-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Cytokine
sind lösliche
Proteine, die das Wachstum und die Differenzierung vieler Zelltypen
beeinflussen. Ihre Rezeptoren bestehen aus einem oder mehreren integralen
Membranproteinen, die das Cytokin mit hoher Affinität binden
und dieses Bindungsereignis an die Zelle über den cytoplasmatischen Anteil
bestimmter Rezeptoruntereinheiten übermitteln. Cytokinrezeptoren
sind in zahlreiche Klassen auf Basis der Ähnlichkeiten ihrer extrazellulären Liganden-Bindungsdomänen eingeteilt
worden. Beispielsweise sind diejenigen Rezeptorketten, die für die Bindung
und/oder Übermittlung
der Wirkung von Interferonen (IFNs) verantwortlich sind, Mitglieder
der Typ-II-Cytokinrezeptorfamilie (CRF2), basierend auf einer charakteristischen
extrazellulären
Domäne
von 200 Resten. Die belegten in vivo-Aktivitäten dieser Interferone veranschaulichen
das enorme klinische Potenzial von und den Bedarf an anderen Cytokinen,
Cytokinagonisten und Cytokinantagonisten.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung erfüllt
diesen Bedarf durch die Bereitstellung neuer Cytokinrezeptoren und verwandter
Zubereitungen und Verfahren. Insbesondere sorgt die vorliegende
Erfindung für
einen extrazellulären
Liganden bindenden Bereich eines Zcytor11-Rezeptors aus Säugern, der
alternativ auch entweder eine Transmembrandomäne oder sowohl eine intrazelluläre Domäne und eine
Transmembrandomäne
enthält.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt bereit ein isoliertes Polynucleotid,
kodierend ein Liganden bindendes Rezeptorpolypeptid. Das Polypeptid
umfasst eine Sequenz von Aminosäuren,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus (a) den Resten 18 bis 228 der SEQ
ID Nr. 2; (b) allelischen Varianten von (a) und (c) Sequenzen, die
zu mindestens 80% identisch zu (a) oder (b) sind. In einer Ausführungsform
umfasst das Polypeptid die Reste 18 bis 228 der SEQ ID Nr. 2. In
einer anderen Ausführungsform
umfasst das von dem isolierten Polynucleotid kodierte Polypeptid
zusätzlich
eine Transmembrandomäne.
Die Transmembrandomäne
kann die Reste 229 bis 251 der SEQ ID Nr. 2 oder eine allelische
Variante derselben umfassen. In einer anderen Ausführungsform
umfasst das von dem isolierten Polynucleotid kodierte Polypeptid
zusätzlich
eine intrazelluläre
Domäne, wie
eine intrazelluläre
Domäne,
umfassend die Reste 252 bis 574 der SEQ ID Nr. 2 oder eine allelische
Variante davon. In weiteren Ausführungsformen
kodiert das Polynucleotid ein Polypeptid, das die Reste 1 bis 574, 1
bis 251, 1 bis 228, 18 bis 251 oder 18 bis 574 der SEQ ID Nr. 2
umfasst. In einer zusätzlichen
Ausführungsform
umfasst das Polypeptid zusätzlich
einen Affinitätsmarker
oder -tag. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich
bei dem Polynucleotid um DNS.
-
In
einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Expressionsvektor bereitgestellt,
umfassend (a) einen Transkriptionspromotor; (b) ein DNS-Segment,
kodierend ein Liganden bindendes Rezeptorpolypeptid, worin das Liganden
bindende Rezeptorpolypeptid eine Sequenz von Aminosäuren umfasst,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus: (i) den Resten 18–228 oder einem beliebigen
der oben beschriebenen Reste der SEQ ID Nr. 2; (ii) allelischen
Varianten von (i) und (iii) Sequenzen, die zu mindestens 80% identisch
zu (i) oder (ii) sind; und (c) einen Transkriptionsterminator, worin
der Promotor, das DNS-Segment und der Terminator operativ miteinander
verbunden sind. Das Liganden bindende Rezeptorpolypeptid kann zusätzlich ein
sekretorisches Peptid, eine Transmembrandomäne, eine Transmembrandomäne und eine
intrazelluläre
Domäne
oder ein sekretorisches Peptid, eine Transmembrandomäne und eine
intrazelluläre
Domäne
umfassen.
-
In
einem anderen Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt eine kultivierte
eukaryotische Zelle, in die ein Expressionsvektor, wie oben offenbart,
eingeführt
wurde, worin die Zelle ein Rezeptorpolypeptid, kodiert von dem DNS-Segment,
exprimiert. In einer Ausführungsform
exprimiert die Zelle zusätzlich
eine notwendige Rezeptoruntereinheit, die einen funktionalen Rezeptorkomplex
bildet. In einer anderen Ausführungsform
hängt die
Zelle für
die Proliferation von einem exogen bereitgestellten hematopoietischen
Wachstumsfaktor ab.
-
In
einem anderen Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein isoliertes
Polypeptid, umfassend ein Segment, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus (a) den Resten 18 bis 228 der SEQ ID Nr. 2, auch offenbart als
SEQ ID Nr. 9, (b) allelischen Varianten von (a); und (c) Sequenzen,
die zu mindestens 80% identisch zu (a) oder (b) sind, worin das
Polypeptid im Wesentlichen frei von üblicherweise mit hematopoietischen
Rezeptoren assoziierten Transmembran- und intrazellulären Domänen ist.
Weitere Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen. In einer
Ausführungsform
umfasst das Polypeptid die Reste 18 bis 228 der SEQ ID Nr. 2. In
einer anderen Ausführungsform
umfasst das Polypeptid zusätzlich
eine Transmembrandomäne.
Die Transmembrandomäne
kann die Reste 229 bis 251 der SEQ ID Nr. 2 umfassen, ebenfalls
offenbart als SEQ ID Nr. 10, oder eine allelische Variante davon.
In einer anderen Ausführungsform
umfasst das Polypeptid zusätzlich eine
intrazelluläre
Domäne
wie eine intrazelluläre
Domäne,
umfassend die Reste 252 bis 574 der SEQ ID Nr. 2, auch offenbart
als SEQ ID Nr. 11, oder eine allelische Variante davon. In weiteren
Ausführungsformen
um fasst das Polypeptid die Reste 1 bis 574, 1 bis 251, 1 bis 228,
18 bis 251 oder 18 bis 574 der SEQ ID Nr. 2.
-
In
einer Ausführungsform
umfasst das Polypeptid zusätzlich
ein Immunoglobin-Fc-Polypeptid.
In einer anderen Ausführungsform
umfasst das Polypeptid zusätzlich
einen Affinitätsmarker
wie ein Polyhistidin, Protein A, eine Glutathion-S-Transferase oder
den konstanten Bereich der schweren Kette eines Immunglobulins.
-
In
einem weiteren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein chimäres Polypeptid,
im Wesentlichen bestehend aus einem ersten Teil und einem zweiten
Teil, verbunden über
eine Peptidbindung. Der erste Teil des chimären Polypeptids besteht im
Wesentlichen aus einer Liganden bindenden Domäne eines Rezeptorpolypeptids,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus (a) einem Rezeptorpolypeptid, wie
in der SEQ ID Nr. 2 gezeigt, (b) allelischen Varianten der SEQ ID
Nr: 2; und (c) Rezeptorpolypeptiden, die zu mindestens 80% identisch
zu (a) oder (b) sind. Der zweite Teil des chimären Polypeptids besteht im
Wesentlichen aus einem Affinitätsmarker.
In einer Ausführungsform
handelt es sich bei dem Affinitätsmarker
um ein Immunglobulin-Fc-Polypeptid. Die Erfindung stellt außerdem bereit
Expressionsvektoren, kodierend das chimäre Polypeptid, und Wirtszellen,
die zur Erzeugung des chimären
Polypeptids transfiziert sind.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
bereit ein isoliertes Polynucleotid, kodierend ein Polypeptid, ausgewählt aus
einer Gruppe, definiert in SEQ ID Nr. 2, bestehend aus den Resten
1 bis 228, den Resten 1 bis 251, den Resten 1 bis 574, den Resten
2 bis 228, den Resten 2 bis 251 und den Resten 2 bis 574. Ebenfalls beansprucht
werden die durch diese Polynucleotide exprimierten isolierten Polypeptide.
-
Die
Erfindung stellt außerdem
bereit ein Verfahren zum Detektieren eines Liganden in einer Testprobe, umfassend
das In-Kontakt-Bringen einer Testprobe mit einem wie oben offenbarten
Polypeptid und das Detektieren der Bindung des Polypeptids an Liganden
in der Probe. In einer Ausführungsform
umfasst das Polypeptid zusätzlich
Transmembran- und intrazelluläre
Domänen.
Das Polypeptid kann in einer kultivierten Zelle membrangebunden
sein, worin der Detektionsschritt das Messen einer biologischen
Antwort in der kultivierten Zelle umfasst. In einer anderen Ausführungsform
ist das Polypeptid auf einem festen Träger immobilisiert.
-
In
einem zusätzlichen
Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Antikörper, der
spezifisch an ein wie oben offenbartes Polypeptid bindet, wie auch
ein anti-idiotypischer Antikörper,
der an den Antigen bindenden Bereich eines Antikörpers gegen Zcytor11 bindet.
-
In
noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden Polynucleotidprimer
und -sonden bereitgestellt, die Mutationen im Zcytor11-Gen detektieren
können.
Diese Polynucleotidsonde sollte mindestens 20–25 Basen, vorzugsweise mindestens
50 Basen und am meisten bevorzugt etwa 80 bis 100 Basen lang sein.
Zusätzlich
zur Detektion von Mutationen können
diese Sonden genutzt werden, um das Zcytor11-Gen in anderen Säugerspezies
zu entdecken. Die Sonden können
entweder positive Stränge
oder antisens-Stränge
sein und sie können
aus DNS oder RNS bestehen.
-
Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptid oder Polypeptid,
das die Aminosäuresequenz
eines epitop-tragenden Teils eines Zcytor11-Polypeptids mit einer
wie oben beschriebenen Aminosäuresequenz
aufweist. Peptide oder Polypeptide mit der Aminosäuresequenz
eines epitop-tragenden Teils eines Zcytor11-Polypeptids der vorliegenden
Erfindung umfassen Anteile eines solchen Polypeptids mit mindestens
9, vorzugsweise mindesten 15 und stärker bevorzugt mindestens 30
bis 50 Aminosäuren,
obwohl epitoptragende Polypeptide jeder Länge bis zu und umfassend die
gesamte Aminosäuresequenz
eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben,
ebenfalls in der vorliegenden Erfindung umfasst sind. Beispiele
dieser Polypeptide sind durch die Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nrn.
7 und 8 definiert. Ebenfalls beansprucht sind beliebige dieser Polypeptide,
die an andere Polypeptide oder Trägermoleküle fusioniert sind.
-
Weitere
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung umfassen isolierte Nukleinsäuremoleküle, die ein
Polynucleotid mit einer Nucleotidsequenz mindestens zu 90% identisch
und stärker
bevorzugt 95%, 97%, 98% oder 99% identisch zu einer der oben beschriebenen
Nucleotidsequenzen enthalten, oder ein Polynucleotid, das unter
Stringenzhybridisierungsbedingungen an ein Polynucleotid mit einer
oben beschriebenen Nucleotidsequenz hybridisiert. Eine zusätzliche
Nukleinsäureausführungsform
der vorliegenden Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend
eine Aminosäure
eines epitop-tragenden Teils eines Zcytor11-Polypeptids.
