DE69431432T2

DE69431432T2 - Untereinheiten von menschlichen n-methyl-d-aspartat rezeptoren, diese kodierende nukleinsäure und dessen verwendung

Info

Publication number: DE69431432T2
Application number: DE69431432T
Authority: DE
Inventors: Lorrie P. Daggett; Steven B. Ellis; Chen Wang Liaw; Chin-Chun Lu
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1993-04-20
Filing date: 1994-04-20
Publication date: 2003-04-24
Anticipated expiration: 2014-04-21
Also published as: GB9503689D0; EP0696320B1; CA2159106A1; US6956102B2; US6033865A; GB2286188A; US6111091A; ES2182843T3; DE69431432D1; US6864358B2; ATE224952T1; GB2286188B; US5849895A; US20030013866A1; CA2159106C; WO1994024284A1; US20020161215A1; EP0696320A1; US6376660B1; US20020161193A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren und davon kodierte Rezeptorproteine. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodieren für neue humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheiten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung solcher Rezeptoruntereinheiten und zur Verwendung der Rezeptorproteine in Assays, die zur Identifizierung und Charakterisierung von Verbindungen, welche die Funktion solcher Rezeptoren beeinflussen, z. B. Agonisten und Antagonisten von NMDA-Rezeptoren, entwickelt wurden.

