ES2353117T3 - Antagonistas de il-17a e il-17f y métodos de uso de los mismos antagonistas de il-17a e il-17f y métodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Polipéptido soluble aislado que comprende los exones 8 a 16 del IL-17RC (residuos aminoacídicos 193 a 447 de la SEQ ID n.º 2) y los exones 1 a 6 del IL-17RA, en el que dicho polipéptido soluble se une específicamente a la IL-17A y a la IL-17F.

Description

1

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las citocinas son proteínas pequeñas solubles que intervienen en numerosos efectos biológicos, que incluyen la regulación del crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células (véase por ejemplo, Arai et al., Annu. Rev. Biochem. 59: 783 (1990); Mosmann, Curr. Opin. Immunol. 3:311 (1991); Paul y Seder, Cell 76: 241 (1994)). Las proteínas que constituyen el grupo de citocinas incluye interleucinas, interferones, factores estimuladores de colonias, factores de necrosis tumoral y otras moléculas reguladoras. Por ejemplo, la interleucina 17 humana es una citocina que estimula la expresión de la interleucina 6, de la molécula 1 de adhesión intracelular, de la interleucina 8, del factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos, y de la prostaglandina E2, y desempeña una función importante para que los precursores hematopoyéticos CD34+ maduren preferentemente en neutrófilos (Yao et al., J. Immunol. 155: 5483 (1995); Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996)).

Los receptores que se unen a las citocinas se componen típicamente de una o más proteínas membranarias integrales que se unen a la citocina con una elevada afinidad y transmiten este acontecimiento de unión a la célula a través de las porciones citoplásmicas de determinadas subunidades de los receptores. Los receptores de las citocinas se han agrupado en varias clases en función de la similitud de sus dominios extracelulares de unión al ligando.

Las actividades demostradas in vivo de las citocinas y sus receptores ilustran el potencial clínico, y que se necesitan, otras citocinas, receptores de citocinas, agonistas de citocinas y antagonistas de citocinas. Por ejemplo, la demostración de las actividades in vivo de la familia de las citocinas proinflamatorias ilustra el enorme potencial clínico, y la necesidad, de antagonistas de las moléculas proinflamatorias. La solicitud de la patente internacional WO 2005/010044 describe anticuerpos y moléculas pequeñas para inhibir la IL-17A y la IL-17F. La solicitud de patente internacional WO 2005/065711 describe receptores quiméricos de la IL-17 y sus ligandos. No obstante, no hay una descripción de un receptor soluble de la IL-17C y la IL-17F que se una específicamente a la IL-17A y la IL-17F.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A y 1B son representaciones gráficas de la estructura de los exones del IL-17RCx1 humano (SEQ ID n.º 2). Para los aminoácidos cuyo codón cae sobre la unión exón/intrón, se desplazó el sitio de ayuste para incluir el codón entero.

Las figuras 2A y 2B son representaciones gráficas de la estructura de exones del IL17RCx4 humano (SEQ ID n.º 166).

La figura 3 es una representación gráfica de la estructura de exones del IL17RA humano (SEQ ID n.º 21).

Las figuras 4A y 4B son representaciones gráficas de la estructura de exones de un polipéptido soluble preferente de la presente invención tal y como se describe en la presente memoria y en las SEQ ID n.º 157 y 158. Este polipéptido soluble comprende exones del IL-17RA humano (SEQ ID n.º 21) y el IL-17RCx1 humano (SEQ ID n.º 2).

La figura 5 es una representación gráfica de un resultado analítico típico que utiliza el protocolo perfilado en el ejemplo 34. Se generó el gráfico con el programa informático Prizm. Los valores de Y representan la IMF (intensidad media de fluorescencia) normalizada por el máximo y el mínimo (100% y 0%) en función de los pocillos de control sólo con ligando y sin ligando/sin receptor soluble y, por lo tanto, el porcentaje de unión del ligando a las células. El programa calcula el IC50 de cada curva.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención pretende satisfacer estas necesidades al dar a conocer antagonistas para las citocinas proinflamatorias IL-17A e IL-17F. Específicamente, las citocinas proinflamatorias IL-17A e IL-17F tienen un elevado grado de similitud entre sus secuencias, comparten muchas propiedades biológicas y ambas están producidas por linfocitos T activados. Se ha demostrado que están implicadas como factores que contribuyen a la progresión de diversas enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias, que incluyen artritis reumatoide y asma. De hecho, los reactivos que anulan la función de IL-17A mejoran significativamente la incidencia de la enfermedad y la gravedad en varios modelos de ratón de la enfermedad humana. La IL-17A ejerce sus efectos a través de la interacción con su receptor cognado, el receptor de la IL-17 (IL-17R), pero todavía no se ha identificado el receptor de la IL-17F. Anteriormente, hemos descrito que el IL-17RC es un receptor de la IL-17A y la IL-17F, y que se une a ambas con una afinidad similar, muy alta. Coherentemente con esto, se ha demostrado que una forma soluble del IL-17R bloquea la unión y la señalización de la IL-17A en las células que expresan el receptor, pero no interfieren con la unión o la función de la IL-17F a la IL-17RC.

Dado que se ha propuesto que la interferencia de la IL-17A constituye un tratamiento eficaz para varias enfermedades autoinmunitarias, la utilización de los antagonistas de la presente invención, que pueden bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de la IL-17A y la IL-17F, tendrá ventajas sobre los tratamientos que actúan selectivamente sólo sobre una de estas dos citocinas. La invención da a conocer además los usos de las mismas en las enfermedades inflamatorias así como composiciones y métodos relacionados.

A) Visión general

Las enfermedades inflamatorias y relacionadas con el sistema inmunitario son la manifestación o la consecuencia de vías biológicas bastante complejas, a menudo con numerosas interconexiones, que en la fisiología normal son decisivas para responder a una agresión o lesión, iniciar la reparación de la agresión o lesión, y organizar una defensa innata y adquirida contra organismos extraños. La enfermedad

o la patología se produce cuando estas vías fisiológicas normales ocasionan una agresión o lesión adicional, bien relacionada directamente con la intensidad de la respuesta, o como consecuencia de la regulación anormal o la estimulación excesiva,

o como una reacción contra lo propio, o como una combinación de ellas.

Aunque el origen de estas enfermedades implica a menudo vías de numerosas etapas y a menudo numerosas vías o sistemas biológicos diferentes, la intervención en puntos decisivos en una o más de estas vías puede tener un efecto terapéutico o de mejora. La intervención terapéutica se puede producir mediante el antagonismo de un proceso o vía perjudicial, o mediante la estimulación de un proceso o vía beneficioso.

Se conocen muchas enfermedades inmunitarias relacionadas y se han estudiado extensivamente. Estas enfermedades incluyen enfermedades inflamatorias con mediación inmunitaria (tal como la artritis reumatoide, la insuficiencia renal con mediación inmunitaria, las enfermedades hepatobiliares, las enteropatías inflamatorias, la psoriasis y el asma), las enfermedades inflamatorias sin mediación inmunitaria, las enfermedades infecciosas, las inmunodeficiencias, las neoplasias, etc.

Los linfocitos T son un componente importante de una respuesta inmunitaria en los mamíferos. Los linfocitos T reconocen los antígenos que se asocian a una molécula propia codificada por genes del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Se puede mostrar el antígeno junto a las moléculas del CMH en la superficie de las células presentadoras de antígenos, células infectadas por virus, células cancerosas, injertos, etc. El sistema de linfocitos T elimina estas células alteradas que suponen una amenaza para la salud de un mamífero que las hospede. Los linfocitos T incluyen linfocitos T cooperadores y linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T cooperadores proliferan extensivamente después del reconocimiento de un complejo antígeno-CMH sobre una célula presentadora de antígenos. Los linfocitos T cooperadores también secretan una serie de citocinas, por ejemplo, linfocinas, que desempeñan una función central en la activación de los linfocitos B, de los linfocitos T citotóxicos y de otras muchas células que participan en la respuesta inmunitaria.

Un acontecimiento central en las respuesta inmunitaria mediada por células y la respuesta humoral es la activación y la expansión clonal de los linfocitos T cooperadores. La activación de los linfocitos T cooperadores se inicia mediante la interacción del complejo receptor de los linfocitos T (TCR)-CD3 con un antígeno-CMH sobre la superficie de una célula presentadora de antígenos. Esta interacción desencadena una cascada de acontecimientos bioquímicos que inducen a que los linfocitos T cooperadores en reposo entren en el ciclo celular (transición de G0 a G1) y da lugar a la expresión de un receptor de gran afinidad por la IL-2 y a veces por la IL-4. Los linfocitos T activados progresan a través del ciclo celular y proliferan y se diferencian en linfocitos de memoria o linfocitos efectores.

Además de las señales mediadas por el TCR, la activación de los linfocitos T implica una coestimulación adicional inducida por las citocinas liberadas por las células presentadoras de antígeno o a través de interacciones con las moléculas unidas a la membrana sobre la célula presentadora de antígeno y sobre los linfocitos T. Se ha demostrado que las citocinas IL-1 e IL-6 proporcionan una señal coestimuladora. La interacción entre la molécula B7 expresada sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno y las moléculas CD28 y CTLA-4 expresadas sobre la superficie de los linfocitos T también efectúan la activación de los linfocitos T. Los linfocitos T activados expresan un mayor número de moléculas de adhesión celular, tal como ICAM-1, integrinas, VLA-4, LFA-1, CD56, etc.

La proliferación de los linfocitos T en un cultivo mixto de linfocitos o una reacción mixta linfocítica (RML) es una indicación establecida de la capacidad de un compuesto para estimular el sistema inmunitario. En muchas respuestas inmunitarias, las células inflamatorias se infiltran en el sitio de la lesión o de la infección. Las células migratorias pueden ser neutrófilos, eosinófilos, monocitos o linfocitos, como se puede determinar mediante el estudio histológico de los tejidos afectados. «Current Protocols in Immunology», John E. Coligan Ed., 1994, John Wiley & Sons, Inc.

Las enfermedades relacionadas con la inmunidad se podrían tratar suprimiendo la respuesta inmunitaria. La utilización de receptores solubles y/o anticuerpos neutralizantes que inhiben las moléculas que tienen una actividad inmunitaria estimuladora sería beneficioso para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y con mediación inmunitaria. Se pueden utilizar moléculas que inhiben la respuesta inmunitaria (directamente las proteínas o mediante el uso de agonistas de anticuerpos) para inhibir la respuesta inmunitaria y, por lo tanto, mejorar la enfermedad relacionada con la inmunidad.

Se ha identificado que la interleucina 17 (IL-17A) es un ortólogo celular de una proteína codificada por el virus del herpes linfotrópico T Saimiri (VHS) [véase Rouvier et al., J. Immunol. 150 (12): 5445-5456 (1993); Yao et al., «J. Immunol.», 122 (12): 5483-5486 (1995) y Yao et al., Immunity, 3(6): 811-821 (1995)]. La caracterización posterior ha demostrado que esta proteína es una citocina potente que actúa induciendo respuestas proinflamatorias en una amplia variedad de tejidos periféricos. La IL-17A es una citocina homodimérica unida por puentes disulfuro de unos 32 kDa que sintetizan y secretan sólo los linfocitos T de memoria CD4+ activados (revisado en Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16: 541-551 [1998]). Específicamente, la IL-17 se sintetiza como un polipéptido precursor de 155 aminoácidos con una secuencia señal en el extremo amino de 19 a 23 residuos y se secreta como una glucoproteína homodimérica unida por puentes disulfuro. Se describe la IL-17A en las patentes internacionales WO9518826 (1995), WO9715320 (1997) y WO9704097 (1997), así como en la patente de los EE.UU. n.º 6 063 372.

A pesar de la escasa distribución en los tejidos, la IL-17A muestra actividades biológicas pleótropas en varios tipos de células. Se ha encontrado que la IL-17A estimula la producción de muchas citocinas. Induce la secreción de la IL-6, la IL-8, la IL-12, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la prostaglandina E2, MCP-1 y el G-CSF mediante células adherentes como fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales y células endoteliales. La IL-17A también tiene la capacidad de inducir la expresión en la superficie de ICAM-1, la proliferación de los linfocitos T y el crecimiento y la diferenciación en neutrófilos de las células progenitoras humanas CD34+. La IL-17A también ha estado implicada en el metabolismo óseo y se ha sugerido que desempeña una función importante en las situaciones patológicas caracterizadas por la presencia de linfocitos T activados y la producción del TNF�, tal como la artritis reumatoide y el aflojamiento de los implantes óseos (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res. 14: 1513-1521 [1999]). Se encontró que los linfocitos T activados del tejido sinovial obtenidos de pacientes con artritis reumatoide secretan cantidades más grandes de IL17A que los obtenidos de individuos normales o pacientes con artrosis (Chabaud et al., Arthritis Rheum. 42: 963-970 [1999]). Se sugirió que esta citocina proinflamatoria contribuía activamente a la inflamación sinovial en la artritis reumatoide. Además de esta función proinflamatoria, la IL-17A parece contribuir a la anatomopatología de la artritis reumatoide, aunque por otro mecanismo. Por ejemplo, se ha demostrado que la IL-17A induce la expresión del ARNm del factor de diferenciación de osteoclastos (ODF) en los osteoblastos (Kotake et al., J. Clin. Invest. 103: 1345-1352 [1999]). El ODF estimula la diferenciación de las células progenitoras en osteoclastos, que son las células implicadas en la resorción ósea.

Dado que la concentración de IL-17A aumenta significativamente en el líquido sinovial de los pacientes con artritis reumatoide, parece que la formación de osteoclastos inducida por la IL-17A desempeña una función decisiva en la resorción ósea de la artritis reumatoide. También se cree que la IL-17A desempeña una función clave en determinados trastornos autoinmunitarios tal como la esclerosis múltiple (Matusevicius et al., Mult. Scler., 5: 101-104 [1999]). Además, se ha demostrado que la IL-17A, mediante señalización intracelular, estimula la entrada de Ca2+ y la reducción de la concentración de AMPc en los macrófagos humanos (Jonavic et al., J. Immunol.,

160: 3513 [1998]). Los fibroblastos tratados con la IL-17A inducen la activación del NF�B, [Yao et al., Immunity, 3:811 (1995), Jovanovic et al., véase más arriba], aunque los macrófagos tratados con ella activan el NF�B y las proteína cinasas activadas por mitógenos (Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem., 273: 27467 [1998]).

Adicionalmente, la IL-17A también comparte similitud de secuencia con el factor 7 de tipo citocina de los mamíferos que está implicado en el crecimiento de los huesos y del cartílago. Otras proteínas con las que los polipéptidos de la IL-17A comparten similitud de secuencia son el factor relacionado con la interleucina obtenido de embriones humanos (EDIRF) y la interleucina 20.

De modo coherente con el amplio margen de efectos de la IL-17A, se ha encontrado que el receptor de la superficie celular de la IL-17A se expresa ampliamente en muchos tejidos y tipos de células (Yao et al., Cytokine, 9:794 [1997]). Mientras que la secuencia de aminoácidos del receptor de la IL-17A de humanos (IL17R) (866 aminoácidos) predice una proteína con un único dominio transmembranario y un gran dominio intracelular de 525 aminoácidos, la secuencia receptora es única y no se parece a la ninguno de los receptores de la familia de los receptores de citocinas/factores de crecimiento. Esto, unido a la falta de similitud de la propia IL-17A con otras proteínas conocidas, indica que la IL-17A y su receptor pueden ser parte de una nueva familia de proteínas y de receptores señalizadores. Se ha demostrado que la actividad de la IL-17A está mediada por la unión a su único receptor de la superficie celular, sobre lo que los estudios anteriores han demostrado que poner en contacto los linfocitos T con una forma soluble del polipéptido del receptor de la IL-17A inhibía la proliferación de los linfocitos T y la producción de IL-2 inducida por PHA, concanavalina A y el anticuerpo monoclonal anti-TCR (Yao et al., J. Immunol., 155: 5483-5486 [1995]). Por lo tanto, hay un gran interés por identificar y caracterizar nuevos polipéptidos que tengan homología con los receptores de citocinas conocidos, específicamente los receptores de la IL-17A.

El patrón de expresión de la IL-17F parece ser similar al de la IL-17A, de tal modo que incluye sólo linfocitos T CD4+ activados y monocitos (Starnes et al., J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]). Se ha demostrado que la IL-17F induce a G-CSF, IL-6 e IL-8 en los fibroblastos (Hymowitz et al., EMBO J. 20: 5322-5341 [2001]) y el TGF� en las células endoteliales (Starnes et al., J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]). Recientemente, se ha descrito que la IL-23, una citocina producida por las células dendríticas, puede intervenir en la producción de IL-17A y de IL-17F, principalmente en los linfocitos T de memoria (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. 278: 1910-1914 [2003]).

Además, se ha demostrado la IL-17A y la IL-17F se sobreexpresan en inducen en los individuos con artritis y asma (revisado por Moseley et al. Cytokine Growth Factor Rev 14:155-174 [2003]). Con respecto a la artritis, estas citocinas actúan de un modo característico sobre el cartílago y la destrucción articular que se asocia a la artritis reumatoide y la artrosis. Por ejemplo, se ha demostrado que la IL-17A y la IL17F activan la degradación de la matriz en los explantes del cartílago articular mediante la liberación de glucosaminoglucanos, un proteoglucano del cartílago, y fragmentos de colágeno, al mismo tiempo que se inhibe la síntesis de nuevos proteoglucanos y colágenos (Cai et al. Cytokine 16:10-21 [2001]; Attur et al Arthritis Rheum 44: 2078-2083 [2001]).

También se ha demostrado que, de modo similar a la IL-17A, la sobreexpresión de la IL-17F en los ratones aumenta el reclutamiento de neutrófilos al pulmón y da lugar a que aumente la expresión de las citocinas asociadas a Th1 en el pulmón, incluidas IL-6, IFN-�, IP-10 y MIG (Starnes et al., J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]). También se indujo la IL-17F en los linfocitos T de asmáticos expuestos a alérgenos (Kawaguchi et al. J. Immunol. 167:4430-4435 [2001]), y se encontró que inducía la producción de IL-6 y de IL-8 en células NHBE. A diferencia de la IL-17A, la IL-17F parece inhibir la angiogénesis in vitro (Starnes et al. J. Immunol. 167: 4137-4140 [2001]).

No se detectó el ARNm de la IL-17F mediante transferencia Northern en diferentes tejidos humanos, pero se indujo espectacularmente al activarse los linfocitos T CD4+ y los monocitos. Id. En los ratones, se halló que los linfocitos Th2 y los mastocitos expresan la IL-17F cuando se activan. Véase Dumont, Expert. Opin. Ther. Patents 13(3) (2003). Al igual que la IL-17A, también se encontró que la IL-23 inducía la expresión de la IL-17F en los ratones.

Las familias de citocina IL-17/receptor parecen representar un sistema de señalización único dentro de la red de citocinas que ofrecerá estrategias innovadoras para la manipulación de respuestas inmunitarias e inflamatorias. Por consiguiente, la presente invención se basa en el descubrimiento de un nuevo receptor de la familia de

IL-17, IL-17RC, y su capacidad para unirse a la IL-17A y la IL-17F.

Primero se identificó el IL-17RC utilizando una estrategia bioinformática para buscar proteínas relacionadas con IL-17RA y se identificó mediante un ADNc que codificaba la proteína IL-17RC relacionada con el receptor de IL-17. A pesar de su similitud obvia con el receptor de IL-17 (IL-17RA), que se une al miembro prototípico IL-17A de la familia de IL-17, y la identificación de otros cinco miembros de la familia de las citocinas IL-17, no se ha descrito anteriormente ningún ligando específico del IL17RC. No obstante, IL-17A e IL-17F se identificaron como los ligandos específicos del IL-17RC, tal y como se describió en la solicitud de patente de los EE.UU. n.º 11/150 533, registrada el 10 de junio de 2005 y publicada como la publicación de patente de los EE.UU. n.º 20060002925. Específicamente, se identificaron estos ligandos utilizando células de riñón de hámsters recién nacidos (BHK) que se transfectaron establemente con construcciones que codificaban el IL-17RA (hIL-17RA)

o el IL-17RC (hIL-17RC) humanos. Se confirmó la expresión de los receptores sobre la superficie mediante un análisis FACS utilizando bien un anticuerpo monoclonal contra el hIL-17RA o un antisuero policlonal contra el hIL-17RC. Para evaluar la unión de las citocinas, se utilizaron las formas biotiniladas de las IL-17A, C, D, E y F humanas y estreptavidina conjugada a fluorocromo para detectar la unión de las citocinas a las células transfectadas mediante citometría de flujo. Los resultados demostraron claramente que, como se esperaba, a las células BHK transfectadas establemente que expresan hIL-17RA se les une claramente la IL-17A humana (hIL-17A), mientras que a las transfectadas con el vector de expresión vacío no se les unía ningún miembro analizado de la familia de la IL-17. También se observó la unión relativamente débil de la IL-17F humana (hIL-17F) a las células transfectadas con hIL-17RA, pero no había ninguna unión significativa de otros miembros analizados de la familia de la IL-17. Se examinó la capacidad de unión de otros miembros de la familia de la IL-17 a las células transfectadas con hIL-17RC y se observó que a estas células se unía una cantidad significativa de hIL-17F. Además, se observó la unión significativa de la hIL17A a estas células, pero ninguna unión de las hIL-17C, D o E. Estos datos demostraron que el hIL-17RC era el receptor de la hIL-17F y la hIL-17A.

Además, se examinó el nivel de fluorescencia en un intervalo de concentraciones de citocinas para determinar las afinidades relativas de la hIL-17A y F por el hIL-17RA y el hIL-17RC. Al comprar las intensidades de fluorescencia medias de cada citocina en cada transfectante, se observó que la hIL-17A se unía mucho mejor al hIL-17RA que la hIL-17F, pero que ambas citocinas parecían unirse igualmente bien a las células transfectadas con hIL-17RC. Resulta interesante que la

unión de las citocinas a las células que expresaban ambos receptores pareciera ser aditiva, sin ningún indicio de cooperatividad. A continuación se investigó la especificidad de esta unión al hacerla competir con con una citocina sin marcar. Se incubaron las células BHK transfectadas con una

5 concentración fija de citocina biotinilada y concentraciones crecientes de citocina sin marcar y se cuantificó con un análisis FACS la cantidad de material biotinilado unido. Se demostró que la unión de hIL-17A y F al hIL-17RC era específica porque las concentraciones crecientes de citocina sin marcar interferían con la unión del material biotinilado. De hecho, las hIL-17A y F sin marcar rivalizaban de modo eficaz por la

10 unión de las formas biotiniladas de ambas citocinas a las células transfectadas con hIL-17RC, lo que sugería que las dos citocinas se estaban uniendo al hIL-17RC con afinidades similares, y que se estaban uniendo en sitios solapantes, si es que no eran realmente el mismo. La hIL-17A sin marcar también competía eficazmente con la unión de ambas hIL-17A y F biotiniladas a las células transfectadas con hIL-17RA,

15 mientras que la hIL-17F sin marcar no mostraba prácticamente ninguna capacidad de competición con hIL-17A por la unión al hIL-RA. Esto indicaba que aunque la hIL-17F mostraba una unión específica al hIL-17RA, la avidez de esta interacción parecía ser significativamente más baja que la interacción entre hIL-17A y hIL-17RA. Se realizaron estudios de saturación de la unión para medir la afinidad de las

20 hIL-17A y F al hIL-17RC y al hIL-17RA. Las estirpes de las células BHK que expresan establemente el hIL-17RA o el hIL-17RC se incubaron con hIL-17A o F yodada en condiciones de unión saturante para determinar las constantes de afinidad de cada citocina para cada receptor. La hIL-17A se unía tanto al hIL-17RA como al hIL-17RC con afinidades similares (tabla1). Específicamente, las células BHK transfectadas con

25 el receptor indicado se utilizaron para establecer valores de Kd para hIL-17A y hIL-17F como se describe en Métodos. Los resultados mostrados son valores de Kd medios obtenidos con determinaciones por triplicado.

Tabla 1

hIL-17A

hIL-17F

hIL-17RC (x1)1

0,6 nM 1,0 nM

hIL-17RA

1,9 nM 1,5 µM

1Indica la variante de ayuste x1 del hIL-17RC. Además, la afinidad de la hIL-17F por hIL-17RC era muy similar a la afinidad de

hIL-17A por su receptor (véase la tabla 1 anterior). Sin embargo, de modo coherente con los resultados obtenidos mediante citocinas biotiniladas, la afinidad de la hIL-17F por hIL-17RA era casi 1000 veces menor con respecto a las otras afinidades medidas (Id). Esto indica que las hIL-17A y F se unen al hIL-17RC con afinidades similares, pero sus afinidades por hIL-17RA difieren espectacularmente.

La observación de que al hIL-17RC se unen ambas hIL-17A y F con una elevada afinidad sugiere que las células que expresan el hIL-17RC deben ser igualmente capaces de responder a hIL-17A y F. Por otra parte, dado que al hIL-17RA se le unía la hIL-17A con un elevada afinidad, pero la hIL-17F unas 1000 veces menos, la implicación es que las células que expresan el hIL-17RA, en condiciones fisiológicas, sólo responderían a la hIL-17A. Anteriormente se ha demostrado que el hIL-17RA se expresa ubicuamente, pero se ha descrito que su expresión es mayor en células hematopoyéticas y menor en otros tejidos. Por lo tanto, se examinó la expresión del hIL-17RC para determinar el nivel del solapamiento de los patrones de expresión. El análisis de transferencia Northern demostró que el hIL-17RC se expresaba en gran cantidad en los tejidos glandulares como la glándula suprarrenal, la próstata, el hígado y la tiroides, sin detectarse ninguna expresión en los tejidos hematopoyéticos.

Para investigar adicionalmente la expresión de estos receptores en las células hematopoyéticas, también se examinó la unión de hIL-17A y F biotiniladas a las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante un análisis de FACS multiparamétrico. Los resultados indicaban que la hIL-17A se unía a casi todos los subconjuntos de CMSP examinados, mientras que la hIL-17F no proporcionó una unión detectable a ninguna de estas poblaciones. Esto es coherente con la capacidad de unión de alta afinidad del hIL-17RA a la hIL-17A, pero no a la hIL-17F, y con la detección del ARNm del hIL-17RC en las CMSP. En conjunto, estos datos indican que el IL-17RC se expresa preferentemente en los tejidos no hematopoyéticos, mientras que el IL-17RA se expresa preferentemente en las células hematopoyéticas.

La gran afinidad de unión de las hIL-17A y F por las células transfectadas con el hIL-17RC sugiere que un tratamiento eficaz podría ser una forma soluble del hIL17RC. Tal molécula sería un antagonista eficaz de estas dos citocinas. Para evaluar esto directamente, se produjo una forma soluble del hIL-17RC humano como una proteína de fusión con Fc y se evaluó su capacidad para inhibir la unión de las hIL-17A y F. Estos efectos se compararon a continuación con los resultados obtenidos al utilizar una forma soluble del hIL-17RA. Se incluyeron concentraciones crecientes del hIL-17RC-Ig o del hIL-17RA-Ig en reacciones de unión y se utilizó el análisis FACS

para evaluar los efectos de los receptores solubles en la unión de citocinas biotiniladas a células BHK transfectadas establemente. El hIL-17RC soluble inhibió con una intensidad similar la unión de las hIL-17A y F, mientras que una proteína de fusión con Fc de otro miembro de la familia del IL-17R, el IL-17RD, no tuvo ningún efecto. Por 5 otra parte, el hIL-17RA soluble bloqueó eficazmente la unión de la hIL-17A, pero no tuvo casi ningún efecto sobre la unión de la hIL-17F. Se obtuvieron resultados similares al examinar la unión de la hIL-17A a las células hematopoyéticas. Esta unión se bloqueó eficazmente utilizando el hIL-17RA-Ig y el hIL-17RC-Ig pero no el hIL-17RD-Ig. Estos datos son coherentes con los resultados obtenidos de las mediciones

10 de afinidad e indican que los receptores solubles se comportan del mismo modo que sus formas ancladas en la membrana. Como una evaluación adicional de la capacidad de unión del hIL-17RC-Ig humano a las hIL-17A y F, se evaluó la afinidad del receptor soluble por estas citocinas utilizando el análisis de Biacore. El hIL-17RC soluble se unió a las hIL-17A y

15 F con gran afinidad (tabla 2), lo que corrobora la idea de utilizar este reactivo como un antagonista de los efectos de las hIL-17A y F in vivo. Específicamente, se capturaron receptores solubles en chips y se realizaron experimentos de unión como se describe más adelante. UI = Unión indetectable.

20 Tabla 2

hIL-17RC-Ig

ka (asociación) kd (disociación) KD

mIL17A

UI

mIL17F

UI

hIL17A

1,05E+06 4,90E–04 0,469 nM

1,24E+06

4,38E–04 0,352 nM

hIL17F

9,91E+05 4,31E–04 0,435 nM

1,11E+06

3,84E–04 0,346 nM

mL-17RA-Ig

ka(asociación) kd (disociación) KD

mIL-17A

9,78E+05 6,79E–05 0,069 nM

1,12E+06

7,99E–05 0,072 nM

mIL17F

UI

El número de variantes de ayuste en los humanos es mucho mayor y, por lo

tanto, realizamos los primeros experimentos sólo en un subconjunto de estas moléculas. Las elegidas para el análisis también diferían por la inclusión o exclusión del exón 7, pero, a diferencia del ratón, todas las variantes de ayuste incorporaban el exón 8. El aceptor de ayuste críptico encontrado en medio de la secuencia del exón 8 5 de ratón no está presente en el exón 8 humano. Sin embargo, las otras variantes de ayuste analizadas incluyeron o excluyeron el exón 12 del hIL-17RC. Estas variantes se denominaron hIL-17RCx1 (idéntica en la composición de exones a la de ratón x1 de más arriba), hIL-17RCx4 (idéntica en la composición de exones a la de ratón x4 de más arriba), hIL-17RCx2 y hIL-17RCx7. De nuevo, estas variantes de ayuste se 10 expresaron transitoriamente en células 293F y se analizó su capacidad para unirse a las IL-17A y F biotiniladas de humano y ratón, y los resultados se resumen en la tabla

3.

Tabla 3

Exones1

Unión de citocinas2

Variante

7 8 12 hIL-17A hIL-17F mIL-17A mIL-17F

Humano

IL-17RCx4 + + + + + - +

IL-17RCx1

- + + + + - -

IL-17RCx2

- + - - - - -

IL-17RCx7

+ + - - - - -

15 1Señala los exones que se incluyeron completamente en el transcrito. 2(+) indica una unión significativa detectable a la citocina evaluada por un aumento significativo de la fluorescencia mediante FACS. (-) indica que la fluorescencia no cambió significativamente.

20 En concordancia con los experimentos presentados anteriormente, el hIL17RCx1 se unió a las hIL-17A y F, pero no se unió a ninguna citocina de ratón. El hIL17RCx4 también se unió a ambas citocinas humanas y, al igual que su homólogo de ratón, se unió a la mIL-17F pero no a la mIL-17A. Los hIL-17RCx2 y x7 no lograron unirse a ninguna de las cuatro citocinas analizadas, aunque se expresaron claramente

25 en la superficie de las células transfectadas, ya que un antisuero policlonal contra el hIL-17RC tiñó los linfocitos CD8+ (datos sin mostrar). Estos resultados de unión se repitieron fielmente también en las células BHK transfectadas establemente. En conjunto, estos datos respaldan las conclusiones relacionadas con las porciones esenciales de la proteína IL-17RC que se necesitan para unirse a las citocinas humanas.

Numerosas publicaciones han estudiado la IL-17A y, en menor grado, la IL-17F por contribuir a la progresión y la gravedad de la enfermedad de la artritis inducida por colágeno (AIC) de ratón y la artritis reumatoide humana. Se examinó la expresión de las mIL-17A y F en las articulaciones o los ganglios linfáticos de drenaje (GLD) de ratones que se habían inmunizado con colágeno para inducir la AIC. El análisis mediante PCR en tiempo real demostró claramente que las dos citocinas estaban inducidas en ambos tejidos en los ratones enfermos respecto a los controles sin inmunizar, lo que indicaba claramente que la expresión se correlacionaba con la enfermedad. Además, también se examinó la expresión relativa del mIL-17RA y del mIL-17RC en los mismos tejidos. No obstante, en este caso, no hay una correlación reproducible de la expresión de ninguno de los receptores con la enfermedad. Además, lo que resultaba obvio era la discrepancia en la expresión al comparar el GLD con tejido no hematopoyético (pata trasera). En concordancia con los resultados anteriores que contemplan la expresión de los receptores humanos, se encontró que el mIL-17RA se expresaba bastante más en el tejido hematopoyético y el mIL-17RC se expresaba más en el tejido no hematopoyético. Estos datos sugieren que la expresión de la mIL-17A y la mIL-17F se correlaciona con la enfermedad, que los dos receptores necesarios están presentes en los tejidos normal y enfermo, y sugiere que la neutralización de estas citocinas pueden ser un tratamiento eficaz para prevenir la progresión de la enfermedad.

En consecuencia, el receptor cognado de las IL-17A y F ha resultado ser el IL17RC. En particular, el hIL-17RC se une a las hIL-17A y F con afinidades similares. Dado que estos dos miembros de la familia de la IL-17 comparten una identidad de secuencia del 55%, quizás no resulta sorprendente que compartan receptores. Sin embargo, el hIL-17RA se une a la hIL-17A con gran afinidad pero se une a la hIL-17F con una afinidad que es casi 1000 veces menor, lo que sugiere que, en condiciones fisiológicas, el hIL-17RA no se uniría a la hIL-17F. La consecuencia es que las células que expresan el hIL-17RC deben responder a las hIL-17A y F, mientras que las células que sólo expresan el hIL-17RA sólo responderán a la IL-17A. Esta diferencia podría tener un impacto en cómo estas citocinas afectan a los diferentes tejidos. Mediante este análisis de expresión, se demostró que aunque la IL-17RA se exprese en todas partes, se expresaba mucho más en las células hematopoyéticas, mientras que el IL17RC tiende a expresarse en los tejidos no hematopoyéticos y no se expresa en las células hematopoyéticas. En concordancia con esto, a todos los subconjuntos de células mononucleares de la sangre periférica humana se les une la hIL-17A pero no la hIL-17F. Además, esto sugiere que los tejidos no hematopoyéticos deben responder a las IL-17A y F, mientras que las células hematopoyéticas sólo deben responder a la IL-17A.

Este examen de la unión de las citocinas a las diferentes variantes de ayuste del IL-17RC ha revelado que el receptor tiene dos porciones esenciales para la unión de las citocinas, y que hay diferencias sutiles en las características de unión de las citocinas humanas y de ratón. Además, estas características son concordantes para las citocinas independientemente de la especie del receptor examinado. Tal y como se muestra de los datos presentados en la tabla 3, se necesita el exón 12 y todo el exón 8 para que las hIL-17A y F se unan al IL-17RC, ya que estas citocinas sólo se unen a las variantes humanas x1 y las variantes humanas x4. Cada una de estas isoformas incluye el exón 8 y el exón 12, aunque difieren con respecto a si el exón 7 está incluido

o no. Esto implica que el exón 7 es dispensable para la unión de las citocinas humanas.

La importancia de generar un antagonista para la función de la IL-17A y de la IL-17F parece clara a partir de la información disponible que muestra una correlación fuerte entre la expresión de las IL-17A y F y la progresión de una serie de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Estas dos citocinas inducen otras citocinas y quimiocinas inflamatorias así como metaloproteasas de la matriz, que contribuyen a la destrucción ósea y del colágeno en la artritis autoinmunitaria. Este reactivo debe servir de tratamiento eficaz para la artritis reumatoide y para otras enfermedades inflamatorias en las que intervienen las hIL-17A y F.

Por lo tanto, se desarrollaron las formas solubles del IL-17RC humano para servir como un antagonista para la IL-17A y la IL-17F. Terapéuticamente, estos polipéptidos solubles del IL-17RC fueron eficaces. Sin embargo, debido a numerosos factores, el IL-17RC soluble no se secreta fácilmente desde los numerosos y distintos sistemas de producción disponibles en la técnica. Ni se secreta en las cantidades adecuadas necesarias para propósitos de fabricación. Por lo tanto, en la técnica se necesita desarrollar antagonistas de la IL-17A y la IL-17F que se puedan expresar y secretar en cantidades que se puedan escalar para su fabricación.

En consecuencia, la presente invención responde a esta necesidad al dar a conocer antagonistas de las IL-17A e IL-17F que se pueden expresar y secretar. Específicamente, la presente invención se basa en el desarrollo y el descubrimiento de un polipéptido soluble aislado que comprende los exones 8-16 del IL-17RC (restos aminoacídicos 193-447 de la SEQ ID n.º 2) y los exones 1-6 del IL-17RA, en la que dicho polipéptido soluble se une específicamente a la IL-17A y a la IL-17F. Como tales, los antagonistas de la actividad de la IL-17F y la IL-17A, tal como el receptor soluble IL-17RC/IL-17RA de la presente invención, son útiles para el tratamiento terapéutico de enfermedades inflamatorias, particularmente como antagonistas de la IL-17F y la IL-17A solos o juntos en el tratamiento de enfermedades que implican a estas moléculas. Además, los antagonistas de la actividad de la IL-17A y la IL-17F son útiles para el tratamiento terapéutico de otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la IL-17F y la IL-17A (juntas o por separado) en el tratamiento de la psoriasis, dermatitis de contacto, enteropatía inflamatoria (IBD), síndrome del intestino irritable (SII), colitis, artritis, artritis reumatoide, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enteropatías inflamatorias tales como colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, rechazo a aloinjertos de órganos y rechazo a transplantes de riñón, pulmón y corazón, etc.

Las subunidades de los receptores de las citocinas se caracterizan por una estructura con varios dominios que comprenden un dominio de unión a ligandos y un dominio efector que normalmente está implicado en la transducción de señales. Los receptores de citocinas multiméricos incluyen monómeros, homodímeros (por ejemplo, las isoformas �� y �� del receptor del PDGF, receptor de la eritropoyetina, MPL [receptor de la trombopoyetina] y receptor del G-CSF), heterodímeros cuyas subunidades tienen dominios de unión a ligandos y dominios efectores (por ejemplo, isoforma �� del receptor del PDGF) y multímeros compuestos por subunidades con funciones dispares (por ejemplo, receptores de IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 y GMCSF). Algunas subunidades del receptor son comunes a muchos receptores. Por ejemplo, la subunidad AIC2B, que no puede unirse al ligando por sí sola, pero que incluye un dominio intracelular de transducción de señales, es un componente de los receptores de la IL-3 y del GM-CSF. Muchos receptores de citocinas se pueden colocar en una de las cuatro familias relacionadas en función de sus estructuras y funciones. Los receptores hematopoyéticos de clase I, por ejemplo, se caracterizan por la presencia de un dominio que contiene residuos de cisteína conservados y el motivo WSXWS. En algunos receptores hematopoyéticos hay otros dominios adicionales, que incluyen dominios proteína cinasa; dominios de tipo III de la fibronectina; y dominios inmunoglobulina, que se caracterizan por bucles con enlaces disulfuro. Se ha revisado la estructura del receptor de las citocinas en Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:221-228, 1991 y Cosman, Cytokine 5:95-106, 1993. Gpor lo general, se cree que bajo la presión selectiva de los organismos para adquirir nuevas funciones biológicas, surgen nuevos miembros de la familia de receptores por la duplicación de los genes de receptores ya existentes, lo que conduce a la existencia de familias multigénicas. Por lo tanto, los miembros de la familia contienen vestigios del gen ancestral, y se pueden explotar estas características para aislar e identificar otros miembros de la familia.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido soluble aislado que comprende los exones 8-16 del IL-17RC (residuos aminoacídicos 193-447 de la SEQ ID n.º2) y los exones 1-6 del IL-17RA, en el que dicho polipéptido soluble se une específicamente a la IL-17A y la IL-17F.

El receptor del IL-17RC tiene un gran número de variantes de ayuste según se incluyan o se excluyan exones específicos. Tal y como se describe más adelante, algunos de estos exones se necesitan para la unión del ligando (IL-17A y/o IL-17F).

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de la similitud estructural («dominios») entre el IL-17RC y otros miembros de la familia IL-17, tal como IL-17RA (SEQ ID n.º 21). Específicamente, se identificaron tres dominios:

1) El dominio 1 (SEQ ID n.º 159 y 160) comprende los exones 8-10 del IL17RC. Esto corresponde a los restos aminoacídicos del IL-17RCx1 193-276 de la SEQ ID n.º 2 y los restos aminoacídicos del IL-17RCx4 208-291 de la SEQ ID n.º 166.

2) El dominio 2 (SEQ ID n.º 161 y 162) comprende los exones 11-13 del IL17RC. Esto corresponde a los restos aminoacídicos del IL-17RCx1 277-370 de la SEQ ID n.º 2 y los restos aminoacídicos del IL-17RCx4 292-385 de la SEQ ID n.º 166.

3) El dominio 3 (SEQ ID n.º 163 y 164) comprende los exones 14-16 del IL17RC. Esto corresponde a los restos aminoacídicos del IL-17RCx1 371-447 de la SEQ ID n.º 2 y los restos aminoacídicos del IL-17RCx4 386-462 de la SEQ ID n.º 166).

La presente invención también da a conocer el polipéptido soluble de la presente invención para utilizarlo en las enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias humanas. El polipéptido soluble de la presente invención se puede utilizar para bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de la IL-17A y la IL-17F para el tratamiento de la inflamación y las enfermedades inflamatorias tales como psoriasis, artritis reumatoide, IBD, SII, colitis, asma, rechazo del aloinjerto, esclerosis múltiple y otras enfermedades inflamatorias descritas en la presente memoria.

Se da a conocer una secuencia nucleotídica ilustrativa que codifica el IL-17RC humano («IL-17RCx1») en la SEQ ID n.º 1; el polipéptido codificado se muestra en la SEQ ID n.º 2. El IL-17RC funciona como un receptor de la IL-17A (SEQ ID n.º 13 y 14) y de la IL-17F (SEQ ID n.º 15 y 16). El IL-17RC puede actuar como un monómero, como un homodímero o como un heterodímero. Tal y como se describe en la presente solicitud, el polipéptido soluble de la presente invención comprende el IL-17RC y porciones del IL-17RA («IL-17RC/IL-17RA»). Como tal, la presente invención abarca receptores solubles que comprenden porciones del IL-17RC en combinación con el IL17RA. El IL-17RC se describe en la solicitud de patente de los EE.UU. n.º 10/458 647 del mismo propietario que la presente, y en la patente internacional WO n.º 01/04304 de publicación WIPO del mismo propietario que la presente. El análisis de un clon del ADNc humano que codifica el IL-17RC (SEQ ID n.º 1) reveló un marco de lectura abierto que codificaba 692 aminoácidos (SEQ ID n.º 2) que comprendían una posible secuencia señal de unos 20 restos aminoacídicos (restos aminoacídicos 1 a 20 de la SEQ ID n.º 2), un dominio extracelular de unión al ligando de unos 431 restos aminoacídicos (restos aminoacídicos 21 a 452 de la SEQ ID n.º 2; SEQ ID n.º 3), un dominio transmembranario de unos 20 restos aminoacídicos (restos aminoacídicos 453 a 473 de la SEQ ID n.º 2), y un dominio intracelular de unos 203 restos aminoacídicos (restos aminoacídicos 474 a 677 de la SEQ ID n.º 2). Además, se representa un dominio de unión al ligando mediante la SEQ ID n.º 22.

Otra secuencia nucleotídica ilustrativa más que codifica una variante humana del IL-17RC, denominada «IL-17RCx4» se da a conocer mediante la SEQ ID n.º 165, mostrándose el polipéptido codificado en la SEQ ID n.º 166. Los péptidos señal predichos son de los restos 1 a 60 de la SEQ ID n.º 165 y de 1 a 20 de la SEQ ID n.º 166; el dominio extracelular va de los restos 61 a 1401 de la SEQ ID n.º 165 y de 21 a 467 de la SEQ ID n.º 166; el dominio transmembranario va de los restos 1402 a 1464 de la SEQ ID n.º 165 y de 468 a 488 de la SEQ ID n.º 166; y el dominio intracelular va de los restos 1465 a 2121 de la SEQ ID n.º 165 y de 489 a 707 de la SEQ ID n.º 166.