-
Diese
und andere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die
folgende detaillierte Beschreibung und die angefügte Zeichnung ersichtlich.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Der
Ausdruck "allelische
Variante" wird hierin
verwendet, um eine von zwei oder mehr alternativen Formen eines
Gens zu bezeichnen, die denselben Chromosomenlokus besetzen. Allelische
Variation entsteht in natürlicher
Weise durch Mutation und kann zu phenotypischem Polymorphismus innerhalb
von Populationen führen.
Genmutationen können
still sein (keine Änderung
im kodierten Polypeptid) oder können
Polypeptide mit geänderter
Aminosäuresequenz
kodieren. Der Ausdruck allelische Variante wird hierin außerdem benutzt, um
ein Protein zu bezeichnen, das von einer allelischen Variante eines
Gens kodiert ist.
-
Der
Ausdruck "Expressionsvektor" wird hierin verwendet,
um ein lineares oder zirkuläres
DNS-Molekül zu
bezeichnen, das ein Segment umfasst, das ein interessierendes Polypeptid
kodiert, operativ verbunden mit weiteren Segmenten, die für seine
Transkription sorgen. Solche weiteren Segmente schließen Promotor-
und Terminatorsequenzen ein und können auch einen oder mehrere
Replikationsursprünge,
einen oder mehrere selektierbare Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylierungssignal
usw. umfassen. Expressionsvektoren leiten sich im Allgemeinen von
Plasmid- oder viraler DNS ab oder können Elemente von beiden enthalten.
-
Der
Ausdruck "isoliert", wenn er auf ein
Polynucleotid angewandt wird, bezeichnet, dass das Polynucleotid
aus seiner natürlichen
genetischen Umgebung entnommen wurde und somit frei von anderen
externen oder nicht gewünschten
kodierenden Sequenzen ist und in einer Form vorliegt, die für die Verwendung
in einem gentechnisch konstruierten Proteinerzeugungssystem geeignet
ist.
-
"Operativ verbunden" zeigt an, dass dann,
wenn auf DNS-Segmente Bezug genommen wird, diese Segmente so angeordnet
sind, dass sie hinsichtlich ihres intendierten Zweckes zusammenwirken,
beispielsweise die Transkription beginnt im Promotor und verläuft über das
kodierende Segment zum Terminator.
-
Ein "Polynucleotid" ist ein einzel-
oder doppelsträngiges
Polymer von Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidbasen, abgelesen
vom 5'- zum 3'-Ende. Polynucleotide
umfassen RNS und DNS und können
aus natürlichen
Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder aus einer Kombination
aus natürlichen
und synthetischen Molekülen
hergestellt sein.
-
Der
Ausdruck "Promotor" wird hierin in seiner
allgemein bekannten Bedeutung verwendet, um einen Teil eines Gens
zu bezeichnen, enthaltend DNS-Sequenzen, die für die Bindung der RNS-Polymerase
und die Initiation der Transkription sorgen. Promotorsequenzen befinden
sich üblicherweise,
jedoch nicht immer, in den 5' nicht
kodierenden Bereichen der Gene.
-
Der
Ausdruck "Rezeptor" wird hierin verwendet,
um ein zellassoziiertes Protein oder eine Polypeptiduntereinheit
eines solchen Proteins zu bezeichnen, das bzw. die an ein bioaktives
Molekül
(den "Liganden") bindet und die
Wirkung des Liganden auf die Zelle vermittelt. Die Bindung des Liganden
an den Rezeptor führt zu
einer Konformationsänderung
im Rezeptor (und in einigen Fällen
zur Rezeptormultimerisierung, das heißt zur Assoziation identischer
oder unterschiedlicher Rezeptoruntereinheiten), die Wechselwirkungen
zwischen der oder den Effektordomäne(n) und anderen Molekülen) in
der Zelle verursacht. Diese Wechselwirkungen führen wiederum zu Änderungen
des Metabolismus der Zelle. Metabolische Ereignisse, die mit Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen
verbunden sind, schließen
die Gentranskription, die Phosphorylierung, die Dephosphorylierung,
die Zellproliferation, einen Anstieg der Produktion von cyclischem
AMP, die Mobilisierung von zellulärem Calcium, die Mobilisierung
von Membranlipiden, die Zelladhäsion,
die Hydrolyse von Inositollipiden und die Hydrolyse von Phospholipiden
ein. Der Ausdruck "Rezeptorpolypeptid" wird verwendet,
um vollständige
Rezeptorpolypeptidketten und Teile davon zu bezeichnen, einschlossen
isolierte funktionale Domänen
(beispielsweise Liganden bindende Domänen).
-
Eine "sekretorische Signalsequenz" ist eine DNS-Sequenz,
die an Polypeptid kodiert (ein "sekretorisches
Peptid"), das als
eine Komponente eines größeren Polypeptids
das größere Polypeptid
durch einen sekretorischen Stoffwechselweg einer Zelle, in der es
synthetisiert wird, dirigiert. Das größere Polypeptid wird üblicherweise
abgespalten, um das sekretorische Peptid während des Durchtritts durch
den sekretorischen Stoffwechselweg zu entfernen.
-
Ein "löslicher Rezeptor" ist ein Rezeptorpolypeptid,
das nicht an eine Zellmembran gebunden ist. Lösliche Rezeptoren sind meist
Liganden bindende Rezeptorpolypeptide, denen Transmembran- und cytoplasmatische
Domänen
fehlen. Lösliche
Rezeptoren können
zusätzliche
Aminosäurereste
umfassen, wie Affinitätsmarker
oder -tags, die für
die Reinigung des Polypeptids sorgen oder Stellen für die Anheftung
des Polypeptids an ein Substrat bereitstellen, oder Sequenzen eines
konstanten Bereichs eines Immunglobulins. Viele Zelloberflächenrezeptoren
besitzen natürlich
auftretende, lösliche
Gegenstücke,
die durch Proteolyse erzeugt werden oder über alternativ gespleiste mRNSs
translatiert werden. Man sagt, dass Rezeptorpolypeptide im Wesentlichen
frei von Transmembran- und intrazellulären Polypeptidsegmenten sind,
wenn ihnen ausreichende Anteile dieser Segmente fehlen, um eine
Membranverankerung bzw. Signaltransduktion bereitzustellen.
-
Die
Analyse der Gewebsverteilung der mRNS, entsprechend dieser neuen
DNS, zeigte, dass der mRNS-Level in der Bauchspeicheldrüse (Pankreas)
am höchsten
war, gefolgt von viel geringeren Leveln in Thymus, Dickdarm und
Dünndarm.
Der Rezeptor wurde bezeichnet als "Zcytor11".
-
Cytokinrezeptoruntereinheiten
sind gekennzeichnet durch eine Multidomänenstruktur, umfassend eine
Liganden bindende Domäne
und eine Effektordomäne,
die typischerweise in die Signaltransduktion involviert ist. Multimere
Cytokinrezeptoren umfassen Homodimere (beispielsweise die PDGF-Rezeptorisoformen αα und ββ, den Erythropoietinrezeptor,
MPL (den Thrombopoietinrezeptor und den G-CSF-Rezeptor), Heterodimere,
deren Untereinheiten Liganden bindende und Effektordomänen haben
(beispielsweise die PDGF-Rezeptorisoform αβ) und Multimere mit Komponentenuntereinheiten
mit disperaten Funktionen (beispielsweise die IL-2-, IL-3-, IL-4-,
IL-5-, IL-6-, IL-7- und GM-CSF-Rezeptoren). Einige Rezeptoruntereinheiten
sind einer Vielzahl von Rezeptoren gemeinsam. Beispielsweise ist
die AIC2B- Untereinheit,
die selbst keinen Liganden binden kann, jedoch eine intrazelluläre Signaltransduktionsdomäne umfasst,
eine Komponente der IL-3- und GM-CSF-Rezeptoren. Viele Cytokinrezeptoren
lassen sich in eine von vier verwandten Familien auf Basis ihrer Strukturen
und Funktionen einordnen. Die Klasse I hematopoietischen Rezeptoren
sind beispielsweise gekennzeichnet durch die Anwesenheit einer Domäne, enthaltend
konservierte Cysteinreste und das Motiv WSXWS. Weitere Domänen, eingeschlossen
Proteinkinasedomänen,
Fibronectin-Typ-III-Domänen und
Immunglobulindomänen,
die durch Disulfid verbrückte
Loops gekennzeichnet sind, finden sich in bestimmen hematopoietischen
Rezeptoren. Die Cytokinrezeptorstruktur ist von Urdal, Ann. Reports
Med. Chem., 26: 221–228 (1991),
und Cosman, Cytokin, 5: 95–106
(1993), im Überblick
dargestellt worden. Es wird allgemein angenommen, dass, damit Organismen
unter Selektionsdruck neue biologische Funktionen gewinnen, neue
Rezeptorfamilienmitglieder aus der Verdoppelung existierender Rezeptorgene
entstanden sind, was zur Existenz von Multigenfamilien geführt hat.
Familienmitglieder enthalten somit Reste des Vorläufergens
und diese charakteristischen Eigenschaften können bei der Isolierung und
Identifizierung weiterer Familiemitglieder genutzt werden.
-
Zelloberflächen-Cytokinrezeptoren
sind weiter durch die Anwesenheit zusätzlicher Domänen gekennzeichnet.
Diese Rezeptoren sind in der Zellmembran über eine Transmembrandomäne verankert,
die durch eine Sequenz hydrophober Aminosäurereste gekennzeichnet ist
(typischerweise etwa 21 bis 25 Reste), die üblicherweise durch positiv
geladene Reste (Lys oder Arg) flankiert wird. Am gegenüber liegenden
Ende des Proteins, gesehen von der extrazellulären Domäne aus und von dieser durch
die Transmembrandomäne
getrennt, befindet sich eine intrazelluläre Domäne.
-
Der
neue Rezeptor der vorliegenden Erfindung Zcytor11 ist ein Klasse-II-Cytokinrezeptor.
Diese Rezeptoren binden üblicherweise
an Cytokine mit vier Helixbündeln.
Interleukin-10 und die Interferone haben Rezeptoren in dieser Klasse
(beispielsweise Interferon-Gamma-Alpha- und Betaketten und die Interferon-Alpha/Beta-Rezeptor-Alpha-
und Betaketten). Die Klasse-II-Cytokinrezeptoren sind durch die
Anwesenheit von einem oder mehreren Cytokinrezeptormodulen (CRM
= Cytokine Receptor Modules) in ihrer extrazellulären Domäne gekennzeichnet.
Die CRMs der Klasse-II-Cytokinrezeptoren unterscheiden sich etwas
von den besser bekannten CRMs der Klasse-I-Cytokinrezeptoren. Während die
Klasse-II-CRMs zwei Typ-III fibronectin-ähnliche Domänen enthalten, unterscheiden
sie sich in ihrer Organisation.
-
Zcytor11
hat wie alle bekannten Klasse-II-Rezeptoren, ausgenommen die Interferon-Alpha/Beta-Rezeptor-Alpha-Kette,
nur ein Klasse-II-CRM in seiner extrazellulären Domäne.
-
Zcytor11
scheint ein Rezeptor für
ein helikales Cytokin der Interferon/IL-10-Klasse zu sein. Unter
Verwendung des Zcytor11-Rezeptors können wir Liganden und weitere
Verbindungen identifizieren, die von signifikantem therapeutischen
Wert wären.