Hintergrund der Erfindung

Die Aminosäure L-Glutamat ist ein wichtiger exzitatorischer Neurotransmitter im Zentralnervensystem von Säugern. Anatomische, biochemische und elektrophysiologische Analysen legen nahe, daß glutamaterge Systeme bei einer umfangreichen Reihe von neuronalen Prozessen, einschließlich schneller exzitatorischer synaptischer Transmission, Regulation von Neurotransmitter-Freisetzungen, Langzeit-Verstärkung, Lernen und Gedächtnis, Formbarkeit von Synapsen in der Entwicklung, hypoxisch-ischämischer Schädigung und Neuronenzelltod, epileptischer Anfälle sowie der Pathogenese verschiedener neurodegenerativer Störungen, eine Rolle spielen. Siehe allgemein Monaghan et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 29: 365-402 (1980). Dieses umfangreiche Repertoire von Funktionen, insbesondere derjenigen mit einem Bezug zu Lernen, Neurotoxizität und Neuropathologie, stimulierte jüngere Versuche zur Beschreibung und Feststellung der Mechanismen, über die Glutamat seine Wirkungen ausübt. Karp et al., J. Biol. Chem. 268: 3728-3733 (1993), offenbaren die molekulare Klonierung der Human-NMDAR1-Untereinheit.
Gegenwärtig basieren die Glutamat-Rezeptor-Klassifizierungsschemata auf pharmakologischen Kriterien. Es wurde beobachtet, daß Glutamat seine Wirkungen über Rezeptoren vermittelt, welche in zwei Hauptgruppen eingeteilt wurden: ionotrope und metabotrope. Ionotrope Glutamat-Rezeptoren enthalten integrierte kationenspezifische, ligandengesteuerte Ionenkanäle, wohingegen metabotrope Glutamat-Rezeptoren G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind, welche extrazelluläre Signale über die Aktivierung von intrazellulären sekundären Botenstoff-Systemen weiterleiten. Ionotrope Rezeptoren werden ferner auf Grundlage der pharmakologischen und funktionellen Eigenschaften der Rezeptoren in mindestens zwei Kategorien eingeteilt. Die zwei Haupttypen von ionotropen Rezeptoren sind der N-Methyl-D-asparaginsäure (NMDA)- und der Kainsäure (KA)/α-Amino-3-hydroxy-5- methylisoxazol-4-propionsäure (AMPA)-Rezeptor, früher als Quisqualinsäure- oder QUIS- Rezeptor bezeichnet. Obwohl die metabotropen Rezeptoren an einige derselben Liganden binden, welche an ionotrope Glutamat-Rezeptoren binden, ändern die metabotropen Rezeptoren die Synapsen-Physiologie über GTP-bindende Proteine und sekundäre Botenstoffe wie cyclisches AMP, cyclisches GMP, Diacylglycerin, Inosit-1,4,5-triphosphat und Calcium [Gundersen et al., Proc. R. Soc. London Ser. 221: 127 (1984); Sladeczek et al., Nature 317: 717 (1985); Nicoletti et al., J. Neurosci. 6: 1905 (1986); Sugiyama et al., Nature 325: 531 (1987)].
Die elektrophysiologischen und pharmakologischen Eigenschaften der Glutamat-Rezeptoren wurden unter Verwendung von Tiergeweben und Zellinien sowie rekombinant hergestellten nicht-humanen Rezeptoren als Quelle solcher Rezeptoren untersucht. Der Wert solcher Studien für die Anwendung auf die Entwicklung von Human-Therapeutika war aufgrund der Verfügbarkeit von lediglich nicht-humanen Rezeptoruntereinheiten begrenzt. Darüber hinaus wurden die charakteristischen Eigenschaften und die Struktur von Glutamat-Rezeptoren erst seit kurzem auf der molekularen Ebene untersucht. Der überwiegende Teil solcher Untersuchungen wurde jedoch bei nicht-humanen Spezies durchgeführt. Aufgrund der potentiellen physiologischen und pathologischen Bedeutung von Glutamat-Rezeptoren wäre es wünschenswert (beispielsweise für Arzneiwirkstoff-Screening-Assays), Human-Sequenzen (d. h., DNA, RNA, Proteine) zur Verfügung zu haben, welche für repräsentative Vertreter der verschiedenen Glutamat-Rezeptorsubtypen kodieren. Die Verfügbarkeit solcher Human- Sequenzen wird auch die Untersuchung der Rezeptorverteilung bei Menschen, die Korrelation einer speziellen Rezeptormodifikation mit dem Auftreten verschiedener Krankheitszustände etc. ermöglichen.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung offenbart neue Nukleinsäuren, die für NMDA-Rezeptorproteinuntereinheiten kodieren, und die davon kodierten Proteine. In einer speziellen Ausführungsform kodieren die neuen Nukleinsäuren für die NMDAR1- und NMDAR2-Untereinheiten von humanen NMDA-Rezeptoren. Konkreter kodieren die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren für die NMDAR1-, NMDAR2A-, NMDAR2B-, NMDAR2C- und NMDAR2D-Untereinheiten, welche zur Bildung von NMDA-aktivierten kationenselektiven Ionenkanälen beitragen. Neben dem Nutzen zur Herstellung von NMDA-Rezeptoruntereinheitsproteinen sind diese Nukleinsäuren auch als Sonden von Nutzen und ermöglichen es so Fachleuten ohne übermäßige Versuche, Nukleinsäuren zu identifizieren und zu isolieren, welche für verwandte Rezeptoruntereinheiten kodieren.
Funktionelle Glutamat-Rezeptoren können gemäß der vorliegenden Erfindung aus einer Mehrzahl von NMDA-Rezeptoruntereinheitsproteinen eines Typs (homomer) oder aus Kombinationen von Untereinheitsproteinen verschiedener Typen (heteromer) aufgebaut werden.
Neben der Offenbarung neuer NMDA-Rezeptorproteinuntereinheiten umfaßt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Verwendung solcher Rezeptoruntereinheiten zur Identifizierung und Charakterisierung von Verbindungen, welche die Funktion solcher Rezeptoren beinflussen, z. B. Agonisten, Antagonisten und Modulatoren der Glutamat-Rezeptor-Funktion. Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Feststellung, ob (ein) unbekannte(s) Protein(e) als NMDA-Rezeptoruntereinheit(en) funktionell ist/sind.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine schematische Darstellung verschiedener Human-NMDAR1-Klone der Erfindung mit partiellen Restriktionskarten eines jeden Klons. Die Klone sind vergleichend zugeordnet und die Unterschiede in den DNAs (d. h., Deletionen und Insertionen) bezüglich des Klons NMDA10 sind angezeigt. Translationsinitiations- und -terminationsstellen sind durch ein "V" bzw. ein "*" dargestellt. Insertionen sind als umgekehrte Dreiecke markiert, Deletionen sind durch Leerräume in den Kästchen angezeigt. Die Zahlen über den Insertionen und Deletionen beziehen sich auf die Anzahl der insertierten oder deletierten Nukleotide bezogen auf NMDA10.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung von cDNAs, die für vollständige Human-NMDAR1- Untereinheitssubtypen der Erfindung kodieren, mit partiellen Restriktionskarten einer jeder DNA. Die cDNAs vollständiger Länge sind durch Ligierung entsprechender Abschnitte der in Fig. 1 gezeigten Klone konstruiert. Regionen einer jeden vollständigen cDNA, aufgebaut aus Nukleotidsequenzen, die einem bestimmten Klon entsprechen, sind als ausgefüllte, schraffierte, kreuzschraffierte oder leere Kästchen unterschieden.
Fig. 3 stellt die gesamte Nukleotidsequenz des Konstrukts NMDAR1A (siehe Sequenz-ID-Nr. 1) dar, wobei die folgende Information zum leichteren Vergleich der Splice-Variationen des NMDAR1-Untereinheitstranskripts hinzugefügt ist: Kleinbuchstaben zeigen die 5'-untranslatierte Sequenz und die 3'-untranslatierte Sequenz der in Sequenz-ID-Nr. 1 dargestellten NMDAR1-Splice-Variante an (in einigen der anderen Splice-Varianten ist diese 3'-untranslatierte Sequenz tatsächlich eine kodierende Sequenz); Großbuchstaben zeigen die kodierende Sequenz an; das Translationsinitiationscodon ist durch das Wort "START" identifiziert, wohingegen die drei verschiedenen Translationsterminationscodons (TGA), die in den verschiedenen Splice-Varianten verwendet werden, duirch kleine Kästchen identifiziert sind; signifikante Restriktionsenzymstellen, die zur Herstellung von Varianten-Konstrukten vollständiger Länge verwendet wurden, sind durch ihre Bezeichnung oberhalb der Stellen identifiziert; die Lage einer Insertion von 63 bp (siehe Sequenz-ID-Nr. 3), welche in einigen der Varianten vorliegt, ist als "63 bp INSERT" markiert; Die Nukleotidsequenzen, welche bei einigen der Varianten deletiert sind, sind eingerahmt und als "204 bp DELETION", "363 bp DELETION" und "1087 bp DELETION" markiert.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung verschiedener Human-NMDAR2C-Klone der Erfindung mit partiellen Restriktionskarten eines jeden Klons. Die Klone sind zugeordnet und die Unterschiede in den DNAs bezüglich des Klons NMDA26 sind auf die gleiche Weise wie in Fig. 1 geschehen angezeigt.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung von vollständigen Human-NMDAR2C-Untereinheitssubtypen der Erfindung mit partiellen Restriktionskarten einer jeden DNA. Die cDNAs vollständiger Länge sind durch Ligierung geeigneter Abschnitte der in Fig. 4 gezeigten Klone konstruiert. Die Regionen einer jeden vollständigen cDNA, aufgebaut aus Nukleotidsequenzen, die einem bestimmten Klon entsprechen, sind als ausgefüllte, schraffierte, querschraffierte oder leere Kästchen unterschieden.
Fig. 6 präsentiert Restriktionskarten der Vektoren pCMV-T7-2 und pCMV-T7-3 auf CMV- Promotor-Basis.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nukleinsäuren bereitgestellt, die für (eine) humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit(en) kodieren. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäuren bereitgestellt, die für (eine) NMDA-Rezeptoruntereinheit(en) des NMDAR1-Subtyps Kodieren. In einem weiteren Aspekt werden Nukleinsäuren, die für (eine) Rezeptoruntereinheit(en) des NMDAR2-Subtyps kodieren, bereitgestellt. In einem weiteren Aspekt werden eukaryotische Zellen, die solche Nukleinsäure enthalten, und eukoryotische Zellen, die solche Nukleinsäuren exprimieren, bereitgestellt.
Ebenfalls bereitgestellt werden (ein) Protein (e), kodiert von den oben beschriebenen Nukleinsäuren, sowie gegen das/die Protein(e) gebildete Antikörper. In weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung werden Nukleinsäure-Sonden bereitgestellt, die mindestens NMDA-Rezeptoruntereinheits-selektive Abschnitte der oben beschriebenen Nukleinsäuren umfassen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)- Rezeptoruntereinheit(en)" auf rekombinant hergestellte (d. h., isolierte oder im wesentlichen reine) Proteine, welche an der Bildung eines spannungsempfindlichen kationenselektiven Kanals, der durch Exposition gegenüber NMDA aktiviert wird, beteiligt sind und mindestens eine Transmembran-Domäne, eine große N-terminale extrazelluläre Domäne und dgl. besitzen, einschließlich Varianten davon, die von mRNA kodiert werden, welche durch alternatives Splicing eines primären Transkripts gebildet wurde, und ferner einschließlich Fragmente davon, welche eine oder mehrere der obigen Eigenschaften behalten haben.
Die Verwendung des Begriffs "rekombinant hergestellt", "isoliert" oder "im wesentlichen rein" in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen als Modifikator von DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteinen bedeutet, daß die so bezeichnete(n) DNA, RNA, Polypeptide oder Proteine in solcher Form von Menschenhand hergestellt wurden und somit von ihrer nativen zellulären Umgebung in vivo abgesondert sind. Als Ergebnis dieser menschlichen Intervention sind die rekombinanten DNAs, RNAs, Polypeptide und Proteine der Erfindung auf Weisen nützlich, wie es die DNAs, RNAs, Polypeptide oder Proteine, wie sie natürlich vorkommen, nicht sind, z. B. zur Identifizierung von selektiven Arzneiwirkstoffen oder Verbindungen.
Der Begriff "funktionell", wenn hier als Modifikator von (einem) Rezeptorprotein(en) der vorliegenden Erfindung verwendet, bedeutet, daß die Bindung von NMDA (oder NMDAähnlichen)-Liganden an Rezeptoren, welche das Protein oder die Proteine umfassen, die Öffnung der Rezeptor-"Ionenkanäle" veranlaßt. Dies ermöglicht Kationen, insbesondere Ca²&spplus; sowie Na&spplus; und K&spplus;, sich über die Membran zu bewegen. Anders ausgedrückt, bedeutet "funktionell", daß als Folge der Agonisten-Aktivierung von (einem) Rezeptorprotein(en) ein Signal erzeugt wird.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine Splice-Variante auf die für eine NMDA-Rezeptoruntereinheitsvariante kodierende Nukleinsäure(en), welche durch unterschiedliche Prozessierung eines primären Transkripts oder primärer Transkripte von genomischer DNA gebildet wurde(n), was zur Bildung von mehr als einem mRNA-Typ führt. cDNA, die von einem unterschiedlich prozessierten primären Transkript stammt, wird für NMDA- Rezeptoruntereinheiten kodieren, welche Regionen mit vollständiger Aminosäureidentität und Regionen mit unterschiedlichen Aminosäuresequenzen aufweisen. So kann dieselbe genomische Sequenz zur Bildung von multiplen verwandten mRNAs und Proteinen führen. Die resultierenden mRNAs und Proteine werden hier beide als "Splice-Varianten" bezeichnet.
Demgemäß werden vom Umfang der vorliegenden Erfindung auch DNAs umfaßt, welche für NMDA-Rezeptoruntereinheiten wie oben definiert kodieren, jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes nicht notwendigerweise mit der offenbarten DNA unter bestimmten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Solche Untereinheiten tragen ebenfalls zur Bildung eines funktionellen Rezeptors, wie durch hier beschriebene Verfahren oder Fachleuten bekannten Verfahren beurteilt, mit einer oder mehreren zusätzlichen NMDA- Rezeptoruntereinheit(en) des gleichen oder unterschiedlichen Typs bei (die Anwesenheit zusätzlicher Untereinheiten eines unterschiedlichen Typs ist fakultativ, wenn die Untereinheit eine NMDAR1-Untereinheit ist). Typischerweise werden, sofern nicht eine NMDA- Rezeptoruntereinheit von RNA kodiert wird, welche das Ergebnis eines alternativen Splice- Vorgangs ist (d. h., eine Splice-Variante), die für die NMDA-Rezeptoruntereinheit kodierende DNA und die davon kodierte NMDA-Rezeptoruntereinheit eine wesentliche Sequenzhomologie mit mindestens einer der hier beschriebenen NMDA-Rezeptoruntereinheits-DNAs (und den davon kodierten Proteine) teilen. Es versteht sich, daß DNA oder RNA, die für eine Splice-Variante kodiert, weniger als 90% Gesamtsequenzhomologie zu der hier bereitgestellten DNA oder RNA aufweisen, jedoch Bereiche von nahezu 100%iger Homologie zu einem hier beschriebenen DNA-Fragment einschließen und für einen offenen Leserahmen kodieren kann, der Start- und Stopcodons einschließt und für eine funktionelle NMDA- Rezeptoruntereinheit kodiert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "NMDA-Rezeptoruntereinheit(en) des NMDAR1- Subtyps" auf Proteine, von denen aufgrund einer Hydrophobizitäts-Analyse von abgeleiteten Aminosäuresequenzen angenommen wird, daß sie vier oder mehr mutmaßliche Transmembran-Domänen enthalten, denen eine große extrazelluläre N-terminale Domäne vorausgeht. Die Aminosäuresequenz enthält typischerweise mögliche Phosphorylierungsstellen für Ca²&spplus;/calmodulin-abhängige Proteinkinase Typ II und Proteinkinase C [siehe z. B. Kemp et al. (1990), Trends in Biological Science, Bd. 15: 342-346; Kishimoto et al. (1985), J. Biol. Chem., Bd. 260: 12492-12499; Whittemore et al. (1993), Nature 364: 70-73]. (Diese Proteinkinasen spielen Berichten nach eine wesentliche Rolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung von Langzeit-Verstärkung).
Das mutmaßliche TMII-Segment (d. h., die zweite Transmembran-Domäne) wird typischerweise von einem Glutaminsäurerest auf der extrazellulären Seite und einer Folge von Glutaminsäureresten auf der Zytoplasmaseite flankiert. Dieses Segment enthält einen Asparaginrest, von dem angenommen wird, daß er für die hohe Ca²&spplus;-Permeabilität des NMDAR-Kanals verantwortlich ist. Hinsichtlich einer Zusammenfassung der NMDAR- Eigenschaften siehe Ben-Ari et al. in TINS 15: 333-339 (1992), insbesondere auf S. 334.
Beispielhafte DNA-Sequenzen, welche für humane NMDAR1-Untereinheiten kodieren, werden durch Nukleotide dargestellt, die im wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie in den Sequenz-ID-Nrn. 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2J, 2K, 2L, 2M, 2N oder 2P angegeben. Derzeit bevorzugte Sequenzen kodieren im wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz wie in den Sequenz-ID-Nrn. 2E, 2F, 2G, 2H, 2I oder 2P angegeben.
Alternativ kann eine beispielhafte DNA als diejenigen Nukleotidsequenzen charakterisiert werden, welche für eine humane NMDAR1-Untereinheit kodieren und unter Bedingungen hoher Stringenz mit im wesentlichen der gesamten Sequenz von irgendeiner der Sequenz- ID-Nrn. 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1I, 1J, 1K, 1L, 1M, 1N oder 1P oder wesentlichen Teilen davon (d. h., typischerweise mindestens 25-30 Nukleotiden davon) hybridisieren; vorzugsweise wird eine beispielhafte DNA unter Bedingungen hoher Stringenz mit im wesentlichen der gesamten Sequenz von irgendeiner der Sequenz-ID-Nrn. 1E, 1F, 1G, 1H, 1I oder 1P oder wesentlichen Teilen davon hybridisieren.
Die "Stringenz" der Hybridisierung wird hier verwendet, um auf Bedingungen zu verweisen, unter denen Polynukleinsäure-Hybride stabil sind. Wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, wird die Stabilität von Hybriden durch die Schmelztemperatur (Tm) der Hybride reflektiert. Tm kann durch die folgende Formel abgeschätzt werden:
81.5ºC - 16.6 (log&sub1;&sub0;[Na&spplus;]) + 0,41 (%G + C) - 600/l,
worin I die Länge der Hybride in Nukleotiden ist. Tm nimmt mit jeweils 1% Abnahme der Sequenzhomologie um etwa 1-1,5ºC ab. Im allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen niedrigerer Stringenz durchgeführt, gefolgt von Waschschritten variierender, jedoch höherer Stringenz. Die Bezugnahme auf die Hybridisierungsstringenz bezieht sich auf solche Waschbedingungen. Somit beziehen sich, wie hier verwendet:
(1) Bedingungen HOHER STRINGENZ bezüglich der Fragmenthybridisierung auf Bedingungen, welche eine Hybridisierung nur derjenigen Nukleinsäuresequenzen erlauben, welche stabile Hybride in 0,018 M NaCl bei 65ºC bilden (d. h., falls ein Hybrid in 0,018 M NaCl bei 65ºC nicht stabil ist, wird es unter Bedingungen hoher Stringenz wie hier betrachtet nicht stabil sein). Für Bedingungen hoher Stringenz kann beispielsweise durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 · Denhart's Lösung, 5 · SSPE, 0,2% SDS, bei 42ºC, gefolgt von Waschen in 0,1 · SSPE und 0,1% SDS bei 65ºC, gesorgt werden;
(2) Bedingungen MÄßIGER STRINGENZ bezüglich der Fragmenthybridisierung auf Bedingungen, die einer Hybridisierung in 50% Formamid, 5 · Denhart's Lösung, 5 · SSPE, 0,2% SDS, bei 42ºC, gefolgt von Waschen in 0,2 · SSPE, 0,2% SDS, bei 65ºC, äquivalent sind;
(3) Bedingungen NIEDRIGER STRINGENZ bezüglich der Fragmenthybridisierung auf Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formarnid, 5 · Denhart's Lösung, 6 · SSPE, 0,2% SDS, bei 42ºC, gefolgt von Waschen in 1 · SSPE, 0,2% SDS, bei 50ºC, äquivalent sind; und
(4) Bedingungen HOHER STRINGENZ bezüglich der Hybridisierung von Oligonukleotiden (d. h., synthetische DNA ≤ etwa 30 Nukleotide Länge) auf Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formamid, 5 · Denhart's Lösung, 6 · SSPE, 0,2% SDS, bei 42ºC, gefolgt von Waschen in 1 · SSPE und 0,2% SDS, bei 50ºC äquivalent sind.
Es versteht sich, daß diese Bedingungen unter Einsatz einer Vielfalt von Puffern und Temperaturen reproduziert werden können und daß sie nicht notwendigerweise exakt sind.
Denhart's Lösung und SSPE (siehe z. B. Sambrook, Fritsch und Maniatis in: Molecular Clonina, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt ebenso wie andere geeignete Hybridisierungspuffer. Beispielsweise ist SSPE phosphatgepufferte 0,18 M NaCl, pH 7,4. SSPE kann beispielsweise als 20 · Stammlösung durch Auflösen von 175,3 g NaCl, 27,6 g NaH&sub2;PO&sub4; und 7,4 g EDTA in 800 ml Wasser, Einstellen des pH-Werts auf 7,4 und anschließende Zugabe von Wasser auf 1 Liter hergestellt werden. Denhart's Lösung (siehe Denhart (1966), Biochem. Biophys. Res. Commun. 23: 641) kann beispielsweise als 50 ·-Stammlösung durch Mischen von 5 g Ficoll (Typ 400, Pharmacia LKB Biotechnology, INC., Piscataway, NJ), 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g Rinderserumalbumin (Fraktion V; Sigma, St. Louis, MO), Wasser auf 500 ml und Filtration zur Entfernung von teilchenförmigem Material hergestellt werden.
Besonders bevorzugte Sequenzen sind diejenigen, welche im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz besitzen wie die kodierenden Sequenzen in irgendeiner der Sequenz-ID- Nrn. 1E, 1F, 1G, 1H, 1I, 1J, 1K, 1L, 1M, 1N oder 1P, wobei diejenigen mit im wesentlichen derselben Sequenz wie die kodierende Sequenz in den Sequenz-ID-Nrn. 1, 1E, 1F, 1G, 1H, 1I oder 1P am meisten bevorzugt sind.
Der Begriff "wesentliche Sequenzhomologie", wie hier verwendet, bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, welche mindestens etwa 90% Identität aufweisen, und auf Aminosäuresequenzen, welche typischerweise mehr als 95% Aminosäureidentität aufweisen (> 99% Aminosäureidentität bei NMDAR1-Untereinheiten). Es versteht sich jedoch, daß Proteine (und DNA oder mRNA, die für solche Proteine kodiert), welche weniger als das oben beschriebene Homologieniveau aufweisen, die sich als Splice-Varianten ergeben oder durch konservative Aminosäuresubstitutionen (oder Substitution von degenerierten Codons) modifiziert sind, als vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt betrachtet werden.
Der Begriff "im wesentlichen identisch", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Nukleotidsequenzen von DNA, die Ribonukleotidsequenzen von RNA oder die Aminosäuresequenzen von Proteinen, welche leichte und nicht aufeinanderfolgende Sequenzvariationen der hier offenbarten tatsächlichen Sequenzen aufweisen. Spezies, welche "im wesentlichen identisch sind", werden als äquivalent zu den offenbarten Sequenzen betrachtet und sind somit vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfaßt. In dieser Hinsicht bedeuten "leichte und nicht aufeinanderfolgende Sequenzvariationen", daß Sequenzen, die im wesentlichen identisch mit den hier offenbarten und beanspruchten DNAs, RNAs oder Proteinen sind, funktionell äquivalent zu den offenbarten und beanspruchten Sequenzen humanen Ursprungs sind. Funktionell äquivalente Sequenzen werden im wesentlichen auf dieselbe Weise ihre Funktion ausüben, um im wesentlichen dieselben Zusammensetzungen wie die hier offenbarten und beanspruchten Nukleinsäure- und Aminosäurezusammensetzungen humanen Ursprungs zu erzeugen. Insbesondere kodieren funktionell äquivalente DNAs für Proteine humanen Ursprungs, welche mit den hier offenbarten identisch sind oder konservative Aminosäurevariationen aufweisen, wie z. B. Ersatz eines unpolaren Rests für einen anderen unpolaren Rest oder eines geladenen Rests für einen ähnlich geladenen Rest. Diese Austausche schließen diejenigen ein, die von Fachleuten auf dem Gebiet als solche erkannt werden, welche die Tertiärstruktur des Proteins nicht wesentlich ändern.
Der Begriff "NMDA-Rezeptoruntereinheit(en) des NMDAR2-Subtyps", wie hier verwendet, bezieht sich auf Proteine, welche eine große mutmaßliche extrazelluläre Domäne im aminoterminalen Bereich besitzen. Ansonsten zeigt die abgeleitete Struktur von NMDAR2- Untereinheiten dieselben allgemeinen Eigenschaften wie die NMDAR1-Untereinheitsstruktur. Eine bemerkenswerte typische Ausnahme besteht darin, daß die negativ geladenen Glutaminsäurereste, welche im allgemeinen in dem mutmaßlichen TMII-Segment von NMDAR1-Untereinheiten vorhanden sind, im allgemeinen bei dem TMII-Fragment von NMDAR2 fehlen. Stattdessen können NMDAR2-Untereinheiten einen positiv geladenen Lysinrest in TMII enthalten. Im Gegensatz zu NMDAR1-Untereinheiten bilden NMDAR2- Untereinheiten im allgemeinen keine homomeren NMDA-Rezeptoren. Darüber hinaus sind die Aminosäuresequenzen der Untereinheiten NMDAR1 und NMDAR2 im allgemeinen zu weniger als 50% identisch, wobei Identitäten von weniger 30% typischerweise beobachtet werden.
Die von der vorliegenden Erfindung betrachteten NMDAR2-Untereinheiten schließen die NMDAR2A-, NMDAR2B-, NMDAR2C- und NMDAR2D-Typen von Untereinheiten ein. Beispielhafte DNA-Sequenzen, die für humane NMDAR2A-Untereinheiten oder Teile davon kodieren, werden durch Nukleotide repräsentiert, welche im wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz wie in Sequenz-ID-Nummer 11 angegeben oder im wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie diejenige, welche von dem NMDAR2-kodierenden Abschnitt des Klons NMDA57, bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 75442 hinterlegt, kodiert wird, kodieren.
Der hinterlegte Klon wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852, gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags hinsichtlich der internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke eines Patenterteilungsverfahrens und den gemäß diesem Vertrag bekanntgemachten Regeln hinterlegt. Proben des hinterlegten Materials sind für Patentämter und andere Personen, die gemäß den Bedingungen des Vertrags und der Regeln gesetzlich zu ihrem Empfang ermächtigt sind, jetzt und in Zukunft verfügbar und ansonsten in Übereinstimmung mit den Patentgesetzen und Regelwerken der Vereinigten Staaten von Amerika und aller anderen Nationen oder internationalen Organisationen, bei denen diese Anmeldung oder eine Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht, eingereicht wird oder bei denen irgendein Patent, das auf irgendeiner solchen Anmeldung beruht, erteilt wird. Insbesondere werden nach Erteilung eines US-Patents, das auf dieser Anmeldung oder irgendeiner Anmeldung, welche die Priorität dieser Anmeldung beansprucht oder diese Anmeldung durch eine Bezugnahme einschließt, beruht, alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit des hinterlegten Materials unwiderruflich aufgehoben werden.
Beispielhafte, für eine humane NMDAR2-Untereinheit kodierende DNAs können alternativ charakterisiert werden als diejenigen Nukleotidsequenzen, welche unter Bedingungen hoher Stringenz mit im wesentlichen der gesamten Sequenz von Sequenz-ID-Nr. 10 oder wesentlichen Teilen davon (d. h., typischerweise mindestens 25-30 Nukleotiden davon) oder dem für NMDAR2 kodierenden Abschnitt des Kions NMDA57 (ATCC Hinterlegungs-Nr. 75442) hybridisieren. Besonders bevorzugte Sequenzen, dies für humane NMDAR2A- Untereinheiten kodieren, sind diejenigen, welche im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz aufweisen wie die kodierende Sequenz von Sequenz-ID-Nr. 10, oder diejenigen, welche im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie die kodierende Sequenz in dem für NMDAR2A kodierenden Abschnitt des Klons NMDA57 enthalten.
Beispielhafte DNA-Sequenzen, die für humane NMDAR2B-Untereinheiten kodieren, werden durch Nukleotide repräsentiert, welche im wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz wie in Sequenz-ID-Nr. 14 angegeben kodieren. Beispielhafte DNAs können alternativ als diejenigen Nukleotidsequenzen charakterisiert werden, welche für eine humane NMDAR2B- Untereinheit kodieren und unter Bedingungen hoher Stringenz mit im wesentlichen der gesamten Sequenz von Sequenz-ID-Nr. 13 oder wesentlichen Teilen davon (d. h., typischerweise mindestens 25-30 Nukleotiden davon) hybridisieren. Besonders bevorzugte NMDAR2B kodierende Sequenzen sind diejenigen, welche im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie die kodierende Sequenz in Sequenz-ID-Nr. 13 aufweisen.
Beispielhafte DNA-Sequenzen, die für humane NMDAR2C-Untereinheiten kodieren, werden von Nukleotiden repräsentiert, welche im wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz wie in den Sequenz-ID-Nrn. 6, 6E, 6F, 6G, 6H oder 6I angegeben kodieren.
Beispielhafte DNAs können alternativ charakterisiert werden als diejenigen Nukleotidsequenzen, welche für eine humane NMDAR2C-Untereinheit kodieren und unter Bedingungen hoher Stringenz mit im wesentlichen der gesamten Sequenz irgendeiner der Sequenz-ID- Nrn. 5, 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H oder 5I oder wesentlichen Teilen davon (d. h., typischerweise mindestens 25-30 Nukleotiden davon) hybridisieren; vorzugsweise wird die beispielhafte DNA unter hochstringenten Bedingungen mit im wesentlichen der gesamten Sequenz von irgendeiner der Sequenz-ID-Nrn. 5, 5E, 5F oder 5G oder wesentlichen Teilen davon hybridisieren.
Besonders bevorzugte, für NMDAR2C kodierende Sequenzen sind diejenigen, welche im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz aufweisen wie die kodierenden Sequenzen in irgendeiner der Sequenz-ID-Nrn. 5, 5E, 5F, 5 G, 5H, 5I, wobei diejenigen, welche im wesentlichen dieselbe Sequenz wie die kodierenden Sequenzen in den Sequenz-ID-Nrn. 5, 5E, 5F oder 5G aufweisen, am meisten bevorzugt sind.
Beispielhafte DNA-Sequenzen, die für humane NMDAR2D-Untereinheiten kodieren, werden durch Nukleotide repräsentiert, welche im wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz wie in Sequenz-ID-Nr. 16 angegeben kodieren. Beispielhafte DNAs können alternativ als diejenigen Nukleotidsequenzen charakterisiert werden, welche für eine humane NMDAR2- Untereinheit kodieren und unter hochstringenten Bedingungen mit im wesentlichen der gesamten Sequenz von Sequenz-ID-Nr. 15 oder wesentlichen Teilen davon (d. h., typischerweise mindestens 25-30 Nukleotiden davon) hybridisieren. Besonders bevorzugte, für NMDAR2D kodierende Sequenzen sind diejenigen, welche im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie die kodierende Sequenz in Sequenz-ID-Nr. 15 aufweisen.
DNA, die für humane NMDA-Rezeptoruntereinheiten kodiert, kann durch Screenen von geeigneten humanen cDNA-Banken oder humanen genomischen Banken unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen mit hier offenbarter DNA (einschließlich Nukleotide, die von irgendwelchen der SEQ-ID-Nrn. 1B-1P, 5, 5A-5I, 10, 13 oder 15 abgeleitet sind) isoliert werden. Geeignete Banken können aus Nervengewebeproben, z. B. Hippocampus- und Cerebellum-Gewebe, Zellinien und dergleichen erstellt werden. Beispielsweise kann die Bank mit einem DNA-Abschnitt, welcher im wesentlichen die gesamte für eine Untereinheit kodierende Sequenz davon enthält, gescreent werden oder die Bank kann mit einer geeigneten Sonde gescreent werden.
Wie hier gebraucht, ist eine Sonde einzelsträngige DNA oder RNA, welche eine Sequenz von Nukleotiden aufweist, die mindestens 14 zusammenhängende Basen einschließt, welche dieselben wie beliebige 14 oder mehr zusammenhängende Basen, die in irgendeiner der SEQ-ID-Nrn. 1B-1P, 5, 5A-5I, 10, 13 oder 15 angegeben sind, sind (oder dazu komplementär sind). Bevorzugte Bereiche, aus denen Sonden zu konstruieren sind, schließen 5'- und/oder 3'-kodierende Sequenzen, Sequenzen, von denen vorausgesagt wird, daß sie für Transmembran-Domänen kodieren, Sequenzen, von denen vorausgesagt wird, daß sie für zytoplasmatische Schleifen kodieren, Signalsequenzen, NMDA-Bindungsstellen und dgl. ein.
Entweder die cDNA-Klone vollständiger Länge oder Fragmente davon können als Sonden eingesetzt werden, vorzugsweise mit geeigneten Markierungen zum schnellen Nachweis markiert. Wenn Fragmente als Sonden eingesetzt werden, werden die DNA-Sequenzen vorzugsweise von dem für das Carboxylende kodierenden Abschnitt der DNA stämmen und am meisten bevorzugt werden sie für vorausgesagte Transmembran-Domänen kodierende Abschnitte der DNA-Sequenz einschließen (die Domänen können auf Grundlage einer Hydropathie-Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenz unter Anwendung von beispielsweise des Verfahrens von Kyte und Doolittle (1982), J. Mol. Biol. Bd. 157: 105, vorausgesagt werden). Diese Sonden können zum Beispiel zur Identifizierung und Isolierung weiterer Vertreter der Glutamat-Rezeptorfamilie eingesetzt werden.
Als spezielle Anwendung der erfindungsgemäßen Sequenzen kann ein genetisches Screening unter Verwendung der Nukleotidsequenzen der Erfindung als Sonden durchgeführt werden. So können Nukleinsäure-Proben von Patienten mit neuropathologischen Zuständen, von denen angenommen wird, daß sie eine Veränderung/- Modifizierung irgendeines oder mehrerer der Glutamat-Rezeptoren beinhalten, mit geeigneten Sonden gescreent werden, um festzustellen, ob irgendwelchen Anomalien bezüglich irgendeines der endogenen Glutamat-Rezeptoren vorliegen. Gleichermaßen können Patienten mit einer Familiengeschichte von Krankheitszuständen, die mit einer Glutamat-Rezeptor-Dysfunktion in Beziehung stehen, gescreent werden, um festzustellen, ob sie ebenfalls eine Veranlagung für solche Krankheitszustände besitzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung von DNA, die für (eine) humane N-Methyl-aspartat (NMDA)-Rezeptorprotein- Untereinheit(en) kodiert, bereitgestellt, wobei das Verfahren umfaßt:
Kontaktieren von humaner DNA mit einer Nukleinsäure-Sonde wie oben beschrieben, wobei das Kontaktieren unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, und Identifizieren von DNA(s), welche mit der Sonde hybridisiert(en).
Nach dem Screenen der Bank werden positive Klone durch Nachweis eines Hybridisierungssignals identifiziert, die identifizierten Klone werden durch Restriktionsenzymkartierung und/oder DNA-Sequenzanalyse charakterisiert und dann durch Vergleich mit den hier angegebenen Sequenzen überprüft, um festzustellen, ob sie DNA einschließen, die für eine vollständige NMDA-Rezeptoruntereinheit kodiert (d. h., ob sie Translationsinitiations- und -terminationscodons einschließen). Falls die ausgewählten Klone unvollständig sind, können sie dazu verwendet werden, um die gleiche oder eine andere Bank erneut zu screenen, um überlappende Klone zu erhalten. Falls die Bank eine genomische Bank ist, können die überlappenden Klone Exons und Introns einschließen. Falls die Bank eine cDNA-Bank ist, werden die überlappenden Klone dann einen offenen Leserahmen einschließen. In beiden Fällen können vollständige Klone durch Vergleich mit der DNA und den kodierten Proteinen, die hier bereitgestellt werden, identifiziert werden.
Komplementäre DNA-Klone, kodierend für verschiedene humane NMDA-Rezeptoruntereinheiten (z. B. NMDAR1, NMDAR2A, NMDAR2B, NMDAR2C, NMDAR2D), wurden isoliert. Jeder Untereinheitstyp scheint von einem unterschiedlichen Gen kodiert zu werden. Die hier bereitgestellten DNA-Klone können zur Isolierung von genomischen Klonen, die für jeden Untereinheitstyp kodieren, und zur Isolierung etwaiger Splice-Varianten durch Screenen von Banken, die aus verschiedenen Nervengeweben erstellt wurden, eingesetzt werden. Nukleinsäure-Amplifizierungstechniken, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, können dazu eingesetzt werden, um DNA zu lokalisieren, die für Splice-Varianten von humanen NMDA- Rezeptoruntereinheiten kodiert. Dies wird erreicht, indem Oligonukleotide auf der Basis von DNA-Sequenzen, welche (eine) divergente Sequenz(en) umgeben, als Primer zur Amplifizierung von humaner RNA oder genomischer DNA eingesetzt werden. Größen- und Sequenzbestimmungen der Amplifizierungsprodukte können die Existenz von Splice- Varianten offenbaren. Ferner kann die Isolierung von humanen genomischen DNA- Sequenzen durch Hybridisierung DNA ergeben, die mehrere Exons, getrennt von Introns, enthält, die verschiedenen Splice-Varianten von Transkripten, kodierend für humane NMDA- Rezeptoruntereinheiten, entsprechen.
Es wurde festgestellt, daß nicht alle Untereinheiten (und Varianten davon) in allen Nervengeweben oder allen Teilen des Gehirns exprimiert werden. Somit ist es zur Isolierung von cDNA, die für eine spezielle Untereinheit oder von Splice-Varianten dafür kodiert, bevorzugt, Banken zu screenen, die aus verschiedenen neuronalen oder Nervengeweben erstellt wurden. Bevorzugte Gewebe zur Verwendung als Quelle von Nukleinsäuren zur Erstellung von Banken, um DNA zu erhalten, die für jede Untereinheit kodiert, schließen ein Hippocampus zur Isolierung von Human-NMDAR1-kodierenden DNAs; Hippocampus, Cerebellum und fötales Gehirn zur Isolierung von NMDAR2-kodierenden DNAs und dgl. Sobald die für eine Untereinheit kodierende DNA isoliert wurde, können Ribonuklease (RNase)-Schutz-Assays eingesetzt werden, um festzustellen, welche Gewebe mRNA exprimieren, die für eine(n) spezielle(n) NMDAR-Untereinheitssubtyp oder -variante kodiert. Diese Assays stellen ein empfindliches Mittel zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung einer RNA-Spezies in einer komplexen Mischung von zellulärer Gesamt-RNA bereit. Die Untereinheits-DNA wird markiert und mit zellulärer RNA hybridisiert. Falls komplementäre mRNA in der zellulären RNA vorhanden ist, ergibt sich ein DNA-RNA-Hybrid.
