DE69333315T2 - Säugetier-rezeptoren für das melanocyten-stimulierendes hormon und deren verwendungen - Google Patents

Säugetier-rezeptoren für das melanocyten-stimulierendes hormon und deren verwendungen Download PDF

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Description

  • Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter 1R01DK41921-03, 1R01DK43859-01 und 1P01DK44239-10A1 durch die nationalen Gesundheitsbehörden ausgearbeitet. Die Regierung besitzt gewisse Rechte an der Erfindung.
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft Melanozyten-stimulierende Hormonrezeptoren von Säugetierspezies und die Gene, welche solchen Rezeptoren entsprechen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung, Klonierung und Sequenzierung eines humanen Gens eines Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors. Die Erfindung betrifft auch die Isolierung, Klonierung und Sequenzierung eines Mausgens eines Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors. Die Erfindung betrifft die Konstruktion von eukaryontischen rekombinanten Expressionskonstrukten, welche diese Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptoren in Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen exprimieren können, und die Herstellung des Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors in solchen Kulturen. Die Erfindung betrifft die Verwendung solcher Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen zur Herstellung von homogenen Zusammensetzungen solcher Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptoren. Die Erfindung stellt auch Kulturen solcher Zellen bereit, welche einen Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptor produzieren, für die Charakterisierung von neuen und nützlichen Arzneimitteln. Antikörper gegen diese Melanozyten-stimulierende Hormonrezeptorproteine und Epitope dieser Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptorproteine werden von der Erfindung auch bereitgestellt.
  • 2. Hintergrund der Erfindung
  • Das Proopiomelanocortin- (POMC) Genprodukt wird unter Erzeugung einer großen Anzahl biologisch aktiver Peptide prozessiert. Zwei dieser Peptide, das α-Melanozyten-stimulierende Hormon (αMSH) und das adrenocorticotrope Hormon (ACTH) spielen bei der Kontrolle der Melanozyten- bzw. der adrenocortikalen Funktion gut verstandene Rollen. Jedoch werden beide dieser Hormone in einer Vielzahl von Formen mit unbekannten Funktionen gefunden. Die Melanocortinpeptide besitzen auch eine unterschiedliche Anzahl von biologischen Aktivitäten in anderen Geweben, einschließlich des Gehirns und des Immunsystems, und binden dort mit einer bestimmten Pharmakologie an spezielle Rezeptoren [für Übersichten siehe, Hanneman et al., in „Peptide Hormone as Prohormones", G. Martinez, Ed.. (Ellis Horwood Ltd.: Chichester, UK), Seiten 53–82; DeWied & Jolles, 1982, Phsiol. Rev. 62: 976–1059].
  • Ein komplettes Verständnis dieser Peptide und ihrer unterschiedlichen biologischen Aktivitäten erfordert die Isolierung und Charakterisierung ihrer entsprechenden Rezeptoren. Im Stand der Technik ist über einige biochemische Untersuchungen berichtet worden.
  • Shimuze, 1985, Yale J. Biol. Med. 58: 561–570 diskutiert die Physiologie eines Melanozyten-stimulierenden Hormons.
  • Tatro & Reichlin, 1987, Endocrinology 121: 1900–1907 offenbart, dass MSH-Rezeptoren in Nagetiergeweben weit verbreitet sind.
  • Kameyama et al., 1988, J. Cell. Phys 137: 35–44 diskutiert den Zusammenhang zwischen der Expression von Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptoren mit der Säugetierpigmentierung.
  • Solca et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 14277–14280 offenbart die Charakterisierung des Molekulargewichts von MSH-Rezeptoren aus Maus und Mensch, welche mit MSH-Analoga verbunden sind, die mit Radioaktivität und Fotoaffinität markiert sind.
  • Leiba et al., 1990, Eur, J. Pharm. 181: 71–82 diskutiert die Verwendung des Melanocortinrezeptors in der Tränendrüse der Ratte als ein Modellsystem für die Untersuchung des Melanozyten-stimulierenden Hormons als ein potenzieller Neurotransmitter.
  • Siegrist et al., 1991, J. Receptor Res. 11: 323–331 offenbart die Quantifizierung von Rezeptoren auf Melanomgewebe der Maus durch eine Rezeptor-Autoradiographie.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ein humanes Melanozyten-stimulierendes Hormonrezeptorgen, die Nukleotidsequenz dieses Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz des verwandten Proteins, eine homogene Zusammensetzung des Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors, Sonden zur Nukleinsäurehybridisierung und ein Verfahren zur Bestimmung der Gewebeverteilung der Expression des Gens, ein rekombinantes Expressionskonstrukt, welches das Gen in Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen exprimieren können, und solche Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen, welche bei der Charakterisierung von neuen und nützlichen Arzneimitteln verwendbar sind. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die homologe Form des humanen Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptorgens aus der Maus.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Nukleotidsequenz des Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors der Maus (1A) (SEQ ID NO: 3) und des Menschen (1B und 1C) (SEQ ID NO: 5).
  • 2 stellt einen Aminosäuresequenzvergleich zwischen den Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptorproteinen der Maus und des Menschen dar.
  • 3 zeigt die Bindung von Agonisten des Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors an einen Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptor der Maus, welcher in humanen 293-Zellen exprimiert wird.
  • 4 zeigt die Gewebeverteilung der Expression des Melanozytenstimulierenden Hormonrezeptorgens des Menschen (Feld A) und der Maus (Feld B) mittels Northern Blotting Hybridisierung.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Klonierung, Expression und funktionelle Charakterisierung von Genen des Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptors (MSHR, „melanocyte stimulation hormone receptor"). Die Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz dieser Gene, welche für die Säugetier-MSHRs codieren und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der verwandten Proteine, ebenso wie Gewebeverteilungsmuster der Expression dieser Gene.
  • Insbesondere ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf die Isolierung, Charakterisierung und pharmakologische Verwendung des humanen MSHR, des diesem Rezeptor entsprechenden Gens, einer Nukleinsäure-Hybridisierungssonde, welche DNA-Sequenzen des humanen MSHR umfasst, ein rekombinantes eukaryontisches Expressionskonstrukt, welches den humanen MSHR in Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen exprimieren kann und solche Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen, welche den humanen MSHR synthetisieren, eine homogene Zusammensetzung des humanen MSHR und Antikörper gegen den humanen MSHR und Epitope des humanen MSHR.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf die Isolierung, Charakterisierung und pharmakologische Verwendung des Maus-MSHR, des diesem Rezeptor entsprechenden Gens, einer Nukleinsäure-Hybridisierungssonde, welche DNA-Sequenzen des Maus-MSHR umfasst, ein rekombinantes eukaryontisches Expressionskonstrukt, welches den Maus-MSHR in Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen exprimieren kann und solche Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen, welche den Maus-MSHR synthetisieren, eine homogene Zusammensetzung des Maus-MSHR und Antikörper gegen den Maus-MSHR und Epitope des Maus-MSHR.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure bereitzustellen, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen Säugetier-MSHR codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz den humanen MSHR. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform codiert die Nukleotidsequenz für den Maus-MSHR.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst eine Nukleinsäure, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, welche für einen humanen MSHR-Rezeptor codiert, welche aus einem DNA-Molekül abgeleitet wurde, das aus einer humanen Genombibliothek isoliert wurde (SEQ ID NO: 5). In dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz 1635 Nukleotide des humanen MSHR-Gens, welches 953 Nukleotide der codierenden Sequenz, 462 Nukleotide der 5'-nicht translatierten Sequenz und 220 Nukleotide der 2'-nicht translatierten Sequenz umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäure, welche eine Nukleotidsequenz umfasst, die für einen Maus-MSHR codiert, der von einem cDNA-Molekül abgeleitet wurde, welches aus einer cDNA-Bibliothek isoliert wurde, die mit RNA von Cloudman-Melanomzellen der Maus konstruiert wurde (SEQ ID NO: 3). In dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst die Nukleotidsequenz 1260 Nukleotide des Maus-MSHR-Gens, welches 947 Nukleotide der codierenden Sequenz, 15 Nukleotide der 5'-nicht translatierten Sequenz und 298 Nukleotide der 3'-nicht translatierten Sequenz umfasst.
