ES2347840T3 - Il-17rcx4 soluble y procedimiento de utilizacion en la inflamacion. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido receptor soluble aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en los restos 21 a 467 de la SEC ID Nº 68.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las citocinas son pequeñas proteínas solubles que median en diversos efectos biológicos, como la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos celulares (véase, por ejemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59:783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76:241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de las citocinas son interleucinas, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de necrosis tumoral y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina-17 humana es una citocina que estimula la expresión de la interleucina-6, la molécula de adhesión intracelular 1, la interleucina-8, el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos y la prostaglandina E2; además participa en la maduración preferente de precursores hematopoyéticos CD34+ en neutrófilos (Yao et al., J. Immunol. 155:5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183:2593 (1996)).

Los receptores que se unen a las citocinas normalmente están compuestos de una o más proteínas integrales de membrana que se unen a la citocina con alta afinidad y transduce este acontecimiento de unión a la célula a través de las porciones citoplásmicas de determinadas subunidades del receptor. Los receptores de citocinas se han agrupado en varias clases en función de las semejanzas en sus dominios extracelulares de unión a ligando.

Las actividades demostradas in vivo de las citocinas y sus receptores ponen de manifiesto el potencial clínico, y la necesidad de otras citocinas, receptores de citocinas, agonistas de citocinas y antagonistas de citocinas. Por ejemplo, las actividades demostradas in vivo de la familla de citocinas proinflamatorias ponen de manifiesto el enorme potencial clínico, y la necesidad de antagonistas de moléculas proinflamatorias.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención aborda estas necesidades proporcionando antagonistas de las citocinas proinflamatorias IL-17A e IL-17F. Específicamente, las citocinas proinflamatorias IL-17A e IL-17F tienen un alto grado de similitud de secuencia, comparten muchas propiedades biológicas y ambas son producidas por células T activadas. Ambas se han considerado factores que contribuyen a la progresión de diversas enfermedades autoinmunes e inflamatorias como artritis reumatoide y asma. De hecho, los reactivos que anulan la función de IL-17A mejoran significativamente la incidencia y la gravedad de la enfermedad en diversos modelos de ratón de enfermedad humana. La IL-17A ejerce sus efectos a través de la interacción con su receptor análogo, el receptor de IL-17 (IL-17R), aunque el receptor de IL-17F aún no se ha identificado. Ahora describimos que se ha identificado la molécula relacionada con IL-17R, IL-17RC como el receptor de IL17F. No obstante, también se ha observado que este receptor se une tanto a IL-17A como IL-17F con una alta afinidad similar. Por otro lado, IL-17R se une a IL-17A con alta afinidad, aunque se une a IL-17F con muy baja afinidad. De acuerdo con esto, los inventores han demostrado que una forma soluble de IL-17R bloquea la unión de IL-17A y la señalización en las células que expresan su receptor, aunque no interfiere con la unión de IL-17F a IL-17RC ni con su función. Por el contrario, una forma soluble de IL-17RC antagoniza tanto con IL-17A como IL-17F, bien por separado o juntas, en células que expresan cualquiera de los dos receptores. Puesto que se ha propuesto la intervención de IL-17A como tratamiento eficaz para varias enfermedades autoinmunes, el uso de antagonistas de la presente invención, que pueden bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL17A, IL-17F o de ambas IL-17A e IL-17F, e incluye receptores IL-17RC solubles y anticuerpos neutralizantes anti-IL-17RC, tendrá ventajas sobre tratamientos dirigidos solo a una de estas dos citocinas. La invención además proporciona los usos de los mismos en enfermedades inflamatorias, así como composiciones y métodos relacionados.

A) Introducción

Las enfermedades inflamatorias y relacionadas con el sistema inmunitario son la manifestación o consecuencia de rutas biológicas interconectadas bastante complejas, con frecuencia múltiples, que en la fisiología normal son críticas para responder a un ataque o lesión, iniciar la reparación a partir de una agresión o lesión y organizar una defensa innata y adquirida frente a organismos extraños. La enfermedad o patología se produce cuando estas rutas fisiológicas normales causan una agresión o lesión adicional relacionada directamente con la intensidad de la respuesta, como consecuencia de una regulación anómala o una excesiva estimulación, como una reacción a lo propio, o como una combinación de estos.

Aunque la génesis de estas enfermedades a menudo supone rutas de varias etapas y con frecuencia múltiples sistemas/rutas biológicas diferentes, la intervención en puntos críticos en una o más de estas rutas puede tener un efecto terapéutico o de mejora. La intervención terapéutica puede producirse mediante antagonismo de un proceso/ruta perjudicial o mediante la estimulación de un proceso/ruta beneficiosa.

Se conocen muchas enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario que han sido ampliamente estudiadas. Entre dichas enfermedades se incluyen enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema inmunitario (como artritis reumatoide, enfermedad renal mediada por el sistema inmunitario, enfermedades hepatobiliares, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), psoriasis y asma), enfermedades inflamatorias no mediadas por el sistema inmunitario, enfermedades infecciosas, inmunodeficiencias, neoplasias, etc.

Los linfocitos T (células T) son un componente importante de la respuesta inmune de mamíferos. Las células T reconocen antígenos que están asociados con una molécula propia codificada por genes dentro del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). El antígeno puede mostrarse junto con las moléculas de MHC en la superficie de las células presentadoras de antígeno, células infectadas por virus, células cancerosas, injertos, etc. El sistema de células T elimina estas células alteradas que suponen una amenaza para la salud del mamífero hospedador. Entre las células T se incluyen células T colaboradoras y células T citotóxicas. Las células T colaboradoras proliferan ampliamente tras el reconocimiento de un complejo antígeno-MHC en una célula presentadora de antígeno. Las células T colaboradoras también secretan diversas citocinas, es decir, linfocinas, que tienen una función central en la activación de células B, de células T citotóxicas y de otras células que participan en la respuesta inmune.

Un suceso central tanto en respuestas inmunes humorales como celulares es la activación y expansión clonal de células T colaboradoras. La activación de células T colaboradoras se inicia mediante la interacción del complejo receptor de célula T (TCR)–CD3 con un complejo antígeno–MHC en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Esta interacción media una cascada de acontecimientos bioquímicos que inducen a las células T colaboradoras a entrar en el ciclo celular (la transición de G0 a G1) que tiene como resultado la expresión de un receptor de alta afinidad para la IL-2 y, a veces, para la IL-4. La célula T activada progresa en el ciclo proliferando y diferenciándose en células de memoria o células efectoras.

Además de las señales mediadas por el TCR, la activación de las células T implica la estimulación simultánea adicional inducida por citocinas liberadas por la célula presentadora de antígeno o a través de interacciones con moléculas unidas a membrana en la célula presentadora de antígeno y en la célula T. Se ha demostrado que las citocinas IL-1 e IL-6 proporcionan una señal estimuladora simultánea. Además, la interacción entre la molécula B7 expresada en la superficie de la célula presentadora de antígeno y las moléculas CD28 y CTLA-4 expresadas en la superficie de la célula T causa la activación de la célula T. Las células T activadas expresan un número elevado de moléculas de adhesión celular, como ICAM-1, integrinas, VLA-4, LFA-1, CD56, etc.

La proliferación de células T en un cultivo mixto de linfocitos o en una reacción mixta de linfocitos (MLR) es un indicativo establecido de la capacidad de un compuesto para estimular el sistema inmunitario. En muchas respuestas inmunes, las células inflamatorias se infiltran en el sitio de lesión o infección. Las células que migran pueden ser neutrófilos, eosinófilos, monocitos o linfocitos, como puede determinarse mediante el estudio histológico de los tejidos afectados. Current Protocols in Immunology, ed. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.

Las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario podrían tratarse mediante la supresión de la respuesta inmune. El uso de receptores solubles y/o anticuerpos neutralizantes que inhiben moléculas con actividad estimuladora del sistema inmunitario sería beneficioso en el tratamiento de enfermedades mediadas por el sistema inmunitario e inflamatorias. Las moléculas que inhiben la respuesta inmune pueden utilizarse (directamente las proteínas o mediante el uso de anticuerpos antagonistas) para inhibir la respuesta inmune y así mejorar la enfermedad relacionada con el sistema inmunitario.

La interleucina-17 (IL-17A) se ha identificado como un ortólogo celular de una proteína codificada por el herpesvirus Saimiri (HVS) linfotrófico de células T [véase, Rouvier et al., J. Immunol., 150(12): 5445-5456 (19993); Yao et al., J. Immunol., 122 (12):5483-5486 (1995) y Yao et al., Immunity, 3(6):811-821 (1995)]. Su caracterización posterior ha demostrado que esta proteína es una potente citosina que induce respuestas proinflamatorias en una gran variedad de tejidos periféricos. La IL-17A es una citocina homodimérica unida por un puente disulfuro de aproximadamente 32 kDa que es sintetizada y secretada únicamente por las células T CD4+ de memoria activadas (revisado en Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16: 541-551 [1998]). Específicamente, la IL-17 se sintetiza como un polipéptido precursor de 155 aminoácidos con una secuencia señal N-terminal de 19-23 restos y se secreta como una glucoproteína homodimérica unida por un puente disulfuro. La IL-17A se describe en los documentos WO9518826 (1995), WO9715320 (1997) y WO9704097 (1997), así como en la patente de EE. UU. Nº

6.063.372.

A pesar de su limitada distribución tisular, la IL-17A muestra actividades biológicas pleiotrópicas en diversos tipos de células. Se ha encontrado que la IL17A estimula la producción de muchas citocinas. Induce la secreción de IL-6, IL-8, IL-12, factor inhibidor de leucemia (LIF), prostaglandina E2, MCP-1 y G-CSF por células adherentes como fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales y endoteliales. La IL-17A tiene la capacidad de inducir la expresión en superficie de ICAM-1, la proliferación de células T y el crecimiento y diferenciación de progenitores CD34+ humanos en neutrófilos. La IL-17A también se ha implicado en el metabolismo óseo y se ha sugerido que tiene un papel importante en situaciones patológicas caracterizadas por la presencia de células T activadas y la producción de TNF-alfa, como la artritis reumatoide, y en el desprendimiento de implantes óseos (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14: 1513-1521 [1999]). Se encontró que las células T activadas del tejido sinovial procedentes de pacientes con artritis reumatoide secretan cantidades superiores de IL-17A que las procedentes de personas sanas o de pacientes con osteoartritis (Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42: 963-970 [1999]). Se ha sugerido que esta citocina proinflamatoria contribuye de forma activa a la inflamación sinovial en la artritis reumatoide. Además de su función proinflamatoria, la IL-17A parece que contribuye a la patología de la artritis reumatoide mediante otro mecanismo. Por ejemplo, se ha demostrado que la IL-17A induce la expresión del ARNm del factor de diferenciación de osteoclastos (ODF) en osteoblastos (Kotake et al., J. Clin. Invest,

103: 1345-1352 [1999]). ODF estimula la diferenciación de células progenitoras en osteoclastos, las células implicadas en la resorción ósea.

Puesto que el nivel de IL-17A está significativamente elevado en el líquido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide, parece que la formación de osteoclastos inducida por IL-17A tiene un papel crucial en la resorción ósea en la artritis reumatoide. Se piensa que la IL-17A también tiene una función clave en otros determinados trastornos autoinmunes como la esclerosis múltiple (Matusevicius et al., Mult. Scler., 5: 101-104 [1999]). Adicionalmente, se ha demostrado que la IL-17A, mediante señalización intracelular, estimula la entrada de Ca2+ y la reducción en la [cAMP] en macrófagos humanos (Jovanovic et al., J. Immunol., 160:3513 [1998]). Los fibroblastos tratados con IL-17A inducen la activación de NF-κB, [Yao et al., Immunity, 3:811 (1995), Jovanovic et al., supra], mientras que los macrófagos tratados con esta interleucina activan el NF-κB y las proteína cinasas activadas por mitógeno (Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273:27467 [1998]).

Adicionalmente, la IL-17A también comparte similitud de secuencia con el factor 7 semejante a citosina de los mamíferos que está implicado en el crecimiento del hueso y del cartílago. Otras proteínas con las que los polipéptidos IL-17A comparten similitud de secuencia son el factor relacionado con interleucina derivado de embriones humano (EDIRF) y la interleucina 20.

De acuerdo con la amplia variedad de efectos de la IL-17A, se ha encontrado que el receptor en la superficie celular para la IL-17A se expresa ampliamente en muchos tejidos y tipos celulares (Yao et al., Cytokine, 9:794 [1997]). Mientras que la secuencia de aminoácidos del receptor humano de IL-17A (IL-17R) (866 aminoácidos) predice una proteína con un único dominio transmembrana y un dominio intracelular largo de 525 aminoácidos, la secuencia del receptor es única y no se asemeja a la de ningún otro receptor de la familia de receptores de citocinas/factores de crecimiento. Esto, junto con la falta de similitud de la propia IL-17A con otras proteínas conocidas, indica que la IL-17A y su receptor pueden formar parte de una nueva familia de proteínas y receptores de señalización. Se ha demostrado que la actividad de IL-17A está mediada por la unión a su receptor exclusivo de la superficie celular, mientras que estudios previos han demostrado que el contacto de células T con una forma soluble del polipéptido del receptor de IL-17A inhibe la proliferación de células T y la producción de IL-2 inducida por PHA, concanavalina A y anticuerpo monoclonal anti-TCR (Yao et al., J. Immunol., 155:5483-5486 [1995]). Por ello, existe un interés significativo en identificar y caracterizar nuevos polipéptidos que tengan homología con los receptores de citocina conocidos, específicamente, con los receptores de IL-17A.

El patrón de expresión de IL-17F parece ser similar al de IL-17A, de tal forma que incluye solo células T CD4+ y monocitos activados (Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]). Se ha demostrado que IL-17F induce G-CSF, IL6 e IL-8 en fibroblastos (Hymowitz et al., EMBO J. 20:5322-5341 [2001]) y TGF-β en células endoteliales (Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]). Recientemente se ha descrito que la IL-23, una citocina producida por células dendríticas, puede mediar en la producción tanto de IL-17A como de IL-17F, principalmente en células T de memoria (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 278:19101914 [2003]).

Además, se ha demostrado la sobreexpresión o regulación por incremento tanto de IL-17A como IL-17F en pacientes artríticos y asmáticos (revisado en Moseley et al. Cytokine Growth Factor Rev 14:155-174 [2003]). Con respecto a la artritis, estas citocinas actúan de una forma característica en la destrucción del cartílago y de la articulación que se asocia con la artritis reumatoide y la osteoartritis. Por ejemplo, se ha demostrado que la IL-17A y la IL-17F estimulan la degradación de la matriz en explantes de cartílago articular a través de la liberación de proteoglucanos y glucosaminoglucanos de cartílago y fragmentos de colágeno, mientras que inhiben la síntesis de nuevos proteoglucanos y colágenos (Cai et al. Cytokine 16:10-21 [2001]; Attur et al. Arthritis Rheum 44: 2078-2083 [2001]).

También se ha demostrado que la sobreexpresión de IL-17F en ratones, de forma similar a la IL-17A, aumenta el reclutamiento de neutrófilos en pulmón, lo que tiene como consecuencia el aumento de la expresión de citocinas asociadas a Th1 en este órgano, como IL-6, IFN-gamma, IP-10 y MIG (Starnes et al., J. Immunol.

167:

4137-4140 [2001]). La IL17-F también está regulada por incremento en células T en asmáticos expuestos a alergeno (Kawaguchi y col J. Immunol 167:4430-4435 [2001]) y se ha encontrado que induce la producción de IL-6 e IL-8 en NHBE. A diferencia de IL-17A, la IL-17F parece inhibir la angiogénesis in vitro (Starnes et al.,

J.

Immunol. 167: 4137-4140 [2001])

El ARNm de IL-17F no se detectó mediante transferencia de tipo Northern en diversos tejidos humanos, pero se inducía considerablemente tras la activación de las células T CD4+ y de monocitos. Id. En ratones, se ha encontrado que las células Th2 y los mastocitos expresan IL-17F tras su activación. Véase Dumont, Expert Opin. Ther. Patents 13(3) (2003). Al igual que IL-17A, también se ha encontrado en el ratón que la expresión de IL-17F está regulada por incremento por la IL-23.

Las familias de citocina/receptor de IL-17 parecen representar un sistema de señalización único dentro de la red de citocinas que ofrecerá estrategias innovadoras para la manipulación de las respuestas inmunitaria e inflamatoria. En consecuencia, la presente invención se basa en el descubrimiento de un nuevo receptor de la familia de IL-17, IL-17RC y su capacidad para unirse tanto a IL-17A como a IL-17F.

Así pues, los antagonistas de la actividad de IL-17F e IL-17A, como los receptores IL-17RC solubles y anticuerpos dirigidos frente a ellas, incluyendo los anticuerpos monoclonal y neutralizante anti-IL-17RC humano de la presente invención, son útiles para el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, especialmente como antagonistas frente a IL-17F e IL-17A por separado o juntos en el tratamiento de la psoriasis. Además, los antagonistas de la actividad de IL-17F, como los receptores IL-17RC solubles y anticuerpos frente a ella, como los anticuerpos monoclonal y neutralizante anti-IL-17RC humano de la presente invención, son útiles para el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la IL-17F y la IL-17A (por separado o juntas) en el tratamiento de la dermatitis atópica y de contacto, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis, endotoxemia, artritis, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad respiratoria del adulto (ERA), choque séptico, fallo multiorgánico, lesión inflamatoria del pulmón como asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hipersensibilidad de las vías respiratorias, bronquitis crónica, asma alérgico, neumonía bacteriana, psoriasis, eccema y enfermedad inflamatoria intestinal, como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, infección por Helicobacter pylori, adhesiones intraabdominal y/o abscesos como consecuencia de inflamación peritoneal (es decir, por infección, lesión, etc.), lupus eritematoso sistémico (LES), esclerosis múltiple, esclerosis sistémica, síndrome nefrótico, rechazo de alotrasplante de órgano, enfermedad de injerto contra huésped (GVHD), rechazo de trasplante de riñón, pulmón, corazón, etc., artritis inducida por pared celular estreptocócica (PCE), osteoartritis, gingivitis/ periodontitis, queratitis estromal herpética, cáncer, como cáncer de próstata, renal, de colon, de ovarios, de cuello uterino, leucemia, angiogénesis, restenosis y enfermedad de Kawasaki.

Las subunidades de los receptores de citocinas se caracterizan por una estructura en múltiples dominios que consta de un dominio de unión a ligando y un dominio efector que normalmente está implicado en la transducción de señales. Los receptores multiméricos de citocinas comprenden monómeros, homodímeros (p. ej., las isoformas αα y ββ del receptor de PDGF, el receptor de la eritropoyetina, MPL [receptor de trombopoyetina] y el receptor de G-CSF), heterodímeros cuyas subunidades tienen cada una dominios de unión a ligando y efector (p. ej., la isoforma αβ del receptor de PDGF) y multímeros que tienen subunidades componentes con funciones dispares (p. ej., los receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 y GM-CSF). Algunas subunidades de receptores son comunes a muchos receptores. Por ejemplo, la subunidad AIC2B, que no puede unirse al ligando por sí misma pero tiene un dominio intracelular de transducción de señales, es un componente del receptor de IL-3 y del de GM-CSF. Muchos receptores de citocinas pueden encuadrarse en una de las cuatro familias relacionadas en función de su estructura y función. Los receptores hematopoyéticos de clase I, por ejemplo, se caracterizan por la presencia de un dominio que contiene restos conservados de cisteína y el motivo WSXWS (SEC ID Nº 10). Determinados receptores hematopoyéticos presentan dominios adicionales, como los dominios proteína cinasa, dominios de fibronectina de tipo III y dominios de inmunoglobulina, que se caracterizan por lazos unidos por puentes disulfuro. La estructura de los receptores de citocinas ha sido revisada por Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991 y Cosman, Cytokine 5:95-106, 1993. Generalmente se considera que bajo presión selectiva para que los organismos adquieran nuevas funciones biológicas, surgen nuevos miembros de las familias de receptores por duplicación de genes de receptores ya existentes, lo que conduce a la existencia de familias de multigenes. Por tanto, los miembros de la familia contienen vestigios del gen ancestral y estos aspectos característicos se pueden explotar en el aislamiento e identificación de miembros adicionales de dicha familia.

La presente invención proporciona un polipéptido receptor aislado soluble que consta de una secuencia de aminoácidos como la mostrada en los restos 21 a 467 de la SEC ID Nº 68 y los usos del receptor soluble. La presente invención también proporciona el polipéptido receptor soluble de la presente invención para uso en enfermedades inflamatorias y autoinmunes humanas. El polipéptido del receptor soluble de la presente invención se puede usar para bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-17F o IL-17A o ambas IL-17A e IL-17F, en el tratamiento de la inflamación y enfermedades inflamatorias como la psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, endotoxemia, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis, asma, rechazo de aloinjerto, enfermedades renales mediadas por el sistema inmunitario, enfermedades hepatobiliares, esclerosis múltiple, ateroesclerosis, estimulación del crecimiento tumoral o enfermedad articular degenerativa y otras afecciones inflamatorias descritas en el presente documento.

Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y el polipéptido receptor soluble de la presente invención.

Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes tras la referencia a la siguiente descripción detallada.

B) Definiciones

En la descripción que sigue se usan ampliamente varios términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar el entendimiento de la invención.

Un "polipéptido” es un polímero de restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea producido de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 restos de aminoácidos se denominan normalmente “péptidos”.

Una “proteína” es una macromolécula que consta de una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también pueden constar de componentes no peptídicos, como grupos de hidratos de carbono. La célula en la que se produce la proteína puede añadir hidratos de carbono y otros sustituyentes no peptídicos, lo que variará con el tipo de célula. Las proteínas se definen en el presente documento en términos de sus estructuras de la cadena principal de aminoácidos; generalmente no se especifican los sustituyentes como grupos de hidratos de carbono, pero no obstante, pueden estar presentes.

Un péptido o un polipéptido codificado por una molécula de ADN que no es del hospedador son un péptido o polipéptido "heterólogo”.

Una “proteína de fusión” es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede contener al menos parte de un polipéptido de IL-17RC fusionado con un polipéptido que se une a una matriz de afinidad. Dicha proteína de fusión proporciona un medio para aislar cantidades grandes de IL-17RC mediante cromatografía de afinidad.

El término “receptor” indica una proteína asociada a la célula que se une a una molécula bioactiva denominada “ligando”. Esta interacción media en el efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden estar unidos a membrana, ser citosólicos o nucleares, ser monoméricos (p. ej., receptor de la hormona estimulante de tiroides o receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (p. ej., receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-6). Los receptores unidos a membrana se caracterizan por una estructura de múltiples dominios que consta de un dominio extracelular de unión a ligando y un dominio efector intracelular que normalmente está implicado en la transducción de señales. En determinados receptores unidos a membrana, el dominio extracelular de unión a ligando y el dominio intracelular efector se localizan en polipéptidos distintos que constituyen el receptor funcional completo.

En general, la unión del ligando al receptor tiene como resultado un cambio conformacional en el receptor que causa una interacción entre el dominio efector y otras moléculas de la célula, lo que a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los acontecimientos metabólicos que a menudo están asociados con las interacciones receptor-ligando son la transcripción génica, la fosforilación, la defosforilación, el aumento de la producción de AMP cíclico, la movilización del calcio celular, la movilización de los lípidos de membrana, la adhesión celular, la hidrólisis de lípidos inositol y la hidrólisis de fosfolípidos.

Un “receptor soluble” es un polipéptido receptor que no se une a la membrana celular. Los receptores solubles son con mayor frecuencia polipéptidos receptores de unión a ligando a los que les faltan los dominios transmembrana y citoplásmico, y otros enlaces con la membrana celular como aquellos a través de glucofosfoinositol (GPI). Los receptores solubles pueden contener restos de aminoácidos adicionales, como etiquetas de afinidad que facilitan la purificación del polipéptido o proporcionan sitios para la unión del polipéptido a un sustrato, o secuencias de la región constante de la inmunoglobulina. Muchos receptores de la membrana celular tienen equivalentes solubles naturales que se producen por proteolisis o se traducen a partir del corte y empalme alternativo de los ARNm. Los receptores solubles pueden ser monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos, no conteniendo los receptores multiméricos generalmente más de 9 subunidades, preferiblemente no conteniendo más de 6 unidades y más preferiblemente, no conteniendo más de 3 subunidades. Se dice que los polipéptidos receptores están sustancialmente libres de segmentos polipeptídicos transmembrana e intracelular cuando carecen de porciones suficientes de estos segmentos que les proporcionen anclaje en la membrana o transducción de la señal, respectivamente. Los receptores solubles de citocinas generalmente contienen el dominio de unión a citocinas extracelular sin dominio transmembrana ni dominio intracelular. Por ejemplo, entre los receptores solubles representativos se incluyen receptores solubles para IL-17R como se muestra en la SEC ID Nº 21. Está bien dentro del nivel de los expertos en la técnica delimitar qué secuencias de una secuencia de receptor de citocina conocida contiene el dominio de unión a citocinas extracelular sin dominio transmembrana y dominio intracelular. Además, un experto en la técnica utilizando el código genético puede determinar fácilmente polinucleótidos que codifiquen dichos polipéptidos receptores solubles.

La expresión “secuencia señal secretora” indica una secuencia de ADN que codifica un péptido (un “péptido secretor”) que, como componente de un polipéptido más largo, dirige al polipéptido más largo a través de la ruta secretora de la célula en la que se sintetiza. Normalmente, el polipéptido más largo se escinde para eliminar el péptido secretor durante su tránsito a través de la ruta secretora.

Un “polipéptido aislado” es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, como hidratos de carbono, lípidos u otras impurezas proteicas asociadas con el polipéptido en estado natural. Típicamente, una preparación de un polipéptido aislado contiene el polipéptido en forma altamente purificada, es decir, al menos aproximadamente puro al 80%, al menos aproximadamente puro al 90%, al menos aproximadamente puro al 95%, puro a más del 95%, tal como al 96%, 97% o 98% o más puro, o puro a más del 99%. Una forma de mostrar que una preparación proteica en particular contiene un polipéptido aislado es la aparición de una única banda tras la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS) de la preparación proteica y la tinción del gel con azul brillante de Coomassie. Sin embargo, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, como dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas.

Las expresiones “amino terminal” y “carboxilo terminal” se usan en este documento para indicar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estas expresiones se utilizan en referencia a una secuencia o porción en particular de un polipéptido para indicar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia colocada en posición carboxilo terminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido se localiza próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no necesariamente en el extremo carboxílico del polipéptido completo.

El término “expresión” se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión supone transcripción del gen estructural a ARNm y la traducción del ARNm a uno o más polipéptidos.

Como se usa en este documento, el término "inmunomodulador" incluye citocinas, factores de crecimiento de células madre, linfotoxinas, moléculas estimuladora simultáneas, factores hematopoyéticos y similares, y análogos sintéticos de estas moléculas.

La expresión “par complemento/anticomplemento” indica restos no idénticos que forman un par estable asociado de forma no covalente en las condiciones apropiadas. Por ejemplo, biotina y avidina (o estreptavidina) son miembros prototipo de un par complemento/anticomplemento. Otros ejemplos de pares complemento/anticomplemento son los pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítope), pares de polinucleótidos sentido/complementario y similares. Cuando se desea la posterior disociación del par complemento/anticomplemento, dicho par complemento/anticomplemento, tiene preferiblemente una afinidad de unión menor de 109 M-1 .

Un “polipéptido diana” o “péptido diana” es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un epítope y que se expresa en una célula diana, como una célula tumoral, o una célula portadora de un antígeno de un agente infeccioso. Las células T reconocen epítopes peptídicos presentados por una molécula del complejo principal de histocompatibilidad a un polipéptido diana o péptido diana y, típicamente, lisan la célula diana o reclutan a otras células inmunes al lugar de la célula diana, matando de este modo a la célula diana.