Die RNA-Probe wird dann mit RNase behandelt, welche einzelsträngige RNA abbaut. Etwaige RNA-DNA-Hybride sind vor RNase-Abbau geschützt und können durch Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht werden. In situ-Hybridisierungstechniken können ebenfalls angewandt werden, um festzustellen, welche Gewebe mRNA exprimieren, die für eine bestimmte NMDAR-Untereinheit kodiert. Die markierten Untereinheits-DNAs werden mit verschiedenen Gehirnbereichsschnitten hybridisiert, um die Expression der Untereinheits-mRNA sichtbar zu machen.
Die Verteilung der Expression einiger humaner NMDA-Rezeptoruntereinheiten kann sich von der Verteilung solcher Rezeptoren in der Ratte unterscheiden. Beispielsweise ist RNA, die für die Ratten-NMDAR2C-Untereinheit kodiert, in Ratten-Cerebellum sehr häufig, nicht jedoch in Ratten-Hippocampus [siehe z. B. Monyer et al., Science 256: 1217-1221 (1992)]. Schließlich wurden zahlreiche Human-NMDAR2C-Klone erhalten, allerdings aus einer Human-Hippocampus-Bank. Somit scheint die Verteilung einiger NMDA-Rezeptoruntereinheiten bei Menschen und Ratten unterschiedlich zu sein.
Die oben beschriebenen Nukleotidsequenzen können zur weiteren Manipulation in Vektoren inkorporiert werden. Wie hier verwendet, bezieht sich Vektor (oder Plasmid) auf diskrete Elemente, welche zur Einführung von heterologer DNA in Zellen für entweder deren Expression oder Replikation eingesetzt werden. Die Selektion und Verwendung solcher Vehikel liegt ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmanns.
Ein Expressionsvektor umfaßt Vektoren, die zur Expression von DNAs in der Lage sind, welche funktionsfähig mit regulatorischen Sequenzen, wie z. B. Promotorregionen, verknüpft sind, die zur Bewirkung der Expression solcher DNA-Fragmente imstande sind. Somit bezieht sich ein Expressionsvektor auf ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie z. B. ein Plasmid, ein Phage, rekombinanter Virus oder ein anderer Vektor, der nach Einführung in eine geeignete Wirtszelle zur Expression der klonierten DNA führt. Geeignete Expressionsvektoren sind Fachleuten wohl bekannt und schließen diejenigen ein, welche in eukaryotischen Zeilen und/oder prokayotischen Zellen replizierbar sind, und diejenigen, welche episomal bleiben, oder diejenigen, welche in das Genom der Wirtszelle integrieren. Derzeit bevorzugte Plasmide zur Expression der erfindungsgemäßen NMDA-Rezeptoruntereinheiten in eukaryotischen Wirtszellen, insbesondere Säugerzellen, schließen Vektoren, die einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor enthalten, wie z. B. pCMV-T7-2 oder pCMV-T7-3 (siehe Fig. 6), pMMTVT7(+) oder pMMTVT7(-) (modifizierte Versionen von pMAMneo (Clontech, Palo Alto, CA) hergestellt wie hier beschrieben), pcDNA1 und dgl. ein.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine Promotorregion auf ein DNA-Segment, welches die Transkription von DNA steuert, mit der es funktionsfähig verknüpft ist. Die Promotorregion schließt spezifische Sequenzen ein, welche für die RNA-Polymerase-Erkennung, -Bindung und -Transkriptionsinitiation ausreichend sind. Dieser Teil der Promotorregion wird als Promotor bezeichnet. Darüber hinaus beinhaltet die Promotorregion Sequenzen, welche diese Erkennungs-, Bindungs- und Transkriptionsinitiations-Aktivität von RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können cis-wirkend sein oder können auf trans-wirkende Faktoren ansprechen. Promotoren können je nach Art der Regulation konstitutiv oder reguliert sein. Beispielhafte Promotoren, die zur Verwendung bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen den frühen SV40-Promotor, den Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, den steroid-induzierbaren Maus-Mammatumor-Virus (MMTV)-Promotor, Moloney-Maus-Leukämievirus (MMLV)-Promotor und dgl.
Der Begriff "funktionsfähig verknüpft", wie hier verwendet, bezieht sich auf die funktionelle Beziehung von DNA zu Regulations- und Effektorsequenzen von Nukleotiden, wie z. B. Promotoren, Enhancer, transkriptionale und translationale Stopstellen und andere Signalsequenzen. Beispielsweise bezieht sich die funktionsfähige Verknüpfung von DNA mit einem Promotor auf die physikalische und funktionelle Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, so daß die Transkription einer solchen DNA von dem Promotor durch eine RNA- Polymerase initiiert wird, welche den Promotor spezifisch erkennt und daran bindet und die DNA transkribiert. Zur Optimierung der Expression und/oder in vitro-Transkription kann es erforderlich sein, 5'- und/oder 3'-untranslatierte Abschnitte der Klone zu entfernen, hinzuzufügen oder zu verändern, um zusätzliche, potentiell ungeeignete alternative Translationsinitiationscodons (d. h. Startcodons) oder andere Sequenzen zu eliminieren, welche die Expression entweder auf der Ebene der Transkription oder der Translation stören oder verringern könnten. Alternativ können Consensus-Ribosomen-Bindungsstellen (siehe beispielsweise Kozak (1991), J. Biol. Chem. 266: 19867-1 9870) unmittelbar 5' des Startcodons inseriert werden und können die Expression erhöhen. Gleichermaßen können alternative Codons, welche für dieselbe Aminosäure kodieren, kodierende Sequenzen der NMDAR-Untereinheiten ersetzen, um die Transkription zu erhöhen (beispielsweise kann eine Anpassung an die Codonbevorzugung der Wirtszellen vorgenommen werden, die Anwesenheit von G-C-reichen Domänen verringert werden und dgl.). Ferner kann zur möglicherweise erhöhten Expression von NMDA-Rezeptoruntereinheiten in Amphibien-Oozyten die für die Untereinheit kodierende Sequenz gegebenenfalls in ein Expressionskonstrukt inkorporiert werden, worin die 5'- und 3'-Enden der kodierenden Sequenz an 5'- bzw. 3'-untranslatierte Sequenzen des Xenopus-β-Globingens angrenzen. Beispielsweise können Sequenzen, die für eine NMDA-Rezeptoruntereinheit kodieren, in den Vektor pSP64T (siehe Krieg und Melton (1984) in Nucleic Acids Research 12: 7057-7070), eine modifizierte Form von pSP64 (erhältlich von Promega, Madison, WI) inkorporiert werden. Die kodierende Sequenz wird zwischen dem 5'-Ende des β-Globingens und den 3'-untranslatierten Sequenzen stromabwärts des SP6-Promotors inseriert. In vitro-Transkripte können dann von dem resultierenden Vektor gebildet werden. Die Erwünschtheit (oder der Bedarf nach) einer solchen Modifikation kann empirisch festgestellt werden.
Expression, wie hier verwendet, bezieht sich auf den Prozeß, durch den Polynukleinsäuren in mRNA transkribiert und in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert werden. Falls die Polynukleinsäure von genomischer DNA stammt, kann die Expression das Splicen der mRNA einschließen, falls eine geeignete eukaryotische Wirtszelle oder ein geeigneter eukaryotischer Wirtsorganismus ausgewählt wird.
Besonders bevorzugte Vektoren zur Transfektion von Säugerzellen sind die pSV2dhfr- Expressionsvektoren, welche den frühen SV40-Promotor, das Maus-dhfr-Gen, die SV40- Polyadenylierungs- und -Splicestellen und Sequenzen, die zur Aufrechterhaltung des Vektors in Bakterien erforderlich sind, enthalten, Vektoren auf Basis des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors, wie z. B. pCMV-T7-2 und pCMV-T7-3 (hier beschrieben) oder pCDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), und Vektoren auf Basis des MMTV-Promotors, wie z. B. pMMTVT7(+) oder pMMTV7(-), hier beschrieben.
DNAs vollständiger Länge, die für humane NMDA-Rezeptoruntereinheiten kodieren, wurden in die Vektoren pcDNA1, pMMTVT7(+), pCMV-T7-2 und pCMV-T7-3 inseriert. pCMV-T7-2 ist ein Säugerzell-Expressionsvektor auf pUC19-Basis, welcher den CMV-Promotor/Enhancer, unmittelbar stromabwärts des Promotors gelegene SV40-Splice/Donorstellen, einen stromabwärts der Splicestellen positionierten T7-Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, gefolgt von einem SV40-Polyadenylierungssignal und einem Polylinker zwischen dem T7- Promotor und dem Polyadenylierungssignal, enthält. Die Plazierung der NMDA-Rezeptoruntereinheits-DNA zwischen dem CMV-Promotor und dem SV40-Polyadenylierungssignal sollte für eine konstitutive Expression der fremden DNA in einer Säuger-Wirtszelle, die mit dem Konstrukt transfiziert ist, sorgen. Das Plasmid pCMV-T7-3 ist identisch mit pCMV-T7-2, mit Ausnahme dessen, daß die Reihenfolge der Restriktionsenzymstellen in dem Polylinker umgekehrt ist.
Die Vektoren pMMTVT7(+) und pMMTVT7(-) wurden durch Modifizierung des Vektors pMAMneo (Clontech, Palo Alto, CA) hergestellt. pMAMneo ist ein Säuger-Expressionsvektor, welcher den Enhancer des langen terminalen Repeats (LTR) des Rous-Sarkom-Virus (RSV) verknüpft mit dem dexamethason-induzierbaren Maus-Mammatumor-Virus (MMTV)-LTR- Promotor, gefolgt von SV40-Splice- und -Polyadenylierungsstellen, enthält. pMAMneo enthält auch das E. coli-neo-Gen zur Selektion von Transformanten sowie das β-Lactamasegen (kodierend für ein Protein, welches Ampicillinresistenz verleiht) zur Vermehrung in E. coli.
Der Vektor pMMTVT7(+) kann durch Modifizierung von pMAMneo zur Entfernung des neo- Gens und Insertion der Mehrfachklonierungsstelle und T7- und T3-Promotoren aus pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) gebildet werden. Somit enthält pMMTVT7(+) den RSV-LTR-Enhancer verknüpft mit dem MMTV-LTR-Promotor, einen stromabwärts des MMTV-LTR-Promotors positionierten T7-Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, einen Polylinker, der stromabwärts des T7-Promotors positioniert ist, einen stromabwärts des T7- Promotors positionierten T3-Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor und stromabwärts des T3-Promotors positionierte SV40-Splice- und -Polyadenylierungsstellen. Das β-Lactamasegen (kodierend für ein Protein, welches Ampicillinresistenz verleiht) aus pMAMneo ist in pMMTVT7(+) erhalten, obwohl es in umgekehrter Orientierung bezogen auf die Orientierung in pMAMneo inkorporiert ist.
Der Vektor pMMTVT7(-) ist identisch mit pMMTVT7(+), mit Ausnahme dessen, daß die Positionen der T7- und T3-Promotoren vertauscht sind, d. h., der T3-Promotor in pMMTVT7(-) liegt dort, wo der T7-Promotor in pMMTVT7(+) liegt, und der T7-Promotor in pMMTVT7(-) liegt dort, wo der T3-Promotor in pMMTVT7(+) liegt. Somit enthalten die Vektoren pMMTVT7(+) und pMMTVT7(-) alle regulatorischen Elemente, die zur Expression von heterologer DNA in einer Säuger-Wirtszeile erforderlich sind, wobei die heterologe DNA an dem Polylinker in die Vektoren inkorporiert wurden. Da sich die T7- und T3-Promotoren auf jeweils einer Seite des Polylinkers befinden, können diese Plasmide darüber hinaus zur Synthese von in vitro-Transkripten von heterologer DNA, welche an dem Polylinker in die Vektoren subkloniert wurde, eingesetzt werden.
Zur induzierbaren Expression von für eine humane NMDA-Rezeptoruntereinheit kodierender DNA in einer Säugerzelle kann die DNA in ein Plasmid wie pMMTVT7(+) oder pMMTVT7(-) inseriert werden. Diese Plasmide enthalten den Maus-Mammatumor-Virus (MMTV)-Promotor für die steroid-induzierbare Expression von funktionsfähig verknüpfter fremder DNA. Falls die Wirtszelle keine endogenen Glucocorticoid-Rezeptoren exprimiert, welche zur Aufnahme von Glucocorticoiden (d. h., Induktoren des MMTV-Promotors) in die Zelle benötigt werden, ist es erforderlich, zusätzlich die Zelle mit DNA zu transfizieren, welche für den Glucocorticoid- Rezeptor kodiert (ATCC-Hinterlegungs-Nr. 67200). Zur Synthese von in vitro-Transkripten können Human-DNA-Klone vollständiger Länge, die für Human-NMDAR1, -NMDAR2A, -NMDAR2B, -NMDAR2C und -NMDAR2D kodieren, auch in pIBI24 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), pCMV-T7-2, pCMV-T7-3, pMMTVT7(+), pMMTVT7(-), pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) oder pGEM7Z (Promega, Madison, WI) subkloniert werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zellen bereitgestellt, welche die oben beschriebenen Polynukleinsäuren (d. h., DNA oder mRNA) enthalten. Solche Wirtszellen wie Bakterien-, Hefe- und Säugerzellen können zur Replikation von DNA und zur Produktion von (einer) NMDA-Rezeptoruntereinheit(en) eingesetzt werden. Verfahren zur Beurteilung der Rezeptorexpression und -funktion werden in den PCT- Anmeldungs-Nrn. WO 92/02639 und WO 93/13423 und in den US-Patent-Nrn. 5,401,629 und 5,670,113 beschrieben.
Die Inkorporation von klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, die Transfektion von eukaryotischen Zellen mit einem Plasmidvektor oder einer Kombination von Plasmidvektoren, die jeweils ein oder mehrere unterschiedliche Gene kodieren, oder mit linearer DNA und die Selektion von transfizierten Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt (siehe z. B. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Heterologe DNA kann in Wirtszellen nach irgendeinem Verfahren eingeführt werden, das Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, wie z. B. Transfektion mit einem Vektor, welcher die heterologe DNA kodiert, durch CaPO&sub4;- Präzipitation (siehe z. B. Wigler et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 1373-1376) oder Lipofectamin (GIBCO BRL #18324-012). Rekombinante Zellen können dann unter Bedingungen kultiviert werden, unter denen die von der DIVA kodierte(n) Untereinheit(en) exprimiert wird/werden. Bevorzugte Zellen umfassen Säugerzelien (z. B. HEK293-, CHO-, BHKBI- und Ltk&supmin;-Zellen, Maus-Monozyten-Makrophagen-P388D1- und J774A-1-Zellen (erhältlich von ATCC, Rockville, MD) und dgl.), Hefezellen (z. B. methylotrophe Hefezellen, wie z. B. Pichia pastoris), Bakterienzellen (z. B. Escherichia coli) und dgl.
Obwohl die hier bereitgestellte DNA in irgendeiner eukaryotischen Zelle exprimiert werden kann, einschließlich Hefezellen (wie z. B. P. pastoris (siehe US-Patent-Nrn. 4,882,279, 4,837,148, 4,929,555 und 4,855,231), Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Hansenula polymorpha und dgl.), sind Säuger-Expressionssysteme, einschließlich im Handel erhältlicher Systeme und anderer solcher Systeme, die Fachleuten bekannt sind, zur Expression von DNA, welche für die hier bereitgestellten humanen NMDA-Rezeptoruntereinheiten kodiert, derzeit bevorzugt. Xenopus-Oozyten sind zur Expression von in vitro-RNA- Traraskripten der DNA bevorzugt.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die für eine humane NMDAR-Untereinheit kodierende DNA in einen Vektor ligiert und in geeignete Wirtszellen eingeführt, um transformierte Zellinien zu produzieren, welche einen speziellen humanen NMDA-Rezeptorsubtyp oder spezielle Kombinationen von Untereinheiten exprimieren. Die resultierenden Zellinien können dann in großer Menge zur reproduzierbaren quantitativen Analyse der Wirkungen bekannter oder potentieller Arzneiwirkstoffe auf die Rezeptorfunktion produziert werden. In anderen Ausführungsformen kann mRNA durch in vitro-Transkription von DNA, die für jede Untereinheit kodiert, produziert werden. Diese mRNA, entweder von einem einzelnen Untereinheits-Klon oder von einer Kombination von Klonen, kann dann in Xenopus-Oozyten injiziert werden, wo die mRNA die Synthese der humanen Rezeptoruntereinheiten steuert, welche dann funktionelle Rezeptoren bilden. Alternativ kann die für eine Untereinheit kodierende DNA zur Expression funktioneller Rezeptoren direkt in Oozyten injiziert werden. Die transfizierten Säugerzellen oder injizierten Oozyten können dann in den hier bereitgestellten Verfahren zum Arzneiwirkstoff-Screening eingesetzt werden.
Eukaryotische Zellen, in die DNA oder RNA eingeführt werden kann, schließen beliebige Zellen ein, die mit einer solchen DNA oder RNA transfiziert werden können oder in die eine solche DNA oder RNA injiziert werden kann. Bevorzugte Zellen sind diejenigen, welche vorübergehend oder stabil transfiziert werden können und auch die DNA und RNA exprimieren. Derzeit am meisten bevorzugte Zellen sind diejenigen, welche rekombinante oder heterologe humane NMDA-Rezeptoren bilden können, die eine oder mehrere Untereinheit(en), kodiert von der heterologen DNA, umfassen. Solche Zellen können empirisch identifiziert oder aus denjenigen ausgewählt werden, von clenen bekannt ist, daß sie unschwer transfiziert oder injiziert werden können.
Beispielhafte Zellen zur Einführung von DNA schließen Zellen ein, die von Säugern stammen, (z. B. COS-Zellen, Maus-L-Zellen, Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Human-Embryonen-Nieren (HEK)-Zellen (insbesondere HEK293-Zellen, welche in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann aufgetaut und erneut kultiviert werden können; beispielsweise die im US-Patent Nr. 5,024,939 von Gorman beschriebenen (siehe auch Stillman et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5: 2051-2060)), Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze und andere solche Zellen, die Fachleuten bekannt sind), Amphibienzellen (z. B. Xenopus laevis-Oozyten), Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) und dgl. Beispielhafte Zellen zur Expression von injizierten RNA-Transkripten schließen Xenopus iaevis-Oozyten ein. Zur Transfektion von DNA bevorzugte Zellen sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt oder können empirisch identifiziert werden und umfassen HEK293-Zellen (welche von ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. CRL 1573 erhältlich sind), Ltk&supmin;-Zellen (welche von ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. CCL 1.3 erhältlich sind), COS-7-Zellen (welche von ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. CRL 1651 erhältlich sind) und DG44-Zellen (dhfr&supmin;-CHO-Zellen, siehe z. B. Urlaub et al. (1986), Cell. Molec. Genet. 12: 555). Derzeit bevorzugte Zellen schließen Ltk&supmin; Zellen und DG44-Zellen ein.
DNA kann unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren stabil in Zellen inkorporiert werden oder vorübergehend exprimiert werden. Stabil transfizierte Säugerzellen können hergestellt werden durch Transfektion von Zellen mit einem Expressionsvektor, der ein selektierbares Markergen (z. B. das Gen für Thymidinkinase, Dihydrofolatreduktase, Neomycinresistenz und dgl.) aufweist, und Züchten der transfizierten Zellen unter Bedingungen, welche selektiv für Zellen sind, die das Markergen exprimieren. Zur Herstellung vorübergehender Transfektanten werden Säugerzellen mit einem Reportergen (z. B. dem E. coli-β-Galactosidasegen) transfiziert, um die Transfektionseffizienz zu überprüfen. Selektierbare Markergene sind bei den vorübergehenden Transfektionen nicht eingeschlossen, da die Transfektanten typischerweise nicht unter selektiven Bedingungen gezüchtet werden und gewöhnlich innerhalb weniger Tage nach der Transfektion analysiert werden.
Zur Herstellung solcher stabil oder vorübergehend transfizierter Zellen sollten die Zellen mit einer ausreichenden Konzentration an untereinheits-kodierenden Nukleinsäuren transfiziert werden, um humane NMDA-Rezeptoren zu bilden, welche die von der heterologen DNA kodierten humanen Untereinheiten enthalten. Die genauen Mengen und Verhältnisse von DNA, welche für die Untereinheiten kodiert, kann empirisch bestimmt und für eine spezielle Kombination von Untereinheiten, Zellen und Assaybedingungen optimiert werden. Rekombinante Zellen, welche NMDA-Rezeptoren exprimieren, die Untereinheiten enthalten, die nur von der heterologen DNA oder RNA kodiert werden, sind besonders bevorzugt.
Heterologe DNA kann in der Zelle als episomales Element aufrechterhalten oder in die chromosomale DNA der Zelle integriert werden. Die resultierenden rekombinanten Zellen können dann aus einer solchen Kultur oder einer Subkultur davon kultiviert oder subkultiviert werden (oder, im Falle von Säugerzellen, Passagen unterworfen werden). Verfahren zur Transfektion, Injektion und Kultivierung rekombinanter Zellen sind dem Fachmann bekannt. Gleichermaßen können die humanen NMDA-Rezeptoruntereinheiten unter Anwendung von Proteinreinigungsmethoden, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, gereinigt werden. Beispielsweise können Antikörper oder andere Liganden, welche spezifisch an eine oder mehrere der Untereinheiten binden, zur Affinitätsreinigung und Immunpräzipitation der Untereinheit oder von humanen NMDA-Rezeptoren, welche die Untereinheiten enthalten, eingesetzt werden.
Heterologe oder fremde DNA und RNA, wie hier verwendet, werden austauschbar gebraucht und beziehen sich auf DNA oder RNA, welche nicht natürlicherweise als Teil des Genoms der Zelle vorkommt, in der sie vorliegt, oder auf DNA oder RNA, welche an einer Stelle oder an Stellen in dem Genom gefunden wird, welche sich von derjenigen unterscheidet/en, in der sie in der Natur gefunden wird. Typischerweise bezieht sich heterologe oder fremde DNA und RNA auf DNA oder RNA, welche für die Wirtszelle nicht endogen ist und künstlich in die Zelle eingeführt wurde. Beispiele heterologer DNA schließen DNA ein, die für eine humane NMDA-Rezeptoruntereinheit kodiert, DNA, welche für RNA kodiert, oder Proteine, welche die Expression endogener DNA durch Beeinflussung der Transkription, Translation oder anderer regulierbarer biochemischer Prozesse vermitteln oder verändern, und dgl. Die Zelle, welche heterologe DNA exprimiert, kann DNA enthalten, welche für die gleichen oder verschiedene Expressionsprodukte kodiert. Heterologe DNA braucht nicht exprimiert zu werden und kann in das Wirtszellgenom integriert oder episomal aufrechterhalten werden.
Rekombinante Rezeptoren auf rekombinanten eukaryotischen Zelloberflächen können eine oder mehrere Untereinheit(en) enthalten, die von der DNA oder mRNA, kodierend für humane NMDA-Rezeptoruntereinheiten, kodiert wird/werden, oder kann eine Mischung von Untereinheiten, die von der Wirtszelle kodiert werden, und Untereinheiten, die von heterologer DNA oder mRNA kodiert werden, enthalten. Rekombinante Rezeptoren können homomer sein oder können eine heteromere Kombination mehrerer Untereinheiten sein. Mischungen von DNA oder mRNA, die für Rezeptoren von verschiedenen Spezies, wie z. B. Ratten und Menschen, kodieren, können ebenfalls in die Zellen eingeführt werden. So kann eine Zelle hergestellt werden, welche rekombinante Rezeptoren exprimiert, die nur NMDAR1-Untereinheiten enthalten, oder eine Kombination von irgendeiner oder mehreren NMDAR1- und irgendeiner oder mehreren NMDAR2-Untereinheit(en), die hier zur Verfügung gestellt werden. Beispielsweise können NMDAR1-Untereinheiten der vorliegenden Erfindung zusammen mit den Rezeptoruntereinheiten NMDAR2A, NMDAR2B, NMDAR2C und/oder NMDAR2D exprimiert werden. Spezielle Beispiele von heteromeren Kombinationen rekombinanter humaner NMDAR-Untereinheiten, welche in Xenopus-Oozyten exprimiert wurden, schließen NMDAR1 + NMDAR2A, NMDAR1 + NMDAR2B und NMDAR1 + NMDAR2A + NMDAR2C (siehe Beispiel 9) ein.
Die DNA, mRNA, Vektoren, Rezeptoruntereinheiten, Rezeptoruntereinheitskombinationen und Zellen, die hier bereitgestellt werden, erlauben die Herstellung ausgewählter NMDA- Rezeptoruntereinheiten und spezifischer Kombinationen davon, sowie von Antikörpern gegen die Rezeptoruntereinheiten. Dies bietet ein Mittel zur Herstellung synthetischer oder rekombinanter Rezeptoren und Rezeptoruntereinheiten, welche im wesentlichen frei von Kontamination mit vielen anderen Rezeptorproteinen sind, deren Anwesenheit die Analyse eines einzelnen NMDA-Rezeptorsubtyps stören kann. Die Verfügbarkeit gewünschter Rezeptorsubtypen ermöglicht es, die Wirkung eines Arzneiwirkstoffes auf einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder eine Kombination von NMDA-Rezeptoruntereinheiten zu beobachten und dadurch zunächst ein in vitro-Screening des Arzneiwirkstoffes in einem Testsystem vorzunehmen, welches spezifisch für Menschen ist und spezifisch für einen humanen NMDA-Rezeptorsubtyp oder eine Kombination von NMDA-Rezeptoruntereinheiten. Die Verfügbarkeit von spezifischen Antikörpern ermöglicht es, die Untereinheitskombinationen zu identifizieren, die in vivo exprimiert werden. Solche spezifischen Kombinationen können dann als bevorzugte Ziele beim Arzneiwirkstoff-Screening eingesetzt werden.
Das Vermögen zum Screenen von Arzneiwirkstoffen in vitro zur Bestimmung der Wirkung des Arzneiwirkstoffs auf spezifische Rezeptorzusammensetzungen sollte die Entwicklung und das Screening von rezeptorsubtyp-spezifischen oder krankheits-spezifischen Arzneiwirkstoffen erlauben. Auch das Testen einzelner Rezeptoruntereinheiten oder spezifischer Kombinationen verschiedener Typen von Rezeptoruntereinheiten mit einer Vielfalt potentieller Agonisten oder Antagonisten liefert zusätzliche Informationen bezüglich der Funktion und Aktivität der individuellen Untereinheiten und sollte zur Identifizierung und Entwicklung von Verbindungen führen, welche zu einer sehr spezifischen Wechselwirkung mit einem oder mehreren Typ(en) von Rezeptoruntereinheiten oder Rezeptorsubtypen in der Lage sind. Die resultierenden Arzneiwirkstoffe sollten weniger unerwünschte Nebenwirkungen als Arzneiwirkstoffe aufweisen, welche durch Screenen mit Zellen identifiziert wurden, die eine Vielfalt von Rezeptorsubtypen exprimieren.
In Bezug auf Arzneiwirkstoffentwicklung und therapeutische Behandlung verschiedener Krankheitszustände ermöglicht ferner die Verfügbarkeit von DNAs; die für humane NMDA- Rezeptoruntereinheiten kodieren, die Identifizierung irgendwelcher Veränderungen in solchen Genen (z. B. Mutationen), welche mit dem Auftreten bestimmer Krankheitszustände korrelieren können. Darüber hinaus wird die Schaffung von Tiermodellen für solche Krankheitszustände möglich, indem spezifisch solche Mutationen in synthetische DNA- Sequenzen eingeführt werden, welche dann in Labortiere oder in vitro-Assay-Systeme eingeführt werden können, um deren Wirkungen festzustellen.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung funktionelle Peptidfragmente und funktionelle Kombinationen davon, die von den DNAs der Erfindung kodiert werden. Solche funktionellen Peptidfragmente können von Fachleuten ohne übermäßige Versuche hergestellt werden, indem einige oder alle Aminosäuren in der Sequenz eliminiert werden, welche für die Funktion des Peptids als Glutamat-Rezeptor nicht essentiell sind. Eine Bestimmung der Aminosäuren, welche für die Glutamat-Rezeptor-Funktion essentiell sind, erfolgt beispielsweise durch systematische Verdauung der DNAs, welche für die Peptide kodieren, und/oder die Einführung von Deletionen in die DNAs. Die modifizierten (z. B. deletierten oder verdauten) DNAs werden beispielsweise exprimiert, indem die DNA transkribiert wird und dann die resultierende mRNA in Xenopus-Oozyten eingeführt wird, wo die Translation der mRNAs stattfinden wird. Eine Funktionsanalyse der so in den Oozyten exprimierten Proteine erfolgt durch Exposition der Oozyten gegenüber Liganden, die bekanntermaßen an Glutamat- Rezeptoren binden und diese funktionell aktivieren, und anschließende Überprüfung der Oozyten, um zu beobachten, ob die exprimierten Fragmente einen Ionenkanal oder Ionenkanäle bilden. Falls ein Ionenkanal oder Ionenkanäle nachgewiesen wird/werden, sind die Fragmente als Glutamat-Rezeptoren funktionell.
Das oben beschriebene Verfahren kann in Gegenwart von NMDAR1-ähnlichen Rezeptoruntereinheiten allein oder in Gegenwart von Kombinationen von NMDAR1-ähnlichen und NMDAR2-ähnlichen Rezeptoruntereinheiten durchgeführt werden. So ist beispielsweise, wenn das getestete Protein eine NMDAR2-ähnliche Rezeptoruntereinheit ist, die zusätzliche Untereinheit vorzugsweise eine NMDAR1-ähnliche Untereinheit.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Identifizierung von Verbindungen, welche an humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit(en) binden, wobei das Verfahrenden Einsatz von Rezeptorproteinen der Erfindung in einem Konkurrenz-Bindungsassay umfaßt. Ein solcher Assay kann das schnelle Screening einer großen Anzahl von Verbindungen ermöglichen, um festzustellen, welche Verbindungen, falls überhaupt, in der Lage sind, an NMDA-Rezeptoren zu binden. Anschließend können detailliertere Assays mit denjenigen Verbindungen, bei denen eine Bindung festgestellt wurde, durchgeführt werden, um weiter festzustellen, ob solche Verbindungen als Modulatoren, Agonisten oder Antagonisten der erfindungsgemäßen Rezeptoren wirken.
Eine weitere Anwendung des Bindungsassays der Erfindung ist der Assay von Testproben (z. B. biologischen Flüssigkeiten) hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit von Rezeptoren der vorliegenden Erfindung. So kann beispielsweise Serum von einem Patienten, der Symptome zeigt, die in Bezug zu einer Dysfunktion des glutamatergen Stoffwechselwegs stehen, untersucht werden, um festzustellen, ob die beobachteten Symptome vielleicht durch eine Über- oder Unterproduktion eines solchen Rezeptors oder solcher Rezeptoren verursacht wird.
Die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Bindungsassays können auf vielfältige Weise durchgeführt werden, wie von Fachleuten auf dem Gebiet ohne weiteres festgestellt werden kann. Beispielsweise können Konkurrenz-Bindungsassays, z. B. Radiorezeptor-Assays, und dgl. eingesetzt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Bioassay zur Identifizierung von Verbindungen bereitgestellt, welche die Aktivität von humanen NMDA- Rezeptoren der Erfindung modulieren, wobei der Bioassay umfaßt:
(a) Exposition von Zellen, die für humane NMDA-Rezeptoruntereinheit(en) kodierende DNA enthalten, wobei die Zellen funktionelle NMDA-Rezeptoren exprimieren, gegenüber mindestens einer Verbindung, deren Vermögen zur Modulierung der Ionenkanalaktivität dieser Rezeptoren festgestellt werden soll, und danach
(b) Überprüfung der Zellen hinsichtlich Veränderungen der Ionenkanalaktivität. Der oben beschriebene Bioassay ermöglicht die Identifizierung von Agonisten und Antagonisten für humane NMDA-Rezeptoren. Gemäß diesem Verfahren werden rekombinante NMDA-Rezeptoren mit einer "unbekannten" oder Testsubstanz (in der weiteren Anwesenheit eines bekannten NMDA-Agonisten, falls die Antagonisten-Aktivität getestet wird) in Kontakt gebracht, die Ionenkanalaktivität des bekannten Glutamat- Rezeptors wird anschließend an den Kontakt mit der "unbekannten" oder Testsubstanz überprüft und diejenigen Substanzen, welche die Ionenkanalreaktion des/der bekannten Glutamat-Rezeptoren(s) erhöhen oder verringern, werden als funktionelle Liganden (d. h., Modulatoren, Agonisten oder Antagonisten) für humane NMDA-Rezeptoren identifiziert.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können rekombinanten humanen NMDA-Rezeptor exprimierende Säugerzellen oder Oozyten mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden und die modulierende Wirkung(en) davon kann/können dann durch Vergleich der NMDA-Rezeptor-vermittelten Reaktion in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung oder durch Vergleich der Reaktion von Testzellen oder Kontrollzellen (d. h., Zellen, welche keine NMDA-Rezeptoren exprimieren) auf die Anwesenheit der Verbindung beurteilt werden.
Eine Verbindung oder ein Signal, welche(s) "die Aktivität eines NMDA-Rezeptors moduliert", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Verbindung oder ein Signal, welche(s) die Aktivität von NMDA-Rezeptoren so verändert, daß die Aktivität des NMDA-Rezeptors in Gegenwart der Verbindung oder des Signals anders ist als in Abwesenheit der Verbindung oder des Signals. Insbesondere schließen solche Verbindungen oder Signale Agonisten und Antagonisten ein. Der Begriff "Agonist" bezieht sich auf eine Substanz oder ein Signal, z. B. NMDA, welche(s) die Rezeptorfunktion aktiviert, und der Begriff "Antagonist" bezieht sich auf eine Substanz, welche die Rezeptorfunktion stört. Typischerweise wird die Wirkung eines Antagonisten als Blockierung der Aktivierung durch einen Agonisten beobachtet. Antagonisten schließen kompetitive und nicht-kompetitive Antagonisten ein. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitiver Blocker) wechselwirkt mit oder in der Nähe der Stelle, die für den Agonisten spezifisch ist (z. B. Ligand oder Neurotransmitter). Ein nicht-kompetitiver Antagonist oder Blocker inaktiviert die Funktion des Rezeptors durch Wechselwirkung mit einer anderen Stelle als der Stelle, die mit dem Agonisten wechselwirkt.
Wie für Fachleute auf dem Gebiet ersichtlich, erfordern Assay-Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Human-NMDA-Rezeptor-Aktivität modulieren (z. B. Agonisten und Antagonisten) im allgemeinen den Vergleich mit einer Kontrolle. Ein Typ einer "Kontroll"- zelle oder "Kontroll"kultur ist eine Zelle oder Kultur, die im wesentlichen genauso wie die Zelle oder Kultur behandelt wird, die der Testverbindung ausgesetzt wird, mit Ausnahme dessen, daß die Kontrollkultur nicht der Testverbindung ausgesetzt wird. Beispielsweise kann bei Verfahren, welche elektrophysiologische Spannungsklammer-Prozeduren verwenden, dieselbe Zelle in Gegenwart und Abwesenheit der Testverbindung getestet werden, indem lediglich die äußere Badlösung der Zelle ausgetauscht wird. Ein weiterer Typ von "Kontroll"zelle oder "Kontroll"kultur kann eine Zelle oder eine Kultur von Zellen sein, die mit den transfizierten Zellen identisch ist, mit Ausnahme dessen, daß die für die Kontrollkultur eingesetzten Zellen keine fuktionellen humanen NMDA-Rezeptoruntereinheiten exprimieren. In diesem Fall wird die Reaktion der Testzelle auf die Testverbindung mit der Reaktion (oder mangelnden Reaktion) von rezeptor-negativen (Kontroll)zeilen auf die Testverbindung verglichen, wenn Zellen oder Kulturen eines jeden Zelltyps im wesentlichen denselben Reaktionsbedingungen in Gegenwart der zu untersuchenden Verbindung ausgesetzt werden.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Ionenkanalaktivität von humanen N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoren moduliert werden, indem solche Rezeptoren mit einer wirksamen Menge von mindestens einer Verbindung, die mit dem oben beschriebenen Bioassay identifiziert wurde, in Kontakt gebracht werden.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Antikörper bereitgestellt, welche gegen die oben beschrieben Rezeptorproteine gebildet wurden. Solche Antikörper können zur Untersuchung der Rezeptor-Gewebelokalisierung, Untereinheitszusammensetzung, Struktur funktioneller Domänen sowie bei diagnostischen Anwendungen, therapeutischen Anwendungen und dgl. eingesetzt werden. Vorzugsweise werden für therapeutische Anwendungen die eingesetzten Antikörper monoklonale Antikörper sein.
Die oben beschriebenen Antikörper können unter Anwendung von Standandtechniken, wie sie Fachleuten wohlbekannt sind, unter Verwendung der Rezeptorproteine der Erfindung oder Teilen davon als Antigene für die Antikörperproduktion hergestellt werden. Sowohl Anti-Peptid- als auch Anti-Fusionsprotein-Antikörper können eingesetzt werden [siehe beispielsweise Bahouth et al. (1991), Trends Pharmacol Sci. Bd. 12: 338-343; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg.), John Wiley and Sons, New York (1989)]. Faktoren, welche bei der Auswahl von Teilen der NMDAR-Untereinheiten zur Verwendung als Immunogen (entweder als synthetisches Peptid oder ein rekombinant produziertes bakterielles Fusionsprotein) zu berücksichtigen sind, schließen Antigenizität, Zugänglichkeit (d. h., extrazelluläre und zytoplasmatische Domänen), Einzigartigkeit für die spezielle Untereinheit etc. ein.
Die Verfügbarkeit von untereinheits-spezifischen Antikörpern ermöglicht die Anwendung der Technik der Immunhistochemie zur Überwachung der Verteilung und Expressionsdichte verschiedener Untereinheiten (z. B. in normalem gegenüber krankheitsbetroffenem Gehirn gewebe). Solche Antikörper könnten auch für diagnostische und therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.
Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren bereitgestellt zur Modulierung der Ionenkanalaktivität eines Rezeptors oder von Rezeptoren der Erfindung durch Kontaktieren des Rezeptors bzw. der Rezeptoren mit einer wirksamen Menge der oben beschriebenen Antikörper.
Die Antikörper der Erfindung können einem Individuum unter Anwendung von Standardverfahren, wie z. B. durch intraperitoneale, intramuskuläre, intravenöse oder subkutane Injektion, ein Implantat oder transdermale Verabreichungswege und dgl., verabreicht werden. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann unschwer Dosierungsformen, Behandlungspläne etc. in Abhängigkeit von dem eingesetzten Verabreichungsmodus festlegen.
Die Erfindung wird nun detaillierter durch Bezugnahme auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele beschrieben werden.