Otra secuencia nucleotídica ilustrativa más que codifica una variante humana del IL-17RC, denominada «IL-17RC-1» se da a conocer mediante la SEQ ID n.º 4; el polipéptido codificado se muestra en la SEQ ID n.º 5. El IL-17RC-1 se describe en la solicitud de patente de los EE.UU del mismo propietario que la presente n.º 10/458 647 y la publicación de patente internacional WO n.º 01/04304 de la WIPO del mismo propietario que la presente. El análisis de la secuencia reveló que el IL-17RC-1 es una forma truncada del polipéptido receptor. Es decir, el IL-17RC-1 carece de los restos de aminoácidos 1 a 113 de la SEQ ID n.º 2. La SEQ ID n.º 10 presenta una secuencia de aminoácidos de un polipéptido del IL-17RC-1 que incluye la porción del extremo amino del IL-17RC.

Una comparación de las secuencias de aminoácidos del IL-17RC y del IL17RC-1 también indicaba que los dos polipéptidos representan variantes de ayuste alternativo. La secuencia de aminoácidos del IL-17RC incluye un segmento de 17 aminoácidos (restos aminoacídicos 339 a 355 de la SEQ ID n.º 2), que no aparece en el IL-17RC-1, mientras que el IL-17RC carece, después del aminoácido 479, de un segmento de 13 aminoácidos encontrado en el IL-17RC-1 (restos de aminoácidos 350 a 362 de la SEQ ID n.º 5). Un polipéptido que contiene ambos segmentos de aminoácidos se da a conocer en SEQ ID n.º 11, mientras que la SEQ ID n.º 12 presenta la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que carece de ambos segmentos de 13 y 17 aminoácidos.

Otra secuencia nucleotídica ilustrativa más que codifica una variante humana del IL-17RC, denominada «IL-17RC-6» se da a conocer en la SEQ ID n.º 23; el polipéptido codificado se muestra en la SEQ ID n.º 24. El IL-17RC-6 contiene una deleción de 25 restos de aminoácidos en comparación con el IL-17RC que se realiza en la SEQ ID n.º 2. Específicamente, el IL-17RC-6 no contiene del resto aminoacídico 94 al resto aminoacídico 118 de la SEQ ID n.º 2. El análisis de un clon del ADNc humano que codifica el IL-17RC-6 (SEQ ID n.º 23) reveló un dominio extracelular de unión al ligando de unos 427 restos aminoacídicos (restos aminoacídicos 1 a 427 de la SEQ ID n.º 24), un dominio transmembranario de unos 20 restos aminoacídicos (restos aminoacídicos 428 a 448 de la SEQ ID n.º 24), y un dominio intracelular de unos 218 restos aminoacídicos (restos aminoacídicos 449 a 667 de la SEQ ID n.º 24).

Una secuencia nucleotídica ilustrativa que codifica una variante murina del IL17RC se da a conocer en la SEQ ID n.º 25; el polipéptido codificado se muestra en la SEQ ID n.º 26. El IL-17RC murino funciona como un receptor de la IL-17A murina (SEQ ID n.º 17 y 18) y la IL-17F murina (SEQ ID n.º 19 y 20). El análisis de un clon del ADNc murino que codifica el IL-17RC (SEQ ID n.º 25) reveló un dominio extracelular de unión al ligando de unos 449 restos aminoacídicos (SEQ ID n.º 27). Además, se representa un dominio de unión al ligando en la SEQ ID n.º 28.

Otra secuencia nucleotídica ilustrativa más que codifica una variante murina del IL-17RC se da a conocer en la SEQ ID n.º 29; el polipéptido codificado se muestra en la SEQ ID n.º 30.

El gen del IL-17RC reside en el cromosoma 3p25-3p24. Como se explica más adelante, esta región está asociada a distintos trastornos y enfermedades.

Los análisis por transferencia Northern indican que hay una fuerte expresión del gen IL-17RC en los tejidos de la glándula tiroides, de la glándula suprarrenal, de la próstata y del hígado, y menos expresión en los tejidos del corazón, del intestino delgado, del estómago y de la tráquea. En cambio, hay poca o ninguna expresión en el cerebro, la placenta, los pulmones, el músculo esquelético, el riñón, el páncreas, el bazo, el timo, los testículos, los ovarios, el colon, los leucocitos de la sangre periférica, la médula espinal, los ganglios linfáticos y la médula ósea. Estas observaciones muestran que las secuencias del IL-17RC se pueden utilizar para distinguir entre diferentes tejidos.

La presente invención además incluye moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el polipéptido aislado de la presente invención.

Estos y otros aspectos de la invención se harán evidentes al consultar la siguiente descripción detallada. Además, a continuación se identifican distintas referencias.

B) Definiciones

En la descripción que sigue se utilizan extensivamente una serie de términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la invención.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «ácido nucleico» o «molécula de ácido nucleico» se refiere a polinucleótidos, tal como ácido desoxirribonucleico (ADN)

o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados por cualquier ligación, corte, acción de una endonucleasa y acción de una exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico se pueden componer de monómeros que son nucleótidos que se producen de forma natural (tal como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen de forma natural (por ejemplo, formas �-enantioméricas de nucleótidos que se producen de forma natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en los restos de azúcar y/o en los restos de las bases pirimidinínicas

o purínicas. Las modificaciones del azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno

o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o se pueden funcionalizar los azúcares como éteres o ésteres. Además, se puede reemplazar todo el resto de azúcar por estructuras similares desde el punto de vista estérico y electrónico, tal como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de las modificaciones en una base nitrogenada incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de los ácidos nucleicos se pueden unir mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales enlaces. Los análogos de los enlaces fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. La terminología «molécula de ácido nucleico» también incluye los llamados «ácidos nucleicos peptídicos», que comprenden bases de ácido nucleico modificadas o que se producen en la naturaleza unidas a un esqueleto de poliamida. Los ácidos nucleicos

pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

La terminología «complemento de una molécula de ácido nucleico» se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica complementaria y la orientación inversa al compararla con una secuencia nucleotídica de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria a 5' CCCGTGCAT 3'.

La terminología «secuencia nucleotídica degenerada» designa una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo resto de aminoácido (por ejemplo, cada uno de los tripletes GAU y GAC codifica Asp).

La terminología «gen estructural» se refiere a una molécula de ácido nucleico que se transcribe en un ARN mensajero (ARNm) que a continuación se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Una «molécula aislada de ácido nucleico» es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula aislada de ADN. Otro ejemplo de una molécula aislada de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie determinada es menor que la molécula de ADN completa de un cromosoma de dicha especie.

Una «construcción de moléculas de ácido nucleico» es una molécula de ácido nucleico, monocatenaria o bicatenaria, que se ha modificado mediante la intervención humana para que contenga segmentos de ácidos nucleicos combinados y yuxtapuestos en una disposición que no existe de modo natural.

El «ADN lineal» designa moléculas de ADN no circulares que tienen los extremos 5' y 3' libres. El ADN lineal se puede preparar a partir de moléculas de ADN circulares cerradas, tales como plásmidos, mediante digestión enzimática o rotura física.

«El ADN complementario (ADNc)» es una molécula de ADN monocatenario que se forma a partir de una plantilla de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. Típicamente, se utiliza un cebador complementario a porciones del ARNm para iniciar la retrotranscripción. Los expertos en la técnica también utilizan la terminología «ADNc» para referirse a una molécula de ADN bicatenario que consiste en una tal molécula de ADN monocatenario y su hebra de ADN complementario. La terminología «ADNc» también se refiere a un clon de una molécula de ADNc sintetizado de una plantilla de ARN.

Un «promotor» es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente, el promotor se localiza en la región no codificante en 5' de un gen, cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción a menudo se caracterizan por tener secuencias nucleotídicas de consenso. Estos elementos del promotor incluyen sitios de unión de la ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de diferenciación (DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol. 7:551 (1993)), elementos de respuesta al AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta al suero (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:47 (1990)), elementos de respuesta a los glucocorticoides (GRE) y sitios de unión para otros factores de transcripción, tales como CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem. 267:19938 (1992)), AP2 (Ye et al., J. Biol. Chem.» 269: 25728 (1994)), SP1, proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc (CREB; Loeken, Gene. Expr.» 3: 253 (1993)) y factores octaméricos (véase en general, Watson et al., eds.«Molecular Biology of the Gene», 4.ª edición (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., 1987) y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J.» 303:1 (1994)). Si un promotor es un promotor inducible, entonces aumenta la tasa de transcripción en respuesta a un inductor. En cambio, la tasa de transcripción no está regulada por un inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen promotores reprimibles.

Un «promotor mínimo» contiene las secuencias nucleotídicas esenciales para la función del promotor, incluidas la caja TATA y el inicio de la transcripción. Con esta definición, un promotor central puede o no tener una actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden aumentar la actividad o conferir una actividad específica de tejido.

Un «elemento regulador» es una secuencia nucleotídica que modula la actividad de un promotor mínimo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia nucleotídica a la que se unen factores celulares que permiten la transcripción exclusiva o preferentemente en determinadas células, tejidos u orgánulos. Estos tipos de elementos reguladores se asocian normalmente a genes que se expresan de un modo «específico de célula», «específico de tejido» o «específico de orgánulo».

Un «potenciador» es un tipo de elemento regulador capaz de aumentar la eficacia de la transcripción, independientemente de la distancia o la orientación del

potenciador respecto al sitio de inicio de la transcripción.

Un «ADN heterólogo» se refiere a una molécula de ADN, o una población de moléculas de ADN, que no existe de forma natural dentro de una célula hospedadora determinada. Las moléculas de ADN heterólogas respecto a una célula hospedadora particular pueden contener ADN obtenido de especies de células hospedadoras (a saber, ADN endógeno) a condición de que este ADN del hospedador se combine con ADN que no es del hospedador (a saber, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN que no es del hospedador que codifica un polipéptido unido operativamente a un segmento de ADN del hospedador que comprende un promotor de transcripción se considera que es una molécula de ADN heterólogo. Y al contrario, una molécula de ADN heterólogo puede comprender un gen endógeno unido operativamente a un promotor exógeno. En otro ejemplo, una molécula de ADN que comprende un gen obtenido de una célula de tipo salvaje se considera que es un ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo salvaje.

Un «polipéptido» es un polímero de restos aminoacídicos unidos mediante enlaces peptídicos, bien si se producen de forma natural como si se sintetizan. Los polipéptidos de menos de unos 10 restos aminoacídicos se denominan habitualmente «péptidos».

Una «proteína» es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Una proteína también puede comprender componentes que no son peptídicos, tales como grupos glucídicos. Se pueden añadir glúcidos u otros sustituyentes que no son peptídicos a una proteína en la célula en la que se produce la proteína, y variará con el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente memoria en términos de la estructura de su esqueleto aminoacídico; los sustituyentes tales como los grupos glucídicos generalmente no se especifican, pero, no obstante, pueden estar presentes.

Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN que no es del hospedador es un péptido o polipéptido «heterólogo».

Un «vector de clonación» es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido o bacteriófago, que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora. Los vectores de clonación típicamente contienen uno, o un número pequeño, de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permiten la introducción de una molécula de ácido nucleico de un modo determinado sin perder la función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para su utilización en la identificación y selección de las células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores incluyen típicamente genes que proporcionan resistencia a las tetraciclinas o resistencia a la ampicilina.

Un «vector de expresión» es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula hospedadora. Típicamente, un vector de expresión comprende un promotor de la transcripción, un gen y un terminador de la transcripción. Normalmente, la expresión del gen se coloca bajo el control de un promotor, y se dice que tal gen está «operativamente unido al» promotor. De igual forma, un elemento regulador y un promotor mínimo están operativamente unidos si el elemento regulador modula la actividad del promotor mínimo.

Un «hospedador recombinante» es una célula que contiene una molécula de ácido nucleico heteróloga, tal como un vector de clonación o un vector de expresión. En el presente contexto, un ejemplo de hospedador recombinante es una célula que produce el IL-17RC partir de un vector de expresión. En cambio, el IL-17RC lo puede producir una célula que sea una «fuente natural» del IL-17RC y que carezca de vector de expresión.

Los «transformantes por integración» son células hospedadoras recombinantes, en los que el ADN heterólogo está integrado en el ADN genómico de las células.

Una «proteína de fusión» es una proteína híbrida expresada por una molécula de ácido nucleico que comprende secuencias nucleotídicas de al menos dos genes. Por ejemplo, una proteína de fusión puede comprender al menos parte de un polipéptido de IL-17RC fusionado con un polipéptido que se una a una matriz de afinidad. Tal proteína de fusión proporciona un medio para aislar cantidades grandes del IL-17RC mediante cromatografía de afinidad.

El término «receptor» designa una proteína asociada a células que se une a una molécula bioactiva denominada «ligando». Esta interacción actúa como mediador del efecto del ligando sobre la célula. Los receptores pueden estar unidos a la membrana, ser citosólicos o nucleares; monoméricos (por ejemplo, el receptor de la tirotropina, receptor �-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor del PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de la IL-3, receptor del GM-CSF, receptor de la eritropoyetina y receptor de la IL-6). Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por tener una estructura con varios dominios que comprenden un dominio extracelular de unión al ligando y un dominio efector intracelular que está normalmente implicado en la transducción de señales. En algunos receptores unidos a la membrana, el dominio extracelular de unión al ligando y el dominio efector intracelular se localizan en polipéptidos independientes que comprenden el receptor funcional completo.

Por lo general, la unión del ligando al receptor da lugar a un cambio conformacional en el receptor que ocasiona una interacción entre el dominio efector y otra(s) molécula(s) de la célula, que a su vez conduce a una alteración del metabolismo de la célula. Las reacciones metabólicas que a menudo están conectadas con interacciones entre el receptor y su ligando incluyen la transcripción génica, la fosforilación, la desfosforilación, aumentos de producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de lípidos de la membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos.

Un «receptor soluble» es un receptor polipeptídico que no está unido a una membrana celular. Lo más habitual es que los receptores solubles sean receptores polipeptídicos de unión a ligando que carecen de dominios transmembranarios y citoplasmáticos, y cualquier otra unión a la membrana celular, tal como a través de glucofosfoinositol (gpi). Los receptores solubles pueden comprender restos aminoacídicos adicionales, tal como etiquetas de afinidad que facilitan la purificación del polipéptido, o que proporcionan sitios para la adhesión del polipéptido a un sustrato, o que son secuencias de la región constante de las inmunoglobulinas. Muchos receptores de la superficie celular tienen homólogos solubles que se producen de forma natural mediante proteólisis o que se traducen a partir de ARNm con un ayuste alternativo. Los receptores solubles pueden ser monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos, si bien los receptores multiméricos en general no comprenden más de 9 subunidades, preferentemente no comprenden más de 6 subunidades y, lo más preferentemente, no comprenden más de 3 subunidades. Se dice que los polipéptidos receptores carecen sustancialmente de segmentos polipeptídicos transmembranarios e intracelulares cuando carecen de porciones suficientes de estos segmentos para proporcionar un anclaje a la membrana o una transducción de señal, respectivamente. Los receptores solubles de los receptores de las citocinas generalmente comprenden el dominio extracelular de unión a las citocinas sin un dominio transmembranario ni un dominio intracelular. Por ejemplo, los receptores solubles representativos incluyen receptores solubles IL-17RA como se muestra en la SEQ ID n.º 167 (polinucleótido) y 21 (polipéptido). Se encuentra perfectamente dentro de los conocimientos del experto en la técnica distinguir qué parte de la secuencia de una secuencia conocida del receptor de las citocinas comprende el dominio extracelular de unión a las citocinas sin un dominio transmembranario y sin el dominio intracelular. Además, el experto en la técnica, utilizando el código genético, puede determinar fácilmente polinucleótidos que codifican tales receptores polipeptídicos solubles.

La terminología «secuencia señal secretora» designa una secuencia de ADN que codifica un péptido (un «péptido de secreción») que, como componente de un polipéptido mayor, dirige el polipéptido mayor a través de una vía de secreción de una célula en la que se sintetiza. El polipéptido mayor se escinde habitualmente para eliminar el péptido de secreción durante el tránsito por la vía de secreción.

Un «polipéptido aislado» es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como glúcidos, lípidos y otras impurezas proteínicas asociadas al polipéptido en la naturaleza. Típicamente, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en un estado muy purificado, por ejemplo, puro al menos en un 80%, puro al menos en un 90%, puro al menos en un 95%, puro a más del 95%, tal como el 96%, 97% o 98% o más puro, o puro a más del 99%. Un modo de demostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es por la aparición de una única banda después de migrar la preparación de proteínas en una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio y teñir del gel con azul brillante de Coomassie. Sin embargo, la terminología «aislado» no descarta la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tal como dímeros o formas glucosiladas o modificadas alternativas.

La terminología «extremo amino» y «extremo carboxilo» tal y como se utilizan en la presente memoria designan posiciones dentro de los polipéptidos. Si el contexto lo permite, esta terminología se utiliza con referencia a una secuencia determinada o una porción de un polipéptido para designar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia colocada hacia el extremo carboxilo de una secuencia de referencia dentro del polipéptido se localiza cerca del extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no se encuentra necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

La terminología «expresión» se refiere a la biosíntesis del producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, expresión implica la transcripción del gen estructural en el ARNm y la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos.

La terminología «variante de ayuste» se utiliza en la presente memoria para designar formas alternativas del ARN transcrito de un gen. La variación de ayuste surge de forma natural por la utilización de sitios de ayuste alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita o, con menos frecuencia, entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar lugar a varios ARNm transcritos por el mismo gen. Las variantes de ayuste pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos alterada. La terminología «variante de ayuste» también se utiliza en la presente memoria para designar un polipéptido codificado por una variante de ayuste de un ARNm transcrito por un gen.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «inmunomodulador» incluye citocinas, factores de crecimiento de las células troncales, linfotoxinas, moléculas coestimuladoras, factores hematopoyéticos y similares, y análogos sintéticos de estas moléculas.

La terminología «pareja complemento/anticomplemento» designa restos no idénticos que forman una pareja estable asociada no covalentemente en las condiciones adecuadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o la estreptavidina) son miembros prototípicos de una pareja complemento/anticomplemento. Otras parejas complemento/anticomplemento ejemplares incluyen parejas receptor/ligando, parejas anticuerpo/antígeno (o hapteno o epítopo), parejas de polinucleótidos sentido/antisentido y similares. Cuando se desea una disociación de la pareja complemento/anticomplemento, la pareja complemento/anticomplemento tiene una afinidad de unión de menos de 109 M–1.

Un «anticuerpo antiidiotípico» es un anticuerpo que se une al dominio de la región variable de una inmunoglobulina. En el presente contexto, un anticuerpo antiidiotípico se une a la región variable de un anticuerpo anti-IL-17RC y, por lo tanto, un anticuerpo antiidiotípico imita un epítopo del IL-17RC.

Un «fragmento de anticuerpo» es una porción de un anticuerpo tal como F(ab´)2, F(ab)2, Fab', Fab y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que reconoce el anticuerpo intacto. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-IL-17RC se une a un epítopo del IL-17RC.

La terminología «fragmento de anticuerpo» también incluye un polipéptido sintético o modificado genéticamente que se une a un antígeno específico, tal como polipéptidos que consisten en una región variable de cadena ligera, fragmentos «Fv» que consisten en regiones variables de cadenas ligeras y pesadas, moléculas polipeptídicas monocatenarias recombinantes en las cuales las regiones variables de las cadenas ligera y pesada están conectadas por un conector peptídico («proteínas scFv») y unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos aminoacídicos que imitan la región hipervariable.

Un «anticuerpo quimérico» es una proteína recombinante que contiene los dominios variables y las regiones determinantes de la complementariedad procedentes de un anticuerpo de roedor, mientras que el resto de la molécula de anticuerpo se proviene de un anticuerpo humano.

Los «anticuerpos humanizados» son proteínas recombinantes en las que las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo monoclonal murino se han transferido desde las cadenas variables ligera y pesada de la inmunoglobulina murina a un dominio variable humano. La construcción de anticuerpos humanizados para el uso terapéutico en los humanos que se derivan de anticuerpos murinos, tal como los que se unen a una proteína humana o la neutralizan, forma parte del conocimiento del experto en la técnica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, un «agente terapéutico» es una molécula o átomo que está conjugado a un resto de anticuerpo para producir un conjugado que es útil para el tratamiento. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen fármacos, toxinas, inmunomoduladores, quelantes, compuesto de boro, agentes fotoactivos o colorantes y radioisótopos.

Una «marca detectable» es una molécula o átomo que se puede conjugar a un resto de anticuerpo para producir una molécula útil para el diagnóstico. Ejemplos de marcas detectables incluyen quelantes, agentes fotoactivos, radioisótopos, sustancias fluorescentes, iones paramagnéticos u otros restos marcadores.

La terminología «etiqueta de afinidad» se utiliza en la presente memoria para designar un segmento polipeptídico que puede estar unido a un segundo polipéptido para facilitar la purificación o la detección del segundo polipéptido o para proporcionar sitios para la adhesión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para el cual se disponga de un anticuerpo u otro agente de unión específico se puede utilizar como una etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen una cadena de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075 (1985); Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3 (1991)), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31 (1988)), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952 (1985)), sustancia P, péptido FLAG (Hopp et al., Biotechnology 6:1204 (1988)), péptido de unión a la estreptavidina u otro epítopo o dominio de unión antigénico. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95 (1991). Las moléculas de ADN que codifican etiquetas de afinidad están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Un «anticuerpo desnudo» es un anticuerpo completo, por oposición a un fragmento de anticuerpo, que no está conjugado con un agente terapéutico. Los anticuerpos desnudos incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, así como determinados anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos quiméricos y humanizados.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «componente de anticuerpo» incluye tanto un anticuerpo entero como un fragmento de anticuerpo.

Un «inmunoconjugado» es un conjugado de un componente de anticuerpo con un agente terapéutico o una marca detectable.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «proteína de fusión con anticuerpo» se refiere a una molécula recombinante que comprende un componente de anticuerpo y un componente polipeptídico del IL-17RC. Ejemplos de una proteína de fusión con anticuerpo incluyen una proteína que comprende un dominio extracelular del IL-17RC y bien un dominio Fc o bien una región de unión al antígeno.

Un «polipéptido diana» o un «péptido diana» es una secuencia aminoacídica que comprende al menos un epítopo y que se expresa en una célula diana, tal como una célula tumoral, o en una célula que lleva un antígeno del agente infeccioso. Los linfocitos T reconocen epítopos peptídicos presentados por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad a un polipéptido diana o péptido diana y típicamente destruye la célula diana o recluta otras células inmunitarias al sitio de la célula diana, por lo que destruye la célula diana.

Un «péptido antigénico» es un péptido que se unirá a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad para formar un complejo CMH-péptido que será reconocido por un linfocito T, por lo que se induce una respuesta de linfocitos citotóxicos al presentarlo al linfocito T. Por lo tanto, los péptidos antigénicos son capaces de unirse a una molécula adecuada del complejo mayor de histocompatibilidad e inducir una respuesta de los linfocitos T citotóxicos, tal como la lisis celular o la liberación de citocinas específicas contra la célula diana que se une al antígeno o lo expresa. El péptido antigénico puede encontrarse unido en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o II, sobre una célula presentadora de antígeno o sobre una célula diana.

En los eucariotas, la ARN polimerasa II cataliza la transcripción de un gen estructural para producir ARNm. Se puede diseñar una molécula de ácido nucleico para que contenga una plantilla de la ARN polimerasa II en el que el transcrito de ARN tiene una secuencia que es complementaria a la de un ARN específico. El ARN transcrito se denomina un «ARN antisentido» y una molécula de ácido nucleico que codifique el ARN antisentido se denomina un «gen antisentido». Las moléculas de ARN antisentido son capaces de unirse a moléculas de ARNm, lo que da lugar a la inhibición de la traducción del ARNm.

Un «oligonucleótido antisentido específico del IL-17RC» o un «oligonucleótido antisentido del IL-17RC» es un oligonucleótido que tiene una secuencia (a) que es capaz de formar una triple hélice estable con una porción del gen IL-17RC,o(b) es capaz de formar una doble hélice estable con una porción de un ARNm transcrito del gen IL-17RC.

Una «ribozima» es una molécula de ácido nucleico que contiene un centro catalítico. La terminología incluye enzimas de ARN, los ARN que se autoayustan, los ARN que se autoescinden y las moléculas de ácido nucleico que realizan estas funciones catalíticas. Una molécula de ácido nucleico que codifica una ribozima se denomina un «gen de ribozima».

Una «secuencia de guía externa» es una molécula de ácido nucleico que dirige la ribozima endógena, la ARNasa P, a una especie determinada del ARNm intracelular, lo que da lugar a que la ARNasa P escinda el ARNm. Una molécula de ácido nucleico que codifica una secuencia de guía externa se denomina un «gen de secuencia de guía externa».

La terminología «gen de variante del IL-17RC» se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es una modificación de la SEQ ID n.º 2. Tales variantes incluyen polimorfismos que se producen de forma natural de los genes del IL-17RC, así como los genes sintéticos que contienen sustituciones conservativas de aminoácidos de la secuencia aminoacídica de la SEQ ID n.º 2. Otras formas de genes de variante del IL-17RC son moléculas de ácido nucleico que contienen inserciones o deleciones de las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria. Se puede identificar un gen de variante del IL-17RC, por ejemplo, determinando si el gen se hibrida con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia nucleotídica de la SEQ ID n.º 1 o la SEQ ID n.º 4, o su complemento, en condiciones rigurosas.

Alternativamente, se han identificado genes de variantes del IL-17RC mediante comparación de secuencias. Dos secuencias de aminoácidos tienen una «identidad de la secuencia aminoacídica del 100%» si los restos aminoacídicos de las dos secuencias aminoacídicas son idénticos cuando se alinean para que tengan una correspondencia máxima. De igual forma, dos secuencias nucleotídicas tienen una «identidad de secuencia nucleotídica del 100%» si los restos nucleotídicos de las dos secuencias nucleotídicas son idénticas cuando se alinean para que tengan una correspondencia máxima. Se pueden realizar comparaciones de secuencias con los programas informáticos estándares tales como los incluidos en la colección de programas bioinformáticos LASERGENE, que elabora DNASTAR (Madison, Wisconsin). Los expertos en la técnica conocen bien otros métodos para comparar dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas por determinación del alineamiento óptimo (véase por ejemplo, Peruski y Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc, 1997), Wu et al. (eds), «Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins» en Methods in Gene Biotechnology, pág. 123-151 (CRC Press, Inc. 1997) y Bishop (ed.), Guide to Human Genome Computing, segunda edición (Academic Press, Inc. 1998)). Más adelante se describen métodos particulares para determinar la identidad de secuencia.

Independientemente del método concreto utilizado para identificar un gen IL17RC variante o un polipéptido de variante del IL-17RC, un gen o polipéptido variante codificado por un gen variante puede caracterizarse funcionalmente por su capacidad de unión específica a un anticuerpo anti-IL-17RC. Un gen de variante del IL-17RC o un polipéptido de variante del IL-17RC también pueden caracterizarse funcionalmente por la capacidad de unirse a su ligando, por ejemplo la IL-17A y/o la IL-17F, mediante un ensayo biológico o bioquímico descrito en la presente memoria.

La terminología «variante alélica» se utiliza en la presente memoria para designar cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de modo natural a través de las mutaciones y puede dar lugar a un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen una secuencia aminoacídica alterada. La terminología «variante alélica» también se utiliza en la presente memoria para designar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.

La terminología «ortólogo» designa un polipéptido o proteína obtenido de una especie que es un homólogo funcional de un polipéptido o proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencia entre los ortólogos son el resultado de la separación de las especies.

Los «parálogos» son proteínas diferentes pero relacionadas estructuralmente sintetizadas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen por duplicación génica. Por ejemplo, la globina �, la globina � y la mioglobina son parálogas unas de otras.

La presente invención incluye fragmentos funcionales de los genes del IL17RC. En el contexto de esta invención, un «fragmento funcional» de un gen del IL17RC se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una porción de un polipéptido del IL-17RC que es un dominio descrito en la presente memoria o que al

menos se une específicamente a un anticuerpo anti-IL-17RC.

Debido a la imprecisión de los métodos analíticos estándares, se entiende que las masas moleculares y las longitudes de los polímeros son valores aproximados. Cuando tal valor se expresa como «unos» X o «aproximadamente» X, se entenderá que el valor mencionado de X tiene una exactitud de ± 10%.

C) Producción de polinucleótidos o genes del IL-17RA y del IL-17RC

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un gen del IL-17RA o del IL17RC humanos o polinucleótidos que codifican cualquiera de los polipéptidos solubles de la presente invención se pueden obtener cribando una genoteca de ADNc o genómica de humano con sondas polinucleotídicas basadas en la SEQ ID n.º 1 y la SEQ ID n.º 4. Estas técnicas son estándares y están bien establecidas, y se pueden llevar a cabo mediante kits de clonación disponibles en los proveedores comerciales. Véase, por ejemplo, Ausubel et al, (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, tercera edición, John Wiley & Sons, 1995; Wu et al, Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc, 1997; Aviv y Leader, Proc. Natl Acad. Sci. USA 69: 1408 (1972); Huynh et al., «Constructing and Screening cDNA Libraries in �gt10 and �gt11» en DNA Cloning: A Practical Approach, vol. 1, Glover (ed.), pág. 49 (IRL Press, 1985); Wu (1997) en las págs. 47-52.

Las moléculas de ácido nucleico que codifican un gen del IL-17RA o del IL17RC humanos también se pueden obtener mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos que tienen secuencias nucleotídicas que se basan en secuencias nucleotídicas del gen o el ADNc del IL17RA o del IL-17RC. Los métodos generales para cribar genotecas por PCR se dan a conocer, por ejemplo, en Yu et al., «Use of the Polymerase Chain Reaction to Screen Phage Libraries» en Methods in Molecular Biology, vol. 15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc., 1993. Además, las técnicas para utilizar la PCR para aislar genes relacionados se describen en, por ejemplo, Preston, «Use of Degenerate Oligonucleotide Primers and the Polymerase Chain Reaction to Clone Gene Family Members» en Methods in Molecular Biology, vol. 15:; PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), Humana Press, Inc. 1993. Como alternativa, se puede obtener un gen del IL-17RA o del IL-17RC sintetizando moléculas de ácido nucleico mediante oligonucleótidos largos que se ceban mutuamente y las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria (véase por ejemplo, Ausubel (1995)). Las técnicas establecidas que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad de sintetizar moléculas de ADN de al menos 2 kb de longitud (Adang et al., Plant. Molec. Biol. 21:1131 (1993), Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993), Dillon et al., «Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes», en Methods in Molecular Biology, vol.15: PCR Protocols: Current Methods and Applications, White (ed.), págs. 263-268, (Humana Press, Inc. 1993) y Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4: 299 (1995)). Para revisiones sobre la síntesis de polinucleótidos, véase, por ejemplo, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53: 323 (1984) y Climie et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 87: 633 (1990).

D) Producción de variantes del gen del IL-17RA o del IL-17RC

La presente invención da a conocer numerosas moléculas de ácido nucleico, entre ellas moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos del IL-17RA o del IL-17RC descritos en la presente memoria. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, se puede variar considerablemente la secuencia entre estas moléculas polinucleotídicas. Además, la presente invención también proporciona polipéptidos del receptor monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos y multiméricos que comprenden al menos una porción del IL-17RC que es considerablemente homólogo al polipéptido del receptor de la SEQ ID n.º 2. Por lo tanto, la presente invención contempla moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido del IL-17RA o del IL-17RC que comprenden los nucleótidos degenerados de la SEQ ID n.º 1 o de la SEQ ID n.º 4, y sus equivalentes de ARN.

Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, se puede variar considerablemente la secuencia entre estas moléculas polinucleotídicas. La SEQ ID n.º 7 es una secuencia nucleotídica degenerada que abarca todas las moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido del IL-17RC de la SEQ ID n.º 2. Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia degenerada de la SEQ ID n.º 7 también da a conocer todas las secuencias de ARN que codifican la SEQ ID n.º 2, al sustituir las T por U. Por lo tanto, la presente invención contempla moléculas de ácido nucleico que codifican el polipéptido del IL-17RC que comprende del nucleótido 154 al nucleótido 2229 de la SEQ ID n.º 1, y sus equivalentes de ARN. De igual forma, la secuencia degenerada del IL-17RC-1 de la SEQ ID n.º 6 también da a conocer todas las secuencias de ARN que codifican la SEQ ID n.º 5, al sustituir las T por U.

La tabla 4 presenta códigos de una letra para designar posiciones nucleotídicas degeneradas. «Resoluciones» son los nucleótidos designados por una letra de código.

«Complemento» indica el código para el(los) nucleótido(s) complementario(s). Por ejemplo, el código Y designa C o T, y su complemento R designa A o G, siendo A complementaria de T, y G complementaria de C.

Tabla 4

Nucleótido

Resolución Complemento Resolución

A

A

T T

C

C

G G

G

G

C C

T

T

A A

R

A|G Y C|T

Y

C|T R A|G

M

A|C K G|T

K

G|T M A|C

S

C|G S C|G

W

A|T W A|T

H

A|C|T D A|G|T

B

C|G|T V A|C|G

V

A|C|G B C|G|T

D

A|G|T H A|C|T

N

A|C|G|T N A|C|G|T

Los codones degenerados, que abarcan todos los codones posibles de un aminoácido determinado, se presentan en la tabla 5.

10 Tabla 5

Aminoácido

Código de una letra Codones Codón degenerado

Cys

C TGC TGT TGY

Ser

S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN

Thr

T ACA ACC ACG ACT ACN

Pro

P CCA CCC CCG CCT CCN

Ala

A GCA GCC GCG GCT GCN

Gly

G GGA GGC GGG GGT GGN

Asn

N AAC AAT AAY

Asp

D GAC GAT GAY

Glu

E GAA GAG GAR

Gln

Q CAA CAG CAR

His

H CAC CAT CAY

Arg

R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN

Lys

K AAA AAG AAR

Met

M ATG ATG

Ile

I ATA ATC ATT ATH

Leu

L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN

Val

V GTA GTC GTG GTT GTN

Phe

F TTC TTT TTY

Tyr

Y TAC TAT TAY

Trp

W TGG TGG

Ter

. TAA TAG TGA TRR

Asn| Asp

B RAY

Glu | Gln

Z SAR

Any

X NNN

El experto en la técnica apreciará que se introduce cierta ambigüedad al determinar un codón degenerado, lo que es representativo de todos los codones posibles que codifican un aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado de la serina 5 (WSN), en algunas situaciones, puede codificar la arginina (AGR), y el codón degenerado de la arginina (MGN) puede, en algunos casos, codificar la serina (AGY).

Existe una relación similar entre los codones que codifican la fenilalanina y la leucina. Por lo tanto, algunos polinucleótidos englobados por la secuencia degenerada pueden codificar secuencias aminoacídicas variantes, pero el experto en la técnica puede identificar fácilmente tales secuencias variantes por referencia a las secuencias aminoacídicas de la SEQ ID n.º 6. Se puede verificar fácilmente la funcionalidad de las secuencias variantes tal y como se describe en la presente memoria.

Diferentes especies pueden mostrar un «uso preferente de codones». Por lo general, véase, Grantham et al., Nucl. Acids. Res. 8: 1893 (1980), Haas et al., Curr. Biol. 6: 315 (1996), Wain-Hobson et al., Gene 13: 355 (1981), Grosjean y Fiers, Gene

18: 199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573 (1982), Sharp y Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4: 851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 494 (1995), y Makrides, Microbiol. Rev. 60: 512 (1996). Tal y como se usa en la presente memoria, la terminología «uso preferente de codones» o «codones preferentes» es una terminología de la técnica que se refiere a los codones de traducción de proteínas que se utilizan con más frecuencia en las células de determinadas especies, lo que favorece a uno o a unos pocos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase la tabla 5). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede estar codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en las células de mamífero, ACC es el codón utilizado con más frecuencia; en otras especies, por ejemplo, las células de insectos, levadura, virus o bacterias, se pueden preferir codones de Thr diferentes. Los codones preferentes para determinadas especies se pueden introducir en los polinucleótidos de la presente invención mediante una serie de métodos conocidos en la técnica. La introducción de secuencias de codones preferentes en el ADN recombinante puede, por ejemplo, hacer aumentar la producción de la proteína al hacer que la traducción de proteínas sea más eficaz dentro de un tipo determinado de célula o especie. Por lo tanto, las secuencias con codones degenerados descritas en la presente memoria sirven como modelo para mejorar la expresión de polinucleótidos en varios tipos de células y especies utilizadas habitualmente en la técnica y descritos en la presente memoria. Las secuencias que contienen los codones preferentes se pueden analizar y optimizar para expresarlas en varias especies, y analizar la funcionalidad tal y como se describe en la presente memoria.

Se puede aislar un ADNc que codifica un IL-17RA o un IL-17RC mediante una serie de métodos, tal como cribar con un ADNc humano completo o parcial o con uno

o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. También se puede clonar un ADNc mediante la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores diseñados de las secuencias representativas del IL-17RA o del IL17RC humanos descritos en la presente memoria. Además, se puede utilizar una genoteca de ADNc para transformar o transfectar células hospedadoras, y se puede detectar la expresión del ADNc de interés con un anticuerpo contra el polipéptido del IL-17RA o del IL-17RC.

Los expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEQ ID n.º 1 representa un solo alelo del IL-17RC humano, y que se espera que se produzca esa variación alélica y ayuste alternativos. Se pueden clonar las variantes alélicas de esta secuencia rastreando genotecas genómicas o de ADNc de diferentes individuos según los procedimientos estándares. Las variantes alélicas de las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria, incluidas las que contienen mutaciones silenciosas y aquellas cuyas mutaciones dan lugar a cambios en la secuencia aminoacídica, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, ya que son proteínas que son variantes alélicas de las secuencias aminoacídicas descritas en la presente memoria. Las moléculas de ADNc generadas de ARNm con un ayuste alternativo, que conservan las propiedades del polipéptido del IL-17RC, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, ya que son polipéptidos codificados por tales ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y las variantes de ayuste de estas secuencias se pueden clonar al rastrear genotecas genómicas o de ADNc de diferentes individuos o tejidos según los procedimientos estándares de la técnica.

Mediante los métodos descritos anteriormente, el experto en la técnica puede preparar el polipéptido de la presente invención.

E) Producción de los polipéptidos IL-17RC, IL-17RA e IL-17RC/IL-17RA

El polipéptido de la presente invención se puede producir en células hospedadoras recombinantes siguiendo las técnicas convencionales. Para expresar un gen del IL-17RC/IL-17RA, una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido se debe unir operativamente a secuencias reguladoras que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión y, a continuación, introducirse en una célula hospedadora. Los vectores de expresión pueden incluir, además de las secuencias reguladoras transcripcionales, tales como promotores y potenciadores, secuencias reguladoras traduccionales y un gen marcador que es adecuado para seleccionar las células que llevan el vector de expresión.

Los vectores de expresión que son adecuados para producir una proteína foránea en las células eucariotas contienen 1) elementos de ADN procariota que codifican un origen de replicación bacteriano y un marcador de resistencia a antibióticos para asegurarse de que el vector de expresión crecerá en un huésped bacteriano y se podrá seleccionar en él; 2) elementos de ADN eucariótico que controlan el inicio de la transcripción, tal como un promotor, y 3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de los transcritos, tal como una secuencia de terminación de la transcripción/poliadenilación. Tal y como se explica anteriormente, los vectores de expresión también pueden incluir secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia secretora que dirige el polipéptido heterólogo hacia la vía secretora de una célula hospedadora. Por ejemplo, un vector de expresión podría comprender un gen del IL-17RC/IL-17RA y una secuencia secretora derivada de algún gen que se secrete.

El polipéptido de la presente invención se puede expresar en células de mamíferos. Ejemplos de células hospedadoras adecuadas de mamífero incluyen las células de riñón del mono verde africano (Vero, ATCC CRL 1587), células de riñón embrionario humano (293-HEK; ATCC CRL 1573), células de riñón de hámster recién nacido (BHK-21, BHK-570, ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de riñón canino (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555, 1986)), células hipófisis de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de riñón de mono transformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650) y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658).

Para un hospedador mamífero, las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales se pueden obtener de virus de mamíferos, por ejemplo, adenovirus, virus del papiloma bovino, virus de simio o similares, en los que las señales reguladoras están asociadas a un gen determinado que tiene un nivel de expresión elevado. Las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales también se pueden obtener de genes de mamíferos, por ejemplo, genes de actina, colágeno, miosina y metalotioneína.

Las secuencias reguladoras transcripcionales incluyen una región promotora suficiente para dirigir el inicio de la síntesis del ARN. Los promotores eucariotas adecuados incluyen el promotor del gen de la metalotioneína I de ratón (Hamer et al.,

J. Molec. Appl. Genet. 1: 273 (1982)), el promotor TK del virus del herpes (McKnight, Cell 31: 355 (1982)), el promotor temprano del SV40 (Benoist et al., Nature 290: 304 (1981)), el promotor del virus del sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 79: 6777 (1982)), el promotor del citomegalovirus (Foecking et al., Gene 45: 101 (1980)) y el promotor del virus del tumor de mama de ratón (véase de forma general, Etcheverry, «Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture», en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), págs. 163-181 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)).

Alternativamente, se puede utilizar un promotor procariota, tal como el promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T3, para controlar la expresión génica en células de mamíferos si el promotor procariota está regulado por un promotor eucariota (Zhou et al, Mol. Cell. Biol. 10: 4529 (1990) y Kaufman et al., Nucl. Acids. Res. 19: 4485 (1991)).

En determinadas realizaciones, una secuencia de ADN que codifica el polipéptido del receptor soluble está operativamente unida a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluyen generalmente un promotor y un terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector también contendrá con frecuencia uno o más marcadores de selección y uno o más orígenes de replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que dentro de algunos sistemas, se pueden proporcionar marcadores de selección en vectores independientes, y se puede conseguir la replicación del ADN exógeno mediante la integración en el genoma de la célula hospedadora. La selección de los promotores, terminadores, marcadores de selección, vectores y otros elementos es un tema de diseño rutinario dentro de la pericia del experto en la técnica. Se describen muchos de estos elementos en la bibliografía y se pueden adquirir a través de proveedores comerciales. Se pueden cotransfectar con varios componentes de un complejo de receptor soluble en vectores de expresión independientes, o se pueden incluir en un solo vector de expresión. Tales técnicas para expresar varios componentes de complejos proteicos se conocen bien en la técnica.

Se puede introducir un vector de expresión en células hospedadoras mediante numerosas técnicas estándares que incluyen la transfección con fosfato de calcio, la transfección mediada por liposomas, la introducción mediante microproyectiles, la electroporación y similares. Se pueden seleccionar y propagar células transfectadas para dar a conocer células hospedadores recombinantes que comprenden el vector de expresión integrado establemente en el genoma de la célula hospedadora. Las técnicas para introducir los vectores en las células eucariotas y las técnicas para seleccionar tales transformantes estables mediante un marcador de selección dominante se describen, por ejemplo, en Ausubel (1995) y en Murray (ed.), «Gene Transfer and Expression Protocols» (Humana Press, 1991).

Por ejemplo, un marcador de selección adecuado es un gen que proporciona resistencia al antibiótico neomicina. En este caso, se lleva a cabo la selección en presencia de un fármaco del tipo de la neomicina, tal como G-148 o similares.

También se pueden utilizar sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, un proceso que se denomina «amplificación». La amplificación se lleva a cabo al cultivar transfectantes en presencia de poca cantidad del agente selectivo y, luego, aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen una gran cantidad de los productos de los genes introducidos. Un marcador de selección amplificable adecuado es la dihidrofolato reductasa (DHFR), que confiere resistencia al metotrexato. Se pueden utilizar otros genes de resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a la higromicina, resistencia multifarmacológica, puromicina acetiltransferasa). Alternativamente, se pueden utilizar marcadores que introducen un fenotipo alterado, tal como la proteína fluorescente verde o proteínas de la superficie celular, tal como CD4, CD8, CMH de clase I, o fosfatasa alcalina placentaria, para detectar las células transfectadas entre las células sin transfectar mediante medios tales como la clasificación con FACS o la tecnología de separación con perlas magnéticas.

El polipéptido de la invención también se puede producir mediante células de mamífero en cultivo utilizando un sistema de transferencia vírico. Virus ejemplares para este propósito incluyen adenovirus, retrovirus, virus del herpes, virus de la variolovacuna y dependovirus (AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es en la actualidad el vector de transferencia génica mejor estudiado para transferir ácidos nucleicos heterólogos (para una revisión, véanse Becker et al., Meth. Cell Biol.