-
Wie
oben angegeben, ist Zcytor11 der Interferon-α-Rezeptor-α-Kette ähnlich. Uze et al., Cell 60, 255–264 (1996),
Analysis of a Human cDNA Clone Encoding Zcytor11 (SEQ ID Nr. 1),
zeigten einen offenen Leserahmen, kodierend 574 Aminosäuren (SEQ
ID Nr. 2), umfassend eine extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von etwa
211 Aminosäureresten
(die Reste 18–228
der SEQ ID Nr. 2), eine Transmembrandomäne von etwa 23 Aminosäureresten
(die Reste 229–251
der SEQ ID Nr. 2) und eine intrazelluläre Domäne von in etwa 313 Aminosäureresten
(die Reste 252–574
der SEQ ID Nr. 2). Fachleute werden erkennen, dass diese Domänengrenzen
Schätzwerte
sind und auf Ausrichtungen an bekannten Proteinen und Vorhersagen
der Proteinfaltung beruhen. Eine Deletion von Resten aus den Enden
der Domänen
sind möglich.
-
In
den bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung werden das isolierte Polynucleotide an Bereiche ähnlicher
Größe der SEQ
ID Nr. 1 oder einer dazu komplementären Sequenz unter Stringenzbedingungen hybridisieren.
Im Allgemeinen werden Stringenzbedingungen so gewählt, dass
sie etwa 5°C
niedriger als der thermische Schmelzpunkt (Tm)
für die
spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und
definiertem pH sind. Die Tm ist diejenige
Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei der 50% der
Zielsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisiert. Typische
Stringenzbedingungen sind diejenigen, in denen die Salzkonzentration
so bemessen ist, dass die Salzkonzentration bis zu etwa 0,03 M bei
pH 7 beträgt,
und die Temperatur beträgt
mindestens etwa 60°C.
Wie zuvor angemerkt, umfassen die isolierten Polynucleotide der vorliegenden
Erfindung DNS und RNS. Verfahren zur Isolierung von DNS und RNS
sind im Stand der Technik wohl bekannt. Es ist im Allgemeinen bevorzugt,
RNS aus Pankreas oder Prostatagewebe zu isolieren, obwohl cDNS auch
unter Anwendung von RNS aus anderen Geweben hergestellt oder als
genomische DNS isoliert werden kann. Gesamt-RNS kann unter Anwendung
der Guanidin/HCl-Extraktion, gefolgt von Isolation mittels Zentrifugation
in einem CsCl-Gradienten hergestellt werden [Chirgwin et al., Biochemistry,
18: 52–94
(1979)]. Eine Poly(A)+-RNS wird aus Gesamt-RNS
unter Anwendung des Verfahrens von Aviv und Leder hergestellt, Proc.,
Natl. Acad. Sci. USA, 69: 1408–1412
(1972). Eine komplementäre
DNS (cDNS) wird aus Poly(A)+-RNS unter Anwendung
bekannter Verfahren hergestellt. Zcytor11-Polypeptide kodierende
Polynucleotide werden anschließend
mittels beispielsweise Hybridisierung oder PCR identifiziert und
isoliert.
-
Fachleute
werden erkennen, dass die in den SEQ ID Nrn. 1 und 2 offenbarten
Sequenzen einzelne Allele des menschlichen Zcytor11-Rezeptors darstellen.
Allelische Varianten dieser Sequenzen lassen sich durch Sondieren
von cDNS oder genomischen Datenbanken aus verschiedenen Individuen
gemäß Standardverfahren
klonieren.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin bereit entsprechenden Rezeptoren
und Polynucleotide aus anderen Spezies ("Speziesorthologe"). Von besonderem Interesse sind Zcytor11-Rezeptoren aus anderen Säugerspezies,
eingeschlossen Maus, Schwein, Schaf, Rind, Hund, Katze, Pferd und
nicht-menschliche Primaten. Speziesorthologe des menschlichen Zcytor11-Rezeptors lassen
sich unter Anwendung der Information und Zusammensetzungen, die
durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, in Kombination
mit herkömmlichen
Klonierungstechniken klonieren. Beispielsweise kann eine cDNS unter
Anwendung von mRNS, erhalten aus einem Gewebe oder einem Zelltyp,
das bzw. der den Rezeptor exprimiert, kloniert werden. Geeignete
Quellen von mRNS lassen sich durch Sondieren von Northern Blots
mit Sonden identifizieren, die aus den hierin offenbarten Sequenzen
designed werden. Eine Datenbank wird anschließend aus mRNS eines positiven
Gewebes oder einer positiven Zelllinie hergestellt. Die den Rezeptor
kodierende cDNS kann anschließend über eine
Vielzahl von Verfahren wie das Sondieren mit einer vollständigen oder
partiellen cDNS menschlicher oder anderer Primaten oder mit einem
oder mehreren Sätzen
an degenerierten Sonden, basierend auf den offenbarten Sequenzen,
isoliert werden. Eine cDNS kann auch unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion
oder PCR kloniert werden (Mullis, US-Patent Nr. 4,683,202), und
zwar unter Anwendung von Primern, die aus den hierin offenbarten
Sequenzen designed wurden. In einem weiteren Verfahren kann die cDNS-Datenbank
benutzt werden, um Wirtszellen zu transformieren oder zu transfizieren,
und die Expression der interessierenden cDNS kann mit einem Antikörper gegen
den Rezeptor detektiert werden. Ähnliche
Techniken lassen sich auch auf die Isolierung genomischer Klone
anwenden.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
bereit isolierte Rezeptorpolypeptide, die im Wesentlichen homolog
zum Rezeptorpolypeptid der SEQ ID Nr. 2 sind. Mit "isoliert" ist ein Protein
oder Polypeptid gemeint, das sich in einem anderen Zustand als seiner
nativen Umgebung findet, wie getrennt von Blut und tierischem Gewebe.
In einer bevorzugten Form ist das isolierte Polypeptid im Wesentlichen
frei von anderen Polypeptiden, insbesondere anderen Polypeptiden
tierischen Ursprungs. Es ist bevorzugt, dass Polypeptid in hoch
gereinigter Form, das heißt
größer als
95% rein, stärker
bevorzugt größer als
99% rein, bereitzustellen. Der Ausdruck "im Wesentlichen homolog" wird hierin genutzt,
um Polypeptide mit 50%, vorzugsweise 60%, stärker bevorzugt mindestens 80%
Sequenzidentität
zu den in der SEQ ID Nr. 2 gezeigten Sequenzen zu bezeichnen. Solche
Polypeptide werden stärker
bevorzugt mindestens 90% identisch und am meisten bevorzugt 95%
oder darüber
identisch zur SEQ ID Nr. 2 sein. Die prozentuale Sequenzidentität wird mittels
herkömmlicher
Verfahren bestimmt (Siehe beispielsweise Altschul et al., Bull.
Math. Bio., 48: 603–616
(1986), und Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
10915–10919
(1992)). Kurz gesagt, werden zwei Aminosäuresequenzen so ausgerichtet,
dass die Ausrichtungstreffer optimiert werden, und zwar unter Anwendung
einer Lückenöffnungsstrafe
von 10, ein Lückenverlängerungsstrafe
von 1 und der "Blüte 62" Treffermatrix von
Henikoff und Henikoff (id.), wie in Tabelle 1 gezeigt (die Aminosäuren werden
mit Hilfe des Standard-Einbuchstaben-Kodes bezeichnet). Die prozentuale
Identität
wird dann berechnet wie folgt:
-
-
-
Die
Sequenzidentität
von Polynucleotidmolekülen
wird über ähnliche
Verfahren unter Anwendung eines Verhältnisses, wie oben offenbart,
bestimmt.
-
Im
Wesentlichen homologe Proteine und Polypeptide sind dadurch gekennzeichnet,
dass sie eine oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen
oder -Additionen aufweisen. Diese Änderungen sind vorzugsweise
von kleiner Natur, das heißt
konservative Aminosäure-Substitutionen (siehe
Tabelle 2) und andere Substitutionen, die die Faltung oder Aktivität des Proteins
oder Polypeptids nicht signifikant beeinflussen, kleine Delektionen,
typischerweise eine bis etwa 30 Aminosäuren, und kleine amino- oder
carboxy-terminale Verlängerungen
wie ein amino-terminaler Methioninrest, ein kleines Linkerpeptid
von bis zu etwa 20–25
Resten oder eine kleine Verlängerung,
die die Reinigung erleichtert (ein Affinitätstag) wie ein Poly histidinrest,
Protein A [Nilsson et al., EMBO J., 4: 1075 (1985); Nilsson et al.,
Methods Enzymol., 198: 3 (1991)), die Glutathion-S-Transferase [Smith
und Johnson, Gene, 67: 31, (1988)] oder andere antigenische Epitope
oder Bindungsdomänen.
Siehe im allgemeinen Ford et al., Protein Expression and Purification,
2: 95–107
(1991). DNS, kodierend Affinitätsmarker,
ist von kommerziellen Anbietern verfügbar (beispielsweise Pharmacia
Biotech, Piscataway, NJ).
-
-
Die
essenziellen Aminosäuren
in den Rezeptorpolypeptiden der vorliegenden Erfindung lassen sich gemäß bekannter
Verfahren identifizieren, wie der artspezifischen Mutagenese oder
der Alanin-Scan-Mutagenese [Cunningham und Wells, Science, 244,
1081–1085
(1989); Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4498–4502 (1991)].
In der letzteren Technik werden einzelne Alanin-Mutationen an jedem
Rest im Molekül
eingeführt
und werden die resultierenden mutierten Moleküle auf biologische Aktivität getestet
(beispielsweise Ligandenbindung und Signaltransduktion), um Aminosäurereste
zu identifizieren, die für
die Aktivität
des Moleküls kritisch
sind. Stellen der Ligand/Rezeptor-Wechselwirkung lassen sich ebenfalls
mittels Analyse der Kristallstruktur bestimmen, wie sie über solche
Verfahren wie die Kernmagnetresonanz, die Kristallographie oder die
Fotoaffinitätsmarkierung
bestimmt wird (Siehe beispielsweise de Vos et al., Science, 255:
306–312
(1992)); Smith et al., J. Mol. Biol., 224: 899–904 (1992); Wlodaver et al.,
FEBS Lett., 309: 59–64
(1992)). Die Identitäten essenzieller
Aminosäuren
lassen sich auch aus Analysen von Homologien mit verwandten Rezeptoren
ableiten.
-
Multiple
Aminosäuresubstitutionen
können
unter Anwendung bekannter Mutageneseverfahren und Sichtungsmethoden
hergestellt und getestet werden, wie denjenigen, die von Reidhaar-Olson
und Sauer, Science, 241: 53–57
(1988), oder Bowie und Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2152–2156 (1989),
offenbart wurden. Kurz gesagt, offenbaren diese Autoren Verfahren
für die
gleichzeitige statistische Änderung
von zwei oder mehr Positionen in einem Polypeptid, zum Selektieren
funktionaler Polypeptide und anschließendes Sequenzieren der mutierten
Polypeptide, um das Spektrum von möglichen und gestattbaren Substitutionen
in jeder Position zu ermitteln. Andere Verfahren, die verwendet
werden können,
schließen
die Phagendarstellung (Phargendisplay) [beispielsweise Lowman et
al., Biochem., 30: 10832–10837
(1991); Ladner et al., US-Patent Nr. 5,223,409; Huse, WIPO-Veröffentlichung
WO 92/06204] und die bereichsgerichtete Mutagenese [Derbyshire et
al., Gene, 46: 145 (1986); Ner et al., DNA, 7: 127 (1988)] ein.
