つの受容体がインビボで類似した機能を 有することを示唆している。 ラット脳におけるＹ５ ｍＲＮＡの分布は、摂食行動におけるＹ５受容体の役 割に関する議論をさらに拡大する。例えば、摂食応答の解剖学的な位置は、少な くとも部分的には視床下部傍室核（ＰＶＮ）に、そして視床下部外側野（latera l hypothalamus）（Ｙ５ ｍＲＮＡが豊富に検出される２つの場所である）にも 存在することが示唆されている。これらの両方の領域におけるＹ５受容体のシナ プス後の局在により、インビボの内因性に放出されるＮＰＹに対する応答を調節 することができる。傍室核は、Ｙ５ ｍＲＮＡが検出されるもう１つの領域であ る弓状核におけるＮＰＹ含有ニューロンからの投射を受ける。このことは、弓状 核−傍室核投射によるＮＰＹ放出の制御における（そして、結果として摂食行動 の制御における）Ｙ５受容体のシナプス前の役割を示している。正中線視床核（ midline thalamic nuclei）におけるＹ５ ｍＲＮＡの局在も重要である。視床 傍室核／中心内側核複合体は、視床下部傍室核および扁桃核に多量に投射する。 このように、Ｙ５受容体は、食欲行動の情動面の基質である。 Ｙ５受容体は、いくつかの研究ラインに基づく、食欲および体重コントロール のための非常に魅力的な標的である（ＳahuおよびＫalra，1993）。ＮＰＹは、 これまでに報告された摂食行動の最も強力な刺激物質である（Ｃlarkら，1984; ＬevineおよびＭorley，1984; ＳtanleyおよびＬeibowitz，1984）。ラットの視 床下部へのＮＰＹの直接注射は、４時間にわたって食物摂取を約１０倍に増加さ せうる（Ｓtanleyら，1992）。ＮＰＹで刺激したラットは、タンパク質や脂肪よ りも炭水化物への好みを示す（Ｓtanleyら，1985）。興味深いことに、ＮＰＹお よびＮＰＹ ｍＲＮＡは、欠食ラット（Ｂradyら，1990;Ｏ'ＳheaおよびＧundla ch，1991）において、さらには遺伝的に肥満のラット（Ｓanacoraら，1990）ま たはストレプトゾトシンでの処理により糖尿病にしたラット（Ｗhiteら，1990） においても増加する。可能性ある１つの説明は、正常ラットにおける摂食行動の 強力な刺激物質であるＮＰＹは、超過重量または糖尿病の動物においては、肥満 に伴って、調節不調となり食物摂取が増大する。肥満の生理学的ストレスにより 、成人型糖尿病の予後の悪化と共に、冠血管機能不全、変形性関節症、および高 インスリン血症のような健康上の問題のリスクが上昇する。したがってＹ５受容 体を標的とする非ペプチド性アンタゴニストは、食欲と体重を制御するだけでな く、肥満−および糖尿病−関連疾患の全範囲を制御する方法として有効であろう （Ｄrydenら，1994）。また、ＮＰＹ介在性機能が、大食症および神経性食思不 振症のような食行動異常において調節不調となり、そのため、これらもＹ５選択 性薬剤による治療に応答性であるということを示唆する神経化学的な証拠もある 。例えば、ＮＰＹ誘導ラットにおける食物摂取は、大食症における食行動耽溺に 関連した大量食物消費によく似ている（Ｓtanley，1993）。ＮＰＹでなくてＰＹ ＹのＣＳＦレベルは、耽溺を断った大食症被験体において上昇し、そして耽溺を 許 すと減少した（Ｂerrettiniら，1988）。逆に、体重不足の食欲不振被験体では ＮＰＹレベルは上昇し、そして体重が正常に戻ると減少した（Ｋayeら，1990） 。 上述のように、ヒトおよびラットのインビトロ発現モデルは、ＮＰＹ依存性摂 食行動を調節することを意図した化合物をスクリーニングするために、組合せて 使用した。この研究方法を使用して、本出願人は、動物モデルにおいて摂食行動 を阻害するいくつかの化合物を発見したが、これらは、さらなる薬剤の発見をも たらすはずである。本発明の化合物は、ズッカー（Ｚucker）肥満ラットにおけ る食物摂取を、特に約０．０１〜約１００mg/kgの範囲で経口、腹腔内または静 脈投与後、阻害する。 Ｙ５薬理学的プロフィールはさらに、全てのＮＰＹ依存性プロセスの分子的基 礎を検討するための新規な基準を提供する：例は表１１にリストする。このよう な検討は、Ｙ５受容体が、摂食行動を超えて生理学的重要性を有するらしいこと を示唆する。例えば、Ｙ型受容体が、インビトロで、非定型Ｙ１の薬理学的プロ フィールにより、ステロイドでプライムしたラットの内側隆起がらの黄体形成ホ ルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）放出を調節することができることが報告された 。ＮＰＹ、ＮＰＹ_2-36、およびＬＰ−ＮＰＹは全て１μＭで有効であったが、Ｎ ＰＹのＮ末端からわずか４アミノ酸の欠失により生物学的活性は消失した。従っ てＹ５は、性的または生殖器疾患の治療標的でありうる。海馬および他の部位の ラットＹ５ ｍＲＮＡの予備的ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、 例えば記憶の調節における、さらなる役割が明らかになる。Ｙ５が、薬理学的プ ロフィールにおいて他のＹ型受容体と類似しているため、Ｙ１、Ｙ２およびＹ４ 受容体の混合集団の中で見落としがちであることは、考慮する価値がある。従っ て、現在これらのサブタイプに関連しているいくつかの機能は、我々の薬理学的 な手段がさらに洗練されると、Ｙ５に割り当て直すこともあろう（表１８）。Ｎ ＰＹ受容体の薬理学への新規な洞察を提供することにより、Ｙ５は、薬剤設計の 分野においてさらなる明快さと焦点を提供する。 Ｙ５受容体に基づく薬剤の設計、または単一のＧタンパク結合受容体サブタイ プを標的とする任意の薬剤のための成功する方策は、候補化合物を、１）放射性 リガンド結合アッセイでスクリーニングして、交差反応性Ｇタンパク結合受容体 に対する親和性を検出し、そして２）生理学的測定法でスクリーニングして、望 ましくない副作用を検出することを含む。Ｙ５選択性薬剤のスクリーニングの具 体的な方法において、交差反応するため放射性リガンド結合スクリーニングにお いて最も重要な受容体サブタイプは、他の「Ｙ型」受容体である、Ｙ１、Ｙ２、 Ｙ３、およびＹ４を含む。Ｙ５と任意の他のサブタイプの間の交差反応性は、表 １７にリストされる病態生理学的適応症により示唆されるような、合併症の可能 性を引き起こす。例えば、肥満および食欲コントロールのためのＹ５アンタゴニ ストを設計する際、高血圧または不安の増大を引き起こすＹ１アンタゴニスト、 記憶喪失を引き起こすＹ２アンタゴニスト、または食欲増進を引き起こすＹ４ア ンタゴニストを設計しないことが重要である。 ヒトおよびラットからのＹ５受容体のクローニングは、ｉｎ ｓｉｔｕ局在化 に基づく受容体の性状解析、アンチセンス機能性ノックアウト、および遺伝子誘 導のために、特に有用である。これらの研究は、Ｙ５受容体機能およびその治療 的意義に関する重要な情報を与える。クローン化されたＹ５受容体は、受容体／ リガンド相互作用をモデル化することが可能な突然変異誘発研究に役立つ。Ｙ５ 受容体により、我々はさらに、相同クローニングにより他のＹ型受容体の可能性 を調べることができる。