JP2008532936A - インターロイキン−17f抗体及び他のil−17fシグナル伝達拮抗物質並びにそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、IL−17Fシグナル伝達経路に関連する単離及び精製されたポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本発明はまた、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体に対する抗体、及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を含むIL−17ファミリーの成員を天然ソースから単離し、精製する方法を提供する。本発明はまた、炎症性疾患、例えば自己免疫疾患(例えば関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス及び多発性硬化症)、呼吸器疾患(例えばCOPD、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー)、移植片拒絶反応(固形臓器移植拒絶反応を含む)、及び炎症性腸疾患又は障害(IBD、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)を含むが、これらに限定されない、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患、すなわちIL−17F関連疾患の進行を診断する、予後判定する、観測する、及び疾患を治療する及び/又は予防するための新規方法を対象とする。本発明はさらに、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患の介入処置(治療)及び予防のための新規治療薬及び治療標的、及び試験化合物をスクリーニングし、評価する方法を対象とする。
【選択図】図1

Description

(関連出願)
本願は、2005年2月14日出願の米国仮特許出願第60/653,260号;及び2005年4月1日出願の米国仮特許出願第60/667,492号に基づく優先権を主張し、どちらもその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、インターロイキン−17F(IL−17F)シグナル伝達、特にヒトIL−17Fシグナル伝達に干渉する抗体、例えばインタクトな抗体及びその抗原結合フラグメント、及び他のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質、例えば可溶性IL−17F受容体、並びにIL−17F関連活性を調節する上でのそれらの使用に関する。本明細書で開示する抗体及び関連IL−17F分子は、IL−17F関連疾患、例えば炎症性疾患(例えば自己免疫疾患(例えば関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症)、呼吸器疾患(例えばCOPD、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー)、移植片拒絶反応(固形臓器移植拒絶反応を含む)、及び炎症性腸疾患又は障害(IBD、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)を診断する、予後を判定する、観測する、予防する及び/又は治療する上で有用である。

サイトカインは、免疫及び炎症応答に関わる多面発現作用を有する分泌可溶性タンパク質であり、例えばサイトカインは、標的細胞による分化、動員又は他の生理的応答、例えば炎症の特徴であるタンパク質の分泌を引き起こし得る。サイトカインは、細胞の活性化、増殖及び分化を導くシグナル伝達経路の引き金を引く、特異的細胞表面受容体に結合する。1つのそのようなサイトカインである、インターロイキン−17(IL−17)(最初はCTLA−8と命名された)は、マウスハイブリドーマから単離され、クローン化されて、Tリンパ球向性ヘルペスウイルス・サイミリのオープンリーディングフレーム13と相同性を有することが示された(Rouvier et al. (1993) J. Immunol. 150:5445- 56; Yao et al. (1996) Gene 168:223-25; Golstein et al.,国際公開公報WO95/01826)。それ以後、IL−17と20〜50%の相同性を有する5個の関連サイトカインが特定された(Moseley et al. (2003) Cytokine & Growth Factor Reviews 14: 155-74参照)。IL−17をIL−17サイトカインファミリーの基本成員として示すため、IL−17Aと命名された (Moseley, supra);その他の成員は、IL−17B、IL−17C、IL−17D、IL−17E及びIL−17Fと命名された。IL−17サイトカインファミリー成員は保存されたシステイン残基を共有する。興味深いのは、50%の同一性を共有する、IL−17A及び特にIL−17Fである;どちらのサイトカインも、T細胞によって共発現される、IL−23によって誘導され、T細胞媒介性自己免疫疾患のための潜在的標的とみなされる。IL−17Aと同様に、IL−17F内の保存されたシステイン残基は、骨誘導因子(BMP)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、神経成長因子(NGF)及び血小板由来因子BB(PDGF−BB)において認められる古典的システインノットモチーフ(knot motif)の特徴を示す(Hymowitz et al. (2001) EMBO J. 20:5332-41; McDonald et al. (1993) Cell 73:421-24)。

IL−17Fは、活性化ヒトPBMCライブラリー(SST)からクローン化された17kDの分泌タンパク質である(米国特許第6,043,344号及び同第6,074,849号)。IL−17Fは、30−35kDのジスルフィド結合ホモ二量体(Hymowitz, supra)を形成し、IL−17Aと同様に、主として活性化T細胞によって発現される(Moseley, supra)。しかし、活性化単球、活性化好塩基球及び肥満細胞によるIL−17Fの発現も示されている(Kawaguchi et al. (2002) J. Immunol. 167:4430-35)。IL−17Fは、マクロファージ、内皮細胞、上皮細胞及び線維芽細胞による多くのサイトカイン及びケモカインの発現を誘導する(Moseley, supra)。

IL−17Fは、一部には、炎症性サイトカインの産生及び好中球増加を誘導することにより、炎症応答において役割を果たす。IL−17Fは、いくつかの自己免疫疾患、例えば関節炎(慢性関節リウマチ及びライム関節炎を含む)、全身性エリテマトーデス(SLE)及び喘息の発症に関連する(Bettelli and Kuchroo (2005) J. Exp. Med. 201 :169-71)。例えば最近になって、IL−23が、中でも特にIL−17Fの産生によって特徴付けられるT細胞集団の増殖のために必須であること、このT細胞集団の受動輸送が、中枢神経系自己免疫に関連する器官特異的炎症の確立のために必須であること(Langrish et al. (2005) J. Exp. Med. 201:233-40)、及びIL−17欠損マウスは実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE;多発性硬化症のための動物モデル)に抵抗性であること(Nakae et al. (2003) J. Immunol. 171:6173-77)が示された。IL−17Fは、関節軟骨によるプロテオグリカン分解を上昇させ、プロテオグリカン合成を低下させるという点で、公知の炎症性サイトカインの中で特異である(Hymowitz, supra)。加えて、喘息に罹患している患者からアレルゲン攻撃誘発後に採取した気管支肺胞洗浄液(BAL)において、対照としてこれらの患者から採取したBALと比較してIL−17Fの発現上昇が明らかにされた(Kawaguchi, supra)。また、潰瘍性大腸炎及びクローン病を有する患者ではIL−17F mRNA発現が上昇する(Gurney et al. (2003) GTCBIO Conf: Cytokines and Beyond)。これらの所見は、IL−17Fシグナル伝達の遮断がプロ炎症性サイトカインの産生を低減し、骨びらんを低下させることを示唆する。その結果として、IL−17Fシグナル伝達経路は、炎症性疾患、例えば動員された好中球が、例えば自己免疫疾患(例えば関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症)、呼吸器疾患(例えばCOPD、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー)、移植片拒絶反応(固形臓器移植拒絶反応を含む)、及び炎症性腸疾患又は障害(IBD、例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)の発症の間の、組織損傷の決定的に重要なメディエイタである炎症性疾患を治療する及び/又は予防するための魅力的な標的である。

現在、IL−17ファミリーの成員の受容体について多くは知られていない。IL−17Aについての受容体であるIL−17Rは、これまでに検査された全ての組織において発現されること、及びIL−17AによるIL−17Rの結合は、一般にNF−κBの活性化を通してプロ炎症性サイトカインの誘導を生じさせることが示された(Moseley, supra)。IL−17Rと部分的配列相同性を共有する4個の付加的な受容体が特定された:1)IL−17RH1(IL−17RBとも呼ばれる)、2)IL−17受容体様タンパク質(IL−17RL又はIL−17RCとも呼ばれる)、3)IL−17RD(SEF又はIL−17RLMとも呼ばれる)、及び4)IL−17RE(Moseley, supra)。これら4個の付加的な受容体のうちで、IL−17RH1だけがIL−17サイトカイン、すなわちIL−17B及びIL−17Eに結合することが示された;しかし、IL−17RH1へのIL−17B及びIL−17E結合の機能は示されていない(Shi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:19167-76; Lee et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:1660-64)。これまでのところ、IL−17Fについての受容体は報告されていない。それ故、IL−17Fシグナル伝達は、組織(例えば関節組織)のホメオスタシス及び様々な疾患(例えば関節炎、喘息、アレルギー、COPD、嚢胞性線維症、潰瘍性大腸炎、クローン病等)の進行において重要な役割を果たすと考えられるが、疾患の予防及び/又は治療のための標的とすることはできなかった。本発明は、IL−17Fタンパク質のシグナル伝達経路に関わるキープレイヤーを特定し、標的することによってこの問題を解決する。

本発明の1つの目的は、IL−17Fシグナル伝達経路の成分、例えばIL−17F及びその受容体を特定すること、及びIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患を治療する方法においてこれらの成分を標的することである。そのようなIL−17F関連疾患及びIL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患は、炎症性疾患、例えば自己免疫疾患(例えば関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症)、呼吸器疾患(例えばCOPD、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー)、移植片拒絶反応(固形臓器移植拒絶反応を含む)、及び炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)を含むが、これらに限定されない。

本発明の基礎となる研究は、IL−17Fが、IL−17R及び/又はIL−17RCへのその結合を通して、プロテオグリカン破壊及び炎症応答を媒介する証拠を提供する。IL−17Fの受容体としてのIL−17R及びIL−17RCの測定は、これらの分子をIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患の治療のための標的として顕在化する。

本明細書では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が提供され、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、IL−17F阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、阻害性抗IL−17F抗体、阻害性抗IL−17R抗体、阻害性抗IL−17RC抗体及び拮抗性低分子を含むがこれらに限定されない。IL−17Fシグナル伝達拮抗物質の好ましい例は、IL−17R及びIL−17RCに対するsiRNA、IL−17R及びIL−17RC(又はそのIL−17F結合フラグメント)を含む可溶性融合タンパク質、及び阻害性(すなわち拮抗性)IL−17F抗体を含む。本発明のもう1つの好ましい実施形態では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質、例えばIL−17R又はIL−17RCに対するsiRNA、IL−17R又はIL−17RC(又はそのIL−17F結合フラグメント)を含む可溶性融合タンパク質、又は阻害性IL−17F抗体は、IL−17F生物活性及び/又はNF−κB応答遺伝子を活性化するNF−κBの能力を低下させる。

加えて、IL−17AとIL−17Fとの間の構造及び配列類似性に基づき、本発明者らは新規IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の形成を仮定し、明らかにした。IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の存在を明らかにするにあたって、本発明者らは初めて、IL−21がIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の産生上昇を生じさせることを明らかにし、IL−21がIL−21Rに結合して、IL−21Rを活性化することに関連する作用が、少なくとも一部には、IL−17シグナル伝達によるものであると考えられることを示唆する。本発明者らはまた、初めて、IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体をこれらのサイトカインの天然ソース、例えば活性化T細胞から単離する。それ故、本発明はまた、IL−21がIL−21Rに結合してIL−21Rを活性化することに関連する作用を、例えばIL−17A及び/又はIL−17Fシグナル伝達を阻害することによって、軽減する方法を提供する。加えて、本発明は、天然(すなわち非組換え)IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体、及び、例えばIL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患及び/又はIL−21がIL−21Rに結合してIL−21Rを活性化することに関連する疾患を治療する方法において、これらを単離し、標的する方法を提供する。加えて、組換えIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体、及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体、及びIL−17Aホモ二量体とIL−17Fホモ二量体を実質的に含まないIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体(組換え又は天然)を単離する方法が本明細書で開示される。

IL−17Fシグナル伝達を標的する方法は、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質としてのIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RCポリヌクレオチド(阻害性ポリヌクレオチド、例えばアンチセンス、siRNA及びアプタマーを含む)、ポリペプチド及びそれらのフラグメントを含み得る。加えて、IL−17Fタンパク質(IL−17Fホモ二量体として又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体として)とその受容体との相互作用を阻害することができる抗体も使用し得る。

本発明はまた、IL−17Fシグナル伝達経路を標的することができ、かつIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患を診断する、予後判定する、観測する及び/又は治療することができる試験化合物をスクリーニングする方法において、本明細書で開示する分子を使用することに関する。

一実施形態では、本発明は、IL−17F及びIL−17Rを含む試料を化合物と接触させる工程;及び試料中のIL−17FとIL−17Rとの相互作用が、化合物と接触していない試料中のIL−17FとIL−17Rとの相互作用に比べて低下しているかどうかを判定する工程を含み、化合物と接触させた試料中のIL−17FとIL−17Rとの相互作用のそのような低下が、その化合物を、IL−17FとIL−17Rとの相互作用を阻害し、IL−17Fシグナル伝達に拮抗することができるものとして特定する、IL−17Fシグナル伝達に拮抗することができる試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、IL−17RCに関する同様のスクリーニング方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、被験者においてIL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患を診断する方法を提供し、被験者からの試料においてIL−17Fシグナル伝達遺伝子産物の試験量を検出する工程;及び上記試験量を、対照試料中の同じIL−17Fシグナル伝達遺伝子産物の正常量と比較する工程を含む。これにより、正常量を有意に上回る試験量が、IL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患の診断における陽性指標を与える。他の実施形態では、疾患は、自己免疫疾患、呼吸器疾患及び炎症性腸疾患から成る群より選択される。他の実施形態では、IL−17Fシグナル伝達遺伝子産物は、IL−17F遺伝子産物、IL−17R遺伝子産物又はIL−17RC遺伝子産物である。

他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質の治療有効量を被験者に投与することを含む、IL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患の危険性がある又は上記疾患と診断された被験者を治療する方法を提供する。他の実施形態では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、IL−17F阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、阻害性抗IL−17F抗体、阻害性抗IL−17R抗体、阻害性抗IL−17RC抗体及び拮抗性低分子から成る群より選択される。一部の実施形態では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチドである。一部のさらなる実施形態では、阻害性ポリヌクレオチドは、配列番号17〜32に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるsiRNAである。一部の実施形態では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む、又はIL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチドである。一部のさらなる実施形態では、可溶性ポリペプチドは、配列番号34又は配列番号35に示すアミノ酸配列を有する。一部の他の実施形態では、(1)IL−17F阻害性ポリヌクレオチドは、配列番号1に示すヌクレオチド配列、又は配列番号1に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号1のフラグメント、又はそれらのRNA等価物を含み、かつ、細胞における阻害性ポリヌクレオチドの発現はIL−17Fの発現低下を生じさせる;(2)IL−17R阻害性ポリヌクレオチドは、配列番号5に示すヌクレオチド配列、又は配列番号5に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号5のフラグメント、又はそれらのRNA等価物を含み、かつ、細胞における阻害性ポリヌクレオチドの発現はIL−17Rの発現低下を生じさせる;及び(3)IL−17RC阻害性ポリヌクレオチドは、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13及び配列番号15に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13及び配列番号15に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13及び配列番号15に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメント、又はそれらのRNA等価物を含み、かつ、細胞における阻害性ポリヌクレオチドの発現はIL−17RCの発現低下を生じさせる。一部の実施形態では、IL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患は炎症性疾患である。一部のさらなる実施形態では、炎症性疾患は、自己免疫疾患、呼吸器疾患及び炎症性腸疾患から成る群より選択される。一部のさらなる実施形態では、炎症性疾患が自己免疫疾患であり、自己免疫疾患は、関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス及び多発性硬化症から成る群より選択される。一部のさらなる実施形態では、炎症性疾患は呼吸器疾患であり、呼吸器疾患は嚢胞性線維症であるか、又は炎症性疾患は炎症性腸疾患である。

他の実施形態では、本発明は、少なくとも1つの付加的な治療薬の治療有効量を被験者に投与することをさらに含む。他の実施形態では、少なくとも1つの付加的な治療薬は、サイトカイン阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、代謝阻害物質、酵素阻害剤、細胞傷害性物質及び細胞増殖抑制物質から成る群より選択される。他の実施形態では、少なくとも1つの付加的な治療薬は、TNF拮抗物質、抗TNF薬、IL−12拮抗物質、IL−15拮抗物質、IL−17拮抗物質、IL−18拮抗物質、IL−22拮抗物質、T細胞除去剤、B細胞除去剤、シクロスポリン、FK−506、CCI−779、エタネルセプト、インフリキシマブ、リツキシマブ、アダリムマブ、プレドニゾロン、アザチオプリン、金、スルファサラジン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ミノサイクリン、アナキンラ、アバタセプト、メトトレキサート、レフルノミド、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、Cox−2阻害剤、cPLA2阻害剤、NSAID、p38阻害剤、B7.1、B7.2、ICOSL、ICOS及び/又はCD28の拮抗物質、及びCTLA4の作動物質から成る群より選択される。

他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を細胞集団又は被験者に投与することを含む、細胞集団又は被験者においてNF−κB応答性プロモーターを活性化するNF−κBの能力を阻害する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を細胞集団又は被験者に投与することを含む、細胞集団又は被験者においてIL−17F生物活性を阻害する方法を提供する。他の実施形態では、IL−17F生物活性は、好中球分化、好中球動員及びサイトカイン誘導から成る群より選択される。

他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質及び製薬上許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質、及び自己抗原、アレルゲン、同種抗原及びそれらのフラグメントから成る群より選択される抗原を含むワクチンアジュバントを提供する。他の実施形態では、本発明は、配列番号6、7、9、11、13及び15に示すものを含む、本発明に関連するアミノ酸配列に特異的に結合することができる単離抗体を提供する;一部の実施形態では、抗体はIL−17Fシグナル伝達に拮抗する。

他の実施形態では、本発明は、IL−17Fタンパク質に特異的に結合することができる単離抗体を提供し、かつ、IL−17Fタンパク質がヒト又は霊長動物に由来する、さらなる実施形態;IL−17Fタンパク質が多量体である、さらなる実施形態;IL−17Fタンパク質がIL−17Fホモ二量体又はIL−17Fへテロ二量体である、さらなる実施形態;IL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、さらなる実施形態;及び抗体がIL−17F生物活性を阻害する、さらなる実施形態を提供する。

他の実施形態では、本発明は、上記で特定した方法を提供し、ここでIL−17Fシグナル伝達及び/又はIL−17F生物活性が、IL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方によって媒介され、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである場合を含む。

他の実施形態では、本発明は、上記で特定した医薬組成物及び/又は上記で特定したワクチンアジュバントを提供し、ここでIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方に拮抗する。

他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達に拮抗することを含む、IL−21シグナル伝達に関連する少なくとも1つの活性を阻害する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達に拮抗することを含む、IL−23シグナル伝達に関連する少なくとも1つの活性を阻害する方法を提供する。一部のさらなる実施形態では、IL−17Fシグナル伝達は、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである場合を含む、IL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方によって媒介される。

他の実施形態では、本発明は、培地中でT細胞を活性化すること;及び培地からIL−17Aタンパク質を免疫沈降させること、を含む、天然IL−17Aタンパク質を精製する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、培地中でT細胞を活性化すること;及び培地からIL−17Fタンパク質を免疫沈降させること、を含む、天然IL−17Fタンパク質を精製する方法を提供する。一部のさらなる実施形態では、IL−17Aタンパク質がIL−17Aホモ二量体、IL−17Aヘテロ二量体、又はIL−17Aホモ二量体とIL−17Aヘテロ二量体の両方であり、及び/又はIL−17Fタンパク質がIL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方であり、及びIL−17A又はIL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、そのような方法が提供される。他の実施形態では、培地はIL−21及び/又はIL−23を含む。

他の実施形態では、本発明は、IL−17Fタンパク質がIL−17Fホモ二量体又はIL−17Fヘテロ二量体であり、IL−17Fタンパク質が天然ソースから単離され、天然ソースが少なくとも1個のT細胞である、単離IL−17Fタンパク質を提供する。他の実施形態では、本発明は、IL−17Aタンパク質がIL−17Aホモ二量体又はIL−17Aヘテロ二量体であり、IL−17Aタンパク質が天然ソースから単離され、天然ソースが少なくとも1個のT細胞である、単離IL−17Aタンパク質を提供する。

他の実施形態では、本発明は、IL−17F拮抗物質を投与することを含む、IL−17Aシグナル伝達に関連する少なくとも1つの活性を阻害する方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、IL−17Aホモ二量体及びIL−17Fホモ二量体を実質的に含まないIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を単離する方法を提供し、(a)培地で培養した宿主細胞において、第一アフィニティータグに融合したIL−17Aタンパク質又はそのフラグメントを含むIL−17A融合タンパク質及び第二アフィニティータグに融合したIL−17Fタンパク質又はそのフラグメントを含むIL−17F融合タンパク質を発現させること;(b)宿主細胞にIL−17A融合タンパク質及びIL−17F融合タンパク質を培地中に分泌させること;(c)IL−17A融合タンパク質が第一アフィニティーカラムに結合するように、非還元条件下で培地を第一アフィニティーカラムに加えること;(d)非還元条件下で結合タンパク質を第一アフィニティーカラムから溶出すること;(e)工程(d)から得た溶離液を、IL−17F融合タンパク質が第二アフィニティーカラムに結合するように、非還元条件下で第二アフィニティーカラムに加えること;及び(f)非還元条件下で結合タンパク質を第二アフィニティーカラムから溶出することを含む。ここで、工程(f)から得た溶離液は、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の形態でIL−17A融合タンパク質とIL−17F融合タンパク質の両方を含む。他の実施形態では、この方法の変法が提供される。他の実施形態では、本発明は、これらの様々な方法に従って単離されるIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を提供する。

インターロイキン−17F(IL−17F)は、タンパク質のIL−17ファミリーに属するサイトカインであり、炎症性サイトカイン及びケモカイン、例えばIL−6、IL−8、GM−CSF、G−CSF、GRO−α、MCP−1、IL−1β、TNF−α、TGF−β等の発現を誘導する。IL−17Fの発現は好中球増加症及び様々な自己免疫疾患と相関する(Bettelli and Kuchroo, supra)。例えばIL−17Fは、関節軟骨によるプロテオグリカン破壊の上昇及びプロテオグリカン合成の低下(Hymowitz, supra)、中枢神経系自己免疫(Langrish, supra)、アレルギー及び喘息応答(Kawaguchi, supra)及び炎症性腸疾患(Gurney, supra)に関連する。それ故、IL−17Fシグナル伝達は、炎症性疾患、例えば自己免疫疾患(例えば関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症)、呼吸器疾患(例えばCOPD、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー)、移植片拒絶反応(固形臓器移植拒絶反応を含む)、及び炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)を含むが、これらに限定されない疾患に関与すると考えられる。

本発明の一部として、本発明者らは、IL−17Fの投与に対する以下の応答を明らかにすることによって炎症性疾患へのIL−17Fの関与を確認した。例えば腹膜への好中球流入(実施例1.1)、一次軟骨細胞による炎症性サイトカインの分泌上昇と相関する炎症性サイトカインの一次転写因子の活性化(実施例1.2)、肺線維芽細胞による炎症性サイトカインの分泌上昇(実施例1.3)、及び一次ヒト軟骨細胞におけるアグリカナーゼレベルの上昇(実施例7)。本発明者らはまた、IL−17FとIL−17Aの両方が、自己免疫性関節炎(実施例7)、乾癬(実施例9)及び炎症性腸疾患(IBD)(実施例9)に関与し得ると判定した。本発明者らはまた、IL−17Fについての受容体としてIL−17R及びIL−17RCを特定し(実施例2)、それ故IL−17Fシグナル伝達経路の阻害のための新規標的を提供する。本発明者らはまた、抗IL−17F抗体を作製し、各々の抗体の結合特異性、親和性及びIL−17Fシグナル伝達を阻害する能力、すなわちIL−17F生物活性に関して特性決定した(実施例3及び5)。一実施形態では、抗体は、IL−17R及び/又はIL−17RC認識のために必要と考えられるIL−17Fエピトープを特性決定するのに役立つ。すなわち、6個のマウス抗ヒトIL−17F抗体のうち5個がIL−17RへのIL−17Fの結合に干渉することができ、5個のうち2個はIL−17RCへのIL−17Fの結合にも干渉することができる。本発明者らはまた、IL−17F生物活性、例えば炎症性サイトカインについての一次転写因子のIL−17Fを介した活性化、及びその後、一次線維芽細胞様滑膜細胞によるIL−17Fを介したサイトカイン分泌を阻害する(すなわち低下させる、制限する、ブロックする又はさもなければ低減する)、これらの抗体の一部の能力を明らかにした(実施例4)。また、IL−17R及びIL−17RCを通してのIL−17A及びIL−17Fシグナル伝達を低下させる阻害性ポリヌクレオチドも本明細書で開示する(実施例8)。本発明者らはまた、IL−21とIL−17Fの直接の関係、すなわちIL−21が活性化T細胞によってIL−17AとIL−17Fの両方の産生を増強する能力も明らかにした。そこで、IL−17Fシグナル伝達の阻害はまた、IL−21のIL−21Rへの結合及びIL−21Rの活性化に関連する少なくとも1つの作用も阻害し得る、例えばIL−17Fシグナル伝達を阻害する方法は、IL−17F関連疾患及び/又はIL−21がIL−21Rに結合してIL−21Rを活性化することに関連する疾患を治療する方法において使用し得ると推論される。本発明者らはまた、初めてサイトカインの天然ソースからIL−17A及びIL−17Fを単離した。本発明者らはまた、新規IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を明らかにし、精製して(それぞれ、例えばT細胞において、及びHEK−293及びCOS細胞において)、このヘテロ二量体が、例えばGRO−αレベルの発現を誘導することによって、IL−17Fシグナルを伝達することを示した(実施例5)。それ故本発明者らは、IL−17Fシグナル伝達経路の阻害のための、及び/又は炎症性疾患及び/又はIL−21がIL−21Rに結合してIL−21Rを活性化することに関連する疾患の治療における、新規標的として上記へテロ二量体を提供した。

そこで、本発明は、インビボでのIL−17Fを介した(IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を介する場合を含む)炎症性応答を抑制するために使用し得る、及びその結果としてIL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患、すなわちIL−17F関連疾患及び/又はIL−21がIL−21Rに結合してIL−21Rを活性化することに関連する疾患の診断、予後判定、観測及び/又は治療において使用し得る、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント(例えばIL−17F結合フラグメント)及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子)を提供する。新規IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の特定と単離は、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患がIL−17Fホモ二量体及び/又はIL−17Fヘテロ二量体によって媒介され得ることを示唆する。そこで、本明細書で使用する「IL−17F」という用語は、適切な場合、IL−17Fホモ二量体又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を指す。例えばIL−17Fシグナル伝達経路は、IL−17Fホモ二量体とIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体のいずれか又は両方を含み得るシグナル伝達経路を包含する。

従って、本願は、IL−17R及びIL−17RCポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む、IL−17Fシグナル伝達に関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本発明はまた、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を含むがこれらに限定されない、IL−17F、特にヒトIL−17Fに結合する抗体、すなわちインタクトな抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、抗IL−17F抗体は、少なくとも1つのIL−17F関連(例えばIL−17Fホモ二量体及び/又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体)活性を阻害する又は活性に拮抗する。例えば抗IL−17F抗体は、IL−17Fに結合して、IL−17FとIL−17F受容体複合体、例えばIL−17R及び/又はIL−17RCを含む複合体との間の相互作用に干渉する(例えばブロックする)ことができる。そこで、本発明の抗体は、IL−17F生物活性、例えばIL−17FとIL−17F受容体複合体又はそのサブユニットの間の結合を検出し、場合により阻害する(例えば低下させる、制限する、ブロックする又はさもなければ低減する)ために使用し得る。それ故、本発明の抗IL−17F抗体は、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患及び/又はIL−21がIL−21Rに結合してIL−21Rを活性化することに関連する疾患を診断する、予後判定する、観測する及び/又は治療又は予防するために使用し得る。
(IL−17F、IL−17R及びIL−17RCのポリヌクレオチド及びポリペプチド)

