DE4403666A1

DE4403666A1 - Untereinheiten von Glutamatrezeptoren, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE4403666A1
Application number: DE4403666A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dr Hoeger; Andreas Dr Ultsch; Alfred Dr Bach; Sylvia Dr Sterrer; Hans-Georg Dr Lemaire
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1994-02-07
Filing date: 1994-02-07
Publication date: 1995-08-10
Also published as: CA2182618A1; WO1995021188A1; US5756697A; JPH09508523A; EP0742792A1

Description

Die Erfindung betrifft die Expression neuer Varianten ionotroper Glutamatrezeptor-Untereinheiten in Eukaryontenzellen sowie Ver fahren zum Auffinden funktioneller Liganden für entsprechende Glutamatrezeptorkanäle.

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem (TIPS 11, 1990, 126-132; Pharmacological Reviews 40, 1989, 143-210; TIPS 13, 1992, 291-296) und ist in zahlreiche pathophysiologische Vorgänge wie z. B. Epilepsie, Schizophrenie, Ischämie involviert. Rezeptoren für Glutamat sind deshalb potentielle Angriffsorte für entsprechende Pharmaka.

In ihrer Primärstruktur aufgeklärt sind bislang einige Unterein heiten von AMPA-, Kainat- und NMDA-Rezeptoren sowie einige meta botrope Rezeptoren (Nature 342, 1989, 643; Science 249, 1990, 556; Neuron 8, 1992, 169; Science 256, 1992, 1217; Nature 358, 1992, 36).

In der Literatur wurden bisher vier AMPA-Glutamatrezeptor-Unter einheiten der Ratte beschrieben, GluRA, GluRB, GluRC und GluRD, die jeweils in zwei splicing-Varianten, "flip" und "flop", vor kommen (Science 249, 1990, 1580). Für GluRB von Maus und Ratte ist zusätzlich "RNA editing" gezeigt worden, das die sog. Q/R- Stelle der zweiten Transmembrandomäne betrifft. Diese beiden GluRB Varianten unterscheiden sich erheblich in ihren elektrophy siologischen Eigenschaften (Cell 67, 1991, 11-19; Neuron 8; 1992, 189-198). Die humane cDNA für GluRAflip und GluRAflop ist eben falls publiziert (PNAS USA 88, 1991, 7557-7561; PNAS USA 89, 1992, 1443-1447).

Es wurden nun Varianten der humanen Glutamatrezeptor-Untereinhei ten A, B, C und D gefunden, sowie DNA-Sequenzen, die für solche Untereinheiten kodieren. Diese Untereinheiten führen zu GluR- Kanälen mit spezifischen elektrophysiologischen Eigenschaften.

Für GluRA, GluRB, GluRC und GluRD wurde gefunden, daß die erste Aminosäure der "flip/flop"-Region durch "RNA-editing" als Glycin (G) oder als Arginin (R) vorliegen kann. Die entsprechen den Untereinheiten werden wie folgt bezeichnet:

GluRAflipG, GluRAflipR, GluRAflopG, GluRAflopR
GluRBflipQ-G, GluRBflipQ-R, GluRBflopQ-G, GluRBflopQ-R
GluRBflipR-G, GluRBflipR-R, GluRBflopR-G, GluRBflopR-R
GluRCflipG, GluRCflipR, GluRCflopG, GluRCflopR
GluRDflipG, GluRDflipR, GluRDflopG, GluRDflopR.

Bei GluRB ist das bereits bei der Ratte bekannte "RNA-editing" bei der Bezeichnung der entsprechenden Varianten berücksichtigt worden.

Für GluRA wurde des weiteren eine durch das "alternative splicing" entstandene Variante gefunden, bei der ein 240 bp Frag ment im 5′-Bereich der GluRA cDNA fehlt und das entsprechende Protein somit um 80 Aminosäuren verkürzt ist. Die entsprechenden Untereinheiten werden wie folgt bezeichnet:

GluRAdel240flipG, GluRAdel240flipR, GluRAdel240flopG, GluRAdel240flopR.

