CN1798768B - 抗il-22ra抗体和结合伴侣及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及的是阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22、IL-20或者IL-20和IL-22多肽分子二者的活性。IL-20和IL-22是细胞因子，它们参与炎症过程和人类疾病。IL-22RA(zcytor11)是IL-20和IL-22的共同受体。本发明包括抗IL-22RA抗体和结合伴侣，以及使用这种抗体和结合伴侣拮抗IL-22或IL-20和IL-22二者的方法。
Description
发明背景
细胞因子是可溶性的小型蛋白，它们介导多种不同的生物学作用，包括对许多细胞类型的生长和分化的调控(参见，例如Arai et al.，Annu.Rev.Biochem.59：783(1990)；Mosmann，Curr.Opin.Immunol.3：311(1991)；Paul and Seder，Cell76：241(1994))。组成细胞因子组的蛋白质包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子以及其他调控分子。例如，人白介素17是可刺激白介素6、胞内粘附分子1、白介素8、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子以及前列腺素E2表达的细胞因子，在CD34+造血前体向嗜中性粒细胞的优先成熟中起作用(Yao et al.，J.Immunol.155：5483(1995)；Fossiez et al.，J.Exp.Med.183：2593(1996))。
结合细胞因子的受体通常由一个或者多个整合性膜蛋白组成，它们与细胞因子以高亲和力相结合，并且通过该受体亚基的细胞质部分将这一结合事件转导给细胞。根据细胞因子受体细胞外配基结合结构域的相似性，将细胞因子受体分为多种类型。例如，负责结合和/或转导干扰素效应的受体链是第II类细胞因子受体家族的成员，划分的依据是200个残基的特征性细胞外结构域。
细胞因子和它们的受体表现出来的体内活性阐明了对于其他细胞因子、细胞因子受体、细胞因子激动剂和细胞因子拮抗剂的需求以及它们用于临床的潜力。例如，促炎性细胞因子家族表现出来的体内活性阐明了对促炎性分子拮抗剂的需求以及它们用于临床的巨大潜力。本发明通过提供针对促炎性细胞因子IL-20和IL-22的拮抗剂而满足了这些需求。本发明的这类拮抗剂可以阻断、抑制、降低、拮抗或者 中和IL-22、IL-20或者IL-20与IL-22两者的活性，它们包括可溶性IL-22RA受体和中和性的抗IL-22RA抗体。本发明还提供了它们在炎症性疾病中的使用以及相关的组合物和方法。
发明详述
1.概述
本发明提供了被命名为“Zcytor11”或“IL-22RA”的可溶性受体以及针对IL-22RA细胞因子受体的中和性抗体的新型用途，以及其它发明。本发明还提供了可溶性IL-22RA多肽片段和融合蛋白，用于人类炎症性和自身免疫疾病。本发明的抗IL-22RA抗体和可溶性IL-22RA受体，包括本发明的中和性抗IL-22RA抗体，可以在治疗特定的人类疾病例如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、关节炎、内毒素血症、炎症性肠病(IBD)、结肠炎和其他在本文公开的炎症性状况中用于阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或者IL-20或者IL-20和IL-22两者的活性。
编码人Zcytor11(IL-22RA)的例证性的核苷酸序列由SEQ IDNO：1提供；所编码的多肽在SEQ ID NO：2中显示。IL-22RA是IL-20和IL-22二者的受体亚基。Zcytor11(IL-22RA)在共有的美国专利编号5,965,704、共有的WIPO出版物WO02/12345以及共有的WIPO出版物WO02/072607中予以公开。对编码IL-22RA(SEQ ID NO：1)的人cDNA克隆进行分析发现了一个编码574个氨基酸(SEQ ID NO：2)的开放阅读框，该开放阅读框包含大约211个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的18-228残基；SEQ ID NO：3)的细胞外配基结合结构域、大约23个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的229-251残基)的跨膜结构域、以及大约313个氨基酸残基(SEQ ID NO：2的252-574残基)的细胞内结构域。这样，本发明的分子包括了含有包含SEQ ID NO：2的18-228号氨基酸残基(SEQ ID NO：3)的细胞因子结合结构域的多肽。在本发明的可溶性受体的一个实施方案中，该可溶性的IL-22R与重链的恒定区(代表序列在SEQ ID NO：4中显示)融合。本领域内的技术人员 会认识到这些结构域的边界是大致性的。从结构域末端缺失残基是可能的。
如下面所描述，本发明提供了分离的多肽，它们包含与SEQ ID NO：2的18-228号残基所示参考氨基酸序列(也表示为SEQ ID NO：3)至少是70％、至少是80％、或者至少是90％、或者大于95％、例如96％、97％、98％或者大于99％或者更高程度相同的氨基酸序列，其中所述分离多肽可与能特异结合包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列之多肽的抗体发生特异结合。例证性的多肽包括包含SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：3中氨基酸残基的多肽。而且，本发明还提供了如以上所公开的与IL-22结合的分离多肽(例如SEQ ID NO：6所示的人IL-22多肽序列)。该人IL-22多核苷酸序列在SEQ ID NO：5中显示。小鼠的IL-22多核苷酸序列在SEQ ID NO：10中显示，相应的多肽在SEQ ID NO：11中显示。本发明还提供了如以上所公开的与IL-20结合的分离多肽(例如如SEQ ID NO：8所示的人IL-20多肽序列；WIPO出版物编号WO99/27103)。该人IL-20多核苷酸序列在SEQ ID NO：7中显示。
本发明还提供了包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中至少15个连续氨基酸残基的分离多肽和表位。例证性的多肽包括包含SEQ IDNO：3或其抗原性表位或其功能性IL-20或IL-22结合片段或者由它们所组成。而且，本发明还提供了如以上所公开的结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或IL-20的活性的分离多肽。
本发明还包括了变体IL-22RA多肽，其中该变体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3所示氨基酸残基的一致性百分比选自以下组中：至少70％一致、至少80％一致、至少90％一致、至少95％一致或者大于95％的一致、如96％、97％、98％或者大于99％或者更高的一致性，其中变体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：3的相应氨基酸序列之间的任何差异是由于一个或者多个保守氨基酸替代造成的。这种保守氨基酸替代在 此有所描述。而且，本发明还提供了如以上所公开的可结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或IL-20活性的分离多肽。
本发明还提供了与这种多肽特异结合的抗体和抗体片段。示例性的抗体包括中和抗体、多克隆抗体、鼠单克隆抗体、来自鼠单克隆抗体的人化抗体以及人单克隆抗体。示例性的抗体片段包括F(ab′)2，F(ab)2，Fab′，Fab，Fv，scFv和最小识别单位。中和抗体优选可结合IL-22RA，使得IL-20和IL-22与IL-22RA的相互作用被阻断、抑制、降低、拮抗或者中和；或使IL-20抑或IL-22与IL-22RA的结合被阻断、抑制、降低、拮抗或者中和的抗IL-22RA中和抗体也包括在本发明中。即本发明的中和性抗IL-22RA抗体可以结合、阻断、抑制、降低、拮抗抑或中和IL-20或者IL-22中仅一种，也可以同时结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20和IL-22。本发明还包括包含载体和本文描述的肽、多肽或者抗体的组合物。
此外，本发明提供了药物组合物，其中包含药学上可以接受的载体以及至少一个这种表达载体或者包含这种表达载体的重组病毒。本发明还包括了包含药物上可以接受的载体以及本文描述的多肽或抗体的药物组合物。
本发明还涉及抗独特型抗体或者抗独特型抗体片段，它们可与能和包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽或者其片段特异结合的抗体或者抗体片段特异性结合。一个示例性的抗独特型抗体可与能和由SEQ ID NO：3组成的多肽特异结合的抗体相结合。
本发明还提供了融合蛋白，其中包含IL-22RA多肽和免疫球蛋白部分。在这样的融合蛋白中，免疫球蛋白部分可以是免疫球蛋白重链恒定区，如人Fc片段。本发明还包括了编码这种融合蛋白的分离的核酸分子。
本发明还提供了多克隆和单克隆抗体，它们可与包含IL-22RA细胞外结构域的多肽(例如单体、均二聚体、杂二聚体以及多聚体受体，包括可溶性受体)结合。此外，这种抗体可以用于拮抗IL-22RA配基、IL-22(SEQ ID NO：6)以及IL-20(SEQ ID NO：8)单独或者一起与IL-22RA受体结合。
而且，人牛皮癣破损处和人特应性皮炎皮肤样品中显示了IL-20和IL-22的过量表达或者上调，提示与IL-20相同，IL-22也参与人牛皮癣、特应性皮炎或者皮肤和上皮组织的其他炎症性疾病。而且，如这里所描述的，在转基因小鼠中IL-20或者IL-22的过量表达显示了表皮层增厚以及表明牛皮癣表型的免疫细胞参与性；此外，向正常的小鼠中注射IL-22，也显示了表皮层增厚以及表明牛皮癣表型的免疫细胞参与性，这些现象被可溶性受体拮抗剂IL-22RA2(zcytor16；WIPO出版物编号WO01/40467)所消除。这些体内数据进一步提示促炎性的IL-22参与了牛皮癣、特应性皮炎或者皮肤和上皮组织的其他炎症性疾病。因此，IL-22和IL-20活性的拮抗剂例如IL-22RA可溶性受体及其抗体(包括本发明的抗人IL-22RA单克隆抗体和中和抗体)在炎症性疾病的治疗性治疗中是有用的，特别是在牛皮癣的治疗中可以作为IL-22和IL-20各自或者共同的拮抗剂。而且，IL-22活性的拮抗剂例如IL-22RA可溶性受体及其抗体(包括本发明的抗人IL-22RA单克隆抗体和中和抗体)在其他炎症性疾病的治疗性处理中是有用的，例如可以在特应性皮炎、IBD、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎以及牛皮癣性关节炎成人呼吸疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤如哮喘或者支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹、特应性或者接触皮炎以及炎症性肠病例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的治疗中结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22和IL-20(单独地或者二者均可)。
参考以下的详述，本发明的这些和其他方面将会显而易见。此外， 以下还列出了多个不同的参考文献，以它们的整体引用在这里作为参考。
2.定义
在以下的描述中，大量使用了一些术语。提供以下的定义以有助于理解本发明。
正如这里所使用的，“核酸”或者“核酸分子”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、聚合酶链式反应(PCR)产生的片段以及由连接、剪切、内切酶作用和外切酶作用中的任何方式所产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)，或者天然存在核苷酸的类似物(例如天然存在核苷酸的α-对映体)或者以上二者的组合这样的单体所组成。修饰的核苷酸可以在其糖部分和/或嘧啶或者嘌呤碱基部分具有改变。糖修饰包括，例如使用卤素、烷基、胺基和叠氮基代替一个或者更多羟基基团，或者糖可以官能化为醚或者酯。而且，整个糖部分可以被立体性或者电子性相似的结构取代，例如氮杂糖和环状糖类似物。碱基部分修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰基化的嘌呤或者嘧啶，或者其他众所周知的杂环取代基。核酸单体可以通过磷酸二酯键或者这种连键的类似物相连。磷酸二酯键连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate，phosphoranilidate、氨基磷酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，它包含连接在多酰胺骨架上的天然存在的或者修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或者双链的。
术语“核酸分子的互补体”是指与参考核苷酸序列相比，具有互补核苷酸序列和相反方向的核酸分子。例如序列5′ATGCACGGG3′与序列5′CCCGTGCAT3′互补。
术语“简并核苷酸序列”是指与编码多肽的参考核酸分子相比包括一个或者更多简并密码子的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核 苷酸三联体，但是编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体都编码天冬氨酸)。
术语“结构基因”是指转录为信使RNA(mRNA)的核酸分子，该信使RNA再翻译为特异多肽所特有的氨基酸序列。
“分离的核酸分子”是未整合到生物体基因组DNA中的核酸分子。例如，已从细胞的基因组DNA中分离出来的、编码生长因子的DNA分子是分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个实例是未整合到生物体基因组中的化学合成的核酸分子。从某一特定物种中分离出的核酸分子小于来自该物种的染色体的完整DNA分子。
“核酸分子构建体”是指单链或者双链的核酸分子，它已通过人的干预受到修饰，从而含有一些核酸片段，这些片段以自然界中不存在的方式组合和并列在一起。
“线性DNA”是指具有游离5′和3′末端的非环状DNA分子。可以通过闭合环状DNA分子，例如质粒，通过酶切或者物理断裂来制备线性DNA分子。
“互补DNA(cDNA)”是指由mRNA模板通过逆转录酶形成的单链DNA分子。通常使用与mRNA的部分互补的引物起始逆转录。本领域内的技术人员还使用术语“cDNA”来表示由这种单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还指从RNA模板合成的cDNA分子的克隆。
“启动子”是指指导结构基因转录的核苷酸序列。通常启动子位于基因的5′非编码区，靠近结构基因的转录起始位点。在转录起始中起作用的启动子内的序列元件，其通常具有的特点是共有的核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、 分化特异性元件(DSEs；McGehee et al.，Mol.Endocrinol.7：551(1993))，环AMP反应元件(CREs)，血清反应元件(SREs；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990))，糖皮质激素反应性(GREs)，以及其他转录因子的结合位点，这些转录因子例如CRE/ATF(O′Reilly et al.，J.Biol.Chem.267：19938(1992))，AP2(Ye etal.，J.Biol.Chem.269：25728(1994))，SP1，cAMP反应元件结合蛋白(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))以及八聚体因子(一般地参见Watson et al.，eds.，Molecular Biology of the Gene，4th ed.(The Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.1987)，和Lemaigre and Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))。如果启动子是诱导型启动子，则转录的速率响应于诱导剂而得到提高。相反，如果启动子是组成性的，则转录速率不受诱导剂的调控。还已知有阻遏型启动子。
“核心启动子”含有启动子作用的关键核苷酸序列，包括TATA盒子和转录起点。根据这个定义，在可能提高活性或者使启动子具有组织特异活性的特异序列不存在的时候，核心启动子可能有或者没有可检测的活性。
“调控元件”是调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可能含有与细胞因子结合的核苷酸序列，这些细胞因子使转录仅仅在或者优先在特定的细胞、组织或者细胞器中进行。这些类型的调控元件一般与具有“细胞特异性”、“组织特异性”或者“细胞器特异性”表达方式的基因有关。
“增强子”是一类调控元件，它们可以提高转录的效率，而无论增强子相对于转录起始位置的距离或者方向如何。
“异源DNA”是指DNA分子或者DNA分子群，它们在天然状况下 不存在于给定的宿主细胞内。只要宿主细胞DNA与非宿主细胞DNA(即外源DNA)相组合，则对于该特定宿主细胞而言属异源的DNA分子中可能含有来自于该宿主细胞种类的DNA(即内源DNA)。例如，含有编码多肽的非宿主DNA片段与包含转录启动子的宿主DNA片段可操作连接的DNA分子被认为是异源DNA分子。相反，异源DNA分子可以包含与外源启动子可操作连接的内源基因。作为另一个示例，包含来自野生型细胞的基因的DNA分子若被引入没有该野生型基因的突变体细胞中，则该DNA分子也被认为是异源的。
“多肽”是指由肽键连接的氨基酸残基的多聚体，不论多聚体是天然产生的还是合成的。小于大约10个氨基酸残基的多肽通常被称为“肽”。
“蛋白质”是包含一个或者更多多肽链的大分子。蛋白质可能还含有非肽性成分，例如糖基。可以由产生蛋白质的细胞向该蛋白质添加糖和其他非肽性取代物，加入的这些取代物随细胞类型的不同而有所不同。在这里根据蛋白质的氨基酸骨架结构对蛋白质进行描述；取代基如糖基团一般并不指明，但是它们是可以存在的。
由非宿主DNA分子编码的肽或者多肽是“异源的”肽或者多肽。
“克隆载体”是核酸分子，例如质粒、粘粒或者噬菌体，它们具有在宿主细胞内自主复制的能力。克隆载体通常含有一个或者少量限制性内切酶识别位点，它们可以使核酸分子按照可确定的方式插入到载体中，而不会使载体的重要生物学功能丧失；载体还含有编码标记基因的核苷酸序列，该标记基因适用于鉴别和选择被克隆载体转化的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性或者氨苄青霉素抗性的基因。
“表达载体”是编码在宿主细胞内表达的基因的核酸分子。通常， 表达载体包含转录启动子、基因以及转录终止子。基因表达经常在启动子的控制下，这样的基因被称为与启动子“可操作性连接”。类似地，如果调控元件调节核心启动子的活性，则所述调控序列和核心启动子是可操作性连接的。
“重组宿主”是含有异源核酸分子例如克隆载体或者表达载体的细胞。在本发明的上下文中，重组宿主的一个实例是从表达载体产生IL-22RA的细胞。与此相反，IL-22RA可以由作为IL-22RA天然来源的细胞产生，该细胞没有表达载体。
“整合转化子”是重组的宿主细胞，其中异源DNA整合到该细胞的基因组DNA中。
“融合蛋白”是由包含至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。例如，融合蛋白可以包含IL-22RA多肽的至少部分与能够结合亲和基质的多肽相融合。这种融合蛋白提供了一种使用亲和层析分离大量IL-22RA的途径。
术语“受体”指的是可与被称为“配基”的生物活性分子结合的细胞相关性蛋白质。这个相互作用介导了配基在细胞上的作用。受体可以是膜结合型受体、胞质受体或者核受体；可以是单体(例如甲状腺刺激激素受体、β-肾上腺素能受体)或者多聚体(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体以及IL-6受体)。膜结合型受体的特征是包含细胞外配基结合结构域和细胞内效应器结构域(它通常参与信号转导)的多结构域结构。在某些膜结合型受体中，该细胞外配基结合结构域以及细胞内效应器结构域位于组成完整且有功能的受体的不同多肽中。
一般而言，配基与受体的结合会导致受体的构象改变，引起效应 器结构域和细胞内的其他分子之间的相互作用，其继而引起细胞代谢的变化。经常与受体-配基相互作用相关的代谢事件包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、环AMP产量的增加、细胞钙的轻移、膜脂的转移、细胞粘附、肌醇脂类的水解以及磷脂的水解。
“可溶性受体”是不结合在细胞膜上的受体多肽。可溶性受体是最常见的配基结合型受体多肽，它们缺少跨膜和细胞质结构域，以及与细胞膜的其他连接，例如通过糖磷酸肌醇(gpi)。可溶性受体可以包含额外的氨基酸残基，例如可提供多肽的纯化或者提供多肽与底物相结合的位点的亲和标签，或者是免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受体具有天然存在的可溶性相对物，它们由蛋白质水解产生或者由可变剪接的mRNA翻译得到。可溶性受体可以是单体、均二聚体、杂二聚体或者多聚体，多聚体受体一般包含的亚基不超过9个，优选不超过6个，最优选不超过3个。当受体多肽缺少足够的跨膜和细胞内多肽片段部分以分别提供膜锚定或者信号转导时，则称这些受体多肽基本上没有跨膜和细胞内多肽区段。I类和II类细胞因子受体的可溶性多肽一般包含没有跨膜结构域和细胞内结构域的细胞外细胞因子结合结构域。例如，代表性的可溶性受体包括CRF2-4(又名IL-10RB)(Genbank登录号Z17227)的可溶性受体，如SEQ ID NO：44和45所示；IL-10RA(Genbank登录号U00672和NM_001558)的可溶性受体，如SEQ ID NO：46所示；pDIRS1(又名IL-20RB)(Genbank登录号AY358305)的可溶性受体，如SEQ ID NO：47所示；以及IL-22RA(US专利编号5,965,704)的可溶性受体，如SEQ ID NO：3所示。描述已知的I类或II类细胞因子序列中什么样的序列包含没有跨膜结构域和细胞内结构域的细胞外细胞因子结合结构域是本领域内的技术人员所熟知的。而且，本领域内的技术人员可以使用遗传密码容易地确定编码这种可溶性受体多肽的多核苷酸。
术语“分泌信号序列”是指编码肽(“分泌肽”)的DNA序列， 该肽作为更大多肽的组分，可指导该更大的多肽通过合成它的细胞的分泌途径。通常该更大的多肽在通过分泌途径转运的过程中被切割以除去分泌肽。
“分离的多肽”是指基本没有被细胞组分例如糖、脂肪或者其他在自然环境中与该多肽相关的蛋白性杂质所污染的多肽。通常，独立的多肽的制备物含有高度纯化形式的所述多肽，即至少大约80％的纯度、至少大约90％的纯度、至少大约95％的纯度、大于95％的纯度、例如96％、97％或者98％或者更纯，或者大于99％的纯度。一种显示某种蛋白质制备物含有分离多肽的方式是通过对该蛋白质制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、再用考马斯亮蓝对凝胶染色后单一条带的显现。但是，术语“分离的”并不排除同一多肽以其他的物理形式存在，例如二聚体或者可变糖基化或者衍生化的形式。
在这里使用术语“氨基端”和“羧基端”来表示多肽内部的位置。在上下文允许的时候，这些术语是参考特定的序列或者多肽的部分使用的，以指示邻近或者相对的位置。例如，在多肽内相对于参考序列位于羧基端的某个序列，其位置靠近该参考序列的羧基端，但是并不一定在整个多肽的羧基端。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，对于结构基因而言，表达涉及结构基因向mRNA的转录以及mRNA向一个或者更多多肽的翻译。
在这里使用术语“剪接变体”表示从基因转录得到的可变形式的RNA。剪接变异是通过使用转录的RNA分子内部的，或者较为少见地是在分别转录的RNA分子之间的可变剪接位点天然产生的，可能导致产生从同一基因转录出几种mRNA。剪接变体可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。在这里还使用术语“剪接变体”来表示由基因转录出的 mRNA的剪接变体所编码的多肽。
正如这里所使用的，术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子等等，以及这些分子的合成类似物。
术语“互补物/抗互补物对(complement/anti-complementpair)”是指在适当条件下形成非共价连接的、稳定配对的不相同的分子。例如，生物素和抗生物素蛋白(或者链亲和素)是互补物/抗互补物对的典型成员。其他的示例性互补物/抗互补物对包括受体-配基对、抗体-抗原(或者半抗原或者表位)对、有义-反义多核苷酸对等等。当需要互补物/抗互补物对的后续解离时，互补物/抗互补物对之间的结合亲和性优选小于109M-1。
“抗独特型抗体”是与免疫球蛋白的可变区结构域结合的抗体。在本发明的上下文中，抗独特型抗体与抗IL-22RA抗体的可变区结合，这样抗独特型抗体可模拟IL-22RA的表位。
“抗体片段”是抗体的部分，例如F(ab′)2，F(ab)2，Fab′，Fab等等的一部分。不论结构如何，抗体片段可与被完整抗体识别的同一抗原结合。例如，抗IL-22RA单克隆抗体片段可与IL-22RA的表位结合。
术语“抗体片段”还包括可与特异抗原结合的合成或者经过遗传工程操作的多肽，例如由轻链可变区组成的多肽、由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段、重组单链多肽分子(其中轻链和重链可变区由肽连接物相连(“scFv蛋白”))、以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
“嵌合抗体”是含有来自啮齿类抗体的可变结构域和互补决定区的重组蛋白质，而该抗体分子的剩余部分来自人抗体。
“人化抗体”是重组蛋白，其中单克隆抗体的鼠互补决定区已经从鼠免疫球蛋白的重链和轻链可变区被转移到人可变结构域中。用于人体治疗用的衍生自鼠抗体的人化抗体(例如那些结合或者中和人蛋白质的人化抗体)的构建在本领域内技术人员掌握的技术范围内。
正如这里所使用的，“治疗性药剂”是与抗体部分相缀合的分子或者原子，产生可用于治疗的缀合物。治疗性药剂的示例包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活性药剂或者染料以及放射性同位素。
“可检测的标记”是可以与抗体部分相偶联产生在诊断中有用的分子的分子或者原子。可检测的标记的示例包括螯合剂、光活性药剂、放射性同位素、荧光药剂、顺磁离子或者其他标记物。
术语“亲和标签”在这里用于指多肽片段，它可以附着到第二多肽上，以提供该第二多肽的纯化或检测，或者为该第二多肽与底物的结合提供位点。原则上，任何已经有抗体或者其他特异结合剂可供利用的肽或者蛋白都可以用作亲和标签。亲和标签包括多聚组氨酸、蛋白A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.198：3(1991))，谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson，Gene67：31(1988))，Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：7952(1985))，物质P，FLAG肽(Hopp et al.，Biotechnology6：1204(1988))，链亲和素结合肽，或者其他抗原性表位或者结合结构域。一般地参见Ford et al.，Protein Expression and Purification2：95(1991).编码亲和标签的DNA分子可以从供应商处获得(e.g.，Pharmacia Biotech， Piscataway，NJ)。
“裸露的抗体”是完整抗体，它与抗体片段相反，并不与治疗性药剂相偶联。裸露的抗体包括多克隆和单克隆抗体，以及某些重组抗体例如嵌合和人化抗体。
正如在这里使用的，术语“抗体组分”包括整个抗体和抗体片段。
“免疫缀合物”是抗体组分与治疗性药剂或者可检测标记的缀合物。
正如这里使用的，术语“抗体融合蛋白”指的是包含抗体组分和IL-22RA多肽组分的重组分子。抗体融合蛋白的实例包括包含IL-22RA细胞外结构域以及Fc结构域抑或抗原结合区的蛋白质。
“目标多肽”或者“目标肽”是一段氨基酸序列，它包含至少一个表位，在目标细胞上例如肿瘤细胞或者携带感染性因子抗原的细胞上表达。T细胞识别由主要组织相容性复合体分子向目标多肽或者目标肽呈递的肽表位，通常裂解目标细胞或者募集其他免疫细胞到达目标细胞的位置，从而杀死目标细胞。
“抗原性多肽”是可结合主要组织相容性复合体分子而形成MHC-肽复合物的肽，该MHC-肽复合物被T细胞识别，从而在复合物向T细胞呈递时诱导细胞毒性淋巴细胞应答。这样，抗原性肽能够与适当的主要组织相容性复合体分子结合并且诱导出细胞毒性T细胞应答，例如细胞裂解或者针对于可与该抗原结合或者表达该抗原的目标细胞的特异性细胞因子释放。抗原性肽可以结合在I类或者II类主要组织相容性复合体分子的环境下，或者在抗原呈递细胞上或者在目标细胞上。
在真核细胞中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录，产生mRNA。可以设计核酸分子，使其含有RNA聚合酶II模板，其中该RNA转录产物具有与特定mRNA序列互补的序列。该RNA转录产物被称作“反义RNA”，编码反义RNA的核酸分子被称作“反义RNA基因”。反义RNA分子能够结合mRNA分子，使mRNA的翻译受到抑制。
“IL-22RA特异的反义寡核苷酸”或者“IL-22RA反义寡核苷酸”是具有某种序列的寡核苷酸，该序列(a)能够与IL-22RA基因的一部分形成稳定三链体，或者(b)能够与IL-22RA基因的mRNA转录产物形成稳定二链体。
“核酶”是含有催化中心的核酸分子。该术语包括RNA酶、自我剪接RNA、自我切割RNA以及进行这些催化反应的核酸分子。编码核酶的核酸分子被称为“核酶基因”。
“外源引导序列”是这样的核酸分子，它指导内源核酶RNaseP到达某种细胞内mRNA，使该mRNA被RNaseP切割。编码外源引导序列的核酸分子被称作“外源引导序列基因”。
术语“变体IL-22RA基因”是指这样的核酸分子，其编码具有SEQID NO：3修饰形式的氨基酸序列的多肽。这种变体包括天然存在的IL-22RA基因的多态性以及含有SEQ ID NO：3中氨基酸序列的保守氨基酸替代的合成基因。其他IL-22RA基因的变体形式是含有本文所述核苷酸序列的插入或者缺失的核酸分子。可以通过例如确定基因是否在严谨条件下与具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或者其互补序列的核酸分子杂交来鉴定变体IL-22RA基因。
或者，可以通过序列比较来鉴定变体IL-22RA基因。当两个氨基酸序列进行比对以寻求最大一致性时，该两个氨基酸的氨基酸残基相 同，则所述两个氨基酸序列具有“100％的氨基酸序列一致性”。类似地，当两个核苷酸序列进行比对以寻求最大一致性时，该两个核苷酸序列的核苷酸残基相同，则所述两个核苷酸序列具有“100％的核苷酸序列一致性”。可以使用标准软件程序，例如那些由DNASTAR(Madison，Wisconsin)生产的包括在LASERGENE生物信息学处理包中的程序进行序列比较。其他通过确定最佳比对而比较两个核苷酸或者氨基酸序列的方法对于本领域内的技术人员是众所周知的(参见，例如Peruskiand Peruski，The Internet and the NewBiology：Tools for Genomicand Molecular Research(ASM Press，Inc.1997)，Wu et al.(eds.)，“Information Superhighway and Computer Databases of NucleicAcids and Proteins，”in Methods in Gene Biotechnology，pages123-151(CRC Press，Inc.1997)，以及Bishop(ed.)，Guide toHuman Genome Computing，2nd Edition(Academic Press，Inc.1998)).以下描述了确定序列一致性的具体方法。
不论用于鉴定变体IL-22RA或者变体IL-22RA多肽的特异方法如何，可以对变体基因或者由变体基因编码的多肽与抗IL-22RA抗体特异结合的能力进行功能性鉴定。还可以使用本文描述的生物学或者生化检测对变体IL-22RA基因或者变体IL-22RA多肽结合其配基IL-22的能力进行功能性鉴定。
术语“等位基因变体”在这里用来表示占据同一染色体基因座的基因的两个或者更多可变形式中的任何一种。等位基因变异通过突变天然产生，可能导致群体中的表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有改变)或者可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语“等位基因变体”在这里还用来表示由基因的等位变体编码的蛋白质。
术语“定向进化同源蛋白质(ortholog)”表示从一个物种获得 的多肽或者蛋白质，该多肽或者蛋白质是来自不同物种的多肽或者蛋白质的功能对应物。定向进化同源基因之间的序列差异是物种形成的结果。
“平行进化同源蛋白质(paralog)”是由生物体生成的截然不同、但是结构相关的蛋白质。平行进化同源蛋白质被认为是通过基因重复产生的。例如，α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌球蛋白互为平行进化同源蛋白质。
本发明包括IL-22RA基因的功能性片段。在本发明的上下文下，IL-22RA基因的“功能性片段”是指编码IL-22RA多肽的一部分(它是本文所述的结构域或者至少与抗IL-22RA抗体特异结合)的核酸分子。
由于标准分析方法的不精确性，多聚体的分子量和长度被认为是大致的数值。当这样一个数值被表示为“大约”X或者“大致”X时，所述的X指被认为精确到±10％。
3.IL-22RA多核苷酸或者基因的产生
编码人IL-22RA基因的核酸分子可以通过使用根据SEQ ID NO：1的多核苷酸探针筛选人cDNA或者基因组文库而得到。这些都是标准和成熟的技术，可以通过使用供应商提供的克隆试剂盒完成。参见例如Ausubel et al.(eds.)，Short Protocols in Molecular Biology，3rdEdition，John Wiley&Sons1995；Wu et al.，Methods in GeneBiotechnology，CRC Press，Inc.1997；Aviv and Leder，Proc.Nat’1 Acad.Sci.USA69：1408(1972)；Huynh et al.，“Constructingand Screening cDNA Libraries in lgt10and lgt11，”DNA Cloning：A Practical Approach Vol.I，Glover(ed.)，49页(IRL Press，1985)；Wu(1997)47-52页.
还可以通过聚合酶链式反应(PCR)，使用基于IL-22RA基因或者cDNA的核苷酸序列的寡核苷酸引物，得到编码人IL-22RA基因的核酸分子。使用PCR筛选文库的一般方法由以下参考文献提供：例如Yu et al.，“Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen PhageLibraries，”Methods in Molecular Biology，Vol.15：PCRProtocols：Current Methods and Applications，White(ed.)，Humana Press，Inc.，1993.而且，使用PCR分离相关基因的技术在例如以下文献中有所描述：Preston，“Use of DegenerateOligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction toClone Gene Family Members，”Methods in Molecular Biology，Vol.15：PCR Protocols：Current Methods and Applications，White(ed.)，Humana Press，Inc.1993。或者，可以使用长的共同引发寡核苷酸以及本文描述的核苷酸序列合成核酸分子，得到IL-22RA基因(参见例如Ausubel(1995))。使用聚合酶链式反应的成熟技术可以合成长度至少为2kb的DNA分子(Adang et al.，Plant Molec.Biol.21：1131(1993)，Bambot et al.，PCR Methods and Applications2：266(1993)，Dillon et al.，“Use of the Polymerase ChainReaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes，”Methods in Molecular Biology，Vol.15：PCR Protocols：CurrentMethods and Applications，White(ed.)，263-268页，(Humana Press，Inc.1993)，以及Holowachuk et al.，PCR Methods Appl.4：299(1995))。对于多核苷酸合成的综述，参见例如Glick and Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles and Applications ofRecombinant DNA(ASM Press1994)，Itakura et al.，Annu.Rev.Biochem.53：323(1984)，和Climie et al.，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA87：633(1990)。
4.IL22-RA基因变体的制备
本发明提供了多种核酸分子，包括DNA和RNA分子，它们编码本文公开的IL-22RA多肽。本领域内的技术人员会很容易地认识到，考虑到遗传密码的简并性，在这些多核苷酸分子中可以有相当多的序列变化。而且，本发明还提供了分离的可溶性单体、均二聚体、杂二聚体和多聚体受体多肽，它们包含至少一个与SEQ ID NO：3的受体多肽基本上同源的IL-22RA受体亚基。这样，本发明涉及包含SEQ ID NO：1所示简并核苷酸的IL-22RA多肽编码核酸分子及其RNA等价物。
表1以单字母代码表示简并核苷酸位置。“拆分”是字母代码所代表的核苷酸。“互补物”表示的是互补核苷酸的代码。例如代码Y代表C或者T，其互补物R代表A或者G，A与T互补，而G与C互补。
表1
| 核苷酸 | 拆分 | 互补核苷酸 | |拆分| |
| A | A | T | T |
| C | C | G | G |
| G | G | C | C |
| T | T | A | A |
| R | A|G | Y | C|T |
| Y | C|T | R | A|G |
| M | A|C | K | G|T |
| K | G|T | M | A|C |
| S | C|G | S | C|G |
| W | A|T | W | A|T |
| H | A|C|T | D | A|G|T |
| B | C|G|T | V | A|C|G |
| V | A|C|G | B | C|G|T |
| D | A|G|T | H | A|C|T |
| N | A|C|G|T | N | A|C|G|T |
在表2中给出了简并密码子，包括了对于给定氨基酸的所有可能的密码子。
表2
| 氨基酸 | 单字母代码 | 密码子 | 简并密码子 |
| Cys | C | TGCTGT | TGY |
| Ser | S | AGC AGT TCA TCC TCG TCT | WSN |
| Thr | T | ACA ACC ACG ACT | ACN |
| Pro | P | CCA CCC CCG CCT | CCN |
| Ala | A | GCA GCC GCG GCT | GCN |
| Gly | G | GGA GGC GGG GGT | GGN |
| Asn | N | AAC AAT | AAY |
| Asp | D | GAC GAT | GAY |
| Glu | E | GAA GAG | GAR |
| Gln | Q | CAA CAG | CAR |
| His | H | CAC CAT | CAY |
| Arg | R | AGA AGG CGA CGC CGG CGT | MGN |
| Lys | K | AAA AAG | AAR |
| Met | M | ATG | ATG |
| Ile | I | ATA ATC ATT | ATH |
| Leu | L | CTA CTC CTG CTT TTA TTG | YTN |
| Val | V | GTA GTC GTG GTT | GTN |
| Phe | F | TTC TTT | TTY |
| Tyr | Y | TAC TAT | TAY |
| Trp | W | TGG | TGG |
| Ter | TAA TAG TGA | TRR | |
| Asn|Asp | B | RAY | |
| Glu|Gln | Z | SAR | |
| Any | X | NNN |
本领域内普通技术人员应当理解，在确定编码氨基酸的所有可能密码子的代表性简并密码子时引入了一些不确定性。例如丝氨酸的简 并密码子(WSN)在某些情况下可以编码精氨酸(AGR)，而精氨酸的简并密码子(MGN)在某些情况下可以编码丝氨酸(AGY)。在编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间也存在类似的关系。该简并序列所涵盖的多核苷酸可能编码氨基酸序列变体，但是本领域内普通技术人员可以参考SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列容易地鉴别出这种变体序列。变体序列可以容易地根据这里的描述进行功能性检测。
不同的物种可以具有“密码子使用偏好”。一般地，参见Granthamet al.，Nucl.Acids Res.8：1893(1980)，Haas et al.Curr.Biol.6：315(1996)，Wain-Hobson et al.，Gene13：355(1981)，Grosjeanand Fiers，Gene18：199(1982)，Holm，Nuc.Acids Res.14：3075(1986)，Ikemura，J.Mol.Biol.158：573(1982)，Sharp and Matassi，Curr.Opin.Genet.Dev.4：851(1994)，Kane，Curr.Opin.Biotechnol.6：494(1995)，以及Makrides，Microbiol.Rev.60：512(1996)。正如这里所使用的，术语“密码子使用偏好”或者“偏好密码子”是现有技术中的一个术语，指的是某个物种的细胞中最经常使用的蛋白质翻译密码子，这样就会对编码每一个氨基酸的可能密码子(参见表2)中的一个或者几个代表性密码子产生偏好。例如苏氨酸(Thr)可以由ACA，ACC，ACG或者ACT编码，但是在哺乳动物细胞中ACC是最为常用的密码子；在其他的物种中，例如昆虫细胞、酵母、病毒或者细菌中，可能对不同的苏氨酸密码子有所偏好。特定物种的偏好密码子可以通过本领域内已知的多种方法引入到本发明的多核苷酸中。向重组DNA中引入偏好密码子序列可以例如使特定细胞类型或者物种中的蛋白质翻译更为高效来增强蛋白质的生成。因此，本文公开的简并密码子序列可作为优化多肽在本领域内常用的以及本文公开的多种细胞类型和物种中表达的模板。含有偏好密码子的序列可以在多种物种中进行检测并且用于表达优化，并且可根据这里所公开的内容对其功能性进行检测。
可以使用多种不同的方法分离编码IL-22RA的cDNA，例如通过使用完整的或者部分的人cDNA作为探针，或者使用基于所公开序列的一组或者多组简并探针。还可以利用根据本文公开的代表性人IL-22RA序列设计的引物进行聚合酶链式反应得到cDNA。此外，可以使用cDNA文库转化或者转染宿主细胞，并且可以使用抗IL-22RA多肽的抗体检测目标cDNA的表达。
本领域内技术人员会认识到，SEQ ID NO：1中公开的序列代表了人IL-22RA的一个单等位基因，并且预计存在等位变异和可变剪接。该序列的等位变体可以根据标准的步骤，通过探查来自不同个体的cDNA或者基因组文库进行克隆。本文公开的核苷酸序列的等位变体，包括那些含有沉默突变的变体以及那些突变导致氨基酸序列改变的变体，均在本发明范畴内；作为本文公开的氨基酸序列的等位变体的蛋白质也在本发明范畴内。由可变方式剪接的mRNA产生、保留了IL-22RA多肽性质的cDNA分子也包含在本发明的范畴内；由这种cDNA和mRNA编码的多肽也包括在本发明的范畴内。可以通过本领域内已知的标准步骤，通过探查来自不同个体或者组织的cDNA或者基因组文库，克隆出这些序列的等位变体和剪接变体。
使用以上讨论的方法，本领域内普通技术人员可以制备多种多肽，所述的多肽包含与SEQ ID NO：1基本同源的可溶性IL-22RA受体亚基或者编码SEQ ID NO：3所示氨基酸的可溶性IL-22RA受体亚基或者上述多肽的等位变体，它们保留了野生型IL-22RA受体的配基结合性质。这种多肽还可以包括如这里所一般性公开的其他多肽片段。
在本发明的某些实施方案中，所述分离的核酸分子可以在严谨条件下与包含本文公开的核苷酸序列的核酸分子发生杂交。例如，这种核酸分子可以在严谨条件下与包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子发生杂交；或者与包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的互补核 苷酸序列或者其片段的核酸分子发生杂交。
一般而言，严谨条件选择成比在确定的离子强度和pH下该特异序列的热溶解温度(Tm)大约低5℃。Tm是50％的目标序列与完全匹配的探针发生杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。杂交后，可以在严谨条件下或者高度严谨条件下漂洗核酸分子以去除未杂交的核酸分子。参见例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A LaboratoryManual，Second Edition(Cold Spring Harbor Press1989)；Ausubelet al.，(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley and Sons，Inc.1987)；Berger and Kimmel(eds.)，Guideto Molecular Cloning Techniques，(Academic Press，Inc.1987)；以及Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。序列分析软件例如OLIGO6.0(LSR；Long Lake，MN)以及PrimerPremier4.0(Premier Biosoft International；Palo Alto，CA)，还有因特网上的站点均是可以获得的工具，可用于分析给定的序列，并且根据使用者确定的标准计算Tm值。针对使用的特定多核苷酸杂合体调整杂交和漂洗的条件完全在本领域内技术人员的能力范围内。
本发明还提供了独立的IL-22RA多肽，它们与SEQ ID NO：3所示多肽有实质上相似的序列一致性，或者其定向进化同源蛋白质。这里使用术语“大体相似的序列一致性”来表示与SEQ ID NO：3所示的序列有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、例如96％、97％、98％或者大于95％的序列一致性的多肽，或者其定向进化同源蛋白质。例如可以使用IL-22RA受体的变体或者定向进化同源蛋白质来激发免疫应答，产生针对人IL-22RA的交叉反应抗体。这种抗体可以是人化的，并且根据这里的描述进行修饰，并治疗性地用于牛皮癣、牛皮癣性关节炎、IBD、结肠炎、内毒素血症以及本文所述的其它治疗性应用。
本发明还涉及可使用下面两个标准鉴别出来的IL-22RA变体核酸 分子：确定所编码的多肽与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的相似性，以及杂交检测。这种IL-22RA变体包括具有以下性质的核酸分子：(1)在严谨的漂洗条件下与具有SEQ ID NO：1(或者其互补物)所示核苷酸序列的核酸分子保持杂交状态，其中的漂洗严谨性相当于0.5x-2xSSC加0.1％SDS，在55-65℃，以及(2)编码的多肽与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或者大于95％(例如96％、97％、98％或者99％)的序列一致性。或者，IL-22RA变体可以被表征为具有以下性质的核酸分子：(1)在高度严谨的漂洗条件下与具有SEQ ID NO：1(或者其互补物)所示核苷酸序列的核酸分子保持杂交，其中所述漂洗严谨性相当于0.1x-0.2x SSC加0.1％SDS，在50-65℃，以及(2)编码的多肽与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或者大于95％(例如96％、97％、98％或者99％或者更高)的序列一致性。
根据常规方法确定百分比序列一致性。参见例如，Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603(1986)，and Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1992)。简而言之，比对两个氨基酸序列，其中使用缺口开放罚10分、缺口延伸罚1分、利用表3所示的Henikoff和Henikoff(参考文献同上)设计的“blosum62”评分矩阵(用标准的单字母代码表示氨基酸)优化比对分数。然后按照下面的公式计算百分比一致性：([相同匹配的总数]/[较长序列的长度+为了比对两个序列而在较长序列中引入的缺口的数目])(100)。
表3
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 20 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
本领域内的技术人员应当理解有许多现成的算法可用于对两个氨基酸序列进行比对。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法是检查本文所公开的氨基酸序列与推定的IL-22RA变体的氨基酸序列之间所共享的序列一致性水平的适宜的蛋白质比对方法。FASTA算法在Pearson and Lipman，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA85：2444(1988)，以及Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)中有所描述。简而言之，FASTA不考虑保守氨基酸替代、插入或者缺失，而是首先找出询问序列(例如SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3)和检测序列之间共有的具有最高一致性密度(如果ktup变量＝1)或者最高一致性配对密度(如果ktup＝2)的区域，从而辨别序列相似性。然后通过使用氨基酸替代矩阵比较所有配对氨基酸的相似性，对10个具有最高一致性密度的区域进行重新评分，对区域的末端进行“修剪”使其只包括那些对最高分数有贡献的残基。如果有几个区域的得分大于“cutoff”值(通过依据序列长度和ktup数值的预先确定的公式进行计算)，则检查被修剪的起始区域，确定是否可以将这些区域加入进来以形成具有缺口的大致比对。最后，使用修改的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974)，这个算法允许氨基酸插入和缺失的存在)，比对两个氨基酸序列中最高评分的区域。FASTA分析的例证性参数是：ktup＝1，缺口开放罚10分，缺口延伸罚1分，替代矩阵＝blosum62。通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)，将这些参数引入到一个FASTA程序中，这在Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)的附录2中有所解释。
还可以使用FASTA确定核酸分子的序列一致性，使用上面公开的比例。对于核苷酸序列的比较，ktup值可以在1到6之间，优选为3到6，最优选为3，其他参数的设置如上所述。
本发明包括编码与本文公开的氨基酸序列相比具有保守氨基酸改 变的多肽的核酸分子。例如，可以得到变体，它们含有具有一个或者更多对SEQ ID NO：3所示序列的氨基酸替代，其中烷基氨基酸被替代为IL-22RA氨基酸序列中的烷基氨基酸，芳香氨基酸被替代为IL-22RA氨基酸序列中的芳香氨基酸，含硫氨基酸被替代为IL-22RA氨基酸序列中的含硫氨基酸，含羟基氨基酸被替代为IL-22RA氨基酸序列中的含羟基氨基酸，酸性氨基酸被替代为IL-22RA氨基酸序列中的酸性氨基酸，碱性氨基酸被替代为IL-22RA氨基酸序列中的碱性氨基酸，或者二碱性单羧基氨基酸被替代为IL-22RA氨基酸序列中的二碱性单羧基氨基酸。在常见的氨基酸中，例如，“保守氨基酸替代”的示例是以下每个组内的氨基酸替代：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(3)丝氨酸和苏氨酸；(4)天冬氨酸和谷氨酸；(5)谷氨酰胺和天冬酰胺；以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表格是氨基酸替代矩阵，它来自大约2000个蛋白质序列片段的局部多重比对，代表了500组以上相关蛋白的高度保守区域(Henikoff and Henikoff，Proc.Nat’1 Acad.Sci.USA89：10915(1992))。因此，BLOSUM62替代频率可以用来确定可以引入到本发明氨基酸序列中的保守氨基酸替代。尽管有可能可以只根据化学性质设计氨基酸替代(如上面讨论的)，语句“保守氨基酸替代”优选指的是BLOSUM62数值大于-1所表示的替代。例如，如果一个氨基酸替代的BLOSUM62数值是0、1、2或者3，则该替代是保守的。根据这个系统，优选的保守氨基酸替代的特征是BLOSUM62数值至少是1(例如1、2或者3)，而更为优选的保守氨基酸替代的特征是BLOSUM62数值至少是2(例如2或者3)。IL-22RA的特殊变体的特征是，与相应的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：3)相比，具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或者大于95％(例如96％、97％、98％或者99％或更高)的序列一致性，其中氨基酸序列的变异是由于一个或者更多的保守氨基酸替代造成的。
可以通过例如用核苷酸代替SEQ ID NO：1中的核苷酸，向IL-22RA 基因中引入保守氨基酸改变。可以通过寡核苷酸指导的诱变、接头扫描诱变、使用聚合酶链式反应进行的诱变等等(参见Ausubel(1995)；and McPherson(ed.)，Directed Mutagenesis：APractical Approach(IRL Press1991))得到这种“保守氨基酸”变体。可以通过其特异结合抗IL-22RA抗体的能力鉴定变体IL-22RA多肽。
本发明的蛋白质还可包含非天然存在的氨基酸残基。非天然氨基酸残基包括、但不限于反式-3-甲基脯氨酸，2，4-甲烷脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟甲基半胱氨酸、羟甲基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、2-甲基哌啶酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸以及4-氟苯丙氨酸。在本领域内已知有一些方法可将非天然存在的氨基酸残基掺入到蛋白质中。例如，可以使用体外系统，其中无义突变被化学氨酰化的抑制子tRNA抑制。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域内已知的。通常使用包含大肠杆菌S30提取物和商品化的酶以及其他试剂的无细胞系统对含有无义突变的质粒进行转录和翻译。使用层析纯化蛋白质。参见例如Robertson et al.，J.Am.Chem.Soc.113：2722(1991)，Ellman et al.，MethodsEnzymol.202：301(1991)，Chung et al.，Science259：806(1993)，and Chung et al.，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA90：10145(1993).