本発明は、IL−17Fシグナル伝達経路のさらなる特性決定、すなわちIL−17F受容体としてIL−17R及び/又はIL−17RCの決定、阻害性分子、例えば抗体、受容体融合タンパク質及びsiRNAを用いた、IL−17FのIL−17R及び/又はIL−17RCへの結合に干渉する作用の解明、及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の精製を提供する。本発明は、阻害性IL−17F、IL−17R及びIL−17RCポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む、IL−17F、IL−17R及びIL−17RCポリヌクレオチド及びポリペプチドに関する。

IL−17Fヌクレオチド及びアミノ酸配列は当分野において公知であり、提供される。ヒトIL−17Fのヌクレオチド配列を配列番号1に示す。そのヌクレオチド配列によってコードされる完全長IL−17Fタンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に示す。成熟IL−17Fのアミノ酸配列は、配列番号2のおよそアミノ酸31から始まるタンパク質に対応する(例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第10/102,080号参照)。

IL−17Aヌクレオチド及びアミノ酸配列は当分野において公知であり、提供される。ポリ(A)尾部を含む、ヒトIL−17Aのヌクレオチド配列を配列番号3に示す。そのヌクレオチド配列に対応する完全長IL−17Aタンパク質のアミノ酸配列を配列番号4に示す。

IL−17Rヌクレオチド及びアミノ酸配列は当分野において公知であり、提供される。ポリ(A)尾部を含む、ヒトIL−17Rのヌクレオチド配列を配列番号5に示す。そのヌクレオチド配列に対応する完全長IL−17Rタンパク質のアミノ酸配列を配列番号6に示す。

IL−17RCヌクレオチド及びアミノ酸配列は当分野において公知であり、提供される。ポリ(A)尾部を含む、いくつかのヒトIL−17RCポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を配列番号7、9、11、13及び15に示す。それらのヌクレオチド配列に対応するいくつかの完全長ヒトIL−17RCタンパク質のアミノ酸配列を配列番号8、10、12、14及び16に示す。

本発明に関連する核酸は、DNA又はRNAを含んでもよく、完全に又は部分的に合成することができる。本明細書で述べるヌクレオチド配列への言及は、文脈が異なる意味を求めない限り、特定された配列を有するDNA分子(又はその相補物)を包含し、UがTを置換している特定配列を有するRNA分子を包含する。

本発明に関連する単離ポリヌクレオチドは、開示するポリヌクレオチドをコードする配列と同一又は類似の配列を有する核酸を特定し、単離するためのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとして使用し得る。核酸を特定し、単離するためのハイブリダイゼーション法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、サザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーションを含み、当業者には周知である。

ハイブリダイゼーション反応は種々のストリンジェンシー条件下で実施し得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、任意の2個の核酸分子がお互いにハイブリダイズすることの難易度を含む。好ましくは、各々のハイブリダイズするポリヌクレオチドは低いストリンジェンシー条件下でその対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズし、より好ましくはストリンジェントな条件下で、最も好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。ストリンジェンシー条件の例を以下の表1に示す:高度にストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば条件A−Fと同程度に厳密な条件であり;ストリンジェントな条件は、少なくとも、例えば条件G−Lと同程度に厳密な条件であり;及び低いストリンジェンシー条件は、少なくとも、例えば条件M−Rと同程度に厳密な条件である。

1:ハイブリッド長は、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域に関して予想されるものである。ポリヌクレオチドが未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするとき、ハイブリッド長はハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さと仮定される。公知の配列のポリヌクレオチドがハイブリダイズするとき、ハイブリッド長は、ポリヌクレオチドの配列を整列し、最適配列相補性の領域(1又はそれ以上)を特定することによって決定できる。
2:ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液においてSSPE(1×SSPEは、0.15M NaCl、10mM NaHPO及び1.25mM EDTA、pH7.4である)をSSC(1×SSCは、0.15M NaCl及び15mMクエン酸ナトリウムである)の代わりに使用することができる;洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後15分間実施する。
−T :50塩基対未満の長さであると予想されるハイブリッドについてのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融点(T)より低い5−10℃にすべきである[Tは以下の方程式に従って決定される]。18塩基対未満の長さのハイブリッドに関しては、T(℃)=2(A+T塩基の数)+4(G+C塩基の数)。18−49塩基対の長さのハイブリッドに関しては、T(℃)=81.5+16.6(log10Na)+0.41(G+C%)−(600/N)[Nはハイブリッド中の塩基の数であり、Naはハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1×SSCについてのNa=0.165M)]。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件のさらなる例は、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4の中で提供される。

本発明に関連する単離ポリヌクレオチドは、開示するポリヌクレオチドの対立遺伝子変異型をコードする配列を有するDNAを特定し、単離するためのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとしても使用し得る。対立遺伝子変異型は、開示するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同一であるか又は有意の類似性を有するポリペプチドをコードする、開示するポリヌクレオチドの天然に生じる選択的形態である。好ましくは、対立遺伝子変異型は、開示するポリヌクレオチドと少なくとも90%の配列同一性(より好ましくは少なくとも95%の同一性;最も好ましくは少なくとも99%の同一性)を有する。あるいは、核酸セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件(例えば高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件)下で開示ポリヌクレオチドにハイブリダイズするとき、有意の類似性が存在する。

本発明に関連する単離ポリヌクレオチドは、開示するポリヌクレオチドに相同なポリペプチドをコードする配列を有するDNAを特定し、単離するためのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとして使用し得る。これらの相同体は、開示ポリペプチド及びポリヌクレオチドの種とは異なる種から単離されるポリヌクレオチド及びポリペプチドであるか、又は同じ種内であるが、開示ポリヌクレオチド及びポリペプチドと有意の配列類似性を有するポリヌクレオチド及びポリペプチドである。好ましくは、ポリヌクレオチド相同体は、開示するポリヌクレオチドと少なくとも50%の配列同一性(より好ましくは少なくとも75%の同一性;最も好ましくは少なくとも90%の同一性)を有し、一方ポリペプチド相同体は、開示するポリペプチドと少なくとも30%の配列同一性(より好ましくは少なくとも45%の同一性;最も好ましくは少なくとも60%の同一性)を有する。好ましくは、開示ポリヌクレオチド及びポリペプチドの相同体は、哺乳動物種から単離されるものである。

2個の配列の間の「相同性」又は「配列同一性」(これらの用語は本明細書では交換可能に使用される)の算定は以下のように実施される。配列を最適比較のために整列し(例えば最適整列のために第一と第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、また比較目的のために非相同配列は無視することができる)。好ましい実施形態では、比較目的のために整列される標準配列の長さは、標準配列の長さの少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、さらに一層好ましくは少なくとも60%、さらに一層好ましくは少なくとも70%、80%、90%、100%である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一配列内の位置が第二配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、分子はその位置において同一である(本明細書で使用する、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」に等しい)。2個の配列の間の同一性パーセントは、2個の配列の最適整列のために導入する必要がある、ギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮に入れて、2個の配列によって共有される同一位置の数の関数である。

配列の比較及び2個の配列の間の配列同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて実施し得る。好ましい実施形態では、2個のアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Blossum 62マトリックス又はPAM250マトリックスのいずれか、及びギャップ加重16、14、12、10、8、6又は4とギャップ長加重1、2、3、4、5又は6を使用して、GCGソフトウエアパッケージ(www.gcg.comにおいて入手可能)内のGAPプログラムに組み込まれた、NeedlemanとWunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-53)のアルゴリズムを用いて決定される。さらにもう1つの好ましい実施形態では、2個のヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、NWSgapdna.CMPマトリックス及びギャップ加重40、50、60、70又は80とギャップ長加重1、2、3、4、5又は6を使用して、GCGソフトウエアパッケージ(www.gcg.comにおいて入手可能)内のGAPプログラムを用いて決定される。パラメータの特に好ましいセット(及び実施者が、分子が本発明の配列同一性又は相同性限界内であるかどうかを判定するためにどのようなパラメータを適用すべきかについて確信がない場合に使用すべきセット)は、Blossum 62スコアリングマトリックス及びギャップペナルティ12、ギャップ伸長ペナルティ4及びフレームシフトギャップペナルティ5である。2個のアミノ酸又はヌクレオチド配列の間の同一性パーセントはまた、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12及びギャップペナルティ4を使用して、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれた、MeyersとMiller((1989) CABIOS 4:11-17)のアルゴリズムを用いて決定することもできる。

本発明に関連する単離ポリヌクレオチドはまた、本発明に関連するポリペプチドを発現する細胞及び組織及びそれらが発現される条件を特定するためのハイブリダイゼーションプローブ及びプライマーとしても使用し得る。

加えて、本発明に関連するポリペプチドの機能は、細胞又は生物において本発明に関連するポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を変化させる(すなわち増強する、低減する又は調節する)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することによって直接検討し得る。これらの「対応する遺伝子」は、本発明に関連するポリヌクレオチドが由来するmRNAを生産するために転写される、本発明に関連するゲノムDNA配列である。

本発明に関連する遺伝子の変化した発現は、様々な阻害性ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスポリヌクレオチド、siRNA及び本発明に関連する遺伝子から転写されるmRNAに結合する及び/又はmRNAを切断するリボザイムの使用を通して細胞又は生物において達成され得る(例えばGalderisi et al. (1999) J. Cell Physiol. 181:251-57; Sioud (2001) Curr. Mol. Med. 1:575-88参照)。例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RCに対する阻害性ポリヌクレオチドは、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質として有用であると考えられ、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患を予防する又は治療する上でも有用であり得る。阻害性ポリヌクレオチドはまた、アプタマー、すなわちタンパク質に結合して、タンパク質活性、例えばIL−17F、IL−17A、IL−17R及び/又はIL−17RCの活性を調節するポリヌクレオチドから成り得る。アプタマーは文献において広く記述されており、例えば Nimjee et al. (2005) Annu. Rev. Med. 56:555-83 and Patel (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:32-46参照。

本発明に関連するアンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムは、本発明に関連する遺伝子のコード鎖全体に又はその一部だけに相補的であり得る。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムは、本発明に関連する遺伝子のコード鎖の非コード領域に相補的であり得る。アンチセンスポリヌクレオチド又はリボザイムは、当分野で周知の手順を用いて化学合成及び酵素結合反応を使用して構築できる。化学合成したポリヌクレオチドのヌクレオシド結合は、ヌクレアーゼを介した分解に抵抗するそれらの能力を増強するように並びにそれらの配列特異性を高めるように修飾することができる。そのような結合修飾は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、モルホリノ及びペプチド核酸(PNA)結合を含むが、これらに限定されない(Galderisi et al., supra; Heasman (2002) Dev. Biol. 243:209-14; Micklefield (2001) Curr. Med. Chem. 8:1157-79)。あるいは、これらの分子は、本発明に関連するポリヌクレオチドをアンチセンス(すなわち逆)方向にサブクローニングした発現ベクターを用いて生物学的に生産することができる。

本発明の阻害性ポリヌクレオチドはまた、高い特異性と親和性で二重鎖DNAの主溝に結合する三重鎖形成性オリゴヌクレオチド(TFO)を含む(Knauert and Glazer (2001) Hum. Mol. Genet. 10:2243-51)。本発明に関連する遺伝子の発現は遺伝子の調節領域(すなわちプロモーター及び/又はエンハンサー配列)に相補的なTFOを標的にし、遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することによって阻害できる。

本発明の一実施形態では、本発明の阻害性ポリヌクレオチドは短い干渉RNA(siRNA)分子である。これらのsiRNA分子は、標的mRNAの配列特異的分解を生じさせる短い(好ましくは19〜25ヌクレオチド;最も好ましくは19又は21ヌクレオチド)、二本鎖RNA分子である。この分解はRNA干渉(RNAi)として公知である(例えばBass (2001) Nature 411 :428-29参照)。下等生物において最初に特定されたRNAiは、哺乳動物細胞に有効に適用されており、最近、Fas mRNAを標的するsiRNA分子で処置したマウスにおいて劇症肝炎を予防することが示された(Song et al. (2003) Nature Med. 9:347-51)。加えて、最近、髄腔内経路で送達されたsiRNAが、ラットでの2つのモデル(作動物質誘導性疼痛モデル及び神経障害性疼痛モデル)において疼痛応答をブロックすることが報告された(Dorn et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(5):e49)。

本発明のsiRNA分子は、2個の相補的な一本鎖RNA分子(そのうちの1個は標的mRNAの一部にマッチする)を一緒にアニーリングすることによって(Fire et al., 米国特許第6,506,559号)又は必要な二本鎖部分を生成するためにそれ自体で折り返す1個のヘアピンRNA分子の使用を通して(Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:6047-52) 作製し得る。siRNA分子は、化学合成し得るか(Elbashir et al. (2001) Nature 411 :494-98)又は一本鎖DNA鋳型を使用したインビトロ転写によって生産し得る(Yu et al., supra)。あるいは、siRNA分子は、センス及びアンチセンスsiRNA配列を含む発現ベクターを使用して、一過性に(Yu et al., supra; Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20)又は安定に(Paddison et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1443-48)、生物学的に生産することができる。最近、効率的且つ配列特異的な方法での、一次ヒト細胞における標的mRNAのレベルの低下が、siRNAへとさらにプロセシングされるヘアピンRNAを発現するアデノウイルスベクターを使用して明らかにされた(Arts et al. (2003) Genome Res. 13:2325-32)。

本発明に関連するポリヌクレオチドを標的するsiRNA分子は、当分野で周知の判定基準(例えばElbashir et al. (2001) EMBO J. 20:6877-88)に基づいて設計することができる。例えば標的mRNAの標的セグメントは、好ましくはAA(最も好ましい)、TA、GA又はCAで始まるべきであり;siRNA分子のGC比は、好ましくは45〜55%であるべきであり;siRNA分子は好ましくは1つの列に同じヌクレオチド3個を含むべきではなく;siRNA分子は、好ましくは1つの列に7個の混合G/Cを含むべきではなく;並びに標的セグメントは、好ましくは標的mRNAのORF領域内にあるべきであり、好ましくは開始ATGの少なくとも75bp後及び終結コドンの少なくとも75bp前にあるべきである。これらの判定基準又は他の公知の判定基準(例えばReynolds et al. (2004) Nature Biotechnol. 22:326-30)に基づき、本発明に関連するmRNAポリヌクレオチドを標的する本発明のsiRNA分子は当業者によって設計され得る。開示する方法における使用のためのsiRNAの好ましい例は、配列番号17〜32に示されており、IL−17R(配列番号17〜24)及びIL−17RC(配列番号25〜32)を標的するために有用なsiRNAに対応する。

生物における、本発明に関連する遺伝子の変化した発現はまた、それらのゲノム内に本発明に関連するポリヌクレオチドが導入された非ヒトトランスジェニック動物の作製を通して達成され得る。そのようなトランスジェニック動物は、本発明の遺伝子(すなわち導入遺伝子)の多数のコピーを有する動物を含む。本発明に関連するポリペプチドの発現を特定細胞又は特定発生段階に指令するために、組織特異的調節配列を導入遺伝子に作動可能に連結し得る。胚操作と微量注入によってトランスジェニック動物、特にマウス等の動物を作製するための方法は慣例的になりつつあり、当分野において周知である(例えばBockamp et al., Physiol. Genomics 11:115-32 (2002))。

生物における、本発明に関連する遺伝子の変化した発現はまた、本発明に関連するポリヌクレオチドに対応する内在性遺伝子が外来性ポリヌクレオチド配列の挿入を通して破壊された動物(すなわちノックアウト動物)の作製を通して達成され得る。内在性遺伝子のコード領域を破壊し、それによって非機能性タンパク質を生成し得る。あるいは、内在性遺伝子の上流調節領域を異なる調節エレメントで破壊又は置換して、まだ機能性であるタンパク質の変化した発現を生じさせ得る。ノックアウト動物を作製するための方法は相同的組換えを含み、当分野において周知である(例えばWolfer et al., Trends Neurosci. 25:336-40 (2002))。

本発明の単離ポリヌクレオチドはまた、発現調節配列に作動可能に連結し得る及び/又は本発明に関連するポリペプチド(その活性フラグメント及び/又は融合ポリペプチドを含む)の組換え生産のための発現ベクターに連結し得る。組換えタンパク質を発現する一般的方法は当分野において周知である。

発現ベクターは、本明細書で使用するとき、それが連結されているもう1つ別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図されている。ベクターの1つの種類は、付加的なDNAセグメントをその中に連結し得る環状二本鎖DNAループを指す、プラスミドである。ベクターのもう1つの種類は、付加的なDNAセグメントをウイルスゲノム内に連結し得る、ウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる(例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターを本明細書では組換え発現ベクター(又は単に、発現ベクター)と称する。一般に、組換えDNA手法において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、プラスミドとベクターは交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、他の形態の発現ベクター、例えば等しい機能を果たすウイルスベクター(例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス)を包含することが意図されている。

一実施形態では、本発明に関連するポリヌクレオチドは、組換えIL−17F作動物質、例えば少なくとも1つの「IL−17F受容体結合モチーフ」の存在に基づいて特定できるものを生成するために使用される。本明細書で使用する、「IL−17F受容体結合モチーフ」という用語は、IL−17Fのその必要な受容体への結合のために重要なアミノ酸配列又は残基を含む。IL−17F作動物質の一例は、IL−17Fホモ二量体、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体、それらのフラグメント、例えばIL−17R又はIL−17RC結合フラグメント、及び/又は低分子(以下で述べるような)を含む。そのような作動物質は、造血の調節において、及びその結果として、骨髄性又はリンパ系細胞欠損症の治療において有用であると考えられる。他の実施形態では、本発明に関連するポリヌクレオチドは、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント(例えばIL−17F結合フラグメント)及び/又は融合タンパク質を含む);IL−17Fホモ二量体及び/又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の生物活性を阻害し得る、阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)を生成するために使用される。

融合ポリペプチド、すなわち第二ポリペプチド部分と結合した第一ポリペプチド部分を生成する方法は、当分野において周知である。例えばIL−17Fポリペプチド又はIL−17F受容体ポリペプチド(例えばそのフラグメントを含む、IL−17R及び/又はIL−17RC)は、第二ポリペプチド部分、例えば免疫グロブリン又はそのフラグメント(例えばそのFc結合フラグメント)に融合され得る。一部の実施形態では、第一ポリペプチド部分は、例えば完全長IL−17RCポリペプチドを含む。あるいは、第一ポリペプチドは完全長未満のIL−17RCポリペプチドを含み得る。加えて、例えばIL−17RCの可溶性形態は、「リンカー」配列を通して免疫グロブリンのFc部分に融合され得る。他の融合タンパク質、例えばグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、Lex−A、チオレドキシン(TRX)又はマルトース結合タンパク質(MBP)との融合タンパク質も使用し得る。

第二ポリペプチド部分は、好ましくは可溶性である。一部の実施形態では、第二ポリペプチド部分は、結合ポリペプチドの半減期(例えば血清半減期)を延長させる。一部の実施形態では、第二ポリペプチド部分は、第二IL−17F又はIL−17Rポリペプチドと融合ポリペプチドとの結合を促進する配列を含む。好ましい実施形態では、第二ポリペプチドは、免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも1つの領域を含む。免疫グロブリン融合ポリペプチドは当分野において公知であり、例えば、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,516,964号;同第5,225,538号;同第5,428,130号;同第5,514,582号;同第5,714,147号;及び同第5,455,165号に述べられている。融合タンパク質は、第一ポリペプチド部分、例えばそのフラグメントを含むIL−17F又はIL−17Rを、第二部分に連結するリンカー配列を付加的に含み得る。そのようなリンカー配列の使用は当分野において周知である。例えば融合タンパク質は、ペプチドリンカー、例えば約2−20個、より好ましくは10個未満のアミノ酸長のペプチドリンカーを含み得る。一実施形態では、ペプチドリンカーは2アミノ酸長であり得る。

他の実施形態では、組換えタンパク質は、そのN末端に異種シグナル配列(すなわちIL−17F、IL−17R又はIL−17RC核酸によってコードされるポリペプチド内には存在しないポリペプチド配列)を含む。例えばもう1つ別のタンパク質からのシグナル配列が、そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含むIL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチドと融合され得る。ある種の宿主細胞(例えば哺乳動物宿主細胞)では、異種シグナル配列の使用を通して組換えタンパク質の発現及び/又は分泌を高めることができる。融合タンパク質に含まれ得る1つのシグナルペプチドは、メリチンシグナルペプチドMKFLVNVALVFMVVYISYIYA(配列番号33)である。

本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えDNA手法によって生産し得る。例えば種々のポリペプチド配列をコードするDNAフラグメントは、例えば連結のための平滑末端又は付着末端、適切な末端を与えるための制限酵素消化、適宜に付着末端を埋めること、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素結合を使用することにより、従来の手法に従ってインフレームで共に連結される。他の実施形態では、融合遺伝子は、自動DNA合成機を含む従来の手法によって合成することができる。あるいは、2個の連続する遺伝子フラグメントの間に相補的突出部を生じさせるアンカープライマーを使用して遺伝子フラグメントのPCR増幅を実施してもよく、その後相補的突出部をアニーリングし、キメラ遺伝子配列を生成するために再増幅することができる(例えばAusubel et al. (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992参照)。さらに、融合部分(例えば免疫グロブリン重鎖のFc領域)をコードする多くの発現ベクターが市販されている。IL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RCをコードする核酸を、融合部分が免疫グロブリンタンパク質にインフレームで連結されるようにそのような発現ベクターにクローニングし得る。一部の実施形態では、IL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC融合ポリペプチドは、オリゴマー、例えば二量体又は三量体として存在する。

本発明の組換え発現ベクターは、付加的な配列、例えば宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)及び選択マーカー遺伝子を担持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。例えば典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に薬剤、例えばG418、ハイグロマイシン又はメトトレキサートに対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅に関するdhfr宿主細胞での使用のため)及びneo遺伝子(G418選択のため)を含む。

プロモーター配列を含む適切な調節配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び適宜に他の配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列(例えば複製起点)を含む適切なベクターを選択し、構築することができる。ベクターは、適宜にプラスミド又はウイルス、例えばファージ又はファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えばMolecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989参照。例えば核酸構築物の作製、突然変異誘発、塩基配列決定、細胞へのDNAの導入及び遺伝子発現における核酸の操作、及びタンパク質の分析のための多くの公知の手法及びプロトコールが、Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992の中で詳細に述べられている。

そこで、本発明のさらなる態様は、本明細書で開示する核酸を含む宿主細胞を提供する。さらなる態様は、そのような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の使用可能な手法を使用し得る。真核細胞については、適切な手法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン、電気穿孔法、リポソームを介したトランスフェクション、及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えばワクシニア、又は昆虫細胞に関してはバキュロウイルスを使用する形質導入を含み得る。細菌細胞については、適切な手法は、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法及びバクテリオファージを用いるトランスフェクションを含み得る。導入に続いて、例えば遺伝子の発現のための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を生じさせ得る又は発現を可能にし得る。

多くの細胞系が、本発明に関連するポリペプチドの組換え発現のための適切な宿主細胞として働き得る。哺乳動物宿主細胞系は、例えばCOS細胞、CHO細胞、293細胞、A431細胞、3T3細胞、CV−1細胞、HeLa細胞、L細胞、BHK21細胞、HL−60細胞、U937細胞、HaK細胞、ジャーカット細胞、並びに一次組織及び一次外植片のインビトロ培養に由来する細胞系を含む。

あるいは、下等真核生物、例えば酵母又は原核生物において本発明に関連するポリペプチドを組換え生産することが可能であり得る。潜在的に適切な酵母菌株は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)菌株及びカンジダ(Candida)菌株を含む。潜在的に適切な細菌株は、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)を含む。本発明に関連するポリペプチドを酵母又は細菌において作製する場合、機能性を得るためにそれらを、例えば適切な部位のリン酸化又はグリコシル化によって、修飾することが必要であり得る。そのような共有結合は、周知の化学的又は酵素的方法を用いて達成され得る。

細菌における発現は、組換えタンパク質を組み込んだ封入体の形成を生じさせ得る。それ故、活性な又はより活性な物質を生産するために組換えタンパク質のリフォールディングが必要であり得る。細菌封入体から正しく折りたたまれた異種タンパク質を得るためのいくつかの方法が当分野において公知である。これらの方法は一般に、封入体からタンパク質を可溶化すること、次にカオトロピック試薬を用いてタンパク質を完全に変性することを含む。システイン残基がタンパク質の一次アミノ酸配列内に存在するときは、しばしばジスルフィド結合の正しい形成を可能にする環境(酸化還元系)でリフォールディングを実施することが必要である。リフォールディングの一般的な方法は、Kohno (1990) Meth. Enzymol. 185:187-95に開示されている。欧州特許第EP0433225号及び米国特許第5,399,677号は他の適切な方法を述べている。

本発明に関連するポリペプチドはまた、1又はそれ以上の昆虫発現ベクター、例えばバキュロウイルスベクターにおいて本発明の単離ポリヌクレオチドを適切な制御配列に作動可能に連結すること、及び昆虫細胞発現系を使用することによって組換え生産し得る。バキュロウイルス/Sf9発現系のための材料及び方法は、キット形態で市販されている(例えばMAXBAC(登録商標)キット、Invitrogen,Carlsbad,CA)。

適切な宿主細胞における組換え発現に続いて、本発明の組換えポリペプチドは、その後、公知の精製方法、例えば免疫沈降法、ゲルろ過及びイオン交換クロマトグラフィーを用いて培地又は細胞抽出物から精製し得る。例えばIL−17Fシグナル伝達拮抗物質、例えばIL−17Rタンパク質及び/又はIL−17RCタンパク質(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む)の可溶性形態;又はIL−17F作動物質、例えば可溶性IL−17F(ホモ二量体又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体形態)は、馴化培地から精製し得る。例えばIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の膜結合形態は、発現細胞から全膜分画を調製し、非イオン性洗浄剤、例えばTriton X−100で膜を抽出することによって精製し得る。本発明に関連するポリペプチドは、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAMICON(登録商標)又はMillipore PELLICON(登録商標)限外ろ過ユニット(Millipore,Billerica,MA)を用いて濃縮し得る。濃縮工程後、濃縮物を精製マトリックス、例えばゲルろ過培地にアプライすることができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)又はポリエチレンイミン(PEI)基を有するマトリックス又は基質を用いることができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製において一般的に使用される他の種類であり得る。あるいは、陽イオン交換工程が使用できる。適切な陽イオン交換体は、スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。スルホプロピル基が好ましい(例えばS−SEPHAROSE(登録商標)カラム、Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)。培養上清からの組換えタンパク質の精製はまた、コンカナバリンA−アガロース、ヘパリン−TOYOPEARL(登録商標)(Toyo Soda Manufacturing Co.,Ltd.,Japan)又はCibacrom blue 3GA SEPHAROSE(登録商標)(Tosoh Biosciences,San Francisco,CA)等のアフィニティー樹脂での;又はフェニルエーテル、ブチルエーテル又はプロピルエーテル等の樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーによる;又は免疫アフィニティークロマトグラフィーによる、1又はそれ以上のカラム工程を含み得る。最後に、疎水性RP−HPLC培地、例えばペンダントメチル基又は他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる1又はそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)工程が、組換えタンパク質をさらに精製するために使用できる。組換えタンパク質に対する抗体を含むアフィニティーカラム(例えば本明細書での方法を用いて記述されているもの)も、公知の方法に従った精製において使用し得る。様々な組合せでの又は他の公知の方法と組み合わせた、上記精製工程の一部又は全部は、実質的に精製された単離組換えタンパク質を提供するためにも使用し得る。好ましくは、単離組換えタンパク質は、実質的に他の哺乳動物タンパク質を含まないように精製される。加えて、これらの精製方法はまた、天然ソースを含む他のソースから本発明のポリペプチドを精製するためにも使用し得る。例えば、トランスジェニック動物の生成物として、例えばトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタ又はヒツジの乳の成分として発現される、本発明に関連するポリペプチド、例えばIL−17F作動物質(例えば可溶性IL−17F)又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばそのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む、可溶性IL−17R及び/又は可溶性IL−17RCタンパク質)は、上述したように精製し得る。