Die folgenden DNA- bzw. Aminosäuresequenzen beziehen sich aus schließlich auf humane Glutamatrezeptor-Untereinheiten.

In SEQ ID NO: 1 ist die cDNA-Sequenz von GluRAflipG und die davon abgeleitete Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 2) dargestellt; in SEQ ID NO: 3 die cDNA-Sequenz von GluRAflopG, in SEQ ID NO: 4 die davon abgeleitete Polypeptidsequenz.

Die GluRAflipR cDNA besitzt im Vergleich zur GluRAflipG cDNA einen Basenaustausch an Position bp 2269, der ein Glycin-Codon (GGA) in ein Arginin-Codon (AGA) umwandelt. Für GluRAflopR gilt entsprechendes.

Die GluRAdel240-Varianten entsprechen den genannten GluRA- Varianten, besitzen jedoch eine Deletion: bp 221-460 bezogen auf SEQ ID NO: 1 und 3.

In SEQ ID NO: 5 ist die cDNA-Sequenz von GluRBflipQ-G und die davon abgeleitete Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 6) dargestellt; in SEQ ID NO: 7 die cDNA-Sequenz von GluRBflopQ-G, in SEQ ID NO: 8 die davon abgeleitete Polypeptidsequenz.

Die cDNA für GluRBflipQ-R besitzt im Vergleich zu GluRBflipQ-G einen Basenaustausch an Position bp 2290, der ein Glycin-Codon (GGA) in ein Arginin-Codon (AGA) umwandelt. Für GluRBflopQ-R gilt entsprechendes.

Die cDNA-Moleküle für GluRBflipR-G, GluRBflipR-R, GluRBflopR-G und GluRBflopR-R besitzen im Vergleich zu den o.g. GluRB-Varian ten einen Basenaustausch an Position bp 1820, der ein Glutamin- Codon (CAG) in ein Arginin-Codon (CGG) umwandelt.

In SEQ ID NO: 9 ist die cDNA-Sequenz von GluRCflipG und in SEQ ID NO: 10 die davon abgeleitete Polypeptidsequenz dargestellt. SEQ ID NO: 11 zeigt die cDNA-Sequenz von GluRCflopG und SEQ ID NO: 12 die davon abgeleitete Polypeptidsequenz.

Die cDNA-Moleküle für GluRCflipR und GluRCflopR besitzen im Ver gleich zu GluRCflipG bzw. GluRCflopG einen Basenaustausch an Po sition bp 2377, der ein Glycin-Codon (GGA) in ein Arginin-Codon (AGA) umwandelt.

In SEQ ID NO: 13 ist die cDNA-Sequenz von GluRDflipG und in SEQ ID NO: 14 die davon abgeleitete Polypeptidsequenz dargestellt. SEQ ID NO: 15 zeigt die cDNA-Sequenz von GluRDflopG und SEQ ID NO: 16 die davon abgeleitete Polypeptidsequenz.

Die cDNA-Moleküle für GluRDflipR und GluRDflopR besitzen im Ver gleich zu GluRDflipG bzw. GluRDflopG einen Basenaustausch an Po sition bp 2293, der ein Glycin-Codon (GGA) in ein Arginin-Codon (AGA) umwandelt.

Weitere geeignete DNA-Sequenzen sind solche, die zwar eine andere Nukleotidsequenz als die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 aufgeführte besitzen, die aber infolge der Degeneration des genetischen Codes für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 aufgeführte Polypeptidkette oder Teile davon codieren. Weiterhin sind solche DNA-Sequenzen geeignet, die für AMPA-Glut amatrezeptor-Untereinheiten codieren und die unter Standardbedin gungen mit der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 darge stellten Nukleotidsequenz oder mit einer Nukleotidsequenz, die für das in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 dargestellte Protein codiert, hybridisieren. Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 1×SSC (1×SSC: 0,15M NaCl, 15mM Natriumnitrat pH 7,2) zu verstehen. Die experimentellen Bedingungen für DNA-Hybridisierung sind in Lehrbüchern der Gentechnik, beispielsweise in Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, be schrieben.