  • Die Erfindung umfasst Nukleinsäuren, welche die Nukleotidsequenzen von Säugetier-MSHRs umfassen, am meisten bevorzugt Maus- und humane MSHRs (SEQ ID NO: 3 & 5), und umfasst Allelvariationen, welche vom Umfang der Ansprüche umfasst werden Die Erfindung umfasst auch ein Protein, welches von einer vorhergesagten Aminosäuresequenz des MSHR der Maus (SEQ ID NO: 4) und des Menschen (SEQ ID NO: 6) umfasst ist, abgeleitet von der Nukleotidsequenz, welche die komplette codierende Sequenz des MSHR-Gens der Maus (SEQ ID NO: 3) und des Menschen (SEQ ID NO: 5) umfasst, wie hierin beschrieben.
  • In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung eine homogene Zusammensetzung eines Maus-MSHR mit 35,3 Kilodalton oder eines Derivats davon, wobei die Aminosäuresequenz des MSHR oder des Derivats davon die in 2 (SEQ ID NO: 4) gezeigte Maus-MSH-R-Sequenz umfasst.
  • In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung eine homogene Zusammensetzung eines humanen MSHR mit 34,7 Kilodalton oder eines Derivats davon, worin die Aminosäuresequenz des MSHR oder des Derivats davon die in 2 (SEQ ID NO: 6) gezeigte humane MSH-R-Sequenz umfasst.
  • Diese Erfindung stellt sowohl Nukleotid- als auch Aminosäuresonden bereit, welche von diesen Sequenzen abgeleitet sind. Die Erfindung umfasst entweder aus cDNA- oder aus genomischen DNA-Klonen isolierte Sonden, ebenso wie synthetisch mit der davon stammenden Sequenzinformation hergestellte Sonden. Die Erfindung umfasst insbesondere, ist aber nicht beschränkt auf Oligonukleotid-, Nick-translatierte, Random-primed oder in vitro amplifizierte Sonden, welche hergestellt werden unter Verwendung von cDNA oder genomischen Klonen, welche die Erfindung verkörpern, und Oligonukleotid- oder andere synthetische Sonden, welche chemisch unter Verwendung der Nukleotidsequenzinformation der erfindungsgemäßen Ausführungsformen mit cDNA oder mit genomischen Klonen synthetisiert wurden.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung, Sequenzen eines Säugetier-MSHR bereitzustellen, bevorzugt des MSHR der Maus oder des Menschen, zur Verwendung als Nukleinsäure-Hybridisierungssonden zur Bestimmung des Musters, der Menge und des Ausmaßes der Expression dieses Rezeptors in verschiedenen Geweben von Säugetieren, einschließlich Menschen. Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Nukleinsäure-Hybridisierungssonden bereitzustellen, welche von den Sequenzen des MSHR der Maus oder des Menschen abgeleitet sind, zur Verwendung beim Nachweis und der Diagnose genetischer Erkrankungen. Es ist ein Gegenstand dieser Erfindung, Nukleinsäure-Hybridisierungssonden bereitzustellen, welche von den DNA-Sequenzen des MSHR der Maus oder des Menschen abgeleitet sind, zur Verwendung für den Nachweis von neuen verwandten Rezeptorgenen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch synthetische Peptide, welche hergestellt werden unter Verwendung der Nukleotidsequenzinformation, umfassend die cDNA- oder genomischen Klonausführungsformen der Erfindung. Die Erfindung umfasst entweder natürlich vorkommende oder synthetische Peptide, welche als Antigene bei der Herstellung von MSHR-spezifischen Antikörpern verwendet werden können, oder als Kompetitoren des MSHR-Moleküls für die Arzneimittelbindung verwendet werden können, oder bei der Herstellung von Inhibitoren für die Bindung von Agonisten oder Antagonisten oder Analoga davon an das MSHR-Molekül verwendet werden können.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper gegen Säugetier-MSHRs und Epitope von Säugetier-MSHRs bereit, bevorzugt von MSHR-Proteinen der Maus oder des Menschen. Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Antikörper bereitzustellen, welche immunologisch reaktiv sind gegenüber einem Säugetier-MSHR-Protein. Es ist ein besonderer Gegenstand der Erfindung, monoklonale Antikörper gegen das Säugetier-MSHR-Protein bereitzustellen, am meisten bevorzugt gegen das MSHR-Protein der Maus oder des Menschen.
  • Es ist auch ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Hybridomzelllinie bereitzustellen, welche einen solchen Antikörper erzeugt. Es ist ein besonderer Gegenstand der Erfindung, eine Hybridomzelllinie bereitzustellen, welche das Ergebnis einer Fusion zwischen einer Myelomzelllinie einer Maus, welche kein Immunglobulin produziert, und Milzzellen ist, welche aus einer Maus stammen, die mit einer humanen Zelllinie immunisiert wurde, welche ein MSHR-Antigen exprimiert. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Hybridomzelllinie bereit, welche solch einen Antikörper erzeugt, und welche in eine lebende Maus injiziert werden kann, um eine Aszitesflüssigkeit aus der Maus bereitzustellen, welches solch einen Antikörper umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, welche eine therapeutisch wirksame Menge eines monoklonalen Antikörpers, welcher immunologisch reaktiv ist gegenüber einem Säugetier-MSHR, bevorzugt einem MSHR der Maus oder des Menschen, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  • Es ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Epitop eines Säugetier-MSHR-Proteins bereitzustellen, wobei das Epitop immunologisch reaktiv ist gegenüber einem Antikörper, welcher für den Säugetier-MSHR spezifisch ist. In bevorzugten Ausführungsformen stammt das Epitop von einem MSHR-Protein der Maus oder des Menschen.
  • Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung, einen chimären Antikörper bereitzustellen, welcher immunologisch reaktiv ist gegenüber einem Säugetier-MSHR-Protein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der chimäre Antikörper ein monoklonaler Antikörper. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der MSHR ein MSHR der Maus oder des Menschen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes Expressionskonstrukt bereit, welches die Nukleotidsequenz eines Säugetier-MSHR umfasst, bevorzugt des MSHR der Maus oder des Menschen, und Sequenzen, welche ausreichen, um die Synthese eines MSHR der Maus oder des Menschen in Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen zu regeln. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das rekombinante Expressionskonstrukt Plasmidsequenzen, welche von dem Plasmid pcDNAI/neo stammen, und cDNA oder genomische DNA des MSHR-Gens der Maus oder des Menschen. Diese Erfindung umfasst ein rekombinantes Expressionssystem, welches im Wesentlichen die Nukleotidequenzen von genomischen oder cDNA-Klonen des MSHR der Maus oder des Menschen umfasst, in einer Ausführungsform, welche deren Expression in Kulturen oder transformierten eukaryontischen Zellen ermöglicht.