あるいは、ポリペプチドはまた、精製を容易にする形態で組換え発現され得る。例えばポリペプチドは、タンパク質、例えばマルトース結合タンパク質(MBP)、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)又はチオレドキシン(TRX)との融合物として発現され得る。そのような融合タンパク質の発現及び精製のためのキットは、それぞれNew England BioLabs(Beverly,MA),Pharmacia(Piscataway,NJ)及びInvitrogenから市販されている。組換えタンパク質はまた、小さなエピトープで標識し、その後エピトープに対する特異的抗体を使用して特定又は精製することができる。好ましいエピトープは、Eastman Kodak(New Haven,CT)から市販されている、FLAGエピトープである。

あるいは、組換えIL−17F及びIL−17A融合タンパク質は、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の精製を可能にするために異なるエピトープで標識し得る。IL−17F及びIL−17A上の異なる標識の存在は、IL−17A及びIL−17Fホモ二量体の両方を実質的に含まないIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の単離を可能にする。例えばIL−17AをFLAG又はmycエピトープ等のエピトープで標識してもよく、一方、同時にIL−17FをHis又はGSTエピトープ等のエピトープで標識し、両方のタンパク質を細胞内で同時に発現させる。組換え宿主細胞又は宿主細胞が培養される培地からの抽出物を得、非還元条件下で二段階アフィニティークロマトグラフィー精製に供する。第一アフィニティーカラムは、2個の異なる標識の一方、例えばIL−17A(又はIL−17Aのフラグメント)に融合したFLAGエピトープに結合し、それ故第一カラムからの洗浄液は(主として)IL−17Fホモ二量体を含み、第一カラムからの溶離液はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体とIL−17Aホモ二量体の両方を含む。次に第一カラムからの溶離液を、2個の異なる標識の他方、例えばIL−17Fに融合したHis標識に特異的に結合する第二アフィニティーカラムに加える。それ故、第二カラムからの洗浄液はIL−17Aホモ二量体を含み、第二カラムからの溶離液は、主として又は独占的にIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を含む(すなわちIL−17A及びIL−17Fホモ二量体の両方を実質的に含まない)。組換え宿主細胞又は宿主細胞培地からの抽出物を、タンパク質−タンパク質相互作用が妨げられないように非還元条件下で得るか、又は還元条件下で得て、次にその中に含まれるIL−17F及びIL−17A単量体の正しいリフォールディングと相互作用を可能にするように処理することができる。当業者は、宿主細胞はIL−17FとIL−17A融合タンパク質の両方を発現する必要がないこと;むしろ、単一トランスフェクタント、例えばIL−17A又はIL−17F融合タンパク質のいずれかを発現する宿主細胞からの細胞又は培地抽出物を得て、IL−17A及びIL−17F単量体が二量体化することを可能にする条件下で併合できることを容易に認識する。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を含む、本発明に関連するポリペプチドはまた、公知の慣例的化学合成によっても生産し得る。そのようなポリペプチドを化学的に合成する方法は当業者に周知である。そのような化学合成ポリペプチドは、天然の精製ポリペプチドと共通の生物学的性質を有し得、それ故天然ポリペプチドの生物学的に活性な又は免疫学的な代用物として使用し得る。

本発明者らはまた、IL−17Aの天然形態を含む、本発明のポリペプチドの「天然」、すなわち非組換え形態を単離することができた(例えば実施例5参照)。それ故、本発明のポリペプチドは、天然IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体等を包含する。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を含む、本発明に関連するポリペプチドはまた、開示するポリペプチドとは構造的に異なる(例えばわずかに変化した配列を有する)が、開示ポリペプチドと実質的に同じ生化学的性質を有する(例えば機能的に必須でないアミノ酸残基においてのみ変化している)分子を包含する。そのような分子は、天然に生じる対立遺伝子変異体及び変化、置換、交換、挿入又は欠失を含む意図的に工作された変異体を含む。そのような変化、置換、交換、挿入又は欠失のための手法は当業者に周知である。一部の実施形態では、ポリペプチド部分は、タンパク質分解に対してより抵抗性の(非突然変異配列に比べて)配列を生じさせる、天然に生じる配列(野生型)内の突然変異を有する変異型ポリペプチドとして提供される。

IL−17F(IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を含む)、IL−17R、IL−17RCポリペプチド、そのフラグメント及び/又は融合ポリペプチド、その組換え形態及び天然形態、及び/又は天然IL−17Aは、IL−17Fに結合する及び/又はIL−17F生物活性を阻害することができる物質(例えば他のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質、例えば抗IL−17F抗体)をスクリーニングするために使用し得る。固定化されているか又は固定化されていない、所望の結合タンパク質を利用する結合アッセイは当分野において周知であり、本発明のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質、例えばIL−17R及び/又はIL−17RCを含む、本発明に関連するポリペプチドに関してこの目的のために使用し得る。精製細胞ベースの又はタンパク質ベースの(無細胞)スクリーニングアッセイは、そのような物質を特定するために使用し得る。例えばIL−17Fタンパク質を精製形態で担体上に固定化し、精製IL−17Fへの潜在的リガンドの結合を測定し得る。
(抗体)

他の実施形態では、本発明は、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を、IL−17F(IL−17Fホモ二量体及び/又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を含む)、好ましくは哺乳動物(例えばヒト)IL−17F、又はIL−17Fについての受容体、例えばIL−17R及び/又はIL−17RCに特異的に結合する抗体として、すなわちインタクトな抗体及びその抗原結合フラグメントとして提供する。一実施形態では、抗体は阻害性抗体であり、すなわちそれらは、少なくとも1つのIL−17F生物活性(例えばIL−17Fとその受容体の結合、IL−17Fを介したシグナル伝達成分(例えばNF−κB)の活性化、IL−17Fを介したサイトカイン産生の誘導、IL−17Fを介したアグリカナーゼの上昇等)を阻害し、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患を診断する、予後判定する、観測する及び/又は治療する上で有用であり得る。IL−21によるIL−17A及びIL−17F産生の上方調節(実施例5参照)は、IL−21がIL−21Rに結合してIL−21Rを活性化すること(例えばIL−21シグナル伝達)に関連するプロ炎症作用が、IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及び/又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体によって媒介されることを示唆する。その結果として、IL−17Fシグナル伝達を低減する本発明の抗体はまた、IL−21シグナル伝達に関連する少なくとも1つの活性(例えばサイトカイン産生の調節、炎症性/自己免疫疾患(例えば炎症性腸疾患又は障害(IBD)、慢性関節リウマチ、移植組織/移植片拒絶反応及び乾癬)における炎症等;米国特許出願第60/599,086号及び同第60/639,176号参照)に対する阻害性抗体であり得、IL−21シグナル伝達に関連する疾患を診断する、予後判定する、観測する及び/又は治療する上で有用であり得る。

加えて、本発明は、IL−17Fに特異的に結合するが、IL−17Fシグナル伝達を阻害しない抗IL−17F抗体(すなわち検出抗体)を提供する;そのような抗体は、例えばIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患を診断する、予後判定する及び/又は観測するためのキットの一部として、IL−17Fタンパク質(例えばホモ二量体及び/又はヘテロ二量体として)の存在を検出するために使用し得る。一実施形態では、抗体はIL−17Fを対象とする。他の実施形態では、抗体はモノクローナル又は単一特異性抗体である。抗体はまた、ヒトIL−17Fに対するヒト、ヒト化、キメラ又はインビトロ生成抗体であり得る。

当業者は、本明細書で使用する、「抗体」という用語が、少なくとも1、好ましくは2個の重(H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)及び少なくとも1、好ましくは2個の軽(L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)を含むタンパク質を指すことを認識する。VH及びVL領域は、より保存された、「フレームワーク領域」(「FR」)と称される領域が組み入れられた、「相補性決定領域」(「CDR」)と称される超可変領域へとさらに細分することができる。FR及びCDRの範囲は正確に定義されている(参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; and Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917参照)。各々のVH及びVLは、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された、3個のCDRと4個のFRから成る:FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

抗体は、それによってそれぞれ重及び軽免疫グロブリン鎖が形成される、重及び軽鎖定常領域をさらに含み得る。一実施形態では、抗体は、重免疫グロブリン鎖と軽免疫グロブリン鎖が、例えばジスルフィド結合によって、相互に連結されている、2本の重免疫グロブリン鎖と2本の軽免疫グロブリン鎖の四量体である。重鎖定常領域は3個のドメイン、CH1、CH2及びCH3から成る。軽鎖定常領域は1個のドメイン、CLから成る。重及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には宿主組織又は因子、例えば免疫系の様々な細胞(例えばエフェクター細胞)及び古典的補体系の第一成分(C1q)への抗体の結合を媒介する。

免疫グロブリンは、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1又はそれ以上のポリペプチドから成るタンパク質を指す。認識されるヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α(IgA1及びIgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリン「軽鎖」(約25Kd又は214アミノ酸)は、NH末端の可変領域遺伝子(約110アミノ酸)及びCOOH末端のκ又はλ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長免疫グロブリン「重鎖」(約50Kd又は446アミノ酸)は、同様に可変領域遺伝子(約116アミノ酸)及びその他の上記定常領域遺伝子の1個、例えばγ(約330アミノ酸をコードする)によってコードされる。免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、抗体クラス、すなわちアイソタイプ(例えばIgM又はIgG1)をコードする。抗体の抗原結合フラグメント(又は単に「抗体部分」又は「フラグメント」)は、本明細書で使用するとき、抗原(例えばCD3)に特異的に結合する能力を保持する、完全長抗体の1又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例は、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価フラグメントである、Fabフラグメント;(ii)ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された2個のFabフラグメントを含む二価フラグメント、F(ab’)フラグメント;(iii)VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント;(iv)抗体の一本の腕のVL及びVHドメインから成るFvフラグメント;(v)VHドメインから成るdAbフラグメント;及び(vi)単離相補性決定領域(CDR)を含むが、これらに限定されない。さらに、Fvフラグメントの2個のドメイン、VLとVHは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用いて、それらをVLとVH領域が一価分子を形成するように対合する1本のタンパク質鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る(一本鎖Fv(scFv)として知られる)。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含されることが意図されている。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の手法を用いて得られ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じようにして有用性に関してスクリーニングされる。

本発明のポリペプチドに対する抗体分子、例えばIL−17Fタンパク質、IL−17R及び/又はIL−17RCに対する抗体は、当業者に周知の方法によって作製し得る。例えばモノクローナル抗体は、公知の方法に従ったハイブリドーマの生成によって作製し得る。このようにして形成されたハイブリドーマを、次に、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体を産生する1又はそれ以上のハイブリドーマを特定するために、標準的な方法、例えば酵素免疫測定法(ELISA)を用いてスクリーニングする。例えば本発明のIL−17Fタンパク質はまた、IL−17Fタンパク質と反応して、IL−17F(例えばIL−17Fホモ二量体及び/又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体)のその受容体、例えばIL−17R又はIL−17RCへの結合を阻害し得るポリクローナル及びモノクローナル抗体を得るために動物を免疫するのに使用し得る。同様に、IL−17R又はIL−17RCタンパク質は、それぞれIL−17R又はIL−17RCと特異的に反応して、これらの受容体のIL−17Fタンパク質(IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を含む)への結合を特異的に阻害し得るポリクローナル及びモノクローナル抗体を得るために使用し得る、すなわちこれらの抗体は、他のIL−17Fファミリー成員、例えばIL−17Aホモ二量体へのこれらの受容体のいずれか又は両方の結合を阻害しない。ペプチド免疫原は、付加的にカルボキシル末端にシステイン残基を含んでもよく、ハプテン、例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に結合し得る。付加的なペプチド免疫原は、チロシン残基を硫酸化チロシン残基で置換することによって作製し得る。そのようなペプチドを合成するための方法は当分野において周知である。本発明の完全長ポリペプチドを免疫原として使用してもよく、あるいはポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントを使用し得る。本発明のポリペプチドの抗原性ペプチドは、少なくとも7個の連続アミノ酸残基を含み、ペプチドに対して惹起される抗体がポリペプチドと特異的免疫複合体を形成するようにエピトープを含む。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも15個のアミノ酸残基、さらに一層好ましくは少なくとも20個のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも30個のアミノ酸残基を含む。

モノクローナル抗体は、組換えDNAテクノロジーの当業者に公知の他の方法によって作製し得る。モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを作製する代わりに、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー(例えば抗体ファージディスプレイライブラリー)を本発明に関連するポリペプチド(例えばIL−17F、IL−17R、IL−17RC)に関してスクリーニングし、それによって本発明に関連するポリペプチド(例えばそれぞれIL−17F、IL−17R、IL−17RC)に結合する免疫グロブリンライブラリー成員を単離することにより、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を特定し、単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングするための手法及び市販のキットは当業者に周知である。加えて、抗体ディスプレイライブラリーを作製し、スクリーニングする上での使用に特に適合させやすい方法及び試薬の例は、文献中に見出すことができる。例えば「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法は周知であり、特定の抗原特異性を有する抗体フラグメントを特定し、単離するために開発されたものであって、モノクローナル抗体を生産するために利用できる。上述したように動物を免疫原で免疫した後、生じるB細胞プールの抗体レパートリーをクローン化する。オリゴマープライマーの混合物とPCRを使用することによって免疫グロブリン分子の多様な集団の可変領域のDNA配列を得るための方法は一般的に公知である。例えば5’リーダー(シグナルペプチド)配列及び/又はフレームワーク1(FR1)配列に対応する混合オリゴヌクレオチドプライマー、並びに保存された3’定常領域に対するプライマーが、多くのマウス抗体からの重及び軽鎖可変領域のPCR増幅のために使用できる;同様の戦略がまた、ヒト抗体からヒトの重及び軽鎖可変領域を増幅するために使用されてきた。

ポリクローナル血清及び抗体は、適切な被験者を本発明のポリペプチドで免疫することによって生産し得る。免疫した被験者における抗体力価を、固定化タンパク質を用いるELISA等の標準的な手法によって経時的に観測し得る。所望する場合は、本発明のポリペプチドに対する抗体分子を被験者又は培地から単離してもよく、IgG分画を得るために周知の手法、例えばプロテインAクロマトグラフィーによってさらに精製し得る。

本発明のポリペプチドに対する抗体のフラグメントは、当分野で周知の方法に従った抗体の切断によって作製し得る。例えば免疫学的に活性なFab及びF(ab’)フラグメントは、抗体をペプシン等の酵素で処理することによって生成し得る。

加えて、ヒト及び非ヒト部分の両方を含む、本発明のポリペプチドに対するキメラ、ヒト化及び一本鎖抗体は、標準的な組換えDNA手法及び/又は組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを用いて生産し得る。ヒト化抗体はまた、内因性免疫グロブリン重及び軽鎖遺伝子を発現することはできないが、ヒト重及び軽鎖遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産し得る。例えば、例えばIL−17Fタンパク質に対するヒトモノクローナル抗体(mAb)は、マウス免疫グロブリン遺伝子ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を担持するトランスジェニックマウスを使用して作製し得る。対象抗原で免疫したこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を、次に、ヒトタンパク質からのエピトープに対して特異的親和性を有するヒトmAbを分泌するハイブリドーマを生産するために使用し得る。

キメラ免疫グロブリン鎖を含むキメラ抗体は、当分野で公知の組換えDNA手法によって生産し得る。例えばマウス(又は他の種の)モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を、マウスFcをコードする領域を除去するために制限酵素で消化し、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の相当部分で置換する。

抗体又は免疫グロブリン鎖は当分野で公知の方法によってヒト化し得る。ヒト化免疫グロブリン鎖を含むヒト化抗体は、抗原結合に直接関与しないFv可変領域の配列をヒトFv可変領域からの相当配列で置換することによって作製し得る。ヒト化抗体を作製するための一般的方法は、その全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる、Morrison (1985) Science 229:1202-07; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Queen et al.,米国特許第5,585,089号;同第5,693,761号;同第5,693,762号に述べられている。それらの方法は、重又は軽鎖の少なくとも1本から免疫グロブリンFv可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を単離し、操作して、発現することを含む。そのような核酸配列のソースは当業者に周知であり、例えばあらかじめ定められた標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから入手し得る。ヒト化抗体又はそのフラグメントをコードする組換えDNAを、その後、適切な発現ベクターにクローン化することができる。

ヒト化又はCDR移植抗体分子又は免疫グロブリンは、免疫グロブリン鎖の1個、2個又は全部のCDRを置換することができる、CDR移植又はCDR置換によって生産し得る。例えばその全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,225,539号; Jones et al. (1986) Nature 321:552-25; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-60; Winter,米国特許5,225,539号参照。Winterは、本発明のヒト化抗体を作製するために使用し得るCDR移植法を述べている(その内容が参照により本明細書に組み込まれる、イギリス特許出願第GB 2188638A号; Winter, 米国特許第5,225,539号)。特定のヒト抗体のCDR全部を非ヒトCDRの少なくとも一部で置換してもよく、又はCDRの一部だけを非ヒトCDRで置換してもよい。あらかじめ定められた抗原へのヒト化抗体の結合のために必要なCDRの数を置換することが唯一必要である。

ヒト抗体は、付加的に、抗原による攻撃誘発に応答する動物の内因性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて生産し得る。例えば国際公開公報WO 94/02602参照。非ヒト宿主における重及び軽免疫グロブリン鎖をコードする内在性遺伝子を無効にして、ヒト重及び軽鎖免疫グロブリンをコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムに挿入する。ヒト遺伝子は、例えば必要なヒトDNAセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込む。全ての所望の修飾を提供する動物は、その後、修飾の完全なセットよりは少ない修飾を含む中間トランスジェニック動物を異種交配することによる子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施形態はマウスであり、国際公開公報WO96/33735及び同WO96/34096に開示されているようにXENOMOUSE(商標)と称される。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌するB細胞を生産する。抗体は、例えばポリクローナル抗体の製剤として、対象免疫原による免疫後の動物から、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ等の、動物に由来する不死化B細胞から直接入手できる。付加的に、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は、抗体を直接得るために回収して発現することができ、又は例えば一本鎖Fv分子等の抗体の類似体を得るためにさらに修飾することができる。

例えば抗体の他の部分、例えば定常領域を欠失させる、付加する又は置換することによって修飾されたモノクローナル、キメラ及びヒト化抗体も本発明の範囲内である。非限定的な例として、定常領域を欠失させることによって、定常領域をもう1つ別の定常領域、例えば抗体の半減期、安定性又は親和性を高めることを意図した定常領域又はもう1つ別の種又は抗体クラスからの定常領域で置換することによって、及び例えばグリコシル化部位の数、エフェクター細胞機能、Fc受容体(FcR)結合、補体結合等を変化させるために定常領域内の1又はそれ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体を修飾することができる。

抗体定常領域を変化させるための方法は当分野において公知である。変化した機能、例えばエフェクターリガンド、例えば細胞上のFcR又は補体のC1成分に対する変化した親和性を有する抗体は、抗体の定常部分内の少なくとも1個のアミノ酸残基を異なる残基で置換することによって生産できる(例えばその全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第EP 388,151Al号、米国特許第5,624,821号及び米国特許第5,648,260号参照)。マウス(又は他の種の)免疫グロブリンへの同様の種類の変化は、これらの機能を低減する又は排除するために適用でき、当分野において公知である。

例えば、特定残基をその側鎖上に適切な官能基を有する残基で置換することによって、又は電荷を有する官能基、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸、又は芳香族非極性残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン又はアラニンを導入することによって、FcR(例えばFcγR1)又はC1q結合に対する抗体(例えばIgG、例えばヒトIgG)のFc領域の親和性を変化させることが可能である(例えば米国特許第5,624,821号参照)。

本発明の抗IL−17F、抗IL−17R又は抗IL−17RC抗体は、上清中、細胞溶解産物中又は細胞表面上の、それぞれIL−17Fタンパク質(例えば単量体、ホモ二量体又はヘテロ二量体構造で)、IL−17R又はIL−17RCポリペプチドを単離する、精製する及び/又は検出するために有用であり得る。本発明において開示する抗体はまた、臨床試験手順の一部として、例えばIL−17Fタンパク質レベルを観測するために診断的に、又は抗体の抗原を含む細胞又は組織に治療的調節剤を標的するために臨床的に使用し得る。例えば低分子等の治療薬、又は本発明の他の治療薬は、それぞれIL−17F、IL−17R又はIL−17RCを発現する細胞又は組織に治療薬を標的するために抗IL−17F、抗IL−17R又は抗IL−17RC抗体に結合し得る。IL−17F、IL−17R又はIL−17RCタンパク質に結合する拮抗性抗体(好ましくはモノクローナル抗体)はまた、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患、及び/又はIL−21とIL−17F産生との間の関係により、IL−21シグナル伝達(例えばIL−21のIL−21Rへの結合及びIL−21Rの活性化)に関連する疾患の治療においても有用であり得る。そこで、本発明はさらに、IL−17Fシグナル伝達を低下させる、制限する、ブロックする又はさもなければ低減する、IL−17F(単量体及び/又は二量体形態)、IL−17R又はIL−17RCに特異的に結合する阻害性抗体を含む組成物を提供する。同様に、抗IL−17F、抗IL−17R又は抗IL−17RC抗体は、それぞれIL−17F、IL−17R又はIL−17RCを単離する、精製する、検出する及び/又は診断的に観測する上で、及び/又はそれぞれIL−17F、IL−17R又はIL−17RCを含む細胞又は組織における治療的調節剤を臨床的に標的する上で有用であり得る。

本発明における使用のための抗体に加えて、抗体に基づく分子も、IL−17Fホモ二量体、IL−17Aホモ二量体及び/又はIL−17F/IL−17Aホモ二量体の活性を調節するために使用し得る。そのような抗体に基づく分子は、スモール・モジュラー・イムノファーマシューティカル(small modular immunopharmaceutical)(SMIP(商標))薬(Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA)を含む。SMIPは、コグネイト構造、例えば抗原、対抗受容体(counterreceptor)等についての結合ドメイン、1個のシステイン残基を有する又はシステイン残基を持たないヒンジ領域ポリペプチド、及び免疫グロブリンCH2及びCH3ドメインから成る一本鎖ポリペプチドである(www.trubion.comも参照のこと)。SMIPは、モノクローナル抗体の結合特異性と活性を示すが、従来の治療的モノクローナル抗体の約3分の1から2分の1の大きさであり、長いインビボ半減期を有する。SMIP及びそれらの使用と適用は、全てが全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第2003/0118592号、同第2003/0133939号、同第2004/0058445号、同第2005/0136049号、同第2005/0175614号、同第2005/0180970号、同第2005/0186216号、同第2005/0202012号、同第2005/0202023号、同第2005/0202028号、同第2005/0202534号及び同第2005/0238646号、及びその関連特許ファミリー成員に開示されている。
(スクリーニングアッセイ)

IL−17Fシグナル伝達に関連するポリヌクレオチド及びポリペプチドは、細胞又は生物においてIL−17Fの活性を調節することができ、それによって炎症応答の潜在的調節剤である、薬理的物質又は薬剤のための先導化合物を特定するためのスクリーニングアッセイにおいて使用し得る。例えばIL−17F(天然又は組換え)を含む試料を複数の試験化合物(生物学的物質又は有機低分子)の1つと接触させ、処置した試料の各々におけるIL−17Fの生物活性を未処置試料又は異なる試験化合物と接触させた試料におけるIL−17Fの生物活性と比較することができる。そのような比較は、試験化合物のいずれかが、1)それによってIL−17Fの拮抗物質を示す、IL−17Fの実質的に低い発現レベル又は生物活性、又は2)それによってIL−17Fの作動物質を示す、IL−17Fの実質的に高いレベルの発現又は生物活性、を生じさせるかどうかを判定する。一実施形態では、IL−17F活性を調節することができる試験化合物の特定は、ハイスループットスクリーニングアッセイ、例えばBIACORE(登録商標)(Biacore International AB, Uppsala, Sweden)、BRET(生物発光共鳴エネルギー転移法)及びFRET(蛍光共鳴エネルギー転移法)アッセイ、並びにELISA及び細胞ベースのアッセイを用いて実施される。
(低分子)

IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患(及び/又はIL−21のIL−21Rへの結合及びIL−21Rの活性化に関連する疾患)、例えば炎症性腸疾患、慢性関節リウマチ、移植片拒絶反応、乾癬等に罹患している(又はその危険性がある)生物(又は被験者)における、又はそのような疾患に関わるそのような生物(又は被験者)からの細胞における、IL−17F活性(及び/又はIL−21のIL−21Rへの結合及びIL−21Rの活性化に関連する少なくとも1つの活性)の低下はまた、IL−17Fに拮抗する、すなわちIL−17Fの活性を阻害する低分子(通常は有機低分子)の使用を通して達成され得る。新規拮抗性低分子は、上述したスクリーニング方法によって特定することができ、本明細書で述べる本発明の治療方法において使用し得る。

逆に、免疫欠損、例えば好中球減少症に罹患している(又はその危険性がある)生物(又は被験者)における、又はそのような疾患に関わるそのような生物(又は被験者)からの細胞における、IL−17F活性(及び/又はIL−21関連活性)の上昇も、IL−17Fを作動する、すなわちIL−17Fの活性を増強する低分子(通常は有機低分子)の使用を通して達成され得る。新規作動性低分子は、上述したスクリーニング方法によって特定することができ、例えばその全てが全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,707,829号;同第6,043,344号;同第6,074,849号及び米国特許出願第10/102,080号に述べられているように、免疫欠損を治療する方法において使用し得る。

低分子という用語は、高分子ではない化合物を指す(例えば Karp (2000) Bioinformatics Ontology 16:269-85; Verkman (2004) AJP-CeIl Physiol. 286:465-74参照)。それ故、低分子はしばしば、例えば1,000ダルトン未満である化合物とみなされる(例えばVoet and Voet, Biochemistry, 2nd ed., ed. N. Rose, Wiley and Sons, New York, 14 (1995)参照)。例えばDavis et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:5981-86は、葉酸塩、メトトレキサート及び神経ペプチドを示すために低分子という語句を使用し、一方Halpin and Harbury (2004) PLos Biology 2:1022-30は、低分子遺伝子産物、例えばDNA、RNA及びペプチドを示すためにこの語句を使用する。天然低分子の例は、コレステロール、神経伝達物質及びsiRNAを含むが、これらに限定されず;合成低分子は、数多くの市販の低分子データベース、例えばFCD(Fine Chemicalsデータベース)、SMID(低分子相互作用データベース)、ChEBI(Chemical Entities of Biological Interest)及びCSD(Cambridge Structural Database)に列挙されている様々な化学物質を含むが、これらに限定されない(例えばAlfarano et al. (2005) Nuc. Acids Res. Database Issue 33:D416-24参照)。
(IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患の進行を診断する、予後判定する及び観測するための方法)

