DE4410882A1 - Verfahren zur permanenten Expression von Glutamatrezeptoren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die permanente ektopische Expression von Glutamatrezeptoren in eukaryontischen Zellen: die Herstellung ge­ eigneter rekombinanter Zellinien mit den o.g. Eigenschaften sowie deren Verwendung.

Glutamat, der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im zen­ tralen Nervensystem (Trends in Pharmacological Sciences 11, 1990, 126-132; Pharmacological Reviews 40, 1989, 143-210; Trends in Pharmacological Sciences 13, 1992, 291-296), ist in zahlreiche pathophysiologische Vorgänge wie z. B. Epilepsie, Schizophrenie, Ischämie involviert.

Rezeptoren für Glutamat sind deshalb potentielle Angriffsorte für Pharmaka zur Behandlung dieser Erkrankungen.

Bei den Glutamatrezeptoren unterscheidet man zwischen ionotropen (NMDA, AMPA, Kainat) und metabotropen Rezeptoren.

Die Erfindung bezieht sich jedoch nur auf die Klasse der ionotro­ pen Glutamatrezeptoren.

Bislang sind einige Untereinheiten von AMPA-, Kainat-, NMDA- so­ wie von metabotropen Rezeptoren in ihrer Primärstruktur aufge­ klärt (Nature 342, 1989, 643; Science 249, 1990, 556; Neuron 8, 1992, 169).

In der Literatur wurden bisher vier AMPA-Glutamatrezeptor-Unter­ einheiten der Ratte beschrieben, GluR-A, GluR-B, GluR-C und GluR- D, die jeweils in zwei Splicing-Varianten, "flip" und "flop", vorkommen (Science 249, 1990, 1580).

Für GluR-B von Maus und Ratte ist zusätzlich "RNA editing" ge­ zeigt worden, das die sog. Q/R-Stelle der zweiten Transmembrando­ mäne betrifft. Diese beiden GluR-B Varianten unterscheiden sich erheblich in ihren elektrophysiologischen Eigenschaften (Cell 67, 1991, 11-19; Neuron 8, 1992, 189-198). Die humanen cDNA′s für GluR-Aflip und GluR-Aflop sind ebenfalls publiziert (PNAS USA 88, 1991, 7557-7561; PNAS USA 89, 1992, 1443-1447).

AMPA-Rezeptoruntereinheiten können sowohl homo- als auch hetero­ mere Kanäle bilden.

NMDA-Rezeptoren können heteromere Strukturen bilden, die aus einer NR1-Untereinheit (Nature 354, 3 (1991)) und einer von vier NR2-Untereinheiten (2A, 2B, 2C, 2D) (Science 256, 1217 (1992); Nature 358, 36 (1992); Nature 357, 70 (1992); FEBS Lett. 313, 34 (1992); J. Biol. Chem. 268, 2836 (1993)) bestehen.

NMDA-Kanäle zeigen eine langsamere Kinetik als AMPA-Kanäle, wei­ sen jedoch eine hohe Ca²⁺-Permeabilität auf, besitzen einen span­ nungsabhängigen Mg²⁺-Block und benötigen Glycin als Coagonisten. Funktionelle Kainat-Rezeptoren können aus den Untereinheiten GluR5, GluR6, GluR7 (Neuron 5, 583 (1990); Nature 351, 745 (1991); EMBO J. 11, 1651 (1992); Neuron 8, 257 (1992); FEBS Lett. 307, 139 (1992)) sowie KA1 und KA2 (Nature 351, 742 (1991); Neuron 8, 267 und 775 (1992)) bestehen. Charakteristisch für diese Kanäle ist eine sehr rasche Kinetik und die Aktivierung sehr rasch desensitisierender Ströme durch AMPA und Kainat.

Bislang wurde nur die transiente ektopische Expression von Glutamatrezeptoren bzw. Untereinheiten in eukaryontischen Zellen beschrieben (Science 246, 1990, 556-560).