Un “péptido antigénico” es un péptido al cual se une una molécula del complejo principal de histocompatibilidad para formar un complejo MHC-péptido que es reconocido por una célula T, induciendo de este modo una respuesta linfocítica citotóxica tras su presentación a la célula T. Por tanto, los péptidos antigénicos son capaces de unirse a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad e inducir una respuesta de células T citotóxicas, como lisis celular o liberación de citocinas específicas frente a la célula diana que se une o exprese el antígeno. El péptido antigénico puede unirse en el contexto de una molécula del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y II, en una célula presentadora de antígeno o en la célula diana.

Debido a la imprecisión de los procedimientos analíticos convencionales, se entiende que los pesos moleculares o las longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando este valor se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, el valor establecido de X se entenderá como exacto ± 10%.

E) Producción de polipéptidos IL-17RC

Los polipéptidos de la presente invención, incluyendo polipéptidos de longitud completa; receptores solubles monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos; receptores de longitud completa; fragmentos de receptores (p. ej., fragmentos de unión a ligando y epítopes antigénicos); fragmentos funcionales y proteínas de fusión, pueden producirse en células hospedadoras recombinantes siguiendo técnicas convencionales. Para expresar un gen IL-17RC, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido debe estar unida de forma operativa a secuencias reguladores que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y, a continuación, ser introducidas en una célula hospedadora. Además de las secuencias reguladoras transcripcionales, como promotores y potenciadores, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras transcripcionales y un gen marcador que sea adecuado para la selección de células portadoras del vector de expresión.

Los vectores de expresión que son adecuados para la producción de una proteína extraña en células eucariotas típicamente contienen (1) elementos de ADN procariota que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos que proporcionan el crecimiento y selección del vector de expresión en un hospedador bacteriano; (2) elementos de ADN eucariota que controlan el inicio de la transcripción, como un promotor y (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcriptos, como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. Como se describe anteriormente, los vectores de expresión también pueden incluir secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia secretora que dirige al polipéptido heterólogo dentro de la ruta secretora de una célula hospedadora. Por ejemplo, un vector de expresión de IL-17RC puede comprender un gen IL-17RC y una secuencia secreta derivada de cualquier gene secretado.

El polipéptido de la presente invención puede expresarse en células de mamífero. Son ejemplos de células hospedadores de mamíferos las células de riñón de mono verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células embrionarias de riñón humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de cría de hámster (BHK-21, BHK-570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón de perro (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células de pituitario de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embriónicas murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658);

En el caso de un hospedador mamífero, las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden derivar de fuentes virales de mamíferos, por ejemplo, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simios o similares, en las que las señales reguladoras se asocian con un gen en particular que tiene un alto nivel de expresión. Las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales adecuadas también pueden obtenerse de genes de mamíferos, por ejemplo, genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneina.

Entre las secuencias reguladoras transcripcionales se incluyen una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis de ARN. Entre los promotores eucariotas adecuados se incluyen el promotor del gen de la metalotioneina I de ratón (Hamer et al. J. Molec. Appl. Genet. 1:273 (1982)), el promotor TK de herpevirus (McKnight, Cell 31:355 (1982)), el promotor temprano de SV40 (Benoist et al., Nature 290:304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 79:6777 (1982)), el promotor del citomegalovirus (Foecking et al., Gene 45:101 (1980)) y el promotor del virus del tumor mamario de ratón (véase, en general, Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

Alternativamente, puede utilizarse un promotor procariota como promotor de la ARN polimerasa T3 de bacteriófago, para controlar la expresión génica en células de mamífero si el promotor procariota está regulado por un promotor eucariota (Zhou et al., Mol. Cell. Biol. 10:4529 (1990) y Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19:4485 (1991)).

En determinadas realizaciones, una secuencia de ADN que codifica el polipéptido receptor soluble, o un fragmento del polipéptido, se une de forma operativa a otros elementos genéticos necesarios para su expresión, incluyendo generalmente un promotor y un terminador de transcripción, dentro de un vector de expresión. Normalmente, el vector también contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que determinados sistemas marcadores seleccionables pueden proporcionarse en vectores distintos y la replicación del ADN exógeno se puede proporcionar mediante la integración en el genoma de la célula hospedadora. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es cuestión del diseño de rutina a nivel de un experto normal en la técnica. Muchos de estos elementos se describen en la literatura y están disponibles en casas comerciales. Múltiples componentes de un complejo receptor soluble pueden transfectarse conjuntamente en vectores de expresión individuales

o estar contenidos en un único vector de expresión. Estas técnicas de expresión de los componentes múltiples de complejos proteicos son bien conocidas en la técnica.

Un vector de expresión puede introducirse en las células hospedadoras usando diversas técnicas convencionales como transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por liposomas, administración mediada por microproyectiles, electroporación y similares. Las células transfectadas pueden seleccionarse y propagarse para proporcionar células hospedadoras recombinantes que contengan el vector de expresión integrado de forma estable en el genoma de la célula hospedadora. Las técnicas para introducir vectores en células eucarióticas y las técnicas para la selección de estos transformantes estables usando un marcador seleccionable dominante se describen, por ejemplo, en Ausubel (1995) y en Murray (ed.), Gene Transfer and Expression Protocols (Humana Press 1991).

Por ejemplo, un marcador seleccionable adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, la selección se lleva a cabo en presencia de un fármaco del tipo de la neomicina, como G-418 o similares. También se pueden usar sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso denominado “amplificación”. La amplificación se realiza cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y, a continuación, aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen niveles altos de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable adecuado es la dihidrofolato reductasa (DHFR), que confiere resistencia a metotrexato. También se pueden usar otros genes de resistencia a fármacos (p. ej., resistencia a higromicina, resistencia múltiple a fármacos, puromicina acetiltransferasa). Alternativamente, se pueden usar marcadores que introducen un fenotipo alterado, como la proteína fluorescente verde, o proteínas de la superficie celular, como CD4, CD8, MHC de clase I o fosfatasa alcalina de placenta para separar células transfectadas de células no transfectadas por sistemas como separación por FACS o tecnología de separación de perlas magnéticas.

Los polipéptidos también pueden obtenerse mediante el cultivo de células de mamífero usando un sistema de administración vírico. Entre los ejemplos de virus para este fin se incluyen adenovirus, retrovirus, herpesvirus, virus de la variolovacuna y virus adenoasociados (AAV). El adenovirus, un virus de ADN de cadena doble, es actualmente el vector de transferencia de genes mejor estudiado para la administración de ácidos nucleicos heterólogos (para revisión, véase Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161 (1994) y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4:44 (1997)). Son ventajas del sistema adenovirus la acomodación de inserciones de ADN relativamente largos, la capacidad de crecimiento hasta valores altos, la capacidad de infectar una amplia gama de tipos de células de mamífero y la flexibilidad que permite su uso con un gran número de vectores que contienen promotores diferentes.

Mediante la deleción de porciones del genoma del adenovirus, pueden acomodarse inserciones más largas (hasta de 7 kb) de ADN heterólogo. Estas inserciones pueden incorporarse en el ADN viral mediante ligamiento directo o recombinación homóloga con un plásmido transfectado conjuntamente. Una opción es la deleción del gen E1 esencial del vector viral, lo que da lugar a la incapacidad para replicarse a no ser que la célula hospedadora le proporcione el gen E1. Las células 293 humanas infectadas con el vector de adenovirus (ATCC Nº CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, pueden crecerse como células adherentes o en cultivo en suspensión a una densidad celular relativamente alta para producir cantidades significativas de proteína (véase, Garnier et al., Cytotechnol. 15:145 (1994)).

El polipéptido también puede expresarse en otras células eucariotas superiores, como células de aves, hongos, insectos, levaduras o vegetales. El sistema baculovirus proporciona un medio eficaz para introducir genes de IL-17RC clonados en células de insectos. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) y contiene promotores bien conocidas como el promotor 70 de la proteína de choque térmico (hsp) de Drosophila, el promotor del gen temprano inmediato (ie-1) y el promotor temprano retrasado 39K del virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica, promotor p10 de baculovirus y el promotor de metalotioneina de Drosophila. Un segundo método para obtener baculovirus recombinantes utiliza un sistema a base de transposones descrito por Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67:4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se vende en el kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que codifica el polipéptido dentro del genoma del baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande denominado “bácmido”. Véase, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551 (1994) y Chazenbalk, y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión en marco con ADN que codifica una etiqueta de epítopes en los extremos C o N-terminales del polipéptido expresado, por ejemplo, una etiqueta epítope Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nat'I Acad. Sci. 82:7952 (1985)). Usando un procedimiento conocido en la técnica, se transforma en E. coli un vector de transferencia que contiene un gen que codifica un polipéptido y se analiza la presencia de bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido indicativo de baculovirus recombinantes. A continuación, el ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla usando técnicas normales.

El vector PFASTBAC ilustrativo puede modificarse en grado considerable. Por ejemplo, puede eliminarse el promotor de la polihedrina y sustituirse por el promotor de la proteína básica de baculovirus (también conocido como promotor Pcor, p.69 o MP) que se expresa más temprano en la infección por baculovirus y se ha demostrado que presenta ventajas para la expresión de proteínas secretadas (véase, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71:971 (1990), Bonning, et al. J. Gen. Viro). 75:1551 (1994) y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543 (1995). En estas construcciones de vectores de transferencia, se puede usar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, pueden construirse vectores de transferencia en los que las secuencias señal secretoras nativas se sustituyen por secuencias señal secretoras derivadas de proteínas de insecto. Por ejemplo, se puede usar una secuencia señal secretora de la ecdisteroide glucosiltransferasa (EGT), la melitina de abeja (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) o del baculovirus gp67 (PharMingen: San Diego, CA) en construcciones para sustituir la secuencia señal secretora de IL-17RC nativa.

El virus o bácmido recombinante se usa para transfectar células hospedadores. Entre las células hospedadoras de insecto adecuadas se incluyen líneas celulares derivadas de IPLB-Sf 21, una célula de ovario de pupa de Spodoptera frigiperda, como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA), así como células Schneider-2 de Drosophila y la línea celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de EE.UU. Nº 5.300.435). Se pueden usar medios sin suero disponibles en el mercado para crecer y mantener las células. Son medios adecuados Sf900 IITM (Life Technologies) o ESF 921TM (Expression Systems) para las células Sf9 y ExcelIOP405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se usa un virus recombinante, las células se crecen típicamente hasta una densidad de inoculación de aproximadamente 2-5 x 105 células a una densidad de 1-2 x 106 células, en cuyo momento se añade una solución madre del virus recombinante a una multiplicidad de infección (MDI) de 0,1 a 10, más típicamente próxima a 3.

Las técnicas establecidas para la producción de proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus se proporciona en Bailey et al., "Manipulation of Baculovirus Vectors," en Methods in Molecular Biology, Volumen 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), páginas 147-168 (The Humana Press, Inc. 1991 ), en Patel et al., “The baculovirus expression system" en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.), páginas 205-244 (Oxford University Press 1995), en Ausubel (1995) páginas 16-37 a 16-57, en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995) y en Lucknow, "Insect Cell Expression Technology," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

También se pueden usar células fúngicas, incluso células de levadura, para expresar los genes descritos en este documento. Las especies de levaduras de especial interés a este respecto son Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Entre los promotores adecuados para la expresión en levaduras se incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato cinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa) y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación de levaduras y están fácilmente disponibles. Entre estos vectores se incluyen vectores basados en YIp, como YIp5, vectores YRp, como YPp17, vectores YEp como YEp13 y vectores YCp como YCp19. Los procedimientos para la transformación de células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producción de polipéptidos recombinantes a partir de este se describen, por ejemplo en Kawasaki, patente de EE.UU. Nº 4.599.311, Kawasaki et al., patente de EE.UU. Nº 4.931.373, Brake, patente de EE.UU. Nº 4.870,008, Welch et al., patente de EE.UU. Nº 5.037.743 y Murray et al., patente de EE.UU. Nº 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan mediante el fenotipo determinado por el marcador seleccionable, normalmente de resistencia a fármacos, o por su capacidad para crecer en ausencia de un nutriente en particular

(p. ej., leucina). Un sistema de vector adecuado para uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vector POT1 descrito por Kawasaki et al. (patente de EE.UU. Nº 4.931.373) que permite que las células transformadas se seleccionen mediante crecimiento en medios que contienen glucosa. Promotores y terminadores adecuados adicionales para uso en levadura son aquellos de los genes de enzimas glucolíticas (véase, por ejemplo Kawasaki, patente de EE.UU. Nº 4.599.311, Kingsman et al., patente de EE.UU. Nº 4.615.974 y Bitter, patente de EE. UU. Nº 4.977.092) y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véase también las patentes de EE.UU. Nº 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 y 4.661.454.

En la técnica se conocen sistemas de transformación para otras levaduras, como los de Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltose. Véase, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459 (1986) y Cregg, patente de EE.UU. Nº 4.882.279. Las células de Aspergillus pueden utilizarse según los procedimientos de McKnight et al., patente de EE.UU. Nº 4.935.349. Los procedimientos para la transformación de Acremonium chrysogenum se describen en Sumino et al., patente de EE.UU. Nº

5.162.228. Los procedimientos para transformar Neurospora se describen en

Lambowitz, patente de EE.UU. Nº 4.486.533. Por ejemplo, el uso de Pichia methanolica como hospedador para la producción de proteínas recombinantes se describe en Raymond, patente de EE.UU. Nº 5.716.808, Raymond, patente de EE.UU. Nº 5.736.383, Raymond et al., Yeast 14:11-23 (1998) y en las publicaciones internacionales Nº WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN utilizadas en la transformación de P. methanolica se prepararán frecuentemente como plásmidos circulares de doble cadena que, preferiblemente, se linealizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el terminador en el plásmido pueden ser los de un gen de P. methanolica, como el gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles son los de los genes de la dihidroxiacetona sintetasa (DHAS), formato deshidrogenasa (FMD) y catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma hospedador, se prefiere tener el segmento de expresión completo del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN del hospedador. Un marcador seleccionable adecuado para uso en Pichia methanolica es el gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21) y que permite a las células hospedadoras ade2 crecer en ausencia de adenina. En procesos industriales a gran escala, donde es deseable minimizar el uso de metanol, se pueden usar células hospedadoras en las que se han eliminados ambos genes de utilización de metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas secretadas, las células hospedadores pueden ser deficientes en genes de proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). La electroporación se usa para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Las células de P. methanolica pueden transformarse mediante electroporación usando un campo eléctrico pulsado con extinción exponencial que tenga una fuerza de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferiblemente de aproximadamente 3,75 kV/cm y una constante de tiempo (t) de 1 a 40 milisegundos, más preferiblemente de aproximadamente 20 milisegundos.

Los vectores de expresión también pueden introducirse en protoplastos vegetales, tejidos vegetales intactos o células vegetales aisladas. Entre los procedimientos para introducir vectores de expresión en tejidos vegetales se incluyen infección directa o cultivo conjunto de tejidos vegetales con Agrobacterium tumefaciens, administración mediante microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y similares. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science 227:1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10:268 (1992) y Miki et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993).

Alternativamente, los genes pueden expresarse en células hospedadoras procariotas. Los promotores adecuados que se pueden usar para expresar los polipéptidos en un hospedador procariota son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL del bacteriófago lambda, los promotores de trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, lpp-lacSpr, phoA y lacA de E. coli, promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago lambda, el promotor bla de pBR322 y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol acetil transferasa. Los promotores procariotas han sido revisados por Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4ª Ed. (Benjamin Cummins 1987) y Ausubel et al. (1995).

Los hospedadores procariotas adecuados son E. coli y Bacillus subtilus. Entre las cepas de E. coli adecuadas se incluyen BL21 (DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH41, DH5, DH51, DH51F’, DH51MCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilis son BR151, YB886, MI119, MI120 y B 170 (véase, por ejemplo, Hardy, "Bacillus Cloning Methods," en DNA Cloning A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).

Cuando se expresa el polipéptido en una bacteria como E. coli, el polipéptido puede permanecer en el citoplasma, típicamente como gránulos insolubles, o puede dirigirse al espacio periplásmico mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan y los gránulos se recuperan y desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. A continuación, el polipéptido desnaturalizado puede replegarse y dimerizarse diluyendo el producto desnaturalizado, como por ejemplo mediante diálisis frente a una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguido de diálisis frente a un tampón fosfato salino. En el segundo caso, el polipéptido puede recuperarse del espacio periplásmico en forma soluble y funcional rompiendo las células (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, evitando de este modo la necesidad de desnaturalización y replegamiento.

Los procedimientos para la expresión de proteínas en hospedadores procariotas son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995), Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995) y Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), página 101 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

Los procedimientos convencionales para introducir vectores de expresión en bacterias, levaduras, insectos y células vegetales se proporcionan, por ejemplo, en Ausubel (1995).

Los procedimientos generales para la expresión y recuperación de proteínas extrañas producidas por un sistema celular de mamífero se proporcionan, por ejemplo, en Etcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture," en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), página 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996). Las técnicas convencionales para la recuperación de proteínas producidas por un sistema bacteriano se proporcionan, por ejemplo, en Grisshammer et al., "Purification of overproduced proteins from E. coli cells," en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª Edición, Glover et al. (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press 1995). Los procedimientos establecidos para el aislamiento de proteínas recombinantes a partir de un sistema de baculovirus se describen en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc. 1995).

Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención pueden sintetizarse mediante síntesis exclusiva en fase sólida, procedimientos parciales en fase sólida, condensación de fragmentos o síntesis clásica en solución. Estos procedimientos de síntesis son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2ª Edición), (Pierce Chemical Co. 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis A Practical Approach (IRL Press 1989), Fields y Colowick, "Solid-Phase Peptide Synthesis," Methods in Enzymology Volumen 289 (Academic Press 1997) y Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc. 1997)). Son también convencionales las variaciones en las estrategias de síntesis química total, como "ligamiento químico nativo” y “ligamiento de proteínas expresadas” (véase, por ejemplo, Dawson et al., Science 266:776 (1994), Hackeng et al., Proc Nat'I Acad Sci. USA 94:7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol. 287: 34 (1997), Muir y col, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:6705 (1998) y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273:16205 (1998)).

Adicionalmente, el polipéptido de la presente invención puede expresarse como monómeros, homodímeros, heterodímeros o multímeros dentro de células eucariotas superiores.

F) Producción de proteínas de fusión y conjugados de IL-17RC

El polipéptido de la presente invención tiene usos tanto in vivo como in vitro. Como ilustración, el polipéptido puede añadirse al medio de cultivo celular para inhibir los efectos del ligando de IL-17RC (es decir, IL-17F, IL-17A o ambas) producido por las células cultivadas.

Las proteínas de fusión del polipéptido de la presente invención se pueden usar para expresar el polipéptido en un hospedador recombinante y para aislar el polipéptido producido. Como se describe a continuación, también se han usado proteínas de fusión polipeptídicas especiales en diagnóstico y tratamiento. Un tipo de proteína de fusión comprende un péptido que guía el polipéptido desde una célula hospedadora recombinante. Para dirigir el polipéptido dentro de la ruta secretora de una célula hospedadora eucariota, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como péptido señal, secuencia líder, secuencias prepro o pre secuencia) en el vector de expresión. Mientras que la secuencia señal secretora puede derivar de IL-17RC, la secuencia señal adecuada también puede derivar de otra proteína secretada o sintetizada de novo. La secuencia señal secretora se une de forma operativa a la secuencia polipeptídica codificadora, de modo que las dos secuencias se ligan en el marco de lectura correcto y se colocan para dirigir el polipéptido recién sintetizado dentro de la ruta secretora de la célula hospedadora. Las secuencias señal secretoras normalmente se colocan en posición 5’ de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias señal secretoras puede colocarse en cualquier lugar de la secuencia de nucleótidos de interés (véase por ejemplo, Welch et al., patente de EE.UU. Nº 5.037.743; Holland et al., patente de EE.UU. Nº 5.143.830).

Aunque la secuencia señal secretora del polipéptido o de otra proteína producida por células de mamíferos (p. ej., secuencia señal del activador de plasminógeno de tejido, como se describe, por ejemplo en la patente de EE.UU. Nº 5.641.655) es útil para la expresión del polipéptido en hospedadores mamíferos recombinantes, se prefiere una secuencia señal de levadura para la expresión en células de levadura. Ejemplos de secuencias señal de levadura adecuadas son las derivadas del factor-α feromona de apareamiento de levaduras (codificado por el gen MFα1), invertasa (codificada por el gen SUC2) o la fosfatasa ácida (codificada por el gen PHO5) Véase, por ejemplo, Romanos et al., “Expression of cloned genes in yeast” en DNA Cloning 2: A Practical Approach, 2ª Edición, Glover y Flames (eds.), páginas 123-167 (Oxford University Press 1995).

Se prefiere dirigir la exportación del polipéptido desde la célula hospedadora uniendo el ADN que codifica el polipéptido a un segundo segmento de ADN que codifica un péptido secretor, como un péptido secretor t-PA. Para facilitar la purificación del dominio receptor secretado, puede fusionarse con el polipéptido receptor una extensión C-terminal, como una etiqueta de polihistidina, sustancia P, un péptido “Flag” (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-1210, (1988); disponible de Eastman Kodak Co., New Haven, CT) u otro polipéptido o proteína para el que se dispone de un anticuerpo u otro agente de unión específico.

El polipéptido de la presente invención puede comprende restos poliméricos solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Entre los polímeros solubles en agua adecuados se incluyen polietilénglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono(C110)alcoxi-PEG, ariloxi-PEG, poli-(N-vinil pirrolidona)PEG, tresilmonometoxi PEG, PEG propionaldehido, bis-succinimidil carbonato PEG, homopolímeros de propilénglicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (p. ej., glicerol), alcohol de polivinilo, dextrano, celulosa u otros polímeros a base de hidratos de carbono. El PEG adecuado puede tener un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60.000 incluyendo, por ejemplo 5.000, 12.000, 20.000 y 25.000.

G) Aislamiento de polipéptidos

Los polipéptidos de la presente invención pueden purificarse al menos a una pureza de aproximadamente el 80%, al menos a una pureza de aproximadamente el 90%, al menos a una pureza de aproximadamente el 95%, o más del 95%, como el 96, 97, 98%, o una pureza mayor del 99% con respecto a macromoléculas contaminantes, especialmente otras proteínas y ácidos nucleicos y sin agentes infecciosos y pirógenos. Los polipéptidos de la presente invención también pueden purificarse hasta un estado farmacéuticamente puro, que esté puro a más del 99,9%. En determinadas preparaciones, el polipéptido purificado está sustancialmente libre de otro polipéptidos, especialmente de otros polipéptidos de origen animal. J) Usos terapéuticos de polipéptidos con actividad IL-17RC

Las secuencias de aminoácidos que tienen actividad IL-17RC soluble se pueden usar para modular el sistema inmunitario mediante la unión de IL-17RC a los ligandos IL-17A e IL-17F (bien por separado o juntas) y, por tanto, prevenir la unión del ligando de IL-17RC con el receptor endógeno IL-17RC. Los antagonistas de IL-17RC, como IL-17RC soluble o anticuerpos anti-IL-17RC también se pueden usar para modular la respuesta inmunitaria mediante la inhibición de la unión del ligando de IL-17RC con el receptor IL-17RC endógeno. Por lo tanto, la presente invención incluye el uso del polipéptido soluble de la presente invención en un sujeto que carece de una cantidad adecuada de este polipéptido, o que produce un exceso de ligando IL-17RC. El polipéptido de la presente invención también se puede usar para tratar a un sujeto que produce un exceso de ligando de IL-17RC o de IL-17RC. Los sujetos adecuados son mamíferos, como seres humanos. Por ejemplo, el polipéptido es útil para unirse, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar IL-17F e IL-17A (por separado o juntas) en el tratamiento de la inflamación y de enfermedades inflamatorias como la psoriasis, artritis psoriásica, artritis reumatoide, endotoxemia, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis, asma, rechazo de aloinjerto, enfermedades renales mediadas por el sistema inmunitario, enfermedades hepatobiliares, esclerosis múltiple, ateroesclerosis, estimulación del crecimiento tumoral o enfermedad articular degenerativa y otras afecciones inflamatorias descritas en el presente documento.

Dentro de las realizaciones preferidas, el polipéptido receptor soluble de la presente invención es un monómero, homodímero, heterodímero o multímero que se une, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza IL-17F e IL-17A (por separado o juntos) in vivo.

El análisis de la distribución tisular del ADNc de IL-17RC correspondiente al ARNm mostró que el ARNm del gen IL-17RC se expresa mucho en los tejidos tiroideo, de la glándula adrenal, de próstata y hepático, y se expresa en menor grado en los tejidos del corazón, intestino delgado, estómago y tráquea. En particular, IL-17RC se expresa de forma constante en líneas de células de sangre periférica distintas a células T, como monocitos, células B y células de la línea mieloide. También, el ARNm de IL-17RC se expresa con fiabilidad en líneas celulares derivadas de la piel. Otras líneas celulares que expresan IL-17RC son las 5 líneas celulares del intestino grueso que estaban presentes en la matriz. Por el contrario, se observa una pequeña expresión o ausencia de la misma, en cerebro, placenta, pulmón, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovario, colon, leucocitos de sangre periférica, médula espinal, ganglio linfático y médula ósea. El ligando al cual se une IL-17RC (IL-17F y/o IL-17A) está implicado en la inducción de la respuesta inflamatoria y contribuye a enfermedades inflamatorias, principalmente a través de su capacidad para potenciar la producción de mediadores inflamatorios, como IL-1b, IL-6 y TNF-α, así como aquellos mediadores implicados en la proliferación, maduración y quimiotaxis de neutrófilos (revisado en Witowski et al., Cell. Mol. Life Sci. 61:567-579 [2004]).

Por tanto, las realizaciones particulares de la presente invención se dirigen hacia el uso del polipéptido de la presente invención como un antagonista en enfermedades o afecciones inflamatorias e inmunes como psoriasis, artritis psoriásica, dermatitis atópica, afecciones inflamatorias cutáneas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, diverticulosis, asma, pancreatitis, diabetes de tipo 1 (DMDI), cáncer pancreático, pancreatitis, enfermedad de Graves, cáncer de colon e intestinal, enfermedad autoinmune, sepsis, trasplante de órgano o de médula ósea; inflamación debido a endotoxemia, traumatismo, cirugía o infección; amiloidosis; esplenomegalia; enfermedad injerto contra huésped y donde la inhibición de la inflamación, supresión inmune, reducción de la proliferación de células hemapoyéticas, inmunes, inflamatorias o linfoides, macrófagos, células T (incluyendo células Th1 y Th2), supresión de la respuesta inmune a un patógeno o antígeno u otros casos en los que es deseable la inhibición de las citocinas IL-17F o IL-17A.

Adicionalmente, el polipéptido de la presente invención es útil para:

1) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización a través de los receptores de IL-17A o IL-17F en el tratamiento de la inflamación aguda, inflamación como resultado de traumatismo, lesión tisular, cirugía, sepsis o infección y enfermedades inflamatorias crónicas como asma, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), colitis crónica, esplenomegalia, artritis reumatoide, episodios recurrentes de inflamación aguda (p. ej., tuberculosis) y tratamiento de amiloidosis y aterosclerosis, enfermedad de Castleman, asma y otras enfermedades asociadas con la inducción de respuesta en fase aguda.

2) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización a través de los receptores de IL-17A o IL-17F en el tratamiento de enfermedades autoinmunes como DMDI, esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia gravis, artritis reumatoide y EII para prevenir o inhibir la señalización en células del sistema inmunitario (p. ej., linfocitos, monocitos o leucocitos) a través de IL-17RC. Bloquear, inhibir, reducir o antagonizar la señalización a través de IL-17RC, usando el polipéptido de la presente invención también puede ser beneficioso en enfermedades del páncreas, riñón, pituitaria y células neuronales. Pueden beneficiarse los pacientes con DMDI, DMNDI, pancreatitis y carcinoma pancreático.