在第二种方法中，将突变的mRNA和化学氨酰化的抑制子tRNA微注射到非洲爪蟾卵母细胞中(Turcatti et al.，J.Biol.Chem.271：19991(1996))进行翻译。在第三种方法中，在缺乏待被取代的天然氨基酸(例如苯丙氨酸)且存在所需的非天然存在氨基酸(例如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或者4-氟苯丙氨酸)的条件下培养大肠杆菌细胞。该非天然存在的氨基酸被掺入到蛋白质中，替代了其天然的对应物。参见Koide et al.，Biochem.33：7470 (1994)。可以通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转变为非天然存在的氨基酸残基。可以将化学修饰与定点诱变相结合，以进一步扩展替代的范围(Wynn and Richards，Protein Sci.2：395(1993))。
有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸以及非天然氨基酸均可以取代IL-22RA中的氨基酸残基。
可以根据本领域内已知的步骤，例如定点诱变或者丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells，Science244：1081(1989)，Bass et al.，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA88：4498(1991)，Coombs and Corey，“Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering，”inProteins：Ahalysis and Design，Angeletti(ed.)，pages259-311(Academic Press，Inc.1998))，鉴定出本发明多肽内的必需氨基酸。在后一种技术中，在该分子中的每一个残基处都引入单一丙氨酸突变，检测产生的突变体分子的生物活性，以鉴定出对于该分子的活性而言至关重要的氨基酸残基。还可以参见Hilton et al.，J.Biol.Chem.271：4699(1996)。
尽管可以使用序列分析进一步确定IL-22RA的配基结合区域，在IL-22RA结合活性(例如IL-22RA与配基IL-22的结合，或者与抗IL-22RA抗体的结合)中起作用的氨基酸还可以根据对结构的物理分析如核磁共振、晶体学、电子衍射或者光亲和标记等方法，以及对推定的接触位点氨基酸进行突变来确定。参见例如，de Vos et al.，Science255：306(1992)，Smith et al.，J.Mol.Biol.224：899(1992)，and Wlodaver et al.，FEBS Lett.309：59(1992)。
可以进行多个氨基酸替代，并且使用已知的诱变和筛选方法进行测试，例如由Reidhaar-Olson和Sauer公开的方法(Science241：53 (1988))或由Bowie和Sauer公开的方法(Proc.Nat’1Acad.Sci.USA86：2152(1989))。简而言之，这些作者公开了同时使多肽中的两个或者多个位置随机化，选择有功能的多肽，然后对诱变的多肽进行测序，以确定在每一个位置上允许存在的替换的范围的方法。其他可以使用的方法包括噬菌体展示(e.g.，Lowman et al.，Biochem.30：10832(1991)，Ladner et al.，U.S.Patent No.5,223,409，Huse，国际出版物编号WO92/06204，)以及区域定位诱变(Derbyshire etal.，Gene46：145(1986)，and Ner et al.，DNA7：127，(1988))。此外，经生物素或者FITC标记的IL-22RA可以用于IL-22RA配基的表达克隆。
所公开的IL-22RA核苷酸和多肽序列变体还可以通过Stemmer，Nature370：389(1994)，Stemmer，Proc.Nat 1 Acad.Sci.USA91：10747(1994)，以及国际出版物编号WO97/20078公开的DNA改组技术产生。简而言之，使亲本DNA随机片段化，然后使用PCR重新装配，产生随机引入的点突变，由此进行体外同源重组，产生变体DNA分子。通过使用一组亲本DNA分子，例如等位变体或者来自不同物种的DNA分子，向该过程中引入额外的变异性，可以对这个技术进行修改。通过选择和筛选所需活性、随后进行额外的反复突变以及检测，可以选择合意的突变而同时淘汰有害的改变，从而为序列提供了迅速的“进化”。
本文公开的诱变方法可以与高通量、自动化的筛选方法结合起来，以检测宿主细胞中克隆的诱变多肽的活性。可以从宿主细胞中回收编码生物活性多肽或者与抗IL-22RA抗体结合的多肽的诱变DNA分子，并且使用现代的仪器进行迅速测序。这些方法可以迅速地确定目标多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且可以应用到未知结构的多肽上。
本发明还包括了IL-22RA多肽的“功能性片段”以及编码这些功 能性片段的核酸分子。可以对核酸分子进行常规缺失分析，以获得编码IL-22RA多肽的核酸分子的功能性片段。作为示例，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA分子可以使用Ba131核酸酶进行消化，获得一系列的嵌套缺失。然后按照正确的阅读框将这些片段插入到表达载体中，分离表达的蛋白并且检测其结合抗IL-22RA抗体的能力。相对于核酸外切酶消化，另一个选择是使用寡核苷酸介导的诱变，以引入缺失或者终止密码子，从而确定所需片段的制备。或者，可以使用聚合酶链式反应合成IL-22RA基因的特殊片段。
有关干扰素的一个或者两个末端的截短研究作为示例阐述了这一一般性的方法，这在Horisberger and DiMarco，Pharmac.Ther.66：507(1995)有概述。而且，对于蛋白质功能分析的标准方法在例如以下文献中有所描述：Treuter et al.，Molec.Gen.Genet.240：113(1993)，Content et al.，“Expression and preliminary deletionanalysis of the42kDa2-5A synthetase induced by humaninterferon，”Biological Interferon Systems，Procaedings ofISIR-TNOMeeting on Interferon Systems，Cantell(ed.)，65-72页(Nijhoff1987)，Herschman，“The EGFReceptor，”Control ofAnimal Cell Proliferation，Vol.1，Boynton et al.，(eds.)169-199页(Academic Press1985)，Coumailleau et al.，J.Biol.Chem.270：29270(1995)；Fukunaga et al.，J.Biol.Chem.270：25291(1995)；Yamaguchi et al.，Biochem.Pharmacol.50：1295(1995)，和Meisel et al.，Plant Molec.Biol.30：1(1996)。
对本文公开的特殊序列进行分析，提供了一组示例性的功能性片段，如表4所示。编码本文描述的额外人IL-22RA功能变体结构域的核苷酸未在表4中示出，它们可以参考SEQ ID NO：1确定。这种功能片段包括例如SEQ ID NO：1中的下列核苷酸序列：SEQ ID NO：1的85-381、206-717和85-717号核苷酸以及它们编码的对应氨基酸序列， 如序列2和序列3分别所示。
表4
| IL-22RA特征 | 氨基酸残基(SEQ ID NO：2) | 核苷酸(SEQ ID NO：1) |
| 第一个Ig结构域 | 18-116 | 85-381 |
| 第二个Ig结构域 | 125-228 | 206-717 |
| 两个Ig结构域 | 18-228 | 85-717 |
本发明还涉及了IL-22RA基因的功能片段，所述片段与这里所公开的氨基酸序列相比具有氨基酸的改变。IL-22RA基因变体可以按照上面的讨论，通过测定它与公开的核苷酸和氨基酸序列的一致性水平，根据结构进行鉴定。根据结构鉴别变体基因的另一个方法是确定编码潜在变体IL-22RA基因的核酸分子是否能够与包含例如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子进行杂交。
本发明还包括使用IL-22RA多肽的功能片段、抗原性表位、IL-22RA多肽的携带表位的部分以及编码这些功能片段、抗原性表位、IL-22RA多肽的携带表位的部分的核酸分子。这些片段可用于产生多肽，以便于可结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22活性或者IL-20和IL-22二者活性的产生抗体和结合伴侣。“功能性的”IL-22RA多肽或者如这里确定的它的片段，其特点是能够阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20或IL-22促炎、增殖或者分化活性，以及能够诱导或者抑制特化细胞功能，或者能够与抗IL-22RA抗体、细胞、IL-20或IL-22特异结合。如在这里前面所描述的，IL-22RA的特征是具有II类细胞因子受体结构和本文描述的结构域。因此，本发明还涉及使用包括下面(a)和(b)的融合蛋白：(a)包含一个或者更多以上描述的结构域的多肽分子；以及(b)包含一个或者更多这些结构域的功能片段。融合蛋白的另一个多肽部分可以由另一II类细胞因子受 体提供，例如IL-10R，IL-13R，IL-20RA，IL-20RB，IL-10RB(CRF2-4)，IL-22RA2，或者由有助于融合蛋白分泌的非天然的和/或不相关的分泌信号肽提供。
本发明还提供了多肽片段或者肽，它们包含本文描述的IL-22RA多肽的携带表位的部分。这样的片段或者肽可以包含“免疫原性表位”，它是蛋白的一部分，当该整个蛋白用作免疫原时，该部分可诱发抗体应答。携带免疫原性表位的肽可以使用标准的方法(参见例如Geysen et al.，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA81：3998(1983))进行鉴定。
相反，多肽片段或者肽可以包含“抗原性表位”，它是蛋白质分子中抗体可以与之特异结合的一个区域。某些表位由一段线性或者连续氨基酸组成，这种表位的抗原性不被变性剂破坏。在本领域内已经知道可以使用模拟蛋白质表位的相对较短的合成肽刺激产生针对该蛋白质的抗体(参见例如Sutcliffe et al.，Science219：660(1983))。因此，本发明的携带抗原性表位的肽、抗原性肽、表位以及多肽对于产生与本文描述的多肽相结合的抗体是有用的，也可以用于鉴定和筛选抗IL-22RA单克隆抗体，所述抗体是中和性的，可能结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22和IL-20(分别或者一起)的活性。本发明的这种中和性单克隆抗体可以与IL-22RA抗原性表位结合。可以使用Hopp/Woods亲水性图确定在SEQ ID NO：3中具有最高抗原性潜力的区域(Hopp et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun.Meth.88：1-18，1986and Triquier et al.， Protein Engineering11：153-169，1998)。该图基于的是滑动的六残基窗口。忽略被盖住的G、S和T残基以及暴露出的H、Y和W残基。本领域技术人员可以在IL-22RA中确定这些区域。而且，根据Jameson-Wolf曲线、使用例如DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)预测的SEQ ID NO：3中的IL-22RA抗原性表位可以作 为优选的抗原性表位，它们可以由本领域技术人员确定。这种抗原性表位包括：(1)SEQ ID NO：3中1(Pro)到6(Asp)号氨基酸残基；(2)SEQ ID NO：3中26(Ser)到32(Pro)号氨基酸残基；(3)SEQID NO：3中41(Lys)到47(Asp)号氨基酸残基；(4)SEQ ID NO：3中49(Val)到62(Cys)号氨基酸残基；(5)SEQ ID NO：3中41(Lys)到62(Cys)号氨基酸残基；(6)SEQ ID NO：3中84(Ala)到97(Ser)号氨基酸残基；(7)SEQ ID NO：3中103(Thr)到108(Asp)号氨基酸残基；(8)SEQ ID NO：3中130(Arg)到135(His)号氨基酸残基；(9)SEQ ID NO：3中164(Gly)到166(Lys)号氨基酸残基；(10)SEQ ID NO：3中175(Tyr)到179(Glu)号氨基酸残基；(11)SEQ ID NO：3中193(Lys)到196(Ala)号氨基酸残基；(12)SEQ ID NO：3中203(Lys)到209(Thr)号氨基酸残基。其他的表位包括以下的肽，它们可以由未被还原的全长人IL-RA22经过溴化氰切割后产生：肽6(SEQ ID NO：56)，肽7(SEQ ID NO：57)；肽8(SEQ ID NO：58)；肽9(SEQ ID NO：59)；肽10(SEQ ID NO：60)；以及肽11(SEQ IDNO：61)。半胱氨酸形成二硫键，这使肽7(SEQID NO：57)和肽10(SEQ ID NO：60)有可能连接在一起。特别地，SEQ ID NO：56对应于SEQ ID NO：3的1(Pro)到92(Met)号氨基酸残基；SEQ ID NO：57对应于SEQ ID NO：3的93(Thr)到120(Met)号氨基酸残基；SEQ ID NO：58对应于SEQ ID NO：3的121(Ile)到160(Met)号氨基酸残基；SEQ ID NO：59对应于SEQ ID NO：3的161(His)到185(Met)号氨基酸残基；SEQ ID NO：60对应于SEQ IDNO：3的186(Ile)到199(Met)号氨基酸残基；SEQ ID NO：61对应于SEQ ID NO：3的200(Cys)到211(Thr)号氨基酸残基。此外，SEQ ID NO：2中对于配基-受体结合比较重要的残基(以及SEQ ID NO：3中的相应残基)包含SEQ ID NO：2中的Tyr-60，Phe-164，Tyr-93，Arg-112，Lys-210，以及Glu-211(以及SEQ ID NO：3的对应残基)。而且，SEQ ID NO：2中对于配基-受体直接结合比较重要的初级残基(以及SEQ ID NO：3的相应残基)包含SEQ ID NO：2中的Tyr-60 和Phe-164(以及SEQ ID NO：3的对应残基)；次级残基包含SEQ ID NO：2的Tyr-93，Arg-112，Lys-210，以及Glu-211(以及SEQ ID NO：3的对应残基)。在优选的实施方案中，与本发明的中和性抗体结合的抗原性表位将含有SEQ ID NO：2中对于配基-受体结合(例如对于IL-22RA与IL-20或者IL-22(单独或者一起)的结合)比较重要的残基(以及SEQ ID NO：3的对应残基)。
携带抗原性表位的肽以及多肽可以含有本文公开的氨基酸序列中至少4到10个氨基酸，至少10到15个氨基酸，或者大约15到大约30个氨基酸。如本文描述的，这种携带表位的肽和多肽可以通过使IL-22RA片段化或者通过化学肽合成而获得。而且可以通过随机肽文库的噬菌体展示来选择表位(参见例如Lane and Stephen，Curr.Opin.Immunol.5：268(1993)，以及Cortese et al.，Curr.Opin.Biotechnol.7：616(1996))。鉴定表位和从包含表位的小肽制备抗体的标准方法在以下文献中有所描述：例如Mole，“EpitopeMapping，”in Methods in Molecular Biology，Vol.10，Manson(ed.)，pages105-116(The Humana Press，Inc.1992)，Price，“Production and Characterization of Synthetic Peptide-DerivedAntibodies，”Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter and Ladyman(eds.)，pages60-84(Cambridge University Press1995)，以及Coligan et al.(eds.)，Current Protocols in Immunology，pages9.3.1-9.3.5and pages9.4.1-9.4.11(John Wiley&Sons1997).
对于任何的IL-22RA多肽，包括变体和融合蛋白，本领域技术人员可以很容易地根据上面的表1和表2中提供的信息，制备编码该变体的完全简并的多核苷酸序列。而且，本领域技术人员可以使用标准的软件，根据本文描述的核苷酸和氨基酸序列设计IL-22RA变体。
5.IL-22RA多肽的制备
本发明的多肽，包括全长的多肽；可溶性单体、均二聚体、杂二聚体和多聚体受体；全长受体；受体片段(例如配基结合片段和抗原性表位)；功能性片段以及融合蛋白，均可以按照常规的技术在重组宿主细胞中制备。为了表达IL-22RA基因，编码多肽的核酸分子必须与在表达载体中控制转录表达的调控序列可操作性连接，然后引入到宿主细胞中。除了例如启动子和增强子等转录调控序列外，表达载体可以包括翻译调控序列和适于选择携带表达载体的细胞的标记基因。
适于在真核细胞中生产外源蛋白的表达载体通常含有(1)编码细菌复制起点的原核DNA元件以及抗生素抗性标记基因，以提供表达载体在细菌宿主中的生长和选择；(2)控制转录起始的真核DNA元件，例如启动子；以及(3)控制转录产物加工的DNA元件，例如转录终止/多聚腺苷酸化序列。正如上面讨论的，表达载体还可以包括编码分泌序列的核苷酸序列，该分泌序列指导异源多肽进入到宿主细胞的分泌途径中。例如，IL-22RA表达载体中可能包含IL-22RA基因和来自任何分泌基因的分泌序列。
本发明的IL-22RA蛋白可以在哺乳动物细胞中表达。适宜的哺乳动物宿主细胞实例包括非洲绿猴肾细胞(Vero；ATCC CRL1587)，人胚胎肾细胞(293-HEK；ATCC CRL1573)，幼仓鼠肾细胞(BHK-21，BHK-570；ATCC CRL8544，ATCC CRL10314)，狗肾细胞(MDCK；ATCCCCL34)，中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1；ATCC CCL61；CHO DG44(Chasinet al.，Som.Cell.Molec.Genet.12：555，1986))，大鼠垂体细胞(GH1；ATCC CCL82)，HeLa S3细胞(ATCC CCL2.2)，大鼠肝瘤细胞(H-4-II-E；ATCC CRL1548)，转化了SV40的猴肾细胞(COS-1；ATCCCRL1650)以及鼠胚胎细胞(NIH-3T3；ATCC CRL1658)。
对于哺乳动物宿主，转录和翻译调控信号可以来源于哺乳动物病毒，例如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猴病毒等等，其中调控信号与具有高表达水平的特定基因有关联。适宜的转录和翻译调控序列还可以从哺乳动物基因例如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白和金属硫蛋白基因中得到。
转录调控序列包括足以指导RNA合成起始的启动子区域。适宜的真核启动子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer et al.，J.Molec.Appl.Genet.1：273(1982))，疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell31：355(1982))，SV40早期启动子(Benoist et al.，Nature290：304(1981))，劳氏肉瘤病毒启动子(Gorman et al.，Proc.Nat′1Acad.Sci.USA79：6777(1982))，巨细胞病毒启动子(Foecking et al.，Gene45：101(1980))，以及小鼠乳腺肿瘤病毒启动子(总体参见Etcheverry，“Expression of Engineered Proteinsin Mammalian Cell Culture，”Protein Engineering：Principles andPractice，Cleland et al.(eds.)，pages163-181(John Wiley&Sons，Inc.1996)).
或者，如果原核启动子受到真核启动子的调控，则可以使用该原核启动子，例如噬菌体T3RNA聚合酶启动子，来控制IL-22RA基因在哺乳动物细胞中的表达(Zhou et al.，Mol.Cell.Biol.10：4529(1990)，以及Kaufman et al.，Nucl.Acids Res.19：4485(1991))。
在某些实施方案中，编码IL22RA可溶性受体多肽或者IL-RA22多肽的片段的DNA序列与其表达所需的其他遗传元件(一般包括转录启动子和终止子)在表达载体中可操作性相连。该载体通常还共同含有一个或者更多的选择性标记以及一个或者更多的复制起点，尽管本领域技术人员会认识到，在某些系统内，选择标记可以在不同的载体上提供，并且该外来DNA的复制可以通过整合到宿主细胞的基因组内 来提供。对于启动子、终止子、选择标记、载体和其他元件的选择是本领域普通技术人员的常规事务。许多这样的元件在文献中有所描述，并且可以通过商业供应商提供。可溶性受体复合体的多个组分可以在不同的表达载体上或者在单一表达载体上被共转染。这种表达蛋白质复合体的多组分的技术是本领域内众所周知的。
可以使用多种不同的标准技术，包括磷酸钙转染、脂质体介导的转染、微抛射体介导的投递、电穿孔等等，将表达载体引入宿主细胞中。可以对被转染的细胞进行选择和增殖，以提供包含稳定整合在宿主细胞基因组中的表达载体的重组宿主细胞。向真核细胞引入载体的技术和使用显性选择标记选择这种稳定转化子的技术在例如Ausubel(1995)和Murray编辑的Gene Transfer and Expression Protocols(Humana Press1991)中有所描述。
例如，一种适宜的选择标记是提供对抗生素新霉素抗性的基因。在这种情况下，在新霉素类型药物如G-418等存在的条件下进行选择。还可以使用选择系统来提高目标基因的表达水平，这个过程被称为“扩增”。扩增如以下进行：在低水平选择药剂存在的情况下培养转染子，然后提高选择药剂的量，选择产生高水平的所引入基因产物的细胞。适宜的可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)，它使细胞对氨甲喋呤具有抗性。还可以使用其他药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰基转移酶)。或者可以使用引入改变表型的标记，例如绿色荧光蛋白或者细胞表面蛋白例如CD4，CD8，I类MHC，胎盘碱性磷酸酶，通过FACS分选或者磁性珠分离技术等方式将转染的细胞与未转染的细胞分选开。
还可以使用病毒投递系统通过培养的哺乳动物细胞制备IL-22RA多肽。用于该目的的示例性病毒包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘病毒和腺伴随病毒(AAV)。作为双链DNA病毒的腺病毒是现在研究得最为充分的用于异源核酸投递的基因转移载体(综述参见Becker et al.，Meth.Cell Biol.43：161(1994)，and Douglas and Curiel，Science&Medicine4：44(1997))。腺病毒系统的优势包括可以容纳相对较大的DNA插入物、具有生长至高滴度的能力、具有感染广泛哺乳动物细胞类型的能力以及灵活机动性，可以与大量含有不同启动子的现成载体一起使用。
通过缺失腺病毒的部分基因组，可以容纳较大(可达7kb)的异源DNA。这些插入物可以通过直接连接或者通过与共转染质粒发生同源重组而掺入到病毒DNA中。一个选择是从病毒载体中缺失必需的E1基因，这将导致载体在宿主细胞不提供E1基因的情况下不能复制。例如，腺病毒载体感染的人293细胞(ATCC编号CRL-1573，45504，45505)，可以作为贴壁细胞培养或者以较高的细胞密度悬浮培养，产生大量的蛋白(参见Garnier et al.，Cytotechnol.15：145(1994))。
IL-22RA还可以在其他的高等真核生物细胞中表达，例如禽、真菌、昆虫、酵母或者植物细胞。杆状病毒系统提供了一个有效的方式，可以将克隆的IL-22RA基因引入到昆虫细胞中。适宜的表达载体是以苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)为基础的，其中含有众所周知的启动子，例如果蝇热激蛋白70(hsp)启动子，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒立即早期基因启动子(ie-1)和延迟早期39K启动子，杆状病毒p10启动子以及果蝇金属硫蛋白启动子。第二种制备重组杆状病毒的方法是使用基于转座子的系统，在Luckow(Luckow，et al.，J.Virol.67：4566(1993)中有所描述。该系统使用了转移载体，在BAC-to-BAC试剂盒(Life Technologies，Rockville，MD)中有售。该系统使用的转移载体PFASTBAC(LifeTechnologies)中含有Tn7转座子，可以将编码IL-22RA多肽的基因转移到杆状病毒的基因组中，所述杆状病毒作为一个大型的质粒被维持在大肠杆菌中，称为“杆粒”。参见Hill-Perkins and Possee，J.Gen.Viroi.71：971(1990)，Bonning，et al.，J.Gen.Virol. 75：1551(1994)，and Chazenbalk，and Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995)。此外，转移载体可以包括在表达的IL-22RA多肽的C或者N端与编码表位标签、例如Glu-Glu表位标签(Grussenmeyer etal.，Proc.Nat’1Acad.Sci.82：7952(1985))的DNA形成的阅读框内融合。使用本领域内已知的技术，将含有IL-22RA基因的转移载体转化到大肠杆菌中，筛选含有被打断的1acZ基因(表明是重组杆状病毒)的杆粒。然后使用通常的技术将含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA分离出来。
可以对示例性的pFastBac修饰相当大的程度。例如，可以去除多角体蛋白启动子，并替换为杆状病毒碱性蛋白启动子(还被称为Pcor，p6.9或者MP启动子)，该启动子在杆状病毒感染的更早期表达，并且已经表明其对于表达分泌型蛋白是有益的(参见例如Hill-Perkins and Possee，J.Gen.Virol.71：971(1990)，Bonning，et al.，J.Gen.Virol.75：1551(1994)，以及Chazenbalk andRapoport，J.Biol.Chem.270：1543(1995))。在这种转移载体构建体中，可以使用短的或者长的碱性蛋白启动子。而且，可以构建这样的转移载体，其中将天然的IL-22RA分泌信号序列替换为来自昆虫蛋白的分泌信号序列。例如，来自蜕皮甾醇葡糖基转移酶(EGT)、蜜蜂的蜂毒素(Invitrogen Corporation；Carlsbad，CA)或者杆状病毒gp67(PharMingen：San Diego，CA)的分泌信号序列均可以被用在构建体中，代替天然的IL-22RA分泌信号序列。
使用重组病毒或者杆粒转染宿主细胞。适宜的昆虫宿主细胞包括来源于IPLB-Sf-21(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)蛹的卵巢细胞系)的细胞系，例如Sf9(ATCC CRL1711)，Sf21AE，和Sf21(Invitrogen Corporation；San Diego，CA)，以及果蝇Schneider-2细胞，和来源于拟尺蠖(Trichoplusia ni)的HIGH FIVEO细胞系(Invitrogen)(美国专利编号5，300,435)。可使用商品化的无血清 培养基生长和维持这些细胞。适宜的培养基有Sf900IITM(LifeTechnologies)或者ESF921TM(Expression Systems)(用于Sf9细胞)；以及Ex-cell0405TM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)或者Express Fi veOTM(Life Technologies)(用于T.刀i细胞)。当使用重组病毒时，通常细胞的接种密度是大致2-5x105个细胞，将细胞培养到密度为1-2x106个细胞，此时加入重组病毒储液，感染复数(MOI)为0.1到10，更通常是接近3。
在杆状病毒系统中制备重组蛋白的成熟技术在以下参考文献中提供：Bailey et al.，“Manipulation of Baculovirus Vectors，”Methods in Molecular Biology，Volume7：Gene Transfer andExpression Protocols，Murray(ed.)，pages147-168(The HumanaPress，Inc.1991)；Patel et al.，“The baculovirus expressionsystem，”DNA Cloning2：Expression Systems，2nd Edition，Gloveret al.(eds.)，pages205-244(Oxford University Press1995)；Ausubel(1995)，pages16-37to16-57；Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(The Humana Press，Inc.1995)；以及Lucknow，“Insect Cell Expression Technology，”in ProteinEngineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages183-218(John Wiley&Sons，Inc.1996)。
也可以使用真菌细胞，包括酵母细胞，来表达本文描述的基因。在这方面特别感兴趣的酵母种包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)，和甲醇毕赤酵母(Pichiame thanolica)。用于在酵母中表达的适宜启动子包括来自GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(乙醇脱氢酶)、AOX(乙醇氧化酶)、HIS4(组氨醇脱氢酶)等等的启动子。已经设计出许多酵母克隆载体，并且可以很容易地获得。这些载体包括基于Ylp的载体例如YIp5，YRp载体例如YRp17，YEp载体例如YEp13以及YCp 载体例如YCp19。用外源DNA转化酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞的方法以及从转化后的酵母细胞中制备重组多肽的方法公开在例如Kawasaki，美国专利编号4,599,311，Kawasaki et al.，美国专利编号4,931,373，Brake，美国专利编号4,870,008，Welch et al.，美国专利编号5,037,743，以及Murray et al.，美国专利编号4,845,075中。根据由选择标记确定的表型来筛选转化的细胞，所述选择标记通常是药物抗性或者是在没有某种营养物(例如亮氨酸)存在时能够生长的能力。适于在酿酒酵母中使用的载体系统是POT1载体系统，这由Kawasaki et al.(美国专利编号4,931,373)公开，该载体系统可以使转化的细胞通过在含有葡萄糖的培养基中生长而筛选出来。其他适宜用于酵母的启动子和终止子包括那些来自糖酵解酶基因(参见例如Kawasaki，美国专利编号4,599,311，Kingsman et al.，美国专利编号4,615,974，和Bitter，美国专利编号4,977,092)以及乙醇脱氢酶基因的启动子和终止子。还可参见美国专利编号4,990,446，5,063,154，5,139,936，和4,661,454。
对于其他酵母，包括多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)，甲醇毕赤氏酵母(Pichia methanolica)，季氏毕赤酵母(Pichia guillermondii)以及麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)的转化系统在本领域内是已知的。参见例如Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.132：3459(1986)，和Cregg，美国专利编号4,882,279。可以根据McKnight et al.，的方法(美国专利编号4,935,349)使用曲霉属(Aspergillus)细胞。转化产黄顶孢霉(Acremonium chrysogenum)的方法在Sumino et al.，美国专利编号5,162,228中予以公开。转化脉孢菌(Neurospora)的方法在Lambowitz，美国专利编号4,486,533中予以公开。
例如，使用甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)作为生产重组蛋白的宿主公开在Raymond，美国专利编号5,716,808，Raymond，美国专利编号5,736,383，Raymond et al.，Yeast14：11-23(1998)，以及在国际申请出版物编号WO97/17450，WO97/17451，WO98/02536，和WO98/02565中予以公开。用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子通常制备为双链环状的质粒，最好在转化之前线性化。对于在毕赤甲醇酵母中制备多肽，质粒中的启动子和终止子可以是毕赤甲醇酵母基因的，例如毕赤甲醇酵母醇利用基因(AUG1或者AUG2)。其他有用的启动子包括二羟丙酮合酶(DHAS)，甲酸脱氢酶(FMD)，以及过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了帮助DNA向宿主染色体中的整合，最好在质粒的整个表达片段的两侧连接宿主DNA序列。用于毕赤甲醇酵母的适宜的选择标记是毕赤甲醇酵母ADE2基因，它编码磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC4.1.1.21)，它可以使ade2宿主细胞在没有腺嘌呤的情况下生长。对于期望甲醇的使用最少的大规模工业化工艺，则可以使用缺失了两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主细胞。对于分泌蛋白的生产，宿主细胞可以缺乏液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)。使用电穿孔来促进将含有编码目标多肽的DNA的质粒引入到毕赤甲醇酵母细胞中。在电穿孔转化毕赤甲醇酵母细胞时，可以使用指数衰减的脉冲电场(场强为2.5-4.5kV/cm，优选为3.75kV/cm)，时间常数(t)为1到40毫秒，最优选为大约20毫秒。
还可以将表达载体引入到植物的原生质体中、完好的植物组织中或者分离的植物细胞中。将表达载体引入到植物组织中的方法包括直接感染或者将植物组织与根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共同培养、微抛射介导的投递、DNA注射、电穿孔等等。参见例如Horschet al.，Science227：1229(1985)，Klein et al.，Biotechnology10：268(1992)，以及Miki et al.，“Procedures for IntroducingForeign DNA into Plants，”Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick et al.(eds.)，pages67-88(CRC Press，1993)。
或者，可以将IL-22RA基因在原核宿主细胞中表达。可以用来在原核宿主中表达IL-22RA多肽的适宜的启动子对于本领域技术人员是众所周知的，它们包括能够识别T4，T3，Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的PR和PL启动子，大肠杆菌的trp，recA，热激，1acUV5，tac，1pp-lacSpr，phoA，以及1acZ启动子，枯草芽孢杆菌的启动子，芽孢杆菌噬菌体的启动子，链霉菌的启动子、噬菌体λ的int启动子、pBR322的bla启动子以及氯霉素乙酰基转移酶基因的CAT启动子。关于原核启动子的综述有Glick，J.Ind.Microbiol.1：277(1987)，Watson et al.，Molecular Biology of the Gene，4thEd.(Benjamin Cummins1987)，以及Ausubel et al.(1995)。
适宜的原核宿主包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。适宜的大肠杆菌菌株包括BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE，DH1，DH4I，DH5，DH5I，DH5IF′，DH5IMCR，DH10B，DH10B/p3，DH11S，C600，HB101，JM101，JM105，JM109，JM110，K38，RR1，Y1088，Y1089，CSH18，ER1451，和ER1647(参见例如Brown(ed.)，MolecularBiologyLabfax(Academic Press1991))。适宜的枯草芽孢杆菌菌株包括BR151，YB886，MI119，MI120，和B170(参见例如Hardy，“BacillusCloning Methods，”DNACloning：A Practical Approach，Glover(ed.)(IRL Press1985))。
当在细菌例如大肠杆菌中表达IL-22RA多肽时，多肽可以被保留在细胞质内，通常作为不溶的颗粒形式，或者可以被细菌的分泌序列指引到胞外周质空间。对于前一种情况，将细胞裂解，回收颗粒并且使用例如异硫氰酸胍或者尿素进行变性。可以通过稀释变性液，例如通过对含有尿素和还原型及氧化型谷胱甘肽混合物的溶液透析，再对 缓冲盐溶液透析，使变性的多肽重折叠并形成二聚体。对于后一种情况，通过破裂细胞(通过例如超声波或者渗透休克)，释放周质空间的内容物并回收蛋白质，从胞外周质空间回收可溶的和有功能的多肽，这样就省掉了变性和重折叠的需要。
在原核宿主中表达蛋白质的方法对于本领域内的技术人员是众所周知的(参见例如Williams et al.，“Expression of foreignproteins in E.coli using plasmid vectors and purification ofspecific polyclonal antibodies，”DNA Cloning2：ExpressionSystems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page15(OxfordUniversity Press1995)，Ward et al.，“Genetic Manipulation andExpression of Antibodies，”Monoclonal Antibodies：Principlesand Applications，page137(Wiley-Liss，Inc.1995)，以及Georgiou，“Expression of Proteins in Bacteria，”in ProteinEngineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，page101(John Wiley&Sons，Inc.1996)).
将表达载体引入细菌、酵母、昆虫和植物细胞中的标准方法在例如Ausubel(1995)中提供。
通过哺乳动物细胞系统表达和回收所生产的外源蛋白质的一般方法在例如Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins inMammalian Cell Culture，”Protein Engineering：Principles andPractice，Cleland et al.(eds.)，pages163(Wiley-Liss，Inc.1996)中提供。回收通过细菌系统产生的外源蛋白质的标准技术在例如Grisshammer et al.，“Purification of over-produced proteinsfrom E.coli cells，”DNA Cloning2：Expression Systems，2ndEdition，Glover et al.(eds.)，pages59-92(Oxford UniversityPress1995)中提供。从杆状病毒系统中分离重组蛋白质的成熟方法 在Richardson(ed.)，Baculovirus Expression Protocols(TheHumana Press，Inc.1995)中描述。
作为另外一种选择，本发明的多肽可以通过完全固相合成、部分固相方法、片段缩合或者经典的溶液合成进行合成。这些合成方法对于本领域内的技术人员是众所周知的(参见例如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149(1963)，Stewart et al.，“Solid Phase PeptideSynthesis”(2nd Edition)，(Pierce Chemical Co.1984)，Bayerand Rapp，Chem.Pept.Prot.3：3(1986)，Atherton et al.，SolidPhase Peptide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press1989)，Fields and Colowick，“Solid-Phase Peptide Synthesis，”Methodsin Enzymology Volume289(Academic Press1997)，以及Lloyd-Williams et al.，Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins(CRC Press，Inc.1997))。完全化学合成策略的变化形式，例如“天然化学连接”和“表达蛋白连接”也是标准方法(参见例如Dawson et al.，Science266：776(1994)，Hackenget al.，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA94：7845(1997)，Dawson，Methods Enzymol.287：34(1997)，Muir et al，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA95：6705(1998)，以及Severinov and Muir，J.Biol.Chem.273：16205(1998))。
本发明的肽和多肽包含SEQ ID NO：3中的至少6个、至少9个或者至少15个毗邻氨基酸残基。作为例证，多肽可以包含SEQ ID NO：3中的至少6个、至少9个或者至少15个毗邻氨基酸残基。在本发明的某些实施方案中，多肽包含这些氨基酸序列中的20，30，40，50，100或者更多的毗邻残基。编码这种肽和多肽的核酸分子可以用作聚合酶链式反应的引物和探针。
而且，IL-22RA多肽及其片段可以作为单体、均二聚体、杂二聚 体或者多聚体在高等真核细胞中表达。这种细胞可以用于产生IL-22RA单体、均二聚体、杂二聚体或者多聚体受体多肽，其中包含至少一个IL-22RA多肽(“包含IL-22RA的受体”或者“包含IL-22RA的受体多肽”)，或者可以在筛选系统中用作检测细胞。在本发明的一个方面中，包含IL-22RA细胞外结构域的本发明多肽由培养细胞产生，该细胞用于筛选受体的配基，包括天然配基IL-22以及天然配基的激动剂和拮抗剂。该方法总结起来是，将编码受体的cDNA或者基因与它的表达所需的其他遗传元件(例如启动子)组合在一起，将产生的表达载体插入到宿主细胞中。选择表达该DNA并且产生功能性受体的细胞，并且在多种不同的筛选系统中使用这些细胞。单体、均二聚体、杂二聚体或者多聚体受体复合体的每一组分都可以在相同细胞中表达。而且，单体、均二聚体、杂二聚体或者多聚体受体复合体的各组分都可以与跨膜结构域融合或者与其他膜融合部分融合，从而可以如上所述进行复合体的装配和转染子的筛选。
为了检测本发明的IL-20和IL-22拮抗剂多肽以及抗体，适宜用于表达包含IL-22RA的受体或者其他已知结合IL-20或IL-22的受体的(例如表达IL-22RA/CRF2-4；以及IL-20RA，IL-20RB，IL-22RA/IL-20RB，或者IL-20RA/IL-20RB的细胞)、并且转导受体介导的信号的哺乳动物细胞包括表达其他受体亚基(这些受体亚基可能与IL22RA或者IL-20RA形成功能复合体)的细胞。这些亚基可能包括那些属于干扰素受体家族或者属于其他类型II或者类型I细胞因子受体的亚基，例如CRF2-4(Genbank登录编号Z17227)，IL-10R(Genbank登录编号U00672和NM-001558)，IL-22RA(共同拥有的美国专利编号5,965,704)，zcytor7(IL-20RA)(共同拥有的美国专利编号5,945,511)，IL-20RA/IL-20RB(WIPO出版物编号WO01/46232)，以及IL-9R。还优选使用与将要表达的受体属于同一物种的细胞。在优选的实施方案中，该细胞的增殖依赖于外加的造血生长因子。这一类型的优选细胞系是人TF-1细胞系(ATCC号CRL-2003)和AML-193 细胞系(ATCC号CRL-9589)，它们是依赖于GM-CSF的人白血病细胞系，以及BaF3(Palacios and Steinmetz，Cell41：727-734，(1985))，它是依赖于IL-3的鼠前B细胞系。其他细胞系包括BHK，COS-1和CHO细胞。可以对适宜的宿主细胞进行工程操作，以产生必需的受体亚基或者其他对于期望的细胞应答所需的细胞组分。这个方法是具有好处的，因为可以对细胞系进行工程操作，使其表达来自任何物种的受体亚基，这样就解决了由于物种特异性而带来的潜在限制。可以克隆人受体cDNA的物种定向进化同源基因，并且用在来自相同物种的细胞系中，例如将小鼠的cDNA用于BaF3细胞系中。这样，依赖于一种造血生长因子例如GM-CSF或者IL-3的细胞系就可以被工程操作，使其依赖于另外一种通过IL-22RA受体起作用的细胞因子，例如IL-22。
表达功能性受体的细胞可用于筛选试验中。在本领域内已知多种不同的适宜试验。这些试验基于的是对目标细胞内生物应答的检测。一种这样的试验是细胞增殖试验。将细胞在有或者没有待测化合物的条件下进行培养，并通过例如测量掺入的氚标记胸腺嘧啶或者基于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，(1983))的代谢降解的比色测试法来检测细胞的增殖。另外一种试验形式使用被进一步工程操作而表达报告基因的细胞。该报告基因与启动子元件相连，所述启动子对于受体相关的途径有响应，该试验检测的是报告基因转录的激活。用于这一目的的优选启动子元件是血清反应元件或者SRE，参见例如Shaw et al.，Cell56：563-572，(1989)。优选的这种报告基因是荧光素酶基因(deWet et al.，Mol.Cell.Biol.7：725，(1987))。可使用本领域内已知的方法(例如Baumgartner et al.，J.Biol.Chem.269：29094-29101，(1994)；Schenborn and Goiffin，Promega_Notes41：11，1993)，通过发光检测荧光素酶基因的表达。可以从例如Promega Corp.，Madison，WI获得荧光素酶活性检测试剂盒。可以使用这种类型的目标细胞系筛选化学物质文库、细胞条件培养基文库、 真菌培养基文库、土壤样品文库、水样品文库等等。例如，可以在目标细胞上对细胞条件培养基样品库进行检测，以鉴定产生配基的细胞。然后使用阳性细胞在哺乳动物载体中制备cDNA文库，将文库分成集合，转染宿主细胞并且表达。然后对来自转染细胞的培养基样本进行检测，接下来继续分割集合、重转染、次培养以及对阳性细胞重检测，以分离克隆的编码配基的cDNA。
在本领域内已知几个对IL-20有应答的细胞系，或者可以构建这样的细胞系，如Baf3/DIRS1/cytoR11细胞系(WIPO出版物编号WO02/072607)。此外，还已知几个对IL-22有应答的细胞系，(Dumontieret al.，J.Immunol.164：1814-1819，2000；Dumoutier，L.et al.， Proc.Nat’1.Acad.Sci.97：10144-10149，2000；Xie MH et al.， J.Biol.Chem.275：31335-31339，2000；Kotenko SV et al.，J.Biol.Chem.276：2725-2732，2001)，以及表达IL-22受体亚基IL-22RA的细胞系。例如，以下的细胞对IL-22有应答：TK-10(Xie MHet al.，见前.)(人肾癌)；SW480(ATCC编号CCL-228)(人结肠腺癌)；HepG2(ATCC编号HB-8065)(人肝癌)；PC12(ATCC编号CRL-1721)(鼠神经元细胞模型；大鼠嗜铬细胞瘤)；和MES13(ATCC编号CRL-1927)(鼠肾小球系膜细胞系)。此外，一些表达IL-22RA(IL-22受体)的细胞系也是对IL-22产生响应的候选细胞系：A549(ATCC编号CCL-185)(人肺癌)；G-361(ATCC编号CRL-1424)(人黑色素瘤)；以及Caki-1(ATCC编号HTB-46)(人肾脏癌)。此外，还可以构建对IL-22有响应的细胞系，例如，本文描述的Baf3/cytoR11/CRF2-4细胞系(WIPO出版物编号WO02/12345)。这些细胞可以用于检测，以测定IL-22RA作为IL-20或者IL-22拮抗剂或者抗炎因子的功能性。
本发明提供的额外筛选方法包括使用杂合体受体多肽。这些杂合体多肽分为两大类。在第一类中，IL-22RA的细胞内结构域与第二受 体的配基结合结构域相连。第二类杂合体受体多肽包含IL-22RA的细胞外(配基结合)结构域(SEQ ID NO：3)以及第二受体(优选为造血性细胞因子受体)的细胞内结构域，以及跨膜结构域。属于第二类的本发明受体的杂合体IL-22RA单体，均二聚体、杂二聚体以及多聚体在已知能够对该第二受体转导的信号产生应答的细胞中表达。总的来说，这两类杂合体受体使鉴定出应答性细胞类型成为可能，这种细胞可以用于开发检测IL-22或者IL-20的测定方法。而且，在竞争类型的测定中，可以在IL-22或者IL-20存在时使用这种细胞测定本发明的可溶性受体拮抗剂。在这种测定中，在本发明的可溶性受体存在的条件下IL-22或者IL-20增殖或者信号转导活性的降低表明了拮抗活性。而且，还可以使用IL-22RA可溶性受体结合检测法(这是一种以细胞为基础的检测法)测定可溶性受体是否结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或者IL-20的活性。
6.IL-22RA融合蛋白和缀合物的制备
IL-22RA类似物的一个一般类型是具有在本文公开的氨基酸序列中存在突变的氨基酸序列的变体。另外一种一般类型的IL-22RA类似物由以下描述的抗独特型抗体及其片段提供。而且，包含抗独特型可变结构域的重组抗体可以用作类似物(参见例如Monfardini et al.，Proc.Assoc.Am.Physicians108：420(1996))。由于抗独特型IL-22RA抗体的可变结构域模拟IL-22RA，这些结构域可以提供IL-22RA结合活性。制备抗独特型催化抗体的方法对于本领域的技术人员是已知的(参见例如Joron et al.，Ann.N Y Acad.Sci.672：216(1992)，Friboulet et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.47：229(1994)，以及Avalle et al.，Ann.N Y Acad.Sci.864：118(1998))。
另一种鉴定IL-22RA类似物的方法通过使用组合文库提供。构建和筛选噬菌体展示以及其他组合文库的方法在以下文献中提供，例如Kay et al.，Phage Display of Peptides and Proteins(AcademicPress1996)，Verdine，美国专利编号5,783,384，Kay，et.al.，美 国专利编号5,747,334，以及Kauffman et al.，美国专利编号5,723,323。
IL-22RA多肽具有体内和体外的用途。作为例证，可以将IL-22RA的可溶性形式加入到细胞培养基中以抑制由培养的细胞产生的IL-22RA配基的作用。
IL-22RA融合蛋白可以用于在重组宿主中表达IL-22RA，并且分离产生的IL-22RA。如下面所描述的，特定的IL-22RA融合蛋白还在诊断和治疗中有用途。一种类型的融合蛋白包含指导IL-22RA多肽离开重组宿主细胞的肽。为了指导IL-22RA多肽进入到真核宿主细胞的分泌途径中，在IL-22RA表达载体中提供分泌信号序列(还被称为信号肽、前导肽、前原序列或者前序列)。尽管分泌信号序列可能来自IL-22RA，适宜的信号序列也可以来自其他的分泌蛋白质或者从头合成。分泌信号序列与IL-22RA编码序列可操作连接，使两个序列按照正确的读码框连接和定位，指导新合成的多肽进入到宿主细胞的分泌途径中。分泌信号序列通常被置于编码目标多肽的核苷酸序列的5′端，某些分泌信号序列也可能被置于目标核苷酸序列的其他位置(参见例如Welch et al.，美国专利编号5,037,743；Holland et al.，美国专利编号5,143，830)。
尽管IL-22RA的分泌信号序列或者由哺乳动物细胞产生的另一种蛋白(例如组织型纤溶酶原激活剂信号序列，如在美国专利编号5,641,655中所描述的)对于在重组哺乳动物宿主中表达IL-22RA是有用的，但是对于在酵母细胞中的表达最好使用酵母的信号序列。适宜的酵母信号序列的实例有来自酵母交配信息素α因子(由MFα1基因编码)、转化酶(由SUC2基因编码)或者酸性磷酸酶(由PHO5基因编码)的酵母信号序列。参见例如Romanos et al.，“Expressionof Cloned Genes in Yeast，”DNA Cloning2：A Practical Approach， 2ndEdition，Glover and Hames(eds.)，pages123-167(OxfordUniversity Press1995)。
IL-22RA可溶性受体多肽可以通过表达编码细胞外结构域(例如含有SEQ ID NO：3的多肽或者非人受体的相应区域)的截短DNA来制备。细胞外结构域多肽优选地以基本上没有跨膜和细胞内多肽片段的形式制备。为了指导受体结构域从宿主细胞中向外运输，将受体DNA与编码分泌肽例如t-PA分泌肽的另一DNA片段相连。为了方便纯化分泌出的受体结构域，可以将C末端延伸例如多聚组氨酸标签、P物质、FlagTM肽(Hopp et al.，Biotechnology6：1204-1210，(1988)；可以从Eastman Kodak Co.，New Haven，CT获得)或者另一多肽或蛋白质(对于该多肽或者蛋白质有抗体或者其它的特异结合因子可供利用)与受体多肽融合。而且，来自细胞外细胞因子结合结构域的IL-22RA抗原性表位也可以根据上面的描述制备。
在另外一种方法中，IL-22RA的受体细胞外结构域或者其他I类或II类细胞因子受体组分可以与免疫球蛋白重链恒定区(通常是Fc片段，它包含两个恒定区结构域和铰链区，但是缺少可变区)相融合的形式进行表达(参见Sledziewski，AZ et al.，美国专利编号6,018,026和5,750,375)。本发明的可溶性IL-22RA多肽包括这种融合体。一种这样的融合体在SEQ ID NO：4中显示。这样的融合蛋白通常作为多聚体分子分泌，其中的Fc部分以二硫键相互连接，两个受体多肽互相紧密靠近。这种类型的融合蛋白可以用于将同源配基从溶液中亲和纯化出来；作为体外检测的工具，通过特异滴定配基而阻断、抑制或者降低体外的信号；以及通过将这些融合蛋白经胃肠外途径给药，作为体内的拮抗剂，结合循环中的配基并且将其从循环中清除出去。为纯化配基，在有利于受体-配基结合的条件下(通常是接近生理温度、pH和离子强度)，向含有配基的样品(例如细胞条件培养基或者组织提取物)中加入IL-22RA-Ig嵌合体。然后使用固定在固相支持 物(例如不溶性树脂珠)上的蛋白质A从混合物中分离嵌合体-配基复合体。然后使用常规的化学技术例如盐或者pH梯度，洗脱配基。或者，可以将嵌合体自身固定在固相支持物上，根据上述进行结合和洗脱。可以在体内使用嵌合体以调控炎症应答，包括急性阶段应答，例如血清淀粉样A物质(SAA)、C反应蛋白(CRP)等等。具有高结合亲和性的嵌合体通过胃肠外途径给药(例如通过肌肉内、皮下或者静脉内注射)。循环中的分子结合配基并且被正常的生理过程从循环中清除出去。对于在检测中的使用，将嵌合体通过Fc区域与支持物结合，按照ELI SA方式使用。
为了辅助分离本发明的抗IL-22RA以及结合伴侣，可以更有利地使用检测系统，其中利用配基结合受体(或者抗体、complement/anti-complement对的成员)或者其结合片段，以及商品化的生物传感器仪器(BIAcore，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。这样的受体、抗体、complement/anti-complement对的成员或者片段被固定在受体芯片的表面。对于这种仪器的使用在Karlsson，J.Immunol.Methods145：229-40，1991和Cunningham and Wells，J.Mol.Biol.234：554-63，1993中予以公开。使用胺或者巯基化学法，将受体、抗体、互补物/抗互补物对的成员或者片段共价连接在葡聚糖纤维上，所述葡聚糖纤维附着在流动池内的金膜上面。使检测样品通过该池。如果在样品中存在配基、表位或者互补物/抗互补物对的相反成员，则它们会分别结合到固定化的受体、抗体或者互补物/抗互补物对成员上，导致介质的折射率发生改变，而这可被检测为金膜表面胞质共振的改变。该系统可以测定开和关的速率，据此可以计算结合亲和性，并评估结合的化学定量关系。或者，可以使用SELDI(TM)技术(Ciphergen，Inc.，Palo Alto，CA)分析配基/受体结合。而且，可以使用以上描述的BIACORE技术在竞争实验中测定不同的单克隆抗体是否结合IL-22RA多肽上的相同或者不同的表位；这样，可以用于辅助本发明中结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或IL-20 和IL-22二者的中和抗体的表位作图。
还可以在本领域内已知的其他检测系统中使用配基结合性受体多肽。这样的系统包括测定结合亲和性的Scatchard分析(参见Scatchard，Ann.NYAcad.Sci.51：660-72，1949)以及量热测定(Cunningham et al.，Science253：545-48，1991；Cunningham et al.， Science245：821-25，1991)。
本发明还提供了多种其他多肽融合体以及相关的包含一个或者更多个融合多肽的多聚体蛋白质。例如，可以将可溶性IL-22RA受体与二聚化蛋白质制备成融合蛋白，如美国专利编号5,155,027和5,567,584中所公开的。用于这种目的的优选二聚化蛋白质包括免疫球蛋白恒定区结构域，例如IgGγ1以及人κ轻链。可以在经遗传工程操作过的细胞中表达免疫球蛋白-可溶性IL-22RA融合蛋白，以制备多种多聚IL-22RA受体类似物。可以将辅助结构域与可溶性IL-22RA受体融合，将其靶向到特异的细胞、组织或者大分子上(例如胶原、或者表达IL-22RA配基的细胞、IL-22或者IL-20)。可以将IL-22RA多肽与两个或者更多个部分(例如用于纯化的亲和标签和靶向结构域)融合。多肽融合体还可以包含一个或者更多个切割位点，特别是在结构域之间参见Tuan et al.，Connective Tissue Research34：1-9，1996.
在细菌细胞中，通常比较理想的是将异源蛋白质以融合蛋白形式表达，以降低毒性，提高稳定性并且提高表达蛋白的回收。例如，可以将IL-22RA以包含谷胱甘肽S-转移酶多肽的融合蛋白形式表达。谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白通常是可溶的，并且可以容易地通过固定化谷胱甘肽层析柱从大肠杆菌的裂解物中纯化出来。用相似的方法，使用淀粉树脂层析柱可以将包含麦芽糖结合蛋白多肽的IL-22RA融合蛋白分离出来，而包含截短的蛋白质基因AC端的融合蛋白可以使用 IgG-Sepharose纯化。在细菌细胞中将异源多肽以融合蛋白形式表达的成熟技术在以下的文献中有所描述，例如Williams et al.，“Expression of Foreign Proteins in E.coli Using PlasmidVectors and Purification of Specific Polyclonal Antibodies，”DNA Cloning2：A Practical Approach，2ndEdition，Glover andHames(Eds.)，pages15-58(Oxford University Press1995)。此外，还有商品化的表达系统可供利用。例如，PI NPOINT Xa蛋白质纯化系统(Promega Corporation；Madison，WI)提供了使用包含抗生物素蛋白的树脂分离融合蛋白的方法，该融合蛋白包含在表达期间被生物素化的多肽。
在分离由原核或者真核细胞表达的异源多肽时有用的肽标签包括多聚组氨酸标签(它对镍螯合树脂有亲和性)、c-myc标签、钙调蛋白结合蛋白(使用钙调蛋白亲和层析分离)、物质P、RYIRS标签(它与抗RYIRS抗体结合)、Glu-Glu标签以及FLAG标签(它与抗FLAG抗体结合)。参见例如Luo et al.，Arch.Biochem.Biophys.329：215(1996)，Morganti et al.，Biotechnol.Appl.Biochem.23：67(1996)，以及Zheng et al.，Gene186：55(1997)。编码这种肽标签的核酸分子可以从例如Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，MO)获得。
另外一种融合蛋白的形式包含IL-22RA多肽以及免疫球蛋白重链恒定区，通常是Fc片段，它含有两个或者三个恒定区结构域以及铰链区，但是没有可变区。作为例证，Chang et al.，美国专利编号5,723,125描述了包含人干扰素和人免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白。干扰素的C端通过肽接头部分与Fc片段的N端连接。肽接头的一个实例是主要包含T细胞惰性序列(它是免疫学惰性的)的肽。示例性的肽接头具有以下的氨基酸序列：GGSGG SGGGG SGGGG S(SEQ ID NO：9)。在这种融合蛋白中，例证性的Fc部分是人γ4链，它在溶液中是稳定 的，并且几乎没有或者没有补体激活活性。因此，本发明涉及包含IL-22RA部分以及人Fc片段的IL-22RA融合蛋白，其中IL-22RA部分的C端通过肽接头(例如包含SEQ ID NO：4中氨基酸序列的肽)与Fc片段的N端相连。该IL-22RA部分可以是IL-22RA分子或者其片段。例如，融合蛋白中可以包含SEQ ID NO：3的氨基酸以及Fc片段(例如人Fc片段)(SEQ ID NO：4)。
在另一变化形式中，IL-22RA融合蛋白包含IgG序列、与IgG序列氨基端共价连接的IL-22RA部分以及与IL-22RA部分的氨基端共价连接的信号肽，其中IgG序列由以下的元件按照以下的顺序组成：铰链区、CH2结构域以及CH3结构域。因此，该IgG序列缺少CH1结构域。正如本文描述的，IL-22RA部分显示了IL-22RA活性，例如与IL-22RA配基结合的能力。这个制备包含抗体和非抗体部分二者的融合蛋白的一般方法已经在LaRochelle et al.，EP742830(WO95/21258)中有所描述。
包含IL-22RA部分以及Fc部分的融合蛋白可以作为例如体外检测工具使用。例如，可以使用IL-22RA-免疫球蛋白融合蛋白检测生物样品中IL-22RA配基的存在情况，其中IL-22RA部分用于与配基结合，而大分子例如蛋白质A或者抗Fc抗体用于将融合蛋白结合到固相支持物上。可以使用这种系统鉴定激动剂以及干扰IL-22RA配基(例如IL-22或者LI-20和IL-22二者)与其受体结合的拮抗剂。
其他抗体融合蛋白的实例包括包含抗原结合结构域以及IL-22RA片段(它含有IL-22RA细胞外结构域)的多肽。这样的分子可以由于IL-22RA的结合活性而用于靶向特殊组织。
本发明还包括了多种其他融合多肽。例如，赋予生物学功能的结构域部分或者全部可以在本发明的IL-22RA和来自细胞因子受体家族 另一成员的功能上等价的结构域之间交换。可以在重组宿主细胞中表达融合多肽，以制备多种IL-22RA融合体类似物。IL-22RA多肽可以与两个或者更多个部分或结构域(例如用于纯化的亲和标签以及靶向结构域融合)。融合多肽还可以包含一个或者更多个切割位点，特别是在结构域之间。参见例如Tuan et al.，Connective Tissue Research34：1(1996).