動物モデル、特にマウスモデルにおいて検討された免疫機構がヒト免疫系に当てはめることが可能であると考えられ、しばしば実際にそうであることが当分野において周知である。本明細書で開示する実施例の多くは、ヒト試料に加えて、動物モデルにおいてIL−17F生物活性を阻害するIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の能力を開示するが、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患を診断する、予後判定する及び観測するための開示方法は、ヒトにおいてそのような疾患を診断する、予後判定する及び観測するために特に有用である。

本発明は、IL−17F活性の上方調節を検出することにより、例えばIL−17Fの上方調節を検出することにより、被験者においてIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患(例えばIL−17Fの生物活性の上昇を直接又は間接的に含む)の進行を診断する、予後判定する及び観測するための、ヒト被験者におけるそのような方法の使用を含むがこれに限定されない方法を提供する。IL−21とIL−17Fの間の直接関係の故に、本発明はまた、IL−17F活性の上方調節を検出することにより、例えばIL−17Fの上方調節を検出することにより、被験者においてIL−21のIL−21Rへの結合及びIL−21Rの活性化に関連する疾患(例えばIL−21の生物活性の上昇を直接又は間接的に含む)の進行を診断する、予後判定する及び観測するための、ヒト被験者におけるそのような方法の使用を含むがこれに限定されない方法を提供する。これらの方法は、IL−17F、IL−17R又はIL−17RCポリヌクレオチド又はそのフラグメント、IL−17F、IL−17R又はIL−17RCポリペプチド又はそのフラグメント(その融合タンパク質を含む)、又はIL−17F、IL−17R又はIL−17RCポリペプチド又はその誘導体に対する抗体、又は例えば臨床環境で、好都合に使用し得る、本明細書で述べるようなIL−17F、IL−17R又はIL−17RCポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドの調節剤を含む群の少なくとも1つを含むあらかじめ包装された診断キットを使用することによって実施し得る。当業者は、他の間接的方法、例えば免疫細胞、例えば好中球の数を数えることが、例えばIL−17Fの上方調節を確認するために使用し得ることを認識する。

「診断」又は「診断すること」は、病的状態の存在又は不在を特定することを意味する。診断方法は、被験者(ヒト又は非ヒト哺乳動物)からの生物学的試料中のIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RCの遺伝子産物(例えばそのフラグメントを含む、mRNA、cDNA又はポリペプチド)の試験量を測定すること、及び上記試験量を正常量又は範囲(すなわちIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患に罹患していないことが知られる個体からの量又は範囲)と比較することによってIL−17Fシグナル伝達(及び/又はIL−21シグナル伝達)の上方調節を検出することを含む。特定診断方法はIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患の決定的診断を提供しないことがあり得るが、その方法が診断に役立つ明確な指標を提供すれば十分である。

本発明はまた、IL−17F活性の上方調節を検出することによって、例えばIL−17F、IL−17R又はIL−17RCの上方調節を検出することによって、そのような疾患を予後判定するための方法を提供する。「予後判定」又は「予後判定すること」は、病的状態の起こり得る発現及び/又は重症度を予測することを意味する。予後判定方法は、被験者からの生物学的試料中のIL−17F、IL−17R又はIL−17RCの遺伝子産物の試験量を測定すること、及び上記試験量を、それぞれIL−17F、IL−17R又はIL−17RCの遺伝子産物についての予後判定量又は範囲(すなわち様々な重症度のIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患及び/又はIL−21シグナル伝達に関連する疾患を有する個体からの量又は範囲)と比較することを含む。試験試料中のIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の様々な量が、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患及び/又はIL−21シグナル伝達に関連する疾患についてのある種の予後と一致する。特定予後判定レベルのIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の量の検出は、被験者についての予後を提供する。

本発明はまた、IL−17F活性の上方調節を検出することによって、例えばIL−17F、IL−17R又はIL−17RCの上方調節を検出することによって、IL−17Fシグナル伝達に関連するそのような疾患(及び/又はIL−21シグナル伝達に関連する疾患)の進行又は経過を観測するための方法を提供する。観測方法は、1回目と2回目に被験者から採取した生物学的試料中のIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の試験量を測定すること、及び上記量を比較することを含む。1回目と2回目の間でのIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の量の変化は、IL−17Fシグナル伝達関連疾患(及び/又はIL−21シグナル伝達関連疾患)の経過の変化を示し、量の低下はそのような疾患の寛解を示し、量の上昇はそのような疾患の進行を示す。そのような観測アッセイはまた、自己免疫疾患のために治療されている患者において特定治療処置の効果を評価するためにも有用である。

上記で概説した方法におけるIL−17Fシグナル伝達上昇は、様々な生物学的試料、例えば体液(例えば全血、血漿及び尿)、細胞(例えば全細胞、細胞分画及び細胞抽出物)及び他の組織において検出され得る。生物学的試料はまた、組織の切片、例えば組織学的目的のために採取された生検及び凍結切片を含む。好ましい生物学的試料は、血液、血漿、リンパ、組織生検、尿、CSF(脳脊髄液)、滑液及びBAL(気管支肺胞洗浄液)を含む。生物学的試料の分析が必ずしも被験者からの細胞又は組織の採取を必要としないことは認識される。例えばIL−17Fシグナル伝達遺伝子産物(例えば抗体、核酸)に結合する適切に標識された物質を被験者に投与し、標準的な画像化テクノロジー(例えばCAT、NMR(MRI)及びPET)を用いて視覚化することができる(標的に結合したとき)。

本発明の診断及び予後判定アッセイでは、試験量を調べるためにIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物を検出し、定量する。次に試験量を正常量又は範囲と比較する。正常量又は範囲を有意に上回る量は、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患(及び/又はIL−21のIL−21Rへの結合及びIL−21Rの活性化に関連する疾患)の診断における陽性表示である。IL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の検出と定量の特定方法を以下で述べる。

IL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の正常量又は基線レベルは、任意の特定試料型及び集団について決定し得る。一般に、IL−17F、IL−17R又はIL−17RCタンパク質又はmRNAの基線(正常)レベルは、正常(すなわち健常)被験者からの生物学的試料型におけるIL−17F、IL−17R又はIL−17RCタンパク質又はmRNAのそれぞれの量を測定することによって決定される。あるいは、IL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の正常値は、罹患した(又はおそらく罹患した)試験細胞又は組織が採取された被験者と同じ被験者から採取された健常細胞又は組織の量を測定することによって決定し得る。IL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の量(正常量又は試験量)は、細胞当り、総タンパク質当り又は容積当りのベースで測定又は発現され得る。試料の細胞量を決定するために、生物学的試料が採取された型の細胞において、構成的に発現される遺伝子産物又は公知のレベルで発現される他の遺伝子産物のレベルを測定することができる。

本発明のアッセイ方法が必ずしもIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の絶対値の測定を必要としないことは認識される。これらの方法の多くの適用に関しては相対値で十分だからである。また、IL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物の量又は存在率に加えて、変異型又は異常IL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物又はそれらの発現パターン(例えば突然変異転写産物、トランケート型ポリペプチド)を、正常遺伝子産物及び発現パターンとの比較によって特定し得る。

2つの試料中の特定遺伝子の発現が有意に類似する又は有意に異なるかどうか、例えば所与のレベルを有意に上回る又は有意に下回るかどうかは、遺伝子自体、中でも特に異なる個体又は異なる試料の間での発現のその変動性に依存する。発現レベルが有意に類似する又は異なるかどうかを判定することは当分野の技術範囲内である。2つの試料の間で、例えばIL−17F及び/又はIL−17Aの発現のレベルが有意に類似する又は有意に異なるかどうか、例えば所与のレベルを有意に上回るかどうかを判定するときは、個体、種、器官、組織又は細胞の間での、例えばIL−17F及び/又はIL−17A発現レベルの遺伝的変異等の因子を考慮し得る(必要なとき及び場合)。個体、種、器官、組織又は細胞の間での遺伝子発現の天然の異質性の結果として、「有意に類似」又は「有意に上回る」等の語句は、厳密なパーセンテージ又は数値として定義することはできず、むしろ本発明を実施するときに当業者によって確認され得る。

本発明の診断、予後判定及び観測アッセイは、生物学的試料中のIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物を検出し、定量することを含む。IL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物は、mRNA及びポリペプチドを含み、どちらも当業者に周知の方法を用いて測定することができる。

例えばmRNAは、ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ、例えばノーザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション、ドット及びスロットブロット法、及びオリゴヌクレオチドアレイを用いて直接検出し、定量することができる。ハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、プローブ核酸を標的核酸にハイブリダイズするアッセイを指す。一部の形式では、標的、プローブ又は両方を固定化する。固定化核酸は、DNA、RNA又はもう1つ別のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得、天然又は非天然に生じるヌクレオチド、ヌクレオチド類似体又は骨格を含み得る。本発明における使用のための核酸プローブ配列を選択する方法は、IL−17F、IL−17R又はIL−17RCの核酸配列に基づき、当分野において周知である。

あるいは、検出及び定量の前にmRNAを増幅することができる。そのような増幅に基づくアッセイは当分野において周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写PCR(RT−PCR)、PCR−酵素免疫測定法(PCR−ELISA)及びリガーゼ連鎖反応(LCR)を含む。増幅されたIL−17F、IL−17R又はIL−17RC遺伝子産物(例えばmRNA又はcDNA)を生産し、検出するためのプライマー及びプローブは、それぞれIL−17F、IL−17R又はIL−17RCの核酸配列に基づき、当業者によって過度の実験を伴わずに容易に設計され、生産され得る。非限定的な例として、増幅されたIL−17F遺伝子産物は、例えばゲル電気泳動によって;プローブ拡散へのハイブリダイゼーションによって;塩基配列決定によって;蛍光、リン光又は放射性シグナルの検出によって;又は様々な周知の方法にいずれかによって、直接分析し得る。加えて、標的核酸配列の増幅によって生成されるシグナルを上昇させるための方法は当業者に公知である。当業者はいずれの増幅方法を使用するかを認識し、遺伝子産物の定量を所望する場合は、当分野で公知の様々な定量方法(例えば定量的PCR)を使用し得る。

IL−17F、IL−17R又はIL−17RCポリペプチド(又はそのフラグメント)は、上述したように作製し得るそれぞれの抗IL−17F、抗IL−17R又は抗IL−17RC抗体を用いた様々な周知の免疫学的測定法を使用して検出し得る。免疫学的測定法は、例えばIL−17Fポリペプチド(又はそのフラグメント)に特異的に結合する抗体(例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、scFv及び/又はそのフラグメント)を利用するアッセイを指す。本発明の実施に適するそのような周知の免疫学的測定法は、ELISA、放射免疫測定法(RIA)、免疫沈降法、免疫蛍光検査法、蛍光活性化セルソーティング(FACS)及びウエスタンブロット法を含む。IL−17Fポリペプチドはまた、標識IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチドを用いて検出し得る。逆に、IL−17R又はIL−17RCは標識IL−17Fポリペプチドを用いて検出し得る。

当業者は、上記方法がIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患に適用され得ることを理解する。
(治療におけるIL−17Fシグナル伝達に関連する分子の使用)

本発明者らは、中でも特に、以下の事柄を初めて明らかにした:1)IL−17F又は他のIL−17F作動物質によるIL−17R及び/又はIL−17RCの結合は、好中球浸潤の上昇、軟骨破壊等と相関する;2)IL−17Fに対する抗体は、IL−17Fタンパク質を検出するため及び少なくとも1つのIL−17F生物活性を阻害するために使用し得る;3)IL−17R及びIL−17RCに対するsiRNAは、IL−17A及びIL−17F生物活性を低下させるために使用し得る;4)IL−17Fタンパク質はIL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を形成することができ、それ故、IL−17Fを対象とする阻害性抗体はまた、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体によって媒介されるIL−17A生物活性も阻害し得る;5)IL−21は、IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を上方調節するためにCD28と相乗作用的に働き、それ故IL−17F活性(例えばIL−17Fホモ二量体活性及び/又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体活性)を阻害する抗体はIL−21シグナルを調節し得る;6)天然及び組換えIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を単離し、精製し得る;7)IL−17Fヘテロ二量体はIL−17F生物活性を有する;8)ヒトIL−17Fに対する抗体は霊長動物IL−17Fと交差反応し、霊長動物IL−17Fを部分的に中和する;及び9)IL−17F及びIL−17Aはいずれも、乾癬を有するヒト患者からの病変組織、及びクローン病及び潰瘍性大腸炎を有するヒト患者における関係組織において上昇する。上記の相関の一部を特定するためにいくつかの動物モデルを使用したが、動物モデルにおいて検討された免疫機構をヒト免疫系に当てはめることが可能であると考えられ、しばしば実際にそうであることは当分野において周知である。加えて、一次ヒトT細胞からホモ二量体及びヘテロ二量体形態の天然IL−17Fを単離するために本発明の抗体を使用したが、アグリカナーゼのIL−17F調節に関連する実験、及び乾癬病変及び炎症性腸疾患における関係組織でのIL−17A及びIL−17Fの発現レベルをプロファイリングする実験は、ヒト細胞及び組織で実施した。IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患及び/又はIL−21シグナル伝達に関連する疾患を治療するためにIL−17Fシグナル伝達に関連する分子、例えばIL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質を使用するための本明細書で開示する方法は、ヒトにおけるそのような疾患を治療するために特に有用である。

本明細書で開示するIL−17Fシグナル伝達関連分子、例えば上述した方法を用いて特定されるIL−17F、IL−17R又はIL−17RCポリヌクレオチド及び/又はポリペプチド活性の調節剤は、インビトロ、エクスビボで使用し得る、又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリペプチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又は抗IL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)の投与によって、例えばIL−17Fシグナル伝達及び/又はIL−21シグナル伝達に関連する疾患を治療するために、医薬組成物に組み込んで、インビボで個体に投与し得る。IL−17Fシグナル伝達関連分子を投与すべきかどうかを決定するときに考慮すべきいくつかの薬理遺伝学的アプローチは、当業者に周知であり、ゲノムワイド関連解析、候補遺伝子アプローチ及び遺伝子発現プロファイリングを含む。本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路(例えば経口組成物は一般に不活性希釈剤又は食用担体を含む)と適合性であるように製剤される。投与経路の他の非限定的な例は、非経口(例えば静脈内)、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(局所)、経粘膜、及び経直腸投与を含む。各々の意図される経路と適合性の医薬組成物は当分野において周知である。

IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、製薬上許容される担体と組み合わせたとき、医薬組成物として使用し得る。そのような組成物は、IL−17Fシグナル伝達関連分子(例えばIL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質)及び担体に加えて、様々な希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、可溶化剤及び当分野で周知の他の物質を含有し得る。「製薬上許容される」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉しない非毒性物質を意味する。担体の特徴は投与経路に依存する。

本発明の医薬組成物はまた、サイトカイン、リンホカイン又は他の造血因子、例えばM−CSF、GM−CSF、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−14、IL−15、G−CSF、幹細胞因子及びエリスロポエチンを含有し得る。医薬組成物はまた、以下でより詳細に述べる抗サイトカイン抗体を含有し得る。医薬組成物は、血栓崩壊性又は抗血栓因子、例えばプラスミノーゲン活性化因子及び第VIII因子を含有し得る。医薬組成物は、以下でより詳細に述べる他の抗炎症性物質をさらに含有し得る。そのような付加的な因子及び/又は物質は、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質との相乗作用を生じさせるため、又はIL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質によって引き起こされる副作用を最小限に抑えるために医薬組成物に含め得る。逆に、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質を、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊性又は抗血栓因子、又は抗炎症性物質の副作用を最小限に抑えるために特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓崩壊性又は抗血栓因子、又は抗炎症性物質の製剤中に含め得る。

本発明の医薬組成物は、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、他の製薬上許容される担体に加えて、両親媒性物質、例えば水溶液中にミセル、不溶性単層、液晶又は薄層として集合形態で存在する脂質と組み合わされた、リポソームの形態であり得る。リポソーム製剤のための適切な脂質は、限定を伴わずに、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を含む。

本明細書で使用する、「治療有効量」という用語は、有意義な患者の利益、例えばそのような状態の症状の改善、治癒又は治癒率の上昇を示すのに十分な、医薬組成物又は方法の各々の活性成分の総量を意味する。単独で投与される、個々の有効成分に適用するとき、この語はその成分だけを指す。組合せに適用するとき、この語は、連続的に又は同時に組み合わせて投与されるかどうかに関わらず、治療作用を生じさせる有効成分の組合せ合計量を指す。

本発明の治療又は使用の方法を実施するとき、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の治療有効量を被験者、例えば哺乳動物(例えばヒト)に投与する。IL−17Fシグナル伝達関連分子は、単独で又は他の治療、例えばサイトカイン、リンホカイン又は他の造血因子、又は抗炎症性物質を用いる治療と組み合わせて、本発明の方法に従って投与し得る。1又はそれ以上の物質と併用投与するとき、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、第二の物質と同時に又は連続的に投与し得る。連続的に投与する場合、医師が投与の適切な順序、例えば他の薬剤と併用するIL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(又はその融合タンパク質)及び/又は阻害性抗体を決定する。

IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の治療有効量を経口的に投与するとき、結合(併用)薬剤(binding agent)は、錠剤、カプセル、粉末、溶液又はエリキシルの形態である。錠剤形態で投与するとき、本発明の医薬組成物は、固体担体、例えばゼラチン又はアジュバントを付加的に含み得る。錠剤、カプセル及び粉末は、約5〜95%の結合薬剤、好ましくは約25〜90%の結合薬剤を含む。液体形態で投与するとき、液体担体、例えば水、石油、動物又は植物由来の油、例えば落花生油、鉱物油、ダイズ油又はゴマ油、又は合成油を添加し得る。医薬組成物の液体形態は、生理食塩水、デキストロース又は他の糖類溶液、又はグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールをさらに含み得る。液体形態で投与するとき、医薬組成物は、約0.5〜90重量%の結合薬剤、好ましくは約1〜50重量%の結合薬剤を含む。

IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の治療有効量を静脈内、皮膚又は皮下注射によって投与するとき、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、発熱物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態である。pH、等張性、安定性等を十分に顧慮した、そのような非経口的に許容されるタンパク質溶液の製造は、当業者の技術範囲内である。静脈内、皮膚又は皮下注射のための好ましい医薬組成物は、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質に加えて、等張賦形剤、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロース及び塩化ナトリウム注射液、乳酸化リンガー注射液、又は当分野で公知の他の賦形剤を含有すべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤、又は当業者に公知の他の添加物を含み得る。

本発明の医薬組成物中のIL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の量は、治療する状態の性質及び重症度並びに患者が受けた事前の治療の性質に依存する。最終的には、主治医が、各々個々の患者を治療するためのIL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の量を決定する。最初に、主治医は、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の低用量を投与し、患者の応答を観察する。患者にとって最適治療効果が得られるまでより高用量のIL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質を投与してもよく、その時点で用量は一般にそれ以上増加させない。本発明の方法を実施するために使用される様々な医薬組成物は、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質、例えばIL−17R及び/又はIL−17RC(その融合タンパク質を含む)約0.1μg−約100mg/kg体重を含有すべきであると考えられる。

本発明の医薬組成物を使用する静脈内(i.v.)治療の期間は、治療する疾患の重症度及び各々個々の患者の状態及び潜在的特異体質性応答に依存して異なる。IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の各々の適用期間は、12−24時間の連続i.v.投与の範囲内であり得ると考えられる。また、本発明の医薬組成物を使用する皮下(s.c.)治療も考慮される。これらの治療薬は、毎日、週に1回、又はより好ましくは2週に1回、又は月に1回投与することができる。また、IL−17F作動物質又はIL−17Fシグナル伝達拮抗物質が低分子(例えば経口送達のため)である場合、治療薬は、毎日、1日2回、1日3回等で投与され得る。最終的には、主治医がi.v.又はs.c.治療又は低分子による治療の適切な期間、及び本発明の医薬組成物を使用する治療の投与の時期を決定する。

本発明のポリヌクレオチド及びタンパク質は、以下で特定する用途又は生物学的活性(本明細書で言及するアッセイに関連するものを含む)の1又はそれ以上を示すと予想される。本発明のタンパク質について述べる用途又は活性は、そのようなタンパク質の投与又は使用、あるいはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与又は使用(例えば遺伝子治療又はDNAの導入に適するベクターにおいて)によって提供され得る。
(炎症を軽減するためのIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の使用)

1つの態様では、本発明は、例えばIL−21シグナル伝達に起因する、炎症応答を低下させる方法を特徴とする。その方法は、細胞の集団を、細胞又は細胞集団のIL−17F活性を阻害するために十分な量のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)と接触させることを含み得る。IL−17Fシグナル伝達に対する拮抗物質はまた、IL−17Fシグナル伝達(及び/又はIL−21シグナル伝達)の抑制が望ましい被験者に投与し得る。これらの状態は、炎症性疾患、例えば自己免疫疾患(例えば関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症)、呼吸器疾患(例えばCOPD、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー)、移植片拒絶反応(固形臓器移植拒絶反応を含む)、及び炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)を含むが、これらに限定されない。

これらの方法は、少なくとも一部には、例えば干渉性抗IL−17F抗体を使用することによって、IL−17Fシグナル伝達に干渉することはIL−17F関連炎症応答、例えば一次線維芽細胞様滑膜細胞によるサイトカイン産生を低下させるという所見に基づく(実施例4.2)。したがって、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質、すなわちIL−17F活性を阻害する分子(例えば抗IL−17F抗体)は、インビボで炎症を軽減させるため、例えばIL−17Fシグナル伝達に関連する疾患及び/又はIL−21シグナル伝達に関連する疾患を治療する又は予防するために使用し得る。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を使用する方法はまた、IL−17F炎症活性を阻害するために使用でき、それ故、様々な免疫疾患を治療する又は予防するために使用できる。治療又は予防することができる疾患の非限定的な例は、移植片拒絶反応、自己免疫疾患(例えば糖尿病、関節炎(慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、反応性関節炎を含む)、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎(アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む)、ライター症候群、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、内因性喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴力喪失、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、スティーヴンズ-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーヴズ病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎及び間隙性肺線維症を含む)、対宿主性移植片病、肺増悪(pulmonary exacerbation)(例えば細菌感染による)、及びアレルギー、例えばアトピー性アレルギーを含むが、これらに限定されない。IL−17Fシグナル伝達拮抗物質、例えば阻害性IL−17F抗体の投与を含む方法を用いて治療できる好ましい疾患は、炎症性疾患、例えば自己免疫疾患(例えば関節炎(慢性関節リウマチを含む)、乾癬、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症)、呼吸器疾患(例えばCOPD、嚢胞性線維症、喘息、アレルギー)、移植片拒絶反応(固形臓器移植拒絶反応を含む)、及び炎症性腸疾患(例えば潰瘍性大腸炎、クローン病)を含むが、これらに限定されない。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)を使用して、多くの方法で免疫応答を調節することが可能である。下方調節は、既に進行している炎症応答を阻害する又はブロックすることの形態であり得るか、又は炎症応答の誘導を予防することを含み得る。

一実施形態では、その医薬組成物を含むIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、併用療法において、すなわち病的状態又は疾患、例えば免疫障害及び炎症性疾患を治療するために有用な他の物質、例えば治療薬と併用投与される。これに関して「併用(組合せ)」という用語は、薬剤を実質的に同時期に、同時に又は連続的に与えることを意味する。連続的に与える場合、2番目の化合物の投与の開始時に、2つの化合物のうちの最初の化合物が、好ましくは治療部位において有効濃度でまだ検出可能である。

例えば併用療法は、1又はそれ以上の付加的な治療薬、例えば以下でより詳細に述べるような、1又はそれ以上のサイトカイン及び増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、代謝阻害物質、酵素阻害剤、及び/又は細胞傷害性又は細胞増殖抑制性物質と共製剤される及び/又は同時投与される、1又はそれ以上のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)を含み得る。さらに、本明細書で述べる1又はそれ以上のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、本明細書で述べる2又はそれ以上の治療薬と組み合わせて使用し得る。そのような併用療法は、有利には、投与する治療薬のより低用量を使用でき、それ故様々な単独療法に関連して起こり得る毒性又は合併症を回避し得る。さらに、本明細書で開示する治療薬は、IL−17F受容体シグナル伝達経路とは異なる経路で作用し、それ故IL−17Fシグナル伝達拮抗物質の作用を増強する及び/又は相乗作用すると予想される。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用して使用される好ましい治療薬は、炎症応答における種々の段階で干渉する薬剤である。一実施形態では、本明細書で述べる1又はそれ以上のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、1又はそれ以上の付加的な物質、例えば他のサイトカイン又は増殖因子拮抗物質(例えば可溶性受容体、ペプチド阻害剤、低分子、リガンド融合物);又は他の標的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント(例えば他のサイトカイン又は増殖因子、それらの受容体又は他の細胞表面分子に結合する抗体);及び抗炎症性サイトカイン又はその作動物質と共製剤され得る及び/又は同時投与され得る。本明細書で述べるIL−17Fシグナル伝達拮抗物質と組み合わせて使用できる物質の非限定的な例は、1又はそれ以上のインターロイキン(IL)又はそれらの受容体の拮抗物質、例えばIL−1、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−18、IL−21及びIL−22の拮抗物質;サイトカイン又は増殖因子又はそれらの受容体の拮抗物質、例えば腫瘍壊死因子(TNF)、LT、EMAP−II、GM−CSF、FGF及びPDGFの拮抗物質を含むが、これらに限定されない。IL−17Fシグナル伝達拮抗物質はまた、細胞表面分子、例えばCD2、CD3、CD4、CD8、CD20(例えばCD20阻害剤リツキシマブ(RITUXAN(登録商標))、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、又はCD154(gp39又はCD40L)を含むそれらのリガンド、又はLFA−1/ICAM−1及びVLA−4/VCAM−1の阻害剤、例えばそれらに対する抗体と組み合わせることができる(Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med. Res. Rev. 22:146-67)。本明細書で述べるIL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用使用できる好ましい拮抗物質は、IL−1、IL−12、TNFα、IL−15、IL−18及びIL−22の拮抗物質を含む。

それらの物質の例は、IL−12拮抗物質、例えばIL−12(好ましくはヒトIL−12)に結合するキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロ作製抗体(又はその抗原結合フラグメント)、例えば国際公開公報WO00/56772において開示される抗体;IL−12受容体阻害剤、例えばヒトIL−12受容体に対する抗体;及びIL−12受容体、例えばヒトIL−12受容体の可溶性フラグメントを含む。IL−15拮抗物質の例は、IL−15又はその受容体に対する抗体(又はその抗原結合フラグメント)、例えばヒトIL−15又はその受容体に対するキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロ作製抗体、IL−15受容体の可溶性フラグメント、及びIL−15結合タンパク質を含む。IL−18拮抗物質の例は、ヒトIL−18に対する抗体、例えばキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロ作製抗体(又はその抗原結合フラグメント)、IL−18受容体の可溶性フラグメント、及びIL−18結合タンパク質(IL−18BP)を含む。IL−1拮抗物質の例は、インターロイキン1変換酵素(ICE)阻害剤、例えばVx740、IL−1拮抗物質、例えばIL−1RA(anikinra、KINERET(商標)、Amgen)、sIL1RII(Immunex)、及び抗IL−1受容体抗体(又はその抗原結合フラグメント)を含む。