  • Es ist auch ein Gegenstand dieser Erfindung, Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen bereitzustellen, welche mit einem solchen rekombinanten Expressionskonstrukt transformiert worden sind, und welche ein MSHR-Protein eines Säugetiers, bevorzugt einer Maus oder eines Menschen synthetisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung humane 293-Zellen bereit, welche den Maus-MSHR synthetisieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung humane 293-Zellen bereit, welche humanes MSHR-Protein synthetisieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Proteinpräparationen von Säugetier-MSHR, bevorzugt von Maus oder Mensch, und Präparationen von Membranen, die einen Säugetier-MSHR enthalten, welche aus Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellmembranen, welche Maus-MSHR-Protein enthalten, aus 293-Zellkulturen isoliert, welche mit einem rekombinanten Expressionskonstrukt transformiert wurden, welches die Synthese des Maus-MSHR regelt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Zellmembranen, welche humanes MSHR-Protein enthalten, aus 293-Zellkulturen isoliert, welche mit einem rekombinanten Expressionskonstrukt transformiert wurden, welches die Synthese des humanen MSHR regelt.
  • Es ist auch ein Gegenstand dieser Erfindung, Säugetier-MSHR, bevorzugt von Maus oder Mensch, zur Verwendung beim in vitro-Screening für neue MSHR-agonistische und -antagonistische Verbindungen bereitzustellen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Membranpräparationen, enthaltend den Maus-MSHR, welche aus Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen stammen, verwendet, um die Dissoziationseigenschaften von verschiedenen neuen MSHR-agonistischen und -antagonistischen Verbindungen in vitro zu untersuchen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Membranpräparationen, enthaltend den humanen MSHR, welche aus Kulturen von transformierten eukaryontischen Zellen stammen, verwendet, um die Dissoziationseigenschaften von verschiedenen neuen MSHR-agonistischen und -antagonistischen Verbindungen in vitro zu bestimmen. Diese Eigenschaften werden dann verwendet, um solche neuen Verbindungen durch Vergleich mit den Bindungseigenschaften von bekannten Agonisten und Antagonisten des MSHR von Maus und Mensch zu charakterisieren.
  • Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich für den in vitro-Nachweis von Analoga von Agonisten oder Antagonisten des MSHR, welche bekannt oder unbekannt sind, entweder natürlich vorkommend oder als Ausführungsformen eines Arzneimittels.
  • Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum quantitativen Nachweis von Agonisten oder Antagonisten, oder Analoga davon, des MSHR, welche bekannt oder unbekannt sind, entweder natürlich vorkommend oder als die Ausführungsformen eines Arzneimittels bereitzustellen. Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, um solche Agonisten, Antagonisten oder Analoga davon in Blut, Speichel, Samen, Liquor, Plasma, Lymphflüssigkeit oder einer anderen Körperflüssigkeit nachzuweisen.
  • Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende ausführlichere Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und die Ansprüche offenbar.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Der Begriff "Melanozyten-stimulierender Hormonrezeptor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Proteine, welche im Wesentlichen homolog sind und im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität besitzen wie das Protein, welches durch die in 1 (SEQ ID NO: 3) dargestellte Nukleotidsequenz codiert wird. Diese Definition soll natürliche Allelvariationen der Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptorsequenz umfassen. Klonierte Gene der vorliegende Erfindung können für MSHRs mit Ursprung in jeder Spezies codieren, einschließlich beispielsweise von Maus, Ratte, Kaninchen, Katze und Mensch, codieren aber bevorzugt für Rezeptoren von Säugetieren, am meisten bevorzugt mit einem Ursprung in Maus und Mensch.
  • Erfindungsgemäß bereitgestellte Nukleinsäure-Hybridisierungssonden umfassen DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen homolog sind mit den in
  • 1A (SEQ ID NO: 3) und in den 1B und 1C (SEQ ID NO: 5) gezeigten DNA-Sequenzen. Nukleinsäuresonden sind nützlich zum Nachweis der MSHR-Genexpression in Zellen und Geweben unter Verwendung von Verfahren, welche im Fachgebiet bekannt sind, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine Northern Blotting-Hybridisierung, einer in situ-Hybridisierung und einer Southern-Hybridisierung für reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion-Produkt-DNAs. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Sonden, einschließlich davon abgeleitete Oligonukleotidsonden, sind auch nützlich bei der Southern-Hybridisierung von genomischer DNA eines Säugetiers, bevorzugt des Menschen, zum Screening im Hinblick auf einen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), welcher mit bestimmten genetischen Erkrankungen assoziiert ist.
  • Die Herstellung von Proteinen wie etwa dem MSHR aus klonierten Genen durch Gentechnologie ist bekannt. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 4,761,371 von Bell et al. in Spalte 6, Zeile 3 bis Spalte 9, Zeile 65. (Die Offenbarung aller hierin zitierten Referenzen von U.S. Patenten sollen hierin durch Referenz enthalten sein.) Die folgende Diskussion soll folglich einen Überblick über dieses Gebiet geben und soll nicht den gesamten Stand der Technik reflektieren.
  • Im Hinblick auf diese Offenbarung kann DNA, welche für den MSHR codiert, durch chemische Synthese, durch Screening von reversen Transkripten von mRNA aus geeigneten Zell- oder Zelllinienkulturen, durch Screening von genomischen Bibliotheken aus geeigneten Zellen oder durch Kombination dieser Verfahren erhalten werden, wie unten veranschaulicht ist. Das Screening von mRNA oder genomischer DNA kann mit Oligonukleotidsonden durchgeführt werden, welche mittels der hierin bereitgestellten Sequenzinformation des MSHR-Gens erzeugt wurden. Die Sonden können gemäß bekannter Verfahren mit einer nachweisbaren Gruppe markiert werden, wie etwa einer Fluoreszenzgruppe, einem radioaktiven Atom oder einer chemilumineszenten Gruppe, und in konventionellen Hybridisierungsassays verwendet werden, was in den Beispielen unten ausführlicher beschrieben wird. Alternativ können MSHR-Gensequenzen erhalten werden durch Verwendung des Verfahrens der Polymerasekettenreaktion (PCR), wobei die PCR-Oligonukleotidprimer erzeugt werden anhand der hierin bereitgestellten MSHR-Gensequenz. Siehe U.S. Patent Nr. 4,683,195 von Mullis et al. und 4,683,202 von Mullis.