-
Die
oben offenbarte Mutagenesemethoden können mit Sichtungsmethoden
hohen Durchsatzes kombiniert werden, um die Aktivität von klonierten,
mutierten Rezeptoren in Wirtszellen zu detektieren. Bevorzugte Tests
in dieser Hinsicht umfassen Zellproliferationstests und auf Biosensoren
beruhende Ligandenbindungstests, die unten beschrieben sind. Mutierte
DNS-Moleküle, die
aktive Rezeptoren oder Teile derselben kodieren (beispielsweise
Ligandenbindungsfragmente), lassen sich aus den Wirtszellen gewinnen
und mit Hilfe moderner Ausstattungen schnell sequenzieren. Diese
Methoden gestatten die schnelle Bestimmung der Bedeutung einzelner
Aminosäurereste
in einem Polypeptid von Interesse und können auf Polypeptide unbekannter Struktur
angewandt werden.
-
Unter
Anwendung der oben diskutierten Verfahren kann ein Fachmann eine
Vielzahl von Polypeptiden herstellen, die zu den Resten 18 bis 228
der SEQ ID Nr. 2 oder allelischen Varianten derselben im Wesentlichen
homolog sind, und die die Ligandenbindungseigenschaften des Wildtyp-Rezeptors
beibehalten. Solche Polypeptide können zusätzliche Aminosäuren aus
einer extrazellulären
Ligandenbindungsdomäne
eines Zcytor11-Rezeptors wie auch Teile oder das Gesamte der Transmembran-
und intrazellulärer
Domänen
enthalten. Solche Polypeptide können
auch zusätzliche
Polypeptidsegmente umfassen, wie sie oben allgemein offenbart sind.
-
Die
Rezeptorpolypeptide der vorliegenden Erfindung, eingeschlossen Rezeptoren
voller Länge,
Rezeptorfragmente (beispielsweise Liganden bindende Fragmente) und
Fusionspolypeptide lassen sich in gentechnisch hergestellten Wirtszellen
gemäß herkömmlicher
Techniken erzeugen. Geeignete Wirtszellen sind diejenigen Zelltypen,
die mit exogener DNS transformiert oder transfiziert und in Kultur
gezogen werden können,
und schließen
Bakterien, Pilzzellen und kultivierte, höhere eukaryotische Zellen ein.
Eukaryotische Zellen, insbesondere kultivierte Zellen mehrzelliger
Organismen, sind bevorzugt. Techniken für die Manipulation klonierter
DNS-Moleküle
und die Einführung
exogener DNS in eine Vielzahl von Wirtszellen sind offenbart von Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), und
von Ausubel et al., ibid.; die durch Bezugnahme hierin aufgenommen
sind.
-
Im
Allgemeinen ist eine ein Zcytor11-Rezeptorpolypeptid kodierende
DNS-Sequenz in einem Expressionsvektor operativ mit anderen genetischen
Elementen verbunden, die für
seine Expression erforderlich sind, allgemein umfassend einen Transkriptionspromotor
und Terminator. Der Vektor wird auch allgemein einen oder mehrere
selektierbare Marker und einen oder mehrere Replikationsursprünge enthalten,
obwohl der Fachmann erkennen wird, dass in bestimmten Systemen selektierbare
Marker auf separaten Vektoren bereitgestellt werden können und
dass die Replikation der exogenen DNS durch die Integration in das
Wirtszellgenom sichergestellt werden kann. Die Selektion bzw. Wahl
von Promotoren, Terminatoren, selektierbaren Markern, Vektoren und
anderen Elementen ist Gegenstand des Routinedesigns im Können des
Fachmanns. Viele solche Elemente sind in der Literatur beschrieben
und von kommerziellen Anbietern erhältlich.
-
Um
ein Zcytor11-Rezeptorpolypeptid in den sekretorischen Stoffwechselweg
einer Wirtszelle zu dirigieren, wird eine sekretorische Signalsequenz
(auch bekannt als Leadersequenz, Prepro-Sequenz oder Pre-Sequenz)
im Expressionsvektor bereitgestellt. Die sekretorische Signalsequenz
kann diejenige des Rezeptors sein, kann von einem anderen sekretierten
Protein abgeleitet sein (beispielsweise t-PA) oder de novo synthetisiert
sein. Die sekretorische Signalsequenz wird im richtigen Leserahmen
an die Zcytor11-DNS-Sequenz gebunden. Sekretorische Signalsequenzen
befinden sich üblicherweise
5' zur DNS-Sequenz,
die das interessierende Polypeptid kodiert, obwohl bestimmte Signalsequenzen
an anderer Stelle in der interessierenden DNS-Sequenz positioniert
sein können
(siehe beispielsweise Welch et al., US-Patent Nr. 5,037,743; Holland
et al., US-Patent Nr. 5,143,830).
-
Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Peptid oder Polypeptid bereit,
umfassend einen epitop-tragenden Teil eines Polypeptids der Erfindung.
Das Epitop dieses Polypeptidteils ist ein immunogenes oder antigenes
Epitop eines Polypeptids der Erfindung. Ein Bereich eines Proteins,
an den ein Antikörper
binden kann, wird als ein "antigenes
Epitop" definiert
(siehe beispielsweise H. M. Geysen et al., Proc., Natl. Acad. Sci.
USA, 81: 3998–4002
(1984)).
-
Hinsichtlich
der Selektion von Peptiden oder Polypeptiden, die ein antigenes
Epitop tragen (das heißt, die
einen Bereich eines Proteinmoleküls
enthalten, an den ein Antikörper
binden kann), ist im Stand der Technik wohl bekannt, dass relativ
kurze synthetische Peptide, die einen Teil einer Proteinsequenz
nachahmen, routinemäßig zur
Auslösung
eines Antiserums in der Lage sind, das mit dem teilweise nachgeahmten
Protein reagiert. Siehe J. G. Sutcliffe et al., Science, 219: 660–666 (1983).
Peptide, die zur Auslösung
protein-reaktiver Sera befähigt
sind, werden häufig
in der Primärsequenz
eines Proteins dargestellt, lassen sich durch einen Satz einfacher
chemischer Regeln charakterisieren und sind weder auf immundominante
Bereiche intakter Proteine (das heißt immunogene Epitope) noch
auf die Amino- oder Carboxyenden beschränkt. Peptide, die extrem hydrophob
sind, sowie diejenigen von sechs oder weniger Resten sind im Allgemeinen
bei der Induktion von Antikörpern,
die an das nachgeahmte Protein binden, ineffektiv; längere lösliche Peptide,
insbesondere diejenigen, die Prolinreste enthalten, sind üblicherweise
wirksam.
-
Antigene,
epitop-tragende Peptide und Polypeptide der Erfindung sind daher
zur Erzeugung von Antikörpern,
einschließlich
monoklonaler Antikörper,
nützlich,
die spezifisch an ein Polypeptid der Erfindung binden. Antigene,
epitop-tragende Peptide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung
enthalten eine Sequenz von mindestens 9, vorzugsweise zwischen 15
bis etwa 30 Aminosäuren,
die in der Aminosäuresequenz
eines Polypeptids der Erfindung enthalten sind. Peptide und Polypeptide,
umfassend einen größeren Anteil
einer Aminosäuresequenz
der Erfindung, enthaltend von 30 bis 50 Aminosäuren oder jede Länge bis
zu und eingeschlossen die gesamte Aminosäuresequenz eines Polypeptids
der Erfindung, sind ebenfalls zum Induzieren von Antikörpern, die
mit dem Protein reagieren, nützlich.
Vorzugsweise wird die Aminosäuresequenz
des epitop-tragenden Peptids gewählt,
um wesentliche Löslichkeit
in wässrigen
Lösungsmitteln
bereitzustellen (das heißt
die Sequenz umfasst relativ hydrophile Reste und hydrophobe Reste
werden vorzugsweise vermieden); und Sequenzen, die Prolinreste enthalten,
sind besonders bevorzugt. Alle in der Sequenzliste gezeigten Polypeptide
enthalten antigene Epitope, die gemäß der vorliegenden Erfindung
genutzt werden können;
spezifisch designte, antigene Epitope schließen jedoch die Peptide ein,
die von den SEQ ID Nrn. 7 und 8 definiert sind.
-
Kultivierte
Säugerzellen
sind bevorzugte Werte innerhalb der vorliegenden Erfindung. Verfahren
zur Einführung
exogener DNS in Säuerwirtszellen
schließen
die calciumphosphatvermittelte Transfektion [Wigler et al, Cell,
14: 725 (1978); Corsaro und Pearson, Somatic Cell Genetics, 7: 603
(1981); Graham und Van der Eb, Virology, 52: 456 (1973)], die Elektroporation
[Neumann et al, EMBO J., 1: 841–845
(1982)], die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion [Ausubel et al.,
Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons,
Inc., NY, 1987)] und die liposomen-vermittelte Transfektion [Hawley-Nelson
et al., Focus, 15: 73 (1993); Ciccarone et al., Focus, 15: 80 (1993)]
ein, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Die Erzeugung
rekombinanter Polypeptide in kultivierten Säugerzellen ist beispielsweise
offenbart von Levinson et al., US-Patent Nr. 4,713,339; Hagen et
al., US-Patent Nr. 4,784,950; Palmiter et al., US-Patent Nr. 4,579,821; und
Ringold, US-Patent Nr. 4,656,134. Geeignete kultivierte Säugerzellen
schließen
ein die Zelllinien COS-1 (ATCC Nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC Nr. CRL
1651), BHK (ATCC Nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC Nr. CRL 10314), 293
(ATCC Nr. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59–72 1977)
und Ovarzellen des chinesischen Hamsters (beispielsweise CHO-K1;
ATCC Nr. CCL 61). Weitere geeignete Zelllinien sind im Stand der Technik
bekannt und von öffentlichen
Hinterlegungsstellen wie der American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland, erhältlich.
Im Allgemeinen sind starke Transkriptionspromotoren bevorzugt wie
die Promotoren von SV-40 oder vom Cytomegalovirus. Siehe beispielsweise
US-Patent Nr. 4,956,288. Andere geeignete Promotoren schließen diejenigen
der Metallothioneingene (US-Patente Nrn. 4,579,821 und 4,601,978)
wie auch den hauptsächlich
späten
Promotor des Adenovirus (adenovirus major late promoter) ein.
-
Die
Wirkstoffselektion wird allgemein angewandt, um auf kultivierte
Säugerzellen
zu selektieren, in die Fremd-DNS insertiert wurde. Solche Zellen
werden üblicherweise
als "Transfektanten" bezeichnet. Zellen,
die in Anwesenheit des Selektionsmittels kultiviert wurden und in
der Lage sind, das interessierende Gen an ihre Nachkommenschaft
weiterzugeben, werden als "stabile
Transfektanten" bezeichnet.
Ein bevorzugter selektierbarer Marker ist ein Gen, das die Resistenz
gegen das Antibiotikum Neomycin kodiert. Diese Selektion erfolgt in
Anwesenheit eines Wirkstoffs vom Neomycintyp wie G-418 oder dergleichen.
Selektionssysteme können auch
genutzt werden, um den Expressionslevel des interessierenden Gens
zu erhöhen,
ein Verfahren, das als "Amplifikation" bezeichnet wird.