TNF拮抗物質の例は、TNF(例えばヒトTNFα)に対するキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロ作製抗体(又はその抗原結合フラグメント)、例えば(HUMIRA(商標)、D2E7、ヒトTNFα抗体)、CDP−571/CDP−870/BAY−10−3356(ヒト化抗TNFα抗体;Celltech/Pharmacia)、cA2(キメラ抗TNFα抗体;REMICADE(登録商標)、Centocor);抗TNF抗体フラグメント(例えばCPD870);TNF受容体の可溶性フラグメント、例えばp55又はp75ヒトTNF受容体又はその誘導体、例えば75kdTNFR−IgG(75kD TNF受容体−IgG融合タンパク質、ENBREL(商標);Immunex)、p55kdTNFR−IgG(55 kD TNF受容体−IgG融合タンパク質(LENERCEPT(登録商標));酵素拮抗物質、例えばTNFα変換酵素(TACE)阻害剤(例えばα−スルホニルヒドロキサム酸誘導体及びN−ヒドロキシホルムアミドTACE阻害剤GW3333,−005又は−022);及びTNF−bp/s−TNFR(可溶性TNF結合タンパク質)を含む。好ましいTNF拮抗物質は、TNF受容体の可溶性フラグメント、例えばp55又はp75ヒトTNF受容体又はその誘導体、例えば75kdTNFR−IgG、及びTNFα変換酵素(TACE)阻害剤である。

他の実施形態では、本明細書で述べるIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、以下の1又はそれ以上と併用投与し得る:IL−13拮抗物質、例えば可溶性IL−13受容体(sIL−13)及び/又はIL−13に対する抗体;IL−2拮抗物質、例えばDAB486−IL−2及び/又はDAB389−IL−2(IL−2融合タンパク質、Seragen)、及び/又はIL−2Rに対する抗体、例えば抗Tac(ヒト化抗IL−2R、Protein Design Labs)。さらにもう1つの併用は、nondepleting抗CD4阻害剤(IDEC−CE9.1/SB210396;nondepleting霊長動物化抗CD4抗体;IDEC/SmithKline)と組み合わせたIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)、拮抗性低分子、及び/又は阻害性抗体を含む。さらなる他の好ましい併用は、抗体、可溶性受容体又は拮抗性リガンドを含む、共刺激経路の拮抗物質、CD80(B7.1)又はCD86(B7.2);並びにp−セレクチン糖タンパク質リガンド(PSGL)、抗炎症性サイトカイン、例えばIL−4(DNAX/Schering);IL−10(SCH52000;組換えIL−10 DNAX/Schering);IL−13及びTGF−β、及びその作動物質(例えば作動性抗体)を含む。

他の実施形態では、1又はそれ以上のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、1又はそれ以上の抗炎症薬、免疫抑制剤、あるいは代謝又は酵素阻害剤と共製剤する及び/又は同時投与することができる。本明細書で述べるIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)と併用して使用できる薬剤又は阻害剤の非限定的な例は、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、例えばイブプロフェン、テニダプ、ナプロキセン、メロキシカム、ピロキシカム、ジクロフェナク及びインドメタシン;スルファサラジン;コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン;サイトカイン抑制性抗炎症薬(CSAID);ヌクレオチド生合成の阻害剤、例えばプリン生合成の阻害剤、葉酸拮抗物質(例えばメトトレキサート(N−[4−[[(2,4−ジアミノ−6−プテリジニル)メチル]メチルアミノ]ベンゾイル]−L−グルタミン酸);及びピリミジン生合成の阻害剤、例えばジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ(DHODH)阻害剤の1又はそれ以上を含むが、これらに限定されない。IL−17Fシグナル伝達拮抗物質と組み合わせた使用のための好ましい治療薬は、NSAID、CSAID、(DHODH)阻害剤(例えばレフルノミド)及び葉酸拮抗物質(例えばメトトレキサート)を含む。

付加的な阻害剤の例は、コルチコステロイド(経口、吸入及び局所注入);免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス(FK−506);及びmTOR阻害剤、例えばシロリムス(ラパマイシン−RAPAMUNE(商標))又はラパマイシン誘導体、例えば可溶性ラパマイシン誘導体(例えばエステルラパマイシン誘導体、例えばCCI−779);プロ炎症性サイトカイン、例えばTNFα又はIL−1によるシグナル伝達に干渉する物質(例えばIRAK、NIK、IKK、p38又はMAPキナーゼ阻害剤);COX2阻害剤、例えばセレコキシブ、ロフェコキシブ及びその変種;ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばR973401(ホスホジエステラーゼIV型阻害剤);ホスホリパーゼ阻害剤、例えば細胞質ホスホリパーゼ2(cPLA2)の阻害剤(例えばトリフルオロメチルケトン類似体);血管内皮細胞増殖因子又は増殖因子受容体の阻害剤、例えばVEGF阻害剤及び/又はVEGF−R阻害剤;及び血管新生の阻害剤の1又はそれ以上を含む。IL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)と組み合わせた使用のための好ましい治療薬は、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス(FK−506);mTOR阻害剤、例えばシロリムス(ラパマイシン)又はラパマイシン誘導体、例えば可溶性ラパマイシン誘導体(例えばエステルラパマイシン誘導体、例えばCCI−779);COX2阻害剤、例えばセレコキシブ及びその変種;及びホスホリパーゼ阻害剤、例えば細胞質ホスホリパーゼ2(cPLA2)の阻害剤、例えばトリフルオロメチルケトン類似体である。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用することができる治療薬の付加的な例は、6−メルカプトプリン(6−MP);アザチオプリンスルファサラジン;メサラジン;オルサラジン;クロロキン/ヒドロキシクロロキン(PLAQUENIL(登録商標));ペニシラミン;金チオルナレート(aurothiornalate)(筋肉内及び経口);アザチオプリン;コルヒチン;β−2アドレナリン作用性受容体作動物質(サルブタモール、テルブタリン、サルメテラル);キサンチン(テオフィリン、アミノフィリン);クロモグリケート;ネドクロミル;ケトティフェン;イプラトロピウム及びオキシトロピウム;ミコフェノール酸モフェチル;アデノシン作動物質;抗血栓薬;補体阻害剤;及びアドレナリン作動薬の1又はそれ以上を含む。

IL−17Fシグナル伝達に関連する特定疾患を治療する又は予防するための、他の治療薬と組み合わせた本明細書で開示するIL−17Fシグナル伝達拮抗物質の使用を以下でさらに詳細に論じる。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用し得る、関節炎疾患(例えば慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症及び乾癬性関節炎)を治療する又は予防するための物質の非限定的な例は、以下の1又はそれ以上を含む:本明細書で述べるIL−12拮抗物質;NSAID;CSAID;本明細書で述べるようなTNF、例えばTNFαの拮抗物質;本明細書で述べるnondepleting抗CD4抗体;本明細書で述べるIL−2拮抗物質;抗炎症性サイトカイン、例えばIL−4、IL−10、IL−13及びTGFα、又はその作動物質;本明細書で述べるIL−1又はIL−1受容体拮抗物質;本明細書で述べるホスホジエステラーゼ阻害剤;本明細書で述べるCox−2阻害剤;イロプロスト;メトトレキサート;サリドマイド及びサリドマイド関連薬(例えばセルゲン);レフルノミド;プラスミノーゲン活性化阻害剤、例えばトラネキサム酸;サイトカイン阻害剤、例えばT−614;プロスタグランジンE1;アザチオプリン;インターロイキン1変換酵素(ICE)の阻害剤;zap−70及び/又はlck阻害剤(チロシンキナーゼzap−70又はlckの阻害剤);本明細書で述べる血管内皮細胞増殖因子又は血管内皮細胞増殖因子受容体の阻害剤;本明細書で述べる血管新生の阻害剤;コルチコステロイド抗炎症薬(例えばSB203580);TNF−コンバターゼ阻害剤;IL−11;IL−13;IL−17阻害剤;金;ペニシラミン;クロロキン;ヒドロキシクロロキン;クロラムブシル;シクロホスファミド;シクロスポリン;全リンパ節照射;抗胸腺細胞グロブリン;CD5毒素;経口投与ペプチド及びコラーゲン;ロベンザリット二ナトリウム;サイトカイン調節剤(CRA)HP228及びHP466(Houghten Pharmaceuticals,Inc.);ICAM−1アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(ISIS2302;Isis Pharmaceuticals,Inc.);可溶性補体受容体1(TP10;T Cell Sciences,Inc.);プレドニゾン;オルゴテイン;グリコサミノグリカンポリスルフェート;ミノサイクリン(MINOCIN(登録商標));抗IL−2R抗体;マウス及び植物脂質(魚及び植物種子脂肪酸);オーラノフィン;フェニルブタゾン;メクロフェナム酸;フルフェナミン酸;静脈内免疫グロブリン;ジロイトン;ミコフェノール酸(RS−61443);タクロリムス(FK−506);シロリムス(ラパマイシン);アミプリロース(テラフェクチン);クラドリビン(2−クロロデオキシアデノシン);及びアザリビン。好ましい併用は、メトトレキサート又はレフルノミドと組み合わせた、及び中等度又は重症の慢性関節リウマチ症例ではシクロスポリンと組み合わせた、1又はそれ以上のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)を含む。

関節炎疾患を治療するためにIL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用して使用する阻害剤の好ましい例は、TNF拮抗物質(例えばTNFに結合するキメラ、ヒト化、ヒト又はインビトロ作製抗体、又はその抗原結合フラグメント;TNF受容体の可溶性フラグメント、例えばp55又はp75ヒトTNF受容体又はその誘導体、例えば75kdTNFR−IgG(75kD TNF受容体−IgG融合タンパク質、ENBREL(商標))、p55kD TNF受容体−IgG融合タンパク質;TNF酵素拮抗物質、例えばTNFα変換酵素(TACE)阻害剤;IL−12、IL−15、IL−18、IL−22の拮抗物質;T細胞及びB細胞除去剤(例えば抗CD4又は抗CD22抗体);低分子阻害剤、例えばメトトレキサート及びレフルノミド;シロリムス(ラパマイシン)及びその類似体、例えばCCI−779;cox−2及びcPLA阻害剤;NSAID;p38阻害剤、TPL−2、Mk−2及びNFkb阻害剤;RAGE又は可溶性RAGE;P−セレクチン又はPSGL−1阻害剤(例えば低分子阻害剤、それに対する抗体、例えばP−セレクチンに対する抗体);エストロゲン受容体β(ERβ)作動物質又はERβ−NFkb拮抗物質を含む。1又はそれ以上のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)と同時投与する及び/又は共製剤することができる最も好ましい付加的な治療薬は、TNF受容体の可溶性フラグメント、例えばp55又はp75ヒトTNF受容体又はその誘導体、例えば75kdTNFR−IgG(75kD TNF受容体−IgG融合タンパク質、ENBREL(商標));メトトレキサート、レフルノミド又はシロリムス(ラパマイシン)又はその類似体、例えばCCI−779の1又はそれ以上を含む。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用することができる、多発性硬化症を治療する又は予防するための物質の非限定的な例は以下を含む:インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ1a(例えばAVONEX(商標);Biogen)及びインターフェロン−1b(BETASERON(商標)Chiron/Berlex);コポリマー1(Cop−1;COPAXONE(商標)Teva Pharmaceutical Industries,Inc.);高圧酸素;静脈内免疫グロブリン;クラドリビン;上述したTNF拮抗物質;コルチコステロイド;プレドニゾロン;メチルプレドニゾロン;アザチオプリン;シクロホスファミド;シクロスポリン;シクロスポリンA、メトトレキサート;4−アミノピリジン;及びチザニジン。IL−17Fシグナル伝達拮抗物質と組み合わせて使用できる付加的な拮抗物質は、他のヒトサイトカイン又は増殖因子、例えばTNF、LT、IL−1、IL−2、IL−6、IL−7、IL−8、IL−12、IL−15、IL−16、IL−18、EMAP−11、GM−CSF、FGF及びPDGFに対する抗体又は拮抗物質を含む。本明細書で述べるIL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、細胞表面分子、例えばCD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90又はそれらのリガンドに対する抗体と併用することができる。IL−17Fシグナル伝達拮抗物質はまた、薬剤、例えばメトトレキサート、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、NSAID、例えばイブプロフェン、コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシン作動物質、抗血栓薬、補体阻害剤、アドレナリン作動薬、本明細書で述べるプロ炎症性サイトカインによるシグナル伝達に干渉する物質、IL−1b変換酵素阻害剤(例えばVx740)、抗P7、PSGL、TACE阻害剤、T細胞シグナル伝達阻害剤、例えばキナーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、6−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、本明細書で述べる可溶性サイトカイン受容体及びその誘導体、及び抗炎症性サイトカイン(例えばIL−4、IL−10、IL−13及びTGFと併用し得る。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用することができる多発性硬化症のための治療薬の好ましい例は、インターフェロンβ、例えばIFNβ−1a及びIFNβ−1b;コパキソン、コルチコステロイド、IL−1阻害剤、TNF阻害剤、CD40リガンド及びCD80に対する抗体、IL−12拮抗物質を含む。

IL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)と併用することができる、炎症性腸疾患(例えばクローン病、潰瘍性大腸炎)を治療する又は予防するための物質の非限定的な例は以下を含む:ブデゾニド;上皮増殖因子;コルチコステロイド;シクロスポリン;スルファサラジン;アミノサリチル酸塩;6−メルカプトプリン;アザチオプリン;メトロニダゾール;リポキシゲナーゼ阻害剤;メサラミン;オルサラジン;バルサラジド;抗酸化剤;トロンボキサン阻害剤;IL−1受容体拮抗物質;抗IL−1モノクローナル抗体;抗IL−6モノクローナル抗体;増殖因子;エラスターゼ阻害剤;ピリジニル−イミダゾール化合物;本明細書で述べるTNF拮抗物質;IL−4、IL−10、IL−13及び/又はTGFβサイトカイン又はその作動物質(例えば作動性抗体);IL−11;プレドニゾロン、デキサメタゾン又はブデゾニドのグルクロニド又はデキストラン複合プロドラッグ;ICAM−1アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(ISIS2302;Isis Pharmaceuticals,Inc.);可溶性補体受容体1(TP10;T Cell Sciences,Inc.);徐放性メサラジン;メトトレキサート;血小板活性化因子の拮抗物質(PAF);シプロフロキサシン;及びリグノカイン。

一実施形態では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)は、免疫応答、例えば移植片拒絶反応を調節することに関与する他の標的を対象とする1又はそれ以上の抗体と併用して使用することができる。本発明のIL−17Fシグナル伝達拮抗物質と併用することができる、免疫応答を治療する又は予防するための物質の非限定的な例は以下を含む:CD25(インターロイキン2受容体−a)、CD11a(LFA−1)、CD54(ICAM−1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4(CD80(B7.1)、例えばCTLA4 Ig−アバタセプト(ORENCIA(登録商標))、ICOSL、ICOS及び/又はCD86(B7.2)を含むがこれらに限定されない、他の細胞表面分子に対する抗体。さらに他の実施形態では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質は、1又はそれ以上の一般的な免疫抑制剤、例えばシクロスポリンA又はFK506と組み合わせて使用される。

他の実施形態では、IL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)は、自己免疫疾患、炎症性疾患等に対するワクチンアジュバントとして使用される。これらの種類の疾患の治療のためのアジュバントの組合せは、自己免疫に関与する標的自己抗原、すなわち自己抗原、例えばミエリン塩基性タンパク質;炎症性自己抗原、例えばアミロイドペプチドタンパク質、又は移植抗原、例えば同種抗原からの多種多様な抗原と組み合わせた使用に適する。抗原は、以下のいずれかのタンパク質並びにフラグメントに由来するペプチド又はポリペプチドを含み得る:糖類、タンパク質、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド、自己抗原、アミロイドペプチドタンパク質、移植抗原、アレルゲン、又は他の高分子成分。一部の場合、2個以上の抗原が抗原組成物中に含まれる。

例えば、本発明のアジュバントの組合せを含む、脊椎動物宿主においてアレルゲンに対する応答を抑えるための望ましいワクチンは、アレルゲン又はそのフラグメントを含有するものを含む。そのようなアレルゲンの例は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,830,877号及び国際公開公報WO99/51259に述べられており、花粉、昆虫毒液、動物のふけ、真菌胞子及び薬物(例えばペニシリン)を含む。ワクチンは、アレルギー反応の公知の原因であるIgE抗体の産生に干渉する。もう1つの例では、本発明のアジュバントの組合せを含む、脊椎動物宿主においてアミロイド沈着によって特徴付けられる疾患を予防する又は治療するための望ましいワクチンは、アミロイドペプチドタンパク質(APP)の部分を含有するものを含む。この疾患は、アルツハイマー病、アミロイドーシス又はアミロイド原性疾患のように様々に称される。それ故、本発明のワクチンは、本発明のアジュバントの組合せプラスAβペプチド並びにAβペプチドのフラグメント及びAβペプチド又はそのフラグメントに対する抗体を含有する。

1)細胞機能を示す抗原を下方調節すること;及び2)免疫抑制を管理するための併用療法、の方法は、当分野において周知である(例えばXiao et al. (2003) BioDrugs 17:103-11; Kuwana (2002) Hum. Immunol. 63:1156-63; Lu et al. (2002) Transplantation 73:S19-S22; Rifle et al. (2002) Transplantation 73:S1-S2; Mancini et al. (2004) Crit. Care. Nurs. Q. 27:61-64参照)。

本発明のもう1つの態様は、従って、他の治療化合物と共にIL−17Fシグナル伝達拮抗物質(例えばIL−17F、IL−17R及び/又はIL−17RC阻害性ポリヌクレオチド;可溶性IL−17R及び/又はIL−17RCポリペプチド(そのフラグメント及び/又は融合タンパク質を含む);阻害性抗IL−17F、抗IL−17R又はIL−17RC抗体;及び/又は拮抗性低分子等)の投与を実施するためのキットに関する。一実施形態では、キットは、1又はそれ以上の別々の医薬製剤中に、製薬担体中に製剤された1又はそれ以上の結合薬剤、及び適切に製剤された少なくとも1つの作用物質、例えば治療薬を含む。

本明細書を通じて言及される全ての参考文献、特許及び公開特許出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

以下の実施例は、本発明を説明するための実施形態を提供するものであり、いかなる意味においても本発明を限定しない。当業者は、数多くの他の実施形態が本発明の範囲内に包含されることを認識する。

実施例は、従来の方法、すなわちベクターの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のそのようなベクター及びプラスミドへの挿入、そのようなベクター及びプラスミドの宿主細胞への導入、及び宿主細胞におけるそのようなベクター及びプラスミドからのポリペプチドの発現において使用するそのような方法の詳細な説明を含まない。そのような方法は当業者に周知である。
(実施例1)
IL−17Fを介した炎症応答及び炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチ、炎症性呼吸器疾患及び炎症性腸疾患への関与
実施例1.1:ナイーブマウスにおけるヒトIL−17F投与は腹腔への好中球流入を誘導する

IL−17F処置が関節軟骨によるプロテオグリカン破壊の上昇及びプロテオグリカン合成の低下を生じさせるという所見(Hymowitz et al. (2001) EMBO J. 20:5332-41)は、関節組織の炎症性疾患の発症におけるIL−17Fシグナル伝達の役割を示唆する。実際に、慢性関節リウマチ及び変形性関節症を有する患者からの滑液試料は、プロテオグリカン、例えばアグリカン、ケラチン及びコラーゲンの破壊を示し(例えばWitter et al. (1987) Arth. Rheum. 30:519-29 and Yagi et al. (2005) J. Orthop. Res. 23(5):1128-38参照)、インビトロでの関節炎モデルは、マトリックス及びプロテオグリカン破壊を呈示することによってこの現象を模倣する(Neidhart et al. (2000) Arth. Rheum. 43:1719-28)。

加えて、喘息に罹患している患者から単離したBAL試料(Kawaguchi et al. (2002) J. Immunol.167:4430-35)及び炎症性腸疾患、例えば潰瘍性大腸炎又はクローン病に罹患している患者から単離した結腸試料(Gurney et al. (2003) GTCBIO Conference: Cytokines and Beyond)において認められるIL−17Fの発現上昇は、肺及び腸組織の炎症性疾患におけるIL−17Fシグナル伝達についての付加的な役割を示唆する。炎症応答におけるIL−17Fシグナル伝達の役割を検討するため、ナイーブマウスにPBS(対照として)又はヒトIL−17F(配列番号2)100μgを腹腔内注射した。処置の数時間後に、末梢血(PB;1、2、4、6、8及び10時間後)及び腹腔(PEC;2、4、6、8及び10時間後)からの試料を採取し、各々の試料中の絶対好中球数(ANC)を測定した。表2のデータは、血液及び腹腔中の好中球数を上昇させるIL−17Fの能力を反映する。この作用は、慢性関節リウマチ及び慢性閉塞性肺疾患(COPD)に罹患している患者で認められる好中球増加を説明すると考えられる。
表2.PBS(n=5)又はIL−17F(n=5)を注射したマウスから単離した末梢血(PB)及び腹腔(PEC)試料における絶対好中球数(ANC;平均±SEM)。星印は、対照試料と比較してp値<0.05を表わす。
実施例1.2:IL−17Fシグナル伝達は炎症性関節疾患において役割を果たす

炎症、特に関節疾患(例えば関節炎)に関わる炎症応答へのIL−17Fシグナル伝達の関与をさらに評価するため、一次軟骨細胞おける炎症性サイトカインの転写に関与する主要因子、すなわちNF−κBを活性化するIL−17Fの能力を測定した。一次ヒト又はブタ軟骨細胞をNF−κBレポーター遺伝子系を発現するアデノウイルスに感染させた(100MOI)。これは、NF−κB応答性プロモーター(BD Mercury Pathway Profiling systems,BD Biosciences,Palo Alto,CA)によって制御されるルシフェラーゼ遺伝子の発現を測定することにより、内因性NF−κBの活性化(すなわち細胞質から核へのNF−κBの転移)を検出する。48−72時間後、感染軟骨細胞を様々な濃度のIL−17A(配列番号4)又はIL−17Fと共に培養した。IL−17A又はIL−17Fとのインキュベーションの4時間後、細胞を室温で20分間、溶解緩衝液(Promega,Madison,WI)25μlに溶解し、自動発光測定装置を用いてNF−κBの活性化を測定した。データは、IL−17Fが一次ヒト軟骨細胞(図1A)及び一次ブタ軟骨細胞(図1B)においてNF−κBを用量依存的に活性化したことを示す。最後に、NF−κBをバックグラウンド以上のレベルまで活性化するために必要なIL−17Fの量は、NF−κBをバックグラウンド以上のレベルまで活性化するために必要なIL−17Aの量と同様であった(図1A)。

一次軟骨細胞においてサイトカイン転写因子、NF−κBを活性化するIL−17Fの能力は、IL−17Fが、例えば関節炎の発症の間に、関節組織の炎症において果たす役割が炎症性サイトカインの誘導を含むことを示唆する。関節組織による炎症性サイトカイン産生へのIL−17Fの作用を試験するため、慢性関節リウマチ(RA)と診断された2名の患者から単離したヒト線維芽細胞様滑膜細胞を24穴プレートに半集密(semi-confluence)に接種し、150ng/ml IL−17Fの不在下又は存在下で培養した。48時間目に上清を収集し、多重サイトカインシステム(Pierce−Bio,Rockford,IL)を用いてサイトカイン産生を評価した。図2に示すように、IL−17Fは、RA患者から単離したヒト線維芽細胞様滑膜細胞による炎症性サイトカイン、例えばIL−6及びIL−8、及びケモカイン、例えばMCP−1及びGRO−αの産生を誘導した。

一次軟骨細胞においてNF−κBを活性化し、RA患者からのヒト線維芽細胞様滑膜細胞による炎症性サイトカイン及びケモカイン、特に好中球動員に関与するケモカインの産生を誘導するIL−17Fの能力は、関節組織による炎症応答を媒介する上でのIL−17Fの役割を裏付ける。これらのデータは、対照動物と比較してコラーゲン誘導の関節炎に罹患しているマウスの足におけるIL−17F発現上昇を明らかにしたデータ(データは示していない)及び変性関節軟骨及び関節腔内の好中球の存在(データは示していない)と合わせて考慮すると、IL−17Fが、その後周辺組織への損傷を引き起こす免疫細胞(例えば好中球)を炎症部位へと動員する、サイトカイン及びケモカイン産生を誘導することによって炎症性関節疾患(例えば慢性関節リウマチ)を媒介することを示唆する。
実施例1.3:一次マウス肺線維芽細胞は、炎症性ケモカイン及びサイトカインの産生を上方調節することによってIL−17Fに応答する

炎症性呼吸器疾患の発症におけるIL−17Fの役割を試験するため、マウス肺線維芽細胞(MFL)を24穴プレートで半集密に増殖させ、IL−17F(50ng/ml)で処置した。48時間目に上清を収集し、多重サイトカインシステム(Pierce−Bio,Rockford,IL)を用いてサイトカイン産生を評価した。図3は、IL−17Fが、炎症性サイトカイン、例えばIL−6、及びケモカイン、例えばJE(CCL2)及びKCのMFL産生を誘導したことを示す。これらの結果は、IL−17Fが、炎症性サイトカイン及び白血球化学誘引物質の産生を誘導することによって肺の炎症性疾患(例えばCOPD、喘息、アレルギー、嚢胞性線維症)に関わる炎症応答に寄与することを示唆する。
(実施例2)
IL−17F受容体の特性決定
実施例2.1:IL−17FはIL−17R及びIL−17RCに結合する

IL−17FはIL−17ファミリーの中でIL−17Aとの最大の相同性を持ち、IL−17AとIL−17FはIL−17受容体を通してシグナル伝達することが示唆されているので、IL−17FがIL−17Aについての受容体(すなわちIL−17R;配列番号6)に結合する能力を測定した。IL−17Fが、そのリガンドが現在まで特定されていないIL−17受容体であるIL−17RCに結合する能力も試験した。

ELISAプレートを1.5μg/ml ヒトIL−17R−Ig(配列番号34)又は1.5μg/ml ヒトIL−17RC−Ig(配列番号35)と共に一晩インキュベートした。プレートをPBS/1%BSAで洗い、ビオチン複合IL−17A又はビオチン複合IL−17Fの連続希釈と共に室温(RT)で2時間インキュベートした。洗浄後、飽和濃度のアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)を添加し、プレートをさらに1時間RTでインキュベートした。非結合アビジン−HRPをPBS/1%BSAを用いて洗い流し、TBMを用いてELISAを展開した。結合IL−17A又はIL−17Fを、405nmでの吸光度を測定することによって検出した。

図4A及び4Bは、それぞれIL−17FがIL−17R及びIL−17RCの両方に結合することを明らかにし、IL−17Fは、IL−17RCに対するその親和性に比べてIL−17Rにより大きな親和性を有する(IL−17R:IL−17FについてのEC50値=1.23μg/ml;IL−17RC:IL−17FについてのEC50値=15μg/ml)。しかし、IL−17FはIL−17Rに結合したが、この受容体に対するその親和性は、同じ受容体に対するIL−17Aの親和性よりも低かった(IL−17R:IL−17FについてのEC50値=1.23μg/ml;IL−17R:IL−17A=0.35μg/ml;図4A)。
実施例2.2:抗IL−17R抗体及びIL−17RC−Ig融合タンパク質はIL−17F活性をブロックするが、IL−17R−Ig融合タンパク質はIL−17F活性をブロックしない

IL−17F受容体結合をさらに特性決定するため、ヒト線維芽細胞(10細胞/穴)を、漸増濃度のIL−17R−Ig融合タンパク質、IL−17RC−Ig融合タンパク質又は抗IL−17R抗体の存在下に0.5ng/ml IL−17A又は20ng/ml IL−17Fで刺激した。24時間後、市販のELISA(R&D, Minneapolis, MN)を使用し、収集した上清のGRO−α濃度を測定した。GRO−αの濃度は標準曲線に基づいて測定した。