3) Agonizar, potenciar, aumentar o iniciar la señalización a través de los receptores de IL-17A o IL-17F en el tratamiento de enfermedades autoinmunes como DMDI, EM, LES, miastenia gravis, artritis reumatoide y EII. Específicamente, la modulación de una respuesta de células T colaboradoras hacia un patrón alternativo de secreción de citocinas puede desvía una respuesta inmune para mejorar la enfermedad (Smith JA et al., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). De forma similar, se pueden usar monómeros, homodímeros y heterodímeros agonistas anti-IL-17RC soluble para señalizar, reducir y desviar a las células inmunes implicadas en asma, alergia y enfermedad atópica. La señalización a través del IL-17RC también puede beneficiar a enfermedades del páncreas, riñón, pituitaria y células renales. Pueden beneficiarse los pacientes con DMDI, DMNDI, pancreatitis y carcinoma pancreático. El polipéptido soluble descrito en este documento se puede usar para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de IL-17F o IL-17A, bien por separado o juntas, en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, enfermedad atópica, DMNDI, pancreatitis y disfunción renal como se describió anteriormente. El polipéptido de la presente invención se puede usar para promover una repuesta anticorpal mediada por células Th y/o para promover la producción de IL-4 u otras citocinas por los linfocitos u otras células inmunes.

El polipéptido soluble de la presente invención es útil como antagonista de las citocinas IL-17A o IL-17F. Estos efectos antagonistas pueden lograrse mediante la neutralización directa o unión de IL-17A o IL-17F. Además de su uso como antagonistas, los receptores solubles de la presente invención pueden unirse a IL17F y actuar como proteínas transportadoras para las citocinas IL-17A o IL-17F, para transportar el ligando a diferentes tejidos, órganos y células dentro del organismo. De este modo, el polipéptido soluble de la presente invención puede fusionarse o conjugarse con moléculas, polipéptidos o restos químicos que dirigen el complejo receptor-ligando a un sitio específico, como un tejido, célula inmune específica o tumor. Por ejemplo, en una infección aguda o en algunos cánceres, el beneficio puede ser el resultado de la inducción de inflamación y de las proteínas de respuesta local en fase aguda mediante la acción de IL-17F. Por tanto, los receptores solubles de la presente invención se pueden usar para dirigir específicamente la acción de IL-17A o IL-17F. Véase, Cosman, D. Cytokine 5: 95106, 1993 y Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000.

Adicionalmente, el polipéptido soluble de la presente invención se puede usar para estabilizar la IL-17F o la IL-17A, para aumentar la biodisponibilidad, longevidad terapéutica y/o eficacia del ligando estabilizando dicho ligando ante la degradación o aclaramiento, o dirigiendo el ligando hacia un sitio de acción dentro del organismo. Por ejemplo, el complejo natural IL-6/IL-6R soluble estabiliza a la IL6 y puede transmitir su señal a través del receptor gp130. Véase, Cosman, D. supra. y Fernandez-Botran, R. supra. Adicionalmente, el polipéptido de la presente invención puede combinarse con un ligando relacionado como IL-17F para constituir un complejo ligando/receptor soluble. Estos complejos se pueden usar para estimular las respuestas de las células que presentan una subunidad receptora acompañante como, por ejemplo, pDIRS1 (IL-17ARB) o CRF2-4 (IL10RB). La especificidad celular de los complejos puede diferir de la observada cuando se administra el ligando solo. Además los complejos pueden tener propiedades farmacocinéticas diferentes como aquellas que afectan a la semivida, dosis/respuesta y especificidad de órgano o tejido. Por tanto, los complejos del polipéptido con IL-17F o IL-17A pueden tener actividad agonista para potenciar una respuesta inmune o estimular a las células mesangiales o a las células hepáticas. Alternativamente, sólo los tejidos que expresan una subunidad señalizadora que forma un heterodímero con el complejo pueden verse afectados de forma análoga a la respuesta a los complejos IL-6/IL-6R (Hirota H. et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. 92:4862-4866, 1995; Hirano, T. en Thomason, A. (Ed.) “The Cytokine Handbook", 3ª Ed., p. 208-209). Los complejos receptor soluble/citocina para IL-12 y CNTF muestran actividades similares.

Además, la inflamación es una respuesta protectora de un organismo para rechazar a un agente invasor. La inflamación supone una cascada de acontecimientos en la que están implicados muchos mediadores celulares y humorales. Por un lado, la supresión de las respuestas inflamatorias puede llevar a un hospedador inmunocomprometido; sin embargo, si se deja sin controlar, la inflamación puede llevar a serias complicaciones como enfermedades inflamatorias crónicas (p. ej., psoriasis, artritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal y similares), choque séptico y fallo multiorgánico. Lo que es más importante, estos estados patológicos diversos comparten mediadores de inflamación frecuentes. Las enfermedades colectivas que se caracterizan por inflamación tienen un gran impacto sobre la morbilidad y mortalidad humanas. Por tanto, es claro que el polipéptido de la presente invención podría tener un potencial terapéutico crucial para un gran número de enfermedades humanas y animales, desde asma y alergia a autoinmunidad y choque séptico.

1. Artritis

La artritis, incluyendo osteoartritis, artritis reumatoide, articulaciones artríticas como resultado de una lesión y similares, son afecciones inflamatorias frecuentes que podrían beneficiarse del uso terapéutico del polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica que afecta al organismo completo y es una de las formas más frecuentes de artritis. Se caracteriza por la inflamación de la membrana que reviste la articulación, lo que produce dolor, rigidez, calor, enrojecimiento e hinchazón. Las células inflamatorias liberan enzimas que pueden digerir el hueso y el cartílago. Como resultado de la artritis reumatoide, el revestimiento de la articulación inflamado, la membrana sinovial, puede invadir y dañar el hueso y el cartílago induciendo un deterioro de la articulación y dolor intenso entre otros efectos fisiológicos. La articulación afectada puede perder su forma y alineación, lo que da lugar a dolor y pérdida de movimiento.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad mediada por el sistema inmunitario caracterizada especialmente por la inflamación y posterior daño del tejido induciendo una discapacidad grave y un aumento de la mortalidad. En las articulaciones reumáticas se producen diversas citocinas a nivel local. Numerosos estudios han demostrado que la IL-1 y el TNF-alfa, dos citocinas proinflamatorias prototipo, tienen una función importante en los mecanismos implicados en la inflamación sinovial y en la destrucción progresiva de las articulaciones. De hecho, la administración de inhibidores del TNF-alfa y de interleucinas en pacientes con AR ha inducido una drástica mejora de los signos clínicos y biológicos de la inflamación y una reducción de los signos radiológicos de la erosión ósea y de la destrucción del cartílago. Sin embargo, a pesar de estos alentadores resultados, un porcentaje significativo de pacientes no responde a estos agentes, lo que sugiere que también están implicados otros mediadores en la fisiopatología de la artritis (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002). Uno de esos mediadores podría ser IL-17A o IL-17F y, por tanto, una molécula que se une o inhibe la actividad de IL-17F o IL17A, podrían servir como agente terapéutico valioso para reducir la inflamación en la artritis reumatoide y en otras enfermedades artríticas.

En la técnica se conocen varios modelos animales para la artritis reumatoide. Por ejemplo, en el modelo de la artritis inducida por colágeno (AIC), los ratones desarrollan artritis inflamatoria crónica que se asemeja bastante a la artritis reumatoide humana. Puesto que el modelo de AIC comparte características inmunológicas y patológicas similares con la AR, esto lo hace un modelo ideal para la selección de posibles compuestos antiinflamatorios humanos. El modelo de IAC es un modelo bien conocido en ratones que depende para su aparición tanto de la respuesta inmune como de la respuesta inflamatoria. La respuesta inmune comprende la interacción entre las células B y las células T CD4+ en respuesta al colágeno que se administra como antígeno, e induce la producción de anticuerpos anticolágeno. La fase inflamatoria es el resultado de las respuestas tisulares a mediadores de inflamación, como consecuencia de la reacción cruzada de algunos de estos anticuerpos con el colágeno nativo del ratón, y de la activación de la cascada del complemento. Una ventaja del uso del modelo de AIC es que se conocen los mecanismos básicos de la patogénesis. Se han identificado los epítopes relevantes para la célula T y la célula B en el colágeno de tipo II y se han determinado diversos parámetros inmunólogos (p. ej., hipersensibilidad retardada y anticuerpos anticolágeno) e inflamatorios (p. ej., citocinas, quimiocinas y enzimas que degradan la matriz) relacionados con la artritis mediada por el sistema inmunitario y, por tanto, se pueden usar para evaluar la eficacia del compuesto de ensayo en el modelo de AIC (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997 y Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995).

La administración de polipéptidos que contiene IL-17RC soluble (IL-17RC), como IL-17RC-Fc4 u otro IL-17RC soluble y proteínas de fusión de este modelo murino de AIC se usa para evaluar el uso de IL-17RC soluble como antagonista de IL-17F utilizado para mejorar los síntomas y alterar la evolución de la enfermedad. Adicionalmente, los resultados que muestran la inhibición de IL-17F por IL-17RC podría proporcionan una prueba de concepto de que otros antagonistas de la IL17F, como el IL-17RC soluble o anticuerpos neutralizantes de la misma, también podrían usarse para mejorar los síntomas y alterar la evolución de la enfermedad. Además, puesto que IL-17A y/o IL-17F inducen la producción de IL-1b y de TNF-α, ambas implicadas en la patogénesis y progresión de la artritis reumatoide, la administración sistémica o local de polipéptidos que contienen IL-17RC soluble, como IL-17RC-Fc4 u otros receptores solubles de IL-17F (p. ej., IL-17RC; SEC ID Nº 3) y anticuerpos anti-IL-17RC, y proteínas de fusión pueden suprimir en potencia la respuesta inflamatoria en la AR. A modo de ejemplo y sin limitaciones, la inyección de 10-200 µg de IL-17RC-Fc por ratón (de una a siete veces a la semana durante 4 semanas, pero sin limitación, por vías de administración s.c., i.p. o i.m.) puede reducir significativamente la puntuación de la enfermedad (puntuación de las patas, incidencia de la inflamación o enfermedad). Dependiendo del inicio de la administración de IL-17RC-Fc (p. ej., antes o en el momento de la inmunización con colágeno, o en cualquier momento tras la segunda inmunización con colágeno, incluso en aquellos puntos temporales en los que la enfermedad ya ha progresado), IL-17RC puede prevenir de forma eficaz la artritis reumatoide, así como prevenir su progresión. Entre otros posibles agentes terapéuticos se incluyen polipéptidos IL17RC, anticuerpos anti-IL-17RC o anticuerpos o pajeras de unión anti IL-17F y similares.

2. Endotoxemia

La endotoxemia es una afección grave que normalmente es el resultado de agentes infecciosos, como bacterias y otros agentes infecciosos patógenos, sepsis, síndrome de choque tóxico o en pacientes inmunocomprometidos sometidos a infecciones oportunistas. El uso terapéutico de proteínas antiinflamatorias, como el polipéptido de la presente invención, podría ayudar a prevenir y tratar la endotoxemia en humanos y en animales. El polipéptido de la presente invención podría servir con agente terapéutico valioso para reducir la inflamación y los efectos patológicos de la endotoxemia.

La endotoxemia inducida por lipopolisacáridos (LPS) involucra muchos de los mediadores proinflamatorios que producen efectos patológicos en las enfermedades infecciosas y la endotoxemia inducida por LPS en roedores es un modelo ampliamente utilizado y aceptable para estudiar los efectos farmacológicos de los posibles agentes proinflamatorios o inmunomoduladores. Los LPS, producidos en bacterias Gram-negativas, son un agente causal principal en la patogénesis del choque séptico (Glausner et al., Lancet 338:732, 1991). De hecho puede inducirse experimentalmente un estado similar al choque mediante una única inyección de LPS en los animales. Las moléculas producidas por las células para responder a los LPS pueden dirigirse frente a patógenos directa o indirectamente. Aunque estas respuestas biológicas protegen al hospedador frente a patógenos invasores, también pueden producir daño. Por tanto, la estimulación masiva de la inmunidad innata, que tiene lugar como resultado de una infección por bacterias Gram-negativas grave, induce una producción excesiva de citocinas y otras moléculas y el desarrollo de un síndrome mortal, el síndrome de choque séptico, que se caracteriza por fiebre, hipotensión, coagulación intravascular diseminada y

fallo multiorgánico (Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000).

Estos efectos tóxicos de los LPS están principalmente relacionados con la activación de macrófagos que induce la liberación de múltiples mediadores inflamatorios. Entre estos mediadores, parece que el TNF tiene una función crucial, como indica la prevención de la toxicidad por LPS mediante la administración de anticuerpos anti-TNF neutralizantes (Beutler et al., Science 229:869, 1985). Está bien establecido que la inyección de 1 µg de LPS de E. coli en un ratón de la cepa C57B1/6 dará lugar a un aumento significativo de IL-6, TNF-alfa, IL-1 y proteínas de fase aguda en circulación (por ejemplo, SAA) aproximadamente 2 horas después de la inyección. La toxicidad de LPS parece estar mediada por estas citocinas ya que la inmunización pasiva frente a estos mediadores puede dar lugar a una disminución de la mortalidad (Beutler et al., Science 229:869, 1985). Entre las posibles estrategias de intervención inmunológica para la prevención y/o tratamiento del choque séptico se incluyen AcM anti-TNF, antagonistas del receptor de IL-1, LIF, IL-10 y G-CSF.

Se puede usar la administración del polipéptido de la presente invención a este modelo inducido por LPS para evaluar el uso del polipéptido para mejorar los síntomas y alterar la evolución de la enfermedad inducida por LPS. Adicionalmente, los resultados que muestran la inhibición de IL-17F por IL-17RC proporcionan una prueba de concepto de que otros antagonistas de la IL-17F, como el IL-17RC soluble o anticuerpos de la misma, también se pueden usar para mejorar los síntomas en el modelo inducido por LPS y alterar la evolución de la enfermedad. El modelo mostrará la inducción de IL-17F mediante la inyección de LPS y el posible tratamiento de la enfermedad mediante polipéptidos IL-17RC. Puesto que LPS induce la producción de factores proinflamatorios contribuyendo posiblemente a la patología de la endotoxemia, se puede usar la neutralización de la actividad de la IL-17F o de otros factores proinflamatorios por un polipéptido antagonista de IL-17C para reducir los síntomas de la endotoxemia, al igual que se ha visto en el choque endotóxico. Entre otros posibles agentes terapéuticos se incluyen polipéptidos IL17RC, anticuerpos anti-IL-17RC o pajeras de unión y similares.

3. Enfermedad inflamatoria intestinal (EII)

En Estados Unidos, aproximadamente 500.000 personas sufren de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que puede afectar al colon y al recto (colitis ulcerosa) o a ambos, intestino delgado y grueso (enfermedad de Crohn). La patogénesis de estas enfermedades no está clara, aunque conlleva la inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos IL-17RC, los anticuerpos anti-IL17RC o sus parejas de unión podrían servir como agentes terapéuticos valiosos para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la EII y en enfermedades relacionadas.

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria del intestino grueso, normalmente denominado colon, caracterizada por inflamación y ulceración de la mucosa o del revestimiento más interno del colon. Esta inflamación hace que el colon se vacié con frecuencia, dando lugar a diarrea. Entre los síntomas se incluyen escape de heces y cólicos asociados, fiebre y pérdida de peso. Aunque la causa exacta de la CU es desconocida, investigaciones recientes sugieren que las defensas naturales del organismo trabajan frente a proteínas del organismo que el propio organismo considera como extrañas (una “reacción autoinmune"). Quizás debido a que recuerdan a proteínas bacterianas en el intestino, estas proteínas pueden provocar o estimular el proceso inflamatorio que se inicia destruyendo el revestimiento del colon. Cuando se destruye el revestimiento del colon, se forman úlceras que liberan moco, pus y sangre. La enfermedad se inicia normalmente en el área del recto y, finalmente, puede extenderse a todo el intestino grueso. Los episodios repetidos de inflamación inducen un engrosamiento de la pared del intestino y del recto con tejido cicatrizal. Puede producir una necrosis del tejido del colon o sepsis con enfermedad grave. La gravedad de los síntomas de la colitis ulcerosa varía y su aparición puede ser gradual o repentina. Los ataques pueden estar provocados por muchos factores, incluyendo infecciones respiratorias o estrés.

Aunque actualmente no existe cura disponible para la CU, los tratamientos se centran en la supresión del proceso inflamatorio anómalo del revestimiento del colon. Están disponibles tratamientos que incluyen corticosteroides inmunodepresores (p. ej., azatioprina, mercaptopurina y metotrexato) y aminosalicilatos para el tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, el uso prolongado de inmunodepresores como corticosteroides y azatioprina puede dar lugar a efectos adversos graves como adelgazamiento de huesos, cataratas, infección y efectos sobre el hígado y la médula ósea. En los pacientes en que los tratamientos actuales no son eficaces, la cirugía es una opción. La cirugía supone la extirpación del colon completo y del recto.

Existen diversos modelos animales que pueden mimetizar parcialmente la colitis ulcerosa crónica. El modelo más ampliamente utilizado es el modelo de colitis inducida por ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico/etanol (TNBS), que induce inflamación crónica y ulceración en el colon. Cuando se introduce TNBS en el colon de ratones susceptibles a través de instilación intrarrectal, se induce una respuesta inmune mediada por células T en la mucosa del colon, induciendo en este caso una inflamación mucosa masiva caracterizada por la infiltración densa de células T y de macrófagos a través de la pared completa del intestino grueso. Además, este cuadro histopatológico va acompañado del cuadro clínico de pérdida progresiva de peso (deterioro progresivo), diarrea hemorrágica, prolapso rectal y engrosamiento de la pared del intestino grueso (Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62, 2000).

Otro modelo de colitis utiliza sulfato sódico dextrano (DSS), que induce una colitis aguda que se manifiesta con diarrea hemorrágica, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por infiltración de células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño focal de la cripta y ulceración epitelial. Se considera que estos cambios se desarrollan debido a los efectos tóxicos del DSS sobre el epitelio y a la fagocitosis de las células de la lámina propia y producción de TNF-alfa e IFN-gamma. A pesar de su uso frecuente, varios aspectos correspondientes a los mecanismos del DSS sobre la importancia para la enfermedad humana siguen sin resolver. El modelo de DSS se contempla como un modelo independiente de células T ya que se ha observado en animales deficientes en células T, como en ratones SCID.

La administración de polipéptidos que contienen IL-17RC soluble, como IL17RC-Fc4 u otras proteínas IL-17RC solubles y de fusiones en estos modelos de TNBS o DSS se puede usar para evaluar el uso de IL-17RC soluble para mejorar los síntomas y alterar la evolución de la enfermedad gastrointestinal. Adicionalmente, los resultados que muestran la inhibición de IL-17F por IL-17RC podrían proporcionan una prueba de concepto de que otros antagonistas de la IL17F, como el IL-17RC soluble o anticuerpos neutralizantes de la misma, también se pueden usar para mejorar los síntomas en los modelos de colitis/EII y alterar la evolución de la enfermedad.

4. Psoriasis

La psoriasis es una enfermedad cutánea crónica que afecta a más de siete millones de estadounidenses. La psoriasis se produce cuando las células de la piel crecen de forma anómala, dando lugar a parches de descamación de la piel, inflamados e hinchados, en los que la piel vieja no se desprende lo suficientemente rápido. La psoriasis en placas, la forma más frecuente, se caracteriza por parches de piel inflamada ("lesiones”) cubiertos con descamaciones plateadas. La psoriasis puede limitarse a unas pocas placas o afectar a áreas de moderadas a extensas de piel, apareciendo con más frecuencia en el cuero cabelludo, rodillas, codos y tronco. Aunque es muy visible, la psoriasis no es una enfermedad contagiosa. La patogénesis de la enfermedad implica inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos de IL-17RC, los anticuerpos anti-IL-17RC o las parejas de unión, podrían servir como agentes terapéuticos valiosos para reducir la inflamación y los efectos patológicos de la psoriasis, otras enfermedades cutáneas inflamatorias, alergias cutáneas y mucosas y enfermedades relacionadas.

La psoriasis es un trastorno inflamatorio de la piel mediado por células T que puede causar una molestia considerable. Se trata de una enfermedad que no tiene cura y que afecta a personas de todas las edades. La psoriasis afecta a aproximadamente el dos por ciento de la población de Europa y Norteamérica. Aunque las personas con psoriasis leve a menudo pueden controlar su enfermedad con agentes tópicos, más de un millón de pacientes de todo el mundo necesitan tratamiento con radiación ultravioleta o tratamiento inmunodepresor sistémico. Desafortunadamente, la inconveniencia y los riesgos de la radiación ultravioleta y las toxicidades de muchos tratamientos limitan su uso prolongado. Asimismo, los pacientes normalmente presentan recurrencia de la psoriasis y, en algunos casos rebote, inmediatamente después de interrumpir el tratamiento inmunodepresor.

Los polipéptidos del receptor soluble IL-17RC y los anticuerpos dirigidos contra este también se pueden usar dentro de sistemas diagnósticos para la detección de niveles en circulación del ligando IL-17F o IL-17A, así como en la detección de IL-17F asociada con la respuesta inflamatoria en fase aguda y situaciones patológicas, como inflamación o cáncer. Se sabe que la IL-17F induce la respuesta inflamatoria de fase aguda asociada. Además, la detección de las proteínas o moléculas de fase aguda, como IL-17A o IL-17F, puede ser indicativo de una afección inflamatoria crónica en determinados estados patológicos (p. ej., asma, psoriasis, artritis reumatoide, colitis o EII). La detección de estas afecciones sirve para ayudar al diagnóstico de la enfermedad, así como para que el médico elija el tratamiento apropiado.

La administración intrauterina de IL-17RC soluble se puede usar para demostrar la eficacia in vivo en modelos de enfermedades reduciendo o eliminando el fenotipo asociado con las crías transgénicas IL-17F que sobreexpresan IL-17F, o crías transgénicas IL-17A que sobreexpresan IL-17A. Existen precedentes en la técnica del tratamiento intrauterino con antagonistas, tales como anticuerpos monoclonales (AcM) neutralizantes. En un caso, el desarrollo del subgrupo B-1 de células B estaba considerablemente afectado por el tratamiento de ratones hembra preñadas con un AcM específico de la molécula específica de células B CD19 (p. ej., Krop I. et al., Eur. J. Immunol. 26(1):238-42, 1996). Krop et al. inyectaron a hembras preñadas controladas por vía intraperitoneal 500 µg de AcM de rata antiCD19 de ratón (o un Ac control del mismo isotipo del Ac de rata) en PBS, comenzando el día 9 de gestación y con inyecciones posteriores cada dos días hasta el parto. A las crías también se les inyectó 500 µg de estos anticuerpos a los 10 días de edad. En otro caso, Tanaka et al. encontraron que el tratamiento intrauterino con un anticuerpo monoclonal anti-cadena beta del receptor de la IL-2 anulaba completamente el desarrollo de células epidérmicas dendríticas Thy-1+. Las dos subunidades distintas del receptor de la IL-2, es decir, la cadena alfa (IL-2R alfa) y la cadena beta (IL-2R beta), se expresan de forma casi mutuamente excluyente durante la ontogenia del timo en el feto. El bloqueo de IL-2R beta, un componente transductor de la señal del IL-2R, mediante la administración de un AcM neutralizante frente a IL-2R beta, tiene como resultado la desaparición completa y selectiva de las células epidérmicas dendríticas de la piel Thy-1+. El desarrollo de cualquier otro subgrupo de células T no se ve afectado. Esto indica que la IL-2 tiene una función crucial en el desarrollo de las células fetales V gamma 5+ y sus descendientes (véase, Tanaka, T. et al., Int Immunol. 4(4) :487-9, 1992). Además, Schattemann GC et al., mostraron que el PDGF-A es necesario para el normal desarrollo cardiovascular murino usando un sistema intrauterino. Varias líneas de evidencias sugieren que la cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-A) es necesaria para un normal desarrollo cardiovascular embrionario. La introducción de anticuerpos neutralizantes anti-PDGF-A en la caduca del útero de ratones tenía como consecuencia la rotura selectiva de las interacciones receptor-ligando PDGF-A in vivo durante un periodo de 18-24 h y permitía evaluar si PDGF-A es necesario para el desarrollo cardiovascular y cuándo es necesario (véase Schattemann GC et al., Dev. Biol. 176(1):133-42, 1996). Estos resultados, así como otros descritos en la técnica, proporcionan pruebas de que antagonistas, como AcM neutralizantes o receptores solubles, pueden provocar fuertes efectos en el útero. De forma similar, pueden mostrarse los datos que demuestran la eficacia in vivo de receptores solubles y/o de la neutralización de IL17A o IL-17F con anticuerpos monoclonales en modelos de enfermedad para reducir o eliminar el fenotipo cutáneo encontrado en crías transgénicas IL-17A e IL

17F que sobreexpresan IL-17A e IL-17F, respectivamente.

Además de otros modelos de enfermedad descritos en el presente documento, se puede medir in vivo la actividad de IL-17RC soluble y/o anticuerpos anti-IL-17RC sobre tejido inflamatorio derivado de lesiones psoriásicas humanas usando un modelo murino de inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Se han desarrollado varios modelos murinos en los que las células humanas se implantan en ratones inmunodeficientes (denominados colectivamente modelos de xenoinjerto); véase, por ejemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18:513-22, 1994 y Flavell, DJ, Hematological Oncology 14:67-82, 1996. Como modelo de xenoinjerto in vivo para la psoriasis, se implanta el tejido cutáneo psoriásico humano en el modelo de ratón SCID y se estimula con un antagonista apropiado. Además, se pueden usar otros modelos animales de psoriasis conocidos en la técnica para evaluar los antagonistas de IL-17A e IL-17F, como injertos de piel psoriásica humana implantada en el modelo de ratón AGR129 y estimulación con un antagonista apropiado (p. ej., véase Boyman, O. et al., J. Exp. Med. Publicación online Nº 20031482, 2004). El IL-17RC soluble o los anticuerpos anti-IL-17RC que unen, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan o neutralizan la actividad de la IL17F o de ambas, IL-17A e IL-17F, son antagonistas preferidos; sin embargo, se pueden usar en este modelo anticuerpos anti-IL-17A y anti-IL-22 (solos o en combinación), IL-17RC soluble, así como otros antagonistas de la IL-17A y la IL17F. De forma similar, se pueden usar tejidos o células derivadas de colitis, EII, artritis u otras lesiones inflamatorias humanas en el modelo SCID para valorar las propiedades antiinflamatorias de los antagonistas de IL-17A e IL-17F descritos en el presente documento.

Los tratamientos diseñados para anular, retardar o reducir la inflamación usando IL-17RC soluble, anticuerpos anti-IL-17RC o sus derivados, antagonistas, conjugados o variantes pueden analizarse mediante la administración de anticuerpos anti-IL-17RC o compuestos IL-17RC solubles a ratones SCID portadores de tejido inflamatorio humano (p. ej., lesiones psoriásicas y similares) u otros modelos descritos en el presente documento. La eficacia del tratamiento se determina y evalúa estadísticamente como el incremento con el tiempo del efecto antiinflamatorio dentro de la población tratada usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Algunos ejemplos de procedimientos son, aunque sin limitaciones, la determinación, por ejemplo, en un modelo de psoriasis, del grosor epidérmico, el número de células inflamatorias en la dermis superior y los grados de paraqueratosis. Dichos procedimientos son conocidos en la técnica y se describen en este documento. Por ejemplo, véase Zeigler, M. et al. Lab Invest 81:1253, 2001; Zollner, T. M. et al. J. Clin. Invest. 109:671, 2002; Yamanaka, N. et al. Microbiol. Immunol. 45:507, 2001; Raychaudhuri, S. P. et al. Br. J. Dermatol. 144:931, 2001; Boehncke, W. H et al. Arch. Dermatol. Res. 291:104, 1999; Boehncke, W. H et al..