Die Amplifikation erfolgt durch Kultivieren von Transfektanten in
Anwesenheit eines geringen Levels an Selektionsmittel und anschließende Erhöhung der
Menge an Selektionsmittel, um auf Zellen zu selektieren, die hohe
Level des Produkts der eingeführten
Gene erzeugen. Ein bevorzugter, amplifizierbarer, selektierbarer
Marker ist die Dihydrofolatreduktase, die eine Resistenz gegen Methotrexat
verleiht.
-
Andere
Wirkstoffresistenzgene (beispielsweise Hygromycin-Resistenz, Mehrfachresistenz,
Puromycin-Acetyltransferase) können
ebenfalls angewandt werden.
-
Andere,
höhere
eukaryotische Zellen können
ebenfalls als Wirte genutzt werden, einschließlich Insektenzellen, Pflanzenzellen
und Vogelzellen. Die Transformation von Insektenzellen und die Produktion
von Fremd-Polypeptiden in diesen ist offenbart von Guarino et al.,
US-Patent Nr. 5,162,222; Bang et al., US-Patent Nr. 4,775,624; und
WIPO-Veröffentlichung
WO 94/06463, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Die Verwendung
von Agrobacterium rhizogenes als Vektor für die Expression von Genen
in Pflanzenzellen ist dargestellt worden von Sinkar et al., J. Biosci.
(Bangalore), 11: 47–58
(1987).
-
Pilzzellen,
einschließlich
Hefezellen und insbesondere Zellen des Genus Saccharomyces, können ebenfalls
innerhalb der vorliegenden Erfindung genutzt werden, wie für die Produktion
von Rezeptorfragmenten oder Polypeptidfusionen. Verfahren zur Transformation
von Hefezellen mit exogener DNS und zur Erzeugung rekombinanter
Polypeptide aus diesen werden beispielsweise offenbart von Kawasaki,
US-Patent Nr. 4,599,311; Kawasaki et al., US-Patent Nr. 4,931,373; Brake, US-Patent
Nr. 4,870,008; Welch et al., US-Patent Nr. 5,037,743; und Murray
et al., US-Patent Nr. 4,845,075. Transformierte Zellen werden über den
Phenotyp selektiert, bestimmt über
selektierbare Marker, üblicherweise
Wirkstoffresistenz oder die Fähigkeit,
in Abwesenheit eines speziellen Nährstoffes (beispielsweise Leucin)
zu wachsen. Ein bevorzugtes Vektorsystem für die Verwendung in Hefe ist
das POT1-Vektorsystem,
offenbart von Kawasaki et al. (US-Patent Nr. 4,931,373), welches
die Selektion transformierter Zellen mittels Wachstum in Glukose
enthaltenden Medien gestattet. Geeignete Promotoren und Terminatoren
für die
Verwendung in Hefen schließen
diejenigen glykolytischer Enzymgene (siehe beispielsweise Kawasaki,
US-Patent Nr. 4,599,311; Kingsman et al., US-Patent Nr. 4,615,974; und
Bitter, US-Patent Nr. 4,977,092) wie auch Alkoholdehydrogenasegene
ein. Siehe auch US-Patente Nrn. 4,990,446, 5,063,154, 5,139,936
und 4,661,454. Transformationssysteme für andere Hefen, eingeschlossen Hanse
nula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis,
Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia
methanolica, Pichia guillermondii und Candida maltosa sind im Stand
der Technik bekannt. Siehe beispielsweise Gleeson et al., J. Gen.
Microbiol, 132: 3459–3465
(1986), und Cregg, US-Patent Nr. 4,882,279. Aspergilluszellen können gemäß den Verfahren
von McKnight et al., US-Patent Nr. 4,935,349, genutzt werden. Verfahren
zum Transformieren von Acremonium chrysogenum sind offenbart von Sumino
et al., US-Patent Nr. 5,162,228. Verfahren zum Transformieren von
Neurospora sind offenbart von Lambowitz, US-Patent Nr. 4,486,533.
-
Transformierte
oder transfizierte Wirtszellen werden gemäß herkömmlicher Verfahren in einem
Kulturmedium kultiviert, enthaltend Nährstoffe und andere Komponenten,
die für
das Wachstum der gewählten
Wirtszellen erforderlich sind. Eine Vielzahl geeigneter Medien,
eingeschlossen definierte Medien und komplexe Medien, ist im Stand
der Technik bekannt; im Allgemeinen enthalten sie eine Kohlenstoffquelle,
eine Stickstoffquelle, essenzielle Aminosäuren, Vitamine und Mineralien.
Medien können
auch Komponenten wie Wachstumsfaktoren oder Serum, nach Bedarf,
enthalten. Das Wachstumsmedium wird im Allgemeinen auf Zellen selektieren,
enthaltend die exogen zugesetzte DNS, beispielsweise mittels Wirkstoffselektion
oder Mangel an einem essenziellen Nährstoff, der von dem selektieren
Marker, geträgert
auf dem Expressionsvektor oder co-transfiziert in die Wirtszelle,
komplementiert wird.
-
In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Rezeptor über eine
kultivierte Zelle erzeugt und die Zelle wird zum Sichten auf Liganden
für den
Rezeptor verwendet, einschließlich
des natürlichen
Liganden wie auch Agonisten und Antagonisten des natürlichen
Liganden. Um diesen Ansatz zusammenzufassen, wird eine cDNS oder
ein Gen, kodierend den Rezeptor, mit anderen genetischen Elementen,
die für
seine Expression erforderlich sind (beispielsweise ein Transkriptionspromotor),
kombiniert und der resultierende Expressionsvektor in eine Wirtszelle
insertiert. Zellen, die die DNS exprimieren und funktionale Rezeptoren
erzeugen, werden selektiert und in einer Vielzahl von Sichtungssystemen
verwendet.
-
Säugerzellen,
die für
die Verwendung beim Exprimieren von Zcytor11-Rezeptoren und zum
Ubermitteln eines rezeptor-vermittelten Signals geeignet sind, schließen Zellen
ein, die andere Rezeptoruntereinheiten exprimieren, die einen funktionalen
Komplex mit Zcytor11 bilden können.
Diese Untereinheiten können
diejenigen der Interferon-Rezeptorfamilie oder anderer Klasse-II-
oder Klasse-I-Cytokinrezeptoren sein. Es ist ebenfalls bevorzugt,
eine Zelle aus derselben Spezies wie der zu exprimierende Rezeptor
zu nutzen. In einer bevorzugten Ausführungsform hängt die
Zelle für
ihre Proliferation von einem exogen bereitgestellten hematopoietischen
Wachstumsfaktor ab. Bevorzugte Zelllinien dieses Typs sind die menschliche
TF-1-Zelllinie (ATCC-Nr. CRL-2003) und die AML-193-Zelllinie (ATCC-Nr.
CRL-9589), bei denen es sich um GM-CSF-abhängige menschliche leukemische
Zelllinien handelt, und BaF3 [Palacios und Steinmetz, Cell 41: 727–734 (1985)],
bei der es sich um eine IL-3-abhängige
pre-B-Zelllinie aus der Maus handelt. Andere Zelllinien umfassen
BHK-, COS-1- und CHO-Zellen.
-
Geeignete
Wirtszellen lassen sich so konstruieren, dass sie die erforderlichen
Rezeptoruntereinheiten oder anderen zellulären Komponenten erzeugen, die
für die
gewünschte
zelluläre
Response erforderlich sind. Dieser Ansatz ist aus dem Grunde vorteilhaft,
dass die Zelllinien so konstruiert werden können, dass sie Rezeptoruntereinheiten
aus jeder Spezies exprimieren, wodurch mögliche Einschränkungen,
die aus der Spezies-Spezifizität
entstehen, überwunden
werden können.
Spezies-orthologe der humanen Rezeptor-cDNS können kloniert und in Zelllinien
aus derselben Spezies genutzt werden, wie eine Maus-cDNS in der
BaF3-Zelllinie. Zelllinien, die von einem hematopoietischen Wachstumsfaktor
wie GM-CSF oder IL-3 abhängen,
lassen sich somit so konstruieren, dass sie von einem Zcytor11-Liganden
abhängig
werden.
-
Zellen,
die einen funktionalen Rezeptor exprimieren, werden in Sichtungstests
benutzt. Eine Vielzahl geeigneter Tests ist im Stand der Technik
bekannt. Diese Tests basieren auf der Detektion einer biologischen Response
in einer Zielzelle. Ein solcher Test ist ein Zellproliferationstest.
Die Zellen werden in Anwesenheit oder Abwesenheit einer Testverbindung
kultiviert und die Zellproliferation beispielsweise über die
Messung der Inkorporation von tritiiertem Thymidin oder über einen
kolorimetrischen Test auf Basis des metabolischen Abbaus von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid
(MTT) [Mosman, J. Immunol., Meth., 65: 55–63 (1983)] detektiert. Ein
alternatives Testformat nutzt Zellen, die weiterhin konstruiert
sind, um ein Reportergen zu exprimieren. Das Reportergen ist an
ein Promotorelement gebunden, das auf den rezeptor-vermittelten
Stoffwechselweg anspricht, und der Test detektiert die Aktivierung
der Transkription des Reportergens. Ein bevorzugtes Promotorelement
ist in dieser Hinsicht ein Serumresponselement oder SRE. Siehe beispielsweise
Shaw et al., Cell, 56: 563–572
(1989). Ein bevorzugtes Reportergen ist ein Luciferasegen [de Wet
et al., Mol. Cell. Biol., 7: 725 (1987)]. Die Expression des Luciferasegens
wird mittels Lumineszenz unter Verwendung bekannter Verfahren detektiert
[beispielsweise Baumgartner et al., J. Biol. Chem., 269: 29094–29101 (1994);
Schenborn und Goiffin, Promega_Notes, 41: 11 (1993)]. Luciferase-Aktivitäts-Testkits
sind im Handel erhältlich
beispielsweise von Promega Corp., Madison, WI. Ziel-Zelllinien dieses
Typs können
genutzt werden, um Datenbanken auf Chemikalien, zellkonditionierte
Kulturmedien, Pilzbrühen,
Erdproben, Wasserproben und dergleichen zu sichten. Beispielsweise
lässt sich
eine Bank oder Reihe zellkonditionierter Medienproben auf einer
Zielzelle testen, um Zellen zu identifizieren, die Liganden erzeugen.
Positive Zellen werden anschließend genutzt,
um eine cDNS-Datenbank in einem Säuger-Expressionsvektor zu erzeugen, der in
Gruppen eingeteilt, in Wirtszellen transfiziert und exprimiert wird.
Medienproben aus den transfizierten Zellen werden anschließend getestet,
bei folgender Teilung der Gruppen, erneuter Transfektion, der Unterkultivierung
und dem noch maligen Testen positiver Zellen, um eine klonierte cDNS
zu isolieren, die den Liganden kodiert.
-
Ein
natürlicher
Ligand des Zcytor11-Rezeptors lässt
sich ebenfalls über
die Mutation einer Zelllinie, exprimierend den Rezeptor, und Kultivieren
derselben unter Bedingungen, die auf autokrines Wachstum selektieren,
identifizieren. Siehe die WIPO-Veröffentlichung WO 95/21930. Bei
einem typischen Vorgehen werden IL-3-abhänge BaF3-Zelleen, exprimierend
Zcytor11 und die erforderlichen weiteren Untereinheiten, mutiert, beispielsweise
mit Hilfe von 2-Ethylmethansulfonat (EMS). Die Zellen lässt man
sich anschließend
in Anwesenheit von IL-3 erholen, sie werden dann in ein Kulturmedium
ohne IL-3 und IL-4 transferiert. Überlebende Zellen werden auf
die Produktion eines Zcytor11-Liganden gesichtet, beispielsweise
durch Zusetzen von löslichem
Rezeptor zum Kulturmedium oder durch Testen des konditionierten
Mediums auf Wiltyp-BaF3-Zellen und den Rezeptor exprimierenden BaF3-Zellen.