図5は、IL−17A(A)又はIL−17F(B)と共にインキュベートしたときのヒト線維芽細胞のGRO−α産生上昇を明らかにし、実施例1.2の所見(IL−17Fと共に培養したヒト線維芽細胞様滑膜細胞による炎症性サイトカイン産生の上昇を明らかにする)をさらに確証付ける。図5Aは、3つの受容体拮抗物質全てが、すなわちIL−17R−Ig(h17R.Fc)、IL−17RC−Ig(h17RH2.Fc)及び抗IL−17R抗体(ahIL17R)が、GRO−αを誘導するIL−17Aの能力をブロックしたことを付加的に示す。これらのデータは、IL−17AがIL−17R及びIL−17RC受容体の両方に結合し、IL−17Aシグナル伝達のために両方の受容体を必要とすることを示唆する。これに対し、抗IL−17R抗体とIL−17RC−Ig融合タンパク質だけがIL−17F活性を著明にブロックし、IL−17R−Ig融合タンパク質はIL−17F活性をブロックしなかった(図5B)。図5Bに示すデータは、IL−17FはIL−17Rに結合するが(図4参照)、IL−17Fを介したシグナル伝達のためにはこの受容体を必要としないことを示唆する。合わせて考慮すると、これらのデータは、IL−17AとIL−17Fはヒト線維芽細胞へのそれらの活性を媒介するために異なる受容体を使用し得ることを示唆する。
(実施例3)
抗IL−17F抗体の作製と特性決定
実施例3.1:抗IL−17F抗体の作製

5匹のマウス(Jackson Labs,Maine)の群にヒトIL−17FをコードするcDNA2μgを注射した。精製プラスミドcDNAを、1μg cDNA/0.5mg金の濃度まで金ビーズ上に沈殿させた。金ビーズ及び沈殿cDNAを、2回の重複しないショットで毎月、遺伝子充填Heliosを使用して11週齢の雌性Balb/cマウスの腹部に皮内送達した。これらの動物を4週ごとに免疫し、この期間の終了時に脾臓を切除した。IL−17F cDNAに加えて精製IL−17Fタンパク質を用いて再免疫を実施した。リンパ球懸濁液を得るために脾臓を処理し、生じた懸濁液を、確立された手順により(Oi and Herzenberg (1980) in Selected Methods in Cellular Immunology, Mishel and Schigi, eds. W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, p. 351)、50%(w/v)ポリエチレングリコール1500を用いて骨髄腫細胞系653/P3と融合した。融合細胞を2×10細胞/穴の密度で96穴マイクロタイタープレートに塗布し、24時間後にHAT選択に供した。推定上の抗IL−17F抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を固相及び液相ELISAによって特定した。上記アッセイに関して陽性のハイブリドーマを含むウエルを増殖させ、限界希釈によってクローン化して、凍結保存した。固相ELISAを用いて抗体のアイソタイプを決定した。精製ヒトIL−17F−Igを使用して96穴マイクロタイタープレートを被覆し、種々のアイソタイプ特異的ビオチン複合ヤギ抗マウスIgG(Zymed,South San Francisco,CA)によって検出した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)と複合したストレプトアビジンを添加し、比色定量基質を用いて特異的に結合した酵素を測定した。
実施例3.2:一部の抗IL−17F抗体はIL−17RへのIL−17F結合を阻害する

IL−17RへのIL−17Fの結合をブロックする抗IL−17F抗体の能力を評価するため、実施例2.1で述べたELISAに修正を加えて阻害アッセイを実施した。簡単に述べると、抗IL−17F抗体の連続希釈を7μg/ml IL−17Fと共にRTで1時間プレインキュベートした。次に各々のサイトカイン:抗体混合物を、1.5μg/ml IL−17R−Ig 100μl/穴であらかじめ被覆したELISAプレートの別々のウエルに添加した。混合物をウエル中RTで1時間インキュベートした。プレートをPBS/1%BSAで洗浄した後、飽和濃度のアビジン−HRPを添加し、プレートをさらに1時間RTでインキュベートした。非結合アビジン−HRPをPBS/1%BSAを用いて洗い流した。TMBを用いてアッセイを展開した。図6は、試験した6個の抗体のうち5個、すなわち抗IL−17F−01、抗IL−17F−02、抗IL−17F−06、抗IL−17F−07及び(より小さな程度であるが)抗IL−17F−05が、IL−17RへのIL−17Fの結合をブロックできたことを明らかにする。これに対し、抗IL−17F−03抗体はIL−17RへのIL−17F結合を阻害しなかった(図6)。
実施例3.3:一部の抗IL−17F抗体はIL−17RCへのIL−17F結合を阻害する

IL−17RCへのIL−17Fの結合をブロックする抗IL−17F抗体の能力を評価するため、1.5μg/ml IL−17RC−Ig及び20μg/mlの濃度のIL−17Fであらかじめ被覆したプレートを使用して、上記で述べたように、修正ELISAを用いて阻害アッセイを実施した。図7は、試験した6個の抗体のうち2個(抗IL−17F−01及び抗IL−17F−07)がIL−17RCへのIL−17Fの結合を阻害できたことを明らかにする。これに対し抗IL−17F−02、抗IL−17F−03、抗IL−17F−05及び抗IL−17F−06抗体は、IL−17RCへのIL−17F結合を阻害しなかった(図7)。図6と7を合わせて考慮すると、データは、抗IL−17F抗体がIL−17F上の異なる部位に結合することを示唆するのみならず、抗IL−17F−02及び抗IL−17F−06抗体はIL−17F:IL−17R相互作用のための独自のIL−17F上の部位に結合する及び/又は上記部位への結合を阻害するが、一方抗IL−17F−01及び抗IL−17F−07抗体はIL−17RとIL−17RCの間で共有されるIL−17F上の部位に結合する及び/又は上記部位への結合を阻害することも示唆する。その結果として、これら6個の抗体は、IL−17F上の異なる部位、すなわちエピトープを定義するために使用し得る。
(実施例4)
抗IL−17F抗体はIL−17F生物活性を阻害する
実施例4.1:抗IL−17F抗体はIL−17Fを介したサイトカイン産生を阻害する

実施例3で述べた抗IL−17F抗体のいずれかがIL−17F生物活性を阻害するかどうかを調べるため、ヒト線維芽細胞(10細胞/穴)を、漸増濃度の対照抗体(mIgG1)又はIL−17Fに対する抗体、すなわち抗IL−17F−01、抗IL−17F−02、抗IL−17F−03、抗IL−17F−05、抗IL−17F−06又は抗IL−17F−07の存在下にヒト20ng/ml IL−17Fで刺激した。24時間後、上清を収集し、市販のELISAを用いてGRO−α濃度を測定した。産生されたGRO−αの濃度を標準曲線に基づいて決定した。

図8は、抗IL−17F−01、抗IL−17F−02及び抗IL−17F−07抗体が、ヒト線維芽細胞によるヒトIL−17Fを介したGRO−α産生を阻害することを明らかにする。図6、7及び8に示す結果は、その後の動員及びIL−17RCを通しての必要なシグナル伝達を生じさせる、IL−17Fシグナル伝達がIL−17RへのIL−17F結合によって開始されるモデルを示唆する。
実施例4.2:炎症性疾患の治療における抗IL−17F抗体の潜在的使用

IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患(例えば自己免疫疾患、呼吸器疾患、炎症性腸疾患等)の治療における治療薬としての抗IL−17F抗体、特に抗IL−17F−07抗体の潜在的可能性を調べるため、NF−κBレポーターベクターに感染させたブタ一次軟骨細胞を、以下の1つの不在下又は存在下にRTで1時間プレインキュベートした100ng/ml IL−17A又は500ng/ml IL−17Fと共に48時間インキュベートした:20μg/ml IL−17R−Ig融合タンパク質(IL17R/Fc)、10μg/ml 抗IL−17F−07抗体(抗IL17F)又は10μg/ml対照抗体(マウスIgG)。図9は、IL−17R−Ig融合タンパク質のインキュベーションはIL−17Aを介したNF−κBの活性化を阻害したが、IL−17Fを介したNF−κBの活性化には影響を及ぼさなかった。これに対し、抗IL−17F−07抗体は、IL−17Fを介したNF−κBの活性化を阻害することができたが、IL−17Aを介したNF−κBの活性化には影響を及ぼさなかった(図9)。

抗IL−17F抗体の存在下で阻害されたNF−κBの活性化がサイトカイン産生の阻害と相関するかどうかを評価するため、実施例1.2で述べたように、IL−17Fと共にインキュベートしたヒト線維芽細胞様滑膜細胞を、アイソタイプ対照抗体、抗IL−17F−01抗体又は抗IL−17F−07抗体と共にインキュベートした。IL−6、IL−8又はGRO−αの濃度を実施例1.2で述べたように評価した。図10は、IL−17FのNF−κB活性化を阻害する抗IL−17F抗体の能力が、慢性関節リウマチを有する2名の患者から単離した一次線維芽細胞様滑膜細胞によるIL−6、IL−8及びGRO−αの産生低下と相関したことを明らかにする。これらのデータは、IL−17Fに対する阻害性抗体を含むがこれらに限定されない、IL−17Fシグナル伝達の拮抗物質が炎症応答を軽減するために使用し得ることを示唆する。特に、IL−17Fの阻害剤は、IL−17Fシグナル伝達に関連する疾患、すなわちIL−17F関連疾患に結びつく炎症応答の治療において使用し得る。
(実施例5)
IL−17F及びIL−17Aに対する抗体は、組換え及び天然IL−17Fホモ二量体、IL−17Aホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を検出し、精製するために使用し得る
実施例5.1:ELISAによる組換えIL−17A/IL−17A、IL−17F/IL−17F及びIL−17A/IL−17Fの検出

ヒトIL−17A、ヒトIL−17F又はヒトIL−17AとヒトIL−17Fの両方をコードするcDNAを、293細胞を修飾するために使用した。これらのcDNAの発現は、IL−17A/IL−17A、IL−17F/IL−17F又はIL−17A/IL−17F二量体の生産を生じさせた。これらの細胞、すなわち組換えサイトカインに由来する馴化培地、及び市販の抗体又は上述した抗体を、IL−17Aタンパク質、IL−17Fタンパク質又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出のためのELISA形式を開発するために使用した。IL−17Aタンパク質の検出、すなわちIL−17Aホモ二量体又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体としての検出のために、抗IL−17A抗体を捕獲抗体として使用し、ビオチン標識抗IL−17A抗体を検出抗体として使用した(どちらの抗体もR&D Systems,Minneapolis,MNより入手可能である)。IL−17Fタンパク質の検出、すなわちIL−17Fホモ二量体又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体としての検出のために、抗IL−17F−01抗体(上述した)及びビオチン標識抗IL−17F−07抗体(上述した)をそれぞれ捕獲及び検出抗体として使用した。IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出のために、抗IL−17A抗体(R&D Systems)を捕獲抗体として使用し、ビオチン標識抗IL−17F−07抗体を検出抗体として使用した。IL−17AとIL−17F抗体は交差反応性ではない(データは示していない)。

ELISAを周知のプロトコールに従って実施した。簡単に述べると、ELISAプレートを捕獲抗体2μg/mlと共に一晩インキュベートした。過剰の捕獲抗体を除去するためにプレートをPBS/1%BSAで洗い、馴化培地(すなわち組換えIL−17A/IL−17A、IL−17F/IL−17F及びIL−17A/IL−17Fサイトカイン)の連続希釈と共にRTで2時間インキュベートした。非結合サイトカインを洗い流した後、ビオチン複合展開抗体(developing antibody)0.07〜0.5μg/mlを添加し、プレートをRTで2時間インキュベートした。非結合展開抗体を除去するためにプレートを洗浄し、飽和濃度のアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)を添加して、プレートをRTで1時間インキュベートした。非結合アビジン−HRPを、PBS/1%BSAを用いて洗い流した。TBMを用いてアッセイを展開した。

図11は、組換えIL−17A及びIL−17Fホモ二量体の検出、並びに組換えIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出を示す。捕獲及び検出抗体がどちらも1つのサイトカイン(すなわちIL−17A又はIL−17F)を対象とする場合、そのサイトカインのホモ二量体とヘテロ二量体の両方が検出された(図11A及び11B)。これに対し、抗IL−17A抗体及び抗IL−17F抗体をそれぞれ捕獲及び検出抗体として使用するときは、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体だけが検出される(図11C)。これらのデータは、IL−17A/IL−17F抗体対が、一次細胞に由来する馴化培地中の天然(すなわち非組換え)IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を検出し、潜在的に精製するために使用し得ることを示唆する。加えて、これらの結果は、抗IL−17F−07抗体も、上述したように抗IL−17F−01抗体及び他の抗IL−17F抗体と同様に、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を対象とし得ることを示唆する。
実施例5.2:天然IL−17Aホモ二量体、天然IL−17Fホモ二量体及び天然IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出

ヒトCD4T細胞(5×10細胞/ml)を、IL−21(60ng/ml)又はIL−23(0.5ng/ml)の不在下又は存在下に、抗CD3結合ビーズ(5μg/10ビーズ)及び漸増濃度の抗CD28抗体(R&D,Minneapolis,MN)で活性化した。一次活性化の72時間後に上清を収集し、IL−17A又はIL−17Fの濃度を、上述したように(実施例5.1)それぞれIL−17Aタンパク質又はIL−17Fタンパク質に関してELISAによって測定した。図12は、IL−21又はIL−23が、一次活性化を受けるT細胞によるIL−17A又はIL−17F産生を増強するために使用し得ることを明らかにする。IL−2、IL−7及びIL−15も、CD3/CD28刺激時にIL−17A及びIL−17F産生を誘導した(データは示していない)。

ヒトCD4T細胞(5×10細胞/ml)を、抗CD3結合ビーズ(5μg/10ビーズ)及び可溶性抗CD28抗体で48時間活性化した。活性化T細胞を採集し、一晩休止させて、ビーズ結合抗CD3、抗CD28抗体、IL−21(60ng/ml)又はIL−23(0.5ng/ml)の存在下で再活性化した。二次活性化の72時間後に上清を収集し、IL−17A又はIL−17Fの産生を、上述したようにそれぞれIL−17Aタンパク質又はIL−17Fタンパク質に関してELISAによって測定した。図13は、IL−21又はIL−23が、二次活性化を受けるT細胞によるIL−17A又はIL−17F産生を増強するためにCD28共刺激と相乗作用することを明らかにする。

ヒトCD4T細胞(2×10細胞/ml)を、抗CD3結合ビーズ(5μg/10ビーズ)及び可溶性抗CD28抗体(0.5μg/ml)による一次活性化に供した。48時間の一次活性化後、馴化培地(CM1)を収集し、細胞を一晩休止させた。その翌日、細胞を計数し、上記一次活性化に関して述べたように2×10細胞/mlで、及び60ng/ml IL−21の存在下で再刺激した。72時間の再刺激後、馴化培地(CM2)を収集した。そのまま及び1:10希釈のCM1及びCM2におけるIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の存在又は不在を、実施例5.1で述べたELISA形式を用いて評価した。

データは、CM1培地、すなわち一次活性化を受けたT細胞の培地中ではIL−17Aホモ二量体又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体がほとんど若しくは全く検出されなかったことを示す(図14A及び14C)。これに対し、再刺激したT細胞の馴化培地(CM2)は、IL−17A及びIL−17Fホモ二量体だけでなく、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体も含んだ(図14A、14B及び14C)。これらのデータは、IL−17サイトカインの「天然」ソースであるT細胞が、IL−17A及びIL−17Fのホモ二量体とヘテロ二量体の両方を発現することを示す。これらの結果はまた、IL−17Fを対象とする抗体がIL−17Fホモ二量体とIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の両方を認識し、それらと反応できること、及びそのような抗体はIL−17Fホモ二量体及び/又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を単離し、それらの生物学的活性を阻害するために使用し得ることを示唆する。
実施例5.3:T細胞からの天然IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の免疫沈降

実施例5.2で述べたように、IL−21の存在下で二次活性化を受けるT細胞に由来する馴化培地(CM2)を、マウス抗ヒトIL−17A−02(Wyeth)又はマウス抗ヒトIL−17F−01(Wyeth)モノクローナル抗体20μg/mlと、静かに回転させながら4℃で1時間混合した。各々の混合物からの抗体複合体を、静かに回転させながら4℃で一晩、水和プロテインA−セファロース50μlで別々に免疫沈降させた。次に免疫沈降ペレットをPBS/1%トゥイーン20、PBS/0.1%トゥイーン20及びPBS/0.05%トゥイーン20で連続的に洗った。免疫沈降ペレットを非還元試料緩衝液に再懸濁し、抗ヒトIL−17Aビオチン複合体(R&D,Minneapolis,MN)又はウサギ抗ヒトIL−17F抗体(Wyeth)のいずれかによるウエスタンブロット分析のために10%トリシンゲルに負荷した。

IL−17Fホモ二量体(35kDa)を、マウス抗ヒトIL−17F−01抗体を用いて免疫沈降させ、ウサギ抗ヒトIL−17Fポリクローナル抗体でのウエスタンブロット分析によってCM2 500μlから検出した。IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体(32kDa)を、マウス抗ヒトIL−17A−02抗体を用いて免疫沈降させ、ウサギ抗ヒトIL−17Fポリクローナル抗体でのウエスタンブロット分析によってCM2 500μlから検出した(図15)。モノクローナル又はポリクローナル抗体のいずれもIL−17Aと交差反応しなかった(データは示していない)。同様に、IL−17Aホモ二量体(31kDa)及びIL−17F/Aヘテロ二量体を、マウス抗ヒトIL−17A−02抗体を用いて免疫沈降させ、ポリクローナルヤギ抗IL−17Aビオチニル化抗体を用いたウエスタンブロット分析によってCM2 700μlから検出した。IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を、マウス抗ヒトIL−17F−01抗体を用いて免疫沈降させ、ポリクローナルヤギ抗IL−17Aビオチニル化抗体を用いたウエスタンブロット分析によってCM2 700μlから検出した(図16)。上記ポリクローナル抗体は、高タンパク質濃度でIL−17Fホモ二量体と交差反応する(データは示していない)。

対照(図15及び16のレーン2)として、IL−17Fホモ二量体を、His標識ヒトIL−17Fを過剰発現する濃縮馴化培地から精製した。簡単に述べると、濃縮馴化培地を100mMトリスpH8/1M NaCl/10mMイミダゾールで1:1希釈し、Nickel−NTA Fast Flowカラム(Qiagen,Valencia,CA)に負荷した。ホモ二量体を250mMイミダゾール緩衝液で段階溶出した。タンパク質をPBS−NSOに対して透析した。次にHisタグを除去するためにホモ二量体を室温で4時間、EK(エンテロキナーゼ)で消化した。消化したタンパク質を50mMリン酸ナトリウムpH8/20mMイミダゾール/300mM NaClで1:1希釈し、Nickel−NTAカラム(Qiagen,Valencia,CA)に結合した。標識除去したタンパク質を40mMイミダゾール緩衝液で溶出し、PBS NSOに対して透析した。対照(図15のレーン5)として使用するための精製IL−17Aホモ二量体をR&D Systems(Minneapolis,MN)より購入した。
実施例5.4:トランスフェクトCOS細胞からの組換えIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の免疫沈降

組換えヒトIL−17FとIL−17AがCOS細胞における発現時にヘテロ二量体を形成するかどうか、及び抗IL−17F及び抗IL−17A抗体が免疫沈降することができ、IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を検出できるかどうかを調べるための実験を実施した。COS細胞培養物にIL−17F cDNA、IL−17A cDNA又はIL−17FとIL−17Aの両方のcDNAをトランスフェクトし、トランスフェクト細胞培養物に、生じたタンパク質を培地中に分泌させた。IL−17F又はIL−17Aのいずれかの発現又はIL−17FとIL−17Aの共発現に由来する馴化培地を、マウス抗ヒトIL−17A−02(Wyeth)又はマウス抗ヒトIL−17F−01(Wyeth)モノクローナル抗体20μg/mlと、静かに回転させながら4℃で1時間混合した。各々の混合物からの抗体複合体を、静かに回転させながら4℃で一晩、水和プロテインA−セファロース50μlで別々に免疫沈降させた。次に免疫沈降ペレットをPBS/1%トゥイーン20、PBS/0.1%トゥイーン20及びPBS/0.05%トゥイーン20で連続的に洗った。免疫沈降ペレットを非還元試料緩衝液に再懸濁し、ヤギ抗ヒトIL−17A(R&D,Minneapolis,MN)又はウサギ抗ヒトIL−17F抗体(Wyeth)のいずれかによるウエスタンブロット分析のために10%トリシンゲルに負荷した。

IL−17Fホモ二量体(35kDa)及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を、マウス抗ヒトIL−17F−01抗体を用いて免疫沈降させ、ウサギ抗ヒトIL−17Fポリクローナル抗体でのウエスタンブロット分析によってCM2 50μlから検出した(図17A;それぞれレーン3及び4)。IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体(32kDa)はまた、マウス抗ヒトIL−17A−02抗体を用いて免疫沈降させ、ウサギ抗ヒトIL−17Fポリクローナル抗体でのウエスタンブロット分析によってCM2 50μlから検出した(図17A;レーン9)。図17Aのレーン8〜10の免疫沈降のために使用したIL−17A抗体は、IL−17Fホモ二量体に対応するバンドがレーン10において抗IL−17F抗体プローブによって検出されるので、高タンパク質濃度でIL−17Fと交差反応すると思われた。図17Bに示すように、IL−17Aホモ二量体(31kDa)及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を、マウス抗ヒトIL−17A−02抗体を用いて免疫沈降させ、ポリクローナルヤギ抗ヒトIL−17A抗体を用いたウエスタンブロット分析によってCM2 50μlから検出した(図17B;それぞれレーン3及び4)。また、IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を、マウス抗ヒトIL−17F−01抗体を用いて免疫沈降させ、ポリクローナルヤギ抗ヒトIL−17A抗体を用いたウエスタンブロット分析によってCM2 50μlから検出した(図17B;レーン6)。図17Aにおいて免疫沈降のために使用したIL−17A抗体と異なり、図17Bのレーン5〜7で免疫沈降のために使用したIL−17F抗体は、IL−17Aホモ二量体に対応するバンドがレーン5において抗IL−17A抗体プローブによってほとんど検出されないので、IL−17Aと有意に交差反応しなかった。

対照(図17Aのレーン6〜7)として、IL−17Fホモ二量体を実施例5.3で述べたように精製した。対照(図17Aのレーン5)として使用するための精製IL−17Aホモ二量体をR&D Systems(Minneapolis,MN)より購入した。対照精製IL−17Fホモ二量体は、馴化培地から免疫沈降させたIL−17Fホモ二量体よりもわずかに速く移動する。これはおそらく、グリコシル化の差及び/又は精製試料中のIL−17Fタンパク質上のエピトープタグの欠如によるものであると考えられる。
実施例5.5:組換えIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の精製

IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を精製する2つの方法を本明細書で提供する。最初の方法では、COS細胞をHis標識IL−17F(配列番号36)及び非標識IL−17Aでコトランスフェクトした。塩化ナトリウムとイミダゾールをそれぞれ500mM及び6mMの最終濃度で馴化培地に添加した。次に馴化培地をNickel−NTAカラム(Qiagen,Valencia,CA)に負荷した。それ故、Hisタグを含むIL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体だけがニッケルカラム上に捕獲された。次にIL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体をイミダゾール勾配で分離し、その後Hisタグを除去するためにIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体をEKで消化した。タンパク質をPBSに対して透析した。IL−17F及びIL−17Aタンパク質がIL−17F/Aへテロ二量体試料中で検出されることを確認するためにエドマン配列分析法を実施した。N末端配列の結果は、ヘテロ二量体の存在を確認し、すなわちIL−17Fについての最初の5個のアミノ酸がRKIPK(配列番号37)であることを示し、IL−17AについてはIVKAG(配列番号38)であることを示した。

第二の方法は、図18に提示するフローチャートで示される、二元カラム精製スキームを使用した。Flag標識ヒトIL−17A(配列番号39)及びHis標識ヒトIL−17F(配列番号36)を別々のpSMED2ベクター(Wyeth)にクローン化し、リポフェクションによってHEK293細胞において共発現させた。簡単に述べると、細胞をトランスフェクションの24時間前に2つの175cmフラスコに接種した。各々のフラスコについて、pSMED2/Flag−IL−17A 24μg+pSMED2/His6−IL−17F 24μgを、無血清培地2ml中でTRANSIT(登録商標)試薬−LT1(Mirus,Madison,WI)120μlと混合し、細胞(90%集密)及び10%熱不活化ウシ胎仔血清を含むDMEM培地25mlを含むフラスコに添加した。トランスフェクションの1日後、培地を取り出し、細胞を無血清培地で1回洗浄して、新鮮無血清培地を添加した(40ml/フラスコ)。馴化培地を48時間後に採集し、細胞を除去するためにろ過して(0.45μ)、−20℃で凍結した。特異抗体を用いたウエスタン分析によってタンパク質発現を確認した。

馴化培地を、4℃で2時間抗FlagM2アフィニティー樹脂(Sigma,St.Louis,MO)にバッチ結合した。結合タンパク質、IL−17Aホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を、50mMトリスpH8/500mM NaCl/200μg/ml Flagペプチド(Sigma,St.Louis,MO)を用いて溶出した。次にFlag溶出物を4℃で一晩Nickel−NTA樹脂(Qiagen,Valencia,CA)にバッチ結合した。結合タンパク質、IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を、50mMトリスpH8/1M NaCl/500mMイミダゾールを用いて溶出した。

IL−17F及びIL−17Aホモ二量体を実質的に含まない組換えIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の精製後、BJ細胞培養培地においてGRO−αレベルを刺激するヘテロ二量体の能力を測定することにより、へテロ二量体の活性をBJ細胞で試験した。そこで、BJ培養物を様々な濃度のIL−17Fホモ二量体、IL−17Aホモ二量体又は精製組換えIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体で刺激した。24時間後、BJ培養物からの上清を収集し、市販のELISAを用いてGRO−α濃度を測定した。簡単に述べると、BJ細胞を平底96穴プレートに5×10細胞/穴で接種し、IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体又はIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を含む培地15μlを添加した。次にプレートを37℃で16−24時間インキュベートし、その後上清を取り、GRO−αに対する抗体による標準的なサンドイッチELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いてGRO−αの濃度を測定した。産生されたGRO−αの濃度を標準曲線に基づいて測定した。結果を図19Aに示す。IL−17F及びIL−17Aホモ二量体と同様に、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体はBJ細胞においてIL−17 GRO−α濃度を刺激することができる。さらに、図19Bに示すように、抗IL−17A抗体又は抗IL−17F抗体と組み合わせた抗IL−17A抗体によるBJ培養物の処理は、GRO−αレベルを刺激するIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の能力を無効にした。
実施例5.6:IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の質量分析