J. Invest. Dermatol. 116:596, 2001; Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146:580, 1995; Boehncke, W. H et al. J. Cutan. Pathol. 24:1, 1997; Sugai, J., M. et al. J. Dermatol. Sci. 17:85, 1998; y Villadsen L.S. et al. J. Clin. Invest. 112:1571, 2003. También puede hacerse un seguimiento de la inflamación con el tiempo usando procedimientos bien conocidos, como citometría de flujo (o PCR) para cuantificar el número de células inflamatorias o lesivas presentes en una muestra, puntuación (pérdida de peso, diarrea, hemorragia rectal, longitud del colon) para la EII, puntuación de la enfermedad y puntuación de inflamación en las patas en el modelo de AR AIC. Por ejemplo, las estrategias terapéuticas apropiadas para el análisis en este modelo son el tratamiento directo usando IL-17RC soluble, anticuerpos anti-IL17RC, otros antagonistas de IL-17A e IL-17F (por separado o juntas) o conjugados

o antagonistas relacionados basados en la rotura de la interacción del IL-17RC soluble con sus ligandos IL-17A e IL-17F, o para los tratamientos a base de células utilizando IL-17RC soluble o anticuerpos anti-IL-17RC o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes.

Además, la psoriasis es una enfermedad cutánea inflamatoria crónica que está asociada con queratinocitos epidérmicos hiperplásicos y células mononucleares infiltrantes, como células T CD4+ de memoria, neutrófilos y macrófagos (Christophers, Int. Arch. Allergy Immunol., 110:199, 1996). Actualmente se piensa que los antígenos ambientales tienen una función importante en el inicio y contribución a la patología de la enfermedad. No obstante, se piensa que es la pérdida de tolerancia a los autoantígenos lo que media en la patología de la psoriasis. Se considera que las células dendríticas y las células T CD4+ tienen una función importante en la presentación y reconocimiento del antígeno que media en la respuesta inmune que conduce a la patología. Recientemente hemos desarrollado un modelo de psoriasis basado en el modelo de transferencia de células CD4+CD45RB (Davenport et al., Internat. Immunopharmacol., 2:653-672). Se administra a los ratones IL-17RC soluble o anticuerpos anti-IL-17RC. La inhibición de las puntuaciones de la enfermedad (lesiones cutáneas, citocinas inflamatorias) indica la eficacia de los antagonistas de IL-17A e IL-17F en la psoriasis, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-17RC o receptores IL-17RC solubles.

5. Dermatitis atópica

La dermatitis atópica (DA) es una enfermedad inflamatoria crónica frecuente que se caracteriza por citocinas hiperactivadas del subgrupo 2 de células T colaboradoras (Th2). Aunque se desconoce la etiología exacta de la DA, se han implicado múltiples factores, como respuestas inmunes Th2 hiperactivas, autoinmunidad, infección, alergenos y predisposición genética. Los aspectos clave de la enfermedad son la xerosis (sequedad de la piel), prurito (picor de la piel), conjuntivitis, lesiones cutáneas inflamatorias, infección por Staphylococcus aureus, eosinofilia elevada en sangre, elevación de los niveles séricos de IgE e IgG1 y dermatitis crónica con infiltración de células T, mastocitos, macrófagos y eosinófilos. La colonización o infección con S. aureus se sabe que exacerba la DA y perpetúa la cronicidad de esta enfermedad cutánea.

La DA se presenta a menudo en pacientes con asma y rinitis alérgica y es con frecuencia la manifestación inicial de una enfermedad alérgica. Aproximadamente el 20% de la población de los países del Este padece estas enfermedades alérgicas y la incidencia de la DA en países desarrollados está creciendo por motivos desconocidos. La DA comienza normalmente en la infancia y, a menudo, puede persistir durante la adolescencia hasta la madurez. Los tratamientos actuales para la DA son corticosteroides tópicos, ciclosporina A oral, fármacos inmunodepresores no corticosteroides como tacrolimus (FK506 en forma de pomada) e interferón gamma. A pesar de la variedad de tratamientos para la DA, muchos de los síntomas de los pacientes no mejoran o presentan reacciones adversas a los medicamentos, lo que requiere la búsqueda de otros agentes terapéuticos más eficaces. Los polipéptidos de IL-17RC solubles y los anticuerpos anti-IL-17RC, como los anticuerpos neutralizantes anti-IL-17RC humano, se pueden usar para neutralizar la IL-17F y la IL-17A en el tratamiento de enfermedades humanas específicas como la dermatitis atópica, afecciones cutáneas inflamatorias u otras enfermedades inflamatorias descritas en este documento.

6. Asma

La IL-17 tiene una función importante en la activación de células T inducidas por alergeno y el influjo de neutrófilos en las vías respiratorias. El receptor de la IL17 se expresa en las vías respiratorias (Yao, et al. Immunity 3:811(1995)) y el reclutamiento de neutrófilos mediados por la IL-17 en el asma alérgico está en gran medida inducido por el quimiotáctico IL-8, GRO-α y la proteína inflamatoria de macrófagos-2 (MIP-2) producida por células epiteliales bronquiales humanas (HBEC) y fibroblastos bronquiales humanos estimulados por IL-17 (Yao, et al. J Immunol 155:5483 (1995)); Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)). La IL-17 también estimula en las células HBEC la liberación de IL-6, un factor activador de neutrófilos (Fossiez, et al. J Exp Med 183:2593 (1996) y Linden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126:179. (2001)) y se ha demostrado que tiene un efecto sinérgico con el TNF-α para prolongar la supervivencia de neutrófilos humanos in vitro (Laan, et al. Eur Respir J 21:387 (2003)). Además, la IL-17 es capaz de amplificar las respuestas inflamatorias en el asma por su capacidad para estimular la secreción de citocinas implicadas en la remodelación de vías respiratorias, como las citocinas profibróticas IL-6 e IL-11, y los mediadores inflamatorios factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)).

Las pruebas clínicas muestras que las exacerbaciones agudas graves del asma están asociadas con el reclutamiento y activación de neutrófilos en las vías respiratorias, por lo que la IL-17 probablemente tiene una función importante en el asma. Los pacientes con asma leve muestran un aumento detectable de la concentración local de la proteína IL-17A soluble libre (Molet, et al. J Allergy Clin Immunol 108:430 (2001)) mientras que voluntarios humanos sanos con inflamación grave inducida de las vías respiratorias debido a la exposición a una granja porcina, muestran un aumento pronunciado de la concentración de proteína IL-17A soluble libre en el espacio broncoalveolar (Fossiez, y col, J Exp Med 183:2593 (1996) y Linden, et al. Int Arch Allergy Immunol 126:179 (2001)). Adicionalmente, los niveles de IL-17 en el esputo se han correlacionado con individuos que mostraban aumento de la hiperreactividad de las vías respiratorias (Barczyk, et al. Respir Med 97:726 (2003).

En modelos animales de hipersensibilidad en las vías respiratorias, la inhalación crónica de ovoalbúmina por ratones sensibilizados daba lugar a inflamación eosinofílica bronquial y a la inducción temprana de la expresión del ARNm de la IL-17 en el tejido pulmonar inflamado, junto con una neutrofilia bronquial (Hellings, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 28:42 (2003)). Los anticuerpos monoclonales anti-IL-17 reducen considerablemente el influjo neutrofílico bronquial, aunque aumentaba significativamente los niveles de IL-5 tanto en el fluido de lavado broncoalveolar como en suero y agravaba el influjo eosinofílico bronquial inducido por alergeno, lo que sugiere que la IL-17A puede estar implicada en la determinación del equilibrio entre la acumulación de neutrófilos y eosinófilos tras la exposición a antígeno Id.

Entre los miembros de la familia de la IL-17, la IL-17F es la más estrechamente relacionada con IL-17A. Las actividades biológicas mediadas por IL17F son similares a las de la IL-17A, estimulando IL-17F la producción de IL-6, IL-8 y G-CSF (Hurst, et al. J Immunol 169:443 (2002)). La IL-17F también induce la producción de IL-2, del factor de crecimiento transformante (TGF)-β y de la proteína quimiotáctica de monocitos (MCP) en células endoteliales (Starnes, et al. J Immunol 167:4137 (2001)). De forma similar, la exposición al antígeno puede aumentar la IL17F local en pacientes con asma alérgico (Kawaguchi, et al. J Immunol 167:4430 (2001)). La administración génica de IL-17F en pulmón murino aumenta los neutrófilos en el espacio broncoalveolar, mientras que la transferencia mucosa del gen de IL-17F aumenta los niveles de neutrofilia pulmonar inducida por antígeno y la sensibilidad de las vías respiratorias a metacolina (Oda, et al. Am J Respir Crit Care Med 171:12 (2005)).

Además del asma, las enfermedades inflamatorias crónicas graves de las vías respiratorias se caracterizan por el reclutamiento de neutrófilos en las vías respiratorias y se ha descrito que la IL-17 tiene una función importante en la patogénesis de enfermedades respiratorias como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), neumonía pulmonar y fibrosis quística (Linden, et al. Eur Respir J 15:973 (2000), Ye, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 25:335 (2001), Rahman, et al. Clin Immunol 115:268 (2005)). Podría demostrarse que una molécula terapéutica anti-IL-17A y/o anti-IL-17F es eficaz en la enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratoria en un modelo in vitro de inflamación. La capacidad de los antagonistas de la actividad de IL-17F y/o IL-17A, como el polipéptido de la presente invención para inhibir la producción de citocinas y quimiocinas inducidas por IL-17A y/o IL-17F en HBEC o fibroblastos bronquiales en cultivo podría usarse como una medida de la eficacia para estos antagonistas en la prevención de la producción de mediadores inflamatorios resultantes directamente de la estimulación de la IL-17A y/o F. Si la adición de antagonistas de la actividad de IL-17F y/o IL-17A, como el polipéptido de la presente invención, reduce considerablemente la producción y expresión de mediadores inflamatorios, se esperaría que fuera eficaz en aspectos inflamatorios asociados con la inflamación crónica de las vías respiratorias.

Para uso farmacéutico, el polipéptido de la presente invención se formula para la administración parenteral, especialmente intravenosa o subcutánea, según los procedimientos convencionales. La administración intravenosa se realizará mediante la inyección en bolo, liberación controlada, por ejemplo, usando minibombas u otra tecnología apropiada, o mediante la infusión durante un periodo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína hematopoyética en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como solución salina, tampón fosfato salino, dextrosa al 5% en agua o similar. Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes de tamponamiento, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en las superficies de viales, etc. Cuando se utilizan en politerapia, las citocinas pueden combinarse en una formulación única o se puede administrar en formulaciones separadas. Los procedimientos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990. Las dosis terapéuticas estarán generalmente en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg de peso del paciente por día, preferiblemente de 0,5-20 mg/kg por día, determinando el médico la dosis exacta según los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y gravedad de la afección que se va a tratar, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de un experto en la materia. Las proteínas normalmente se administrarán durante un periodo de hasta 28 días tras la quimioterapia o trasplante de médula ósea o hasta que se consiga un recuento de plaquetas >20.000/mm3, preferiblemente >50.000/mm3. Más frecuentemente, las proteínas se administrarán durante una semana o menos, a menudo durante un periodo de uno a tres días. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de la presente invención es una cantidad suficiente para producir un aumento clínicamente significativo en la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras linfoides o mieloides, lo que se manifestará como un aumento de los niveles en circulación de células maduras (p. ej., plaquetas

o neutrófilos). El tratamiento de trastornos de plaquetas continuará así hasta que se consiga un recuento de plaquetas de al menos 20.000/mm3, preferiblemente 50.000/mm3. El polipéptido de la presente invención también se puede administrar en combinación con otras citocinas como IL-3, IL-6 e IL-11, factor de células madre, eritropoyetina, G-CSF y GM-CSF. Dentro de las pautas de politerapia, las dosis diarias de otras citocinas en general serán: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 lg/kg; IL3, 1-5 lg/kg y G-CSF, 1-25 lg/kg. La politerapia con EPO, por ejemplo, está indicada en pacientes anémicos con niveles bajos de EPO.

Generalmente, la posología del polipéptido administrado variará dependiendo de factores como la edad, el peso, la estatura, el sexo, el estado médico general y los antecedentes patológicos previos del paciente. Normalmente, es deseable proporcionar al receptor una dosis del polipéptido que esté en el intervalo desde aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de fármaco/peso corporal del paciente), aunque también se puede administrar una dosis más baja o superior, según determinen las circunstancias.

La administración del polipéptido a un sujeto puede ser intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, mediante perfusión a través de un catéter regional o mediante inyección intralesión directa. Cuando se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración puede ser por infusión continua o mediante bolos únicos o múltiples.

Las vías adicionales de administración son oral, membrana mucosa, pulmonar o transcutánea. La administración oral es adecuada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas de proteinoide, microesferas de policianoacrilato y sistemas a base de lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins" en “Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). La factibilidad de una administración intranasal se ilustra por el modo de administración de insulina (véase, por ejemplo, Hinchcliffe e Ilium, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)). Las partículas secas o líquidas que comprenden IL-17RC soluble o anticuerpos anti-IL-17RC pueden prepararse e inhalarse con ayuda de dispersores de polvo seco, generadores de aerosol líquido o nebulizadores (p. ej., Pettit y Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Esta estrategia se ilustra por el sistema de tratamiento de la diabetes AERX, que se trata de un inhalador electrónico de mano que administra insulina aerolizada en los pulmones. Los estudios han demostrado que se han administrado proteínas de hasta 48.000 kDa a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonido de baja frecuencia, lo que ilustra la factibilidad de la administración transcutánea (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). La administración transdérmica usando la electroporación proporciona otro medio para administrar una molécula que tiene actividad de unión a IL-17RC (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10:213 (1997)).

Puede formularse una composición farmacéutica que comprenda el polipéptido de la presente invención según los procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, por lo cual las proteínas terapéuticas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un “vehículo farmacéuticamente aceptable” si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. El tampón fosfato salino es un ejemplo de vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otros vehículos idóneos son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995).

Para los propósitos de tratamiento, el polipéptido de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente a una cantidad terapéuticamente eficaz. Se dice que una combinación de una molécula terapéutica de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra a una “cantidad terapéuticamente eficaz” si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un fármaco es fisiológicamente significativo si su presencia causa un cambio detectable en la fisiología del paciente receptor. Por ejemplo, un fármaco usado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria.

Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la presente invención se puede proporcionar en forma de líquido, en un aerosol o en forma de sólido. Las formas líquidas se ilustran mediante soluciones inyectables y suspensiones orales. Ejemplos de formas sólidas son cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. Esta última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Delivery with Infusion Pumps," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)).

Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos a un sujeto por vía intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutánea o a través de la administración oral, inhalación o intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que constan de una o más capas lipídicas que rodean un compartimento acuoso (véase, en general, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) y Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Los liposomas son similares en composición a las membranas celulares y como consecuencia, estos pueden administrarse de forma segura y son biodegradables. Dependiendo del procedimiento de preparación, los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares y pueden variar en tamaño con diámetros que oscilan de 0,02 µm a más de 10 µm. Se pueden encapsular diversos fármacos en liposomas: partición en las bicapas de agentes hidrófobos y partición dentro del interior de espacios acuosos de agentes hidrófilos (véase, por ejemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987) y Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño del liposoma, el número de bicapas, la composición lipídica, así como la carga y las características de la superficie de los liposomas.

Los liposomas pueden adsorberse prácticamente a cualquier tipo de célula y liberar, a continuación, lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser endocitado por células que son fagocíticas. A la endocitosis le sigue la degradación intralisosomal de lípidos liposomales y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.

446:368 (1985)). Tras la administración intravenosa, los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 µm) normalmente son captados por células del sistema reticuloendotelial, localizado principalmente en el hígado y el bazo, mientras que los liposomas de más de 3,0 µm se depositan en el pulmón. Esta captación preferencial de los liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha usado para administrar agentes quimioterapéuticos a macrófagos y a tumores hepáticos.

El sistema reticuloendotelial puede obviarse por varios procedimientos como la saturación con dosis grandes de partículas de liposomas o la inactivación selectiva de macrófagos por medios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:428 (1984)). Además, se ha demostrado que la incorporación de fosfolípidos derivados de glucolípido o polietilénglicol en membranas de liposomas da lugar a una captación significativamente reducida por el sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

También pueden prepararse liposomas dirigidos a células u órganos en particular variando la composición de fosfolípidos o insertando receptores o ligandos en liposomas. Por ejemplo, los liposomas, preparados con un contenido alto de un tensioactivo no iónico, se han usado para dirigirse al hígado (Hayakawa et al., patente japonesa 04-244,018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull. 16:960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja, α-tocoferol y aceite de ricino etoxilado hidrogenado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla al vacío y reconstituyéndola a continuación con agua. Una formulación de liposomas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPFC) con una mezcla de esterilglucósido derivado de soja (EG) y colesterol (C) también se ha demostrado que se dirigen al hígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20:881 (1997)).

Alternativamente, se pueden unir diversos ligandos objetivo en la superficie del liposoma, como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, hidratos de carbono, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, los liposomas pueden modificarse con derivados de lípidos de tipo galactosilo ramificados para dirigirse a receptores de asialoglucoproteína (galactosa), que se expresan exclusivamente en la superficie de las células hepáticas (Kato y Sugiyama, Crit. Rey. Ther. Drug Carrier Syst. 14:287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). De forma similar, Wu et al., Hepatology 27:772 (1998), han demostrado que el marcaje de liposomas con asialofetuína conduce a una semivida en plasma más corta del liposoma y a una captación superior de liposomas marcados con asialofetuína por los hepatocitos. Por otro lado, la acumulación hepática de liposomas que contienen derivados de lípidos de tipo galactosilo ramificados puede inhibirse mediante la inyección previa de asialofetuína (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull.20:259 (1997)). Los liposomas de albúmina sérica humana poliaconitilada proporcionan otra estrategia para dirigir los liposomas a las células hepáticas (Kamps et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11681 (1997)). Asimismo, la patente de EE. UU. Nº

4.603.044 de Geho et al. describe un sistema de administración de vesículas de liposoma dirigidas a hepatocitos que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados con las células metabólicas especializadas del hígado.

En una estrategia más general para dirigirse a tejidos, las células diana se marcan previamente con anticuerpos biotinilados específicos de un ligando expresado por las células diana (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32:99 (1998)). Tras la eliminación del anticuerpo libre en plasma, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otra estrategia, los anticuerpos diana se unen específicamente a los liposomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev.

32:99 (1998)).

Los polipéptidos pueden encapsularse en liposomas usando técnicas convencionales de microencapsulación de proteínas (véase, por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res. 50:1853 (1990) y Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," en Liposome Technology, 2º edición, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como se indicó anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener diversos componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden contener derivados lipídicos de poli(etilénglicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)).

Se han diseñado microesferas de polímero degradable para mantener altos niveles sistémicos de proteína terapéutica. Las microesferas se preparan a partir de polímeros degradables como poli(láctido-co-glicólido) (PLG), polianhídridos, poli (orto ésteres), polímeros de etilvinilo no biodegradables, en las que las proteínas están atrapadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6:332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery" en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos y Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery" en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281:1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16:153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas de polietilénglicol (PEG) también pueden proporcionar un vehículo para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase, por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167 (1997)). Los expertos en la materia pueden diseñar otras formas de dosificación, como se muestra, por ejemplo, en Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5ª edición (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª edición (Mack Publishing Company 1995) y Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Como ilustración, se pueden suministrar composiciones farmacéuticas en forma de kit que comprendan un envase que contenga el polipéptido de la presente invención. Los polipéptidos terapéuticos pueden proporcionarse en forma de solución inyectable para dosis únicas o múltiples, o como polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Alternativamente, este kit puede incluir un dispersor de polvo seco, un generador de aerosol líquido o un nebulizador para la administración de un polipéptido terapéutico. Este kit puede contener además información escrita sobre las indicaciones y uso de la composición farmacéutica.

La invención se ilustra adicionalmente a través de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión del gen IL-17RC

Los análisis por transferencia de tipo Northern se realizaron usando transferencias de tejidos múltiples humanos (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Se generaron dos sondas a partir de los productos de PCR purificados en gel. La primera sonda se realizó usando ZC21798 (5' CGG CGT GGT GGT CTT GCT CTT 3'; SEC ID Nº 8) y ZC21808 (5' TCC CGT CCC CCG CCC CAG GTC 3'; SEC ID Nº 31) como cebadores. La sonda se marco radiactivamente usando el kit de marcaje Miltiprime de Amersham (Arlington Heights, IL) según el protocolo del fabricante. La sonda se purificó usando una columna por presión NUCTRAP (STRATAGENE, La Jolla, CA). Se usó la solución EXPRESSHYB (CLONTECH) para la prehibridación y las soluciones de hibridación para las transferencias de tipo Northern. La hibridación tuvo lugar durante la noche a 65ºC. Tras la hibridación, las transferencia se lavaron durante 30 minutos cada una en soluciones que contenían SDS al 0,1% y SSC como sigue: dos veces en SSCx2 a temperatura ambiente, tres veces en SSCx0,1 a 50ºC, una vez en SSCx0,1 a 55ºC y una vez en SSCx0,1 a 65ºC. Los resultados mostraron que el gen IL-17RC se expresa mucho en los tejidos tiroideo, de glándula adrenal, próstata y hepático, y se expresaba en menor grado en tejido cardíaco, intestino delgado, estómago y tráquea. Por el contrario, se observa una pequeña expresión o ausencia de la misma, en cerebro, placenta, pulmón, músculo esquelético, riñón, páncreas, bazo, timo, testículos, ovario, colon, leucocitos de sangre periférica, médula espinal, ganglio linfático y médula ósea.

EJEMPLO 2 Distribución del ARNm en paneles de líneas celulares usando PCR

El ARN total se purificó a partir de líneas células en reposo y estimuladas crecidas en el laboratorio usando un kit RNeasey de Qiagen (Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, o un protocolo de purificación ácido-fenol (Chomczynski y Sacchi, Analytical Biochemistry, 162.156-9, 1987). La calidad del ARN se comprobó desarrollando una alícuota en un Agilent Bioanalyzer. Si el ARN estaba significativamente degradado, no se usaba para la posterior creación de la primera cadena de ADNc. La presencia de ADN genómico contaminante se evaluó mediante un ensayo de PCR sobre una alícuota del ARN con zc41011 (5'CTCTCCATCCTTATCTTTCATCAAC 3'; SEC ID Nº 32) y zc41012 (5'CTCTCTGCTGGCTAAACAAAACAC 3'; SEC ID Nº 33), cebadores que amplifican un único sitio de ADN genómico intergénico. Las condiciones de la PCR para la prueba del ADN genómico contaminante fueron las siguientes: 2,5 µI de tampón 10x y 0,5 µl de mezcla de ADNc polimerasa 2 Advantage (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl de mezcla de dNTP 2,5 mM (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 µI de Rediload 10x (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 0.5µI de zc41011 y zc41012 20 µM en un volumen final de 25 µl. Los parámetros de ciclado fueron 94°C 20", 40 ciclos de 94°C 20" 60°C 1'20" y un ciclo de 72°C 7'. Alícuotas de 10 µl de cada reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se examinó en los geles la presencia de un producto de PCR procedente del ADN genómico contaminante. Si se observaba ADN genómico contaminante, el ARN total se trataba con ADNasa usando reactivos sin ADN (Ambion, Inc, Austin, TX) según las instrucciones del fabricante, a continuación se probaron de nuevo como se ha descrito anteriormente. Sólo los ARN que parecían estar libres de ADN genómico contaminantes se usaron para la posterior creación de la primera cadena de ADNc.

Veinte µg de ARN total de 82 líneas celulares humanas se llevaron a 98 µl con H2O, a continuación se dividieron en dos alícuotas de 49 µl, que contenía cada una 10 µg de ARN total y se colocaron en dos placas para PCR de 96 pocillos. A cada alícuota se añadieron reactivos para la síntesis de la primera cadena de ADNc (Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System, Carlsbad, CA): 20 µI de MgCl2 25mM, 10 µl de tampón de TI (transcriptasa inversa) 10x, 10 µl de DTT 0,1 M, 2 µl de oligo dT y 2 µl de RNAseOut. A continuación, se añadieron 2 µl de transcriptasa inversa Superscript a una alícuota de cada línea celular y a la alícuota correspondiente de la línea celular se añadieron 2 µl de H2O para hacer un control negativo sin transcriptasa inversa. Todas las muestras se incubaron como sigue: 25°C 10', 42°C 50', 70°C 15'. Las muestras se dispusieron en placas de pocillos profundos y se diluyeron hasta 1,7 ml con H2O. Se usó un robot Multipette (Saigan) para añadir alícuotas de 16,5 µl en cada pocillo de una placa de PCR de tiempos múltiples de 96 pocillos, generando numerosos paneles de PCR de un solo uso de las líneas celulares que, a continuación, se sellaron y conservaron a -20ºC. Cada pocillo de estos paneles representa la primera cadena de ADNc de aproximadamente 100 ng de ARN. Las 82 líneas celulares se extendieron en dos paneles, denominados matrices Nº 118A y Nº 118B. La calidad de la primera cadena de ADNc de los paneles se evaluó mediante un ensayo de PCR multiplex sobre un conjunto de los paneles usando cebadores para dos de los genes más ampliamente expresados, pero moderadamente abundante, CLTC (clatrina) y TFRC (receptor C de la transferrina). Se mezclaron 0,5 µl de los cebadores de clatrina zc42901 (5'CTCATATTGCTCAACTGTGTGAAAAG 3'; SEC ID Nº 34) y zc42902 (5'TAGAAGCCACCTGAACACAAATCTG3'; SEC ID Nº 35) y los cebadores de TFRC zc42599 (5'ATCTTGCGTTGTATGTTGAAAATCAATT3'; SEC ID Nº 36) y zc42600 (5'TTCTCCACCAGGTAAACAAGTCTAC3'; SEC ID Nº 37), con 2,5 µl de tampón 10x y 0,5 µl de mezcla de ADNc polimerasa 2 advantage (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µI de mezcla de dNTP 2,5 mM (Applied Biosystems" Foster City, CA), 2,5 µl de Rediload 10x (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se añadió a cada pocillo del panel de las matrices 118A y 118B. Los parámetros de ciclado fueron los siguientes: 94°C 20", 35 ciclos de 94°C 20", 67°C 80" y un ciclo de 72°C 7'. Diez µl de cada reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y en los geles se puntuó la presencia de un producto de PCR sólido para cada gen específico de los pocillos +TI de cada línea celular.

La expresión del ARNm en los paneles de la primera cadena de ADNc para IL-17RC se ensayo por PCR usando el oligo sentido ZC42756 (5'ctctccaggcccaagtcgtgctct3'; SEC ID Nº 38) y el oligo complementario ZC42757 (5'ttgtcctgggggcctcgtgtctcc3’; SEC ID Nº 39) en las siguientes condiciones de PCR por muestra. 2,5 µl de tampón 10x y 0,5 µl de mezcla de polimerasa de ADNc 2 advantage (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl de mezcla de dNTP 2,5 mM (Applied Biosystems), 2,5 µl de Rediloal 10x (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 0,5 µl de cada cebador sentido y complementario. Las condiciones de ciclado fueron 94°C 2', 35 ciclos de 94°C 1', 66°C 30", 72°C 1,5' y un ciclo de 72°C 7'. Diez µl de cada reacción se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa y se puntuó la expresión positiva o negativa en los geles de IL-17RC.