BEISPIEL 1

Isolierung von DNA, die für humane NMDA-Rezeptor-NMDAR1-Untereinheiten kodiert

A. cDNA-Bank-Screening

Aus Human-Hippocampusgewebe isolierte RNA wurde als Matrize für die Synthese von oligo-dT-geprimter und statistisch geprimter einzelsträngiger cDNA nach Standardverfahren [siehe beispielsweise Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] eingesetzt. Die einzelsträngige cDNA wurde in doppelsträngige cDNA überführt und EcoRI/SnaBI/XhoI-Adapter wurden deren Enden hinzugefügt. Die cDNAs wurden mit Hilfe von Agarosegelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt und diejenigen, welche > 2,0 kb waren, wurden in mit EcoRI verdaute λgt10-Bakteriophagenvektoren ligiert. Die resultierende cDNA-Bank wurde durch Replikation eines jeden Klons durch limitierte Infektion eines bakteriellen Wirts amplifiziert und bei -70ºC gelagert.
Die amplifizierte, oligo-dT-geprimte Hippocampus-cDNA-Bank würde später aus dem Lager geholt und 1 · 10&sup6; Rekombinanten wurden hinsichtlich Hybridisierung mit Oligonukleotiden gescreent, die den Nukleotiden 96-128 (SE7) und Nukleotiden 2576-2609 (SE8) der Ratten- NMDAR1A-Rezeptor-cDNA entsprachen (siehe Moriyoshi et al. (1991), Nature 354: 31). Die Hybridisierung wurde bei 42ºC in 6 · SSPE, 5 · Denhart's Lösung, 10% Formamid, 0,2% SDS und 200 ug/ml Heringssperma-DNA durchgeführt. Die Waschungen erfolgten in 1 · SSPE und 0,2% SDS bei 50ºC. Hybridisierende Klone (z. B. NMDA1-3) wurden identifiziert. Diese Klone hybridisierten mit SE8, nicht jedoch mit SE7.
Eine statistisch geprimte, primäre Human-Hippocampus-cDNA-Bank (~ 2 · 10&sup5; Rekombinante, hergestellt durch Auswahl von lediglich cDNAs > 2,0 kb für den Einschluß in die Bank) wurde unter denselben Bedingungen hinsichtlich Hybridisierung mit dem Oligonukleotid SE8 und einem Oligonukleotid, das den Nukleotiden 129-141 der Ratten- NMDAR1A-Rezeptor-cDNA entsprach, (SE11) gescreent. Fünf hybridisierende Klone, welche mit SE8 und nicht mit SE11 hybridisierten, wurden identifiziert: NMDA5-7 und NMDA10-11.

B. Charakterisierung von Klonen

Die Klone wurden plaquegereinigt und durch Restriktionsenzymkartierung und DNA- Sequenzanalyse der Inserts charakterisiert. Einer der Klone, NMDA11, (siehe Sequenz-ID- Nr. 1B hinsichtlich einer Beschreibung eines Abschnitts von NMDA11) ist eine vollständige cDNA (d. h., sie enthält Translationsinitiations- und -terminationscodons), die für eine vollständige NMDAR1-Untereinheit kodiert. Die restlichen Klone sind partielle cDNAs. Die Klone NMDA2, NMDA3 (siehe Sequenz-ID-Nr. 1D), NMDA5, NMDA6, NMDA7 (siehe Sequenz-ID-Nr. 1C) und NMDA10 (siehe Sequenz-ID-Nr. 1A hinsichtlich einer Beschreibung eines Abschnitts von NMDA10) enthalten ein Translationsterminationscodon, ihnen fehlen jedoch Nukleotide am 5'-Ende der kodierenden Sequenz.
Die Charakterisierung der Klone offenbarte, daß die isolierten cDNAs verschiedenen alternativ gespliceten Formen des Human-NMDAR1-Untereinheitstranskripts entsprechen. Die vier Typen von alternativem Splicing, welche durch die Klone repräsentiert werden, sind schematisch in Fig. 1 dargestellt. Der Klon NMDA10 (dem 5'-untranslatierte Sequenzen sowie 60 Nukleotide des 5'-Ende der kodierenden Sequenz fehlen) wird als Referenz eingesetzt, mit dem die anderen Varianten verglichen werden. Dem Klon NMDA11 fehlen 363 Nukleotide (im 3'-Abschnitt des Klons), die in NMDA10 vorhanden sind. Diese 363- Nukleotid-Deletion zerstört nicht den Leserahmen des Transkripts, sie führt jedoch zu einem anderen Terminationscodon. Die letzten 69 Nukleotide der kodierenden Sequenz von NMDA11 entsprechen 3'-untranslatierter Sequenz des Klons NMDA10 (d. h., den Nukleotiden 3325-3393 von Sequenz-ID-Nr. 1). Dem Klon NMDA7 fehlt dieselbe Sequenz von 363 Nukleotiden, die bei NMDA11 deletiert ist, jedoch fehlen NMDA7 ferner 204 Nukleotide am 5'-Ende, die in NMDA10 und NMDA11 vorhanden sind. Diese 204-Nukleotid-Deletion zerstört ebenfalls nicht den Leserahmen des Trariskripts. Darüber hinaus enthält NMDA7 eine Insertion von 63 Nukleotiden im Leserahmen am 5'-Ende, bezogen auf NMDA10 und NMDA11. Die letzten 69 Basenpaare der kodierenden Sequenz von NMDA7 entsprechen 3'-untranslatierter Sequenz von NMDA10 (d. h., den Nukleotiden 3325-3393 von Sequenz-ID- Nr. 1) Dem Klon NMDA3 fehlt 1087 Basenpaare am 3'-Ende, die in NMDA10 vorhanden sind. Diese 1087-Basenpaar-Deletion zerstört nicht den Leserahmen des Transkripts, sie führt jedoch zu einem anderen Terminationscodon. Die letzten 231 Basenpaare der kodierenden Sequenz von NMDA3 entsprechen 3'-untranslatierter Sequenz des Klons NMDA10 (d. h., den Nukleotiden 4049-4279 in Sequenz-ID-Nr. 1).

BEISPIEL 2

Herstellung von NMDAR1-Untereinheits-cDNA-Konstrukten vollständiger Länge

Abschnitte der Klone NMDA10, NMDA11, NMDA7 und NMDA3 wurden zusammenligiert, um cDNAs vollständiger Länge zu konstruieren, welche für Varianten der NMDA-Rezeptos- NMDAR1-Untereinheit kodieren. Die vollständigen NMDAR1-Untereinheits-eDNAs wurden in dem Vektor pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA) inkorporiert, zur Verwendung für die Expression der Rezeptoruntereinheiten in Säuger-Wirtszellen und zur Verwendung bei der Erzeugung von in vitro-Transkripten der DNAs zur Expression in Xenopus-Oozyten.
Der Vektor pcDNA1 ist ein Plasmid auf pUC19-Basis, welches die folgenden Elemente in der 5'-zu-3'-Reihenfolge enthält: den "immediate early gene"-Promotor/Enhancer des Cytomegalovirus (CMV), den RNA Polymerase-Promotor des Bakteriophagen T7, einen Polylinker, den RNA Polymerase-Promotor des Bakteriophagen SP6, SV40-RNA-Prozessierungs (d. h., Splice-Donor/Acceptor)-Signale, das SV40-Polyadenylierungssignal und den ColE1- Ursprung und supF-Suppressor-tRNA, um die Aufrechterhaltung des Vektors in Escherichia coli-Stämmen mit dem P3-Episom zu erlauben. Dieser Vektor enthält somit alle erforderlichen regulatorischen Elemente für die Expression von heterologer DNA in einer Säuger- Wiriszelle, wobei die heterologe DNA an dem Polylinker in den Vektor inkorporiert wurde. Darüber hinaus kann dieses Plasmid, nachdem sich die T7- und SP6-Promotoren auf jeweils einer Seite des Polylinkers befinden, dieses Plasmid zur Synthese von in vitro-Transkripten von heterologer DNA, welche an dem Polylinker in den Vektor subkloniert wurde, eingesetzt werden.

A. NMDAR1A

Das NMDAR1A-Konstrukt vollständiger Länge wurde hergestellt durch Ligierung eines 5'- Abschnittes von NMDA11 (5' des Translationsinitiationscodons beginnend und bis zu der HindIII-Stelle in der Mitte des Klons reichend) und eines 3'-Abschnitts von NMDA10 (an der HindIII-Stelle in der Mitte des Klons beginnend und bis 3' des Translationsterminationscodons reichend) wie in Fig. 2 dargestellt. Die beiden DNA-Fragmente wurden in dem Säuger-Expressionsvektor pcDNA1 verbunden.
Zunächst beinhaltete die Strategie zur Herstellung des NMDAR1-Konstrukts einen ersten Schritt der separaten Subklonierung des gesamten 4,0-kb-EcoRI-Insert-Fragments von NMDA10 und des gesamten 4,0-kb-SnaBI-Insert-Fragments von NMDA11 in pcDNA1; jedoch waren die beiden Versuche unter Anwendung dieser Klonierungsstrategie nicht erfolgreich. Es schien, daß es eine Selektion gegen E. coli-Wirte, welche die vollständigen Insert-Fragmente behielten, gegeben haben könnte, da die überlebenden rekombinanten E. coli, welche analysiert wurden, unvollständige Insert-cDNAs enthielten, von denen Nukleotide deletiert worden waren. Deshalb war es erforderlich, das NMDAR1A-Konstrukt vollständiger Länge durch Subklonierung und Kombination verschiedener Fragmente von NMDA10 und NMDA11 in pcDNA1 wie folgt in mehreren Schritten herzustellen (siehe Fig. 3 hinsichtlich Positionen von Restriktionsenzymstellen).
Der Klon NMDA10 wurde mit Bg/II und EcoRI verdaut und das ~3,3-kb-Fragment, welches die Nukleotide 1020-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, wurde isoliert und in BamHI/EcoRI- verdauten peDNA1 subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit HindIII und NheI verdaut und das Fragment, welches die Nukleotide 2137-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus einen Abschnitt von pcDNA1 enthielt, wurde isoliert.
Der Klon NMDA11 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und das 4,1-kb-Fragment, welches die Nukleotide 1-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, wurde isoliert und in EcoRI/HindIII- verdauten modifizierten pcDNA1 (modifiziert durch Deletion der HindIII-Stelle, die 5' der EcoRI-Stelle im Polylinker liegt, und Addition einer HindIII-Stelle in dem Polylinker an einer Position 3' der EcoRI-Stelle) subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit NheI und HindIII verdaut und das Fragment, welches die Nukleotide 1-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus einen Abschnitt des modifizierten pcDNA1 enthielt, wurde isoliert. Dieses NheI/HindIII- Fragment wurde dann mit dem HindIII/NheI-Fragment ligiert, welches die Nukleotide 2137- 4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, um das Konstrukt NMDAR1A vollständiger Länge zu bilden (siehe Fig. 2). Die Ligierungsmischung wurde zur Transformation des E. coli-Stammes MC1061/P3 verwendet. Nachdem die NheI-Stelle in pcDNA1 innerhalb des supF-Selektionsgens auftritt, waren nur E. coli, die das korrekt ligierte, vollständige NMDAR1A-Plasmid (welches das vollständige funktionelle Selektionsgen besitzt) enthielten, in der Lage, den Selektionsprozeß zu überleben. Diese Fragment-Subklonierungsstrategie ermöglichte die Selektion der gewünschten, das richtige NMDAR1A enthaltenden E. coli-Wirtszellen, obwohl die Gesamtzahl solcher rekombinanten Wirtszellen klein war.
Zusammenfassend, das Konstrukt NMDAR1A enthält 261 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz von NMDAR11 (Nukleotide 1-261 von Sequenz-ID-Nr. 1) und eine vollständige kodierende Sequenz (Nukleotide 262-3078 von Sequenz-ID-Nr. 1) für die NMDAR1A- Variante der NMDAR1-Untereinheit sowie 1220 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 3079-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1). Die für NMDAR1A kodierende Sequenz ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pcDNA1 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.
B. NMDAR1-Δ363
Das Konstrukt NMDAR1-Δ363 vollständiger Länge wurde clurch Ligierung eines 5'-Abschnitts von NMDA11 (5' des Translationsinitiationscodons beginnend und bis zur HindIII- Stelle in der Mitte des Klons reichend, d. h., die Nukleotide 1-2136 in Sequenz-ID-Nr. 1) und eines 3'-Abschnitts von NMDA11 (an der HindIII-Stelle in der Mitte des Klons beginnend und bis 3' des Translationsterminationscodons reichend, d. h., die Nukleotide 2137-2961 und 3325-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1) hergestellt. Wie oben beschrieben, war es aufgrund der Schwierigkeit bei der direkten Subklonierung des gesamten 4,0-kb-SnaBI-NMDA11-Inserts in pcDNA1 erforderlich, das Konstrukt durch Ligierung von zwei Fragmenten des NMDA11- Inserts in pcDNA1 wie folgt herzustellen (siehe Fig. 3 hinsichtlich der Positionen der Restriktionsenzymstellen).
Zum Erhalt des 5'-NMDA11-Fragments wurde der Klon NMDA11 mit EcoRI und HindIII verdaut und das ~2,2-kb-Fragment, welches die Nukleotide 1-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, wurde isoliert und in EcoRI/HindIII-verdauten modifizierten pcDNA1 (modifiziert wie oben beschrieben) subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit NheI und HindIII verdaut und das Fragment, welches die Nukleotide 1-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus einen Abschnitt von modifiziertem peDNA1 enthielt, wurde isoliert.
Zum Erhalt des 3'-NMDA11-Fragments wurde der Klon NMDA11 mit Bg/II und EcoRI verdaut und das 3,0-kb-Fragment, welches die Nukleotide 1020-2961 und 3325-4298 von Sequenz- ID-Nr. 1 enthielt, wurde isoliert und in BamHI/EcoRI-verdauten pcDNA1 subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit NindIII und NheI verdaut und das Fragment, welches die Nukleotide 2137-2961 und 3325-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus einen Abschnitt von pcDNA1 enthielt, wurde isoliert. Dieses HindIII/NheI-Fragment wurde dann mit dem NheI/HindIII-Fragment, welches die Nukleotide 1-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, ligiert, um NMDAR1-Δ363 zu bilden.
Zusammenfassend, das Konstrukt NMDAR1-Δ363 enthält 261 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-261 von Sequenz-ID-Nr. 1) und eine vollständige kodierende Sequenz für die NMDAR1-Δ363-Variante der NMDAR1-Untereinheit (Nukleotide 262-2961 und 3325-3393 von Sequenz-ID-Nr. 1) sowie 905 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 3394-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1). Somit unterscheidet sich NMDAR1- Δ363 von NMDAR1 darin, daß ihm 363 Nukleotide (Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID- Nr. 1) fehlen, welche die letzten 117 Nukleotide der kodierenden Sequenz und die ersten 246 Nukleotide der 3'-untranslatierten Sequenz von NMDAR1 umfassen. Die für die NMDAR1-Δ363-Untereinheitsvariante kodierende Sequenz ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pcDNA1 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.

C. NMDAR1-Δ1087

Das Konstrukt NMDAR1-Δ1087 vollständiger Länge wurde durch Ersatz des 3'-Endes des für die NMDAR1-Variante kodierenden Inserts von NMDAR1-Δ363 durch ein Fragment vom 3' Ende des Klons NMDA3 (siehe Fig. 2) hergestellt. Das Plasmid NMDAR1-Δ363 wurde partiell mit PstI verdaut und vollständig mit XbaI verdaut. Es gibt eine PstI-Stelle ~112 Nukleotide stromaufwärts der Position der 363-Nukleotid-Deletion in NMDAR1-Δ363 und eine XbaI-Stelle in dem Polylinker stromabwärts der 3'-untranslatierten Sequenz von NMDAR1-Δ363 (siehe Fig. 3). Somit führt die PstI/XbaI-Verdauung von NMDAR1-Δ363 zur Entfernung eines Fragments, welches die Nukleotide 2850-2961 und 3325-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthält, aus dem Vektor. Das größere Fragment wurde aus dem Verdau isoliert.
Das Insert des Klons NMDAR3 wurde in die EcoRI-Restriktionsstelle(n) von pGEM (Promega, Madison, WI) kloniert und das resultierende Plasmid wurde mit PstI und XbaI verdaut. Das kleinere Fragment, welches die Nukleotide 2850-2961 und 4049-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, wurde isoliert und mit dem größeren Fragment aus dem PstI/XbaI- Verdau von NMDAR1-Δ363 ligiert. Das resultierende Konstrukt wurde als NMDAR1-Δ1087 bezeichnet.
Zusammenfassend, NMDAR1-Δ1087 enthält 261 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-261 in Sequenz-ID-Nr. 1), die vollständige kodierende Sequenz für die NMDAR1-Δ1087-Variante der NMDAR1-Untereinheit (Nukleotide 262-2961 und 4049- 4279 von Sequenz-ID-Nr. 1) und 19 Basenpaare von 3' untranslatierter Sequenz (Nukleotide 4280-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1). Somit unterscheidet sich NMDAR1-Δ1087 von NMDAR1 darin, daß ihm 1087 Nukleotide (Nukleotide 2962-4048 von Sequenz-ID-Nr. 1) fehlen, welche die fetzten 117 Nukleotide der kodierenden Sequenz und die ersten 970 Nukleotide der 3'-untranslatierten Sequenz von NMDAR1 umfassen. Die für die NMDAR1-Δ1087- Untereinheitsvariante kodierende Sequenz ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pcDNA1 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.

D. NMDAR1-I63-Δ204

Das Konstrukt NMDAR1-I63-Δ204 vollständiger Länge wurde hergestellt durch Ersatz eines 1399-Nukleotid-Fragments des Konstrukts NMDAR1A (d. h., die Nukleotide 738-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1) durch das PvuII-HindIII-Fragment von NMDA7 (d. h., die Nukleotide 738- 831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus die Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 und die Nukleotide 832-984 und 1189-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1) wie in Fig. 2 dargestellt. Nachdem es mehrere PvuII-Stellen in dem NMDAR1-Konstrukt gibt, war zur Konstruktion von NMDAR1- I63-Δ204 ein mehrstufiges Verfahren wie folgt erforderlich (siehe Fig. 3 hinsichtlich der Lage von Restriktionsenzymstellen).
Das ~2,2-kb-EcoRI-HindIII-Fragment, das aus dem Konstrukt NMDAR1A isoliert wurde und die Nukleotide 1-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthält, wurde mit dem modifizierten pcDNA1 (modifiziert wie in Beispiel 2A beschrieben) ligiert, welcher mit EcoRI und HindIII verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde mit AvrII verdaut und selbstligiert, um zwei PvuII-Stellen von einem Abschnitt des Plasmids zu entfernen, der von pcDNA1 beigesteuert worden war. Das Plasmid wurde dann partiell mit PvuII verdaut und vollständig mit HindIII verdaut. Der Verdau wurde mit einem PvuII-HindIII-Fragment von 1258 Nukleotiden verdaut, das aus dem Klon NMDA7 isoliert worden war. Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung NMDAR1-I63-Δ204-5' wurde mit BamHI und HindIII verdaut und das ~2-kb- Fragment, welches die Nukleotide 1-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus die Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 und die Nukleotide 832-984 und 1189-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, wurde isoliert und mit BamHI/HindIII-verdautem NMDAR1 ligiert, um NMDAR1-I63-Δ204 zu bilden.
NMDAR1-I63-Δ204 enthält 261 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1- 261 in Sequenz-ID-Nr. 1), die vollständige kodierende Sequenz für die NMDAR1-I63-Δ204- Variante der NMDAR1-Untereinheit (Nukleotide 262-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus die Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 und die Nukleotide 832-984 und 1189-3078 von Sequenz-ID-Nr. 1) und 1220 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 3079- 4298 von Sequenz-ID-Nr. 1). Somit unterscheidet sich NMDAR1-I63-Δ204 von NMDAR1 darin, daß es 63 Nukleotide enthält, die in NMDAR1 nicht vorhanden sind (Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3), lokalisiert zwischen den Nukleotiden 831 und 832 von Sequenz-ID- Nr. 1. Ferner fehlen NMDAR1-I63-Δ204 204 Nukleotide, die in NMDAR1 vorhanden sind (Nukieotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1). Die Sequenz, welche für die NMDAR1-I63- Δ204-Untereinheitsvariante kodiert, ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pcDNA1 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.