  • Der MSHR kann in Wirtszellen synthetisiert werden, welche mit einem rekombinanten Expressionskonstrukt transformiert werden, welches eine DNA-Sequenz umfasst, die für den MSHR codiert. Solch ein rekombinantes Expressionskonstrukt kann auch einen Vektor umfassen, welcher ein replizierbares DNA-Konstrukt ist. Hierin werden Vektoren entweder verwendet, um die für den MSHR codierende DNA zu amplifizieren und/oder DNA zu exprimieren, welche für den MSHR codiert. Erfindungsgemäß ist ein rekombinantes Expressionskonstrukt ein replizierbares DNA-Konstrukt, in welchem eine für den MSHR codierende DNA-Sequenz in funktionsfähiger Weise mit geeigneten Kontrollsequenzen verbunden ist, welche die Expression des MSHR in einem geeigneten Wirt bewirken können. Der Bedarf an solchen Kontrollsequenzen hängt von dem ausgewählten Wirt und dem gewählten Transformationsverfahren ab. Im Allgemeinen umfassen Kontrollsequenzen einen Transkriptionspromotor, eine optionale Operatorsequenz zur Kontrolle der Transkription, eine Sequenz, welche für geeignete mRNA Ribosomenbindungsstellen codiert und Sequenzen, welche die Termination der Transkription und der Translation steuern. Amplifikationsvektoren benötigen keine Expressionskontrolldomänen. Alles was gebraucht wird, ist die Fähigkeit, in einem Wirt zu replizieren, normalerweise verliehen durch einen Replikationsursprung, und ein Selektionsgen, um die Erkennung der Transformanten zu erleichtern.
  • Beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung nützliche Vektoren umfassen Plasmide, Viren (einschließlich Phagen), Retroviren und integrierbare DNA-Fragmente (d. h. Fragmente, welche durch homologe Rekombination in das Wirtsgenom integriert werden können). Der Vektor repliziert und funktioniert unabhängig vom Wirtsgenom oder kann in einigen Fällen selbst in das Genom integrieren. Geeignete Vektoren enthalten Replikon- und Kontrollsequenzen, welche aus Spezies stammen, die mit dem vorgesehenen Expressionswirt kompatibel sind. Ein bevorzugter Vektor ist das Plasmid pcDNAIneo. Transformierte Wirtszellen sind Zellen, welche transformiert oder transfiziert worden sind mit rekombinanten Expressionskonstrukten, welche unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt wurden und einen Säugetier-MSHR umfassen. Transformierte Wirtszellen können normalerweise den Säugetier-MSHR exprimieren, aber Wirtszellen, welche zum Zweck der Klonierung oder Amplifikation von DNA für Nukleinsäure-Hybridisierungssonden transformiert wurden, müssen den Rezeptor nicht exprimieren. Wenn der Rezeptor exprimiert wird, ist der Säugetier-MSHR normalerweise in der Wirtszellmembran lokalisiert.
  • Die DNA-Regionen sind funktionsfähig verbunden, wenn sie funktionell miteinander in Beziehung stehen. Ein Promotor ist beispielsweise funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass eine Translation ermöglicht wird. Im Allgemeinen bedeutet funktionsfähig verbunden benachbart und im Fall von Leadersequenzen benachbart und im gleichen Translationsleserahmen.
  • Zellkulturen, welche aus mehrzelligen Organismen stammen, sind für die Synthese rekombinanter MSHR ein erwünschter Wirt. Prinzipiell ist jede höhere eukaryontische Zellkultur bearbeitbar, entweder aus einer Vertebratenkultur oder einer Invertebratenkultur. Wie in den Beispielen veranschaulicht ist, sind aber Säugetierzellen bevorzugt. Die Propagierung solcher Zellen in einer Zellkultur ist zu einem Routineverfahren geworden. Siehe Tissue Culture, Academic Press, Kruse & Patterson, Editoren (1973). Beispiele für verwendbare Wirtszelllinien sind humane 293-Zellen, VERO- und HeLa-Zellen, chinesische Hamstereierstock- (CHO, „Chinese hamster ovary") Zelllinien und WI138-, BHK-, COS-7-, CV- und MDCK-Zelllinien. Humane 293-Zellen sind bevorzugt. Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen normalerweise (falls nötig) einen Replikationsursprung, einen stromabwärts des zu exprimierenden Gens lokalisierten Promotor, zusammen mit einer ribosomen Bindungsstelle, RNA-Splicestellen (wenn genomische DNA mit Introns verwendet wird), einer Polyadenylierungsstelle und einer Transkriptionsterminationssequenz.
  • Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors bereitgestellt werden, damit ein exogener Ursprung eingefügt wird, der etwa aus SV40 oder einer anderen viralen Quelle (z. B. Polyoma, Adenovirus, VSV oder MPV) stammen kann, oder kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, kann das letztere ausreichen.
  • Die Erfindung stellt homogene Zusammensetzungen eines Säugetier-MSHR-Proteins bereit, welches durch die hierin bereitgestellten transformierten eukaryontischen Zellen hergestellt wird. Solche homogenen Zusammensetzungen sollen Säugetier-MSHR-Protein umfassen, das 90% des Proteins in solchen homogenen Zusammensetzungen umfasst.
  • Säugetier-MSHR-Protein, welches erfindungsgemäß aus klonierten Genen hergestellt wurde, kann zum Screening von agonistischen Verbindungen der MSHR-Aktivität verwendet werden, oder zur Bestimmung der Menge eines MSHR-agonistischen oder -antagonistischen Arzneimittels in einer Lösung (z. B. Blutplasma oder Serum). Beispielsweise können Wirtszellen mit einem rekombinanten Expressionskonstrukt der Erfindung transformiert werden, MSHR wird in diesem Wirt exprimiert, die Zellen werden lysiert und die Membranen dieser Zellen werden verwendet, um Verbindungen im Hinblick auf eine MSHR-Bindeaktivität zu durchsuchen. Kompetitive Bindungsassays, in denen solche Verfahren durchgeführt werden können, sind im Fachgebiet gut bekannt. Durch die Selektion von Wirtszellen, welche normalerweise keine MSHRs exprimieren, können reine Präparationen von Membranen, welche MSHRs enthalten, erhalten werden. Weiterhin können MSHR-Agonisten und - Antagonisten identifiziert werden durch Transformation von Wirtszellen mit erfindungsgemäßen Vektoren. Von solchen Zellen erhaltene Membranen können in Bindungsuntersuchungen verwendet werden, worin die Dissoziationsaktivität des Arzneimittels überwacht wird.
  • Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionskonstrukte sind nützlich in der Molekularbiologie, um Zellen zu transformieren, welche normalerweise den MSHR nicht exprimieren, damit diese danach diesen Rezeptor exprimieren. Solche Zellen sind nützlich als Zwischenprodukte bei der Herstellung von Zellmembranpräparationen, welche in Rezeptorbindungsassays nützlich sind, welche wiederum für das Screening von Arzneimitteln nützlich sind. Gene und Vektoren, welche das erfindungsgemäße rekombinante Expressionskonstrukt umfassen, sind weiterhin in der Gentherapie verwendbar. Für solche Zwecke können retrovirale Vektoren verwendet werden, wie sie im U.S. Patent Nr. 4,650,764 von Temin & Watanabe oder im U.S. Patent Nr. 4,861,719 von Miller beschrieben werden. Die klonierten Gene der vorliegenden Erfindung oder Fragmente davon können auch in einer Gentherapie verwendet werden, welche mittels homologer Rekombination oder ortsgerichteter Mutagense durchgeführt wird. Siehe im Allgemeinen Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503–512; Bertling, 1987, Bioscience Reports 7: 107–112; Smithis et al., 1985, Nature 317: 230–234.
  • Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind nützlich als diagnostische Werkzeuge zum Sondieren der Expression des MSHR-Rezeptorgens in Geweben. Die Gewebe können beispielsweise in situ mit Oligonukleotidsonden, welche durch konventionelle Autoradioagraphieverfahren nachweisbare Gruppen tragen, sondiert werden, wie es in den Beispielen unten ausführlicher dargestellt wird, um die native Expression dieses Rezeptors oder damit verbundenen pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Weiter können Chromosomen sondiert werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit des MSHR-Gens und mögliche damit verbundene pathologische Bedingungen zu untersuchen, was ebenso in den Beispielen unten veranschaulicht wird.