El ARNm de IL17-RC se expresa ampliamente en muchas líneas celulares que representan un amplio espectro de tejidos y tipos celulares. En particular, IL17RC se expresa de forma constante en líneas de células de sangre periférica distintas a células T, incluyendo monocitos, células B y células de la línea mieloide. También, el ARNm de IL-17RC se expresa con fiabilidad en líneas celulares derivadas de la piel. Otras líneas celulares que expresan IL-17RC son las 5 líneas celulares del intestino grueso que estaban presentes en la matriz.

EJEMPLO 3 Distribución del ARNm en paneles de líneas celulares de ratón usando PCR-TI

El ARN total se purificó a partir de 60 líneas células en reposo y estimuladas crecidas en el laboratorio y la purificación se hizo usando un kit RNeasey de Qiagen (Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, un protocolo de purificación ácido-fenol (Chomczynski y Sacchi, Analytical Biochemistry, 162.156-9, 1987) o un protocolo con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Se dispusieron 5 µg de ARN total de cada línea celular en una placa de 96 pocillos de pocillos profundos y se añadieron a cada pocillo125 µl de NaOAc 3M y 100 µl de Pellet Paint (Novagen, Madison, WI) a continuación, el volumen final se ajustó a 1,25 ml con H2O. Se usó un robot Multipette (Saigan) para añadir alícuotas de 25 µl de la mezcla de ARN seguido de 75 µl de EtOH en cada pocillo de una placa de PCR de tiempos múltiples de 96 pocillos, generándose numerosos paneles de PCR-TI de un solo uso de las líneas celulares que, a continuación, se sellaron y conservaron a -20ºC. El análisis de la PCR-TI se realizó centrifugando primero un panel en una centrífuga de 96 pocillos de Qiagen (Valencia, CA) durante 10’ a

6.000 rpm. Se retiraron los sobrenadantes invirtiendo la placa sobre un papel absorbente. Los precipitados de ARN se lavaron con 100 µl de EtOH al 70%, seguido de una centrifugación durante 5’ a 6.000 rpm. Se eliminó de nuevo el sobrenadante y las placas se dejaron secar al aire hasta que se evaporó el remanente de EtOH. Los precipitados de ARN se resuspendieron en 15 µl de H2O.

La expresión del ARNm de IL-17RC en los paneles de ARN de líneas celulares de ratón se evaluó mediante PCR-TI con zc38910 (5'acgaagcccaggtaccagaaagag3'; SEC ID Nº 40) y zc38679 (5'aaaagcgccgcagccaagagtagg3'; SEC ID Nº 41) en las siguientes condiciones de PCR-TI por muestra: PCR en un paso SuperScript con el kit Platinum Taq, Invitrogen, Carlsbad, CA. Las condiciones de ciclado fueron: 1 ciclo de 48ºC durante 30 minutos, 94ºC durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94º C durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1,5 minutos, seguido de un ciclo de 72ºC durante 7 minutos. Diez µl de cada reacción se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se puntuó la expresión positiva o negativa en los geles de IL-17RC.

El ARNm de IL-17RC murino se expresa en varias líneas celulares de ratón, en particular en células derivadas de médula ósea, como en líneas celulares de osteoblastos, adipocitos y preadipocitos. También el ARNm de IL-17RC de ratón está representado en varias muestras del sistema endocrino, como en líneas celulares estromales del páncreas, líneas celulares de la isleta pancreática y líneas celulares del hipotálamo, glándula salivar y testículos.

EJEMPLO 4 Replegamiento y purificación de pIL-17F producida en E. coli

A) Aislamiento de los cuerpos de inclusión y extracción de pE. 17F

Tras la inducción de la expresión de la proteína en cada fermentación en batch o cultivo en matraz oscilante, el medio de E. coli se centrifuga en botellas de 1 litro a 3.000 rpm en un rotor de adaptadores oscilantes Sorvall. El lavado de la pasta celular para eliminar cualquier contaminación de medio se realiza con Tris 50 mM, pH 8 que contiene NaCl 200 mM y EDTA 5 mM hasta que el sobrenadante está transparente.

Después, los precipitados celulares se resuspenden en tampón de lisis enfriado en hielo (Tris 50 mM, pH 8; EDTA 5 mM; NaCl 200 mM, sacarosa al 10% (p/v); DTT 5 mM; benzamidina 5 mM) hasta 10-20 unidades de densidad óptica a 600 nm. A continuación, esta suspensión se somete a 3 pases a 8.500-9.000 psi en un homogeneizador enfriado APV 2000 Lab para producir una disrupción del lisado celular. La fracción insoluble (cuerpos de inclusión) se recupera mediante centrifugación del lisado celular a 20.000 x g durante 1 hora a 4ºC.

El precipitado de los cuerpos de inclusión resultante de la centrifugación a 20.000xg se pesa y, a continuación, se resuspende en tampón de lavado (Tris 50 mM, pH 8 que contiene NaCl 200 mM, EDTA 5 mM, DTT 5 mM, benzamidina 5 mM) a 10 ml de tampón de lavado por gramo de cuerpos de inclusión. La dispersión completa se consigue homogeneizando con un generador rotor del estator de OMNI international. Esta suspensión se centrifuga a 20.000xg durante 30 minutos a 4ºC. El ciclo de lavado se repite de 3 a 5 veces hasta que el sobrenadante está transparente.

El precipitado lavado final se solubiliza en Guanidina-HCl 7M en tampón Tris 40 mM a pH 8 que contiene sulfito sódico 0,1 M y tetrationato sódico 0,02 M. Se deja que la extracción y la reacción de sulfitolisis procedan con agitación suave a 4ºC durante la noche. La solución resultante de color rosado se centrifuga a 35.000xg durante 1 hora a 4ºC y el sobrenadante transparente, que contiene la pIL17F soluble, se filtra a través de 0,45 µm. B) Procedimiento de replegamiento de pBL-17F

La pIL-17F sulfitolizada y solubilizada se repliega mediante la dilución gota a gota en tampón de replegamiento enfriado en hielo que contiene MES 55 mM, NaCl 10,56 mM, KCl 0,44 mM, PEG (3.400 K) al 0,055%, EDTA 1,1 M, glicerol al 20%, guanidina HCl 0,5 M, arginina 0,75 M y el par redox de glutatión a una proporción

1:1 (GSH 1 mM: GSSG 1mM). El pH del tampón de replegamiento se ajusta a 6,5 con HCl y se añade pIL-17F a una concentración final de 100 µg/ml. Una vez diluido, se permite que la mezcla se agite lentamente en la cámara fría durante 72 horas. C) Recuperación y purificación del producto

La pIL-17F replegada se concentra 10 veces a través de una membrana de 10 kDa de valor de corte en un sistema Lab Scale TFF. A continuación se filtra usando una membrana de 0,45 micrómetros y se ajusta el pH a 5,1 con la adición de ácido acético. El material con pH ajustado se captura mediante cromatografía de intercambio catiónico en una columna SP de flujo rápido de Pharmacia equilibrada en tampón acetato 50 mM, pH 5,1. La pIL-17F se carga por incorporación en proporción 1:5 con el tampón de equilibrado a un caudal de 190 cm/h. Esta dilución disminuye la fuerza iónica permitiendo una unión eficaz del material objetivo a la matriz. Tras completar la carga de la muestra, la columna se lava hasta absorbancia basal con tampón de equilibrado. La columna se lava con NaCl 0,4 M en tampón acetato 50 mM a pH 5,1 y, a continuación, la proteína unida se eluye con un gradiente de 5 VC/(volúmenes de columna) de NaCl 0,4 M a 1,5 M en tampón acetato 50 mM a pH 5,1. La proteína eluye a ~NaCl 1 M y es aproximadamente dimérica al 85% por análisis en PAGE SDS de las fracciones eluidas. Las fracciones que contienen pIL-17F se mezclan y concentran a través de una membrana de ultrafiltración con un valor de corte de 10 kDa usando una célula de agitación Amicon para la preparación de la purificación final y el cambio de tampón mediante cromatografía de exclusión molecular. D) Cambio de tampón por exclusión molecular y formulación

El pool catiónico concentrado (a un volumen del 3-4% del VC) se inyecta a un caudal de 30 cm/h en una columna de exclusión molecular Superdex 75 de Pharmacia equilibrada en tampón fosfato sódico 50 mM que contiene NaCl 109 mM, pH 7,2. El pico de elución simétrico que contiene el producto se diluye hasta una concentración de 1 mg/ml en tampón fosfato sódico 50 mM que contiene NaCl 109 mM, pH 7,2. Finalmente, la pIL-17F se esteriliza por filtración a través de 0,2 micrómetros, se dividen en alícuotas y conservan a 80ºC. El rendimiento final del proceso es del 20%.

EJEMPLO 5 Obtención de una construcción de expresión de IL-17RC soluble de mamífero

Se obtiene una construcción de expresión que contenía IL-17RC [L21-K451] humana-mFc1 (Fc µ2a de ratón BALB/c) mediante PCR solapante y recombinación homóloga usando un fragmento de ADN (SEC ID Nº 42) que codifica el polipéptido IL-17RC (SEC ID Nº 43), un fragmento de ADN que codifica mFc1 (SEC ID Nº 44) y el vector de expresión pZMP20. Los fragmentos se generaron mediante amplificación por PCR.

El fragmento de PCR que codifica IL-17RC [L21-K451] contiene un extremo 5’ solapante con la secuencia del vector pZMP20 en la región codificadora de la secuencia líder pre-pro secreción del activador tisular del plasminógeno optimizada, el dominio extracelular de IL-17RC [L21-K451] y un extremo 3’ solapante con la región que codifica mFc1. En la reacción de amplificación por PCR se usan el oligonucleótido 5’ [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGG AGAGGCTTGTGGGGCCT; SEQ ID Nº 46], el oligonucleótido 3' [TGTGGGCCCTCTGGGCTCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEC ID Nº 47] y un clon de ADN generado previamente de IL-17RC como molde.

El fragmento PCR que codifica mFc1 contiene un extremo 5’ que solapa con la secuencia de IL-17RC, la región que codifica mFc1 y un extremo 3’ que solapa con el vector pZMP20 en la región del sitio interno de entrada de ribosomas del virus de la polio. En la reacción de amplificación por PCR se usan el oligonucleótido 5’ [GACAAATACATCCACAAGGAGCCCAGAGGGCCCACA; SEC ID Nº 48], el oligonucleótido3’ [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGG GA; SEC ID Nº 49] y un clon de ADN generado previamente de mFcl como molde.

Las condiciones de la reacción de amplificación por PCR son las siguientes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido de 55°C, 2 minutos, seguido de 72ºC, 3 minutos; 1 ciclo, 72°C, 10 minutos. Las mezclas de reacción de PCR se desarrollan en un gen de agarosa al 1% y los fragmentos de ADN correspondientes a los tamaños esperados se extraen del gel usando el kit QlAquickTM Gel Extraction (Qiagen, Nº de catálogo: 28704).

Los dos fragmentos de PCR se unieron mediante PCR solapante. Aproximadamente 1 µl de cada uno de los dos fragmentos extraídos del gel se combinan en una reacción de amplificación por PCR usando el oligonucleótido 5’ [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTG GAGAGGCT TGTGGGGCCT; SEC ID Nº 46] y el oligonucleótido 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGG GA; SEC ID Nº 49]. Las condiciones de PCR utilizadas son las siguientes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido de 55 °C, 2 minutos, seguido de 72ºC, 3 minutos; 1 ciclo, 72 °C, 10 minutos. Las mezclas de reacción de PCR se desarrollan en un gel de agarosa al 1% y los fragmentos de ADN correspondientes al tamaño de la inserción se extraen del gel usando el kit QlAquickTM Gel Extraction (Qiagen, Nº de catálogo: 28704).

El plásmido pZM20 es un vector de expresión de mamíferos que contiene un casete de expresión con el promotor MPSV, un sitio Bg/II para la linealización previa a la recombinación en levaduras, una secuencia del péptido señal otPA, un elemento interno de entrada de ribosomas del virus de la polio, el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo C-terminal del dominio transmembrana; un origen de replicación de E. coli; una unidad de expresión marcadora seleccionable de mamífero que comprende un promotor, potenciador y origen de replicación de SV40, un gen DHFR y el terminador de SV40; y secuencias URA3 y CEN-ARS necesarias para la selección y replicación en S. cerevisiae.

El plásmido pZMP20 se digiere con Bg/II antes de la recombinación en levaduras con el fragmento de PCR extraído del gel IL-17RC[L21-K451]-mFc1. Se combinan 100 µl de células de levadura (S. cerevisiae) competentes con 10 µl del ADN de la inserción IL-17RC[L21-K451]-mFc1 y 100 ng del vector pZMP20 digerido con Bg/II, y la mezcla se transfiere a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. La mezcla levadura/ADN se introduce por electropulsación usando una fuente de alimentación (BioRad Laboratories, Hercules, CA) fijada a 0,75 kV (5 kV/cm), ∞ ohmios y 25 µF. Se añaden a la cubeta 600 µl de sorbitol 1,2 M, la levadura se siembre en alícuotas de 100 y 300 µl en dos placas URA-D y se incuba a 30ºC. Después de aproximadamente 72 horas, las levaduras transformante Ura+ de una única placa se resuspenden en 1 ml de H2O y se centrifugan brevemente hasta que sedimentan las células de levadura. Los sedimentos de células se resuspenden en 0,5 ml de tampón de lisis (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM). Se añaden los 500 µl de la mezcla de lisis a un tubo Eppendorf que contiene 250 µl de perlas de vidrio lavadas con ácido y 300 µl de fenol-cloroformo, se agita durante 3 minutos y se centrifuga 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Se transfieren 300 µl de la fase acuosa a un tubo nuevo y el ADN se precipita con 600 µl de etanol, seguido de la centrifugación durante 30 minutos a velocidad máxima. El tubo se decanta y el sedimento se lava con 1 ml de etanol al 70%. El tubo se decanta y el sedimento de ADN se resuspende en 30 µl de Tris 10 mM, pH 8, EDTA 0,1 mM.

La transformación de células hospedadores de E. coli electrocompetentes (DH12S) se realiza usando 5 µl de la preparación de ADN de levadura y 50 µl de células de E. coli. Las células se electropulsaron a 2,0 Kv, 25 µF y 400 ohmios. Tras la electroporación, se añade 1 ml de SOC (triptona de BactoTM al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM) y, a continuación, las células se siembran en placas en alícuotas de 50 y 200 µl en dos platas LB AMP (medio de cultivo LB

(Lennox), agar BactoTM al 1,8% (Difco), ampicilina a 100 mg/ml).

Las inserciones de tres clones de ADN para la construcción se someten a análisis de secuencia y se selecciona un clon que contiene la secuencia correcta. El ADN del plásmido a gran escala se aísla usando un kit disponible en el mercado (QIAGEN Plasmad Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 6 Obtención de construcciones de expresión de IL-17RC soluble de mamífero que expresan IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS y IL-17RC-CFLAG

Una construcción de expresión que contiene IL-17RC [L21-K451] humano con una etiqueta C-terminal, Glu-Glu (CEE), seis His (CHIS) o FLAG (CFLAG), se obtiene mediante PCR y recombinación homóloga usando un fragmento de ADN que codifica IL-17RC [L21-K451] (SEC ID Nº 42) y el vector de expresión pZMP20.

El fragmento de PCR que codifica IL-17RCCEE contiene un solapamiento 5’ con la secuencia del vector pZMP20 en la región codificadora de la secuencia líder pre-pro secreción del activador tisular del plasminógeno optimizado, el dominio extracelular de IL-17RC que codifica [L21-K451], la secuencia de la etiqueta Glu-Glu (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu; SEC ID Nº 53) y un solapamiento 3’ con el vector pZMP20 en la región del sitio interno de entrada de ribosomas del virus de la polio. La reacción de amplificación de PCR utiliza el oligonucleótido 5’ [GTTTCGCTCAGCCAGGAAATCCATGCCGAGTTGAGACGCTTCCGTAGACTGG AGAGGCT TGTGGGGCCT; SEC ID Nº 46], el oligonucleótido 3' [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTCCATGGGCATGTAT TCTTCCT TGTGGATGTATTTGTC; SEC ID Nº 50] y un clon de ADN previamente generado de IL-17RC como molde.

Las condiciones de la reacción de amplificación por PCR son las siguientes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido de 55 °C, 2 minutos, seguido 72ºC, 3 minutos; 1 ciclo, 72 °C, 10 minutos. La mezcla de reacción de PCR se desarrolla en un gel de agarosa al 1% y el fragmento de ADN correspondiente al tamaño esperado se extrae del gel usando el kit QlAquickTM Gel Extraction (Qiagen, Nº de catálogo: 28704).

El plásmido pZMP20 se digiere con Bg/II antes de la recombinación en levaduras con el fragmento de PCR extraído del gel IL-17RCCEE. Se combinan 100 µl de células de levadura (S. cerevisiae) competentes con 10 µl del ADN de la inserción IL-17RCCEE y 100 ng del vector pZMP20 digerido con Bg/II y la mezcla se transfiere a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. La mezcla levadura/ADN se introduce por electropulsación usando una fuente de alimentación (BioRad Laboratories, Hercules, CA) fijada a 0,75 kV (5 kV/cm), ∞ ohmios y 25 µF. Se añaden a la cubeta 600 µl de sorbitol 1,2 M, la levadura se añade en alícuotas de 100 y 300 µl a dos placas URA-D y se incuba a 30ºC. Después de aproximadamente 72 horas, las levaduras transformante Ura+ de una única placa se resuspenden en 1 ml de H2O y se centrifugan brevemente hasta que las células de levadura forman un precipitado. Los sedimentos de células se resuspenden en 0,5 ml de tampón de lisis (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM). Se añaden los 500 µl de la mezcla de lisis a un tubo Eppendorf que contiene 250 µl de perlas de vidrio lavadas con ácido y 300 µl fenol-cloroformo, se agita durante 3 minutos y se centrifuga 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a máxima velocidad. Se transfieren 300 µl de la fase acuosa a un tubo nuevo y el ADN se precipita con 600 µl de etanol, seguido de la centrifugación durante 30 minutos a velocidad máxima. El tubo se decanta y el sedimento se lava con 1 ml de etanol al 70%. El tubo se decanta y el sedimento de ADN se resuspende en 30 µl de Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM.

La transformación de células hospedadores de E. coli electrocompetentes (DH12S) se realiza usando 5 µl de la preparación de ADN de levadura y 50 µl de células de E. coli. Las células se electropulsan a 2,0 Kv, 25 µF y 400 ohmios. Tras la electroporación, se añade 1 ml de SOC (triptona de BactoTM al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM) y, a continuación, las células se colocan en placas en alícuotas de 50 y 200 µl en dos placas LB AMP (medio de cultivo LB (Lennox), agar BactoTM al 1,8% (Difco), ampicilina a 100 mg/ml).

Las inserciones de tres clones de ADN para la construcción se someten a análisis de secuencia y se selecciona un clon que contiene la secuencia correcta. El ADN del plásmido a gran escala se aísla usando un kit disponible en el mercado (QIAGEN Plasmad Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

Se usa el mismo proceso para preparar IL-17RC con una etiqueta his en el extremo C-terminal, compuesta por Gly Ser Gly Gly His His His His His His (IL17RCCHIS; SEC ID Nº 51) o la etiqueta FLAG C-terminal, compuesto por Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (IL-17RCCFLAG; SEC ID Nº 52). Para preparar estas construcciones, en lugar del oligonucleótido 3’ de SEC ID Nº 50, se usa el oligonucleótido 3’ [CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGA TGTCCACCAGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEC ID Nº 54] para generar IL17RCCHIS o se usa el oligonucleótido 3’ [CAACCCGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATACTTATCATCATCATCCTTAT AATCGGATCCCTTGTGGATGTATTTGTC; SEC ID Nº 55] para generar IL17RCCFLAG.

EJEMPLO 7 Transfección y expresión de las construcciones de expresión del receptor IL17RC soluble que expresan la proteína de fusión IL-17RC-mFc1 y las proteínas etiquetadas en el extremo C-terminal IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS r IL-17RC-CFLAG

Tres series de 200 µg de cada una de las construcciones de expresión de IL-17RC soluble de fusión o etiquetadas se digieren por separado con 200 unidades de PvuI a 37ºC durante 3 horas, se precipitan con alcohol de isopropilo y se centrifugan en un tubo de microfuga de 1,5 ml. El sobrenadante se decanta del sedimento y este último se lava con 1 ml de etanol al 70% y se deja incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo se centrifuga en una microfuga durante 10 minutos a 14.000 rpm y se decanta el sobrenadante del sedimento. A continuación, el sedimento se resuspende en 750 µl de medio de cultivo tisular de células CHO en un entorno estéril, se deja incubar a 60ºC durante 30 minutos y se enfría a temperatura ambiente. En cada uno de los tres tubos sedimentan aproximadamente 5 x 106 células CHO que se resuspenden usando la solución de medio de ADN. Las mezclas de ADN/células se colocan en una cubeta de 0,4 cm de paso y se electroporan usando los siguientes parámetros: 950 µF y alta capacitancia a 300 V. A continuación, los contenidos de las cubetas se retirar, se mezclan y diluyen hasta 25 ml con medio de cultivo tisular de células CHO y se colocan en un matraz oscilante de 125 ml. El matraz se coloca sobre un agitador en un incubador a 37ºC, CO2 al 6% con agitación a 120 rpm.

Las células CHO se someten a selección de nutrientes seguida de un paso de amplificación para metotrexato (MTX) 200 nM y, después a MTX 1 µM. La expresión de la proteína de fusión o etiquetada se confirma mediante inmunotrasferencia y se producen células CHO a gran escala que se recogen para la purificación de la proteína.

EJEMPLO 8 Expresión de IL-17RC soluble

Se construyó un plásmido de expresión que contenía IL-17RC-Tbx-C(Fc9) (SEC ID Nº 64) mediante recombinación homóloga usando un fragmento de ADN de IL-17RC_Tbx y el vector de expresión pZMP40. El fragmento se generó mediante amplificación por PCR usando los cebadores zc44531 y zc44545.

El fragmento de PCR de IL-17RC_Tbx contiene una región parcial codificadora del dominio extracelular de IL-17RC, que se obtuvo usando un clon generado previamente de IL-17RC como molde. El fragmento incluye un solapamiento 5’ con la secuencia del vector pZMP40 en la región que codifica otPA, el segmento IL-17RC (restos de aminoácidos del 21 al 451 de la SEC ID Nº 2), una secuencia enlazadora, un sitio de escisión de trombina y un solapamiento 3’ con el vector pZMP40 en la región que codifica Fc9. Las condiciones de la PCR usadas fueron las siguientes: 1 ciclo, 94°C, 5 minutos; 35 ciclos, 94°C, 1 minuto, seguido de 55ºC, 2 minutos, seguido de 72ºC, 3 minutos; 1 ciclo, 72 °C, 10 minutos.

Las mezclas de reacción de PCR se desarrollaron en un gel de agarosa al 1% y se extrajo del gel una banda que se correspondía con los tamaños de las inserciones usando el kit QlAquickTM Gel Extraction (Qiagen, Nº de catálogo: 28704).

El plásmido pZMP40 es un vector de expresión de mamíferos que contiene un casete de expresión que tiene el promotor MPSV, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificadores, una secuencia del péptido señal otPA y la secuencia de Fc9, un elemento del sitio interno de entrada de ribosomas (IRES) del virus de la polio y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo C-terminal del dominio transmembrana; un origen de replicación de E. coli; una unidad de expresión de marcador seleccionable de mamíferos que contiene el promotor, potenciador y origen de replicación de SV40, un gen DHFR y el terminador de SV40 y las secuencias de URA3 y CEN-ARS necesarias para la selección y replicación el S. cerevisiae. Se construyó a partir de pZMP21 (publicación de patente Nº US 2003/0232414 A1; depositado en la American Type Culture Collection y denominada ATCC Nº PTA-5266).

El plásmido pZMP40 se cortó con BgIII antes de la recombinación en levaduras con el fragmento de PCR. Cien microlitros de células de levaduras (S. cerevisiae) competentes se combinaron independientemente con 10 µl de la inserción de ADN (SEC ID Nº 66) y 100 ng del vector pZMP40 cortado y la mezcla se transfirió a un cubeta de electroporación de 0,2 cm. La mezcla levadura/ADN se introdujo por electropulsación usando una fuente de alimentación (BioRad Laboratories, Hercules, CA) fijada a 0,75 kV (5 kV/cm), ∞ ohmios y 25 µF. Se añadieron a la cubeta 600 µl de sorbitol 1,2 M, las levaduras se sembraron en alícuotas de 100 y 300 µl en dos placas URA-D y se incubaron a 30ºC. Después de aproximadamente 72 horas, las levaduras transformantes Ura+ de una única placa se resuspendieron en 1 ml de H2O y se centrifugaron brevemente hasta que las células de levadura formaron un precipitado. Los sedimentos de células se resuspenden en 0,5 ml de tampón de lisis (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1 %, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM). Se añadieron los 500 µl de la mezcla de lisis a un tubo Eppendorf que contenía 250 µl de perlas de vidrio lavadas con ácido y 300 µl fenol-cloroformo, se agitó durante 3 minutos y se centrifugó 5 minutos en una centrífuga Eppendorf a velocidad máxima. Se transfirieron 300 µl de la fase acuosa a un tubo nuevo y el ADN se precipitó con 600 µl de etanol (EtOH), seguido de la centrifugación durante 30 minutos a velocidad máxima. El tubo se decantó y el sedimento se lavó con 1 ml de etanol al 70%. El tubo se decantó y el sedimento de ADN se resuspendió en 30 µl de TE.

La transformación de las células hospedadoras de E. coli electrocompetentes (DH12S) se realizó usando 5 µl del ADN de levadura preparado y 50 µl de células. Las células se electropulsaron a 2,0 Kv, 25 µF y 400 ohmios. Tras la electroporación, se añadió 1 ml de SOC (triptona de BactoTM al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM, glucosa 20 mM) y, a continuación, las células se sembraron en alícuotas de 50 y 200 µl en dos placas LB AMP (medio de cultivo LB (Lennox), agar BactoTM al 1,8% (Difco), ampicilina a 100 mg/ml).

Las inserciones de tres clones de la construcción se sometieron a análisis de secuencia y se seleccionó un clon para cada construcción, que contenía la secuencia correcta. El ADN del plásmido a mayor escala se aisló usando un kit disponible en el mercado (QIAGEN Plasmad Mega Kit, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

A continuación, se digirieron tres series de 200 µg de la construcción IL17RC[L21-K451]_Tbx_C(Fc9) con 200 unidades cada uno de PvuI a 37ºC durante tres horas y después, se precipitaron con IPA y se centrifugaron en un tubo de microfuga de 1,5 ml. El sobrenadante se separó del sedimento por decantación y este último se lavó con 1 ml de etanol al 70% y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo se centrifugó en una microfuga durante 10 minutos a

14.000 rpm y el sobrenadante se separó del sedimento por decantación. A continuación, el sedimento se resuspendieron en 750 µl de medio PF-CHO en un entorno estéril, se incubó a 60ºC durante 30 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. Las células 5E6 APFDXB 11 se centrifugaron en tres tubos diferentes y se resuspendieron usando la solución DNA-media. Las mezclas de ADN/células se colocaron en una cubeta de 0,4 cm de paso y se electroporaron usando los siguientes parámetros: 950 µF, alta capacitancia y 300 V. A continuación, el contenido de las cubetas se retiró, mezcló y diluyó hasta 25 ml con medio PF-CHO y se colocó en un matraz oscilante de 125 ml. El matraz se colocó sobre un agitador en un incubador a 37ºC, CO2 al 6% con agitación a 120 rpm.

La línea celular se sometió a selección de nutrientes seguido de un paso de amplificación para metotrexato (MTX) 200 nM y, después a MTX 1 µM. La expresión se confirmó mediante inmunotransferencia y la línea celular se produjo a gran escala, seguida de la purificación de la proteína.