43: 161 (1994) y Douglas y Curiel, Science & Medicine 4: 44 (1997)). Las ventajas del sistema adenovírico incluyen el alojamiento de insertos de ADN relativamente grandes, la capacidad de crecer hasta dar titulaciones elevadas, la capacidad de infectar un amplio abanico de tipos de células de mamíferos y la flexibilidad de permitir su utilización con un gran número vectores disponibles que contienen diferentes promotores.

Al eliminar partes del genoma del adenovirus, se pueden alojar insertos más grandes (de hasta 7 kb) de ADN heterólogo. Estos insertos se pueden incorporar en el ADN vírico mediante ligación directa o mediante recombinación homóloga con un plásmido cotransfectado. Una opción es eliminar el gen esencial E1 del vector vírico, lo que lo incapacita para replicarse a menos que la célula hospedadora proporcione el gen E1. Las células 293 humanas infectadas con el vector adenovírico (n.º de la ATCC CRL-1573, 45504, 45505), por ejemplo, se pueden hacer crecer como células adherentes o en un cultivo en suspensión a una densidad celular relativamente elevada para producir cantidades significativas de proteínas (v. Garnier et al., Cytotechnol. 15: 145 (1994)).

El polipéptido de la invención se puede expresar en otras células eucariotas superiores, tal como células de aves, de hongos, de levadura, de insectos o de plantas. El sistema de baculovirus proporciona un medio eficaz para introducir genes clonados en células de insectos. Los vectores de expresión adecuados se basan en el virus de la polihedrosis nuclear múltiple de Autographa californica (AcMNPV) y contiene promotores bien conocidos tales como el promotor proteína de choque térmico (hsp) 70 de Drosophila, el promotor del gen temprano inmediato (ie-1) y, el promotor temprano retrasado 39K del virus de la polihidrosis nuclear de Autographa californica, el promotor p10 del baculovirus y el promotor de la metalotioneína de Drosophila. Un segundo método para fabricar baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566 (1993)). Este sistema, que utiliza vectores de transferencia, se comercializa con el kit BAC-to-BAC (Life Technologies, Rockwille, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, PFASTBAC (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para mover el ADN que se codifica un polipéptido a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un plásmido grande llamado «bácmido» . Véase, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990), Booning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551 (1994) y Chazenbalk y Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543 (1985). Además, los vectores transferidos pueden incluir una fusión en fase con el ADN que codifica una etiqueta de epítopo en el extremo amino o carboxilo del polipéptido expresado, por ejemplo una etiqueta de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc Nat Acad Sci. 82: 7952 (1985)). Utilizando un método conocido en la técnica, un vector de transferencia que contiene un gen que codifica un polipéptido de la presente invención se introduce por transformación en E. coli, y se detectan selectivamente los bácmidos que contienen un gen lacZ interrumpido, lo que es indicativo de un baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla entonces mediante las técnicas habituales.

El vector PFASTBAC ilustrativo se puede modificar considerablemente. Por ejemplo, se puede eliminar el promotor de la polihedrina y sustituirlo por el promotor de la proteína básica del baculovirus (también conocido como Pcor, p6.9 o promotor MP) que se expresa al principio de la infección por el baculovirus, y se ha demostrado que es ventajoso para expresar proteínas secretadas (véase, por ejemplo, Hill-Perkins y Possee, J. Gen. Virol. 71: 971 (1990), Bonning et al., J. Gen. Virol., 75: 1551 (1994) y Chazenbalk y Rapoport , J. Biol. Chem. 270: 153 (1995). En tales construcciones del vector de transferencia se puede utilizar una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, se pueden construir vectores de transferencia que reemplacen las secuencias señal secretoras naturales con secuencias señal secretoras obtenidas de proteínas de insecto. Por ejemplo, se puede utilizar una secuencia señal secretora de la ecdisteroide glucosiltransferasa (EGT), la melitina de la abeja melífera (Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA) o la gp67 del baculovirus (PharMingen; San Diego, CA) en construcciones para reemplazar la secuencia señal secretora natural del IL-17RC.

El virus o el bácmido recombinante se utiliza para transfectar células hospedadoras. Las células hospedadoras de insectos adecuadas incluyen estirpes celulares derivadas de IPLB-Sf-21, una estirpe de células de ovario de la crisálida de Spodoptera frugiperda, tal como Sf9 (ATCC CRL 1711), Sf21AE y Sf21 (Invitrogen Corporation; San Diego, CA) así como células Schneider-2 de Drosophila, y la estirpe celular HIGH FIVEO (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (patente de los EE.UU. n.º 5 300 435). Se pueden utilizar medios sin suero disponibles comercialmente para hacer crecer y mantener las células. Los medios adecuados son Sf900 II™ (Life Technologies) o ESF 921™ (Expression Systems) para las células Sf9; y ExcellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o Express FiveO™ (Life Technologies) para las células de T. ni. Cuando se utiliza un virus recombinante, las células se hacen crecer típicamente hasta una densidad de inoculación entre unas 2-5 x 105 células y unas 1-2 x 106 células en el momento en que se añade el cultivo primario de virus recombinantes con una multiplicidad de infección (MDI) de 0,1 a 10, más típicamente cerca de 3.

Las técnicas establecidas para producir proteínas recombinantes en sistemas de baculovirus se dan a conocer en Bailey et al., «Manipulation of Baculovirus Vectors» en Methods in Molecular Biology, Volume 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray (ed.), págs. 147-168 (The Humana Pres, Inc. 1991), en Patel et al., «The baculovirus expression system» en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2ª edición, Glover et al., (eds), págs. 205-244 (Oxford University Press, 1995), Ausubel (1995) en las páginas 16-37 a 16-57, en Richardson (ed.), «Baculovirus Expression Protocols» (The Humana Press, Inc. 1995), y en Lucknow, «Insect Cell Expression Technology» en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 183-218 (John Wiley & Sons, Inc. 1996).

También se pueden utilizar células de hongos, incluidas las células de levadura, para expresar los genes descritos en la presente memoria. Las especies de levadura de interés particular en este sentido incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Los promotores adecuados para la expresión en la levadura incluyen promotores de GAL1 (galactosa), PGK (fosfoglicerato cinasa), ADH (alcohol deshidrogenasa), AOX1 (alcohol oxidasa), HIS4 (histidinol deshidrogenasa) y similares. Se han diseñado muchos vectores de clonación para levadura y se pueden adquirir fácilmente. Estos vectores incluyen vectores basados en Ylp, tal como YIp5, vectores YRp, tal como YRp17, vectores YEp, tal como YEp13, y vectores YCp tal como YCp19. Los métodos para transformar las células de S. cerevisiae con ADN exógeno y que produzcan polipéptidos recombinantes a partir de él se describen en, por ejemplo, Kawasaki, patente de los EE.UU. n.º 4 599 311, Kawasaki et al., patente de los EE.UU n.º 4 931 373, Brake, patente de los EE.UU n.º 4 870 008, Welch et al., patente de los EE.UU n.º 5 037 743 y Murray et al., patente de los EE.UU n.º 4 845 075. Se seleccionan las células transformadas mediante el fenotipo determinado por el marcador de selección, habitualmente resistencia a fármacos o capacidad desarrollarse en ausencia de un nutriente determinado (por ejemplo, leucina). Un sistema de vectores adecuado para el uso en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vectores POT1 descrito por Kawasaki et al., (patente de los EE.UU n.º 4 931 373), que permite seleccionar las células transformadas según su crecimiento en medios con glucosa. Otros promotores y terminadores adecuados para su utilización en la levadura incluyen los de los genes de enzimas glucolíticas (véase, por ejemplo, Kawasaki, patente de los EE.UU. n.º 4 599 311, Kingsman et al., patente de los EE.UU. n.º 4 615 974 y Bitter, patente de los EE.UU. n.º 4 977 092) y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también las patentes de los EE.UU. n.º 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 y 4 661 454.

Los sistemas de transformación para otras levaduras, incluidas Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986) y Cregg, patente de los EE.UU. n.º 4 882 279. Se pueden utilizar las células de Aspergillus según los métodos de McKnight et al., patente de los EE.UU. n.º 4 935 349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum se describen en Sumino et al, patente de los EE.UU. n.º 5 162 228. Los métodos para transformar Neurospora se describen en Lambowitz, patente de los EE.UU. n.º 4 486 533.

Por ejemplo, el uso de Pichia methanolica como huésped para producir proteínas recombinantes se describe en Raymond, patente de los EE.UU. n.º 5 716 808, Raymond, patente de los EE.UU. n.º 5 736 383, Raymond et al., Yeast 14: 11-23 (1998) y en la publicación de las patentes internacionales n.º WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Las moléculas de ADN que se utilizarán para transformar P. methanolica se prepararán de forma habitual como plásmidos circulares bicatenarios que se linealizan preferentemente antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, el promotor y el terminador en el plásmido pueden ser el de un gen de P. methanolica, tal como el gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los genes de la dihidroxiacetona sintasa (DHAS), la formiato deshidrogenasa (FMD) y la catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN en el cromosoma del hospedador, se prefiere tener todo el segmento de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN del hospedador. Un marcador de selección adecuado para utilizarlo en Pichia methanolica es un gen ADE2 de P. methanolica, que codifica la fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21) y que permite que las células hospedadoras ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para los procedimientos industriales a gran escala en los que se desea utilizar la menor cantidad posible de metanol, se pueden utilizar células hospedadoras en las que se han eliminado los dos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2). Para producir las proteínas secretadas, las células hospedadoras pueden carecer de los genes de la proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). Se utiliza la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene el ADN que codifica un polipéptido de interés en células de P. methanolica. Se pueden transformar las células de P. methanolica por electroporación mediante un pulso de campo eléctrico con disminución exponencial que tiene una intensidad de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferentemente unos 3,75 kV/cm, y una constante del tiempo (t) de 1 a 40 ms, más preferentemente unos 20 ms.

También se pueden introducir vectores de expresión en protoplastos vegetales, en tejidos vegetales intactos o en células vegetales aisladas. Los métodos para introducir vectores de expresión en el tejido vegetal incluyen la infección directa o el cocultivo del tejido vegetal con Agrobacterium tumefaciens, transferencia mediante microproyectiles, inyección de ADN, electroporación y similares. Véase, por ejemplo, Horsch et al., Science 227: 1229 (1985), Klein et al., Biotechnology 10: 268 (1992) y Miki et al., «Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants» en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al., (eds.) páginas 67-88 (CRC Press, 1993).

Alternativamente, los genes que codifican el polipéptido de la presente invención se pueden expresar en células hospedadoras procariotas. Los promotores adecuados que se pueden utilizar para expresar el polipéptido en un hospedador procariótico los conocen bien los expertos en la técnica e incluyen los promotores capaces de reconocer las polimerasas de T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL del bacteriófago �, los promotores de E. coli trp, recA, de choque térmico, lacUV5, tac, lpplacSpr, pho4 y lacZ, los promotores de B. subtilis, los promotores de los bacteriófagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriófago �, el promotor bla del pBR322 y el promotor CAT del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa. Se puede encontrar una revisión de los promotores procariotas en Glick, J. Ind. Microbiol. 1: 277 (1987), Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4.ª ed. (Benjamin Cummins, 1987) y Ausubel et al. (1995).

Los hospedadores procarióticos adecuados incluyen E. coli y Bacillus subtilus. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysE, DH1, DH4I, DH5, DH5I, DH5IF', DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451 y ER1647 (véase, por ejemplo, Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)). Las cepas adecuadas de Bacillus subtilus incluyen BR151, YB886, MI119, MI120 y B170 (véase, por ejemplo, Hardy, «Bacillus Cloning Methods», en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)).

Cuando se expresa un polipéptido de la presente invención en bacterias tales como E. coli, el polipéptido puede quedar retenido en el citoplasma, normalmente en gránulos insolubles, o se puede dirigir al espacio periplasmático mediante una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, se lisan las células, se recuperan los gránulos y se desnaturalizan utilizando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. A continuación, el polipéptido desnaturalizado se puede volver a plegar y a hacer dimerizar diluyendo el desnaturalizante, tal como mediante diálisis frente a una disolución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguida de diálisis frente a una disolución salina tamponada. En el último caso, se puede recuperar el polipéptido del espacio periplasmático en una forma soluble y funcional por simple rotura de las células (por ejemplo, mediante sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplasmático y recuperar la proteína, por lo que se evita tener que desnaturalizar y volver a plegar.

Los métodos para expresar proteínas en huéspedes procarióticos los conocen bien los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Williams et al., «Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies» en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2.ª edición, Glover et al. (eds.), página 15, (Oxford University Press, 1995), Ward et al., «Genetic Manipulation and Expression of Antibodies» en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, página 137 (Wiley-Liss, Inc., 1995) y Georgiou, «Expression of Proteins in Bacteria» en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., (eds.), página 101, (John Wiley & Sons, Inc., 1996)).

Los métodos estándares para introducir vectores de expresión en células bacterianas, de levadura, de insectos y vegetales se dan a conocer, por ejemplo, en Ausubel (1995).

Los métodos generales para expresar y recuperar la proteína foránea producida por un sistema celular de mamíferos se dan a conocer en, por ejemplo, Etcheverry, «Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture», en Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al, (eds), páginas 163 (Wiley-Liss, Inc, 1996). Las técnicas estándares para recuperar la proteína producida por un sistema bacteriano se dan a conocer en, por ejemplo, Grisshammer et al., «Purification of over-produced proteins from E. coli cells» en DNA Cloning 2: Expression Systems, 2.ª edición, Glover et al., (eds.), páginas 59-92 (Oxford University Press, 1995). Los métodos establecidos para aislar las proteínas recombinantes de un sistema de baculovirus se describen en Richardson (ed.), Baculovirus Expression Protocols (The Humana Press, Inc., 1995).

Alternativamente, el polipéptido de la presente invención se puede sintetizar mediante síntesis en fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensación de fragmentos o síntesis clásica en solución. Estos métodos de síntesis los conocen bien los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963), Stewart et al., «Solid Phase Peptide Synthesis» (2.ª edición), (Pierce Chemical Co., 1984), Bayer y Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3 (1986), Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, 1989), Fields y Colowick, «Solid-Phase Peptide synthesis», Methods in Enzymology, volumen 289 (Academic Press 1997) y Lloyd-Williams et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (CRC Press, Inc, 1997)). Las variaciones de las estrategias de síntesis química total, tal como «ligación química nativa» y «ligación de proteínas expresadas» también son estándares (véase, por ejemplo, Dawson et al., Science 266: 776 (1994), Hackeng et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 94: 7845 (1997), Dawson, Methods Enzymol., 287: 34 (1997), Muir et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 6705 (1998) y Severinov y Muir, J. Biol. Chem. 273: 16205 (1998)).

La presente invención también contempla composiciones modificadas químicamente, en las que el polipéptido está unido a un polímero. Típicamente, el polímero es hidrosoluble para que el conjugado no se precipite en un medio acuoso, tal como un medio fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que se ha modificado para tener un solo grupo reactivo, tal como un éster activo por acilación, o un aldehído por alquilación. De este modo, se puede controlar el grado de polimerización. Un ejemplo de un aldehído reactivo es un polietilenglicol propionaldehído, o mono-alcoxi(C1-C10), o derivados de ariloxi de los mismos (véase, por ejemplo, Harris et al., patente de los EE.UU. n.º 5 252 714). El polímero puede estar ramificado o sin ramificar. Además, se puede utilizar una mezcla de polímeros para producir los conjugados.

Los conjugados de la presente invención utilizados para tratamiento pueden comprender restos de polímeros hidrosolubles farmacéuticamente aceptables. Los polímeros hidrosolubles adecuados incluyen polietilenglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi(C1-C10)-PEG, ariloxi-PEG, poli(N-vinil-pirrolidona)PEG, tresil-monometoxi-PEG, PEG-propionaldehído, bis-succinimidil-carbonato-PEG, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles de polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, dextrano, celulosa u otros polímeros a base de glúcidos. El PEG adecuado puede tener una masa molecular de unos 600 a unos 60 000, incluidos, por ejemplo, 5000, 12 000, 20 000 y 25 000. El conjugado también puede comprender una mezcla de tales polímeros hidrosolubles.

Un ejemplo de un conjugado comprende el polipéptido de la presente invención y un resto de óxido de polialquilo unido al extremo amino del polipéptido. El PEG es un óxido de polialquilo adecuado. A modo de ilustración, se puede modificar el polipéptido con PEG, un procedimiento conocido como «PEGilación». La PEGilación del polipéptido se puede llevar a cabo mediante cualquier reacción de PEGilación conocida en la técnica (véase, por ejemplo, la patente europea EP 0 154 313, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin. Pharmacokinet., 27: 290 (1994), y Francis et al., Int. J. Hematol. 68:1 (1998)). Por ejemplo, se puede realizar la PEGilación mediante una reacción de acilación o mediante una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilenglicol. En un enfoque alternativo, se forman los conjugados al condensar el PEG activado, en el que se han reemplazado un hidroxi o un grupo amino terminales por un conector activado (véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente de los EE.UU. n.º 5 382 657).

La PEGilación mediante acilación requiere típicamente hacer reaccionar un derivado activo del PEG por esterificación con un polipéptido. Un ejemplo de un éster de PEG activado es el PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «acilación» incluye los tipos siguientes de enlaces entre el polipéptido y un polímero hidrosoluble: amida, carbamato, uretano y similares. Los métodos para preparar el IL-17RC/IL-17RA PEGilado por acilación típicamente comprenderá la etapas de a) hacer reaccionar un polipéptido IL-17RC/IL17RA con PEG (tal como un éster reactivo de un derivado aldehídico del PEG) en unas condiciones mediante las cuales uno o más grupos PEG se unen al IL-17RC/IL17RA, y b) obtener el(los) producto(s) de reacción. Por lo general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán basándose en los parámetros conocidos y en los resultados deseados. Por ejemplo, cuanto mayor es la proporción de PEG:IL-17RC/IL-17RA, mayor el porcentaje del producto del IL-17RC/IL17RA poliPEGilado.

El producto de PEGilación mediante acilación es típicamente un producto poliPEGilado, en el que los grupos amino � de lisina se PEGilan a través de un grupo de unión acílico. Un ejemplo de un enlace conector es una amida. Típicamente, el IL17RC/IL-17RA resultante será mono-, di- o triPEGilado al menos al 95%, aunque se pueden formar algunas especies con grados mayores de PEGilación según las condiciones de reacción. Se pueden separar las especies PEGiladas de polipéptidos IL-17RC/IL-17RA sin conjugar mediante métodos de purificación estándares, tal como diálisis, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares.

La PEGilación por alquilación implica por lo general hacer reaccionar un derivado aldehídico terminal del PEG con el IL-17RC/IL-17RA en presencia de un agente reductor. Se pueden unir grupos PEG al polipéptido mediante un grupo -CH2NH.

La modificación a través de la alquilación reductora para producir un producto monoPEGilado aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios disponibles para la modificación. Típicamente, la reacción se lleva a cabo a un pH que permite aprovechar las diferencias de pKa entre los grupos amino � de los restos de lisina y el grupo amino � del resto de extremo amino de la proteína. Mediante la modificación selectiva, se controla la adhesión de un polímero hidrosoluble que contiene un grupo reactivo, tal como un aldehído, a una proteína. La conjugación con el polímero se produce principalmente en el extremo amino de la proteína sin modificar significativamente otros grupos reactivos tal como los grupos amino de la cadena lateral de lisina. La presente invención proporciona una preparación considerablemente homogénea de los conjugados monopoliméricos del IL-17RC/IL17RA.

La alquilación reductora para producir una población esencialmente homogénea de la molécula del conjugado monopolimérico del IL-17RC/IL-17RA puede comprender las etapas de: a) hacer reaccionar un polipéptido IL-17RC/IL-17RA con un PEG reactivo en unas condiciones de alquilación reductora a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo amino � en el extremo amino del IL17RC/IL-17RA, y b) obtener el(los) producto(s) de reacción. El agente reductor utilizado para la alquilación reductora debe ser estable en disolución acuosa y debe ser capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el proceso inicial de la alquilación reductora. Los agentes reductores ilustrativos incluyen borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, borano de dimetilamina, borano de trimetilamina y borano de piridina.

Para una población esencialmente homogénea de conjugados monopoliméricos del IL-17RC/IL-17RA, las condiciones de reacción de la alquilación reductora son las que permiten la unión selectiva del resto del polímero hidrosoluble al extremo amino del IL-17RC/IL-17RA. Estas condiciones de reacción proporcionan por lo general diferencias de pKa entre los grupos amino de lisina y el grupo amino � del extremo amino. El pH también afecta a la proporción de polímero por proteína a utilizar. En general, si el pH es más bajo, se deseará un mayor exceso de polímero por proteína porque cuanto menos reactivo es el grupo � del extremo amino, más polímero se necesita para conseguir las condiciones óptimas. Si el pH es mayor, no es necesario que el exceso de polímero IL-17RC/IL-17RA sea tan grande porque se dispone de más grupos reactivos. Típicamente, el pH caerá dentro del intervalo de 3 a 9 o de 3 a 6. Se puede utilizar este método para construir conjugados de receptores solubles homodiméricos, heterodiméricos o multiméricos que comprenden el IL17RC/IL-17RA.

Otro factor a considerar es la masa molecular del polímero hidrosoluble. Por lo general, cuanto mayor es la masa molecular del polímero, menor es la cantidad de moléculas de polímero que se pueden unir a la proteína. Para las reacciones de PEGilación, la masa molecular típica es de unos 2 kDa a unos 100 kDa, de unos 5 kDa a unos 50 kDa, o de unos 12 kDa a unos 25 kDa. La proporción molar del polímero hidrosoluble por IL-17RC/IL-17RA estará generalmente en el intervalo de 1:1 a 100:1. Típicamente, la proporción molar del polímero hidrosoluble por IL-17RC/IL-17RA será de 1:1 a 20:1 para la poliPEGilación, y de 1:1 a 5:1 para la monoPEGilación.

Los métodos generales para producir conjugados que comprenden un polipéptido y restos del polímero hidrosoluble se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Karasiewicz et al., patente de los EE.UU. n.º 5 382 657, Greenwald et al., patente de los EE.UU. n.º 5 738 846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal. Biochem. 247: 434 (1997)).

La presente invención contempla composiciones que comprenden el polipéptido de la presente invención. Tales composiciones pueden comprender adicionalmente un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Ejemplos de vehículos incluyen agua, solución tamponante, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de maíz y similares.

G) Aislamiento de los polipéptidos IL-17RC o IL-17RC/IL-17RA

Se puede purificar el polipéptido de la presente invención a una pureza de al menos el 80% aproximadamente, a una pureza de al menos el 90% aproximadamente, a una pureza de al menos el 95% aproximadamente o a una pureza de más del 95%, tal como 96%, 97%, 98%, o una pureza mayor del 99% con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y sin agentes infecciosos ni pirógenos. El polipéptido de la presente invención también se puede purificar a una estado farmacéuticamente puro, cuya pureza es mayor del 99,9%. En algunas preparaciones, el polipéptido purificado está esencialmente libre de otros polipéptidos, particularmente de otros polipéptidos de origen animal.

Se pueden utilizar métodos de fraccionamiento y/o de purificación convencional para obtener preparaciones del IL-17RC/IL-17RA purificado de células hospedadoras recombinantes. Por lo general, se puede utilizar la precipitación con sulfato de amonio y extracción ácida o caótropa para fraccionar las muestras. Las etapas de purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión por tamaños, FPLC y cromatografía líquida de gran resolución de fase inversa. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos modificados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especializados y similares. Son adecuadas las modificaciones con PEI, DEAE, QAE y

Q. Los medios cromatográficos ejemplares incluyen los medios modificados con grupos fenilo, butilo u octilo, tal como Fenil-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butil 650 (Toso Haas, Mongomeryville, PA), Octil-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, tal como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas a base de sílice, resinas de celulosa, perlas de agarosa, perlas de agarosa interconectadas, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida interconectadas y similares que son insolubles en las condiciones en las que se deben utilizar. Se pueden modificar estos soportes con grupos reactivos que permiten la adhesión de las proteínas mediante grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o restos glucídicos.

Ejemplos de químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida y modificaciones carboxílicas y amínicas para las químicas de acoplamiento con carbodiimida. Estos y otros medios sólidos se conocen bien y se utilizan ampliamente en la técnica, y están disponibles de proveedores comerciales. La selección de un método particular para el aislamiento del polipéptido y su purificación es un asunto de diseño rutinario y se determina en parte por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods (Pharmacia LKB Biotechnology 1988) y Doonan, Protein Purification Protocols (The Humana Press, 1996).

Los expertos en la técnica pueden formular otras variaciones en el aislamiento y la purificación del IL-17RC/IL-17RA.

El polipéptido de la presente invención también se puede aislar al aprovecharse de determinadas propiedades. Por ejemplo, se puede utilizar la cromatografía de adsorción por iones metálicos inmovilizados (IMAC) para purificar proteínas ricas en histidina, incluidas las que comprenden etiquetas de polihistidina. Brevemente, primero se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1 (1985)). Se adsorberán a esta matriz las proteínas ricas en histidina con afinidades diferentes, según el ion metálico utilizado, y se eluirá mediante una elución competitiva, al disminuir el pH, o utilizar agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glucosiladas mediante cromatografía de afinidad a la lectina y cromatografía de intercambio iónico (M. Deutscher, (ed.,), Meth. Enzymol. 182: 529 (1990)). En realizaciones adicionales de la invención, se puede construir una fusión del polipéptido de interés y una etiqueta de afinidad (por ejemplo, proteína de unión a la maltosa, un dominio de inmunoglobulina) para facilitar la purificación. Además, las propiedades de unión a ligando del polipéptido soluble IL-17RC/IL-17RA de la presente invención se pueden explotar para la purificación, por ejemplo, de receptores solubles que comprenden el IL-17RC; por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad en la que el ligando IL-17F se une a una columna y el receptor que comprende el IL-17RC se une y posteriormente se eluye utilizando métodos cromatográficos estándares.

También se pueden preparar el polipéptido IL-17RC/IL-17RA o fragmentos del mismo mediante síntesis química, tal y como se describió anteriormente. Estos polipéptidos pueden ser monómeros o multímeros; glucosilados o sin glucosilar; PEGilados o sin PEGilar; y pueden o no pueden incluir un resto aminoacídico inicial de metionina.

I) Usos terapéuticos del polipéptido IL-17RC/IL-17RA de la invención

El polipéptido de la presente invención se puede utilizar para modular el sistema inmunitario al unirse a los ligandos IL-17A e IL-17F (juntos o por separado) y, por lo tanto, al impedir la unión de estos ligandos con los receptores IL-17RC y/o IL17RA endógenos. El polipéptido de la presente invención también se puede utilizar para modular el sistema inmunitario al inhibir la unión de la IL-17A y la IL-17F con los receptores endógenos IL-17RC e IL-17RA. Por consiguiente, la presente invención incluye la utilización del polipéptido de la presente invención para administrarlo a un sujeto que carece de una cantidad adecuada de este polipéptido, o que produce un exceso de IL-17A y/o de IL-17F. El polipéptido de la presente invención (por ejemplo, IL-17RC/IL-17RA) también se puede utilizar para tratar a un sujeto que produce un exceso de IL-17A, o de IL-17F, o de IL-17RA o de IL-17RC. Los sujetos adecuados incluyen mamíferos, tales como humanos. Por ejemplo, tales polipéptidos solubles son útiles para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la IL-17A y la IL17F (juntas o por separado) en el tratamiento de la inflamación y de las enfermedades inflamatorias tales como psoriasis, artritis reumatoide, enteropatía inflamatoria, SII, colitis, asma, rechazo de aloinjerto, esclerosis múltiple y otras enfermedades inflamatorias descritas en la presente memoria.

El polipéptido de la presente invención se une, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza a la IL-17F y la IL-17A (juntas o por separado) in vivo.

El análisis de la distribución tisular del ARNm que corresponde al ADNc del IL17RC mostró que el ARNm del gen IL-17RC se expresa fuertemente en tejidos de la glándula tiroides, de la glándula suprarrenal, de la próstata y del hígado, y se expresa menos en tejidos del corazón, del intestino delgado, del estómago y de la tráquea. En particular, el IL-17RC se expresa congruentemente en estirpes de células de sangre periférica de linfocitos distintos a los T, que incluyen monocitos, linfocitos B y células de la estirpe mieloide. De igual forma, el ARNm del IL-17RC se expresa fiablemente en las estirpes celulares obtenidas de la piel. Otras estirpes celulares que expresan el IL-17RC son las 5 estirpes celulares del intestino grueso que estaban presentes en el panel de tejidos. En cambio, hay poca o ninguna expresión en cerebro, placenta, pulmón, músculo esquelético, riñón, páncreas, timo, testículo, ovario, colon, leucocitos de la sangre periférica, médula espinal, ganglios linfáticos y la médula ósea. El ligando al que se une el IL-17RC (IL-17F y/o IL-17A) interviene en la inducción de la respuesta inflamatoria y contribuye a las enfermedades inflamatorias, principalmente mediante su capacidad para potenciar la producción de mediadores inflamatorios, incluidos IL-1�, IL-6 y TNF-�, así como los mediadores que están implicados en la proliferación, maduración y quimiotaxia de los neutrófilos (revisado por Witowski et al., Cell. Mol. Life Sci. 61: 567-579 (2004)).

Por lo tanto, las realizaciones particulares de la presente invención están dirigidas a utilizar el polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble como antagonista en las enfermedades o afecciones inflamatorias e inmunitarias tales como psoriasis, enfermedades inflamatorias de la piel, artritis reumatoide, enteropatía inflamatoria, SII, enfermedad de Crohn, asma, enfermedad autoinmunitaria, trasplante de órganos o de médula ósea, inflamación debido a un traumatismo, intervención quirúrgica o infección; enfermedad de injerto contra huésped; y en la que la inhibición de la inflamación, la supresión inmunitaria, la reducción de la proliferación de las células hematopoyéticas, inmunitarias, inflamatorias o linfáticas, macrófagos, linfocitos T (incluidos los linfocitos Th1 y Th2), supresión de la respuesta inmunitaria a un patógeno o antígeno u otros casos en los que se desea la inhibición de la IL-17F y/o la IL-17A.

Además, el polipéptido soluble IL-17RC/IL-17RA es útil para:

1) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización a través del IL-17RA o del IL-17RC en el tratamiento de la inflamación aguda, inflamación como resultado de traumatismo, lesiones tisulares, intervención quirúrgica, infección y enfermedades inflamatorias crónicas tales como asma, enteropatía inflamatoria, SII, colitis crónica, artritis reumatoide, asma y otras enfermedades asociadas a la inducción de la respuesta de la fase aguda.

2) Bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la señalización del IL17RA o del IL-17RC en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes sacarina insulinodependiente, esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide, SII y enteropatía inflamatoria para prevenir o inhibir la señalización en células inmunitarias (por ejemplo, linfocitos, monocitos, leucocitos). Bloquear, inhibir, reducir o antagonizar la señalización a través del IL-17RC y/o del IL-17RA, mediante el polipéptido de la presente invención, también puede resultar beneficioso para las enfermedades del páncreas, del riñón, de la hipófisis o de las células neuronales.

3) Hacer de agonista, potenciar, aumentar o iniciar la señalización a través del IL-17RA o del IL-17RC en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tales como la EM, la artritis reumatoide, el SII y la enteropatía inflamatoria. El polipéptido soluble de la presente invención puede dar la señal para que los linfocitos u otras células inmunitarias se diferencien, alteren la proliferación, o cambien la producción de citocinas o de proteínas de la superficie celular ,que mejoran la autoinmunidad. Específicamente, la modulación de una respuesta de linfocitos cooperadores T a un patrón alternativo de la secreción de citocinas puede desviar una respuesta autoinmunitaria para mejorar la enfermedad (Smith JA et al., J. Immunol. 160: 48414849, 1998). De igual forma, se pueden usar polipéptidos solubles agonistas para señalizar, agotar y desviar las células inmunitarias implicadas en el asma, la alergia y la atopia. La señalización del IL-17RC y/o del IL-17-RA también puede resultar beneficioso para las enfermedades del páncreas, del riñón, de la hipófisis y de las células neuronales.

El polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble descrito en la presente memoria se puede utilizar para unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de la IL-17F o de la IL-17A, juntas o por separado, en el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria o la atopia, tal y como se describió anteriormente. La forma soluble del IL-17RC/IL-17RA se puede utilizar para favorecer una respuesta a los anticuerpos mediada por linfocitos Th y/o para favorecer la producción de la IL-4 u otras citocinas desde los linfocitos o desde otras células inmunitarias.

El polipéptido soluble de la presente invención es útil como un antagonista de IL-17A y/o IL-17F. Tales efectos antagonistas se pueden conseguir mediante la neutralización o unión directa a la IL-17A o a la IL-17F. Además de los usos antagonistas, el receptor soluble de la presente invención puede unirse a la IL-17F o a la IL-17A y actuar como proteínas transportadoras del ligando, para transportarlo a diferentes tejidos, órganos y células dentro del cuerpo. Como tal, el receptor soluble de la presente invención se puede fusionar o unir a moléculas, polipéptidos o grupos químicos que dirigen el complejo ligando-receptor soluble a un sitio específico, tal como un tejido, célula inmunitaria específica o tumor. Por ejemplo, en la infección aguda o algunos cánceres, puede ser beneficioso inducir la inflamación y las proteínas de respuesta de la fase aguda local mediante la acción de la IL-17F. Por lo tanto, los receptores solubles de la presente invención se pueden utilizar para dirigir específicamente la acción de la IL-17A o de la IL-17F. Véase, Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; y Fernandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000.

La inflamación es una respuesta protectora que un organismo desarrolla para repeler un agente invasor. La inflamación es un acontecimiento en cascada con muchos mediadores celulares y humorales. Por una parte, la supresión de las respuestas inflamatorias puede dejar inmunodeprimido al hospedador; no obstante, si no se verifica, la inflamación puede dar lugar a complicaciones graves que incluyen enfermedades inflamatorias crónicas (por ejemplo, psoriasis, artritis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, enteropatía inflamatoria y similares). Cabe destacar que estas enfermedades heterogéneas comparten unos mediadores inflamatorios comunes. Las enfermedades colectivas que se caracterizan por la inflamación tienen un gran impacto sobre la morbimortalidad humana. Por lo tanto, está claro que las proteínas antiinflamatorias, tal como el polipéptido soluble de la presente invención, podría tener un potencial terapéutico decisivo para un gran número de enfermedades humanas y animales, desde el asma y la alergia a la autoinmunidad.

1. Artritis

La artritis, incluida la artrosis, la artritis reumatoide, las articulaciones artríticas como resultado de una lesión, y similares, son enfermedades inflamatorias frecuentes que se beneficiarían del uso terapéutico de proteínas antiinflamatorias, tal como los polipéptidos solubles de la presente invención. Por ejemplo, la artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica que afecta a todo el cuerpo y es una de las formas más habituales de artritis. Se caracteriza por la inflamación de la membrana que reviste la articulación, lo que ocasiona dolor, rigidez, calor, enrojecimiento e hinchazón. Las células inflamatorias liberan enzimas que podrían digerir el hueso y el cartílago. Como resultado de la artritis reumatoide, el revestimiento inflamado de la articulación, la membrana sinovial, puede invadir y dañar el hueso y el cartílago, lo que conduce al deterioro de la articulación y a dolor intenso entre otros efectos fisiológicos. La articulación afectada puede perder su forma y alineación, lo que da lugar a dolor y pérdida de movimiento.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad con mediación inmunitaria caracterizada particularmente por la inflamación y el posterior daño al tejido, lo que conduce a incapacidad pronunciada y aumento de la mortalidad. En las articulaciones con artritis reumatoide se producen localmente una serie de citocinas. Varios estudios han demostrado que la IL-1 y el TNF-�, dos citocinas proinflamatorias prototípicas, desempeñan una función importante en los mecanismos implicados en la inflamación sinovial y en la destrucción progresiva de la articulación. De hecho, la administración de inhibidores del TNF-� y la IL-1 en los pacientes con AR ha llevado a una mejora considerable de los signos clínicos y biológicos de la inflamación y a una reducción de los signos radiológicos de la erosión ósea y la destrucción del cartílago. No obstante, a pesar de estos resultados alentadores, un porcentaje significativo de los pacientes no responde a estos fármacos, lo que sugiere que otros mediadores también están implicados en la fisiopatología de la artritis (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135149, 2002). Uno de estos mediadores podría ser IL-17A o IL-17F, y como tal, una molécula que se une o inhibe la actividad de la IL-17F o la IL-17A, tal como el IL17RC/IL-17RA soluble, podría servir a modo de tratamiento valioso para reducir la inflamación en la artritis reumatoide y en otras enfermedades artríticas.

En la técnica se conocen varios modelos de animales para la artritis reumatoide. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por el colágeno (AIC), los ratones padecen una artritis inflamatoria crónica que se parece mucho a la artritis reumatoide humana. Dado que la AIC comparte características similares inmunitarias y anatomopatológicas con la AR, constituye un modelo ideal para detectar los posibles compuestos inflamatorios humanos. El modelo de AIC es un modelo bien conocido en los ratones que, para que se produzca, depende a la vez de una respuesta inmunitaria y de una respuesta inflamatoria. La respuesta inmunitaria comprende la interacción de los linfocitos B y los linfocitos T CD4+ en respuesta al colágeno, que se administra a modo de antígeno, y conduce a la producción de anticuerpos contra el colágeno. La fase inflamatoria es el resultado de respuestas del tejido debidas a mediadores de la inflamación, como consecuencia de que algunos de estos anticuerpos reaccionan cruzadamente con el colágeno natural del ratón y activan la cascada del complemento. Una ventaja al utilizar el modelo de AIC es que se conocen los mecanismos básicos de la patogenia. Se han identificado los epítopos relevantes de linfocitos T y linfocitos B sobre el colágeno de tipo II, y se han determinado varios parámetros inmunológicos (por ejemplo, hipersensibilidad de tipo retrasado y anticuerpos contra el colágeno) e inflamatorios (por ejemplo, citocinas, quimiocinas y enzimas degradantes de la matriz) relacionados con la artritis con mediación inmunitaria y, por lo tanto, se pueden utilizar para evaluar la eficacia del compuesto en el modelo de AIC (Wooley, Curr. Opin. Rheum., 3: 407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89: 9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci., 61: 1861-78, 1997; y Wang et al., Immunol. 92: 8955-959, 1995).

Un grupo ha demostrado que un anticuerpo contra la IL-17 de ratón reduce los síntomas en un modelo de AIC de ratón respecto a los ratones de control, lo que demuestra conceptualmente que los polipéptidos solubles de la presente invención serían beneficiosos para tratar la enfermedad humana. La administración de un solo antisuero de rata específico contra la IL-17 de ratón redujo los síntomas de la artritis en los animales cuando se administró preventivamente o después de que los síntomas de la artritis ya estuviesen presentes en el modelo (Lubberts et al., Arthritis Rheum. 50: 650-9, 2004). Por consiguiente, se puede utilizar el IL-17RC/IL-17RA-Fc para neutralizar la IL-17A y/o la IL-17F en el tratamiento de enfermedades humanas específicas tales como artritis, psoriasis, enteropatía inflamatoria, SII y otras enfermedades inflamatorias descritas en la presente memoria.

La administración del polipéptido soluble de la presente invención a estos ratones modelo de AIC se utiliza para evaluar su uso como un antagonista de la IL-17F y la IL-17A para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad. Además, los resultados que muestran inhibición o neutralización de la IL-17F y/o Ia IL-17A mediante el polipéptido soluble de la presente invención proporcionarían una demostración preliminar de que también se pueden utilizar otros antagonistas de la IL17A o la IL-17F para mejorar los síntomas y alterar el curso de la enfermedad. Además, dado que la IL-17A y/o la IL-17F induce la producción de la IL-1� y el TNF-�, los cuales están implicados en la patogenia y la progresión de la artritis reumatoide, la administración generalizada o local de estos polipéptidos solubles podría suprimir la respuesta inflamatoria en la AR. A modo de ejemplo y sin que sirva de limitación, la inyección de 10 a 200 µg de IL-17RC-Fc por ratón (de 1 a 7 veces a la semana hasta, pero sin que sea limitante, 4 semanas mediante las vías de administración s.c., i.p. o i.m.) puede reducir significativamente la puntuación de la enfermedad (puntuación de la pata, episodio de inflamación o enfermedad). Según el inicio de la administración del IL-17RC-Fc (por ejemplo, antes o en el momento de la inmunización con colágeno, o en cualquier momento después de la segunda inmunización con colágeno, incluidos los puntos en los que la enfermedad ya ha progresado), el IL-17RC puede ser eficaz para prevenir la artritis reumatoide así como para prevenir su progresión. Otros posibles medicamentos incluyen los polipéptidos IL-17RC/IL-17RA, y similares.

2. Enteropatías inflamatorias

En los EE.UU., unas 500 000 personas padecen una enteropatía inflamatoria (IBD por su nombre en inglés) que puede afectar tanto al colon como al recto (colitis ulcerosa o CU) o a ambos, al intestino delgado y al grueso (enfermedad de Crohn). La patogenia de estas enfermedades está poco clara, pero implican la inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos solubles de la presente invención podrían servir como un medicamento valioso para reducir la inflamación y los efectos patológicos en la enteropatía inflamatoria, la CU y otras enfermedades relacionadas.

La CU es una enfermedad inflamatoria del intestino grueso, habitualmente denominada el colon, caracterizada por la inflamación y la ulceración de la mucosa o el revestimiento más interno del colon. Esta inflamación hace que el colon se vacíe con frecuencia, lo que da lugar a diarrea. Los síntomas incluyen heces sueltas y la asociación de cólicos, fiebre y adelgazamiento. Aunque se desconoce la causa exacta de la CU, la investigación reciente sugiere que las defensas naturales del cuerpo luchan contra las proteínas del cuerpo porque cree que son extrañas (una «reacción autoinmunitaria»). Quizás porque se parecen a proteínas bacterianas en el intestino, estas proteínas pueden instigar o estimular el proceso inflamatorio que comienza destruyendo el revestimiento del colon. A medida que se destruye el revestimiento del colon, se forman úlceras que liberan moco, pus y sangre. Normalmente, la enfermedad comienza en la zona rectal y, finalmente, puede extenderse por todo el intestino grueso. Los episodios repetidos de inflamación conducen al engrosamiento de la pared del intestino y el recto con cicatrización del tejido. Se puede producir la muerte del tejido del colon o septicemia si la enfermedad es grave. Los síntomas de la colitis ulcerosa son de diferente gravedad, y su comienzo puede ser gradual o repentino. Los ataques pueden estar provocados por muchos factores, incluidasls infecciones respiratorias o el estrés.

Aunque en la actualidad no hay cura para la CU, los tratamientos se centran en suprimir el proceso inflamatorio anormal del revestimiento del colon. Se puede disponer de tratamientos que incluyen corticoesteroides, inmunodepresores (por ejemplo, azatioprina, mercaptopurina y metotrexato) y aminosalicilatos para tratar la enfermedad. Sin embargo, el uso a largo plazo de inmunodepresores tal como corticoesteroides y azatioprina puede dar lugar a efectos secundarios graves que incluyen adelgazamiento de los huesos, cataratas, infección y efectos en el hígado y la médula ósea. En los pacientes en los que los tratamientos actuales no son satisfactorios, la intervención quirúrgica es una opción. La intervención quirúrgica implica eliminar todo el colon y el recto.

Hay varios modelos animales que simulan parcialmente la colitis ulcerosa crónica. El modelo más ampliamente utilizado es el modelo de colitis inducida por el ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico/etanol (TNBS), que induce la inflamación crónica y la ulceración del colon. Cuando se introduce el TNBS en el colon de ratones susceptibles a través de una instilación intrarrectal, induce la respuesta inmunitaria mediada por los linfocitos T en la mucosa del colon, que en este caso conduce a una inflamación masiva de la mucosa caracterizada por la infiltración densa de linfocitos T y macrófagos por toda la pared del intestino grueso. Además, este cuadro histopatológico está acompañado del cuadro clínico de adelgazamiento progresivo (debilitante), hematoquecia, prolapso rectal, y engrosamiento de la pared del intestino grueso (Neurath et al., Intern. Rev. Immunol. 19: 51-62, 2000).

