ES2214721T3 - Receptor 11 de citoquinas de mamiferos. - Google Patents
Receptor 11 de citoquinas de mamiferos.Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Abstract
La invención se refiere a nuevos polipéptidos de receptor, polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, composiciones y procedimientos asociados. Los polipéptidos comprenden un dominio extracelular de un receptor de superficie que se expresa en el páncreas, el intestino delgado, el colon y el timo. Los polipéptidos pueden utilizarse en procedimientos que sirven para detectar ligandos que activan la proliferación y/o la diferenciación de estos órganos.
Description
Receptor 11 de citoquinas de mamíferos.
Las citoquinas son proteínas solubles que
influyen en el crecimiento y la diferenciación de muchos tipos
celulares. Sus receptores están compuestos de una o más proteínas
de membrana integrales que se unen a la citoquina con elevada
afinidad y transducen este proceso de unión a la célula a través de
las porciones citoplásmicas de las correspondientes subunidades de
receptor. Los receptores de citoquinas han sido agrupados en
diversas clases basándose en similitudes de sus dominios
extracelulares de unión a ligandos. Por ejemplo, las cadenas de
receptor responsables de la unión a, y/o la transducción del efecto
de, interferones (IFNs) son miembros de la familia de receptores
citoquínicos de tipo II (CRF2; del inglés, type II
cytokine receptor family), basándose en un
característico dominio extracelular de 200 restos. Las demostradas
actividades in vivo de estos interferones ilustran el enorme
potencial clínico, y la necesidad, de otras citoquinas, agonistas de
citoquinas y antagonistas de citoquinas.
El presente invento satisface esta necesidad al
proporcionar nuevos receptores de citoquinas y composiciones y
métodos relacionados. En particular, el presente invento
proporciona una región extracelular de unión a ligandos de un
receptor Zcytor11 de mamífero, que además contiene alternativamente
un dominio transmembranal o tanto un dominio intracelular como un
dominio transmembranal.
El presente invento proporciona un polinucleótido
aislado que codifica un polipéptido de receptor de unión a ligandos.
El polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada
del grupo que consiste en (a) los restos 18 a 228 de la ID. SEC. nº
2; (b) variantes alélicas de (a); y (c) secuencias que son al menos
80% idénticas a (a) o (b). En una realización, el polipéptido
comprende los restos 18 a 228 de la ID. SEC. nº 2. En otra
realización, el polipéptido codificado por el polinucleótido
aislado comprende además un dominio transmembranal. El dominio
transmembranal puede comprender los restos 229 a 251 de la ID. SEC.
nº 2, o una variante alélica de los mismos. En otra realización, el
polipéptido codificado por el polinucleótido aislado comprende
además un dominio intracelular, tal como un dominio intracelular
que comprende los restos 252 a 574 de la ID. SEC. nº 2 o una
variante alélica del mismo. En otras realizaciones, el
polinucleótido codifica un polipéptido que comprende los restos 1 a
574, 1 a 251, 1 a 228, 18 a 251 ó 18 a 574 de la ID. SEC. nº 2. En
una realización adicional, el polipéptido comprende además una
etiqueta de afinidad. En una realización más, el polinucleótido es
DNA.
En otro aspecto del invento, se proporciona un
vector de expresión que comprende (a) un promotor de transcripción;
(b) un segmento de DNA que codifica un polipéptido de receptor de
unión a ligandos, en el que el polipéptido de receptor de unión a
ligandos comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del
grupo que consiste en: (i) los restos 18-228 o
cualquiera de los anteriormente descritos restos de la ID. SEC. nº
2; (ii) variantes alélicas de (i); y (iii) secuencias que son al
menos 80% idénticas a (i) o (ii); y (c) un terminador de
transcripción, en el que el promotor, el segmento de DNA y el
terminador están operativamente enlazados. El polipéptido de
receptor de unión a ligandos puede comprender además un péptido
secretor, un dominio transmembranal, un dominio transmembranal y un
dominio intracelular, o un péptido secretor, un dominio
transmembranal y un dominio intracelular.
En otro aspecto del invento, se proporciona una
célula eucariótica en cultivo en la que se ha introducido un vector
de expresión como el anteriormente descrito, en el que dicha célula
expresa un polipéptido de receptor codificado por el segmento de
DNA. En una realización, la célula expresa además una necesaria
subunidad de receptor que forma un complejo de receptor funcional.
En otra realización, la célula depende, para su proliferación, de
un factor de crecimiento hematopoyético exógenamente
suministrado.
En otro aspecto del invento, se proporciona un
polipéptido aislado que comprende un segmento seleccionado del grupo
que consiste en (a) los restos 18 a 228 de la ID. SEC. nº 2,
también descritos como ID. SEC. nº 9; (b) variantes alélicas de
(a); y (c) secuencias que son al menos 80% idénticas a (a) o (b), en
el que dicho polipéptido está sustancialmente exento de los
dominios transmembranal e intracelular normalmente asociados con
receptores hematopoyéticos. En una realización, el polipéptido
comprende los restos 18 a 228 de la ID. SEC. nº 2. En otra
realización, el polipéptido comprende además un dominio
transmembranal. El dominio transmembranal puede comprender los
restos 229 a 251 de la ID. SEC. nº 2, también descritos como ID.