EJEMPLO 9 Purificación de IL-17RC soluble a partir de células CHO

Los medios condicionados de las células CHO que expresaban IL-17RCTbX-Fc9 (SEC ID Nº 64) se concentraron aproximadamente 10 veces con un sistema de flujo tangencial Pellicon-II frente a dos casetes de membrana con un valor de corte de 30 kDa de peso molecular Biomax de 0,1 m2 (Millipore, Bedford, MA). Los medios concentrados se ajustaron a pH 5,5 con ácido acético glacial, 0,2 mM estéril filtrado, a continuación se cargaron en una resina Proteína G sepharosa de flujo rápido (Pharmacia, Piscataway, NJ) mediante cromatografía por lotes durante la noche a 4ºC. Antes de cargar los medios condicionados ajustados a pH, la resina de proteína G se equilibró previamente con 5 volúmenes de columna (aproximadamente 150 ml) de acetato sódico 25 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5. La relación entre los medios acondicionados ajustados a pH y la resina fue de 33:1 (v/v).

El proceso de cromatografía por lotes se realizó a temperatura ambiente (aproximadamente 21ºC). Los medios condicionados, en batch, ajustados a pH y filtrados por 0,22 µm se vertieron en una columna de vidrio vacía de 5,5 x 20,5 cm (BioRad, Hercules, CA) y se empaquetaron por gravedad. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (aproximadamente 300 ml) de acetato sódico 25 mM, NaCl 150 mM, pH 5,5. A continuación, la proteína unida se eluyó por pH con glicina 100 mM, pH 2,7. Se recogieron fracciones de 9 ml que se neutralizaron inmediatamente con 1 ml de Tris 2 M, pH 8. Las fracciones recogidas se analizaron mediante geles PAGE en presencia de SDS teñidos con Coomassie. Las fracciones que contenían IL-17RC-Tbx-Fc9 se mezclaron y concentraron aproximadamente 6 veces usando un concentrador por centrifugación Biomax con un valor de corte de 5 kDa de peso molecular (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante.

Las fracciones mezcladas y concentradas se dializaron entonces a 4ºC exhaustivamente frente a tampón fosfato salino 1x, pH 7,3 (Sigma, St. Louis, MO) usando una membrana de valor de corte de peso molecular de 7 kDa Slide-A-Lyzer (Pierce, Rockford, IL). IL-17RC-TbX-Fc9 formulado en tampón fosfato salino 1x, pH 7,3, se filtró a esterilidad por un filtro de 0,22 µm antes de ser divididas en alícuotas y conservadas a -80ºC.

EJEMPLO 10 Unión de IL-17A e IL-17F a IL-17RC humano

A) Unión de citocinas biotilinadas a células transfectadas

En este apartado, se comprobó la capacidad de células de riñones de cría de hámster (BHK, por sus siglas en inglés) que habían sido transfectados con vectores de expresión que codifican el receptor de la IL-17 humana (SEC ID Nº 21), IL-17RC humano (SEC ID Nº 2) o ambos receptores, para unirse a IL-17A humana y a IL-17F humana biotilinadas. Las células se recogen con verseno, se cuentan y diluyen a 107 células por ml en medio de tinción (MT), que es HBSS más albúmina sérica bovina (BSA) a 1 mg/ml, Hepes 10 mM y azida sódica al 0,1% (p/v). La IL17A human (SEC ID Nº 14) y la IL-17F humana (SEC ID Nº 16) biotiniladas se incuban con las células en hielo durante 30 minutos a diversas concentraciones. Después de 30 minutos, el exceso de citocina se elimina con MT y las células se incuban con una dilución 1:100 de estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SA-PE) durante 30 minutos en hielo. Se elimina el exceso de SA-PE y las células se analizan mediante citometría de flujo. La cantidad de citocina unida se cuantifica a partir de la intensidad media de fluorescencia de la tinción de citosina. En este análisis encontramos que la IL-17A humana se une tanto al receptor IL17R humano como a IL-17RC en grado similar. También, la IL-17F humana se une a IL-17RC a nivel similar y, aunque se une de forma detectable a IL-17R, lo hace a un nivel mucho menor que el observado con IL-17A. B) Unión de citocinas biotiniladas a células mononucleares de sangre periférica humanas.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas se prepararon a partir de sangre completa mediante centrifugación en gradiente de densidad de ficoll. Las PBMC, a 107 células por ml, se incubaron simultáneamente con IL-17A o IL-17F biotiniladas a 1 µg/ml y anticuerpos conjugados con fluorocromo frente a proteínas específicas de la superficie celular diseñados para distinguir entre las distintas estirpes de leucocitos. Estos marcadores son CD4, CD8, CD19, CD11 b, CD56 y CD16. Se elimina el exceso de anticuerpo y citocina, y la unión específica de citocina se detecta incubando con SA-PE como se describió anteriormente. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo y, a partir de este análisis se encontró que la IL-17A humana se une a prácticamente toda las poblaciones de PBMC examinadas, pero la IL-17F humana no se une de forma detectable a ninguna población. C) Inhibición de la unión específica de IL17A e IL-17F humanas biotiniladas con citocina no marcada.

Los estudios de unión se realizaron como se describió anteriormente, aunque en la reacción de unión se incluye un exceso de IL-17A e IL-17F humanas no marcadas. En estudios con células BHK, la cantidad de citocina no marcada se varió a lo largo de un intervalo de concentraciones y se encontró que la adición de IL-17A no marcada competía por la unión de IL-17A y IL-17F tanto a IL-17RC como a IL-17R. Sin embargo, la IL-17F no marcada competía por la unión de IL-17A e I L17F a IL-17RC, pero no competía de forma eficaz por la unión a IL-17R. Esto indica que tanto IL-17A como IL-17F se une específicamente al IL-17RC y que se unen a un sitio que es idéntico o solapa significativamente, ya que presenta competición cruzada para la unión. También, IL-1 7A compite por la unión relativamente débil de IL-17F a IL-17R, lo que indica que estas dos citocinas también se unen a una región similar del IL-17R, aunque IL-17F se une a IL-17R con una afinidad mucho más reducida en relación con IL-17RC. D) Inhibición de la unión específica de IL-17A e IL-17F humanas biotiniladas con IL17RC e IL-17R solubles.

Los estudios de unión se realizaron como se describe anteriormente, excepto porque se incluye una forma soluble de IL-17RC o IL-17R en las reacciones de unión. Estos receptores solubles son proteínas de fusión derivadas del dominio extracelular de cada receptor fusionado con la región constante (Fc) de IgG1. Se encuentra que IL-17RC soluble inhibe la unión tanto de IL-17A como de IL-17F a las célula BHK transfectadas con IL-17R e IL-17RC. Sin embargo, el IL17R soluble inhibe la unión de IL-17A a ambos receptores solubles, aunque no bloquea de forma eficaz la unión de IL-17F a IL-17RC, en concordancia con la mala unión de IL-17F al IL-17R.

EJEMPLO 11 Unión de IL-17A e IL-17F a IL-17RC

A) Inhibición de la unión con ligando frío

Las células BHK transfectadas con hIL-17RC (SEC ID Nº 2) e IL-17R (SEC ID Nº 21) se sembraron en placas a 40.000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (Costar 3527) dos días antes del ensayo. IL-17A (SEC ID Nº 14) e IL-17F (SEC ID N1. 16) que se habían marcado radiactivamente por el procedimiento de Iodobead se añadieron independientemente a pocillos por triplicado a 10 ng/ml con un total de 250 µl/pocillo en tampón de unión (medios RPMI 1640 (JRH 51502500M) con albúmina sérica bovina a 10 mg/ml (Gibco 15260-037)). Se añadieron competidores fríos a un exceso molar de 100 veces. Los competidores probados fueron IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F e IL-21. Los pocillos se incubaron en hielo durante 1 hora, seguida de dos lavados con PBS (Invitrogen 20012-027) y un lavado con una solución de alta concentración de sal (NaCl 1,5 M, HEPES 50 mM pH 7,4). Los pocillos se extrajeron con 500 µl de NaOH 0,8 M durante 30 min a temperatura ambiente y se determinó el número de cuentas por minuto en un contador gamma (Packard Cobra II A5005).

Los resultados indicaron que un exceso 100x molar de IL-17A e IL-17F frías 100x molar era capaz de reducir la unión de IL-17A marcada con 125I a BHK hIL17RC aproximadamente 7 veces mientras que IL-17B, C, D, E e IL-21 no tenían efecto sobre la unión. Un exceso 100x molar de IL-17A fría reducía la unión de IL17A marcada con 125I a BHK IL-17R aproximadamente 4 veces mientras que IL17B, C, D, E, F e IL-21 no tenían efecto sobre la unión. Un exceso 100x molar de IL-17A e IL-17F reducía la unión de 125IL-17F a BHK hIL-17RC aproximadamente 4 y 5 veces, respectivamente, mientras que IL-17B, C, D, E e IL-2 no tenían efecto sobre la unión. B) Inhibición de la unión con receptor soluble

La unión a células BHK transfectadas con hzytor14 (SEC ID Nº 2) e IL-17R (SEC ID Nº 21) se realizo como en el primer punto, aunque se usó un exceso 100 veces molar de hIL-17RCx1/Fc9 soluble (Ejemplo 8) e IL-17R/Fc soluble (obtenido de R&D; Ref. 177-IR) en lugar del ligando frío en la competición. Las células se lavaron, extrajeron y contaron como en la primera parte.

hIL-17RC/Fc soluble inhibía la unión de 17F a BHK hIL-17RC marcada con 125I con una IC50 de un exceso molar 10x media de tres experimentos. La inhibición de hIL-17RC/Fc soluble de -IL-17A marcada con 125Ien la misma línea celular ofrecía una IC50 media de un exceso molar 20x y la inhibición de IL-17R/Fc soluble de IL-17A marcada con 125I ofrecía una IC50 media de un exceso molar 20x. C) Saturación de unión

5 Las células BHK transfectadas se sembraron en placas de 24 pocillos como en el primer punto. Se añadieron IL-17A e IL-17F marcadas radiactivamente empezando a una concentración de 4 nM en 8 diluciones 1:3 (hasta a una concentración de 1,83 pM) por triplicado con un total de 250 µl/pocillo en tampón de unión. Por separado, se añadió un exceso molar de 100 veces de ligando frío a

10 cada punto de dilución. Las células se lavaron, extrajeron y contaron como en la primera parte. Los recuentos específicos por minuto se representaron frente a la concentración de ligando marcado radiactivamente restando los recuentos con el exceso de 100 veces de los recuentos sin competencia en cada punto de dilución. Estos datos normalizados se representaron para obtener curvas de saturación de

15 unión para cada combinación de ligado marcado radiactivamente y células BHK transfectadas. La Tabla 4 muestra los valores de afinidad calculados a partir de los tres experimentos. Tabla 4

125I IL-17A+BHK hIL-17RC 125I IL-17A+BHK hIL-17R

1.

180 pM 1. 2,5 +/-0,2 nM

2.

200 pM 2. 4,5 +/-0,3 nM

3.

370 pM 3. 5,9 +/-0,1 nM 125I IL-17F+BHK hIL-17RC 125I IL-17F+BHK hIL-17R

1.

50 pM 1. Muy baja afinidad

2.

60 pM 2. Muy baja afinidad

3.

80 pM 3. Muy baja afinidad

Las curvas de unión a un sitio se aproximan más a la unión de IL-17A e IL

20 17F a IL-17R Las curvas de unión a dos sitios se aproximan más a la unión de IL17A e IL-17F a hIL-17RC. El valor mostrado arriba es el sitio de unión de alta afinidad. El sitio de unión de baja afinidad tenía una afinidad muy baja y variaba ampliamente entre los tres experimentos.

25 EJEMPLO 12 Respuesta de las células Nih3t3 murinas a IL-17A e IL-17F humanas. A) Siembra de las células e infección con el adenovirus indicador kz142. Las células Nih3t3, derivadas de fibroblastos de ratón (descritos en la

ATCC) Nih3t3, se distribuyeron en placas a razón de 5.000 células/pocillo en placas de cultivo celular blancas duras 96 pocillos recubiertas (Nº de cat.: 3.917. Costar) usando medio DMEM/FBS al 10% con glutamina, suplementado con piruvato y se cultivaron durante una noche a 37ºC y con CO2 al 5%. El segundo día, se retiró el medio de siembra y se prepararon partículas de adenovirus Kz142 a una multiplicidad de infección de 5.000 partículas/pocillo en DMEM/FBS al 1%, que contenía glutamina suplementado con piruvato y se cultivaron durante la noche a 37ºC y con CO2 al 5%. B) Ensayo de luciferasa para medir la activación de IL-17A y F de las células nih3t3 infectadas con el adenovirus indicador kz142

Después de la incubación durante la noche con la partícula indicadora de adenovirus, se prepararon los tratamientos con los ligandos IL-17A e IL-17F humanas en medios sin suero suplementado con BSA al 28%. Se eliminaron las partículas de adenovirus y los medios y se administraron dosis apropiadas del ligando por triplicado. La incubación a 37ºC con CO2 al 5% se continuó durante 4 horas, tras lo cual se retiraron los medios, las células se lisaron durante 15 minutos y se determinó la media de la intensidad de fluorescencia (MIF) usando el sistema de ensayo y los reactivos de la luciferasa. (Nº de cat.: e1531 Promega, Madison, WI) y un luminómetro de Microplate. La actividad se detectó a concentraciones que oscilaban de 0,1 a 1.000 ng/ml de IL-17A e IL-17F humanas, lo que generaba valores de EC50 de aproximadamente 50 ng/ml para ambos ligandos. Estos datos sugieren que las células nih3t3 portan receptores para estos ligandos y que IL-17A e IL-17F activan el factor de transcripción Nfκb/Ap-1.

EJEMPLO 13 Las células Nih3t3 murino expresan ambos receptores IL-17 e IL-17RC

El análisis por PRC-TI del ARN de nih3t3 demostró que estas células son positivas para la expresión de los receptores de IL-17 e IL-17RC, en consistencia con su respuesta nfkb/ap1 a la mediación de IL-17A e IL-17F humanas, estando mediado por uno o ambos receptores.

DETALLES DE LA PCR-RI: a) PCR de cytor14 de ratón

La primera cadena del ADNc se preparó a partir del ARN total aislado de células nih3t3 usando procedimientos convencionales. La PCR se aplicó usando la polimerasa HotStar y las recomendaciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA) con el cebador sentido zc38910, 5' ACGAAGCCCAGGTACCAGAAAGAG 3' (SEC ID Nº 56) y el cebador complementario, zc 38679, 5' AAAAGCGCCGCAGCCAAGAGTAGG 3' (SEC ID Nº 57) y 35 ciclos de amplificación. La electroforesis en gel de agarosa mostró un único amplicón sólido del tamaño de 850 pb previsto. B) PCR de IL-17R de ratón

La primera cadena del ADNc se preparó a partir del ARN total aislado de células nih3t3 usando procedimientos convencionales. La PCR se aplicó usando la polimerasa HotStar y las recomendaciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA) con el cebador sentido zc38920, 5' CGTAAGCGGTGGCGGTTTTC 3' (SEC ID Nº 58) y el cebador complementario zc 38521, 5' TGGGCAGGGCACAGTCACAG 3' (SEC ID Nº 59) y 35 ciclos de amplificación. La electroforesis en gel de agarosa mostró un único amplicón sólido del tamaño de 498 pb previsto.

EJEMPLO 14 Creación de un clon de ensayo de Nih3t3 estable que expresa el factor de transcripción ap1/nfkb

La línea celular murina nih3t3 descrita anteriormente se transfectó de forma estable con la construcción indicadora kz142 ap1/nfkb, que contenía un marcador seleccionable por neomicina. El conjunto de transfección resistente a Neo se sembró a una densidad clonal. Los clones se aislaron usando cilindros de clonación y se analizaron mediante el ensayo de la luciferasa usando el ligando IL-17A humano como inductor. Se seleccionaron los clones con la media de intensidad de fluorescencia (MIF) más alta (a través de luciferasa ap1/NfkB) y el fondo más bajo. Se seleccionó una línea celular transfectante estable que se denominó nih3t3/kz142.8.

EJEMPLO 15 Inhibición de la activación por IL-17A e IL-17F humanas en células Nih3t3 murinas usando quimeras de receptores IL-17RC e IL-17/FC solubles

Se usaron formas solubles de IL-17RC o IL-17R como antagonistas de la activación de IL-17A e IL-17F humanas de elementos ap1/nfkb en un ensayo de luciferasa. Estos receptores solubles son proteínas de fusión derivadas del dominio extracelular de cada receptor fusionado con la región constante (Fc) de IgG1. La proteína de fusión IL-17R FC humana soluble se compró (quimera IL-17R/FC humana recombinante, número de catálogo 177-1R-100, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Mn). La quimera IL-17RC FC humana soluble (IL-17RcsR/FC9) se construyó como se ha descrito anteriormente. Se encontró que un exceso de IL17RCsR/FC9 y de quimera IL-17RsR/FC humana inhibe los niveles EC50 de la mediación de IL-17A e IL-17F humanas en la activación de apl1/nfkb de la línea celular de ensayo nih3t3/kz142.8 murina.

La proteína IL-17RCsR/FC9 mostró la potencia mayor para antagonizar la activación de IL-17F y la quimera IL-17RsR/FC mostró la potencia mayor para antagonizar la activación de IL-17A.

EJEMPLO 16 El ARNm de IL-17F está regulado por incremento en un modelo murino de asma

Los niveles de ARNm de IL-17F se determinaron en un modelo de sensibilización y estimulación de las vías respiratorias en ratones. Grupos de ratones de 8 a 10 semanas de edad fueron sensibilizados mediante inyección intraperitoneal de 10 µg de alergeno 1 recombinante de Dermatophagoides pteronyssinus (DerP1) (Indoor biotechnologies, Cardiff, UK) en Imject Alum (Pierce) al 50% los días 0 y 7. Siete días después, los ratones fueron estimulados en 3 días consecutivos (días 14, 15 y 16) con 20 µg de DerP1 en 50 µl de PBS. Hubo 4 ratones representativos de este grupo. Como controles negativos se incluyeron 5 ratones a los que se administró una sensibilización con tampón fosfato salino (PBS), seguido de la estimulación con PBS. Adicionalmente, 3 ratones recibieron sensibilización con DerP1, seguida de una estimulación con PBS. Cuarenta y ocho horas después de la estimulación con el alergeno o con el control se recogió el tejido pulmonar completo y se aisló el ARN total.

La primera cadena del ADNc se preparó usando cantidades idénticas de ARN total de cada sujeto. La PCR de IL-17F se aplicó usando la polimerasa HotStar de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) y las recomendaciones de fabricación. La PCR de IL-17F utilizó 35 ciclos de amplificación con el cebador sentido, zc46098, 5' ACTTGCCATTCTGAGGGAGGTAGC 3' (SEC ID Nº 60) y el cebador complementario, 46099, 5' CACAGGTGCAGCCAACTTTTAGGA 3' (SEC ID Nº 61). Para establecer que la calidad del molde era uniforme entre todos los sujetos, se aplicó una PCR de beta actina a la misma cantidad de cada molde usado en la amplificación de IL-17F. La PCR de B actina incluyó 25 ciclos de PCR con el cebador sentido, zc44779, 5' GTGGGCCGCTCTAGGCACCA 3' (SEC ID Nº 62) y el cebador complementario, zcc44776, 5' CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG 3' (SEC ID Nº 63).

Los 4 ratones del grupo de tratamiento de sensibilización con DerP1 y estimulación con DerP1 (la estimulación del asma) mostraron una fuerte amplificación de IL-17F. Por el contrario, se observó una débil amplificación de IL17F en los controles negativos, incluso en 3 de los 3 sujetos que representaban el grupo de tratamiento de sensibilización con DerP1/estimulación con PBS y en 5 de los 5 sujetos del grupo de tratamiento de sensibilización con PBS/estimulación con PBS. La amplificación de B actina era, al menos, tan fuerte para los controles negativos como para los sujetos estimulados para el asma, lo que demuestra que el control negativo débil de amplificación de IL-17F no era debido a problemas con el molde.

EJEMPLO 17 Transfección de células COS secreción por trampa

A) La transfección de células Cos y los ensayos de secreción por trampa muestran que IL-17RCsR/Fc9 e IL-17F son un par receptor/ligando

Se usó una secreción por trampa para emparejar el IL-17RC humano (SEC ID Nº 2) con la IL-17F humana (SEC ID Nº 16). La proteína de fusión IL17RCsR/Fc9 soluble (Ejemplo 8) se usó como reactivo de unión en un ensayo de secreción. Vectores de expresión que contenían ori de SV40 y el ADNc de las IL17B, C, D, E y F humanas se transfectaron de forma transitoria en células COS. La unión de IL-17RCsR/Fc9 a células COS transfectadas se realizó usando el ensayo de secreción por trampa descrito a continuación. Sólo se observó unión positiva de IL-17RCsR/Fc9 a IL-17F humana. Estos resultados demostraron el hallazgo novedoso de que IL-17RC e IL-17F humanos son un par receptor/ligando. B) Transfecciones de células COS

La transfección de células COS se realizó como sigue: mezclar 3 µl de ADN mezclado y 5 µl de lipofectaminaTM en 92 µl de medio DMEM sin suero (55 mg de piruvato sódico, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 µg de selenio y 5 mg de fetuina en 500 ml de DMEM), incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos y, a continuación añadir 400 µl de medio DMEM sin suero. Añadir esta mezcla de 500 µl a 1,5x105 células COS/pocillo sembradas en placas de cultivo tisular de 12 pocillos e incubar durante 5 horas a 37ºC. Añadir 500 µl de medio DMEM con FBS al 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato sódico y 146 mg de L-glutamina en 500 ml de DMEM) e incubar durante la noche. C) Ensayo de secreción por trampa

La secreción por trampa se realizó como sigue: el medio de las células se lavó con PBS y, a continuación, las células se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 1,8% en PBS. A continuación, las células se lavaron con TNT (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M y Tween 20 al 0,05% en H2O) y se permearon con Tritón-X en 0.1% en PBS durante 15 minutos y se lavaron de nuevo con TNT. Las células se bloquearon durante 1 hora con TNB (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M y reactivo de bloqueo al 0,5% (Kit TSA-Direct de NEN Renaissance) en H2O), y se lavaron de nuevo con TNT. Las células se incubaron durante 1 hora con proteína de fusión del receptor IL-17Rcx1sR/FC9 humano soluble. A continuación, las células se lavaron con TNT. Las células se incubaron durante otra hora con anticuerpos de cabra anti-Ig humana-HRP (específica de Fc) diluida 1:200. Las células se lavaron de nuevo con TNT.

La unión positiva se detectó con reactivo de fluoresceina tiramida diluida

1:50 en tampón de dilución (kit de NEN), se incubó durante 4-6 minutos y se lavó con TNT. Las células se conservaron con medio de montaje Vectashield (Vector Labs Burlingame, CA) diluido 1:5 en TNT. Las células se visualizaron usando un filtro de FITC en microscopio de fluorescencia.

EJEMPLO 18 Generación de anticuerpos monoclonales murinos anti-IL-17RC humano

A. Inmunización para la generación de anticuerpos anti-IL-17RC

1. IL-17RC-muFc soluble

Ratones intactos o que no expresaban IL-17RC de 6 a 12 semanas se inmunizaron mediante inyección intraperitoneal con 25-50 µg de proteína IL-17RCmuFc humana soluble (Ejemplo 23) mezclado en relación 1:1 (v:v) con adyuvante Ribi (Sigma) en un programa bisemanal. Siete a diez días después de la tercera inmunización, se tomaron muestras de sangre mediante sangrado retroorbital, se recogieron los sueros y se evaluó su capacidad para inhibir la unión de IL-17 o IL17F a IL-17RC en ensayos de neutralización (p. ej., descritos en este documento) y para teñir células 293 transfectadas con IL-17RC frente a no transfectadas en un ensayo de tinción FACS. Se continuó inmunizando a los ratones y se tomaron muestras de sangre que se evaluaron como se describió anteriormente hasta que los valores de neutralización se estabilizaron. En este momento, los ratones con los valores de neutralización superiores se inyectaron por vía intravascular con 25-50 µg de proteína IL-17RC-Fc soluble en PBS. Tres días después, se extrajeron el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se usaron para la generación de hibridomas usando, por ejemplo, células de mieloma de ratón (P3-X63Ag8.653.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la técnica usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica (p. ej., véase Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123:1548-50, 1979 y Lane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985).

2. IL-17RC, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS e IL-17RC-CFLAG solubles

Ratones intactos o que no expresaban IL-17RC de 6 a 12 semanas se inmunizan mediante inyección intraperitoneal con 25-50 µg de proteínas IL-17RCCEE, IL-17RC-CHIS o IL-17RC-CFLAG humanas solubles mezcladas en relación

1:1 (v:v) con adyuvante Ribi (Sigma) en un programa bisemanal. Siete a diez días después de la tercera inmunización, se toman muestras de sangre mediante sangrado retroorbital, se recogen los sueros y se evalúa su capacidad para inhibir la unión de IL-17 o IL-17F a IL-17RC en ensayos de neutralización (p. ej., descritos en este documento) y para teñir células 293 transfectadas con IL-17RC frente a no transfectadas en un ensayo de tinción FACS. Se continúa inmunizando a los ratones y se toman muestras de sangre que se evalúa como se describió anteriormente hasta que los valores de neutralización se estabilizaron. En este momento, los ratones con los títulos de neutralización superiores se inyectaron por vía intravascular con 25-50 µg de proteína antígeno IL-17RC, IL-17RC-CEE, zcytor-CHIS o IL-17RC-CFLAG solubles en PBS. Tres días después, se extraen el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se usan para la generación de hibridomas usando, por ejemplo, células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.6s3.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la técnica, usando los procedimientos convencionales conocidos en la técnica (p. ej., véase Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123:1 S48-S0, 1979 y Lane, R.D. J Immunol Methods 81:223-8, 1985).

3. Transfectantes P815 que expresan el IL-17RC

Ratones DBA/2 hembras de seis a diez semanas se inmunizan mediante inyección intraperitoneal de 1x105 células P815 vivas transfectadas, por ejemplo, células P815/1L-17RC (p. ej, 0,5 ml a una densidad celular de 2x105 células/ml). Antes de la inyección, las células se mantienen en la fase de crecimiento exponencial. Para la inyección, las células se recogen, lavan tres veces con PBS y, a continuación, se resuspenden en PBS a una densidad de 2x105 células/ml. En este modelo, los ratones desarrollan un tumor con ascitis a las 2-3 semanas y progresan hasta la muerte a las 4-6 semanas a no ser que se produzca una respuesta inmune frente al antígeno diana transfectado. A las tres semanas, los ratones si hinchazón abdominal aparente (indicativa de ascitis) se reinmunizan como anteriormente a intervalos de 2-3 semanas. Siete a diez días después de la segunda inmunización, se toman muestras de sangre mediante sangrado retroorbital, se recogen los sueros y se evalúa su capacidad para inhibir la unión de IL-17 o IL-17F a IL-17 o IL-17RC en ensayos de neutralización (p. ej., descritos en este documento) y para teñir células 293 transfectadas con IL-17RC frente a no transfectadas en un ensayo de tinción por FACS. Se continúa inmunizando a los ratones y se toman muestras de sangre que se evalúan como se describió anteriormente hasta que los valores de neutralización se estabilizan. En este momento, los ratones con los valores de neutralización más altos se inyectaron por vía intraperitoneal con 1 x 105 células P815 transfectadas vivas. Cuatro días después, se extraen el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se usan para la generación de hibridomas usando, por ejemplo, células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.II) u otras líneas celulares apropiadas en la técnica, usando procedimientos convencionales conocidos en la técnica (p. ej., véase Kearney, J.F. et al., supra y Lane, R.D. supra).