Solche transient exprimierenden Zellen sind jedoch als Testzellen zur Identifizierung von Glutamatrezeptorantagonisten wenig ge­ eignet, da sie nicht vollkommen reproduzierbar herstellbar sind und infolgedessen die daran gewonnenen Ergebnisse nicht oder nur sehr schwierig vergleichbar sind.

Die permanente ektopische Expression von Glutamatrezeptoren ge­ lang bisher nicht. Die im Kulturmedium der Zelle als Nährstoff vorhandene essentielle Aminosäure Glutamat führt zu einer perma­ nenten Stimulierung der Glutamatrezeptoren, wodurch infolge des daraus resultierenden Ioneneinstroms rasch der Zelltod eintreten kann. Dies gilt insbesondere für Ionenkanäle, die einen hohen Ionenfluß erlauben oder Kanäle, die Ca²⁺-permeabel sind (z. B. NMDA-Kanäle oder Ca²⁺-permeable AMPA-Kanäle).

Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung von eukaryontischen permanent ektopisch Glutamatrezeptoren expri­ mierenden Zellinien bereitzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von eukaryontischen permanent ektopisch Glutamatrezeptoren exprimie­ renden Zellinien durch Transformation von Zellen mit einer für Glutamatrezeptoren kodierenden Nukleinsäure, dadurch gekennzeich­ net, daß bei der Etablierung der Zellinien mindestens eine der folgenden Kulturbedingungen eingehalten wird:

• a) Züchten der transformierten Zellen in einem Kulturmedium, das eine Glutamatvorstufe enthält,
• b) Züchtung der transformierten Zellen in Gegenwart eines Gluta­ matrezeptor-Antagonisten,
• c) Züchtung der transformierten Zellen in einer ersten Phase unter Bedingungen, bei denen die Glutamatrezeptorexpression reprimiert ist, und in einer zweiten Phase unter Bedingungen, bei denen die Repression wieder aufgehoben wird.

Als Zellen, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, können generell eukaryontische Zellen verwendet werden. Es können beispielsweise Zellen von niederen Eukaryonten wie Hefen und Pilze, oder Insektenzellen verwendet werden.

Bevorzugt werden Zellen von Säugern eingesetzt, beispielsweise HEK 293, BHK, COS 7.

Diese Zellen werden mit einer oder mehreren Nukleinsäuren trans­ formiert, die für einen Glutamatrezeptor kodieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl für die perma­ nente Expression von einzelnen Glutamatrezeptoruntereinheiten als auch von Kombinationen mehrerer Untereinheiten. Es kann sich da­ bei um natürlicherweise vorkommende Kombinationen von Unterein­ heiten als auch um neue, nicht so in der Natur vorkommende Kom­ binationen von Untereinheiten handeln. Auch ist es möglich, Un­ tereinheiten verschiedener Spezies neu zu kombinieren. Ebenso möglich ist die Kombination von Glutamatrezeptoruntereinheiten aus verschiedenen Subklassen (beispielsweise aus AMPA, Kainat, NMDA).

Bevorzugt werden die einzelnen Untereinheiten oder Kombinationen von einzelnen Untereinheiten der humanen Glutamatrezeptoren ein­ gesetzt.

Die zur Transformation verwendeten Nukleinsäuren werden in der Regel verknüpft mit einem Expressionsvektor eingesetzt. Die Wahl eines geeigneten Expressionsvektors richtet sich unter anderem nach der zu transformierenden Zelle. So sollte sichergestellt sein, daß die Regulationssignale des Expressionsvektors auch von der Zelle erkannt werden.

Für die Expression in eukaryontischen Zellen können eine Vielzahl von Vektoren verwendet werden, wobei Vektoren mit Cytomegalovi­ rus-Promotoren besonders gute Expression zeigen.

Die Expressionskonstrukte können über verschiedene Methoden, bei­ spielsweise Elektroporation, Calcium-Phosphat Präzipitation oder Liposomen-vermittelt in die Zellen eingebracht werden.

Eukaryontische Expressionssysteme besitzen den Vorteil, die ent­ sprechenden Expressionsprodukte effektiv und meist in nativer Form zu exprimieren und auch posttranslational zu modifizieren. Zur Etablierung der erfindungsgemäßen Zellinien muß mindestens eine der oben unter a) b) und c) beschriebenen Kulturbedingungen erfüllt sein.