-
Ein
weiterer, von der vorliegenden Erfindung bereitgestellter Sichtungsansatz
umfasst die Verwendung von hybriden Rezeptorpolypeptiden. Diese
hybriden Polypeptide fallen in zwei allgemeine Klassen. In der ersten
Klasse ist die intrazelluläre
Domäne
von Zcytor11, umfassend in etwa die Reste 252 bis 574 der SEQ ID
Nr. 2, an die Liganden bindende Domäne eines zweiten Rezeptors
gebunden. Es ist bevorzugt, dass der zweite Rezeptor ein hematopoietischer
Cytokinrezeptor wie ein mp1-Rezeptor ist [Souyri et al., Cell, 63: 1137–1147 (1990)].
Der hybride Rezeptor wird außerdem
eine Transmembrandomäne
umfassen, die von einem der beiden Rezeptoren abgeleitet sein kann.
Ein DNS-Konstrukt, kodierend den hybriden Rezeptor, wird anschließend in
eine Wirtszelle insertiert. Zellen, die den hybriden Rezeptor exprimieren,
werden, in Anwesenheit eines Liganden für die Bindungsdomäne kultiviert
und auf eine Antwort getestet. Dieses System stellt ein Mittel für die Analyse
der von Zcytor11 vermittelten Signaltransduktion bereit, und zwar
unter Verwendung leicht verfügbarer
Liganden. Dieses System kann auch genutzt werden, zu ermitteln,
ob spezielle Zelllinien auf von Zcytor11 übermittelte Signale ansprechen
können.
Eine zweite Klasse hybrider Rezeptorpolypeptide umfasst die extrazelluläre (Ligandenbindungs-)Domäne von Zcytor11
(in etwa die Reste 18 bis 228 der SEQ ID Nr. 2) mit einer intrazellulären Domäne eines
zweiten Rezeptors, vorzugsweise eines hematopoietischen Cytokinrezeptors,
und eine Transmembrandomäne.
Hybride Rezeptoren dieser zweiten Klasse werden in Zellen exprimiert,
von denen bekannt ist, dass sie auf vom zweiten Rezeptor übermittelte
Signale ansprechen können.
Zusammen ermöglichen
diese zwei Klassen von hybriden Rezeptoren die Identifizierung eines
ansprechenden Zelltyps für
die Entwicklung eines Tests zum Detektieren eines Zcytor11-Liganden.
-
Zellen,
die nach den Ergebnissen den Liganden exprimieren, werden anschließend zur
Herstellung einer cDNS-Datenbank genutzt, aus der die Liganden kodierende
cDNS isoliert werden kann, wie oben offenbart. Die vorliegende Erfindung
stellt somit zusätzlich
zu den neuen Rezeptorpolypeptiden Verfahren zum Klonieren von Polypeptidliganden
für diese
Rezeptoren bereit.
-
Die
Gewebsspezifizität
der Zcytor11-Expression legt eine Rolle in der Entwicklung des Pankreas,
des Dünndarms,
Dickdarms und des Thymus nahe. Im Hinblick auf die für diesen
Rezeptor beobachtete Gewebsspezifizität haben Agonisten (einschließlich des
natürlichen
Liganden) und Antagonisten ein enormes Potenzial sowohl in in vitro
als auch in in vivo Anwendungen. Als Rezeptoragonisten identifizierte
Verbindungen sind für
die Stimulation der Proliferation und Entwicklung von Zielzellen
in vitro und in vivo nützlich.
Beispielsweise sind Agonistverbindungen nützlich als Komponenten definierter
Zellkulturmedien und können
alleine oder in Kombination mit anderen Cytokinen und Hormonen genutzt
werden, um Serum zu ersetzen, das üblicherweise in Zellkultur
genutzt wird. Agonisten oder Antagonisten können bei der spezifischen Steuerung
des Wachstums und/oder der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsen-, gastrointestinalen
oder vom Thymus abgeleiteten Zellen in Kultur nützlich sein. Diese Verbindungen
sind als Forschungsreagenzien zum Charakterisieren von Stellen der
Ligand/Rezeptor-Wechselwirkung nützlich.
In vivo können
Rezeptoragonisten oder -antagonisten bei der Behandlung von Bauchspeicheldrüsen-, gastrointestinalen
oder Thymus-Erkrankungen Anwendung finden.
-
Agonisten
für oder
Antagonisten gegen Zcytor11 können
kleine Peptidfamilien umfassen. Diese Peptide können unter Anwendung der Affinitätsselektionsbedingungen,
die im Stand der Technik bekannt sind, aus einer Population von
Kandidaten, die in einer Peptiddatenbank vorhanden sind, identifiziert
werden. Peptiddatenbanken schließen kombinatorische Datenbanken,
chemisch synthetisiert und auf einem festen Träger präsentiert [Lam et al., Nature,
354: 82–84
(1991)] oder solche in Lösung
[Houghten et al., BioTechniques, 13: 412–421 (1992)], solche, die exprimiert
und anschließend
an Plasmid-DNS gebunden sind [Cull et al., Proc., Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 1865–1869
(1992)], oder solche ein, die exprimiert und anschließend auf
den Oberflächen
von Viren oder Zellen präsentiert
bzw. dargestellt werden [Boder und Wittrup, Nature Biotechnology, 15:
553–557
(1997); Cwirla et al., Science 276: 1696–1699 (1997)].
-
Zcytor11
kann auch in diagnostischen Systemen für die Detektion zirkulierender
Level an Ligand genutzt werden. In einer verwandten Ausführungsform
können
Antikörper
oder andere Mittel, die spezifisch an Zcytor11 binden, zum Detektieren
zirkulierender Rezeptorpoly peptide genutzt werden. Erhöhte oder
gesenkte Level an Ligand oder Rezeptorpolypeptiden können auf
pathologische Zustände
hinweisen, eingeschlossen Krebs.
-
Zcytor11-Rezeptorpolypeptide
können
durch Exprimieren einer trunkierten DNS, kodierend die extrazelluläre Domäne, beispielsweise
eines Polypeptids, das die Reste 18 bis 228 eines menschlichen Zcytor11-Rezeptors
(SEQ ID Nr. 2) oder den entsprechenden Bereich eines nicht-menschlichen
Rezeptors enthält,
hergestellt werden. Es ist bevorzugt, dass die extrazelluläre Domäne als Polypeptid
in einer Form hergestellt wird, die im Wesentlichen frei von Transmembran-
und intrazellulären
Polypeptidsegmenten ist. Beispielsweise kann sich der C-Terminus des Rezeptorpolypeptids
am Rest 228 der SEQ ID Nr. 2 oder dem entsprechenden Bereich einer
allelischen Variante oder eines nicht-menschlichen Rezeptors befinden.
Um den Export der Rezeptordomäne
aus der Wirtszelle zu dirigieren, wird die Rezeptor-DNS an ein zweites
DNS-Segment gebunden, kodierend ein sekretorisches Peptid wie ein
t-PAsekretorisches Peptid. Um die Reinigung der sekretierten Rezeptordomäne zu erleichtern,
kann eine C-terminale Verlängerung
wie ein Polyhistidin-Tag, die Substanz P, ein FlagTM-Peptid
[Hopp et al., Biotechnology, 6: 1204–1210 (1988); erhältlich von
Eastman Kodak Co., New Haven, CT] oder ein anderes Polypeptid oder
Protein, für
das ein Antikörper
oder anderes spezifisches Bindungsmittel erhältlich ist, an das Rezeptorpolypeptid
fusioniert werden.
-
In
einem alternativen Ansatz kann eine extrazelluläre Rezeptordomäne als eine
Fusion mit konstanten Bereichen der schweren Kette eines Immunglobulins,
typischerweise einem Fc-Fragment,
das zwei Domänen des
konstanten Bereichs und eine Gelenkregion enthält, dem jedoch der variable
Bereich fehlt, exprimiert werden. Solche Fusionen werden typischerweise
als multimere Moleküle
sekretiert, deren Fc-Anteile mit Disulfidbrücken untereinander verbrückt sind,
und worin zwei Rezeptorpolypeptide in enger Nachbarschaft zueinander angeordnet
sind. Fusionen dieses Typs lassen sich zur Affinitätsreinigung
des erkennenden Liganden aus Lösung,
als ein Testwerkzeug in vitro, zum Blockieren von Signalen in vitro
mittels spezifischem Austitrieren des Liganden und als Antagonisten
in vivo durch parenterale Verabreichung derselben zur Bindung von
zirkulierendem Liganden und zum Clearing desselben aus der Zirkulation
nutzen. Um Liganden zu reinigen, wird eine Zcytor11-Ig-Chimäre zu einer
Probe, enthaltend den Liganden (beispielsweise zell-konditioniertes
Kulturmedium oder Gewebsextrakte) unter Bedingungen zugesetzt, die
die Rezeptor/Ligand-Bindung erleichtern (typischerweise ungefähr physiologische
Temperatur, pH und Ionenstärke).
Der Komplex aus Chimäre
und Ligand wird anschließend
unter Anwendung von Protein A, das auf einem festen Träger immobilisiert
ist (beispielsweise unlösliche
Harzkügelchen),
von der Mischung abgetrennt. Der Ligand wird anschließend unter
Anwendung herkömmlicher
chemischer Techniken eluiert wie mit Salz oder einem pH-Gradienten.
Alternativ kann die Chimäre
selbst an einen festen Träger
gebunden sein, wobei Bindung und Elution wie oben durchgeführt werden. Die
Chimären
können
in vivo zur Steuerung gastrointestinaler, pankreatischer oder von
Thymus-Funktionen genutzt
werden. Chimäre
mit hoher Bindungsaffinität
werden parenteral (beispielsweise mittels intramuskulärer, subkutaner
oder intravenöser
Injektion) verabreicht. Zirkulierende Moleküle binden Liganden und werden über normale
physiologische Prozesse aus der Zirkulation entfernt. Für die Verwendung
in Tests werden die Chimären über den
Fc-Bereich an einen Träger
gebunden und in einem ELISA-Format genutzt.
-
Ein
bevorzugtes Testsystem, dass ein Liganden bindendes Rezeptorfragment
einsetzt, nutzt ein im Handel erhältliches Biosensorinstrument
(BIAcoreTM, Pharmacia Biosensor, Piscataway,
NJ), worin das Rezeptorfragment auf der Oberfläche eines Rezeptorchips immobilisiert
ist. Die Verwendung dieses Instruments ist offenbart in Karlsson,
J. Immunol. Methods, 145: 229–240
(1991), und Cunningham und Wells, J. Mol. Biol., 234: 554–563 (1993).