Una alternativa al esquema de inmunización anterior con células P815 transfectadas vivas supone la inyección intraperitoneal de 1-5x106 células transfectadas irradiadas cada 2-3 semanas. En esta técnica, ningún animal desarrolla ascitis ni muere. En su lugar, se controla la aparición en los animales de una respuesta inmunitaria neutralizante frente a IL-17RC en sus sueros como se subraya anteriormente, empezando con un sangrado después de la segunda inmunización. Una vez que los valores de neutralización han alcanzado un nivel máximo, los ratones con los valores más altos reciben una inyección intraperitoneal perfusión de 5 x 106 células irradiadas y cuatro días después, se extraen el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se usan para la generación de hibridomas usando, por ejemplo, células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.6S3.3.12.11) u otras líneas celulares apropiadas en la técnica, usando procedimientos (p. ej., véase Kearney, J.F. et al., supra y Lane, R.D. supra).

B. Selección de las fusiones de hibridomas de anticuerpos que se unen a IL-17RC e inhiben la unión de IL-17 o IL-17F a IL-17RC

Se realizan tres selecciones primarias diferentes en los sobrenadante de los hibridomas a los 8-10 días después de la fusión. En el primer ensayo, se comprobó la capacidad de los anticuerpos de los sobrenadantes para unirse a las proteínas IL-17RC, IL-17RC-mufc, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS o IL-17RC-CFLAG humanas solubles unidas a placas mediante ELISA usando reactivos secundarios de cabra anti-cadena ligera kappa y lambda de ratón conjugados con HRP para identificar anticuerpos de ratón unidos. Para demostrar la especificidad de la porción IL-17RC de las proteínas de fusión de IL-17RC, se evaluaron los sobrenadantes positivos en el ensayo inicial sobre una proteína de fusión no relevante de la misma región Fc murina (mG2a), secuencia EE, secuencia HIS o secuencia FLAG. Se consideró que el anticuerpo de aquellos sobrenadantes que se unían a la proteína de fusión IL17RC y no a la proteína no relevante muFc ni a otras proteínas que contenían la secuencia de la proteína de fusión era específico de IL-17RC. En el segundo ensayo, se evaluó mediante ELISA la capacidad de los anticuerpos de todos los sobrenadantes de hibridomas para inhibir la unión de la IL-17 humana biotinilada o de la IL-17F humana biotinilada a IL-17RC-muFc o a proteínas de fusión de IL17RC unidas a placas.

Todos los sobrenadantes que contenían anticuerpos que se unían específicamente al IL-17RC, tanto si inhibían o no la unión de IL-17 o IL-17F a IL17RC en el ensayo de ELISA, se probaron posteriormente por su capacidad para inhibir la unión de IL-17 o IL-17F a células Baf3 o BHK transfectadas con IL-17RC o a células epiteliales bronquiales humanas normales. Todos los sobrenadantes que eran positivos para la neutralización en algunos de los ensayos de inhibición de IL17 o IL-17F o en ambos ensayos de inhibición de IL-17 e IL-17F, fueron evaluados posteriormente por su capacidad para teñir células transfectadas con IL-17RC frente a células Baf3 o BHK no transfectadas mediante análisis por FACS. Este análisis se diseñó para confirmar que la inhibición de la unión de IL-17 o IL-17F a IL-17Rc se debía, de hecho, a un anticuerpo que se unía específicamente al receptor IL-17RC. Adicionalmente, puesto que el análisis por FACS se realizó con un reactivo secundario anti-IgG, los resultados de FACS positivos específicos indican que era probable que el anticuerpo neutralizante fuera de clase IgG. Por estos medios, se identificó un pocillo original que se unía a IL-17RC en el ELISA de unión a la placa, inhibía la unión de IL-17 o IL-17F a IL-17RC en el ensayo de inhibición basado en ELISA, bloqueaba la interacción de IL-17 e IL-17F con las células Baf3 o BHK transfectadas con IL-17RC, respectivamente, y era muy positivo en la tinción de células Baf3 o BHF transfectadas con IL-17RC con un reactivo secundario anti IgG de ratón.

El tercer ensayo consiste en células primarias epiteliales bronquiales humanas que expresan IL-17RC y en las que puede inducirse la secreción de IL-8 o IL-6 en respuesta al tratamiento con IL-17F. Se estudia la capacidad del anticuerpo monoclonal específico para inhibir la producción de IL-8 o IL-6 estimuladas por IL17 o IL-17F por estas células. La producción de IL-8 e IL-6 se ensaya en respuesta a IL-17 o a IL-17F como se describe en este documento.

Alternativamente, el anticuerpo monoclonal anti-IL-17RC, que mediaba en la inhibición de la producción de luciferasa inducida por IL-17 o IL-17F en células NIH 3T3 o en otras células que contenían IL-17RC, se puede usar con o en lugar de uno de los ensayos de neutralización de bioactividad señalados anteriormente. El ensayo de luciferasa mediada por NFκB en células NIH 3T3 se describe en este documento. C) Clonación de hibridomas productores de anticuerpos específicos anti-IL-17RC

Las líneas celulares de hibridomas que producen un AcM anti-IL-17RC específico que neutraliza de forma cruzada la unión de IL-17 e IL-17F a las células BaF3 o BHK apropiadamente transfectadas se clonan mediante una técnica de dilución de baja densidad convencional (menos de una célula por pocillo). Aproximadamente 5-7 días tras la siembra, los clones se analizaron por ELISA sobre, por ejemplo, IL-17RC-muFc humana unida a placas seguido de un nuevo análisis de los pocillos positivos por ELISA sobre una proteína de fusión que contenía muFc no relevante como se describió anteriormente. Los clones seleccionados, cuyos sobrenadantes se unían a IL-17RC-muFc y no a la proteína de fusión no relevante que contenía muFc, se confirman adicionalmente por su actividad de anticuerpo específica repitiendo tanto el ensayo de neutralización como el análisis por FACS. Todos los clones positivos de anticuerpo anti-IL-17RC seleccionados se clonan un mínimo de dos veces para asegurar su clonabilidad y evaluar la estabilidad de producción de anticuerpos. Se realizaron rondas de clonación adicionales y se analizaron como se ha descrito hasta que, preferiblemente, al menos el 95% de los clones eran positivos en la producción neutralizante de anticuerpos anti-IL-17RC. D) Caracterización bioquímica de la molécula reconocida por los AcM anti-IL-17RC

La confirmación bioquímica de que la molécula diana IL-17RC, reconocida por los posibles AcM anti-IL-17RC es, de hecho, IL-17RC se realiza mediante inmunoprecipitación convencional seguida de análisis por PAGE en presencia de SDS o procedimientos de inmunotransferencia, empleando en ambos casos preparaciones solubles de membrana de células Baf3 o BHK transfectadas con IL17RC frente a no transfectadas. Además, las preparaciones solubles de membranas de líneas celulares no transfectadas que expresan IL-17RC utilizadas muestran que los AcM reconocen la cadena del receptor nativo así como la transfectada. Alternativamente, se comprueba la capacidad de los AcM para inmunoprecipitar o mostrar en inmunotransferencia específicamente la proteína IL17RC-muFc soluble.

EJEMPLO 19 Neutralización del IL-17RC humano por sueros de ratones inyectados con células P815 transfectadas con IL-17RC humano

Usando un ensayo de neutralización basado en células, se añade el suero de ratones inyectados con células P815 transfectadas con IL-17RC humano (Ejemplo 17) como una dilución seriada al 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02% y 0%. Las placas de ensayo se incuban a 37ºC, con CO2 al 5% durante 4 días, en cuyo momento se añade azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Las placas se incuban de nuevo a 37ºC, con CO2 al 5% durante 16 horas. Los resultados mostraron que el suero de cuatro de los animales podía neutralizar la señalización de huIL-17 y huIL-17F a través del IL-17RC humano.

Los resultados como estos proporcionan indicios adicionales de que el bloqueo eficaz de IL-17RC uniéndose, bloqueando, inhibiendo, reduciendo, antagonizando o neutralizando la actividad de IL-17 o IL-17F (individual o conjuntamente), por ejemplo, a través de un anticuerpo monoclonal neutralizante frente a IL-17RC de la presente invención podría ser ventajoso a la hora de reducir los efectos de IL-17 e IL-17F (solas o juntas) in vivo y puede reducir la inflamación inducida por IL-17 y/o IL.17F, como se observa, por ejemplo, en psoriasis, EII, colitis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística u otras enfermedades inflamatorias inducidas por IL-17 y/o IL-17F como EII, artritis, asma, artritis psoriásica, colitis, afecciones inflamatorias cutáneas y dermatitis atópica.

EJEMPLO 20 Farmacocinética de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17RC humano

El anticuerpo monoclonal de ensayo, AcM anti-IL-17RC humano, se proporciona, por ejemplo, en 3 alícuotas de 3 ml a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml (determinada por absorbancia UV a 280 nm) y se conservó a -80ºC hasta su uso. El vehículo es PBS 1x (NaPO4 50 mM, NaCl 109 mM), pH 7,3. El AcM se descongela a temperatura ambiente antes de su uso y se usan las alícuotas de 1 y 2 según se proporcionan para los grupos de dosis de 100 µg IV y SC, respectivamente. La mitad de la alícuota 3 se diluye 1:2 en PBS 1x para el grupo de dosis SC de 50 µg y la otra mitad de la alícuota 3 se diluye 1:10 en PBS 1x para el grupo de dosis SC de 10 µg. Los ratones SCID hembras (n=96) se obtienen de Charles River Labs. Se comprueba la salud de los animales a su llegada y se alojaran en grupos (3 animales por jaula). Los ratones tienen 12 semanas de edad con un peso corporal medio de aproximadamente 22 g al inicio

del estudio. A) Protocolo de administración Los ratones SCID hembras (n=24/grupo de dosis) se colocan de forma aleatoria en cuatro grupos de dosis (Tabla 5). El grupo 1 recibió el AcM anti-IL

5 17RC humano a través de inyección IV de aproximadamente 93 µl en la vena de la cola y los grupos 2, 3 y 4 recibieron el AcM mediante inyección SC de aproximadamente 93 µl en el pescuezo. B) Recogida de muestras

Antes de la toma de muestras de sangre, los ratones se anestesiaron

10 completamente con halotano o isofluorano. Las muestras de sangre se recogieron mediante punción cardiaca en todos los puntos temporales excepto en el punto temporal de 168 horas (recogida por sangrado del ojo y los mismos animales se sangraron de nuevo en el punto temporal de 504 horas mediante punción cardiaca). La sangre se recogió en tubos separadores de suero y se dejó coagular durante 15

15 minutos. Posteriormente, las muestras se centrifugaron durante 3 minutos a 14.000 rpm. Tras la centrifugación, las alícuotas de 125-150 µl se dispusieron en tubos eppendorf marcados e inmediatamente se conservaron a -80ºC hasta su análisis.

Tabla 5

Nº de Grupo

Dosis (VDA) Animales Puntos temporales para FC

1

100 µg (IV) 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

2

100 µg (SC) 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

3

50 µg (SC) 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

4

10 µg (SC) 3 ratones/punto temporal* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

* Se usaron los mismos animales para los puntos temporales de 168 y 504 horas.

20 C) Cuantificación de las concentraciones séricas de AcM anti-IL-17RC humano por ELISA Se desarrolla y cualifica un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) para analizar las muestras de suero de ratón de animales a los que se administró AcM anti-IL-17RC durante estudios farmacocinéticos. Este ensayo se diseña para

25 aprovechar un anticuerpo secundario disponible en el mercado y la detección colorimétrica usando TMB. Las diluciones utilizadas para la curva patrón se modificaron para mejorar la definición de la porción lineal de dicha curva patrón. Una curva patrón en el intervalo de 100 ng/ml a 0,231 ng/ml con diluciones 1:2 permite la cuantificación de las muestras de suero de ratón. Las muestras CC se diluyeron 1:100, 1:1.000 y 1:10.000 en suero de ratón SCID al 10% y se realizó el cálculo a la inversa a partir de la curva patrón. D) Análisis farmacocinético

Los datos de concentración sérica frente a tiempo se cargaron en el software WinNonlin Professional 4.0 (Pharsight, Inc., Cary, NC) para el análisis farmacocinético. Se usa un análisis no compartimental para determinar los parámetros farmacocinéticos en función de los datos medios en cada punto temporal.

EJEMPLO 21 Neutralización de la actividad de IL-17 e IL-17F por un anticuerpo monoclonal anti-IL-17RC humano

Usando un ensayo de neutralización basado en células, se añade un anticuerpo monoclonal de ratón anti IL-17RC humano purificado como dilución seriada, por ejemplo, 10 µg/ml, 5 µg/ml, 2,5 µg/ml, 1,25 µg/ml, 625 ng/ml, 313 ng/ml, 156 ng/ml y 78 ng/ml. Las placas de ensayo se incuban a 37ºC, con CO2 al 5% durante 4 días, en cuyo momento se añade azul de Alamar (Accumed, Chicago, IL) a 20 µl/pocillo. Las placas se incuban de nuevo a 37ºC, con CO2 al 5% durante 16 horas. Este ensayo es capaz de demostrar que el anticuerpo monoclonal anti IL17RC humano purificado es capaz de neutralizar la señalización tanto de huIL-17 e huIL-17F a través de IL-17RC humano. En el caso de anticuerpos altamente eficaces, cuando se usa a una concentración de aproximadamente 10 µg/ml, el anticuerpo neutraliza por completo la proliferación inducida por huIL-17 o huIL-17F, disminuyendo la inhibición de la proliferación en forma dependiente de dosis a bajas concentraciones. Se prevé que un AcM de ratón control negativo del mismo isotipo, probado a las concentraciones descritas anteriormente, no proporcione inhibición de la proliferación de cualquiera de las citocinas. Estos resultados son capaces de demostrar adicionalmente que los anticuerpos monoclonales frente a IL-17RC podrían, de hecho, antagonizar la actividad de los ligandos proinflamatorios, IL-17 e IL-17F a bajas concentraciones.

EJEMPLO 22 IL-17A induce niveles elevados de IFN-gamma e TNF-alfa en células mononucleares de sangre periférica humanas

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas se purifican mediante centrifugación en gradiente de densidad de ficoll y, a continuación, se incuban durante la noche a 37ºC en medio solo, con 50 ng/ml de anticuerpo anti-CD3 humano o la combinación de 50 ng/ml de anticuerpo anti-CD3 humano más 1 µg/ml de anticuerpo anti-CD28 humano. Se establecen replicados de los cultivos para cada una de estas condiciones y se cultivan sin citocina, con 25 ng/ml de IL-17A humana o 25 ng/ml de IL-17F humana. Tras incubaciones de 24 horas, se recogen los sobrenadantes de cada cultivo y se comprueba el contenido de citocinas usando una matriz citométrica de grano (CBA) humana Th1/Th2 de BD Bioscience. Se encontró que los cultivos que habían sido estimulados con antiCD3 o anti-CD3 más anti-CD28 y habían sido complementados con IL-17A contenían niveles significativamente elevados de IFN-gamma y TNF-alfa (elevación de 3 a 5 veces de cada una) sobre los cultivos sin adición de citocina o aquellos que recibieron IL-17F. Los cultivos a los que no se añadió estimulación anti-CD3 no mostraron cambios significativos en los niveles de citocinas. Además, la adición de IL-17A no inducía cambios significativos en otras citocinas ensayadas con la CBA, como IL-2, IL-4, IL-5 e IL-10. Estos datos indican que IL-17A, pero no IL-17F, puede aumentar la producción de IFN-gamma y TNF-alfa en cultivos de PBMC estimuladas con anti-CD3 o anti-CD3 más anti-CD28.

EJEMPLO 23 IL-17RC-Fc disminuye la incidencia y progresión de la enfermedad en un modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) en ratón

A) Modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) en ratón

Ratones DBA/1J machos de 10 semanas (Jackson Labs) se dividen en 3 grupos de 13 ratones/grupo. El día -21, los animales reciben una inyección intradérmica en la cola de 50-100 µl de colágeno de tipo II de pollo a 1 mg/ml formulado en adyuvante completo de Freund (preparado por Chondrex, Redmond, WA) y tres semanas después a día 0, reciben la misma inyección, excepto que esta vez se prepara en adyuvante incompleto de Freund. IL-17RC-Fc se administra como inyección intraperitoneal 3 veces a la semana durante 4 semanas, a diferentes puntos temporales que va del día 0 al día en que la mayoría de los ratones muestra síntomas moderados de enfermedad. Los grupos reciben 10 o 100 µg de IL-17RC-Fc por animal y dosis y los grupos control reciben el control del vehículo, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Los animales empiezan a mostrar síntomas de artritis tras la segunda inyección de colágeno, desarrollando la mayoría de los animales inflamación entre 1,5-3 semanas. El alcance de la enfermedad se evalúa en cada pata usando un calibre para medir el espesor de la misma y asignando una puntuación clínica (0-3) a cada pata: 0=normal, 0,5=dedo(s) del pie inflamado, 1=inflamación leve de la pata, 2=inflamación moderada de la pata y 3=inflamación grave de la pata como se describe a continuación. B) Seguimiento de la enfermedad

Los animales pueden empezar a mostrar signos de inflamación de la pata poco después de la segunda inyección de colágeno y algunos animales puede incluso empezar a tener signos de inflamación de los dedos del pie antes de la segunda inyección de colágeno. La mayoría de los animales desarrolla artritis tras 1,5-3 semanas de la inyección de refuerzo, aunque algunos pueden necesitar un periodo de tiempo más largo. La incidencia de enfermedad en este modelo típicamente es del 95-100% y, típicamente, en estudio en el que se usan 40 animales se observan 0-2 sin respuesta (determinado después de 6 semanas de observación). Observe que cuando empieza la inflamación, puede observarse una aparición transitoria frecuente de inflamación de la pata o de los dedos del pie de grado bajo variable. Por esta razón, no se considera que un animal presente una enfermedad establecida hasta que se ha desarrollado una hinchazón de la pata acusada y persistente.

Todos los animales se observan diariamente para evaluar el estado de la enfermedad en sus patas, lo que se hace asignando una puntuación clínica cualitativa a cada pata. Cada día, se puntúan las 4 patas de los animales según el estado de su enfermedad clínica. Para determinar la puntuación clínica, se considera que la tapa se divide en 3 zonas, los dedos de las patas traseras, la pata en sí (delantera o trasera) y las articulaciones de ambas. Se anota la extensión y gravedad de la inflamación relativa a estas zonas incluyendo: observación de la inflamación de cada dedo; uñas rotas o enrojecimiento de los dados de las patas traseras; notificación de cualquier signo de edema o enrojecimiento en cualquiera de la patas; notificación de cualquier pérdida de demarcación anatómica fina de tendones o huesos; evaluación de edema o enrojecimiento de las articulaciones de las patas y notificación de si la inflamación se extiende de forma proximal hacia la pata. Una puntuación de la pata de 1, 2 ó 3 se basa, en primer lugar, en la impresión global de gravedad y, en segundo lugar, en cuantas zonas están afectadas. A continuación se muestra la escala utilizada para la puntuación clínica:

C) Puntuación clínica

0 = normal

0,5 = uno o más dedos de las patas traseras afectados, pero sólo están inflamados los dedos

1 = inflamación leve que afecta a la pata (1 zona) y puede incluir uno o varios dedos de las patas traseras

2 = inflamación moderada de la pata y puede incluir alguno de los dedos de las patas traseras y/o las articulaciones de las patas (2 zonas)

3 = inflamación grave de la pata, articulaciones de las patas y alguno o todos los dedos de las patas traseras (3 zonas)

La enfermedad establecida se define como una puntuación cualitativa de la inflamación de la pata clasificada de 2 o más, que persiste dos o más días seguidos. Una vez que se presenta enfermedad establecida, se registra la fecha y se designa como el primer día de los animales con "enfermedad establecida".

A través del experimento se recogen muestras de sangre para controlar los niveles séricos de anticuerpos anticolágeno, así como los niveles séricos de inmunoglobulina y citocinas. Los anticuerpos séricos anti-colágeno se correlacionan con la gravedad de la enfermedad. Los animales se sacrifican el día 21 y se recogen muestras de sangre para obtención de suero y recuento sanguíneo completo. A partir de cada animal, se recoge una pata afectada en NBF al 10% para el estudio histológico y otra se congela en nitrógeno líquido y se conserva a 80ºC para el análisis de ARNm. También se recogen ½ bazo, ½ timo, ½ ganglio linfático mesentérico, un lóbulo hepático y el riñón izquierdo en RNAlater para análisis de ARN y ½ bazo, ½ timo, ½ ganglio linfático mesentérico, el resto del hígado y el riñón derecho se recogen en NBF al 10% para análisis histológico. El suero se recoge y congela a -80ºC para las pruebas de inmunoglobulinas y citocinas.

Los grupos de ratones que recibieron IL-17RC-Fc en todos los puntos temporales se caracterizan por un retraso de la aparición y/o progresión de la inflamación de la pata. Estos resultados indican que IL-17RC puede reducir la inflamación, así como la incidencia y progresión de la enfermedad asociada con este modelo. Estos resultados también se apoyan en la observación de que IL-17RC-Fc da lugar a una disminución de los niveles de TNF-α, IL-1b y anticuerpos anticolágeno séricos.

EJEMPLO 24 Sobreexpresión estable de IL-17RC en la línea celular de ensayo murina, Nih3t3/kz142.8 que expresa el factor de transcripción ap1/nfκb

La línea celular murina nih3t3/kz142.8 se transfectó con IL-17RCx1 humano (SEC ID Nº 2) en un vector de expresión con un gen de resistencia a metotrexato (dihidrofolato reductasa, DHFR). Esta transfección se realizó usando un kit disponible en el mercado y siguiendo las recomendaciones del fabricante (Mirus, Madison, Wi. Nº de cat.: MIR218). Las células se sembraron en placas con medio de cultivo suplementado con 1 µM de mtx para seleccionar el vector de expresión que contenía el transgén IL-17RCx1 humano. Tras la selección, se generó una mezcla de transfección de IL-17RCx1 humano y se denominó nih3t3/kz142.8/hcytor14x1. A) Ensayo de luciferasa usando la línea celular de ensayo nih3t3/kz142.8

Puesto que nih3t3/kz142.8 tiene un indicador kz142 estable, no es necesaria la infección con adenovirus para añadir este indicador. Por tanto, el protocolo de ensayo de luciferasa fue más corto y se realizó de la siguiente forma:

1.

Siembra de células

Las células nih3t3/kz142.8 se sembraron a 5.000 células/pocillo en placas de cultivo celular blancas duras de 96 pocillos recubiertas (Nº de cat.: 3917, Costar) usando medio DMEM/FBS al 10% con glutamina, suplementado con piruvato y se cultivaron durante una noche a 37ºC y con CO2 al 5%. El segundo día, se retiró el medio de siembre y se cambió por DMEM/FBS al 1%, con glutamina suplementado con piruvato y se cultivaron durante la noche a 37ºC y con CO2 al 5%.

2.

Ensayo de la luciferasa para determinar la activación de IL-17A y F del indicador kz142 estable

Tras la incubación durante la noche en el medio DMEM con FBS al 1%, se hicieron diluciones de los ligandos IL-17A e IL-17F en medio sin suero suplementado con BSA a nivel del 0,28%. Tras añadir las diluciones del ligando, las células se incubaron a 37ºC y con CO2 al 5% durante 4 horas, tras lo cual se retiraron los medios, las células se lisaron durante 15 minutos y se determinó la media de la intensidad de fluorescencia (MIF) usando el sistema y los reactivos del ensayo de la luciferasa (Nº de cat. e1531 Promega, Madison, WI) y un luminómetro de Microplate. Se detectó actividad para ambos ligandos a concentraciones que oscilaban de 0,1 a 1.000 ng/ml. La mezcla de transfección nih3t3/kz142.8/hcytor14x1 mostró una actividad similar para el ligando IL-17A a la mostrada con la línea celular parental (ejemplo 14). Sin embargo, la mezcla transfectante cytor14x1 mostró una sensibilidad elevada a los tratamientos con IL17A y F humanas, incluso cuando estas concentraciones de ligando eran de tan sólo 20 fentogramos. El hecho de que la señalización de mIL-17A sea comparable a la de la línea celular parental (ejemplo 14) sugiere que no es un problema no específico general con las células humanas que expresan IL-17RC y que la IL-17A murina probablemente se señaliza a través del receptor de IL-17R o IL-17RC endógeno de la célula murina nih3t3. Por tanto, el hecho de que IL-17A e IL-17F humanas produzcan una elevación de la MIF a concentraciones de ligando tan bajas puede indicar una hipersensibilidad específica de las células a dichos ligandos, lo que está mediado por la sobreexpresión del receptor IL-17RC humano.

Este resultado tiene ramificaciones y utilidad clínicas y biológicas significativas. Por ejemplo, las situaciones fisiológicas podrían producir una regulación por incremento local de los receptores IL-17RC que entonces podrían hacer a estas zonas hipersensibles a IL-17A e IL-17F, dando lugar a la activación biológica a concentraciones de ligando mucho más bajas que las sugeridas sin sobreexpresión de IL-17RC. Por tanto, pueden ser suficientes niveles mucho menores de receptor soluble para antagonizar estas concentraciones de ligando hipotéticamente más bajas, que lo que previamente pensaron o reconocieron los expertos en este campo.

EJEMPLO 25 Los antagonistas de la actividad de IL-17F e IL-17A disminuyen la incidencia y la progresión de la enfermedad en un modelo de enfermedad inflamatoria intestinal (EII)

Este modelo se ha diseñado para mostrar que el tejido intestinal cultivado de pacientes con EII produce niveles más altos de mediadores inflamatorios en comparación con el tejido de controles sanos. Este aumento de la producción de mediadores inflamatorios (incluyendo pero sin limitaciones, IL-1b, IL-4, IL-5, IL-6, IL8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 A y F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, miembros de la familia MIP, MCP-1, G-CSF y GM-CSF, etc.) contribuye a los síntomas y a la patología asociada con la EII, como la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) mediante sus efectos sobre las rutas inflamatorias de activación y células efectoras posteriores. A continuación, estas rutas y componentes inducen un daño/destrucción tisular y celular observados in vivo. Por tanto, este modelo puede estimular este aspecto mediador de aumento de la inflamación de la EII. Además, cuando el tejido intestinal de controles sanos o de líneas humanas de células del epitelio intestinal (CEI) se cultiva en presencia de estos componentes inflamatorios, puede observarse la señalización de la vía inflamatoria así como indicios de daño tisular y celular.

Los fármacos que pudieran ser eficaces en la EII humana in vivo funcionarían en los modelos ex vivo o de CEI anteriores inhibiendo y/o neutralizando la producción y/o presencia de mediadores inflamatorios.

En este modelo, se recoge tejido intestinal humano de pacientes con EII o de controles sanos sometidos a biopsia intestinal o gastrectomía o de recogidas de tejidos durante las autopsias, y se procede usando una modificación de Alexakis et al. (Gut 53:85-90; 2004). En condiciones asépticas, las muestras se limpian con cuidado con cantidades copiosas de PBS, seguido del cultivo de las secciones de tejido cortadas en presencia de medio de cultivo tisular completo (más antibióticos para prevenir el crecimiento bacteriano excesivo). Las muestras de la misma mezcla de tejidos cortados se tratan con uno de los siguientes reactivos: vehículo (PBS); (rh)IL-17A recombinante humana; rhIL-17F o rhlL-17A+rhIL-17F Además, estas se tratan con o sin un antagonista de IL-17A o IL-17F, sol o en combinación (como con IL-17RC soluble). Este protocolo experimental se sigue para estudios con líneas EEC humanas con la excepción de que las células proceden de pases de cultivos madre existentes. Después de diferentes tiempos en cultivos (de 1 a varios días), se recogen los sobrenadantes y se analizan los niveles de mediadores de inflamación, incluyendo los enumerados previamente. En las muestras de pacientes con EII o en las muestras tratadas con rhlL-17A y/o F, los niveles de citocinas inflamatorias y de quimiocinas estaban elevados en comparación con las muestras de tejidos controles sanos sin tratar. La adición de antagonistas a la actividad de IL-17F y/o IL-17A, como receptores IL-17RC solubles y anticuerpos para estas, incluyendo anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano, reduce notablemente la producción de mediadores inflamatorios y, por tanto, cabría esperarse que fuera beneficioso en la EII en humanos.