Weiterhin wurden gentechnische Herstellverfahren für diese Unter einheiten gefunden. Außerdem wurde gefunden, daß sich die für diese Rezeptor-Untereinheiten kodierenden DNA-Sequenzen zum Auf finden von funktionellen Liganden für diese Rezeptoren verwenden lassen. Gegenstand der Erfindung sind darüber hinaus Verfahren zur Identifizierung funktioneller Liganden für AMPA-Glutamatre zeptoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man mit Sequenzen, welche für AMPA-GluR-Untereinheiten codieren, Zellen transfi ziert, die Membranen dieser Zellen isoliert und mit diesen Mem branen übliche Rezeptorbindungsexperimente durchführt.

Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur Identifizierung funktioneller Liganden für AMPA-Glutamatrezeptoren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Zellen, welche mit einer oder mehreren DNA-Sequenzen transfiziert wurden, die für AMPA-GluR-Untereinhei ten codieren, eine Beeinflussung des Signaltransduktionswegs durch Bindung der Liganden an den Rezeptor verursacht, die durch ein Rezeptorsystem detektiert wird, beispielsweise die intrazel luläre Ca⁺⁺-Konzentration nach Ligandenbindung mit fluorimetri schen Methoden (Anal. Biochem. 209, 1993, 343).

Die neuen Polypeptide und DNA-Sequenzen lassen sich gentechnisch unter Verwendung bekannter Methoden herstellen. So kann man aus Hirngewebe mRNA isolieren und in doppelsträngige cDNA übersetzen. Diese cDNA kann als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden. Durch die Verwendung spezifischer Primer kann so unter geeigneten Reaktionsbedingungen die entsprechende cDNA amplifiziert werden. Durch die Verwendung geeigneter Primer kann die amplifizierte cDNA ohne vorherige Klonierung sequenziert werden. Die doppelsträngige cDNA kann auch in λ Vektoren, z. B. λ gt 10 oder λ ZAP, integriert werden, um eine hirnspezifische cDNA Bank zu generieren. Eine solche cDNA Bank kann mit radioak tiv markierten DNA- oder RNA-Sonden durchgesucht werden, um Klone zu identifizieren, die Homologie mit der Hybridisierungsprobe aufweisen. Die dabei verwendeten Methoden sind beispielsweise in "Current Protocols in Molecular Biology" (Hrsg. F.M. Ausubel et al.) 1989, ISBN 0-471 50338-x (Vol. 1 u. 2), für die Polymerase- Kettenreaktion in Saiki et al. (1985) Science, 230, 1350-54 bzw. Mullis and Faloona (1987) Meth. Enzymol., 155, 335-350 beschrie ben.

Die so charakterisierte cDNA ist mit Hilfe von Restriktionsenzy men leicht zugänglich. Die dabei entstehenden Fragmente, ggf. in Verbindung mit chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, Adapto ren oder Genfragmenten, können benutzt werden, um die für das Protein codierende Sequenzen zu klonieren. Der Einbau der Gen fragmente bzw. synthetischen DNA-Sequenzen in Klonierungsvekto ren, z. B. die handelsüblichen Plasmide M13mp18 oder Bluescript, erfolgt in bekannter Weise. Auch können die Gene oder Genfrag mente mit geeigneten chemisch synthetisierten oder aus Bakterien, Phagen, Eukaryontenzellen oder deren Viren isolierten Kontroll regionen versehen werden, die die Expression der Proteine in unterschiedlichen Wirtssystemen ermöglichen.