E. NMDAR1-I63

Das Konstrukt NMDAR1-I63 vollständiger Länge kann als NMDAR1 beschrieben werden, worin ein 173-bp-Fragment (Nukleotide 738-910 von Sequenz-ID-Nr. 1) durch das 236-bp- PvuII-SmaI-Fragment von NMDA7 (Nukleotide 738-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 und Nukleotide 832-910 von Sequenz-ID-Nr. 1) ersetzt ist. Nachdem es mehrere PvuII-Stellen in dem NMDAR1-Konstrukt gibt, war für die Konstruktion von NMDAR1-I63 ein mehrstufiges Verfahren wie folgt erforderlich. Das Plasmid NMDAR1- I63-Δ204-5' wurde partiell mit SmaI verdaut und vollständig mit HindIII verdaut. Das größere Vektorfragment wurde mit dem 1226-bp-SmaI/Hind-III-Fragment ligiert, welches aus NMDA11 isoliert worden war (Nukleotide 911-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1). Der resultierende Vektor wurde mit BamHI und HindIII verdaut und das ~2,2-kb-Fragment, welches die Nukleotide 1-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus die Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 und die Nukleotide 832-2136 von Sequenz-ID-Nr. 1 enthielt, wurde isoliert und mit BamHI/HindIII- verdautem NMDAR1 ligiert, um NMDAR1-I63 zu bilden.
NMDAR1-I63 enthält 261 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-261 in Sequenz-ID-Nr. 1), die vollständige kodierende Sequenz für die NMDAR1-I63-Variante der NMDAR1-Untereinheit (Nukleotide 262-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus die Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 und Nukleotide 832-3078 von Sequenz-ID-Nr. 1) und 1220 Nukleotide von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 3079-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1). Somit unterscheidet sich NMDAR1-I63 von NMDAR1 darin, daß es 63 Nukleotide enthält, die in NMDAR1 nicht vorhanden sind (Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3), lokalisiert zwischen den Nukleotiden 831 und 832 von Sequenz-ID-Nr. 1. Die Sequenz, welche für die NMDAR1- I63-Untereinheitsvariante kodiert, ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pcDNA1 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.

F. NMDAR1-I63-Δ204-Δ363

Das Konstrukt NMDAR1-I63-Δ204-Δ363 vollständiger Länge wurde hergestellt durch Ersatz des 2861-Nukleotid-Fragments aus dem Konstrukt NMDAR1-I63-Δ204 (d. h., die Nukleotide 1438-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1) durch das KpnI-XbaI (Polylinker-Stelle)-Fragment von NMDAR1-Δ363 (d. h., die Nukleotide 1438-2961 und 3325-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1) wie in Fig. 2 dargestellt. Das NMDAR1-I63-Δ204 wurde vollständig mit XbaI verdaut, dann aufgrund der Anwesenheit von zwei zusätzlichen KpnI-Stellen in der Vektorsequenz partiell mit KpnI verdaut. Das resultierende NMDAR1-I63-Δ204-5'-Fragment, welches die pcDNA1- Vektorsequenzen einschließt, wurde mit dem KpnI-XbaI-3'-Fragment aus NMDAR1-Δ363 ligiert, um NMDAR1-I63-Δ204-Δ363 zu bilden.
Zusammenfassend, das Konstrukt NMDAR1-I63-Δ204-Δ363 enthält 261 Basenpaare von 5'- untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-261 in Sequenz-ID-Nr. 1), die vollständige kodierende Sequenz für die NMDAR1-I63-Δ204-Δ363-Variante der NMDAR1A-Untereinheit (Nukleotide 262-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus die Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 plus die Nukleotide 832-984, 1189-2961 und 3325-3393 von Sequenz-ID-Nr. 1) sowie 905 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 3394-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1). Somit unterscheidet sich NDMAR1-I63-Δ204-Δ363 von NMDAR1A darin, daß es 63 Nukleotide enthält, die in NMDAR1A nicht vorhanden sind (Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3), lokalisiert zwischen den Nukleotiden 831 und 832 von Sequenz-ID-Nr. 1. Ferner fehlen NMDAR1-I63-Δ204-Δ363 204 Nukleotide, die in NMDAR1A vorhanden sind (Nukleotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1) und 363 Nukleotide, die in NMDAR1A vorhanden sind (Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID-Nr. 1), welche die letzten 117 Nukleotide der kbdierenden Sequenz und die ersten 246 Nukleotide der 3'-untranslatierten Sequenz von NMDAR1A umfassen. Die Sequenz, welche für die NMDAR1-I63-Δ204-Δ363-Untereinheitsvariante kodiert, ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pcDNA1 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.

G. NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087

Das Konstrukt NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087 vollständiger Länge wurde hergestellt durch Ersatz des 2861-Nukleotid-Fragments aus dem Konstrukt NMDAR1-I63-Δ204 (d. h., die Nukleotide 1438-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1) durch das KpnI-XbaI (Polylinker-Stelle)-Fragment von NMDAR1-Δ1087 (d. h., die Nukleotide 1438-2961 und 4049-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1) wie in Fig. 2 dargestellt. Das NMDAR1-I63-Δ204 wurde vollständig mit XbaI verdaut, dann aufgrund der Anwesenheit von zwei zusätzlichen KpnI-Stellen in der Vektorsequenz partiell mit KpnI verdaut. Das resultierende NMDAR1-I63-Δ204-5'-Fragment, welches die pcDNA1- Vektorsequenzen einschließt, wurde mit dem KpnI-XbaI-3'-Fragment von NMDAR1-Δ1087 ligiert, um NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087 zu bilden.
Zusammenfassend, das Konstrukt NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087 enthält 261 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-261 in Sequenz-ID-Nr. 1), die vollständige kodierende Sequenz für die NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087-Variante der NMDAR1A-Untereinheit (Nukieotide 262-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus die Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID-Nr. 3 plus die Nukleotide 832-984, 1189-2961 und 4280-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1) sowie 19 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 4280-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1). Somit unterscheidet sich NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087 von NMDAR1A darin, daß es 63 Nukleotide enthält, die in NMDAR1A nicht vorhanden sind (Nukleotide 1-63 von Sequenz-ID- Nr. 3), lokalisiert zwischen den Nukleotiden 831 und 832 von Sequenz-ID-Nr. 1. Ferner fehlen NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087 204 Nukleotide, die in NMDAR1A vorhanden sind (Nukleotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1), und 1087 Nukleotide, die in NMDAR1A vorhanden sind (Nukleotide 2962-4048 von Sequenz-ID-Nr. 1), welche die letzten 117 Nukleotide der kodierenden Sequenz und die ersten 970 Nukleotide der 3'-untranslatierten Sequenz von NMDAR1A umfassen. Die Sequenz, welche für die NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087- Untereinheitsvariante kodiert, ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pcDNA1 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.

H. Zusätzliche Konstrukte, die cDNAs vollständiger Länge, kodierend für Varianten der NMDAR1-Untereinheit, enthalten

Zusätzliche cDNAs vollständiger Länge, kodierend für weitere mögliche NMDAR1-Varianten, können unter Anwendung von ähnlichen Verfahren wie oben in den Beispielen 2A-G beschrieben konstruiert werden. Speziell können die folgenden Konstrukte durch Ligierung von Abschnitten der Klone NMDA11, NMDA10, NMDA7 und NMDA3 wie in Fig. 2 dargestellt hergestellt werden:
NMDAR1-Δ204 (Sequenz-ID-Nr. 1J)
NMDAR1-Δ204-Δ363 (Sequenz-ID-Nr. 1K)
NMDAR1-I63-Δ363 (Sequenz-ID-Nr. 1M)
NMDAR1-I63-Δ1087 (Sequenz-ID-Nr. 1N)
NMDAR1-Δ204-Δ1087 (Sequenz-ID-Nr. 1L)
Die cDNAs vollständiger Länge können auch in Säuger-Expressionsvektoren wie pcDNA1 wie in den Beispielen 2A-G beschrieben inkorporiert werden.
Es können verschiedene Verfahren eingesetzt werden, um festzustellen, welche NMDAR1- Untereinheitsvarianten tatsächlich in verschiedenen humanen Geweben exprimiert werden. Beispielsweise können Oligonukleotide, welche spezifisch für die Nukleotidsequenzen sind, die sich 5' und 3' der Insertionen und Deletionen der hier beschriebenen NMDAR1-Transkripte befinden, als Primer für Nukleinsäureamplifizierungen von RNA, die aus verschiedenen Geweben isoliert wurde, und/oder cDNA-Banken, die aus verschiedenen Geweben erstellt wurden, eingesetzt werden. Die Anwesenheit oder Abwesenheit von Amplifizierungsprodukten und die Größen der Produkte zeigen an, welche Varianten in den Geweben exprimiert werden. Die Produkte können auch eingehender durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden.
RNase-Schutz-Assays können ebenfalls eingesetzt werden, um festzustellen, welche Varianten-Transkripte in verschiedenen Geweben exprimiert werden. Diese Assays sind ein empfindliches Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung einer RNA- Spezies in einer komplexen Mischung von zellulärer Gesamt-RNA. Ein Abschnitt der NMDAR1-Untereinheitsvarianten-DNA wird markiert und mit zellulärer RNA hybridisiert. Falls komplementäre mRNA in der zellulären RNA vorhanden ist, ergibt sich ein DNA-RNA-Hybrid. Die RNA-Probe wird dann mit RNase behandelt, welche einzelsträngige RNA abbaut. Etwaige RNA-DNA-Hybride sind vor dem RNase-Abbau geschützt und können mittels Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht werden.
Weitere Informationen hinsichtlich möglicher Splice-Varianten des NMDAR1-Primärtranskripts können durch Isolierung genomischer Klone, welche für die NMDAR1-Untereinheit kodierende Sequenzen enthalten, (z. B. durch Hybridisierung mit den hier offenbarten humanen NMDAR1-Untereinheits-cDNAs) und anschließende Charakterisierung der resultierenden Klone erhalten werden.

BEISPIEL 3

Isolierung von DNA, die für humane NMDA-Rezeptor- NMDAR2C-Untereinheiten kodiert

Es wurden degenerierte Oligonukleotide synthetisiert auf Basis der beiden konservierten Regionen von Ratten-NMDAR2A-, -NMDAR2B- und -NMDAR2C-DNAs, welche für die mutmaßlichen ersten und vierten Transmembran-Domänen kodieren. Bei Ratten-NMDAR2A- DNA werden diese Regionen von den Nukleotiden 1669-1692 (Oligo SE74) bzw. 2437-2465 (Oligo SE75) kodiert [siehe Monyer et al. (1992), Science 256: 1217-1221]. Diese Oligonukleotide wurden als Primer zur Nukleinsäureamplifizierung von cDNAs eingesetzt, welche von aus humanem Hippocampus-, Cerebellum- und orbitofrontalem Gewebe isolierter RNA hergestellt worden waren. Zwei Produkte, ein 795-bp- und ein 640-bp-Fragment wurden nachgewiesen, als die Reaktionsmischung mittels Gelelektrophorese und Ethidiumbromid- Anfärbung analysiert wurde. Das 795-bp-Fragment, amplifiziert von der Cerebellum-cDNA, wurde in PCR1000 (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert, welche offenbarte, daß es ~86% Ähnlichkeit mit der Ratten- NMDAR2A-DNA-Sequenz, ~78% Ähnlichkeit mit der Ratten-NMDAR2B-DNA-Sequenz und ~74% Ähnlichkeit mit der Ratten-NMDAR2C-DNA-Sequenz: aufwies. Somit erhielt dieses Plasmid die Bezeichnung pcrNMDAR2A.
Das 795-bp-Insert von pcrNMDAR2A wurde zum Screenen von 1 · 10&sup6; Rekombinanten einer Human-Hippocampus-cDNA-Bank (hergestellt durch Verwendung statistischer Primer zur Synthese von cDNAs aus Hippocampus-Gewebe und Auswahl von Fragmenten > 2,0 kb zur Insertion in λgt10-Vektoren) und einer Human-Cerebellum-eDNA-Bank (statistisch geprimte Bank in λgt10, die hinsichtlich Fragmente > 2,8 kb größenselektioniert worden war) eingesetzt. Die Hybridisierung erfolgte in 5 · SSPE, 5 · Denhart's Lösung, 50% entionisiertem Formamid, 0,2% SDS, 200 ug/ml beschallter denaturierter Heringssperma-DNA bei 4200. Waschungen wurden in 1 · SSPE, 0,2% SDS, bei 55ºC durchgeführt. Die Sonde hybridisierte mit 11 Plaques von der Hippocampus-Bank und 8 Plaques von der Cerebellum-Bank.
Die DNA-Sequenzanalyse und/oder Restriktionsenzymkartierung von 15 der hybridisierenden Plaques, die gereinigt worden waren, offenbarte überraschenderweise, daß sie mehr Ähnlichkeit mit Ratten-NMDAR2C-DNA als mit Ratten-NMDAR2A-DNA aufwiesen. Alle Klone waren partielle cDNAs (d. h., ihnen fehlte ein Translationsinitiations- und/oder -terminationscodon) und wurden als NMDAR2C-cDNAs bezeichnet. Ein Vergleich der Klone offenbarte, daß das Human-NMDAR2C-Untereinheitstranskript unterschiedlich prozessiert wird.
Die Klone NMDA26, NMDA24, NMDA22 und NMDA21 (siehe Fig. 4) repräsentieren vier grundlegende Klone, die identifiziert wurden, von denen allen angenommen wird, daß es sich um Splice-Varianten handelt. Der Klon NMDA26 (Sequenz-ID-Nr. 5D) wird als Referenz verwendet, mit der die anderen Varianten verglichen werden können. Der Klon NMDA24 (Sequenz-ID-Nr. 5C) enthält eine 24-bp-Sequenz (siehe Sequenz-ID-Nr. 7), welche in NMDA26 nicht vorhanden ist. Dem Klon NMDA22 (Sequenz-ID-Nr. 5B) fehlen 15 bp, welche in NMDA26 vorhanden sind, und dem Klon NMDA21 (Sequenz-ID-Nr. 5A) fehlen 51 bp, welche in NMDA26 vorhanden sind. Die Klone NMDA22 und NMDA24 enthalten beide eine 11-bp-Sequenz (Sequenz-ID-Nr. 9), welche in NMDA26 nicht vorhanden ist (zwischen den Nukleotiden 1116-1117 von Sequenz-ID-Nr. 5). Die Einführung dieser Sequenz in diese Klone (zwischen den Nukleotiden 1116-1117 von Sequenz-ID-Nr. 5) zerstört den Leserahmen des Transkripts und führt ein vorzeitiges Translationsterminationscodon (d. h., Stopcodon) in das Transkript ein.
Die Klone NMDA26 und NMDA27 (siehe Fig. 4) sind partielle NMDAR2C-cDNAs, welche eine 5'-untranslatierte Sequenz, ein Translationsinitiationscodon und einen Teil der kodierenden Sequenz enthalten. Der Klon NMDA26 enthält 188 Basenpaare von 5'- untranslatierter Sequenz, wohingegen der Klon NMDA27 ~1,1 kb von 5'-untranslatierter Sequenz enthält. Die Sequenzen der 5'-untranslatierten Bereiche dieser beiden Klone sind für die ersten 15 Nukleotide, die dem Translationsinitiationscodon 5' vorangehen, identisch. Beginnend mit dem 16. Nukleotid 5' des Translationsinitiationscodons divergieren die Sequenzen der beiden Klone jedoch (vgl. Nukleotide 116-191 von Sequenz-ID-Nr. 5 mit den Nukleotiden 1-74 von Sequenz-ID-Nr. 12).

BEISPIEL 4

Herstellung von NMDAR2C-Untereinheits-cDNA-Konstrukten vollständiger Länge

Abschnitte der partiellen NMDAR2C-Klone können auf vielfältige Weise ligiert werden, um Konstrukte zu bilden, die für NMDAR2C-Untereinheitsvarianten vollständiger Länge kodieren. Das 5'-Ende einer jeden NMDAR2C-cDNA kann von NMDA26 beigesteuert werden, wohingegen die 3'-Enden der Konstrukte von verschiedenen Kombinationen der Klone NMDA21, NMDA22 und NMDA24 beigesteuert werden. Fig. 5 stellt NMDAR2C- Konstrukte vollständiger Länge dar und zeigt die Abschnitte der verschiedenen Klone, welche zu jedem Konstrukt beitragen.
Beispielsweise können Konstrukte vollständiger Länge unter Anwendung von Verfahren hergestellt werden, wie sie im Beispiel 2 zur Herstellung von NMDAR1-Konstrukten beschrieben werden. So werden Klon-Inserts zur leichteren Manipulation in einen Vektor (z. B. pcDNA1) überführt und dann werden die gewünschten Abschnitte der cDNAs durch Restriktionsenzymverdauung der Vektoren isoliert. Dies kann mehrere Schritte und/oder partielle Verdauungen erfordern, falls es beispielsweise keine nur einmal vorkommenden Restriktionsstellen in der Umgebung der gewünschten Abschnitte der cDNAs gibt. Die gewünschten cDNA-Fragmente werden dann ligiert und in ein Expressionsplasmid wie pcDNA1 oder pCMV-T7-2 inkorporiert.
Das Plasmid pCMV-T7-2 (siehe Fig. 6) ist ein Vektor auf pUC19-Basis, welcher einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor/Enhancer, unmittelbar stromabwärts des Promotors gelegene SV40-Splice-Donor/Splice-Akzeptor-Stellen, einen stromabwärts der SV40-Splice- Stellen gelegenen T7-Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotor, ein SV40-Polyadenylierungssignal stromabwärts des T7-Promotors und einen Polylinker zwischen dem T7- Promotor und dem Polyadenylierungssignal enthält. Dieser Vektor enthält somit alle regulatorischen Elemente, welche zur Expression von heterologer DNA in einer Säuger- Wirtszelle erforderlich sind, wobei die heterologe DNA an dem Polylinker in den Vektor inkorporiert wurde. Nachdem sich der T7-Promotor gerade stromaufwärts des Polylinkers befindet, kann dieses Plasmid darüber hinaus zur Synthese von in vitro-Transkripten von heterologer DNA, welche an dem Polylinker in den Vektor subkloniert wurde, eingesetzt werden. Das Plasmid pCMV-T7-3, ebenfalls in Fig. 6 dargestellt, ist mit pCMV-T7-2 identisch, mit der Ausnahme, daß die Reihenfolge der Restriktionsenzymstellen in dem Polylinker umgekehrt ist. Dieses Plasmid kann ebenfalls zur heterologen Expression von NMDAR-Untereinheits-DNA eingesetzt werden.
Das Konstrukt pcDNA1-26-NotI-24-5'UT enthält 188 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-188 von Sequenz-ID-Nr. 5), die vollständige kodierende Sequenz der ersten Variante der Human-NMDAR2C-Untereinheit (Nukleotide 189-3899 von Sequenz-ID- Nr. 5) und 440 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 3900-4340 von Sequenz-ID-Nr. 5). Die NMDAR2C-cDNA ist innerhalb des Polylinkers des Expressionsvektors pcDNA1 zur Expression enthalten.
Das Konstrukt pCMV-26-NotI-24 (Sequenz-ID-Nr. 5) enthält 49 Basenpaare von 5'- untranslatierter Sequenz (Nukleotide 140-188 von Sequenz-ID-Nr. 5), die vollständige kodierende Sequenz einer ersten Variante der Human-NMDAR2C-Untereinheit (Nukleotide 189-3899 von Sequenz-ID-Nr. 5) und 440 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 3900-4340 von Sequenz-ID-Nr. 5). Die NMDAR2C-cDNA ist innerhalb des Polylinkers des Expressionsvektors pCMV-T7-2 zur Expression enthalten.
Das Konstrukt pCMV-26-ScaI-24 (Sequenz-ID-Nr. 5E) ist identisch mit pCMV-26-NotI-24, mit Ausnahme dessen, daß es 24 Basenpaare (Sequenz-ID-Nr. 7) inseriert zwischen den Nukleotiden 2350 und 2351 von Sequenz-ID-Nr. 5 enthält.
Das Konstrukt pCMV-26-ScaI-22 (Sequenz-ID-Nr. 5F) ist identisch mit pCMV-26-NotI-24, mit Ausnahme dessen, daß ihm 15 Basenpaare (Nukleotide 1960-1974 von Sequenz-ID-Nr. 5) fehlen.
Das Konstrukt pCMV-26-ScaI-21-NotI-24 (Sequenz-ID-Nr. 5G) ist identisch mit pCMV-26- NotI-24, mit Ausnahme dessen, daß ihm 51 Basenpaare (Nukleotide 2351-2401 von Sequenz-ID-Nr. 5) fehlen.
Das Konstrukt NMDAR2C-Δ15-I24 (Sequenz-ID-Nr. 5H) ist identisch mit pCMV-26-NotI-24, mit Ausnahme dessen, daß ihm 15 Basenpaare (d. h., die Nlukleotide 1960-1974 von Sequenz-ID-Nr. 5) fehlen und es eine 24-Basenpaar-Sequenz (d. h., Sequenz-ID-Nr. 7, inseriert zwischen den Nukleotiden 2350 und 2351 von Sequenz-ID-Nr. 5) einschließt.
Das Konstrukt NMDAR2C-Δ15-Δ51 (Sequenz-ID-Nr. 5I) ist identisch mit pCMV-26-NotI-24, mit Ausnahme dessen, daß ihm 15 Basenpaare (d. h., die Nukleotide 1960-1974 von Sequenz-ID-Nr. 5) und 51 Basenpaare (d. h., die Nukleotide 2351-2401 von Sequenz-ID-INr. 5) fehlen.
Zusätzliche NMDAR2C-Konstrukte vollständiger Länge können unschwer wie hier beschrieben hergestellt werden. Beispielsweise kann eine aus NMDA27 (anstelle von NMDA26) erhaltene 5'-untranslatierte Sequenz eingesetzt werden und zu den 3'-Enden der Konstrukte können verschiedene Kombinationen der Klone NMDA21, NMDA22 und NMDA24 beitragen.
Mehrere Verfahren (z. B. Nukleinsäureamplifizierung, RNase-Schutz-Assays etc.) wie in Beispiel 2 beschrieben können eingesetzt werden, um festzustellen, welche NMDAR2C- Untereinheitsvarianten tatsächlich in verschiedenen Humangeweben exprimiert werden.
Human-NMDAR2C besitzt einen GC-Nukleotidgehalt von 83,5% zwischen den Nukleotiden 2957 und 3166. Zur potentiellen Erhöhung der Expression der NMDAR2D-Untereinheit kann der GC-Gehalt unter Beibehaltung der nativen Aminosäuresequenz in dieser Region reduziert werden. Synthetische DNAs können durch Oligonukleotid-Primer-Verlängerung über diese Region hinweg hergestellt werden. Vier Oligonukleotide, SE343 (Sequenz-ID-Nr. 17), SE344 (Sequenz-ID-Nr. 18), SE345 (Sequenz-ID-Nr. 19) und SE346 (Sequenz-ID-Nr. 20) wurden synthetisiert. Diese Primer erhalten die Aminosäuresequenz des Human- NMDAR2D-Rezeptors und einige Restriktionsstellen, verringern jedoch den Gesamt-GC- Gehalt dieser Region auf 53,4%. Die Kriterien für die Modifizierung von Basen waren: 1) nicht mehr als 4 Guanin-Nukleotide hintereinander zu haben, falls irgend möglich, 2) die Restriktions-Spaltstellen für NotI (Nukleotide 2962-2969 von Sequenz-ID-Nr. 5), AvaII (Nukleotide 3069-3073 von Sequenz-ID-Nr. 5) und AatII (Nukleotide 3156-3161 von Sequenz-ID-Nr. 5) zu erhalten, 3) die Sekundärstruktur der Oligonukleotide so weit wie möglich zu verringern, 4) nicht irgendwelche zusätzliche NotI-, AvaII- oder AatII-Restriktionsstellen in die Sequenz einzuführen, und 5) die Basenpaar-Überlappung zwischen den Oligonukleotidpaaren {SE343 und SE344} oder {SE345 und SE346} mit einer vorgeschlagenen Schmelztemperatur zwischen 62-66ºC zu haben. Das Oligonukleotidpaar SE343 und SE344 besitzt eine komplementäre Sequenz zu den Nukleotiden 51-71 der Sequenz-ID-Nrn. 17 und 18. Das Oligonukleotidpaar SE345 und SE346 besitzt eine komplementäre Sequenz zu den Nukleotiden 42-61 der Sequenz-ID-Nr. 19 bzw. den Nukleotiden 43-62 der Sequenz- ID-Nr. 20.
Die Primerpaare, {SE343 und SE344} und {SE345 und SE346}, werden in einer Standard- PCR-Reaktionsmischung kombiniert, welche 50 pMol eines jeden Oligonukleotids enthält, und werden gemäß dem folgenden PCR-Protokoll amplifixiert:
Verschmelzungstemperatur von 55ºC für 1 Minute, Verlängerungstemperatur von 72ºC für 2 Minuten und Schmelztemperatur 96ºC für 30 Sekunden für 30 Zyklen.
Das resultierende 121-bp-PCR-Produkt von dem Primerpaar SE343-SE344 wird mit NotI und Aval verdaut und das resultierende 103-bp-PCR-Produkt von dem Primerpaar SE345-SE346 wird mit Aval und Aafll verdaut. Diese Fragmente werden in pCMV-NMDAR2C-26-NotI-24 ligiert, welches aufgrund der Anwesenheit zusätzlicher NotI- und/oder AatII-Restriktionsstellen in der Vektorsequenz sowohl mit NotI als auch AatII partiell verdaut wurde, um pCMV-26-NotI-24-GCMOD zu bilden. Dieses Konstrukt pCMV-26-NotI-24-GCMOD enthält die Nukleotide 140-2965 von Sequenz-ID-Nr. 5, gefolgt von den in Sequenz-ID-Nr. 21 angegebenen 195 Nukleotiden und dann den Nukleotiden 3161 bis 4340 von Sequenz-ID- Nr. 5.