可以通过本领域内技术人员熟知的方法，先制备融合蛋白的每一个组分，再将它们化学偶联，这样来制备融合蛋白。或者，可以使用已知的技术按照正确的阅读框产生编码融合蛋白两个组分的多核苷酸，并且用本文描述的方法表达该多核苷酸。对融合蛋白进行酶促和化学切割的一般方法在例如Ausubel(1995)16-19到16-25页中描述。
还可以通过例如核磁共振、晶体学、电子衍射或者光亲和标记等技术对结构进行物理分析，并且结合对IL-22RA配基激动剂的推测接触位点氨基酸的突变，进一步表征IL-22RA结合结构域。参见例如deVos et al.，Science255：306(1992)，Smith et al.，J.Mol.Biol.224：899(1992)，and Wlodaver et al.，FEBS Lett.309：59(1992)。
本发明还涉及化学修饰的IL-22RA组合物，其中IL-22RA多肽与聚合物相连。例证性的IL-22RA多肽是可溶性的多肽，它们缺乏功能性的跨膜结构域，例如由SEQ ID NO：3所示氨基酸残基组成的多肽。通常所述聚合物是水溶性的，这样IL-22RA缀合物在水性环境中，例如生理环境中，不会发生沉淀。适宜的聚合物的实例是经过修饰而具有一个活性基团的聚合物，例如活性酯用于酰化，或者醛用于烷基化。这样可以控制聚合的程度。活性醛的示例是聚乙二醇丙醛，或者单-(C1-C10)烷氧基，或者其芳氧基的衍生物(参见例如Harris，et al.，美国专利编号5,252,714)。聚合物可以是分枝或者是未分枝的。而 且，可以使用聚合物混合物制备IL-22RA缀合物。
用于治疗的IL-22RA缀合物可以包含药物上可以接受的水溶性聚合物成分。适宜的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)，单甲氧基PEG、单-(C1-C10)烷氧基PEG、芳氧基PEG、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)PEG、tresyl单甲氧基PEG、PEG丙醛、双琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素或者其他基于类糖的聚合物。适宜PEG的分子量可能从大约600到大约60000，包括例如5,000，12,000，20,000和25,000。IL-22RA缀合物还可以包含这种水溶性聚合物的混合物。
IL-22RA缀合物的一个实例包含IL-22RA部分以及连接在IL-22RA部分N端的聚环氧烷部分。PEG是一种适宜的聚环氧烷。作为例证，可以用PEG修饰IL-22RA，此过程被称为“PEG化”。IL-22RA的PEG化可以通过本领域内已知的任何一种PEG化反应进行(参见例如EP0154 316，Delgado et al.，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems9：249(1992)，Duncan and Spreafico，Clin.Pharma cokinet.27：290(1994)，以及Francis et al.，IntJHematol68：1(1998))。例如，可以使用反应性的聚乙二醇分子通过酰化反应或者烷化反应进行PEG化。在另一种方法中，通过缩合活化的PEG形成IL-22RA缀合物，其中PEG的末端羟基或者氨基基团被活化的接头取代(参见例如Karasiewicz et al.，美国专利编号5,382,657)。
通过酰化进行的PEG化通常需要使PEG的活性酯类衍生物与IL-22RA多肽发生反应。活化的PEG酯的示例是PEG与N-羟基琥珀酰亚胺形成的酯。正如这里所使用的，术语“酰化”包括在IL-22RA和水溶性聚合物之间的下列类型的连接：酰胺、氨(基)甲酸酯、尿烷等等。通过酰化制备PEG化的IL-22RA的方法通常包含下面的步骤：(a) 在使一个或者更多个PEG基团与IL-22RA相连的条件下使IL-22RA多肽与PEG(例如PEG醛类衍生物的活性酯)反应以及(b)得到反应产物。一般地，根据已知的参数和所需的结果确定酰化反应的最佳反应条件。例如，PEG：IL-22RA的比例越大，多聚PEG化的IL-22RA产物的百分比越高。
通过酰化反应的PEG化产物通常是聚PEG化的IL-22RA产物，其中赖氨酸ε氨基通过酰基连接基团被PEG化。一种连接实例是酰胺。通常所产生的IL-22RA至少95％被单-、二-、或者三-PEG化，尽管依反应条件而可以形成具有更高程度PEG化的一些IL-22RA。使用标准的纯化方法，例如透析、超滤、离子交换层析、亲和层析等等，可以将PEG化的IL-22RA与未偶联的IL-22RA多肽分离开。
通过烷基化进行的PEG化通常涉及在还原剂存在的条件下使PEG的末端醛基衍生物与IL-22RA反应。PEG基团可以通过-CH2-NH基团连接在多肽上。
而且，也可以用本领域内的以及本文描述的方法使本发明的抗IL-22抗体或者抗体片段PEG化。
通过还原性烷基化进行的衍生化作用而产生单PEG化的产物利用了不同类型的可用于衍生化的伯氨基的不同反应性。通常反应在可以利用蛋白质的赖氨酸ε氨基基团和N端残基的α氨基之间的pKa差异的pH下进行。通过这种选择性衍生化，控制含有活性基团(例如醛)的水溶性聚合物与蛋白质的联接。与聚合物的偶联主要发生在蛋白质的N端，而对其他活性基团例如赖氨酸的侧链氨基没有明显改变。本发明提供了基本上均质的IL-22RA单多聚物缀合物。
产生基本上均质的IL-22RA单聚合物缀合物的还原性烷基化反应 可以包括下面的步骤：(a)在还原性烷基化的条件下，在适合于使IL-22RA的氨基端α氨基基团发生选择性修饰的pH条件下使IL-22RA多肽与反应性的PEG发生反应，以及(b)得到反应产物。在还原性烷基化中使用的还原剂应该在水性溶液中稳定，并且能够只还原在还原性烷基化的起始过程中形成的西弗氏碱。例证性的还原剂包括硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二甲胺基硼烷、三甲胺基硼烷、以及吡啶硼烷。
对于基本上均质的单聚合物IL-22RA缀合物群，还原性烷基化反应的条件是能够使该水溶性的聚合物部分与IL-22RA的N端发生选择性连接的条件。这样的反应条件一般要求赖氨酸的氨基基团和N端的α氨基基团之间有pKa差异。pH也影响使用的多聚物和蛋白质的比例。一般地，如果pH较低，需要多聚物对蛋白质大大过量，因为N端的α-基团活性越低，则需要越多的多聚物以达到最佳的条件。如果pH高一些，则多聚物：IL-22RA不需要太高，因为有更有活性的基团可供利用。通常，pH在3-9的范围或者3-6的范围内。可以使用该方法制备包含IL-22RA的均二聚体、杂二聚体或者多聚体可溶性受体缀合物。
另外一个要考虑的因素是水溶性多聚物的分子量。一般而言，多聚物的分子量越大，则可能连接到蛋白质上的多聚物分子的数目就越少。对于PEG化反应而言，通常的分子量是在2kDa到大约100kDa之间，大约5kDa到大约50kDa之间，或者大约12kDa到大约25kDa之间。水溶性多聚物与IL-22RA的分子比例一般是在1：1到100：1的范围。通常对于多PEG化反应，水溶性多聚物与IL-22RA的摩尔比例在1：1到20：1之间，对于单PEG化反应，比例在1：1到5：1。
用于制备包含多肽和水溶性多聚物部分的缀合物的一般方法是本领域内已知的。参见例如Karasiewicz et al.，美国专利编号5,382,657，Greenwald et al.，美国专利编号5,738,846，Nieforthet al.，Clin.Pharmacol.Ther.59：636(1996)，Monkarsh et al.， Anal.Biochem.247：434(1997))。该方法可以用于制备包含IL-22RA的均二聚、杂二聚或者多聚可溶性受体缀合物。
本专利涉及包含肽或者多肽(例如本文描述的可溶性受体或者抗体)的组合物。这种组合物还可以包含载体。载体可以是常规的有机或者无机载体。载体的示例包括水、缓冲溶液、醇、丙二醇、macrogol、芝麻油、玉米油等等。
7.IL-22RA多肽的分离
就污染的大分子特别是其他蛋白质和核酸而言，本发明的多肽可以纯化至至少大约80％的纯度、至少大约90％的纯度、至少大约95％的纯度，例如96％、97％、98％或者大于99％的纯度，而没有感染性和热原性的因子。本发明的多肽也可以纯化到药物纯的状态，即大于99.9％的纯度。在某些制剂中，纯化的多肽几乎没有其他的多肽，特别是动物源的其他多肽。
可以使用分级分离和/或常规的纯化方法得到从天然来源(例如人组织来源)纯化的IL-22RA的制备物、合成的IL-22RA多肽、以及从重组宿主细胞中纯化的重组IL-22RA多肽和融合IL-22RA多肽。一般地，可以使用硫酸铵沉淀和酸或者离液剂提取，对样品进行分级分离。示例性的纯化步骤可以包括羟基磷灰石、大小排阻层析、FPLC以及反相高效液相层析。适宜的层析介质包括衍生化葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特质硅胶等等。PEI、DEAE、QAE以及Q衍生物是适宜的。示例性的层析介质包括使用苯基、丁基或者辛基基团衍生的介质，例如Phenyl-Sepharose FF(Pharmacia)，Toyopearl butyl650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)，Octyl-Sepharose(Pharmacia)等等；或者是聚丙烯树脂例如Amberchrom CG71(Toso Haas)等等。适宜的固相支持物包括玻璃珠、基于硅胶的树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等等，它们在被使用的条件下是不溶的。可以使用活性基团修饰这些支持物，这 些活性基团可允许蛋白质通过氨基基团、羧基基团、巯基基团、羟基基团和/或糖部分连接上。
偶联化学反应的实例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化以及碳二亚胺偶联化学反应中的羧基和氨基衍生物。这些和其他的固相介质在本领域内众所周知并且广泛使用，可以从供应商处获得。用于多肽分离和纯化的特定方法的选择是常规的设计问题，可部分地由所选支持物的性质决定。参见例如Affinity Chromatography：Principles&Methods(Pharmacia LKBBiotechnology1988)，以及Doonan，Protein PurificationProtocols(The Humana Press1996)。
在IL-22RA分离和纯化中的其他改变可以由本领域内的技术人员设计。例如，根据如下描述得到的IL-22RA抗体可以用于通过免疫亲和纯化分离大量的蛋白质。
本发明的多肽还可以通过利用某些特殊的性质而被分离。例如，可以使用固定化金属离子吸附(IMAC)层析纯化富含组氨酸的蛋白，包括那些包含多聚组氨酸标签的蛋白。简而言之，首先用二价金属离子荷载凝胶，形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。富含组氨酸的蛋白质会根据所使用的金属离子而以不同的亲和性被吸附到该基质上，然后用竞争性洗脱、降低pH或者使用强的螯合剂洗脱。其他的纯化方法包括使用植物凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化的蛋白(M.Deutscher，(ed.)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。在本发明的其他实施方案中，可以构建目标多肽与亲和标签(例如麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白结构域)形成融合多肽，帮助纯化。而且，还可以利用IL-22RA细胞外结构域的配基结合性质来进行纯化，例如纯化包含IL-22RA的可溶性受体；例如使用亲和层析，其中IL-22配基结合到层析柱上，包含IL-22RA的受体将发生结 合，然后使用标准的层析方法洗脱上述受体。
如上所述，IL-22RA多肽或者其片段还可以通过化学合成进行制备。IL-22RA多肽可以是单体或者多聚体、糖基化或者未糖基化、PEG化或者未PEG化、含有或者没有起始的甲硫氨酸残基。
8.抗IL-22RA蛋白抗体的制备
针对IL-22RA的抗体可以通过例如使用IL-22RA表达载体的产物或者由天然来源分离的IL-22RA作为抗原获得。特别有用的抗IL-22RA抗体与IL-22RA“特异结合”。如果抗体表现出以下两种性质中至少一种，则认为抗体是特异结合的：(1)抗体以结合活性的阈水平结合IL-22RA，以及(2)抗体与IL-22RA的相关多肽并没有显著的交叉反应。
就第一个特征而言，如果抗体与IL-22RA多肽、肽或者表位的结合亲和力(Ka)是106M-1或者更高，优选是107M-1或者更高，更优选是108M-1或者更高，最优选是109M-1或者更高，则该抗体是特异结合的。抗体的结合亲和性可以很容易地由本领域普通技术人员通过例如Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660(1949))测定。就第二个特征而言，如果使用标准的Western印迹分析方法可检测到IL-22RA，但不能检测到目前已知的多肽，则该抗体与相关的多肽分子之间没有显著的交叉反应。已知的相关多肽的实例包括已知的细胞因子受体。
抗IL-22RA抗体可以使用携带抗原性IL-22RA表位的肽和多肽进行制备。本发明的携带抗原性表位的肽和多肽含有SEQ ID NO：3中或者本文所述另一氨基酸序列中包含的至少9个或者约15-30个氨基酸。但是，包含更高比例的本发明氨基酸序列的肽或者多肽，含有本发明 多肽的完整氨基酸序列中30-50个氨基酸或者含有本发明多肽的任何长度部分、甚至包括本发明多肽的整个氨基酸序列长度的肽和多肽，也可以用于诱导与IL-22RA结合的抗体。理想的是将携带表位的肽的氨基酸序列选择成使肽在水性溶剂中具有显著的溶解性(即该序列包括相对亲水的残基，而通常避免疏水残基)。而且，含有脯氨酸残基的氨基酸序列用于抗体制备也是合意的。
作为例证，使用Jameson-Wolf方法(Jameson and Wolf，CABIOS4：181，(1988))，由LASERGENE的PROTEAN程序(版本3.14)(DNASTAR；Madison，WI)实施，确定IL-22RA中的潜在抗原性位点。在分析中使用默认参数。
Jameson-Wolf方法通过将6个主要的蛋白质结构预测子程序结合在一起来预测潜在的抗原性决定簇。简而言之，首先使用Hopp-Woods方法(Hopp et al.，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA78：3824(1981))确定代表具有最大局部亲水性的区域的氨基酸序列(参数：平均7个残基)。第二步，使用Emini的方法(Emini et al.，J.Virology55：836(1985))计算表面概率(参数：表面决定阈值(0.6)＝1)。第三，使用Karplus-Schultz方法(Karplus and Schultz，Naturwissenschaften72：212(1985))预测骨架链的柔性(参数：柔性阈值(0.2)＝1)。在分析的第四和第五步中，对数据应用二级结构预测，其中使用Chou-Fasman的方法(Chou，“Prediction of ProteinStructural Classes from Amino Acid Composition，”Prediction ofProtein Structure and the Principles of Protein Conformation，Fasman(ed.)，pages549-586(Plenum Press1990))，以及Garnier-Robson，Garnier et al.，J.Mol.Biol.120：97(1978)(Chou-Fasman参数：构象表格＝64个蛋白；α区域阈值＝103；β区域阈值＝105；Garnier-Robson参数：α和β决定常数＝0)。在第六个子程序中，将柔性参数和亲水性/溶剂可及性因素结合在一起，确定表面 轮廓数值，命名为“抗原性指数”。最后，对抗原性指数应用峰增宽函数，通过添加20％，40％，60％，或80％相应的峰值，使主要表面峰加宽，以考虑由于表面区域相对于内部区域的迁移产生的额外自由能。但是没有将这个计算应用于任何位于螺旋区域内部的主要峰，原因是螺旋区域的柔性似乎较低。
这一分析的结果表明SEQ ID NO：3中的以下氨基酸序列可提供适宜的抗原性肽：可以使用Hopp/Woods亲水性概况图确定在SEQ ID NO：3中具有最高抗原性潜力的区域(Hopp et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun.Meth.88：1-18，1986andTriquier et al.，Protein Engineering11：153-169，1998)。这个概况图是以滑动的六残基窗口为基础的。忽略包埋住的G、S和T残基以及暴露出的H、Y和W残基。而且，根据Jameson-Wolf曲线使用由例如DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)预测的SEQ ID NO：3中的IL-22RA抗原性表位作为优选的抗原性表位，并可以由本领域技术人员确定。这种抗原性表位包括(1)SEQ ID NO：3中1(Pro)到6(Asp)号氨基酸残基；(2)SEQ ID NO：3中26(Ser)到32(Pro)号氨基酸残基；(3)SEQ ID NO：3中41(Lys)到47(Asp)号氨基酸残基；(4)SEQ ID NO：3中49(Val)到62(Cys)号氨基酸残基；(5)SEQ ID NO：3中41(Lys)到62(Cys)号氨基酸残基；(6)SEQ ID NO：3中84(Ala)到97(Ser)号氨基酸残基；(7)SEQ ID NO：3中103(Thr)到108(Asp)号氨基酸残基；(8)SEQ ID NO：3中130(Arg)到135(His)号氨基酸残基；(9)SEQ IDNO：3中164(Gly)到166(Lys)号氨基酸残基；(10)SEQ ID NO：3中175(Tyr)到179(Glu)号氨基酸残基；(11)SEQ ID NO：3中193(Lys)到196(Ala)号氨基酸残基；(12)SEQ ID NO：3中203(Lys)到209(Thr)号氨基酸残基。本发明涉及使用抗原性多肽1-12中的任何一种产生针对IL-22RA的抗体，或者作为工具用于筛选或者鉴定本发明的中和性单克隆抗体。本发明还涉及包含抗原性肽1-10中至少 一种的多肽。本发明涉及使用本文描述的任何抗原性肽或者表位产生针对IL-22RA的抗体，以及鉴定和筛选抗IL-22RA单克隆中和性抗体，所述抗体可以结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22和IL-20的活性(单独或者一起)。
而且，适宜的抗原还包括包含上面公开的IL-22RA细胞因子结合结构域或者细胞外结构域以及另外一种I类或者II类细胞因子细胞外结构域--如那些形成可溶性IL-22RA杂二聚或者多聚多肽--的IL-22RA多肽，如可溶性的IL-22RA/CRF2-4，IL-22RA/zcytor11，IL-22RA/zcytor7等等。
针对重组IL-22RA蛋白或者从天然来源分离的IL-22RA的多克隆抗体可以使用本领域内技术人员众所周知的方法制备。参见例如Greenetal.，“Production of Polyclonal Antisera，”inImmunochemical Protocols(Manson，ed.)，pages1-5(Humana Press1992)，以及Williams et al.，“Expression of foreign proteinsinE.coli using plasmid veGtors and purification of specificpolyclonal antibodies，”in DNA Cloning2：Expression Systems，2nd Edition，Glover et al.(eds.)，page15(Oxford UniversityPress1995)。IL-22RA多肽的免疫原性可以通过使用佐剂例如铝(氢氧化铝)或者弗氏完全或不完全佐剂而提高。对于免疫有用的多肽还包括融合多肽，例如IL-22RA或其一部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白形成的融合多肽。多肽免疫原可以是全长的分子或者只是其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”，则这样的部分可以便利地与大分子载体(例如钥孔血蓝蛋白KLH、牛血清白蛋白BSA或者破伤风类毒素)连接在一起用于免疫。
尽管通常在动物如马、牛、狗、鸡、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、山羊或者绵羊中制备多克隆抗体，本发明的抗IL-22RA抗体还可以衍生 自类人的灵长类抗体。在狒狒中制备诊断用和治疗上有用的抗体的一般技术可以在例如Goldenberg et al.，国际专利出版物编号WO91/11465，以及在Losman et al.，Int.J.Cancer46：310(1990)中找到。
或者，可以产生单克隆的抗IL-22RA抗体。可以通过本领域内技术人员已知的方法得到针对特异抗原的啮齿类单克隆抗体(参见例如Kohler et al.，Nature256：495(1975)，Coligan et al.(eds.)，Current Protocols in Immunology，Vol.1，pages2.5.1-2.6.7(John Wiley&Sons1991)[“Coligan”]，Picksley et al.，“Production of monoclonal antibodies against proteinsexpressed in E.coli，”DNA Cloning2：Expression Systems，2ndEdition，Glover et al.(eds.)，page93(Oxford University Press1995))。
简而言之，通过以下步骤可以得到单克隆抗体：向小鼠注射包含IL-22RA基因产物的组合物、通过取出血清样品来证实抗体的产生、取出脾脏得到B淋巴细胞、将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤、克隆杂交瘤、选择出产生针对该抗原的抗体的阳性克隆、培养产生针对该抗原的抗体的克隆、和从杂交瘤培养物中分离抗体。
此外，本发明的抗IL-22RA抗体可以衍生自人单克隆抗体。人单克隆抗体可以从已被基因工程化操作而响应于抗原攻击产生特异性人抗体的转基因小鼠中获得。在这个技术中，人重链和轻链基因座的元件被引入到由胚胎干细胞系衍生的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系的内源重链和轻链基因座已被靶向破坏。该转基因小鼠可以合成对于人抗原特异的人抗体，可以用所述小鼠生产分泌人抗体的杂交瘤。从转基因小鼠中获得人抗体的方法在例如Green et al.，Nature Genet.7：13(1994)，Lonberg et al.，Nature368：856(1994)，以及Taylor et al.，Int.Immun.6：579(1994)中有所描述。
可以通过多种成熟的技术方法从杂交瘤培养物中分离并且纯化出单克隆抗体。这种分离技术包括使用蛋白质A Sepharose进行的亲和层析、大小排阻层析以及离子交换层析(参见例如Coliganpp2.7.1-2.7.12和pp2.9.1-2.9.3；Baines et al.，＂Purificationof Immunoglobulin G(IgG)，＂Methods in Molecular Biology，Vol.10，pages79-104(The Humana Press，Inc.1992))。
对于特殊的用途，可能需要制备抗IL-22RA抗体的片段。这样的抗体片段可以通过例如抗体的蛋白水解得到。可以通过常规方法用胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶消化整个抗体得到抗体片段。作为例证，可以通过使用胃蛋白酶酶切得到抗体片段，产生5S的片段，称为F(ab′)2。这个片段可以进一步用硫还原剂切割，产生3.5S的Fab′单价片段。可选地，切割反应也可以使用巯基的封闭基团进行，所述巯基是由于二硫键的切断产生的。或者，使用胃蛋白酶切割直接产生两个单价的Fab片段和Fc片段。这些方法在例如Goldenberg，美国专利4,331,647，Nisonoff et al.，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)，Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman et al.，inMethods in Enzymology Vol.1，page422(Academic Press1967)，以及Coligan，pp2.8.1-2.8.10和pp2.10.-2.10.4中有所描述。
只要片段可以与被完整抗体识别的抗原相结合，就可以使用其他切割抗体的方法，例如将重链分开以形成单价的轻-重链片段、片段的进一步切割以及其他酶促、化学或者遗传技术。
例如，Fv片段包含VH和VL链的结合。这种结合可以是非共价的，如Inbar et al.，Proc.Nat′1Acad.Sci.USA69：2659(1972)中所述。或者，可以通过分子间二硫键或者通过化学物质如戊二醛的 交联使可变区链连接起来(参见例如，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992))。
Fv片段可能包含由肽接头连接的VH和VL链。这些单链的抗原结合蛋白(scFv)是通过构建包含编码VH和VL结构域的DNA序列的结构基因而制备的，该VH和VL结构域编码序列之间由寡核苷酸连接。将结构基因插入到表达载体中，然后将表达载体引入到宿主细胞，例如大肠杆菌中。重组的宿主细胞合成具有衔接肽(在两个V结构域之间搭桥)的单链多肽。制备scFvs的方法在例如Whitlow et al.，Methodds：A Companion to Methods in Enzymology2：97(1991)(还请参见Bird et al.，Science242：423(1988)，Ladner et al.，美国专利编号4,946,778，Pack et al.，Bio/Technology11：1271(1993)，以及Sandhu，见前)中有所描述。
作为例证，使淋巴细胞在体外暴露于IL-22RA多肽，筛选噬菌体或者类似载体中的抗体展示文库(例如通过使用固定化的或标记的IL-22RA蛋白质或者肽)，可以得到s cFV。可以通过筛选展示在噬菌体上(噬菌体展示)或者细菌如大肠杆菌上的随机肽文库得到具有潜在IL-22RA多肽结合结构域的多肽的编码基因。编码这些多肽的核苷酸序列可以用多种方法获得，例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成。可以使用这些随机肽展示文库筛选与已知目标(可以是蛋白质或者多肽，例如配基或者受体、生物或者合成大分子、有机或者无机物质)相互作用的肽。制备和筛选这种随机肽展示文库的技术在本领域内是已知的(Ladner et al.，美国专利编号5,223,409，Ladner et al.，美国专利编号4,946,778，Ladner et al.，美国专利编号5,403,484，Ladner et al.，美国专利编号5,571,698，以及Kay et al.，PhageDisplay of Peptides and Proteins(Academic Press，Inc.1996))，并且有商品化的随机肽文库以及用于筛选这种文库的试剂盒，例如可以从Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)，Invitrogen Inc. (San Diego，CA)，New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)，以及Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)等厂家获得。可以使用本文公开的IL-22RA序列筛选随机肽展示文库，以鉴定与IL-22RA结合的蛋白质。
另外一种形式的抗体片段是编码单一互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目标抗体的CDR的基因而获得。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区，可以制备这样的基因(参见例如Larrick et al.，Methods：ACompanion to Methods in Enzymology2：106(1991)，Courtenay-Luck，“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies，”MonoclonalAntibodies：Production，Engineering and Clinical Application，Ritter et al.(eds.)，page166(Cambridge University Press1995)，以及Ward et al.，“Genetic Manipulation and Expression ofAntibodies，”Monoclonal Antibodies：Principles andApplications，Birch et al.，(eds.)，page137(Wiley-Liss，Inc.1995))。
或者，可以从“人化的”单克隆抗体获得抗IL-22RA抗体。通过将小鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区的互补决定区转移到人的可变结构域中，可以得到人化的单克隆抗体。然后在小鼠对应抗体的框架区中替换典型的人抗体残基。使用衍生自人化单克隆抗体的抗体组分避免了与小鼠恒定区的免疫原性相关的可能问题。克隆小鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术在例如Orlandi et al.，Proc.Nat′1Acad.Sci.USA86：3833(1989)中有所描述。制备人化单克隆抗体的技术在例如Jones et al.，Nature321：522(1986)，Carter et al.，Proc.Nat′1Acad.Sci.USA89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，Singer et al.，J.Immun.150：2844(1993)，Sudhir(ed.)，Antibody Engineering Protocols(Humana Press，Inc.1995)， Kelley，“Engineering Therapeutic Antibodies，”ProteinEngineering：Principles and Practice，Cleland et al.(eds.)，pages399-434(John Wiley&Sons，Inc.1996)，以及Queenetal.，U.S.Patent No.5,693,762(1997)中有所描述。
而且，本发明的抗IL-22RA抗体或者抗体片段可以使用本领域的方法以及本文描述的方法PEG化。
可以通过使用标准的技术，用抗IL-22RA抗体或者抗体片段免疫动物，由此制备多克隆抗独特型抗体。参见例如Green et al.，“Production of Polyclonal Antisera，”Methods In MolecularBiology：Immunochemical Protocols，Manson(ed.)，pages1-12(Humana Press1992)。还可参见Coligan pp2.4.1-2.4.7。或者，可以如上所述用抗IL-22RA抗体或者抗体片段作为免疫原制备单克隆抗独特型抗体。作为另外一种选择，可以使用以上描述的技术制备人化的抗独特型抗体或者类人的灵长类抗独特型抗体。制备抗独特型抗体的方法在例如Irie，U.S.美国专利编号5,208,146，Greene，et.al.，美国专利编号5,637,677，以及Varthakavi and Minocha，J.Gen.Virol.77：1875(1996)中有所描述。
可以将抗IL-22RA抗体与可检测标记偶联形成抗IL-22RA免疫缀合物。适宜的可检测标记包括，例如，放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或者胶体金。制备和检测这种可检测标记的免疫缀合物的方法对于本领域普通技术人员是众所周知的，并且在下面有更详细的描述。
可检测标记可以是可通过自显影检测的放射性同位素。对于本发明的目的特别有用的放射性同位素有3H，125I，131I，35S和14C。
抗IL-22RA免疫缀合物还可以用荧光化合物标记。通过将免疫缀合物暴露于适当波长的光并检测产生的荧光，可以检测荧光标记抗体的存在。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红素、藻蓝素、别藻蓝素、邻苯二甲醛和荧光胺。
或者，可以通过将抗体组分与化学发光化合物偶联而对抗IL-22RA免疫缀合物进行可检测的标记。通过检测化学反应过程中产生的发光可以检测出化学发光标签标记的免疫缀合物的存在。化学发光标记化合物的示例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶鎓盐以及草酸酯。
类似地，可以使用生物发光化合物标记本发明的抗IL-22RA免疫缀合物。生物发光是在生物系统中发现的一类化学发光，其中催化蛋白提高了化学发光反应的效率。通过检测发光的存在来确定生物发光蛋白的存在。可用于标记的生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶以及水母发光蛋白。
或者，可以将抗IL-22RA抗体组分与酶相连而对抗IL-22RA免疫缀合物进行可检测的标记。当抗IL22RA-酶缀合物在适当底物的存在下孵育时，酶部分与底物发生反应，产生可以通过例如分光光度法、荧光法或者目测的方法检测的化学部分。可以用于对多特异性免疫缀合物进行可检测标记的酶的示例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶体以及碱性磷酸酶。
本领域内的技术人员知道有可用于本发明的其他适宜标记。标记部分与抗IL-22RA抗体的结合可以使用本领域内已知的标准技术完成。这方面的典型方法学在Kennedy et al.，Clin.Chim.Acta70：1(1976)，Schurs et al.，Clin.Chim.Acta81：1(1977)，Shih etal.，Int′1 J.Cancer46：1101(1990)，Stein et al.，Cancer Res.50：1330(1990)，以及Coligan(同前)中有所描述。
而且，可以使用已与抗生物素蛋白、链亲和素以及生物素偶联的抗IL-22RA抗体来提高免疫化学检测的方便性和多能性(参见例如Wilchek et al.(eds.)，“Avidin-Biotin Technology，”MethodsIn Enzymology，Vol.184(Academic Press1990)，以及Bayer et al.，“Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology，”Methods In Molecular Biology，Vol.10，Manson(ed.)，pages149-162(The Humana Press，Inc.1992)。
进行免疫检测的方法是很成熟的。参见例如Cook and Self，“Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays，”Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，and ClinicalApplication，Ritter and Ladyman(eds.)，pages180-208，(Cambridge University Press，1995)，Perry，“The Role ofMonoclonal Antibodies in the Advancement of ImmunoassayTechnology，”Monoclonal Antibodies：Principles andApplications，Birch and Lennox(eds.)，pages107-120(Wiley-Liss，Inc.1995)，以及Diamandis，Immunoassay(AcademicPress，Inc.1996)。
本发明还涉及对于IL-22RA基因表达进行免疫诊断检测的试剂盒。这种试剂盒包含至少一个容器，其中包含抗IL-22RA抗体或者抗体片段。试剂盒中还可以包含另一容器，其中包含一种或多种能够指示IL-22RA抗体或者抗体片段存在的试剂。这种指示剂的示例包括可检测的标记，例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或者胶体金等等。试剂盒还可以包含告知使用者检测IL-22RA蛋白使用的是IL-22RA抗体或者抗体片段的途径。例如，书面的说明书中可以说明试剂盒所包含的抗体或者抗体片段可以用于检测IL-22RA。该书面材料可以直接印在容器上，或者以包装插页的形 式提供。
9.使用抗IL-22RA抗体拮抗IL-22RA与IL-22的结合或者与IL-20和IL-22二者的结合
产生或者选择在本文中有用的抗体的另外的技术包括使淋巴细胞在体外暴露于可溶性IL-22RA受体多肽或者其片段(例如抗原性表位)，并且筛选噬菌体或者类似载体中的抗体展示文库(例如通过使用固定化的或者标记的可溶性IL-22RA受体多肽或者其片段，例如抗原性表位)。可以通过筛选噬菌体上展示(噬菌体展示)的或者细菌如大肠杆菌上展示的随机肽文库而得到具有潜在结合结构域的多肽(例如可溶性IL-22RA受体多肽或者其片段，例如抗原性表位)的编码基因。编码该多肽的核苷酸序列可以通过多种方式获得，例如通过随机诱变和随机多核苷酸合成。可以使用这些随机肽展示文库筛选与已知目标(可以是蛋白质或者多肽，例如配基或者受体、生物或者合成大分子、有机或者无机物质)相互作用的肽。制备和筛选这种随机肽展示文库的技术在本领域内是已知的(Ladner et al.，美国专利编号5,223,409，Ladner et al.，美国专利编号4,946,778，Ladner etal.，美国专利编号5，403,484，Ladner et al.，美国专利编号5,571,698)，并且有商品化的随机肽文库以及用于筛选这种文库的试剂盒可供利用，例如可以从Clontech Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)，Invitrogen Inc.(San Diego，CA)，New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)，以及Pharmacia LKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)等厂家获得。可以使用可溶性IL-22RA受体多肽或者其片段(例如本文公开的抗原性表位多肽序列)筛选随机肽展示文库，以鉴定出可与包含IL-22RA的受体多肽结合的蛋白质。这些与包含IL-22RA的可溶性受体多肽相互作用的“结合多肽”可以用于给细胞加上标签、用于通过亲和纯化分离同系物多肽；它们可以直接或者间接地与药物、毒素、放射性核素等等偶联。这些结合多肽还可以用在一些分析方法中，例如用于筛选表达文库和中和活性(例如结合、 阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22配基和受体之间的相互作用，或者病毒与受体的结合)的分析方法。结合多肽还可以用在诊断检测中，用于测定包含IL-22RA的可溶性受体多肽的循环水平；用于检测或者定量作为潜在病理学或疾病标志的可溶性或者不溶性的包含IL-22RA的受体。这些结合多肽还可以作为“拮抗剂”用于体外和体内阻断或者抑制可溶性或者膜结合型IL-22RA单体受体或者IL-22RA均二聚、杂二聚或多聚多肽的结合(例如与配基的结合)以及信号转导。同样，这些结合多肽可以作为抗IL-22RA单体受体或者抗IL-22RA均二聚、杂二聚或多聚多肽，用于抑制IL-22或者IL-20和IL-22二者的活性，以及受体活性或与蛋白质的结合。针对本发明的天然受体复合体产生的抗体，以及结合IL-22RA-表位的抗体，和抗IL-22RA中和性单克隆抗体可以是优选的实施方案，因为它们可以更特异地作用于IL-22RA，并且可以抑制IL-22或者IL-20和IL-22二者。而且，本发明抗体的拮抗和结合活性可以在IL-20或者IL-22分别存在以及包含IL-22RA的可溶性受体存在的条件下用于IL-20或者IL-22增殖、信号诱捕、荧光素酶或者结合试验中，以及本文描述的其他生物或者生化测定中。
针对可溶性IL-22RA受体多肽(例如针对SHQ ID NO：3的受体)或者其片段(例如抗原性表位)的抗体可以用于体内抑制IL-20、IL-22或者IL-20和IL-22二者的炎症作用，用于针对牛皮癣、遗传特应性皮炎、炎症性皮肤病、内毒素血症、关节炎、哮喘、IBD、结肠炎、牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎或者其他由IL-20和IL-22诱发的炎性病症的治疗；用于给表达IL-22RA受体的细胞加上标签；用于通过亲和纯化分离可溶性的包含IL-22RA的受体多肽；用于在诊断检测中测定包含IL-22RA的可溶性受体多肽的循环水平；用于检测或者定量作为潜在病理或疾病标志的包含IL-22RA的可溶性受体；用在应用FACS的分析方法中；用于筛选表达文库；用于产生可以作为IL-22或者IL-20激动剂的抗独特型抗体；以及用作中和性抗体或者拮抗剂， 以结合、阻断、抑制、降低或者拮抗IL-22RA受体的功能，或者在体外和体内结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22和/或I1-20的活性(或者单独或者一起)。适宜的直接标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、生物素、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等等；间接的标签或者标记可能涉及使用生物素-抗生物素蛋白或者其他complement/anti-complement对作为媒介。还可以直接或者间接地将本发明的抗体与药物、毒素、放射性核素等等进行偶联，并将这些缀合物用于体内的诊断或者治疗性应用中。而且，可以在体外使用针对包含IL-22RA的可溶性受体多肽的抗体或者其片段，以便在测定中(例如Western印迹或者其他本领域内已知的测定)检测变性的或者未变性的包含IL-22RA的受体多肽或者其片段。
针对可溶性IL-22RA受体或者可溶性IL-22RA均二聚、杂二聚或者多聚受体多肽的抗体可以用于给表达相应受体的细胞加上标签并且检测这些受体的表达水平，用于亲和纯化，在诊断检测中用于测定受体多肽的循环水平，用于使用荧光激活细胞分拣术的分析方法中。而且，可以使用二价抗体或者抗独特型抗体作为激动剂，模拟IL-22RA配基、IL-22或者IL-20的作用。
还可以将本发明的抗体直接或者间接与药物、毒素、放射性核素等等进行偶联，这些缀合物可以用于体内的诊断或者治疗应用中。例如，识别可溶性IL-22RA受体或者可溶性IL-22RA均二聚、杂二聚或多聚受体多肽的抗体或者结合多肽可以用来鉴定或者处理表达相应抗互补体分子(即包含IL-22RA的可溶性或者膜结合型受体)的组织或者器官。更具体地，针对包含IL-22RA的可溶性受体多肽的抗体或者其生物活性片段或部分可以与可检测的或者细胞毒性分子偶联，并且投递到具有表达包含IL-22RA的受体(例如表达IL-22RA的癌症)的细胞、组织或器官的哺乳动物体内。
适宜的可检测分子可以直接或者间接地与可结合包含IL-22RA之受体多肽的多肽相附着，例如“结合多肽”(包括上面公开的结合肽)、抗体或者其生物活性片段或部分。适宜的可被检测的分子包括放射性核素、酶、底物、辅因子、生物素、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等等。适宜的细胞毒性分子可以直接或者间接与多肽或者抗体相连，并且包括细菌或者植物毒素(例如白喉毒素、假单胞菌外毒素、篦麻毒素、相思豆毒素等等)，以及治疗性放射性核素如碘131、铼188或者钇90(或者直接与多肽或抗体连接，或者以间接方式如通过螯合部分相连接)。结合性多肽或者抗体还可以与细胞毒性药物如阿霉素偶联。对于可检测的或者细胞毒性分子的间接连接，可以将可检测的或细胞毒性分子与互补物/抗互补物对的一个成员偶联，互补物/抗互补物对的另一个成员结合在该结合性多肽或者抗体部分上。生物素/链亲和素是用于这些目的的一种示例性互补物/抗互补物对。
在另外一个实施方案中，结合性多肽-毒素融合蛋白或者抗体-毒素融合蛋白可以用于靶向性细胞或者组织抑制或消除(例如用于处理癌症细胞或组织)。或者，如果结合性多肽具有多个功能结构域(即，活化结构域或配基结合结构域，加上靶向结构域)，则仅包含靶向结构域的融合蛋白可能就适宜将可被检测的分子、细胞毒性分子或者互补物分子导向目标细胞或者组织类型。当只包含单一结构域的融合蛋白包括互补物分子时，可以将抗互补物分子与可检测的或者细胞毒性分子偶联。这样，这种结构域-互补物分子融合蛋白代表了一类靶向载体，可用于一般的抗互补物-可检测/细胞毒性分子缀合物的细胞/组织特异性投递。
在另一个实施方案中，如果IL-22RA结合性多肽-细胞因子或者抗IL-22RA受体抗体靶向过度增殖细胞，则该IL-22RA结合性多肽-细胞因子或者抗体-细胞因子融合蛋白可以用于增强在体内对靶组织(例如 脾脏、胰脏、血液、淋巴、结肠以及骨髓癌症)的杀伤(一般地参见Hornick et al.，Blood 89：4437-47，1997)。所描述的融合蛋白能够使细胞因子靶向到所需的作用位点，这样就使局部的细胞因子浓度提高。适宜的抗IL-22RA单体、均二聚体、杂二聚体或者多聚体抗体可靶向不合乎需要的细胞或者组织(即肿瘤或者白血病)，所融合的细胞因子可介导效应细胞对靶细胞裂解的增强。用于此目的的适宜的细胞因子包括例如白介素2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
或者，可以使用本文描述的IL-22RA受体结合多肽或者抗体融合蛋白，通过直接刺激IL-22RA受体调节的凋亡途径而提高对体内靶组织的杀死，导致表达包含IL-22RA的受体的过度增殖细胞的死亡。
10.具有IL-22RA活性的多肽或者针对IL-22RA的抗体的治疗用途
具有可溶性IL-22RA活性的氨基酸序列可以用于通过结合IL-22RA配基IL-20和IL-22(或者单独或者一起)，阻止IL-22RA配基与内源性IL-22RA受体结合，从而调节免疫系统。还可以使用IL-22RA拮抗剂(例如抗IL-22RA抗体)，通过抑制IL-22RA配基与内源IL-22RA受体的结合而调节免疫系统。因此，本发明包括了对缺乏足量的IL-22RA多肽或者过量产生IL-22RA配基的受试对象使用具有IL-22RA活性的蛋白、多肽和肽(例如可溶性IL-22RA多肽、IL-22RA多肽片段、IL-22RA类似物(例如抗IL-22RA抗独特型抗体)以及IL-22RA融合蛋白)。还可以使用IL-22RA拮抗剂(例如抗IL-22RA抗体)治疗过量产生IL-22RA配基或者IL-22RA的受试对象。适宜的受试对象包括哺乳动物，例如人。例如，这种IL-22RA多肽和抗IL-22RA抗体可以在牛皮癣、遗传特应性皮炎、炎症性皮肤病、牛皮癣性关节炎、关节炎、内毒素血症、哮喘、炎症性肠病(IBD)、结肠炎和本文公开的其他炎性病症的治疗中用于结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20和IL-22(或者单独或者一起)。
而且，我们已经显示IL-22RA受体可结合称为T细胞可诱导型因子(IL-22)(SEQ ID NO：6；Dumoutier，L.et al.，Proc.Nat’1.Acad.Sci. 97：10144-10149，2000；小鼠IL-22序列在Dumontier etal.，J.Immunol. 164：1814-1819，2000中显示)的配基。此外，共同拥有的zcytor11(IL-22RA)(美国专利编号5,965,704)和CRF2-4受体也以杂二聚体形式与IL-22结合(参见WIPO出版物WO00/24758；Dumontier et al.，J.Immunol. 164：1814-1819，2000；Spencer，SD et al.，J.Exp.Med.187：571-578，1998；Gibbs，VCand Pennica Gene186：97-101，1997(CRF2-4cDNA)；Xie，MH et al.， J.Biol.Chem. 275：31335-31339，2000；以及Kotenko，SV et al.， J.Biol.Chem. 276：2725-2732，2001)。而且，IL-10β受体可能作为IL-22的受体起作用，认为它与CRF2-4是相同的(Dumoutier，L.et al.，Proc.Nat’1.Acad.Sci. 97：10144-10149，2000；LiuYetal，J Immunol. 152；1821-1829，1994(IL-10R cDNA)。而且，我们已经显示IL-22RA受体与称为IL-20的配基(SEQ ID NO：8；WIPO出版物编号WO99/27103)结合。在优选的实施方案中，IL-22RA的可溶性受体形式(SEQ ID NO：3)是在体内可结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22和IL-20的单体、均二聚体、杂二聚体或者多聚体。针对这种IL-22RA单体、均二聚体、杂二聚体或者多聚体的抗体和结合多肽也可作为IL-22RA活性的拮抗剂，以及IL-20和IL-22(单独或者一同)的拮抗剂，如这里所描述的。
此外，我们在本文中已经描述并且证实了多克隆和单克隆中和性抗IL-22抗体可在基于细胞的中和试验中结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22和IL-20的活性。
已经显示I1-22在IL-9的存在下被诱导，并且怀疑它参与促进Th1类型的免疫应答以及炎症。IL-9以多种方式促进增殖、活化、分 化和/或诱导免疫功能，并且涉及哮喘、肺部肥大细胞增多症和其他疾病，并且可激活STAT途径。IL-22或者IL-9功能的拮抗剂对这种人类疾病可以有有益的用途。本发明提供了这种新型的IL-22拮抗剂。
已经表明IL-22参与上调急性期反应物的产生，例如血清淀粉样物质A(SAA)、α1抗胰凝乳蛋白酶、血清触珠蛋白，并且在体内注射脂多糖(LPS)后IL-22表达升高，这提示IL-22参与炎症应答(Dumoutier，L.et al.，Proc.Nat’1.Acad.Sci. 97：10144-10149，2000)。急性期蛋白质如SAA的产生被认为是短期生存机制，其中炎症是有益的；但是急性期蛋白质的长期维持会导致慢性炎症，并且可能对人的健康有害。综述请参见Uhlar，CM and Whitehead，AS，Eur.J.Biochem. 265：501-523，1999，以及Baumann H.and Gauldie，J. Immunology Today 15：74-80，1994。而且，急性期蛋白质SAA涉及许多慢性炎症疾病的致病机理，并且也参与动脉硬化症和类风湿性关节炎，它还是在淀粉样变性病中沉积的淀粉样A蛋白的前体(Uhlar，CM和Whitehead，见前)。这样，由于IL-22充当促炎分子并且诱导SAA产生，拮抗剂可以用于治疗炎症疾病和其他与由IL-22诱导的与急性期反应蛋白有关的疾病。这种拮抗剂由本发明提供。例如，降低IL-22诱导的或者IL-9诱导的炎症的方法包含向具有炎症的哺乳动物给予一定量的包含IL-22RA的可溶性受体的组合物，其量足以减轻炎症。而且，抑制具有炎症的哺乳动物中炎症反应的方法可以包括：(1)测定血清淀粉样蛋白A的水平；(2)施用包含本文描述的可溶性IL-22RA细胞因子受体多肽的组合物，所述组合物中包含在药物上可以接受的载体；(3)测定给药后的血清淀粉样蛋白A的水平；(4)比较步骤(1)中血清淀粉样蛋白A水平和步骤(3)中的血清淀粉样蛋白A水平，其中血清淀粉样蛋白A水平没有升高或者有降低就表明炎症反应受到抑制。本文描述的实验证据显示IL-22拮抗剂，例如可溶性受体和抗体，的确在体内炎症疾病模型中降低了SAA的水平，显示结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22具有抗炎作用。
有证据表明IL-20及其受体在牛皮癣中起作用。这种多基因皮肤病的特征是角质细胞增殖的增加，角质细胞分化的改变以及免疫细胞向皮肤内的浸润。IL-20参与牛皮癣的首要证据是在模拟人类牛皮癣异常的转基因小鼠中观察到角化过度和增厚的表皮。张力丝数目的下降(被认为与缺陷的角质化有关)是人类牛皮癣的显著特点。在小鼠中，化学诱导的和天然出现的皮肤增生状况中都发现有线粒体内包涵体。包涵体的原因及其对线粒体功能的影响(如果有的话)还不知道。IL-20转基因小鼠表现出许多在人类牛皮癣中观察到的特点。
而且，与正常皮肤相比，IL-20受体mRNA(IL-20RA和IL-20RBmRNA)在人类牛皮癣皮肤中显著上调，这进一步提示IL-20在牛皮癣中起作用。IL-20受体的两个亚基在整个表皮的角质细胞中都有表达，并且也在部分的免疫和内皮细胞中表达。我们推测被活化的IL-20受体的表达提高可能改变内皮细胞、免疫细胞和角质细胞之间的相互作用，导致角质细胞增殖和分化的异常调节。此外，本文描述的小鼠敲除数据(其中IL-22RA受体被敲除)显示IL-22RA对于转基因动物中皮肤内IL-20诱导的炎症作用是必需的。这些结果印证了有效地阻断IL-22RA的活性，例如通过IL-22RA基因敲除，或者类似地通过本发明的抗IL-22RA中和性单克隆抗体，会类似地降低IL-20诱导的皮肤状况以及IL-22诱导的皮肤状况，例如牛皮癣、IBD、结肠炎或者其他由IL-20或者IL-22诱导的炎症疾病，包括IBD、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎症性皮肤病以及遗传特应性皮炎。
而且，IL-20刺激人角质细胞HaCaT细胞系中的信号转导，佐证了这种新型配基在皮肤中的直接作用。此外，已知在角质细胞中有活性并且参与皮肤中增殖性和促炎信号的蛋白质IL-1β，EGF和TNF-α均会提高对于IL-20的应答。在表达IL-20受体的HaCaT和BHK细胞中，IL-20通过STAT3转导信号。
正如以上的讨论和以下的实施例所显示的，IL-20参与了牛皮癣的病理过程。本发明特别涉及一种通过施用结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20的药剂而治疗牛皮癣的方法。针对IL-20的拮抗剂可以是结合IL-20的可溶性受体(如可溶性IL-22RA)或者是结合IL-20或者IL-20受体的抗体、单链抗体或者抗体的片段，如抗IL-22RA抗体。这样拮抗剂会阻止IL-20受体的激活。而且，由于IL-20和IL-22将IL-22RA作为共同的受体，拮抗剂如可溶性IL-22RA或者结合IL-22RA受体的抗体、单链抗体或者抗体片段可以用于同时结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或者IL-20和IL-22二者的活性。
牛皮癣是一种最常见的皮肤疾病，影响到多达世界人口的1-2％。它是一种慢性炎症性皮肤病症，特点是被银色云母状鳞片覆盖的红斑、具有显著分界的丘疹以及圆形的斑块。牛皮癣的皮肤破损处不一定痒。创伤处经常出现牛皮癣破损。此外，其他的外界因素也可能加重牛皮癣，包括感染、压力以及用药例如锂、β阻断剂以及抗疟疾药物。
最常见的牛皮癣种类称为斑块型。具有斑块型牛皮癣的病人有稳定且缓慢生长的斑块，斑块在长时间内基本保持不变。斑块牛皮癣最常出现的区域是肘部、膝部、臀沟以及头皮。多对称发病。皮褶牛皮癣影响对磨区域包括腋窝、腹股沟，乳腺下的区域以及肚脐，它还会影响到头皮、手掌和脚底。单独的破损是明显分界的斑块，但是由于破损所处的位置它们也可能是湿润的。斑块型的牛皮癣一般发展缓慢，并且是无痛的。它很少自发地复发。
爆发型牛皮癣(滴状牛皮癣)在小孩和年轻成人中最常见。它在没有牛皮癣的个体中或者在那些患有慢性斑块型牛皮癣的人中急性发作。病人出现许多小的红斑、鳞片状丘疹、常见于由于β-溶血性链球 菌导致的上呼吸道感染之后。患有牛皮癣的病人也可以产生脓泡破损。这些破损处可能位于手掌和脚底处，或者可以是全身化，并且与发烧、不适、腹泻和关节痛相伴。
大约一半患有牛皮癣的病人具有指甲影响，甲外观呈现凹凸不平、甲增厚或者甲下过度角质化。大约5-10％的患有牛皮癣的病人具有伴随的关节不适，这些最常见于具有指甲影响的病人中。尽管一些病人碰巧出现典型的类风湿性关节炎，许多病人患有的关节疾病属于以下五种与牛皮癣有关的类型之一：(1)只限于一个或者几个关节的疾病(70％的病例)；(2)血清反应阴性的类风湿性关节炎样疾病；(3)远端指(趾)节间的关节累及；(4)严重的破坏性关节炎，出现“残毁性关节炎”以及(5)只限于脊柱的疾病。
可以通过施用结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22、IL-20或者IL-20和IL-22二者的药剂治疗牛皮癣。优选的拮抗剂是IL-20和IL-22的可溶性受体，例如IL-22RA(SEQ ID NO：3)，或者结合IL-22RA受体的抗体、抗体片段或者单链抗体，例如本发明的中和抗体。这种拮抗剂可以单独给予或者与其他成熟的疗法，如润滑剂、去角质剂、局部类固醇、局部维生素D衍生物、地蒽酚、全身抗代谢物例如氨甲蝶呤、补骨脂素紫外线疗法(PUVA)、银屑灵、异维甲酸、环孢霉素、以及局部的维生素D3衍生物钙泊三醇组合使用。而且，这种拮抗剂可以通过皮下、静脉内给药或者用含有拮抗剂的乳膏或皮肤贴片经皮给药。如果经皮下给药，则拮抗剂可以注射进入一个或者更多个的牛皮癣斑块中。如果经皮给药，则拮抗剂可以用含有拮抗剂的乳膏、软膏、油膏或者溶液等形式直接给予在斑块上面。
IL-20或者IL-22的拮抗剂可以向患有哮喘、支气管炎或者囊性纤维化或者其他炎症性肺部疾病的人给予以治疗这些疾病。拮抗剂可以通过任何适宜的方法，包括静脉内、皮下、支气管灌洗以及使用含 有拮抗剂的吸入剂等方法给药。
对应于IL-22RA cDNA的mRNA的组织分布的分析表明，mRNA水平在胎盘和脾脏中最高，且与IL-22RA结合的配基(IL-22)参与诱导炎症反应，包括诱导急性期应答(Dumoutier，L.et al.，Proc.Nat’1.Acad.Sci. 97：10144-10149，2000)。因此，本发明的特殊实施方案针对的是使用可溶性IL-22RA和抗IL-22RA抗体作为拮抗剂用于炎症和免疫疾病或者病症，如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、遗传特应性皮炎、炎症性皮肤病况、类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、克罗恩氏病(节段性回肠炎)、憩室病、哮喘、胰腺炎、I型糖尿病(IDDM)、胰腺癌、格雷夫斯病、结肠和小肠癌、自身免疫疾病、败血病、器官或者骨髓移植；由于内毒素血症、创伤、手术或者感染导致的炎症；淀粉样变性病；脾肿大；移植物对抗宿主疾病；以及需要抑制炎症，免疫抑制，降低造血细胞、免疫、炎症或者淋巴细胞、巨噬细胞、T细胞(包括Th1和Th2细胞)增殖，对于病原或者抗原的免疫应答的抑制，或者其他需要抑制IL-22或者IL-20细胞因子的情况。
而且，本文描述的与IL-22RA多肽结合的抗体或者结合多肽以及IL-22RA多肽自身可以用于：
1)在治疗急性炎症，由于外伤、组织损伤、手术、败血症或者感染导致的炎症，以及慢性炎症性疾病如哮喘、炎症性肠病(IBD)、慢性结肠炎、脾肿大、类风湿性关节炎、复发性急性炎症发作(如结核病)，以及淀粉样变性病和动脉硬化症、Castleman疾病、哮喘以及其他与急性期应答诱导有关的疾病的治疗中，阻断、抑制、降低、拮抗或者中和通过IL-20或者IL-22受体介导的信号。
2)在治疗自身免疫疾病如IDDM、多发性硬化症(MS)、全身性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、类风湿性关节炎以及IBD中阻断、抑制、 降低、拮抗或者中和通过IL-20或者IL-22受体介导的信号，以阻止或者抑制免疫细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、白细胞)通过IL-22RA的信号转导(Hughes C et al.，J.Immunol 153：3319-3325，1994)。或者，也可以使用针对包含IL-22RA的受体的抗体例如单克隆抗体(mAb)作为拮抗剂，清除不需要的免疫细胞，以治疗自身免疫疾病。可以使用针对例如可溶性IL-22RA受体的单抗治疗哮喘、过敏或者其他特应性变态反应，以抑制免疫应答或者清除侵犯的细胞。使用本发明的多肽和抗体阻断、抑制、降低或者拮抗通过IL-22RA介导的信号，可能对胰腺、肾脏、垂体和神经元细胞等的疾病也是有益的。IDDM、NIDDM、胰腺炎以及胰腺肿瘤也可能受益。IL-22RA可以作为癌症单抗疗法的靶标，其中拮抗性的单抗抑制癌的生长，并且以免疫介导的杀死作为目标。(Holliger P，and Hoogenboom，H：Nature Biotech.16：1015-1016，1998)。针对可溶性IL-22RA的单抗还可以用干治疗肾脏疾病，例如肾小球硬化症、膜状神经病变、淀粉样变性病(也影响肾脏等组织)、肾动脉硬化症、不同来源的肾小球性肾炎、肾脏纤维增生病以及与SLE，IDDM，II型糖尿病(NIDDM)，肾脏肿瘤和其他疾病有关的肾功能紊乱。
3)在治疗自身免疫疾病例如IDDM，MS，SLE、重症肌无力、类风湿性关节炎以及IBD中增效、提高、增加或者启动通过IL-20或I1-22受体的信号。抗IL-22RA中和性单克隆抗体可以向淋巴细胞或者其他免疫细胞传递信号，使细胞因子或者其他改善自体免疫力的细胞表面蛋白分化、改变其增殖或者改变其产生。特别地，将T辅助细胞应答改变为另外一种型式的细胞因子分泌，可以使自体免疫应答异化，使疾病缓解(Smith JA et al.，J.Immunol. 160：4841-4849，1998)。类似地，激动性抗可溶性IL-22RA抗体、抗可溶性IL-22RA/CRF2-4杂二聚体和多聚体单克隆抗体可以用于向参与哮喘、过敏和特应性变态反应疾病的免疫细胞发出信号、或者将其清除和异化。通过IL-22RA的信号传导还可能对胰腺、肾脏、垂体和神经元细胞疾病有益。IDDM， NIDDM，胰腺炎和胰腺癌也可能受益。IL-22RA可以作为胰腺癌单抗疗法的靶标，其中信号传导性单抗抑制癌的生长，并且以免疫介导的杀死作为目标(Tutt，AL et al.，J Immunol. 161：3175-3185，1998)。类似地，可以使用针对本发明中包含IL-22RA的可溶性受体的单克隆抗体治疗肾细胞癌。
本文描述的可溶性IL-22RA多肽可以在上面描述的自身免疫疾病、特应性疾病、NIDDM、胰腺炎以及肾功能障碍的治疗中用于结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或者IL-20(单独或者一同)的活性。IL-22RA的可溶性形式可以用于促进由Th细胞介导的抗体应答和/或促进淋巴细胞或者其他免疫细胞产生IL-4或者其他细胞因子。
本发明中的包含IL-22RA的可溶性受体可以作为IL-20或者IL-22细胞因子的拮抗剂。这种拮抗作用可以通过直接中和或者结合IL-20或I1-22而实现。除了拮抗的用途以外，本发明的可溶性受体还可以结合IL-22，并且作为IL-20或IL-22细胞因子的载体蛋白，目的是将配基运输到体内不同的组织、器官和细胞处。这样，本发明的可溶性受体可以与指导可溶性受体-配基复合体到达特异位置(例如组织、特异的免疫细胞或者肿瘤)的分子、多肽或者化学成分融合或者偶联。例如，通过IL-22的作用诱导炎症以及局部产生急性期反应蛋白，可能会使急性感染或者一些癌症获益。因此，本发明的可溶性受体可以用于特异地指导IL-20或者IL-22的作用。参见Cosman，D. Cytokine 5：95-106，1993；以及Fernandez-Botran，R.Exp.Opin.Invest.Drugs 9：497-513，2000。
而且，本发明的可溶性受体可以用于稳定IL-22或者IL-20，通过稳定配基使其不发生降解或清除，或者通过将配基靶向到体内的作用位点而提高配基的生物可获得性、治疗寿限和/或效力。例如，天然 存在的IL-6/可溶性IL-6复合体可使IL-6稳定，并且能够通过gp30受体转导信号。参见Cosman，D.见前，以及Fernandez-Botran，R.见前。而且，IL-22RA可以与同源的配基例如IL-22组合在一起，形成配基/可溶性受体复合体。这种复合体可以用于刺激呈递伴侣受体亚基(例如pDIRS1(IL-20RB)或CRF2-4(IL-10RB))的细胞产生应答。IL-22RA/配基复合体的细胞特异性可能与当配基单独给药时观察到的细胞特异性不同。而且，复合体可能具有独特的药代动力学性质，例如影响半寿期、剂量/反应以及器官或组织特异性。因此，IL-22RA/IL-22或IL-22RA/IL-20复合体可能具有激动剂的活性，可以增强免疫应答或者刺激肾小球膜细胞或者刺激肝细胞。或者，只有表达与复合体杂二聚化的信号传导亚基的组织才能受到与针对IL6/IL6R复合体的应答相似的影响(Hirota H.et al.，Proc.Nat’1.Acad.Sci. 92：4862-4866，1995；Hirano，T.in Thomason，A.(Ed.)”The Cytokine Handbook”，3rdEd.，p.208-209)。IL12和CNTF的可溶性受体/细胞因子复合体显示了相似的活性。
而且，炎症是生物体的保护性应答，以抵挡侵犯的因子。炎症是一个级联的过程，它涉及许多细胞和体液的介体。一方面，对炎症应答的抑制可以使宿主不能产生正常的免疫反应；但是，如果不加以限制，则炎症可以导致严重的并发症，包括慢性炎症疾病(例如牛皮癣、关节炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎症性肠炎等等)、败血症性休克以及多器官衰竭。重要的是，这些不同的疾病状态具有共同的炎症性介体。具有发炎特征的这些疾病对于人的患病率和死亡率有很大的影响。因此，很明显的是，抗炎症性蛋白例如IL-22RA和抗IL-22RA抗体可能对大量的人类和动物疾病，从哮喘和过敏到自体免疫性和败血性休克，都有着极其重要的治疗潜力。
1.关节炎
关节炎，包括由于损伤所致的骨关节炎、类风湿性关节炎、关节 炎关节等等，是常见的炎症性病症，它们可以受益于抗炎症蛋白如本发明的IL-22RA多肽的治疗性使用。例如，类风湿性关节炎(RA)是一种全身疾病，它影响整个机体，并且是一种最常见形式的关节炎。其特征是沿关节滑膜发炎，这导致疼痛、僵硬、温暖、发红和肿大。炎症性细胞释放的酶可以消化骨和软骨。类风湿性关节炎的结果是发炎的关节内膜—滑膜可以侵入和破坏骨和软骨，导致关节磨损和剧烈的疼痛以及其他生理状况。患病的关节可以丧失其形状和排列，导致疼痛以及运动的丧失。
类风湿性关节炎(RA)是一种免疫介导的疾病，其特征尤其在于发炎和随后的组织损坏，导致严重残疾和死亡率的增加。在患类风湿的关节处局部产生了多种细胞因子。许多研究表明，两种原型的促炎细胞因子—IL-1和TNFα在涉及滑膜炎症和进行性关节破坏的机制中起到重要的作用。的确在患RA的病人中给予TNFα和IL-1抑制因子已经导致炎症的临床和生物学征候的显著改善，并且骨质糜烂和软骨破坏的放射性学征候下降。但是，尽管有这些令人鼓舞的结果，有很大百分比的病人对于这些药剂并不产生反应，这提示还有其他的介体也参与关节炎的病理生理学(Gabay，Expert.Opin.Biol.Ther.2(2)：135-149，2002)。这些介体中的一种可能就是IL-20或者IL-22，如果是这样，结合或者抑制IL-22或IL-20活性的分子，如IL-22RA多肽或抗IL-22RA抗体或者结合伴侣可以成为有用的治疗药物减轻类风湿性关节炎以及其他关节性疾病中的炎症。
在本领域中有多个类风湿性关节炎的动物模型。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠产生慢性炎症性关节炎，它非常类似人类的类风湿性关节炎。由于CIA与RA有相似的免疫学和病理学特征，它成为筛选潜在的人抗炎化合物的理想模型。CIA模型是小鼠中众所周知的模型，它的出现依赖于免疫应答和炎症反应二者。免疫应答包括对作为抗原给予的胶原反应产生的B细胞和CD4+T细胞之间的相互 作用，导致抗胶原抗体的产生。发炎阶段是由炎症介体产生的组织应答的结果，是这些抗体中的一些与小鼠的天然胶原发生交叉反应并且激活补体级联的结果。使用CIA模型的一个优点是致病的基本机制是已知的。已经在II类胶原上鉴定出了相关的T细胞和B细胞表位，并且已经确定了各种与免疫介导的关节炎有关的免疫学参数(例如延迟超敏反应和抗胶原抗体)和炎症参数(例如细胞因子、化学因子以及基质降解酶)，这些参数可以用于评估待检化合物在CIA模型中的效力(Wooley，Curr.Opin.Rheum. 3：407-20，1999；Williams et al.， Immunol. 89：9784-788，1992；Myers et al.，Life Sci. 61：1861-78，1997；以及Wang et al.，Immunol. 92：8955-959，1995).