Die Transformation bzw. Transfektion geeigneter Wirtsorganismen mit Hybridplasmiden ist ebenfalls bekannt und eingehend be schrieben (M. Wigler et al., Cell, 16 (1979), 777-785; F.L. Graham and A.J. van der Eb, Virology, 52 (1973), 456-467).

Bei der Expression in Säugerzellen kann man Vektoren verwenden, die das zu exprimierende Gen, in diesem Fall die für die hier beschriebenen Untereinheiten von AMPA-Glutamatrezeptoren codie renden cDNA-Sequenzen, unter die Kontrolle des Maus-Metallothio nein-, des viralen SV40- oder des Cytomegalievirus-Promotors setzen (J. Page Martin, Gene, 37 (1985), 139-144). Notwendig für die Expression ist das Vorliegen des Methionin-Startcodons des Gens, das für diese Untereinheiten von AMPA-Glutamatrezepto ren codiert. Man isoliert dann Klone, die Kopien dieser Vektoren als Episome oder ins Genom integriert besitzen. Besonders vor teilhaft ist die Integration des Fremdgens in einen Vektor, der den Promoter des Cytomegalievirus enthält.

Alternativ dazu kann man Zellen mit einem geeigneten Vektor der art transfizieren, daß die transiente Expression der so einge brachten DNA für eine pharmakologische Charakterisierung der ex primierten heterologen Polypeptide ausreicht. Auch hier ist die Kontrolle der Expression durch den Promoter des Cytomegalievirus besonders vorteilhaft.

Weiterhin kann man funktionelle AMPA-Glutamatrezeptoren dadurch herstellen, daß man eine oder mehrere verschiedene DNA-Sequenzen aus der Gruppe der AMPA-GluR-Untereinheiten zusammen in Zellen transfiziert. Auf diese Art lassen sich AMPA-Glutamatrezeptoren mit unterschiedlichen Untereinheiten gewinnen.

In Verbindung mit prokaryontischen Sequenzen, die für die Repli kation in Bakterienzellen und eine Antibiotika-Resistenz kodie ren, ist die Verwendung von "shuttle"-Vektoren gut geeignet. Kon struktionen und Vermehrung des Plasmids erfolgen zunächst in Bak terienzellen; anschließend erfolgt die Umsetzung in die Eukaryon tenzellen, z. B. in die menschliche embryonale Nieren-Zellinie HEK 293.

Auch andere Zellsysteme, z. B. Hefe und andere Pilze, Insektenzel len sowie tierische und humane Zellen wie z. B. CHO-, COS- und L- Zellen, können in Verbindung mit geeigneten Expressionsvektoren zur Expression der klonierten cDNA verwendet werden.

Die eukaryontischen Expressionssysteme besitzen den Vorteil, daß sie in der Lage sind, ihre Produkte effektiv und meist in nativer Form zu exprimieren. Ferner besitzen sie die Fähigkeit, ihre Pro dukte posttranslational zu modifizieren.

Die exprimierten Rezeptorproteine können durch Detergenzien solu bilisiert werden und durch Affinitätschromatographie nach bekann ten Verfahren gereinigt werden. Das reine Polypeptid kann, nach Kristallisation und Röntgen-Strukturanalyse oder anderen physika lischen Verfahren wie NMR oder Raster-Tunnelmikroskopie, dazu benutzt werden, zunächst die räumliche Struktur des Rezeptors und dann die räumliche Struktur der Liganden-Bindungsstelle aufzuklä ren.

Die exprimierten Rezeptorproteine können nach entsprechender Rei nigung auch als Antigene für die Generierung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper dienen. Diese Antikörper wiederum können gegebenenfalls für diagnostische Zwecke verwendet werden. Eine weitere Anwendungsmöglichkeit für solche Antikörper besteht in ihrer Verwendung als Hilfsmittel zum rationalen Drug Design. So können die Rezeptor-spezifischen Antikörper als Antigen für die Generierung antiidiotypischer Antikörper eingesetzt werden. Sol che Antikörper können für definierte Bereiche ein Abbild des Re zeptors darstellen und für das Screening nach spezifischen Rezep torliganden oder für das rationale Drug Design verwendet werden.