SEC. nº 10, o una variante alélica de los mismos. En otra
realización, el polipéptido comprende además un dominio
intracelular, tal como un dominio intracelular que comprende los
restos 252 a 574 de la ID. SEC. nº 2, también descritos como ID.
SEC. nº 11, o una variante alélica del mismo. En otras
realizaciones, el polipéptido comprende los restos 1 a 574, 1 a 251,
1 a 228, 18 a 251 ó 18 a 574 de la ID. SEC. nº 2.
En una realización, el polipéptido comprende
además un polipéptido F_{C} de inmunoglobulina. En otra
realización, el polipéptido comprende además una etiqueta de
afinidad, tal como polihistidina, proteína A, glutatión S
transferasa o una región constante de cadena pesada
inmunoglobulínica.
En un aspecto más del invento, se proporciona un
polipéptido quimérico que consiste esencialmente en una primera
porción y una segunda porción unidas por un enlace peptídico. La
primera porción del polipéptido quimérico consiste esencialmente en
un dominio de unión a ligandos de un polipéptido de receptor
seleccionado del grupo que consiste en (a) un polipéptido de
receptor como el mostrado en la ID. SEC. nº 2; (b) variantes
alélicas de la ID. SEC. nº 2; y (c) polipéptidos de receptor que
son al menos 80% idénticos a (a) o (b). La segunda porción del
polipéptido quimérico consiste esencialmente en una etiqueta de
afinidad. En una realización, la etiqueta de afinidad es un
polipéptido F_{C} de inmunoglobulina. El invento también
proporciona vectores de expresión que codifican los polipéptidos
quiméricos, y células huésped transfectadas para que produzcan los
polipéptidos quiméricos.
El presente invento también proporciona un
polinucleótido aislado que codifica un polipéptido seleccionado de
un grupo definido de la ID. SEC. nº 2 que consiste en los restos 1
a 228, restos 1 a 251, restos 1 a 574, restos 2 a 228, restos 2 a
251 y restos 2 a 574. También se reivindica el polipéptido aislado,
expresado por estos polinucleótidos.
El invento también proporciona un método para
detectar un ligando en una muestra de ensayo, que comprende poner la
muestra de ensayo en contacto con un polipéptido como el
anteriormente descrito, y detectar la unión del polipéptido al
ligando en la muestra. En una realización, el polipéptido comprende
además dominios transmembranales e intracelulares. El polipéptido
puede estar unido a la membrana de una célula en cultivo, en cuyo
caso la operación de detección comprende medir una respuesta
biológica en la célula en cultivo. En otra realización, el
polipéptido está inmovilizado sobre un soporte sólido.
En un aspecto adicional del invento, se
proporciona un anticuerpo que se une específicamente con un
polipéptido como el anteriormente descrito, así como un anticuerpo
antiidiotípico que se une a la región de unión a antígeno de un
anticuerpo hacia Zcytor11.
En aún otro aspecto del presente invento, se
proporcionan cebadores y sondas polinucleotídicos que permiten
detectar mutaciones en el gen Zcytor11. La sonda polinucleotídica
debería tener una longitud de al menos 20-25 bases,
preferiblemente una longitud de al menos 50 bases, y muy
preferiblemente una longitud de aproximadamente 80 a 100 bases.
Además de para la detección de mutaciones, estas sondas pueden ser
utilizadas para descubrir el gen Zcytor11 en otras especies de
mamífero. Las sondas pueden ser cadenas positivas o cadenas
antisentido, y pueden estar compuestas de DNA o RNA.
Una realización adicional del presente invento se
refiere a un péptido o polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos de una porción, que lleva epítopo, de un polipéptido
Zcytor11 que tiene una secuencia de aminoácidos anteriormente
descrita. Los péptidos o polipéptidos que tienen la secuencia de
aminoácidos de una porción, que lleva epítopo, de un polipéptido
Zcytor11 del presente invento incluyen porciones de dichos
polipéptidos con al menos nueve, preferiblemente al menos 15, y más
preferiblemente al menos 30 a 50, aminoácidos, aunque también se
incluyen en el presente invento polipéptidos, que llevan epítopo,
de cualquier longitud hasta, y que incluyen, la secuencia de
aminoácidos completa de un polipéptido del presente invento
anteriormente descrito. Los ejemplos de dichos polipéptidos vienen
definidos por las secuencias de aminoácidos de las ID. SEC. números
7 y 8. También se reivindican cualesquiera de estos polipéptidos que
están fusionados con otro polipéptido o molécula portadora.