向这些CIA模型小鼠给予包含IL-22RA2的可溶性多肽(zcytor16)，例如zcytor16-Fc4或者其他IL_22RA2可溶性和融合蛋白，来评价使用IL-22RA2作为IL-22的拮抗剂用于缓解症状和改变病程的效果。而且，IL-22被IL-22RA2抑制的结果为其他IL-22拮抗剂例如IL-22RA或者其抗体也可以用来缓解症状和改变病程这个观点提供了证据。由于IL-22RA2的配基IL-22诱导SAA的产生，而SAA参与了类风湿性关节炎的发病，而且IL-22RA2被证明能够在体外和体内抑制IL-22和SAA的活性，所以全身或者局部给予包含IL-22RA2的多肽例如zcytor16-Fc4或者其他IL-22可溶性受体(如IL-22RA；SEQIDNO：3)和抗IL-22RA抗体以及融合蛋白可以潜在地抑制RA中的炎症反应。注射10微克zcytor16-Fc(一周三次注射四周)显著降低了疾病评分(爪评分，发炎或者疾病的发病率)。其他潜在的治疗剂包括IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或者抗IL-22抗体或结合伴侣等等。
一个小组的研究显示，相对于对照小鼠，抗小鼠IL-22抗体可以减轻CIA模型小鼠的症状，因此显示理论上可溶性IL-22RA多肽和IL-22RA中和抗体可能有益于治疗人类疾病。给予一种小鼠IL-22特异性大鼠单克隆抗体(P3/1)作为预防给药或者在CIA模型被诱导关 节炎后给药，可以减轻动物中的关节炎症状(WIPO出版物02/068476；2002-09-09出版)。因此，本发明的可溶性IL-22RA多肽以及抗IL-22RA抗体，包括本发明的抗人IL-22RA中和抗体，可以在治疗特异的人类疾病如牛皮癣、牛皮癣性关节炎、关节炎、内毒素血症、炎症性肠炎(IBD)、结肠炎以及其他本文公开的炎性病症时用于中和IL-22和IL-20。
2.内毒素血症
内毒素血症是一种严重的病症，通常由于感染性因子如细菌和其他感染性疾病因子、败血症、中毒性休克综合征引起或者在无免疫应答的病人中由于机会感染而出现。治疗上有用的抗炎症蛋白，如本发明的IL-22RA多肽和抗体，可以帮助阻止和治疗人和动物的内毒素血症。IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或者抗IL-22抗体或结合伴侣，可以作为有价值的治疗剂用于减轻内毒素血症中的炎症和病理作用。
脂多糖(LPS)诱导的内毒素血症涉及了许多的促炎介体，它们在感染性疾病中产生病理作用，在啮齿类动物中LPS诱导的内毒素血症是一种广泛使用并被接受的用于研究潜在的促炎或者免疫调节因子药理作用的模型。在革兰氏阴性细菌中产生的LPS是败血性休克发病机制中的主要致病因子(Glausner et al.，Lancet 338：732，1991)。休克样状态确实可以通过向动物单次注射LPS进行实验诱导。细胞应答LPS产生的分子可以直接或者间接地靶向病原。尽管这些生物应答保护宿主不受入侵病原的侵袭，但它们也会导致伤害。因此，由严重革兰氏阴性细菌感染引起的内在免疫力的大规模刺激导致了细胞因子和其他分子的过量产生，并且出现致命的综合征--败血性休克综合征，其特点是发烧、血压过低、弥散性血管内凝血以及多器官衰竭(Dumitru et al.Cell103：1071-1083，2000)。
LPS的这些毒性作用大多数与巨噬细胞被激活、导致多种炎症介 体释放有关。在这些介体中，TNF看起来起了极其重要的作用，这一点可以由通过给予抗TNF的中和抗体而防止了LPS的毒性而表明(Beutler et al.，Science229：869，1985)。已经很明确的是，注射1微克大肠杆菌LPS到C57B1/6小鼠体内，大约2小时后会导致循环中IL-6、TNF-α、IL-2以及急性期蛋白(例如SAA)的明显增加。LPS的毒性看起来是通过这些细胞因子介导的，因为对这些介体的被动免疫可以使死亡率下降(Beutler et al.，Science229：869，1985)。预防和/或治疗败血性休克的潜在免疫干预策略包括抗TNF单抗、IL-1受体拮抗剂、LIF、IL-10和G-CSF。
向这些LPS诱导的模型给予包含IL-22RA2的可溶性多肽(例如Zcytor16-Fc4)或者其他IL-22RA可溶性和融合蛋白，用于评价使用IL-22RA2减轻症状和改变LPS诱导疾病病程的效果。而且，IL-22被IL-22RA2所抑制的结果为其他IL-22拮抗剂例如IL-22RA或其抗体也可以用来缓解LPS诱导的模型中的症状和改变疾病病程这个观点提供了证据。该模型显示了LPS注射诱导了IL-22以及IL-22RA2多肽对疾病的可能治疗。由于LPS诱导产生促炎性IL-22、SAA或者其他可能在内毒素血症病理学中起作用的促炎因子，所以使用拮抗剂IL-22RA2多肽中和IL-22的活性、SAA或者其他促炎因子，可以减轻内毒素血症的症状，正如在内毒素休克中所见到的那样。其他潜在的治疗剂包括IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或者抗IL-22抗体或结合伴侣等等。
3.炎症性肠病，IBD
在美国大致500000人罹患炎症性肠病(IBD)，它可以影响结肠和直肠(溃疡性结肠炎)或者小肠和大肠二者(节段性回肠炎)。这些疾病的病理机制还不清楚，但是它们涉及被感染组织的慢性炎症。IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或者抗IL-22抗体或者结合伴侣可以作为有价值的治疗剂用于减轻IBD和相关疾病中的炎症和病理作用。
溃疡性结肠炎(UC)是一种大肠(通常称为结肠)的炎症疾病，其特征是结肠的粘膜或最内层的炎症和溃疡。这种炎症导致结肠经常排空，产生腹泻。症状包括稀松的粪便和伴随的腹部绞痛、发烧以及体重下降。尽管UC的确切原因还不知道，最近的研究提示机体的天然防卫对在机体内的被机体认为是外源的蛋白质起作用(一种“自体免疫反应”)。可能因为它们象肠道内的细菌蛋白，这些蛋白可能激起或者刺激炎症过程，开始破坏结肠内膜。随着结肠内膜被破坏，形成溃疡，释放粘液、脓和血液。这种疾病通常从直肠区域开始，最终可以扩散到整个大肠。炎症的反复发作导致肠和直肠壁上由于疤痕组织而增厚。结肠组织的死亡或者败血症可以在严重的疾病中出现。溃疡性结肠炎根据严重性的不同其症状有所不同，它们的发作可以是逐步的或者突然的。疾病发作可能由许多因素引起，包括呼吸系统感染或者压力。
尽管现在还没有治愈UC的方法可供利用，治疗集中在抑制结肠内膜中异常的炎症过程。治疗方法包括皮质类固醇免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、巯基嘌呤和氨甲蝶呤)，对氨基水杨酸也可以治疗这种疾病。但是，长期使用免疫抑制剂例如皮质激素和硫唑嘌呤可以导致严重的副反应，包括骨变细、白内障、感染以及对肝脏和骨髓的影响。对于在当前的治疗中不能成功的病人，手术是一种选择。手术包括将整个结肠和直肠去掉。
有许多动物模型可以部分地模拟慢性溃疡性结肠炎。最广泛使用的模型是2，4，6三硝基苯磺酸/乙醇(TNBS)诱导的结肠炎模型，它在结肠中诱导慢性炎症和溃疡。当TNBS通过直肠内滴注被引入敏感小鼠的结肠中时，它在结肠的粘膜中诱导T细胞介导的免疫应答，在这种情况下导致大规模的粘膜炎症，其特点是在整个大肠壁中密集的T细胞和巨噬细胞浸润。而且，这一组织病理情景还伴随着临床上的进行性体重下降(消瘦)、血性腹泻、直肠脱垂以及大肠壁增厚(Neurath et al.Intern.Rev.Immunol. 19：51-62，2000)。
另外一个结肠炎模型使用葡聚糖硫酸钠(DSS)，它诱导了急性结肠炎，其表现为血性腹泻、体重下降、结肠缩短以及具有嗜中性粒细胞浸润的粘膜溃疡。DDS诱导的结肠炎的组织学特点是炎症细胞向鼓膜中层浸润、淋巴样增生、局部小囊损坏以及上皮溃疡。这些改变的出现被认为是由于DSS在上皮细胞上的毒性作用、鼓膜中层细胞的吞噬作用、以及TNFα和IFNγ的产生。尽管由于DSS模型的普遍使用，涉及关于人类疾病相关性的DSS机制的许多问题还有待解决。DSS被认为是一个不依赖于T细胞的模型，因为在T细胞缺失的动物例如SCID小鼠中也观察到了这种模型。
向这些TNBS或者DSS模型给予包含IL-22RA2的可溶性多肽(例如Zcytor16-Fc4)或者其他IL-22RA可溶性和融合蛋白，可以用于评价使用IL-22RA2减轻症状和改变胃肠道疾病病程的效果。而且，IL-22被IL-22RA2抑制的结果为其他IL-22拮抗剂例如IL-22RA或者其抗体也可以用来缓解结肠炎/IBD模型中的症状和改变疾病病程这个观点提供了证据。我们通过RT-PCR以及IL-22与IL-1β在肠细胞系上的协同活性，在DSS小鼠的结肠组织中观察到IL-22的表达增加。它表明IL-22在结肠炎的炎症反应中可能起作用，而且通过给予IL-22RA2多肽中和IL-22的活性是一种潜在的IBD治疗方法。其他潜在的治疗剂包括IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或者抗IL-22抗体或结合伴侣等等。
4.牛皮癣
牛皮癣是一种慢性皮肤病患，它影响到700万以上的美国人。当新的皮肤细胞生长异常时即出现牛皮癣，导致皮肤发炎、肿胀以及鳞片状的斑点，其中老的皮肤不能迅速脱落。斑块型牛皮癣是最常见的形式，其特点是皮肤上红肿的斑点(“损伤”)覆盖有银白色的鳞片。 牛皮癣可以只限于少数斑块，或者累及皮肤中度到大部分区域，最为经常出现的位置是头皮、膝盖、肘部和躯干。尽管明显可见，牛皮癣并不是一种传染性疾病。这种疾病的发病机制涉及发病组织的慢性炎症。IL-22RA多肽、抗IL-22RA抗体或者抗IL-22与抗IL-20抗体或结合伴侣可以作为有价值的治疗剂，在牛皮癣、其他炎症性皮肤疾病、皮肤和粘膜过敏以及相关疾病中减轻炎症和病理作用。
牛皮癣是一种T细胞介导的皮肤炎症性病症，它可以导致相当程度的不舒适。这种疾病还没有治愈方法，影响所有年龄的人。牛皮癣影响大约欧洲和北美人口的2％。尽管具有轻度牛皮癣的个体可以使用局部药剂控制其疾病，世界上有超过100万的患者需要紫外线或全身性免疫抑制治疗。但不幸的是，紫外线辐射的不便和风险以及许多治疗方法的毒性限制了它们的长期使用。而且，在停止免疫抑制治疗后不久，病人通常会复发牛皮癣，某些情况下会反弹。
IL-20是一种新型的IL-10同系物，显示它可以在IL-20转基因小鼠中导致新生儿致死以及皮肤的异常，包括畸形的表皮分化(Blumberg H etal.，Cell 104：9-19，2001)。IL-20受体在牛皮癣的皮肤中急剧上调。由于IL-22与IL-20受体共享有受体亚基(zcytor11)，并且IL-22转基因小鼠表现出相似的表型，所以可能IL-22也参与了炎症性皮肤疾病例如牛皮癣。通过皮下或者局部给予IL-22RA多肽或者抗IL-22RA抗体拮抗剂，有可能减轻炎症和症状。其他可能的治疗药剂包括IL-22RA多肽，可溶性zcytor11/CRF2-4受体多肽，或者抗IL-22抗体或结合伴侣等等。
而且，在人类牛皮癣损伤中显示有IL-22和IL-20的过量表达，提示IL-22与IL-20一样也涉及人类牛皮癣。而且，正如这里所描述的，IL-20或者IL-22在转基因小鼠中的过量表达显示了表皮增厚和免疫细胞牵连，这是牛皮癣表型的指示；此外，将IL-22向正常小鼠 中注射显示了表皮增厚和免疫细胞牵连(这是牛皮癣表型的指示)，这种现象可以通过可溶性受体拮抗剂IL-22RA2(zcytor16；WIPO出版物编号WO01/40467)消除。这种体内数据进一步提示促炎的IL-22参与了牛皮癣。类似地，IL-22和IL-20活性的拮抗剂，例如IL-22RA可溶性受体及其抗体，包括本发明的抗人IL-22RA单克隆中和抗体，在炎症性疾病的治疗性治疗中是有用的，特别是在牛皮癣的治疗中可作为IL-22和IL-20(单独或者一同)的拮抗剂。而且，IL-22活性的拮抗剂，例如IL-22RA可溶性受体及其抗体，包括本发明的抗人IL-22RA单克隆中和抗体，在其他炎症性疾病的治疗性治疗中是有用的，例如可以在治疗遗传特应性皮炎、IBD、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、成人呼吸疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、水肿、遗传特应性皮炎和接触性皮炎以及炎症性肠病如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎中，作为结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22和IL-20的药剂。
而且，本发明的抗IL-22RA抗体和IL-22RA可溶性受体可以用于预防和治疗与本文描述的一系列炎症性疾病有关的体重下降，以及用于预防和治疗与癌症(例如化疗和恶病质)和感染性疾病有关的体重下降。例如，严重的体重下降是与败血症、MS、RA和肿瘤模型有关的关键标志。此外，体重下降是许多人类疾病包括癌症、感染性疾病和炎症疾病的重要参数。注射了本文描述的IL-22腺病毒的小鼠显示了体重下降。可以测试本发明的抗IL-22抗体和IL-22拮抗剂例如可溶性IL-22RA受体及其抗体，以及zcytor16(IL-22RA2)受体防止和治疗注射了本文描述的IL-22腺病毒的小鼠中体重下降的能力。确定这种IL-22拮抗剂的预防性或者治疗性方案的方法在本领域内是已知的，并且可以使用本文描述的方法确定。
IL-22RA可溶性受体多肽及其抗体还可以在诊断系统中使用，用 于检测IL-22或者IL-20配基的循环水平，并且用于检测与急性期炎症反应有关的IL-22。在相关的实施方案中，可以使用抗体或者其他与本发明的IL-22RA可溶性受体特异结合的药剂，来检测循环中的受体多肽；相反，IL-22RA可溶性受体自身可以用来检测循环中或者局部作用的IL-22或IL-20多肽。配基或者受体多肽的升高或者受抑制水平可以是对病理状况包括炎症或者癌症的指示。已知IL-22诱导相关的急性期炎症反应。而且，对急性期蛋白或者分子例如IL-20或IL-22的检测可以指示某些疾病中(例如牛皮癣、类风湿性关节炎、结肠炎、IBD)的慢性炎症状况。这种状况的检测可以有助于疾病的诊断以及帮助内科医生选择正确的治疗方法。
可以使用抗IL-22或者抗IL-20中和抗体的子宫内给药，通过降低或者消除在过量表达IL-22的IL-22转基因幼仔中或者是在过量表达IL-20的IL-20转基因幼仔中发现的皮肤表型，从而显示在疾病模型中的体内效力。在本领域内有使用中和性单克隆抗体进行子宫内治疗的先例。在一个实例中，通过使用对于B细胞特异分子CD19特异的单抗处理怀孕的雌性小鼠，使B细胞的B1亚群的发育受到严重影响(例如KroDI.Et al.，Eur.J.Immunol. 26(1)：238-42，1996)。Krop等人在妊娠后第9天通过腹腔内注射500微克溶于PBS的大鼠抗小鼠CD19单抗(或者是大鼠同I型匹配的对照单抗)，接下来每隔一天注射，直至分娩。幼仔在10日龄时也注射500微克的这些抗体一次。在另外一个实例中，Tanaka等人发现使用IL-2受体β链的单克隆抗体进行子宫内处理，完全终止了Thy-1+树突状表皮细胞的发育。IL-2受体的两个不同亚基，即α链(IL-2Rα)和β链(IL-2Rβ)，以一种几乎互斥的方式在胚胎胸腺中表达。通过给予针对IL-2Rβ的中和性单抗阻断IL-2Rβ--IL-2R的信号转导组分，导致了Thy1+皮肤树突状表皮细胞的完全和选择性消失。任何其他T细胞亚群的发育没有受到影响。这表明IL-2在胚胎Vγ5+细胞及其后裔的发育中起极其重要的作用(参见Tanaka，T.et al.，Int Immunol. 4(4)：487-9，1992)。 此外，Schattemann GC等人使用子宫内系统显示了正常的小鼠心血管发育需要PDGF-A。多个证据提示，在正常的胚胎心血管发育中需要血小板衍生生长因子A链(PDGF-A)。将抗PDGF-A中和抗体引入小鼠妊娠子宫内膜，导致对体内PDGF-A配基—受体相互作用的选择性破坏18-24小时，从而确定心血管的发育是否需要PDGF-A以及何时需要(参见否Schattemann GC et al.，Dev.Biol. 176(1)：133-42，1996)。这些结果以及本领域内描述的其他结果，佐证了中和性单抗可以在子宫内引发强烈作用。类似地，可以提供表明在疾病模型中体内使用单克隆抗体中和IL-20或者IL-22时降低或者去除在分别过量表达IL-20和IL-22的IL-20和IL-22转基因小鼠幼仔中发现的皮肤表型的效力。这些转基因小鼠出生时具有“光亮的”皮肤外表，这至少部分地因为本文描述的表皮增厚。表达较低水平的转基因细胞因子的IL-20转基因幼仔可以恢复，并且确实能够存活而繁育后代，但是IL-22转基因小鼠在出生后不久死亡，一般在5日龄以前。
例如，IL-20的中和抗体包括能够结合IL-20抗原性表位和中和IL-20活性的抗体，如中和单克隆抗体。因此，携带抗原性表位的IL-20肽和多肽，可以用于制备结合本发明的IL-20多肽的抗体，以及用于鉴定和筛选能够结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20活性的中和性抗IL-20单克隆抗体。本发明的这种中和性单克隆抗体可以结合IL-20抗原性表位。这种SEQ ID NO：8内的表位(由Jameson-Wolf图线预测，例如使用DNASTAR Protean程序(DNASTAR，Inc.，Madison，WI))可作为优选的抗原性表位，而且可以由本领域内的技术人员确定。这种抗原性表位包括：SEQ ID NO：8的42(Ile)到102(Asp)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的42(Ile)到60(Ile)号氨基酸残基；SEQID NO：8的42(Ile)到69(Glu)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的42(Ile)到81(Cys)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的42(Ile)到96(Lys)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的42(Ile)到102(Asp)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的60(Ile)到69(Glu)号氨基酸残基； SEQ ID NO：8的60(Ile)到81(Cys)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的60(Ile)到96(Lys)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的60(Ile)到102(Asp)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的69(Glu)到81(Cys)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的69(Glu)到96(Lys)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的69(Glu)到102(Asp)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的81(Cys)到96(Lys)号氨基酸残基；SEQ ID NO：8的81(Cys)到102(Asp)号氨基酸残基；以及SEQ ID NO：8的96(Lys)到102(Asp)号氨基酸残基。
除了本文描述的其他疾病模型以外，抗IL-22RA抗体在来自人牛皮癣损伤的炎症组织上的活性可以使用重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型进行体内测定。已经开发出几个小鼠模型，其中将人的细胞移植到免疫缺陷小鼠体内(统称为异种移植模型)；参见例如Cattan AR，Douglas E，Leuk.Res. 18：513-22，1994以及Flavell，DJ， Hematological Oncology 14：67-82，1996。作为一个体内牛皮癣异种移植模型，将人的牛皮癣皮肤组织移植到SCID小鼠模型中，用适当的拮抗剂进行攻击。而且，本领域内的其他牛皮癣动物模型也可以用于评价IL-20和IL-22拮抗剂，例如将人牛皮癣皮肤组织移植到AGR129小鼠模型中，用适当的拮抗剂进行攻击(例如参见Boyman，O.et al.，J.Exp.Med.网上出版编号#20031482，2004，这里引用作为参考)。能够结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或者IL-20和IL-22二者活性的抗IL-22RA抗体是优选的拮抗剂，但是抗IL-20和抗IL-22抗体(单独或者组合在一起)、可溶性IL-22RA以及其他IL-20和IL-22拮抗剂也可以在这个模型中使用。类似地，来自人结肠炎、IBD、关节炎或者其他炎症损伤的组织或细胞可以用于SCID模型上，以研究本文描述的IL-20和IL-22拮抗剂的抗炎性质。
为消除、延缓或者减轻炎症而设计的、使用抗IL-22RA抗体或者其衍生物、激动剂、缀合物或者变体的治疗方案，可以通过将抗 IL-22RA抗体或者可溶性IL-22RA化合物给予带有人类炎症组织(例如牛皮癣损伤等等)的SCID小鼠或者本文描述的其他模型，进行测试。使用本领域内众所周知的方法，测定处理的效力并统计学评价为在所处理的群体内增加的抗炎效果随时间的关系。一些示例性的方法包括，但是不止限于，测量例如牛皮癣模型中的表皮厚度、上层真皮中炎症细胞的数目、角化不全的程度。这些方法在本领域内是已知的，并且在这里有所描述。例如，参见Zeigler，M.et al.LabInvest 81：1253，2001；Zollner，T.M.et al.J.Clin.Invest. 109：671，2002；Yamanaka，N.et al.Microbio.lImmunol. 45：507，2001；Raychaudhuri，S.P.et al.Br.J.Dermatol. 144：931，2001；Boehncke，W.H et al.Arch.Dermatol.Res. 291：104，1999；Boehncke，W.H et al..J.Invest.Dermatol. 116：596，2001；Nickoloff，B.J.et al.Am.J.Pathol. 146：580，1995；Boehncke，W.H et al.J.Cutan.Pathol. 24：1，1997；Sugai，J.，M.et al. J.Dermatol.Sci. 17：85，1998；以及Villadsen L.S.et al.J.Clin.Invest. 112：1571，2003。还可以使用众所周知的方法随时间监测炎症，例如采用流式细胞仪(或者PCR)定量测定样品中的炎症或者损伤细胞的数目，对于IBD进行评分(体重下降、腹泻、直肠出血、结肠长度)，对于CIARA模型进行爪疾病评分和炎症评分。例如，适于在这种模型中进行测试的治疗性策略包括直接治疗，其中使用抗IL-22RA抗体、其他IL-20和IL-22拮抗剂(单独或者一起)或相关的缀合物或基于抗IL-22RA抗体与其配基IL-20和IL-22之间破坏性的相互作用的拮抗剂，或者使用抗IL-22RA抗体或其衍生物、激动剂、缀合物或变体的基于细胞的治疗方法。
而且，牛皮癣是一种慢性炎症性皮肤疾病，它与增生的表皮角质细胞和浸润的单核细胞有关，包括CD4+记忆T细胞、嗜中性粒细胞以及巨噬细胞(Christophers，Int.Arch.Allergy Immunol.，110：199，1996)。现在认为环境抗原在引发和促进疾病的病理机制上有重要作 用。但是，正是对自体抗原耐受的丧失被认为介导了牛皮癣的病理机制。树突状细胞和CD4+T细胞被认为在抗原呈递和识别中起重要作用，这种呈递和识别介导了导致牛皮癣病理的免疫应答。我们最近根据CD4+CD45RB转移模型开发了牛皮癣模型(Davenport et al.， Internat.Immunopharmacol.，2：653-672)。向小鼠给予抗IL-20抗体、抗IL-22抗体或者针对IL20R和/或IL22R的抗体，例如本发明的抗IL-22RA抗体、或者可溶性IL-22RA。对疾病评分(皮肤损伤、炎症性细胞因子)的抑制表明IL-20和IL-22拮抗剂在牛皮癣中的有效性，例如抗IL-22RA抗体或者IL-22RA可溶性受体或者其他拮抗剂例如抗IL20和/或IL-22的抗体或者它们受体。
遗传特应性皮炎
IL-20和IL-22在遗传特应性皮炎(AD)病人的样品中都出现上调。AD是一种常见的慢性炎症性疾病，其特点是属于辅助T细胞亚类2(Th2)的细胞因子过度活化。尽管AD的确切病原学还不知道，但已经知道有多个因素参与，包括过度活跃的Th2免疫应答、自体免疫、感染、过敏原以及遗传诱因。疾病的主要特征包括干燥病(皮肤干燥)、瘙痒(皮肤瘙痒)、结膜炎、炎症性皮肤损伤、金黄色葡萄球菌感染、血液中的嗜曙红细胞升高、血清IgE和IgG1升高以及具有T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和嗜曙红细胞浸润的慢性皮炎。已经认识到金黄色葡萄球菌的集落化或者感染会使AD恶化，并且使这种皮肤病变为永久的慢性病。
AD通常在具有哮喘和过敏性鼻炎的病人中发现，并且经常是过敏疾病的初始表现。在西方国家中，大约20％的人口罹患这些过敏性疾病，在发达国家中AD的发病率由于不知道的原因正在上升。AD通常在儿童时期开始，并常常从青春期一直持续到成年。目前对AD的治疗包括局部的皮质类固醇、口服环孢霉素A、非皮质类固醇免疫抑制剂例如他克莫斯(FK506，软膏的形式)以及干扰素γ。尽管有多种AD治 疗方式，许多病人的症状并没有改善，或者他们对用药产生了不良反应，需要寻找其他更加有效的治疗性药剂。本发明的可溶性IL-22RA多肽和抗IL-22RA抗体，包括抗人IL-22RA中和抗体，可以在治疗特殊人类疾病如遗传特应性皮炎、炎症性皮肤病症以及本文公开的其他炎症性病症中用于中和IL-22和IL-20。
对于药物使用，根据常规方法将本发明的可溶性IL-22RA或者抗IL-22RA抗体配制成用于胃肠道外给药，特别是静脉内或者皮下给药。使用大药丸注射、控制释放进行静脉内给药，例如使用微型泵或者其他适当的技术，或者在通常一到几小时内进行灌注。一般地，药物配方中包括造血蛋白质和药物上可以接受的载体如盐溶液、缓冲盐溶液、5％右旋葡萄糖水溶液等的组合。配方中还可以包括一种或者更多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止蛋白质附着在管壁上造成损失。在使用这种组合疗法时，细胞因子可以组合在一个配方中，或者以分开的配方给药。配方的方法是本领域内众所周知的，并且公开在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton PA，1990中，这里引用作为参考。治疗性剂量一般的范围是每天0.1到100mg/kg病人体重，优选为每天0.5-20mg/kg，确切的剂量由临床医生根据接受的标准确定，并考虑将要治疗的病况的性质和严重性，病人的遗传特性等等。剂量的确定是在本领域内普通技术水平内的。蛋白质通常在化疗之后或者骨髓移植之后给药最多长达28天或者直至血小板计数达到大于20,000/mm3，优选大于50,000/mm3。更为常见的是，将蛋白质在一周或者更短的时间内给药，通常在一到三天的时间段内给药。一般地，治疗上有效量的本发明的可溶性IL-22RA或者抗IL-22RA抗体是足以导致临床上淋巴细胞或者骨髓始祖细胞的增殖和/或分化发生临床上显著增加的量，这种增加表现为成熟细胞(例如血小板或者嗜中性粒细胞)循环水平的增加。对血小板失调症的治疗将持续至血小板计数达到至少20,000/mm3，优选为50,000/mm3。本发明的可溶性IL-22RA或者抗 IL-22RA抗体还可以与其他的细胞因子例如IL-3，-6和-11、干细胞因子、促红细胞生成素、G-CSF和GM-CSF组合给药。在组合治疗的方案中，其他细胞因子的每日剂量一般是：EPO，150U/kg；GM-CSF，5-151g/kg；IL-3，1-51g/kg；G-CSF，1-251g/kg。例如，使用EPO的组合疗法用于低EPO水平的贫血病人。
一般地，可溶性IL-22RA(或者IL-22RA类似物或者融合蛋白)或者抗IL-22RA抗体的给予剂量将根据病人的年龄、体重、身高、性别、一般身体状况以及以前的治疗史等因素而有所不同。通常比较理想的是向受体提供剂量范围在从大约1pg/kg到10mg/kg(药剂的量/病人的体重)内的可溶性IL-22RA或者抗IL-22RA抗体，当然根据情况，可以给予更低或者更高剂量。
可溶性IL-22RA或者抗IL-22RA抗体向受试者的给予可以通过静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸腔内、鞘内途径、通过局部的导管进行灌注或者直接向病灶内注射给药。在通过注射给予治疗性蛋白时，给药可以是连续的灌注或者是单次或多次的大剂量注射。
其他的给药途径包括口服、经粘膜、经肺部以及跨皮肤。口服给药适于基于聚酯微球、玉米蛋白微球、类蛋白微球、聚腈基丙烯酸酯微球以及脂类的系统(参见例如DiBase and Morrel，“Oral Deliveryof Microencapsulated Proteins，”Protein Delivery：PhysicalSystems，Sanders and Hendren(eds.)，pages255-288(PlenumPress1997))。通过这样一种胰岛素给药方式示例了鼻内给药的便利性(参见例如Hinchcliffe and Illum，Adv.Drug Deliv.Rev.35：199(1999))。可以制备包含IL-22RA的干燥或者液体颗粒，并且借助干粉分散装置、液体气溶胶发生器或者喷雾器吸入病人体内(例如，Pettit and Gombotz，TIBTECH16：343(1998)；Patton et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.35：235(1999))。这个方法由AERX糖尿病 处理系统予以举例说明，该系统是一种手提式电子吸入器，可以将气溶胶式的胰岛素送入肺部。研究表明大到48000kDa的蛋白质都已经在低频超声波的辅助下跨皮肤运输，达到治疗性的浓度，这证明了经过皮肤给药的可行性(Mitragotri et al.，Science269：850(1995))。使用电穿孔通过皮肤给药提供了另外一种给予具有IL-22RA结合活性的分子的方式(Potts et al.，Pharm.Biotechnol.10：213(1997))。
包含可溶性IL-22RA或者抗IL-22RA抗体的药物组合物可以根据已知的方法进行配制，以制备药物上有用的组合物，其中治疗性蛋白质与药物上可以接受的载体组合形成混合物。如果接受给药的患者能够耐受组合物的给予，则称这种组合物为“药物上可以接受的载体”。无菌的磷酸盐缓冲液是药物上可以接受的载体的一个实例。其他的适宜载体对本领域的人员是众所周知的。参见例如Gennaro(ed.)，Remington′s Pharmaceutical Sciences，19th Edition(MackPublishing Company1995)。
为实现治疗目的，将可溶性IL-22RA或者抗IL-22RA抗体分子以及药物上可以接受的载体以治疗上有效的量给予患者。如果本发明的治疗性分子和药物上可以接受的载体的组合的给药量是生理上显著的，则称该组合是以“治疗上有效的量”给予的。如果药剂的存在导致接受它的病人出现可以检测到的生理变化，则这种药剂是生理上显著的。例如，如果治疗炎症的药剂的存在可以缓解炎症反应，则称这种药剂是生理上显著的。
包含IL-22RA(或者IL-22RA类似物或融合蛋白)或者抗IL-22RA中和抗体的药物组合物可以以液体形式、气溶胶形式或者固体形式提供。液体形式的例证有可注射的溶液和口服悬液。示例的固体形式包括胶囊、片剂以及控释形式。后一种形式的例证有微型渗透压泵和植入体(Bremer et al.，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade， “Implants in Drug Delivery，”Drug Delivery Systems，Ranade andHollinger(eds.)，pages95-123(CRC Press1995)；Bremer et al.，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”Protein Delivery：Physical Systems，Sanders and Hendren(eds.)，pages239-254(Plenum Press1997)；Yewey et al.，“Delivery of Proteins froma Controlled Release Injectable Implant，”Protein Delivery：Physical Systems，Sanders and Hendren(eds.)，pages93-117(Plenum Press1997))。
脂质体提供了一种通过静脉内、腹腔内、鞘内、肌肉内、皮下或者通过口服、吸入或鼻内给药而向受试对象投递治疗性多肽的方式。脂质体是显微镜下可见的囊泡，它由一个或者更多个脂质双分子层组成，双分子层内包裹的是水性小室(参见，一般地，Bakker-Woudenberget al.，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs46：618(1993)，以及Ranade，“Site-SpecificDrug Delivery Using Liposomes as Carriers，”Drug DeilverySystems，Ranade and Hollinger(eds.)，pages3-24(CRC Press1995))。脂质体在组成上与细胞膜相似，所以脂质体可以安全给予并且可以生物降解。依制备方法而定，脂质体有单层或者多层的，且脂质体的直径范围可以从0.02μm到大于10μm。可以将多种药剂包裹在脂质体内。疏水药剂被分配在双分子层中，而亲水的药剂被分配在内部的水性空间(参见例如Machy et al.，Liposomes In Cell BiologyAnd Pharmacology(John Libbey1987)，以及Ostro et al.，AmericanJ.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。而且，可以通过改变脂质体的大小、双分子层的数目、脂类组成以及脂质体的电荷和表面性质来控制被包裹药剂的治疗可获得性。
脂质体可以吸附到几乎任何种类的细胞上，然后缓慢释放所包裹的药剂。或者，吸附的脂质体可以被吞噬细胞细胞内吞。内吞作用后， 脂质体的脂类发生溶酶体内降解，释放所包裹的药剂(Scherphof etal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。静脉内给药后，小的(0.1到1.0μm)脂质体通常被主要位于肝脏和脾脏内的网状内皮系统的细胞摄取，而大于3.0μm的脂质体在肺部沉积。网状内皮系统的细胞对较小脂质体的优先摄取已经被用于将化疗的药剂投递到巨噬细胞以及肝脏的肿瘤处。
网状内皮系统可以通过许多方法规避，包括使用大剂量脂质体颗粒饱和或者通过药理学方式进行选择性的巨噬细胞失活(Claassenet al.，Biochim.Biophys.Acta802：428(1984))。此外，已经显示将糖脂或者聚乙二醇衍生的磷脂掺入到脂质体的膜上也可以大大降低脂质体被网状内皮系统摄取(Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta1068：133(1991)；Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
还可以通过改变磷脂组成或者向脂质体中插入受体或者配基，来制备靶向特殊细胞或者器官的脂质体。例如，已经将用高含量非离子表面活性剂制备的脂质体用于靶向肝脏(Hayakawa et al.，JapanesePatent04-244，018；Kato et al.，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。将大豆磷脂酰胆碱、α生育酚以及乙氧基氢化蓖麻油(HCO-60)混和在甲醇中，真空浓缩混合物，然后用水使混合物复原，制备出这些配方。使用二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)以及大豆来源的硬脂酰葡糖苷混合物(soybean-derived sterylglucosidemixture，SG)和胆固醇(Ch)的脂质体配方，也已经被证明可靶向肝脏(Shimizu et al.，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。
或者，可以将不同的靶向配基结合到脂质体的表面，例如抗体、抗体片段、糖、维生素和转运蛋白。例如，可以用分枝型半乳糖基脂类衍生物修饰脂质体，以便靶向脱唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该 受体只在肝脏细胞的表面表达(Kato and Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287(1997)；Murahashi et al.，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。类似地，Wu et al.，Hepatology27：772(1998)，表明用脱唾液酸胎球蛋白标记脂质体可以使脂质体的血浆半寿期缩短，并且显著提高肝细胞对脱唾液酸胎球蛋白标记的脂质体的摄取。另一方面，包含分枝型半乳糖基脂类衍生物的脂质体在肝脏中的积累可以被事先注射脱唾液酸胎球蛋白所抑制(Murahashi et al.，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。多聚乌头酸化的人血清白蛋白脂质体提供了另外一种将脂质体靶向到肝脏细胞的方法(Kamps et al.，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA94：11681(1997))。而且，Geho，et al.美国专利编号4,603,044，描述了一种定向于肝脏的脂质体囊泡投递系统，它对与肝脏特化代谢细胞相关的肝胆管受体有特异性。
在更为一般的组织靶向方法中，事先用对靶细胞所表达的配基特异的生物素化抗体标记靶细胞(Harasym et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。血浆中的游离抗体被清除后，给予缀合了链亲和素的脂质体。在另外一种方法中，将靶向抗体直接附着于脂质体上(Harasym et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。
可以使用标准的蛋白质微包裹技术将多肽和抗体包裹到脂质体中(参见例如，Anderson et al.，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson et al.，Cancer Res.50：1853(1990)，Cohen et al.，Biochim.Biophys.Acta1063：95(1991)，Alving et al.“Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies，”Liposome Technology，2nd Edition，Vol.III，Gregoriadis(ed.)，page317(CRC Press1993)，Wassef et al.，Meth.Enzymol.149：124(1987))。正如上面所指出的，治疗上有用的脂质体可以含有多种组分。例如，脂质体可以包含聚乙二醇的脂类衍生物(Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
已经设计了可降解的聚合物微球体，以保持治疗性蛋白的全身性高水平。从可降解的聚合物例如聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLG)，聚酸酐、聚原酸酯、不能生物降解的乙酸乙基乙烯酯聚合物来制备微球体，其中蛋白质被包在聚合物中(Gombotz and Pettit，BioconjugateChem.6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymers in DrugDelivery，”Drug Delivery Systems，Ranade and Hollinger(eds.)，pages51-93(CRC Press1995)；Roskos and Maskiewicz，“Degradable Controlled Release Systems Useful for ProteinDelivery，”Protein Delivery：Physical Systems，Sanders andHendren(eds.)，pages45-92(Plenum Press1997)；Bartus et al.，Science281：1161(1998)；Putney and Burke，Nature Biotechnology16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇涂层的纳米小球也可以作为治疗性蛋白静脉内给药的载体(参见例如Gref et al.，Pharm.Biotechnol.10：167(1997))。
本发明还涉及化学修饰的具有结合IL-22RA活性的多肽，例如IL-22RA单体、均二聚、杂二聚或者多聚可溶性受体，以及IL-22RA拮抗剂，例如如上面描述的与聚合物连接的抗IL-22RA抗体或结合多肽或者抗IL-22RA中和抗体。
本领域内的技术人员可以设计其他剂量形式，例如Ansel andPopovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，5thEdition(Lea&Febiger1990)，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，19thEdition(Mack Publishing Company1995)，以及Ranade and Hollinger，Drug Delivery Systems(CRCPress1996)中所示。
作为例证，药物组合物可以作为包含容器的试剂盒提供，该容器 中包含具有IL-22RA细胞外结构域的多肽，例如IL-22RA单体、均二聚、杂二聚或者多聚可溶性受体或者IL-22RA拮抗剂(例如与IL-22RA多肽结合的抗体或者抗体片段，或者抗IL-22RA中和抗体)。治疗性多肽可以以可注射溶液形式提供，用于单或者多剂量的注射，或者作为无菌粉末提供，可在注射前将粉末重溶。或者，这种试剂盒中可以包括干粉分散器，液体气溶胶生成器或者喷雾器，用于治疗性多肽的给药。这种试剂盒还可以包含关于药物组合物适应症和用法的书面信息。而且，这种信息可以包括说明，指明IL-22组合物是已知对IL-22RA有超敏反应的病人禁用的。
包含抗IL-22RA抗体或者结合伴侣(或者抗IL-22RA抗体片段、抗体融合蛋白、人化抗体等等)或者IL-22RA可溶性受体的药物组合物，可以以液体形式、气溶胶形式或者固体形式提供。液体形式的例证有可注射的溶液、气溶胶、滴剂、局部溶液和口服悬液。示例性的固体形式包括胶囊、片剂以及控释形式。后面一种形式的例证有微型渗透压泵和植入体(Bremer et al.，Pharm.Biotechnol.10：239(1997)；Ranade，“Implants in Drug Delivery，”Drug DeliverySystems，Ranade and Hollinger(eds.)，pages95-123(CRC Press1995)；Bremer et al.，“Protein Delivery with Infusion Pumps，”Protein Delivery：Physical Systems，Sanders and Hendren(eds.)，pages239-254(Plenum Press1997)；Yewey et al.，“Delivery ofProteins from a Controlled Release Injectable Implant，”Protein Delivery：Physical Systems，Sanders and Hendren(eds.)，pages93-117(Plenum Press1997))。其他固体形式包括乳膏、糊剂、其他局部敷用药物等等。
脂质体提供了一种通过静脉内、腹腔内、鞘内、肌肉内、皮下或者口服、吸入或鼻内给药途径投递治疗性多肽的方式。脂质体是显微镜下可见的囊泡，它由一个或者更多个脂质双分子层组成，膜内包裹 着水性小室(总体参见Bakker-Woudenberg et al.，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61(1993)，Kim，Drugs46：618(1993)，以及Ranade，“Site-Specific Drug Delivery UsingLiposomes as Carriers，”Drug Delivery Systems，Ranade andHollinger(eds.)，pages3-24(CRC Press1995))。脂质体在组成上与细胞膜相似，所以脂质体可以安全给予并且可以生物降解。依制备方法而定，脂质体有单层或者多层的，且脂质体的直径范围可以从0.02μm到大于10μm。可以将多种药剂包裹在脂质体内：疏水性药剂被分配在脂质双分子层内，而亲水性药剂被分配在内部水性空间(参见例如Machy et al.，Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(John Libbey1987)，以及Ostro et al.，American J.Hosp.Pharm.46：1576(1989))。而且，可以通过改变脂质体的大小、脂质双分子层的数目、脂类组成以及脂质体的电荷和表面性质来控制被包裹药剂的治疗可获得性。
脂质体可以吸附到几乎任何种类的细胞上，然后缓慢释放所包裹的药剂。或者，吸附的脂质体可以被吞噬细胞细胞内吞。内吞作用后，脂质体的脂类发生溶酶体内降解，释放所包裹的药剂(Scherphof etal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.446：368(1985))。静脉内给药后，小的(0.1到1.0μm)脂质体通常被主要位于肝脏和脾脏内的网状内皮系统的细胞摄取，而大于3.0μm的脂质体在肺部沉积。网状内皮系统的细胞对较小脂质体的优先摄取已经被用于将化疗剂投递到巨噬细胞以及肝脏的肿瘤处。
网状内皮系统可以通过许多方法规避，包括使用大剂量脂质体颗粒饱和或者通过药理学方式进行选择性的巨噬细胞失活(Claassenet al.，Biochim.Biophys.Acta802：428(1984))。此外，已经显示将糖脂或者聚乙二醇衍生的磷脂掺入到脂质体的膜上也可以大大降低脂质体被网状内皮系统摄取(Allen et al.，Biochim.Biophys. Acta1068：133(1991)；Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
还可以通过改变磷脂组成或者向脂质体中插入受体或者配基，来制备靶向特殊细胞或者器官的脂质体。例如，已经将用高含量非离子表面活性剂制备的脂质体用于靶向肝脏(Hayakawa et al.，JapanesePatent04-244,018；Kato et al.，Biol.Pharm.Bull.16：960(1993))。将大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚以及乙氧基氢化蓖麻油(HCO-60)混和在甲醇中，真空浓缩混合物，然后用水使混合物复原，制备出这些配方。使用二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)以及大豆来源的硬脂酰葡糖苷混合物(SG)和胆固醇(Ch)的脂质体配方，也已经被证明可靶向肝脏(Shimizu et al.，Biol.Pharm.Bull.20：881(1997))。
或者，可以将不同的靶向配基结合到脂质体的表面，例如抗体、抗体片段、糖、维生素和转运蛋白。例如，可以用分支型半乳糖基脂类衍生物修饰脂质体，以便靶向脱唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体只在肝脏细胞的表面表达(Kato and Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287(1997)；Murahashi et al.，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。类似地，Wu et al.，Hepatology27：772(1998)，表明用脱唾液酸胎球蛋白标记脂质体可以使脂质体的血浆半寿期缩短，并且显著提高肝细胞对脱唾液酸胎球蛋白标记的脂质体的摄取。另一方面，包含分支型半乳糖脂衍生物的脂质体在肝脏中的积累可以被事先注射脱唾液酸胎球蛋白所抑制(Murahashi et al.，Biol.Pharm.Bull.20：259(1997))。多聚乌头酸化的人血清白蛋白脂质体提供了另外一种将脂质体靶向到肝脏细胞的方法(Kamps et al.，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA94：11681(1997))。而且，Geho，et al.美国专利编号4,603,044，描述了一种定向于肝脏的脂质体囊泡投递系统，它对与肝脏特化代谢细胞相关的肝胆管受体有特异性。
在更为一般的组织靶向方法中，事先用对靶细胞所表达的配基特异的生物素化抗体标记靶细胞(Harasym et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。血浆中的游离抗体被清除后，给予缀合了链亲和素的脂质体。在另外一种方法中，将靶向抗体直接附着于脂质体上(Harasym et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99(1998))。
可以使用标准的蛋白质微包裹技术将具有IL-22或IL-20结合活性的抗IL-22RA中和抗体和结合伴侣，或者将IL-22RA可溶性受体，包裹到脂质体中(参见例如，Anderson et al.，Infect.Immun.31：1099(1981)，Anderson et al.，Cancer Res.50：1853(1990)，Cohen et al.，Biochim.Biophys.Acta1063：95(1991)，Alving etal.“Preparation and Use of Liposomes in ImmunologicalStudies，”Liposome Technology，2nd Edition，Vol.III，Gregoriadis(ed.)，page317(CRC Press1993)，Wassef et al.，Meth.Enzymol.149：124(1987))。正如上面所指出的，治疗上有用的脂质体可以含有多种组分。例如，脂质体可以包含聚乙二醇的脂类衍生物(Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta1150：9(1993))。
已经设计了可降解的聚合物微球体，以保持治疗性蛋白的全身性高水平。从可降解的聚合物例如聚(交酯-共-乙醇酸交酯)(PLG)，聚酸酐、聚原酸酯、不能生物降解的乙酸乙基乙烯酯聚合物来制备微球体，其中蛋白质被包在聚合物中(Gombotz and Pettit，BioconjugateChem.6：332(1995)；Ranade，“Role of Polymers in DrugDelivery，”Drug Delivery Systems，Ranade and Hollinger(eds.)，pages51-93(CRC Press1995)；Roskos and Maskiewicz，“Degradable Controlled Release Systems Useful for ProteinDelivery，”Protein Delivery：Physical Systems，Sanders andHendren(eds.)，pages45-92(Plenum Press1997)；Bartus et al.， Science281：1161(1998)；Putney and Burke，Nature Biotechnology16：153(1998)；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548(1998))。聚乙二醇(PEG)涂层的纳米小球也可以作为治疗性蛋白静脉内给药的载体(参见例如Gref et al.，Pharm.Biotechnol.10：167(1997))。
本发明还涉及化学修饰的抗IL-22RA抗体或者结合伴侣，例如如上所述与聚合物连接的抗IL-22RA抗体或者IL-22RA可溶性受体。
本领域内的技术人员可以设计其他剂量形式，例如Ansel andPopovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，5thEdition(Lea&Febiger1990)，Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences，19thEdition(Mack Publishing Company1995)，以及Ranade and Hollinger，Drug Delivery Systems(CRCPress1996)中所示。
本发明涉及包含本文描述的抗体、肽或者多肽的抗IL-22抗体组合物，以及方法和治疗性使用。这种组合物中还可以包含载体。载体可以是常规的有机或者无机载体。载体的实例包括水、缓冲溶液、醇、丙二醇、macrogol，芝麻油、玉米油等等。
11.转基因小鼠的制备
在人类牛皮癣损伤中显示了IL-22和IL-20二者的过量表达，提示IL-22与IL-20都涉及人类牛皮癣的发病。而且，正如这里所描述的，IL-20和IL-22在转基因小鼠中的过量表达显示了表皮增厚和免疫细胞牵连，这是牛皮癣表型的指示；此外，将IL-22向正常小鼠中注射显示了表皮增厚和免疫细胞牵连(这是牛皮癣表型的指示)，这可以通过可溶性受体拮抗剂zcytor16(IL-22RA2)消除。这种体内数据进一步提示促炎的IL-22参与了牛皮癣发病。这样，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22RA单克隆中和抗体，以及可溶性 IL-22RA受体，在炎症性疾病的治疗性治疗中是有用的，特别是在牛皮癣的治疗中作为IL-22和IL-20的拮抗剂。而且，结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-22或者IL-20和IL-22二者活性的药剂，例如本发明的抗人IL-22RA单克隆中和抗体，以及可溶性IL-22RA受体，在其他炎症性疾病的治疗性治疗中是有用的，例如在遗传特应性皮炎、IBD、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、成人呼吸疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、水肿、遗传特应性皮炎和接触性皮炎以及炎症性肠病如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎等等的治疗中用作IL-22或者IL-20和IL-22二者的拮抗剂。
在一个方面，本发明提供了一种制备针对多肽的抗体的方法，该方法包括：将选自下述的多肽接种到动物中：(a)由SEQ ID NO：3的1号氨基酸(Pro)到6号氨基酸(Asp)组成的多肽；(b)由SEQ ID NO：3的26号氨基酸(Ser)到32号氨基酸(Pro)组成的多肽；(c)由SEQ IDNO：3的41号氨基酸(Lys)到47号氨基酸(Asp)组成的多肽；(d)由SEQID NO：3的49号氨基酸(Va l)到62号氨基酸(Cys)组成的多肽；(e)由SEQ ID NO：3的41号氨基酸(Lys)到62号氨基酸(Cys)组成的多肽；(f)由SEQ ID NO：3的84号氨基酸(Ala)到97号氨基酸(Ser)组成的多肽；(g)由SEQ ID NO：3的103号氨基酸(Thr)到108号氨基酸(Asp)组成的多肽；(h)由SEQ ID NO：3的130号氨基酸(Arg)到135号氨基酸(His)组成的多肽；(i)由SEQ ID NO：3的164号氨基酸(Gly)到166号氨基酸(Lys)组成的多肽；(j)由SEQ ID NO：3的175号氨基酸(Tyr)到179号氨基酸(Glu)组成的多肽；(k)由SEQ IDNO：3的193号氨基酸(Lys)到196号氨基酸(Ala)组成的多肽；(1)由SEQ ID NO：3的203号氨基酸(Lys)到209号氨基酸(Thr)组成的多肽；以及(m)由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成的多肽；以及(n)由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的多肽；其中所述多肽在动物中诱发免疫应答，产生所述抗体；和从动物中分离抗体；其中所述抗 体特异地结合IL-22RA多肽(SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3)；并且降低IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的活性。在一个实施方案中，提供了如上所述的方法，其中由该方法产生的抗体降低了IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)的促炎活性。在另一个实施方案中，提供了如上所述的方法，其中由该方法产生的抗体中和了IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)与IL-22RA(SEQID NO：2)的相互作用。在另一个实施方案中，提供了如上所述的方法，其中所述抗体产生的中和作用是通过在基于细胞的体外中和试验中对IL-20(SEQ ID NO：8)或IL-22(SEQ ID NO：6)表现出中和而测量的。在另一个实施方案中，提供了如上所述的方法，其中由该方法产生的抗体可降低IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)二者的促炎活性。在另一个实施方案中，提供了如上所述的方法，其中由该方法产生的抗体可中和IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)二者与IL-22RA(SEQ ID NO：2)的相互作用。在另一个实施方案中，提供了如上所述的方法，其中所述抗体产生的中和作用是通过在基于细胞的体外中和试验中对IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ IDNO：6)二者表现出中和而测量的。