Rezeptor exprimierende Zellinien stellen ein wichtiges Instrument im Screening nach spezifischen Rezeptorliganden dar. Dazu können die Membranen dieser Zellen für Rezeptorbindungstests verwendet werden. Informationen über Wirkungsweise (Agonismus/Antagonis mus) eines Rezeptorliganden können dadurch gewonnen werden, daß man Zellen, die mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz transfi ziert worden sind, mit einem geeigneten Reportersystem versieht. Geeignete Reportersysteme sind solche, bei denen ein Promotor, der durch Verbindungen des Signaltransduktionswegs (second mes senger) reguliert wird, mit einem Gen für ein leicht nachzuwei sendes Produkt wie Luciferase funktionell verbunden ist. Solche Reportersysteme sind beispielsweise aus Science 252, 1424 (1991); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5061 (1991) oder Journal of Recep tor Res. 13, 1993, 79 bekannt. Ein geeigneter Promotor, der bei spielsweise durch die intrazelluläre Ca⁺⁺-Konzentration reguliert wird, ist der des fos-Gens. Auch ist es möglich, Änderungen der intrazellulären Ca⁺⁺-Konzentration mit Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. FURA 2AM) direkt nachzuweisen.

Weiterhin kann der Stromfluß durch die Zellmembran in Abhängig keit von der Ligandenbindung gemessen werden.

Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ist es möglich, andere DNA-Sequenzen als hier beschrieben, z. B. chemisch synthe tisierte Gene mit unterschiedlicher DNA-Sequenz für die Expres sion der beschriebenen Untereinheiten von humanen AMPA-Glutamat rezeptoren zu benutzen.

Mit Hilfe der Erfindung wird es möglich, Substanzen zu identifi zieren und zu charakterisieren, die an den hier beschriebenen Re zeptor binden und dort agonistisch oder antagonistisch wirken.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Oli gonukleotiden, die von der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 beschriebenen Struktur abgeleitet sind, als antisense Mo leküle zur gezielten Ausschaltung von Genen.

Mit Hilfe der Erfindung ist es auch möglich, synthetische Oligo nukleotide herzustellen, mit denen die Expression von AMPA- Glutamatrezeptor-Untereinheiten durch intracerebroventrikuläre Applikation spezifisch inhibiert werden kann, wie es beispiels weise für NMDA-Rezeptoren beschrieben wurde (Nature 363, 1993, 260).

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Beispielen nä her beschrieben.

Für gentechnische Methoden sei dazu z. B. auf das Handbuch von Sambrook et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Labora tory, 1989, oder "DNA cloning", Vol. I bis III, IRI Press 1985 bis 1987, Herausgeber D.M. Glover, hingewiesen.

Beispiel 1

Isolierung von cDNA-Molekülen, die für die humanen AMPA-Glutamat rezeptor-Untereinheiten GluRA und GluRAdel240 kodieren.

Mit der Technik der Polymreasekettenreaktion (PCR) wurden drei cDNA-Fragmente, die für die humane AMPA-Glutamatrezeptor-Unter einheit GluRA spezifisch sind, aus zwei kommerziell erhältlichen humanen Hirn cDNA-Bibliotheken amplifiziert. Zur Erhöhung der Spezifität der Amplifikation wurde das im folgenden beschriebene 2-stufige PCR-Verfahren durchgeführt: jeweils 10 µl Lysat einer humanen temporalen Cortex cDNA-Bibliothek (Titer: 1,5×10¹¹ Phagen/ml; Vektor Lambda ZAP; GluRA cDNA-Fragment bp 1-839) bzw. einer humanen Nucleus accumbens cDNA-Bibliothek (Titer: 1-9×10⁹ Phagen/ml; Vektor Lambda gt10; GluRA cDNA-Fragmente 1-1421 und 1407-2721) wurden als Template für die erste PCR-Reaktion mit den Primer-Oligonukleotiden A und B eingesetzt. Die Reaktionsvolumina der Ansätze betrugen jeweils 100 µl, jeweils 20 pMol der verschie denen Primer wurden eingesetzt und der Reaktionspuffer enthielt 10 mM Tris-HCl pH 8,5, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Es wurden 20 Zyklen mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 1 Minute 94°C, 1 Minute 55°C, 1 Minute 72°C. Verwendet wurde ein Thermocycler des Typs 9600 der Firma Perkin-Elmer.