Ein Rezeptorfragment wird unter Verwendung der Amin- oder Sulfhydrylchemie
kovalent an Dextranfasern angeheftet, die an einen Goldfilm in der
Durchflusszelle angeheftet sind. Eine Testprobe tritt durch die
Zelle hindurch. Falls Ligand in der Probe vorhanden ist, wird dieser
an das immobilisierte Rezeptorpolypeptid binden, was eine Veränderung
im Brechungsindex des Mediums verursacht, die als Änderung
in der Oberflächen-Plasmon-Resonanz
des Goldfilms detektiert wird. Dieses System gestattet die Bestimmung von
On- und Off-Raten, aus denen die Bindungsaffinität berechnet werden kann, wie
auch eine Bewertung der Bindungsstöchiometrie.
-
Die
Liganden bindenden Rezeptorpolypeptide können auch in anderen, im Stand
der Technik bekannten Testsystemen genutzt werden. Solche Systeme
schließen
die Scatchard-Analyse
zur Bestimmung der Bindungsaffinität ein (Siehe Scatchard, Ann.
NY Acad. Sci., 51: 660–672
(1949)) wie auch kolorimetrische Tests [Cunningham et al., Science,
253: 545–548
(1991); Cunningham et al., Science, 254: 821–825 (1991)].
-
Ein
Liganden bindendes Rezeptorpolypeptid kann auch für die Reinigung
des Liganden genutzt werden. Das Rezeptorpolypeptid wird auf einem
festen Träger
wie Kügelchen
aus Agarose, quervernetzter Agarose, Glas, Zelluloseharzen, Harzen
auf Silikabasis, Polystyrol, quervernetztem Polyacrylamid oder ähnlichen Materialien,
die unter den Anwendungsbedingungen stabil sind, immobilisiert.
Verfahren zur Bindung von Polypeptiden an feste Träger sind
im Stand der Technik bekannt und schließen die Aminchemie, die Cyanogenbromidaktivierung,
die N-Hydroxysuccinimidaktivierung, die Epoxidaktivierung, die Sulfhydrylaktivierung
und die Hydrazidaktivierung ein. Die resultierenden Medien werden
im Allgemeinen in Form einer Säule
konfiguriert, und man lässt
Fluide, enthaltend Liganden, durch die Säule ein oder mehr mals durchtreten,
um die Bindung des Liganden an das Rezeptorpolypeptid zu gestatten.
Der Ligand wird anschließend
unter Anwendung von Änderungen
der Salzkonzentration oder des pH-Wertes zur Aufbrechung der Ligand/Rezeptor-Bindung eluiert.
-
Zcytor11-Polypeptide
können
auch zur Herstellung von Antikörpern
genutzt werden, die spezifisch an Zcytor11-Polypeptide binden. Wie
hierin verwendet, umfasst der Ausdruck "Antikörper" polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Einzelketten-Antikörper und
Antigen bindende Fragmente derselben wie F(ab')2 und Fab als
Fragmente und dergleichen, einschließlich gentechnisch hergestellter
Antikörper.
Antikörper
sind so definiert, dass sie dann, wenn sie an ein Zcytor11-Polypeptid
spezifisch mit einem Ka von größer als
oder gleich 107/M binden. Die Affinität eines
monoklonalen Antikörpers
kann vom Fachmann leicht bestimmt werden (siehe beispielsweise Scatchard,
ibid.).
-
Verfahren
für die
Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper sind im Stand der Technik
wohl bekannt. Siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Habor, NY (1989);
und J. G. R. Hurrell, Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques
and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1982), die durch
Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Wie für den Fachmann ersichtlich,
lassen sich polyklonale Antikörper
aus einer großen
Vielzahl warmblütiger
Tiere erzeugen, wie Pferden, Kühen,
Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnern,
Kaninchen, Mäusen
und Ratten. Die Immunogenizität
eines Zcytor11-Polypeptids lässt
sich durch die Verwendung eines Adjuvans wie dem Freund'schen vollständigen oder
unvollständigen
Adjuvans steigern. Eine Vielzahl von Tests, die dem Fachmann bekannt
sind, kann genutzt werden, um Antikörper zu detektieren, die spezifisch
an Zcytor11-Polypeptide binden. Beispielhafte Tests sind im Detail
beschrieben in "Antibodies:
A Laboratory Manual",
Harlow and Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988).
Repräsentative
Beispiele solcher Tests schließen ein:
die gleichlaufende Immunelektrophorese, Radioimmuntests, die Radioimmunfällungen,
enzymvermittelte Immunosorptionstests (ELISA), Dot-Blot-Tests, Inhibitions-
oder Wettbewerbstests und Sandwichtests.
-
Antikörper gegen
Zcytor11 können
zum Markieren von Zellen genutzt werden, die den Rezeptor exprimieren,
für die
Affinitätsreinigung,
in diagnostischen Tests zur Bestimmung zirkulierender Level von
löslichen Rezeptorpolypeptiden
und als Antagonisten, um die Ligandenbindung und Signaltransduktion
in vitro und in vivo zu blockieren.
-
Antiidiotypische
Antikörper,
die an die antigenische Bindungsstelle von Antikörpern gegen Zcytor11 binden,
werden ebenfalls als Teil der vorliegenden Erfindung betrachtet.
Der Antigenbindungsbereich des antiidiotypischen Antikörpers wird
somit den Ligandenbindungs bereich von Zcytor11 nachahmen. Ein antiidiotypischer
Antikörper
könnte
somit genutzt werden, um auf mögliche
Liganden des Zcytor11-Rezeptors zu sichten. Somit kann das Neutralisieren
von Antikörpern
gegen Zcytor11 genutzt werden, um antiidiotypische Antikörper zu
erzeugen, und zwar über
im Stand der Technik wohl bekannte Verfahren, wie beispielsweise
beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, zweite Auflage (Cold Spring Harbor, NY, 1989); und J. G.
R. Hurrell, Hrsg., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and
Applications (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982).
-
Zcytor11
kartiert 84,62 cR von der Spitze des menschlichen Chromosoms einer
Bindungsgruppe auf der WICGR-Radiationhybridkarte. Die Verwendung
umgebender Marker positionierte Zcytor11 im Bereich 1p35,2 bis 35,1.
-
Somit
könnte
Zcytor11 genutzt werden, um eine Sonde zu erzeugen, die die Detektion
einer Änderung des
Zcytor11-Gens im 1p-Chromosom detektiert, was die Anwesenheit einer
Krebszelle oder einer Prädisposition
für eine
krebsartige Zellentwicklung anzeigen könnte. Dieser Bereich des Chromosoms
1 ist oft in sichtbare Deletionen oder den Verlust der Heterozygotie
in Tumoren involviert, die sich von Neuralleistenzellen ableiten,
insbesondere Neuroblastomen und Melanomen. Für eine weitere Diskussion hinsichtlich
der Entwicklung von Polynucleotidsonden und der Hybridisierung siehe
Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg.
(John Wiley & Sons,
Inc., 1991).
-
Die
Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht einschränkenden
Beispiele veranschaulicht.
-
BEISPIEL 1
-
Herstellung
einer cDNS-Datenbank aus Pankreas-Inselzellen
-
Zcytor11
wurde aus einer cDNS-Datenbank pankreatischer Inselzellen kloniert,
hergestellt gemäß dem folgenden
Verfahren. RNS, extrahiert aus Bauchspeicheldrüsen-Inselzellen, wurde auf
folgende Weise revers transkribiert. Die Reaktion des ersten cDNS-Stranges
enthielt 10 μl
menschliche, pankreatische poly-d(T)-selektierte Inselzell-Poly(A)+-mRNS (Clontech, Palo Alto, CA) in einer
Konzentration von 1,0 mg/ml und 2 μl 20 pMol/μl Primer des ersten Strangs
ZC6171 (SEQ ID Nr. 6), enthaltend eine Xho I-Restriktionsstelle.
Die Mischung wurde 2,5 Minuten lang auf 70°C erwärmt und durch Kühlen auf
Eis gekühlt.
Die Synthese des ersten Stranges cDNS wurde durch Zusatz von 8 μl von erstem
Strangpuffer (5 × SUPERSCRIPT®-Puffer;
Life Technologies, Gaithersburg, MD), 4 μl 100 mM Dithiothreitol und
3 μl einer
Desoxynucleotidtriphosphat-(dNTP)-Lösung, enthaltend 10 mM von
jedem von dTTP, dATP, dGTP und 5-Methyl-dCTP (Pharmacia LKB Biotechnology,
Piscataway, NJ) zu der RNS-Primer-Mischung initiiert. Die Reaktionsmischung
wurde 2 Minuten lang bei 40°C
inku biert, gefolgt vom Zusatz von 10 μl 200 U/μl RNase H– als
reverser Transkriptase (SUPERSCRIPT II®, Life
Technologies). Die Effizienz der Synthese des ersten Stranges wurde
in einer parallelen Reaktion durch den Zusatz von 10 μCi 32P-αdCTP
zu einem 5 μl
Aliquot aus einem der Reaktionsgemische zum Markieren der Reaktion
für die
Analyse analysiert. Die Reaktionen wurden 5 Minuten bei 40°C, 50 Minuten
45°C und
anschließend
10 Minuten bei 50°C
inkubiert. Nicht eingebautes 32P-αdCTP in markierter
Reaktion wurde mittels Chromatographie auf eine Gelfiltrationssäule mit
400er Porengröße (Clontech
Laboratories, Palo Alto, CA) entfernt. Nicht eingebaute Nucleotide
und Primer in den nicht markierten Reaktionen des ersten Stranges
wurden mittels Chromatographie auf einer Gelfiltrationssäule von
400er Porengröße (Clontech
Laboratories, Palo Alto, CA) entfernt. Die Länge der markierten cDNS des
ersten Stranges wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese bestimmt.
-
Die
Reaktion des zweiten Stranges enthielt 102 μl der unmarkierten cDNS des
ersten Stranges, 30 μl 5 × Polymerase-I-Puffer
(125 mM Tris: HCl, pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2,
50 mM (NH4)2SO4), 2,0 μl
100 mM Dithiothreitol, 3,0 μl
einer Lösung,
enthaltend 10 mM jedes Desoxynucleotidtriphosphats, 7 μl 5 mM β-NAD, 2,0 μl 10 U/μl E. coli-DNS-Ligase (New England
Biolabs; Beverly, MA), 5 μL
10 U/μl
E. coli-DNS-Polymerase I (New England Biolabs, Beverly, MA) und
1,5 μl 2
U/μl RNase
H (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Ein 10 μl Aliquot von einer der Synthesereaktionen
des zweiten Stranges wurde durch Zusatz von 10 μCi 32P-αdCTP markiert,
um die Effizienz der zweiten Strangsynthese zu beobachten. Die Reaktionen
wurden für 2
Stunden bei 16°C
inkubiert, gefolgt vom Zusatz von 1 μl einer 10 mM dNTP-Lösung und
6,0 μl T4-DNS-Polymerase
(10 U/μl,
Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und für zusätzliche 10 Minuten bei 16°C inkubiert. Nicht
eingebautes 32P-αdCTP in der markierten Reaktion
wurde vor der Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese durch Chromatographie über eine
Gelfiltrationssäule
400er Porengröße entfernt
(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Die Reaktion wurde durch
den Zusatz von 10,0 μl
0,5 M EDTA und Extraktion mit Phenol/Chloroform und Chloroform abgestoppt,
gefolgt von Ethanolfällung
in Anwesenheit von 3,0 M Na-Acetat und 2 μl Pellet Paint Carrier (Novagen,
Madison, WI). Die Ausbeute an cDNS wurde auf etwa 2 μg ausgehend von
einem ursprünglichen
mRNS-Template von 10 μg,
geschätzt.