Es können jedoch auch mehrere dieser Kulturbedingungen gleichzei­ tig oder auch zeitlich abgestuft eingehalten werden.

Bei der Etablierung von Zellinien unter Kulturbedingungen gemäß a) wird zur Zellzüchtung ein Kulturmedium verwendet, das keine Glutaminsäure oder deren Salze (Glutamate) enthält. Das Kultur­ medium enthält einen oder mehrere Glutamatvorstufen, die in den Zellen zu Glutamat umgesetzt werden.

Geeignete Glutamatvorstufen sind Verbindungen, die als solche von der Zelle aufgenommen werden und aus denen intrazellulär Glutamin freigesetzt wird, das anschließend durch Stoffwechselreaktionen in Glutamat überführt wird.

Solche Verbindungen sind beispielsweise Glutamin enthaltende Oligopeptide oder Oligopeptidderivate wie die entsprechenden Ester oder Amide. Besonders geeignet sind Dipeptide aus einer apolaren Aminosäure und Glutamin.

Solche Medien, die Glutamatvorstufen enthalten, sind auch kommer­ ziell erhältlich, z. B. das Glutamax-Medium der Firma Gibco BRL, das als Glutamatvorstufe das Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin ent­ hält.

Soweit keine bereits vorgemischten kommerziellen Kulturmedien mit Glutamatvorläufern eingesetzt werden, werden die Glutamatvorläu­ fer in der Regel in einer Endkonzentration im µM-Bereich, bevor­ zugt von 1-100 µM dem Kulturmedium zugesetzt.

Eine weitere mögliche Kulturbedingung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die unter b) genannte Züchtung der transformierten Zellen in Gegenwart eines Glutamatrezeptorantagonisten.

Diese Verbindungen verhindern die Dauerstimulierung der permanent exprimierten Glutamatrezeptoren. Dadurch wird es möglich, den an­ sonsten bei Dauerstimulation auftretenden Zelltod zu verhindern. Geeignete Glutamatrezeptorantagonisten sind beispielsweise NBQX oder CNQX. Die Endkonzentrationen dieser Verbindungen im Kultur­ medium liegen in der Regel im µM-Bereich.

Eine weitere mögliche Kulturbedingung ist die unter c) genannte temporäre Repression der Glutamatrezeptorexpression. Dazu wird ein induzierbares Expressionssystem benutzt, das je nach Kultur­ bedingungen an- bzw. abgeschaltet ist. In einer ersten Phase der Etablierung und Züchtung von Zellinien werden Kulturbedingungen gewählt, bei denen die Glutamatrezeptorexpression reprimiert ist. In einer zweiten Phase wird dann die Repression aufgehoben, wo­ durch eine Rezeptorexpression bewirkt wird.

Bevorzugte induzierbare Expressionssysteme sind solche, die mit­ tels des Tetrazyklinoperons gesteuert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Zellinien, die permanent ektopisch Glutamatrezeptoren exprimieren und die sich mit dem oben beschriebenen Verfahren herstellen lassen.

Solche Zellinien eignen sich besonders zur Identifizierung funk­ tioneller Liganden von Glutamatrezeptoren.

Rezeptor exprimierende Zellinien sind ein wichtiges Instrument im Screening nach spezifischen Rezeptorliganden. Hierfür können bei­ spielsweise Membranen der Zellinien in Rezeptorbindungstests ein­ gesetzt werden.

Informationen über die Wirkungsweise (Agonismus/Antagonismus) von Rezeptorliganden erhält man durch Einbringen von Reportersystemen in erfindungsgemäße Zellinien. Geeignete Reportersysteme sind solche, bei denen ein Promotor, der durch Verbindungen des Si­ gnaltransduktionsweges (second messenger) reguliert wird, mit einem Gen für ein leicht nachzuweisendes Produkt wie Luciferase funktionell verbunden ist. Solche Reportersysteme sind beispiels­ weise aus Science 252, 1424 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5061 (1991) oder J. Rec. Res. 13, 79 (1993) bekannt. Ein ge­ eigneter Promotor, der beispielsweise durch die intrazelluläre Ca²⁺-Konzentration reguliert wird, ist der des fos-Gens. Der Me­ tallothionein-Promotor, der u. a. durch Zn²⁺ stimuliert werden kann, kommt ebenfalls in Betracht.