BEISPIEL 5

Isolierung von DNA, die für humane NMDA-Rezeptor-NMDAR2A-Untereinheiten kodiert

Zwei Human-cDNA-Banken wurden hergestellt unter Verwendung unterschiedlicher Oligonukleotide (statistischer und spezifischer Primer), um die cDNA-Synthese von RNA, die aus Cerebellum-Gewebe isoliert worden war, zu primen. Der für die Synthese des ersten Strangs eingesetzte spezifische Primer war SE162, Nukleotide 904 bis 929 von Sequenz-ID-Nr. 10. Durch statistisches Priming synthetisierte cDNAs, die im Größenbereich von 1,0-2,8 kb lagen, und durch spezifisches Priming synthetisierte cDNAs, die im Größenbereich von 0,6- 1,1 kb lagen, wurden isoliert und in den λgt10-Phagenvektor inseriert, um die beiden Banken zu erstellen.
Die statistisch geprimte Bank (3 · 10&sup6; Rekombinante) wurde hinsichtlich Hybridisierung mit dem 795-Basenpaar-Insert aus pcrNMDAR2A (siehe Beispiel 3) in 5 · SSPE, 5 · Denhart's Lösung, 50% entionisiertem Formamid, 0,2% SDS, 200 pg/ml beschallter denaturierter Heringssperma-DNA bei 42ºC gescreent. Waschschritte wurden in 1 · SSPE, 0,2% SDS, bei 55ºC durchgeführt. Die Sonde hybridisierte mit 11 Plaques.
Die spezifisch geprimte Bank (6 · 10&sup5; Rekombinante) wurde hinsichtlich Hybridisierung mit dem Oligonukleotid SE177 (Nukleotide 859 bis 884 von Sequenz-ID-Nr. 10) in 6 · SSPE, 5 · Denhart's Lösung, 10% entionisiertem Formamid, 0,2% SDS, 200 ug/ml beschallter denaturierter Heringssperma-DNA bei 42ºC gescreent. Waschschritte wurden in 1 · SSPE, 0,2% SDS, bei 50ºC durchgeführt. Die Sonde hybridisierte mit 2 Plaques.
Neun der hybridisierenden Plaques wurden gereinigt und die Inserts durch Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Alle Klone enthielten partielle cDNAs. Zwei der Klone, NMDA53 und NMDA54, enthalten das Translationsinitiationscodon und 320 Basenpaare bzw. 88 Basenpaare 5'-untranslatierter Sequenz. Die Sequenzen vier anderer Klone, NMDA47, NMDA49, NMDA50 und NMDA51, zusammen mit denjenigen von NMDA53 und NMDA54, überlappen, um -70% der Sequenz, die für die humane NMDAR2A-Untereinheit kodiert, zu umfassen (siehe die Nukleotide 1-3084 von Sequenz-ID- Nr. 10).
Um Klone zu erhalten, welche die restlichen -1300 Basenpaare der 3'-Sequenz enthalten, welche zur Vervollständigung der für NMDAR2A kodierenden Sequenz erforderlich sind, wurden 6,6 · 10&sup6; Rekombinanten einer zusätzlichen Human-cDNA-Bank (eine amplifizierte statistisch geprimte Cerebellum-cDNA-Bank mit Inserts im Bereich von 1,0-2,8 kb Länge) hinsichtlich Hybridisierung mit einem Oligonukleotid, welches dem 3'-Ende des Klons NMDA51 entsprach (Oligo SE171; Nukleotide 3454 bis 3479 von Sequenz-ID-Nr. 10), unter denselben Bedingungen wie zum Screenen der spezifisch geprimten Cerebellum-cDNA- Bank wie oben beschrieben eingesetzt gescreent. Vier hybridisierende Plaques wurden gereinigt und die Inserts wurden mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert, um festzustellen, ob sie das 3'-Ende der kodierenden Sequenz und ein Translationsterminationscodon enthalten. Zwei der Klone (NMDA57 und NMDA58, von denen festgestellt wurde, daß sie identisch sind) enthalten ein Translationsterminationscodon, wie durch DNA-Sequenzanalyse festgestellt. Phagenlysat, enthaltend den Klon NMDA57, wurde gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 13. April 1993 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungs-Nr. 75442.

BEISPIEL 6

Herstellung von NMDAR2-Untereinheits-cDNA-Konstrukten vollständiger Länge

Zwei separate Konstrukte, kodierend für eine vollständige NMDAR2A-Untereinheit (pCMV- hNMDAR2A-1(53) und pCMV-hNMDAR2A-2(54), wurden durch Ligierung von Abschnitten der folgenden partiellen NMDAR2A-Klone hergestellt: NMDAR47, NMDAR50, NMDAR58 und entweder NMDAR53 oder NMDAR54 (NMDAR53 und NMDAR54 unterscheiden sich nur in dem Umfang der 5'-untranslatierten Sequenz, die in den Klonen enthalten ist). Die Inserts der Klone NMDA47, NMDA50 und NMDA58 wurden als EcoRI-Fragmente isoliert und mit EcoRI-verdautem pCMV-T7-2 ligiert, um pNMDA47, pNMDA50 bzw. pNMDA58 zu bilden. Die Inserts der Klone NMDA53 und NMDA54 wurden als XhoI-Fragmente isoliert und mit SaII-verdautem pCMV-T7-2 ligiert, um pNMDA53 bzw. pNMDA54 zu bilden.
pNMAD47 wurde mit ScaI und NsiI verdaut, um ein ~3350-bp-Fragment freizusetzen, welches einen3'-Abschnitt des β-Lactamasegens, kodierend für ein Protein, das Ampicillinresistenz verleiht, und die Nukleotide 824-2415 von Sequenz-ID-Nr. 10 enthält. Dieses Fragment wurde mit einem ~2890-bp-NsiI/ScaI-Fragment von pNMDA50 (enthaltend einen 5'-Abschnitt des β-Lactamasegens und die Nukleotide 2416-3346 von Sequenz-ID-Nr. 10) ligiert, um pNMDA47 + 50 zu bilden.
Der Abschnitt von pNMDA58, welcher für das 3'-Ende von NMDAR2A kodiert, enthält 2 MscI-Stellen. Da die 3'-MscI-Stelle gegenüber der 5'-MscI-Stelle bevorzugt gespalten wird, war eine partielle Verdauung von pNMDA58 keine Option. So wurde pNMDA58 mit ScaI/MscI verdaut und das ~2020-bp-Fragment, enthaltend einen 5-Abschnitt des β- Lactamasegens und einen 3'-Abschnitt des Inserts (Nukieotide 4751-4808 von Sequenz-ID- Nr. 10), wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit einem ~4150-bp-ScaI/MscI-Fragment von pNMDA47 + 50 (enthaltend einen 3'-Abschnitt des β-Lactamasegens und die Nukleotide 824- 3212 von Sequenz-ID-Nr. 10) ligiert, um pNMDA47 + 3'END58 zu bilden. Dieses Plasmid enthielt ein vollständiges β-Lactamasegen und die Nukleotide 824-3214 und 4751-4808 von Sequenz-ID-Nr. 10. Zur Hinzufügung der Nukleotide 343-4750 von Sequenz-ID-Nr. 10 zu pNMDA47 + 50 + 3'END58 wurde pNMDA58 mit MscI verdaut und das isolierte 1537-bp- Fragment, bestehend aus den Nukleotiden 3213-4750 von Sequenz-ID-Nr. 10, wurde mit MscI-verdautem pNMDA47 + 50 + 3'END58 ligiert. Das re sultierende Plasmid, pNMDA47 + 50 + 58, enthielt die Nukleotide 824-4808 von Sequenz-ID-Nr. 10.
Zur Bildung von zwei Konstrukten, welche identische NMDAR2A-kodierende Sequenzen, jedoch einen unterschiedlichen Umfang an 5'-untranslatierter Sequenz enthielten, wurden pNMDA53 und pNMDA54 mit ScaI/EcoRI verdaut, um Fragmente freizusetzen, die einen 3'- Abschnitt des β-Lactamasegens und die Nukleotide 1-854 bzw. 225-854 von Sequenz-ID-Nr. 10 enthielten. pNMDA47 + 50 + 58 wurde mit ScaI/EcoRI (partiell) verdaut und das 3954-pb- Fragment, enthaltend einen 5'-Abschnitt des β-Lactamasegens und die Nukleotide 855-4808 von Sequenz-ID-Nr. 10, wurde separat mit den ScaI/EcoRI-Fragmenten von pNMDA53 und pNMDA54 ligiert, um pCMV-hNMDAR2A-1(53) bzw. pCMV-hNMDAR2A-2(54) zu bilden. Diese beiden Konstrukte sind identisch, mit Ausnahme des Umfangs an 5'-untranslatierter Sequenz, die in jedem enthalten ist. Beide enthalten eine NMDAR2A-kodierende Sequenz vollständiger Länge (Nukleotide 311-4705 von Sequenz-ID-Nr. 10) und 103 Nukleotide von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 4706-4808 von Sequenz-ID-Nr. 10). pCMV- hNMDAR2A-1(53) enthält 310 Nukleotide von 5-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-310 von Sequenz-ID-Nr. 10), wohingegen pCMV-hNMDAR2A-2(54) 87 Nukleotide von 5'- untranslatierter Sequenz (Nukleotide 224-310 von Sequenz-ID-Nr. 10) enthält. Die NMDAR2A-cDNA ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen von pCMV-T7-2 zur Expression in Säuger-Wirtszellen verknüpft.
Es gibt keine nur einmal vorkommende Restriktionsstelle 3' der NMDAR2A-spezifischen DNA in pCMV-hNMDAR2A-1(53), welche zur Linearisierung des Plasmids eingesetzt werden kann, um in vitro-Transkripte zur Injektion in Xenopus-Oozyten herzustellen. Zur Herstellung eines Konstrukts, welches eine nur einmal vorkommende, 3' liegende Restriktionsstelle aufweist (pCMV-hNMDAR2A-3(53)) wurde im wesentlichen die gesamte NMDAR2A-spezifische DNA von pCMV-hNMDAR2A-1(53) in den Vektor pCMV-T7-3 wie folgt überführt. pCMV-NMDAR2A-1(53) wurde mit NotI verclaut und das ~44-kb-Fragment wurde isoliert und mit NotI-verdautem pCMV-T7-3 ligiert, um pCMV-hNMDAR2A-3(53) zu bilden.

BEISPIEL 7

Isolierung von DNA, die für humane NMDA-Rezeptor-NMDAR2B-Untereinheiten kodiert

Eine Human-Fötusgehirn-λZAP-cDNA-Bank (1 · 10&sup6; Rekombinante; Stratagene, La Jolla, CA) wurde hinsichtlich Hybridisierung mit einem DNA-Fragment, welches die gesamte für die Ratten-NMDAR2B-Untereinheit kodierende Sequenz enthielt (siehe Monyer et al. (1992), Science 256: 1217-1221), gescreent. Die Hybridisierung erfolgte in 50% entionisiertem Formamid, 5 · Denhart's Lösung, 5 · SSPE, 200 ug/ml beschallter denaturierter Heringssperma-DNA und 0,2% SDS bei 42ºC. Die Waschschritte wurden in 0,5 · SSPE, 0,2% SDS, bei 65ºC durchgeführt. Einer der aus der Human-Fötusgehirn-Bank isolierten hybridisierenden Klone, NMDA81, der ein 5.435-bp-Insert und Translationsinitiations- und -terminationscodons enthält, kodiert für eine NMDAR2B-Untereinheit vollständiger Länge. Dieses isolierte Plasrnid, welches in dem pBluescript-Vektor vorliegt, wurde als pBS-hNMDAR2B bezeichnet.
NMDA81 wurde mit EcoRI/EcoRV verdaut und das ~5,5-kbp-Fragment wurde isoliert und mit EcoRI/EcoRV-verdautem pCMV-T7-3 ligiert. Das resultierende Konstrukt, pCMVPL3- hNMDAR2B, enthält die für NMDAR2B kodierende Sequenz (Nukleotide 210-4664 von Sequenz-ID-Nr. 13) sowie 209 Nukleotide von 5-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 1-209 von Sequenz-ID-Nr. 13) und 339 Nukleotide von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 4665-5003 von Sequenz-ID-Nr. 13). Die für NMDAR2B kodierende DNA in diesem Konstrukt ist funktionsfähig mit regulatorischen Elementen in pCMV-T7-3 zur Expression in Säuger- Wirtszellen verknüpft.

BEISPIEL 8

Isolierung von DNA, die für humane NMDA-Rezeptor-NMDAR2D-Untereinheiten kodiert

Eine Human-Fötusgehirn-cDNA-Bank (1 · 10&sup6; Rekombinante; Stratagene, La Jolla, CA) wurde mit Substraktions-Screeningverfahren hinsichtlich DPA gescreent, die für eine humane NMDAR2D-Rezeptoruntereinheit kodiert. Bei diesem Verfahren wurden Plaques auf der Grundlage von schwacher oder keiner Hybridisierung mit DNAs ausgewählt, die für humane NMDAR2A-, NMDAR2B- und NMDAR2C-Untereinheiten kodieren.
Zuerst wurde die Bank hinsichtlich Hybridisierung mit pcrNMDAR2A (siehe Beispiel 3) unter Bedingungen niedriger Stringenz (30% entionisiertes Formamid, 5 · Denhart's Lösung, 5 · SSPE, 200 ng/ml beschallter Heringssperma-DNA, 0,2% SDS, bei 42ºC) gescreent. Die Waschschritte wurden ebenfalls unter Bedingungen niedricter Stringenz vorgenommen (2 · SSPE, 0,2% SDS, 50ºC). Die Filter wurden abgezogen, dann hinsichtlich Hybridisierung mit dem pcrNMDAR2A-Fragment und mit einem ~1200-bp-PstI-Fragment von DNA, kodierend für eine humane NMDAR2B-Untereinheit (siehe Beispiel 7), und einem ~950-bp-AccI- Fragment von DNA, kodierend für eine humane NMDAR2C-Untereinheit (siehe Beispiel 3), gescreent. Diese Fragmente enthalten DNA, die für alle mutmaßlichen Transmembran- Domänen der Untereinheiten kodiert. Die Hybridisierung erfolgte unter Bedingungen hoher Stringenz (50% entionisiertes Formamid, 5 · Denhart's Lösung, 5 · SSPE, 200 ng/ml beschallter Heringssperma-DNA, 0,2% SDS, bei 42ºC) ebenso wie die Waschschritte (0,1 · SSPE, 0,1% SDS, 65ºC).
Achtzehn der Plaques, die mit pcrNMDAR2A in dem ersten Screening der Bank bei niedriger Stringenz schwach hybridisierten, hybridisierten in dem Screening bei hoher Stringenz nur schwach oder gar nicht mit Abschnitten der DNA, die für humane NMDAR2A-, NMDAR2B- und NMDAR2C-Untereinheiten kodierte. Die Plaques wurden gereinigt und die Insert- Fragmente mitttels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Eines der Inserts, NMDA96, entspricht der 3'-Hälfte der für das humane NMDAR2D-Untereinheitsgen kodierenden Sequenz. Die Sequenz dieses Klons ist in Sequenz-ID-Nr. 15 angegeben.
Zum Erhalt von Klonen, welche die verbleibenden 2000 bp von 5'-Sequenz enthielten, die zur Vervollständigung der für die NMDAR2D-Untereinheit kodierenden Sequenz erforderlich waren, wurde die Human-Fötusgehirn-cDNA-Bank hinsichtlich Hybridisierung mit einem ~831-bp-SmaI-Fragment des Klons, welcher die 3'-Hälfte der für NMDAR2D kodierenden Sequenz enthielt, unter Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz und Waschen mit 0,5 · SSPE, 0,2% SDS, bei 65ºC gescreent. Neun hybridisierende Plaques wurden gereinigt und mittels DNA-Sequenzierung analysiert, welche offenbarte, daß keiner der Plaques DNA enthält, die für ein Translationsinitiationscodon kodiert und 3' bis mindestens zum 5'-Ende des Klons reicht, welcher die 3'-Hälfte der für NMDAR2D kodierenden Sequenz enthält.
Eine Human-cDNA-Bank wurde unter Verwendung eines spezifischen Oligonukleotids, SE296, zum Primen der cDNA-Synthese von RNA, die aus Human-Fötusgehirn isoliert worden war, erstellt. Der für die Synthese des ersten Strangs verwendete spezifische Primer war SE296 (Nukleotide 2920-2949 von Sequenz-ID-Nr. 15). Durch spezifisches Priming synthetisierte cDNAs, welche größer als 2,2 kb waren, wurden isoliert und in den λZAPII- Phagenvektor inseriert, um die Bank zu erstellen.
Die spezifisch geprimte Bank (1 · 10&sup6; Rekombinante) wurde hinsichtlich Hybridisierung mit dem 831-bp-SmaI-Fragment von NMDAR2D (Nukleotide 2435-3265 von Sequenz-ID-Nr. 15) in 5 · SSPE, 5 · Denhart's Lösung, 50% entionisiertem Formamid, 0,2% SDS, 200 ug/ml beschallter denaturierter Heringssperma-DNA bei 42ºC gescreent. Die Waschschritte wurden in 0,1 · SSPE, 0,2% SDS, bei 65ºC durchgeführt. Eine Sonde hybridisierte mit 11 Plaques.
Elf der hybridisierenden Plaques wurden gereinigt und die Inserts mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzanalyse charakterisiert. Sechs der Klone (NMDA111, NMDA112, NMDA115, NMDA116, NMDA119 und NMDA121) enthalten das Translationsinitiationscodon und variierende Mengen 5'-untranslatierter Sequenz.
Die Sequenzen dieser Klone überlappen mit NMDA96, um 100% der für die humane NMDAR2D-Untereinheit kodierenden Sequenz auszumachen (siehe Nukleotide 485-4495 von Sequenz-ID-Nr. 15).
Das hNMDAR2D-Konstrukt vollständiger Länge wurde unter Verwendung von NMDA115- und NMDA96-cDNAs hergestellt. NMDA115- und NMDA96-cDNAs liegen bereits in dem pBIueScript-Vektor vor, jedoch liegt die NMDA115-cDNA in der Sense-Orientierung zum T7-Promotor vor, während die NMDA96-cDNA in der Antisense-Orientierung vorliegt. Zur leichteren Subklonierung des Konstrukts vollständiger Länge wurde die NDMA96-cDNA durch Verdauung von NMDA96 mit EcoRI und Screening der resultierenden Klone hinsichtlich der Orientierung in der Sense-Orientierung geklont (NMDAR96-T7). Innerhalb der vollständigen humanen NMDAR2D-Sequenz befindet sich eine nur einmal vorkommende HindIII-Stelle beim Nukleotid 2804, welche zur Klonierung von NMDA115 zusammen mit NMDA96 eingesetzt wurde. Es gibt jedoch eine zusätzliche HindIII-Stelle in dem pBS- Polylinker am 5'-Ende der NMDA115-cDNA. Deswegen wurde NMDA115 mit SpeI, einer 3'-Polylinkerstelle, vollständig verdaut und partiell mit Hind III verdaut. Das resultierende ~5,6-kb-SpeI-HindII-Fragment aus pNMDA115 (pBS-Vektor plus die Nukleotide 397-2804 von Sequenz-ID-Nr. 15) wurde mit dem 1,7-kb-HindIII-SpeI-Fragment (Nukleotide 2805-4651 von Sequenz-ID-Nr. 15) aus NMDA96-T7 ligiert, um pBS-hNMDAR2D zu bilden. In vitro- Transkripte wurden zur Coinjektion in Xenopus-Oozyten hergestellt, um die Änderung der NMDAR1A-Ströme zu testen.
Das vollständige NMDAR2D-Insert wird dann als ein ~4,7-kb-EcoRV/SpeI-Fragment in den Säugerexpressionsvektor pMMTV-T7+ überführt. Die EcoRV- und SpeI-Restriktionsstellen liegen in der Mehrfachklonierungsregion des pBlueScript-Vektors.
Zusammenfassend, das Konstrukt NMDAR2D enthält 88 Basenpaare von 5'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 397-484 in Sequenz-ID-Nr. 15), die vollständig kodierende Sequenz für die NMDAR2D-Untereinheit (Nukleotide 484-4495 von Sequenz-ID-Nr. 15) sowie 200 Basenpaare von 3'-untranslatierter Sequenz (Nukleotide 4496-4695 von Sequenz-ID-Nr. 15). Die für die NMDAR2D-Untereinheit kodierende Sequenz ist funktionsfähig mit den regulatorischen Elementen in pMMTV-T7 zur Expression in Säugerzellen verknüpft.

BEISPIEL 9

Expression von rekombinanten humanen NMDA-Rezeptoruntereinheiten in Oozyten

Xenopus-Oozyten wurden in vitro-Transkripte injiziert, welche von Konstrukten hergestellt worden waren, die für die humanen NMDA-Rezeptor-NMDAR1- und -NMDAR2-Untereinheiten kodierende DNA enthielten. Elektrophysiologische Nlessungen der Oozyten- Transmembranströme wurden unter Anwendung der Zweielektroden-Spannungsklammer- Technik (siehe z. B. Stuhmer (1992), Meth. Enzymol. 207: 319-339) vorgenommen.

A. Herstellung von in vitro-Transkripten

Rekombinante, mit einem Cap versehene Transkripte von NMDA-RezeptoruntereinheitscDNAs, die in den Konstrukten NMDAR1A, NMDAR1-I63, NMDAR1-I63-Δ204, NMDAR1- Δ1087, NMDAR1-Δ363 und pCMV-26-NotI-24 enthalten waren, wurden von linearisierten Plasmiden unter Verwendung des mCAP-RNA-Capping-Kits (Kat. #200350, Stratagene, Inc., La Jolla, CA) synthetisiert. Für Experimente, in denen NMDAR2A- oder NMDAR2B- und NMDAR1- oder NMDAR1-I63-Transkripte in Xenopus-Oozyten coinjiziert wurden, wurden die Transkripte von den linearisierten Konstrukten NMDAR1A, NMDAR1-I63, pCMV- hNMDAR2A-3(53), pCMV-26-NotI-24 und pBS-hNMDAR2B unter Verwendung von mMessage mMachine (Ambion, Katalog #1344, Austin, IX) synthetisiert. Die Masse eines jeden synthetisierten Transkripts wurde mittels UV-Extinktion bestimmt und die Integrität eines jeden Transkripts wurde mittels Elektrophorese durch ein Agarosegel bestimmt.