-
Eco
RI-Adapter wurden an die 5'-Enden
der oben beschriebenen cDNS ligiert, um das Klonieren in einen Expressionsvektor
zu ermöglichen.
Ein 12,5 μl
Aliquot an cDNS (~2,0 μg)
und 3 μl
69 pMol/μl
an Eco RI-Adapter (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway,
NJ) wurden mit 2,5 μl
10 × Ligasepuffer
(660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2),
2,5 μl 10 mM
ATP, 3,5 μl
0,1 M DTT und 1 μl
15 U/μl
T4-DNS-Ligase (Promega Corp., Madison, WI) gemischt. Die Reaktion
wurde für
1 Stunde bei 5°C,
2 Stunden bei 7,5°C,
2 Stunden bei 10°C,
2 Stunden bei 12,5°C
und 16 Stunden bei 10°C
inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 65 μl H2O und 10 μl
10 × H-Puffer
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und Inkubation bei 70°C für 20 Minuten terminiert.
-
Um
das gerichtete Klonieren der cDNS in einen Expressionsvektor zu
erleichtern, wurde die cDNS mit Xho I angedaut, was zu einer cDNS
mit einem 5'-Eco
RI-kohesiven Ende und einem 3'-Xho
I-kohesiven Ende resultierte. Die Xho I-Restriktionsstelle am 3'-Ende der cDNS war
zuvor eingeführt
worden. Der Abbau mit Restriktionsenzym erfolgte in einem Reaktionsgemisch
durch Zusatz von 1,0 μl
40 U/μl
Xho I (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Der Abdau erfolgte
bei 37°C
für 45
Minuten. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 70°C für 20 Minuten
und Chromatographie auf einer Gelfiltrationssäule mit 400er Porengröße (Clontech
Laboratories, Palo Alto, CA) terminiert.
-
Die
cDNS wurde mit Ethanol gefällt,
mit 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 10,0 μl Wasser, 2 μl 10X Kinasepuffer
(660 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2),
0,5 μl 0,1
M DTT, 2 μl
10 mM ATP, 2 μl
T4-Polynucleotidkinase (10 U/μl,
Life Technologies, Gaithersburg, MD) resuspendiert. Nach Inkubation
für 30
Minuten bei 37°C
wurde die cDNS mit Ethanol in Anweseinheit von 2,5 M Ammoniumacetat
ausgefällt
und auf einem 0,8%igen niederschmelzenden Agarosegel der Elektrophorese
unterworfen. Die kontaminierenden Adapter und cDNS unterhalb von
0,6 Kb Länge
wurden aus dem Gel ausgeschnitten. Die Elektroden wurden umgekehrt
und die cDNS solange der Elektrophorese unterworfen, bis diese in
der Nähe
des Spurursprungs konzentriert war. Die Fläche des Gels, enthaltend die
konzentrierte cDNS, wurde ausgeschnitten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben
und das ungefähre
Volumen des Gelstückchens
bestimmt. Ein Wasseraliquot von ungefähr dem Dreifachen des Volumens
des Gelstückchens
(300 μl)
und 35 μl
10 × β-Agarose-I-Puffer (New
England Biolabs) wurden zum Röhrchen
zugesetzt, und man ließ die
Agarose durch Erwärmen
auf 65°C für 15 Minuten
schmelzen. Nach Äquilibrierung
der Probe auf 45°C
setzte man 3 μl
1 U/μl β-Agarose-I (New England
Biolabs, Beverly, MA) zu, und die Mischung wurde für 60 Minuten
bei 45°C
inkubiert, um die Agarose zu verdauen. Nach Inkubation gab man 40 μl 3 M Na-Acetat zu der Probe
zu, und die Mischung wurde auf Eis für 15 Minuten inkubiert. Die
Probe wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 14.000 × g zentrifugiert, um
nicht verdaute Agarose zu entfernen. Die cDNS wurde mit Ethanol
ausgefällt,
in 70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 40 μl Wasser
resuspendiert.
-
Nach
der Rückgewinnung
aus dem niedrig schmelzenden Agarosegel wurde die cDNS in die Eco
RI- und Xho I-Stellen des Vektors pBLUESCRIPT SK+ (Gibco/BRL, Gaithersburg,
MD) kloniert und mittels Elektroporation in DH10B-Zellen eingeführt. Bakterielle
Kolonien, enthaltend ESTs bekannter Gene, wurden identifiziert und
aus der Sequenzanalyse mittels wiederkehrenden Zyklen der Sondenhybridisierung
an hochdichte Koloniefilterarrays (Genome Systems, St. Louis, MI)
eliminiert. Die cDNS bekannter Gene wurde in Gruppen von 50 – 100 Inserts
gepolt und mit 32P-αdCTP unter Verwendung eines
MEGAPRIME-Markierungskits (Amersham, Arlington Heights, IL) markiert.
Kolonien, die nicht an die Sondenmischung hybridisierten, wurden für die Sequenzierung
gewählt.
Die Sequenzierung erfolgte unter Anwendung eines ABI 377-Sequenziergeräts, unter
Verwendung entweder von T3 oder des reversen Primers. Die resultierenden
Daten wurden analysiert, was zur Identifikation des EST LISF104376
(SEQ ID Nr. 3) führt.
-
Beispiel 2
-
Klonierung von Zcytor11
-
Der
exprimierte Sequenztag (EST) LISF104376 (SEQ ID Nr. 3), enthalten
im Plasmid pSLIS4376, wurde aus einer humanen, pankreatischen Inselzell-cDNS-Datenbank
isoliert. Nach dem Sequenzieren des gesamten pSLIS4376-cDNS-Inserts
wurde bestimmt, dass dieses kein Zcytor11-Polypeptid voller Länge kodiert.
-
Eine
Zcytor11 in voller Länge
kodierende cDNS wurde mittels Screenen einer menschlichen Inselzell-cDNS-Datenbank
unter Anwendung einer Sonde isoliert, die aus den PCR-Primern ZC14,295
(SEQ ID Nr. 4) und ZC14294 (SEQ ID Nr. 5) und dem pSLIS4376-Template erzeugt
wurde. (Für
Einzelheiten der Konstruktion der pankreatischen Inselzell-cDNS-Datenbank siehe
Beispiel 2 unten.) Die resultierende Sonde von 276 bp, enthaltend
die Nucleotide 142 bis 417 der SEQ ID Nr. 1, wurde mittels Chromatographie
durch eine Spinsäule
100er Porengröße (Clontech,
Palo Alto, CA) gereinigt. Die gereinigte Sonde wurde mit 32P-αdCTP unter Anwendung
des MEGAPRIME®-Markierungskits
(Amersham Corp., Arlington Heights, IL) markiert. Die markierte
Sonde wurde auf einer NUCTRAP®-Reinigungssäule (Stratagene Cloning Systems,
La Jolla, CA) für
die Datenbanksichtung gereinigt.
-
Nach
der Rückgewinnung
der Inselzell-cDNS aus einem niederschmelzenden Agarosegel aus Beispiel
1 wurde die cDNS in die Eco RI- und Xho I-Stellen von pBLUESCRIPT
SK+ (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) kloniert und in DH10B-Zellen mittels
Elektroporation eingeführt.
Bakterielle Klone aus resultierenden cDNS-Datenbanken wurden einzeln
auf einem Raster eines hochdichten Koloniefilterarrays (Genome Systems,
St. Louis, MI) angeordnet und mit der oben beschriebenen markierten
Zcytor11-Sonde sondiert. Ein Glycerinstamm jedes Klons auf jedem
Raster wurde ebenfalls hergestellt, um die Isolierung positiver
Klone zu beschleunigen. Die Filter wurden zunächst in einer wässrigen
Lösung
vorgewaschen, enthaltend 0,25 × Standard-Natriumcitrat
(SSC), 0,25% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 mM EDTA, um zelluläre Bruchstücke zu entfernen,
und anschließend
in einer Hybridisierungslösung
(5 × SSC,
5 × Denhardt's Lösung, 0,2%
SDS und 1 mM EDTA), enthaltend 100 μg/ml wärmedenaturierte, gescherte
Lachs-Sperma-DNS, vorhybridisiert.
-
Fünfzig Nanogramm
der PCR-abgeleiteten Zcytor11-Sonde wurde mit 32P-αdCTP mittels
statistischen Primern unter Anwendung des MEGAPRIME®-DNS-Markierungssystems
(Amersham Corp., Arlington Heights, IL) radiomarkiert. Die Vorhybridisierungslösung wurde
durch frische Hybridisierungslösung
ersetzt, enthaltend 1 × 106 cpm/ml Sonde, und man ließ über Nacht
bei 65°C
hybridisieren. Die Filter wurden in einem Waschpuffer gewaschen,
enthaltend 0,25 × SSC,
0,25% SDS und 1 mM EDTA, und zwar bei 65°C.
-
Nach
der Autoradiographie detektierte man drei Signale unter den 40.000
Klonen auf den Rastern des Filterarrays. Aus den Rasterkoordinaten
der positiven Signale wurden die entsprechenden Klone, pSLR11-1, pSLR11-2
und pSLR11-3 aus dem Glycerinstamm gewonnen und deren Inserts sequenziert.
Das Insert in pSLR11-1 wurde auf 2831 Basenpaare (bp) bestimmt und
kodierte das Zcytor11-Polypeptid voller Länge.
-
Beispiel 3
-
Expression menschlicher
Zcytor11-mRNS in menschlichen Geweben
-
Poly(A)+-RNS, isoliert aus Hirn, Dickdarm, Herz,
Niere, Leber, Lunge, Ovar, Pankreas, Prostata, Plazenta, Leukozyten
des Peripherieblutes, Magen, Milz, Skelettmuskel, Dünndarm,
Hoden, Thymus, Thyroid, Rückenmark,
Lymphknoten, Trachea, Nebenniere und dem Knochenmark, wurden unter
Bedingungen hoher Stringenz mit einer radiomarkierten DNS-Sonde, enthaltend
die Nucleotide 181–456
der SEQ ID Nr. 1, hybridisiert. Membranen wurde von Clontech bezogen.
Die Membran wurde mit 0,1 × SSC,
0,1% SDS bei 50°C gewaschen
und 24 Stunden autoradiographiert. Die mRNS-Level waren im Pankreas
am höchsten,
mit geringen Spiegeln in Colon, Dünndarm und Thymus. Die Rezeptor-mRNS-Lokalisierung
legt nahe, dass Zcytor11 gastrointestinale, pankreatische oder Thymus-Funktionen
regulieren könnte.
-
Beispiel 4
-
Chromosomale Zuordnung
und Anordnung von Zcytor11
-
Zcytor11
wurde unter Anwendung der im Handel erhältlichen Version des Whitehead
Institute/MIT Center for Genome Research's "GeneBridge
4 Radiation Hybrid Panel" (Research
Genetics, Inc., Huntsville, AL) auf Chromosom 1 kartiert. Das GeneBridge
4 Radiation Hybrid Panel enthält
PCR befähigte
DNS aus jedem von 93 Strahlungshybridklonen sowie zwei Kontroll-DNSs
(der HFL-Spender und der A23-Empfänger). Ein öffentlich verfügbarer Internetserver
(http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) gestattet die
Kartierung relativ zur Whitehead Institute/MIT Center for Genome
Research's Radiation
Hybrid-Karte des menschlichen Genoms (die "WICGR"-Radiation-Hybrid-Karte), die mit Hilfe
des GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panels konstruiert wurde.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