  • Die Erfindung stellt auch Antikörper bereit, welche gegenüber einem Säugetier-MSHR immunologisch reaktiv sind. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Antikörper können in Tieren angezogen werden, durch Inokulation mit Zellen, welche einen Säugetier-MSHR exprimieren, oder Epitopen eines Säugetier-MSHR unter Verwendung der im Fachgebiet gut bekannten Verfahren. Tiere, welche für solche Inokulationen verwendet werden können, umfassen Individuen aus den Spezies umfassend Kühe, Schafe, Schweine, Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hamster, Ziegen und Primaten. Bevorzugte Tiere zur Inokulation sind Nagetiere (einschließlich Mäuse, Ratten, Hamster) und Kaninchen. Das am meisten bevorzugte Tier ist die Maus.
  • Zellen, welche für solche Inokulationen verwendet werden können oder für ein beliebiges anderes Mittel, welches in der Erfindung verwendet wird, umfassen jede Zelllinie, welche natürlicherweise ein Säugetier-MSHR exprimiert, oder jede Zelle oder Zelllinie, welche ein Säugetier-MSHR oder ein beliebiges Epitop darin als Ergebnis einer molekularen oder genetischen Manipulation exprimiert, oder welche behandelt wurde, um die Expression eines Säugetier-MSHR durch physikalische, biochemische oder genetische Mittel zu steigern. Bevorzugte Zellen sind humane Zellen, am meisten bevorzugte humane 293-Zellen, welche mit einem rekombinanten Expressionskonstrukt transformiert wurden, welches DNA-Sequenzen umfasst, die für ein Säugetier-MSHR codieren, und welche das Produkt des Säugetier-MSHR-Gens exprimieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt monoklonale Antikörper bereit, welche gegenüber einem Epitop immunologisch reaktiv sind, welches ein Säugetier-MSHR ist, der auf der Oberfläche von Säugetierzellen, bevorzugt Mensch- oder Mauszellen vorliegt. Diese Antikörper werden unter Verwendung von Verfahren und Techniken hergestellt, die Fachleuten gut bekannt sind.
  • Erfindungsgemäß bereitgestellte monoklonale Antikörper werden hergestellt durch Hybridomzelllinien, welche ebenso erfindungsgemäß bereitgestellt werden, und welche durch die im Fachgebiet gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Hybridomzelllinien werden hergestellt durch Fusionierung einzelner Zellen einer Myelomzelllinie mit Milzzellen, welche aus Tieren stammen, die mit Zellen immunisiert wurden, welche einen Säugetier-MSHR exprimieren, einschließlich humaner Zellen, wie oben beschrieben. Die in der Erfindung verwendeten Myelomzelllinien umfassen Linien, welche von Myelomen von Mäusen, Ratten, Hamstern, Primaten und Menschen abgeleitet sind. Bevorzugte Myelomzelllinien sind von der Maus, und die am meisten bevorzugte Maus-Myelomzelllinie ist P3X63-Ag8.653. Die Tiere, aus denen die Milzen nach einer Immunisierung erhalten werden sind Ratten, Mäuse und Hamster, bevorzugt Mäuse, am meisten bevorzugt Balb-C-Mäuse. Milzzellen und Myelomzellen werden fusioniert unter Verwendung einer Anzahl von im Fachgebiet bekannten Verfahren, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Inkubation mit inaktiviertem Sendai-Virus und die Inkubation in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG). Das am meisten bevorzugte Verfahren zur Zellfusion ist eine Inkubation in Gegenwart einer Lösung von 45% (w/v) PEG-1450. Durch Hybridomzelllinien produzierte monoklonale Antikörper können aus der Flüssigkeit des Zellkulturüberstands beim in vitro-Zellwachstum geerntet werden; alternativ können Hybridomzellen subkutan und/oder in die Peritonealhöhle eines Tiers, am meisten bevorzugt einer Maus, injiziert werden, und die monoklonalen Antikörper können aus dem Blut und/oder der Aszitesflüssigkeit erhalten werden.
  • Erfindungsgemäß bereitgestellte monoklonale Antikörper können auch durch rekombinante genetische Verfahren erzeugt werden, welche Fachleuten bekannt sind, und die vorliegende Erfindung umfasst durch solche Verfahren hergestellte Antikörper, welche gegenüber einem Epitop eines Säugetier-MSHR immunologisch reaktiv sind.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst Fragmente des Antikörpers, welche gegenüber einem Epitop eines Säugetier-MSHR immunologisch reaktiv sind. Solche Fragmente können durch eine Vielzahl von Verfahren erzeugt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine proteolytische Spaltung, die chemische Synthese oder Präparation solcher Fragmente mittels Genmanipulationsverfahren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Einzelkettenantikörper, welche gegenüber einem Epitop eines Säugetier-MSHR immunologisch reaktiv sind, die durch Verfahren hergestellt werden, welche Fachleuten bekannt sind.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Epitop eines Säugetier-MSHR, welches Sequenzen und/oder eine Konformation von Sequenzen umfasst, die im Säugetier-MSHR-Molekül vorliegt. Dieses Epitop kann natürlich vorkommen, oder kann das Resultat einer proteolytischen Spaltung des Säugetier-MSHR-Moleküls und der Isolierung eines Epitop enthaltenden Peptids sein, oder kann erhalten werden durch die Synthese eines Epitop-enthaltenden Peptids unter Verwendung von Verfahren, welche Fachleuten bekannt sind. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Epitoppeptide, welche als Ergebnis von Genmanipulationsverfahren erzeugt werden und durch genetisch veränderte prokaryontische oder eukaryontische Zellen synthetisiert werden.
  • Die Erfindung umfasst auch chimäre Antikörper, welche Peptide der leichten Kette und der schweren Kette umfassen, welche immunologisch reaktiv sind gegenüber einem Epitop, welches ein Säugetier-MSHR ist. Die in der vorliegenden Erfindung dargestellten chimären Antikörper umfassen diejenigen Antikörper, welche von natürlich vorkommenden Antikörpern abgeleitet sind, ebenso wie chimäre Antikörper, welche mittels Genmanipulationsverfahren, welche Fachleuten gut bekannt sind, hergestellt werden.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen spezielle Ausführungsformen der Erfindung und verschiedene Verwendungen davon. Sie werden ausschließlich für erläuternde Zwecke bereitgestellt und sollen keine Beschränkung der Erfindung darstellen.
  • Beispiel 1
  • Isolierung einer αMSH-Rezeptorsonde durch eine Random-PCR-Amplifikation von cDNA eines humanen Melanoms unter Verwendung von degenerierten Oligonukleotidprimern
  • Um neue G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zu klonieren, wurde die cDNA eines humanen Melanoms als Templat für ein auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) basierendes, zufälliges Klonierungsexperiment verwendet. Die PCR wurde durchgeführt unter Verwendung eines Paars von degenerierten Oligonukleotidprimern, welche der mutmaßlichen dritten und sechsten Transmembranregion des G-Protein-gekoppelten Rezeptors entsprechen (Libert et al., 1989, Science 244: 569–72; Shou et al., 1990, Nature 347: 76–80). Die in diesem Experiment erhaltenen PCR-Produkte wurden mittels Nukleotidsequenzierung charakterisiert. Es wurden zwei neue Sequenzen identifiziert, welche neue G-Protein-gekoppelte Rezeptoren darstellen.