在另一个方面，本发明提供了由本文中公开的方法产生的抗体，它与SEQ ID NO：2或者SEQ ID NO：3所示多肽可结合。在一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体，其中所述抗体是(a)多克隆抗体，(b)鼠单克隆抗体，(c)衍生自(b)的人化抗体，(d)抗体片段，或者(e)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或者毒素。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体，其中所述抗体还包含PEG化。
在另一方面，本发明提供了一种抗体或者抗体片段，它可与包含SEQ ID NO：3所示氨基酸残基序列的多肽结合，并且降低IL-20(SEQID NO：8)或者IL-22(SEQ ID NO：6)的促炎活性。在一个实施方案 中，本发明提供了如上所述的抗体或者抗体片段，其中该抗体或者抗体片段可降低IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)二者的促炎活性。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体或者抗体片段，其中所述抗体或者抗体片段是(a)多克隆抗体，(b)鼠单克隆抗体，(c)衍生自(b)的人化抗体，(d)抗体片段，或者(e)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体或者抗体片段，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或者毒素。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体或者抗体片段，其中所述抗体还包含PEG化。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体或者抗体片段，其中所述抗体或者抗体片段是(a)多克隆抗体，(b)鼠单克隆抗体，(c)衍生自(b)的人化抗体，(d)抗体片段，或者(e)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体或者抗体片段，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或者毒素。在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的抗体或者抗体片段，其中所述抗体还包含PEG化。
在另一方面，本发明提供了一种用于降低或者抑制IL-22诱导的或者IL-20诱导的造血细胞和造血始祖细胞的增殖或者分化的方法，该方法包括将骨髓或者外周血细胞与包含一定量的本文所述抗体的组合物一起培养，与没有该抗体时培养的骨髓或者外周血细胞相比，所述抗体的量足以降低骨髓或者外周血细胞中的造血细胞的增殖和分化。在一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中造血细胞和造血始祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述淋巴样细胞是巨噬细胞或者T细胞。
在另一方面，本发明提供了一种降低IL-22诱导的或者IL-20诱导的炎症的方法，该方法包括向具有炎症的哺乳动物给予一定量的本文所述抗体的组合物，该抗体的量足以减轻炎症。
在另一方面，本发明提供了一种用于降低或者抑制IL-22诱导的 和IL-20诱导的造血细胞和造血始祖细胞的增殖或者分化的方法，该方法包括将骨髓或者外周血细胞与包含一定量的本文所述抗体的组合物一起培养，与没有抗体时培养的骨髓或者外周血细胞相比，所述抗体的量足以降低骨髓或者外周血细胞中的造血细胞的增殖或分化。在一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述造血细胞和造血始祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，该抗体是如上所述的，其中所述淋巴样细胞是巨噬细胞或者T细胞。
在另一方面，本发明提供了一种降低IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，该方法包括向具有炎症的哺乳动物给予一定量的本文所述抗体的组合物，所述抗体的量足以减轻炎症。
在另一方面，本发明提供了一种用于降低或者抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血始祖细胞的增殖或者分化的方法，该方法包含将骨髓或者外周血细胞与包含一定量的本文所述抗体或抗体片段的组合物一起培养，与没有所述抗体或抗体片段时培养的骨髓或者外周血细胞相比，所述抗体或抗体片段的量足以降低骨髓或者外周血细胞中的造血细胞的增殖或分化。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述造血细胞和造血始祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述淋巴样细胞是巨噬细胞或者T细胞。
在另一方面，本发明提供了一种降低IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，该方法包括向具有炎症的哺乳动物给予一定量的本文所述抗体或者抗体片段的组合物，其中所述抗体或者抗体片段的量足以减轻炎症。
在另一方面，本发明提供了一种用于降低或者抑制IL-22诱导的和IL-20诱导的造血细胞和造血始祖细胞的增殖或者分化的方法，该方法包括将骨髓或者外周血细胞与包含一定量的本文所述抗体或抗体片段的组合物一起培养，与没有抗体时培养的骨髓或者外周血细胞相比，所述抗体或抗体片段的量足以降低骨髓或者外周血细胞中的造血细胞的增殖或分化。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其 中所述造血细胞和造血始祖细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述淋巴样细胞是巨噬细胞或者T细胞。
在另一方面，本发明提供了一种降低IL-22诱导的和IL-20诱导的炎症的方法，该方法包括向具有炎症的哺乳动物给予一定量的本文述抗体或者抗体片段的组合物，所述抗体或者抗体片段的量足以减轻炎症。
在另一方面，本发明提供了一种抑制具有炎症的哺乳动物中炎症反应的方法，该方法包括：(1)确定血清淀粉样物质A蛋白的水平；(2)给予包含在可接受的药物载体中的本文所述抗体或抗体片段的组合物；(3)确定给药后血清淀粉样物质A蛋白的水平；(4)比较步骤(1)和步骤(3)中的血清淀粉样物质A蛋白的水平；其中血清淀粉样物质A蛋白的水平没有升高或者出现下降表明炎症反应受到抑制。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受到IL-22或者IL-20在其中起作用的炎症疾病折磨的哺乳动物的方法，该治疗方法包括：向哺乳动物给予IL-22或IL-20的拮抗剂，使炎症减轻，其中所述拮抗剂包含(i)与IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或者多肽片段特异结合的抗体、抗体片段或结合多肽，或者(ii)IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或者多肽片段；并且其中IL-22(SEQ ID NO：6)或IL-20(SEQID NO：8)的炎症活性被降低。在一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是慢性炎症疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是慢性炎症疾病，包括炎症性肠病、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是急性炎症疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是急性炎症疾病，包括内毒素血症、败血症、毒性休克综合征或者感染性疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述抗体、抗体片段或者结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或者毒素。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受到IL-22和IL-20在其中起作用的炎症疾病折磨的哺乳动物的方法，该治疗方法包括：向哺乳动物给予IL-22和IL-20二者的拮抗剂使炎症减轻，其中所述拮抗剂包含(i)与IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或者多肽片段特异结合的抗体、抗体片段或结合多肽，或者(ii)IL-22RA(SEQ ID NO：3)的多肽或者多肽片段；并且其中IL-22(SEQ ID NO：6)和IL-20(SEQIDNO：8)二者的炎症活性被降低。在一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是慢性炎症疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是慢性炎症疾病，包括炎症性肠病、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是急性炎症疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是急性炎症疾病，包括内毒素血症、败血症、毒性休克综合征或者感染性疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述抗体、抗体片段或者结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或者毒素。
在另一方面，本发明提供了包含可与人IL-22RA(SEQ ID NO：3)中选自下组的抗原性表位特异性结合的单克隆抗体的抗体：(a)由SEQ ID NO：3的1号氨基酸(Pro)到6号氨基酸(Asp)所示氨基酸序列组成的表位；(b)由SEQ ID NO：3的26号氨基酸(Ser)到32号氨基酸(Pro)所示氨基酸序列组成的表位；(c)由SEQ ID NO：3的41号氨基酸(Lys)到47号氨基酸(Asp)所示氨基酸序列组成的表位；(d)由SEQ ID NO：3的49号氨基酸(Val)到62号氨基酸(Cys)所示氨基酸序列组成的表位；(e)由SEQ ID NO：3的41号氨基酸(Lys)到62号氨基酸(Cys)所示氨基酸序列组成的表位；(f)由SEQ ID NO：3的84号氨基酸(Ala)到97号氨基酸(Ser)所示氨基酸序列组成的表位；(g)由SEQ ID NO：3的103号氨基酸(Thr)到108号氨基酸(Asp)所示氨基酸序列组成的表位；(h)由SEQ ID NO：3的130号氨基酸(Arg)到135号氨基酸(His)所示氨基酸序列组成的表位；(i)由SEQ ID NO：3的164号氨基酸(Gly)到166号氨基酸(Lys)所示氨基酸序列组成的表位；(j)由SEQ ID NO：3的175号氨基酸(Tyr)到179号氨基酸(Glu)所示氨基酸序列组成的表位；(k)由SEQ ID NO：3的193号氨基酸(Lys)到196号氨基酸(Ala)所示氨基酸序列组成的表位；(1)由SEQ ID NO：3的203号氨基酸(Lys)到209号氨基酸(Thr)所示氨基酸序列组成的表位；以及(m)由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成的表位；以及(n)由SEQ ID NO：4所示氨基酸序列组成的表位；其中所述抗体可降低或者中和人IL-22(SEQ ID NO：6)或IL-20(SEQIDNO：8)的活性。在一个实施方案中，该抗体是如上所述的，其中所述抗体可降低或者中和人IL-20(SEQ ID NO：8)和IL-22(SEQ ID NO：6)二者的活性。在另一个实施方案中，该抗体是如上所述的，其中所述抗体选自下组中：(a)鼠单克隆抗体，(b)衍生自(a)的人化抗体，(c)抗体片段，和(d)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，该抗体是如上所述的，其中所述抗体还包含PEG化。在另一个实施方案中，该抗体是如上所述的，其中所述抗体选自下组中：(a)鼠单克隆抗体，(b)衍生自(a)的人化抗体，(c)抗体片段，和(d)人单克隆抗体。在另一个实施方案中，该抗体是如上所述的，其中所述抗体还包含PEG化。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受试对象中与IL-22RA的活性有关的病理状况的方法，包括给予有效量的本文所述抗体，由此治疗所述病理状况。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述的病理状况是慢性炎症病况。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述的慢性炎症病况包含炎症性肠病、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述的病理状况是急性炎症病况。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述的急性炎症病况包含内毒素血症、败血症、毒性休克综合征或者感染性疾病。
在另一方面，本发明提供了一种治疗受到IL-22RA在其中起作用的炎症疾病折磨的哺乳动物的方法，该治疗方法包括：向哺乳动物给 予IL-22RA的拮抗剂使炎症减轻，其中所述拮抗剂包含与IL-22RA(SEQID NO：3)的多肽或者多肽片段特异结合的抗体、抗体片段或结合多肽；并且其中的炎症活性被降低。在一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是慢性炎症疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是慢性炎症疾病，包含炎症性肠病、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是急性炎症疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述疾病是急性炎症疾病，包含内毒素血症、败血症、毒性休克综合征或者感染性疾病。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述抗体、抗体片段或者结合多肽还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或者毒素。在另一个实施方案中，该方法是如上所述的，其中所述抗体、抗体片段或者结合多肽还包含PEG化。
在另一方面，本发明还提供了一种减轻炎症的方法，该方法包括向具有炎症的哺乳动物给予量足以减轻炎症的包含本文所述抗体的组合物。
本发明还由以下非限制性的实施例举例阐明。
实施例1
从转染的BHK570细胞中纯化IL-22RA2-Fc4多肽
除特别说明外，所有的操作在4℃进行。使用以下的步骤纯化在C端与人Fc4(SEQ ID NO：14)融合的IL-22RA2多肽(成熟的可溶性受体多肽，SEQ ID NO：13的23-231号残基；多核苷酸见SEQ ID NO：12)，命名为IL-22RA2-Fc4。将来自经IL-22RA2-Fc4转染的BHK570细胞的大约16500毫升条件培养基通过0.2微米的除菌滤膜过滤，然后加入蛋白酶抑制剂溶液，至终浓度为0.001mM亮异蛋白酶肽 (Boerhinger-Mannheim，Indianapolis，IN)，0.001mM胃蛋白酶抑制剂(Boerhinger-Mannheim)和0.4mM Pefabloc(Boerhinger-Mannheim)。装Poros protein A50层析柱(20毫升柱床体积，Applied Biosystems)，用400毫升PBS(Gibco/BRL)洗涤。添加了蛋白酶抑制剂的条件培养基上柱，流速为15毫升每分钟，然后用800毫升PBS(Gibco/BRL)洗涤。用0.1M甘氨酸pH3.0从柱中洗脱IL-22RA2-Fc4，将5毫升级分直接收集到0.5毫升2M Tris pH7.8中，调整级分的最终pH至7.4。
通过对起始培养基和层析柱流出液进行还原SDS-PAGE凝胶的Western印迹，对柱性能进行研究。Western印迹中使用抗人IgG HRP(Amersham)抗体，显示在起始的培养基中60000Da处有免疫活性蛋白，流出液中无任何成分，提示完全捕获。protein A50的洗脱级分用还原型SDS PAGE凝胶进行研究。显示级分3到11在60000Da处都有考马斯亮蓝染色很深的条带。混和级分3-11。
使用30,000Da Ultrafree Biomax离心浓缩管(15毫升体积，Millipore)将Protein A50洗脱混合物从44毫升浓缩至4毫升。用350毫升PBS(BRL/Gibco)洗涤Sephacryl S-300凝胶过滤层析柱(175毫升床体积；Pharmacia)。将浓缩混合物注入到层析柱中，流速为1.5ml/min，然后用225毫升PBS(BRL/Gibco)洗涤。洗脱峰按照2毫升的级分收集。
用还原性和非还原性银染(Geno Technology)SDS-PAGE凝胶研究洗脱级分。还原性银染SDS-PAGE凝胶显示14-31级分中有60000Da处深度染色的条带，而非还原性银染SDS-PAGE凝胶显示14-31级分中有160000Da处深度染色的条带。级分1-13显示有多个不同大小的条带。混和14-31级分，使用30,000Da Ultrafree Biomax离心浓缩管(15毫升体积，Millipore)将混合物浓缩到22毫升。浓缩物用0.2 μm Acrodisc除菌滤膜(Pall Corporation)过滤。
根据我们的标准步骤，通过BCA分析(Pierce，Rockford，IL)测定浓缩混和级分的蛋白质浓度，将混合物分成小份，在-80℃储存。混和级分的浓度是1.50mg/ml。
实施例2
表达CRF2-4受体的BaF3细胞(BaF3/CRF2-4细胞)的构建以及表达CRF2-4受体和IL-22RA受体的BaF3细胞(BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞)的构建
使用30微克CFR2-4表达载体，构建表达全长CFR2-4受体的BaF3细胞，描述如下。表达CRF2-4受体的BaF3细胞被命名为BaF3/CRF2-4细胞。这些细胞用作对照，再用全长的IL-22RA受体(美国专利编号5,965,704)转染，用于根据以下的描述对IL-22活性进行筛选。
A.表达CRF2-4受体的BaF3细胞的构建
从Daudi细胞系cDNA文库中分离出全长的CRF2-4(cDNA Genbank登录编号Z17227)，然后克隆到表达载体pZP7P中。
BaF3是来源于小鼠骨髓的依赖于白介素3(IL-3)的前淋巴样系(Palacios and Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevotet al.，Mol.Cell.Biol. 6：4133-4135，1986)，在补加了10％热灭活胎牛血清、2ng/ml小鼠IL-3(mIL-3)(R&D，Minneapolis，MN)、2M L-glutaMax-1TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)和PSN抗生素(GIBCO BRL))的完全培养基(RPMI培养基(JRHBioscience Inc.，Lenexa，KS)中维持。在电穿孔以前，根据制造商的说明书，使用Qiagen Maxi Prep试剂盒(Qiagen)制备并纯化 CRF2-4/pZP7P质粒。对于电穿孔，用无血清的RPMI培养基漂洗BaF3细胞一次，重悬于无血清的RPMI培养基中，细胞密度为107个细胞/毫升。将1毫升的重悬BaF3细胞与30微克的CRF2-4/pZP7P质粒DNA混和，转移到单独的一次性电穿孔小池(GIBCO BRL)中。室温孵育15分钟后，对细胞进行两次连续电击(8001Fad/300V.；11801Fad/300V.)，电击由电穿孔装置(CELL-PORATOR；GIBCO BRL)提供。5分钟复苏之后，将电穿孔的细胞转移到50毫升完全培养基中，置于孵育箱内15-24小时(37℃，5％CO2)。然后将细胞离心，重悬于T-162摇瓶内的50毫升含有2微克/毫升嘌呤霉素的完全培养基中，分离抗嘌呤霉素细胞群。对转染过的BaF3细胞的混合物(此后称为BaF3/CRF2-4细胞)根据下面的描述检测信号转导能力。而且，对这些细胞进一步用IL-22RA受体转染，如下所述。
B.表达CRF2-4受体和IL-22RA受体的BaF3细胞的构建
表达全长IL-22RA受体的BaF3/CRF2-4细胞是根据如上所述，使用30微克的IL-22RA表达载体构建的。在复苏之后，使用200μg/mlzeocin和2μg/ml嘌呤霉素筛选转染子。表达IL-22RA受体的BaF3/CRF2-4细胞被命名为BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞。这些细胞用于筛选本文描述的IL-22活性以及IL-22RA拮抗剂活性。
实施例3
使用Alamar Blue增殖试验，用BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞筛选IL-22拮抗剂活性
A.使用Alamar Blue增殖试验，用BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞筛选IL-22活性
根据下面的描述，使用纯化的IL-22-CEE(实施例4)测试增殖活性的存在。根据下面的描述，在此测试中使用纯化的IL-22RA2-Fc4(实 施例1)拮抗IL-22的增殖应答。
离心沉淀BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞，用完全培养基添加了10％热灭活胎牛血清、2ng/ml鼠IL-3(mIL-3)(R&D，Minneapolis，MN)、2mM L-g lutaMax-1(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)和PSN抗生素(GIBCO BRL))的(RPMI培养基(JRH Bioscience Inc.，Lenexa，KS)、但是没有mIL-3的培养基漂洗(这以后被称为“无mIL-3的培养基”)。细胞离心并漂洗3次，以确保去除mIL-3。然后用血球计数仪计数细胞。将细胞置于96孔板中，5000个细胞每孔，体积为100微升/孔，使用无mIL-3的培养基。
用无mIL-3的培养基将IL-22-CEE蛋白稀释至50，10，2，1，0.5，0.25，0.13，0.06ng/ml的浓度，用于评估BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞的增殖。向BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞中加入100微升所述稀释蛋白。总检测体积是200微升。检测培养板在37℃，5％CO2条件下孵育3天，这时加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)，每孔20微升。然后在37℃，5％CO2条件下再培养平板24小时。Alamar Blue根据活细胞的数目而给出荧光计量读数，因此与阴性对照相比就是对细胞增殖的直接量度。再将培养板置于37℃，5％CO2中培养24小时。在FmaxTM读板仪(Molecular Devices Sunnyvale，CA)上对平板读数，使用SoftMaxTM程序，波长为544nm(激发)和590纳米(发射)。结果证实了BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞对IL-22-CEE有剂量依赖性增殖响应。如此测量的响应在50ng/ml的高端是背景的约15倍，在0.06ng/ml的低端诱导2倍。BaF3野生型细胞以及BaF3/CRF2-4细胞并不响应于IL-22-CEE而产生增殖，显示IL-22对于CRF2-4/IL-22RA杂二聚体受体是特异的。为了确定IL-22RA2是否能够拮抗IL-22的活性，使用纯化的可溶性IL-22RA2/Fc4重复上面描述的检测。当IL-22与10μg/mlIL-22RA2组合时，在所有浓度下对IL-22的响应都被降低到背景水平。可溶性IL-22RA的存在消除了IL-22的增殖性效果表 明了IL-22RA是IL-22配基的有力拮抗剂。可以使用本检测测试本文描述的其他IL-22活性拮抗剂，例如抗IL-22RA抗体。
实施例4
从BHK570细胞中纯化IL-22-CEE
除非另外说明，所有的操作都在4℃进行。以下的步骤用于纯化含有C端GluGlu(EE)标签的IL-22多肽(SEQ ID NO：15；或者SEQ IDNO：16)。用Amicon S10Y3螺旋柱体在ProFlux A30上浓缩来自表达IL-22-CEE的BHK细胞的条件培养基。向浓缩的条件培养基中加入蛋白酶抑制剂溶液，终浓度为2.5mM乙二胺四乙酸(EDTA，SigmaChemical Co.St.Louis，MO)，0.003mM亮抑蛋白酶肽(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)，0.001mM胃蛋白酶抑制剂(Boehringer-Mannheim)和0.4mM Pefabloc(Boehringer-Mannheim)。取样分析，将大体积在-80℃储存，直至开始纯化。通过SDS-PAGE和Western印迹，对浓缩条件培养基中的总目标蛋白的浓度进行分析，其中使用缀合了HRP的抗EE抗体。
将大约100毫升抗EEG-Sepharose的柱(根据下面的描述准备)注入WatersAP-5，5cmx10cm玻璃层析柱中。在BioCad Sprint(PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)上装柱并使用磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4平衡。将浓缩的条件培养基融化，用0.2微米滤器无菌过滤，调整至pH7.4，然后上样到柱上过夜，流速约为1毫升/分钟。层析柱用10个柱体积(CVs)的磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4洗涤，然后用200ml含有0.5mg/ml EE肽(Anaspec，San Jose，CA)的PBS(pH6.0)洗脱，流速为5毫升/分钟。使用的EE肽具有序列EYMPME(SEQ ID NO：15)。用10CV的PBS洗柱，然后用5CV的0.2M甘氨酸pH3.0洗脱。用2CV的5XPBS调节甘氨酸洗脱后的层析柱pH至7.0，然后用PBS(pH7.4)平衡。在整个洗脱层析过程中收集5毫升 的级分，并且监测280和215nm的吸光值，保留流出物和洗涤混合物并进行分析。对EE-多肽洗脱峰级分使用SDS-PAGE银染和Western印迹(用缀合了HRP的抗EE抗体)分析目标蛋白。合并目标多肽洗脱级分，使用10,000道尔顿分子量截留的膜回旋离心浓缩器(Millipore，Bedford，MA)，根据生产商的说明书，将混合物从60毫升浓缩至5.0毫升。
为了将IL-22-CEE与其他共纯化的蛋白质分离开，将浓缩多肽洗脱合并级分上样于pH8.0的POROS HQ-50柱(强阴离子交换树脂，来自PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)。在BioCad Sprint上向1.0x6.0cm层析柱内注入层析介质并且装柱。层析柱负载了抗衡离子，然后用20mM Tris(pH8.0)平衡(Tris，三羟甲基氨基甲烷)。将样品1:13稀释(以降低PBS的离子强度)，然后上样于PorosHQ层析柱上，流速为5ml/分。层析柱用10CV的20mM Tris pH8.0洗涤，然后用40CV的20mM Tris/1M氯化钠梯度洗脱，流速为10ml/分钟。在整个洗脱层析过程中收集1.5毫升的级分，并且监测280和215nm处的吸光度。对洗脱峰级分使用SDS-PAGE银染法进行分析。合并目标级分，使用10,000道尔顿分子量截留膜回旋离心浓缩器(Millipore，Bedford，MA)，根据生产商的说明书，将合并物浓缩至1.5-2毫升。
为了将IL-22-CEE多肽与游离的EE肽和任何污染的共纯化蛋白分开，对合并的浓缩级分在1.5x90cm Sephadex S200(Pharmacia，Piscataway，NJ)层析柱上以流速1.0ml/min、使用BioCad Sprint进行大小排阻层析，该柱是在PBS中平衡和上样的。在整个层析过程中收集1.5毫升的级分，并且监测280和215nm处的吸光度。洗脱峰级分使用SDS-PAGE银染法进行鉴定，只合并最纯的级分。该物质代表了纯化的IL-22-CEE多肽。
最后将纯化的物质上样于4毫升的ActiClean Etox(Sterogene)层析柱，以除去任何残留的内毒素。使样品四次通过PBS平衡的重力层析柱，然后层析柱用一次3毫升的PBS洗涤，洗涤液与“清洁的”样品混和。然后用0.2微米滤器无菌过滤，并储存在-80℃下，直至分装。
在Western印迹的、考马斯亮蓝染色和银染色的SDS-PAGE凝胶上，IL-22-CEE多肽呈现一条主带。用BCA分析法(Pierce，Rockford，IL)测定纯化物质的蛋白浓度，将蛋白质分装，然后根据标准的步骤在-80℃储存。
为了制备抗EE-Sepharose，用含有0.02％叠氮化钠的100ml PBS洗涤100毫升床体积的蛋白G-Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)3次，其中使用500毫升的Nalgene0.45微米过滤装置。凝胶用6.0体积的200mM三乙醇胺pH8.2(TEA，Sigma，St.Louis，MO)洗涤，然后加入等体积的包含900毫克EE抗体的抗体溶液。在4℃孵育过夜后，用5体积的200mM TEA根据上面描述洗涤树脂，去掉未结合的抗体。用2体积的TEA重悬树脂，转移到适宜的容器内，将溶解在TEA中的dimethylpimilimidate-2HCl(Pierce，Rockford，IL)加入到蛋白G-Sepharose凝胶中，终浓度为36mg/ml。将凝胶在室温震摇45分钟，使用上面描述的过滤装置除去液体。通过在室温下用5体积的20mM乙醇胺(在/200mM TEA中)与凝胶共同孵育10分钟，封闭胶上的非特异位点。然后用含有0.02％叠氮化钠的5体积PBS洗涤凝胶，在该溶液中4℃储存。
实施例5
IL-22多肽的体内作用
小鼠(雌性，C57BL/6N，8周大；Charles River Labs，Kingston， NY)分成三组。以前使用标准方法制备了表达IL-22多肽(SEQ IDNO：6)的腺病毒。在第0天，向第一组(n＝8)和第二组(n＝8)小鼠通过尾静脉分别给予亲本腺病毒或者IL-22腺病毒，每只小鼠得到的剂量是约0.1毫升中约1x1011个颗粒。第三组(n＝8)不进行处理。第12天，对小鼠称重并取血。对样品进行全血细胞计数(CBC)和血清化学分析。相对于用亲本腺病毒处理的组，在IL-22腺病毒给药组的血样中检测到嗜中性粒细胞和血小板计数在统计上显著的升高。而且，相对于用亲本腺病毒处理的组，在IL-22腺病毒给药组的血样中检测到淋巴细胞和红细胞计数在统计上显著下降。此外，经IL-22腺病毒处理的小鼠体重下降，而经亲本腺病毒处理的小鼠体重增加。而且第3天时血清中IL-22水平升高而葡萄糖水平降低。总之，IL-22腺病毒小鼠表现出急性期反应，这种反应也可以由其他的促炎细胞因子例如TNF-α，IL-1β，和gp130细胞因子引发。急性期反应是一系列由模式识别分子引发的即发炎症反应。急性期蛋白为抵抗微生物提供了增强的保护，并且通过对细胞运输和介体释放的影响而对炎症反应进行修饰。例如，SAA具有强大的白细胞激活功能，包括诱导趋化性、提高白细胞对内皮细胞的粘附以及吞噬作用的增加。理解引发和改变急性期反应程度和持续时间的因素，是开发对抗感染和炎症疾病新型疗法的重要步骤。
结果提示IL-22影响造血作用，即体内的血细胞形成。这样，IL-22可能具有影响不同血液干细胞的生物活性，导致特定细胞谱系中某些分化血细胞的增加或者减少。例如，IL-22看起来会减少淋巴细胞，这可能是由于对产生淋巴样细胞的定向始祖细胞的抑制所致。IL-22还减少红细胞，这支持了IL-22可能在贫血、感染、炎症和/或免疫疾病中通过影响参与这些过程的血细胞而起作用的观点。IL-22的拮抗剂，例如抗体或者其可溶性受体IL-22RA2，可以在这些疾病中用作治疗药物。
而且，这些在小鼠中使用IL-22腺病毒的实验提示IL-22的过量表达增加了体内嗜中性粒细胞和血小板的水平。可以想像，在整个动物系统中还有其他的因子(例如细胞因子和修饰基因)参与对IL-22的应答。不过这些数据强烈说明IL-22参与造血作用。因此，IL-22及其受体是诊断和治疗多种紊乱的适宜药剂/靶，例如炎症、免疫紊乱、感染、贫血、造血系统和其他癌症等等。
实施例6
表达IL-22的转基因小鼠
A.表达小鼠IL-22的转基因小鼠的制备
通过标准的方法制备来自含有淋巴样特异性EμLCK启动子的5′和3′侧翼序列、小鼠IL-22(SEQ ID NO：10；多肽在SEQ ID NO：11中显示)、大鼠胰岛素II内含子、IL-22cDNA以及人生长激素多聚A序列的转基因载体的DNA片段，并且使用标准的微注射实验方法，用于微注射到受精的B6C3f1(Taconic，Germantown，NY)小鼠卵细胞中。参见Hogan，B.et al.，Manipulating the Mouse Embryo.ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994。
在154只幼仔中，发现25只对于小鼠IL-22和淋巴样特异性EμLCK启动子属转基因。出生后几个小时内11只转基因小鼠幼仔死亡，对9只在出生时具有光亮外观的转基因幼仔进行尸体解剖，两只长到成年。在一只成年小鼠中表达水平低。制备尸检幼仔的组织，并按照下面描述进行组织学检查。
新生幼仔的光亮外表看起来与皮肤的硬化有关，好像皮肤快要干了，导致正常哺育的下降。它们的行动一般变得僵硬。
B.转基因小鼠的基因型和表达分析
从以上描述的受EμLck启动子驱动的IL-22转基因小鼠品系中，观察到新生的幼仔在第一天(出生当天)即有异常，处死取组织。给所有幼仔带上独特的耳标签，记录下那些在处死时具有光亮皮肤表型的个体。在12只幼仔中，6只观察到具有光亮皮肤表型，其中两只被称为具有“严重”表型。严重表型的定义是几乎不活动、其皮肤特别光亮且非常干燥小的幼仔。从每一只幼仔的左外侧取皮肤，在Tissue-Tek包埋介质中冷冻。
基因型分析证实光亮皮肤是一个很好的转基因状态标志，尽管没有收集表达的数据。冷冻的皮肤块在恒冷切片机上切成7微米的切片，染色，观察CD3、CD4、CD8、小鼠巨噬细胞、B细胞、CD80和MHCII类分子的存在。染色方案包括用商品化的抗体与组织结合，用经过氧化物酶标记的二抗检测，经DAB色原体观察染色。
发现转基因动物含有更高水平的MHCII类分子和CD80，它们分别染色抗原呈递细胞和树突状细胞。在严重和非严重转基因动物中，巨噬细胞标记也检测到比野生型动物中有更多的细胞，尽管这些细胞的分布非常局限在上部真皮中。被划分为严重表型的动物对于所有三个标记均有最强的染色，显示与野生型相比，细胞密度和数量有显著的升高。这种变化可能是由于IL-22在这些转基因建立者幼仔中的表达水平有所不同。MHCII类阳性细胞位于下部真皮，呈疏松的开放簇状排列，而CD80阳性细胞主要位于真皮以下，其位于或者刚刚高过肌肉/脂肪层。这两群细胞看起来并不重合。所有其他标记在所有动物中染色相同。对肥大细胞的甲苯胺蓝染色显示野生型和转基因动物之间只有微小的区别或者没有区别。
C.对转基因小鼠的组织进行显微镜分析：具有EuLck启动子的IL-22TG有新生致死的组织学
在出生的当天，含有IL-22转基因的一窝幼仔被无痛地给予安乐 死，将整个尸体浸没在10％缓冲福尔马林溶液中固定。取6只转基因和2只非转基因幼仔作进一步检查。在进行安乐死时发现6只转基因小鼠中有4只具有光亮的皮肤。将经固定的组织切割成5块(头部纵切；上、下胸腔以及上下腹部横切)。将组织包埋在石蜡中，按常规处理，5微米切片(Jung2065Supercut切片机，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)，用H&E染色。染色的组织由(ACVP)委员会授予证书的兽医病理学家在光学显微镜(Nikon Eclipse E600，Nikon Inc.，Melville，NY)下进行检查。
在进行显微镜检查时，发现两只转基因幼仔的表皮比其他六只幼仔(包括对照)的表皮要厚。在任何小鼠的皮肤和其他组织上没有发现其他的异常。对来自胸腔和腹部相应区域的代表性皮肤区在40X物镜下进行照相，使用的是连接在显微镜上的CoolSnap数码相机(RoperScientific，Inc.，San Diego，CA)。使用组织形态学软件(ScionImage for Windows(NIH Image)，Scion Corp.，Frederick，MD，v.B4.0.2)对表皮的厚度进行测量，结果在下面的表5中显示。
表5
| 基因型/表型 | 平均胸部皮肤厚度(μm) | 平均腹部皮肤厚度(μm) |
| 非转基因/正常 | 5.2 | 5.4 |
| 转基因/非光亮 | 5.0 | 6.7 |
| 转基因/光亮 | 8.2 | 7.4 |
| 转基因/所有 | 7.1 | 7.1 |
由于小鼠数目不够，所以不能确定统计学显著性；但是，转基因小鼠，特别是具有光亮皮肤的小鼠，与非光亮皮肤的转基因小鼠和非转基因小鼠对照相比倾向于具有更厚的表皮。光亮转基因小鼠可能比非光亮转基因小鼠具有更高的IL-22表达水平；但是对于这些小鼠没有测定其表达水平。这些结果提示了IL-22在牛皮癣、牛皮癣性关节炎或者其他炎症性皮肤病症中或者其他炎症疾病中所起的作用。
实施例7
IL-22多肽的体内作用
A.感染IL-22腺病毒的小鼠表现出SAA的诱导
将小鼠(雌性，C57BL/6N，8周大；Charles River Labs，Kingston，NY)分成三组。事先使用标准方法制备了表达IL-22多肽(SEQ ID NO：6)的腺病毒。在第0天，向第一组(n＝8)和第二组(n＝8)小鼠通过尾静脉分别给予亲本腺病毒或者IL-22腺病毒，每只小鼠得到的剂量是约0.1毫升中约1x1011个颗粒。第三组(n＝8)不进行处理。第12天，对小鼠称重并取血。在研究的第20天，处死小鼠，记录体重，并且收集血液和组织用于分析。
对所有血液样品进行全血细胞计数(CBC)和血清化学分析。相对于用亲本腺病毒处理的组，IL-22腺病毒给药组在第12天和第20天的血样中检测到嗜中性粒细胞和血小板计数在统计上显著升高。而且，相对于用亲本腺病毒处理的组，IL-22腺病毒给药组第12天血样中的淋巴细胞细胞在统计学上显著下降，但是在第20天出现相反的效果。此外，IL-22腺病毒处理小鼠的体重下降，而亲本腺病毒处理小鼠的体重增加。而且两个时间点时IL-22腺病毒处理组的血清样品中葡萄糖水平均比亲本腺病毒处理组的葡萄糖水平显著降低。两个时间点时血清白蛋白也显著降低。血液尿氮水平在第20天时显著降低。两个时间点时IL-22腺病毒给药组的血清球蛋白水平比亲本腺病毒处理组显著升高。在显微镜下，观察到由于IL-22导致的一项组织形态学改变是肾中肾小管的再生。尽管并不罕见，但是在这组动物中却有升高的发生率和严重性。肾病的特征是皮质肾小管表皮细胞的嗜碱性细胞多病灶区域。
进行另外一个与上面描述的实验设计相同的实验，目的是确证结果并且收集额外的样品。在这个研究中，每三天记录一次体重，在腺病毒注射后3天从小鼠取血，在第10天(n＝4每组)和第20天(n-4每组)处死小鼠并收集血液和组织。相对于用亲本腺病毒处理的组，在IL-22腺病毒给药组的血样中再次检测到升高的嗜中性粒细胞和血小板计数。对于嗜中性粒细胞，这个结果在第3天即明显，但是对于血小板，显著差异直至第10天才出现。而且，在第3天和第10天，IL-22腺病毒给药组中淋巴细胞计数相对于用亲本腺病毒处理组有显著下降，但是与前面的研究不同，在第20天没有升高。同样，在整个研究过程中接受IL-22腺病毒的小鼠体重下降，而对照病毒处理小鼠和未处理小鼠的体重增加。血清化学参数的结果与前面的研究一致。在这个研究中也确证了与IL-22腺病毒处理相关的肾脏中肾小管再生的组织学发现。这与在给予IL-22腺病毒的小鼠中有关中度蛋白尿的额外发现(第20天)也是一致的。
结果提示IL-22影响造血作用，即体内的血细胞形成。这样，IL-22可能具有影响不同血液干细胞的生物活性，导致在某一特定细胞谱系中的某些分化血细胞增加或者减少。例如，IL-22看起来会减少淋巴细胞，这可能是由于产生淋巴样细胞的定向始祖细胞受到抑制所致，这支持了IL-22可能在贫血、感染、炎症和/或免疫疾病中通过影响参与这些过程的血细胞而起作用的观点。IL-22的拮抗剂，例如抗体或者其可溶性受体IL-22RA2，可以在这些疾病中用作治疗药物。
而且，这些在小鼠中使用IL-22腺病毒的实验提示IL-22的过量表达增加了体内嗜中性粒细胞和血小板的水平。可以想像，在整个动物系统中还有其他的因子(例如细胞因子和修饰基因)参与对IL-22的应答。不过这些数据强烈支持IL-22参与造血作用。因此IL-22、抗IL-22抗体、IL-22RA可溶性受体(例如SEQ ID NO：3)以及抗IL-22RA抗体是诊断和治疗多种疾病的适宜药剂/靶，所述疾病例如是炎症、免 疫障碍、感染、贫血、造血系统和其他癌症等等。
IL-22的表达与体重丧失、急性期蛋白SAA的出现以及由血清葡萄糖、白蛋白和尿氮降低所反应出的代谢紊乱有关，提示IL-22是在某些炎症反应的早期起作用的细胞因子。给予IL-22腺病毒的小鼠可能表现出一种慢性炎症的状态，如在IBD、溃疡性结肠炎、关节炎、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、哮喘等中观察到的那样。某些有害的发炎过程可以通过使用IL-22的拮抗剂如抗IL-22抗体、IL-22的受体如IL-22RA可溶性受体(例如SEQ ID NO：3)以及抗IL-22RA抗体等等而被抑制。
B.IL-22是一种促炎性细胞因子：腺病毒IL-22小鼠中的血清SAA水平
进行ELISA，测定IL-22腺病毒小鼠中的SAA水平，其中使用小鼠SAA免疫检测试剂盒和方法(Biosource International，California，USA)。将酶标板事先用抗小鼠SAA抗体包被，然后将稀释好的标准品和未知样品与HRP-抗小鼠SAA一同加入到板中。板在37℃孵育1小时，然后根据试剂盒说明书洗涤。使用TMB在室温对板显色15分钟，用2M硫酸终止。使用Spectromax190(Molecular Devices，California，USA)读取450nm处的吸光度。用Softmax Pro(Molecular Devices，California，USA)和Excel(Microsoft Corp.，Washington，USA)分析得到的数据。
感染IL-22腺病毒的小鼠其mSAA水平大大升高，是亲本腺病毒小鼠对照的10倍以上。
C.IL-22腺病毒感染小鼠的流式细胞仪分析
为了分析腺病毒在体内表达IL-22的作用，我们在感染后的第10 天和第20天从IL-22腺病毒感染的C57BL/6N小鼠中分离了外周血、脾脏和骨髓。在肝素化的试管中收集大约100μl血液，然后通过低张力裂解去除净血红细胞(细胞在4.5毫升的蒸馏水中裂解大约5秒，之后加入1.5毫升3.6％氯化钠)。用两片毛玻璃载片碾碎脾脏，使释放的细胞通过Nytex膜(细胞滤网)，然后沉淀。将股骨在研钵中碾碎，将细胞通过细胞滤网(Falcon)，得到骨髓。将细胞重悬于FACS洗涤缓冲液中(洗涤缓冲液＝HBSS/1％BSA/10mM HEPES)。用台盼蓝计数。每种类型的细胞取1x106个活细胞分装到5毫升的聚苯乙烯试管中。漂洗并沉淀细胞，在冰上与可以识别不同细胞表面标记(用于鉴定某种免疫细胞亚类)的荧光标记(FITC，PE，和CyChrome)单克隆抗体(PharMingen，San Diego，CA)混合物共同孵育20分钟。这些标记包括下列(列在我们检测的第3组中)：对于血液染色：CD3，Gr1，和B220；对于脾脏染色：CD62L，CD44，和CD3；CD21，CD23，和B220；IgD，IgM，和B220；CD1lb，Gr1，和CD8；对于骨髓染色：CD11b，Gr1，CD3；IgD，IgM，和B220。细胞用1.5毫升的WB漂洗并沉淀，然后重悬于0.4毫升WB中，在FACScan上用CellQuest软件(BectonDickinson，MountainView，CA)进行分析。
我们发现，IL-22腺病毒处理小鼠的血液中的嗜中性粒细胞级分在第10天升高4-13倍，在第20天升高了2-3倍。在第10天，这一差异导致血液中淋巴细胞和单核细胞级分随之下降。在骨髓中，我们发现，第10天B细胞总数降低了大约1.5倍，而成熟的再循环B细胞的百分比以及未成熟B细胞的总数只有略微下降。在第20天，这些差异中有许多不再明显，尽管我们的确发现成熟再循环B细胞的级分有轻微升高。在脾脏中，B细胞的总数在第10天和第20天都有略微降低(1.5-2倍)，而在第20天，缘区B细胞级分(CD21+CD23-B220+)增加了2倍，滤泡B细胞(CD21+CD23+B220+)的数目降低了2倍。缘区B细胞被认为是抵抗病原的第一道防线，因为与更为普遍的滤泡B细胞相比，它们对B细胞促细胞分裂剂(例如LPS)更敏感，而且当它 们遇到它们的同源抗原时，它们将迅速分化为抗体分泌细胞。IL-22有可能提高滤泡细胞向缘区B细胞的转变或者选择性地除去较为不成熟的滤泡细胞。在骨髓中发现的B细胞数目的改变可以反映出前/原B细胞或者未成熟B细胞分化的增加，或者再循环B细胞从血液/脾脏的内流增加，而且可能伴随未成熟B细胞向外周血的外运增加。成熟BMB细胞的实际数目并未增加，所以IL-22可能没有增强它们的增殖。或者，IL-22可能阻断、降低或者抑制未成熟B细胞的分化，从而提高成熟B细胞的相对比例。
D.IL-22RA2-Fc4在体内中和IL-22的活性：SAA ELISA显示由IL-22诱导的SAA表达被IL-22RA2-Fc4的注射所抑制：
为了测定IL-22RA2是否可以抑制IL-22诱导SAA，将小鼠(雌性，C3H/HEJ，8周大；Jackson Labs，Bar Harbor，ME)分为5组，每组3只，按照表6显示通过腹腔内途径注射蛋白质进行处理：
表6
| 组# | IL-22 | IL-22RA2 |
| 组1： | - | - |
| 组2： | - | 100μg |
| 组3： | 3μg | - |
| 组4： | 3μg | 20μg |
| 组5： | 3μg | 100μg |
IL-22RA2注射在IL-22注射之前15分钟进行。两种蛋白的注射都通过腹腔内途径。在处理前从每一只小鼠中取血样，然后在处理后2和6小时取血样。从每一样品制备血清，用于测定SAA和IL-22。
根据前面描述进行ELISA，以测定用IL-22以及本文描述的可溶性IL-22受体和IL-22RA2-Fc4处理的小鼠中的SAA水平。使用3微克IL-22与20-100微克浓度的IL-22RA2-Fc4共同处理的小鼠中显示由IL-22单独诱导的SAA水平降低到了背景水平，表明IL-22RA2在体内 抑制了IL-22的SAA诱导活性。
实施例8
在炎症性肠病小鼠模型中表达IL-22
炎症性肠病(IBD)是一种多因子疾病，分为两种类型，即溃疡性结肠炎(UC)和节段性回肠炎(CD)。这些疾病的病原学现在还不知道，并且临床表现有差异。UC限于结肠，其症状包括血性腹泻、体重下降和腹痛。UC的解剖镜下特征包括斑点性溃疡以及缩短的结肠。相反，节段性回肠炎也可以影响肠的其他部分。症状包括腹泻(与UC相比，便血较为少见)，低烧和疼痛。解剖镜下特征包括纤维化和异常狭窄的肠，具有狭窄、深度溃疡、裂纹以及瘘。
有许多动物模型模拟了这些人类疾病。用于新型药物筛选的三种常用结肠炎模型是2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的大鼠模型、小鼠T细胞转移模型以及葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠模型。DSS模型来自Dr.S.Murthy建立的模型，其中使用疾病活性指数评分系统(S.N.S.Murthy，Treatment of Dextran Sulfate Sodium-InducedMurine Colitis by Intracolonic Cyclosporin，Digestive Diseasesand Sciences，Vol.38，No.9(September1993)，pp.1722-1734)。
在本研究中，当小鼠在其饮水中饲喂DSS6天后，产生了急性结肠炎。动物表现出体重降低和血性腹泻，这模拟了UC病人的情况。DSS损伤的机制研究得还不清楚，但是认为DSS诱导了非特异的炎症性免疫应答，并且模拟了对肠的环境影响。有可能产生了硫化氢，它对细胞是有毒的。此外，出现了腔内细菌菌群的改变。在结肠中已证明有激活的单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞。所有三种动物模型的介体包括炎症性前列腺素、白三烯代谢物以及细胞因子。
A.方法
在Swiss Webster雌性小鼠(来自Charles River Laboratories)中通过DSS摄入诱导结肠炎。小鼠在研究开始时是10和11周大。小鼠在饮水中加入4％DSS，饮用6天(处理小鼠)，或者用正常饮用水给小鼠饮用(对照小鼠)。使用疾病活性指数临床评分(DAI)，它包含一些测定值的组合，包括粪便的质量、潜隐血以及体重下降。从DSS处理后的第一天开始每天测量每一只小鼠的DAI。6天后，从处理小鼠的饮用水中去除DSS。所有的小鼠通过DAI临床评分进行监测，直至在从研究开始后的第2、7或者10天处死。在第2和第7天，各处死四只DSS处理小鼠和一只对照小鼠。在第10天，处死四只DSS处理小鼠和两只对照小鼠。所有动物处死后均测量结肠的长度。将结肠切片在10％中性缓冲的福尔马林中固定用于组织学分析，或者冷冻用于mRNA提取。
B.组织学评分以及疾病活性指数(DAI)评分
根据参考文献1中的方法获得组织学指数评分。一般而言，结肠切片由病理学家在不知情的情况下确定小囊评分、增生上皮、小囊变形以及炎症评分。
每日根据小鼠体重减轻、大便坚固性以及小肠出血的情况对小鼠进行临床评分分级。体重减轻、腹泻和出血量的增加，则分数增加。每只小鼠每天的分数是三次结果/观察值的平均值。
C.结果
在第7和第10天，经DSS处理的小鼠的结肠长度略短于未处理对照小鼠，但是结果不一定显著(没有进行统计学检验)。临床DAI分数反映了在DSS处理的小鼠中疾病症状的增加，这与在以前使用该模型的研究中观察到的结果相似。在大约第4天和第5天潜隐血最严重，而稀松的粪便在第6和第7天更显著。组织病理学结果显示在所有处死的日子，疾病分数均与对照组的分数不同，特别是在第7天(高峰)和第10天。 组织病理学筛选评分是：对照＝0.5，第二天DSS处理小鼠＝8.8，第7天DSS处理小鼠21，第10天DSS处理小鼠＝18。临床和组织病理学分数显示与未处理的对照相比，经DSS处理的小鼠具有显著的结肠疾病。后面使用冷冻的组织样品进行mRNA测定，如下面描述的。
D使用RT-PCR检查IL-22RNA在鼠IBD结肠样品中的组织表达：
为了测定在炎症性肠疾病模型中小鼠IL-22RNA(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)的相对表达，收集经DSS处理的小鼠的远端结肠并且迅速在液氮中冷冻。在该实验中，小鼠使用DSS处理，在处理后的第2、7和10天取样。也收集来自正常的未经处理的小鼠的样品。然后使用标准的RNeasy MidiprepTMKit(Qiagen，Valencia，CA)根据生产商的说明书从样品中分离RNA。
使用‘Superscript One-Step RT-PCR System with PlatinumTaq.’(Life Technologies，Gaithersburg，MD)进行RT-PCR反应。每个25微升反应中含有：12.5微升2X反应缓冲液，0.5ul(20pmol/μl)ZC39，289(SEQ ID NO：17)，0.5μl(20pmol/μl)ZC39，290(SEQ ID NO：18)，0.4μl RT/Taq聚合酶混合物，10μl无RNA酶的水，1.0μl总RNA(100ng/μl)。扩增反应如下进行：50℃30分钟1个循环；之后是94℃30秒、58℃30秒、72℃60秒进行35个循环；最后是72℃7分钟的最后延伸。取8-10微升的PCR产物进行标准的琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶的浓度是2％。正确的cDNA片段大小观察如下：在两个第2天的样品中都有一条弱的带。第7天的三个样品中有两个产生强的条带，第三个第7天样品产生很强的条带。三个第10天的样品产生强的条带。最后，两个“正常的”对照样品没有产生任何条带。这些结果提示IL-22在结肠中某些类型的炎症反应中、包括那些与IBD、UC和CD相关的炎症反应中，可能有上调。数据总结在下面的表7中，其中对相对表达进行评分：0＝无条带，1＝弱条带，2＝强条带，3＝很强的条带。
表7
| 组织 | 相对表达(0-3) |
| 正常结肠 | 0 |
| 正常结肠 | 0 |
| 处理后第二天 | 1 |
| 处理后第二天 | 1 |
| 处理后第七天 | 3 |
| 处理后第七天 | 2 |
| 处理后第七天 | 2 |
| 处理后第十天 | 2 |
| 处理后第十天 | 2 |
| 处理后第十天 | 2 |
实施例9
在小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型中IL-22RA2降低了IL-6和SAA的水平
A.小鼠胶原诱导的关节炎(CIA)模型
十周大的雄性DBA/1J小鼠(Jackson Labs)分为三组，每组13只小鼠。在第21天，对动物通过皮下注射50-100微升的配制在完全弗氏佐剂(由Chondrex，Redmond，WA制备)中的1mg/ml鸡II类胶原。三周后，在第0天，向小鼠注射100微升(25微克)来自大肠杆菌0111：B4的LPS，LPS从冻干的小份(Sigma，St.Louis，MO)中制备成250微克/毫升。将IL-22RA2通过腹腔内注射途径给药，一周三次，连续4周，从第0天到第25天。前两组的注射剂量是每只动物每剂100或者10微克的IL-22RA2，第三组接受载体对照PBS(LifeTechnologies，Rockville，MD)。在LPS注射后，动物开始表现出关节炎的症状，大多数动物在2-3周内出现炎症。每只爪的疾病程度通过使用卡尺测量爪的厚度、并且对每一只爪给予临床分数(0-3)进行评价：0＝正常，0.5＝脚趾发炎，1＝轻度爪发炎，2＝中度爪发炎，和3＝重度爪发炎，如下面所描述的。
监测疾病：
在第二次胶原注射后不久，动物可能开始表现爪发炎的迹象，一些动物甚至在第二次胶原注射之前就出现了脚趾炎症的迹象。在加强注射后2-3周大多数动物出现关节炎，但是一些动物可能需要更长一些的时间。在这个模型中疾病的发病率通常是95-100％，在一项使用40只动物的研究中，通常可以看到0-2个没有反应的动物(在6周观察之后确定)。注意随着炎症的开始，可能出现短暂的不稳定的低级爪或者脚趾的炎症。由于这个原因，在显著、持续的爪肿大出现之前不认为动物已经患病。
每天观察所有的动物，评价其爪的疾病状态，其做法是对每一个爪给出定量的临床分数。根据临床疾病状况，每天对每只动物的4只爪进行评分。为了确定临床分数，可以认为爪有三个区带：脚趾、爪自身(脚或者脚)以及脚腕或者踝关节。对相对于这些区带的炎症程度和严重性进行观察，包括观察所有的脚趾是否有关节肿大、破裂的趾甲或者发红，注意任何的爪中是否有水肿或者发红的迹象，并且观察肌腱或者骨是否有任何精细解剖分界的消失，评价脚腕或者踝是否有任何水肿或者发红，并且注意炎症是否向腿靠近。爪的评分1，2，3首先基于对严重性的整体印象，其次取决于累及了多少区带。用于临床评分的等级标准如下：
临床评分：
0＝正常
0.5＝涉及一个或者更多脚趾，但是只有脚趾发炎
1＝涉及爪的轻度炎症(1个区带)，可能包括一个或者更多脚趾
2＝在爪上的中度炎症，可能包括一些脚趾和/或脚腕/脚踝(两个区带)
3＝在爪、脚腕/脚踝以及一些或者所有脚趾上的重度炎症(3个区带)
确立的疾病定为爪炎症的定量评分为2或者更高，持续过夜(连续两天)。一旦出现确立的疾病，则记录日期，将其作为该动物患“确立疾病”的第一天。
在整个实验中取血，监测血清中抗胶原抗体的水平。在第21天对动物进行安乐死，取血用于获得血清和白细胞计数。对于每一只动物，收集一只患病的爪，固定于10％NBF中用于组织学，一只爪在液氮中冷冻并储存于-80℃中用于mRNA分析。另外，将1/2脾脏、1/2胸腺、1/2肠系膜淋巴结、一叶肝脏以及左肾储存于RNAlater中用于RNA分析；1/2脾脏、1/2胸腺、1/2肠系膜淋巴结、剩余的肝脏以及右肾固定在10％NBF中用于组织学。收集血清并在-80℃冷冻，用于免疫球蛋白和细胞因子的检测。
在对爪的分数和测量数据进行分析时，在各组之间没有发现统计学显著的差异，尽管有一项提示表明一个接受IL-22RA2的处理组可能在爪发炎的开始和发展上有所延迟。组之间的体重、CBC参数或者抗胶原抗体水平没有显著差异。这些早期的结果表明IL-22RA2对体重、红或白细胞或者抗体产生没有负面影响，但是可能能够减轻炎症。对剂量、作用机制以及效力的进一步研究正在进行中(例如实施例10)。
B.在小鼠CIA模型中的抗胶原ELISA数据
在相对于LPS攻击(第0天)的第0、7、14、21、和28天，从胶原诱导的关节炎小鼠模型中收集血清样品(上面的实施例9A)。用ELISA筛选血清样品中抗胶原抗体的滴度。与PBS对照相比，100微克或者10微克处理组中IL-22RA2处理对于抗胶原抗体水平没有统计学 上显著的影响。以下是对抗胶原ELISA材料和方法的描述。
用于抗胶原ELISA的试剂是Maxisorp96孔微量滴定板(NUNC，Rochester，NY)、鸡II类胶原(Chondrex，Redmond，WA)，SuperBlock(Pierce，Rockford，IL)，缀合了辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG+A+M(H+L)(Zymed，South San Francisco，CA)以及邻苯二胺二盐酸盐底物(Pierce，Rockford，IL)。在所有检测中使用的缓冲液是ELISA B稀释缓冲液(PBS+0.1％BSA+0.05％Tween(Sigma，St.Louis，MO))，ELISA C洗涤缓冲液(PBS+0.05％Tween)以及NovoD显色缓冲液(0.063M柠檬酸钠，0.037M柠檬酸)，H2O2(Sigma)和1N H2SO4(VWR，Tukwilla，WA).