Otro modelo de colitis utiliza dextransulfato de sodio (DSS), que induce una colitis ulcerosa que se manifiesta con hematoquecia, adelgazamiento, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por el DSS se caracteriza histológicamente por infiltración de células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfática, daño en la cripta focal y ulceración epitelial. Se cree que estos cambios se desarrollan debido a un efecto tóxico del DSS sobre el epitelio y por la fagocitosis de las células de la lámina propia y la producción del TNF-� y el IFN-�. A pesar de su uso frecuente, quedan sin resolver varias cuestiones relacionadas con los mecanismos del DSS en cuanto a su relevancia para la enfermedad humana. El DSS se considera como un modelo independiente de linfocitos T porque se observa en animales deficientes en linfocitos T tal como ratones con inmunodeficiencia combinada grave (IDCG).

La administración del polipéptido soluble de la presente invención a estos modelos de TNBS o DSS se puede utilizar con el objeto de evaluar su utilización para mejorar los síntomas y alterar la evolución de la enfermedad digestiva. Además, los resultados que demuestran la inhibición o la neutralización de la IL-17F y/o la IL-17A mediante estos polipéptidos solubles proporcionan una demostración preliminar de que estos (o moléculas similares) también se pueden utilizar para mejorar los síntomas en los modelos de colitis/enteropatía inflamatoria y alterar la evolución de la enfermedad.

3. Psoriasis

La psoriasis es una enfermedad cutánea crónica que afecta a más de siete millones de estadounidenses. La psoriasis se produce cuando crecen nuevas células cutáneas de forma anormal, lo que da lugar a zonas de la piel inflamadas, hinchadas y con escamas, en las que la piel vieja no se ha desprendido lo suficientemente rápido. La psoriasis en placa, la forma más común, se caracteriza por zonas inflamadas de la piel («lesiones») coronadas con escamas blancas plateadas. La psoriasis se puede limitar a unas pocas escamas o afectar moderada o extensamente a diversas zonas de la piel, y aparece habitualmente en el cuero cabelludo, las rodillas, los codos o el tronco. Aunque es muy visible, la psoriasis no es una enfermedad contagiosa. La patogenia de las enfermedades implica la inflamación crónica de los tejidos afectados. Los polipéptidos solubles de la presente invención podrían servir como un medicamento valioso para reducir la inflamación y los efectos anatomopatológicos de la psoriasis, de otras enfermedades cutáneas inflamatorias, de alergias de la piel y las mucosas, y de enfermedades relacionadas.

La psoriasis es un trastorno inflamatorio de la piel mediado por los linfocitos T que puede causar un malestar considerable. Es una enfermedad para la cual no hay cura y afecta a personas de todas las edades. La psoriasis afecta aproximadamente al 2% de la población de Europa y Norteamérica. Aunque los individuos con psoriasis leve pueden controlar a menudo la enfermedad con sustancias tópicas, más de un millón de pacientes de todo el mundo necesita un tratamiento con rayos ultravioleta o con un inmunodepresor sistémico. Desgraciadamente, los inconvenientes y los riesgos de la radiación ultravioleta y los efectos secundarios de muchos tratamientos limitan su uso a largo plazo. Además, los pacientes normalmente padecen recidivas de psoriasis y, en algunos casos, rebrotes, poco después de interrumpir el tratamiento con los inmunodepresores.

El polipéptido soluble de la presente invención también se puede utilizar en los sistemas diagnósticos para detectar los niveles en circulación de la IL-17F o la IL-17A, y en la detección de la IL-17F o la IL-17A asociada a una respuesta inflamatoria en la fase aguda. En una realización relacionada, el polipéptido soluble de la presente invención se puede utilizar para detectar polipéptidos de la IL-17F o la IL-17A que actúan localmente. El aumento o la disminución de la cantidad de ligando o de los polipéptidos receptores puede ser indicativo de afecciones patológicas, incluidas la inflamación o el cáncer. Se sabe que la IL-17F induce la respuesta inflamatoria asociada en la fase aguda. Además, la detección de proteínas o de moléculas de la fase aguda, tal como la IL-17A o la IL-17F, puede ser indicativa de una enfermedad inflamatoria crónica en algunos estados patológicos (por ejemplo, asma, psoriasis, artritis reumatoide, enteropatía inflamatoria, SII). La detección de estas afecciones sirve para ayudar a diagnosticar la enfermedad, así como para ayudar al médico a elegir el mejor tratamiento.

Además de otros modelos de enfermedad descritos en la presente memoria, la actividad de los polipéptidos solubles de la presente invención sobre el tejido inflamado derivado de lesiones psoriásicas humanas se puede medir in vivo mediante un modelo de ratón con inmunodeficiencia combinada grave (IDCG). Se han desarrollado varios modelos de ratón en los que se implantan células humanas en ratones inmunodeficientes (citados colectivamente como modelos xenotrasplantados); véase, por ejemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18: 513-22, 1994 y Flavell, DJ, Hematological Oncology, 14: 67-82, 1996. Al igual que en el modelo xenotransplantado in vivo para la psoriasis, se implanta tejido cutáneo con psoriasis de humano en el modelo de ratón IDCG y se expone a un antagonista adecuado. Además, se pueden utilizar otros modelos de animales con psoriasis en la técnica para evaluar los antagonistas de la IL-17A y la IL-17F, tal como injertos de piel con psoriasis de humanos en el modelo de ratón AGR129, y se expone a un antagonista adecuado (por ejemplo, véase, Boyman, O, et al., J. Exp. Med., publicación en línea n.º 20031482, 2004). En este modelo se puede usar el polipéptido soluble de la presente invención que une, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza o neutraliza la actividad de la IL-17A y la IL-17F. De igual forma, los tejidos o células derivados de la enteropatía inflamatoria, el síndrome del intestino irritable, la artritis u otras lesiones inflamatorias se pueden utilizar en el modelo con IDCG para evaluar las propiedades inflamatorias de los antagonistas de la IL-17A y de la IL-17F descritos en la presente memoria.

Los tratamientos diseñados para abolir, retrasar o reducir la inflamación mediante el polipéptido soluble de la presente invención se pueden analizar mediante la administración a los ratones IDCG que llevan tejido humano inflamatorio (por ejemplo, lesiones psoriásicas y similares) u otros modelos descritos en la presente memoria. La eficacia del tratamiento se mide y se evalúa estadísticamente como un aumento del efecto antiinflamatorio dentro de la población tratada a lo largo del tiempo con los métodos bien conocidos en la técnica. Algunos métodos ejemplares incluyen, pero sin limitarse a ellos, medir, por ejemplo, en un modelo con psoriasis, el grosor de la epidermis, el número de células inflamatorias en la dermis superior y los grados de paraqueratosis. Tales métodos se conocen en la técnica y se describen en la presente memoria. Por ejemplo, véase Zeigler, M. et al., Lab. Invest. 81: 1253, 2001; Zollner, T. M et al. J. Clin. Invest. 109: 671, 2002; Yamanaka, N. et al. Microbiol. Immunol. 45: 507, 2001; Raychaudhuri, S.P. et al. Br. J. Dermatol., 144: 931, 2001; Boehncke, W. H et al., Arch. Dermatol. Res. 291: 104, 1999; Boehncke, W. H et al., J. Invest. Dermatol.

116: 596, 2001; Nickoloff, B. J. et al. Am. J. Pathol. 146: 580, 1995; Boehncke, W. H et al. J. Cutan. Pathol. 24: 1, 1997; Sugai, J. M. et al., J. Dermatol. Sci., 17: 85, 1998; y Villadsen, L. S. et al., J. Clin. Invest. 112: 1571, 2003. La inflamación también se puede monitorizar con el tiempo mediante métodos bien conocidos tal como citometría de flujo (o la PCR) para cuantificar el número de células inflamatorias o que provoca lesiones presentes en una muestra, puntuación (adelgazamiento, diarrea, hemorragia rectal, longitud del colon) para la enteropatía inflamatoria, puntuación de la enfermedad en la pata y puntuación de la inflamación para el modelo de AR mediante la AIC. Por ejemplo, las estrategias terapéuticas adecuadas para analizar tal modelo incluyen el tratamiento directo que utiliza el IL-17RC o el IL-17RC/IL-17RA solubles, u otros antagonistas de la IL-17A o de la IL-17F (juntos o por separado), o conjugados relacionados o antagonistas basados en interrumpir la interacción del IL-17RC y/o el IL-17RA con sus ligandos correspondientes.

La psoriasis es una enfermedad cutánea inflamatoria crónica que está asociada a los queratinocitos epidérmicos hiperplásicos y la infiltración de linfocitos mononucleares, que incluyen los linfocitos T CD4+ de memoria, los neutrófilos y los macrófagos (Christophers., Int. Arch. Allergy. Immunol., 110: 199, 1996). En la actualidad se cree que los antígenos medioambientales desempeñan una función importante a la hora de iniciar y contribuir a la patología de la enfermedad. No obstante, se cree que la pérdida de tolerancia a los antígenos propios interviene en la anatomopatología de la psoriasis. Se cree que las células dendríticas y los linfocitos T CD4+ desempeñan una función importante en la presentación de antígenos y en el reconocimiento de que intervienen en la respuesta inmunitaria que conduce a la enfermedad. Recientemente, hemos desarrollado un modelo de psoriasis basado en el modelo de transferencia en CD4+CD45RB (Davenport et al., Internat. Immunolpharmacol., 2: 653-672). El polipéptido soluble de la presente invención se administra a los ratones. La inhibición de las puntuaciones de la enfermedad (lesiones cutáneas, citocinas inflamatorias) indica la eficacia de los polipéptidos solubles para la psoriasis.

4. Asma

La IL-17 desempeña una función importante en la activación de los linfocitos T inducida por alérgenos y la afluencia de neutrófilos en las vías aéreas. El receptor de la IL-17 se expresa en las vías aéreas (Yao et al., Immunity 3: 811 (1995)), y el reclutamiento de los neutrófilos mediado por la IL-17 en el asma alérgico está inducido considerablemente por los quimiotácticos IL-8, GRO-� y la proteína-2 inflamatoria de macrófagos (MIP-2) producida por las células epiteliales bronquiales humanas estimuladas con IL-17 (HBEC, por su nombre en inglés) y los fibroblastos bronquiales humanos (Yao et al., J. Immunol 155: 5483 (1995)); Molet et al., J. Allergy Clin. Immunol. 108: 430 (2001)). IL-17 también estimula las HBEC para liberar IL-6, un factor de activación de neutrófilos (Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996) y Linden et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 126: 179 (2001)) y se ha demostrado que presenta sinergia con el TNF-� para prolongar la supervivencia de los neutrófilos humanos in vitro (Laan et al., Eur. Respir. J. 21: 387 (2003)). Además, la IL-17 es capaz de amplificar las respuestas inflamatorias en el asma por su capacidad para potenciar la secreción de las citocinas implicadas en la remodelación de las vías respiratorias tal como las citocinas profibrósicas, IL-6 e IL-11, y los mediadores inflamatorios factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) y factor estimulador de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) (Molet et al., J. Allergy Clin Immunol. 108: 430 (2001)).

Las pruebas clínicas muestran que las complicaciones graves y agudas del asma se relacionan con el reclutamiento y la activación de los neutrófilos en las vías respiratorias, por lo que la IL-17 desempeña una función importante en el asma. Los pacientes con asma leve muestran un aumento detectable de la concentración local de proteína IL-17A soluble libre (Molet al., J. Allergy Clin. Immunol 108: 430 (2001)), mientras que los voluntarios humanos sanos con una inflamación grave de las vías respiratorias inducida por la exposición a una pocilga muestran un aumento pronunciado de la concentración de la proteína libre soluble IL-17A en el espacio broncoalveolar (Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996) y Linden et al., Int. Arch. Allergy ImmunoI, 126: 179 (2001)). Además, la concentración de IL-17 en la flema se ha correlacionado con pacientes cuya hiperreactividad de las vías respiratorias está aumentada (Barczyk et al., Respir. Med. 97: 726 (2003)).

En los modelos de animales con hiperreactividad en las vías respiratorias, la inhalación crónica de ovalbúmina por parte de ratones sensibilizados dio lugar a la inflamación eosinófila bronquial y a una inducción temprana de la expresión del ARNm de la IL-17 en tejido pulmonar inflamado, junto con neutrofilia bronquial (Hellings et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 28:42 (2003)). Los anticuerpos monoclonales anti-IL-17 redujeron fuertemente la afluencia de neutrófilos a los bronquios, pero aumentaron significativamente la concentración de IL-5 tanto en el líquido de lavado broncoalveolar como en el suero, y agravó la afluencia de eosinófilos en los bronquios inducida por alérgenos, lo que sugería que la IL-17A podría estar implicada en la determinación del equilibrio entre la acumulación de neutrófilos y eosinófilos después del ataque del antígeno (Id).

Entre los miembros de la familia de la IL-17, la IL-17F es la que está más relacionada con la IL-17A. Las actividades biológicas mediadas por la IL-17F son similares a las de la IL-17A, en las que IL-17F estimula la producción de IL-6, IL-8 y GCSF (Hurst et al., J. Immunol. 169: 443 (2002)). IL-17F también induce la producción de IL-2, el factor de crecimiento transformante (TGF)-�, y la proteína quimiotáctica de monocitos (MCP) en las células endoteliales (Starnes et al., J. Immunol. 167: 4137 (2001)). De igual forma, la exposición a alérgenos puede aumentar la IL-17F local en los pacientes con asma (Kawaguchi et al., J. Immunol. 167: 4430 (2001)). La liberación del gen de la IL-17F en el pulmón murino hace aumentar los neutrófilos en el espacio broncoalveolar, mientras que la transferencia a la mucosa del gen de la IL-17F hace aumentar la concentración de neutrófilos pulmonares inducidos por Ag y la reactividad de las vías respiratorias a la metacolina (Oda et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 171: 12 (2005)).

Además del asma, varias enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias se caracterizan por el reclutamiento de neutrófilos en las vías respiratorias y se ha descrito que la IL-17 desempeña una función importante en la patogenia de las afecciones respiratorias, tal como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y la fibrosis quística (Linden et al., Eur. Respir. J. 15: 973 (2000); Ye et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 25: 335 (2001), Rahman et al., Clinic. Immunol., 115: 268 (2005)). Una molécula terapéutica anti-IL-17A y/o anti-IL-17F se podría demostrar que sería eficaz para las enfermedades inflamatorias crónicas de las vías aéreas en un modelo de inflamación in vitro. La capacidad de los antagonistas a la actividad de la IL-17F y/o la IL-17A, tal como los receptores solubles IL-17RC y los anticuerpos contra ellos, incluidos los anticuerpos neutralizantes y monoclonales anti-IL-17RC humano de la presente invención, para inhibir la producción de citocinas y quimiocinas inducida por la IL-17A y/o la IL-17F en los cultivos de HBEC o fibroblastos bronquiales se podría utilizar para medir la eficacia de tales antagonistas a la hora de prevenir la producción de mediadores inflamatorios que se obtienen directamente por la estimulación de la IL-17A y/o de la IL-17F. Si la adición de antagonistas, tal como el polipéptido soluble de la presente invención, contra la actividad de la IL-17F y/o la IL17A reduce notablemente la producción y la expresión de los mediadores inflamatorios, se podría esperar que fuera eficaz en los aspectos inflamatorios relacionados con la inflamación crónica de las vías aéreas.

5. Síndrome del intestino irritable («SII»)

El síndrome del intestino irritable constituye una enfermedad caracterizada por dolor abdominal o malestar y un hábito intestinal errático. Los pacientes con el SII se pueden clasificar en tres grupos principales según los hábitos intestinales: aquellos con heces sueltas o frecuentes, aquellos con heces principalmente duras o infrecuentes y aquellos con unas heces normales o variables (Talley et al., 2002). La alteración de la motilidad intestinal, las anomalías en la función epitelial, el tránsito anormal de las heces y el gas, y el estrés, pueden contribuir a los síntomas, al mismo tiempo que la hipersensibilidad visceral es una característica clave en la mayor parte de los pacientes. Los factores genéticos que afectan a la señalización del dolor y a las alteraciones en el procesamiento central de las señales aferentes se piensa que predisponen a los individuos al SII tras exposiciones medioambientales específicas. Los estudios también han demostrado que las respuestas inflamatorias en el colon pueden contribuir a un aumento de la sensibilidad del músculo liso y de los nervios entéricos y, por lo tanto, a perturbar las funciones motoras sensoriales en el intestino (Collins et al., 2001). Hay un solapamiento clínico entre el SII y la enteropatía inflamatoria, describiéndose con frecuencia unos síntomas de tipo SII en los pacientes antes de diagnosticarles la enteropatía inflamatoria, y unos síntomas de SII mayores de lo esperado en los pacientes con remisión de una enteropatía inflamatoria establecida. Por lo tanto, estas afecciones pueden coexistir con una frecuencia mayor de la esperada, o pueden existir como un continuo, con el SII y la enteropatía inflamatoria en diferentes extremos del mismo espectro. Sin embargo, se debe destacar que, en la mayoría de los pacientes con el SII, las muestras de biopsia de colon aparecen normales. No obstante, el SII afecta significativamente a un gran número de personas (prevalencia en aproximadamente 16 millones de personas en el año 2000 en los EE.UU.), lo que da lugar a una carga de coste total de 1700 millones de dólares (año 2000). Por lo tanto, entre las enfermedades y los trastornos digestivos más prevalentes y costosos, el SII es la segunda solo después de la enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE). A diferencia de la ERGE, el tratamiento para el SII sigue siendo insatisfactorio (Talley et al., 2002; Farhadi et al., 2001; Collins et al.,

2001), lo que demuestra que el SII constituye claramente una necesidad médica insatisfecha.

Se han propuesto modelos de enfermedad coincidentes que proponen una mejora de la reactividad de los circuitos neurales, inmunitarios o neuroinmunitarios en el sistema nervioso central (SNC) o en el intestino a las perturbaciones centrales (psicosociales) o periféricas (irritación, inflamación o infección de los tejidos) de la homeostasia normal (Talley et al., 2002). Esta reactividad reforzada da lugar a una desregulación de la motilidad intestinal, de la función epitelial (inmunitaria, permeabilidad), y una hipersensibilidad visceral, que a su vez da lugar a síntomas de SII.

Muchas moléculas diferentes pueden realizar una función en la patogenia del SII, incluida una función para las moléculas que estimulan las neuronas y las que están implicadas en el inicio del proceso inflamatorio. Se sabe que una serie de las moléculas diseñadas en nuestro laboratorio están relacionadas con una posible actividad sobre las neuronas debido a su expresión directa en las neuronas o por la expresión de sus receptores en las neuronas, incluidas la IL-17D, la IL-17B y la IL-31. Además, una serie de miembros de la familia de la IL-17 y moléculas relacionadas se han asociado a la inflamación en el intestino, incluidas IL-17A, IL-17F, IL-23 e IL-31.

Se podría analizar la eficacia de los inhibidores de estas moléculas in vivo en modelos de animales de la enfermedad. Se han sugerido varios modelos animales que imitan las características principales del SII y que implican los estímulos centrales (estrés) o los estímulos periféricos (infección, inflamación). Dos ejemplos de modelos animales in vivo que se podrían utilizar para determinar la eficacia de los inhibidores en el tratamiento del SII son 1) modelos que se centran en la patogenia del SII dirigida por el SNC (modelos de estrés) y 2) modelos que se centran en los inductores intestinales del estrés (es decir, inflamación, infección o esfuerzo físico del intestino). Sin embargo, se debe destacar que los acontecimientos dentro del SNC o en el tubo digestivo no se producen de forma aislada y que los síntomas del SII más probablemente sean resultado de una interacción compleja entre las señales del SNC sobre el tubo digestivo y viceversa.

J) Formulaciones farmacéuticas

Para el uso farmacéutico, el polipéptido soluble de la presente invención se formula para la administración por vía parenteral, particularmente por vía intravenosa o vía subcutánea, según los métodos convencionales. La administración por vía intravenosa será por inyección intravenosa rápida (bolo), liberación controlada, por ejemplo, mediante minibombas de infusión intravenosa u otra tecnología adecuada, o mediante infusión durante el periodo habitual de una a varias horas. Por lo general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína hematopoyética en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una solución salina, una solución salina tamponada, dextrosa al 5% en agua, o similares. Además, las formulaciones incluyen uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, tamponantes, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en la superficie de los viales, etc. Cuando se utiliza esta politerapia, se pueden combinar las citocinas en una formulación única o se pueden administrar en formulaciones separadas. Los métodos de formulación se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990. Por lo general, las dosis terapéuticas estarán en el intervalo de 0,1 a 100 mg/kg de masa del paciente al día, preferentemente de 0,5 a 20 mg/kg al día, cuya la dosis exacta la determinará el médico según los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y la gravedad de la enfermedad a tratar, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis se encuentra al alcance del experto en la técnica. Las proteínas se administrarán con frecuencia durante un periodo de hasta 28 días después de la quimioterapia o del trasplante de médula ósea, o hasta que se consiga un número de plaquetas >20 000/mm3, preferentemente >50 000/mm3. Con más frecuencia, se administrarán las proteínas durante una semana o menos, a menudo durante un periodo de uno a tres días. Por lo general, una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido soluble de la presente invención es una cantidad suficiente para producir un aumento clínicamente significativo de la proliferación y/o la diferenciación de las células progenitoras linfáticas o mieloides, lo que se manifestará como un aumento de la concentración en circulación de las células maduras (por ejemplo, plaquetas o neutrófilos). Por lo tanto, el tratamiento de los trastornos plaquetarios continuará hasta que se consiga un número de plaquetas de al menos 20 000/mm3, preferentemente 50 000/mm3. También se puede administrar el polipéptido soluble de la presente invención en politerapia con otras citocinas tales como IL-3, IL-6 e IL-11; factor de hemocitoblastos; eritropoyetina; G-CSF y GM-CSF. Dentro de las posologías de la politerapia, las dosis diarias de otras citocinas serán, de forma general: EPO, 150 U/kg; GM-CSF, 5-15 lg/kg; IL-3, 1-5 lg/kg; y G-CSF, 1-25 lg/kg. La politerapia con EPO, por ejemplo, está indicada en los pacientes anémicos con poca cantidad de EPO.

Por lo general, la dosis del polipéptido soluble administrado variará según factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, el estado médico general y los antecedentes del paciente. Típicamente, es deseable administrar al paciente receptor una dosis de tal polipéptido soluble que se encuentre en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (cantidad de fármaco/masa corporal del paciente), aunque se administrará una dosis menor o mayor según dicten las circunstancias.

La administración del polipéptido soluble de la presente invención a un sujeto puede ser por vía intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intrapleural, intratecal, mediante perfusión a través de un catéter local, o mediante inyección directa en la lesión. Cuando se administran proteínas terapéuticas mediante inyección, la administración será por infusión continua o mediante una o varias inyecciones intravenosas rápidas (bolos).

Otras vías de administración incluyen la oral, la membrana de las mucosas, la pulmonar y la transcutánea. La administración oral es adecuada para las microesferas de poliéster, las microesferas de zeína, las microesferas de proteinoides, las microesferas de policianoacrilato y los sistemas a base de lípidos (véase, por ejemplo, DiBase y Morrel, «Oral Delivery of Microencapsulated Proteins» en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press, 1997)). La facilidad de una administración por vía intranasal se ejemplifica mediante tal modo de administración de insulina (véase , por ejemplo, Hinchcliffe y Ilum., Adv. Drug. Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Se pueden preparar partículas secas o líquidas que comprenden el polipéptido soluble e inhalarlo con la ayuda de dispersantes en polvo seco, generadores en aerosol líquidos, o nebulizadores (por ejemplo, Pettit y Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Este enfoque se ilustra mediante el sistema de tratamiento de la diabetes AERX, que es un inhalador electrónico de mano que administra la insulina atomizada en los pulmones. Los estudios han demostrado que se han administrado proteínas de hasta 48 000 kDa a través de la piel a concentraciones terapéuticas con la ayuda de ultrasonidos de baja frecuencia, lo que ilustra que la administración transcutánea resulta factible (Mitragotri et al., Science 269: 850 (1995)). La administración transdérmica mediante electroporación proporciona otro medio para administrar el polipéptido soluble de la presente invención (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)).

Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido soluble de la presente invención se puede formular según los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante los cuales se combinan las proteínas terapéuticas en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se dice que una composición es un «vehículo farmacéuticamente aceptable» si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de vehículo farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica conocen bien otros vehículos adecuados. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19.ª edición (Mack Publishing Company, 1995).

Para los propósitos de tratamiento, el polipéptido soluble de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administran a un paciente en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una combinación de una molécula terapéutica de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable se dice que se administra en una «cantidad terapéuticamente eficaz» si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Un agente es fisiológicamente significativo si su presencia da lugar a un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor. Por ejemplo, un agente utilizado para tratar la inflamación es fisiológicamente significativo si su presencia alivia la respuesta inflamatoria.

Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido soluble de la presente invención se puede proporcionar en forma líquida, en un aerosol, o en forma sólida. Las formas líquidas se ilustran mediante soluciones inyectables y suspensiones orales. Las formas sólidas ejemplares incluyen cápsulas, comprimidos y formas de liberación controlada. La última forma se ilustra mediante bombas miniosmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10:239 (1997); Ranade, «Implants in Drug Delivery», en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press, 1995); Bremer et al., «Protein Delivery with infusion pumps», en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press, 1997); Yewey et al., «Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant» en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press, 1997)).

Los liposomas proporcionan un medio para administrar polipéptidos terapéuticos a un paciente por vía intravenosa, intraperitoneal, intradural, intramuscular, subcutánea o administración oral, inhalación o intranasal. Los liposomas son vesículas microscópicas que consisten en una o más bicapas lipídicas que rodean compartimentos acuosos (véase en general, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46; 618 (1993) y Ranade, «Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers» en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press, 1995)). Los liposomas tienen una composición similar a la de las membranas celulares y, como resultado, los liposomas se pueden administrar de modo seguro y son biodegradables. Según el método de preparación, los liposomas pueden ser unilaminares o multilaminares, y los liposomas pueden variar de tamaño con diámetros que oscilan de 0,02 µm a más de 10 µm. Se pueden encapsular una serie de agentes en los liposomas: la partición de agentes hidrófobos en las bicapas y la partición de agentes hidrófilos dentro del(de los) espacio(s) acuoso(s) del interior (véase por ejemplo, Machy et al., Liposomes in Cell Biology And Pharmacology (John Libbey, 1987) y Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)). Además, es posible controlar la disponibilidad terapéutica del agente encapsulado variando el tamaño de los liposomas, el número de bicapas, la composición lipídica, así como la carga y las características de la superficie de los liposomas.

Los liposomas se pueden adsorber a casi cualquier tipo de célula y, luego, liberar lentamente el agente encapsulado. Alternativamente, un liposoma absorbido puede ser tomado por endocitosis por células fagocíticas. La endocitosis va seguida de la degradación intralisosómica de los lípidos liposómicos y la liberación de los agentes encapsulados (Scherphof et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 446: 368 (1985)). Después de la administración intravenosa, las células del sistema reticuloendotelial toman típicamente los liposomas pequeños (0,1 a 1,0 µm), ubicados principalmente en el hígado y el bazo, mientras que los liposomas de más de 3,0 µm se depositan en los pulmones. Esta captación preferencial de los liposomas más pequeños por las células del sistema reticuloendotelial se ha utilizado para administrar agentes quimioterápicos a los macrófagos y a los tumores del hígado.

El sistema reticuloendotelial se puede soslayar mediante varios métodos, que incluyen la saturación con dosis grandes de partículas liposómicas o mediante la inactivación selectiva de macrófagos mediante medios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta. 802: 428 (1984)). Además, se ha demostrado que la incorporación de fosfolípidos derivados de glucolípidos y de polietilenglicol en las membranas liposómicas da lugar a una reducción significativa de la captación por el sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta. 1068: 133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta. 1150: 9 (1993)).

También se pueden preparar liposomas que se dirijan a células u órganos determinados variando la composición fosfolipídica o introduciendo receptores o ligandos en los liposomas. Por ejemplo, se han utilizado liposomas, preparados con un contenido elevado de un tensioactivo no iónico, para que se dirijan selectivamente al hígado (Hayakawa et al., patente japonesa 04-244 018; Kato et al., Biol. Pharm. Bull.

16: 960 (1993)). Estas formulaciones se prepararon mezclando fosfatidilcolina de soja,

�-tocoferol y aceite de ricino hidrogenado etoxilado (HCO-60) en metanol, concentrando la mezcla al vacío y, luego, reconstituyendo la mezcla con agua.

También se ha demostrado que una formulación liposómica de dipalmitoilosfatidilcolina (DPPC) con una mezcla de esterilglucósido (SG) derivado de soja y colesterol (Ch) se dirige selectivamente al hígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 881 (1997)).

Alternativamente, se pueden unir varios ligandos selectivos a la superficie del liposoma, tal como anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, glúcidos, vitaminas y proteínas de transporte. Por ejemplo, se pueden modificar los liposomas con derivados galactosillipídicos de tipo ramificado para que se unan selectivamente a los receptores de la asialoglucoproteínas (galactosa), que se expresan exclusivamente sobre la superficie de los hepatocitos (Kato y Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 14: 287 (1997). De igual forma, Wu et al., Hepatology 27: 772 (1998), han demostrado que marcar los liposomas con asialofetuina conduce a un acortamiento de la semivida de los liposomas en el plasma y a una enorme mejora de la captación del liposoma marcado con asialofetuina por los hepatocitos. Por otra parte, la acumulación hepática de los liposomas que comprenden derivados galactosillipídicos de tipo ramificado se puede inhibir mediante la preinyección de asialofetuina (Murahashi et al., Biol. Pharm. Bull. 20: 259 (1997)). Los liposomas poliaconitilados con seroalbúmina humana proporcionan otro método para dirigir los liposomas a las células hepáticas (Kamps et al., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU., 94: 11681 (1997)). Además, Geho et al., patente de los EE.UU. n.º 4 603 044 describen un sistema de administración de vesículas liposómicas dirigidas a los hepatocitos que tiene especificidad por los receptores hepatobiliares asociados con las células metabólicas especializadas del hígado.

En un enfoque más general del envío selectivo sobre los tejidos, las células destinatarias se marcan previamente con anticuerpos biotinilados específicos contra un ligando expresado por la célula destinataria (Harasym et al., Adv. Drug. Deliv. Rev.

32: 99 (1998)). Después de eliminar del plasma los anticuerpos libres, se administran liposomas conjugados con estreptavidina. En otro método, los anticuerpos de reconocimiento selectivo están unidos directamente a los liposomas (Harasym et al., Adv. Drug. Deliv. Rev. 32: 99 (1998)).

Los polipéptidos y los anticuerpos se pueden encapsular dentro de liposomas mediante técnicas estándares de microencapsulación de proteínas (véase por ejemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson et al., Cancer Res.

50: 1853 (1990), y Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving et al., «Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies» en Liposome Technology, 2.ª edición, vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press, 1993), Wassef et al., Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)). Tal y como se observó anteriormente, los liposomas terapéuticamente útiles pueden contener numerosos componentes. Por ejemplo, los liposomas pueden comprender derivados lipídicos del polietilenglicol (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta. 1150:9 (1993)).

Se han diseñado microesferas de polímeros degradables diseñados para mantener una concentración sistémica elevada de las proteínas terapéuticas. Se preparan microesferas de polímeros degradables tal como poli(lactido-co-glucólido) (PLG), polianhídridos, poli(orto-ésteres), polímeros de acetato de etilivinilo no biodegradables, en las que las proteínas quedan atrapadas en el polímero (Gombotz y Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, «Role of Polymers in Drug Delivery» en Drug Delivery Systems, Ranade y Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press, 1995); Roskos y Maskiewicz, «Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery» en Protein Delivery: Physical Systems, Sanders y Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press, 1997); Bartus et al., Science, 281: 1161 (1998); Putney y Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). Las nanoesferas recubiertas de polietilenglicol (PEG) también pueden proporcionar vehículos para la administración intravenosa de proteínas terapéuticas (véase por ejemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol.,10: 167 (1997)).

Los expertos en la técnica pueden formular otras formas farmacéuticas, como se muestra, por ejemplo, en Ansel y Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5.ª edición (Lea y Febiger, 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19.ª edición (Mack Publishing Company 1995) y en Ranade y Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press, 1996).

A modo de ilustración, las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar como un kit que comprende un contenedor que comprende el polipéptido soluble de la presente invención. Se puede proporcionar el polipéptido terapéutico en forma de una solución inyectable para una o varias dosis, o como un polvo estéril que se reconstituirá antes de la inyección. Alternativamente, tal kit puede incluir un dispersante de polvo seco, un generador de aerosol líquido, o un nebulizador, para la administración de un polipéptido terapéutico. Tal kit puede comprender adicionalmente información escrita sobre las indicaciones y usos de la composición farmacéutica. Además, tal información puede incluir una declaración de que la composición está contraindicada en los pacientes con hipersensibilidad conocida al IL-17RC o al IL17RA.

La presente invención contempla composiciones del polipéptido soluble de la presente invención, y métodos y usos terapéuticos que comprenden el mismo polipéptido descrito en la presente memoria. Tales composiciones pueden además comprender un vehículo. El vehículo puede ser un vehículo orgánico o inorgánico convencional. Ejemplos de vehículos incluyen agua, solución salina, alcohol,

propilenglicol, macrogol, aceite de sésamo, aceite de almidón y similares.

K) Producción de ratones transgénicos

Se pueden fabricar ratones transgénicos para sobreexpresar el gen de IL-17F, IL-17A, IL-17RA o IL-17RC en todos los tejidos o bajo el control de un elemento regulador específico o preferente de tejido. Estos sobreproductores se pueden utilizar para caracterizar el fenotipo que se obtiene por la sobreexpresión, y los animales transgénicos pueden servir como modelos de la enfermedad humana ocasionada por un exceso de IL-17F, IL-17A, IL-17RA o IL-17RC. Los ratones transgénicos que sobreexpresan cualquiera de ellas también proporcionan modelos de biorreactores para la producción del IL-17RA o del IL-17RC, como cualquiera de los polipéptidos solubles de la presente invención en la leche o en la sangre de animales más grandes. Los métodos para producir ratones transgénicos son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Jacob, «Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice» en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd, 1994), Monastersky y Robl (eds.), Strategies in Transgenic Animal Science (ASM Press, 1995) y Abbud y Nilson, «Recombinant Protein Expression in Transgenic Mice» en Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression, Fernandez y Hoeffler (eds.), páginas 367-397 (Academic Press, Inc, 1999)).

Por ejemplo, un método para producir un ratón transgénico que expresa un gen del IL-17RC se puede comenzar con varones fértiles adultos (sementales) (B6C3fl, 2 a 8 meses de edad (Taconic Farms, Germantown, NY)), varones vasectomizados (improductivos) (B6D2fl, 2 a 8 meses, (Taconic Farms)), hembras fértiles prepúberes (donantes) (B6C3fl, 4 a 5 semanas, (Taconic Farms)) y hembras fértiles adultas (receptoras) (B6D2fl, 2 a 4 meses (Taconic Farms)). Los donantes se aclimatan durante una semana y, luego, se les inyecta aproximadamente 8 UI/ratón de gonadotropina de suero de yegua preñada (Sigma Chemical Company; St. Louis, MO), por vía i.p., y 46 a 47 horas después, 8 UI/ratón de la coriogonadotropina humana (hCG (Sigma)) por vía i.p. para inducir la superovulación. Los donantes se aparean con sementales después de las inyecciones con hormonas. Por lo general, la ovulación se produce a las 13 horas de la inyección de la hCG. Se confirma la cópula mediante la presencia de un tapón vaginal la mañana después del apareamiento.

Los óvulos fertilizados se recogen con un endoscopio quirúrgico. Se recogen los oviductos y se dejan los óvulos en superficies para análisis de orina que contienen hialuronidasa (Sigma). Se lavan los óvulos una vez en hialuronidasa y dos veces en medio W640 de Whitten (descrito, por ejemplo, en Menino y O'Claray, Biol. Reprod.

77: 159 (1986), y Dienhart y Downs, Zygote 4: 29 (1996)) que se ha incubado con CO2 al 5%, O2 al 5% y N2 al 90% a 37ºC. A continuación se almacenan los óvulos en un incubador con CO2 al 5% a 37ºC hasta la microinyección.

Se linealizan de 10 a 20 µg de ADN plasmídico que contiene una secuencia que codifica el IL-17RC, se purifica en gel y se resuspende en Tris-HCl a 10 mM (pH 7,4), EDTA a 0,25 mM (pH 8,0), a una concentración final de 5 a 10 ng/µl para la microinyección. Por ejemplo, las secuencias que codifican el IL-17RC pueden codificar un polipéptido que comprende los restos aminoacídicos 21 a 452 de la SEQ ID n.º 2.

El ADN plasmídico se microinyecta en los huevos recolectados contenidos en una gota de medio W640 recubierto por aceite mineral caliente equilibrado con CO2. Se extrae el ADN en una aguja hipodérmica (se saca de un capilar de vidrio de borosilicato con un diámetro interno de 0,75 mm y un diámetro externo de 1 mm) y se inyecta en óvulos distintos. Se penetra en cada óvulo con la aguja hipodérmica hasta uno o ambos los pronúcleos haploides.

Se inyectan picolitros de ADN en los pronúcleos y se retira la aguja hipodérmica sin entrar en contacto con los nucléolos. Se repite el procedimiento hasta que se han inyectado todos los óvulos. Los óvulos microinyectados satisfactoriamente se transfieren a una placa de cultivo de tejidos de órganos con un medio W640 pregasificado para almacenarlos durante una noche en un incubador a 37ºC con CO2 al 5%.

Al día siguiente, se transfieren los embriones de dos células a receptoras seudoembarazadas. Se identifican las receptoras por la presencia de tapones de copulación, después del apareamiento con varones vasectomizados (improductivos). Se anestesian las receptoras, se les afeita el lado izquierdo dorsal y se transfieren a un microscopio quirúrgico. Se realiza una pequeña incisión en la piel y a través de la pared muscular en medio de la zona abdominal delimitada por la parrilla costal, el lomo y la pata trasera, a medio camino entre la rodilla y el bazo. Los órganos reproductores se colocan sobre un pequeño paño quirúrgico. La almohadilla de grasa se expande sobre el paño quirúrgico y se colocan unas pequeñas pinzas para vasos (Roboz, Rockville, MD) a la almohadilla de grasa y la parte izquierda que cuelga sobre la espalda del ratón, lo que impide que los órganos se vuelvan a meter en el cuerpo.

Con una pipeta de transferencia delgada que contiene aceite mineral seguido de una alternancia de W640 y burbujas de aire, se transfieren en la receptora de 12 a 17 embriones sanos bicelulares de la inyección del día anterior. Se localiza la ampolla hinchada y, sosteniendo el oviducto entre la ampolla y la bolsa, se hace una mella en el oviducto con una aguja de 28 gauges cerca de la bolsa, asegurándose de no romper la ampolla ni la bolsa.

Se transfiere la pipeta a la mella del oviducto, y se introducen los embriones, dejando que la primera burbuja de aire salga de la pipeta. Se empuja suavemente la almohadilla de grasa en el peritoneo, y se deja que los órganos reproductores se deslicen por sí solos al interior. Se cierra la pared del peritoneo con una sutura y se cierra la piel con una grapa de cicatrización. Las ratonas se recuperan en una superficie calefactada a 37ºC durante un mínimo de cuatro horas.

Se devuelven las receptoras por parejas a las jaulas, y se deja que siga el embarazo durante 19 a 21 días. Después del parto, se deja un puerperio de 19 a 21 días antes del destete. Se determina el sexo de los animales destetados y se colocan en jaulas separadas según el sexo, y se corta una biopsia de 0,5 cm (utilizada para el genotipado) de la cola con una tijeras limpias.

Se prepara el ADN genómico de los pedacitos de cola utilizando, por ejemplo, un kit DNeasy de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se analiza por PCR con los cebadores diseñados para amplificar un gen del IL-17RC o un gen marcador de selección que se introdujo en el mismo plásmido. Después de confirmar que los animales son transgénicos, se retrocruzan en una estirpe cosanguínea colocando una hembra transgénica con un varón de tipo salvaje, o un varón transgénico con una o dos hembra(s) de tipo salvaje. A medida que las crías nacen y se destetan, se separan por sexos y se les corta la punta de la cola para el genotipado.

Para comprobar la expresión de un transgén en un animal vivo, se realiza una hepatectomía parcial. Se realiza una preparación quirúrgica de la parte superior del abdomen directamente por debajo del apéndice cifoides. Mediante una técnica estéril, se realiza una incisión pequeña de 1,5 a 2 cm por debajo del esternón y se expone el lóbulo lateral izquierdo del hígado. Con una seda 4-0, se realiza una atadura alrededor del lóbulo inferior asegurándolo fuera de la cavidad corporal. Se utiliza una pinza atraumática para sostener el nudo mientras que se coloca una segunda atadura de Dexon absorbible (American Cyanamid; Wayne, NJ) cerca del primer lazo. Se realiza un corte distal desde la atadura de Dexon y se colocan unos 100 mg del tejido de hígado extirpado en una placa Petri estéril. El trozo de hígado extirpado se transfiere a un tubo de polipropileno de 14 ml de fondo redondeado, se congela de golpe en nitrógeno líquido y despés se almacena en hielo seco. El sitio quirúrgico se cierra con sutura y grapas de cicatrización, y la jaula del animal se coloca sobre una almohadilla calefactora a 37ºC durante 24 horas tras la operación. Se inspecciona el animal diariamente tras la operación y se eliminan las grapas de cicatrización 7 a 10 días después de la intervención quirúrgica. Se evalúa el nivel de expresión del ARNm del IL-17RC en cada ratón transgénico mediante un ensayo de hibridación de ARN en solución o mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

Además de producir ratones transgénicos que sobreexpresan IL-17F, IL-17A, IL-17RA o IL-17RC, es útil fabricar ratones transgénicos con una expresión anormalmente baja de alguno estos genes o que no lo expresen. Tales ratones transgénicos proporcionan modelos útiles para enfermedades asociadas con una ausencia de IL-17F, IL-17A, IL-17RA o IL-17RC. Tal y como se explicó anteriormente, la expresión del gen del IL-17RC se puede inhibir con genes antisentido, genes de ribozimas o genes de secuencia de guía externa. Por ejemplo, para producir ratones transgénicos que subexpresan el gen del IL-17RC, tales secuencias inhibidoras se dirigen selectivamente al ARNm del IL-17RC. Los métodos para producir ratones transgénicos que tienen una expresión anormalmente baja de un gen determinado son conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Wu et al, «Gene Underexpression in Cultured Cells and Animals by Antisense DNA and RNA Strategies», in Methods in Gene Biotechnology, páginas 205-224 (CRC Press, 1997)).

Un método alternativo para producir ratones transgénicos que tienen poca o ninguna expresión del gen del IL-17RC es generar ratones que tengan al menos un alelo normal del IL-17RC reemplazado por un gen del IL-17RC no funcional. Un método para diseñar un gen del IL-17RC no funcional es insertar otro gen, tal como un gen marcador de selección, dentro de una molécula de ácido nucleico que codifica el IL-17RC. Los métodos estándares para producir los llamados «ratones con desactivación génica» son conocidos por los expertos en la técnica (véase por ejemplo, Jacob, «Expression and Knockout of Interferons in Transgenic Mice» en Overexpression and Knockout of Cytokines in Transgenic Mice, Jacob (ed.), páginas 111-124 (Academic Press, Ltd, 1994) y Wu et al., «New Strategies for Gene Knockout» en Methods in Gene Biotechnology, páginas 339-365 (CRC Press, 1997)).