  • Die PCR-Amplifikation wurde wie folgt durchgeführt. Aus einer humanen Melanomtumorprobe wurde Gesamt-RNA isoliert durch das Guanidiniumthiocyanatverfahren (Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294–5299). Aus der Gesamt-RNA wurde mit muriner reverser Transkriptase (BRL, Gaithersburg, MD) durch Oligo-dT-Priming [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), 1990] doppelsträngige cDNA synthetisiert. Das Melanom-cDNA-Gemisch wurde dann 45 Zyklen einer PCR-Amplifikation unterworfen, unter Verwendung von 500 Picomol der degenerierten Oligonukleotidprimer mit folgender Sequenz: Primer III (sense)
    Figure 00190001
    und Primer IV (antisense)
    Figure 00190002
    in 100 μl einer Lösung, welche 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 2,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, jeweils 200 μM dNTP und 2,5 Unit Taq Polymerase (Saiki et al., 1988, Science 239: 487–491) enthielt. Diese Primer wurden kommerziell synthetisiert von Research Genetics Inc. (Nuntsville, AL). Jeder PCR-Amplifikationszyklus bestand aus Inkubationen bei 94°C für 1 min (Denaturierung), 45°C für 2 min (Annealing) und 72°C für 2 min (Extension).
  • Die amplifizierten Produkte der PCR-Reaktion wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Methanol präzipitiert. Nach einem Verdau mit EcoRI und SalI wurden die PCR-Produkte auf einem 1,2%-igen Agarosegel aufgetrennt. Ein Stück dieses Gels, welches den PCR-Produkten mit 300 Basenpaaren (bp) in der Größe entsprach, wurde ausgeschnitten und unter Verwendung von Glasbeads und Natriumjodid gereinigt, und das Insert wurde dann in einen pBKS-Klonierungsvektor (Stratagene, LaJolla, CA) kloniert.
  • Es wurden insgesamt 172 solcher pBKS-Klone mit Inserts unter Verwendung von Squenase (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) durch das Didesoxynukleotid-Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467) sequenziert. Es wurden zwei Typen von Sequenzen identifiziert, welche zu anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren homolog waren.
  • Beispiel 2
  • Isolierung und Sequenzanalyse von αMSH-Rezeptor-cDNA der Maus
  • Die in Beispiel 1 isolierten Sonden wurden verwendet, um eine Cloudman-Mclanom-cDNA-Bibliothek zu durchsuchen, um eine Volllängen-cDNA zu isolieren, welche der klonierten Sonde entspricht. Aus einer Bibliothek mit 5 × 106 Klonen, welche wie oben beschrieben durchsucht wurde, wurde ein Klon isoliert. Dieser Klon enthielt ein Insert mit 2,6 Kilobasen (kb). Die Nukleotidsequenz der kompletten codierenden Region wurde bestimmt, wie in 1A (SEQ ID NO: 3) gezeigt wird.
  • Die PCR-Sonde wurde markiert durch das Random-Priming-Verfahren (Stratagene Primelt, #300387, LaJolla, CA) und verwendet, um eine Cloudman-Melanomlinien-cDNA-Bibliothek zu durchsuchen, welche im λZAP-Vektor (Stratagene) konstruiert wurde. Das Screening der Bibliothek wurde durchgeführt unter im Fachgebiet bekannten Verfahren, welche in Bunzow et al (1988, Nature 336: 783–787) beschrieben werden, bei mittlerer Stringenz (40% Formamid, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1% Natriumpyrophosphat, 0,2% Natriumdodecylsulfat, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 10 × Denhardt-Lösung). Es wurde ein cDNA-Klon identifiziert (als mmeIA bezeichnet), und dessen 2,6 kb cDNA-Insert wurde isoliert und in pBKS (Stratagene) subkloniert, das resultierende Plasmid wurde pmmeIA genannt. Die Analyse und die Homologievergleiche der Nukleotidsequenz wurden durchgeführt mit dem OHSU-Computersystem mit einer Software, die von Intelligenetics Inc. (Mountain View, CA) bereitgestellt wird.
  • Die Nukleotidsequenz von pmmeIA (dem cDNA-Klon, der wie oben beschrieben isoliert wurde) ist in 1A (SEQ ID NO: 3) gezeigt. Der längste offene Leserahmen dieser cDNA codiert für ein vorhergesagtes Proteinprodukt mit 315 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von 35,3 Kilodalton (kD). Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in 2 (SEQ ID NO: 4) als Maus-MSHR gezeigt. Es wird der Aminosäurecode mit einem Buchstaben verwendet [siehe G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988, (MacMillen Publishing: New York), S. 33). Die oberen Buchstaben bezeichnen die Aminosäurereste, welche den gezeigten Rezeptorproteinen gemeinsam sind; die unteren Buchstaben bezeichnen abweichende Reste.
  • Eine Analyse der Hydrophobizität (Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105–132) der abgeleiteten Aminosäuresequenz zeigte, dass das Protein sieben hydrophobe Stücke von 21 bis 26 Aminosäuren pro Stück enthält. Mutmaßliche Transmembrandomänen sind überstrichen und mit römischen Zahlen bezeichnet.
  • Beispiel 3
  • Konstruktion eines Maus-αMSHR-Expressionsplasmids, DNA-Transfektion und funktionelle Expression des αMSHR-Genprodukts
  • Um die wie in Beispiel 2 isolierte mutmaßliche Maus-αMSHR-cDNA biochemisch zu charakterisieren und zu bestätigen, dass sie für einen MSH-Rezeptor codiert, wurde mmeIA in einen Säugetierexpressionsvektor kloniert, dieser Vektor wurde in humane 293-Zellen transfiziert und es wurden Zelllinien erzeugt, welche den mutmaßlichen αMSHR-Rezeptor an der Zelloberfläche exprimierten. Solche Zellen und aus solchen Zellen isolierte Membranen wurden für die unten beschriebenen Experimente zur biochemischen Charakterisierung verwendet.
  • Die gesamte codierende Region des αMSHR-cDNA-Inserts aus mmelA, welche in einem 2,1 kb Fragment enthalten war, wurde aus pBSK ausgeschnitten und in die BamHI/XhoI-Stellen des pcDNAI/neo-Expressionsvektors (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert. Das resultierende Plasmid wurde pcDNA-mmeIA genannt. Plasmid-DNA von pcDNA-mmeIA wurde in großen Maßstab durch einen Zyklus einer CsCI-Gradientenultrazentrifugation präpariert und 20 μg pcDNA-mmelA DNA wurden jeweils in eine Schale mit 100 mm mit 293-Zellen unter Verwendung des Calciumphosphatverfahrens transfiziert (siehe Chen & Okayama, 1987, Mol. Cell. Bol. 7: 2745–2752). Nach der Transfektion wurden die Zellen in DMEM-Medium, welches mit 10% Kälberserum ergänzt war, in einer 3% CO2-Atmosphäre bei 37°C kultiviert. Eine Selektion wurde mit Neomycin (G418; GIBCO) bei einer Konzentration von 1000 μg/ml durchgeführt; die Selektion wurde 72 h nach der Transfektion begonnen und für 3 Wochen fortgesetzt.