B. Elektrophysiologie

Xenopus-Oozyten wurden 12,5-50 ng von einem oder mehreren NMD-Rezeptoruntereinheitstranskript(en) pro Oozyt injiziert. Die Vorbereitung und Injektion von Oozyten wurde wie von Dascal [(1987), Crit. Rev. Biochem. 22: 317-387] beschrieben durchgeführt. Zwei bis sechs Tage nach der mRNA-Injektion wurden die Oozyten unter Anwendung der zwei Elektroden-Spannungsklammer-Technik untersucht. Die Zellen wurden in Ringers Lösung (115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl&sub2; 10 mM HEPES, pH 7,3) gebadet und das Membranpotential wurde bei -80 bis -100 mv geklammert. Arzneiwirkstoffe wurden durch Pipettieren von 6,0-ul-Aliquots von Arzneiwirkstoff enthaltender Lösung direkt in das Bad oder mittels Schwerkraftzuführung in eine Kammer von Warner Instruments (Volumen = 110 ul) bei einer Durchflußrate von 8 ml/min. zugeführt. Die Probendaten wurden bei 2-5 Hz mit einer Labmaster-Datenerfassungssteckkarte in einem PC 386 unter Verwendung von AXOTAPE Version 1.2 (Axon instruments, Foster City, CA) Software erfaßt. Die Daten wurden zu einem Laserdrucker exportiert oder mit Hilfe von Sigmaplot Version 5.0 graphisch dargestellt.
NMDA-Agonisten, d. h., 10-30 uM Glycin (Gly) und 10-100 uM Glutamat (Glu) oder 100-1000 uM NMDA, wurden dem Bad zugeführt. Falls eine Stromreaktion beobachtet wurde, wurden die Agonisten aus dem Bad gewaschen und 0,1-1,0 mM MgCl&sub2; oder 1 uM MK801 (Research Biochemicals, Inc., Natick, MA) (NMDA-Rezeptor-Antagonisten) wurden vor der Zufuhr eines zweiten Agonisten zugeführt, um festzustellen, ob der Strom durch Antagonisten blockiert wurde. Alternativ wurden MgCl&sub2; oder MK-801 während eines von einem Agonisten induzierten Stromflusses zugeführt. Die Ergebnisse mehrfacher Aufzeichnungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. TABELLE 1 Elektrophysiologische Analyse von Oozyten, denen NMDA-Rezeptoruntereinheitstranskripte injiziert worden waren
a Die Oozyten waren beeinträchtigt (d. h., der Haltestrom war groß).
* Die agonist-induzierten Ströme in mindestens einer Zelle wurden durch 100 uM MgCl&sub2; blockiert.
&spplus; Die agonist-induzierten Ströme in mindestens einer Zelle wurden durch 1,0 uM MK801 blockiert.
Die Analyse der in Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse zeigt an, daß im allgemeinen die durch NMDA-Agonisten induzierten Ströme durch entweder MgCl&sub2; oder MK801 blockiert wurden.
Oozyten, denen Transkripte (12,5 bis 65 ng) der für die NMDAR-1-Untereinheit kodierenden Inserts der Konstrukte NMDAR1A, NMDAR1-I63 oderr NMDAR1-Δ363 injiziert worden waren, wurden weiter analysiert, um die Human-NMDA-Rezeptorsensitivität gegenüber Glutamat und NMDA zu beurteilen. Die oben beschriebenen Zweielektroden-Spannungsklammer-Methoden wurden zur Strommessung in den Zellen eingesetzt.
Zur Bestimmung der Glutamat- und NMDA-Sensitivität der rekombinanten humanen NMDA- Rezeptoren wurden verschiedene Konzentrationen an Glutamat (0,1-100 uM) oder NMDA (3-1000 uM) dem Bad zugeführt (in Gegenwart von 10-30 uM Glycin) und die Stromreaktion wurde aufgezeichnet. Das Bad wurde zwischen den Zuführungen von Agonist gespült. Zwischen-Testzuführungen von 10 uM Glycin + 10 uM Glutamat waren in den Experimenten eingeschlossen, um die Rezeptoren hinsichtlich "Run-down" (d. h., Inaktivierung von Rezeptoren, die während einer längeren elektrophysiologischen Aufzeichnung wiederholt aktiviert wurden) zu überprüfen. Die Daten wurden dazu verwendet, um Dosis-Wirkung- Kurven zu erstellen, aus denen EC&sub5;&sub0; -Werte für die beiden Agonisten berechnet wurden. Die Glycin-Sensitivität wurde auf gleiche Weise bestimmt, mit Ausnahme dessen, daß verschiedene Konzentrationen (0,1-100 uM) an Glycin zusammen mit 100 uM NMDA zugeführt wurden.
Die EC&sub5;&sub0;-Werte, welche für die Glutamat-Stimulation von NMDA-Rezeptoren bestimmt wurden, die in Oozyten exprimiert wurden, denen NMDAR1A-, NMDAR1-I63- oder NMDAR1-Δ363-Transkripte injiziert worden waren, betrugen 0,4, 0,6 bzw. 0,5 uM. Die EC&sub5;&sub0;- Werte, welche für die NMDA-Stimulierung von NMDA-Rezeptoren bestimmt wurden, die in Oozyten exprimiert wurden, denen NMDAR1A-, NMDAR1-I63- oder NMDAR1-Δ363- Transkripte injiziert worden waren, betrugen 6,3, 10,9 bzw. 11,9 uM.
Es gab als Reaktion auf Glutamat und Glycin bei Oozyten, denen in vitro-Transkripte von pCMV-hNMDAR2A-3(53) und NMDAR1A oder NMDAR1-I63 coinjiziert worden waren, eine ausgeprägte Zunahme der Stromhöhe im Vergleich zu den Strömen, welche in Oozyten aufgezeichnet wurden, denen Transkripte von entweder NMDAR1A oder NMDAR1-I63 allein injiziert worden waren. Gleichermaßen gab es es eine deutliche Zunahme der Stromhöhe als Reaktion auf Glutamat und Glycin bei Oozyten, denen in vitro-Transkripte von NMDAR1A und pBS-hNMDAR2B coinjiziert worden waren, im Vergleich zu den aufgezeichneten Strömen bei Oozyten, denen nur das NMDAR1A-Transkript injiziert worden war.
Zur Untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften von humanen NMDA-Rezeptoren, welche durch Coexpression der humanen NMDAR1A-, NMDAR2A- und NMDAR2C- Untereinheiten gebildet worden waren, wurden jeweils 50 ng von in vitro-Transkripten, hergestellt von den NMDAR1A-, pCMV-hNMDAR2A-3- und pCMV-26-NotI-24 (NMDAR2C)- Konstrukten, in Oozyten coinjiziert. Die Sensitivität der rekombinanten heteromeren Rezeptoren für Glycin und NMDA wurde wie oben beschrieben bestimmt. Der EC&sub5;&sub0;-Wert für die Glycin-Aktivierung von einwärts gerichteten Strömen in diesen rekombinanten Oozyterr wurde anhand der Dosis-Wirkung-Kurve als 0,87 + 0,24 uM (Mittelwert ± S.A. von 4 Oozyten) berechnet, was sich signifikant von demjenigen EC&sub5;&sub0;-Wert unterschied, der für die Glycin-Sensitivität von Oozyten berechnet wurde, denen jeweils 50 ng von in vitro- Transkripten von NMDAR1A und pCMV-hNMDAR2A-3 allein injiziert worden war (1,9 ± 0,26 uM; p = 0,0002, einzweigiger p-Test). Die Sensitivität für NNIDA erhöhte sich auch, wenn Human-NMDAR2C mit Human-NMDAR1A- und NMDAR2A-Untereinheiten coexprimiert wurde. Der EC&sub5;&sub0;-Wert für NMDA verschob sich von 30,2 ± 9,4 uM für Oozyten, denen jeweils 50 ng von in vitro-Transkripten von NMDAR1A und pCMV-hNMDAR2A-3 coinjiziert worden war, auf 11,9 ± 5,2 uM für Oozyten, denen jeweils 50 ng von in vitro-Transkripten von NMDAR1A, pCMV-hNMDAR2A-3 und pCMV-26-NotI-24 coinjiziert worden war (Mittelwert ± S.A. von 4 Oozyten).

BEISPIEL 10

Rekombinante Expression von humanen NMDA-Rezeptoruntereinheiten in Säugerzellen

Säugerzellen, z. B. Human-Embryonen-Nieren (HEK293)-Zellen können vorübergehend und/oder stabil mit DNA transfiziert werden, die für humane NMDA-Rezeptoruntereinheiten kodiert (z. B. DNA, die für eine NMDAR1-Untereinheit kodiert, oder DNA, die für eine NMDAR1-Untereinheit kodiert, und DNA, die für eine NMDAR2-Untereinheit kodiert, wie z. B. pCMV'-26-NotI-24, pCMV-hNMDAR2A-3(53) oder pCMVPL3-hNMDAR2B). Transfektanten werden unter Einsatz verschiedener Assays, z. B. Northernblot-Hybridisierung, elektrophysiologische Aufzeichnung von Zellströmen, Ca²&spplus;- sensitive Assays auf Fluoreszenzindikator- Basis und [³H]-MK801-Bindungsassays, hinsichtlich Expression von NMDA-Rezeptoren analysiert.

A. Vorübergehende Transfektion von HEK-Zellen

Es wurden zwei vorübergehende Transfektionen durchgeführt. Bei einer Transfektion wurden HEK 293-Zellen vorübergehend mit DNA transfiziert, die für eine NMDAR1-Untereinheit kodiert (Konstrukt NMDAR1A). Bei einer weiteren Transfektion wurden HEK 293-Zellen vorübergehend mit DNA cotransfiziert, welche für die Untereinheiten NMDAR1 (Konstrukt NMDAR1A) und NMDAR2C (pCMV-26-NotI-24) kodiert. Bei beiden Transfektionen wurden ~2 · 10&sup6; HEK-Zellen vorübergehend mit 19 ug des angegebenen Plasmids bzw. der angegebenen Plasmide nach Standard-CaPO&sub4;-Transfektionsverfahren [Wigler et al. (1979), Proc Natl. Acad. Sci. USA 76: 1373-1376] transfiziert. Zusätzlich wurde 1 ug des Plasmids pCMVßgal (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), welches das Escherichia coli-β-Galactosidasegen fusioniert mit dem CMV-Promotor enthält, als Reportergen zur Überprüfung der Transfektionseffizienz cotransfiziert. Die Transfektanten wurden durch direkte Färbung des Produkts einer Reaktion, welche β-Galactosidase und das X-Gal-Substrat beinhaltet, [Jones (1986), EMBO 5: 3133-3142] hinsichtlich β-Galactosidase-Expression analysiert. Transfektanten können auch hinsichtlich β-Gafactosidase-Expression durch Messung der β-Gafactosidase-Aktivität analysiert werden [Miller (1972) in Experiments in Molecular Genetics, S. 352-355, Cold Spring Harbor Press].
Die Effizienz dieser Transfektionen von HEK-Zellen war typisch für Standardeffizienzen (d. h., ~50%).

B. Stabile Transfektion von Säugerzellen

Säugerzellen, z. B. HEK 293-Zellen, können durch Anwendung des Calciumphosphat- Transfektionsverfahrens [Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1, Wiley Inter-Science, Ergänzung 14, Einheit 9.1.1-9.1.9 (1990)] stabil transfiziert werden. 10-cm-Platten, jeweils 1-2 · 10&sup6; Zellen enthaltend, werden mit 10 ml DNA/Calciumphosphat-Präzipitat in Medien transfiziert, die etwa 19 ug an für eine NMDA-Rezeptoruntereinheit kodierender DNA und 1 ug DNA, die für einen selektierbaren Marker, z. B. das Neomycin-Resistenzgen, kodiert, (d. h., pSV2neo) enthalten. Nach ~ 14 Tagen Wachstum in Medien, die typischerweise 1 ug/ml G418 enthalten, bilden sich Kolonien und werden individuell mit Hilfe von Klonierungszylindern isoliert. Die Isolate werden dann einer Grenzverdünnung unterworfen und gescreent, um diejenigen zu identifizieren, welche NMDA-Rezeptoren exprimieren, wobei beispielsweise im folgenden beschriebenen Verfahren angewandt werden.

C. Analyse von Transfektanten

1. Northernblot-Hybridisierungsanalyse

Gesamt-RNA wurde aus ~ 1 · 10&sup7; HEK-Zellen, die mit NMDAR1 und pCMV-26-NotI-24 cotransfiziert worden waren, isoliert und 5-10 ug RNA wurden für eine Northern-Hybridisierungsanalyse eingesetzt. Fragmente von Plasmiden, die für eine humane neuronale NMDAR-Untereinheit kodierten, wurden statistisch geprimt und mittels ³²P-dCTP-Klenow- Inkorporation markiert und als Sonden eingesetzt. Die Northernblot-Hybridisierung und die Waschbedingungen waren wie folgt:
Hybridisierung in 5 · SSPE, 5 · Denhart's Lösung, 50% Formamid, bei 42ºC, gefolgt von Waschen in 0,2 · SSPE, 0,1% SDS, bei 65ºC.
Die Ergebnisse dieser Studien offenbarten, daß die Transfektanten nachweisbare Niveaus von NMDAR1- und NMDAR2C-mRNA der geeigneten Größe exprimierten (basierend auf der Größe der cDNAs).

2. Assays auf Fluoreszenzindikator-Basis

Die Aktivierung von ligandengesteuerten NMDA-Rezeptoren durch Agonisten führt zu einem Einstrom von Kationen (sowohl einwertigen als auch zweiwertigen), einschließlich Ca²&spplus;, durch den Rezeptorkanal. Der Calciumeintritt in die Zelle durch den Kanal kann wiederum die Freisetzung von Calcium induzieren, das in intrazellulären Speichern enthalten ist. Der Eintritt eines einwertigen Kations in die Zelle durch den Kanal kann auch zu einer Erhöhung der zytoplasmatischen Calciumniveaus durch Depolarisation der Membran und anschließende Aktivierung von spannungsabhängigen Calciumkanälen führen. Deshalb können Verfahren zum Nachweis vorübergehender Erhöhungen der intrazellulären Calciumkonzentration für die Analyse funktioneller NMDA-Rezeptorexpression eingesetzt werden. Ein Verfahren zur Messung der Niveaus von intrazellulärem Calcium beruht auf calciumsensitiven Fluoreszenzindikatoren.
Calcium-sensitive Indikatoren, z. B. Fluo-3 (Katalog-Nr. F-1241, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), sind erhältlich als Acetoxymethylester, welche die Membran durchdringen können. Wenn die Acetoxymethylesterform des Indikators in eine Zelle eintritt, wird die Estergruppe durch zytosolische Esterasen entfernt, wodurch der freie Indikator in Zytosol eingeschlossen wird. Die Wechselwirkung des freien Indikators mit Calcium resultiert in erhöhter Fluoreszenz des Indikators, deshalb kann eine Zunahme der intrazellulären Ca²&spplus;- Konzentration von Zelleen, welche den Indikator enthalten, direkt als Zunahme der Fluoreszenz ausgedrückt werden. Ein automatisches Fluoreszenz-Nachweissystem zum Nachweis von NMDA-Rezeptoren wurde im US-Patent Nr. 5,670,113 und der entsprechenden PCT-Patentanmeldung Nr. WO 93/13423 beschrieben.
Säugerzellen, welche mit DNA, die für NMDAR1- oder NMDAR1- und NMDAR2-Untereinheiten kodiert, transfiziert wurden, können hinsichtlich Expression von funktionellen rekombinanten NMDA-Rezeptoren unter Verwendung des automatischen Assays auf Basis eines Fluoreszenzindikators analysiert werden. Das Assayverfahren ist wie folgt:
Untransfizierte Säuger-Wirtszellen (oder Wirtszellen, die vorübergehend mit pCMV-T7-2 transfiziert wurden) und Säugerzellen, die mit NMDAR1 ± NMDAR2-Untereinheits-DNA transfiziert wurden, werden in die Mulden einer 96-Mulden-Mikrotiterschale (Nung-Katalog- Nr. 1-6708, erhältlich von Alameda Industries, Escondido, CA) ausplattiert, welche mit Poly- L-lysin in einer Dichte von 2,5 · 10&sup5; Zellen/Mulde vorbeschichtet und mit Fluo-3 durch Inkubation für 2 Stunden bei 20ºC in einem Medium, das 20 uM Fluo-3, 0,2% Pluronic F-127 in HBS (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl&sub2;, 0,62 mM MgCl&sub2;, 20 mM Glucose, 20 mM HEPES, pH 7,4) enthielt, beladen wurden. Die Zellen werden dann mit Assay-Puffer (d. h., HBS) gewaschen. Die Mikrotiterschale wird dann in ein Fluoreszenz-Plattenlesegerät eingebracht (z. B. Fluoroskan II, Lab Products International, Ltd., Raleigh, NC) und die Grundfluoreszenz einer jeden Mulde wird vor der Zugabe von 10 uM Glycin und 10 uM Glutamat zu den Mulden gemessen und aufgezeichnet. Die Fluoreszenz der Mulden wird nach Zugabe eines Agonisten wiederholt überprüft (75 Ablesungen in 0,63-sekündigen Intervallen).
Die Fluoreszenz der untransfizierten Wirtszellen wird sich vorzugsweise nach der Zugabe von Glycin und Glutamat nicht ändern, d. h., die Wirtszellen sollten keine endogenen exzitatorischen Aminosäure-Rezeptoren exprimieren. Die Fluoreszenz von Säugerzellen, die mit NDMAR1 ± NMDAR2-Untereinheits-DNA transfiziert wurden, wird nach Zugabe von Glycin und Glutamat ansteigen, falls eine ausreichende Zahl funktioneller NMDA-Rezeptoren auf der Zelloberfläche exprimiert wird und die Fluoreszenzablesungen schnellvorgenommen werden.
Das Ruhepotential der Membran einiger Säuger-Wirtszellen kann relativ positiv sein (z. B. -35 mV). Nachdem die Aktivierung einiger NMDA-Rezeptoren bei relativ positiven Potentialen beträchtlich verringert sein kann, mag es erforderlich sein, das Ruhepotential der Membran von Zellen, die mit Human-NMDA-Rezeptoruntereinheits-kodierenden DNAs transfiziert wurden, vor der Untersuchung der Zellen hinsichtlich NMDA-Rezeptoraktivität unter Verwendung des Assays auf Fluoreszenzindikator-Basis zu verringern. Dies kann erzielt werden durch Zugabe von Valinomycin (~10 uM) zu den transfizierten Zellen vor der Zugabe von NMDA-Rezeptor-Agonisten, um den Assay zu starten.

3. NMDA-Rezeptorliganden-Bindungsassays

Säugerzellen, die mit NMDAR1 + NMDAR2-Untereinheits-DNAs transfiziert wurden, können hinsichtlich [³H]-MK801-Bindung analysiert werden. Ein zusätzlicher Liganden-Bindungsassay hinsichtlich NMDA-Rezeptoren unter Verwendung von ³H-CGP39653 wird ebenfalls im folgenden beschrieben. Rattengehirnmembranen sind in den Bindungsassays als positive Kontrolle eingeschlossen.

a. Herstellung von Membranen

1. Leukozytenmanschettenhomogenat aus der Rattengehirnrinde

Leukozytenmanschettenmembranen werden aus Rattengehirnrinden präpariert wie von Jones et al. [(1989) J. Pharmacol. Meth. 21: 161] beschrieben. In Kürze, Cortices von zehn frisch aufgetauten eingefrorenen Rattengehirnen werden zerkleinert und gewogen. Das Gewebe wird in 20 Volumina von 0,32 M eiskalter Sucrose in einem gläsernen Homogenisierungsröhrchen unter Verwendung eines Teflon-Pistills homogenisiert. Die Suspension wird mit 1.000 · g 10 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und 20 Minuten lang bei 4ºC mit 20.000 · g zentrifugiert. Das Pellet wird in 20 Volumina eiskaltem destillierten Wasser mit einem Polytron für 30 Sekunden bei Einstellung 6 resuspendiert. Die Suspension wird 20 Minuten lang bei 4ºC mit 8.000 · g zentrifugiert. Das Leukozytenmanschettenpellet wird sanft mit Überstand gespült und dann erneut 20 Minuten lang bei 400 mit 48.000 · g zentrifugiert. Das Pellet wird erneut in 20 Volumina eiskaltem destilliertem Wasser mit einem Polytron resuspendiert und erneut 20 Minuten lang mit 48.000 · g zentrifugiert. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Die endgültige Suspension wird in Aliquots aufgeteilt, zentrifugiert. Jedes Pellet kann eingefroren bei -20ºC; 12 Stunden lang oder länger vor der Verwendung gelagert werden.

i. Membranen von transfizierten und untransfizierten Säugerzellen

Zur Gewinnung von Membranen von transfizierten und untransfizierten Säugerzellen werden die Zellen von den Gewebekulturplatten abgeschabt und die Platten mit 5 ml PBS (phosphatgepufferte Salzlösung: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 1,7 mM KH&sub2;PO&sub4;) gespült. Die Zellen werden mit niedriger Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge zentrifugiert und das Zellpellet wird mit PBS gespült. Das Zellpellet wird in 20 ml 10 mM Hepes- Puffer, pH 7,4, unter Verwendung eines Polytrons bei Einstellung 3-6 für 30 Sekunden resuspendiert. Die Zellsuspension wird 20 Minuten lang bei 4ºC mit 48.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird 12 Stunden oder länger bei -20ºC gehalten.

b. [³H]-MK801-Bindung an NMDA-Rezeptoren

Die Bindung von [³H]-MK801 an NMDA-Rezeptoren wird wie von Wong et al. [(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7104] beschrieben mit einigen kleineren Veränderungen durchgeführt. Somit werden am Tag des Assays die Membranpellets aus Rattengehirn und Säugerzellen (transfizierte und untransfizierte) in 50 Volumina 10 mM Hepes-Puffer, pH 7,4, unter Verwendung einer 10-ml-Spritze und einer 21-Gauge-Nadel resuspendiert und 20 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Der Überstand wird 20 Minuten lang bei 4ºC mit 48.000 · g zentrifugiert. Das Pellet wird in 2 ml 10 mM Hepes, pH 7,4, resuspendiert und wie oben beschrieben zentrifugiert. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt und das Pellet wird in 10 ml 10 mM-Hepes, pH 7,4, resuspendiert. Die Proteinkonzentration wird mit Hilfe des Bradford-Reagenzes von Biorad bestimmt. Das Pellet wird schließlich in dem Assay- Puffer (10 mM Hepes, pH 7,4) mit 1 mg/ml resuspendiert.
Für die Bindungsstudien wird die Membransuspension in doppelter Ausführung mit 2,5 nM [³H]-MK801 (New England Nuclear, Boston, MA) in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml Assay-Puffer (10 mM Hepes, pH 7,4) in Gegenwart und Abwesenheit von 10 uM Glutamat und 10 uM Glycin 60 oder 120 Minuten lang bei 23ºC inkubiert. Die gebundene Radioaktivität wird von der freien Radioaktivität mittels schneller Filtration durch Whatman GF/C-Filter, welche 2-3 Stunden lang in 0,05%igem Polyethylenimin vorgetränkt worden sind, abgetrennt. Die Filter werden zweimal mit 3 ml eiskaltem Assay-Puffer gewaschen. Die Filter werden getrocknet und in Szintillationsgefäße überführt, die jeweils 10 ml Szintilfationsflüssigkeit enthalten. Die Gefäße werden mechanisch verwirbelt (gevortext) und die Radioaktivität in einem Beckman-Szintillationszähler gemessen. Die unspezifische Bindung, die in Gegenwart von 10 uM MK801 beobachtet wird, wird von der Gesamtbindung subtrahiert, um die spezifische Bindung zu bestimmen.
Rattengehirnrinden-Leukozytenmanschettenmembranen zeigten eine spezifische sättigungsfähige Bindung von [³H]-MK801. In Gegenwart von Glycin und Glutamat betrug das Verhältnis der gesamten zur unspezifischen Bindung (S : N-Verhältnis) 28 : 1, wohingegen in Abwesenheit von Glutamat und Glycin das S : N-Verhältnis 5 : 1 betrug. Somit wird die Bindung von MK801 an Ratten-NMDA-Rezeptoren durch glutamaterge Agonisten verstärkt. Eine Scatchard-Analyse der [³H]-MK801-Bindung an Rattengehirnmembranen zeigte, daß die Sensitivität des Assays 90 fMol an Rezeptor betrug.

c. [³H]-CGP39653-Bindung an NMDA-Rezeptoren

Die Bindung von [³H]-CGP39653 an Rattengehirnmembranen wird durchgeführt wie von Sills et al. [(1991) Eur. J. Pharmacol. 192: 19] beschrieben. Das Leukozytenmanschettenmembran-Pellet wird in 50 Volumina 5 mM Tris-HCl, enthaltend 10 mM EDTA, pH 7,7, resuspendiert und 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Der Überstand wird mit 48.000 · g 10 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Der Waschschritt wird einmal wiederholt und das Pellet in 10 ml 5 mM Tris-HCl, enthaltend 10 mM EDTA, pH 7,7, resuspendiert. Diese Rattengehirnmembran-Suspension wird in doppelter oder dreifacher Ausführung mit 2,0 nM [³H]- CGP39653 (New England Nuclear) in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml Assay-Puffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,7) 60 Minuten lang bei 0ºC inkubiert. Die unspezifische Bindung wird in Gegenwart von 100 uM Glutamat bestimmt. Die gebundene Radioaktivität wird von der freien Radioaktivität mittels Vakuumfiltration durch GF/C-Filter abgetrennt, welche 2-3 Stunden lang in 0,05%igem Polyethylenimin vorgetränkt worden sind, wobei der Filtrationskollektor eingesetzt wurde. Die ungebundene Radioaktivität wird mit 2 Waschungen von jeweils 3 ml eiskaltem Puffer entfernt. Die Filter werden getrocknet und in Szintillationsgefäße überführt, die jeweils 10 ml Szintillationsflüssigkeit enthalten. Die Gefäße werden gevortext und die Radioaktivität wird in einem Beckman-Szintillationszähler gemessen. Die unspezifische Bindung, die in Gegenwart von 100 uM Glutamat beobachtet wird, wird von der Gesamtbindung subtrahiert, um die spezifische Bindung zu bestimmen.
Die [³H]-CGP39653-Bindung wurde zuerst als Funktion der Membrankonzentration gemessen. Die spezifische Bindung nahm linear mit zunehmender Membrankonzentration bis zu 200 ug Protein in Gegenwart von 2 nM [³H]-CGP39653 zu.
Eine Sättigungsanalyse der [³H]-CGP39653-Bindung wurde durch Inkubation von 150 ug Rattenleukozytenmanschetten-Homogenat mit zunehmenden Konzentrationen an [³H]- CGP39653 für 60 Minuten bei 4ºC durchgeführt. Die Scatchard-Analyse zeigte eine einzige Klasse von Bindungsstellen mit einem Bmax-Wert von 0,69 ± 0,09 pMol/mg und einem Kd- Wert von 12,3 ± 0,12 nM an.