将眼窝后取血收集的大约100微升外周血液放置在血清分离管(Becton Dickinson)中。通过离心(2-3min，16,000xg，4-6℃)分离血清，在-20℃储存直至分析。为测定抗胶原Ig抗体的水平，用10μg/mL鸡II类胶原(Chondrex，Redmond WA)包被NUNC板，4℃孵育过夜。用ELISAC洗板，用Super Block(Pierce，Rockford，IL)封闭(5分钟，室温)，然后用ELISA C洗涤。将稀释的血清样品(在ELISA B中5倍连续稀释，从1：5000到1：625，000)加入到ELISA板中，一式三份，将板在4℃孵育过夜。孵育后，用ELISA C洗板，加入过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Ig Fc(Zymed，ELISA B中1：2000稀释度)。孵育板(室温90分钟)、再次用ELISA C洗、用邻苯二胺二盐酸盐底物显色(10mL NovoD+1片OPD+10μLH2O2，Pierce)。反应用1N硫酸终止。1：25000稀释度的血清样品的相对光密度测量值使用Spectra MAX190在490nm测得，数据用SoftMax Pro软件(Molecular Devices Corporation，Palo Alto，CA)进行分析。
C.在小鼠CIA模型中对IL-6和SAA进行分析
第0天，腹腔内注射25微克的LPS后4小时，从CIA小鼠收集血 清样品(上面的实施例9A)。用商品化的ELISA试剂盒(购自BiosourceInternational(Camarillo，CA))，根据生产商的说明书进行测定，检测样品中IL-6和血清淀粉样物质A(SAA)的浓度。
在分别注射100μgIL-22RA2，10μgIL-22RA2和PBS对照的小鼠组中，IL-6的水平分别是9651+/-1563pg/ml，10,865+/-1478pg/ml和15，006+/-2,099pg/ml。注射100微克IL-22RA2剂量的CIA小鼠组中的IL-6浓度与PBS对照组小鼠相比明显降低，p＝0.0351。使用Fisher’s PLSD计算统计显著性，显著性水平是5％(ABACUS Concepts，INC，Berkeley，CA)。
此外，在分别注射100μgIL-22RA2，10μg IL-22RA2和PBS对照的小鼠组中，SAA浓度分别为381+/-40μg/ml，348+/-37μg/ml和490+/-50μg/ml。注射10μgIL-22RA2剂量的CIA小鼠组中的SAA浓度与PBS对照组小鼠相比明显降低，p＝0.0257。使用Fisher’s PLSD计算统计显著性，显著性水平是5％(ABACUS Concepts，INC，Berkeley，CA)。
实施例10
在小鼠CIA模型中抗IL-22RA单抗或者抗IL-22单抗抑制疾病的严重性
胶原诱导的关节炎(CIA)模型是类风湿性关节炎的小鼠模型，它很大程度上反映了在人类中见到的该疾病(Moore，Methods Mol.Biol. 225：175-179，2003：Waksman，Scand.J.Immunol.，56：12-34，2002)。使用两剂在CFA中乳化的胶原通过尾基部免疫小鼠。这导致爪的肿大，这种肿大随着时间推移增加，并且可以目测评分和用卡尺测量。而且，血清抗胶原抗体与疾病的严重性有很好的相关性。根据显 示IL-20和IL-22诱导炎症的数据，将抗IL-22RA和抗IL-22单抗给予经胶原免疫的小鼠组，考察其对于疾病分数的影响。在抗IL-22RA单抗或抗IL-22单抗给药之后，爪的分数和爪的厚度下降，提示在IL-20和IL-22在自体免疫模型中可促进正在进行的免疫应答，并且阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20或IL-22的功能可以抑制自体免疫病。血清TNFa和抗胶原抗体的抑制也提示阻断IL-22RA可能对自身免疫疾病是有益的。
因此，为了确定抗IL-22RA单抗或者抗IL-22单抗对于自体免疫力是否有影响，在小鼠的类风湿性关节炎模型--胶原诱导的关节炎(CIA)模型中对它们进行测试。特别地，向DBA1J小鼠注射胶原以诱导类风湿样关节炎。在第0天的接种是皮下接种，接种的是由完全弗氏佐剂(CFA)和II类胶原的均质混合物(50-100μl，含2mg/ml胶原)。注射在靠近尾基部进行。在第21天，进行第二次接种，唯一的区别是均质混合物是使用不完全弗氏佐剂(IFA)而不是完全弗氏佐剂制备的。每天测定爪的分数和厚度。从第二次胶原注射开始，不同组的小鼠分别接受PBS、20-200微克同型匹配单抗对照或者20-200微克抗-IL-22RA单抗或抗-IL-22单抗，腹腔内注射、每周2-3次，注射1-4周。每天监测小鼠直至第30天。在第30天处死小鼠，取血清进行抗胶原抗体分析和血清细胞因子分析(TNFα)。
通过给予抗-IL-22RA或抗-IL-22单抗使爪分数、爪厚度、血清TNF和血清抗胶原抗体受到抑制，这提示阻断性IL-22RA在自体免疫模型中可以结合、阻断、抑制、降低拮抗或者中和IL-22，并且抑制正在进行的免疫应答，可能抑制自体免疫紊乱。
实施例11
在DSS小鼠模型中IL-22受体IL-22RA的表达
进行定量RT-PCR，以测量在患有DSS诱导的IBD的小鼠(实施例8)结肠中小鼠IL-22RA的表达水平。从正常的小鼠结肠中以及经DSS处理的小鼠在处理后2、7和10天后从其远端结肠分离RNA。使用Applied Biosystems7700TaqMan仪器和方法进行RT-PCR。简而言之，根据Applied Biosystems指导，使用“Primer Express”软件设计针对小鼠IL-22RA序列的引物(ZC39776(SEQ ID NO：19)和ZC39777(SEQ ID NO：20))，以及FAM/TAMRA标记的TaqMan探针(ZC38752(SEQ ID NO：21))。在每一个反应中加入25ng RNA，以及PE/Applied Biosystems TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents、上面提到的引物和探针。每个RT-PCR反应均一式两份，在以下条件下反应：50℃2分钟，60℃30分钟，95℃5分钟，以及94℃20秒和60℃1分钟共40个循环。将表达数值与已知数量的合成小鼠IL-22RA RNA转录产物分子作出的标准曲线相比较，将表达值表示为每个反应中小鼠IL-22RA分子的绝对数目。初步的数据提示与正常小鼠结肠中的表达水平相比，在具有DSS诱导的IBD的小鼠第7和第10天的远端结肠中，小鼠IL-22RA的表达可能被略微下调。
实施例12
在轻度内毒素血症模型中的IL-22和促炎指示剂：LPS诱导的内毒素血症小鼠模型
A.LPS诱导的内毒素血症小鼠模型：在LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中对促炎细胞因子和体温进行测量
设计体内实验，以检测IL-22RA2(IL-22RA2)在轻度内毒素血症小鼠LPS模型中的作用。为了初步评价这个模型，我们测量了促炎细胞因子和体温，针对这个模型收集参考数据。
简而言之，将溶于无菌PBS中的25μg LPS(Sigma)腹膜内注射 给六个月的Balb/c(CRL)雌性小鼠。在第0，1，4，8，16，24，48和72小时时从每组8只小鼠取血清样品。分析血清样品中的促炎细胞因子水平。使用商品化的ELISA试剂盒(购自测量BiosourceInternational(Camarillo，CA))测量IL-1b，IL-6，TNFa，IL-10和血清淀粉样物质A蛋白(SAA)的水平。
LPS注射1小时后TNFa水平达到4000pg/ml且IL-10水平是341pg/ml。LPS注射后4小时，IL-6，IL-1b和IL-10分别是6，100pg/ml，299pg/ml和229pg/ml。LPS注射后4小时，血清中SAA的水平是0.405mg/ml。LPS注射后24小时，血清中SAA的水平持续增加到3.9mg/ml，但是使用现有的ELISA试剂盒很难准确或者可重复性地测定血清中高于1-2mg/ml的SAA水平，原因是SAA和其他血清组分的相互作用。这些结果表明，除IL-22(实施例11B)以外，促炎细胞因子在这个模型中的确被诱导。这样建立了以下的标准作为轻度内毒素血症LPS模型的生物标记：LPS注射1小时后TNFa血清水平，LPS注射4小时后IL-6血清水平以及SAA血清水平LPS注射4小时和8小时后。
在另外的动物组中，使用手术植入的遥感测量装置在72小时的实验中测量体温。LPS注射后，小鼠的体温最大降低了2℃，从37.07℃到LPS注射后30分钟的34.98℃。
在LPS注射之前30分钟注射100微克的IL-22RA2-Fc融合蛋白，可以显著降低在4小时和8小时时间点的SAA诱导大约50％，而10微克的IL-22RA2-Fc没有显著作用。TNF-α和IL-6水平没有显著改变。IL-22RA2-Fc注射降低了1小时时循环中的嗜中性粒细胞计数。显示给予IL-22RA2-Fc可以中和IL-22诱导SAA的活性。
B.使用BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞在Alamar Blue增殖试验中检测LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中小鼠血清内的IL-22活性
将本文描述的BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞离心沉淀并用PBS漂洗2次，以确保mIL-3被完全去掉。然后离心第3次，重悬于没有mLL-3的完全培养基(RPMI1640，10％FBS，1％GlutaMAX，1％丙酮酸钠)(这以后被称为“无mIL-3的培养基”)。然后用血球计数仪对细胞计数。将细胞置于96孔板中，每孔5000细胞，体积为100微升/孔，使用无mIL-3的培养基。
将来自上面实施例11A中描述的LPS诱导的内毒素血症小鼠的血清用无mIL-3的培养基在96孔板最上面的一行中稀释至2％，然后向下面7行中1：2系列稀释，每孔中的体积都是100微升。然后将这些稀释血清加入到100微升细胞中，使血清的终浓度为1％，0.5％，0.25％，0.125％，0.063％，0.031％，0.016％，和0.018％，总的检测体积为200微升。将检测平板置于37℃，5％CO2中孵育4天，然后加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)，每孔20微升。然后再将平板在37℃，5％CO2中孵育16小时。Alamar Blue根据活细胞的数目给出荧光计量读数，因此是与阴性对照相比的细胞增殖的直接量度。在Wallac Victor21420Multilabel Counter(Wallac，Turku，Finland)上对平板读数，波长为544纳米(激发)和590纳米(发射)。
结果显示，在0小时，1小时，8小时和16小时时间点没有显著的超过背景水平的增殖。4小时时间点的血清样品显示4倍到大于10倍的超过背景水平的增殖，表明在那些样品中存在IL-22。
C.LPS诱导的内毒素血症小鼠模型：测定IL-22RA2作用的实验
测试IL-22RA2处理对由单一25微克LPS剂量IP注射小鼠诱导产生的促炎指示剂的影响能力。对所有的样品分析SAA、IL-22和循环 嗜中性粒细胞计数。每组小鼠的一部分用于分析特定的细胞因子水平(对1小时样品分析TNFα，4小时样品分析IL-6)。在表8所示的时间点处死动物，取全血，收集血清，分成小份用于分析。
通过IP途径向72只C57BL/6N雌性小鼠(CRL)给予单一剂量的IL-22RA2注射，如下面的表8所示。对照小鼠是C57BL/6N(CRL).
30分钟后，它们接受另外一次IP注射100微升含25微克的LPS(Sigma)，以起始内毒素血症级联过程。每组中的小鼠在表8中显示的相应时间点处死，取50毫升的全血，测量循环嗜中性粒细胞总数，对剩余的血离心得到血清，分成小份用于本文描述的各种不同检测。
表8
| 组 | 编号 | 处理 | LPS | 处死 | 样品 |
| A | 8 | 100μg IL-22RA2IP | 25μg IP30min posttx | 1小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| B | 8 | 10μg IL-22RA2IP | 25μg IP30min post tx | 1小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| C | 8 | 200μl PBS IP | 25μg IP30min post tx | 1小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| D | 8 | 100μg IL-22RA2IP | 25μg IP30min posttx | 4小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| E | 8 | 10μg IL-22RA2IP | 25μg IP30min posttx | 4小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| F | 8 | 200μl PBS IP | 25μg IP30min post tx | 4小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| G | 8 | 100μg IL-22RA2IP | 25μg IP | 8小时 | 血清分成小份； |
| 30min post tx | 对血液进行全血细胞计数 | ||||
| H | 8 | 10μg IL-22RA2IP | 25μg IP30min post tx | 8小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| J | 8 | 200μl PBS IP | 25μg IP30min post tx | 8小时 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
| K | 5 | 对照 | 无 | LPS前 | 血清分成小份；对血液进行全血细胞计数 |
D.IL-22RA2-Fc4中和体内SAA诱导：SAA ELISA显示在LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中LPS诱导的SAA表达被IL-22RA2-Fc4的注射所抑制
为了测定IL-22RA2是否能够抑制LPS诱导的内毒素血症小鼠模型中的SAA诱导，在LPS注射前30分钟给小鼠注射IL-22RA2，如上面的实施例11C的表8所示。
根据生产商的说明书使用Mouse SAA Immunoassay Kit(BioSource International，California)进行ELISA，测量4小时和8小时样品中SAA的水平。在4小时时间点处，与注射PBS的小鼠相比，用100微克或者10微克IL-22RA2处理的小鼠显示剂量依赖性的统计学上显著的SAA水平下降。在8小时时间点处，与注射PBS的小鼠相比，用100微克IL-22RA2处理的小鼠持续显示统计学上显著的SAA水平下降。这表明IL-22RA2的存在能够抑制LPS在体内对SAA的诱导。
实施例13
IL-22多肽对皮肤的体内作用
A.IL-22诱导的棘皮症
将小鼠(雌性，C3H/HEJ，8周大；Jackson Labs，Bar Harbor，ME)分成3组(每组6只动物)，另一组4只动物。将人BHK细胞产生的IL-22通过微型渗透压泵连续灌注给药，使IL-22的局部和稳态血清浓度与泵中的IL-22浓度成比例。在Alzet微型渗透压泵(型号2002；Alza corporation Palo Alto，CA)中无菌条件下用IL-22蛋白(A601F，0.22mL)装满，该蛋白质在磷酸盐缓冲液(pH7.0)中稀释，使泵中的蛋白有不同的浓度：对第一组小鼠，浓度为2mg/mL；对第二组小鼠，浓度为0.2mg/mL；对第三组小鼠，浓度为0.02mg/mL；对第四组小鼠，浓度为0mg/mL(只有稀释液)。在背部皮肤上作1厘米的切口，通过该切口经皮下途径将泵植入到小鼠体内，用无菌伤口缝合线缝合伤口。将泵设计为以每小时0.5微升的速率输送其内容物，输送14天。根据这个表观输注速率，计算出1-4组的剂量水平分别为24μg/天，2.4μg/天，0.24μg/天和0μg/天。
在第14天结束时，将小鼠安乐死，从每只小鼠收集泵周围区域皮肤大约1平方厘米的皮肤样品。用10％中性缓冲福尔马林固定皮肤。将经福尔马林固定的皮肤样品用石蜡包埋，按通常方法处理，作5微米的切片，用苏木精和曙红染色。在不知情的情况下由ACVP委员会授予执照的兽医病理学家对组织进行显微镜检。观察组织学改变，对棘皮症的严重性(即表皮增厚)使用以下评分系统进行主观评分：0-正常，1-最轻微的棘皮症，2-轻度棘皮症，3-中度棘皮症和4-重度棘皮症。此外，使用CoolSnap数码相机(Roper Scientific，Inc.，SanDiego，CA)对被选择组的皮肤进行照相，使用组织形态学软件(ScionImage for Windows，v.4.02，Scion Corp.，Frederick，MD)对表皮的厚度进行测量。
以2.4和24微克/天给予IL-22时导致表皮的增厚，表现为平均 棘皮症评分(sees)一致性地大于对照组皮肤的评分。而且，经IL-22处理的动物其表皮还有单核细胞浸润。这些浸润物在用载体处理的对照中没有观察到。
各组内表皮厚度的棘皮症评分和皮肤厚度(以普通单位像素为单位)的测量在下面的表9中显示：
表9：
组# n＝ 泵 平均棘皮症 测量的厚度
1 6 24μg IL-22/天 3.0 ND
2 6 2.4μg IL-22/天 2.4 67.5
3 6 0.24μg IL-22/天 2.2 ND
4 4 PBS灌注 1.8 45.6
B.IL-22RA2对IL-22诱导的棘皮症的影响
将小鼠(雌性，C3H/HEJ，8周大；Jackson Labs，Bar Harbor，ME)分成8组，每组8只动物。将IL-22通过微型渗透压泵连续灌注给药，如实施例12A中的描述。在Alzet微型渗透压泵(型号2001；Alzacorporation Palo Alto，CA)中无菌条件下用IL-22蛋白(A601F，0.22mL)装满，该蛋白用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释，使泵中的蛋白有不同的浓度：对第一、二组小鼠，浓度为0.22mg/mL；对第三、四组小鼠，浓度为0.45mg/mL；对第五、六组小鼠，浓度为0.9mg/mL；对第七、八组小鼠，浓度为0mg/mL(只有稀释液)。将泵设计为以每小时0.5微升的速率输送其内容物，输送14天。根据这个表观灌输速率，计算出各组的剂量水平分别为一、二组10μg/天，三、四组5μg/天，五、六组2.5μg/天和七、八组0μg/天。对于每两组接受相同剂量IL-22的小鼠，一组通过腹腔内途径注射三次(第1、3和5天)0.1毫克人IL-22RA2Fc蛋白(本文所述)，另外一组以相同的方式注射载体(PBS)。
在研究的第8天，将小鼠安乐死，从每只小鼠收集泵周围区域皮肤大约1平方厘米的皮肤样品。用10％中性缓冲福尔马林固定皮肤。将经过福尔马林固定的皮肤样品用石蜡包埋，按通常方法处理，作5厘米的切片，用苏木精和曙红染色。在不知情的情况下由ACVP委员会授予执照的兽医病理学家对组织进行显微镜检。以与前面的实施例 不同的方式对本研究进行评分。测定从基底层到颗粒层的表皮层数。根据结果对切片评分：0-正常(2-3层)，1-轻度增厚(3-4层)，2-中度增厚(4-6层)以及3-重度增厚(6层以上)。
以2.5、5和10微克/天的剂量给予IL-22导致了表皮的增厚(参见表10)。而且，经IL-22处理的动物的表皮中还有单核细胞浸润。这些浸润物在经载体处理的对照中没有观察到。同时给予100微克IL-22RA2(三次注射)降低了经5微克IL-22/天处理的小鼠中的表皮增厚量。
各组表皮厚度的棘皮症评分在下面的表10中显示：
表10：
| 组# | n＝ | 泵 | 注射 | 平均棘皮症 |
| 1 | 8 | 2.5μgIL-22/天 | 100μL载体(3次注射) | 1.1 |
| 2 | 8 | 2.5μgIL-22/天 | 100μgIL-22RA2(3次注射) | 0.8 |
| 3 | 8 | 5μgIL-22/天 | 100μL载体(3次注射) | 2.0 |
| 4 | 8 | 5μgIL-22/天 | 100μgIL-22RA2(3次注射) | 0.6 |
| 5 | 8 | 10μgIL-22/天 | 100μL载体(3次注射) | 2.0 |
| 6 | 8 | 10μgIL-22/天 | 100μgIL-22RA2(3次注射) | 1.9 |
| 7 | 8 | 载体 | 100μL载体(3次注射) | 0.0 |
| 8 | 8 | 载体 | 100μgIL-22RA2(3次注射) | 0.0 |
在人牛皮癣皮肤中也观察到了表皮增厚和免疫浸润。IL-22皮下注射的皮肤表型还表明IL-22在牛皮癣致病中的潜在作用。IL-22RA2-Fc可以中和IL-22诱导的皮肤表型的事实提示，其他IL-22拮抗剂例如以及抗IL-22中和抗体或者可溶性受体可以用于治疗牛皮癣和其他IL-22诱导的炎症疾病。
C.IL-22RA可溶性受体和抗IL-22RA抗体对于IL-22诱导的或者IL-20诱导的棘皮症的影响
使用由皮下输注IL-22或者IL-20蛋白导致的棘皮症组织学终点，对IL-22RA可溶性受体或者IL-22RA的抗体抑制IL-22或IL-20体内活性的能力按照相似的方式进行评价。在本模型的实施例中，根据上面实施例12(A)和12(B)中的描述，向C3H/HEJ小鼠皮下植入微型渗透压泵。在与IL-22或者IL-20接触的过程中，通过注射纯化的IL-22单抗处理小鼠，或者类似地注射载体作为对照。在IL-22输注阶段的终点，从泵周围的区域取皮肤样品进行组织学分析。与IL-22RA2可溶性受体IL-22拮抗剂相似，本发明的IL-22或IL-20拮抗剂IL-22RA可溶性受体或者抗-IL-22RA抗体预计可以使得由于IL-22或IL-20导致的表皮增厚和免疫细胞浸润降低，因此可以用作IL-22或者IL-20拮抗剂，在牛皮癣和其他IL-22或者IL-20诱导的炎症疾病中治疗性使用。
实施例14
在人牛皮癣皮肤样品中IL-22得到上调
RNA样品：
获得正常皮肤样品以及牛皮癣病人皮肤样品。后者包括从稳定的斑块型牛皮癣得到的患病皮肤以及邻近未患病的皮肤。使用常规方法从人皮肤样品中分离RNA。使用Agilent2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Waldbronn Germany)对RNA样品的完整性和质量进行分析。
定量RT-PCR的引物和探针
先前已描述过使用ABI PRISM7700Sequence Detection System (PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR(参见Heid，C.A.et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)。该方法包括了含有报告和淬灭荧光染料二者的基因特异探针的使用。当探针完好无损时，由于靠近淬灭染料，所以报告染料的发射被消除。在使用额外的基因特异性正向和反向引物进行的PCR延伸过程中，探针被r Tth DNA聚合酶的5′到3′核酸水解活性切割，这使报告染料得以从探针处被释放，导致荧光发射的增加。
用于IL-22表达的实时定量RT-PCR分析的引物和探针是使用引物设计软件Primer ExpressTM(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)进行设计的。人IL-22引物被设计成跨越内含子和外显子的连接处，使基因组DNA不会被扩增出来。在下面的PCR反应中使用正向引物ZC42459(SEQ ID NO：：22)和反向引物ZC42458(SEQ ID NO：：23)，浓度为800nM，合成72bp的产物。合成相应的IL-22探针ZC42460(SEQID NO：24)，并且在ZymoGenetics内进行标记。该IL-22探针的5′端用报告荧光染料(6-羧基荧光素)(FAM)(PE Applied Biosystems)标记，3′端用淬灭荧光染料(6-羧基-四甲基罗丹明)(TAMRA)(PEApplied Biosystems)标记。
C.实时定量RT-PCR
使用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents Kit(PE AppliedBiosystems)分析总RNA样品，确定IL-22mRNA的相对水平。制备失控的IL-22转录产物，产生标准曲线用于定量。该曲线由10倍系列稀释度组成(约1e8到1e3IL-22全部mRNA的总拷贝数)，对每个标准曲线点一式三份进行分析。还对皮肤的总RNA样品一式三份分析人IL-22转录产物的水平，分析hGUS的水平作为内部对照。对每一个RNA样品都进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE Applied Biosystems)，总 体积为25微升，含有：大约25纳克的溶于经DEPC处理过的水(无DNA酶和RNA酶)中的总RNA；适宜的引物(大约800nM ZC42459(SEQID NO：22)和ZC42458(SEQ ID NO：23))；适宜的探针(大约100nMZC42460(SEQ ID NO：24))；1XTaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸镁；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM；d-UTP600μM；r Tth DNA聚合酶(0.1U/μl)；以及AmpErase UNG(0.01U/μl)。PCR热循环的条件如下：起始的UNG处理步骤，即50℃2分钟1个循环；接着是逆转录(RT)步骤，即60℃30分钟1个循环；接着是使UNG失活步骤，即95℃5分钟1个循环；然后是扩增，即94℃20秒以及60℃1分钟进行40个循环。
使用标准曲线的方法，根据生产商PE Biosystems的描述(UsetBulletin#2：ABI Prism7700Sequence Detection System，RelativeQuantitation of Gene Expression，1997-12-11)，测定IL-22RNA的相对水平。使用hGUS的测量值对IL-22水平进行标准化。数据在下面的表11中显示。
表11
| 皮肤样品 | IL-22 |
| 正常 | 0 |
| 未受牵连的 | 0 |
| 患病的 | 1149 |
在正常病人或者未受牵连区域的皮肤样品中未检测到IL-22mRNA。相反，在牛皮癣病人的患病(受牵连)皮肤中IL-22mRNA有急剧的上调。这些数据佐证了IL-22与人牛皮癣具有强烈的疾病关联性。
在人牛皮癣破损处显示有IL-22的过量表达，提示人牛皮癣中有IL-22参与。而且，如这里所描述的，IL-22在转基因小鼠中的过量表达显示了表皮增厚以及免疫细胞的参与，这是牛皮癣表型的指示，而 且将IL-22向正常小鼠中的注射显示了表皮增厚以及免疫细胞参与，这是牛皮癣表型的指示，而这些可以通过可溶性受体拮抗剂IL-22RA2消除。这样的体内数据进一步提示在牛皮癣中有促炎性的IL-22参与。类似地，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22单抗及其可溶性受体和抗体，在炎症性疾病的治疗性治疗中都是有用的，特别是可以在牛皮癣的治疗中用作IL-22的拮抗剂。而且，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22单抗及其可溶性受体和抗体，在其他炎症性疾病的治疗性治疗中也是有用的，例如特应性皮炎、IBD、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎以及牛皮癣性关节炎、成人呼吸疾病(ARD)、败血症性休克、多器官衰竭、炎症性肺部损伤例如哮喘或者支气管炎、细菌性肺炎、牛皮癣、湿疹、特应性皮炎和接触性皮炎以及炎症性肠病例如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎。
实施例15
在人特应性皮炎皮肤样品中IL-22被上调
获得正常皮肤样品(n＝4)以及来自特应性皮炎病人(n＝4)的皮肤样品。使用常规方法从人皮肤样品中分离RNA。使用Agilent2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Waldbronn Germany)对RNA样品的完整性和质量进行分析。
用于定量RT-PCR的引物和探针
原先已描述过使用ABI PRISM7700Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR(参见Heid，C.A.et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)。该方法中包括使用含有报告和淬灭荧光染料的基因特异性探针。当探 针完好无损时，由于非常靠近淬灭染料，所以报告染料的发射被消除。在使用额外的基因特异性正向和反向引物进行的PCR延伸过程中，探针被r Tth DNA聚合酶的5′到3′核酸水解活性切割，这使报告染料得以从探针处被释放，导致荧光发射的增加。
用于IL-22表达的实时定量RT-PCR分析的引物和探针是使用引物设计软件Primer ExpressTM(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)进行设计的。人IL-22的引物被设计成跨越内含子和外显子的连接处，使基因组DNA不会被扩增出来。在下面的PCR反应中使用正向引物ZC42459(SEQ ID NO::22)和反向引物ZC42458(SEQ ID NO::23)，浓度为800nM，合成一个72bp的产物。合成相应的IL-22探针ZC42460(SEQ ID NO：24)，并且在ZymoGenetics内部进行标记。该IL-22探针在5′端被报告荧光染料(6-羧基荧光素)(FAM)(PE AppliedBiosystems)所标记，在3′端被淬灭荧光染料(6-羧基-四甲基罗丹明)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)所标记。
C.实时定量RT-PCR
使用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents Kit(PE AppliedBiosystems)分析总RNA样品，测定IL-22mRNA的相对水平。制备失控的IL-22转录产物，产生标准曲线用于定量。该曲线由10倍系列稀释度组成，从1e8到1e3IL-22全部mRNA的总拷贝数，对每个标准曲线点一式三份进行分析。还对皮肤的总RNA样品一式三份分析人IL-22转录产物水平，并分析hGUS的水平作为内部对照。对每一个RNA样品都进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE Applied Biosystems)，总体积为25微升，含有：大约25纳克的溶于经DEPC处理过的水(无DNA酶和RNA酶)中的总RNA；适宜的引物(大约800nM ZC42459(SEQ IDNO：22)和ZC42458(SEQ ID NO：23))；适宜的探针(大约100nM ZC42460(SEQ ID NO：24))；1XTaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸镁；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM；d-UTP600μM；r Tth DNA聚合酶(0.1U/μl)； 以及AmpEraseUNG(0.01U/μl)。PCR热循环的条件如下：起始的UNG处理步骤，即50℃2分钟1个循环；接着是逆转录(RT)步骤，即60℃30分钟1个循环；接着是UNG失活步骤，即95℃5分钟1个循环；然后是扩增步骤，即94℃20秒以及60℃1分钟进行40个循环。
使用标准曲线的方法，根据生产商PE Biosystems的描述(UserBulletin#2：ABI Prism7700Sequence Detection System，RelativeQuantitation of Gene Expression，1997-12-11)，测定IL-22RNA的相对水平。使用hGUS的测量值对IL-22水平进行标准化。
在正常病人的皮肤样品中检测不到IL-22mRNA。相反，在4个特应性皮炎的病人中有三个出现IL-22mRNA显著上调(大约400-2300个拷贝)。这些数据支持了IL-22与人特应性皮炎之间有强烈的疾病相关性。
在人类特应性皮炎皮肤中显示了IL-22的过量表达，提示IL-22涉及人类特应性皮炎的发病。而且，正如这里所描述的，IL-22在转基因小鼠中的过量表达显示了表皮增厚和免疫细胞的累及，这是特应性皮炎表型的指示；此外，将IL-22向正常小鼠中注射显示了表皮增厚和免疫细胞的累及，这是特应性皮炎表型的指示；这可以通过可溶性受体拮抗剂IL-22RA2消除。这些体内数据进一步提示促炎的IL-22参与了特应性皮炎发病。这样，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22RA单克隆抗体，以及可溶性受体及其抗体，在炎症性疾病的治疗性治疗中是有用的，特别是可在特应性皮炎的治疗中作为IL-22的拮抗剂。而且，IL-22活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22单克隆抗体，以及可溶性受体及其抗体，在其他炎症性疾病的治疗性在治疗中也是有用的，例如在治疗下面的疾病中作为IL-22的拮抗剂：特应性皮炎、IBD、结肠炎、内毒素血症、关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、成人呼吸疾病(ARD)、败血性休克、多器官衰竭、炎症性肺损伤例如哮喘或支气管炎、细菌性肺炎、特应性皮炎、水肿、特应性皮炎和接触性皮炎以及炎症性肠病如溃疡性结肠炎和节段性回 肠炎。
实施例16
人IL-22多克隆抗体
使用从BHK细胞(IL-22-BHK)制备的纯化的成熟重组人IL-22多肽(SEQ ID NO：6中氨基酸残基22(Ala)到167(Ile))免疫两只雌性新西兰白兔，制备抗IL-22多克隆抗体。每只兔通过腹膜内(IP)途径起始注射(在弗氏完全佐剂中的200微克纯化蛋白)，接下来每隔三周进行一次加强免疫，即通过IP途径注射在弗氏不完全佐剂中的100微克肽。第二次增强注射后(一共三次注射)7到10天，对动物采血并收集血清。然后每三周加强注射一次并采血。
每克CNBr-SEPHAROSE使用10毫克特异抗原纯化的重组蛋白人IL-22-BHK制备CNBr-SEPHAROSE4B蛋白层析柱(Pharmacia LKB)，利用该柱从免疫的家兔血清中将人IL-22特异多克隆抗体亲和纯化出来，在PBS中20×透析过夜。对人IL-22特异性抗体进行ELISA研究，用500ng/ml纯化的重组蛋白人IL-22-BHK作为抗体靶。在特异性纯化重组抗原人IL-22-BHK上，兔抗人IL-22亲和纯化抗体的检测下限(LLD)是280pg/ml。
进一步研究人IL-22特异多克隆抗体阻断纯化的重组人IL-22-BHK对BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)的细胞增殖活性的能力(“中和试验”)。50倍摩尔浓度过量的人IL-22特异多克隆抗体足以抑制细胞增殖。
实施例17
抗人IL-22单克隆抗体
使用从BHK细胞制备的纯化的成熟重组人IL-22多肽(SEQ ID NO：6中氨基酸残基22(Ala)到167(Ile))(IL-22-BHK)免疫四只雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)，制备单克隆抗体。对每只大鼠通过腹膜内途径起始注射在弗氏完全佐剂(Pierce，Rockford，IL)中的100微克纯化人重组IL-22蛋白，接下来每两周进行一次加强免疫，即通过IP途径注射在弗氏不完全佐剂中的50微克纯化重组蛋白。第三次增强注射后7到10天，对动物采血并收集血清。
对人IL-22特异性大鼠血清样品进行ELISA研究，用500ng/ml生物素化的人IL-22-BHK和500ng/ml生物素化的小鼠IL-22以及生物素化的鼠IL-22-大肠杆菌(R+D Systems，Minneapolis，MN)作为抗体靶。三个大鼠血清样品对特异抗体靶-生物素化人IL-22-BHK的滴度是1：1E5稀释度，对特异抗体靶向-生物素化鼠IL-22-大肠杆菌的滴度是1：1E4稀释度。
从两个高滴度的大鼠中收获脾细胞和淋巴结细胞，在两个分别进行的融合步骤中，用PEG1500与SP2/0(小鼠)骨髓瘤细胞融合(脾细胞与骨髓瘤细胞是4：1的融合比例，Antibodies A LaboratoryManual，E.Harlow and D.Lane，Cold Spring Harbor Press)。融合后生长10天，通过ELISA，使用生物素化的重组蛋白人IL-22-BHK和生物素化的重组蛋白鼠IL-22-大肠杆菌分别作为抗体靶，鉴定产生特异性抗体的杂交瘤混合物。对在两个ELISA实验中均呈阳性的杂交瘤混合物进一步分析它们阻断或者降低纯化的重组鼠IL-22-大肠杆菌对BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)的细胞增殖活性的能力(“中和试验”)。
对仅在ELISA中产生阳性结果的杂交瘤混合物或者在ELISA和“中 和试验”二者中都产生阳性结果的杂交瘤混合物使用有限稀释法至少再克隆两次。
研究从组织培养基中纯化出来的单克隆抗体在ELISA中用于定量测定小鼠和人血清样品中重组和天然人IL-22含量的用途。在定量检测中，两个选择的抗体的检测下限是在100％人血清中大约1ng/ml重组人IL-22-大肠杆菌。
研究从组织培养基中纯化出来的单克隆抗体阻断或者降低纯化的重组人IL-22-大肠杆菌或者鼠IL-22-大肠杆菌对BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)的细胞增殖活性的能力(“中和试验”)。用这种方式鉴定出六种“中和性”单克隆抗体。已根据布达佩斯条约将以上描述的表达针对人IL-22的中和性单克隆抗体的杂交瘤作为原始保藏物保藏于美国典型培养保藏中心(ATCC；Manassas VA)的专利收藏处，并获得以下的ATCC登录编号：克隆266.16.1.4.4.1(ATCC专利保藏号PTA-5035)；克隆266.5.1.2.2.3(ATCC专利保藏号PTA-5033)；克隆267.17.1.1.4.1(ATCC专利保藏号PTA-5038)；克隆267.4.1.1.4.1(ATCC专利保藏号PTA-5037)；克隆266.12.6.1.3.2.1(ATCC专利保藏号PTA-5034)；克隆266.19.1.10.5.2(ATCC专利保藏号PTA-5036)；以及克隆267.9.1.1.4.1(ATCC专利保藏号PTA-5353)。
实施例18
抗IL-22RA单克隆抗体
使用经切割和纯化的重组融合蛋白鼠IL-22-Fc(SEQ ID NO：4)免疫四只Lewis大鼠(Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA)，制备单克隆抗体。每只大鼠通过腹膜内途径起始注射在弗氏完全佐剂(Pierce，Rockford，IL)中)的100微克纯化的重组融合蛋白， 接下来每两周进行一次加强IP途径注射在弗氏不完全佐剂中的50微克纯化重组蛋白，免疫四周。第一个四周免疫结束后，将在弗氏不完全佐剂中的50微克经切割和纯化的重组蛋白与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH，Pierce，Rockford，IL)相偶联的产物通过IP途径每两周进行一次加强免疫，免疫四周。第四次增强注射后7到10天，对动物采血并收集血清。
对小鼠IL-22RA特异性大鼠血清样本进行ELISA研究，其中使用500ng/ml经纯化的重组融合蛋白鼠IL-22RA-Fc作为特异性抗体靶，一种无关的融合蛋白作为非特异性抗体靶。
从一只高滴度的大鼠中收获脾细胞，使用优化的PEG介导的融合实验方案(Rockland Immunochemicals)与SP2/0(小鼠)骨髓瘤细胞融合。融合后生长12天，产生特异性抗体的杂交瘤混合物通过ELISA，使用纯化的重组融合蛋白鼠IL-22RA-Fc-Bv作为特异性抗体靶，一种无关的融合蛋白作为非特异性抗体靶，进行鉴定。进一步分析只对特异抗体靶呈阳性的杂交瘤混合物阻断或者降低纯化的重组鼠IL-22-大肠杆菌对BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)的细胞增殖活性的能力(“中和试验”)，以及通过FACS分析测定其结合作为抗体靶的BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)的能力。
在ELISA中产生特定阳性结果以及在FACS或“中和试验”中产生阳性结果的杂交瘤混合物使用有限稀释法至少再克隆两次。
对组织培养基中的单克隆抗体研究它们阻断或者降低在纯化的重组蛋白鼠IL-22-大肠杆菌或者人IL-22-BHK存在下生长的BaF3/CRF2-4/IL-22RA细胞(实施例2和实施例3)增殖的能力。鉴定出14个“中和性”单克隆抗体，并且克隆了9个单克隆抗体。
已根据布达佩斯条约，将表达针对以上描述的小鼠IL-22RA的中和性单克隆抗体的杂交瘤作为原始保藏物保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas VA)的专利收藏处，并获得以下的ATCC登录编号：克隆R2.1.1G11.1(ATCC专利保藏号[####])；克隆R2.1.5F4.1(ATCC专利保藏号[####])；克隆R2.1.5H8.1(ATCC专利保藏号[####])；克隆R2.1.12G7.1(ATCC专利保藏号[####])；克隆R2.1.13C8.1(ATCC专利保藏号PTA-5037)；克隆R2.1.15E2.1(ATCC专利保藏号[####])；克隆R2.1.16C11.1(ATCC专利保藏号[####])；克隆R2.1.18C8.1(ATCC专利保藏号[####])；以及克隆R2.1.21G8.2(ATCC专利保藏号[####])。
实施例19
两种大鼠抗小鼠IL-22RA单抗的结合亲和性
将山羊抗大鼠IgG-Fcγ特异抗体(Jackson)固定到CM5 Biacore芯片上。将检测优化，使每一种单抗在抗大鼠捕获表面上结合，然后跨过单抗注射一系列浓度的IL-22RA，考察结合(Ka)和解离(Kd)。在初步试验后，在融合蛋白和芯片的捕获表面之间观察到非特异的结合。得到一管通过凝血酶切割了Fc4标签的IL-22RA，然后进行检测，显示没有背景影响。在每一次运行后，使用两次注射20mM盐酸，使表面再生成抗大鼠抗体。对于每个单抗获得数据，使用分析软件(BIAevaluation software version 3.2，Pharmacia BIAcore，Uppsala，Sweden)测定抗IL-22RA与IL-22RA蛋白质结合的动力学，如下面的表12中所示：
表12
**显示了每一抗IL-22RA单抗的结合平衡(Ka)和解离平衡(Kd)速率常数，数值落在机器的限度范围内。Chi2指的是结合曲线和评价拟合曲线之间差的平方和。越接近0，数据的置信度越高。
由表12所示，两种抗IL-22RA单抗都与IL-22RA蛋白强烈结合，正如皮摩尔浓度的单抗与IL-22RA(经凝血酶切割掉Fc4标签)的结合所显示的。由低的Chi2数值可见数据有良好的置信度，数据显示单抗克隆R2.1.5F4.1对IL-22RA受体有略强的亲和性。
实施例20
在组织样品中IL-22蛋白体内表达的免疫组化分析
A.概述
使用抗人IL-22(anti-hIL-22)单克隆抗体(Mab266.19.1.10.5.2)，在下面的组织样品中进行IL-22蛋白表达的免疫组化(IHC)分析以及定位：人multi-Normal Grid和Tumor Grid；人胰腺炎、肺以及肾脏疾病样品；人牛皮癣皮肤样品；INS IL-22TG(由大鼠胰岛素启动子表达)以及野生型小鼠的胰腺；muIL-22-EuLCKTG和野生型小鼠皮肤样品；以及DSS(野生型和IL-22KO)小鼠结肠样品。而且，比较了抗hIL-22单克隆抗体MAB266.19.1.10.5.2(实施例17)与多克隆抗体(兔抗-hIL-22)(实施例16)的染色型式。
对大鼠抗人IL-22单克隆抗体MAb266.16.1.4.4.1和MAb266.19.1.10.5.2(实施例17)进行测试，显示它们能够使大多数BHK/人IL-22(>50％)染色，但是一些BHK/小鼠IL-22细胞(1-5％)也被染色。使用这两种抗体研究IL-22在病人和动物模型样品中的组织分布和表达，并且用于与多克隆兔抗体的染色型式进行比较，以对结果进行确证。
B.材料和方法
将经福尔马林固定、石蜡包埋的人源和小鼠动物模型的细胞和组织切成5微米的切片。表达人或者小鼠IL-22的BHK细胞和野生型细胞分别作为阳性对照和阴性对照。人组织包括：多组织对照载片(NormalGridTM；Biomeda，Foster City，CA)，其中具有50个各种正常人组织的切片(例如脑、垂体、肾上腺、乳房、肾脏、心脏、胃、小肠、大肠、胚胎肝脏、肝脏、皮肤、胰腺、肺、扁桃腺、卵巢、睾丸、前列腺、子宫、胎盘、甲状腺和脾)；多组织对照载片(TumorGridTM；Biomeda，Foster City，CA)，其中具有50个各种人肿瘤的切片(例如肺腺癌、肝腺癌、肾腺癌、结肠腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、胃腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢腺癌，淋巴瘤，骨髓瘤、尤因氏肉瘤，上皮细胞瘤，恶性纤维组织细胞瘤，Rhabdo瘤，良性肿瘤，未分化的癌、间皮瘤，teretoma和精原细胞瘤)；来自CHTN(Cooperation HumanTissue Network，Cleveland，Ohio)的肺癌；正常胰腺、具有慢性胰腺炎的胰腺、具有慢性周围血管炎症的肺、来自NDRI(NationalDisease Research Interchange，Philadelphia，PA)的具有多病灶性肾小球硬化症的肾、具有球膜增生性肾小球性肾炎的肾或者具有硬化肾小球间质纤维化的肾；以及人的牛皮癣皮肤样品。小鼠的组织包括：炎症性肠病动物模型(本文公开的DSS模型，Swiss Webster雌性小鼠)的结肠；IL-20野生型和敲除的结肠炎动物模型(DSS小鼠，野生型和IL-20敲除的雌性小鼠)，在饮用水中添加载体或者4％DSS 处理7天；以及转基因动物模型的皮肤样品，包括mIL-22-EuLCK TG和mIL-22-INS对照以及转基因动物。每个载片上的一个切片用苏木精和曙红(H&E)染色进行组织学检查，其余的切片用免疫组化染色检查IL-22蛋白表达和定位。
对于免疫组化，将细胞和组织切片置于ChemMateTMCapillary GapPlus显微镜载片上(BioTek，Winooski，Vermont)，在60℃的烘箱内干燥60分钟，使用标准程序进行脱蜡：二甲苯中5分钟三次，100％乙醇中4分钟，100％乙醇中3分钟，95％乙醇中2分钟。然后对组织切片在37℃用胃蛋白酶(NeoMarkers Fremont CA)进行20分钟的酶诱导表位修复过程，然后按照生产厂商(Zymed，South San Francisco，CA)的说明书进行抗生物素蛋白/生物素的封闭步骤。使用TechMate500TMAutomated Immunostainer and Immunoperoxidase(IP)免疫组化实验方案，用抗生物素蛋白-生物素复合体检测系统(VentanaBiotek Systems，Tucson，AZ)进行染色。TechMateTM500AutomatedImmunos tainer使用了毛细管作用的原理，IP实验方案采用了一种被称为“三明治”技术的免疫染色。切片用5％(在PBS中)的正常山羊血清(Vector，Burlingame CA)预封闭10分钟，然后用1×缓冲液1(Signet，Dedham MA)漂洗，再与抗IL-22的一抗(单抗266.19.1.10.5.2)(实施例17)PAS纯化为2.04mg/ml，1：800稀释)室温孵育30分钟，然后用5×缓冲液1漂洗。一抗用TechMate500TM抗体稀释缓冲液(Ventana)稀释。生物素化的山羊抗大鼠IgG(Vector)用PBS1：200稀释，加入5％的正常山羊血清和2.5％的脱脂奶粉，作为二抗在室温下孵育25分钟，之后分别用1×缓冲液1和缓冲液2&3(Signet)漂洗。组织切片用3％的过氧化氢(HP)(Ventana)封闭3X7分钟，然后用3×缓冲液2&3漂洗。使用过氧化物DAB试剂盒(Ventana)进行免疫过氧化物酶标记，与抗生物素蛋白-生物素复合体(ABC)孵育30分钟，然用5×缓冲液2&3漂洗，用二氨基联苯胺(DAB)处理4X4分钟，之后用2×缓冲液2&3漂洗，1×水洗(Signet，目录编 号2340)。然后用甲基绿(Dako，目录编号S1962)对组织进行负染色10分钟，接下来是2×缓冲液2&3漂洗和3×水洗。对照包括非免疫初级血清，使用大鼠一抗同型对照(Zymed)代替一抗。
使用Olympus BH-2显微镜观察免疫染色，用CoolSNAP HQ数字相机(Roper Scientific，Tucson，AZ)拍摄相片。
C.结果
阳性和阴性对照细胞系：单抗266.19.1.10.5.2，一种抗人IL-22单克隆抗体，在表达人IL-22的BHK细胞(+++)和表达鼠IL-22的BHK细胞(+)中显示了阳性染色，在野生型BHK细胞中没有染色(-)。使用大鼠同型阴性对照代替一抗对所有的阳性和阴性BHK细胞系进行染色，均未显示有染色(-)，这表明所述抗体对IL-22配基是特异的。该抗体对人和小鼠的IL-22具有交叉免疫反应性。
人组织：对人multi-Normal Grid和Tumor Grid；胰腺、肺和肾脏疾病样品；以及人牛皮癣皮肤样品进行了检查。这些人的组织包括1)在多组织对照载片(NormalGridTM)上的脑、垂体、肾上腺、乳房、肾脏、心脏、胃、小肠、大肠、胚胎肝脏、肝脏、皮肤、胰腺、肺、扁桃腺、卵巢、子宫、睾丸、胎盘、甲状腺和脾/正常人组织；2)在多组织对照载片(TumorGrid)上的肺腺癌、肝腺癌、肾腺癌、甲状腺癌、胃腺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢腺癌，淋巴瘤，黑素瘤、尤因氏肉瘤，上皮细胞瘤，恶性纤维组织细胞瘤，Rhabdo瘤，良性肿瘤，未分化的癌、间皮瘤，teretoma和精原细胞瘤/人异常组织/肿瘤；3)正常胰腺、具有慢性胰腺炎的胰腺、具有慢性周围血管炎症的肺、肺癌、具有多病灶性肾小球硬化症的肾、具有球膜增生性肾小球性肾炎的肾以及具有硬化肾小球间质性纤维化的肾，来自CHTN和/或NDRI；4)。
小鼠组织：检查了INS IL-22转基因和野生型小鼠的胰腺。在INSIL-22转基因胰腺的胰岛中散布的细胞显示使用单抗266.19.1.10.5.2有强的阳性染色(+++)，而野生型胰腺没有染色(-)。
多克隆和单克隆抗体的比较：已显示抗IL-22多克隆抗体(实施例16)是灵敏的，而单克隆抗体MAB266.19.1.10.5.2是特异的。多克隆抗体在表达人IL-22的BHK细胞上(+++)、表达鼠IL-22的BHK细胞上(+)、各种人和小鼠组织样品上(+)、以及在INS mIL-22转基因小鼠的胰岛中(+++)显示了阳性显色。与野生型相比，转基因小鼠中的胰岛有更高比例含有阳性染色。转基因胰岛的染色广泛地分布在胰岛中(+++)，而野生型胰岛中的染色一般局限于胰岛的外围(+)。但是，这种抗体对野生型BHK阴性对照细胞显示了非特异性染色(+)。
单抗266.19.1.10.5.2在表达人IL-22的BHK细胞上(+++)、表达鼠IL-22的BHK细胞上(+)、以及在INS mIL-22转基因小鼠的胰岛中(+++)显示了阳性显色。转基因胰岛的染色广泛地分布在胰岛中(+++)而野生型胰岛中没有染色(-)。
实施例21
IL-20在人牛皮癣皮肤样品中上调
A.RNA样品
获得正常的皮肤样品以及牛皮癣病人的皮肤受影响样品。后者包括涉及牛皮癣的皮肤以及邻近未受影响的皮肤。使用常规方法从人皮肤样品中分离RNA。使用Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies，Waldbronn Germany)对RNA样品的完整性和质量进行分析。
B.定量RT-PCR的引物和探针
原先已描述过使用ABI PRISM7700Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR(参见Heid，C.A.et al.，Genome Research6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology139：4756-4764，1998)。该方法包括了使用含有报告和淬灭荧光染料二者的基因特异性探针。当探针完好无损时，由于与淬灭染料密切靠近，所以报告染料的发射被消除。在使用额外的基因特异性正向和反向引物进行的PCR延伸过程中，探针被r Tth DNA聚合酶的5′到3′核酸水解活性切割，这使报告染料得以从探针处被释放，导致荧光发射的增加。
用于IL-22表达的实时定量RT-PCR分析的引物和探针是使用引物设计软件Primer ExpressTM(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)进行设计的。在下面的PCR反应中使用正向引物ZC40541(SEQ IDNO::25)和反向引物ZC40542(SEQ ID NO::26)，其浓度为800nM，合成一个71bp的产物。合成相应的IL-20
探针ZC40544(SEQ ID NO：27)，并且通过PE Applied Biosystems进行标记。在IL-20探针的5′端标记上报告荧光染料(6-羧基荧光素)(FAM)(PE AppliedBiosystems)，在3′端标记上淬灭荧光染料(6-羧基-四甲基罗丹明)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)。
C.实时定量RT-PCR