これらは、ヒトの病態に関連している実験動物モデルの 確立のための、Ｙ５種の同族体のみならず新規な受容体サブタイプも含む。従っ てＹ５受容体は、新規で選択的な薬物療法、詳細には食欲および体重コントロー ルを標的とするだけでなく、記憶喪失、うつ病、不安、胃潰瘍、癲癇発作、疼痛 、高血圧、クモ膜下出血、睡眠障害、鼻うっ血、神経性排尿機能不全、および下 痢の薬物療法を開発するための大きな機会となる。 特に、ラットの食物摂取を阻害するＹ５選択的アンタゴニストの発見は、広範 な脊椎動物の摂食行動を調節する方法を提供する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＦ Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＡＨＮ 39/395 ＡＡＨ 48/00 ＡＡＢ 48/00 ＡＡＢ ＡＡＥ ＡＡＥ ＡＡＫ ＡＡＫ ＡＢＮ ＡＢＮ ＡＢＵ ＡＢＵ ＡＣＬ ＡＣＬ ＡＣＭ ＡＣＭ ＡＣＮ ＡＣＮ ＡＣＲ ＡＣＲ ＡＣＶ ＡＣＶ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/53 Ｙ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＦ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ブランチェック、 テレサ アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07666、ティーネック・スタンディッシ ュ・ロード 518 (72)発明者 ワインシャンク、 リチャード・エル アメリカ合衆国、ニュージャージ州 07666、ティーネック、バンデリンダ・ア ベニュー 268

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の摂食挙動を改善する方法であって、患者に対して、患者による食物 の消費を増大または減少させ、それによって患者の摂食挙動を改善するのに有効 な量の、Ｙ５受容体の作動剤または拮抗剤である化合物を投与することを具備し た方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、前記化合物はＹ５受容体拮抗剤であり、 その量は患者による食物の消費を減少させるのに有効な量である方法。 ３．請求項１または２に記載の方法であって、該化合物は食物と組み合わせて 投与される方法。 ４．請求項１に記載の方法であって、前記化合物はＹ５受容体の作動剤であり 、その量は、患者による食物の消費を増大させるのに有効な量である方法。 ５．請求項１または４に記載の方法であって、前記化合部は食物と組み合わせ て投与される方法。 ６．請求項１に記載の方法であって、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、ヒト 、またはイヌである方法、 ７．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、患者のＹ ５受容体の活性を阻害するのに有効な量の、Ｙ５受容体拮抗剤である非ペプチジ ル化合物を投与することを具備した方法であって、前記化合物のヒト受容体に対 する結合が、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに100ナノモル未満のＫｉに よって特徴付けられる方法。 ８．請求項７に記載の方法であって、前記化合物は50ナノモル未満のＫ_iを有 する方法。 ９．請求項８に記載の方法であって、前記化合物は10ナノモル未満のＫｉを有 する方法。 １０．請求項９に記載の方法であって、他の何れかのヒトＹ型受容体への前記 化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも大 きいＫ_iによって特徴付けられる方法。 １１．請求項９に記載の方法であって、ヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受 容体の夫々に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したと きに10ナノモルよりも大きいＫ_iによって特徴付けられる方法。 １２．請求項１０に記載の方法であって、他の何れかのヒトＹ型受容体に対す る前記化合物の結合は、50ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方 法。 １３．請求項１２に記載の方法であって、他の何れかのヒトＹ型受容体に対す る前記化合物の結合は、100ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる 方法。 １４．請求項７に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対して 、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大き な親和性で結合する方法。 １５．請求項７に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対して 、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和性 の１０倍よりも大きな親和性で結合する方法。 １６．請求項７に記載の方法であって、前記摂食障害は肥満症または過食症(b ulimia)である方法。 １７．請求項７に記載の方法であって、前記患者は脊椎動物、哺乳動物、ヒト またはイヌの患者である方法。 １８．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者 のＹ５受容体の活性を阻害するのに有効な量の、Ｙ５受容体拮抗剤であるペプチ ジル化合物を投与することを具備し、ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合 が、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモル未満のＫｉによって特 徴付けられる方法。 １９．請求項１８に記載の方法であって、前記化合物の結合が１ナノモル未満 のＫ_iによって特徴付けられる方法。 ２０．請求項１８に記載の方法であって、他の何れかのヒトＹ型受容体への前 記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定したときに10ナノモルよりも 大きいＫ_iによって特徴付けられる方法。 ２１．請求項１８に記載の方法であって、ヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４ 受容体の夫々に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下で測定した ときに10ナノモルよりも大きいＫ_iによって特徴付けられる方法。 ２２．請求項２０に記載の方法であって、他の何れかのヒトＹ型受容体に対す る前記化合物の結合は、50ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方 法。 ２３．請求項２２に記載の方法であって、他の何れかのヒトＹ型受容体に対す る前記化合物の結合は、100ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる 方法。 ２４．請求項１８に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大 きな親和性で結合する方法。 ２５．請求項１８に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和 性の１０倍よりも大きな親和性で結合する方法。 ２６．請求項１８に記載の方法であって、前記摂食障害は肥満または過食症で ある方法。 ２７．請求項１８に記載の方法であって、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、 ヒトまたはイヌである方法。 ２８．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者 のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤である非ペプ チジル化合物を投与することを具備し、 （ａ）ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下 で測定したときに100ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられ； （ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−Ｐ ＹＹの存在下で測定したときに1000ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付け られる方法。 ２９．請求項１８に記載の方法であって、ヒトＹ５受容体に対する前記化合物 の結合は、10ナノモル未満のＫｉによって特徴付けられる方法。 ３０．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者 のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤である非ペプ チジル化合物を投与することを具備し、 （ａ）ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下 で測定したときに１ナノモル未満のＫ_iによって特徴付けられ；また （ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−Ｐ ＹＹの存在下で測定したときに100ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付け られる方法。 ３１．請求項２８に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大 きな親和性で結合する。 ３２．請求項２８に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和 性の１０倍よりも大きな親和性で結合する方法。 ３３．請求項２８に記載の方法であって、前記摂食障害は食欲不振である方法 。 ３４．請求項２８に記載の方法であって、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、 ヒトまたはイヌの患者である方法。 ３５．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者 のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペプチ ジル化合物を投与することを具備し、 （ａ）ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下 で測定したときに１ナノモル未満のＫ_iによって特徴付けられ；また （ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−Ｐ ＹＹの存在下で測定したときに25ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けら れる方法。 ３６．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者 のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペプチ ジル化合物を投与することを具備し、 （ａ）ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下 で測定したときに0.1ナノモル未満のＫ_iによって特徴付けられ；また （ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−Ｐ ＹＹの存在下で測定したときに１ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けら れる方法。 ３７．請求項３６に記載の方法であって、当該作動剤の他の何れかのヒトＹ型 受容体に対する結合は、10ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けられる方 法。 ３８．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者 のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペプチ ジル化合物を投与することを具備し、 （ａ）ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下 で測定したときには0.01ナノモル未満のＫ_iによって特徴付けられ；また （ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−Ｐ ＹＹの存在下で測定したときに１ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けら れる方法。 ３９．請求項３５に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大 きな親和性で結合する方法。 ４０．請求項３５に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和 性の１０倍よりも大きな親和性で結合する。 ４１．請求項３５に記載の方法であって、前記摂食障害は食欲不振である方法 。 ４２．請求項３５に記載の方法であって、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、 ヒトまたはイヌである方法。 ４３．Ｙ５受容体をコードする単離された核酸。 ４４．前記核酸はＤＮＡである請求項４３に記載の核酸。 ４５．ｃＤＮＡである請求項４４に記載のＤＮＡ。 ４６．ゲノムＤＮＡである請求項４４に記載のＤＮＡ。 ４７．前記核酸はＲＮＡである請求項４３に記載の核酸。 ４８．