Die durch die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor bewirkte Veränderung der intrazellulären Ionenkonzentration kann über Fluoreszenzfarbstoffe (beispielsweise FURA 2AM, Natrium-Grün, Calcium-Grün, Aequorin (Analyt. Biochem. 209, 343 (1993)) oder über chemische Nachweisreaktionen (wie Fällung von Ionen (Neuron 7, 509 (1991)) erfaßt werden.

Der Stromfluß durch die Zellmembran in Abhängigkeit von der Li­ gandenbindung kann ebenfalls gemessen werden.

Die exprimierten Rezeptorproteine können nach entsprechender Rei­ nigung auch als Antigene zur Generierung polyklonaler oder mono­ klonaler Antikörper dienen, die für diagnostische Zwecke oder als Hilfsmittel für rationales Drug Design Verwendung finden. Das reine Polypeptid kann auch, nach Kristallisation und Röntgen­ strukturanalyse oder anderen physikalischen Verfahren wie NMR oder Raster-Tunnelmikroskopie, zur Aufklärung der räumlichen Struktur des Rezeptors und der Liganden-Bindungsstelle benutzt werden. Die erfindungsgemäßen Zellinien können auch in Empfänger­ systeme wie transgene Tiere oder Wirtsorganismen implantiert wer­ den, um die Signaltransduktion zu beeinflussen oder die Liganden­ konzentration zu analysieren.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veran­ schaulicht.

Beispiel 1

Stabile Expression der Glutamatrezeptor-Untereinheiten in HEK 293 Zellen (ATCC), mit Adenovirus Typ 5 transformierte humane embryo­ nale Nierenzellen, wurden in RPMI 1640 Glutamax Medium I (Gibco BRL) mit 10% dialysiertem FCS (Gibco BRL) unter 5% CO₂ kultiviert.

Die entsprechenden Glutamatrezeptor-cDNA-Moleküle (WO 93/23536; Science 249, 556-560, 1990; J. Biol. Chem. 268, 3728-3733, 1993; WO 91/06648) wurden in den eukaryontischen Expressionsvektor pcDNA3 (Fa. Invitrogen) kloniert. Diese Expressionskonstrukte wurden nach folgendem Protokoll durch Elektroporation einzeln oder in Kombination in HEK 293 Zellen eingebracht: Für die Elektroporation wurden 10⁷ Zellen in 0.8 ml PBS mit 20 µg des Ex­ pressionskonstruktes mit einem Elektroporator (BTX, electro cell manipulator 600, 3 mF, 130 V, 72 Ohm) transfiziert.

Die Zellen wurden 24-36 h in Kulturmedium inkubiert und an­ schließend in Selektionsmedium (Kulturmedium mit 600-800 µg/ml G418-Sulfat, Geneticin bzw. 50 µg/ml Hygromycin) überführt. Stabile Geneticin- bzw. Hygromycin-resistente Zellklone wurden nach 10-12 Tagen über Einzelzellablage isoliert, expandiert und mittels Membranbindungsassay analysiert.

Beispiel 2 Rezeptorbindungsassays an Membranen der stabil Glutamatrezeptor exprimierenden Zellinien

Die Kultivierung der rekombinanten Zellinien erfolgte wie in Bei­ spiel 1 beschrieben.