2個のIL−17単量体の間のジスルフィド結合の直接証拠を提供するために、タンデム型質量分析によってジスルフィド結合の存在を確認し、分子間ジスルフィド結合ペプチド(IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体)を特定した。ジスルフィド結合ペプチドを単離するためにトリプシン切断及び逆相高速液体クロマトグラフィー(rpHPLC)を使用し、単離したペプチドをその後ナノLC−MS/MSによって分析した。簡単に述べると、精製非還元組換えIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体1〜2μgを10%ビス−トリスゲル(Invitrogen,Carlsbad,CA)で泳動させ、IMPERIAL(商標)タンパク質染色液(Pierce,Rockford,IL)で染色した。陽性染色バンドを切り出し、質量分析のために手動でトリプシン消化した(Promega,Madison,WI)。消化のために、切り出したゲル切片をアセトニトリル(ACN)中で脱水し、25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で再水和し、洗浄して、ACN中で再び脱水した。プロテアーゼトリプシン(25mMリン酸ナトリウム緩衝液に溶解したトリプシン0.5μg)を添加し、再水和によってゲル片に推進(drive)して、37℃で4時間インキュベートした。生じたペプチドを、60%ACN/1%ギ酸(FA)及び90%ACN/5%FAのアリコートを用いた3回の連続洗浄によってゲルからさらに抽出した。これらの抽出物を併合し、蒸発させて、最終試料を2%ACN及び0.1%FAに再溶解した。

消化した試料を、Magic C18ビーズ(5μm、75μm×11cm、Michrom BioResources,Auburn,CA)を充填したC18 PICOFRIT(登録商標)マイクロキャピラリーカラム(New Objective,Woburn,MA)に加圧負荷した。次にカラムを線形イオントラップ質量分析計(LTQ,ThermoFinnigan,San Jose,CA)に結合した。HPLC勾配は、溶媒Bを調節剤として使用して(溶媒A、2%ACN及び0.1%FA;溶媒B、90%ACN及び0.1%FA)250nl/分の流速で70分間にわたって4〜60%ACNに直線的に上昇した。タンデム質量分析モード(MS/MSと称する)でLTQを使用して質量スペクトルを収集し、このモードでは、各々のMS取得の後に事前のMSスペクトル内の最初の6個の最も強いペプチドイオンの6つのMS/MS取得が続いた。一部の場合は、MS/MS取得の後に事前のMS/MS取得の最初の2個の最も強いペプチドイオンの2つのMS/MS/MS取得が続いた。ペプチド質量を375〜1500のm/z(質量電荷比)範囲を走査することによって記録した。製造者によって提供される取得ソフトウエアの動的排除も、分析する対象ペプチドイオンの数を増加させるために使用した。MS/MSデータを手動で解釈した。

MSレベルで、ペプチドフラグメントの認められたm/z(IL−17Aホモ二量体について[M+3H]3+=919.7;IL−17Fホモ二量体について[M+3H]3+=1196.9;IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体について[M+3H]3+=1138.1又は807.9)は、算定候補ジスルフィド結合ペプチドと一致した。さらに、これらの標的質量のMS/MSデータに従ってペプチド配列が得られ、それらが、図20に示すようなジスルフィド結合形成のためのIL−17A及び/又はIL−17Fに由来する予想されたシステイン(C)含有ペプチドであることが確認された。加えて、MS/MSレベルでの低いフラグメント化のためにIL−17Aホモ二量体ペプチドについてのMSデータを取得した([M+3H]3+=907.7及び[M+3H]3+=843.3)。これは、IL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体がジスルフィド結合による二量体として存在することを明らかにする。結論として、2個のホモ二量体及びヘテロ二量体のジスルフィド結合パターンを解明し、それらは各々の単量体の間のC1及びC4であると一致した。分子内ジスルフィド結合形成についての他のシステイン(C2/C3及びC5/C6)の関与を明らかにするためにこの試験において同様にアプローチを使用した。
(実施例6)
ヒトIL−17Fに対する抗体は霊長動物IL−17F生物活性を阻害する

抗IL−17F抗体が霊長動物IL−17Fと交差反応することができるかどうかを調べるため、様々な濃度のマカクIL−17F馴化培地又は精製ヒトIL−17Fを、100μg/mlの抗IL−17F−01又は抗IL−17F−07抗体の存在下又は不在下でBJ細胞を刺激するために使用した。この実験で使用するためのマカクIL−17F馴化培地は、pCRIIにサブクローニングしたマカクIL−17F cDNA(配列番号40)をHEK293細胞において発現し、マカクIL−17Fホモ二量体を含む馴化培地を採集することによって生産した。ヒト又はマカクIL−17Fのいずれかによる処置の16〜24時間後、処置培地から収集した上清のGRO−α濃度を、実施例5.5で述べたように市販のELISA(R&D,Minneapolis,MN)を用いて測定した。GRO−αの濃度は標準曲線に基づいて測定した。

図21は、マカクIL−17F馴化培地又はヒトIL−17Fタンパク質と共にインキュベートしたBJ細胞によるGRO−α産生上昇を明らかにする。先に述べたように(図2及び図8参照)、ヒトIL−17FはGRO−αレベルを刺激し、この刺激は抗IL−17F−01及び抗IL−17F−07抗体の両方によって阻害される(図21A)。図21Bに示すように、マカクIL−17Fはまた、BJ細胞におけるGRO−αの産生を刺激する。抗IL−17F−01及び抗IL−17F−07抗体はどちらも、GRO−αサイトカインレベルを刺激するマカクIL−17F馴化培地の能力を阻害することができる。それ故、ヒトIL−17Fに対する拮抗性抗体は、霊長動物IL−17F生物活性を阻害するように霊長動物IL−17Fと交差反応することができる。
(実施例7)
ヒト軟骨細胞におけるアグリカナーゼ1レベルのIL−17F刺激は、IL−17F抗体での同時処置によって低減する

IL−17Fが、例えば慢性関節リウマチに伴う炎症応答に関与し得るかどうかを調べるため、非関節炎ヒト軟骨をNational Disease Research Interchange(NDRI,Philadelphia,PA)より入手し、死後48時間以内にプロナーゼ(1mg/ml、37℃で30分間)及びコラゲナーゼP(1mg/ml、37℃で一晩)の連続酵素消化によって軟骨細胞を単離した。単離後、細胞を、2μM L−グルタミン及び10%ウシ胎仔血清(FBS)を含む100U/mlペニシリン/100μg/mlストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/F−12培地に再懸濁した。細胞を1×10細胞/穴で24穴プレートに接種した。72時間後に培地を無血清培地に交換し、軟骨細胞を、抗IL−17F−07又はそのアイソタイプ対照(IgG)の存在下又は不在下に37℃で6時間、ヒトIL−17Fで刺激した。細胞を直ちに、β−メルカプトエタノールを含むRLT緩衝液(Qiagen,Valencia,CA,RNEASY(登録商標)キット)に採集し、RNA単離の準備ができるまで−80℃で保存した。RNEASY(登録商標)ミニキットを用いてRNAを調製し、製造者のプロトコールに従って室温で15分間RNEASY(登録商標)カラムでDNアーゼ処理を実施した。ADAMTS−4(アグリカナーゼ1)mRNA発現レベルをTAQMAN(登録商標)PCR分析(Applied Biosystems,Foster City,CA)によって観測した。簡単に述べると、単離RNA100ngを、Applied Biosystemsより入手したADAMTS−4プローブ/プライマーによるQPCR反応のために使用した。ADAMTS−4の発現を各々の試料についてGAPDHの発現(単離RNA10ngを、Applied Biosystemsより入手したGAPDHプライマーと共に使用した)に基準化した。試料外挿のための標準曲線を、種々の組織のプールから成るUniversal Reference Total RNA(Clontech,Palo Alto,CA)0.16ng〜100ngを用いて作成した。

TAQMAN(登録商標)単位として表わした結果を図22に示す。このように、IL−17F処置はヒト軟骨細胞におけるアグリカナーゼ1の発現を上昇させ、抗IL−17F−07抗体による処置はこの刺激を無効にする。これらのデータは、自己免疫性関節炎、例えば反応性関節炎及び慢性関節リウマチにおいて起こるような、炎症及び関節破壊へのIL−17Fの関与が、抗IL−17F抗体での処置によって軽減され得ることを示唆する。
(実施例8)
BJ細胞における受容体IL−17R及びIL−17RCのsiRNAノックダウンによるIL−17F及びIL−17A生物活性の調節

IL−17R及び/又はIL−17RC転写産物のレベル低下がIL−17F及び/又はIL−17Aの生物活性を低下させるかどうかを調べるための実験を設計した。トランスフェクションの24時間前にBJ細胞を9×10細胞/100μl培地/穴で96穴プレートに接種した。細胞を、0.3μl/穴のDHARMAFECT(登録商標)1(Dharmacon,Lafayette,CO)及び10nM又はそれ以下の個別又はプールsiRNA(配列番号17〜32)を用いて化学合成RNAi試薬(Dharmacon,Lafayette,CO)でトランスフェクトした。siRNAトランスフェクション後、細胞をトランスフェクション複合体と共に18時間インキュベートした。その後トランスフェクション培地を標準培地に交換し、さらに6時間インキュベートした。次に標準培地を、1ng/mlのIL−17A又は50ng/mlのIL−17Fを含む培地150μlと交換した。指定サイトカインと共に16時間インキュベートした後、培養上清を、IL−6、IL−8及びGRO−αのレベルを誘導するIL−17F及び/又はIL−17Aの能力の標準サンドイッチELISAによる分析のために収集した(図2)。hGRO−α、hIL−6及びhIL−8についてのマッチする抗体対をR&D Systems(Minneapolis,MN)より購入した。

siRNA処理後のIL−17R及びIL−17RC受容体レベルの低下を測定するため、TURBOCAPTURE(登録商標)mRNAキット(Qiagen,Valencia,CA)を、製造者の指示に従ってBJ線維芽細胞からmRNAを単離するために使用した。1段階RT qPCR MASTERMIX PLUS(登録商標)(Eurogentec,San Diego,CA)TAQMAN(登録商標)(Applied Biosystems)プロトコールを使用し、それにより試料当り10μlのmRNAを、ABI PRISM(登録商標)7700 DNA Sequence Detector(Applied Biosystems)で実施したTAQMAN(登録商標)PCR反応25μl中で使用した。TAQMAN(登録商標)PCRについての条件は以下の通りであった:MICROAMP OPTICAL(登録商標)キャップで覆ったMICROAMP OPTICAL(登録商標)(Applied Biosystems)96穴プレートで、48℃で30分間、95℃で10分間、次に95℃で15秒間及び60℃で1分間の各々40サイクル。各プレートは、各々の反応混合物に関して試験cDNA鋳型又は鋳型なし対照を3つずつ(triplicates)含んだ。各々のマウス遺伝子についての発現をヒトβ2ミクログロブリン遺伝子発現に基準化した。IL−17R及びIL−17RCについてのTAQMAN(登録商標)遺伝子発現アッセイプローブ−プライマーセットをApplied Biosystemsより入手した。

図23に示す結果は、BJ培養物のsiRNA処理後のGRO−αレベルの低下パーセント(β2ミクログロブリンに基準化)を表わす。BJ培養物のsiRNA処理は、IL−17R及びIL−17RC転写レベルを約80%低下させた(図23A及び図23B−“Taqman”)。IL−17RとIL−17RCの両方のレベル低下は、IL−17A及びIL−17FがGRO−αレベルを刺激する能力を低下させたが(図23A及び図23B)、IL−17RCレベルの低下(図23B)は、IL−17Rレベルの低下(図23A)よりもIL−17A及びIL−17Fの両方の生物活性により著明な作用を及ぼした。興味深いことに、IL−17RCの低下は、GRO−αレベルを刺激するIL−17Aの能力により大きな作用を及ぼした(図23B)。IL−17R及びIL−17RCを標的するsiRNAの好ましい例を図23Cに開示する(配列番号17〜32も参照のこと)。これらのデータは、IL−17AとIL−17Fの両方がIL−17R及びIL−17RCを通してシグナル伝達できること、及びIL−17RCはGRO−α刺激に関連する両方の分子にとって好ましい受容体であると考えられることを示唆する。
(実施例9)
IL−17A及びIL−17Fは、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎を有するヒト患者からの罹患組織において上方調節される

乾癬組織生検試料を、Wyethが主催する臨床試験No.3067K6−207(活動性乾癬を有する患者における組換えヒトインターロイキン11、rhIL−11の無作為化・二重盲検・プラセボ対照・探索的薬理ゲノム試験)に登録された患者から収集した。48名の患者からの基線(2回目の訪問)乾癬病変及び非病変皮膚生検を収集直後に液体窒素中で瞬間凍結し、Wyeth Clinical Pharmacogenomics Laboratory in Andover,MAに輸送した。

クローン病試料を、Wyethが主催する臨床試験No.3067K6−204(活動性クローン病を有する患者の治療のための経口投与組換えヒトインターロイキン11(RhIL−11)の多施設・無作為化・二重盲検・プラセボ対照・安全性及び探索的薬理ゲノム試験)に登録された患者から収集し、潰瘍性大腸炎試料を、臨床試験No.3067K5−114(軽度から中等度の左側潰瘍性大腸炎を有する患者における経口投与組換えヒトインターロイキン11(RhIL−11)の多施設・無作為化・二重盲検・プラセボ対照・用量漸増・安全性及び探索的薬理ゲノム試験)に登録された患者から収集した。No.3067K6−204患者(16名の患者)からの基線(2回目の訪問)対合関与(baseline paired involved)及び非関与組織生検、及びNo.3067K5−114患者(12名の患者)からのS状結腸及び左結腸の同じ解剖学的領域からの基線(1回目の訪問)対合組織生検を収集直後に液体窒素中で瞬間凍結し、Wyeth Clinical Pharmacogenomics Laboratory in Andover,MAに輸送した。

ポリトロンを用いて組織を均質化し、RNEASY(登録商標) Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用いて溶解産物の上清からRNAを単離して、DNアーゼ(Qiagen RNase−free DNaseキット)で処理した。DNアーゼ処理したRNA試料を、Phase Lock Gelカラム(Brinkman,Westbury NY)を用いてさらに精製し、フェノール:クロロホルム:IAA(イソアミルアルコール)抽出して(Ambion,Austin,TX)、RNEASY(登録商標)ミニカラムを用いて濃縮した。SPECTRAMAX(登録商標)(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を用いてRNAを定量し、RNAの品質をAgilent Bioanalyzerゲル(2100型;Agilent Technologies,Palo Alto,CA)によって評価した。上記試料からの全RNA2μgのcDNAへの変換を、Applied Biosystems High Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems)を用いて製造者の指示に従って実施した。完了した反応を含むプレートを−20℃(短期間)又は−80℃(長期間)の温度で保存した。

Applied BiosystemのAssays−on−Demand(AOD)遺伝子特異的プライマー−プローブ対をあらかじめ有効性確認し、品質管理試験を実施して、ABI PRISM(登録商標)配列検出システムでの使用のために最適化した(全てApplied Biosystemsより)。製造者のAODプロトコールに従って、IL−17F又はIL−17Aプライマーをを含むTAQMAN(登録商標)Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)を使用してマスターミックスを調製し、最終容量50μl/穴になるように96穴プレートに等分した。連続希釈標準品及びcDNA試料(50ng/穴)のための2つの(duplicate)ウエルを、50℃で2分間、95℃で10分間、95℃で15秒間(40サイクル)及び60℃で1分間の伸長の汎用熱サイクリング条件を用いてABI PRISM(登録商標)7700Sequence Detector(Sequence Detectorソフトウエアバージョン1.7)で検定した。

IL−17F及びIL−17AのRNA転写レベルの相対的定量を、ABI PRISM(登録商標)7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems)に関して述べられている製造者のガイドラインに従って実施した。詳細には、標的の標準物質及び内部対照についての標準曲線を算定し、標準曲線の勾配とy切片を用いて標的と内部対照に関する入力値を算定して、標的入力値を内部対照に基準化した。標準物質50ngをキャリブレーターとして使用してIL−17F及びIL−17A発現の倍率変化を算定し、キャリブレーターに倍率変化を乗じて、その後平均することにより、試料の相対濃度を得た。

標準曲線法を利用するため、TAQMAN(登録商標)AOD(Applied Biosystems)を用いて標的遺伝子を発現する組織を経験的に決定した。10以上の候補標的陽性組織からの全RNAをWyeth(Cambridge/Andover)及び外部販売元より入手した。単一RNA試料からの多数の2μgアリコートをcDNAに変換し(上述したように)、プールして、−80℃でアリコートとして保存し、TAQMAN(登録商標)(Applied Biosystems)によって標的遺伝子の発現に関して検定した。≧35の閾値サイクル数(Ct)を検出限界以下とみなした。標準曲線の作成のために、ゴールはcDNA 100ngに関して18〜25のCt値を達成することであった;これは適切な標準曲線ダイナミックレンジを可能にした。これらの必要条件を満たす陽性対照組織の試料を、各々のアッセイについての標準曲線を作成するために使用した。標準曲線は、100ng/穴から1.5ng/穴までの全cDNAの2倍連続希釈から成った。標準曲線をアッセイごとに各々のプレートに関して実施し、試料の定量及びアッセイ成績の観測のために使用した。96穴プレートの空間的制約のため、試料を移動させるときは25ng及び3ngの標準曲線希釈点を除外した。プレート間のCV%は、乾癬試料については<3%、クローン病及び潰瘍性大腸炎試料については<5%であった。

全ての試料(すなわち処置及び未処置、病変及び非病変等)において同様のレベルで発現される遺伝子を、相対標準曲線法における内部対照として使用するために選択した。候補内部対照のリストから、ZNF592(GenBankアクセッション番号NM_014630)と称される遺伝子が許容される標準曲線を生成し、病変組織と非病変組織及び関与組織と非関与組織において有意に異ならないと判定した(乾癬試料についてはp<0.05、クローン病及び潰瘍性大腸炎試料についてはp<0.09)。相対濃度値を決定するときに全ての試験試料をZNF592レベルに基準化した。

対応あるスチューデントt検定(各々の患者からの対応ある病変試料と非病変試料又は関与組織と非関与組織)を、IL−17F及びIL−17A発現レベルと病変(乾癬)又は炎症表現型(クローン病又は潰瘍性大腸炎)との間の結びつきの有意性を評価するために使用した。乾癬試験についての倍率変化を、病変相対濃度値を非病変相対濃度値で除することによって算定した。クローン病及び潰瘍性大腸炎(IBD)試験についての倍率変化は、関与相対濃度値を非関与相対濃度値で除することによって得た。IL−17F又はIL−17Aレベルに関する全患者からの倍率変化を平均することによって要約倍率変化を算定した。

これらの試験の結果を図24及び図25に示す。図24に示すように、IL−17F及びIL−17A発現レベルの両方が罹患患者からの病変組織において有意に上昇しており、IL−17F及びIL−17Aがインビボで乾癬に関与することを示唆する。図25に示すように、IL−17A及びIL−17Fの両方が、クローン病に罹患している患者からの関与組織並びに潰瘍性大腸炎に罹患している患者からの関与組織において上昇している。クローン病と潰瘍性大腸炎を有する患者の間でのかなりの不均質性は、比較的小さい標本サイズと合わせて、IL−17A及びIL−17Fと関与表現型との統計的に有意の結びつきを特定することを抑制した(mitigated)。しかし、クラスター化ツールは、IL−17AとIL−17Fの両方がクローン病試料セットにおいて関与表現型と良好に相関することを示した(r=0.65)(データは示していない)。これらのデータは、関与組織におけるIL−17A及びIL−17Fのレベル上昇が、インビボでIBDに関連する炎症状態に役割を果たし得ることを示唆する。
(実施例10)
オボアルブミンで免疫したマウスからのLN細胞はIL−17Fを生産する

8週齢のC57BL/6マウスを、側腹部において、完全フロイントアジュバントに乳化したオボアルブミンタンパク質100μgで免疫した。7日後、鼠径リンパ節を採取した。リンパ節を分離し、細胞をホルボールエステル12−テトラデカノイルホルボール−13アセテート50ng、1μg/mlイオノマイシン及び1μg/ml GOLGIPLUG(商標)で12時間再刺激した。その後細胞を採取し、抗マウスCD4 PerCP Cy5.5(Pharmagen,San Diego,CA)を用いて表面CD4に関して染色した。細胞を固定し、CYTOFIX/CYTOPERM(商標)(BD Biosciences,San.Diego,CA)で透過性を上げて、その後細胞を4μg/mlラットIgG1 ALEXA FLUOR(登録商標)647複合体(Invitrogen,Carlsbad,CA)又は4μg/mlラット抗IL−17F(クローン15−1)ALEXA FLUOR(登録商標)647(Invitrogen,Carlsbad,CA)で30分間染色した。次に細胞をPERM/WASH(商標)(BD Biosciences,San.Diego,CA)で2回洗い、FACSCALIBUR(商標)(BD Biosciences,San.Diego,CA)を用いて分析した。ラット抗IL−17F(クローン15−1)ALEXA FLUOR(登録商標)647(Invitrogen,Carlsbad,CA)は、InvitrogenからのALEXA FLUOR(登録商標)647複合キットを用いて作製した。結果を図26に示す。このように、オボアルブミン免疫マウスのリンパ節からのインビボCD4+T細胞はIL−17Fタンパク質を生産する。
(実施例11)
結論及び考察

いくつかの所見の中で、これらのデータは、IL−21及びIL−23がTCR/CD28共刺激時にIL−17A及びIL−17Fを誘導すること、及びIL−23とIL−21はIL−17A及びIL−17F産生のために共刺激と相乗作用することを指し示す。IL−23とIL−21はIL−17誘導において等しく有効である。これらのデータは、IL−17A、及び特にIL−17F(IL−17Aと比較して10−20倍高いレベルで生産されるので)は、IL−21に帰せられるプロ炎症作用の一部を媒介し得ること、及びIL−17F(IL−17Fホモ二量体又はIL−17Fへテロ二量体として)の阻害は、IL−21シグナル伝達をブロックするのと類似の治療作用を有し得ること(例えば米国特許出願第60/599,086号及び同第60/639,176号参照)を示唆する。IL−17Fシグナル伝達とIL−21シグナル伝達の作用の類似性は、IL−17Fシグナル伝達の阻害がIL−21シグナル伝達を阻害するのと同等の治療的価値があると考えられるという強力な結論を導く。加えて、上記結果は、初めて、T細胞がIL−17A及びIL−17Fホモ二量体のほかにIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を発現することを示す。結果はまた、そのようなサイトカインをそれらの天然及び組換え形態で単離し、精製し得ることを示す。本明細書で示すデータはまた、IL−17FとIL−17R及びIL−17RCを標的するsiRNAから成る融合タンパク質、抗IL−17F抗体がIL−17F生物活性を低下させることを示す。さらに、上記結果は、IL−17F処置がヒト軟骨細胞におけるアグリカナーゼ発現を上昇させ、それが抗IL−17F抗体によって低減され得ること、及びIL−17FとIL−17Aがヒト生検からの乾癬病巣及びIBDに関与する組織において上昇することを示す。

IL−17A及びIL−17Fは、活性化T細胞によって産生される新規プロ炎症性サイトカインである。これらのサイトカインは、システインノットモチーフの構造的特徴を示す保存されたシステインを含む、高度のアミノ酸同一性を共有する。両サイトカインは、受容体鎖を共有し、類似の生物学的機能を示すことが提起された。IL−17サイトカインファミリーの成員は、異常免疫応答によって媒介される疾患、例えば慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患(IBD)及び喘息に関係付けられてきた。上記に列挙した類似性の故に、活性化時にヒトT細胞によって産生されるIL−17AとIL−17Fを特性決定した。CD4+T細胞を、CD28共刺激、γ共通サイトカイン(IL−2、IL−4、IL−7、IL−15、IL−21)又はIL−23の存在下又は不在下に抗CD3で活性化した。IL−17A及びIL−17Fの最適産生は、TCR並びにCD28共刺激を必要とした。加えて、CD28とIL−21はIL−17A及びIL−17F産生において相乗作用的に働き、IL−17AとIL−17FがIL−21シグナル伝達に帰せられるプロ炎症作用を媒介し得ることを示唆する。全ての活性化条件下で、IL−17Fのタンパク質レベルはIL−17Aに関して得られたものを10〜20倍上回った。興味深いことに、IL−17Aホモ二量体及びIL−17Fホモ二量体に加えて、T細胞はまた、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体も生産した。これらの所見は、これらのサイトカインの多数の形態がインビボで存在し、それらの各々の形態が異なる生物学的機能を説明すること、例えばIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体は炎症性疾患の治療における新しいサイトカイン標的を構成し得ることを示唆する。