  • Der αMSHR koppelt bekanntermaßen an G-Proteine und aktiviert dabei die Adenylcyclase, was die intrazellulären Spiegel von cAMP steigert (siehe Buckley & Ramachandran, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 78: 7431–7435; Grahame-Smith et al., 19867, J. Biol. Chem. 242: 5535–5541; Mertz & Catt, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8525–8529; Pawalek et al., 1976, Invest. Dermatol. 66: 200–209). Diese Eigenschaft von Zellen, welche den αMSH-Rezeptor exprimieren, wurde wie folgt zur Analyse der Expression des αMSH-Rezeptors in Zellkolonien verwendet, welche mit den hierin beschriebenen Expressionsvektoren transfiziert wurden. Es wurden Zellen (~ 1 × 106) in 6-well Platten ausplatziert, einmal mit DMEM mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5 mM IBMX (ein Phosphodiesteraseinhibitor) gewaschen, dann für 45 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen der melanotropen Peptide αMSH, βMSH, γMSH, den MSH-Peptidanaloga NIe4, D-Phe7-αMSH (NDP-MSH) und ACTH inkubiert. Nach der Hormonbehandlung wurden die Zellen zweimal mit Phosphat-gepufferter Saline gewaschen und es wurde das intrazelluläre cAMP durch Lyse der Zellen mit 1 ml 60% Ethanol extrahiert. Es wurden die intrazellulären cAMP-Konzentrationen bestimmt unter Verwendung eines Assays (Amersham), welcher die Fähigkeit des CAMP misst [8-3H]cAMP aus einem cAMP-Bindungsprotein mit hoher Affinität (siehe Gilman, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67: 305–312) zu verdrängen.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 3 gezeigt. Die Abszisse zeigt die Konzentration jedes Hormons und die Ordinate zeigt den Prozentsatz der durch jede Behandlung erreichten basalen intrazellulären cAMP-Konzentration. Die Punkte zeigen den Mittelwert von zwei Inkubationen an; der Standardfehler überstieg für keinen der Datenpunkte 15%. Keines der untersuchten Peptide induzierte irgendeine Veränderung des intrazellulären cAMP in den Zellen, welche nur den Vektor enthielten. Zellen, welche den murinen αMSH-Rezeptor exprimierten, reagierten auf die melanotropen Peptide mit einer 2- bis 3-fachen Erhöhung des intrazellulären cAMP, ähnlich mit Spiegeln von cAMP, welche durch diese Peptide in der Cloudman-Zelllinie induziert wurden (siehe Pawalek, 1985, Yale J. Biol. Med. 58: 571–578). Die EC50-Werte, welche für αMSH, (2,0 × 10–9 M), ACTH (8,0 × 10–9 M) und das suuperpotente MSH-Analogon NDP-MSH (2,8 × 10–11 M) bestimmt wurden, entsprechen eng den beschriebenen Werten (siehe Tatro et al., 1990, Cancer Res. 50: 1237–1242). Wie erwartet, besaß das βMSH-Peptid einen EC50-Wert, dermit αMSH22 vergleichbar war, während γMSH wenig oder keine Aktivität besaß (siehe Slominski et al., 1992, Life Sci. 50: 1103–11081, was die Identität dieses Rezeptors als ein Melanozyten-αMSH-Rezeptor bestätigt.
  • Beispiel 4
  • Isolierung und Charakterisierung eines humanen genomischen αMSHR-Klons
  • Um ein humanes Gegenstück des murinen Melanozyten αMSH-Rezeptorgens zu isolieren, wurde eine humane genomische Bibliothek mit hoher Stringenz (50% Formamid, 42°C) unter Verwendung der wie in Beispiel 1 beschrieben isolierten humanen PCR-Fragmente durchsucht. Es wurden zwei verschiedene Arten von Sequenzen isoliert, welche den zwei PCR-Fragmenten entsprechen, und es wurde gefunden, dass diese für hochverwandte G-Protein gekoppelte Rezeptoren codieren. Diese genomischen Klone wurden wie in Beispiel 2 beschrieben sequenziert. Es wurde bestimmt, dass einer dieser genomischen Klone für einen humanen MSH-Rezeptor codiert (SEQ ID NO: 5). Der humane MSH-Rezeptor besitzt eine vorhergesagte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6), welche zu 75% identisch und kolinear mit der cDNA-Sequenz des Maus-αMSH-Rezeptors (2) ist, dargestellt als humaner MSH-R. Das vorhergesagte Molekulargewicht des humanen MSHR beträgt 34,7 kD.
  • Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen des Maus-αMSHR (SEC ID NO: 4) und des humanen MSHR (SEQ ID NO: 6) werden in 2 verglichen. Diese Sequenzen definieren die Melanocortinrezeptoren als eine neue Unterfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren mit mehreren ungewöhnlichen Merkmalen. Die Melanocortinrezeptoren sind die kleinsten bislang identifizierten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (297-317AS), welche aus einer kurzen Amino-terminalen extrazellulären Domäne, einer kurzen Carkoxy-terminalen intrazellulären Domäne und einer sehr kleinen dritten intrazellulären Schleife resultieren. Den Melanocortinrezeptoren fehlen mehrere Aminosäurereste, welche in den meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vorliegen (siehe Probst et al., 1992, DNA & Cell Biol. 11: 1–20), einschließlich der Prolinreste in der 4. und 5. Transmembrandomäne, welche wahrscheinlich eine Krümmung in der alphahelikalen Struktur der Transmembrandomänen einbringen, und wahrscheinlich in die Bildung der Bindungstasche involviert sind (siehe Applebury & Hargrave, 1986, Vision Res. 26. 1881–1895) und einer oder beide Cysteinreste, welche wahrscheinlich zwischen der ersten und zweiten extrazellulären Schleife eine Disulfidbindung bilden (siehe Dixon et al., 1987, EMBO J. 6: 3269–3275 und Karnik et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 85: 8459–8463). Es ist bemerkenswert, dass die Melanocortinrezeptoren nicht hochverwandt mit den anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu sein scheinen, welche Peptidliganden erkennen, wie etwa die Rezeptoren für Bombesin (siehe Spindel et al., 1990, Mol. Endocrinol. 4: 1956–1963) oder für die Substanz K (siehe Masu et al., 1987, Nature 329: 836–838) sondern eher enger verwandt sind mit dem Rezeptor für Δ9-Tetrahydrocannabinol (siehe Matsuda et al., 1990, Nature, 346: 561–564). Dem Cannabinoidrezeptor fehlt auch das konservierte Prolin in der Transmembran 5 und das Cystein in der ersten extrazellulären Schleife, welches für die Bildung der Disulfidbrücke notwendig ist. Eine "Least Parsimony-Analyse" mit den in 2 gezeigten Rezeptorsequenzen deutet darauf hin, dass die Cannabinoid- und Melanocortinrezeptoren evolutionär verwandt sind und eine Unterfamilie bilden, welche sich von den Peptidrezeptoren und den Aminrezeptoren unterscheidet. Ungeachtet, ob die Ähnlichkeiten das Ergebnis einer evolutionären Konservierung oder Konvergenz sind, können die Sequenzähnlichkeiten und mutmaßlichen Strukturähnlichkeiten zwischen den Melanocortin- und Cannabinoidrezeptoren bei der Suche nach dem endogenen Cannabinoid-ähnlichen Liganden informativ sein.