Nach der Durchführung der PCR-Reaktion wurden jeweils 10 µl der PCR-Ansätze entnommen und als Template für eine zweite PCR-Reak tion mit den Primern C und D eingesetzt. Die Reaktions- und Puf ferbedingungen waren die gleichen wie bei der ersten PCR, die Zahl der Zyklen wurde jedoch auf 35 erhöht. Die amplifizierten cDNA-Fragmente wurden entsprechend den Herstellerangaben unter Einsatz des TA Cloning Kits der Firma Invitrogen in den Vektor pCRII kloniert.

Die Primer-Oligonukleotide für die Amplifikation des humanen GluRA cDNA-Fragments, das die Basenpaare 1-1431 umfaßt, hatten die folgenden Sequenzen:

Die Primer-Oligonukleotide für die Amplifikation des humanen GluRA cDNA-Fragments, das die Basenpaare 1407-2721 umfaßt, hatten die folgenden Sequenzen:

Die Primer-Oligonukleotide für die Amplifikation des humanen GluRA cDNA-Fragments, das die Basenpaare 1-839 umfaßt, hatten die folgenden Sequenzen:

Mit Hilfe gentechnischer Standardmethoden (s. z. B. Sambrook et al. (1989), "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory) wurden die amplifizierten cDNA-Fragmente jeweils zu den voll ständigen kodierenden Regionen von GluRA und GluRAdel240 zusammengesetzt.

Beispiel 2 Isolierung von cDNA-Molekülen für die humanen Glutamatrezeptor- Untereinheiten A, B, C und D

cDNA-Fragmente, die für die humanen Glutamatrezeptor-Untereinhei ten A, B, C und D spezifisch sind, wurden durch das "screenen" der folgenden kommerziell erhältlichen humanen Hirn cDNA-Biblio theken erhalten:
Hippocampus (Fa. Stratagene)
Cerebellum (Firmen Clontech und Stratagene)
Nucleus accumbens (Clontech).

Als Screeningproben wurden PCR-Fragmente der Größen 600-3000 bp eingesetzt, die von den in pBluescript klonierten cDNA-Molekülen für GluRA, B, C und D der Ratte amplifiziert worden waren. Es wurde jeweils 1 ng Plasmid-DNA als Template eingesetzt. Die Pri mer-Konzentrationen und Puffer-Bedingungen für die PCR-Reaktionen entsprachen denen in Beispiel 1, jedoch wurden jeweils 2 µl des dNTP-Markierungsgemisches aus dem DNA Labeling and Detection Kit der Fa. Boehringer Mannheim als Nukleotidquelle eingesetzt. Es wurden 35 Zyklen mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 2 Minuten 94°C, 2 Minuten 55°C, 3 Minuten 72°C. Die Dig-dUTP mar kierten Fragmente wurden über ein Seaplaque-Agarose-Gel gerei nigt. Die Durchführung der Screening-Prozedur wurde gemäß den Vorschriften des Manuals für o.g. Kit durchgeführt. Die GluR cDNA-Fragmente der aus dem Screening hervorgegangenen Lambda- Klone wurden mit Hilfe der üblichen gentechnischen Methoden in den Vektor pBluescript umkloniert und zu den vollständigen cDNA- Molekülen der verschiedenen GluR-Varianten zusammengesetzt.