使用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents Kit(PE AppliedBiosystems)分析总RNA样品，确定IL-20mRNA的相对水平。制备失控的(runoff)IL-20转录产物，产生一条标准曲线用于定量。曲线由10倍系列稀释的从大约1e8到1e3IL-22全部mRNA的总拷贝数组成，每个标准曲线点一式三份进行分析。还对皮肤的总RNA样品中人IL-20转录产物的水平一式三份进行分析，分析hGUS的水平作为内部 对照。每一个RNA样品都进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE AppliedBiosystems)，总体积为25微升，含有：大约25纳克的溶于经DEPC处理过的水(无DNA酶和RNA酶)的总RNA；适宜的引物(大约800nMZC40541(SEQ ID NO：25)和ZC40542(SEQ ID NO：26))；适宜的探针(大约100nM ZC40544(SEQ ID NO：27))；1XTaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸锰；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM；d-UTP600μM；r Tth DNA聚合酶(0.1U/μl)；以及AmpErase UNG(0.01U/μl)。PCR热循环的条件如下：起始的UNG处理步骤50℃2分钟1个循环；接着是逆转录(RT)步骤，60℃30分钟1个循环；接着是使UNG失活步骤，95℃5分钟1个循环；然后是94℃20秒以及60℃1分钟扩增进行40个循环。
使用标准曲线的方法，根据生产商PEBiosystems的描述(UserBulletin#2：ABI Prism7700Sequence Detection System，RelativeQuantitation of Gene Expression，1997-12-11)，测定IL-20RNA的相对水平。使用hGUS的测量对IL-20水平进行标准化。数据在下面的表13中显示。
表13
| 皮肤样品 | IL-20 |
| 正常 | 2903 |
| 未受牵连的 | 7233 |
| 患病的 | 27,695 |
尽管在正常病人或者未受牵连区域的皮肤样品中可检测到IL-22mRNA，但是牛皮癣病人的患病皮肤中IL-20的mRNA上调。IL-20的受体亚基，包括IL-20RA、IL-22RA(IL-22RA)和IL-20RB在人正常和患病的皮肤中都有表达。这些数据支持了IL-20与人牛皮癣具有强烈的疾病关联性。
在人牛皮癣破损处显示有IL-20的过量表达，提示人牛皮癣中有IL-20参与。而且，如这里所描述的，IL-20在转基因小鼠中的过量表达显示了表皮增厚以及免疫细胞参与其中，这是牛皮癣表型的指示。这样的体内数据进一步提示在牛皮癣中有IL-20参与。这样，IL-20活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22RA单抗及其可溶性受体和抗体，以及抗IL-20中和性和单克隆抗体，在炎症性疾病例如牛皮癣以及本文公开的其他病症的治疗性治疗中可用作IL-20的拮抗剂。
实施例22
在人特应性皮炎皮肤样品中IL-20上调
A.RNA样品
获得正常皮肤样品以及特应性皮炎病人的皮肤样品。使用常规方法从人皮肤样品中分离RNA。使用Agilent2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies，Waldbronn Germany)对RNA样品的完整性和质量进行分析。
B.定量RT-PCR的引物和探针
原先已描述过使用ABI PRISM7700Sequence Detection System(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)进行实时定量RT-PCR(参见Heid，C.A.et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，U.E.M.et al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)。该方法包括使用含有报告和淬灭荧光染料二者的基因特异性探针。当探针完好无损时，由于与淬灭染料紧密靠近，所以报告染料的发射被消除。在使用额外的基因特异性正向和反向引物进行的PCR延伸过程中，探针被r Tth DNA聚合酶的5′到3′核酸水解活性切割，这使报告 染料得以从探针处释放下来，导致荧光发射的增加。
用于IL-20表达的实时定量RT-PCR分析的引物和探针是使用引物设计软件Primer ExpressTM(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)进行设计的。在下面的PCR反应中使用正向引物ZC40541(SEQ IDNO：25)和反向引物ZC40542(SEQ ID NO：26)，浓度为800nM，合成一个71bp的产物。合成相应的
探针ZC40544(SEQ IDNO：27)，并且由PE Applied Biosystems进行标记。该IL-20探针在5′端标记上报告荧光染料(6-羧基荧光素)(FAM)(PE AppliedBiosystems)，在3′端标记上淬灭荧光染料(6-羧基-四甲基罗丹明)(TAMRA)(PE Applied Biosystems)。
C.实时定量RT-PCR
使用TaqMan EZ RT-PCR Core Reagents Kit(PE AppliedBiosystems)分析总RNA样品，确定IL-20mRNA的相对水平。制备失控的IL-20转录产物，产生一条标准曲线用于定量。曲线由10倍系列稀释的从1e8到1e3IL-20全部mRNA的总拷贝数组成，对每个标准曲线点一式三份进行分析。还对皮肤的总RNA样品中人IL-20转录产物的水平一式三份进行分析，并分析hGUS的水平作为内部对照。对每一个RNA样品都进行TaqMan EZ RT-PCR反应(PE AppliedBiosystems)，总体积为25微升，其中含有：大约25纳克的溶于经DEPC处理的水(无DNA酶和RNA酶)中的总RNA；适宜的引物(大约800nM ZC40541(SEQ ID NO：25)和ZC40542(SEQ ID NO：26))；适宜的探针(大约100nM ZC40544(SEQ ID NO：27))；lXTaqMan EZ缓冲液；3mM醋酸锰；d-CTP、d-ATP和d-GTP各300μM；d-UTP600μM；r Tth DNA聚合酶(0.1U/μl)；以及AmpErase UNG(0.01U/μl)。PCR热循环的条件如下：起始的UNG处理步骤50℃2分钟1个循环；接着是逆转录(RT)步骤，60℃30分钟1个循环；接着是使UNG失活步 骤，95℃5分钟1个循环；然后是94℃20秒以及60℃1分钟扩增进行40个循环。
使用标准曲线的方法，根据生产商PE Biosystems的描述(UserBulletin#2：ABI Prism7700Sequence Detection System，RelativeQuantitation of Gene Expression，1997-12-11)，测定IL-20RNA的相对水平。使用hGUS的测量值对IL-20水平进行标准化。
在皮肤样品中可以检测到低水平的IL-20mRNA(大约800拷贝)。相反，在来自特应性皮炎的病人的皮肤中IL-20mRNA有上调(大约8600拷贝)。在人的正常和患病皮肤中，IL-20受体亚基，包括IL-20RA、IL-22RA以及IL-20RB都有表达。这些数据支持了IL-20与人特应性皮炎有强烈的疾病相关性。在人特应性皮炎皮肤处显示有IL-20的过量表达，提示人特应性皮炎中有IL-20参与。而且，如这里所描述的，IL-20在转基因小鼠中的过量表达显示了表皮增厚以及免疫细胞参与其中，这是特应性皮炎表型的指示。这样的体内数据进一步提示在特应性皮炎中有IL-20参与。这样，IL-20活性的拮抗剂，例如本发明的抗人IL-22RA单抗及其可溶性受体和抗体，以及抗IL-20中和性和单克隆抗体，在炎症性疾病例如特应性皮炎以及其他本文公开的病症的治疗性治疗中可用作IL-20的拮抗剂。
实施例23
由IL-20导致的IL-8的上调
将第2代正常人表皮新生角质细胞(NHEK)(来自Clonetics)铺板，并在12孔组织培养板上生长至密集。KGM(角质细胞生长培养基)购自Clonetics。当细胞达到密集时，使用不含生长因子的KGM培养基即KBM(角质细胞基本培养基)漂洗。在KBM中使细胞进行血清饥饿72小时，然后加入待测的化合物。1I.U./mL凝血酶和25nM的胰 蛋白酶作为阳性对照。每孔加入1毫升的培养基。只用KBM作为阴性对照。
在KBM培养基中配制IL-20，并以不同的浓度加入到实验中：第一个实验中从2.5μg/ml到618ng/mL；第二个实验中从2.5μg/mL到3ng/mL。
将细胞在37℃5％二氧化碳中孵育48小时。除去上清，在-80℃冷冻多日后检测IL-8和GM-CSF的水平。根据生产商的说明书，使用人IL-8免疫检测试剂盒#D8050(RandD Systems，Inc.)以及人GM-CSF免疫检测试剂盒#HSGMO(RandD Systems，Inc.)，测定细胞因子的产生。
结果表明IL-8和GM-CSF的表达受IL-20诱导。
实施例24
IL-20导致炎症性细胞因子的上调
将人角质细胞系HaCaT在T-75组织培养瓶中于37℃培养数日，至达到密集之后。这时除去正常的生长培养基(DMEM+10％FBS)，换入无血清的培养基。然后在37℃孵育细胞2天。然后除去DMEM，每个处理使用4瓶细胞，分别使用下面的条件进行处理，在37℃孵育4小时：5ng/mL的重组人(rh)IL-1α、20ng/mL的rhIL-1α、5ng/mL的rh IL-1α+1μg/mL的IL-20、1μg/mL的IL-20或者10ng/mL的rhIL-10。
细胞因子处理之后，除去培养基，使用硫氰酸胍溶液裂解细胞。通过氯化铯梯度离心过夜，从细胞裂解物中提取总RNA。第二天将RNA沉淀用TE/SDS溶液重悬并且用乙醇沉淀。使用分光光度计对RNA进 行定量，然后根据Clontech’s AtlasTMcDNA Expression Arrays UserManual(version PT3140-1/PR9X390，1999-11-5出版)的V.B.部分对RNA进行DNA酶处理。根据由分光光度计的读数计算得到的纯度以及琼脂糖凝胶电泳的观察确证RNA样品的质量。使用PCR分析RNA样品中的β肌动蛋白基因，由此排出基因组DNA的污染。
使用Clontech的polyA+富集、探针合成以及AtlasTM阵列杂交的方法(参见上面，以及AtlasTMPure Total RNA Labeling System UserManual，PT3231-1/PR96157，1999-6-22出版)。简而言之，使用被链亲和素包被的磁珠(Clontech，Paolo Alto，CA)和磁性颗粒分离器从50毫克的总RNA中分离出polyA+RNA。然后通过RT-PCR使用α32P-dATP对PolyA+RNA进行标记。在反应中使用Clontech的CDS引物，这些引物对AtlasTM人细胞因子/受体阵列(目录编号7744-1)中的268个基因是特异的。标记的探针用柱层析的方法分离，然后用液闪计数。
对AtlasTM阵列使用Clontech ExpressHyb加100mg/mL热变性的鲑精DNA进行预杂交，在68℃下不断摇动下预杂交至少30分钟。用1.9x106CPM/mL(总计1.14x107CPM)对膜在68℃杂交过夜，不断摇动。第二天，用2X SSC、1％SDS68°C漂洗膜4次，每次30分钟，然后用0.1X SSC、0.5％SDS68℃漂洗膜1次30分钟，最后在室温下用2X SSC洗膜一次5分钟。将阵列的膜置于Kodak塑料袋内密封，并且对磷光成像屏(phosphor imager screen)在室温下曝光过夜。第二天用磷光成像仪扫描磷光屏，使用Clontech的AtlasImageTM1.0软件进行分析。
被IL-20上调的基因
1.肿瘤坏死因子(TNF)被IL-20上调1.9-2.4倍；
2.胎盘生长因子1&2(PLGF)被IL-20上调1.9-2.0倍；
3.凝血因子II受体被IL-20上调2.0-2.5倍；
4.降钙素受体被IL-20上调2.2-2.3倍；
5.TNF诱导型透明质酸结合蛋白TSG-6被IL-20上调2.1-2.2倍；
6.血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体-1前体，酪氨酸蛋白激酶受体(FLT-1)(SFLT)被IL-20上调2.1-2.7倍；
7.MRP-8(巨噬细胞中的钙结合蛋白，MIF相关的)被IL-20上调2.9-4.1倍；
8.MRP-14(巨噬细胞中的钙结合蛋白，MIF相关的)被IL-20上调3.0-3.8倍；
9.松弛素H2被IL-20上调3.14倍；
10.转化生长因子β(TGFβ)受体III300kDa被IL-20上调2.4-3.6倍；
与IL-20+IL-1处理表现出协同性的基因：
1.骨形成蛋白2a在用IL-20单独处理时上调1.8倍，用IL-1单独处理时上调2.5倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调8.2倍。
2.MRP-8在用IL-20单独处理时上调2.9倍，用IL-1单独处理时上调10.7倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调18.0倍。
3.红细胞分化蛋白(EDF)在用IL-20单独处理时上调1.9倍，用IL-1单独处理时上调9.7倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调19.0倍。
4.MRP-14(巨噬细胞中的钙结合蛋白，MIF相关的)在用IL-20单独处理时上调3.0倍，用IL-1单独处理时上调12.2倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调20.3倍。
5.肝素结合性类EGF生长因子在用IL-20单独处理时上调2.0倍，用IL-1单独处理时上调14倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调 25.0倍。
6.β-血小板球蛋白样蛋白在用IL-20单独处理时上调1.5倍，用IL-1单独处理时上调15倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调27倍。
7.脑源神经营养因子(BDNF)在用IL-20单独处理时上调1.7倍，用IL-1单独处理时上调25倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调48倍。
8.单核细胞趋化和激活因子MCAF在用IL-20单独处理时上调1.3倍，用IL-1单独处理时上调32倍，用IL-20和IL-1共同处理时上调56倍。
实施例25
IL-20转基因表型
使用各种不同的启动子在转基因小鼠中过量表达人和小鼠的IL-20。开始使用肝脏特异性的小鼠白蛋白启动子指导人IL-20的表达，以试图获得循环水平的蛋白。接下来的研究使用角蛋白14(K14)启动子，它主要将表达靶向到表皮和其他复层扁平上皮；小鼠金属硫蛋白1启动子，它有广泛的表达型式；EμLCK启动子，它驱动蛋白在淋巴谱系的细胞中表达。在所有四种情况中得到了相似的结果，这可能是由于这些启动子都导致了循环水平的IL-20表达。
在所有的情况中，表达IL-20转基因的转基因幼仔都比非转基因的同窝幼仔小，具有光亮的外表，绷紧多皱的皮肤，并且在出生后头几天内死亡。幼仔的胃内有奶，表明它们能够吮吸。这些小鼠有肿胀的四肢、尾、鼻孔和嘴部区域，并且移动困难。此外，小鼠非常赢弱，缺少可见的脂肪组织，并且耳和脚趾的发育延迟。在肝脏中低水平的表达(小于100个mRNA分子/细胞)就足以导致新生幼仔致死和皮肤的异常。无可见表型的转基因小鼠或者没有表达转基因，或者表达水 平在可检测的水平以下，或者是嵌合体。
对IL-20转基因小鼠的皮肤进行组织分析显示，与非转基因的同窝小鼠比较，转基因小鼠表皮增厚、过度角化以及致密的角质层。有时观察到浆细胞痂(结痂)。对转基因小鼠皮肤的电子显微镜分析显示有线粒体内的类脂包含体，具斑点的角质透明蛋白颗粒以及相当少的张力细丝(与在人牛皮癣皮肤和小鼠皮肤病模型中观察到的相似)。此外，许多转基因小鼠具有凋亡的胸腺淋巴细胞。组织病理分析没有发现其他的异常。这些组织学和电镜结果支持并且扩展了观察到的大体皮肤改变。
实施例26
用于表达可溶性人IL-22RA-muFc的表达载体的构建
制备含有IL-22RA的细胞外结构域与小鼠γ2a重链Fc区(mG2a)相融合的人IL-22RA可溶性受体-muFc融合蛋白(命名为IL-22RA-C(mG2a))。通过同源重组，使用两个独立的DNA片段和表达载体pZMP40，构建含有IL-22RA-C(mG2a)的表达质粒。使用下面的引物，通过PCR扩增产生IL-22RA(SEQ ID NO：1)和mG2a(SEQ IDNO：39)的多核苷酸序列片段：(a)IL-22RA引物ZC45，593(SEQ IDNO：28)，和ZC45，592(SEQ ID NO：29)；以及(b)mG2a引物ZC45，591(SEQ ID NO：30)，和ZC45，594(SEQ ID NO：31)。
第一片段含有IL-22RA细胞外结构域编码区，它是使用IL-22RA多核苷酸(例如SEQ ID NO：1)作为模板制备的。该第一片段包括与部分的pZMP40载体序列有所重叠的5′端、IL-22RA片段以及含有接头序列和部分mG2a序列的3′重叠部分。PCR条件：1个循环，94℃，5分钟；35个循环，94℃，1分钟，55℃，2分钟，72℃，3分钟；1个循环，72℃，10分钟。
第二片段包括与接头序列和部分IL-22RA序列有所重叠的5′端、mG2a片段以及含有部分pZMP40载体序列的3′重叠部分。小鼠γ2a重链Fc区(mG2a)(SEQ ID NO：39)是由小鼠Igγ2a重链cDNA的克隆产生的。mG2a含有小鼠免疫球蛋白γ2a重链恒定区的铰链、CH2和CH3结构域。PCR条件：1个循环，94℃，5分钟；35个循环，94℃，1分钟，55℃，2分钟，72℃，3分钟；1个循环，72℃，10分钟。
对PCR反应混合物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquickTMGelExtraction Kit(Qiagen)凝胶提取对应于插入物大小的条带。
将用Bg1II切割后的pZMP40质粒用于与两个PCR插入片段进行三向重组。pZMP40质粒是一种哺乳动物表达载体，其中含有表达盒，该表达盒具有MPSV启动子以及用于插入编码序列的多克隆位点；大肠杆菌复制起点；哺乳动物选择标记基因表达单元(包含SV40启动子、增强子、复制起点、DHFR基因以及SV40终止子)；以及在S.cerevisiae中筛选和复制所需的URA3和CEN-ARS序列。pZMP40质粒是通过向pZMP21(保藏在美国典型培养物保藏中心，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209，编号为PTA-5266)的多克隆位点中加入几个限制性酶切位点而构建的。
将100微升的感受态酵母(S.cerevisiae)细胞分别与10微升插入物DNA和100纳克切割后的pZMP40载体混和，将混合物转移到0.2厘米的电穿孔小杯中。对酵母/DNA混合物使用电源(BioRadCaboratories，Hercules，CA)设置0.75kV(5kV/cm)，无穷大欧姆，以及25μF进行电击。向小杯中加入600微升的1.2M山梨醇，取100微升和300微升电击产物涂布与两块URA-D平板上，30℃孵育。大约72小时后，将来自一个平板中的Ura+酵母转化子用1毫升水重悬，轻微离心沉淀酵母细胞。细胞沉淀用0.5毫升裂解缓冲液(2％Triton X-100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA) 重悬。将500微升的裂解物加入到含有250微升用酸洗过的玻璃珠和300微升酚-氯仿的Eppendorf管内，旋涡振荡3分钟，在Eppendorf离心机内以最大速度离心5分钟。将300微升的水相转移到干净的管内，用600微升乙醇和30微升3M醋酸钠沉淀DNA，然后以最大速度离心30分钟。倾去上清，用1毫升70％乙醇洗涤沉淀。倾去上清，用30微升TE重悬DNA沉淀。
使用5微升的酵母DNA提取物和50微升的细胞转化电感受态大肠杆菌宿主细胞(DH12S)。在2.0kV，25μF，和400ohms下电击细胞。电穿孔后，加入1毫升的SOC(2％BactoTM胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0.5％酵母提取物(Difco)，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖)，然后取50微升和200微升细胞涂布于两块LB氨苄青霉素平板上(LB培养基(Lennox)，1.8％BactoTM琼脂(Difco)，100mg/L氨苄青霉素)。
对用于构建体的三个克隆的插入物进行序列分析。对于每一个构建体选择一个含有正确序列的克隆。使用商品化的试剂盒(QIAGENPlasmid Mega Kit，Qiagen，Valencia，CA)，根据生产商的说明书进行大规模质粒DNA分离。
实施例27
人可溶性IL-22RA-muTc多肽的表达和纯化
将三组200微克的IL-22RA-C(mG2a)构建体(实施例22)分别使用200单位PvuI在37℃酶切3小时，然后使用IPA沉淀，离心沉淀于1.5毫升微型离心管内。倾去上清，沉淀用1毫升70％乙醇洗涤，然后在室温孵育5分钟。将离心管在微量离心机内14000rpm离心10分钟，倾去上清。在无菌环境中将沉淀用750微升的PF-CHO培养基重悬，60℃孵育30分钟。在三只管内，每管沉淀5E6APFDXB11细胞， 使用DNA培养基溶液重悬。将DNA/细胞混合物置于0.4厘米缺口小杯中，使用以下的参数进行电击：950μF、高电容、300伏。将小杯中的内容物取出，混和并用PF-CHO培养基稀释至25毫升，置于125毫升的摇瓶中。将摇瓶置于培养箱内的振荡器上，37℃，6％CO2120rpm振荡孵育。
对细胞系进行营养选择，之后是逐步扩增，其中氨甲蝶呤(MTX)的浓度从100nM提高到500nM最后到1μM。之后进行CD8细胞分选。使用稳定的经1μM MTX扩增的混合物，采用单克隆FITC抗CD8抗体(BD PharMingen，cat#30324X)，在生产商推荐的浓度下对约5E6细胞进行适当染色，完成CD8细胞分选。对染色的细胞在FACS Vantage(BD)流式细胞仪上进行处理和分选。收集上面的5％细胞并对其进行培养。使用Western印迹对表达进行确证，将细胞系进行放大培养，并使用标准方法进行蛋白纯化。
实施例28
来自免疫接种了huIL22RA-mG2a的小鼠的血清中和huIL-22RA
A.利用基于细胞的中和试验测试对IL-20和/或IL-22的抑制。使用经IL-22RA和IL-20RB(pDIRS1)共转染的依赖于因子的前B细胞系BaF3(BAF/IL-22RA/IL-20RB细胞；实施例38)，通过拮抗在IL-22RA/IL-20RB受体上的IL-20，评价抗IL-22RA抗体的中和能力。类似地，使用经IL-22RA和IL-10RB(CRF2-4)共转染的BaF3(BAF/IL-22RA/CRF2-4细胞；实施例2)，通过拮抗在IL-22RA/IL10RB受体上的IL-22，评价抗IL-22RA抗体的中和潜力。使用实施例3中描述的AlamarBlue检测，评价在IL-20或IL-22分别存在时，分别表达IL-20和IL-22的细胞系的增殖以及在拮抗剂抗体存在时对这种增殖的抑制。在这一检测中，对这些细胞增殖的抑制是中和活性的指示。
B.在基于细胞的中和试验中，抗IL-22RA抗血清中和IL-20和IL-22二者。使用实施例28A中描述的检测，对来自免疫接种了huIL-22RA-muG2a的IL-22RA敲除小鼠(实施例30(A)(1))的血清进行系列稀释(1％，0.5％，0.25％，0.13％，0.06％，0.03％，0.02％，和0％)并加入。检测培养板在37℃，5％CO2中孵育4天，此时加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)，每孔20微升。然后在37℃，5％CO2条件下再培养板16小时。Alamar Blue根据活细胞的数目给出荧光计量读数，这样与阴性对照相比就是对细胞增殖的直接量度。在WallacVictor21420Multilabel Counter(Wallac，Turku，Finland)上读板，波长是530纳米(激发)和590纳米(发射)。结果表明，来自所有七只免疫动物的血清都能够中和huIL-22和huIL20通过huIL-22RA的信号传导。例如，在浓度为1％时，来自五只动物(16517，16518，16519，16520，和16527)的血清完全中和了由huIL-22诱导的增殖，在更低浓度下对增殖的抑制表现出以剂量依赖的形式降低。而且，在浓度为1％时，来自其他两只动物(16471和16701)的血清抑制了由huIL-22导致的增殖的约90％，在更低浓度下对增殖的抑制表现出以剂量依赖的形式降低。类似地，在浓度为1％和0.5％时，来自五只动物(16517，16518，16519，16520，和16527)的血清完全中和了由huIL-20诱导的增殖，在更低浓度下对增殖的抑制表现出以剂量依赖的形式降低。而且，在浓度为1％时，来自动物16701的血清完全中和了由huIL-20诱导的增殖，在更低浓度下对增殖的抑制表现出以剂量依赖的形式下降。在浓度为1％时，来自动物16471的血清中和了由huIL-20诱导的增殖的大约95％，在更低浓度下对增殖的抑制表现出以剂量依赖的形式下降。因此，来自所有七只动物的血清都能够中和IL-22或IL20通过huIL-22RA受体诱导的增殖。这些结果进一步表明了针对IL-22RA的抗体的确能够在低浓度下拮抗促炎配基IL-20和IL-22的活性。
这些结果提供了额外的证据表明，通过结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20或IL-22的活性(单独或者共同)对IL-22RA活 性进行有效阻断，例如经由本发明的针对IL-22RA的中和性单克隆抗体，在减轻IL-20和IL-22的体内作用(单独或者共同)方面可能是有益的，并且可能减轻IL-20和/或IL-22诱导的炎症，例如在IL-20诱导的皮肤病患中以及IL-22诱导的皮肤病患中，例如在牛皮癣、IBD、结肠炎或者其他由IL-20和/或IL-22诱导的炎症性疾病，包括IBD、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎症性皮肤病患以及特应性皮炎。
实施例29
P815/hIL-22RA细胞的产生和对小鼠的免疫接种
A.P815/hIL-22RA细胞的产生和注射小鼠以产生抗hIL-22RA抗体
根据生产商的方案(Roche，Indianapolis，IN)，使用FugeneReagent，用包含hIL-22RA cDNA序列(例如SEQ ID NO：1)以及可选择的嘌呤霉素抗性标记的质粒载体转染野生型P815细胞(ATCC编号TIB-64)。转染后，将细胞置于嘌呤霉素上选择48小时。通过有限稀释法克隆抗嘌呤霉素的转染子，使用生物素化的人IL-22(huIL-22-生物素)，通过流式细胞术筛选转染子的hIL-22RA细胞表面表达水平。简而言之，在冰上使细胞与5μg/ml huIL-22-生物素共同孵育30分钟，然后漂洗。使用1：500稀释的PE-标记的链亲和素检测huIL-22-生物素与细胞的结合。在Facscan流式细胞仪上分析细胞，使用Cellquest软件(Becton Dickinson，San Jose，CA)。
令选出的P815/IL-22RA细胞生长，然后收获用于注射。收获细胞，用PBS漂洗三次，计数，重悬至密度为每毫升1x108个细胞，用10,000rads辐射。然后将细胞悬液转移至1毫升的注射器中，通过腹腔内途径注射到DBA/2小鼠体内。3周后以同样方式加强免疫小鼠，对血清筛选其与hIL-22RA转染细胞系相结合的能力。简而言之，用 Facs缓冲液(HBSS，2％BSA，0.02％NaN3)将血清稀释1：100，然后与Fc封闭的过量表达hIL-22RA的293人肾细胞一起孵育。然后使用缀合了荧光素的山羊抗小鼠IgG(Southern Biotech，Birmingham，AL)(1:200稀释)检测抗IL-22RA抗体与细胞的结合。按照前面的描述分析细胞。再次加强免疫小鼠一共3次，如上所述筛选血清。根据其血清与hIL-22RA转染细胞相结合的水平选择两只小鼠用于杂交瘤融合，使用本领域内标准的方法用于产生单克隆抗体(实施例25)。
以上的方法还用于产生表达杂二聚IL-22RA受体、例如IL-22RA/CRF2-4(P815/IL-22RA/CRF2-4细胞)，IL-22RA/pDIRS1(P815/IL-22RA/pDIRS1细胞)，或者IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1(P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1细胞)的P815细胞，用于例如免疫接种小鼠，产生抗IL-22RA的单克隆抗体和抗包含IL-22RA的杂二聚受体的抗体。
实施例30
鼠抗人IL-22RA(IL-22RA)单抗的产生
A.免疫接种产生抗IL-22RA抗体
(1)使用可溶性IL-22RA-muFc
对6-12周大的IL-22RA敲除小鼠(实施例26)通过腹腔内注射免疫接种25-50微克的可溶性人IL-22RA-muFc蛋白(实施例23)与Ribi佐剂(Sigma)的1:1(v:v)混合物，每两周免疫一次。第三次免疫接种后7-10天，通过后眼窝取血的方式取血样，收获血清并且用中和试验(例如本文描述的)测定其抑制IL-22或者IL-20和IL-22二者与IL-22RA相结合的能力，以及用FACS染色测定法对转染了IL-22RA的293细胞与未转染的293细胞染色的能力。根据上面的描述持续免疫接种小鼠并且取血样和测定，直至中和滴度达到一个平台。那时通过血管内途径向具有最高中和滴度的小鼠注射25-50微克的可 溶性IL-22RA-Fc蛋白质(溶于PBS中)。三天后，从这些小鼠获得脾脏和淋巴结用于产生杂交瘤，例如使用小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或者本领域内其他适当的细胞系，采用本领域内已知的标准方法(例如参见Kearney，J.F.et al.，JImmunol. 123：1548-50，1979；and Lane，R.D.J Immunol Methods81：223-8，1985)。
(2)使用表达IL-22RA受体的R815转染细胞
通过腹腔内注射1x105个活的转染P815细胞，例如P815/IL-22RA细胞，P815/IL-22RA/CRF2-4，P815/IL-22RA/pDIRS1或P815/IL-22RA/CRF2-4/pDIRS1细胞(实施例24)(例如0.5毫升中，细胞密度为2x105个细胞/毫升)，对6-10周大的雌性DBA/2小鼠进行免疫。注射以前，将细胞维持在对数生长期内。注射时，收获细胞，用PBS漂洗三次，然后重悬于PBS中，至密度为2x105个细胞/毫升。在这个模型中，小鼠在2-3周内产生腹水肿瘤，如果没有事先激发对所转染的靶抗原的免疫应答，则小鼠在4-6周时死亡。在三周时没有明显腹部肿大(腹水肿瘤的指示)的小鼠根据上述以2-3周的间隔重新免疫接种。第二次免疫接种后7-10天，通过眼后采血取血样，收获血清，并且用中和试验(例如本文描述的)测定其抑制IL-22或者IL-20和IL-22二者与IL-22RA相结合的能力，以及用FACS染色测定法测定其使转染了IL-22RA的293细胞相对于未转染的293细胞染色的能力。根据上面的描述持续免疫接种小鼠，并且取血样和测定，直至中和滴度达到一个平台。那时，通过腹腔内途径向具有最高中和滴度的小鼠注射1x105个活的经转染的P815细胞。四天后，从这些小鼠收获脾脏和淋巴结，用于产生杂交瘤，例如使用小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或者本领域内其他适当的细胞系，利用本领域内已知的标准方法(例如参见Kearney。J.F.et al.，同前；以及Lane，R.D.同前)。
以上使用活的经转染P815细胞进行的免疫接种方案的一个替代途径是每2-3周腹膜内注射1-5x106个辐射的转染细胞。在这种方式中，没有动物产生腹水并且由于腹水死亡。相反，从第二次免疫接种后的采血开始，根据上面概述的方法监测动物血清对于IL-22RA的中和性免疫应答。一旦中和滴度达到最大水平，即对具有最高滴度的小鼠进行预融合，腹腔内注射5x106个经辐射的细胞，四天后从这些小鼠获得脾脏和淋巴结用于产生杂交瘤，例如使用小鼠骨髓瘤(P3-X63-Ag8.653.3.12.11)细胞或者本领域内其他适当的细胞系，使用本领域内已知的标准方法(例如参见Kearney，J.F.et al.，同前；以及Lane，R.D.同前)。
B.筛选杂交瘤融合细胞是否产生能够结合IL-22RA并且能够抑制IL-22与IL-22RA相结合的抗体
在融合后8-10天对杂交瘤上清进行两个不同的初筛。在第一个检测中，通过ELISA检测上清中的抗体与结合在板上的可溶性人IL-22RA-muFc蛋白质相结合的能力，其中使用缀合了HRP的山羊抗小鼠κ和抗λ轻链作为二抗，检测结合的小鼠抗体。为了证明IL-22RA-muFc蛋白中的IL-22RA部分的特异性，用与相同的小鼠Fc区(mG2a)相融合的无关蛋白来检查在第一个检测中的阳性上清。在可与IL-22RA-muFc结合而不与含有无关muFc的融合蛋白结合的那些上清中的抗体被认为是对IL-22RA特异的抗体。对于第二个检测，用ELISA检查所有杂交瘤上清中的抗体抑制生物素化的人IL-22与结合在板上的IL-22RA-muFc相结合的能力。
接下来检测所有含有与IL-22RA特异性结合的抗体的上清抑制IL-20或者IL-22分别与经IL-22RA/IL-20RB和IL-22RA/CRF2-4转染的Baf3细胞相结合(以及同时的促增殖效果)的能力，而不论这些血清在ELISA检测中是否抑制IL-22与IL-22RA的结合。随后对在IL-22抑制检测中或者在IL-20和IL-22两种抑制检测中呈中和阳性的上清 通过FACS分析评估其相对于未转染的Baf3细胞而使经IL-22RA转染的细胞染色的能力。设计这个分析的目的是确证对IL-22与IL-22RA/CRF2-4的结合的抑制或者对IL-20与IL-22RA/IL-20RB结合的抑制的确是由于与IL-22RA受体特异结合的抗体所致。此外，因为FACS分析是使用抗IgG的二抗进行的，特异的FACS阳性结果表明中和抗体可能是IgG类的。通过这些方式鉴定出一个主孔，它在板结合型ELISA中与IL-22RA相结合，在基于ELISA的抑制试验中抑制IL-22与IL-22RA的结合，阻断IL-20或者IL-22分别与经IL-22RA/IL-20RB和IL-22RA/CRF2-4转染的Baf3细胞的相互作用(实施例28)，并且在对经IL-22RA/IL-20RB和IL-22RA/CRF2-4转染的Baf3细胞的染色中呈现强阳性(使用抗小鼠IgG作为二抗)。
D产生抗IL-22RA特异抗体的杂交瘤的克隆
使用标准的低密度稀释(每孔内小于一个细胞)法克隆生成抗IL-22RA单抗(该单抗交叉中和IL-20和IL-22与适当转染的BaF3细胞的结合)的杂交瘤。在铺板后约5-7天，使用ELISA在板结合型人IL-22RA-muFc上对克隆进行筛选，然后根据上面的描述对阳性细胞用ELISA使用含有无关muFc的融合蛋白进行再检测。对选出的、其上清与IL-22RA-muFc结合而不与含有无关muFc的融合蛋白相结合的克隆进一步通过重复中和试验以及FACS分析而确证其中的特异抗体活性。所有选出的IL-22RA抗体阳性克隆均至少克隆两次以确保其无性系形成能力，并且评估抗体产生的稳定性。进行进一步的多轮克隆，并且根据描述进行筛选，直至优选地至少95％的所得克隆对于产生中和性抗IL-22RA抗体是阳性的。
E.被抗IL-22RA单抗识别的分子的生化特性研究
对于被推定的抗IL-22RA单抗所识别的目标分子的确是IL-22RA进行的生化确证是用标准的免疫沉淀步骤、然后进行SDS-PAGE分析或者Western印迹步骤进行的，其中都使用了来自经IL-22RA转染的 Baf3细胞和未转染Baf3细胞的可溶性膜制备物。而且，使用表达IL-22RA的未转染细胞系的可溶性膜制备物来表明该单抗可以识别天然的受体链以及转染的受体链。或者，检测单抗特异性免疫沉淀或者Western印迹可溶性IL-22RA-muFc蛋白的能力。
实施例31
来自注射了被huIL22RA所转染的P815细胞的小鼠的血清对huIL22RA的中和
使用实施例28中描述的基于细胞的中和试验，将来自注射了活的经huIL-22RA转染的P815细胞的小鼠的血清(实施例30.A.2)进行系列稀释(1％，0.5％，0.25％，0.13％，0.06％，0.03％，0.02％，和0％)并加入。检测培养板在37℃，5％CO2中孵育4天，此时加入AlamarBlue(Accumed，Chicago，IL)，每孔20微升。然后在37℃，5％CO2条件下再培养板16小时。结果表明来自四只动物的血清能够中和huIL-22和huIL20二者通过huIL-22RA的信号传导。
在浓度为1％时，来自六只动物(7125，7127，7128，7118，7124和7117)的血清中和了由huIL-22诱导的增殖的50％-80％，在更低浓度下对增殖的抑制以剂量依赖的形式下降。而且，在浓度为1％时，来自四只动物(7125，7127，7118，和7117)的血清中和了由huIL-20诱导的增殖的40％-70％，在更低浓度下对增殖的抑制以剂量依赖的形式下降。这些结果进一步表明了针对IL-22RA的抗体的确可以在低浓度下拮抗促炎配基IL-20和IL-22的活性。
这些结果提供了额外的证据，表明了通过结合、阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20或IL-22的活性(单独或者共同)而对IL-22RA活性进行有效阻断，例如经由本发明的针对IL-22RA的中和性单克隆抗体，在减轻IL-20和IL-22的体内作用(单独或者共同)方面可能 是有益的，并且可能减轻IL-20和/或IL-22诱导的炎症，例如在IL-20诱导的皮肤病患中以及IL-22诱导的皮肤病患中所观察到的那些，例如在牛皮癣、I BD、结肠炎或者其他由IL-20和/或IL-22诱导的炎症性疾病，包括IBD、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎症性皮肤病患以及特应性皮炎。
实施例32
IL-22RA敲除小鼠的表型
A.携带遗传改变的小鼠的产生
1.表达鼠IL-20、具有出生后光亮外表的转基因小鼠的产生
a)通过K14启动子表达小鼠IL-20的构建体
为了研究IL-20的体内生物学功能，制备转基因构建体，其中小鼠的IL-20在人K14启动子的控制下(还参见实施例21)。设计寡核苷酸，使之产生含有共有Kozak序列和小鼠IL-20编码区的PCR片段。将这些寡核苷酸设计成在其5′端有FseI位点，在3′端有AscI位点，以帮助其克隆到pRSK14中。pRSK14是一个标准的转基因载体，含有人角质细胞和表皮细胞特异性启动子。
使用200ng鼠IL-20模板(SEQ ID NO：33)以及设计的寡核苷酸，通过PCR反应扩增出全长的IL-20(SEQ ID NO：34)。使用本领域内知的方法确定PCR的反应条件。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，使用QiaQuickTM(Qiagen)凝胶提取试剂盒纯化产物。将分离的、正确大小的DNA片段使用FseI和AscI(Boerhinger-Mannheim)进行酶切，乙醇沉淀并且连接到事先经FseI和AscI酶切好的pRSK14中。pRSK14质粒被设计成在转基因小鼠中的角质细胞和表皮细胞中表达目标基因，它含有侧翼为大约3kb人角蛋白特异性K14启动子的表达盒。
根据生产商的指导，将大约1微升的连接产物电穿孔转化到DH10BElectroMaxTM感受态细胞(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)中，将转化后的细胞涂在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，孵育过夜。挑取克隆并在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上培养。从挑取的克隆微量制备DNA，通过使用FseI和AscI联合酶切和琼脂糖凝胶电泳筛选小鼠IL-20插入物。对具有正确cDNA插入物的转基因构建体通过序列分析进行确证。对正确的pRSK14-小鼠IL-20进行大量制备。
b)K14IL-20转基因小鼠的产生及其鉴定
从含有角蛋白特异性K14启动子的5′和3′侧翼序列、小鼠IL-20(SEQ ID NO：33，多肽在SEQ ID NO：34中显示)，Gormon内含子、IL-20cDNA以及人生长激素polyA信号序列的转基因(TG)载体中分离出大约4kb长的NotI片段。将它显微注射到受精的B6C3f1(Taconic，Germantown，NY)小鼠卵细胞中，微注射和转基因小鼠的制备根据Hogan，B.et al.Manipulating the Mouse Embryo，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，1994中的描述进行。
使用TaqManTMRT-PCR反应对TG RNA的表达进行定量，其中使用对转基因中的人生长激素polyA信号部分特异的PCR引物。
所有表达IL-20的TG构建体显示了高的出生死亡率，并且生下来的TG幼仔通常表现出“光亮的”表型。新生幼仔的光亮外表看起来与皮肤的硬化有关，皮肤好像快要干了，导致正常哺育的下降。它们的行动一般变得僵化。从组织病理学角度看，光亮的幼仔具有增厚的表皮，且角蛋白层致密。这些光亮的原源种幼仔中大多数在头5天内死亡，存活的和断奶的幼仔一般不表达转基因(根据转录产物分析得出)或者它们是嵌合体(转基因向后代的传递很低)。
已确立了一个由K14启动子控制表达小鼠IL-20的品系。其皮肤 和胸腺中的表达水平低，所有新生的幼仔出生时都有光亮的表型。一般而言，这个品系有20％的TG后代，表明50-60％的转基因幼仔在子宫内死亡。(在一个半合子交配中，后代的50％应该是TG。)
2.没有IL-22RA表达的小鼠的产生：IL-22RA敲除小鼠
a)小鼠IL-22RA敲除(KO)构建体的制备
为了进一步研究IL-22RA的体内生物学功能，制备小鼠敲除(KO)品系以消除IL-22RA的表达。首先，使用小鼠IL-22RA cDNA探针筛选小鼠129/SvJ基因组BAC文库。确定含有IL-22RA基因组基因座的克隆并对其进行表征。小鼠IL-22RA多核苷酸序列见SEQ ID NO：41，多肽序列见SEQ ID NO：42。
使用ET克隆技术(Zhang et al.1998.A new logic for DNAengineering using recombinationin E.coli.Nat.Genet.Vol.20：123-8)制备敲除载体，以产生用于消除IL-22RA的敲除构建体。简而言之，KO载体含有1.8kb的IL-22RA基因5′臂(短臂)、IRES-LacZ/MClneo选择标记以及10kb的IL-22RA基因3′臂(长臂)。在KO载体中，IL-22RA基因组序列的外显子2、3和4以及内含子2和3被IRES-LacZ/MClneo选择标记取代，这样就通过同源重组在ES细胞中产生了大约4.4kb的缺失。
在使用限制性内切酶PmeI使KO载体线性化后，将其电穿孔转移到129/SvJ ES细胞中。同源重组事件的选择以及重组ES克隆的鉴定根据Robertson，E.J.et al.Teratocarcinomas and Embryonic StemCells：A Practical Approach，2nded.，IRL Press Limited，Oxford，1987中的描述进行。
b)消除了IL-22RA表达的小鼠的产生和分析
对IL-22RA基因组序列的外显子2、3和4以及内含子2和3被缺 失的阳性ES克隆进行扩增。将其注射到C57B1/6j小鼠的胚泡中。在经过注射的胚泡短暂重扩增之后，将其注射到假孕的养母体内，产生嵌合体。根据Robertson，E.J.et al.Teratocarcinomas andEmbryonic Stem Cells：A Practical Approach，2nded.，IRL PressLimited，Oxford，1987中的描述进行突变IL-22RA的胚泡注射、嵌合体小鼠繁育以及接下来的种系传递。
通过PCR基因定型鉴策略鉴定KO突变体小鼠。在多重PCR反应中使用三个PCR引物ZC22901(SEQ ID NO：35)，ZC45039(SEQ IDNO：36)，ZC38573(SEQ ID NO：：37)，检测野生型等位基因和突变等位基因。野生型(WT)等位基因产生的DNA片段长度为229bp，而突变等位基因产生的DNA片段长度为371bp。
半合子小鼠的配对产生正常比例的纯合子(HOM)、杂合子(Het)和野生型(WT)后代以及正常的性别比。通过PhysioScreen(收集体重、组织重量、全血计数、临床化学、大体观察和组织病理学)对小鼠进行检查，发现在HOM、Het和野生型动物之间没有明显区别。
B.IL-22RA对于IL-22诱导的SAA是必需的：SAA ELISA显示由IL-22诱导的SAA表达在IL-22RA敲除小鼠中没有出现
为了确定在注射了IL-22的小鼠中SAA的诱导是否需要IL-22RA，用5微克的IL-22注射IL-22RAKO小鼠，6小时后取血。
进行ELISA，以确定血清样品中的SAA水平，该ELI SA是根据生产商的说明使用小鼠SAA否Immunoassay Kit(BioSourceInternational，California)进行的，血清稀释至1：1000。五只WT小鼠中，四只显示出在IL-22注射后SAA水平升高，而五只HOMIL-22RAKO小鼠中，四只显示了基础SAA水平。所检查的两只Het IL-22RAKO小鼠都具有升高的SAA水平，但是其SAA水平低于SAA水平升高的WT 小鼠中的SAA水平。这表明IL-22RA对于IL-22诱导产生SAA是必需的。
这些结果提供了证据表明，有效地阻断IL-22RA活性，例如通过IL-22RA基因敲除或者类似地通过本发明的IL-22RA中和性单克隆抗体，可以类似地降低在例如牛皮癣、IBD、结肠炎、内毒素血症或者IL-22诱导的其它炎症疾病中由IL-22诱导的炎症。
C.IL-22RA对于IL-22诱导的表皮增厚所必需的：通过皮下植入的微型渗透压泵给予IL-22纯蛋白，不会导致IL-22RAKO小鼠发生表皮增厚。
为了确定IL-22RA对于IL-22诱导的表皮增厚是否是必需的，将IL-22通过微型渗透压泵经皮下途径向IL-22RAHOM和WTKO小鼠给药。泵投递IL-22的速率是18.4微升/天，连续给药7天。4只HOM和6只WT IL-22RAKO小鼠给予IL-22蛋白，而3只HOM和1只WT给予PBS。
在Baf3增殖试验中检测经IL-22处理的小鼠的血清样品，以确证IL-22的存在。经IL-22RA和CRF2-4转染的Baf3细胞需要IL-22或者小鼠IL3的存在才能增殖。将这些细胞离心并用不含mIL-3的完全培养基(RPMI培养基(JRH Bioscience Inc.，Lenexa，KS)，补充10％热灭活的胎牛血清，2mM L-glutaMax-1TM(Gibco BRL)，1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)，和PSN抗生素(GIBCO BRL))(在这以后称为“无mIL-3的培养基)漂洗。沉淀细胞并漂洗三次以确保mIL-3的除去。然后用血球计数仪计数细胞，将细胞置于96孔板中，5000细胞/孔，终体积为200微升/孔，使用无mIL-3的培养基。孔中小鼠血清的浓度是1％，0.5％，0.25％或0.125％。将检测培养板在37℃，5％CO2条件下孵育3天，这时加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)，每孔20微升。然后将板在37℃，5％CO2条件下再培养24小时。Alamar Blue根据活细胞的数目给出荧光计量读数，这样与阴性对照相比就是对细 胞增殖的直接量度。再将培养板置于37℃，5％CO2培养24小时。在Wallac Victor21420Multilabel Counter(Wallac，Turku，Finland)上读板，波长是544纳米(激发)和590纳米(发射)。结果显示没有一只经PBS注射的动物具有IL-22活性，而1只Het动物中的一只、4只HOM动物中的2只以及6只WT动物中的3只具有可检测的IL-22活性。在1ug/ml IL-22BP存在时阻断了血清诱导的增殖，证明了它是IL-22特异性的。
将来自经IL-22处理和未经处理的IL-22RA HOM、Het敲除(KO)和WT对照小鼠的皮肤样品在10％缓冲福尔马林中浸没固定。将组织进行修剪，包埋在石蜡中，按常规处理，以5微米切片(Jung2065Supercut microtome，Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)，用H&E染色。染色的组织由ACVP委员会授予证书的兽医病理学家在光学显微镜(Nikon Eclipse E600，Nikon Inc.，Melville，NY)下观察。
对每一个皮肤样品按照0(没有)到4(严重)的级别检查其皮下泵植入位置周围的组织中炎症的严重程度，按照0(没有)到3(弥散)的级别检查表皮增厚(棘皮症)的程度，在表皮的最厚部分计数表皮层的数目。在给予PBS的HOM小鼠和WT小鼠之间没有差异。这两个组的结果混和在一起成为一个PBS组的结果。计算每一个处理组的平均值和标准差，在下面的表14中列出。
表14
| 处理 | PBS对照 | HOM KO：IL-22 | WT：IL-22 |
| 小鼠数 | 4 | 4 | 6 |
| 表皮厚度 | 3.5±1.0 | 3.2±0.5 | 5.9±2.3 |
| 棘皮症程度 | 0.5±1.0 | 0.2±0.5 | 1.9±1.3 |
| 炎症 | 1.5±1.0 | 1.2±1.0 | 2.0±1.0 |
结果显示，在接受IL-22处理的WT小鼠中表皮厚度和棘皮症有增加的趋势，而IL-22RA HOM小鼠在接受IL-22处理时其表皮增厚和棘皮症较少。
这些结果提供了证据表明，有效地阻断IL-22RA活性，例如通过IL-22RA基因敲除或者类似地通过本发明的IL-22RA中和性单克隆抗体，可以类似地降低在例如牛皮癣、IBD、结肠炎、或者IL-22诱导的其他炎症疾病中的皮肤病患。
D.IL-22RA对于IL-20诱导的新生幼仔光亮皮肤是必需的：表达小鼠IL-20的转基因小鼠和IL-22RA KO小鼠交配产生没有光亮皮肤的转基因幼仔
为了确定IL-22RA对于IL-20诱导的新生转基因幼仔的光亮皮肤是否是必需的，将K14muIL-20转基因杂交到IL-22RA KO品系中，观察新生幼仔中是否有光亮表型。
生出69只幼仔，它们符合盂德尔基因型比例。在Het KO背景下所有的TG都是光亮的，而非TG或者HOM KO背景下的TG中没有一只是光亮的。
使用表达IL-20RA和IL-20RB的Baf3细胞进行alamar blue增殖试验，以确定在小鼠血清中IL-20的存在。这些细胞会对IL-20或小鼠IL3产生应答而增殖。试验的步骤与上面C部分中的步骤相同。试验的结果显示所有的TG小鼠都有相似的IL-20活性，与C57BL/6N背景下的IL-20TG水平相同。没有出现任何新生幼仔的光亮表型，表明光亮新生幼仔表型依赖于IL-22RA的存在。增殖试验显示所有的TG小鼠都有相当的IL-20活性，并且与C57BL/6N背景下的IL-20TG水平相同。没有出现任何新生幼仔的光亮表型，表明光亮新生幼仔表型 依赖于IL-22RA的存在。
产后第三天，对来自在IL-22RA KO背景下含有K14muIL-20TG的窝的小鼠实行无痛安乐死，将整个尸体浸没在10％缓冲福尔马林中固定，对固定的组织进行切割，分成胸腔和腹腔的横切块，石蜡包埋，按常规处理，以5微米切片(Jung2065Supercut microtome，LeicaMicrosystems，Wetzlar，Germany)，用H&E染色。染色的组织由ACVP委员会授予证书的兽医病理学家以不知情的方式在光学显微镜(NikonEclipseE600，Nikon Inc.，Melville，NY)下观察。记录组织异常情况并且计数背头端胸廓的表皮层数。
对来自三只HOMIL-22RAKO背景下的IL-20TG(IL-20TG/IL-22RA KO HOM)小鼠以及三只HOM IL-22RA KO背景下的非TG(non-TG/IL-22RA KO HOM)小鼠的组织进行显微镜检查，没有发现含有异常。还检查了两只Het IL-22RA KO背景下的IL-20TG(IL-20TG/IL-22RA KO Het)的小鼠的组织。所有动物中表皮层内的表皮层数目相似。但是，有两只IL-20TG/IL-22RA KO Het小鼠与其他动物相比，其表皮内嗜曙红细胞增多，并且表现出颗粒层中颗粒性的丧失。在任何小鼠的皮肤或者其他组织中没有观察到其他的异常情况。
这些结果提供了证据表明，有效地阻断IL-22RA活性，例如通过IL-22RA基因敲除或者类似地通过本发明的IL-22RA中和性单克隆抗体，可以类似地降低在例如牛皮癣、IBD、结肠炎或者由IL-20和/或IL-22诱导的其他炎症疾病(包括IBD、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎症性皮肤病症以及特应性皮炎)中由IL-20以及IL-22诱导的皮肤病症。
实施例33
IL-22RA敲除小鼠的组织形态成像分析
已建立了一个K14IL-20m转基因(TG)小鼠品系，其TG新生幼仔表现光亮的表型。该转基因由K14启动子表达，它使表达发生在皮肤中产生角蛋白的细胞中。也建立了一个IL-22RA敲除(KO)小鼠品系，在未受到攻击的小鼠中没有观察到显著的改变。将两个品系杂交，获得具有以下四种不同基因型的新生幼仔：(1)TG/-HOM：在没有IL-22RA表达的背景下表达k14IL-20m转基因；(2)TG/-Het：在从一个拷贝的IL-22RA基因表达一些IL-22RA的背景下表达k14IL-20m转基因；(3)WT/HOM：在没有IL-22RA表达的背景下不表达k14IL-20m转基因；以及(4)WT/Het：在从一个拷贝的IL-22RA基因表达一些IL-22RA的背景下不表达k14IL-20m转基因。在第三天，出生后约48小时对34具有各种基因型的新生幼仔进行安乐死(表15)：
表15
| TG/-HOM* TG/-Het* WT/HOM* WT/Het* (组1) (组2) (组3) (组4) |
| 总计 n＝10 n＝10 n＝9 n＝5 |
TG＝转基因；WT＝野生型；HOM＝纯合的；Het＝杂合的；n＝幼仔数目.