請求項４３に記載の核酸であって、前記核酸は脊椎動物Ｙ５受容体をコ ードする核酸。 ４９．請求項４３に記載の核酸であって、前記核酸はほ乳類Ｙ５受容体をコー ドする核酸。 ５０．請求項４３に記載の核酸であって、前記核酸はヒトＹ５受容体をコード する核酸。 ５１．請求項５０に記載の核酸であって、前記核酸は、図６に示したヒトＹ５ 受容体の膜貫通領域におけるアミノ酸配列に対して60％以上の相同性を有する膜 貫通領域のアミノ酸配列に特徴付けられる受容体をコードする核酸。 ５２．請求項５０に記載の核酸であって、前記ヒトＹ５受容体は、図６に示し たアミノ酸配列と実質的に同じ配列を有する核酸。 ５３．請求項５０に記載の核酸であって、前記ヒトＹ５受容体は図６に示した アミノ酸配列を有する核酸。 ５４．請求項４３に記載の核酸であって、該核酸はラットＹ５受容体をコード する核酸。 ５５．請求項５４に記載の核酸であって、前記ラットＹ５受容体は図４に示し たのと実質的に同じアミノ酸配列を有する核酸。 ５６．請求項５４に記載の核酸であって、前記ラットＹ５受容体は図４に示し たアミノ酸配列を有する核酸。 ５７．請求項４３に記載の核酸であって、該核酸はイヌＹ５受容体をコードす る核酸。 ５８．請求項５７に記載の核酸分子であって、前記イヌＹ５受容体は図１５に 示したものと実質的に同じアミノ酸配列を有する核酸分子。 ５９．請求項５７に記載の核酸であって、前記イヌＹ５受容体は図１５に示し たアミノ酸配列を有する核酸。 ６０．精製されたＹ５受容体タンパク。 ６１．請求項４３に記載の核酸を含むベクター。 ６２．請求項５０に記載の核酸を含むベクター。 ６３．請求項５４に記載の核酸を含むベクター。 ６４．請求項５７に記載の核酸を含むベクター。 ６５．バクテリア細胞内での発現に適用される請求項６１に記載のベクターで あって、バクテリア細胞内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコ ードする前記核酸に機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだベク ター。 ６６．酵母細胞内での発現に適用される請求項６１に記載のベクターであって 、酵母細胞内での当該核酸の発現のために必要な、Ｙ５受容体をコードする前記 核酸に機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素をも含んだベクターを提供 する。 ３８．患者における摂食障害を治療する方法であって、患者に対して、該患者 のＹ５受容体の活性を増大するのに有効な量の、Ｙ５受容体作動剤であるペプチ ジル化合物を投与することを具備し、 （ａ）ヒトＹ５受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−ＰＹＹの存在下 で測定したときには0.01ナノモル未満のＫ_iによって特徴付けられ；また （ｂ）他の何れかのヒトＹ型受容体に対する前記化合物の結合は、¹²⁵Ｉ−Ｐ ＹＹの存在下で測定したときに１ナノモルよりも大きいＫｉによって特徴付けら れる方法。 ３９．請求項３５に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物が他の何れかのヒトＹ型受容体に結合する親和性の１０倍よりも大 きな親和性で結合する方法。 ４０．請求項３５に記載の方法であって、前記化合物はヒトＹ５受容体に対し て、該化合物がヒトＹ１、ヒトＹ２およびヒトＹ４受容体の夫々に結合する親和 性の1０倍よりも大きな親和性で結合する。 ４１．請求項３５に記載の方法であって、前記摂食障害は食欲不振である方法 。 ４２．請求項３５に記載の方法であって、前記患者は、脊椎動物、哺乳動物、 ヒトまたはイヌである方法。 ４３．Ｙ５受容体をコードする単離された核酸。 ４４．前記核酸はＤＮＡである請求項４３に記載の核酸。 ７４．哺乳類細胞内での発現に適用される請求項６４に記載のベクターであっ て、哺乳類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、ラットＹ５受容体をコード する前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだベクタ ー。 ７５．プラスミドである、請求項７４に記載のベクター。 ７６．ｐｃＥＸＶ−ｒＹ５（ＡＴＣＣ受付番号第75944号）と命名された請求 項７４に記載のベクター。 ７７．哺乳類細胞内での発現に適用される請求項６４に記載のベクターであっ て、哺乳類細胞内でのＤＮＡの発現のために必要な、イヌＹ５受容体をコードす る前記ＤＮＡに機能的にリンクしてこれを発現させる調節要素を含んだベクター 。 ７８．Ｙ５−ｂｄ−８（ＡＴＣＣ受付番号第 号）と命名された請 求項７７に記載のベクター。 ７９．Ｙ５−ｂｄ−５（ＡＴＣＣ受付番号第 号）と命名された請 求項７７に記載のベクター。 ８０．請求項７０，７１，７４，または７７の何れかに記載のベクターを含む 哺乳類細胞。 ８１．請求項８０に既済の哺乳類細胞であって、前記細胞は非神経起源である 細胞。 ８２．前記哺乳類細胞はＣＯＳ−７細胞である、請求項８０に記載の哺乳類細 胞。 ８３．前記哺乳類細胞はヒト胎児腎臓細胞である、請求項８０に記載の哺乳類 細胞。 ８４．２９３−ｒＹ５−１４（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲＬ11757号）と命名され た請求項８３に記載の細胞。 ８５．前記哺乳類細胞がＮＩＨ−３Ｔ３細胞である、請求項８０に記載の細胞 。 ８６．［名称］と命名された請求項８１に記載の細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲ Ｌ 号）。 ８７．前記哺乳類細胞がＬＭ（ｔｋ−）細胞である、請求項８０に記載の哺乳 類細胞。 ８８．［名称］と命名された請求項８７に記載の細胞（ＡＴＣＣ受付番号ＣＲ Ｌ 号）。 ８９．請求項６７に記載のベクターを含む昆虫細胞。 ９０．前記昆虫細胞がＳｆ９細胞である、請求項８９に記載の昆虫細胞。 ９１．前記昆虫細胞がＳｆ２１細胞である、請求項８９に記載の昆虫細胞。 ９２．請求項８０の細胞から単離された膜調製物。 ９３．請求項４３に記載のＹ５受容体をコードする核酸の配列内に含まれるユ ニークな配列と特異的にハイブリダイズできる少なくとも１５ヌクレオチドの核 酸を含んだ核酸プローブ。 ９４．前記核酸がＤＮＡである、請求項９３に記載の核酸プローブ。 ９５．前記核酸がＲＮＡである、請求項９３に記載の核酸プローブ。 ９６．請求項４７のＹ５受容体をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイ ズして、該ｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる配列を有するアンチセンスオ リゴヌクレオチド。 ９７．請求項４６のゲノムＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズできる配列 を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。 ９８．