Beispiel 3 Transiente Expression der klonierten humanen GluR-Gene in HEK293-Zellen

Wenn nicht anders beschrieben, wurde die Zellkultur nach Lindl und Bauer, "Zell- und Gewebekultur", Gustav Fischer Verlag, durchgeführt.

Die GluR cDNA-Moleküle aus den Beispielen 1 und 2 wurden im Rah men ihrer Isolierung in übliche Plasmide wie z. B. pBluescript (Fa. Stratagene) und pCRII (Fa. Invitrogen) kloniert. Die klo nierten GluR-Fragmente umfassen dabei jeweils das gesamte offene Leseraster, einschließlich Start- und Stopcodon, und mindestens 40 bp der dem Startcodon vorausgehenden 5′-nicht-translatierten Regionen.

Zur transienten Expression in eukaryontischen Zellinien wurden die klonierten GluR-Fragmente in den Expressionsvektor pcDNA3 (Fa. Invitrogen) kloniert. Die daraus resultierenden rekombinan ten Plasmide wurden in bekannter Weise vermehrt.

HEK 293 Zellen wurden unter Standard-Bedingungen kultiviert. Nach Trypsinierung wurden die Zellen in DMEM Medium (Gibco), das 3,7 g/l NaHCO₃ enthielt, aufgenommen und 1,5×10⁶-Zellen/10 cm Petrischalen ausgesät. Danach wurden die Zellen für 24 h bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.

Die zu transfizierende DNA wurde wie folgt vorbereitet: 20 µg der DNA-Lösung (1 mg/ml), gereinigt mit dem Quiagen®-System, Fa. Diagen, wurden mit 437 µl H₂O versetzt, danach wurden 62,5 µl 2 M CaCl₂ zugesetzt und schließlich 500 µl BBS. Innerhalb von 10 min bildeten sich bei Raumtemperatur Ca⁺⁺-Präzipitate.

Die Lösung wurde auf eine 10-cm-Zellkulturschale mit den nach obiger Vorschrift kultivierten HEK 293 Zellen gegeben. Nach vor sichtiger Durchmischung wurden die Zellen 15 bis 20 h in einem Inkubator bei 37°C/3% CO₂ kultiviert. Danach wurden vorsichtig 5 ml serumfreies Medium zugesetzt. Nach Entfernung des gesamten Mediums und Wiederholung des Waschvorgangs mit 5 ml Medium wurden den Zellen 10 ml Medium zugesetzt. Nach 48 h Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ konnten die Zellen für pharmakologische und elektro physiologische Untersuchungen verwendet werden.

Alternativ wurde die DNA auch Liposomen-vermittelt in die Zellen eingebracht. Dabei wurde Lipofectin der Firma GIBCO-BRL den Herstellerangaben entsprechend eingesetzt.

Beispiel 4 Expression der AMPA-Glutamatrezeptor-Untereinheiten in Oozyten

Zur Herstellung von cRNA wurden die entsprechenden cDNA-Moleküle, welche für die Glutamatrezeptor-Untereinheiten kodieren, in das mit EcoRI gespaltene Plasmid Bluescript (Stratagene) nach Stan dard-Protokollen einkloniert.

Nach Vermehrung der Bluescript-Klone, welche für Untereinheiten der AMPA-Glutamatrezeptoren codieren, wurde nach Standard-Metho den Plasmid-DNA gewonnen. Diese Plasmid-DNA wurde mit dem Restrik tionsenzym Not I gespalten und zur in vitro Transkription einge setzt. Die Transkription wurde von dem T3 oder T7 Promotor ge startet und unter Standard-Bedingungen entsprechend dem in vitro Transkriptionskit von Stratagene durchgeführt.