La invención se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos no limitativos siguientes.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión del gen del IL-17RC

Se realizaron análisis por transferencia Northern utilizando membranas con varios tejidos humanos (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Se generaron dos sondas a partir de productos de PCR purificados en gel. Se realizó la primera sonda

se marcó radioactivamente con el kit de marcación Multiprime de Amersham (Arlington Heights, IL) según el protocolo del fabricante. Se purificó la sonda mediante una columna con empuje NucTrap (Stratagene, La Jolla, CA). Se utilizó la solución ExpressHyb (Clontech) para las soluciones de prehibridación e hibridación para los análisis de transferencia Northern. La hibridación tuvo lugar durante una noche a 65ºC. Después de la hibridación, se lavaron las transferencias durante 30 minutos cada vez en soluciones que contenían SDS al 0,1% y SSC como sigue: dos veces en SSC a 2X a temperatura ambiente, tres veces en SSC a 0,1X a 50ºC, una vez en SSC a 0,1X a 55ºC, y una vez en SSC a 0,1X a 65ºC. Los resultados demostraron que el gen del IL17RC se expresa mucho en los tejidos de la glándula tiroidea, de la glándula suprarrenal, de la próstata y del hígado, y que se expresa mucho menos en tejidos del corazón, del intestino delgado, del estómago y de la tráquea. Por el contrario, hay poca o ninguna expresión en el cerebro, la placenta, los pulmones, el músculo esquelético, los riñones, el páncreas, el bazo, el timo, los testículos, los ovarios, el colon, los leucocitos de la sangre periférica, la médula espinal, los ganglios linfáticos y la médula ósea.

EJEMPLO 2 Distribución del ARNm en paneles de estirpes celulares mediante PCR

Se purificó el ARN total de estirpes celulares en reposo y estimuladas cultivadas en el laboratorio y se purificó con un kit RNeasy de Qiagen (Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, o un protocolo de purificación con fenol ácido (Chomczynski y Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: 156-9, 1987). La calidad del ARN se evaluó migrando una alícuota en un Bioanalizador de Agilent. Si el ARN estaba significativamente degradado, no se utilizó para la creación posterior de la primera hebra del ADNc. La presencia de ADN genómico contaminante se evaluó mediante un ensayo por PCR en una alícuota del ARN con los cebadores zc41011

; SEQ ID n.º 32) y zc41012

; SEQ ID n.º33), que amplifican un sitio único del ADN genómico intergénico. Las condiciones de la PCR para el ensayo de ADN genómico contaminante fueron las siguientes: 2,5 µl de tampón 10 X y 0,5 µl de una mezcla de ADNc polimerasa Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl de mezcla de dNTP a 2,5 mM (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 µl de Rediload 10X (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 0,5 µl de zc41011 y zc41012 a 20 µM, en un volumen final de 25 µl. Los parámetros de ciclación fueron 20 s a 94ºC, 40 ciclos de 20 s a 94ºC, 60ºC durante 1 min y 20 s, y un ciclo a 72ºC de 7 min. De cada reacción, 10 µl se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se examinaron los geles en busca de la presencia de un producto de PCR a partir de ADN genómico contaminante. Si se observara ADN genómico contaminante, el ARN total se digeriría con ADNasa utilizando reactivos sin ADN (Ambion, Inc., Austin, TX) según las instrucciones del fabricante, y luego se volverían a analizar tal y como se describió anteriormente. Sólo los ARN que parecían no contener ADN genómico contaminante se utilizaron para la creación posterior de la primera hebra de ADNc.

imagen1

imagen2

20 µg de ARN total de 82 estirpes celulares humanas se llevaron a 98 µl con H2O, luego se dividieron en dos alícuotas de 49 µl, conteniendo cada una 10 µg de ARN total, y se colocaron en dos placas de PCR de 96 pocillos. A cada alícuota se le añadieron reactivos para la síntesis de la primera hebra del ADNc (Invitrogen First Strand cDNA Synthesis System, Carlsbad, CA): 20 µl de MgCl2 25 mM, 10 µl de tampón RT 10X , 10 µl de DTT a 0,1 M, 2 µl de oligo-dT, 2 µl de RNAseOut. A continuación, a una alícuota de cada estirpe celular se le añadieron 2 µl de transcriptasa inversa Superscript II, y a la alícuota de la estirpe celular correspondiente, se le añadieron 2 µl de H2O para fabricar un control negativo de ausencia de la transcriptasa inversa. Se incubaron todas las muestras del siguiente modo: 25ºC 10 min, 42ºC 50 min, 70ºC 15 min. Se distribuyeron las muestras en placas de pocillos profundos y se diluyeron a 1,7 ml con H2O. Se utilizó un robot Multipette (Saigan) para distribuir alícuotas de 16,5 µl en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos varias veces, lo que genera numerosos paneles de PCR de un uso de las estirpes celulares, que luego se sellaron y se guardaron a –20ºC. Cada pocillo en estos paneles representa la primera hebra del ADNc a partir de aproximadamente 100 ng de ARN total. Las 82 estirpes celulares se distribuyeron por los dos paneles, matriz n.º 118A y n.º 118B. Se evaluó la calidad de la primera hebra del ADNc en los paneles mediante un ensayo de PCR multiplex en un conjunto de paneles que utilizan cebadores para los genes de abundancia moderada que se expresan ampliamente CLTC (clatrina) y TFRC (receptor C de la transferrina). Se mezclaron 0,5 µl de cada uno de los cebadores para la clatrina zc42901

imagen3

imagen4

; SEQ ID n.º 37) con 2,5 µl de tampón 10X y 0,5 µl de la mezcla de ADNc polimerasa Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl de la mezcla de dNTP a 2,5 mM (Applied Biosystems, Foster City, CA), 2,5 µl de Rediload 10X (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se añadieron a cada pocillo de un panel de matriz n.º 118A y de matriz n.º 118B. Los parámetros de ciclación fueron los siguientes: 20 s a 94ºC, 35 ciclos de 20 s a 94ºC, 80 s a 67ºC, y un ciclo a 72ºC de 7 min. De cada reacción, 10 µl se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se puntuaron los geles por la presencia de un producto de PCR considerable para cada gen específico de los pocillos +RT para cada estirpe celular.

La expresión del ARNm en los paneles de la primera hebra del ADNc humano para el IL-17RC se analizó por PCR con el oligonucleótido sentido ZC42756 ; SEQ ID n.º 38) y el oligonucleótido antisentido ZC42757

SEQ ID n.º 39) con estas condiciones de PCR por muestra: 2,5 µl de tampón 10X y 0,5 µl de la mezcla de ADNc polimerasa Advantage 2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), 2 µl de la mezcla de dNTP a 2,5 mM (Applied Biosystems), 2,5 µl de Rediload 10X (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 0,5 µl de cada cebador sentido y antisentido a 20 µM. Las condiciones de ciclación fueron 2 min a 94ºC, 35 ciclos de 1 min a 94ºC, 30 s a 66ºC, 1,5 min a 72ºC, y un ciclo a 72ºC de 7 min. De cada reacción, 10 µl se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se puntuaron los geles por la expresión positiva o negativa del IL-17RC.

El ARNm del IL-17RC se expresó ampliamente en muchas estirpes celulares que representan un espectro amplio de tipos de tejidos y células. En concreto, el IL17RC se expresa repetiblemente en estirpes celulares de sangre periférica que no son linfocitos T, incluidos los monocitos, los linfocitos B y células de la estirpe mieloide. También, el ARNm del IL-17RC se expresa fiablemente en las estirpes celulares derivadas de la piel. Otras estirpes celulares que expresan el IL-17RC son las 5 estirpes celulares de intestino grueso que estaban presentes en la matriz.

EJEMPLO 3 Distribución del ARNm en los paneles de estirpes celulares de ratón mediante RT-PCR

Se purificó el ARN total a partir de 60 estirpes celulares en reposo y estimuladas cultivadas en el laboratorio y se purificó con un kit RNeasy de Qiagen (Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante, un protocolo de purificación con fenol ácido (Chomczynski y Sacchi, Analytical Biochemistry, 162: 156-9, 1987) o un protocolo con el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA).

imagen5

Se distribuyeron 5 µg de ARN total de cada estirpe celular en una placa de 96 pocillos profundos, se añadieron 125 µl de NaOAc 3M y 100 µl de Pellet Paint (Novagen, Madison, WI) a cada pocillo, y a continuación se ajustó el volumen final a 1,25 ml con H2O. Se utilizó un robot Multipette (Saigan) para distribuir alícuotas de 25 µl de la mezcla de ARN seguidos de 75 µl de EtOH en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos varias veces, lo que genera numerosos paneles de RT-PCR de un uso de las estirpes celulares que, luego, se sellaron y se guardaron a –20ºC. Se realizó la detección por RT-PCR centrifugando primero un panel en una centrifugadora para 96 pocillos de Qiagen (Valencia, CA) durante 10 min a 6000 rpm. Se retiró el sobrenadante invirtiendo la placa sobre papel absorbente. Se lavaron los sedimentos de ARN con 100 µl de EtOH al 70%, seguido por una centrifugación de 5 min a 6000 rpm. Se retiró el sobrenadante de nuevo y se dejaron secar las placas al aire hasta que se evaporó el EtOH que quedaba. Se resuspendieron los sedimentos de ARN en 15 µl de H2O.

Se analizó la expresión del ARNm del IL-17RC en los paneles de ARN de las estirpes celulares de ratón mediante RT-PCR con los cebadores zc38910 ( imagen6 ; SEQ ID n.º 40) y zc38679 ( imagen6 ; SEQ ID n.º 41) en las siguientes condiciones de RT-PCR por muestra: Superscript One-Step PCR con el kit Platinum Taq, Invitrogen, Carlsbad, CA. Las condiciones de ciclación fueron: 1 ciclo a 48ºC durante 30 min, 94ºC durante 2 min, seguidos de 35 ciclos de 94ºC durante 15 s, 55ºC durante 30 s, 72ºC durante 1,5 min, seguido de 1 ciclo a 72ºC durante 7 min. De cada reacción, 10 µl se sometieron a electroforesis en gel de agarosa y se puntuaron los geles para la expresión positiva o negativa del IL17RC.

El ARNm del IL-17RC murino se expresa en varias estirpes celulares de ratón, especialmente en las estirpes celulares derivadas de médula ósea, que incluyen estirpes celulares de osteoblastos, adipocitos y preadipocitos. También, el ARNm del IL-17RC de ratón está representado en varias muestras del sistema endocrino, tal como las estirpes celulares del estroma del páncreas, estirpes celulares de los islotes del páncreas, y estirpes celulares de hipotálamo, glándulas salivales y testículo.

EJEMPLO 4 Replegamiento y purificación de la pIL-17F producida en E. coli

A) Aislamiento de los cuerpos de inclusión y extracción de la pIL-17F

Después de inducir la expresión de las proteínas en un cultivo bien en fermentador por lotes o bien en matraces con agitación, se centrifuga el caldo de E.

coli en botellas de 1 litro a 3000 rpm en un rotor flotante de Sorvall. El lavado de la pasta celular para retirar cualquier contaminante del caldo se realiza con Tris a 50 mM, pH 8,0 que contiene NaCl a 200 mM y EDTA a 5 mM hasta que el sobrenadante esté transparente.

A continuación se suspenden los sedimentos celulares en tampón de lisis enfriado en hielo (Tris a 50 mM, pH 8,0; EDTA a 5 mM; NaCl a 200 mM; sacarosa al 10% (p/v); DTT a 5 mM; benzamidina a 5 mM) a una densidad óptica a 600 nm de 10

20. Despues, esta suspensión se somete a 3 pases a 8500-9000 psi en un homogeneizador APV 2000 de laboratorio enfriado para producir un lisado de células rotas. Se recupera la fracción insoluble (cuerpos de inclusión) mediante centrifugación del lisado celular a 20 000 X G durante 1 hora a 4ºC.

El sedimento de cuerpos de inclusión que resultante de una centrifugación a 20 000 X G se pesa y, a continuación, se vuelve a suspender en 10 ml de tampón de lavado (Tris a 50 mM, pH 8, que contiene NaCl a 200 mM, EDTA a 5 mM, DTT a 5 mM y benzamidina a 5 mM) por gramo de cuerpos de inclusión. Se consigue la dispersión completa al homogeneizarla mediante un generador con rotor y estator de OMNI International. Se centrifuga esta suspensión a 20 000 X G durante 30 minutos a 4ºC. Se repite el ciclo de lavado 3-5 veces hasta que el sobrenadante esté transparente.

El sedimento de lavado final se solubiliza en hidrocloruro de guanidina a 7 M en tampón de Tris a 40 mM con un pH 8 que contiene sulfito de sodio a 0,1 M y tetrationato de sodio a 0,02 M. Se deja que continúe la extracción y la sulfitólisis con una agitación suave a 4ºC durante una noche. La disolución coloreada de rosa resultante se centrifuga a 35 000 X g durante 1 hora a 4ºC y el sobrenadante límpido, que contiene la pIL-17F soluble, se pasa por un filtro de 0,45 µm.

B) Procedimiento de replegamiento de la pIL-17F

La pIL-17F sulfitolisada solubilizada se repliega mediante una dilución por goteo en un tampón de replegamiento enfriado en hielo que contiene MES a 55 mM, NaCl a 10,56 mM, KCl a 0,44 mM, PEG al 0,055% (3400 K), EDTA a 1,1 mM, glicerol al 20%, hidrocloruro de guanidina a 0,5 M, arginina a 0,75 M y la pareja redox de glutatión a una proporción 1:1 (GSH 1 mM:GSSG 1 mM). El pH del tampón de replegamiento se ajusta a 6,5 con HCl y se añade la pIL-17F a una concentración final de 100 µg/ml. Una vez diluida, se deja agitar la mezcla lentamente en la cámara fría durante 72 horas.

C) Recuperación y purificación del producto La pIL-17F replegada se concentra a 10X frente a una membrana con un límite de 10 kDa en un sistema de filtración de flujo tangencial a escala de laboratorio. A

continuación se filtra utilizando una membrana de 0,45 µm y se ajusta el pH a 5,1 con la adición de ácido acético. Se captura el material con el pH ajustado mediante cromatografía de intercambio de cationes en una columna de flujo rápido SP de Pharmacia equilibrada en tampón de acetato a 50 mM, pH 5,1. Se carga la pIL-17F en línea a una proporción 1:5 con tampón de equilibrio a una velocidad de flujo de 190 cm/h. Esta dilución hace disminuir la fuerza iónica que permite una unión eficaz de la diana a la matriz. Después de que la carga de la muestra se haya completado, se lava la columna hasta una absorbencia basal con tampón de equilibrio. Se lava la columna con NaCl a 0,4 M en tampón de acetato a 50 mM a pH 5,1 y luego la proteína unida se eluye con un gradiente de 5 volúmenes de la columna de NaCl desde 0,4 M a 1,5 M en tampón de acetato a 50 mM a pH 5,1. La proteína se eluye en NaCl a aproximadamente 1 M y es dimérica a aproximadamente el 85% mediante análisis de SDS-PAGE de las fracciones eluidas. Las fracciones que contienen la pIL-17F se agrupan y se concentran contra una membrana de ultrafiltración con un punto de corte a 10 kDa mediante una celda de agitación de Amicon para preparar la purificación y el intercambio de tampón finales mediante cromatografía de exclusión por tamaños.

D) Intercambio del tampón por exclusión de tamaños y formulación

Se inyecta el conjunto de cationes concentrado (a un volumen del 3% al 4% del volumen de la columna) a una velocidad de flujo de 30 cm/h en una columna de exclusión por tamaños Superdex 75 de Pharmacia equilibrada en tampón de fosfato de sodio a 50 mM que contiene NaCl a 109 mM, pH 7,2. El pico de elución simétrico que contiene el producto se diluye a una concentración de 1 mg/ml en un tampón de fosfato de sodio a 50 mM que contiene NaCl a 109 mM, pH 7,2. Finalmente, la pIL-17F se pasa por un filtro de 0,2 µm estéril, se distribuye en alícuotas y se almacena a – 80ºC. El rendimiento final del procedimiento es del 20%.

EJEMPLO 5 Construcción para la expresión del IL-17RC soluble de mamífero

Se fabrica una construcción para expresión que contiene el IL-17RC humano [L21-K451]-mFc1 (Fc de ratón BALB/C µ2a) por PCR solapante y recombinación homóloga mediante un fragmento de ADN (SEQ ID n.º 42) que codifica un polipéptido IL-17RC (SEQ ID n.º 43), un fragmento de ADN que codifica mFc1 (SEQ ID n.º 44) y el vector de expresión pZMP20. Se generan los fragmentos mediante amplificación por PCR.

El fragmento de PCR que codifica el IL-17RC [L21-K451] contiene un solapamiento en 5' con la secuencia del vector pZMP20 en la región codificante de la secuencia líder optimizada de secreción del pre-pro-activador del plasminógeno de

tejidos, el dominio extracelular del IL-17RC que codifica el [L-21-K451], y un solapamiento en 3' con la región codificante de mFc1. La reacción de amplificación por

PCR

utiliza el oligonucleótido en 5'

[

;

SEQ ID n.º 46], el oligonucleótido en 3'

[ ; SEQ ID n.º 47] y un clon de ADN generado previamente del IL-17RC como molde.

El fragmento de PCR que codifica el mFc1 contiene un solapamiento en 5' con la secuencia del IL-17RC, la región codificante de mFc1 y un solapamiento en 3' con el vector pZMP20 en la región del sitio interno de entrada del ribosoma del poliovirus. La reacción de amplificación por PCR utiliza el oligonucleótido en 5'

imagen7

; SEQ ID n.º 48], el oligonucleótido en 3'

SEQ ID n.º 49] y el clon del ADN generado previamente de mFc1 como molde.

Las condiciones de la reacción de amplificación por PCR son las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos; 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, seguido de 55ºC durante 2 minutos, seguido de 72ºC durante 3 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. Las mezclas de reacción de PCR se migran en un gel de agarosa al 1% y los fragmentos de ADN que corresponden a los tamaños esperados se extraen del gel utilizando un kit de extracción en gel QIAquick™ (Qiagen, n.º de catálogo 28704).

Los dos fragmentos de PCR se unen mediante PCR de solapamiento. Aproximadamente 1 µl de cada uno de los dos fragmentos extraídos del gel se combinan en una reacción de amplificación por PCR con el oligonucleótido en 5' [

imagen6

imagen6 ; SEQ ID n.º 46] y el oligonucleótido en 3' [imagen6 ; SEQ ID n.º 49]. Las condiciones de PCR utilizadas son las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos; 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, seguido de 55ºC durante 2 minutos, seguidos de 72ºC durante 3 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. La mezcla de reacción de la PCR se migra en un gel de agarosa al 1% y el fragmento de ADN que corresponde al tamaño del inserto se extrae del gel mediante un kit de extracción en gel QIAquick™ (Qiagen, n.º de catálogo 28704).

El plásmido pZMP20 es un vector de expresión de mamíferos que contiene un casete de expresión que tiene el promotor MPSV, un sitio BgIII para la linealización antes de la recombinación en la levadura, una secuencia peptídica señal de otPA, un elemento interno de entrada del ribosoma del virus de la poliomielitis, el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo carboxilo del dominio transmembranario; un origen de replicación en E. coli; una unidad de expresión con marcador de selección para mamíferos que comprende un promotor de SV40, potenciador y origen de replicación, un gen de la DHFR y el terminador de SV40; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para la selección y replicación en S. cerevisiae.

imagen8

El plásmido pZMP20 se digiere con BgIII antes de recombinarse en la levadura con el fragmento de PCR IL-17RC[L21-K451]-mFc1 extraído de gel. Se combinan 100 µl de células competentes de levadura (S. cerevisiae) con 10 µl del ADN del inserto de IL-17RC[L21-K451]-mFc1 y 100 ng del vector pZMP20 digerido con BgIII, y se transfiere la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Se da un pulso eléctrico a la mezcla de levadura/ADN utilizando los ajustes de la fuente de alimentación (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0,75 kV (5 kV/cm), �� y 25 µF. Se añaden 600 µl de sorbitol a 1,2 M a la cubeta, y se siembran las levaduras en alícuotas de 100 µl y 300 µl sobre dos placas de URA-D y se incuban a 30ºC. Después de unas 72 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una sola placa se resuspenden en 1 ml de H2O y se centrifugan brevemente para sedimentar las células de levadura. Se resuspende el sedimento de células en 0,5 ml de tampón de lisis (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl a 100 mM, Tris a 10 mM, pH 8,0, EDTA a 1 mM). Los 500 µl de la mezcla de lisis se añaden a un tubo Eppendorf que contiene 250 µl de perlas de vidrio lavadas en ácido y 300 µl de fenol-cloroformo, se aplica agitación vorticial durante 3 minutos y se centrifuga durante 5 minutos en una centrifugadora Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfieren 300 µl de la fase acuosa a un tubo nuevo, y se precipita el ADN con 600 µl de etanol, seguido de centrifugación durante 30 minutos a la velocidad máxima. Se decanta el tubo y se lava el sedimento con 1 ml de etanol al 70%. Se decanta el tubo y el sedimento de ADN se resuspende en 30 µl de Tris a 10 mM, pH 8,0 y EDTA a 1 mM.

Se realiza la transformación de las células hospedadoras de E. coli electrocompetentes (DH12S) utilizando 5 µl de la preparación de ADN de levadura y 50 µl de células de E. coli. Se da un pulso eléctrio a las células a 2,0 kV, 25 µF y 400

�. Después de la electroporación, se añade 1 ml de SOC (Bacto™ Tryptone al 2% [Difco, Detroit, MI], extracto de levadura al 0,5% [Difco], NaCl a 10 mM, KCl a 2,5 mM, MgCl2 a 10 mM, MgSO4 a 10 mM, y glucosa a 20 mM) y a continuación las células se siembran en placas en alícuotas de 50 µl y 200 µl sobre dos placas de LB-AMP (caldo LB [Lennox], agar Bacto™ al 1,8% [Difco], y ampicilina a 100 mg/l).

imagen9

Los insertos de tres clones de ADN para la construcción se someten a análisis de secuencia y se selecciona un clon que contiene la secuencia correcta. Se aísla el ADN plasmídico a gran escala mediante un kit disponible comercialmente (kit MegaPlasmid de QIAGEN, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 6 Construcciones para la expresión del IL-17RC soluble de mamífero que expresan IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS y IL-17RC-CFLAG

Se elabora una construcción de expresión que contiene el IL-17RC humano [L21-K451] con una etiqueta en el extremo carboxilo, bien de Glu-Glu (CEE), bien de seis His (CHIS) o bien FLAG (CFLAG) mediante PCR y recombinación homóloga utilizando un fragmento de ADN que codifica el IL-17RC [L21-K451] (SEQ ID n.º 42) y el vector de expresión pZMP20.

El fragmento de PCR que codifica el IL-17RC-CEE contiene un solapamiento en 5' con la secuencia del vector pZMP20 en la región codificante de la secuencia líder de secreción optimizada del pre-pro activador del plasminógeno de tejido, el dominio extracelular del IL-17RC que codifica el [L21-K451], la secuencia de la etiqueta Glu

; SEQ ID n.º 53) y el solapamiento en 3' con el vector pZMP20 en la región del sitio de entrada interno del ribosoma del virus de la poliomielitis. La reacción de amplificación por PCR utiliza el oligonucleótido en 5'

[

imagen6

; SEQ ID n.º 46], el oligonucleótido en 3'

[

; SEQ ID n.º 50] y un clon de ADN generado previamente del

IL-17RC como molde.

Las condiciones de la reacción de amplificación por PCR es la siguiente: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos; 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, seguido de 55ºC durante 2 minutos, seguidos de 72ºC durante 3 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. La mezcla de reacción de la PCR se migra en gel de agarosa al 1% y el fragmento de ADN que corresponde al tamaño esperado se extrae del gel mediante un kit de extracción en gel QIAquick™ (Qiagen, n.º de catálogo 28704).

Se digiere el plásmido pZMP20 con BgIII antes de la recombinación en la levadura con el fragmento de PCR del IL-17RC-CEE extraído del gel. Se combinan 100 µl de células competentes de levadura (S. cerevisiae) con 10 µl del ADN del inserto del IL-17RC-CEE y 100 ng del vector pZMP20 digerido con BgIII, yse transfiere la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Se da un pulso eléctrico a la mezcla de levadura/ADN utilizando los ajustes de la fuente de alimentación (BioRad Laboratories, Hercules, CA) de 0,75 kV (5 kV/cm), �� y 25 µF. A la cubeta se le añaden 600 µl de sorbitol a 1,2 M y se siembran alícuotas de 100 µl y 300 µl de levadura en dos placas de URA-D, y se incuban a 30ºC. Tras unas 72 h, los transformantes de levadura Ura3+ de una única placa se resuspenden en 1 ml de H2O y se centrifugan brevemente para sedimentar las células de levadura. El sedimento de células se resuspende en 0,5 ml de tampón de lisis (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl a 100 mM, Tris a 10 mM, pH 8,0, y EDTA a 1 mM). Los 500 µl de la mezcla de lisis se añaden a un tubo Eppendorf que contiene 250 µl de perlas de vidrio lavadas con ácido y 300 µl de fenol-cloroformo, se agita vorticialmente durante 3 min y se centrifuga durante 5 min en una centrifugadora Eppendorf a la máxima velocidad. Se transfieren 300 µl de la fase acuosa a un tubo nuevo y se precipita el ADN con 600 µl de etanol y luego se centrifuga durante 30 min a la máxima velocidad. Se decanta el tubo y se lava el sedimento con 1 ml de etanol al 70%. Se decanta el tubo y el sedimento de ADN se resuspende en 30 µl de Tris a 10 mM, pH 8,0, y EDTA a 1 mM.

Se lleva a cabo la transformación de las células hospedadoras de E. coli electrocompetentes (DH12S) con 5 µl de la preparación de ADN de levadura y 50 µl de células de E. coli. Se da un pulso eléctrico a las células a 2,0 kV, 25 µF, y 400 �. Después de la electroporación, se añade 1 ml de SOC (Bacto™ Tryptone al 2% [Difco, Detroit, MI], extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl a 10 mM, KCl a 2,5 mM, MgCl2 a 10 mM, MgSO4 a 10 mM, y glucosa a 20 mM) y a continuación se siembran alícuotas de 50 µl y 200 µl de las células en dos placas de LB AMP (caldo de LB [Lennox], Bacto™ Agar (Difco) al 1,8%, y ampicilina a 100 mg/l).

Los insertos de tres clones de ADN para la construcción se someten a un análisis de secuencia y se selecciona un clon que contiene la secuencia correcta. Se aísla el ADN plasmídico a gran escala mediante un kit disponible comercialmente (kit Mega Plasmid QIAGEN, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

Se utiliza el mismo procedimiento para preparar el IL-17RC con una etiqueta de His en el extremo carboxilo, compuesta de Gly Ser Gly Gly His His His His His His (IL17RC-CHIS; SEQ ID n.º 51) o la etiqueta FLAG en el extremo carboxilo, compuesta de Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (IL-17RC-CFLAG; SEQ ID n.º 52). Para preparar estas construcciones, en vez del oligonucleótido en 3' de la SEQ ID n.º 50, se utiliza el oligonucleótido en 3'

imagen7

imagen10

imagen6 � SEQ ID n.º 54] para generar IL-17RC-CHIS o se utiliza el oligonucleótido

5 EJEMPLO 7 Transfección y expresión de las construcciones de expresión del receptor IL-17RC soluble que expresa la proteína de fusión IL-17RC-mFc1, y las proteínas etiquetadas en el extremo carboxilo IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS e IL-17RCCFLAG

10 Se digieren por separado tres conjuntos de 200 µg de cada una de las construcciones de expresión etiquetadas o de fusión del IL-17RC soluble con 200 unidades de PvuI a 37ºC durante 3 horas, se precipita con isopropanol y se centrifuga en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El sobrenadante se retira por decantación y se lava el sedimento con 1 ml de etanol al 70% y se deja incubar durante 5 minutos a

15 temperatura ambiente. Se centrifuga el tubo en una microcentrífuga durante 10 minutos a 14 000 rpm y el sobrenadante se retira por decantación. A continuación, se resuspende el sedimento en 750 µl de medio de cultivo de tejidos de células CHO en un entorno estéril, se deja incubar a 60ºC durante 30 min y se deja enfriar a temperatura ambiente. Se sedimentan aproximadamente 5 x 106 células CHO en cada

20 uno de los tres tubos y se resuspenden con la solución del medio de ADN. Las mezclas de ADN/células se colocan en una cubeta con una separación de 0,4 cm y se electroporan con los siguientes parámetros; 950 µF, alta capacitancia, a 300 V. A continuación se retira el contenido de las cubetas, se juntan y se diluyen a 25 ml con el medio de cultivo de tejidos de células CHO y se colocan en un matraz de 125 ml con

25 agitación. Se coloca el matraz en un incubador con agitación a 37ºC, CO2 al 6%, en agitación a 120 rpm. Las células CHO se seleccionan por nutrientes y, luego, se amplifican por etapas con metotrexato (MTX) a 200 nM y después MTX a 1 µM. La expresión de las proteínas etiquetadas o de fusión se confirma mediante un análisis de

30 inmunotransferencia y se aumenta la escala el conjunto de células CHO para las recogidas de la purificación de proteínas. EJEMPLO 8 Expresión del IL-17RC soluble

Se construyó un plásmido de expresión que contenía el IL-17RC-Tbx-C(Fc9) 35 (SEQ ID n.º 64) mediante recombinación homóloga utilizando un fragmento de ADN del IL-17RC_Tbx y el vector de expresión pZMP40. Se generó el fragmento mediante amplificación por PCR con los cebadores zc44531 y zc44545.

El fragmento de PCR de IL-17RC_Tbx contiene una región codificante parcial del dominio extracelular del IL-17RC, que se construyó utilizando un clon generado previamente del IL-17RC como molde. El fragmento incluye un solapamiento en 5' con la secuencia del vector pZMP40 en la región codificante de otPA, el segmento del IL17RC (restos aminoacídicos 21 a 451 de la SEQ ID n.º 2), una secuencia conectora, un sitio de escisión de la trombina y un solapamiento en 3' con el vector pZMP40 en la región codificante de Fc9. Las condiciones de PCR utilizadas fueron las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 5 minutos; 35 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, seguido de 55ºC durante 2 minutos, seguidos de 72ºC durante 3 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos.

Se migraron las mezclas de reacción de la PCR en gel de agarosa al 1% y se extrajo del gel una banda que correspondía a los tamaños de los insertos utilizando un kit de extracción en gel QIAquick™ (Qiagen, n.º de catálogo 28704).

El plásmido pZMP40 es un vector de expresión de mamíferos que contiene un casete de expresión que tiene el promotor MPSV, numerosos sitios de restricción para introducir secuencias codificantes, una secuencia señal peptídica de otPA y la secuencia para Fc9; un elemento del sitio de entrada interno del ribosoma (IRES, por su nombre en inglés) del poliovirus, y el dominio extracelular de CD8 truncado en el extremo carboxilo del dominio transmembranario; un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión del marcador de selección de mamíferos que comprende un promotor de SV40, un potenciador y un origen de replicación, un gen de la DHFR y el terminador de SV40; y las secuencias URA3 y CEN-ARS requeridas para seleccionar y replicar en S. cerevisiae. Se construyó a partir de pZMP21 (publicación de patente n.º US 2003/0232414 A1; depositada en la American Type Culture Collection y designado como ATCC n.º PTA-5266).

El plásmido pZMP40 se cortó con BgIII antes de recombinarlo en la levadura con el fragmento de PCR. Se combinaron independientemente 100 µl de células de levadura (S. cerevisiae) competentes con 10 µl del ADN del inserto (SEQ ID n.º 66) y 100 ng del vector pZMP40 cortado, y se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Se dio un pulso eléctrico a la mezcla de levadura/ADN con una fuente de alimentación (BioRad Laboratories, Hercules, CA) ajustada a 0,75 kV (5 kV/cm), �� y 25 µF. Se añadieron 600 µl de sorbitol a 1,2 M a la cubeta, y se sembraron alícuotas de 100 µl y 300 µl de la levadura sobre dos placas de URA-D y se incubaron a 30ºC. Después de unas 72 horas, se resuspendieron los transformantes de levadura Ura+ de una sola placa en 1 ml de H2O y se centrifugaron brevemente para sedimentar las células de levadura. El sedimento de células se resuspendió en 0,5 ml de tampón de lisis (Tritón X-100 al 2%, SDS al 1%, NaCl a 100 mM, Tris a 10 mM, pH 8,0, y EDTA a 1 mM). Los 500 µl de la mezcla de lisis se añadieron a un tubo Eppendorf que contenía 250 µl de perlas de cristal lavadas con ácido y 300 µl de fenolcloroformo, se mezcló por agitación vorticial durante 3 minutos, y se centrifugó durante 5 minutos en una centrifugadora Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfirieron 300 µl de la fase acuosa a un tubo nuevo, y se precipitó el ADN con 600 µl de etanol (EtOH), seguido de centrifugación durante 30 minutos a la velocidad máxima. Se decantó el tubo y se lavó el sedimento con 1 ml de etanol al 70%. Se decantó el tubo y se resuspendió el sedimento de ADN en 30 µl de TE.

Se realizó la transformación de las células hospedadoras electrocompetentes de E. coli (DH12S) utilizando 5 µl de la preparación de ADN de levadura y 50 µl de células. Se dio un pulso eléctrico a las células a 2,0 kV, 25 µF y 400 �. Después de la electroporación, se añadió 1 ml de SOC (Bacto™ Tryptone al 2% [Difco, Detroit, MI], extracto de levadura al 0,5% [Difco], NaCl a 10 mM, KCl a 2,5 mM, MgCl2 a 10 mM, MgSO4 a 10 mM, y glucosa a 20 mM) y después se sembraron las células en alícuotas de 50 µl y 200 µl en dos placas de LB AMP (caldo de LB [Lennox], Bacto™ Agar [Difco] al 1,8%, ampicilina a 100 mg/l).

Los insertos de tres clones para la construcción se sometieron a análisis de secuencia y se seleccionó un clon de cada construcción que contenía la secuencia correcta. Se aisló el ADN plasmídico a gran escala utilizando un kit disponible comercialmente (QIAGEN Mega Plasmid, Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante.

A continuación se digirieron tres conjuntos de 200 µg de la construcción IL17RC[L21-K451]_Tbx_C(Fc9) con 200 unidades de PvuI a 37ºC durante 3 horas y luego se precipitaron con isopropanol y se centrifugaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El sobrenadante se retiró por decantación, y se lavó el sedimento con 1 ml de etanol al 70% y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. El tubo se centrifugó en una microcentrífuga durante 10 minutos a 14 000 rpm y el sobrenadante se retiró por decantación. A continuación, el sedimento se resuspendió en 750 µl de medio PF-CHO en un entorno estéril, se dejó incubar a 60ºC durante 30 minutos, y se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se centrifugaron las células 5E6 APFDXB11 en cada uno de los tres tubos y se resuspendieron utilizando la solución de medios de ADN. Se colocaron las mezclas de ADN/células en una cubeta con una separación de 0,4 cm y se electroporaron con los parámetros siguientes: 950 µF, alta capacitancia, y 300 V. Luego se retiró el contenido de las cubetas, se agrupó y se diluyó a 25 ml con medio PF-CHO, y se colocaron en un matraz para agitación de 125 ml. Se colocó el matraz en un incubador con agitación a 37ºC, CO2 al 6%, y se agitó a 120 rpm.

La estirpe celular se seleccionó con nutrientes seguido de la amplificación por etapas con metotrexato (MTX) a 200 nM y, luego, MTX a 1 µM. Se confirmó la expresión mediante análisis de inmunotransferencia y a continuación se aumentó la escala de la estirpe celular y le siguió la purificación de proteínas.

EJEMPLO 9 Purificación del IL-17RC soluble de las células CHO

Los medios acondicionados de las células CHO que expresan el IL-17RC-TbXFc9 (SEQ ID n.º 64) se concentraron unas 10 veces con un sistema de flujo tangencial Pellicon II contra dos casetes con una membrana Biomax de 0,1 m2 con un punto de corte a una masa molecular de 30 kDa (Millipore, Bedford, MA). Al medio concentrado se le ajustó el pH a 5,5 con ácido acético glacial, se pasó por un filtro de 0,2 µm estéril, y luego se cargó sobre una resina de flujo rápido de Sepharosa con proteína G (Pharmacia, Piscataway, NJ) mediante cromatografía por lotes durante una noche a 4ºC. Antes de cargar el medio acondicionado con el pH ajustado, se preequilibró la resina con la proteína G con 5 volúmenes de la columna (unos 150 ml) de acetato de sodio a 25 mM, NaCl a 150 mM, pH 5,5. La proporción de los medios acondicionados con pH ajustado y filtrados respecto a la resina era de 33:1 (v/v).

El procedimiento de cromatografía por lotes se realizó a temperatura ambiente (unos 21ºC). Los medios acondicionados filtrados por 0,22 µm con el pH ajustado, por lotes, se vertieron en una columna de vidrio vacía de 5,5 x 20,5 cm (BioRad, Hercules, CA) y se empaquetó por gravedad. Se lavó la columna con 10 volúmenes de columna (unos 300 ml) de acetato de sodio a 25 mM y NaCl a 150 mM, pH 5,5. A continuación, la proteína unida se eluyó por pH con glicina a 100 mM, pH 2,7. Se recogieron fracciones de 9,0 ml y se neutralizaron inmediatamente con 1,0 ml de Tris a 2,0 M, pH 8,0. Las fracciones recogidas se analizaron mediante SDS-PAGE con tinción de Coomassie. Se agruparon las fracciones que contenían el IL-17RC-Tbx-Fc9 y se concentraron unas 6 veces utilizando un concentrador por centrifugación con membrana Biomax con un valor de corte a una masa molecular de 5 kDa (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante.

A continuación, las fracciones concentradas agrupadas se dializaron a 4ºC extensivamente contra una disolución salina tamponada con fosfato 1X, pH 7,3 (Sigma, St Louis, MO) utilizando una membrana Slide-A-Lyzer con un punto de corte a una masa molecular de 7 kDa (Pierce, Rockford, IL). El IL-17RC-TbX-Fc9 formulado en una disolución salina tamponada con fosfato 1X, pH 7,3 se esterilizó a través de un filtro de 0,22 µm antes de distribuirlo en alícuotas y almacenarlo a –80ºC.

EJEMPLO 10 Unión de la IL-17A y la IL-17F al IL-17RC humano

A) Unión de citocinas biotiniladas a las células transfectadas

A las células de riñón de hámster recién nacido (BHK) que se habían transfectado con vectores de expresión que codifican el receptor humano de la IL-17 (SEQ ID n.º 21), el IL-17RC humano (SEQ ID n.º 2) o ambos receptores, se les valoró su capacidad para que se les una la IL-17A humana y la IL-17F humana biotiniladas. Las células se recogieron con Versene, se contaron y se diluyeron a 107 células/ml en medio de tinción (MT), que es HBSS más seroalbúmina bovina (SAB) a 1 mg/ml, Hepes a 10 mM, azida de sodio al 0,1% (p/v). Las IL-17A humana (SEQ ID n.º 14) e IL-17F humana (SEQ ID n.º 16) biotiniladas se incubaron con células en hielo durante 30 minutos a distintas concentraciones. Después de 30 minutos, se lava el exceso de citocinas con MT y se incuban las células con una dilución 1:100 de estreptavidina conjugada con ficoeritrina (SA-PE) durante 30 minutos en hielo. Se lava el exceso de SA-PE y se analizan las células mediante citometría de flujo. Se cuantificó la cantidad de citocinas que se unían a partir de la intensidad media de la fluorescencia de la tinción de citocinas. A partir de este análisis, encontramos que la IL-17A humana se une al IL-17R y el IL-17RC humanos con una afinidad similar. También, la IL-17F humana se une al IL-17RC a un nivel similar pero se une al IL-17R de forma detectable, pero a un nivel mucho más bajo que el observado con la IL-17A.

B) Unión de citocinas biotiniladas a linfocitos mononucleares de sangre periférica humana

Se prepararon linfocitos mononucleares de sangre periférica humana (LMSP, por su nombre en inglés) a partir de sangre completa mediante centrifugación en un gradiente de densidad de ficoll. Se incubaron simultáneamente las células LMSP a 107 células/ml con IL-17A o IL-17F biotiniladas a 1 µg/ml y anticuerpos conjugados con fluorocromo contra proteínas específicas de la superficie celular que se diseñaron para diferenciar varias estirpes celulares de glóbulos blancos. Estos marcadores incluyen CD4, CD8, CD19, CD11b, CD56 y CD16. Se lava el exceso de anticuerpos y citocinas, y se detecta la unión específica de las citocinas incubando con SA-PE tal y como se describió anteriormente. Se analizaron muestras mediante citometría de flujo y, a partir de este análisis, encontramos que la IL-17A humana se une a casi todas las poblaciones de LMSP examinadas, pero que la IL-17F humana no se une detectablemente a ninguna población.

C) Inhibición de la unión específica de la IL-17A y la IL-17F humanas biotiniladas con citocina sin marcar

Los estudios de unión se realizaron como se explicó anteriormente, pero se incluye un exceso de IL-17A e IL-17F humanas sin marcar en la reacción de unión. En los estudios con las células BHK, se varió la cantidad de citocina sin marcar en un intervalo de concentraciones y encontramos que la adición de IL-17A sin marcar competía con IL-17A e IL-17F por unirse a IL-17RC y a IL-17R. Sin embargo, la IL-17F sin marcar compitió con IL-17A e IL-17F por unirse a IL-17RC, pero no compitió con eficacia por la unión a IL-17R. Esto indica que tanto IL-17A como IL-17F se unen específicamente a IL-17RC y que se unen a un sitio que es idéntico o que se solapan significativamente porque compiten entre sí por la unión. También, la IL-17A compite con IL-17F por una unión relativamente débil a IL-17R, lo que indica que estas dos citocinas también se unen a una región similar en el IL-17R pero que la IL-17F se une a IL-17R con una afinidad más reducida respecto a IL-17RC.

D) Inhibición de la unión específica de la IL-17A y la IL-17F humanas biotiniladas con el IL-17RC y el IL-17R solubles

Se realizan estudios de unión tal y como se explicó anteriormente, excepto que una forma soluble de IL-17RC o IL-17R se incluyen en las reacciones de unión. Estos receptores solubles son proteínas de fusión derivadas del dominio extracelular de cada receptor fusionado con la región constante (Fc) de la IgG1 humana. Encontramos que el IL-17RC soluble inhibe la unión de la IL-17A y de la IL-17F humanas a las células BHK transfectadas tanto con IL-17RC como con IL-17R. Sin embargo, el IL-17R soluble inhibe la unión de la IL-17A a cualquiera de los dos receptores, pero no bloquea eficazmente la unión de la IL-17F con el IL-17RC, en concordancia con la poca unión de la IL-17F con el IL-17R.

EJEMPLO 11 IL-17A e IL-17F se unen al IL-17RC

A) Inhibición de la unión con ligando frío

Las células BHK transfectadas con el hIL-17RC (SEQ ID n.º 2) y el IL-17R (SEQ ID n.º 21) se sembraron a 40 000 células/pocillo en una placa de 24 pocillos (Costar 3527) dos días antes del ensayo. La IL-17A (SEQ ID n.º 14) y la IL-17F (SEQ ID n.º 16), que se habían radiomarcado mediante el método de perlas de yodo, se añadieron independientemente a los pocillos por triplicado a 10 ng/ml con un total de 250 µl/pocillo en tampón de unión (medio RPMI 1640 [JRH 51502-500 M] con seroalbúmina bovina a 10 mg/ml [Gibco 15260-037]). Se añadieron competidores fríos con un exceso molar de 100 veces. Los competidores analizados incluían IL-17A, IL17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F e IL-21. Se incubaron los pocillos en hielo durante 1 hora y después se lavaron dos veces con PBS (Invitrogen 20012-027) y una vez con una solución con una concentración elevada de sales (NaCl a 1,5 M, HEPES a 50 mM, pH 7,4). Los pocillos se extrajeron con 500 µl de NaOH a 0,8 M durante 30 minutos a temperatura ambiente y se midieron las cuentas por minuto en un contador � (Packard Cobra II A5005).

Los resultados indicaron que la IL-17A y la IL-17F frías a un exceso molar de 100 veces fueron capaces de reducir la unión de 125I-IL-17A a las BHK hIL-17RC unas 7 veces, mientras que IL-17B, C, D, E e IL-21 no tuvieron ningún efecto sobre la unión. La IL-17A fría a un exceso molar de 100 veces redujo la unión de 125I-IL-17A a las BHK IL-17R unas 4 veces, mientras que IL-17B, C, D, E, F e IL-21 no tuvieron ningún efecto sobre la unión. Un exceso molar de 100 veces de IL-17A e IL-17F redujo la unión de 125I-IL-17F a las BHK hIL-17RC unas 4 veces y 5 veces, respectivamente, mientras que IL-17B, C, D, E e IL-21 no tuvieron ningún efecto sobre la unión.