前記オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたヌクレオチドまたはヌク レオチド類縁体を含む、請求項９６または９７の何れかに記載のアンチセンスオ リゴヌクレオチド。 ９９．請求項４３のＹ５授与言う体に結合することができる抗体。 １００．請求項９９に記載の抗体であって、前記Ｙ５受容体がヒトＹ５受容体 である抗体。 １０１．請求項９９の抗体のＹ５受容体への結合を拮抗的に阻害することがで きる抗体。 １０２．前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項９９に記載の抗体。 １０３．請求項１０２に記載のモノクローナル抗体であって、Ｙ５受容体を発 現する細胞の表面に存在するＹ５受容体のエピトープに向けられたモノクローナ ル抗体。 １０４．細胞膜を通過して細胞内のヒトＹ５受容体をコードするｍＲＮＡと特 異的に結合し、その翻訳を阻止することによってヒトＹ５受容体の活性を低下さ せることができる有効量の請求項９６のオリゴヌクレオチドと、細胞膜を通過で きる薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。 １０５．請求項１０４に記載の薬学的組成物であって、前記オリゴヌクレオチ ドはｍＲＮＡを不活性化する物質に結合されている薬学的組成物。 １０６．請求項１０５に記載の薬学的組成物であって、ｍＲＮＡを不活性化す る前記物質はリボザイムである薬学的組成物。 １０７．請求項１０４に記載の薬学的組成物であって、前記薬学的に許容可能 なキャリアは細胞の受容体に結合する構造を具備し、該受容体は該構造に結合し た後に前記細胞によって取り込まれることができる薬学的組成物。 １０８．請求項１０７に記載の薬学的組成物であって、前記薬学的に許容可能 なキャリアの構造は、選択された細胞タイプに特異的な受容体に結合することが できる薬学的組成物。 １０９．Ｙ５受容体へのリガンドの結合を阻止するのに有効な量の請求項９９ の抗体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含有する薬学的組成物。 １１０．請求項５０のヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡを発現する非ヒト遺 伝子導入哺乳動物。 １１１．相同的組換えによる本来のＹ５受容体のノックアウトを含む、非ヒト 遺伝子導入哺乳動物。 １１２、非ヒト遺伝子導入哺乳動物であって、そのゲノムが、Ｙ５受容体をコ ードするｍＲＮＡに対して相補的で且つＹ５受容体をコードするｍＲＮＡとハイ ブリダイズしてその翻訳を低減するようなアンチセンスｍＲＮＡ中に転写される ように配置された、請求項５０のヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡに対して相 補的なアンチセンスＤＮＡを含む非ヒト遺伝子導入哺乳動物。 １１３．請求項１１０または１１１の何れかに記載の非ヒト遺伝子導入哺乳動 物であって、ヒトＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡが更に誘導性プロモータを 具備する非ヒト遺伝子導入哺乳動物。 １１４．請求項１１０または１１２の何れかに記載の非ヒト遺伝子導入哺乳動 物であって、ヒトＹ５受容体をコードする前記ＤＮＡが、更に組織特異的な調節 要素を具備する非ヒト遺伝子導入哺乳動物。 １１５．前記非ヒト遺伝子導入哺乳動物はマウスである、請求項１２０、１２ １または１２２の何れか１項に記載の非ヒト遺伝子導入哺乳動物。 １１６．或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定する ための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされて これを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガン ド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に 結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンド が前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備し た方法。 １１７．前記Ｙ５受容体はヒトＹ５受容体である、請求項１１６に記載の方法 。 １１８．或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定する ための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされて これを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対してリガン ド類を結合させる条件下において接触させることと、前記Ｙ５受容体に特異的に 結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって前記リガンド が前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定することとを具備し 、このようなＹ５受容体は、図６に示したＹ５受容体の膜貫通領域のアミノ酸配 列に対して60％以上の相同性をもった、膜貫通領域のアミノ酸配列によって特徴 付けられる方法。 １１９．或るリガンドがヒトＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定 するための方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェク トされてこれを発現している細胞と前記リガンドとを、このような受容体に対し てリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、前記ヒトＹ５受容 体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、これによって 前記リガンドが前記ヒトＹ５受容体に対して特異的に結合するかどうかを決定す ることとを具備し、このようなヒトＹ５受容体は図６に湿したのと実質的に同じ アミノ酸配列を有するた方法。 １２０．或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定する ための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされて これを発現している細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜 フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、このよ うな受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させることと、 前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出することと、 これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合するかどうか を決定することとを具備した方法。 １２１．請求項１２０に記載の方法であって、前記Ｙ５受容体はヒトＹ５受容 体である方法。 １２２．本発明は、或るリガンドがＹ５受容体に特異的に結合できるかどうか を決定するための方法であって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェ クトされてこれを発現している細胞から細胞抽出物を調整することと、該細胞抽 出物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドと を、前記Ｙ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させる ことと、前記Ｙ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検出する ことと、これによって前記リガンドが前記Ｙ５受容体に対して特異的に結合する かどうかを決定することとを具備し、このようなＹ５受容体は、図６に示したＹ ５受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列に対して60％以上の相同性をもった、膜貫 通領域のアミノ酸配列によって特徴付けられる方法。 １２３．或るリガンドがヒトＹ５受容体に特異的に結合できるかどうかを決定 するための方法であって、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェク トされてこれを発現している細胞から細胞抽出物を調整することと、該細胞抽出 物から膜フラクションを単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを 、前記ヒトＹ５受容体に対してリガンド類を結合させる条件下において接触させ ることと、前記ヒトＹ５受容体に特異的に結合した何等かのリガンドの存在を検 出することと、これによって前記リガンドが前記ヒトＹ５受容体に対して特異的 に結合するかどうかを決定することとを具備し、このようなヒトＹ５受容体は、 図６に示したのと実質的に同じアミノ酸配列を有する方法を提供する。 １２４．前記リガンドが予め知られていない、請求項１１６，１１７，１１８ ，１１９，１２０，１２１，１２２または１２３の何れか１項に記載の方法。 １２５．請求項１２４の方法によって決定されたリガンド。 １２６．或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるかどうかを決定する方法で あって、Ｙ５受容体をコードする核酸をトランスフェクトされてこれを発現して いる細胞と前記リガンドとを、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接触させるこ とと、Ｙ５受容体活性における機能増大を検出することと、これによって前記リ ガンドがＹ５受容体作動剤であるかどうかを決定することとを具備した方法。 １２７．或るリガンドがＹ５受容体の作動剤であるかどうかを決定する方法で あって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現し ている細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクション を単離することと、該膜フラクションと前記リガンドとを、前記Ｙ５受容体を活 性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体活性における増大を検出する ことと、これによって前記リガンドがＹ５受容体作動剤であるかどうかを決定す ることとを具備した方法。 １２８．請求項１２６または１２７の何れかに記載の方法であって、前記Ｙ５ 受容体がヒトＹ５受容体である方法。 １２９．或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法で あって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現し ている細胞と前記リガンドとを、ＰＹＹのような公知のＹ５受容体作動剤の存在 下において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接触させることと、Ｙ５受容体 活性における低下を検出することと、これによって前記リガンドがＹ５受容体拮 抗剤であるかどうかを決定することとを具備した方法 １３０．或るリガンドがＹ５受容体の拮抗剤であるかどうかを決定する方法で あって、Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされてこれを発現し ている細胞から細胞抽出物を調製することと、該細胞抽出物から膜フラクション を単離することと、該膜フラクションとと前記リガンドとを、ＰＹＹのような公 知のＹ５受容体作動剤の存在下において、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で接 触させることと、Ｙ５受容体活性における低下を検出することと、これによって 前記リガンドがＹ５受容体拮抗剤であるかどうかを決定することとを具備した方 法。 １３１．請求項１２９または１３０に記載の方法であって、前記Ｙ５受容体が ヒトＹ５受容体で或る方法。 １３２．請求項１１６，１１７，１１８，１１９，１２０，１２１，１２２， １２３，１２４，１２６，１２７，１２８，１２９，１２０または１３１の何れ か１項に記載の方法であって、前記細胞が昆虫細胞である方法。 １３３．請求項１１６，１１７，１１８，１１９，１２０，１２１，１２２， １２３，１２４，１２６，１２７，１２８，１２９，１２０または１３１の何れ か１項に記載の方法であって、前記細胞が哺乳類細胞である方法。 １３４．請求項１３３に記載の方法であって、前記細胞が非神経起源である方 法。 １３５．請求項１３４に記載の方法であって、前記非神経起源の細胞は、ＣＯ Ｓ−７細胞、２９３ヒト胎児腎細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、またはＬＭ(ｔｋ−) 細胞である方法。 １３６．請求項１３３に記載の方法であって、前記リガンドは予め既知ではな い方法。 １３７．請求項１３６の方法によって決定されたＹ５リガンド。 １３８．Ｙ５受容体の活性を増大するのに有効な量の請求項１２６または１２ ７の何れかの方法によって決定されたＹ５受容体作動剤と、薬学的に許容可能な キャリアとを含有する薬学的組成物。 １３９．請求項１３８に記載の薬学的組成物であって、前記Ｙ５受容体拮抗剤 は予め知られていない方法。 １４０．Ｙ５受容体の活性を減少させるために有効な量の請求項１２９または １３０の何れかの方法によって決定されたＹ５受容体拮抗剤と、薬学的に許容可 能なキャリアとを含有する薬学的組成物。 １４１．請求項１４０に記載の薬学的組成物であって、前記Ｙ５受容体拮抗剤 は予め知られていない方法。 １４２．Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、該Ｙ５受容 体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングする方法であ って、 (a) Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡを 発現している細胞を、該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られている化合 物と接触させる工程と; (b) 工程(a)の調製物と該Ｙ５受容体に特異的に結合する事が知られていな い複数の化合物とを、該Ｙ５受容体に結合することが知られている化合物の結合 を許容する条件下で接触させる工程と; (c) Ｙ５受容体に結合することが知られている前記化合物の結合が、前記複 数の化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して、前記複数の化合物の存 在下において減少するかどうかを決定する工程と; もしそうであれば、 (d) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物のＹ５受容体に対する結合 を別々に測定し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合する化合物を同定 する工程とを具備する方法。 １４３．本発明は、Ｙ５受容体に特異的に結合する化合物を同定するために、 該Ｙ５受容体に結合することが知られていない複数の化合物をスクリーニングす る方法であって、 (a) Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡを 発現している細胞から細胞抽出物を調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを 単離し、該膜フラクションを前記Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られて いる化合物と接触させる工程と; (b) 工程(a)の調製物と該Ｙ５受容体に特異的に結合することが知られてい ない複数の化合物とを、該Ｙ５受容体に結合することが知られている化合物の結 合を許容する条件下で接触させる工程と; (c) Ｙ５受容体に結合することが知られている化合物の結合が、前記複数の 化合物の非存在下での前記化合物の結合と比較して、前記複数の化合物の存在下 において減少するかどうかを決定する工程と; もしそうであれば、 (d) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物のＹ５受容体に対する結合 を別々に測定し、これによってヒトＹ５受容体と特異的に結合する化合物を同定 する工程とを具備する方法。 １４４．請求項１４２または１４３に記載の方法であって、前記Ｙ５受容体は ヒトＹ５受容体である方法。 １４５．Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物を スクリーニングして、前記Ｙ５受容体を活性化する化合物を同定する方法であっ て、 (a) Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡを 発現している細胞を、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、該Ｙ５受容体に特異 的に結合することが知られていない複数の化合物と接触させる工程と; (b) 前記化合物の存在下で、前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを決 定する工程と; もしそうであれば、 (c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物によって前記Ｙ５受容体の 活性が増大するかどうかを別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体を活性化 する化合物を同定する工程とを具備する方法。 １４６．Ｙ５受容体を活性化することが知られていない複数の化学的化合物を スクリーニングして、前記Ｙ５受容体を活性化する化合物を同定する方法であっ て、 (a) Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡを 発現している細胞から細胞抽出物調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを単 離し、該膜フラクションを、Ｙ５受容体を活性化させる条件下で、該Ｙ５受容体 に特異的に結合することが知られていない複数の化合物と接触させる工程と; (b) 前記化合物の存在下で、前記Ｙ５受容体の活性が増大するかどうかを決 定する工程と; もしそうであれば、 (c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物によって前記Ｙ５受容体の 活性が増大するかどうかを別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体を活性化 する化合物を同定する工程とを具備する方法。 １４７．請求項１４５または１４６に記載の方法であって、前記Ｙ５受容体は ヒトＹ５受容体である方法。 １４８．Ｙ５受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化 合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定す る方法であって、 (a) Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡを 発現している細胞を、公知のＹ５受容体拮抗剤の存在下において、Ｙ５受容体を 活性化させる条件下で、前記複数の化合物に接触させる工程と; (b) 前記Ｙ５受容体の活性化が、前記複数の化合物の非存在下でのＹ５受容 体の活性化に比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを 決定 する工程と; もしそうであれば、 (c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物について、前記Ｙ５受容体 の活性化の阻害を別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体の活性化を阻害す る化合物を同定する工程とを具備する方法。 １４９．Ｙ５受容体の活性化を阻害することが知られていない複数の化学的化 合物をスクリーニングして、前記Ｙ５受容体の活性化を阻害する化合物を同定す る方法であって、 (a) Ｙ５受容体をコードするＤＮＡをトランスフェクトされ且つ該ＤＮＡを 発現している細胞から細胞抽出物を調製し、該細胞抽出物から膜フラクションを 単離し、該膜フラクションを、公知のＹ５受容体拮抗剤の存在下において、Ｙ５ 受容体を活性化させる条件下で、前記複数の化合物に接触させる工程と; (b) 前記Ｙ５受容体の活性化が、前記複数の化合物の非存在下でのＹ５受容 体の活性化に比較して、前記複数の化合物の存在下において減少するかどうかを 決定する工程と; もしそうであれば、 (c) 前記複数の化合物中に含まれる夫々の化合物について、前記Ｙ５受容体 の活性化の阻害を別々に決定し、これによってヒトＹ５受容体の活性化を阻害す る化合物を同定する工程とを具備する方法。 １５０．請求項１４８または１４９に記載の方法であって、前記Ｙ５受容体は ヒトＹ５受容体である方法。 １５１．請求項１４３〜１５０の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞 が哺乳類細胞である方法。 １５２．請求項１５１に記載の方法であって、前記細胞は非神経起源である方 法。 １５３．請求項１５２に記載の方法であって、前記非神経細胞は、ＣＯＳ−７ 細胞、293ヒト胎児腎細胞、ＬＭ(tk−)細胞、またはＮＩＨ−３Ｔ３細胞である 。 １５４．請求項１４７の方法で同定された薬物と、薬学的に許容可能なキャリ アとを含有する薬学的組成物。 １５５．請求項１５０の方法で同定された薬物と、薬学的に許容可能なキャリ アとを含有する薬学的組成物。 １５６．Ｙ５受容体をコードするｍＲＮＡ存在を検出することによりＹ５受容 体の発現を検出する方法であって、細胞から全ｍＲＮＡを得ることと、こうして 得たｍＲＮＡをハイブリダイズ条件下で請求項93の核酸プローブと接触させるこ とと、これによって細胞による前記Ｙ５受容体の発現を検出することとを具備し た方法。 １５７．患者において、Ｙ５受容体の阻害によって緩和される異常を治療する 方法であって、患者に対し、該患者におけるＹ５受容体の活性を低下させ、これ によって患者の異常を治療するために有効な量の、請求項104，105，106，107， 108，109，140，141または155に記載の薬学的組成物を投与することを具備した 方法。 １５８．請求項１５７に記載の方法であって、前記異常は肥満または過食症で ある方法。 本発明は、患者において、Ｙ５受容体の活性化によって緩和される 異常を治療する方法であって、患者に対し、該患者のＹ５受容体を活性化するの に有効な量の上記薬学的組成物を投与することを具備した方法を提供する。 １５９．本発明は、患者において、Ｙ５受容体の活性化によって緩和される異 常を治療する方法であって、患者に対し、患者のＹ５受容体を活性化するために 有効な量のＹ、請求項148，139または154の薬学的組成物を投与することを具備 した方法。 １６０．請求項１５９に記載の方法であって、前記異常症状は食欲不振である 方法。 １６１．細胞表面のヒトＹ５受容体の存在を検出する方法であって、前記細胞 と請求項99の抗体とを、該抗体の当該受容体への結合を可能にする条件下で接触 させることと、前記細胞に結合した前記抗体の存在を検出することと、これによ って前記細胞表面におけるヒトＹ５受容体の存在を検出することとを具備した方 法。 １６２．ヒトＹ５受容体の活性レベルを変化させることの生理学的効果を決定 する方法であって、ヒトＹ５受容体の発現を調節する誘導性プロモータの使用に よりヒトＹ５受容体活性のレベルが変化するような、請求項110の非ヒト遺伝子 導入哺乳動物を製造することを具備した方法。 １６３．ヒトＹ５受容体の活性レベルを変化させることの生理学的効果を決定 する方法であって、夫々が異なった量のヒトＹ５受容体を発現する請求項110の 複数の非ヒト遺伝子導入哺乳動物のパネルを製造することを具備した方法。 １６４．ヒトＹ５受容体の活性を減少させることによって緩和される患者にお ける異常 を緩和することができる拮抗剤を同定するための方法であって、該拮抗剤を請求 項110〜115の何れか1項の非ヒト遺伝子導入動物に投与することと、該物質が、 ヒトＹ５受容体の過剰活性の結果として前記非ヒト遺伝子導入動物の示す生理学 的および挙動的な異常を緩和するかどうかを決定することとを具備し、前記異常 の緩和によって拮抗剤の同定が示される方法。 １６５．請求項１６４の方法によって同定された拮抗剤。 １６６．請求項１６４の方法によって同定された拮抗剤と、薬学的に許容され 得るキャリアとを含有する薬学的組成物。 １６７．ヒトＹ５受容体の活性を減少させることによって緩和される患者の異 常を治療する方法であって、患者に対して、有効量の請求項166の薬学的組成物 を投与し、これによって前記異常を治療することを具備した方法。 １６８．ヒトＹ５受容体の活性を増大させることによって緩和される患者にお ける異常を緩和することができる作動剤を同定するための方法であって、該作動 剤を請求項110〜115の何れか1項の非ヒト遺伝子導入動物に投与することと、該 物質が前記非ヒト遺伝子導入動物の示す生理学的および挙動的な異常を緩和する かどうかを決定することとを具備し、前記異常の緩和によって作動剤の同定が示 される方法。 １６９．請求項１６８の方法によって同定された作動剤。 １７０．請求項１６８の方法によって同定された作動剤と、薬学的に許容され 得るキャリアとを含有する薬学的組成物。 １７１．ヒトＹ５受容体の活性を増大少させることによって緩和される患者の 異常を治療する方法であって、患者に対して、有効量の請求項170の薬学的組成 物を投与し、これによって前記異常を治療することを具備した方法。 １７２．ヒトＹ５受容体対立遺伝子の活性に関連した疾患に対する疾病素因を 診断するための方法であって、 a.該疾患に罹患している患者のＤＮＡを採取する工程と; b.制限酵素類のパネルを用いて、該ＤＮＡの制限消化をおこなう工程と; c.得られたＤＮＡ断片を、サイジングゲル上で電気泳動的に分離する工程と; d.得られたゲルを、ヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡと特異的にハイブ リダイズでき且つ検出可能なマーカーで標識された核酸プローブと接触させる工 程と; e.検出可能なマーカーで標識されたヒトＹ５受容体をコードするＤＮＡと ハイブリダイズした標識バンドを検出して、該疾患に罹患している患者のＤＮＡ に特異的なユニークなバンドを作製する工程と; f.工程a〜eによって、診断用に採取したＤＮＡを調製する工程と; g.工程eで得られた前記疾患に罹患している患者のＤＮＡおよび工程fで得 られた診断用のＤＮＡに特異的なバンドパターンを比較して、両パターンが同一 であるか異なるかを決定し、それによって、もしパターンが同一であれば、当該 疾患の疾病素因ありと診断する工程とを具備した方法。 １７３．請求項１７２に記載の方法であって、特異的なヒトＹ５受容体対立遺 伝子の活性に関連した疾患が診断される方法。 １７４．請求項６０の精製されたＹ５受容体を調製する方法であって、 a.細胞に対して前記Ｙ５受容体の発現を誘導する工程と; b.上記の誘導された細胞から前記受容体を回収する工程と; c.こうして回収された前記受容体を精製する工程とを具備する方法。 １７５．請求項６０の精製されたＹ５受容体を調製する方法であって、 a.Ｙ５受容体をコードする核酸を、適切なベクター中に挿入する工程と; b.得られたベクターを適切なホスト細胞に挿入工程と; c.得られた細胞を、単離されたＹ５受容体を産生させる適切な条件に置く 工程と; d.得られた細胞によって産生された受容体を回収する工程と; e.こうして回収された前記受容体を精製する工程とを具備する方法。