EJEMPLO 26 Los antagonistas de la actividad de IL-17F e IL-17A disminuyen la incidencia y la progresión de la enfermedad en un modelo de esclerosis múltiple (EM)

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad compleja que se considera está mediada por diversos factores, como la presencia de infiltrados inflamatorios linfocíticos y de células mononucleares y desmielinización a lo largo del SNC. La microglia está compuesta por células similares a macrófagos que pueblan el sistema nervioso central (SNC) y se activan tras una lesión o infección. La microglía ha sido implicada ya que tiene funciones críticas en diversas enfermedades del SNC como la EM, y puede utilizarse para estudiar el mecanismo(s) de inicio, progresión y tratamiento de la enfermedad (Nagai et al. Neurobiol Dis 8:1057-1068; 2001; Olson et al. J Neurosci Methods 128:33-43; 2003). Las líneas celulares de microglía humanas inmortalizadas y/o las líneas celulares de astroglía humanas establecidas pueden, por tanto, utilizarse para estudiar algunos de los efectos de los mediadores inflamatorios sobre estos tipos de células y su potencial para la neutralización. Los mediadores inflamatorios (incluyendo pero sin limitaciones, IL1b, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 A y F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, miembros de la familia MIP, RANTES, IP-10, MCP-1, G-CSF y GM-CSF, etc.) pueden contribuir a los síntomas y a la patología asociada con la EM, mediante su efecto(s) sobre las rutas inflamatorias de activación y células efectoras posteriores.

Para evaluar las acciones proinflamatorias de IL-17A e IL-17F y la capacidad de un antagonista de la actividad de IL-17F y/o IL-17A, como receptores IL-17RC solubles y anticuerpos frente a estas, incluyendo los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano de la presente invención para neutralizar o disminuir estos efectos, las células gliales en cultivo se tratan con uno de los siguientes reactivos: vehículo; rhlL-17A; rhlL-17F o rhlL-17A+IL-17F. Además, estas se tratan con o sin un antagonista de IL-17A o IL-17F, solas o en combinación (como con IL-17RC soluble). Después de diferentes tiempos en cultivos (de 1 h a varios días), se recogen los sobrenadantes y las células y se analizan los niveles y/o la expresión de mediadores de inflamación, incluyendo los enumerados previamente. Los niveles de citocinas y quimiocinas inflamatorias están elevados en presencia de rhIL-17A y/o IL-17F en comparación con los cultivos tratados sólo con el vehículo. La adición de antagonistas de la actividad de IL-17F y/o IL-17A, como receptores IL-17RC solubles y anticuerpos frente a estas, incluyendo anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano, reduce notablemente la producción de mediadores inflamatorios y, por tanto, cabría esperarse que fuera beneficioso en la EM en humanos.

EJEMPLO 27 Los antagonistas de la actividad de IL-17F e IL-17A disminuyen la incidencia y progresión de la enfermedad en un modelo de artritis reumatoide (AR) y osteoartritis (OA)

Este modelo se diseña para mostrar que los cultivos sinoviales humanos (incluyendo macrófagos sinoviales, fibroblastos sinoviales y condrocitos articulares) y los explantes de pacientes con AR y OA produce niveles más altos de mediadores de inflamación en comparación con cultivos/explantes de controles sanos. Esto potencia la producción de mediadores inflamatorios (incluyendo pero sin limitaciones oncostatina M, IL-1b, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17 A y F, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IP-10, RANTES, RANKL, miembros de la familia MIP, MCP-1, G-CSF y GM-CSF, óxido nítrico, etc.) que contribuyen a los síntomas y a la patología asociados con AR y OA mediante su efecto(s) sobre las rutas inflamatorias de activación y células efectoras posteriores. A continuación, estas rutas y componentes inducen la formación de infiltrados inflamatorios, pérdida/destrucción de cartílago y matriz, pérdida ósea y regulación por incremento de prostaglandinas y ciclooxigenasas. Por tanto, este modelo puede estimular los aspectos destructivos inflamatorios de la AR y la OA en experimentos in vitro y ex vivo. Adicionalmente, cuando los explantes y cultivos sinoviales de controles sanos se cultivan en presencia de varios de estos componentes inflamatorios (p. ej., oncostatina M, TNFα, IL-1b, IL-6, IL-17A y F, IL-15, etc.) puede observarse la señalización de la vía inflamatoria. Los fármacos que pudieran ser eficaces en la AR humana in vivo funcionarían en los modelos in vitro y ex vivo anteriores inhibiendo y/o neutralizando la producción y/o presencia de mediadores inflamatorios.

En este modelo, se recogen explantes sinoviales humanos de pacientes con AR, OA o de controles sanos sometidos a sustitución de articulación o de tejidos de autopsias y se precede según una modificación de Wooley y Tetlow (Artritis Res 2: 65-70; 2000) y van 't Hof et al. (Rheumatology 39:1004-1008; 2000). También se estudian los cultivos de fibroblastos sinoviales, macrófagos sinoviales y condrocitos articulares. Las muestras replicadas se tratan con uno de los siguientes reactivos: vehículo (PBS); rhIL-17A; rhlL-17F o rhlL-17A+rhIL-17F humana recombinante y varias muestras que contienen diversas combinaciones de oncostatina M, TNF-α, IL-1b, IL-6, IL-17A, IL-17F y IL-15. Además, estas se tratan con o sin un antagonista de la actividad IL-17F y/o IL-17A, como receptores IL-17RC solubles y anticuerpos frente a estas, incluyendo anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano de la presente invención. Después de diferentes tiempos en cultivos (de 1 a varios días), se recogen los sobrenadantes y se analizan los niveles de mediadores de inflamación, incluyendo los enumerados previamente. En las muestras de pacientes con AR u OA, o en muestras tratadas con rhIL-17A y/o F (solas o en combinación con otras citocinas antiinflamatorias), los niveles de citocinas y de quimiocinas inflamatorias estaban elevados en comparación con los explantes de controles sanos sin tratar o en cultivos celulares sin tratar. La adición de antagonistas a la actividad de IL-17F y/o IL-17A, como receptores solubles de IL17RC y anticuerpos para estas, incluyendo anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano, reduce notablemente la producción de mediadores inflamatorios y, por tanto, cabría esperarse que pueda ser beneficioso en la AR y OA en humanos.

EJEMPLO 28 Respuestas funcionales de IL-17A e IL-17F

Las células NIH-3T3/KZ142 se transfectaron de forma estable con IL17RCx1 humano (SEC ID Nº 1) e IL-17RCx1 de ratón (SEC ID Nº 25). Como se describió previamente, cada línea se trató durante 7 y 15 minutos con una dosis respuesta de IL-17A, IL-17F, IL-17F murina y controles apropiados. Tanto IL-17A como IL-17F daban una respuesta dependiente de dosis en los factores IκB-α y p38 MAPK fosforilados cuando se transfectaba IL-17RCx1 (SEC ID Nº 1), aproximadamente un 30% mayor que la señalización inherente de la línea control. IL-17A e IL-17F no producían aumento de la señalización cuando se transfectaba IL-17RCx1 murino (SEC ID Nº 25). La IL-17F murina no proporcionaba aumento de la señalización para IL-17RCx1 humano o murino.

EJEMPLO 29 Expresión de IL-17A, IL-17F, IL-17R e IL-17RC en modelos murinos de enfermedad

Se analizaron cuatro modelos murinos de enfermedad (asma, colitis inducida por DSS, dermatitis atópica y encefalomielitis alérgica experimental) usando técnicas conocidas para la expresión de IL-17A, IL-17F, IL-17R e IL-17RC.

En el modelo de asma, IL-17A e IL-17F se expresan a niveles de muy bajos a no detectables en pulmón, bazo, ganglios linfáticos que drenan en el pulmón y células que infiltran el pulmón en ratones enfermos y no enfermos. Se encontró que el mensajero de IL-17RC se expresaba mucho más en pulmón en comparación con bazo y ganglio linfático, pero no se regulaba con la enfermedad. IL-17R se expresaba mucho más en bazo y en ganglio linfático que drena en pulmón en comparación con el pulmón pero tampoco se regulaba con la enfermedad.

Al contrario que en el modelo del asma, IL-17A e IL-17F estaban altamente reguladas en ratones enfermos pero no en ratones normales en el modelo de colitis inducida por DSS tanto en colon proximal como distal. Ninguna citocina estaba significativamente regulada por incremento en el ganglio linfático mesentérico. Además, se encontró una regulación por incremento de ambos citocinas en el contexto de la colitis inducida por DSS aguda y no en la colitis inducida por DSS crónica. Se encontró que IL-17R se expresaba principalmente en ganglios linfáticos mesentéricos en comparación con el colon proximal y distal, pero dicha expresión no estaba regulada por la enfermedad. Por el contrario, IL-17RC se expresaba mucho más en el tejido del colon distal proximal en comparación con los ganglios linfáticos mesentéricos. La expresión de IL-17RC tampoco estaba regulada con la enfermedad.

En dermatitis atópica no se detectaba el ARNm de IL-17A. Se encontró que IL-17F se expresaba en la piel y en los ganglios linfáticos que drenan en la piel aunque parecía una regulación significativa con la enfermedad. El ARNm de IL-17R se expresaba mucho más en los ganglios linfáticos que drenan en la piel en comparación con la piel, pero esta expresión no se regulaba con la enfermedad. IL17R se expresaba mucho más en la piel en comparación con los ganglios linfáticos que drenan en la piel, pero esto tampoco se regulaba con la enfermedad.

En la encefalopatía alérgica experimental, tanto IL-17A como IL-17F aparecían reguladas por incremento en la médula espinal de los ratones enfermos pero no en los sanos. Puede que IL-17F se expresara mucho más en los ganglios linfáticos en comparación con la médula espinal, pero la expresión en los ganglios linfáticos no se regulaba con la enfermedad. Sin embargo, los niveles totales de expresión en estos tejidos eran bastante bajos. IL-17R se expresaba mucho más en el tejido del ganglio linfático en comparación con el cerebro y la médula espinal. No se probó IL-17RC.

En resumen, parece que la expresión de IL-17A e IL-17F esta regulada con la enfermedad en el contexto de los modelos de colitis inducida por DSS y encefalomielitis alérgica experimental pero aparentemente no en asma o dermatitis atópica. No parece que la expresión de IL-17R e IL-17RC se regule con la enfermedad aunque parece que la expresión de IL-17R está enriquecida en tejidos linfoides mientras que la de IL-17RC lo está en tejidos no linfoides.

EJEMPLO 30 IL-17RC es un mediador de la activación tanto de IL-17A como de IL-17F

La línea celular de ensayo murina nih3t3/kz142.8 se transfectó con IL17RCx1 (SEC ID Nº 2) en un vector de expresión con un gen de resistencia a metotrexato (dihidrofolato reductasa, DHFR). IL-17RA humano (SEC ID Nº 21) se transfectó de forma similar en esta línea celular. Las transfecciones se realizaron usando un kit disponible en el mercado y las recomendaciones del fabricante (Mirus, Madison, WI. Nº de cat.: MIR218). Las células se colocaron en medio de crecimiento suplementado con mtx 1 µM para seleccionar el vector de expresión que contenía las construcciones de expresión. Tras la selección se generaron mezclas de transfección que se denominaron nih3t3/kz142.8/hcytor14X1 y nih3t3/kz142.8/IL,-17R. A) Ensayo de luciferasa usando las líneas celulares derivadas de nih3t3/kz142.8

Puesto que las líneas celulares derivadas de nih3t3/kz142.8 tenían indicadores ap1/nfkb estables (kz142), no fue necesaria la infección con adenovirus para añadir este indicador. Por tanto, el protocolo de ensayo de luciferasa fue más corto y se realizó de la siguiente forma:

1.

Siembra de células

Las células se sembraron a 5.000 células/pocillo en placas de cultivo celular blancas duras de 96 pocillos recubiertas (Nº de cat.: 3917. Costar) usando medio DMEM/FBS al 10% con glutamina, suplementado con piruvato y se cultivaron durante una noche a 37ºC y con CO2 al 5%. Este segundo día, se retiró el medio de siembra y se cambió por DMEM/FBS al 1%, con glutamina suplementado con piruvato y se cultivaron durante la noche a 37ºC y con CO2 al 5%.

2.

Ensayo de la luciferasa para determinar la activación de IL-17A y F del indicador kz142 estable

Tras la incubación durante la noche en medio DMEM con FBS al 1%, se hicieron diluciones de los ligandos IL-17A e IL-17F humanas en medio sin suero suplementado con BSA a nivel del 0,28%. Tras añadir las diluciones del ligando, las células se incubaron a 37ºC y con CO2 al 5% durante 4 horas, tras lo cual se retiraron los medios, las células se lisaron durante 15 minutos y se determinó la media de la intensidad de fluorescencia (MIF) usando el sistema y los reactivos del ensayo de la luciferasa (Nº de cat. e1531 Promega, Madison, WI) y un luminómetro de Microplate. Se detectó actividad para ambos ligandos a concentraciones que oscilaban de 0,1 a 100 ng/ml.

Las DE50 descritas a continuación son las medias de al menos 4 experimentos. La mezcla de transfección nih3t3/kz142.8/hcytor14x1 mostró una actividad similar para el ligando IL-17A murino a la mostrada por la línea celular parental, con una DE50 de aproximadamente 4 ng/ml (ejemplo 14). El hecho de que la señalización de mIL-17A en la línea recombinante hcytorI4x1 sea comparable a la de la línea celular parental (ejemplo 14) sugiere que, probablemente, la IL-17A murina realiza su señalización a través de los receptores IL-17-RA o IL-17RC endógenos de la célula nih3t3 murina y no activa las células a través de hcytor14x1. Sin embargo, la mezcla transfectante hIL-17RCx1 mostró una sensibilidad elevada al tratamiento con IL-17A humana con una DE50 de 0,41 ng/ml frente a 2,8 ng/ml (media de 4 experimentos) en la línea parental (DE50 6,8 veces más potente en la línea recombinante). Además, la línea recombinante hIL-17RCx1 presentó un aumento de la sensibilidad a hIL-17F, con una DE50 de 0,61 ng/ml en la línea recombinante frente a 10 ng/ml en la línea parental (una DE50 17 veces más potente en la línea recombinante). El aumento de la potencia para hIL-17A y F en la línea hIL-17RCX1 coincide con que IL-17RCX1 humano sea un receptor de alta afinidad para la IL-17A e IL-17F humanas. Por el contrario, la línea recombinante hIL-17RA presentaba un aumento de la sensibilidad sólo frente a hIL-17A con una DE50 de 0,6 ng/ml frente a 2,8 ng/ml para la línea parental. No se observó aumento de la DE50 de hIL-17F en la línea recombinante hIL-17RA, con una DE50 para IL-17F de 12,4 ng/ml frente a 8,9 ng/ml en la línea parental.

Este resultado es significativo ya que implica específicamente a hIL-17RCX1 como mediador de activación de hIL-17A y hIL-17F y sugiere que hIL-17RA media en la señalización de la activación de hIL-17A y no en la de hIL-17F.

EJEMPLO 31 IL-17RCX4 se une tanto a IL-17A como a IL-17F

Previamente se ha mostrado que IL-17RC es el receptor para IL-17F y para IL-17A. Específicamente, se ha demostrado que IL-17RCx1 se une tanto a IL-17F como a IL-17A. Sin embargo, ahora se muestra que IL-17RCx4 también se une a IL-17A y a IL-17F. Patrones de unión de variantes humanas de corte y empalme de IL-17Rc

Dadas las diferentes variantes de corte y empalme de IL-17RC, se realizó un análisis de unión de algunas de las variantes de corte y empalme humanas. El numero de variantes de corte y empalme en humanos es mucho mayor y, por tanto, los experimentos iniciales se realizaron sólo con un subgrupo de estas moléculas. Aquellas elegidas para el análisis también diferían en su inclusión o exclusión del exón 7 y el exón 12. Estas variantes se designaron IL-17RCx1, IL-17RCx4, IL17RCx2 e IL-17RCx7 humanos y estas también se muestran en la Tabla 6 a continuación. Una vez más, estas variantes de corte y empalme se expresaron de forma transitoria en células 293T y se comprobó su capacidad para unirse a IL-17A e IL-17F murinas y humanas biotiniladas, como se describe en los Ejemplos anteriores. En la Tabla 6 se muestra una evaluación cualitativa de estos datos de unión. En concordancia con los experimentos presentados previamente, el IL17RCx1 humano se unía a IL-17A e IL-17F humanas, pero no se unía a ninguna de las citocinas de ratón. El IL-17RCx4 humano también se unía a ambas citocinas

5 humanas y también se unía a IL-17F de ratón, pero no a la IL-17A de ratón. IL17RCx2 y x7 humanos no se unían a ninguna de las cuatro citocinas probadas.

El examen de la capacidad de las diferentes variantes de corte y empalme de IL-17RC para unirse a IL-17A e IL-17F de ratón y humanas mostró dos porciones del receptor que son esenciales para la unión a las citocinas y,

10 sorprendentemente, hay dos subpoblaciones diferentes en las características de unión de las citocinas de ratón y humanas. Lo que es más soprendente es que estas características son constantes para las citocinas independientemente de la especie de receptor examinada. A partir de los datos presentados en la Tabla 6, puede concluirse que el exón 12 y el exón 8 completo son necesarios para que IL

15 17A e IL-17F humanas se unan a IL-17RC. Cada una de estas isoformas incluye todo el exón 8 y el exón 12, aunque difieren con respecto a la inclusión del exón 7. Esto supone que el exón 7 es dispensable para la unión de las citocinas humanas. Tabla 6*

Exones1

Unión de la citocina2

Especie

Variante 7 8 12 HuIL-17A HuIL-17F MuIL-17A MuIL-17F

Ratón

IL-17RCx4 + + + + + - +

IL-17RCx1

- + + + + - -

IL-17RCx3

- - + - - - -

IL-17RCx5

+ - + - - - -

Humano

IL-17RCx4 + + + + + - +

IL-17RCx1

- + + + + - -

IL-17RCx2

- + - - - - -

IL-17RCx7

+ + - - - - -

*Evaluación de la unión de variantes de corte y empalme de IL-17RC y citocinas; se

20 indica la inclusión de los exones 7, 8 y 12 en cada variante de corte y empalme y se indica la capacidad de unión de cada variante a cada una de las cuatro citocinas. 1 Los exones indicados se incluyeron completamente en la transcripción. En el caso de las variantes de ratón, siempre se incluyó el extremo 3' del exón 8, aunque el símbolo (-) indica que no se incluye el extremo 5'.

25 2 El símbolo (+) indica una unión detectable significativa a citocina según se evaluó por un aumento significativo en la fluorescencia mediante FACS. El símbolo (-)

indica que no hay cambios significativos en la fluorescencia.

De lo precedente, se apreciará que, aunque en este documento se han

descrito realizaciones específicas de la invención con fines ilustrativos, pueden

hacerse diversas modificaciones sin desviarse del alcance de las reivindicaciones

adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> ZymoGenetics, Inc. Kuestner, Rolf E. Gao, Zeren Levin, Steven D. Rixon, Mark W.

<120> IL-17RCX4 SOLUBLE Y PROCEDIMIENTOS PARA SU USO EN LA INFLAMACIÓN

<130> 06-05PC

<150> 60/772,177

<151> 10/2/2006

<150> 60/781.078

<151> 10/3/2006

<160> 68

<170> FastSEQ para Windows, versión 4.0

<210> 1

<211> 2.255

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (159) ... (2.229)

<220>

<223> Secuencia señal pre-pro del activador tisular del plasminógeno optimizado (otPA) y exones 7-10 de IL-17RC humano, y Fc5

<400> 1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 2

<211> 692

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 3

<211> 432

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

imagen1

imagen1

<210> 4

<211> 1.753

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (2) … (1.726)

<400> 4

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 5

<211> 575

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 6

<211> 1.725

<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia degenerada

<220>

<221> misc_feature 10 <222> (1) … (1.725)

<223>n= A,T,C oG

<220>

<221> misc_feature

<222> 9, 12, 18, 21, 24, 30, 36, 39, 42, 45, 54, 60, 63, 66, 69, 75, 78, 81, 87, 93, 96 15 99, 102, 105, 108, 117, 123

<223>n= A,T,C oG <220>

<221> misc_feature

<222> 126, 129, 132, 135, 138, 156, 159, 162, 165, 168, 174, 177, 186, 192, 198,

201, 216, 225, 234, 237, 240, 243, 246 5 <223>n=A,T,CoG

<220>

<221> misc_feature

<222> 252, 258, 261, 264, 270, 279, 285, 250, 291, 297, 300, 318, 321, 324, 327,

342, 348, 351, 354, 360, 363, 378, 381 10 <223>n=A,T,CoG

<220>

<221> misc_feature

<222> 384, 387, 399, 402, 411, 417, 420, 423, 429, 441, 447, 450, 456, 462, 465,

468, 471, 483, 489, 498, 501, 504, 516 15 <223>n=A,T,CoG

<400> 6

imagen1

imagen1

<210> 7

<211> 2.076

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> secuencia degenerada

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(2.076)

<223>n= A,T,C oG

<220>

<221> misc_feature

<222> 6, 9, 12, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63, 69, 72, 75, 78, 81, 90, 93, 102, 105, 108

<223>n= A,T,C oG

<220>

<221> misc_feature

<222> 111, 114, 120, 123, 132, 141, 147, 150, 153, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 198, 204, 210

<223>n= A,T,C oG

<220>

<221> misc_feature

<222> 213, 216, 219, 234, 246, 252, 255, 258, 261, 264, 270, 273, 276, 282, 297, 318, 321, 324, 327, 333, 336, 339, 348

<223>n= A,T,C oG

<220>

<221> misc_feature <222> 351, 357, 360, 363, 369, 375, 378, 381, 384, 393, 399, 402, 405, 408, 414, 417, 420, 426, 432, 435, 438, 441, 444

<223>n= A,T,C oG

<400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 21

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial <220>

<223> cebador de PCR

imagen2

5 <210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> enlazador peptídico

<400> 9

imagen1

<210> 10

<211>

688 15 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica Zcytor14

<210> 11

<211> 705

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica Zcytor14

<400> 11

<210> 12

<211> 675

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Proteína quimérica Zcytor14

<400> 12

<210> 13

<211> 1.874

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 155

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 923

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211>

153 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 1.172

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 17

<210> 18

<211> 158

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

<210> 19

<211>

462 10 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 19

<210> 20

<211> 153

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

<210> 21

<211>

320 10 <212> PRT

imagen3

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<213> Homo sapiens

<400> 21

imagen1

imagen1

<210> 22

<211> 221

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

imagen1

<210> 23

<211> 2.180

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23

imagen1

imagen1

<210> 24

<211> 667

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

imagen1

imagen1

<210> 25

<211> 2.269

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 25

imagen1

<210> 26

<211> 683

<212> PRT

<213> Mus musculus

imagen4

imagen1

imagen1

<210> 27

<211> 449

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

imagen1

imagen1

<210> 28

<211> 222

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

imagen1

<210> 29

<211> 2.287

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 29

imagen1

imagen1

<210> 30

<211> 689

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 31

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen5

<210> 32

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen6

<210> 33

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen7

<210> 34

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 34 <210> 35

imagen1

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen8

<210> 36

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen9

<210> 37

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen10

<210> 38

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen11

<210> 39

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen12

5 <210> 40

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> cebador oligonucleotídico

imagen13

<210> 41

<211> 24 15 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen14

<210> 42

<211> 1.293

<212> ADN

<213> Homo sapiens 25 <400> 42

imagen1

<210> 43

<211> 431

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 44

<211> 699

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 44

imagen1

<210> 45

<211> 233 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

imagen1

imagen1

<210> 46

<211> 69

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 46

imagen1

10 <210> 47

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> cebador oligonucleotídico

<400> 47

imagen1

<210> 48

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen15

<210> 49

<211> 55

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen16

<210> 50

<211> 76

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 50

imagen1

<210> 51

<211> 10

<212> PROT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> etiqueta his C-terminal

<400> 51

imagen1

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> etiqueta FLAG C-termina

<400> 52

imagen1

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> etiqueta Glu-Glu

<400> 53

imagen1

<210> 54

<211> 85

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 54

imagen1

<210> 55

<211> 85

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 55 <210> 56

imagen1

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen17

<210> 57

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen18

<210> 58

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen19

<210> 59

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen20

<210> 60

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen21

<210> 61

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen22

<210> 62

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen23

<210> 63

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

imagen24

<210> 64

<211> 2.127

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 64

imagen1

<210> 65

<211> 708

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

imagen1

imagen1

imagen1

<210> 66

<211> 1.416

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> inserción sintética

<400> 66

imagen1

<210> 67

<211> 2.124

<212> ADN

<213> Humana

<400> 67 <210> 68

imagen1

imagen1

<211> 707

<212> PRT

<213> Humana

<400> 68

imagen1

imagen1

imagen1

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipéptido receptor soluble aislado que comprende una secuencia de aminoácidos como la mostrada en los restos 21 a 467 de la SEC ID Nº 68.

2. 2.

   El polipéptido receptor soluble de la reivindicación 1, en el que el receptor soluble es una proteína de fusión soluble que adicionalmente comprende una región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, tal como un fragmento Fc.

3. 3.

   El polipéptido receptor soluble de las reivindicaciones 1 ó 2 para uso en terapia.

4. 4.

   El polipéptido receptor soluble aislado según las reivindicaciones 1 ó 2 para reducir la inflamación inducida por IL-17A y/o inducida por IL-17F en un mamífero.

5. 5.

   El polipéptido receptor soluble aislado según las reivindicaciones 1 ó 2 para el tratamiento de un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria en la que están implicadas IL-17A y/o IL-17F.

6. 6.

   Uso de un polipéptido receptor soluble aislado según las reivindicaciones 1 ó 2 en la fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria en la que están implicadas IL-17A y/o IL17F.

7. 7.

   El uso de la reivindicación 6, en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria crónica.

8. 8.

   En uso de la reivindicación 7, en el que la enfermedad inflamatoria crónica se selecciona entre el grupo compuesto por enfermedad inflamatoria intestinal (EII), artritis, dermatitis atópica y psoriasis.

9. 9.

   El uso de la reivindicación 8, en el que la enfermedad inflamatoria intestinal se seleccionan entre el grupo compuesto por colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn; o en el que la artritis se selecciona entre el grupo compuesto por artritis reumatoide y artritis psoriásica.

10. 10.

    El uso de la reivindicación 6, en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad inflamatoria aguda, como endotoxemia, septicemia, síndrome de choque tóxico o una enfermedad infecciosa.

    5 11. El uso de la reivindicación 6, en el que la enfermedad inflamatoria es una enfermedad autoinmune.
11. 12. El uso de la reivindicación 11, en el que la enfermedad autoinmune se selecciona entre el grupo compuesto por diabetes de tipo 1 (DMDI), esclerosis

    10 múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia gravis, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria intestinal (EII).
12. 13. El uso de la reivindicación 6, en el que la enfermedad inflamatoria es una

    enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias. 15
13. 14. El uso de la reivindicación 13, en el que la enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias se selecciona entre el grupo compuesto por asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y fibrosis quística.

    20 15. El uso de la reivindicación 6, en el que la enfermedad inflamatoria se selecciona entre el grupo compuesto por rechazo de trasplante y enfermedad injerto contra huésped (GVHD).