Zur Expression der Rezeptoruntereinheiten wurden jeweils 10 ng cRNA entweder einzeln oder in Kombination mit anderer cRNA in Oo zyten injiziert, die aus dem Krallenfrosch Xenopus laevis explan tiert worden waren [C. Methfessel et al., Pflügers Arch. 407, 577, (1986)]. Die Oozyten wurden in OR-2 (92,5 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1mM Na₂HPO₄, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 0,5 g/l Po lyvinylpyrolidon, pH 7,2 mit dem Zusatz von 4 µg/ml Zinacef und 100 U/ml Penstrep) bei 19°C inkubiert. 24 Stunden nach der Injek tion wurden die Oozyten mit Kollagenase (Typ II Sigma) behandelt (1 mg/ml in OR-2 für 1 Stunde). Elektrophysiologische Ableitungen wurden 2-6 Tage nach Injektion der cRNA vorgenommen. Dabei wurde eine 2 Elektroden-"Voltage clamp" Konfiguration benutzt mit einem TEC 01C Amplifier (NPI Electronic, Tamm, Deutschland). Wäh rend der elektrophysiologischen Messungen wurden die Oozyten mit normaler Frosch Ringerlösung NFR (115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, pH 7,2) perfundiert.

Beispiel 5 Stabile Expression der Glutamatrezeptor-Untereinheiten in HEK 293 Zellen

Die in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Glutamatrezeptor- cDNA-Moleküle wurden in den eukaryontischen Expressionsvektoren pcDNA3 und pRc/CMV (Fa. Invitrogen) kloniert. Diese Expressions konstrukte wurden nach folgendem Protokoll durch Elektroporation einzeln oder in Kombination in HEK 293 Zellen eingebracht: HEK 293 Zellen (ATCC) wurden in RPMI 1640 Medium (Glutamax I, Fa. Gibco BRL) mit 10% FCS (Gibco BRL) unter 5% CO₂ kultiviert. Für die Elektroporation wurden 10⁷ Zellen in 0,8 ml PBS mit 20 µg des Expressionskonstruktes mit einem Elektroporator (BTX, electro cell manipulator 600, 3 µF, 130 V, 72 Ohm) transfiziert. Die Zel len wurden anschließend 24 h in Kulturmedium inkubiert und an schließend in Selektionsmedium (RPMI-Medium mit 600 µg/ml G418-Sulfat, Geneticin) überführt. Stabile Geneticin resistente Zellklone wurden nach 10-12 Tagen über Einzelzellablage isoliert, expandiert und mittels Membranbindungsassay analysiert.

Sequenzprotokoll

Claims

1. DNA-Sequenzen, die für Varianten von Glutamatrezeptor-Unter einheiten codieren und die aus der Gruppe, die von

a) DNA-Sequenzen der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 beschriebenen Struktur,
b) DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 oder 16 beschriebenen Struktur codieren, und
c) DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit DNA- Sequenzen a) oder b) hybridisieren, gebildet wird,

ausgewählt sind.

2. Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Glutamat rezeptor-Untereinheiten unter Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1.

3. Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 zur Identifi zierung funktionaler Liganden für Glutamatrezeptoren.

4. Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für Glutamatrezeptoren, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer für einen Glutamatrezeptor codierenden DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 Zellen transfiziert, die Membranen dieser Zellen isoliert und mit diesen Membranen übliche Rezeptorbindungs experimente durchführt.

5. Verfahren zur Identifizierung funktionaler Liganden für Glutamatrezeptoren, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einer oder mehreren für einen Glutamatrezeptor codierenden DNA-Se quenz gemäß Anspruch 1 Zellen transfiziert und die in diesen Zellen durch Bindung der Liganden an den Rezeptor verursachte Beeinflussung des Signaltransduktionswegs durch ein Reporter system detektiert.

6. Verwendung von Oligonukleotiden, die von der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 oder 15 beschriebenen Struktur abgeleitet sind, als antisense Moleküle zur gezielten Ausschaltung von Genen.