B) Inhibición de la unión con el receptor soluble:

Se llevó a cabo la unión a células BHK transfectadas con hzytor14 (SEQ ID n.º 2) e IL-17R (SEQ ID n.º 21) como en uno, pero en la competición se utilizaron hIL17RCx1/Fc9 soluble (ejemplo 8) e IL-17R/Fc soluble (obtenido de R&D; ref. 177-IR) a un exceso molar de 100 veces en lugar de un ligando frío. Se lavaron las células, se extrajeron y se contaron como en la parte uno.

El hIL-17RC/Fc soluble inhibió la unión de 125I-IL-17F a las BHK hIL-17RC con una CI50 a un exceso molar de 10X según el promedio de tres experimentos. El hIL-17RC/Fc soluble inhibió la 125I-IL-17A en la misma estirpe celular con un promedio de CI50 a un exceso molar de 20X, y el IL-17R/Fc soluble inhibió a 125I-IL-17A con un promedio de CI50 a un exceso molar de 20X.

C) Saturación de la unión

Se sembraron las células BHK transfectadas en placas de 24 pocillos como en uno. Se añadieron las IL-17A e IL-17F radiomarcadas comenzando a una concentración de 4 nM en ocho diluciones 1:3 (hasta una concentración de 1,83 pM) por triplicado con un total de 250 µl/pocillo en tampón de unión. Por separado, se añadió un exceso molar de 100 veces del ligando frío a cada punto de dilución. Se lavaron las células, se extrajeron y se contaron como en uno. Se representaron en un gráfico las cuentas por minuto específicas frente a la concentración de ligando radiomarcado añadido substrayendo las cuentas del exceso molar de 100 veces de las cuentas sin competición en cada punto de dilución. Se representaron en un gráfico estos datos normalizados para generar curvas de unión con saturación para cada combinación de ligando radiomarcado y células BHK transfectadas. La tabla 7 muestra los valores de afinidad calculados de los tres experimentos.

Tabla 7

125I-IL-17A + BHK hIL-17RC

125I-IL-17A + BHK IL-17R

1. 180 pM

1. 2,5 ± 0,2 nM

2. 200 pM

2. 4,5 ± 0,3 nM

3. 370 pM

3. 5,9 ± 0,1 nM

125I-IL-17F + BHK hIL-17RC

125I-IL-17F + BHK IL-17R

1. 50 pM

1. Afinidad muy baja

2. 60 pM

2. Afinidad muy baja

3. 80 pM

3. Afinidad muy baja

Una curva de unión a sitio único es lo que mejor se ajusta a la unión de IL-17A e IL-17F a IL-17R. Una curva de unión con dos sitios es lo que mejor se ajusta a la unión de IL-17A e IL-17F a hIL-17RC. El sitio de unión de gran afinidad es el valor

10 mostrado anteriormente. El sitio de unión de gran afinidad tenía una afinidad muy baja y variaba ampliamente entre los tres experimentos. EJEMPLO 12 Las células Nih3t3 murinas responden a las IL-17A e IL-17F humanas A) Siembra en placa de las células e infección con el adenovirus indicador

15 kz142 Las células Nih3t3, derivadas de Nih3t3 de fibroblastos de ratón (descritas en la ATCC), se sembraron a 5000 células/pocillo en placas de color blanco sólido de 96 pocillos (catálogo n.º 3917. Costar) recubiertas con un cultivo de células usando DMEM/SBF al 10%, que contiene glutamina y complementado con piruvato, y se

20 cultivaron durante una noche a 37ºC y CO2 al 5%. En este segundo día, se retiró el medio de siembra y se prepararon las partículas del adenovirus Kz142 a una multiplicidad de infección de 5000 partículas/células en DMEM/SBF al 1%, que contiene glutamina y complementado con piruvato, y se cultivó durante una noche a 37ºC y CO2 al 5%.

25 B) Ensayo de la luciferasa para medir la activación que la IL-17A y la IL-17F

producen sobre las células nih3t3 infectadas con el adenovirus indicador kz142

Después de incubar durante una noche con las partículas del adenovirus indicador, se prepararon los tratamientos con los ligandos IL-17A e IL-17F humanos en medio sin suero complementado con SAB al 0,28%. Se retiraron las partículas del adenovirus y el medio, y se administraron las dosis del ligando adecuado por triplicado. Se continuó la incubación a 37ºC con CO2 al 5% durante 4 horas, después de lo cual se retiró el medio, se lisaron las células durante 15 minutos y se midió la intensidad media de fluorescencia (IMF) mediante el sistema y los reactivos de ensayo de la luciferasa (n.º de catálogo 1531, Promega. Madison, WI) y un luminómetro de microplacas. Se detectó actividad a concentraciones que oscilaban de 0,1-1000 ng/ml de las IL-17A e IL-17F humanas, lo que generó valores de CE50 de unos 50 ng/ml para ambos ligandos. Estos datos sugieren que las células nih3t3 llevan receptores para estos ligandos y que IL-17A e IL-17F activan el factor de transcripción NfKb/Ap-1.

EJEMPLO 13 Las células Nih3t3 murinas expresan IL-17RA e IL-17RC

El análisis por RT-PCR del ARN de nih3t3 demostró que estas células expresaban el IL-17RA y el IL-17RC, lo que resultaba coherente con su respuesta nfkb/ap1 a la mediación de las IL-17A e IL-17F humanas que se realiza a través de uno de los receptores, o de ambos.

DETALLES DE LA RT-PCR:

A) PCR del IL-17RC murino

Se preparó la primera hebra del ADNc a partir de ARN total aislado de células nih3t3 mediante métodos estándares. Se llevó a cabo la PCR con la polimerasa de arranque en caliente y las recomendaciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA) utilizando como cebador sentido zc38910, 5' (SEQ ID n.º 56) y como cebador antisentido, zc38679, 5'

imagen6 �3' (SEQ ID n.º 57), y 35 ciclos de amplificación. La electroforesis en gel de agarosa reveló un amplicón robusto único del tamaño esperado de 850 pb.

B) PCR del IL-17RA murino

Se preparó la primera hebra del ADNc a partir del ARN total aislado de células nih373 mediante métodos estándares. Se aplicó la PCR con la polimerasa de arranque en caliente y las recomendaciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA) utilizando como cebador sentido, zc38520, 5' como cebador antisentido, zc38521, 5' 59), y 35 ciclos de amplificación. La electroforesis en gel de agarosa reveló un solo amplicón robusto del tamaño esperado de 498 pb.

imagen11

imagen12

EJEMPLO 14 Creación de un clon estable de Nih3t3 para ensayo que expresa el factor de transcripción ap1/nfkb

La estirpe de las células nih3t3 murinas descrita anteriormente se transfectó establemente con la construcción indicadora ap1/nfkb en kz142, que contiene un marcador se selección para neomicina. Se sembró en placas a densidad clonal el grupo transfectado resistente a Neo. Se aislaron clones mediante anillos de clonación y detección selectiva con el ensayo de la luciferasa utilizando el ligando IL-17A humano como un inductor. Se seleccionaron los clones con la intensidad media de fluorescencia (IMF) más elevada (a través de la ap1/NfkB luciferasa) y el ruido de fondo más bajo. Se seleccionó una estirpe celular transfectada estable y se llamó nih3t3/kz142.8.

EJEMPLO 15 Inhibición de la activación ejercida por las IL-17A y IL-17F humanas en las células Nih3t3 murinas mediante las quimeras IL-17RC e IL-17RA/Fc solubles

Se utilizaron las formas solubles del IL-17RC o del IL-17RA como antagonistas de la activación ejercida por la IL-17A y la IL-17F humanas sobre los elementos ap1/nfkb en un ensayo para la luciferasa. Estos receptores solubles son proteínas de fusión derivadas del dominio extracelular de cada receptor fusionado con la región constante (Fc) de la IgG1 humana. Se compró la proteína de fusión IL-17RC-Fc humana soluble (quimera IL-17R/Fc humana recombinante, n.º de catálogo 177-IR100, R&D Sytems, Inc., Minneapolis, Mn). Se construyó la quimera IL-17RC-Fc humana soluble (IL-17RCsR/Fc9) como se describió anteriormente. Encontramos que un exceso de las quimeras IL-17RsR/Fc e IL-17RCsR/Fc9 inhibían los niveles de CE50 de la mediación de ambas IL-17A e IL-17F humanas para la activación de ap1/nfkb de la estirpe celular murina para ensayo nih3t3/kz142.8.

La proteína IL-17RCsR/Fc9 mostró la mayor potencia para antagonizar la activación ejercida por la IL-17F, y la quimera IL-17RsR/Fc mostró la mayor potencia para antagonizar la activación ejercida por la IL-17A.

EJEMPLO 16 El ARNm de la IL-17F se induce en un modelo murino de asma

Se midieron las concentraciones del ARNm de la IL-17F en un modelo de exposición de las vías respiratorias y de sensibilización en ratones. Se sensibilizaron grupos de ratones, de 8 a 10 semanas de edad, mediante inyección intraperitoneal de 10 µg del alérgeno 1 recombinante de Dermatophagoides pteronyssinus (DerP1) (Indoor Biotecnologies, Cardiff, Reino Unido) en alumbre al 50% (Imject Alum™, Pierce)) en los días 0 y 7. Siete días después, los ratones se expusieron 3 días consecutivos (días 14, 15 y 16) con 20 µg de DerP1 en 50 µl de PBS. Había 4 ratones que representaban este grupo. Los controles negativos incluían 5 ratones a los cuales se les sensibilizó con solución salina tamponada con fosfato (PBS), seguida de una prueba de provocación con PBS. Además de los 3 ratones que se sensibilizaron con DerP1 y luego se les hizo la prueba de provocación con PBS. A las 48 horas de la prueba de provocación con el alérgeno o con el control, se recogió tejido de todo el pulmón y se aisló el ARN total.

Se preparó la primera hebra del ADNc con cantidades idénticas de ARN total de cada sujeto. Se aplicó la PCR del IL-17F con polimerasa de arrranque en caliente de Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) y las recomendaciones del fabricante. La PCR del IL-17F utilizó 35 ciclos de amplificación con el cebador sentido zc46098 5'

3' (SEQ ID n.º 60) y el cebador antisentido

�3' (SEQ ID n.º 61). Para establecer que la calidad del molde era uniforme entre todos los sujetos, se aplicó la PCR de la actina

� a la misma cantidad de cada molde utilizado en la amplificación de la IL-17F. La

PCR de la actina � incluía 25 ciclos de PCR con el cebador sentido zc44779, 5' 3' (SEQ ID n.º 62) y el cebador antisentido zcc44776,

�3' (SEQ ID n.º 63).

Los 4 ratones del grupo de tratamiento sensibilizado con DerP1 y sometido a una prueba de provocación con DerP1 (la simulación del asma) mostró una amplificación robusta de la IL-17F. En cambio, se observó una amplificación débil de la IL-17F en los controles negativos, incluidos 3 de los 3 sujetos que representan el grupo de tratamiento sensibilizado con DerP1 y sometido a una prueba de provocación con PBS y 5 de los 5 sujetos del grupo de tratamiento sensibilizado con PBS y sometido a una prueba de provocación con PBS. La amplificación de la actina � fue al menos tan robusta en los controles negativos como en los sujetos de simulación del asma, lo que demuestra que la amplificación débil de la IL-17F de los controles negativos no se debía a problemas del molde.

EJEMPLO 17 Transfección de las células COS y atrapamiento de la secreción

A) Los ensayos de transfección de las células COS y de atrapamiento de la secreción muestran que el IL-17RCsR/Fc9 y la IL-17F son una pareja receptor/ligando

imagen13

imagen14

Se utilizó un ensayo de atrapamiento de la secreción para emparejar el IL17RC humano (SEQ ID n.º 2) a la IL-17F humana (SEQ ID n.º 16). La proteína de fusión del IL-17RCsR/Fc9 soluble (ejemplo 8) se utilizó como un reactivo de unión en un ensayo de secreción. Los vectores de expresión que contienen el origen de replicación de SV40 que contienen el ADNc de las IL-17B, C, D, E y F humanas se transfectó transitoriamente en células COS. La unión del IL-17RCsR/Fc9 a las células COS transfectadas se llevó a cabo utilizando el ensayo de atrapamiento de secreción descrito más abajo. La unión positiva del IL-17RCsR/Fc9 sólo se observó con la IL-17F humana. Estos resultados demuestran el nuevo hallazgo de que el IL-17RC humano y la IL-17F humana son una pareja receptor/ligando.

B) Transfecciones de las células COS

La transfección de las células COS se realizó del siguiente modo: se mezclan 3 µl de ADN reunido y 5 µl de Lipofectamina™ en 92 µl de medio DMEM sin suero (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 µg de selenio y 5 mg de fetuína en 500 ml de DMEM), se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se añaden 400 µl de medio DMEM sin suero. Se añade esta mezcla de 500 µl sobre 1,5 x 105 células COS/pocillo sobre una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos y se incuba 5 horas a 37ºC. Se añaden 500 µl de medio DMEM con SBF al 20% (100 ml de SBF, 55 mg de piruvato de sodio y 146 mg de L-glutamina en 500 ml de DMEM) y se incuba durante una noche.

C) Ensayo de atrapamiento de la secreción

Se realizó el atrapamiento de la secreción como sigue: se lavó el medio de las células con PBS y luego se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 1,8% en PBS. A continuación se lavaron las células con TNT (Tris-HCl a 0,1 M, NaCl a 0,15 M y Tween-20 al 0,05% en H2O), y se permeabilizaron con Tritón-X al 0,1% en PBS durante 15 minutos, y de nuevo se lavaron con TNT. Se bloquearon las células durante 1 hora con TNB (Tris-HCl a 0,1 M, NaCl a 0,15 M y reactivo de bloqueo al 0,5% [kit NEN® Renaissance® TSA-Direct] en H2O), y se lavaron de nuevo con TNT. Se incubaron las células durante 1 hora con la proteína de fusión del receptor humano soluble IL-17RCx1sR/Fc9 a 1 µg/ml. Luego se lavaron las células con TNT. Se incubaron las células durante otra hora con anti-Ig-HRP humana (específico de Fc) de cabra diluido a 1:200. Se lavaron las células de nuevo con TNT.

Se detectó la unión positiva con un reactivo de tiramida de fluoresceína diluida

1:50 en un tampón de dilución (kit NEN®) que se incubó durante 4 a 6 minutos y se lavó con TNT. Se conservaron las células con el medio de montaje Vectashield® (Vector Labs Burlingame, CA) diluido 1:5 en TNT. Se visualizaron las células mediante un filtro FITC sobre un microscopio de fluorescencia.

EJEMPLO 18 Generación de anticuerpos monoclonales murinos contra el IL-17RC humano

A. Inmunización para generar anticuerpos anti-IL-17RC

1. IL-17RC-muFc soluble

Se inmunizaron ratones con seis a doce semanas de edad con desactivación génica del IL-17RC o intactos mediante una inyección por vía intraperitoneal con 25 a 50 µg de la proteína humana soluble IL-17RC-muFc (ejemplo 23) mezclada 1:1 (v:v) con adyuvante de Ribi (Sigma) en una posología bisemanal. Siete a diez días después de la tercera inmunización, se tomaron muestras de sangre mediante sangrado retroorbital, se recogió el suero y se evaluó su capacidad para inhibir la unión de la IL17 o la IL-17F al IL-17RC en ensayos de neutralización (por ejemplo, los descritos en la presente memoria) y para teñir las células 293 transfectadas con IL-17RC frente a las no transfectadas en un ensayo de tinción con FACS. Se continuó inmunizando a los ratones, se tomaron muestras de sangre y se evaluaron como se describió anteriormente hasta que las valoraciones de la neutralización alcanzaron un valor meseta. En ese momento, a los ratones con las valoraciones de neutralización más elevadas se les inyectó por vía intravascular de 25 a 50 µg de proteína IL-17RC-Fc soluble en PBS. Tres días después, se recogieron el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se utilizaron para la generación de hibridomas, por ejemplo, utilizando células de mieloma de ratón (PX-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras estirpes celulares apropiadas en la técnica, mediante los métodos estándares conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123: 1548-50, 1979; y Lane, R.D.

J. Immunol. Methods 81: 223-8, 1985).

2. IL-17RC, IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS, IL-17RC-CFLAG solubles

Se inmunizan ratones de seis a doce semanas de edad con desactivación génica de IL-17RC o intactos mediante una inyección intraperitoneal con 25 a 50 µg de IL-17RC-CEE, IL-17RC-CHIS o IL-17RC-CFLAG humanos solubles mezclados 1:1

(v:v) con adyuvante Ribi (Sigma) en una posología bisemanal. Siete a diez días después de la tercera inmunización, se toman muestras de sangre mediante sangrado retroorbital, se recoge el suero y se evalúa su capacidad para inhibir la unión de IL-17

o IL-17F al IL-17RC en ensayos de neutralización (por ejemplo, los descritos en la presente memoria) y para teñir las células 293 transfectadas con IL-17RC frente a las no transfectadas en un ensayo de tinción con FACS. Se siguen inmunizando los ratones, se toman muestras de sangre y se evalúan como se describió anteriormente hasta que las valoraciones de neutralización alcanzan un valor meseta. En ese momento, los ratones con las titulaciones de neutralización más elevadas se inyectan por vía intravascular con 25 a 50 µg de la proteína antigénica soluble IL-17RC, IL17RC-CEE, zcytor-CHIS o IL-17RC-CFLAG en PBS. Tres días después se recogen el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se utilizan para generar hibridomas, por ejemplo, con células de mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras estirpes celulares adecuadas en la técnica, mediante los métodos estándares conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Kearney, J.F. et al., J. Immunol. 123:154850, 1979; y Lane, R.D. J. Immunol. Methods 81: 223-8, 1985).

3. Transfectantes de P815 que expresan el IL-17RC

Se inmunizan ratones hembra DBA/2 de seis a diez semanas de edad mediante inyección intraperitoneal con 1 x 105 células P815 transfectadas vivas, por ejemplo, células P815/IL-17RC (por ejemplo, 0,5 ml a una densidad celular de 2 x 105 células/ml). Antes de la inyección, se mantienen las células en la fase de crecimiento exponencial. Para la inyección, se recogen las células, se lavan tres veces con PBS y luego se resuspenden en PBS a una densidad de 2 x 105 células/ml. En este modelo, los ratones desarrollan un tumor ascítico en el plazo 2 a 3 semanas y acaban muriendo a las 4 a 6 semanas a menos que se haya desencadenado una respuesta inmunitaria contra el antígeno diana transfectado. A las 3 semanas, los ratones sin ninguna hinchazón abdominal evidente (indicativa de ascitis) se vuelven a inmunizar como antes a intervalos de 2 a 3 semanas. Siete a diez días después de la segunda inmunización se toman muestras de sangre por sangrado retroorbital, se recoge el suero y se evalúa su capacidad para inhibir la unión de la IL-17 o la IL-17F al IL-17 o al IL-17RC en ensayos de neutralización (por ejemplo, los descritos en la presente memoria) y para teñir las células 293 transfectadas con IL-17RC frente a las células 293 sin transfectar en un ensayo de tinción con FACS. Se sigue inmunizando los ratones, se toman muestras de sangre y se evalúan tal y como se describió anteriormente hasta que las valoraciones de neutralización alcanzan un valor meseta. En ese momento, a los ratones con las valoraciones de neutralización más elevadas se les inyectan por vía intraperitoneal 1 x 105 células P815 transfectadas vivas. Cuatro días después se recogen el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se utilizan para generar hibridomas, por ejemplo, con células de mieloma de ratón (P3-X63Ag8.653.3.12.11) u otras estirpes celulares adecuadas en la técnica, mediante los métodos estándares conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Kearney, J. F. et al., supra; y Lane, R.D., supra).

Una alternativa al esquema de inmunización anterior con células P815 transfectadas vivas implica inyección intraperitoneal de 1-5 x 106 células transfectadas irradiadas cada 2 o 3 semanas. En este método, ningún animal padece ascitis ni muere por ella. En su lugar, se vigilan los animales para detectar la respuesta inmunitaria neutralizante del IL-17RC en el suero tal y como se describió anteriormente, comenzando con un sangrado después de la segunda inmunización. Una vez que las valoraciones de neutralización han alcanzado un nivel máximo, a los ratones con las valoraciones más elevadas se les administra una inyección por vía intraperitoneal de prefusión de 5 x 106 células irradiadas y, cuatro días después, se recogen el bazo y los ganglios linfáticos de estos ratones y se utilizan para generar hibridomas, por ejemplo, con mieloma de ratón (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) u otras estirpes celulares adecuadas en la técnica, mediante los métodos estándares conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Kearney, J.F et al., supra; y Lane, R.D., supra).

B. Detección selectiva de las fusiones de hibridomas para anticuerpos que se unen al IL-17RC y que inhiben la unión de la IL-17 o la IL-17F al IL-17RC

Se realizan tres detecciones selectivas primarias diferentes sobre los sobrenadantes de los hibridomas 8 a 10 días después de la fusión. Para el primer ensayo, se analizaron los anticuerpos en los sobrenadantes por su capacidad para unirse a la proteína humana soluble IL-17RC, IL-17RC-muFc, IL-17RC-CEE, IL-17RCCHIS o IL-17RC-CFLAG unida a la placa, mediante ELISA, utilizando reactivos para la segunda etapa de cabra conjugados con HRP anti-cadena ligera � y � de ratón para identificar los anticuerpos de ratón unidos. Para demostrar la especificidad de la porción del IL-17RC de las proteínas de fusión del IL-17RC, se evaluaron los sobrenadantes positivos en el ensayo inicial con una proteína irrelevante fusionada con la misma región Fc murina (mG2a), secuencia EE, secuencia HIS o secuencia FLAG. El anticuerpo en estos sobrenadantes que se unen a la proteína de fusión del IL-17RC y no la muFc irrelevante u otras proteínas que contienen secuencia de las proteínas de fusión parecían ser específicos contra el IL-17RC. Para el segundo ensayo, se evaluaron los anticuerpos en todos los sobrenadantes de hibridomas mediante ELISA por su capacidad para inhibir la unión de la IL-17 humana biotinilada o la IL-17F humana biotinilada a las proteínas de fusión unidas a la placa IL-17RC-muFc

o IL-17RC.

Todos los sobrenadantes que contienen anticuerpos que se unen específicamente al IL-17RC, tanto si inhiben o no la unión de la IL-17 o de la IL-17F al IL-17RC en el ensayo de ELISA, se analizaron posteriormente por su capacidad para inhibir la unión de IL-17 o IL17F a las células Baf3 o BHK transfectadas con IL-17RC o a las células epiteliales bronquiales humanas normales. Todos los sobrenadantes que dieron positivo en la neutralización tanto en los ensayos de inhibición de la IL-17 o de la IL-17F, o bien en los ensayos de inhibición de ambas IL-17 y IL-17F, se evaluaron posteriormente por su capacidad para teñir las células Baf3 o BHK transfectadas con IL-17RC frente a las no transfectadas mediante un análisis con FACS. Este análisis se diseñó para confirmar que esa inhibición de la unión de la IL-17 o la IL-17F al IL-17RC se debía realmente a un anticuerpo que se une específicamente al receptor del IL17RC. Adicionalmente, dado que se realizó el análisis con FACS con un reactivo de segunda etapa de anti-IgG, los resultados positivos específicos de la FACS indican que el anticuerpo neutralizante probablemente era de la clase IgG. Con estos medios, se identificó un pocillo maestro que daba unión con el IL-17RC unido a la placa en el ELISA, inhibía la unión de IL-17 o IL-17F al IL-17RC en un ensayo de inhibición basado en ELISA, bloqueaba la interacción de IL-17 e IL-17F con las células Baf3 o BHK transfectadas con IL-17RC, respectivamente, y daba un positivo intenso para la tinción de células Baf3 o BHK transfectadas con IL-17RC con un reactivo de segunda etapa anti-IgG de ratón.

El tercer ensayo consiste en células epiteliales bronquiales humanas primarias que expresan el IL-17RC y que se pueden inducir para que secreten IL-8 o IL-6 en respuesta al tratamiento con IL-17F. Al anticuerpo monoclonal específico se le ensaya su capacidad para inhibir la síntesis de IL-8 o IL-6 estimulada por IL-17 o IL-17F en estas células. Se ensayó la producción de IL-8 e IL-6 en respuesta a IL-17 o IL-17F como se describió en la presente memoria.

Alternativamente, la inhibición, mediada por el anticuerpo monoclonal anti-IL17RC, de la producción de luciferasa inducida por IL-17 o IL-17F en las células NIH 3T3 u otras que contengan el IL-17RC se puede utilizar con, o en lugar de, uno de los ensayos de neutralización de bioactividad señalados anteriormente. El ensayo de la luciferasa mediado por NF�B en las células NIH 3T3 se describe en la presente memoria.

C) Clonación de hibridomas que producen anticuerpos específicos anti-IL-17RC

Las estirpes celulares de hibridomas que producen un Acm anti-IL-17RC específico que neutraliza cruzadamente la unión de IL-17 e IL-17F a las células Baf3 o BHK transfectadas adecuadamente se clonan mediante un método de dilución a baja densidad estándar (menos de 1 célula por pocillo). Unos 5 a 7 días después de la siembra en placas, se realiza la detección selectiva de los clones por ELISA en, por ejemplo, placas con el IL-17RC-muFc humano unido seguido de otra recomprobación de pocillos positivos por ELISA sobre las proteínas de fusión irrelevantes que contienen muFc tal y como se describió anteriormente. A los clones seleccionados, cuyos sobrenadantes se unen a la IL-17RC-muFc y no a la proteína de fusión irrelevante que contiene la muFc se les confirma adicionalmente la actividad específica del anticuerpo al repetir los dos ensayos de neutralización así como el ensayo con FACS. Todos los clones seleccionados que dan positivo para el anticuerpo contra IL17RC se clonan un mínimo de dos veces para ayudar a asegurar la clonalidad y para evaluar la estabilidad de la producción del anticuerpo. Se realizan más ciclos de clonación y de detección selectiva tal y como se ha describito hasta que, preferentemente, al menos el 95% de los clones resultantes daban positivo para la producción del anticuerpo anti-IL-17RC neutralizante.

D) Caracterización bioquímica de la molécula reconocida por los Acm anti-IL17RC

La confirmación bioquímica de que la molécula destinataria, el IL-17RC, reconocida por los posibles Acm anti-IL-17RC es realmente el IL-17RC se realiza mediante inmunoprecipitación estándar seguida de análisis por SDS-PAGE o procedimientos de análisis de inmunotransferencia, empleándose en ambos preparaciones de membrana solubles de las células Baf3 o BHK transfectadas con el IL-17RC frente a las no transfectadas. Además, las preparaciones de membrana solubles de las estirpes celulares no transfectadas que expresan el IL-17RC solían mostrar que los Acm reconocen la cadena del receptor original así como el transfectado. Alternativamente, se analiza la capacidad de los Acm para inmunoprecipitar específicamente la proteína IL-17RC-muFc soluble, o bien para los análisis de inmunotransferencia, .

EJEMPLO 19 Neutralización del IL-17RC humano mediante sueros de ratones inyectados con células P815 transfectadas con el IL-17RC humano

En un ensayo de neutralización con células, se añade suero de ratones a los que se les inyectó células P815 vivas transfectadas con IL-17RC humano (ejemplo 17) como una dilución seriada al 1%, 0,5%, 0,25%, 0,13%, 0,06%, 0,03%, 0,02% y 0%. Se incuban las placas de análisis a 37ºC, CO2 al 5%, durante 4 días, tras los cuales se añade Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 �l/pocillo. Las placas se incuban de nuevo a 37ºC, CO2 al 5%, durante 16 horas. Los resultados demostraron que el suero de cuatro de los animales podría neutralizar la señalización de la hIL-17 y la hIL-17-F a través del IL-17RC humano.

Los resultados como estos proporcionan más pruebas de que bloquear eficazmente el IL-17RC al unir, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar o neutralizar la actividad de la IL-17 o la IL-17F (juntas o por separado), por ejemplo, mediante un anticuerpo monoclonal neutralizante contra IL-17RC de la presente invención, podría ser ventajoso para reducir los efectos de la IL-17 y la IL-17F (juntas o por separado) in vivo y podría reducir la inflamación inducida por la IL-17 y/o la IL-17F, tal como las observadas en, por ejemplo, la psoriasis, la enteropatía inflamatoria, la colitis, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la fibrosis quística u otras enfermedades inflamatorias inducidas por la IL-17, y/o la IL-17F incluidas enteropatía inflamatoria, artritis, asma, artropatía psoriásica, colitis, enfermedades inflamatorias de la piel y dermatitis atópica.

EJEMPLO 20 Farmacocinética de un anticuerpo monoclonal anti-IL-17RC humano

El anticuerpo monoclonal del análisis, el Acm anti-IL-17RC humano, se proporciona en, por ejemplo, alícuotas de 3 x 3 ml a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml (determinado mediante absorbencia UV a 280 nm) y se almacenó a –80ºC hasta que se utilice. El vehículo es 1X PBS (NaPO4 a 50 mM, NaCl a 109 mM), pH 7,3. Se descongela el Acm a temperatura ambiente antes de utilizarlo y se utilizan las alícuotas 1 y 2 tal como se proporcionan para los grupos de dosificación i.v. y s.c. de 100 µg, respectivamente. La mitad de la alícuota 3 se diluye

1:2 en PBS 1X para el grupo de dosificación s.c. de 50 �g y la segunda mitad de la alícuota 3 se diluye 1:10 en PBS 1X para el grupo de dosificación s.c. de 10 �g. Se obtuvieron ratones SCID hembra (n = 96) de Charles River Labs. Se comprobó la salud de los animales al recibirlos y se guardaron por grupos (3 animales por caja). Los ratones tienen 12 semanas de edad con una masa corporal media de unos 22 g al comenzar el estudio.

A) Protocolo de dosificación

Los ratones SCID hembra (n = 24/grupo de dosis) se distribuyen aleatoriamente en cuatro grupos de dosificación (tabla 8). Al grupo 1 se le administró el Acm anti-IL-17RC humano por inyección i.v. de unos 93 �l en la vena de la cola y a los grupos 2, 3 y 4 se les administró el Acm mediante una inyección s.c. de unos 93 �l en la nuca.

B) Recogida de muestras

Antes de recoger la sangre, se anestesió totalmente a los ratones con halotano e isofluorano. Se recogieron muestras de sangre con una varilla cardíaca en todos los puntos salvo a las 168 horas (recogidas mediante sangrado ocular y los animales se sangraron de nuevo a las 504 horas con una varilla cardíaca). Se recogió sangre en tubos separadores del suero y se dejó que coagulara durante 15 minutos. Posteriormente, se centrifugaron muestras durante 3 minutos a 14 000 rpm. Después de la centrifugación, se dispensaron alícuotas de 125 a 150 �l en tubos Eppendorf marcados y se almacenaron inmediatamente a –80ºC hasta el ensayo.

Tabla 8

Grupo n.º

Dosis (vía de administración) Animales Puntos para PK

1

100 �g (i.v.) 3 ratones/punto* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

2

100 �g (s.c.) 3 ratones/punto* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

3

50 �g (s.c.) 3 ratones/punto* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

4

10 �g (s.c.) 3 ratones/punto* 0,25, 1, 4, 8, 24, 72, 168, 336 y 504 horas

*Se utilizaron los mismos animales a las 168 horas y a las 504 horas.

C) Cuantificación de las concentraciones de Acm anti-IL-17RC humano en el

10 suero mediante ELISA Se desarrolló un ensayo inmunoenzimático (ELISA) y se capacitó para analizar muestras de suero de ratón de animales dosificados con Acm anti-IL-17RC durante los estudios farmacocinéticos. Se diseñó este ensayo para aprovecharse de un anticuerpo secundario disponible comercialmente y de la detección colorimétrica utilizando TMB.

15 Las diluciones utilizadas para la curva estándar se modificaron para mejorar la definición de la porción lineal de la curva estándar. Una curva estándar en el intervalo de 100 ng/ml a 0,231 ng/ml con diluciones de 2 veces permite cuantificar las muestras de suero de ratón. Se diluyen muestras de CC a 1:100, 1:1000 y 1:100000 en suero de ratones SCID al 10% y se calcularon a partir de la curva estándar.

20 D) Análisis farmacocinético La concentración en el suero frente a datos de tiempo se introducen en el programa informático WinNonlin Professional 4.0 (Pharsight, Inc.; Cary, NC) para el análisis farmacocinético. Se utiliza el análisis no compartimental para determinar los parámetros farmacocinéticos en función de la media de los datos en cada tiempo.

EJEMPLO 21 Neutralización de la actividad de la IL-17A y la IL-17F mediante un anticuerpo monoclonal contra el IL-17RC humano

En un ensayo de neutralización con células se añade anticuerpo monoclonal purificado de ratón anti-IL-17RC humano como una dilución seriada, por ejemplo, a 10 �g/ml, 5 �g/ml, 2,5 �g/ml, 1,25 �g/ml, 625 ng/ml, 313 ng/ml, 156 ng/ml y 78 ng/ml. Las placas del ensayo se incuban a 37ºC, CO2 al 5%, durante 4 días, momento en el que se añade Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 �l/pocillo. Se incuban las placas de nuevo a 37ºC, CO2 al 5%, durante 16 horas. Este ensayo es capaz de demostrar que el anticuerpo monoclonal purificado anti-IL-17RC humano es capaz de neutralizar la señalización de la hIL-17 y de la hIL-17F a través del IL-17RC humano. Para los anticuerpos muy eficaces, cuando se utilizan a una concentración de unos 10 �g/ml, el anticuerpo neutraliza completamente la proliferación inducida por la hIL-17 o por la hIL-17F, disminuyendo la inhibición de la proliferación en un modo dependiente de la dosis a las concentraciones más bajas. Se lleva a cabo un control negativo emparejado por isotipo de Acm de ratón, analizado en las concentraciones descritas anteriormente, para no proporcionar la inhibición de la proliferación de ninguna citocina. Estos resultados son capaces de demostrar además que los anticuerpos monoclonales contra el IL-17RC realmente podrían antagonizar con la actividad de los ligandos proinflamatorios IL-17 y IL-17F a concentraciones bajas.

EJEMPLO 22 La IL-17A induce la cantidad de IFN-� y TNF-� en los linfocitos mononucleares de la sangre periférica humana

Los linfocitos mononucleares de la sangre periférica (LMSP) se purifican por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll y luego se incuban una noche a 37ºC solo con medio, con anticuerpo anti-CD3 humano a 50 ng/ml, o con la combinación de anticuerpo anti-CD3 humano a 50 ng/ml más anticuerpo anti-CD28 humano a 1 µg/ml. Se hacen cultivos replicados para cada una de las condiciones y no se les administra ninguna citocina, o bien IL-17A humana a 25 ng/ml, o bien IL-17F humana a 25 ng/ml. Después de incubarlos durante 24 horas, los sobrenadantes de cada cultivo se recogen y se ensayan para detectar el contenido de citocinas mediante el Cytometric Bed Array (CBA) para Th1/Th2 humano de B-D Bioscience. Encontramos que los cultivos que se habían estimulado tanto con anti-CD3 como con anti-CD3 más anti-CD28 y que habían sido complementados con IL-17A contenían una cantidad significativamente elevada de IFN-� y TNF-� (elevación de 3 a 5 veces de cada uno) sobre los cultivos a los que no se había añadido ninguna citocina o los que habían recibido IL-17F. Los cultivos sin estimulación con anti-CD3 no mostraron cambios significativos de la concentración de citocinas. Además, la adición de IL-17A no indujo cambios significativos en las otras citocinas ensayadas que se incluyen en el CBA, como IL-2, IL-4, IL-5 e IL-10. Estos datos indican que IL-17A, pero no IL-17F, hace aumentar la producción de IFN-� y TNF-� en los cultivos de LMSP estimulados con anti-CD3 o anti-CD3 más anti-CD28.

EJEMPLO 23 El IL-17RC-Fc disminuye la incidencia de la enfermedad y su progresión en el modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) de ratón

A) Modelo de artritis inducida por colágeno (AIC) de ratón

Los ratones macho DBA/1J de 10 semanas de edad (Jackson Labs) se distribuyen en 3 grupos de 13 ratones/grupo. El día –21 se administra a los animales una inyección intradérmica en la cola de 50-100 µl de colágeno de tipo II de pollo formulado en adyuvante completo de Freund (preparado por Chondrex, Redmond, WA), y tres semanas después, en el día 0, se les administró la misma inyección salvo que preparada en el adyuvante incompleto de Freund. El IL-17RC-Fc se administra como una inyección intraperitoneal 3 veces a la semana durante 4 semanas, en diferentes momentos que van desde el día 0 hasta el día en el que la mayoría de los ratones muestran unos síntomas moderados de la enfermedad. Los grupos recibieron

o bien 10 µg o bien 100 µg de IL-17RC-Fc por animal por dosis, y los grupos de control recibieron el control de vehículo, PBS (Life Technologies, Rockville, MD). Los animales comenzaron a mostrar síntomas de artritis después de la segunda inyección de coágeno, y la mayoría de los animales sufrió una inflamación en el plazo de 1,5-3 semanas. La magnitud de la enfermedad se evaluó en cada pata mediante un calibrador para medir el grosor de la pata, y asignando una puntuación clínica (0-3) a cada pata: 0 = normal, 0,5 = dedo(s) inflamado(s), 1 = inflamación leve de la pata, 2 = inflamación moderada de la pata, y 3 = inflamación intensa de la pata.

B) Vigilancia de la enfermedad

Los animales comienzan a mostrar signos de inflamación de la pata poco después de la segunda inyección de colágeno y algunos animales pueden incluso comenzar a tener signos de inflamación de los dedos antes de la segunda inyección. La mayoría de los animales sufre artritis en el plazo de 1,5 a 3 semanas desde la inyección de refuerzo, pero algunos requieren más tiempo. La incidencia de la enfermedad en este modelo es típicamente del 95 al 100%, y en los estudios con 40 animales se observan típicamente de 0 a 2 no respondedores (determinado después de 6 semanas de observación). Obsérvese que a medida que comienza la inflamación, es frecuente que aparezca una inflamación transitoria de la pata o de algún dedo con intensidad baja variable. Por este motivo, un animal no se considera que sufre la enfermedad hasta que haya aparecido una hinchazón de la pata persistente y marcada.

Los animales se observan a diario para valorar el estado de la enfermedad de sus patas, que se hace asignando una puntuación clínica cualitativa a cada pata. Cada día se puntúan las 4 patas de todos los animales según el estado clínico de la enfermedad. Para determinar la puntuación clínica, la pata se puede pensar que tiene 3 zonas: los dedos, la propia pata (delantera o trasera) y la articulación de la muñeca o tobillo. La magnitud y la intensidad de la inflamación relativa a estas zonas se anota con: observación de la inflamación en cada dedo; desgarros o enrojecimientos de las uñas de los dedos; anotación de cualquier indicio de edema o enrojecimiento en alguna de las patas; anotación de cualquier pérdida de delimitación anatómica fina de los tendones o los huesos; evaluación de la muñeca o el tobillo en busca de edema o enrojecimiento; y anotación de si la inflamación se extiende hacia arriba por la pata. Una puntuación de pata de 1, 2 o 3 se basa primero en la impresión general de la intensidad, y después en cuántas zonas están afectadas. La escala que se utiliza para la puntuación clínica se muestra a continuación.

C) Puntuación clínica

0 = normal

0,5 = uno o más dedos afectados, pero solo están inflamados los dedos

1 = inflamación leve que afecta a la pata (1 zona) y puede afectar a uno o más dedos

2 = inflamación moderada de la pata y puede afectar algunos de los dedos y la muñeca o tobillo (2 zonas)

3 = inflamación intensa de la pata, muñeca o tobillo y parte o todos los dedos (3 zonas)

La enfermedad establecida se define como una puntuación cualitativa de la inflamación de la pata de categoría 2 o más que persiste durante dos o más días seguidos. Una vez que la enfermedad establecida está presente, se anota la fecha y se designa como el primer día del animal con «enfermedad establecida».

Se recoge sangre a lo largo del experimento para vigilar la concentración en el suero de los anticuerpos contra el colágeno, así como la concentración de citocinas e inmunoglobulinas. Los anticuerpos contra el colágeno del suero se correlacionan bien con la intensidad de la enfermedad. Se da muerte a los animales el día 21 y se recoge la sangre para el suero y el hemograma completo. De cada animal se recoge una pata en NBF al 10% para estudios histológicos y otra se congela en nitrógeno líquido y se guarda a –80ºC para analizar el ARNm. También se recogen en RNAlater® medio bazo, medio timo, medio ganglio linfático mesentérico, un lóbulo hepático y el riñón izquierdo para el análisis del ARN, y se recogen medio bazo, medio timo, medio ganglio linfático mesentérico, el resto del hígado y el riñón derecho en NBF al 10% para el estudio histológico. El suero se recoge y se congela a –80ºC para los ensayos de inmunoglobulinas y citocinas.

Los grupos de ratones que recibieron IL-17RC-Fc en todos los puntos temporales se caracterizaron por retrasar el comienzo o progresión de la inflamación de la pata. Estos resultados indican que el IL-17RC puede reducir la inflamación, así como la incidencia y la progresión de la enfermedad asociada a este modelo. Estos resultados están apoyados además por la observación de que el IL-17RC-Fc dio lugar a una disminución de la concentración en el suero de TNF-�, IL-1� y anticuerpos contra el colágeno.

EJEMPLO 24 Sobreexpresión estable del IL-17RC en la estirpe celular murina para ensayo Nih3t3/kz142.8 que expresa el factor de transcripción ap1/nfkb

La estirpe celular murina para ensayo nih3t3/kz142.8 se transfectó con un IL17RCx1 humano (SEQ ID n.º 2) en un vector de expresión con un gen de resistencia al metotrexato (dihidrofolato reductasa, DHFR). Esta transfección se realizó con un kit comercial y las recomendaciones del fabricante (Mirus, Madison, WI; n.º catálogo MIR218). Las células se colocaron en medio de crecimiento modificado con MTX a 1 µM para seleccionar el vector de expresión que contiene el transgén del IL-17RCx1 humano. Después de la selección se generó un grupo de transfección con el IL17RCx1 humano, que se denominó nih3t3/kz142.8/hcytor14x1.

A) Ensayo de la luciferasa con la estirpe celular para ensayo nih3t3/kz142.8

Como nih3t3/kz142.8 tiene un indicador kz142 estable, no hay necesidad de infectar con un adenovirus para añadir este indicador. Por lo tanto, el protocolo del ensayo de la luciferasa se acortó y se realizó de la siguiente manera:

1. Siembra en placa de las células

Las células nih3t3/kz142.8 se sembraron a 5000 células/pocillo en placas de color blanco opaco de 96 pocillos (n.º catálogo 3917, Costar) recubiertos con medio de cultivo DMEM/SBF al 10% que contiene glutamina y complementado con piruvato, y se cultivó una noche a 37ºC y CO2 al 5%. Al segundo día, el medio de siembra se retiró y se cambió por DMEM/SBF al 1% con glutamina y complementado con piruvato, y se cultivó una noche a 37ºC y CO2 al 5%.

2. Ensayo de la luciferasa para medir la activación de IL-17A y F sobre el delator estable kz142

Tras la incubación durante una noche en medio DMEM con SBF al 1%, se realizaron diluciones de los ligandos IL-17A e IL-17F humanos en medio sin suero complementado con SAB al 0,28%. Tras añadir las diluciones de los ligandos, las células se incubaron a 37ºC y CO2 al 5% durante 4 horas, tras lo cual se retiró el medio, se lisaron las células durante 15 minutos y se midió la intensidad media de fluorescencia (IMF) con el sistema de ensayo y los reactivos de la luciferasa (n.º de catálogo e1531, Promega, Madison, WI) y un luminómetro de microplacas. Se detectó actividad para ambos ligandos a concentraciones que oscilaban de 0,1 a 1000 ng/ml. El grupo de transfección nih3t3/kz142.8/hcytor14x1 mostró para el ligando IL-17A murino una actividad similar que su estirpe celular progenitora (ejemplo 14). Sin embargo, el grupo transfectante cytor14x1 mostró una capacidad de respuesta elevada a los tratamientos con IL-17A y F humanos, incluso cuando la concentración de estos ligandos era de tan solo 20 fg. El hecho de que la señalización del mIL-17A sea comparable a la de la estirpe celular progenitora (ejemplo 14) sugiere que no hay un problema inespecífico general con las células que expresan el IL-17RC humano, y que la IL-17A murina está mandando la señal probablemente a través del receptor IL17RC o IL-17R endógeno de las células nih3t3 murinas. Por lo tanto, el hecho de que las IL-17A e IL-17F humanas ocasionen una elevación del IMF a concentraciones tan bajas indicaría que existe una posible hiperreactividad de las células a dichos ligandos, que está mediada por la sobreexpresión del receptor IL-17RC humano.