  • Beispiel 5
  • Gewebeverteilung von αMSH-Rezeptoren
  • Um einen weiteren Einblick in diese Rezeptoren zu erhalten, haben wir die Gewebeverteilung ihrer entsprechenden mRNAs aus verschiedenen Geweben untersucht, mittels Durchführung von Northern-Hybridisierungsexperimenten mit RNA, welche von verschiedenen Geweben isoliert wurde (siehe Maniatis et al., ibid.). Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 4 gezeigt.
  • Eine Reihe von Gewebeproben wurde durch eine Northern-Hybrdisierungsanalyse untersucht, welche unter Bedingungen mit hoher Stringenz durchgeführt wurde. Der gleiche Nitrocellulosefilter wurde nacheinander mit einer humanen MSH-Rezeptorsonde und einer Maus-MSH-Rezeptorsonde hybridisiert, um die Verteilung von jeder Rezeptor-mRNA zu untersuchen. Der murine MSH-Rezeptor wird vorwiegend durch eine einzelne mRNA-Spezies mit 3,9 kb codiert, während der humane MSH-Rezeptor in zwei Melanomproben vorwiegend durch eine Spezies mit 3,0 kb codiert wird. Hohe Spiegel der Rezeptor-mRNA werden sowohl in primären Maus-Melanozyten als auch Maus-Melanomzelllinien beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden extrem niedrige Spiegel der Rezeptor-mRNA in primären humanen Melanozyten und vielen humanen Melanomproben nachgewiesen (siehe Melanom 1, 4). Am interessantesten ist die dramatische Steigerung der MSH-R mRNA, welche bislang in 3 von 11 untersuchten Proben beobachtet wurde, was beispielsweise in der Melanomprobe #2 gesehen wird (4).
  • Außerdem konnten wir keine Expression von einem der hierin beschriebenen Rezeptoren im Gehirn nachweisen, trotz einer umfangreichen Dokumentation von dortigen MSH-Bindungsstellen, ebenso wie in anderen Geweben. Dieses Ergebnis deutet auf die Existenz von alternativen Formen dieser oder verwandter Rezeptoren hin, welche speziell im Gehirngewebe exprimiert werden können.
  • Es sollte verstanden werden, dass die obige Offenbarung einige bestimmte Ausführungsformen der Erfindung betont, und dass alle dazu äquivalenten Modifikationen und Alternativen innerhalb des Geists und des Umfangs der Erfindung liegen, welcher in den nachfolgenden Ansprüchen dargestellt wird.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001

Claims (19)

  1. Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche: a) für einen Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptor mit einer der in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 gezeigten Aminosäuresequenzen codiert; oder b) mit dem komplementären Strang der in SEQ ID NO: 3 oder der in SEQ ID NO: 5 gezeigten Nukleotidsequenz hybridisierbar ist, unter Bedingungen mittlerer Stringenz (40% Formamid, 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M Natriumpyrophosphat, 0,2% Natriumdodecylsulfat, 100 μg Lachssperma-DNA, 10X Denhardt-Lösung), worin die Zellen, welche die Nukleinsäuresequenz exprimieren, auf die melanotropen Peptide α-MSH und β-MSH mit einem Anstieg des intrazellulären cAMP reagieren.
  2. Nukleinsäure nach Anspruch 7, worin die Nukleotidsequenz die in SEQ ID NO: 3 oder in SEQ ID NO: 5 gezeigte Sequenz ist.
  3. Melanozyten-stimulierender Säugetier-Hormonrezeptor mit einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 codiert wird.
  4. Melanozyten-stimulierender Säugetier-Hormonrezeptor nach Anspruch 3, mit einer der in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 gezeigten Aminosäuresequenzen.
  5. Homogene Zusammensetzung eines Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors mit 34,6 Kilodalton oder eines Derivats davon, worin die Aminosäuresequenz des Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptors oder Derivates davon die in SEQ ID NO: 6 gezeigte MSH-R-Sequenz umfasst.
  6. Nukleinsäure-Hybridisierungssonde zum Nachweis der Expression eines Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptors, umfassend die Nukleotidsequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2; wobei die Sonde gegebenenfalls zur Verwendung bei Nachweis und Diagnose einer genetischen Erkrankung eines Menschen angepasst ist, oder zur Verwendung bei Nachweis, Isolierung und Charakterisierung neuer Säugetier-Rezeptorgene angepasst ist.
  7. Rekombinantes Expressionskontrukt, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für einen Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptor nach Anspruch 3 codiert.
  8. Rekombinantes Expressionskontrukt, umfassend die Nukleotidsequenz nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin das Konstrukt den Melanozytenstimulierenden Maus-Hormonrezeptor oder den humanen Melanozytenstimulierenden Hormonrezeptor in einer transformierten eukaryontischen Zellkultur exprimieren kann.
  9. Eukaryontische Zellkultur, transformiert mit dem Expressionskontrukt nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die transformierte eukaryontische Zellkultur den Melanozyten-stimulierenden Maus-Hormonrezeptor oder den humanen Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptor exprimieren kann.
  10. Verfahren zum Screenen einer Verbindung als ein Inhibitor der agonistischen Bindung an einen Melanozyten-stimulierenden Säugetier- Hormonrezeptor, gegebenenfalls der Maus oder des Menschen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Transformieren einer eukaryontischen Zellkultur mit einem Expressionskonstrukt nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, das den Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptor in einer eukaryontischen Zelle exprimieren kann; und (b) Prüfen der Fähigkeit der Verbindung, das Binden eines nachweisbaren Melanozyten-stimulierenden Hormonrezeptor-Agonisten zu hemmen.
  11. Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Verbindung als ein Inhibitor der agonistischen Bindung an einen Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptor, gegebenenfalls der Maus oder des Menschen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Transformieren einer eukaryontischen Zellkultur mit einem Expressionskonstrukt nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, das den Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptor in einer eukaryontischen Zelle exprimieren kann; und (b) Prüfen der Menge einer Verbindung durch Messen des Ausmaßes der Inhibition des Bindens eines nachweisbaren Rezeptoragonisten.
  12. Verfahren nach Anspruch 1 1, worin entweder die zu untersuchende Verbindung in einem Menschen vorliegt, in humanem Blut oder in humanem Liquor vorliegt, oder die Verbindung nicht bekannt ist.
  13. Antikörper, gegebenenfalls monoklonal oder ein Fragment davon, der immunologisch reaktiv ist gegenüber einem Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptor nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, gegebenenfalls der Maus oder des Menschen.
  14. Zelllinie, welche einen Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 13 produziert.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Antikörpers oder eines Fragments davon nach Anspruch 13 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  16. Epitop eines Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptors nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, worin das Epitop immunologisch reaktiv ist gegenüber dem Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 13.
  17. Chimärer Antikörper, der gegenüber einem Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptor nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 immunologisch reaktiv ist.
  18. Verfahren zur Herstellung eines Melanozyten-stimulierenden Säugetier-Hormonrezeptors, gegebenenfalls der Maus oder des Menschen, umfassend Kultivieren einer eukaryontischen Zellkultur, worin die Zellen mit einem Konstrukt nach Anspruch 7 oder Anspruch 8 transformiert wurden.
  19. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend Formulieren einer therapeutisch wirksamen Menge eines Antikörpers oder eines Fragments davon nach Anspruch 13 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
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