将每只幼仔去头，沿身体横切成三部分(头端胸、尾端胸和腹部)。将4.0-5.0毫米厚的组织样本固定在10％中性缓冲的福尔马林中，处理为石蜡块，苏木精和曙红(H&E)染色，用于常规的组织学检查和组织形态成像分析。选择每个组织样品中脊髓背部区域的表皮用于组织形态成像分析，使用Olympus BH-2显微镜、摄像机(Dage-MTI，Michigan City，IN)以及BioQuant True Color windows98软件(R&M Biometrics，Inc.Nashville，TN37209)，使用以下的设置：参数：mag.10X，Z off set0；阵列：长度(mm)；测量：人工和加合模式每一个皮肤样品的表皮以及角质层或者角质化层的厚度(微米) 在每一个10×显微镜视野中分别测量10次，每次测量之间间隔0.1毫米，通过Excel计算获得平均值、SD和SEM。将所有的切片随机打乱顺序，在事先不知道的情况下进行测量。测量后对切片进行解盲，将结果与处理组相匹配。按照处理组的最终结果分类如下：1.头端胸、尾端胸和腹部的平均表皮厚度(微米)，进一步分为(a)头端胸的平均表皮厚度；(b)尾端胸的平均表皮厚度以及(c)胸部的平均表皮厚度。2.头端胸、尾端胸和腹部的平均角质层厚度(微米)，进一步分为(a)头端胸的平均角质层厚度；(b)尾端胸的平均角质层厚度以及(c)胸部的平均角质层厚度。3.头端胸、尾端胸和腹部表皮加角质层的平均厚度。使用GraphPad InStat软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA92121)对所得结果进行分析。应用单因素方差分析(ANOVA)检查第1组到第4组的平均值差异的统计学显著性。使用Tukey-Kramer多重比较检验，确定两组之间平均值的统计学差异(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)。P<0.05的观察结果被认为是显著的。
(1)组织形态结果
(a)头端胸、尾端胸和腹部的平均表皮厚度(微米)
与没有IL-22RA表达的IL-20转基因幼仔(TG/-HOM，P＝0.001***)以及对照同窝幼仔(WT/HOM，P＝0.001***以及WT/Het，P＝0.001***)分别比较，缺少一个拷贝IL-22RA基因(TG/-Het)的IL-20转基因幼仔中表皮增厚显著(表16)。TG/-Het幼仔表现出未角化表皮增厚，这很可能是由于角质细胞肥大造成的。这一增加可能涉及所有三个非角化层(基底层、棘层和颗粒层)，但是最经常影响棘细胞层。TG/-Het幼仔的表皮厚度增加大约25％，棘细胞层变得明显。而TG/-HOM幼仔的表皮厚度与对照(WT/HOM和WT/Het)相比仅有略微增加，且统计学表明组间没有显著差异(P>0.05)。对头端胸、尾端胸和腹部的表皮厚度也进行了比较。正常情况下很薄的腹部表皮比尾端胸表皮 厚，而尾端胸表皮比头端胸表皮厚(表16)。
表16
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝28) (N＝30) (N＝27) (N＝15) |
| 平均值 32.58±1.25 41.05±2.04 31.31±1.08 30.83±1.43 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
TG/-Het幼仔头端胸皮肤中的扁平上皮厚度增加，伴随上皮细胞(角质细胞)的肥大；但是与其他各组(TG/-HOM，WT/HOM和WT/Het)比较没有显著差异(P＝0.1565，表17)。这可能是由于组织学假象造成的，例如切片与切片之间的差异性、表皮的天然构架，或者在头端胸的薄层皮肤中没有很大的作用。注意：头端胸的组织学步骤或者组织切片可能不适合作组织形态分析来获得统计学显著性。
表17
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOMW T/Het (N＝10) (N＝10) (N＝9) (N＝5) |
| 平均值 29.18±2.24 33.20±2.24 27.28±0.62 29.38±1.77 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
与TG/-HOM(P<0.05*)、WT/HOM(P<0.001***)以及WT/Het(P<0.01**)分别比较，只有一个拷贝IL-22RA基因(Het)的IL-20(TG/-)表皮厚度的平均值增加(表18)。统计表明组间差异极为显著(P<0.0001****)。与WT/Het表皮相比，TG/-Het表皮增加大约29％。没有IL-22RA(HOM)的IL-20(TG/-)幼仔的表型部分地近似于缺少一个拷贝IL-22RA基因(Het)且具有增厚表皮的幼仔的表型，而与对照同窝幼仔(WT/HOM和WT/Het)的表型不同，但是统计学表明与对照没有统计差异(P>0.05)。TG/-HOM表皮比WT/HOM表皮增厚大约14％。与IL-20TG/-幼仔不同，IL-22RAm受体缺陷幼仔(WT/HOM和WT/Het) 表现出相对更薄的表皮厚度。显著的是，尾端胸表皮厚度的组织形态结果是一致不变的，与头端胸、尾端胸和腹部平均表皮厚度相关，这表明尾端胸的组织学步骤和组织切片非常适合于组织形态成像分析。
表18
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝10) (N＝10) (N＝9) (N＝5) |
| 平均值 35.91±1.37 43.79±2.35 30.83±1.86 30.94±2.83 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
除了TG/-HOM与对照同窝幼仔相比没有差异(WT/HOM和WT/Het，P>0.05)以外，腹部平均表皮厚度结果(表19)与尾端胸平均表皮厚度结果(表18)类似。组织切片有一些变化，在TG/-HOM组中有两个切片丢失，即没有覆盖背部区域的表皮切片。
表19
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝8) (N＝10) (N＝9) (N＝5) |
| 平均值 32.35±1.44 46.33±3.10 35.81±1.90 32.16±2.97 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
(b)头端胸、尾端胸和腹部的平均角质层厚度(微米)
尽管在背景为不表达IL-22RA(HOM)或者只表达一个拷贝该基因(Het)的IL-20转基因幼仔(TG/-)中表皮厚度增加，但是与对照同窝幼仔(WT/HOM和WT/Het)比较，在TG/-HOM和TG/-Het皮肤中观察到角质层或者角质化层厚度明显降低，统计表明组间差异极为显著(P<0.0001****，表20)。与TG/-HOM(P<0.01**)，WT/HOM(P<0.001***)和WT/Het(P<0.001***)分别比较，TG/-Het幼仔表皮表面上角蛋白的量分别降低了36％，50％和49％。与其对照 (WT/HOM，P<0.05*)相比，TG/-HOM幼仔角质层厚度显示了约22％的显著下降，而与WT/Het相比，只下降了17％，没有显著差异(P>0.05)。对照幼仔WT/HOM和WT/Het中的角质层厚度几乎相同，显然，尾端胸中的角质层比腹部的角质层厚，而腹部角质层比头端胸角质层厚。
表20
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝8) (N＝10) (N＝9) (N＝5) |
| 平均值 33.26±2.69 21.41±1.27 42.54±2.01 40.31±3.82 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
头端胸中角质层的平均厚度(表21)与头端胸、尾端胸和腹部的角质层厚度(表20)相似，但是角质层的显著减少只出现在TG/-Het与TG/-HOM(P<0.05*)相比以及与WT/HOM(P<0.01**)相比。标准差和平均值标准差高，这可能是由于切片质量差、皮肤样品丢失、表皮的天然构架或者对头端胸的作用不明显造成的。注意：头端胸的组织学步骤或者组织切片可能不适合进行组织形态分析而获得有价值的结果。
表21
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝28) (N＝30) (N＝26) (N＝14) |
| 平均值 34.96±3.53 18.14±3.99 40.47±4.38 32.96±8.11 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
尾端胸中角质层的平均厚度结果(表22)与头端胸、尾端胸和腹部的角质层厚度相似，只有以下三个例外：(1)TG/-HOM与TG/-Het 相比以及TG/-HOM与WT/HOM相比显示没有统计差异(P>0.05)；(2)TG/-HOM与WT/Het相比显示有显著差异(P<0.01**)；(3)WT/Het中的角质层显著增厚，这可能是由于组织处理的假象造成的，例如角质蛋白在置于低渗溶液中或者在水浴中放置时间过长时出现肿胀或膨大。
表22
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝10) (N＝10) (N＝8) (N＝4) |
| 平均值 35.64±3.4 24.22±1.54 44.35±3.51 53.77±7.21 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
只有TG/-HOM与WT/HOM相比以及TG/-Het与WT/HOM相比显示统计学上显著的差异，P值分别为P<0.05*和P<0.001***(表23)。TG/-幼仔与其对照同窝小鼠(WT/HOM和WT/Het)比较显示腹部角质层厚度降低。
表23
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝8) (N＝10) (N＝9) (N＝4) |
| 平均值 28.84±4.36 21.86±1.30 42.45±3.15 33.25±3.96 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
(c)头端胸、尾端胸和腹部表皮加角质层的平均厚度(微米)
与对照同窝小鼠(WT/HOM和WT/Het)比较，TG/-Het幼仔表现出表皮厚度的显著增加和角质层厚度的显著下降，TG/-HOM幼仔产生相似的结果，但是影响程度低(表24)。
表24
| TG/-HOM TG/-Het WT/HOM WT/Het (N＝10) (N＝10) (N＝9) (N＝4) |
| 角质层 32.58 41.05 31.31 30.83表皮 33.26 21.41 42.54 40.31 |
结果代表了平均值±SEM。N＝所测量的切片数目。
(d)IL-20通过IL-20RA和IL-22RA二者的信号传导
表皮是分层的、不断更新的上皮细胞，其依赖于细胞增殖、分化和死亡之间的平衡达到稳态。在正常的表皮中，有丝分裂活跃的基底层细胞产生最终分化的角质细胞(角质细胞向外迁移，最后从皮肤上成为无核鳞片脱落)、角蛋白或者位于角质层中的角化层。尽管已知有许多蛋白在维持表皮稳态中起作用，对这些事件之间的分子协同作用了解还非常少。IL-20是一种新型的受体相互作用蛋白，它通过在皮肤中与角质细胞增殖有关的层内表达的IL20RA或IL-22RA受体(IL-22RA)传导信号。IL-20转基因新生幼仔表现出异常的增厚和光亮皮肤表型。小鼠中IL-22RAm(HOM)的缺陷显示对于IL-22的处理没有反应，而具有IL-22RA基因的野生型小鼠在使用IL-22处理后表现出显著的表皮厚度增加(P<0.001***，参见IL-22RAmKO/IL-22组织形态成像分析的结果，PID59.2)。为了研究IL-22RA的缺失是否对K14IL-20m TG新生小鼠中观察到的光亮表型具有影响，异位表达IL-20的转基因小鼠与IL-22RA纯合缺陷(HOM)或者IL-22RA杂合缺陷(Het)小鼠进行交配。对表皮厚度进行定量成像分析，这在本研究中的尾端胸研究中已对几个幼仔曾经进行过(即19只幼仔，每只幼仔一个切片，共19个切片)，但是没有统计学显著性，原因是所研究的动物数目有限，并且组内有差异。本研究的目的是对相同研究中所有幼仔的头端胸、尾端胸和腹部中的更多皮肤样品进行组织形态定量(即 34只幼仔，每只幼仔3个切片，共102个切片)，以探究IL-20的生物学并获得可靠的定量结果。为了得到有效的成像分析，我们确保对于所有各组幼仔中的所有个体，在石蜡块中的皮肤的方向在所有的皮肤样品中是一致的，并且对皮肤样品的测量是从同一个相对位置进行的。进行了下面两种测量：(1)对每一个皮肤样品，在每一个10×显微视野中对表皮的厚度测量10次，均位于脊髓背侧，以研究IL-20在介导角质细胞增殖和分化中的作用；(2)以相同方式测量角质层或者角质化层的厚度，便将结果与IL-20TG新生幼仔中的光亮皮肤外表联系起来。
表皮厚度的组织形态成像分析显示，TG/-Het新生幼仔(在从一个拷贝IL-22RA基因表达一些IL-22RA的背景下表达K14IL-20m转基因)显示增厚的表皮，而TG/-HOM新生幼仔(在没有IL-22RA表达的背景下表达K14IL-20m转基因)没有明显变化。与两个拷贝的IL-22RA基因都缺失的IL-20转基因幼仔(TG/-HOM)以及对照同窝小鼠(WT/HOM和WT/Het)相比，在缺少一个拷贝IL-22RA基因的IL-20转基因幼仔(TG/-Het)中，表皮厚度显著增加，P值分别为P＝0.001***、P＝0.001***和P＝0.001***。TG/-Het幼仔的非角质化表皮增厚，主要是由于棘层中的角质细胞肥大所致。TG/-Het幼仔的表皮厚度与对照(WT/HOM和WT/Het)相比增加了大约25％，而TG/-HOM幼仔的表皮厚度只有略微增加，大约4-5％，统计表明TG/-HOM与其对照WT/HOM相比没有显著差异(P>0.05)。
角质层的组织形态结果显示，尽管TG/-Het幼仔的表皮出现增厚，但是与对照同窝幼仔(WT/HOM和WT/Het)比较，TG/-HOM和TG/-Het皮肤中观察到角蛋白或者角质化层厚度明显降低，统计表明组间差异极为显著(P<0.0001****)。与TG/-HOM(P<0.01**)，WT/HOM(P<0.001***)和WT/Het(P<0.001***)分别比较，TG/-Het幼仔表皮表面的角蛋白量分别降低了约36％，50％和49％。与其对照(WT/HOM， P<0.05*)相比，TG/-HOM幼仔角质层厚度有约22％的显著下降，而与WT/Het相比，只下降了17％(P>0.05)。对照幼仔WT/HOM和WT/Het中的角质层厚度几乎相同。TG/-HOM和TG/-Het新生幼仔中角质层平均厚度的降低似乎与大体观察的结果相应，即在大体水平上IL-20(TG)/IL-22RA(Het)新生幼仔的皮肤看来光亮度降低(例如具有较少的角蛋白)，称为光泽，而IL-20(TG)/IL-22RA(HOM)不发光(例如具有更多的角蛋白)。从组织学上看，TG/-幼仔角质层中的角蛋白比WT幼仔中的角蛋白更紧密。总的来说，IL-20转基因新生幼仔中与肥大角质细胞相关的增厚表皮和薄角质层可能解释了为什么它们表现出光亮皮肤的表型。
在具有一个拷贝的IL-22RA基因被靶向敲除的背景(Het)的IL-20转基因新生幼仔中观察到角质细胞的肥大和受到干扰的最终分化。皮肤表现出角质细胞的肥大，但是不能完全分化，缺少角蛋白或者角质层。两个拷贝IL-22RA基因都被破坏(HOM)的IL-20转基因新生幼仔，表现出的表型与TG/-Het皮肤相似，但是只表现较低的或者最低限度的影响(图12-15)。看起来IL-22RA的缺失(HOM)对于K14IL-20mTG新生幼仔中观察到的光亮表型有部分的影响，而IL-22RA的缺失(Het)对光亮表型只有很小的影响或者几乎没有影响。换言之，IL-20(一种通过IL-20RA或者IL-22RA受体传导信号的新型受体相互作用性蛋白)的信号传导很可能并没有因为一个拷贝IL-22RA基因的缺陷表达(Het)而受到阻碍，但是两个拷贝IL-22RA基因均缺陷表达会使其信号传导受到部分的阻碍。
这些结果提供了证据表明，有效地阻断IL-22RA活性，例如通过IL-22RA基因敲除或者类似地通过本发明的IL-22RA中和性单克隆抗体，可以类似地降低在例如牛皮癣、IBD、结肠炎或者由IL-20和/或IL-22诱导的其他炎症疾病中由IL-20以及IL-22诱导的皮肤影响。
实施例34
IL-22对IL-22RA敲除小鼠的影响
通过皮下植入带导管的微型泵或者微型泵自身，向包括23只IL-22RAKO(HOM)小鼠和13只对照(WT)小鼠在内的36只小鼠给予IL-22或PBS(表25)：
表25
| HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22 (组1) (组2) (组3) (组4) |
| 雄性 n＝3 n＝10 n＝3 n＝8雌性 n＝0 n＝10 n＝0 n＝2 |
| 总计 n＝3 n＝20 n＝3 n＝10 |
从每一只动物中由植入泵位置获得1.5-2.5厘米长、4.0-5.0毫米厚的皮肤样品组织，用于常规的组织学检查和组织形态成像分析。将所有组织样本固定在10％中性缓冲的福尔马林中，处理成石蜡块。从每只动物的每个皮肤样品做6个切片，5微米厚，相邻切片之间间隔10微米(所有表面都有皮肤覆盖)，用苏木精和曙红(H&E)染色。组织样品的组织形态成像分析是使用Olympus BH-2显微镜、摄像机(Dage-MTI，Michigan City，IN)以及BioQuant True Color windoWs98软件(R&M Biometrics，Inc.Nashville，TN37209)使用以下的设置进行的：参数：mag.10X，Z off set0；阵列：length(mm)；测量：手工和加合模式。在每一个10×显微镜视野中分别测量5次，从每一个皮肤切片中心0.4厘米处捕获4个视野(例如一个10×视野＝0.1厘米，四个10×视野＝0.4厘米)，由此测量表皮厚度(μm)。每只动物总共测量六个切片，通过Excel计算获得平均值、SD和SEM。 所有的切片随机打乱顺序，在事先不知道的情况下进行测量。测量后对切片进行解盲，将结果与处理组相匹配。按照处理组的最终结果分类如下：1.HOM和WT雄性和雌性小鼠的表皮厚度；2.HOM和WT雄性小鼠的表皮厚度。使用GraphPad InStat软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA92121)对所得结果进行分析。应用单因素方差分析(ANOVA)检查第1组到第4组的平均值差异的统计学显著性。使用Tukey-Kramer多重比较检验和不配对的T-检验确定两组之间平均值差异的显著性。P<0.05的观察结果被认为是显著的。
III.组织形态结果(1)HOM和WT雄性和雌性小鼠的表皮厚度(微米)
与WT/PBS对照相比，在使用IL-22(WT/IL-22)处理的WT小鼠皮肤中表皮厚度显著增加(P＝0.0001)。与HOM/PBS对照相比，使用IL-22(HOM/IL-22)处理的IL-22RAmKO小鼠皮肤显示表皮厚度平均值增加，但是统计表明两组之间没有显著差异(P>0.05)。与WT小鼠相比，IL-22RAKO小鼠中观察到表皮厚度显著下降(例如HOM/IL-22与WT/IL-22比较：P<0.001)(表26)。
表26
| HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22 (N＝3) (N＝19) (N＝3) (N＝10) |
| 平均值 14.15±0.19 19.01±1.03 23.34±5.49 43.08±1.85 |
结果代表了平均值±SEM。N＝动物数。
(2)HOM和WT雄性小鼠的表皮厚度(微米)
与WT/PBS雄性对照相比，在使用IL-22(WT/IL-22)处理的WT雄性小鼠皮肤中表皮厚度增加大约2倍(P＝0.0001)，但是与HOM/PBS雄性对照相比，使用IL-22(HOM/IL-22)处理的IL-22RAmKO雄性小鼠表皮厚度只有小幅增厚(P>0.05)。值得注意的是，与其对照WT 雄性小鼠相比，IL-22RAmKO小鼠的表皮厚度表现出显著降低(例如HOM/PBS与WT/PBS相比：P<0.05；HOM/IL-22与WT/IL-22相比：P<0.001)(表27)。
表27
| HOM/PBS HOM/IL-22 WT/PBS WT/IL-22 (N＝3) (N＝9) (N＝3) (N＝8) |
| 平均值 14.15±0.19 15.86±0.75 23.34±5.49 41.41±1.71 |
结果代表了平均值±SEM。
(3)HOM和WWT小鼠的表皮厚度(μm)，雄性与雌性比较
发现雌性小鼠的表皮比雄性小鼠的表皮厚(例如HOM/IL-22/雄性与HOM/IL-22/雌性相比：P<0.01；WT/IL-22/雄性与WT/IL-22/雌性相比：P<0.05)(表28).
表28
| HOM/IL-22 HOM/IL-22 WT/IL-22 WT/IL-22 (雄性，N＝9) (雌性，N＝10) (雄性，N＝8) (雌性，N＝2) |
| 平均值 15.86±0.75 21.85±1.3 41.41±1.71 49.75±4.82 |
结果代表了平均值±SEM。
(4)HOM小鼠的表皮厚度(μm)，IL-22通过泵给药与IL-22通过泵+导管给药
使用泵和导管给予IL-22的IL-22RAmKO(HOM)小鼠中的表皮厚度要明显高于仅仅使用泵给药的IL-22RAmKO(HOM)小鼠中的表皮厚度(P<0.0001，通过未配对T-检验)(表29)。
表29
| HOM w/IL-22泵 HOM w/IL-22泵+导管 (M＝8&F＝2，N＝10) (M＝2&F＝8，N＝10) |
| 平均值 15.850.65 23.30+1.36 |
结果代表了平均值±SEM。
M：雄性；F：雌性；N：小鼠总数。
IV讨论
总的来看，本研究的目的是研究IL-22RAmKO和WT小鼠接受IL-22处理后对皮肤表皮的影响，并将这些发现与临床症状联系起来。进行定量成像分析以确定H&E染色的皮肤切片中表皮的厚度。对每只动物的皮肤样品通过组织形态学方法测量120次(即每个切片20次×每只小鼠6个分段切片＝120次测量)，通过Excel计算获得平均表皮厚度。组织形态测量研究证明了IL-22导致了表皮厚度的显著增加，特别是在存在IL-22RA受体的WT小鼠中(通过ANOVA计算，P<0.0001，被认为是极为显著)，而在没有IL-22RA受体的IL-22RAm KO(HOM)小鼠中影响较低或者只有很小的影响(P>0.05)。与使用PBS处理的小鼠比较，经IL-22处理的野生型小鼠表皮厚度增加了大约43％(例如WT/PBS，P<0.001)，而经IL-22处理的IL-22RAm KO(HOM)小鼠表皮厚度与对照(HOM/PBS)相比仅增加了大约26％(P>0.05)。与WT小鼠比较，IL-22RAm KO小鼠显示更薄的表皮(P<0.001)。总之，IL-22对小鼠皮肤的生物学影响提示这个因子可能参与表皮生长和增殖的调控。
实施例35
抗人IL-20单克隆抗体(克隆#262.7.1.3.2.4)的药代动力学
将测试单克隆抗体-抗人IL-20单抗(克隆#262.7.1.3.2.4)以3×3毫升等份、浓度为1.08毫克/毫升(由280nm紫外吸收确定)的形式提供，储存于-80℃备用。载体是1×PBS(50mM磷酸钠，109mM氯化钠)pH7.3。使用前将单抗在室温下融化，第一和第二份用于分别通过静脉内和皮下途径给药(100微克剂量组)。第三份的一半用1×PBS1:2稀释用于50微克皮下剂量组，另外一半用1×PBS1:10稀释 用于10微克皮下剂量组。从Charles RiverLabs得到雌性SCID小鼠(n＝96)。动物抵达时检查其健康情况并分组装笼(每笼三只动物)。研究开始时小鼠为12周大，平均体重为22克。
A.剂量方案
雌性SCID小鼠(n＝24/剂量组)随机分配到4个剂量组中(参见表30)。第1组通过IV注射给予抗huIL-20单抗，通过尾静脉注射大约93微升；第2、3、4组通过SC途径给予单抗，在颈背注射大约93微升。
B.样品收集
在收集血液前，小鼠用氟烷和异氟烷完全麻醉。在所有时间点通过心脏插管收集血样，只是在168小时时间点通过眼部取血，同样的动物在504小时时通过心脏插管再次取血。将血液收集到血清分离器中，使之凝固15分钟。然后将样品在14000rpm离心3分钟。离心后，将125-150微升的等分样品装入标记好的eppendorf小管中，立即在-80℃冻存直至分析(表30)。
表30
| 组# | 剂量(给药途径) | 动物 | PK时间点 |
| 1 | 100μg(IV) | 3只小鼠/时间点* | 0.25，1，4，8，24，72，168,336和504小时 |
| 2 | 100μg(SC) | 3只小鼠/时间点* | 0.25，1，4，8，24，72，168,336和504小时 |
| 3 | 50μg(SC) | 3只小鼠/时间点* | 0.25，1，4，8，24，72，168,336和504小时 |
| 4 | 10μg(SC) | 3只小鼠/时间点* | 0.25，1，4，8，24，72， 168,336和504小时 |
*在168和504小时时间点使用相同的动物。
C.通过ELISA对血清中的抗huIL-20单抗进行定量
开发出酶联免疫吸附检测法(ELISA)，使其能够合格地用于小鼠血清样品的分析。所述血清来自药代动力学研究中给予抗-IL-20单抗267.7.1.3.2.4的小鼠。该检测被设计成利用商品化的二抗和使用TMB进行比色检测。改变用于标准曲线的稀释度，以改善标准曲线的线性部分的定义。用于标准曲线的稀释度范围是100ng/mL到0.231ng/mL的连续2倍稀释，可用于小鼠血清样品的定量。QC样品用10％的SCID小鼠血清稀释至1：100、1:1000和1:10000，并通过标准曲线进行回测。
D.药代动力学分析
血清浓度与时间数据下载到WinNonlin Professional4.0(Pharsight，Inc.；Cary，NC)软件中用于药代动力学分析。使用非室模型分析，根据每一个时间点的平均数据确定药物动力学参数。
E.结果
给予100微克IV以及100、50和10微克SC后平均血清抗人IL-20单抗浓度在表31中列出：
表31
| 时间(hr) | 100μgIV浓度(μg/mL) | 10μgSC浓度(μg/mL) | 50μgSC浓度(μg/mL) | 100μgSC浓度(μg/mL) |
| 0.25 | 196(12) | LTR | 0.101(0.065) | 0.481(0.485) |
| 1 | 154(18) | 0.356(0.146) | 1.61(0.52) | 3.48(1.72) |
| 4 | 118(20) | 2.42(0.53) | 10.4(3.4) | 19.7(4.7) |
| 8 | 112(20) | 3.41(0.30) | 18.9(3.6) | 40.2(64) |
| 24 | 103(13) | 4.95(0.05) | 26.3(0.7) | 50.1(6.2) |
| 72 | 101(16) | 4.27(0.79) | 21.0(3.4) | 43.4(2.7) |
| 168 | 45.6(15.4) | 2.92(0.53) | 19.6(2.7) | 37.6(3.4) |
| 336 | 36.4(16.6) | 3.60(0.31) | 23.5(3.5) | 34.4(5.8) |
| 504 | 28.8(3.8) | 2.74(0.39) | 20.5(3.6) | 25.7(2.1) |
LTR：低于可报告数值
IV给药后，单抗的浓度对时间的曲线呈双指数下降。SC给药后，单抗看来有一个缓慢的吸收阶段，伴随吸收速率限制性的清除。基于每一个时间点的平均数据的血清药代动力学参数在表32中列出。
表32
| 参数单位 | 100μgIV | 10μgSC | 50μgSC | 100μgSC |
| C0(IV)；Cmax(SC) μg/mLTmax hrt1/2，λz hr hr·μg/mAUC(0-t) L hr·μg/mAUC(0-inf) LAUC(％外推) ％Vss(IV)；Vz/F(SC) mLCl(IV)；Cl/F(SC) mL/hrF(生物可获得性) ％ | 212N/A50927059 48269 43.91.340.002N/A | 4.9524ND1730 ND NDNDNDND | 26.324ND10845 ND NDNDNDND | 50.12461218110 41561 56.42.120.00286.1 |
ND：由于缺乏浓度-时间变化曲线中的最终清除阶段内的数据而无法测定
IV给药后，单抗显示了非常低的清除(CI＝0.002mL/hr)以及长的清除半寿期(t1/2，λz约21天)。单抗表现出稳态的分布体积(Vss＝1.3毫升)，小于小鼠的血液体积(约1.7毫升)，提示单抗几乎没有分布到血管腔隙以外。回算的最大浓度(C0)比根据注射剂量和小鼠血液的体积预计的浓度要高。这一点，以及小的Vss，一起提示所述单抗可能很大程度上局限于血液的血清级分中。
SC给药之后，Cmax数值随剂量呈线性增加。100微克SC剂量时， 单抗的t1/2，λz约为25天，清除与表观分布体积与IV剂量之后的类似。生物可获得性是86％。在较低的两个SC剂量时，大多数药代动力学参数由于没有可供测量的最终清除阶段而不能被估计，即使是样品取到504小时时。SC给药后单抗的吸附看来达到一个稳态，清除在研究的整个过程中都有发生。
实施例36
在CD4+CD45RB
hi
(CD25-)结肠炎和牛皮癣模型中的IL20和IL-22拮抗剂
A.概述
将CD4+CD45RBhi或CD4+CD25-T细胞转移到同系SCID小鼠中会导致小鼠出现结肠炎。共转移调控T细胞(CD4+CD25+或CD4+CD45RBlo)会抑制这种结肠炎。在将CD4+CD25-T细胞转移到小鼠中后，如果再给小鼠注射葡萄球菌肠毒素B(SEB)，小鼠不仅仅出现结肠炎，而且出现牛皮癣。在细胞转移后0-21天给予抗IL-22RA、IL-20、IL-22、IL-20R和/或IL-22RA的抗体或者可溶性IL-22RA受体，同时监测结肠炎和牛皮癣的症状。牛皮癣评分的下降或者结肠炎的抑制(组织学)表明IL-21可以抑制这些自身免疫疾病。
B.研究设计
从B10.D2小鼠中分离脾脏和腹股沟淋巴结。制备单细胞悬液并计数。使用Miltenyi Bead系统，通过阳性选择分选出CD25+细胞。用1:100稀释的CD25-PE(BD Pharmingen)对细胞进行染色，孵育15分钟。漂洗掉过量的抗体，将细胞与10微升抗PE珠/106个细胞共同孵育20分钟。用PBS漂洗细胞，并通过LS柱(Miltenyi Biotech)。保留通过柱的细胞(CD25-)用于进一步的分析。向这些CD25-细胞中加入富集CD4的混合物(1:100)(Stem Cell technologies)，孵育15分钟。用PBS漂洗细胞。向细胞中加入1:10稀释的抗生物素四聚 体，孵育15分钟，之后加入磁性胶体(60微升/106个细胞)孵育15分钟(都来自Stem Cell Technologies)。将细胞通过负选择层析柱(0.5”，Stem cell Technologies)。通过的细胞是CD4+CD25-细胞。使用流式细胞仪对纯度进行分析。向CB-17SCID中通过IV途径注射0.4x106个细胞，总体积是200微升。第二天(D1)通过IP途径向小鼠注射10微克SEB。从第2到第5周跟踪牛皮癣和结肠炎的症状。根据以下的标准对小鼠进行牛皮癣病评分：0-无损伤，1-颈部轻度损伤，2-颈部和背部(躯干)严重损伤，3-小鼠颈部、背部和腹部非常严重的损伤。同时测量耳部增厚，作为对疾病严重性的量度之一。第1-30天，几组小鼠通过IP途径注射PBS、100微克对照抗体或者10-100微克的抗IL-22RA，IL-20，IL-22，IL-20R或IL-22R抗体，或者可溶性IL-22RA，使用不同的给药方案(每周三次或者每周两次)。
C.结果和结论
在经抗体处理的小鼠中牛皮癣和结肠炎的症状被抑制，表明对IL-20和/或IL-22功能的抑制可以抑制该牛皮癣和结肠炎模型中的自体免疫症状。
实施例37
在SCID-hu移植牛皮癣模型中的IL-20和IL-22拮抗剂
在SCID小鼠上移植的人牛皮癣皮肤可以几个星期保持其临床、光镜以及免疫组化牛皮癣性质。这个模型为评价将破损组织恢复为正常表型的治疗方法提供了一个系统。一旦人的皮肤被成功移植，抗IL-22RA，IL-20，IL-22，IL-20R和/或IL-22R的抗体或者可溶性IL-20或IL-22受体可以给药数周，可以分析表皮厚度，以评价这些拮抗剂对牛皮癣的影响。
B.研究设计
从健康成年志愿者和牛皮癣破损皮肤处取出全厚度6毫米打孔活检组织，其由整个表皮和数毫米的真皮组成。从每一个供体获得4-6个活检组织。将每一个供体的一个打孔活检组织移植到接受者SCID小鼠(CB-17，Taconic)的背部皮肤表面。将动物饲养在无病原的环境中。成功移植之后(移植后2-3周)开始按如下处理：一个活检组织用作阴性对照(PBS或者同型单抗)、一个活检组织用作阳性对照(环孢霉素A)、2-3个活体组织用于使用抗人IL-22RA、抗人IL-20、抗人IL-22单抗或者IL-20或IL-22的可溶性受体处理(腹腔内注射，每周三次连续2-4周，按照M-W-F日程表进行)。
C.定量分析
在整个实验中定时进行临床观察和评价，并且进行记录。在预先不知道样品的情况下对牛皮癣破损的严重程度根据多鳞片性、硬化和红斑进行评价。使用三点标准对这些参数打分：0＝完全没有皮肤累及；1＝轻微累及；2＝中度累及；3＝严重累及。在给药阶段结束时对所有动物实施安乐死，收集组织用于组织学和免疫组化。(1)将部分的组织固定在10％福尔马林中并用苏木精和曙红染色。使用NIH成像软件，将表皮区域作为单位长度的表皮厚度改变的函数进行测量。对每一个移植物的多个面积进行定量，以提供高的n值和平均表皮面积。(2)上真皮中每一个高倍视野(0.103x0.135mm)中的炎症性单核细胞的数目；(3)角化不全的程度以相对单位按照0-3的标准评分，其中0是无角化不全，1代表切片中小于1/3的部分具有角化不全，2代表切片中大于1/3但小于2/3的部分具有角化不全，3代表切片中大于2/3的部分具有角化不全。(4)对剩余的组织针对Ki67进行染色(增殖性角质细胞的标记)，以评价切片中每毫米长度中Ki67循环角质细胞的数目。以表皮厚度测量的牛皮癣严重程度的降低表明 在这个牛皮癣模型中对IL-20和IL-22功能的中和可能是有效的。为了对牛皮癣严重程度的降低进行定量，我们测量了表皮厚度、上真皮中炎症性细胞的数目，Ki67循环角质细胞的数目以及角化不全的等级。与对照组小鼠相比，所有四个参数都显著降低，表明IL-20和IL-22拮抗剂的潜在治疗价值。
实施例38
使用Alamar Blue增殖检测用BaF3/IL-22RA/IL-20RB细胞筛选IL-20拮抗剂活性
用IL-22RA和IL-22RB共转染因子依赖性前B细胞系BaF3(参见实施例3中的方法)，并使用不同浓度的I1-20处理。根据实施例3中的描述，用alamar blue assay评估增殖。在细胞因子预计应具有的浓度下，IL-20以剂量依赖的方式刺激增殖，表明IL-20在细胞因子预计应具有的浓度下结合并活化杂二聚IL-22RA/IL-20RB受体。含有未转染BaF3细胞的阴性对照没有增殖。
为了确定抗IL-22RA抗体是否能够拮抗IL-20的活性，使用抗IL-22RA抗体作为IL-20活性的拮抗剂，进行上面描述的检测。当IL-20与这种拮抗剂组合在一起时，对IL-20的响应就被降低到背景的水平。消除或者降低IL-20的增殖作用的拮抗剂的存在证明它就是IL-20配基的拮抗剂。这个检测还可以用于检测本文描述的IL-20活性的其他拮抗剂，例如包含可溶性IL-22RA受体的拮抗剂多肽。
实施例39
抗huIL22RA单克隆抗体对IL-20和IL-22活性的中和
使用在实施例28中描述的基于细胞的中和试验，将纯化的小鼠抗huIL-22RA单克隆抗体(实施例30(D))以系列稀释度加入，例如浓度 为10ug/ml，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml，625ng/ml，313ng/ml，156ng/ml和78ng/ml。将测定板在37℃，5％CO2中孵育4天，之后加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)，每孔20微升。然后在37℃，5％CO2中继续孵育板16小时。结果表明纯化的抗huIL-22RA单克隆抗体能够中和huIL-22和huIL-20通过huIL-22RA产生的信号传导。在浓度为10ug/ml时，抗体完全中和了由huIL-22或huIL-20诱导的增殖，在更低浓度下对增殖的抑制表现出以剂量依赖的形式下降。用同型匹配的阴性对照小鼠单抗在以上描述的浓度下进行测试，结果表明对两种细胞因子的增殖作用都没有抑制。这些结果进一步证明针对IL-22RA的单克隆抗体的确能够在低浓度下拮抗促炎配基IL-20和IL-22的活性。
这些结果提供了额外的证据表明，对IL-22RA活性进行有效阻断，例如经由本发明的IL-22RA中和单克隆抗体，可以有利于阻断、抑制、降低、拮抗或者中和IL-20和IL-22的体内活性(单独或者共同)，并且可能减轻IL-20和/或IL-22诱导的炎症，例如在IL-20诱导的皮肤病患中以及IL-22诱导的皮肤病患中所观察到的那些，例如牛皮癣、IBD、结肠炎或者IL-20和/或IL-22诱导的其它炎症性疾病，包括IBD、关节炎、哮喘、牛皮癣性关节炎、结肠炎、炎症性皮肤病患以及特应性皮炎中。
实施例40
使用中和性抗IL-22RA单克隆抗体处理怀孕的IL-20和IL-22转基因小鼠
为了检测大鼠抗小鼠IL-22RA单克隆抗体(mAb)的体内中和活性，通过腹腔内途径向怀孕的IL-20转基因(Tg)和IL-22转基因小鼠中注射抗小鼠IL-22RA单抗。检查新生幼仔中通常表现这些品系小鼠特征的“光亮”表型存在与否。
特别地，将雄性IL-20Tg(使用角蛋白14启动子制备)或者IL-22Tg(使用胰岛素启动子)小鼠与发情期的C57BL/6N小鼠交配，第二天通过检查阴道栓判断雌性小鼠是否发生交配。将每一只怀孕的雌性小鼠隔离在单独的笼内，每日监测。处理组包括每组至少4只怀孕雌鼠，以便能统计学上显著性地分析Tg和非Tg幼仔。根据以前在这些转基因小鼠上的经验，每一窝通常有大约6-8只幼仔，其中2-3只为转基因阳性的。
交配后7-9天(胚胎年龄7-9；e7-9)，将200-250微升PBS中的250-500微克大鼠抗小鼠IL-22RA单抗(大鼠IgG2a同型)通过腹腔内途径注射给雌性小鼠。使用短的针头、浅的注射角度以避免直接注射到子宫内。对怀孕的雌性小鼠用此方式每周注射三天(周一、周三和周五)，注射两周(直至生产)，目的是成功接触正在发育的胚胎。对照组(每组不少于4只雌性孕鼠)包括以下：同型对照大鼠IgG2a单抗、抗人/小鼠IL-22单抗(大鼠IgG1同型)以及同型对照大鼠IgG1单抗。作为中和小鼠IL-20的对照，给怀孕的雌鼠注射能够结合和中和人与小鼠IL-20的可溶性IL-20R-Fc4蛋白或者Fc4对照蛋白。
出生后1-2天，密切观察幼仔是否出现光亮皮肤表型。第二天，对幼仔实施安乐死，取尾的一部分提取DNA，以确定每只幼仔的基因型(Tg或者非Tg)。收集皮肤样品进行组织学分析以评价幼仔是否具有通常表现这些Tg小鼠特征的增厚表皮细胞层。取幼仔的躯干血(以及出生一天后取母亲(dams)的眼血)，通过ELISA对每只小鼠血清中的抗IL-22RA单抗水平进行定量。由于这些单抗在体内是有效的IL-20和/或IL-22抑制剂，Tg幼仔具有正常的皮肤(即没有表皮增厚或者“光亮”外表)。
实施例41
在器官培养牛皮癣模型中的IL-20和IL-22拮抗剂
人牛皮癣斑块皮肤可以维持在器官培养中，且破损皮肤的异常组织学特征可以在没有外加生长因子的条件下得以维持。可以给予抗IL-22RA、IL-20、IL-22、IL20R和/或IL-22R的抗体或者可溶性IL-20或I1-22受体，使牛皮癣破损皮肤的组织学特征得以改善。
B.研究设计
从健康成年志愿者或牛皮癣破损皮肤取出全厚度2毫米打孔活体组织，其由整个表皮和数毫米的真皮组成。活检取样后立即将组织浸没到由角质细胞基本培养基(KBM)(Clonetics Inc，Walkersville，MD)组成的组织培养基中。在培养基中添加氯化钙使Ca2+的终浓度达到1.4mM(Varani et a l，1993，1994)。然后将活体组织置于96孔板的孔中，其中含有200微升补充Ca2+的KBM，使用抗IL-20、IL-22、IL22RA抗体或者可溶性IL-20或IL-22受体进行处理或者不进行处理。培养物在37℃含95％空气和5％二氧化碳的大气中培养8天。
C.定量分析
在孵育结束时，将组织在10％缓冲福尔马林中固定，并在用苏木精和曙红染色后进行组织检查。牛皮癣组织在暴露于抗体或可溶性受体后的外观可以更类似正常组织的外观，包括以下观察到的现象：起初无组织的、无定形的基底表皮细胞发展成更显柱状的外观，具有恢复的极性；表皮网嵴退化，表皮细胞向真皮延伸的区域减少，上表皮层的整体退化减少。器官培养模型提供了一个迅速和灵敏的方法，可用于确定某种具体化合物是否具有作为抗过度增殖药剂的潜力。异常组织学特征可以在IL-20、IL-22拮抗剂存在时得到改善，提示这种药剂在治疗牛皮癣中的有效性。
实施例42
与中和性单抗R2.1.5F4.1和R2.1.15E2.1结合的mIL22RA(zCytoR11m)区域的作图定位
A.小鼠IL-22RA上被中和性单克隆抗体结合的表位。
以下描述的实验的目的是确定小鼠IL-22RA可溶性受体蛋白(SEQID NO：62)的氨基酸序列中对于受体活性或者对于拮抗剂或中和性抗体结合比较重要的一个或者多个区域。小鼠IL-22RA-Fc蛋白先用凝血酶切除Fc，然后与溴化氰(CNBr)温育而将C端甲硫氨酸序列切除。对经CNBr切除产生的肽进行分级分离，用ELISA检测各级分的结合活性，用Western分析反应性(在ELISA和Western中使用具有中和性质的单克隆抗体-克隆R2.1.5F4.1和R2.1.15E2.1)。
CNBr切割后，从非还原的全长mIL-22RA可能产生以下的肽(表33)。在非还原条件下，半胱氨酸由二硫键连接，可能在肽1中产生一个内部连接，在肽3和5之间产生一个连接。黑体的残基可能参与配基结合，这些残基对应于人IL-22RA中可能参与SEQ ID NO：2或3中可能参与配基结合的残基，如实施例42B中所描述。特别地，SEQ IDNO：48对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基16(His)到83(Met)；SEQ ID NO：49对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基84(Glu)到109(Met)；SEQ ID NO：50对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基110(Thr)到137(Met)；SEQ ID NO：51对应于SEQ ID NO：42的氨基酸残基138(Leu)到177(Met)；SEQ ID NO：52对应于SEQ IDNO：42的氨基酸残基163(His)到208(Pro)或者SEQ ID NO：62的氨基酸残基163(His)到212(Arg)。
表33
1.CNBr切割和肽级分的分离
将50微克mIL22RA冻干并用180微升甲酸(70％)重溶。加入1微升溶于乙腈中的5M CNBr。将样品混匀，使之在室温下黑暗处反应18小时。取150微升的反应混合物通过装配在分析性Zorbax SB300-C8层析柱上的反相HPLC进行分级分离。使用从25％乙腈(0.085％TFA)和75％水(0.1％TFA)到95％乙腈(0.085％TFA)和5％水(0.1％TFA)的梯度分离洗脱峰。UV分析显示有三个主要峰和两个小峰，收集之。将每个级分分成两份：一部分进行ELISA检测，另一部分冻干并用150微升磷酸盐缓冲液(PBS)重溶。对PBS级分进行UV分析确证了所有的峰都从分析性层析柱上被回收。对PBS级分进行Western分析。
2.ELISA
含有IL-22RA被CNBr切割后的肽序列的HPLC级分使用HPLC缓冲液(90％乙腈、10％水、0.09％三氟乙酸)稀释至大约相等的浓度，将样品加入96孔微量滴定板上的4孔中，每孔100微升，在通风橱中室 温下干燥过夜。用ELISAC缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)漂洗平板，然后用ELISA B缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.05％Tween-20)37℃封闭2小时。将两种针对IL22RA的单克隆抗体(克隆R2.1.5F4.1，和克隆R2.1.15E2.1)用ELISA B缓冲液稀释至2μg/ml。每种单抗都加入到每个肽序列样品中，每孔100微升，将培养板在37℃孵育60分钟。漂洗以去除未结合的抗体，用ELISA B缓冲液将二抗(缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗大鼠IgG(Jackson))稀释到1μg/ml，每孔中加入100微升。将培养板在37℃孵育60分钟。用ELISA C缓冲液漂洗各孔，在TMB1Component HRP Microwell Substrate(BioFx)中孵育5分钟。加入450nm Stop Reagent for TMB Microwell(BioFx)终止反应，在Dynatech ELISA读板仪(Molecular Devices)中对平板读取450nm处的吸光度。
结果表明，单抗R2.1.5F4.1与mIL22RA CNBr反应的HPLC#4级分发生反应，同时在Western印迹实验中也产生了一个条带。
3.Western印迹
将含有IL-22RA被CNBr切割后的肽序列的HPLC级分室温下冻干过夜，用PBS重溶。然后将样品与非还原性样品缓冲液(Invitrogen)混和，煮沸10分钟。然后将样品上样，并在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上进行SDS-PAGE电泳，使用1x MES-SDS电泳缓冲液(Invitrogen)，并在20％的甲醇转移缓冲液中转移到硝酸纤维素膜(0.2μm；Bio-Rad)上，所有操作在室温下进行。使滤膜在室温下干燥过夜。用含10％脱脂奶粉的缓冲液A(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，0.05％Igepal CA-630，150mM NaCl，0.25％明胶)室温封闭滤膜30分钟。用含2.5％脱脂奶粉的缓冲液A将针对IL-22RA的单抗(克隆R2.1.5F4.1)稀释至2μg/ml。将印迹在一抗中室温孵育1小时。孵育后用缓冲液A洗膜三次，室温下与用含2.5％脱脂奶粉的缓冲液A按1：5000稀释的二抗(缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗大鼠IgG(Jackson Inc.))孵育1小时。然后漂洗印迹，用化学发光底物 (Lumi-Light Western Blotting Substrate；Roche)显色，用发光成像仪(Mannheim Boehringer Lumi-Imager)曝光。
在30分钟曝光时间下，非还原凝胶显示级分4和级分5具有很强的条带，级分3只有一个弱条带。级分4在ELISA检测中也呈阳性。
活性级分#4的N端测序
在从分析性反相层析柱上收集的5个CNBr肽级分中，级分4在ELISA中显示了活性并且在Western印迹中也呈阳性。为了鉴定出活性级分4中的肽，使用众所周知的方法对样品进行Edman降解。从该活性级分中鉴定出3个N端，与肽2(SEQ ID NO：49)、3(SEQ ID NO：50)和5(SEQ ID NO：52)一致。这些结果表明，抗体与肽2(SEQ ID NO：49)、3(SEQ ID NO：50)和5(SEQ ID NO：52)相结合。
表34
| Bdman降解 | N-端序列 | 肽鉴定 |
| 从级分4获得的第一个序列CNBr-产生的mIL22RA序列 | HLEGK QREYE FLGLT PDTEFHLEGK QREYE FLGLT PDTEFLGSIT ILTPI LSKES APYVCRVKTL PLVPR(SEQ ID NO：53) | CNBr肽5(SEQ IDNO：52) |
| 从级分4获得的第二个序列CNBr-产生的mIL22RA序列 | ETRNH TEFYY AKVTA VSAGGETRNH TEFYY AKVTA VS AGGPPVTK M(SEQ ID NO：54) | CNBr肽2(SEQ IDNO：49) |
| 从级分4获得的第三个序列CNBr-产生的mIL22RA序列 | TDRFS XLQHT XIXPX DXXXITDRFS SLQHT TIKPP DVTCIPKVRS IQM(SEQ ID NO：55) | CNBr肽3(SEQ IDNO：50) |
讨论
从经CNBr切割的mIL22RA肽的混合物中分离出5个级分。其中只有4#级分在ELISA中具有活性且在Western中显阳性。Edman降解确定出了三个N端，与级分4#中的CNBr肽2(SEQ ID NO：49)、3(SEQID NO：50)、和5(SEQ ID NO：52)相应。在这些区域中，六个残基 可能潜在地参与配基结合。这些配基是SEQ ID NO：42中的Y93、R112、K210和E211，它们也对应于SEQ ID NO：62中的Y78、R97、K195和E196残基。SEQ I DNO：42中的Y60和F164残基也参与配基结合。
B.在人IL-22RA上被中和性单克隆抗体结合的表位。
以下描述的实验的目的是确定人IL-22RA蛋白(SEQ ID NO：2)氨基酸序列中的细胞外结构域中对于受体活性或者对于拮抗剂或中和抗体结合比较重要的一个或者多个区域。然后将人可溶性受体IL-22RA蛋白(例如包含SEQ ID NO：3，例如用凝血酶切除Fc后的IL-22RA-Fc)通过与溴化氰(CNBr)共同孵育而将C端甲硫氨酸切除，或者使用本领域内已知的将此蛋白切割成确定片段的其他试剂。对经CNBr切割产生的肽进行分级分离，用ELISA检测各级分的结合活性，用Western分析反应性(使用具有中和性质的单克隆抗体)。
预测有四个半胱氨酸以二硫键形式成键，即SEQ ID NO：2中的Cys71-Cys79和Cys204-Cys217。用CNBr切割后，从非还原的全长人IL-22RA可能产生以下的肽：肽6(SEQ ID NO：56)、肽7(SEQ ID NO：57)、肽8(SEQ ID NO：58)、肽9(SEQ ID NO：59)、肽10(SEQ ID NO：60)和肽11(SEQ ID NO：61)(表35)。半胱氨酸由二硫键连接，使肽7(SEQ ID NO：57)和肽10(SEQ ID NO：60)之间产生一个可能的连接。特别地，SEQ ID NO：56对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基1(Pro)到92(Met)；SEQ ID NO：57对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基93(Thr)到120(Met)；SEQ ID NO：58对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基121(I1e)到160(Met)；SEQ ID NO：59对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基161(His)到185(Met)；SEQ ID NO：60对应于SEQ ID NO：3的氨基酸残基186(Ile)到199(Met)；SEQ ID NO：61对应于SEQ IDNO：3的氨基酸残基200(Cys)到211(Thr)。
表35
| 肽编号 | 从 | 到 | 序列 |
| CNBr肽6 | 1 | 92 | Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His ValLys Phe Gln Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile LeuThr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr Pro AspThr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly GluArg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln ArgIle Thr Arg Lys Ser Cys Asn Leu Thr Val GluThr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala ArgVal Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser AlaThr Lys Met(SEQ ID NO：56) |
| CNBr肽7 | 93 | 120 | Thr Asp Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr ThrLeu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys Ile Ser Lys V alArg Ser Ile Gln Met(SEQ ID NO：57) |
| CNBr肽8 | 121 | 160 | Ile Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala GlyAsp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile PheHis Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln ValAsn Arg Thr Tyr Gln Met(SEQ ID NO：58) |
| CNBr肽9 | 161 | 185 | His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu PhePhe Gly Leu Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu GlyThr Ile Met(SEQ ID NO：59) |
| CNBr肽10 | 186 | 199 | Ile Cys Val Pro Thr Trp Ala Lys Glu Ser Ala ProTyr Met(SEQ ID NO：60) |
| CNBr肽11 | 200 | 211 | Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg Thr TrpThr(SEQ ID NO：61) |
4.CNBr切割和肽级分的分离、Western和ELISA以及N端测序
将大约50微克的人IL22RA冻干并重溶，分级分离、收集并且用如实施例42A中描述的Western和ELISA进行分析，以鉴定含有抗IL-22RA单克隆抗体的级分以及由ELISA和Western分析显示与IL-22RA结合的那些级分。对从分析性反相层析柱上收集的CNBr肽级分用ELISA检测活性，并用Western印迹确证为阳性。使用众所周知的方法通过Edman降解鉴定阳性级分中的肽。
讨论
小鼠CNBr肽#5(SEQ ID NO：52)对应于人CNBr肽#9和#10(SEQID NO：59和SEQ ID NO：60)；小鼠CNBr肽#2(SEQ ID NO：49)对应于人CNBr肽#6(SEQ ID NO：56)；小鼠CNBr肽#3(SEQ ID NO：50)对应于人CNBr肽#7(SEQ ID NO：57)。在从经CNBr切割的人IL22RA肽的混合物中分离出的级分中，在可能区域中的六个残基可能潜在地参与配基结合：SEQ ID NO：2中对于配基-受体结合比较重要的残基(以及SEQ ID NO：3中的相应残基)包括SEQ ID NO：2中的Tyr-60和Phe-164、Tyr-93、Arg-112、Lys-210以及Glu-211(以及SEQ IDNO：3中的相应残基)。而且，SEQ ID NO：2中对于配基-受体结合比较重要的初级残基(以及SEQ ID NO：3中的相应残基)包括SEQ ID NO：2中的Tyr-60和Phe-164(以及SEQ ID NO：3中的相应残基)，次级残基包括SEQ ID NO：2中的Tyr-93、Arg-112、Lys-210和G lu-211(以及SEQ ID NO：3中的相应残基)。
从上面的实施例可以理解，尽管为了举例说明的目的在本文中已经描述了本发明的特别实施方案，但是在不脱离本发明精神和范畴的前提下，可以对实施方案进行各种不同的修改。因此，除了受所附的权利要求书的限制以外，本发明不受到限制。
Claims (24)
1.制备针对多肽的抗体的方法，包括：
(1)将选自下组中的多肽接种到非人类动物上：
(a)由SEQ ID NO：3的41号氨基酸到47号氨基酸组成的多肽；
(b)由SEQ ID NO：3的41号氨基酸到62号氨基酸组成的多肽；和
(c)由SEQ ID NO：3的84号氨基酸到97号氨基酸组成的多肽；
其中所述多肽在动物中诱发免疫应答，产生所述抗体；以及
(2)从动物中分离抗体；
其中所述抗体特异地结合具有选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列的IL-22RA多肽；并且降低具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的IL-22多肽的活性。
2.根据权利要求1的方法，其中由该方法产生的抗体降低所述IL-22多肽的促炎活性。
3.权利要求1的方法，其中由该方法产生的抗体中和所述IL-22多肽与SEQ ID NO：2的IL-22RA多肽的相互作用。
4.权利要求3的方法，其中所述抗体产生的中和通过在基于细胞的体外中和试验中对所述IL-22多肽表现出中和而测量。
5.权利要求1的方法，其中由该方法产生的抗体降低所述IL-22多肽和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的IL-20多肽二者的促炎活性。
6.权利要求1的方法，其中由该方法产生的抗体中和所述IL-22多肽和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的IL-20多肽二者与SEQ ID NO：2的IL-22RA多肽的相互作用。
7.权利要求3的方法，其中所述抗体产生的中和通过在基于细胞的体外中和试验中对所述IL-22多肽和所述IL-20多肽二者表现出中和而测量。
8.权利要求2的方法，其中所述抗体是(a)多克隆抗体，(b)鼠单克隆抗体，(c)衍生自(b)的人化抗体，(d)抗体片段，或者(e)人单克隆抗体。
9.权利要求2的方法，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒或者毒素。
10.权利要求8的方法，其中所述抗体还包含PEG化。
11.与具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的人IL-22RA多肽的抗原性表位特异性结合的单克隆抗体，其中所述抗原性表位选自：
(a)由SEQ ID NO：3的41号氨基酸到47号氨基酸所示氨基酸序列组成的表位；
(b)由SEQ ID NO：3的41号氨基酸到62号氨基酸所示氨基酸序列组成的表位；和
(c)由SEQ ID NO：3的84号氨基酸到97号氨基酸所示氨基酸序列组成的表位；
其中所述抗体降低或者中和了具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的人IL-22多肽的活性。
12.权利要求11的抗体，其中所述抗体降低或者中和所述IL-22多肽和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的人IL-20多肽二者的活性。
13.权利要求11或12的抗体，其中所述抗体选自下组中：(a)鼠单克隆抗体，(b)衍生自(a)的人化抗体，(c)抗体片段，和(d)人单克隆抗体。
14.权利要求11的抗体，其中所述抗体还包含放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、磁性颗粒、药物或者毒素。
15.权利要求11的抗体，其中所述抗体还包含PEG。
16.权利要求11的抗体在制备用于减轻哺乳动物中IL-22诱导的炎症的药物中的用途。
17.权利要求11的抗体在制备用于治疗患有炎性疾病的哺乳动物的药物中的用途，其中IL-22在所述炎性疾病中发挥作用。
18.权利要求11的抗体在制备用于治疗患有炎性疾病的哺乳动物的药物中的用途，其中IL-22RA在所述炎性疾病中发挥作用。
19.权利要求11的抗体在制备用于治疗受试对象中与IL-22RA的活性有关的病理状况的药物中的用途。
20.权利要求17至19任一项的用途，其中所述的炎性疾病或病理状况是慢性炎症病况。
21.权利要求20的用途，其中所述的慢性炎症病况选自炎症性肠病、溃疡性结肠炎、节段性回肠炎、关节炎、特应性皮炎或牛皮癣。
22.权利要求17至19任一项的用途，其中所述的炎性疾病或病理状况是急性炎症病况。
23.权利要求22的用途，其中所述的急性炎症病况是感染性疾病。
24.权利要求23的用途，其中感染性疾病选自内毒素血症、败血症、和毒性休克综合征。
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Cited By (1)
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