Este resultado tiene unas ramificaciones y utilidad biológicas y clínicas significativas. Por ejemplo, ciertas situaciones fisiológicas podrían ocasionar una inducción de los receptores IL-17RC que podría hacer que estas áreas sean hiperreactivas a IL-17A e IL-17F, lo que daría lugar a la activación biológica a una concentración de ligando mucho más baja que las que se necesitarían sin la sobreexpresión del IL-17RC. Por lo tanto, podrían bastar concentraciones de receptor soluble mucho más bajas de lo que se había pensado o reconocido anteriormente por los expertos en el tema para antagonizar estas concentraciones de ligando hipotéticamente más bajas .

EJEMPLO 25 Los antagonistas de la actividad de IL-17F e IL-17A disminuyen la incidencia y la progresión de la enfermedad en un modelo de enteropatía inflamatoria

Este modelo está diseñado para mostrar que el tejido intestinal cultivado de los pacientes con una enteropatía inflamatoria produce más cantidad de mediadores inflamatorios en comparación con los tejidos de los controles sanos. Este aumento de la producción de mediadores inflamatorios (que incluyen, sin limitarse a ellos, IL-1�, IL4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A y F, IL-18, IL-23, TNF-�, IFN-�, miembros de la familia MIP, MCP-1, G-CSF, GM-CSF, etc.) contribuye a los síntomas y a la patología asociadas a las enteropatías inflamatorias, tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (CU) mediante su(s) efecto(s) sobre la activación de las vías inflamatorias y de las células efectoras posteriores. Estas vías y componentes conducen entonces a la destrucción o el daño de células y tejidos observada in vivo. Por lo tanto, este modelo simula este aspecto potenciado de mediador inflamatorio que tiene la enteropatía inflamatoria. Es más, cuando el tejido intestinal de los controles sanos o de las estirpes de células epiteliales intestinales (CEI) humanas se cultiva en presencia de estos componentes inflamatorios, se puede observar la señalización de las vías inflamatorias, así como indicios de daños celulares y tisulares.

Los tratamientos que podrían resultar eficaces para las enteropatías inflamatorias humanas in vivo también servirían en los modelos de CEI o ex vivo anteriores al inhibir o neutralizar la producción y/o presencia de mediadores inflamatorios.

En este modelo, el tejido intestinal humano se recoge de pacientes con una enteropatía inflamatoria o de controles sanos sometidos a una biopsia intestinal, a una resección o a la recolección del tejido en la autopsia, y se procesa con una modificación de Alexakis et al. (Gut 53: 85-90, 2004). En condiciones asépticas, las muestras se limpian cuidadosamente con una cantidad generosa de PBS y luego se cultivan en pequeñas secciones de tejido en presencia de medio de cultivo tisular completo (más antibióticos para evitar un crecimiento excesivo de bacterias). Las muestras del mismo grupo de trocitos de tejido se tratan con alguno entre: vehículo (PBS); IL-17A humana recombinante (rh); rhIL-17F; o rhIL-17A + rhIL-17F. Además, estas se tratan con o sin un antagonista de o bien IL-17A o bien IL-17F, juntos o por separado (tal como un IL-17RC soluble). Este protocolo experimental va seguido de estudios con estirpes de CEI humanas, con la excepción de que las células se cultivan a partir de los cultivos primarios existentes. Después de varios tiempos de cultivo (de 1 hora a varios días), se recogen los sobrenadantes y se les analiza la cantidad de mediadores inflamatorios, incluidos los recogidos más arriba. En las muestras de los pacientes con enteropatía inflamatoria o en las muestras tratadas con rhIL-17A y/o F, la concentración de citocinas y quimiocinas inflamatorias están elevadas en comparación con las muestras de tejido de controles sanos sin tratar. La adición de antagonistas de la actividad de IL-17F y/o IL-17A, tal como los receptores solubles IL17RC y los anticuerpos contra ellos que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano de la presente invención, reduce notablemente la producción de mediadores inflamatorios, y así se espera que sean eficaces contra las enteropatías inflamatorias humanas.

EJEMPLO 26 Los antagonistas de la actividad de IL-17F e IL-17A disminuyen la incidencia y la progresión de la enfermedad en un modelo de esclerosis múltiple (EM)

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad compleja que se cree que está mediada por numerosos factores, incluida la presencia de infiltrados inflamatorios de células mononucleares y linfocíticas, y la desmielinización del SNC. Los microgliocitos son células de tipo macrófago que pueblan el sistema nervioso central (SNC) y que se activan por lesiones o infecciones. Se ha asignado a los microgliocitos funciones importantes en diversas enfermedades del SNC, incluida la EM, y se podrían utilizar para estudiar el(los) mecanismo(s) de inicio, progresión y tratamiento de la enfermedad (Nagai et al., Neurobiol. Dis. 8: 1057-1068; 2001; Olson et al., J. Neurosci. Methods. 128: 33-43; 2003). Por lo tanto, las estirpes de microgliocitos humanos inmortalizados y/o las estirpes de astrogliocitos humanos establecidos se pueden utilizar para estudiar algunos de los efectos de los mediadores inflamatorios sobre estos tipos de células y su potencial para la neutralización. Los mediadores inflamatorios (incluidos pero sin limitarse a ellos, IL-1�, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A y F, IL-18, IL-23, TNF-�, IFN-�, miembros de la familia MIP, RANTES, IP-10, MCP-1, G-CSF, GM-CSF, etc.) pueden contribuir a los síntomas y a la patología asociada a la EM por medio de su(s) efecto(s) activadores de las vías inflamatorias y de las células efectoras posteriores.

Para evaluar las acciones proinflamatorias de la IL-17A y la IL-17F, y la capacidad de un antagonista de la actividad de la IL-17F y/o la IL-17A, tal como los receptores solubles del IL-17RC y los anticuerpos contra ellos, que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano y de la presente invención para neutralizar o disminuir estos efectos, se tratan los gliocitos cultivados con uno entre lo siguiente: vehículo; rhIL-17A; rhIL-17F; rhIL-17A + IL-17F. Además, se tratan con o sin un antagonista de IL-17A o de IL-17F, bien juntas o por separado (tal como un IL-17RC soluble). Después de varios tiempos de cultivo (de 1 hora a varios días), se recogen los sobrenadantes y las células y se analiza la concentración y/o la expresión de los mediadores inflamatorios, que incluyen los enumerados anteriormente. La concentración de las citocinas y quimiocinas inflamatorias está elevada en presencia de la rhIL-17A y/o la IL-17F en comparación con los cultivos tratados sólo con vehículo. La adición de antagonistas de la actividad de la IL-17F y/o de la IL-17A, tal como los receptores solubles del IL-17RC y los anticuerpos contra ellos, que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano de la presente invención, reduce notablemente la producción y la expresión de los mediadores inflamatorios y, por lo tanto, se podría esperar que fuera eficaz para los aspectos inflamatorios asociados a la EM humana.

EJEMPLO 27 Los antagonistas de la actividad de IL-17F e IL-17A disminuyen la incidencia y la progresión de la enfermedad en el modelo de artritis reumatoide (AR) y de artrosis.

Este modelo está diseñado para demostrar que los cultivos sinoviales humanos (que incluyen macrófagos sinoviales, fibroblastos sinoviales y condrocitos articulares) y explantes de pacientes con AR y artrosis producen una mayor cantidad de mediadores inflamatorios en comparación con los cultivos/explantes de los controles sanos. Esta producción reforzada de mediadores inflamatorios (incluidos, pero sin limitarse a ellos, oncostatina M, IL-�, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17A y F, IL-18, IL-23, TNF-�, IFN-�, IP10, RANTES, RANKL, miembros de la familia MIP, MCP-1, G-CSF, GM-CSF, óxido nítrico, etc.,) contribuye a los síntomas y la patología asociada a la AR y a la artrosis por medio de su(s) efecto(s) sobre la activación de las vías inflamatorias y de las células efectoras posteriores. A continuación, estos componentes y vías producen infiltrados inflamatorios, pérdida o destrucción del cartílago y de la matriz, disminución de la masa ósea e inducción de las prostaglandinas y las ciclooxigenasas. Por lo tanto, este modelo puede simular los aspectos inflamatorios destructivos de la AR y la artrosis en experimentos in vitro y ex vivo. Además, cuando los cultivos sinoviales y de explantes de controles sanos se hacen crecer en presencia de varios de estos compuestos inflamatorios (por ejemplo, oncostatina M, TNF-�, IL-1�, IL-6, IL-17A y F, IL-15, etc), se puede observar una transducción de señales a través de las vías inflamatorias. Los medicamentos que serían eficaces contra la AR humana in vivo funcionarían en los modelos anteriores in vitro y ex vivo al inhibir y/o neutralizar la producción y/o presencia de mediadores inflamatorios.

En este modelo, se recogen explantes sinoviales humanos de pacientes con AR, artrosis o de controles sanos que se someten a una artroplastia o de tejidos procedentes de autopsias y se procesan mediante una modificación de Wooley y Tetlow (Arthritis Res. 2: 65-70; 2000) y van't Hof et al., (Rheumatology 39: 1004-1008; 2000). También se estudian los cultivos de fibroblastos sinoviales, macrófagos sinoviales y condrocitos articulares. Las muestras replicadas se tratan con uno entre lo siguiente: vehículo (PBS); IL-17A recombinante humana (rh); rhIL-17F; o rhIL-17A + rhIL-17F y algunas muestras contienen varias combinaciones de oncostatina M, TNF�, IL-1�, IL-6, IL-17A, IL-17F e IL-15. Además, se tratan con o sin un antagonista de la actividad de la IL-17F y/o de la IL-17A, tal como los receptores solubles del IL-17RC y anticuerpos contra ellos que incluyen los anticuerpos monoclonales y neutralizantes anti-IL-17RC humano de la presente invención. Después varios tiempos de cultivo (de 1 hora a varios días), se recogen los sobrenadantes y se analiza la concentración de los mediadores inflamatorios, que incluye los enumerados anteriormente. En las muestras de pacientes con AR o artrosis, o en las muestras tratadas con rhIL-17A y/o F (solas o junto a otras citocinas inflamatorias), aumenta la cantidad de citocinas y quimiocinas inflamatorias en comparación con explantes de control sanos sin tratar o con cultivos de células sin tratar. La adición de los antagonistas de la actividad de la IL-17F y/o de la IL-17A, tal como los receptores solubles del IL-17RC y los anticuerpos neutralizantes de la presente invención, reduce notablemente la producción de los mediadores inflamatorios y, por lo tanto, se esperaría que fuera eficaz contra la AR y la artrosis humanas.

EJEMPLO 28 Respuestas funcionales de la IL-17A y de la IL-17F

Las células NIH-3T3/KZ142 se transfectaron establemente con el IL-17RCx1 humano (SEQ ID n.º 1) y el IL-17RCx1 de ratón (SEQ ID n.º 25). Tal y como se describió anteriormente, cada estirpe celular se trató durante 7 y 15 minutos con una dosis-respuesta de la IL-17A, la IL-17F, la IL-17F murina y los controles adecuados. La IL-17A y la IL-17F ofrecieron una respuesta dependiente de la dosis en los factores de transcripción MAPK p38 y I�B-� fosforilados cuando se transfectó con el IL-17RCx1 (SEQ ID n.º 1), aproximadamente un 30% mayor que la señalización inherente de la línea de control. La IL-17A y la IL-17F no hicieron aumentar la señalización cuando se transfectó con el IL-17RCx1 murino (SEQ ID n.º 25). La IL-17F murina no hizo aumentar la señalización ni con el IL-17RCx1 humano ni con el murino.

EJEMPLO 29 Expresión de IL-17A, IL-17F, IL-17RA e IL-17RC en modelos murinos de enfermedades

Se analizaron cuatro modelos de enfermedad murinos (asma, colitis inducida por DDS, dermatitis atópica y encefalomielitis alérgica experimental) mediante las técnicas conocidas para expresar IL-17A, IL-17F, IL-17R e IL-17RC.

En el modelo de asma, la IL-17A y la IL-17F se expresan a unos niveles muy bajos o incluso indetectables en los pulmones, el bazo, los ganglios linfáticos drenantes pulmonares y las células infiltrantes pulmonares en los ratones enfermos y los sanos. Se encontró que el mensajero de IL-17RC se expresaba mucho más en los pulmones en comparación con el bazo y los ganglios linfáticos, pero no estaba regulado por la enfermedad. El IL-17R se expresaba mucho más en el bazo y los ganglios linfáticos drenantes de los pulmones en comparación con el pulmón, pero tampoco estaba regulado por la enfermedad.

A diferencia de lo que ocurre en el modelo de asma, en el modelo de colitis inducida por DDS la IL-17A y la IL-17F estaban inducidas considerablemente en los ratones enfermos, pero no en los ratones normales en el colon proximal y en el distal. Ninguna citocina estaba considerablemente inducida en los ganglios linfáticos mesentéricos. Además, se encontró que ambas citocinas se inducían en el contexto de la colitis aguda inducida por DDS y no en la colitis crónica inducida por DDS. Se encontró que el IL-17R se expresaba considerablemente en los ganglios linfáticos mesentéricos en comparación con el colon proximal y el distal, pero que no estaba controlado por la enfermedad. En cambio, el IL-17RC se expresaba considerablemente mucho más en el tejido de colon distal proximal en comparación con los ganglios linfáticos mesentéricos. La expresión del IL-17RC tampoco estaba regulada por la enfermedad.

En la dermatitis atópica no se detectaba el ARNm de la IL-17A. Se encontró que la IL-17F se expresaba en la piel y en los ganglios linfáticos drenantes de la piel, pero no parecía estar controlada significativamente por la enfermedad. El ARNm del IL-17R se expresaba mucho más en los ganglios linfáticos drenantes de la piel en comparación con la piel, pero tampoco estaba regulado por la enfermedad. El IL-17RC se expresaba mucho más en la piel en comparación con los ganglios linfáticos drenantes de la piel, pero tampoco estaba regulado por la enfermedad.

En la encefalomielitis alérgica experimental, la IL-17A y la IL-17F parecían aumentar en la médula espinal en los ratones enfermos pero no en los ratones sanos. La IL-17F podría expresarse considerablemente más en los ganglios linfáticos en comparación con la médula espinal, pero la expresión en los ganglios linfáticos no estaba regulada por la enfermedad. Sin embargo, el nivel global de la expresión en estos tejidos era bastante bajo. El IL-17R se expresaba mucho más en el tejido de ganglio linfático en comparación con el cerebro y la médula espinal. No se analizó el IL-17RC.

En pocas palabras, la expresión de la IL-17A y la IL-17F parece estar regulada por la enfermedad en el contexto de la colitis inducida por la DDS y en los modelos de encefalomielitis alérgica experimental, pero aparentemente no en el asma ni en la dermatitis atópica. La expresión del IL-17R y del IL-17RC no parece estar regulada por la enfermedad, pero la expresión del IL-17R parece estar aumentada en los tejidos linfáticos mientras que la expresión del IL-17RC parece estar aumentada en los tejidos no linfoáticos.

EJEMPLO 30 El IL-17RC es un mediador de la activación de la IL-17A y la IL-17F

Se transfectó la estirpe celular murina para ensayo nih3t3/kz142.8 con un IL17RCx1 humano (SEQ ID n.º 2) en un vector de expresión con un gen de resistencia al metotrexato (la dihidrofolato reductasa, DHFR). El IL-17RA humano (SEQ ID n.º 21) se transfectó de igual forma en esta estirpe celular. Se realizaron las transfecciones con un kit disponible comercialmente y las recomendaciones del fabricante (Mirus, Madison, WI, n.º de catálogo MIR218). Se sembraron las células en medio de crecimiento modificado con MTX a 1 �M para seleccionar el vector de expresión que contiene las construcciones de expresión. Después de la selección se generaron los grupos de transfección y se llamaron nih3t3/kz142.8/hcytor14X1 y nih3t3/kz142.8/IL17R.

A) Ensayo de la luciferasa con las estirpes celulares basadas en nih3t3/kz142.8

Dado que las estirpes celulares basadas en nih3t3/kz142.8 tienen indicadores ap1/nfkb (kz142) estables, no es necesario añadir la infección con adenovirus a este indicador. Por lo tanto, se redujo el protocolo de ensayo de la luciferasa y se realizó del modo siguiente:

1. Siembra de las células en placas

Se sembraron las células a 5000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de color blanco opaco cubiertas por un cultivo celular (n.º de catálogo 3917, Costar) con DMEM/SBF al 10%, que contiene glutamina y se complementó con piruvato, y se cultivó una noche a 37ºC con CO2 al 5%. En ese segundo día, se retiró el medio de cultivo y se cambió por DMEM/SBF al 1%, que contiene glutamina y se complementó con piruvato, y se cultivó una noche a 37ºC con CO2 al 5%.

2. Ensayo de la luciferasa para medir la activación del indicador kz142 estable debida a las IL-17A y F

Después de incubar durante una noche en el medio DMEM/SBF al 1%, se prepararon diluciones de los ligandos IL-17A e IL-17F humanos en medio sin suero, complementado con SAB al 0,28%. Después de añadir las diluciones de ligandos, se incubaron las células a 37ºC con CO2 al 5% durante 4 horas, tras las cuales se retiró el medio, se lisaron las células durante 15 minutos y se midió la intensidad media de fluorescencia (IMF) con el sistema y los reactivos del ensayo de la luciferasa (catálogo n.º 1531 de Promega, Madison, WI) y un luminómetro de microplacas. Se detectó la actividad de ambos ligandos a unas concentraciones que oscilaban de 0,1 a 100 ng/ml.

Las CE50 descritas más adelante son promedios de al menos 4 experimentos. El grupo de transfección de nih3t3/kz142.8/hcytor14x1 mostró una actividad similar para el ligando de la IL-17A murina del mismo modo que la estirpe celular parental, con una CE50 de unos 4 ng/ml (ejemplo 14). El hecho de que la señalización de la mIL17A en la estirpe recombinante hcytor14x1 sea comparable a la de la estirpe celular parental (ejemplo 14) sugiere que la IL-17A murina señaliza probablemente a través de los receptores IL-17RA o IL-17RC endógenos de las células nih3t3 murinas y que no activa las células a través de hcytor14x1. Sin embargo, el grupo transfectante con el hIL-17RCx1 mostró una capacidad de respuesta elevada al tratamiento con la IL17A humana, con una CE50 de 0,41 ng/ml frente a 2,8 ng/ml (promedios de 4 experimentos) en la estirpe parental (una CE50 6,8 veces más potente en la estirpe recombinante). Además, la estirpe recombinante hIL-17RCX1 tenía aumentada la capacidad de respuesta a la hIL-17F, con una CE50 de 0,61 ng/ml en el recombinante frente a 10 ng/ml en la estirpe parental (una CE50 17 veces más potente en la estirpe recombinante). El aumento de la potencia de las hIL-17A y F en la estirpe hIL-17RCx1 es coherente con que el IL-17RCx1 humano sea un receptor con gran afinidad por la IL-17A y por la IL-17F humanas. En cambio, la estirpe recombinante hIL-17RA vio incrementada su sensibilidad sólo a la hIL-17A, con una CE50 de 0,6 ng/ml frente a 2,8 ng/ml para la estirpe parental. No hubo un refuerzo de la CE50 para la hIL-17F en la estirpe recombinante con el hIL-17RA, con una CE50 para la IL-17F de 12,4 ng/ml frente a 8,9 ng/ml en la estirpe parental.

Este resultado es significativo porque implica específicamente al hIL-17RCx1 como un mediador de la activación de la hIL-17A y la hIL-17F, y sugiere que el hIL17RA interviene en la señalización sólo para la activación por la hIL-17A y no por la hIL-17F.

EJEMPLO 31 Administración intravenosa de la IL-17A y la IL-17F

Se determina el efecto de la administración por vía intravenosa de la IL-17A o de la IL-17F humanas o murinas sobre los hemogramas completos y las citocinas/quimiocinas en el suero de ratones BALB/c en distintos momentos.

La administración por vía intravenosa de 1 µg de la mIL-17A dio lugar a un aumento de unas 2 veces del número de neutrófilos en circulación (mediante hemograma completo) y un aumento de unas 10 veces de KC y de MCP-1 (mediante Luminex) en el suero de 1 a 2 horas después de la administración; se observaron unos resultados similares en estas quimiocinas con 5 µg de la IL-17A. La cantidad de monocitos en la sangre también aumentó significativamente en los ratones tratados con 1 µg de mIL-17A (mostró el mayor aumento), 5 µg de hIL-17A o 5 µg de hIL-17F a las 2 horas. La administración por vía intravenosa de la IL-17F humana y la murina dio lugar a un aumento notable de la IL-15 en el suero (mediante Luminex) a los tiempos de 1 y 2 horas, y unos aumentos pequeños de KC y de MCP-1 en el suero en los mismos tiempos.

EJEMPLO 32

Neutralización de la administración por vía intravenosa de la IL-17A y la

IL-17F

Se neutralizan los aumentos de las citocinas y de las quimiocinas mediados por la administración i.v. de IL-17A y de IL-17F con receptores solubles por vía i.p. (mIL-17RA:Fc para los ligandos murinos; IL-17RC humano soluble para los ligandos humanos). A las ratonas BALB/c hembra se les administró mediante inyección i.p. en PBS, 100 µg de mIL-17RA:Fc, o 100 µg de IL-17RC humano soluble tres horas antes de administrar una inyección por vía intravenosa en la cola de PBS; 2 µg de mIL-17A o de mIL-17F, o 2 µg de mIL-17A y F (para las ratonas que recibieron mIL-17RA:Fc); o 2 µg de hIL-17A o de hIL-17F o 2 µg de hIL-17A y F (para las ratonas que recibieron el IL-17RC humano soluble). Se recogió el suero 1 h después de la administración del ligando y se analizó un número pequeño de citocinas y quimiocinas en el suero.

Las ratonas tratadas previamente con el receptor soluble por vía i.p. redujeron notablemente los aumentos mediados por la IL-17A en las concentraciones de IL-17A y de KC en el suero en comparación con las ratonas tratadas con PBS + IL-17A.

EJEMPLO 33 Ensayos de unión a proteínas en placa de los polipéptidos solubles IL17RC e IL-17RC/IL-17RA

El formato del Capture EIA es el siguiente: se recubre la placa de ELISA con anti-IgG humana de cabra a 1 µg/ml y se incuba una noche a 4ºC. La placa se lava y se bloquea con 200 µl por pocillo de SAB al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava, se añaden las diluciones seriadas (de 100 µg/ml a 0,1 µg/ml) de las variantes del receptor soluble (A1586F, A1587F) o de IL-17RCx1 (A1034F) a la placa y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava, se añade el ligando marcado con biotina a 10:1 (IL-17A) o a 6:1 (IL-17F) y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava, se añade estreptavidina-peroxidasa de rábano picante a 0,5 µg/ml y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava, se añade sustrato TMB durante 4 minutos. Se para la reacción añadiendo la solución de parada (nota: todos los volúmenes de los reactivos fueron 50 µl por pocillo a menos que se indique otra cosa). Un resultado positivo serían valores de DO elevados, en general por encima de 0,5. Los resultados indicaron que la construcción 1342 (SEQ ID n.º 74) no se une a la IL-17A y se une débilmente a la IL-17F en este ensayo. La construcción 1341 (SEQ ID n.º 72) se une a la IL-17A y a la IL-17F con mucha fuerza. La IL-17RCx1 se une a la IL-17A y a la IL-17F.

El formato del EIA de neutralización es el siguiente: se recubre la placa de ELISA con el receptor soluble (A1034F) a 1 µg/ml y se incuba durante una noche a 4ºC. La placa se lava y se bloquea con 200 µl de SAB al 1% por pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente. Mientras se está bloqueando, en una placa diferente, se incuban las diluciones en serie (desde 50 µg/ml a 0,05 µg/ml) de las variantes del receptor soluble (A1586F, A1587F) con el ligando marcado con biotina a 10:1 (IL-17A)

o a 6:1 (IL-17F) en volúmenes iguales durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa bloqueada se lava, se le añade el complejo receptor-ligando a la placa bloqueada y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava, se añade estrepavidina–peroxidasa de rábano picante a 0,5 µg/ml y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente. Se lava y se añade el sustrato TMB durante 7 minutos. Se para la reacción añadiendo la disolución de parada (nota: todos los volúmenes de los reactivos eran 50 µl por pocillo a menos que se indique otra cosa). Un resultado positivo serían valores de DO bajos, por lo general por debajo de 0,5. Los resultados indicaron que la construcción 1342 (SEQ ID n.º 74) neutralizaba débilmente la unión de la IL-17A al IL-17RCx1 y que neutralizaba fuertemente la unión de la IL-17F al IL17RCx1. La construcción 1341 (SEQ ID n.º 72) neutralizaba débilmente la unión de la IL-17A al IL-17RCx1 y neutralizaba débilmente la unión de la IL-17F al IL-17RCx1. La neutralización indica que la variante de la proteína se está uniendo al ligando biotinilado.

EJEMPLO 34 Protocolo del ensayo de unión con FACS

Para evaluar la capacidad de los polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solubles de la presente invención para unirse a los ligandos IL-17A e IL-17F, se utilizó un ensayo de unión competitivo basado en citometría de flujo. La incubación de una estirpe de células BHK transfectada establemente con el IL-17RCx4 completo en presencia de los ligandos IL-17A o IL-17F, y el receptor soluble destinado a unirse selectivamente a los ligandos permite detectar el ligando unido a la superficie celular (y por lo tanto, sin unir al receptor soluble) y su cuantificación relativa. La biotinilación del ligando permite detectarlo por FACS mediante un fluoróforo secundario conjugado a estreptavidina. Una reducción del ligando unido a la célula sobre una valoración del receptor soluble se registra como una reducción de la fluorescencia media de las células. Los ligandos biotinilados se mezclan de antemano por separado a 1 µg/ml con cantidades valorables del receptor soluble en medio de tinción (HBSS + SAB al 1% + NaAzida al 0,1% + HEPES a 10 mM) en volúmenes de 100 µl y se incuban a TA durante 15 minutos. Se prepara una estirpe de células BHK transfectada establemente con el IL17RCx4 completo para teñir el ligando mediante la resuspensión con Versene (Invitrogen, n.º de catálogo 15040-066), el equilibrado a 2 x 105 células/100 µl, la sedimentación y la resuspensión en la premezcla de receptor soluble/ligando. Se incuban las células teñidas a 4ºC durante 30 minutos, se lavan 1x en medio de tinción y se tiñen con estreptavidina-PE (BD Pharmingen, n.º de catálogo 554061) a una proporción de 1:100. Se incuban las células a 4ºC en la oscuridad durante 30 minutos, se lavan 2x en medio de tinción y se resuspenden en medio de tinción y Cytofix® (BD Bioscience 554655) a una proporción de 1:1. Se utiliza un citómetro de flujo LSRII de BD o un instrumento similar para recoger los datos y realizar el análisis. La figura 5 describe un gráfico estándar. Se genera el gráfico utilizando el programa informático Prizm. Los valores en Y representan la IMF normalizada por el máximo y el mínimo (100% y 0%) según los pocillos de control que contienen solo el ligando y sin ligando ni receptor soluble y, por lo tanto, el porcentaje de unión del ligando a las células. El programa informático calcula el CI50 de cada curva.

EJEMPLO 35 Inhibición de la unión específica de la IL-17A y de la IL-17F humanas biotiniladas con un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble

El ensayo de unión utilizado para determinar la capacidad de los polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solubles para unirse a IL-17A e IL-17F se describe en la presente memoria. Se realizan estudios de unión tal y como se explicó anteriormente, excepto que se incluyeron en la reacción de unión polipéptidos solubles adicionales, tal como las SEQ ID n.º 157 y 158. Este polipéptido soluble inhibió que tanto de la IL17A como de la IL-17F humanas se unieran a las células BHK transfectadas con IL17RC en la misma medida que la proteína de fusión IL-17RCx1-Fc humana soluble (SEQ ID n.º 64). Los demás polipéptidos solubles, incluidos el polipéptido soluble de las SEQ ID n.º 157 y 158, se incluyen en la tabla 9 que viene a continuación.

Tabla 9*

Polipéptido soluble

Variante CI50-IL17A Polipéptido Variante CI50-IL17F

IL-17RA/RC

1407 7 1L-17RC 1390 9

IL-17RA/RC

1407 9 IL-17RA/RC 1454 18

IL-17RA/RC

1454 4 IL-17RA/RC 1454 31

IL-17RA/RC

1454 17 IL-17RA/RC 1454 95

IL-17RA7RC

1454 20 IL-17RA/RC 1407 33

IL-17RC

1390 12 IL-17RA/RC 1407 42

IL-17RA/RC

1341 30 IL-17RC 1210 31

IL-17RC

1210 35 IL-17RC 1210 61

IL-17RC

1210 47 IL-17RC 1210 67

IL-17RC

1210 74 IL-17RA/RC 1341 47

IL-17RC

1459 126 IL-17RC 1459 103

IL-17RC

1342 217 IL-17RC 1342 313

EJEMPLO 36 Afinidad de unión de los polipéptidos solubles IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA a IL-17A e IL-17F

* CI50 (ng/µl) de unión competitiva con células; las construcciones están ordenadas desde las que unen con más fuerza a las más débiles según la CI50 para cada ligando.

5

Se analizó la afinidad de unión de IL-17RCx1, IL-17RA y el polipéptido soluble

10 IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID n.º 157 y 158) frente a las IL-17A e IL-17F de la siguiente forma: se diluyó el anticuerpo específico de cabra anti-Fc de IgG humana (Jackson n.º de catálogo 109-005-008) a 50 µg/ml en acetato de sodio a pH 5,0 y se inmovilizó sobre un chip de Biacore CM5. Se optimizó el protocolo para capturar el receptor a una unión teórica máxima antes de inyectar una serie de concentraciones de cada

15 ligando para observar la asociación y la disociación. Se analizó la unión de los receptores solubles y del polipéptido IL-17RC/IL-17RA a una serie de concentraciones de cada ligando. Se regeneró la superficie con 2 inyecciones de 30 segundos de glicina a pH 1,75 entre ciclos. Se evaluaron los datos utilizando el programa

120 informático de evaluación de Biacore para definir los valores cinéticos, y se muestran en la tabla 10 que viene a continuación. Tabla 10*

Afinidad del IL-17RCx1 humano por la IL-17A humana 05-2005

ka (1/MS)

kd(1/s) KD (M) Rmax (UR) Ji2 (UR2)

1,05E+06

4,90E–04 4,69E–10 9,02 0,424

1,24E+06

4,38E–04 3,52E–10 8,86 0,324

Afinidad del IL-17RCx1 humano por la IL-17F humana 05-2005

ka (1/Ms)

kd(1/s) KD(M) Rmax (UR) Ji2(UR2)

9,91E+05

4,31E–04 4,35E–10 7,22 0,378

1,11E+06

3,84E–04 3,46E–10 7,57 0,549

Afinidad del polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble por la IL-17A humana 04-2006

ka (1/Ms)

kd (1/s) KD (M) Rmax (UR) Ji2 (UR2)

1,42E+06

6,22E–05 4,39E–11 20,5 0,460

2,61E+06

9,95E–05 3,82E–11 18,3 0,888

Afinidad del polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble por la IL-17F humana 04-2006

ka (1/Ms)

kd (1/s) KD (M) Rmax (UR) Ji2 (UR2)

1,82E+06

2,61E–04 1,43E–10 10,2 0,495

2,49E+06

3,15E–04 1,26E–10 11,2 0,544

Afinidad del IL-17RA humano por la IL-17A humana 06-2006

ka (1/Ms)

kd (1/s) KD (M) Rmax (UR) Ji2 (UR2)

3,70E+05

8,65E–05 2,34E–10 29,5 0,249

2,89E+05

8,57E–05 2,96E–10 35,1 0,197

Afinidad del IL-17RA humano por la IL-17F humana 07-2006

ka (1/Ms)

kd (1/s) KD (M) Rmax (UR) Ji2 (UR2)

2,09E+04

5,56E–04 2,66E–08 20,3 0,071

2,55E+04

4,40E–04 1,72E–08 9,9 0,076

*Se muestran las constantes de equilibrio y de velocidad, y los valores caen dentro de los límites de la máquina. Ji2 se refiere a la suma de los cuadrados de los residuales entre las curvas de unión y las curvas de ajuste de evaluación. Cuanto más cerca del 0, más confianza tendremos en los datos. Estos datos tienen una buena fiabilidad.

Estos datos demuestran que la IL-17A humana y la IL-17F humana se unen al IL-17RA humano y al IL-17RC humano. Específicamente, el IL-17RC humano muestra una afinidad de unión similar para la IL-17A humana y la IL-17F humana con unas constantes de equilibrio de disociación (KD) en el intervalo de 400 pM. El polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble se une a la IL-17A humana con una afinidad ligeramente mayor, con una KD de ~40 pM, que a la IL-17F humana, con una KD de ~140 pM. El IL-17RA humano produjo la mayor discrepancia de afinidad de unión por el ligando, con una diferencia de 100 veces entre la IL-17A humana, con una KD de ~300 pM, y la IL-17F humana, con una KD de ~30 nM.

EJEMPLO 37 Creación de las estirpes celulares indicadoras para ensayo IL17RA/NIH3T3/KZ142.8 e IL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8 con receptor humano recombinante

La estirpe celular indicadora NIH3T3/KZ142.8 murina descrita en la presente memoria se utilizó para crear nuevas estirpes celulares de ensayo, recombinantes para el IL-17RA (SEQ ID n.º 21) o el IL-17RCx4 (SEQ ID n.º 166) humanos. Se llevó a cabo mediante la transfección de estas células con construcciones de expresión que contienen cada uno de estos ADNc. Se utilizó el vector de expresión pzmp11, que contiene el gen de la dihidrofolato reductasa. Por lo tanto, se seleccionaron los transfectantes con metotrexato a 1 µM añadido al medio de crecimiento para crear grupos estables. Estas estirpes celulares de ensayo se llamaron hIL17RA/NIH3T3/KZ142.8 y hIL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8.

EJEMPLO 38 Un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble antagoniza la activación de la IL17A humana sobre las células rhIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8

La eficacia de la competición del polipéptido soluble IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID n.º 157 y 158) por la activación de la IL-17A humana sobre las células del hIL-17RA recombinante/NIH3T3/KZ142.8 se midió del siguiente modo: la siembra en placas de las células y la preparación para un ensayo de la luciferasa fueron tal y como se ha descrito en la presente memoria. El día del ensayo, a estas células se les dio primero una serie de dosis al doble por triplicado de un volumen de receptores solubles a 2 veces la concentración final, incluido el polipéptido soluble anterior, el IL-17RA y el IL17RC, comenzando a 2 µg/ml (que da lugar a una concentración final de 1 µg/ml una vez combinado con el ligando). A continuación, se aplicó un volumen de la IL-17A a 1 ng/ml, que es 2 veces la concentración final de 0,5 ng/ml que se obtiene al mezclar juntos el receptor y un ligando. Se determinó la activación máxima utilizando una serie por triplicado que recibió 0,5 ng/ml de IL-17A sin receptor. Se determinó la activación basal utilizando con una serie por triplicado que recibió sólo el medio de ensayo que no contenía ni ligando ni receptor soluble. El análisis de los datos reveló que la CI50 era de 7 ng/ml para la activación por la IL-17A de la estirpe celular anterior mediante el polipéptido soluble. No tenían una potencia suficiente ni el IL-17RA ni el IL-17RC solubles para antagonizar convincentemente la activación de la hIL-17A a 0,5 ng/ml sobre esta estirpe celular, incluso con la dosis más alta del receptor soluble, que fue de 1 µg/ml.

EJEMPLO 39 El polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble antagoniza la activación de la IL17F humana sobre las células rhIL-17RA/NIH3T3/KZ142.8

La eficacia de la competición del polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 157 y 158) por la activación de la IL-17F humana de las células hIL-17RA recombinante/NIH3T3/KZ142.8 (descrito anteriormente) se midió del siguiente modo: la siembra en placa de las células y la preparación del ensayo de la luciferasa fueron tal y como se ha descrito en la presente memoria. El día del ensayo, a estas células se les dio primero una serie de dosis al doble por triplicado de un volumen del polipéptido soluble a 2 veces la concentración final, incluido el péptido soluble anterior, el IL-17RA y el IL-17RC comenzando a 4 µg/ml (lo que da lugar a una concentración final a 2 µg/ml una vez combinado con el ligando). A continuación se aplicó un volumen de la IL-17F a 40 ng/ml, que es 2 veces la concentración final de 20 ng/ml que se obtiene al mezclar juntos un ligando y el receptor. Se determinó la activación máxima utilizando un conjunto por triplicado que recibió 20 ng/ml de la IL-17F sin el receptor. Se determinó la activación basal utilizando una serie por triplicado que recibió sólo medio de ensayo que no contenía ni ligando ni receptor soluble. El análisis de los datos reveló que el polipéptido soluble IL-17RC/IL-17RA tenía una CI50 de 0,48 µg/ml para la activación de la IL-17F sobre la estirpe celular anterior. No tenían suficiente potencia ni el IL-17RA ni el IL-17RC solubles para mostrar algún antagonismo de la activación de la IL-17F a 20 ng/ml sobre esta estirpe celular, incluso con la dosis más alta del receptor soluble, que fue 2 µg/ml.

EJEMPLO 40 Un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble antagoniza la activación de la IL17F humana sobre las células rhIL-17RCx4/NIH3T3/KZ142.8

La eficacia de la competición del polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 157 y 158) por la activación de la IL-17F sobre las células hIL-17RCx4 recombinante/NIH3T3/KZ142.8 (descrito más arriba) se midió del siguiente modo: la siembra en placa de las células y la preparación de ensayo de la luciferasa fueron tal y como se describió en la presente memoria. El día del ensayo, a estas células se les dio primero una dosis seriada por 5 por triplicado de un volumen de los receptores solubles a 2 veces la concentración final, incluidos el polipéptido soluble anterior, el IL17RA y el IL-17RC, comenzando a 4 µg/ml. A continuación, se aplicó un volumen del lote A1275F de la IL-17F a 2 ng/ml, que es 2 veces la concentración final de 1 ng/ml que se obtiene al mezclar juntos un ligando y el receptor. Se determinó la activación máxima con una serie por triplicado que recibió 1 ng/ml de la IL-17F sin el receptor. Se determinó la activación basal mediante una serie por triplicado que recibió medio del ensayo sólo que no contenía ni ligando ni receptor soluble. El análisis de los datos reveló que la CI50 de la activación del IL-17F era de 0,8 µg/ml para el polipéptido IL17RC/IL-17RA soluble, de 6 µg/ml para el IL-17RC, y que el IL-17RA no presentaba ningún antagonismo en ninguna dosis.

EJEMPLO 41 El polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble neutraliza la actividad de la IL-17A y la IL-17F humanas que induce el G-CSF, la IL-6 y la IL-8

Se trataron células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas (CEVRP) humanas con la IL-17A humana o con la IL-17F humana, y se recogieron los sobrenadantes a las 48 horas. Se analizaron estos sobrenadantes y mostraron que la inducción del G-CSF, de la IL-6 y de la IL-8 era dependiente de la dosis, tal y como se muestra en la tabla 11 que viene a continuación:

Tabla 11

Veces de inducción en sobrenadantes de 48 horas

G-CSF

IL-6 IL-8

CEVRP tratadas con: hIL-17A a 50 ng/ml a 10 ng/ml a 2 ng/ml a 0,4 ng/ml

26 24 14 13 13 14 8 8 8 6 3 3

hIL-17F a 250 ng/ml a 50 ng/ml a 10 ng/ml a 2 ng/ml

15 10 8 4 11 8 8 5 4 3 2 2

También se trataron las CEVRP con dosis de 0,01 a 10 µg/ml del polipéptido

5 soluble IL-17RC/IL-17RA (SEQ ID n.º 157 y 158) en politerapia con la IL-17A humana a 10 ng/ml o la IL-17F humana a 50 ng/ml (se incubaron el ligando y el polipéptido soluble juntos durante 30 minutos a 37ºC antes de añadirlo a las células) y se recogieron los sobrenadantes a las 48 horas. Tal y como se muestra en la tabla 12 a continuación, estos sobrenadantes mostraron una disminución del G-CSF, la IL-6 y la

10 IL-8, lo que demuestra que el polipéptido soluble IL-17RC/IL-17RA también fue capaz de neutralizar con eficacia la actividad inductora de estas citocinas que tienen la IL17A humana y la IL-17F humana. Adviértase que no se pudieron determinar los valores de CI50 para la neutralización de la IL-6, porque con la dosis más baja analizada (0,01 µg/ml) del polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble, la neutralización sólo

15 había regresado a aproximadamente al 50% del máximo.

Tabla 12

El receptor IL-17RA/RC soluble neutraliza la actividad de la hIL-17A/F:

CI50 del IL-17RA/RC (µg/ml)

Inducción del G-CSF por la hIL-17A (10 ng/ml) Inducción del G-CSF por la hIL-17F (50 ng/ml)

0,14 1,20

Inducción de la IL-8 por la hIL-17A (10 ng/ml) Inducción de la IL-8 por la hIL-17F (50 ng/ml)

0,03 0,57

Inducción de la IL-6 por la hIL-17A (10 ng/ml) Inducción de la IL-6 por la hIL-17F (50 ng/ml)

Neutralizado el 94% a 10 µg/ml Neutralizado el 49% a 0,01 µg/ml Neutralizado el 72% a 10 µg/ml Neutralizado el 57% a 0,01 µg/ml

EJEMPLO 42 5 Eficacia de los polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solubles en muestras de esclerosis múltiple humana

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad compleja que se cree que está mediada por numerosos factores, incluida la presencia de infiltrados inflamatorios de células linfocíticas y mononucleares y la desmielinización por todo el sistema nervioso

10 central (SNC). Los microgliocitos son células de tipo macrófago que pueblan el SNC y que se activan con una lesión o infección. Los microgliocitos y los neurogliocitos desempeñan funciones decisivas en varias enfermedades del SNC, incluida la EM, y se pueden utilizar para estudiar el(los) mecanismo(s) de inicio, progresión y tratamiento de la enfermedad (Nagai et al., Neurobiol. Dis. 8:1057-1068; 2001; Olson

15 et al., J. Neurosci. Methods, 128:33-43; 2003; Giuliani et al., J. Neuroimmunol. 165: 8391; 2005). Por lo tanto, se pueden utilizar cultivos primarios de células neuronales, estirpes de microgliocitos humanos inmortalizados y/o estirpes establecidas de astrogliocitos humanos para estudiar los efectos de los mediadores inflamatorios sobre estos tipos de células y su capacidad de neutralización. Los mediadores inflamatorios

20 (incluidos, pero sin limitarse a ellos, IL-1�, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A y F, IL18, IL-23, TNF-�, IFN-�, miembros de la familia MIP, RANTES, IP-10, MCP-1, G-CSF, GM-CSF, etc.) pueden contribuir a los síntomas y la patología asociada a la EM por medio de su(s) efecto(s) activador de las vías inflamatorias y de las células efectoras posteriores.

Para evaluar las acciones proinflamatorias de la IL-17A y de la IL-17F sobre estos tipos de células, y la capacidad de los polipéptidos solubles de la presente invención, tal como el polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158), para neutralizar o hacer disminuir estos efectos, se tratan las células neuronales o los neurogliocitos cultivados con uno entre los siguientes: vehículo; rhIL-17A; rhIL-17F; rhIL-17A + IL-17F. Además, se tratan con o sin un polipéptido soluble de la presente invención, tal como el polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158). En un conjunto independiente de cultivos, los linfocitos T en circulación aislados a partir de pacientes humanos y activados con anti-CD3 se añaden a los neurogliocitos y a las células neuronales que se están cultivando en ausencia de IL-17A o IL-17F exógenos, lo que proporciona un método de cocultivo para investigar los efectos destructivos de los linfocitos T activados sobre estos tipos de células. Los linfocitos T se tratan con o sin un polipéptido soluble de la presente invención, tal como el polipéptido IL-17RC/IL17RA soluble (SEQ ID n.º 158). Después de diferentes tiempos en cultivo (de 1 hora a varios días), se recogen los sobrenadantes y las células y se analiza la concentración y/o la expresión de los mediadores inflamatorios, que incluyen los enumerados anteriormente, y también se analiza la supervivencia celular. La cantidad de citocinas y quimiocinas inflamatorias, y la muerte de las células neuronales, aumentan en presencia de la rhIL-17A y/o la IL-17F en comparación con los cultivos tratados únicamente con vehículo. La adición de un polipéptido soluble de la presente invención, tal como el polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º158), reduce notablemente la producción y la expresión de mediadores inflamatorios en estos cultivos y hace aumentar la supervivencia celular de las células neuronales.