IL−17A及び/又はIL−17Fの様々な濃度(ng/ml)(x軸)で培養した(A)一次ヒト軟骨細胞又は(B)一次ブタ軟骨細胞における、NF−κBを介したレポータートランス活性化(相対的ルシフェラーゼ活性;y軸)を図1に示す。 培地中(対照;□)又は20ng/ml IL−17Fの存在下で(IL−17F;■)培養したヒト線維芽細胞様滑膜細胞から収集した上清における、2名の患者(P1、P2;x軸)の各々からのサイトカイン(IL−6、IL−8、MCP−1又はGRO−α;x軸)の濃度(pg/ml;y軸)を図2に示す。 図3は、培地中で(0ng/ml IL−17F)、又は1ng/ml、3.3ng/ml、10ng/ml又は30ng/ml IL−17Fと共に培養した一次マウス肺線維芽細胞の培養物から収集した上清中の炎症性サイトカイン(IL−6、JE(CCL2)、KC;x軸)の濃度(pg/ml;y軸)を示す。 図4は、ELISAで測定した、(A)IL−17R−IgG(上のパネル)又は(B)IL−17RC−IgG(下のパネル)への漸増濃度のヒトIL−17F(左のパネル)又はヒトIL−17A(右のパネル)(x軸)の結合(OD450nm;y軸)を示す。また、各々の受容体/サイトカイン相互作用についてのEC50値も示す。 (A)0.5ng/ml IL−17A(左のパネル)又は(B)20ng/mlIL−17F(右のパネル)の存在下に、単独で(培地;−)又は漸増濃度(μg/ml;x軸)のIL−17R−IgG融合タンパク質(h17R.Fc;●)、IL−17RC−IgG融合タンパク質(h17RH2.Fc;■)、対照IgGタンパク質(hIgG1;▲)、抗IL−17R抗体(ahIL17R;□)又は対照抗体(ヤギIgG;△)と共に培養したヒト線維芽細胞から収集した上清中のGRO−αの濃度(pg/ml;y軸)を図5に示す。 図6は、以下の6個の抗IL−17F抗体:抗IL−17F−01(□)、抗IL−17F−02(−)、抗IL−17F−03(▲)、抗IL−17F−05(◆)、抗IL−17F−06(●)及び抗IL−17F−07(△)の1個の漸増濃度(μg/ml;x軸)の存在下でIL−17RへのIL−17Fの結合を阻害する抗ヒトIL−17F抗体の能力(OD450nm;y軸)を示す。 図7は、以下の6個の抗IL−17F抗体:抗IL−17F−01(□)、抗IL−17F−02(−)、抗IL−17F−03(▲)、抗IL−17F−05(◆)、抗IL−17F−06(●)及び抗IL−17F−07(△)の各々の漸増濃度(μg/ml;x軸)の存在下でIL−17RCへのIL−17Fの結合を阻害する抗ヒトIL−17F抗体の能力(OD450nm;y軸)を示す。 20ng/ml IL−17F並びに漸増濃度(μg/ml;x軸)の抗IL−17F−01(aIL−17F−01)、抗IL−17F−02(aIL−17F−02)又は抗IL−17F−03(aIL−17F−03)(左のパネル)及び抗IL−17F−05(aIL−17F−05))、抗IL−17F−06(aIL−17F−06)又は抗IL−17F−07(aIL−17F−07)又は対照mIgG1抗体(右のパネル)中で培養したヒト線維芽細胞から収集した上清中のGRO−αの濃度(pg/ml;y軸)を図8に示す。 培地単独(なし)、100ng/ml IL−17A(IL−17A(100ng/ml))、IL−17R−IgG融合タンパク質の存在下での100ng/ml IL−17A(IL−17A+IL17R/Fc)、抗IL−17F抗体の存在下での100ng/ml IL−17A(IL−17A+抗IL17F)、対照マウスIgGの存在下での100ng/ml IL−17A(IL−17A+マウスIgG)、500ng/ml IL−17F(IL−17F(500ng/ml))、IL−17R−IgG融合タンパク質の存在下での500ng/ml IL−17F(IL−17F+IL17R/Fc)、抗IL−17F抗体の存在下での500ng/ml IL−17F(IL−17F+抗IL17F)、対照マウスIgGの存在下での500ng/ml IL−17F(IL−17F+マウスIgG)中で培養したブタ一次軟骨細胞における、NF−κBを介したレポータートランス活性化(相対的ルシフェラーゼ活性;y軸)を図9に示す。 20ng/ml IL−17F、アイソタイプ対照抗体(アイソタイプAb)、抗IL−17F−01抗体又は抗IL−17F−07抗体の存在下で培養したヒト線維芽細胞様滑膜細胞から収集した上清における、2名の患者(P1、P2;x軸)の各々からのサイトカイン(IL−6、IL−8又はGRO−α;x軸)の濃度(pg/ml;y軸)を図10に示す。 図11は、(A)IL−17Aタンパク質(IL−17Aホモ二量体及びIL−17Aヘテロ二量体を含む)、(B)IL−17Fタンパク質(IL−17Fホモ二量体及びIL−17Fヘテロ二量体を含む)又は(C)IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出に特異的なELISA形式を用いて、IL−17Aホモ二量体(IL−17A/A;x軸)、IL−17Fホモ二量体(IL−17F/F;x軸)又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体(IL−17A/F;x軸)の検出(OD450nm;y軸)を示す。 図11は、(A)IL−17Aタンパク質(IL−17Aホモ二量体及びIL−17Aヘテロ二量体を含む)、(B)IL−17Fタンパク質(IL−17Fホモ二量体及びIL−17Fヘテロ二量体を含む)又は(C)IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出に特異的なELISA形式を用いて、IL−17Aホモ二量体(IL−17A/A;x軸)、IL−17Fホモ二量体(IL−17F/F;x軸)又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体(IL−17A/F;x軸)の検出(OD450nm;y軸)を示す。 図12は、ビーズ結合CD3抗体、漸増濃度の抗CD28抗体の存在下で(抗−CD28(ng/ml);x軸)、及びIL−21とIL−23の不在下(□)、又はIL−21の存在下(■)又はIL−23の存在下で一次活性化を受けるT細胞から単離した培地中の(A)IL−17A又は(B)IL−17Fの濃度(産生されるサイトカイン(pg/ml;y軸))を示す。 図13は、以下の刺激条件(x軸):IL−23単独(IL−23);IL−21単独(IL−21);ビーズ結合抗CD3抗体及び抗CD28抗体(CD3/CD28);IL23、ビーズ結合抗CD3抗体及び抗CD28抗体(IL−23/CD3/CD28);IL−21、ビーズ結合抗CD3抗体及び抗CD28抗体(IL−21/CD3/CD28);又は培地、の下で二次活性化を受けるT細胞から単離した培地中のIL−17A(■)又はIL−17F(□)の濃度(産生されるサイトカイン(pg/ml;y軸)を示す。 図14は、(A)IL−17Aタンパク質(IL−17Aホモ二量体及びIL−17Aヘテロ二量体を含む)、(B)IL−17Fタンパク質(IL−17Fホモ二量体及びIL−17Fヘテロ二量体を含む)又は(C)IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出に特異的なELISA形式を用いて、一次活性化(CM1)又は再刺激(CM2)(x軸)に供したT細胞から得た非希釈(原液)又は希釈(1:10)培地中のIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出(OD450nm;y軸)を示す。 図14は、(A)IL−17Aタンパク質(IL−17Aホモ二量体及びIL−17Aヘテロ二量体を含む)、(B)IL−17Fタンパク質(IL−17Fホモ二量体及びIL−17Fヘテロ二量体を含む)又は(C)IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出に特異的なELISA形式を用いて、一次活性化(CM1)又は再刺激(CM2)(x軸)に供したT細胞から得た非希釈(原液)又は希釈(1:10)培地中のIL−17Aホモ二量体、IL−17Fホモ二量体又はIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の検出(OD450nm;y軸)を示す。 二次活性化を受けるT細胞から得た馴化培地500μlから抗ヒトIL−17F−01免疫沈降物を検出するために、ポリクローナルウサギ抗ヒトIL−17F抗体で実施したウエスタンブロット分析を図15に示す。対照は、実施例5.3で述べるように作製したIL−17Fホモ二量体(2番目のレーン)、又はR&D Systems(Minneapolis,MN)から購入したIL−17Aホモ二量体(5番目のレーン)から成る。分子量標準を最初のレーンに示す。IL−17A及びIL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の位置を矢印で示す。 図16は、二次活性化を受けるT細胞から得た馴化培地500μlから抗ヒトIL−17A−02免疫沈降物を検出するために、ビオチン複合ヤギ抗ヒトIL−17A抗体で実施したウエスタンブロット分析の結果を示す。対照(レーン2)は、実施例5.3で述べるように作製したIL−17Fホモ二量体から成る。分子量標準をレーン1に示す。IL−17A及びIL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の位置を矢印で示す。 図17Aは、抗IL−17F抗体で免疫プローブした(immunoprobed)抗IL−17F免疫沈降物(レーン2〜7)又は抗IL−17A免疫沈降物(レーン8〜10)を示す。免疫沈降物は、IL−17A(レーン2及び8)、IL−17F(レーン3及び10)、IL−17AとIL−17F(レーン4及び9)、精製IL−17Aホモ二量体(レーン5)又は精製IL−17Fホモ二量体(レーン6及び7)を過剰発現するCOS細胞の馴化培地(CM)から得た。対照(「A/A精製」、レーン5及び「F/F精製」、レーン6〜7)は、実施例5.4で述べる精製組換えIL−17A及びIL−17Fホモ二量体から成る。分子量標準をレーン1に示す。IL−17A及びIL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の位置を矢印で示す。 図17Bは、抗IL−17A抗体で免疫プローブした抗IL−17A免疫沈降物(レーン2〜4)又は抗IL−17F免疫沈降物(レーン5〜7)を示す。免疫沈降物は、IL−17A(レーン3及び5)、IL−17F(レーン2及び7)又はIL−17AとIL−17F(レーン4及び6)を過剰発現するCOS細胞の馴化培地(CM)から得た。分子量標準をレーン1に示す。IL−17A及びIL−17Fホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の位置を矢印で示す。 図18は、IL−17A及びIL−17Fホモ二量体を実質的に含まない組換えIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を精製する方法を示す一覧図である。この方法は、2つの異なるアフィニティータグを有するIL−17A及びIL−17Fを使用して、IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体を単離するために2つの別個の連続的なアフィニティーカラムを用いる。 図19Aは、組換え精製IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体(X)が、IL−17A(◆)及びIL−17F(□)ホモ二量体と同様に、BJ細胞培養の培地中でGRO−αレベル(pg/ml)を刺激することを示す。 図19Bは、抗IL−17A抗体(■)又は抗IL−17F抗体と組み合わせた抗IL−17A抗体(△)によるBJ培養物の共処理は、IL−17F/IL−17Aヘテロ二量体のGRO−αレベルの刺激を無効にするが、IL−17F抗体単独(□)では、上記刺激を無効にしないことを示す。対照は、IL−17F及びIL−17A抗体の両方を欠く培地を与えた培養物(X)から成った。 図20は、IL−17Fホモ二量体、IL−17Aホモ二量体及びIL−17F/IL−17Aヘテロ二量体の消化によって作製されるトリプシンペプチド質量に関するMALDI−TOF型質量分析データを要約した表である。表の最初の欄は、分析したペプチドフラグメントの由来を示し、2番目の欄(構造)はペプチドフラグメント配列を示し、3番目の欄(MW Cal)はフラグメントの算定分子量を示し、4番目の欄はフラグメントの算定質量電荷比(m/z値)(算定)を示し、5番目の欄は、質量分析によって測定した実際の質量電荷比(m/z値)(所見)を示す。 図21は、抗ヒトIL−17F抗体が霊長動物IL−17Fの生物活性を部分的に阻害できることを示す。図21Aは、ヒト又は霊長動物(マカク)IL−17Fで刺激したBJ細胞が、漸増レベルのIL−17Fに応答してGRO−αの高レベルを示すことを明らかにする。図21Aは、抗IL−17F−01(□)及び抗IL−17F−07(X)抗体が、GRO−αレベルを刺激するヒトIL−17Fの能力(◆)を低下させることを示す。 図21は、抗ヒトIL−17F抗体が霊長動物IL−17Fの生物活性を部分的に阻害できることを示す。21Bは、ヒト又は霊長動物(マカク)IL−17Fで刺激したBJ細胞が、漸増レベルのIL−17Fに応答してGRO−αの高レベルを示すことを明らかにする。図21Bは、抗IL−17F−01(□)及び抗IL−17F−07(X)抗体が、ヒトIL−17F生物活性を低下させるよりは小さい程度であるが、GRO−αレベルを刺激する霊長動物IL−17Fの能力(◆)を低下させることを示す。 図22は、IL−17F処置が、ヒトドナーから得た軟骨細胞におけるADAMTS−4(アグリカナーゼ1)の発現を上昇させること、及び抗IL−17F抗体による処置がこの刺激を無効にすることを示す。培養した軟骨細胞を250ng/ml IL−17F、250ng/ml IL−17F及び25μg/ml抗IL−17F、25μg/ml抗IL−17F、250ng/ml IL−17F及び25μg/ml対照IgG1、又は25μg/ml対照IgG1(x軸)で処置し、アグリカナーゼ1の転写レベルをリアルタイムPCRによって測定した(TAQMAN(登録商標)単位として表わした;y軸)。GAPDH発現レベルをノーマライザーとして使用した。 図23は、IL−17R及びIL−17RCの転写産物に対するsiRNAによるBJ細胞の処置が、GRO−αレベルを上昇させるIL−17F及びIL−17Aの能力を低下させることを示す。図23A:Taqman=IL−17Rに対するsiRNAで処置した細胞におけるIL−17R転写産物の低下%;IL−17F=IL−17Rに対するsiRNAで処置した細胞におけるGRO−αレベルを刺激するIL−17Fの能力の低下%;IL−17A=IL−17Rに対するsiRNAで処置した細胞におけるGRO−αレベルを刺激するIL−17Aの能力の低下%。 図23は、IL−17R及びIL−17RCの転写産物に対するsiRNAによるBJ細胞の処置が、GRO−αレベルを上昇させるIL−17F及びIL−17Aの能力を低下させることを示す。図23Bは、IL−17RCの転写産物に対するsiRNAによるBJ細胞の処置が、GRO−αレベルを上昇させるIL−17F及びIL−17Aの能力を低下させることを示す。Taqman=IL−17RCに対するsiRNAで処置した細胞におけるIL−17RC転写産物の低下%;IL−17F=IL−17RCに対するsiRNAで処置した細胞におけるGRO−αレベルを刺激するIL−17Fの能力の低下%;IL−17A=IL−17RCに対するsiRNAで処置した細胞におけるGRO−αレベルを刺激するIL−17Aの能力の低下%。 図23は、IL−17R及びIL−17RCの転写産物に対するsiRNAによるBJ細胞の処置が、GRO−αレベルを上昇させるIL−17F及びIL−17Aの能力を低下させることを示す。図23Cは、本発明に関連するmRNAポリヌクレオチド(すなわちIL−17R及びIL−17RC)を標的する本発明のいくつかのsiRNA分子(配列番号17〜32)を開示する。 図24は、乾癬に罹患している患者からの48対の組織生検試料におけるIL−17F及びIL−17A転写産物発現の平均倍率変化(病変/非病変(非罹患)組織)を示す。IL−17A及びIL−17Fの両方の転写レベルが、非罹患組織に比べて乾癬病変組織では上昇する。対応あるt検定からのP値は以下の通りである:IL−17A p=2.8×10−13、IL−17F p=1.1×10−9 図25は、潰瘍性大腸炎(UC)(□)(12対)又はクローン病(CD)(■)(16対)に罹患している患者からの対の組織生検試料におけるIL−17F及びIL−17A転写産物発現の平均倍率変化(関連/非関連組織)を示す。IL−17A及びIL−17Fの両方の転写レベルが、両方のセットのIBD試料において非関連組織に比べて罹患組織では上昇する。対応あるt検定からのP値は以下の通りである:IL−17A(UC)、p=0.309;IL−17A(CD)、p=0.069;IL−17F(UC)、p=0.406;IL−17F(CD)、p=0.206。 図26は、IL−17Fについての細胞内サイトカイン染色を示す。IL−17Fについての染色を、完全フロイントアジュバントに乳化したオボアルブミン100μgで免疫したC57BL/6マウスからのLN(リンパ節)細胞に関して実施した。細胞をCD4に関して表面染色し、固定して、透過性を上げ、抗IgG1アイソタイプ対照又はラット抗マウスIL−17F(クローン15−1)で染色した。数字は陽性細胞のパーセントを表わす。

Claims (75)

  1. IL−17Fシグナル伝達に拮抗することができる試験化合物をスクリーニングする方法であって、
    IL−17F及びIL−17Rを含む試料を化合物と接触させる工程;及び
    試料中のIL−17FとIL−17Rとの相互作用が、化合物と接触していない試料中のIL−17FとIL−17Rとの相互作用に比べて低下しているかどうかを判定する工程を含み、
    化合物と接触させた試料中のIL−17FとIL−17Rとの相互作用のそのような低下が、その化合物を、IL−17FとIL−17Rとの相互作用を阻害し、IL−17Fシグナル伝達に拮抗することができるものとして特定する、前記方法。
  2. IL−17Fシグナル伝達に拮抗することができる試験化合物をスクリーニングする方法であって、
    IL−17F及びIL−17RCを含む試料を化合物と接触させる工程;及び
    試料中のIL−17FとIL−17RCとの相互作用が、化合物と接触していない試料中のIL−17FとIL−17RCとの相互作用に比べて低下しているかどうかを判定する工程を含み、
    化合物と接触させた試料中のIL−17FとIL−17RCとの相互作用の低下が、その化合物を、IL−17FとIL−17RCとの相互作用を阻害し、IL−17Fシグナル伝達に拮抗することができるものとして特定する、前記方法。
  3. 被験者においてIL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患を診断する方法であって、
    被験者からの試料においてIL−17Fシグナル伝達遺伝子産物の試験量を検出する工程;及び
    前記試験量を、対照試料中の同じIL−17Fシグナル伝達遺伝子産物の正常量と比較する工程を含み、
    正常量を有意に上回る試験量が、IL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患の診断における陽性指標を提供する、前記方法。
  4. 疾患が、自己免疫疾患、呼吸器疾患及び炎症性腸疾患から成る群より選択される、請求項3に記載の方法。
  5. IL−17Fシグナル伝達遺伝子産物がIL−17F遺伝子産物である、請求項4に記載の方法。
  6. IL−17Fシグナル伝達遺伝子産物がIL−17R遺伝子産物である、請求項4に記載の方法。
  7. IL−17Fシグナル伝達遺伝子産物がIL−17RC遺伝子産物である、請求項4に記載の方法。
  8. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質の治療有効量を被験者に投与することを含む、IL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患の危険性がある又は前記疾患と診断された被験者を治療する方法。
  9. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17F阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、阻害性抗IL−17F抗体、阻害性抗IL−17R抗体、阻害性抗IL−17RC抗体及び拮抗性低分子から成る群より選択される、請求項8に記載の方法。
  10. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17R阻害性ポリヌクレオチドである、請求項9に記載の方法。
  11. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチドである、請求項9に記載の方法。
  12. 阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号17〜24に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるsiRNAである、請求項10に記載の方法。
  13. 阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号25〜32に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるsiRNAである、請求項11に記載の方法。
  14. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチドである、請求項9に記載の方法。
  15. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチドである、請求項9に記載の方法。
  16. 可溶性ポリペプチドが、配列番号34に示すアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の方法。
  17. 可溶性ポリペプチドが、配列番号35に示すアミノ酸配列を有する、請求項15に記載の方法。
  18. IL−17F阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号1に示すヌクレオチド配列、又は配列番号1に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号1のフラグメント、又はそれらのRNA等価物を含み、かつ、細胞における阻害性ポリヌクレオチドの発現がIL−17Fの発現低下を生じさせる、請求項9に記載の方法。
  19. IL−17R阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号5に示すヌクレオチド配列、又は配列番号5に示すヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号5のフラグメント、又はそれらのRNA等価物を含み、かつ、細胞における阻害性ポリヌクレオチドの発現がIL−17Rの発現低下を生じさせる、請求項9に記載の方法。
  20. IL−17RC阻害性ポリヌクレオチドが、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13及び配列番号15に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列、又は配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13及び配列番号15に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13及び配列番号15に示すヌクレオチド配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメント、又はそれらのRNA等価物を含み、かつ、細胞における阻害性ポリヌクレオチドの発現がIL−17RCの発現低下を生じさせる、請求項9に記載の方法。
  21. IL−17Fシグナル伝達上昇に関連する疾患が炎症性疾患である、請求項8に記載の方法。
  22. 炎症性疾患が、自己免疫疾患、呼吸器疾患及び炎症性腸疾患から成る群より選択される、請求項21に記載の方法。
  23. 炎症性疾患が自己免疫疾患であり、自己免疫疾患が、関節炎、乾癬、全身性エリテマトーデス及び多発性硬化症から成る群より選択される、請求項22に記載の方法。
  24. 自己免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項23に記載の方法。
  25. 炎症性疾患が呼吸器疾患であり、呼吸器疾患が嚢胞性線維症である、請求項22に記載の方法。
  26. 炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項22に記載の方法。
  27. 少なくとも1つの付加的な治療薬の治療有効量を被験者に投与することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
  28. 前記少なくとも1つの付加的な治療薬が、サイトカイン阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症薬、代謝阻害物質、酵素阻害剤、細胞傷害性物質及び細胞増殖抑制物質から成る群より選択される、請求項27に記載の方法。
  29. 前記少なくとも1つの付加的な治療薬が、TNF拮抗物質、抗TNF薬、IL−12拮抗物質、IL−15拮抗物質、IL−17拮抗物質、IL−18拮抗物質、IL−22拮抗物質、T細胞除去剤、B細胞除去剤、シクロスポリン、FK−506、CCI−779、エタネルセプト、インフリキシマブ、リツキシマブ、アダリムマブ、プレドニゾロン、アザチオプリン、金、スルファサラジン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ミノサイクリン、アナキンラ、アバタセプト、メトトレキサート、レフルノミド、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、Cox−2阻害剤、cPLA2阻害剤、NSAID、p38阻害剤、B7.1、B7.2、ICOSL、ICOS及び/又はCD28の拮抗物質、及びCTLA4の作動物質から成る群より選択される、請求項27に記載の方法。
  30. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を細胞集団又は被験者に投与することを含む、細胞集団又は被験者においてNF−κB応答性プロモーターを活性化するNF−κBの能力を阻害する方法。
  31. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17F阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、阻害性抗IL−17F抗体、阻害性抗IL−17R抗体、阻害性抗IL−17RC抗体及び拮抗性低分子から成る群より選択される、請求項30に記載の方法。
  32. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質を細胞集団又は被験者に投与することを含む、細胞集団又は被験者においてIL−17F生物活性を阻害する方法。
  33. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17F阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、阻害性抗IL−17F抗体、阻害性抗IL−17R抗体、阻害性抗IL−17RC抗体及び拮抗性低分子から成る群より選択される、請求項32に記載の方法。
  34. IL−17F生物活性が、好中球分化、好中球動員及びサイトカイン誘導から成る群より選択される、請求項32に記載の方法。
  35. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質及び製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
  36. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17F阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、阻害性抗IL−17F抗体、阻害性抗IL−17R抗体、阻害性抗IL−17RC抗体及び拮抗性低分子から成る群より選択される、請求項35に記載の医薬組成物。
  37. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質、及び自己抗原、アレルゲン、同種抗原及びそれらのフラグメントから成る群より選択される抗原を含むワクチンアジュバント。
  38. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17F阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R阻害性ポリヌクレオチド、IL−17RC阻害性ポリヌクレオチド、IL−17R又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、IL−17RC又はそのIL−17F結合フラグメントを含む可溶性ポリペプチド、阻害性抗IL−17F抗体、阻害性抗IL−17R抗体、阻害性抗IL−17RC抗体及び拮抗性低分子から成る群より選択される、請求項37に記載のワクチンアジュバント。
  39. 配列番号6に示すアミノ酸配列に特異的に結合することができる単離抗体。
  40. 配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13及び配列番号15に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列に特異的に結合することができる単離抗体。
  41. 抗体がIL−17Fシグナル伝達に拮抗する、請求項39に記載の抗体。
  42. 抗体がIL−17Fシグナル伝達に拮抗する、請求項40に記載の抗体。
  43. IL−17Fタンパク質に特異的に結合することができる単離抗体。
  44. IL−17Fタンパク質がヒト又は霊長動物に由来する、請求項43に記載の抗体。
  45. IL−17Fタンパク質が多量体である、請求項43に記載の抗体。
  46. IL−17Fタンパク質がIL−17Fホモ二量体又はIL−17Fへテロ二量体である、請求項45に記載の抗体。
  47. IL−17Fタンパク質がヘテロ二量体であり、IL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、請求項46に記載の抗体。
  48. 抗体がIL−17F生物活性を阻害する、請求項43に記載の抗体。
  49. IL−17Fシグナル伝達が、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方によって媒介される、請求項1〜3及び8のいずれかに記載の方法。
  50. IL−17Fシグナル伝達が、少なくとも一部には、IL−17Fヘテロ二量体によって媒介され、IL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、請求項49に記載の方法。
  51. IL−17F生物活性が、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方によって媒介される、請求項32に記載の方法。
  52. IL−17F生物活性が、少なくとも一部には、IL−17Fヘテロ二量体によって媒介され、IL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、請求項51に記載の方法。
  53. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方に拮抗する、請求項35に記載の医薬組成物。
  54. IL−17Fシグナル伝達拮抗物質が、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方に拮抗する、請求項37に記載のワクチンアジュバント。
  55. IL−17Fシグナル伝達に拮抗することを含む、IL−21シグナル伝達に関連する少なくとも1つの活性を阻害する方法。
  56. IL−17Fシグナル伝達に拮抗することを含む、IL−23シグナル伝達に関連する少なくとも1つの活性を阻害する方法。
  57. IL−17Fシグナル伝達が、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方によって媒介される、請求項55に記載の方法。
  58. IL−17Fシグナル伝達が、少なくとも一部には、IL−17Fヘテロ二量体によって媒介され、IL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、請求項57に記載の方法。
  59. a)培地中でT細胞を活性化すること;及び
    b)培地からIL−17Aタンパク質を免疫沈降させること
    を含む、天然IL−17Aタンパク質を精製する方法。
  60. a)培地中でT細胞を活性化すること;及び
    b)培地からIL−17Fタンパク質を免疫沈降させること
    を含む、天然IL−17Fタンパク質を精製する方法。
  61. IL−17Aタンパク質が、IL−17Aホモ二量体、IL−17Aヘテロ二量体、又はIL−17Aホモ二量体とIL−17Aヘテロ二量体の両方である、請求項59に記載の方法。
  62. IL−17Fタンパク質が、IL−17Fホモ二量体、IL−17Fヘテロ二量体、又はIL−17Fホモ二量体とIL−17Fヘテロ二量体の両方である、請求項60に記載の方法。
  63. IL−17Aタンパク質がヘテロ二量体であり、IL−17Aヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、請求項61に記載の方法。
  64. IL−17Fタンパク質がヘテロ二量体であり、IL−17Fヘテロ二量体がIL−17A/IL−17Fである、請求項62に記載の方法。
  65. 培地がIL−21を含む、請求項59又は60のいずれかに記載の方法。
  66. IL−17Fタンパク質がIL−17Fホモ二量体又はIL−17Fヘテロ二量体である、単離IL−17Fタンパク質。
  67. IL−17Fタンパク質が天然ソースから単離される、請求項66に記載のIL−17Fタンパク質。
  68. 天然ソースが少なくとも1個のT細胞である、請求項67に記載のIL−17Fタンパク質。
  69. IL−17Aタンパク質がIL−17Aホモ二量体又はIL−17Aヘテロ二量体である、単離IL−17Aタンパク質。
  70. IL−17Aタンパク質が天然ソースから単離される、請求項69に記載のIL−17Aタンパク質。
  71. 天然ソースが少なくとも1個のT細胞である、請求項70に記載のIL−17Aタンパク質。
  72. IL−17F拮抗物質を投与することを含む、IL−17Aシグナル伝達に関連する少なくとも1つの活性を阻害する方法。
  73. IL−17Aホモ二量体及びIL−17Fホモ二量体を実質的に含まないIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を単離する方法であって、
    a)培地で培養した宿主細胞において、第一アフィニティータグに融合したIL−17Aタンパク質又はそのフラグメントを含むIL−17A融合タンパク質及び第二アフィニティータグに融合したIL−17Fタンパク質又はそのフラグメントを含むIL−17F融合タンパク質を発現させること;
    b)宿主細胞にIL−17A融合タンパク質及びIL−17F融合タンパク質を培地中に分泌させること;
    c)IL−17A融合タンパク質が第一アフィニティーカラムに結合するように、非還元条件下で培地を第一アフィニティーカラムに加えること;
    d)非還元条件下で結合タンパク質を第一アフィニティーカラムから溶出すること;
    e)工程d)から得た溶離液を、IL−17F融合タンパク質が第二アフィニティーカラムに結合するように、非還元条件下で第二アフィニティーカラムに加えること;及び
    f)非還元条件下で結合タンパク質を第二アフィニティーカラムから溶出すること
    を含み、
    工程f)から得た溶離液が、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の形態でIL−17A融合タンパク質とIL−17F融合タンパク質の両方を含む、前記方法。
  74. IL−17Aホモ二量体及びIL−17Fホモ二量体を実質的に含まないIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体を単離する方法であって、
    a)培地で培養した宿主細胞において、第一アフィニティータグに融合したIL−17Fタンパク質又はそのフラグメントを含むIL−17F融合タンパク質及び第二アフィニティータグに融合したIL−17Aタンパク質又はそのフラグメントを含むIL−17A融合タンパク質を発現させること;
    b)宿主細胞にIL−17A融合タンパク質及びIL−17F融合タンパク質を培地中に分泌させること;
    c)IL−17F融合タンパク質が第一アフィニティーカラムに結合するように、非還元条件下で培地を第一アフィニティーカラムに加えること;
    d)非還元条件下で結合タンパク質を第一アフィニティーカラムから溶出すること;
    e)工程d)から得た溶離液を、IL−17A融合タンパク質が第二アフィニティーカラムに結合するように、非還元条件下で第二アフィニティーカラムに加えること;及び
    f)非還元条件下で結合タンパク質を第二アフィニティーカラムから溶出すること
    を含み、
    工程f)から得た溶離液が、IL−17A/IL−17Fヘテロ二量体の形態でIL−17A融合タンパク質とIL−17F融合タンパク質の両方を含む、前記方法。
  75. 請求項73又は74のいずれかに記載の方法に従って単離されるIL−17A/IL−17Fヘテロ二量体。
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