Membranpräparation: Zellen wurden in 2-3 ml 5 mM Tris pH 7,4/10 cm Schale abgeschabt und abzentrifugiert (1200 rpm, 4°C). Das Pellet wurde in 1 ml eiskaltem Tris (5 mM, pH 7,4) resuspendiert, 15 min auf Eis inkubiert und anschließend bei 11500 rpm, 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 1,5 ml Bin­ dungspuffer/10 cm Schale (30 mM Tris pH 7,2 bei 10°C), 2,5 mM CaCl₂, 100 mM KSCN) resuspendiert, homogenisiert, zentrifugiert (11500 rpm, 30 min, 4°C). Der Überstand wurde nochmals homo­ genisiert und zentrifugiert. Das Membranpellet wird in 150 µl/10 cm Schale Bindungspuffer resuspendiert und für den Bindungsassay verwendet.

Bindungsansatz: 50 µl Membranen in Bindungspuffer mit 149 µl Bin­ dungspuffer und 1 µl ³H-AMPA (600 nM) wurden für 1 Stunde auf Eis inkubiert, über GFC-Filter abfiltriert, mit Bindungspuffer gewa­ schen und ausgezählt. Für die Verdrängungsreaktion wurden 50 µl Membranen in Bindungspuffer mit 147 µl Bindungspuffer, 2 µl Glutamat (100 mM) und 1 µl ³H-AMPA (600 nM) inkubiert und wie mit dem Bindungsansatz verfahren.

Beispiel 3

Reportersysteme, mit Hilfe derer die durch die Bindung eines Li­ ganden bewirkte Beeinflussung des Signaltransduktionsweges (second messenger) detektiert werden kann.

Die Kultivierung und Transfektion der Zellen erfolgte wie in Bei­ spiel 1 beschrieben.

Nach der Transfektion wurden die Zellklone auf induzierbare Ex­ pression getestet. Die Zellen wurden hierfür in 96 well Platten (=lichtundurchlässige Mikrotiterplatten) kultiviert. 2-48 h nach der Stimulierung der Zellen wurde der Test durch Lyse der Zellen beendet. Lyse, Herstellung der Zellextrakte sowie Bestimmung der Luciferase Aktivität erfolgte nach Angaben und unter Verwendung des Luciferase-Assay-Kits (Promega, Nr. E1500). Messung der Luci­ ferase Aktivität wurde in herkömmlichen Luminometern durchge­ führt.

Beispiel 4

Identifizierung funktioneller Liganden für Glutamatrezeptoren, wobei mittels Fluoreszenzfarbstoffen die durch Bindung eines Li­ ganden bewirkte Veränderung der intrazellulären Ionenkonzentra­ tion gemessen werden soll.

Kultivierung der rekombinanten Zellinien erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.

FURA 2-Markierung von Zellen: Zellen wurden mit Trypsin bzw. EDTA abgelöst und mit Markierungspuffer (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 25 mM HEPES, 10 mM Glucose) gewaschen. Die Zel­ len (2×10⁶ pro ml) in Markierungspuffer wurden mit 2 KLM FURA-2-pentaacetoxymethylester für 15 min bei 37°C markiert und anschließend mit Markierungspuffer gewaschen. Die markierten Zel­ len wurden auf Eis gehalten und innerhalb von 3 h für die Messungen verwendet.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung von eukaryontischen permanent ektopisch Glutamatrezeptoren exprimierenden Zellinien durch Transformation von Zellen mit für Glutamatrezeptoren kodie­ renden Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Etablierung der Zellinien mindestens eine der folgenden Kulturbedingungen eingehalten wird:

• a) Züchten der transformierten Zellen in einem Kulturmedium, das eine Glutamatvorstufe enthält,
• b) Züchtung der transformierten Zellen in Gegenwart eines Glutamatrezeptor-Antagonisten,
• c) Züchtung der transformierten Zellen in einer ersten Phase unter Bedingungen, bei denen die Glutamatrezeptorexpres­ sion reprimiert ist, und in einer zweiten Phase unter Bedingungen, bei denen die Repression wieder aufgehoben wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Glutamatvorstufe ein Glutamin-haltiges Dipeptid verwendet wird.

3. Zellinien, die permanent ektopisch Glutamatrezeptoren exprimieren, erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2.

4. Verwendung der Zellinien gemäß Anspruch 3 zur Identifizierung funktioneller Liganden für Glutamatrezeptoren.