Zusammenfassung der Sequenzen

Sequenz-ID-Nr. 1 ist eine Nukleotidsequenz, die für eine humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit, NMDAR1A, kodiert, und die abgeleitete Aminosäuresequenz davon.
Sequenz-ID-Nr. 1A ist eine Sequenz von 3083 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA10, welche die Nukleotide 320-3402 von Sequenz-ID-Nr. 1 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 1A von Sequenz-ID-Nr. 1 darin, daß sie weder die 319 5'-Nukleotide noch die 896 3'-Nukleotide davon enthält.
Sequenz-ID-Nr. 1B ist eine Sequenz von 3155 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA11, welche die Nukleotide 1-2961 plus die Nukleotide 3325-3518 von Sequenz-ID-Nr. 1 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 1B von Sequenz-ID-Nr. 1 durch die Deletion von 363 Nukleotiden vom 3'-Abschnitt davon (d. h., durch die Deletion der Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID-Nr. 1) und ferner durch das Fehlen der 781 terminalen 3'-Nukleotide von Sequenz-ID-Nr. 1.
Sequenz-ID-Nr. 1C ist eine Sequenz von 2542 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA7, welche die Nukleotide 556-831 von Sequenz-ID-Nr. 1 plus zusätzliche 63 Nukleotide (in Sequenz-ID-Nr. 3 angegeben) und die Nukleotide 832-984, 1189-2961 und 3325-3599 von Sequenz-ID-Nr. 1 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 1C von Sequenz-ID-Nr. 1 darin, daß sie nicht die am weitesten 5' gelegenen 555 Nukleotide davon enthält, nicht die 204 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind, nicht die 363 3'-Nukleotide enthält, die als Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind, und nicht die 700 am weitesten 3' liegenden Nukleotide von Sequenz-ID- Nr. 1 enthält, während sie zusätzliche 63 Nukleotide (Sequenz-ID-Nr. 3) enthält, die zwischen den Nukleotiden 831 und 832 von Sequenz-ID-Nr. 1 inseriert sind.
Sequenz-ID-Nr. 1D ist eine Sequenz von 593 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA3, welche die Nukleotide 2617-2961 plus die Nukleotide 4049-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 1 D von Sequenz-ID-Nr. 1 darin, daß sie nicht die 2616 5'-Nukleotide davon enthält, und durch die Deletion von 1087 Nukleotiden vom 3'-Abschnitt davon (d. h., durch die Deletion der Nukleotide 2962-4048 von Sequenz-ID- Nr. 1).
Sequenz-ID-Nr. 1E ist eine Nukleotidsequenz, kodierend für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-Δ363, welche die Nukleotide 1-2961 plus die Nukleotide 3325-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 1E von Sequenz-ID- Nr. 1 darin, daß sie nicht die 363 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1F ist eine Nukleotidsequenz, kodierend für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NDMAR1-Δ1087, welche die Nukleotide 1-2961 plus die Nukleotide 4049-4298 von Sequenz-ID-Nr. 1 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 1F von Sequenz-ID- Nr. 1 darin, daß sie nicht die 1087 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 2962-4048 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1G ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-I63 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1G ist die gleiche wie Sequenz-ID-Nr. 1 und umfaßt ferner zusätzliche 63 Nukleotide (in Sequenz-ID-Nr. 3 angegeben), die zwisclhen den Nukleotiden 831 und 832 von Sequenz-ID-Nr. 1 inseriert sind.
Sequenz-ID-Nr. 1H ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-I63-Δ204 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1H ist die gleiche wie Sequenz-ID- Nr. 1G, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 1H nicht die 204 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1I ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-I63-Δ204-Δ363 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1I ist die gleiche wie Sequenz-ID-Nr. 1H, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 1I nicht die 363 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1J ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-Δ204 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1J ist die gleiche wie Sequenz-ID-Nr. 1, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 1J nicht die 204 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1K ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-Δ204-Δ363 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1K unterscheidet sich von Sequenz-ID-Nr. 1 darin, daß Sequenz-ID-Nr. 1K weder die 204 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind, noch die 363 Nukleotide, die als Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1L ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-Δ204-Δ1087 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1L unterscheidet sich von Sequenz-ID-Nr. 1 darin, daß Sequenz-ID-Nr. 1L weder die 204 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 985-1188 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind, noch die 1087 Nukleotide, die als Nukleotide 2962-4048 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1M ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-I63-A363 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1M ist die gleiche wie Sequenz-ID- Nr. 1G, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 1M nicht die 363 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 2962-3324 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1N ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NDMAR1-I63-Δ1087 kodiert. Sequenz Nr. 1N ist die gleiche wie Sequenz-ID-Nr. 1G, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 1N nicht die 1087 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 2962-4048 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 1P ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR1-I63-Δ204-Δ1087 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 1P ist die gleiche wie Sequenz-ID-Nr. 1H, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 1 P nicht die 1087 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 2962-4048 von Sequenz-ID-Nr. 1 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 2 ist die Aminosäuresequenz der in Sequenz-ID-Nr. 1 angegebenen NMDA- Rezeptoruntereinheit.
Sequenz-ID-Nr. 2A ist die Aminosäuresequenz eines Abschnitts einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1A kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 2B ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1B kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2C ist die Aminosäuresequenz eines Abschnitts einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1G kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 2D ist die Aminosäuresequenz eines Abschnitts einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1D kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 2E ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die vor der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1E kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2F ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nlukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1F kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2G ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1G kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2H ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1H kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 21 ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1I kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2J ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1J kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2K ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1K kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2L ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der IVukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1L kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2M ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1M kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2N ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1N kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 2P ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, die von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 1P kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 3 ist eine Nukleotidsequenz, die für das Insert von 63 Nukleotiden kodiert, das in den Sequenz-ID-Nrn. 1C, 1G, 1H, 1I, 1M, 1N und 1P vorliegt.
Sequenz-ID-Nr. 4 ist die 21-Aminosäuren-Sequenz, die von dem in Sequenz-ID-Nr. 3 angegebenen Insert kodiert wird.
Sequenz-ID-Nr. 5 ist eine Nukleotidsequenz eines Klons (pCMV-26-NotI-24), kodierend für eine humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit, NMDAR2C, und die abgeleitete Aminosäuresequenz davon.
Sequenz-ID-Nr. 5A ist eine Sequenz von 2026 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA21, welche die Nukleotide 931-2350 und 2402-3307 von Sequenz-ID-Nr. 5 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 5A von Sequenz-ID-Nr. 5 darin, daß sie weder die 930 5'-Nukleotide davon enthält noch die 51 Nukleotide, die sich an Position 2351-2401 von Sequenz-ID-Nr. 5 befinden, noch die 1061 3'-Nukleotide von Sequenz-ID-Nr. 5.
Sequenz-ID-Nr. 5B ist eine Sequenz von 3698 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA22, welche die Nukleotide 367-1300 von Sequenz-ID-Nr. 5 plus zusätzliche 11 Nukleotide (angegeben als Sequenz-ID-Nr. 9) und die Nukleotide 130'1-1959 und 1975-4068 von Sequenz-ID-Nr. 5 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 5B von Sequenz-ID-Nr. 5 durch das Fehlen der 366 am weitesten 5'-gelegenen Nukleotide, durch die Insertion von 11 Nukleotiden zwischen den Nukleotiden 1300 und 1301 von Sequenz-ID-Nr. 5 und ferner durch das Fehlen der 15 Nukleotide von Rest 1960 bis Rest 1974 von Sequenz-ID-Nr. 5.
Sequenz-ID-Nr. 5C ist eine Sequenz von 3243 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA24, welche die Nukleotide 861-1300 von Sequenz-ID-Nr. 5 plus zusätzliche 11 Nukleotide (Sequenz-ID-Nr. 9), die Nukleotide 1301-2350 von Sequenz-ID-Nr. 5, zusätzliche 24 Nukleotide (als Sequenz-ID-Nr. 7 angegeben) und die Nukleotide 2351-4068 von Sequenz- ID-Nr. 5 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 5C von Sequenz-ID-Nr. 5 darin, daß sie nicht die 860 am weitesten 5 gelegenen Nukleotide davon enthält, während sie zusätzliche 11 Nukleotide (Sequenz-ID-Nr. 9), inseriert zwischen den Nukleotiden 1300 und 13()1, plus zusätzliche 24 Nukleotide (Sequenz-ID-Nr. 7), inseriert zwischen den Nukleotiden 2350 und 235 von Sequenz-ID-Nr. 5, enthält.
Sequenz-ID-Nr. 5D ist eine Sequenz von 3025 Nukleotiden, kodiert von dem Klon NMDA26, welche die Nukleotide 1-3025 von Sequenz-ID-Nr. 5 umfaßt. Somit unterscheidet sich Sequenz-ID-Nr. 5D von Sequenz-ID-Nr. 5 darin, daß sie nicht die 1043 3'-terminalen Nukleotide davon enthält.
Sequenz-ID-Nr. 5E ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit pCMV-26-ScaI-24 kodiert, welche sich von Sequenz-ID-Nr. 5 nur durch die Insertion von 24 Nukleotiden (Sequenz-ID-Nr. 7) zwischen den Nukleotiden 2350 und 2351 von Sequenz-ID-Nr. 5 unterscheidet.
Sequenz-ID-Nr. 5F ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit pCMV-26-ScaI-22 kodiert, welche sich von Sequenz-ID-Nr. 5 nur durch die Deletion der Nukleotide 1960-1974 von Sequenz-ID-Nr. 5 unterscheidet.
Sequenz-ID-Nr. 5 G ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit pCMV-26-ScaI-21-NotI-24 kodiert, welche sich von der Sequenz-ID-Nr. 5 nur durch die Deletion der Nukleotide 2351-2401 von Sequenz-ID-Nr. 5 unterscheidet.
Sequenz-ID-Nr. 5H ist ein Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR2C-Δ15-I24 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 5H ist die gleiche wie Sequenz-ID- Nr. 5F, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 5H ferner das in Sequenz-ID-Nr. 7 angegebene Insert von 24 Nukleotiden, positioniert zwischen den Nukleotiden 2350 und 2351 von Sequenz-ID-Nr. 5, enthält.
Sequenz-ID-Nr. 51 ist eine Nukleotidsequenz, welche für die humane NMDA-Rezeptoruntereinheit NMDAR2C-Δ15-Δ51 kodiert. Sequenz-ID-Nr. 5I ist die gleiche wie Sequenz-IID- Nr. 5G, mit Ausnahme dessen, daß Sequenz-ID-Nr. 5I nicht die 15 Nukleotide enthält, die als Nukleotide 1960-1974 von Sequenz-ID-Nr. 5 angegeben sind.
Sequenz-ID-Nr. 6 ist die Aminosäuresequenz der in Sequenz-ID-Nr. 5 angegebenen NMDA- Rezeptoruntereinheit.
Sequenz-ID-Nr. 6A ist die Aminosäuresequenz eines Abschnitts einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5A kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 6B ist die Aminosäuresequenz eines Abschnitts einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5B kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 6C ist die Aminosäuresequenz eines Abschnitts einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5C kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 6D ist die Aminosäuresequenz eines Abschnitts einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5D kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 6E ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, kodiert von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5E.
Sequenz-ID-Nr. 6F ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, kodiert von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5F.
Sequenz-ID-Nr. 6G ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, kodiert von dler Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5G.
Sequenz-ID-Nr. 6H ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, kodiert von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5H.
Sequenz-ID-Nr. 6I ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit, kodiert von der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 5I.
Sequenz-ID-Nr. 7 ist eine Nukleotidsequenz, kodierend für das Insert von 24 Nukleotiden, das in den Sequenz-ID-Nrn. 5C, 5E und 5H vorliegt.
Sequenz-ID-Nr. 8 ist die 7-Aminosäuren-Sequenz, die von den Nukleotiden 2-22 des in Sequenz-ID-Nr. 7 angegebenen Inserts kodiert wird. Nachdem das Insert innerhalb eines Codons eingeführt ist, kodiert das Insert selbst nur für 7 Aminosäuren. Die terminalen Reste des Nukleotid-Inserts sind an der Bildung von Codons mit einer benachbarten Sequenz an der Insertionsstelle beteiligt.
Sequenz-ID-Nr. 9 ist eine Nukleotidsequenz, welche für das Insert von 11 Nukleotiden kodiert, das in den Sequenz-ID-Nrn. 5B und 5C vorliegt.
Sequenz-ID-Nr. 10 ist eine Nukleotidsequenz, die für eine humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit, NMDAR2A, kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 11 ist die Aminosäuresequenz einer NMDA-Rezeptoruntereinheit wie von der in Sequenz-ID-Nr. 10 angegebenen Nukleotidsequenz kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 12 ist die Nukleotidsequenz von 71 Nukleotiden 5'-untranslatierter Sequenz des Klons NMDA27 plus das Initiationscodon (Nukleotide 72-74) des Klons.
Sequenz-ID-Nr. 13 ist eine Nukleotidsequenz eines Klons, der für eine humane N-Methyl-ID- aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit, NDMAR2B, kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 14 ist die Aminosäuresequenz der in Sequenz-ID-Nr. 13 angegebenen NMDA-Rezeptoruntereinheit.
Sequenz-ID-Nr. 15 ist eine Nukleotidsequenz eines Klons, der für eine humane N-Methyl-D- aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit, NMDAR2D, kodiert.
Sequenz-ID-Nr. 16 ist die Aminosäuresequenz der in Sequenz-ID-Nr. 15 angegebenen NMDA-Rezeptoruntereinheit.
Sequenz-ID-Nrn. 17-20 sind vier synthetische Oligonukleotide, die bei der Herstellung eines NMDAR2C-Klons (pCMV-26-NotI-24-GCMOD) mit einem verringerten GC-Nukleotidgehallt zwischen den Nukleotiden 2957 und 3166 eingesetzt wurden.
Sequenz-ID-Nr. 21 ist die Nukleotidsequenz des 195-Basenpaar-Inserts des NMDAR2C- Klons pCMV-26-NotI-24-GCMOD (Ersatz der Nukleotide 2966-3160 von Sequenz-ID-Nr. 5).

SEQUENZVERZEICHNIS

(I) ALLGEMEINE INFORMATION

(i) Anmelden Daggett, Lorrie P.
Ellis, Steven B.
Liaw, Chen W.
Lu, Chin-Chun
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: HUMANE N-METHYL-D-ASPARTAT- REZEPTORUNTEREINHEITEN, DAFÜR KODIERENDE DNA UND VERWENDUNGEN DAFÜR
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 21
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Pretty, Schroeder, Brueggemann & Clark
(B) STRASSE 444 South Flower Street, Suite 2000
(C) STADT: Los Angeles
(D) STAAT: CA
(E) LAND. USA
(F) PLZ 90071-2921
(v) COMPUTERLESBARE FORM
(A) MEDIUMTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Version # 1.25
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER.
(B) EINREICHUNGSDATUM: 20. April 1994
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 08/052,449
(B) EINREICHUNGSDATUM: 20. April 1993
(viii) ANWALTNERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Reiter, Stephen E.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 31.192
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: FP41 9727 (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 619-546-4737
(B) TELEFAX: 619-546-9392
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4298 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 262..3078
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 938 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 2:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 63 Basenpaare
(B) TYP; Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1..63
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 3
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 21 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 4:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4340 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 189..3899.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 5:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1236 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 6:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
(B) LAGE: 2..22
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 7:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 8:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 11 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
(C) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLTYP. cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 9:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4808 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 311..4705
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 10:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1464 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 11:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 74 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(C) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(x) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 12
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5538 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 210..4664
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 13:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1484 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 14:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4695 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 485..4495
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 15:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 16:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1336 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 16:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 17:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 71 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 17:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr 18:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 71 Basenpaare
(C) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 18:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 19:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 61 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 19:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 20:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 20:
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-Nr. 21:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 195 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: beide
(D) TOPOLOGIE: beide
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 21:

Claims

1. Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die für eine humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit kodiert, welche die Sequenz aufweist, die in irgendeiner von Sequenz-ID-Nr. 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2J, 2K, 2L, 2M, 2N oder 2P angegeben ist.

2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die für eine humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit kodiert, welche die in Sequenz-ID-Nr. 2B, 2E, 2F oder 2I angegebene Sequenz von Aminosäuren umfaßt.

3. Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die in Sequenz-ID-Nr. 1E, 1F, 1G, 1H, 1I, 1J, 1K, 1L, 1M, 1N oder 1P angegeben ist, wobei die Sequenz von Nukleotiden diejenige ist, welche für eine Aminosäuresequenz kodiert.

4. Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche identisch oder im wesentlichen identisch mit der Sequenz von Nukleotiden ist, die in Sequenz-I D-Nr. 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H, 1I, 1J, 1K, 1L, 1M, 1N oder 1P angegeben ist.

5. Nukleinsäure nach Anspruch 2, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche identisch oder im wesentlichen identisch mit der Sequenz von Nukleotiden ist, die in Sequenz-I D-Nr. 1B, 1E, 1F oder 1I angegeben ist.

6. Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die für eine humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptoruntereinheit kodiert, wobei die Untereinheit eine NMDAR2C- oder NMDAR2D-Untereinheit ist.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, wobei die Untereinheit die Aminosäuresequenz von Sequenz-ID-Nr. 6, 6E, 6F, 6G, 6H oder 6I aufweist.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 6, wobei die Sequenz von Nukleotiden unter hochstringenten Bedingungen mit irgendeiner der Nukleotidsequenzen von Sequenz-ID- Nr. 5, 5A, 5B, 5C, 5D, 5E, 5F, 5G, 5H oder 5I hybridisiert.

9. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die in Sequenz-ID-Nr. 5, 5E, 5F, 5 G, 5H oder 5I angegeben ist, wobei die Sequenz von Nukleotiden diejenige ist, welche für eine Aminosäuresequenz kodiert.

10. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend die Sequenz von Nukleotiden, die von Position 189 bis 3899 der Sequenz-ID-Nr. 5 angegeben ist.

11. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche identisch oder im wesentlichen identisch mit der Sequenz von Nukleotiden ist, die in Sequenz-ID-Nr. 5, 5E, 5F, 5G, 5H oder 5I angegeben ist.

12. Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die für eine humane N-Methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptor 2B-Untereinheit kodiert, wobei die Sequenz von Nukleotiden unter hochstringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 13 hybridisiert.

13. Isolierte Nukleinsäure, kodierend für eine humane N-Methyl-D-aspartat-Rezeptor 2B- Untereinheit, umfassend die von Nukleotidposition 210 bis 4664 der Sequenz-ID-Nr. 13 angegebene Sequenz von Nukleotiden.

14. Nukleinsäure nach Anspruch 13, umfassend die in Sequenz-ID-Nr. 13 angegebene Sequenz von Nukleotiden.

15. Nukleinsäure nach Anspruch 6, wobei die Untereinheit die Aminosäuresequenz von Sequenz-ID-Nr. 6 umfaßt.

16. Nukleinsäure nach Anspruch 6, wobei die Sequenz von Nukleotiden unter hochstringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz von Sequenz-ID-Nr. 15 hybridisiert.

17. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche mit der in Sequenz-ID-Nr. 15 angegebenen Sequenz von Nukleotiden identisch oder im wesentlichen identisch ist.

18. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend die von Nukleotidposition 485 bis 4495 der Sequenz-ID-Nr. 15 angegebene Sequenz von Nukleotiden.

19. Isolierte Nukleinsäure, die für die humane N-Methyl-D-aspartat-Rezeptoruntereinheit NMDAR2A kodiert, welche die in Sequenz-ID-Nr. 10 angegebene Sequenz der Nukleotide 1 bis 3084 umfaßt.

20. Nukleinsäure nach Anspruch 19, welche die in Sequenz-ID-Nr. 10 angegebene Sequenz von Nukleotiden umfaßt.

21. Isolierte Nukleinsäure, kodierend für eine humane N-Methyl-D-aspartat-Rezeptoruntereinheit, umfassend die von Nukleotidposition 311 bis 4705 in Sequenz-ID-Nr. 10 angegebene Sequenz von Nukleotiden.

22. Isolierte humane Nukleinsäuresequenz, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, welche ausgewählt ist aus einer Sequenz von Nukleotiden, die (I) im wesentlichen für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert wie diejenige, die von dem NMDAR2A- kodierenden Abschnitt des Klons NMDA57 kodiert wird, oder (2) unter hochstringenten Bedingungen mit dem NMDAR2A-kodierenden Abschnitt des Klons NMDA57 hybridisiert, oder (3) im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie die kodierende Sequenz in dem NMDAR2A-kodierenden Abschnitt des Klons NMDA57 enthält, wobei der Klon NMDA57 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 75442 hinterlegt ist.

23. Isolierte Nukleinsäuresequenz, umfassend (I) eine Sequenz von Nukleotiden, welche für dieselbe Aminosäuresequenz kodiert wie diejenige, die von dem NMDAR2A- kodierenden Abschnitt des Klons NMDA57 kodiert wird, oder (II) dieselbe Sequenz von Nukleotiden wie die kodierende Sequenz in dem NMDAR2A-kodierenden Abschnitt des Klons NMDA57 enthält, wobei der Klon NMDA57 unter der ATCC- Hinterlegungsnummer 75442 hinterlegt ist.

24. Klon NMDA57 mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 75442.

25. Isoliertes Protein, kodiert von der DNA nach irgendeinem der Ansprüche 1-11 und 15-18.

26. Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1-23, wobei die Nukleinsäure mRNA ist.

27. Eukaryotische Zellen, die mit der Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1-24 transformiert sind.

28. Eukaryotische Zellen, die mit der Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1-23 transformiert sind und diese exprimieren.

29. Zellen nach Anspruch 28, welche funktionelle heterologe NMDA-Rezeptoren exprimieren.

30. Amphibien-Oozyten, welche die mRNA nach Anspruch 26 exprimieren.

31. Nukleinsäure-Sonden, umfassend mindestens 14 zusammenhängende Nukleotide, welche von irgendeiner der Sequenz-ID-Nrn. 5, 5A bis 5I, 10, 13 oder 15 abgeleitet sind.

32. Verfahren zur Identifizierung von DNA, die für (eine) humane N-Methyl-D-aspartat- (NMDA)-Rezeptorprotein-Untereinheit(en) kodiert, welches Verfahren umfaßt:

Kontaktieren von humaner DNA mit einer Nukleotid-Sonde nach Anspruch 31, wobei das Kontaktieren unter hochstringenten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wird, und

Identifizieren von DNA(s), welche mit der Sonde hybridisierten.

33. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, welche an humane N-Methyl-D- aspartat (NMDA)-Rezeptoren binden, wobei das Verfahren den Einsatz von Zellen nach Anspruch 29 in einem Konkurrenz-Bindungsassay umfaßt.

34. Bioassay zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Aktivität von humanen NMDA-Rezeptoren modulieren, wobei der Bioassay umfaßt:

(a) Exposition von Zellen nach Anspruch 29 gegenüber mindestens einer Verbindung, deren Vermögen zur Modulierung der Ionenkanalaktivität dieser Rezeptoren festgestellt werden soll, und danach

(b) Überprüfung der Zellen auf Veränderungen der Ionenkanalaktivität.

35. Antikörper, gebildet gegen Protein, welches von der Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 6-18, 20 oder 21 kodiert wird, oder gegen Protein, welches von der Sequenz von Nukleotiden kodiert wird, die in Sequenz-ID-Nr. 1 identifiziert ist, mit der Maßgabe, daß der Antikörper nicht an Protein bindet, welches von den Nukleinsäuren von Position 1 bis 2850 oder 2862 bis 3078 der Sequenz in Sequenz-ID-Nr. 1 kodiert wird.

36. Antikörper nach Anspruch 35, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

37. Verwendung eines Antikörpers, der gegen das Protein nach Anspruch 25 oder gegen Protein, welches von der Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 12, 13, 14, 20 oder 21 kodiert wird, gebildet wurde, zur Herstellung eines Medikaments zur Modulierung der Ionenkanalaktivität von (einem) humanen N-Methyl-D-aspartat- (NMDA)-Rezeptor(en).

38. Isolierte Nukleinsäure, umfassend die in Sequenz-ID-Nr. 12 angegebene Sequenz von Nukleotiden.

39. Isolierte Nukleinsäure, umfassend die Sequenz von Nukleotiden, die als Nukleotide 189 bis 3899 in Sequenz-ID-Nr. 5 angegeben ist, wobei die in Sequenz-ID-Nr. 21 angegebenen Nukleotide anstelle der Nukleotide 2966-3160 der Sequenz-ID-Nr. 5 inseriert sind.

40. Isolierte Nukleinsäure, umfassend die in Sequenz-ID-Nr. 7 angegebene Sequenz von Nukleotiden.

41. Isolierte Nukleinsäure, umfassend die Sequenz von Nukleotiden, die als Nukleotide 367-1300 von Sequenz-ID-Nr. 5 angegeben ist, gefolgt von den in Sequenz-ID-Nr. 9 angegebenen Nukleotiden, gefolgt von den Nukleotiden 1301 bis 1959 von Sequenz- ID-Nr. 5, gefolgt von den Nukleotiden 1875-4068 von Sequenz-ID-Nr. 5.

42. Isolierte Nukleinsäure, umfassend die Sequenz von Nukleotiden, die als Nukleotide 861-1300 von Sequenz-ID-Nr. 5 angegeben ist, gefolgt von den als Sequenz-ID-Nr. 9 angegebenen Nukleotiden, gefolgt von den Nukleotiden 1301-2350 von Sequenz-ID- Nr. 5, gefolgt von den als Sequenz-ID-Nr. 7 angegebenen Nukleotiden, gefolgt von den Nukleotiden 2351-4068 von Sequenz-ID-Nr. 5.

43. Isolierte Nukleinsäure, umfassend die als Nukleotide 1-3025 von Sequenz-ID-Nr. 5 angegebene Sequenz von Nukleotiden.

44. Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine Sequenz von Nukleotiden, die als Nukleotide 931-2350 von Sequenz-ID-Nr. 5 angegeben ist, gefolgt von den Nukleotiden 2402 bis 3307 von Sequenz-ID-Nr. 5.