Por lo tanto, dado que estos experimentos ex vivo demuestran que un polipéptido soluble de la presente invención, tal como el polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158) puede reducir las acciones destructivas e inflamatorias que están asociadas a la patobiología de la EM humana, se podría esperar que el tratamiento con tales polipéptidos solubles fuera eficaz a la hora de reducir los aspectos inflamatorios, la muerte neuronal y/o la desmielinización asociada a la EM humana.

EJEMPLO 43 Eficacia de los polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solubles en muestras de artritis reumatoide (AR) y de artrosis humanas

Estos modelos están diseñados para mostrar que los cultivos sinoviales humanos (incluidos los macrófagos sinoviales, los fibroblastos sinoviales y los condrocitos articulares) y los explantes de pacientes con AR y con artrosis producen una mayor cantidad de mediadores inflamatorios en comparación con los cultivos/explantes de controles sanos que, a su vez, pueden contribuir a degradar los componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, hueso, cartílago, etc.) que es el distintivo de estas enfermedades. Además, los modelos de cocultivo descritos más adelante están diseñados para mostrar que los mediadores inflamatorios presentes en el líquido sinovial de la AR/artrosis y/o los linfocitos T activados también pueden dar lugar a una mayor inflamación y a la degradación de la matriz.

El aumento de la producción de los mediadores inflamatorios (incluidos, pero sin limitarse a ellos, oncostatina M, IL-1�, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17 y F, IL-18, IL23, TNF-�, IFN-�, IP-10, RANTES, RANKL, los miembros de la familia MIP, MCP-1, MMP-9, G-CSF, GM-CSF, óxido nítrico, etc.) contribuye a los síntomas y a la patología asociada a la AR y a la artrosis por medio de su(s) efecto(s) activadores de las vías inflamatorias y de las células efectoras posteriores. A continuación, estas vías y componentes conducen a infiltrados inflamatorios, pérdida/destrucción de cartílago y de matriz, la pérdida de masa ósea y la inducción de las metaloproteasas de la matriz, las prostaglandinas y las ciclooxigenasas. Por lo tanto, estos modelos pueden simular los aspectos inflamatorios destructivos de la AR y de la artrosis en experimentos in vitro y ex vivo. Además, cuando los explantes y los cultivos sinoviales de controles sanos se cultivan en presencia de componentes inflamatorios añadidos exógenamente (por ejemplo, oncostatina M, TNF-�, IL-1�, IL-6, IL-17A y F, IL-15, etc.), o, alternativamente, en presencia de líquido sinovial de pacientes con AR (que contendrían componentes inflamatorios endógenos), se puede observar una señalización de las vías inflamatorias y degradativas. Los medicamentos que serían eficaces contra la AR humana in vivo funcionarían en los modelos in vitro y ex vivo al inhibir y/o neutralizar la producción y/o presencia de los mediadores inflamatorios.

En estos modelos, se recogen explantes sinoviales humanos de pacientes con AR, artrosis o de controles sanos que se someten a una artroplastia o de muestras recogidas de tejido de autopsia, y se procesan mediante una modificación de Wooley y Tetlow (Arthritis Res. 2: 65-70; 2000) y van't Hof et al. (Rheumatology 39: 1004-1008; 2000). También se estudian los cultivos de fibroblastos sinoviales, macrófagos sinoviales y condrocitos articulares. Las réplicas de las muestras se tratan con uno entre los siguientes: vehículo (PBS); IL-17A recombinante humana (rh); rhIL-17F o rhIL-17A + rhIL-17F, y algunas muestras contienen distintas combinaciones de oncostatina M, TNF-�, IL-1�, IL-6, IL-17A, IL-17F e IL-15. Se tratan una serie de muestras independientes con linfocitos T humanos activados, o líquido sinovial de controles sanos o pacientes con AR o artrosis. Además, todas estas muestras se tratan con o sin un polipéptido soluble de la presente invención, como un polipéptido IL-17RC soluble o un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158). Después de variar el tiempo del cultivo (de 1 hora a varios días), se recogen los sobrenadantes y las células y se analiza la concentración de los mediadores inflamatorios y los biomarcadores de cartílago/hueso/matriz, incluidos los enumerados más arriba. En las muestras de pacientes con AR o artrosis, o en muestras tratadas con líquido sinovial de AR/artrosis, con linfocitos T activados, con la rhIL-17A y/o la rhIL-17F (solas o en politerapia con otras citocinas inflamatorias), aumenta la concentración de las citocinas y quimiocinas inflamatorias y de los marcadores de degradación del cartílago/hueso/matriz en comparación con los explantes de controles sanos sin tratar

o en cultivos de células sin tratar. La adición de un polipéptido soluble de la presente invención reduce notablemente la producción de los mediadores inflamatorios y degradantes del cartílago/hueso/matriz y, por lo tanto, se esperaría que fueran eficaces en la AR y la artrosis humanas.

EJEMPLO 14 Eficacia de los polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solubles en muestras de enteropatías inflamatorias humanas a través de cultivos de biopsias de las mucosas.

Este modelo está diseñado para demostrar que el tejido intestinal cultivado de pacientes con enteropatía inflamatoria produce una mayor cantidad de mediadores inflamatorios en comparación con los tejidos de controles sanos. Este aumento de la producción de mediadores inflamatorios (incluidos, pero sin limitarse a ellos, IL-1�, IL4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A y F, IL-18, IL-23, TFN-�, IFN-�, miembros de la familia de la MIP, MCP-1, G-CSF, GM-CSF, etc.) contribuye a los síntomas y la enfermedad asociada a las enteropatías inflamatorias tal como la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) por medio de su(s) efecto(s) sobre la activación de las vías inflamatorias y de las células efectoras posteriores. A continuación, estas vías y componentes conducen a la destrucción/daño celular y del tejido observados in vivo. Por lo tanto, este modelo puede simular este aspecto potenciador de la mediación inflamatoria que tienen las enteropatías inflamatorias. Además, cuando el tejido intestinal de los controles sanos o de estirpes de las células epiteliales intestinales (CEI) humanas se cultiva en presencia de estos componentes inflamatorios, se puede observar la señalización de las vías inflamatorias así como indicios de daño celular y del tejido.

Los medicamentos que serían eficaces contra las enteropatías inflamatorias humanas in vivo funcionarían en modelos de CEI o ex vivo mencionados anteriormente al inhibir y/o neutralizar la producción y/o presencia de los mediadores inflamatorios.

En este modelo se recoge tejido intestinal humano de pacientes con enteropatías inflamatorias o de controles sanos que se someten a una biopsia intestinal, a una resección o a una recogida tejido en la autopsia, y se procesan utilizando una modificación de Alexakis et al (Gut 53: 85-90; 2004). En condiciones asépticas, se limpian suavemente las muestras con una gran cantidad de PBS y luego se cultivan cortes troceados del tejido en presencia de medio de cultivo de tejidos completo (más antibióticos para evitar el crecimiento de bacterias). Las muestras del mismo conjunto de tejido troceado se tratan con uno entre los siguientes: vehículo (PBS); IL-17A humana recombinante (rh); rhIL-17F; o rhIL-17A + rhIL-17F. Además, se tratan con o sin un polipéptido soluble de la presente invención, tal como un polipéptido IL-17RC soluble o un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158). Después de este protocolo experimental se realizan estudios con estirpes de CEI humanas, con la salvedad de que se hacen pases de las células a partir de los cultivos primarios existentes. Después de diferentes tiempos del cultivo (de 1 hora a varios días), se recogen los sobrenadantes y se analiza la concentración de los mediadores inflamatorios, incluidos los enumerados anteriormente. En las muestras de pacientes con enteropatías inflamatorias o en las muestras tratadas con la rhIL-17A y/o F, aumenta la concentración de las citocinas y quimiocinas inflamatorias en comparación con las muestras de tejido de controles sanos sin tratar. La adición de un polipéptido soluble de la presente invención reduce considerablemente la producción de los mediadores inflamatorios y, por lo tanto, se esperaría que fuera eficaz contra las enteropatías inflamatorias humanas.

Un grupo adicional de este estudio puede incluir comparaciones de la producción de los mediadores inflamatorios de biopsias de tejido de pacientes con enteropatías inflamatorias que se someten a un tratamiento eficaz y de los que actualmente no toman medicación o que se considera que no responden al tratamiento.

EJEMPLO 45 Eficacia de los polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solubles en muestras de enteropatías inflamatorias humanas a través de la función de barrera epitelial

El mantenimiento de la integridad de la barrera epitelial es un factor decisivo para que el tubo digestivo se conserve sano. Las pruebas experimentales sugieren que las fugas a través de la barrera epitelial del intestino podrían contribuir al desarrollo de las enteropatías inflamatorias. Las células inmunitarias ubicadas en la lámina propria intestinal interaccionan generalmente con las células epiteliales intestinales a través del contacto intercelular o la síntesis de factores solubles para mantener la supervivencia inmunitaria y contribuir a la integridad de la barrera epitelial. Sin embargo, la inflamación con mediación inmunitaria prolongada o desregulada puede contribuir a provocar deficiencias en la integridad y la función de las células de la barrera epitelial. El siguiente estudio está diseñado para medir el o los efectos directos sobre la integridad de la barrera epitelial que ejercen la IL-17A y/o la IL-17F sintetizadas por los linfocitos T.

En este ejemplo, las estirpes de las células epiteliales intestinales, como las células Caco-2, se diferencian en membranas semipermeables y se cocultivan en el lado basolateral con linfocitos T o con monocitos derivados de biopsias de pacientes con una enteropatía inflamatoria o de individuos normales. La integridad de la monocapa epitelial se vigila en el tiempo utilizando la evaluación de la resistencia eléctrica transepitelial o la resistencia que pone la monocapa a la difusión del colorante. Las disminuciones en la resistencia transepitelial de las monocapas en los cocultivos sugeriría una alteración en la monocapa inducida por la actividad de los linfocitos T o los monocitos en el cocultivo. Los inhibidores de la IL-17A y la IL-17F tal como los polipéptidos solubles de la presente invención, tal como un polipéptido IL17RC soluble o un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158), se podrían utilizar para determinar la contribución relativa de la IL-17A y de la IL-17F a la alteración de la monocapa epitelial y analizar si los inhibidores de las IL-17A e IL-17F serían eficaces a la hora de mantener la integridad de la barrera epitelial. La prevención de la alteración de la monocapa epitelial inducida por los linfocitos T activados mediante tales moléculas sugeriría que los polipéptidos solubles IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA de la presente invención serían eficaces para el tratamiento terapéutico de las enteropatías inflamatorias en los humanos.

También se podrían generar los sistemas de cocultivo utilizando monocapas formadas por el epitelio primario de pacientes con enteropatía inflamatoria para determinar si estas células son más sensibles a la IL-17A y a la IL-17F en comparación con las células epiteliales obtenidas de individuos sanos. Si es así, estos datos sugerirían que inhibir la IL-17A y la IL-17F sería una estrategia adecuada para el tratamiento terapéutico de las enteropatías inflamatorias.

EJEMPLO 46 Efectos de la IL-17A y la IL-17F sobre los linfocitos T y los monocitos/macrófagos de la lámina propia de muestras humanas normales y

con una enteropatía inflamatoria

La inflamación con mediación inmunitaria prolongada o desregulada puede contribuir a los síntomas o a la enfermedad asociada a las enteropatías inflamatorias a través de daños al tejido o a la asimetría permanente de las respuestas inmunitarias prolongadas o inadecuadas. Este modelo puede determinar las posibles consecuencias posteriores de que los linfocitos T y los monocitos asociados a la enfermedad se expongan a la IL-17A y a la IL-17F, que pueden estar presentes en el medio de citocinas del entorno inmediato del tejido intestinal.

Los medicamentos que serían eficaces contra las enteropatías inflamatorias humanas in vivo funcionarían en los modelos ex vivo anteriores al inhibir y/o neutralizar la producción y/o presencia de mediadores inflamatorios (incluidos, pero sin limitarse a ellos, IL-1�, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A y F, IL-18, IL-23, TNF-�, IFN-�, miembros de la familia MIP, MCP-1, G-CSF, GM-CSF, etc.).

En este modelo se aíslan los linfocitos T y los monocitos/macrófagos a partir de muestras de biopsia cortando cuidadosamente con una tijera trozos en HBSS, tratándolos con colagenasa y dispasa II e incubándolos durante 1 hora a 37ºC en un agitador. Se filtra la suspensión celular a través de una malla de nilón para retirar los desechos y los agregados celulares y se lavan varias veces en HBSS. Se pueden aislar los linfocitos T y los macrófagos/monocitos mediante la clasificación directa de las células o mediante protocolos de enriquecimiento/agotamiento de perlas. Se incuban las células aisladas en presencia de la IL-17A y de la IL-17F. Esto induce la producción de los mediadores inflamatorios desde los linfocitos T y los monocitos/macrófagos o da lugar a la asimetría de las respuestas posteriores de los linfocitos T a respuestas altamente proinflamatorias. Se pueden comparar los tipos de mediadores inflamatorios producidos por las células de pacientes con enteropatías inflamatorias y los de las células de individuos normales, y se podría sugerir que los linfocitos T y los monocitos/macrófagos de los pacientes con enteropatías inflamatorias producen un perfil más proinflamatorio en presencia de IL-17A y de IL-17F. La adición de un polipéptido soluble de la presente invención, tal como un polipéptido IL-17RC soluble o un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158), para neutralizar la producción posterior de los mediadores inflamatorios inducidos por la IL-17A y la IL17F sugiere que los polipéptidos IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA solubles pueden ser eficaces para el tratamiento terapéutico de los pacientes con enteropatías inflamatorias.

EJEMPLO 47 Eficacia de los polipéptidos solubles IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA en el

síndrome del intestino irritable (SII): patogenia dirigida por el SNC

Un modelo que se centra en la patogenia del SII dirigida por el SNC que utiliza estímulos de estrés para inducir los los síntomas característicos del SII. El modelo de estrés psicosocial neonatal imita algunas características clínicas asociadas a los pacientes que padecen SII, incluidas la hiperalgesia, la diarrea y la sensibilidad al estrés. La separación de la cría de su madre todos los días durante 180 minutos entre los días 4 a 18 después del nacimiento dará lugar a la alteración del comportamiento materno y reducirá significativamente las veces que se manifiesta el comportamiento de cuidado o aseo. El estrés de los recién nacidos da lugar a cambios permanentes en el SNC que da lugar a una alteración de la sensibilidad al dolor somático y visceral inducido por el estrés. La función motora colónica en respuesta al estrés mejora en estos animales y los datos preliminares muestran indicios de un aumento de la permeabilidad intestinal (Mayer et al., 2002). El tratamiento con un polipéptido soluble de la presente invención, tal como un polipéptido IL-17RC soluble o un polipéptido IL17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158) y el análisis posterior de la función motora colónica, de la permeabilidad epitelial y de la respuesta a estímulos de estrés podría determinar la eficacia en este modelo animal de SII. La disminución de la incidencia de los síntomas después del tratamiento con estos inhibidores sugeriría la posible eficacia del tratamiento del SII.

EJEMPLO 48 Eficacia de los polipéptidos solubles IL-17RC e IL-17RC/IL-17RA en el síndrome del intestino irritable (SII): inductores del estrés dirigidos principalmente al intestino

Se trata de un modelo que se centra en los inductores del estrés dirigidos principalmente al intestino (a saber, inflamación del intestino, infección o estrés físico). Los estudios en animales han indicado que la inflamación leve o la activación inmunitaria puede ser una base para que se altere la motilidad y/o la función aferente y epitelial del intestino (Mayer et al., 2002). En este modelo se produce la irritación diaria del colon en los animales recién nacidos (días 8 a 21) en forma de inyección intracolónica diaria de aceite de mostaza. El aceite de mostaza es un estimulador neural y se ha demostrado que induce la hiperalgesia visceral después de la administración intracolónica. Este modelo imita las características clave del SII incluidas la hipersensibilidad visceral y la alteración de los hábitos intestinales. Los animales también presentan diarrea y estreñimiento, una característica clave de los pacientes con SII (Mayer et al., 2002; Kimball et al., 2005). Se podría administrar un polipéptido soluble de la presente invención, tal como un polipéptido IL-17RC soluble o un polipéptido IL-17RC/IL-17RA soluble (SEQ ID n.º 158), para determinar los cambios en la aparición de los síntomas asociados a este modelo. La disminución de la incidencia o la magnitud de la hipersensibilidad visceral y la alteración de la movilidad del intestino después del tratamiento terapéutico con nuestros inhibidores sugeriría que es posible que estas moléculas resulten eficaces para el tratamiento del SII.

EJEMPLO 49 Diseño de un procedimiento escalable de producción de proteínas para un antagonista soluble de la IL-17A y de la IL-17F

Al diseñar las estrategias centradas en desarrollar un procedimiento escalable de producción de proteínas para una forma soluble del IL-17RC, se encontraron muchas dificultades a la hora de identificar un sistema de expresión que permitiera una concentración elevada de la proteína en el medio acondicionado. El ensayo de inmunotransferencia mostró que la concentración de la proteína secretada era baja porque se acumulaba en la célula. Para descubrir los polipéptidos solubles de la presente invención, se diseñaron y se generaron más de 70 construcciones de expresión diferentes, y se analizó su expresión en las células BHK, CHO o HEK 293. Se analizaron varias en más de una estirpe celular hospedadora. Las variaciones del casete de expresión del IL-17RC soluble analizado incluían:

1) Secuencias señal alternativas tales como: a) la original; b) la de otPA; c) la de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón; d) la de la hormona de crecimiento humana; e) la del IL-17RA de ratón.

2) Dos variantes de ayuste diferentes que se producen de forma natural (IL17RCx1; SEQ ID n.º 2; e IL-17RCx4, SEQ ID n.º 166).

3) Adición de secuencias conectoras entre el dominio extracelular (DEC) del IL17RC y la porción Fc, tal como: a) sin conector; b) un conector de 9 aminoácidos basado en GlyGlyGlySer; y c) un conector de 20 aminoácidos basado en GlyGlyGlySer

4) Formas monoméricas etiquetadas con His

5) Proteínas de fusión con Fc en el extremo amino y en el carboxilo

6) Eliminación de sitios de N-glucosilación

7) Sustituciones del aminoácido Asn por Gln

8) Proteínas de fusión híbridas entre el IL-17RA y el IL-17RC

Se analizó la expresión de la proteína de las construcciones de expresión de la variante soluble del IL-17RC mediante la transfección transitoria en la estirpe celular HEK 293. Se utilizó un ensayo de inmunotransferencia para detectar la proteína secretada en el medio acondicionado en comparación con la proteína que se queda retenida en la célula mediante el muestreo de lisados celulares. La mayor parte de las

construcciones expresaron la proteína secretada en el medio acondicionado de forma casi indetectable por un ensayo de inmunotransferencia. Además, la señal fue mayor en las muestras de los lisados celulares en comparación con la muestra del medio acondicionado, lo que indica que la proteína fue incapaz de secretarse con eficacia. 5 Las construcciones de expresión que dieron lugar a las señales más elevadas en el medio acondicionado se utilizaron para transfectar establemente conjuntos de células CHO. Se midieron las valoraciones de la proteína de los conjuntos de células CHO estables y, cuando fue posible, se analizó la unión de la proteína purificada a la IL-17A y a la IL-17F en un ensayo de unión competitiva con células. La tabla siguiente

10 muestra los resultados de expresión de la proteína de las construcciones que dieron mayor expresión en grupos de células CHO estables. Si las mediciones de la concentración absoluta de la proteína estaban por debajo del umbral de detección, se indicaba la valoración de la proteína como < 0,5 mg/ml. Número de referencia de las construcciones de expresión de las proteínas IL

15 17RC e IL-17RC/RA, descripción breve de los exones incluidos, valoración de la proteína en el grupo de células CHO transfectadas establemente, y la capacidad de unión a IL-17A y a IL-17F. No todas las secuencias de las variantes de la tabla 13 se incluyeron en la que viene a continuación.

Descripción

Valoración de la proteína (mg/l) Unión

Variante de ayuste x1 Exones 1-6 y exones 8-16 (variante 1210) del IL-17RC

3,0 Capacidad de bloquear la IL-17A y la IL-17F

Variante de ayuste X4 Exones 1-16 del IL-17RC

< 0,5 Incapaz de obtener suficiente muestra

Exones 1-6 del IL-17RC

< 0,5 Inactiva

Exones 8-13 del IL-17RC

1,6 Inactiva

Exones 7-16 del IL-17RC

< 0,5 Capacidad de bloquear la IL-17A y la IL-17F

Exones 1-10 del IL-17RA Exones 8-16 del IL-17RC (variante 1407)

32,5 Capacidad de bloquear la IL-17A y la IL-17F

Exones 1-6 del IL-17RA Exones 8-16 del IL-17RC Exones 7-10 del IL-17RA

< 0,5 Inactiva

Exones 1-3 del IL-17RA Exones 4-16 del IL-17RC

< 0,5 Incapaz de obtener suficiente muestra

Exón 1 del IL-17RA Exones 2-16 del IL-17RC

< 0,5 Incapaz de obtener suficiente muestra

Exones 1-6 del IL-17RA Exones 8-16 del IL-17RC (variante 1454)

19 Capacidad de bloquear la IL-17A y la IL-17F

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Levin, Steven D. Rixon, Mark W. Gao, Zeren Lewis, Katherine E. Bilsborough, Janine Taft, David W.

<120> Antagonistas de IL-17A e IL-17F y sus métodos de uso

<130> 05-30

<140> Aún no asignado

<141> 2006-09-28

<150> 60/721,162

<151> 2005-09-28

<150> 60/753,794

<151> 2005-12-22

<150> 60/772,022

<151> 2006-02-10

<150> 60/782,247

<151> 2006-03-14

<160> 181

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 2255

<212> DNA <213> Homo sapiens

<220> 5 <221> CDS

<222> (154)...(2229)

<220>

10 <223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro y exones 7-10 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 1

imagen15

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 2

<211> 692

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

imagen6

imagen6

<210> 3

<211> 432

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 3

imagen6

<210> 4

<211> 1753

<212> DNA 5 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (2)...(1726) 10

<400> 4

imagen6

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 5

<211> 575

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

imagen6

imagen6

<210> 6

<211> 1725

5

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia degenerada

10

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1)...(1725)

<223> n = A,T,C or G

15

<400> 6

imagen6

<210> 7 5 <211> 2076

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> secuencia degenerada

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> (1)..(2076) 15 <223> n = A,T,C or G

<400> 7

imagen6

5

<210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

10

<220> <223> Cebador PCR

<400> 8 cggcgtggtg gtcttgctct t

21

15

<210> 9 <211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> enlazador peptídico

<400> 9

imagen6

10 <210> 10

<211> 688

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> Proteína Zcytor14 quimérica

<400> 10

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 11

<211> 705 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

Proteína Zcytor14 quimérica 10

<400> 11

<210> 12

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

Proteína Zcytor14 quimérica 10

imagen6

imagen16

<400> 12

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 13

<211> 1874

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

imagen6

<210> 14

<211> 155

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

imagen6

<210> 15

<211> 923

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

imagen6

<210> 16

<211> 153

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

imagen6

5

<210> 17

<211> 1172

<212> DNA

<213> Mus musculus

10

<400> 17

imagen6

<210> 18

<211> 158

<212> PRT 5 <213> Mus musculus

<400> 18

imagen6

imagen6

10

<210> 19

<211> 462

<212> DNA

<213> Mus musculus 15

<400> 19

imagen6

<210> 20

<211> 153

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

imagen17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

imagen6

<210> 22

<211> 221

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

imagen6

<210> 23

<211> 2180

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

imagen6

<210> 24

<211> 667

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

imagen6

imagen6

<210> 25

<211> 2269

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 25

imagen6

<210> 26

<211> 683

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

imagen6

imagen6

<210> 27

<211> 449

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27 400> 27

imagen6

<210> 28

<211> 222

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

imagen18

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 29

imagen6

<210> 30

<211> 689

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

imagen6

imagen6

<210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 31 tcccgtcccc cgccccaggt c

21

<210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 32 ctctccatcc ttatctttca tcaac

25

<210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 33 ctctctgctg gctaaacaaa acac

24

<210> 34 <211> 26 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 34 ctcatattgc tcaactgtgt gaaaaa

26

<210> 35 <211> 25 ' <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 35 tagaagccac ctgaacacaa atctg

25

<210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 36 atcttgcgtt gtatgttgaa aatcaatt

28

<210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 37 ttctccacca ggtaaacaag tctac 25

<210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 38 ctctccaggc ccaagtcgtg ctct

24

<210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 39 ttgtcctggg ggcctcgtgt ctcc

24

<210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 40

acgaagccca ggtaccagaa agag

24

5

<210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

10

<220> <223> cebador oligonucleotídico <400> 41 aaaagcgccg cagccaagag tagg 24

15

<210> 42 <211> 1293 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 42

imagen19

<210> 43

<211> 431

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

imagen20

imagen6

<210> 44

<211> 699

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 44

imagen6

<210> 45

<211> 233

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

imagen6

10 <210> 46

<211> 69

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

15 <220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 46

imagen6

5

<210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

10

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 47 tgtgggccct ctgggctcct tgtggatgta tttgtc

36

15

<210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

20

<220> <223> cebador oligonucleotídico

25 30

<400> 48 gacaaataca tccacaagga gcccagaggg cccaca 36 <210> 49 <211> 55 <212> DNA <213> Secuencia Artificial <220> <223> cebador oligonucleotídico

35

<400> 49 caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattattt acccggagtc cggga 55

<210> 50

<211> 76

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 50

imagen6

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cola de his C-terminal

<400> 51

imagen6

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cola FLAG C-terminal

<400> 52 <210> 53

imagen6

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cola Glu-Glu

<400> 53

imagen6

<210> 54

<211> 85

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 54

imagen6

<210> 55

<211> 85

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador oligonucleotídico

<400> 55

imagen6

<210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 56 acgaagccca ggtaccagaa agag

24

<210> 57 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 57 aaaagcgccg cagccaagag tag

24

<210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 58 cgtaagcggt ggcggttttc

20

<210> 59 <211> 20

<212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 59 tgggcagggc acagtcacag

20

<210> 60 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 60 acttgccatt ctgagggagg tagc

24

<210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

<400> 61 cacaggtgca gccaactttt agga

24

<210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

5

<400> 62 gtgggccgct ctaggcacca 20

10

<210> 63 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador oligonucleotídico

15

<400> 63 cggttggcct tagggttcag ggggg 25

20

<210> 64 <211>.2127 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 64

imagen6

<210> 65

<211> 708

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

imagen6

imagen6

imagen21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> inserto sintético

<400> 66

imagen6

<210> 67

<211> 2154

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400>

67

<400>

68

imagen6

10

<210> 68

<211> 718

<212> PRT

<213> homosapiens

15

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 69

<211> 2052

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 69

imagen22

<210> 70

<211> 683

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 70

imagen6

imagen23

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Péptido señal murino y exones 1-6 de IL-17RA murino, exones 8-16 de IL-17RC humana, enlazador y Fc10

<400> 71 <212> PRT

imagen24

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Péptido señal murino y exones 1-6 de IL-17RA murino, exones 8-16 de IL-17RC humano, enlazador y Fc10

<400> 72

imagen6

imagen6

<210> 73

<211> 1638

<212> DNA 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> otPA (Activador de plasminógeno de tejido optimizado) péptido señal y exones

8-16 de IL-17RC humano, enlazador y Fc10 10

<400> 73

imagen25

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> otPA (Activador de plasminógeno de tejido optimizado) péptido señal y exones

<400> 74

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 75

<211> 622

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 75

imagen22

<210> 76

<211> 207

<212> PRT 15 <213> homo sapiens

<400> 76 <210> 77

imagen6

<211> 1318 5 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

IL-17RC péptido señal y exones 1-7 de IL-17RC humana, y Fc5 10

<400> 77

<210> 78

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

IL-17RC péptido señal y exones 1-7 de IL-17RC humana, y Fc5 10

<400> 78

<210> 79

<211> 762

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 79

<210> 81

<211> 1458 5 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

IL-17RC péptido señal y exones 1-8 de IL-17RC humana, y Fc5 10

imagen26

imagen6

imagen6

10

<210> 80

<211> 254

<212> PRT

<213> homo sapiens

15

<400> 80

imagen6

<400> 81 <212> PRT

imagen27

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> IL-17RC péptido señal y exones 1-8 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 82

imagen6

imagen6

<210> 83

<211> 822

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 83

imagen6

<210> 84

<211> 274

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 84

imagen20

<210> 85

<211> 1518 10 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal exones 1-9 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 85

imagen6

5

<210> 86

<211> 506

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> IL-17RC péptido señal exones 1-9 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 86

imagen6

imagen6

<210> 87

<211> 873

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 87

imagen6

<210> 88

<211> 291

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 88

imagen20

<210> 89

<211> 1569

<212> DNA 10 <213> Secuencia Artificial <220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-10 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 89

imagen28

<210> 90

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

IL-17RC péptido señal y exones 1-10 de IL-17RC humana, y Fc5 15

<400> 90

<210> 91

<211> 1059

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 91

<210> 92

<211> 353

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 92

<210> 93

<211> 1755

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-11 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 93

<210> 94

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

IL-17RC péptido señal y exones 1-11 de IL-17RC humana, y Fc5 15

imagen6

imagen6

imagen6

imagen6

imagen6

imagen29

<400> 94

imagen6

imagen6

<210> 95

<211> 303

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 95

imagen6

<210> 96 10 <211> 101

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 96

imagen15

<210> 97

<211> 999

<212> DNA 20 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 97

imagen6

5 <210> 98

<211> 333

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 98

imagen6

<210> 99

<211> 585

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 99

imagen6

<210> 100

<211> 195

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 100

imagen22

<210> 101

<211> 1281

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 11-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 101

imagen22

<210> 102

<211> 427

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 11-16 de IL-17RC humana, y Fc5

20 <400> 102

imagen6

<210>

103

<210>

103

imagen6

<211> 882

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 103

imagen6

10 <210> 104

<211> 294

<212> PRT

<213> homo sapiens

15 <400> 104 <212> ADN

imagen30

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> IL-17RC péptido señal y exones 7-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 105

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> IL-17RC péptido señal y exones 7-16 de IL-17RC humana, y Fc5

imagen31

<400> 106

imagen6

imagen6

<210> 107

<211> 864

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 107

imagen6

<210> 108

<211> 288

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 108

imagen20

<210> 109

<211> 1560

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-7 y 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

15 <400> 109 <212> PRT

imagen32

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> IL-17RC péptido señal y exones 1-7 y 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 110

imagen6

imagen6

<210> 111

<211> 1146

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 111

imagen6

<210> 112

<211> 382

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 112

imagen6

<210> 113

<211> 1842

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-7 y 11-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 113

imagen20

<210> 114

<211> 614

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-7 y 11-16 de IL-17RC humana, y Fc5

15 <400> 114

imagen6

imagen6

<210> 115

<211> 1524

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-13 de IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL

17RA humana 10

<400> 115

imagen33

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> IL-17RC péptido señal y exones 1-13 de IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL17RA humana

<400> 116

imagen6

imagen6

<210> 117

<211> 2220

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-13 de IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL17RA humana, y Fc5

<400> 117

imagen6

<210> 118

<211> 740

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-13 de IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL17RA humana, y Fc5

<400> 118

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 119

<211> 1500 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RA murina péptido señal y exones 1-6 de IL-17RA murina, exones 8-13 de 10 IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL-17RA murina

<400> 119 <212> PRT

imagen34

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> IL-17RA murina péptido señal y exón 1-6 de IL-17RA murina, exones 8-13 de IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL-17RA murina

<400> 120

imagen6

imagen6

<210> 121

<211> 2196 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RA murina péptido señal y exones 1-6 de IL-17RA murina, exones 8-13 de 10 IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL-17RA murina y Fc5

<400> 121 <212> PRT

imagen35

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> IL-17RA murina péptido señal y exones 1-6 de IL-17RA murina, exones 8-13 de IL-17RC humana, y exones 7-9 de IL-17RA murina y Fc5

<400> 122

imagen6

imagen6

imagen6

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 123

<211> 1272 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-6 de IL-17RC humana, y Fc5 10

<400> 123

imagen36

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> IL-17RC péptido señal y exones 1-6 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 124

imagen6

<210> 125

<211> 1794

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-6 y 11-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 125

imagen6

10

<210> 126

<211> 598

<212>

PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-6 y 11-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 126

<210> 127

<211> 1515

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-6 y 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 127

<210> 128

<211> 505

<212>

PRT 10 <213> Secuencia Artificial

imagen6

imagen6

imagen20

<220>

<223> IL-17RC péptido señal y exones 1-6 y 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

15 <400> 128

imagen6

imagen6

<210> 129

<211> 1335 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro 10 y exones 8-13 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 129

imagen6

5 <210> 130

<211> 445

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro y exones 8-13 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 130

imagen6

<210> 131

<211> 1299

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial 5

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro y exones 8-10 y 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

10 <400> 131

imagen37

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

20 <223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro y exones 8-10 y 14-16 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 132

imagen6

<210> 133

<211> 1056

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro y exones 8-10 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 133

imagen22

<210> 134

<211> 352

<212> PRT 15 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro

y exones 8-10 de IL-17RC humana, y Fc5 20

<400> 134 <210> 135

imagen6

imagen6

<211> 1080 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro 10 y exones 11-13 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 135

imagen6

5

<210> 136

<211> 360

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 10

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro y exones 11-13 de IL-17RC humana, y Fc5

15 <400> 136

imagen6

<210> 137

<211> 1164

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro y exones 7-10 de IL-17RC humana, y Fc5

<400> 137

imagen20

<210> 138

<211> 388

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Activador de plasminógeno de tejido optimizado (otPA) secuencia señal pre-pro

y exones 7-10 de IL-17RC humana, y Fc5 15

<400> 138

imagen6

<210> 139

<211> 2433

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RA y exones 1-10 de IL-17RA y exones 8-16 de IL17RC humana, y Fc5

<400> 139

imagen38

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Secuencia señal de IL-17RA y exones 1-10 de IL-17RA y exones 8-16 de IL17RC humana, y Fc5

<400> 140

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 141

<211> 2190 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RA y exones 1-6 de IL-17RA y exones 8-13 de IL10 17RC humana y exones 7-10 de IL-17RA, y Fc5

<400> 141 <212> PRT

imagen39

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Secuencia señal de IL-17RA y exones 1-6 de IL-17RA y exones 8-13 de IL17RC humana y exones 7-10 de IL-17RA, y Fc5

<400> 142

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 143

<211> 2124

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RA y exones 1-3 de IL-17RA y exones 4-16 de IL

17RC humana y Fc5 10

<400> 143 <210> 144

imagen40

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RA y exones 1-3 de IL-17RA y exones 4-16 de IL10 17RC humana y Fc5

<400> 144

imagen6

imagen6

<210> 145

<211> 2127

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RA y exón 1 de IL-17RA y exones 2-16 de IL-17RC humana y Fc5

<400> 145

imagen20

<210> 146

<211> 709

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RA y exón 1 de IL-17RA y exones 2-16 de IL-17RC

humana y Fc5 15

<400> 146

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 147

<211> 2094 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RC y exones 1-16 de IL-17RCx4 con sustituciones 10 Cys194Ser y Cys202Ser y exones 2-16 de IL-17RC humana y Fc5

<400> 147 <212> PRT

imagen41

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Secuencia señal de IL-17RC y exones 1-16 de IL-17RCx4 con sustituciones Cys194Ser y Cys202Ser y exones 2-16 de IL-17RC humana y Fc5

<400> 148

imagen6

imagen6

<210> 149

<211> 2061

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RC y exones 1-6 y 8-16 de IL-17RC con enlazador GlyGlyGlySer entre los exones 6 y 8, y Fc5

<400> 149

imagen42

<210> 150

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Secuencia señal de IL-17RC y exones 1-6 y 8-16 de IL-17RC con Enlazador 15 GlyGlyGlySer entre los exones 6 y 8, y Fc5

<400> 150

imagen6

imagen6

imagen6

5

<210> 151 <211> 2094 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

10

<220> <223> otPA secuencia señal pre-pro y sustitución Leu21Ala, y Fc5 exones 1-6 y 8-16 de IL-17RC con una

<400> 151

imagen6

5

<210> 152 <211> 698 <212> PRT <213> Secuencia Artificial

10

<220> <223> otPA secuencia señal pre-pro y sustitución Leu21Ala, y Fc5 exones 1-6 y 8-16 de IL-17RC con una

<400> 152

imagen6

imagen6

<210> 153

<211> 2097

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Exones 1-6 y 8-16 de IL17RC con sustituciones Ser215Thr y Ser228Thr

<400> 153

imagen20

<210> 154

<211> 698

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Exones 1-6 y 6-16 de IL17RC con sustituciones Ser215Thr y Ser228Thr y Fc5

15 <400> 154

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 155

<211> 2094 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Exones 1-6 y 8-16 de IL17RC con sustituciones Ser a Thr y en los restos 120, 10 215, 228, 374, y 408 y Fc5

<400> 155 <212> PRT

imagen43

<213> Secuencia Artificial

<220>

10 <223> Exones 1-6 y 8-16 de IL17RC con Sustituciones Ser a Thr en los restos120, 215, 228, 374, y 408 y Fc5

<400> 156

imagen6

imagen6

<210> 157

<211> 2070

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RA péptido señal y exones 1-6 de IL-17RA y exones 8-16 de IL-17RC y

Fc5

<400> 157

imagen20

<210> 158

<211> 690

<212> PRT 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> IL-17RA péptido señal y exones 1-6 de IL-17RA y exones 8-16 de IL-17RC y

Fc5 15

<400> 158

imagen6

imagen6

imagen6

<210> 159

<211> 252 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Dominio 1 10

<400> 159

imagen6

<210> 160 15 <211> 84

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Domino 1

<400> 160 <210> 161

imagen6

<211> 282 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Dominio 2 10

<400> 161

imagen6

<210> 162 15 <211> 94

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Dominio 2

<400> 162 <210> 163

imagen6

<211> 231 5 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Dominio 3 10

<400> 163

imagen6

<210> 164 15 <211> 77

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 20 <223> Dominio 3

<400> 164

imagen6

<210> 165

<211> 2124

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 165

imagen6

<210> 166

<211> 707

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 166

imagen6

imagen6

<210> 167

<211> 3120

<212> ADN

<213> homo sapiens

<400> 167

imagen6

<210> 168

<211> 78

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido señal de la hormona de crecimiento humana 5

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(78)

10 <400> 168

imagen6

<210> 169

<211> 26 15 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> péptido señal de la hormona de crecimiento humana 20

<400> 169

imagen6

<210> 170 25 <211> 57

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> <223> Péptido señal de la región variable (VH 26-10) de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(57)

<400> 170

imagen6

10

<210> 171

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial 15

<220>

<223> Péptido señal de la región variable (VH 26-10) de la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón

20 <400> 171

imagen6

<210> 172

<211> 48 25 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido señal de CD33 humana 30 <220>

<221> CDS

<222> (1)...(48)

<400> 172

imagen6

<210> 173

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Péptido señal de CD33 humana

<400> 173

imagen6

<210> 174

<211> 696

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina Fc10

<220>

<221> CDS

<222> (0)...(696)

<400> 174

imagen6

<210> 175

<211> 232

<212> .PRT 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina Fc10

10 <400> 175

imagen44

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> conector

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(60)

<400> 176

imagen6

10

<210> 177

<211> 20

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

15

<220>

<223> conector

<400> 177

imagen19

<210> 178

<211> 35

<212> PRT 25 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> secuencia señal pre-pro de tPA

<400> 178

imagen6

<210> 179 5 <211> 696

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> Región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina Fc5

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(696) 15

<400> 179

imagen6

imagen45

<210> 180

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

Región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina Fc5 10

<400> 180

<210> 181

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223>

Péptido señal de I1-17RA murina 10

imagen46

<400> 181

imagen6

Claims (25)

1. 339

   1.

   Polipéptido soluble aislado que comprende los exones 8 a 16 del IL-17RC (residuos aminoacídicos 193 a 447 de la SEQ ID n.º 2) y los exones 1 a 6 del IL-17RA, en el que dicho polipéptido soluble se une específicamente a la IL-17A y a la IL-17F.

2. 2.

   Polipéptido soluble aislado según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende los residuos aminoacídicos 1 a 458 de la SEQ ID n.º 158.

3. 3.

   Polipéptido soluble aislado según la reivindicación 2, en el que el polipéptido comprende la SEQ ID n.º 158.

4. 4.

   Polipéptido soluble aislado según la reivindicación 2, en el que el polipéptido consiste en los residuos aminoacídicos 1 a 458 de la SEQ ID n.º 158.

5. 5.

   Polipéptido soluble aislado según la reivindicación 3, en el que el polipéptido consiste en la SEQ ID n.º 158.

6. 6.

   Polipéptido soluble aislado según la reivindicación 1, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID n.º 72 y SEQ ID n.º 140.

7. 7.

   Molécula de ácido nucleico aislada, que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. 8.

   Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7, en la que la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia nucleotídica mostrada en la SEQ ID n.º

9. 157.
10. 9. Vector de expresión, que comprende los siguientes elementos unidos operativamente:

    a) un promotor de transcripción;

    b) un segmento de ADN que codifica un polipéptido según una cualquiera de

    las reivindicaciones 1 a 6; y c) un terminador de transcripción.
11. 10. Célula aislada en la que se ha introducido un vector de expresión de la reivindicación 9, en la que la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN.
12. 11. Un método para producir un polipéptido que comprende:

    a) cultivar una célula en la que se ha introducido un vector de expresión de la reivindicación 9, en el que la célula expresa el polipéptido codificado por el segmento de ADN; y

    b) recuperar el polipéptido expresado.

13. 12.

    Método según la reivindicación 11, en el que la célula es una célula eucariota, y en el que el polipéptido expresado se secreta desde la célula.

14. 13.

    Método según la reivindicación 11 o 12, en el que el polipéptido codificado comprende la secuencia aminoacídica mostrada en la SEQ ID n.º 158 o los residuos 1458 de la SEQ ID n.º 158.

15. 14.

    Polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el polipéptido comprende además PEGilación.

16. 15.

    Polipéptido soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para reducir o inhibir la inflamación en un mamífero inducida por la IL-17A o inducida por la IL-17F.

17. 16.

    Polipéptido soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para reducir la inflamación en un mamífero inducida por la IL-17A e inducida por la IL-17F.

18. 17.

    Utilización de un polipéptido soluble según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para tratar un mamífero afectado por una enfermedad inflamatoria en la que interviene la IL-17A y/o la IL-17F.

19. 18.

    Utilización según la reivindicación 17, en la que la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en una enfermedad inflamatoria crónica, una enfermedad inflamatoria aguda, una enfermedad autoinmunitaria y una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias.

20. 19.

    Utilización según la reivindicación 18, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica seleccionada entre el grupo que consiste en enteropatía inflamatoria, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, artritis y psoriasis.

21. 20.

    Utilización según la reivindicación 18, en la que la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria seleccionada entre el grupo que consiste en esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enteropatía inflamatoria (IBD).

22. 21.

    Utilización según la reivindicación 18, en la que la enfermedad es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias seleccionada entre el grupo que consiste en asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y fibrosis quística.

23. 22.

    Utilización según la reivindicación 17, en la que la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en psoriasis; artritis reumatoide; artrosis; colitis ulcerosa; enfermedad de Crohn; síndrome del intestino irritable (SII); dermatitis de contacto; esclerosis múltiple (EM); rechazo del trasplante; asma; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); fibrosis quística; y asma alérgica.

24. 23.

    Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en la que el polipéptido soluble es un polipéptido producido por el método de la reivindicación
25. 13.