Otras realizaciones del invento incluyen
moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un
polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90%
idéntica, y más preferiblemente 95%, 97%, 98% o 99% idéntica, a la
de cualquiera de los nucleótidos anteriormente descritos, o un
polinucleótido que se hibrida bajo condiciones de hibridación
rigurosas con un polinucleótido que tiene una secuencia de
nucleótidos anteriormente descrita. Una realización adicional de
ácido nucleico del presente invento se refiere a una molécula de
ácido nucleico aislada que comprende un aminoácido de una porción,
que lleva epítopo, de un polipéptido Zcytor11.
Estos y otros aspectos del invento se harán
evidentes tras referencia a la descripción detallada siguiente y el
dibujo adjunto.
La expresión "variante alélica" se usa aquí
para significar cualquiera de dos o más formas alternativas de un
gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica
surge naturalmente por mutación y puede dar lugar a polimorfismo
fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser
silenciosas (sin cambio en el polipéptido codificado) o pueden
codificar polipéptidos que tengan una secuencia de aminoácidos
alterada. La expresión "variante alélica" también se usa aquí
para significar una proteína codificada por una variante alélica de
un gen.
La expresión "vector de expresión" se usa
para significar una molécula de DNA, lineal o circular, que
comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés
operativamente enlazado a segmentos adicionales que proporcionan su
transcripción. Dichos segmentos adicionales incluyen secuencias
promotoras y terminadoras y pueden incluir también uno o más
orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un
potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de
expresión proceden generalmente de DNA plasmídico o vírico, o
pueden contener elementos de ambos.
El término "aislado", cuando se aplica a un
polinucleótido, significa que el polinucleótido ha sido separado de
su entorno genético natural y, por lo tanto, está exento de otras
secuencias de codificación extrañas o indeseadas, y está en una
forma adecuada para uso en sistemas para producción de proteínas
genéticamente construidas.
"Operativamente enlazado", cuando hace
referencia a segmentos de DNA, indica que los segmentos están
dispuestos de modo que actúan de concierto para sus fines
previstos; por ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y
se desarrolla a través del segmento de codificación hasta el
terminador.
Un "polinucleótido" es un polímero, de
cadena sencilla o doble, de bases desoxirribonucleotídicas o
ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al 3'. Los polinucleótidos
incluyen RNA y DNA y pueden ser aislados de fuentes naturales,
sintetizados in vitro o preparados a partir de una
combinación de moléculas naturales y sintéticas.
El término "promotor" se usa aquí por su
significado, reconocido en la técnica, de representar una porción de
un gen que contiene secuencias de DNA que proporcionan la unión de
la RNA polimerasa y la iniciación de la transcripción. Comúnmente,
aunque no siempre, se encuentran secuencias promotoras en las
regiones no codificadoras 5' de
genes.
genes.
El término "receptor" se usa aquí para
significar una proteína asociada a una célula, o una subunidad
polipeptídica de dicha proteína, que se une a una molécula
bioactiva (el "ligando") y media en el efecto del ligando sobre
la célula. La unión del ligando al receptor da lugar a un cambio
conformacional en el receptor (y, en algunos casos, a la
multimerización de receptores, es decir, la asociación de
subunidades de receptor idénticas o diferentes), lo que causa
interacciones entre el(los) dominio(s)
efector(es) y otra(s) molécula(s) de la
célula. A su vez, estas interacciones conducen a alteraciones del
metabolismo de la célula. Los procesos metabólicos que están
ligados a interacciones receptor-ligando incluyen
transcripción génica, fosforilación, desfosforilación,
proliferación celular, aumentos de producción de AMP cíclico,
movilización de calcio celular, movilización de lípidos de
membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e
hidrólisis de fosfolípidos. La expresión "polipéptido de
receptor" se usa aquí para significar cadenas polipéptidicas de
receptor completas y porciones de las mismas, incluyendo dominios
funcionales aislados (por ejemplo, dominios de unión a
ligandos).
Una "secuencia señal secretora" es una
secuencia de DNA que codifica un polipéptido (un "péptido
secretor") que, como componente de un polipéptido más grande,
dirige al polipéptido más grande a través de una ruta secretora de
una célula en que es sintetizado. El polipéptido más grande es
comúnmente escindido para que se separe el péptido secretor durante
el tránsito a través de la ruta secretora.
Un "receptor soluble" es un polipéptido de
receptor que no está unido a una membrana celular. Los receptores
solubles son muy comúnmente polipéptidos de receptor de unión a
ligandos, que carecen de dominios transmembranal y citoplásmico.
Los receptores solubles pueden comprender restos de aminoácido
adicionales, tales como etiquetas de afinidad que proporcionan la
purificación del polipéptido o proporcionan sitios para la fijación
del polipéptido a un sustrato, o secuencias de región constante
inmunoglobulínica. Muchos receptores de la superficie celular
presentan parejas solubles, presentes en la naturaleza, que son
producidas por proteolisis o son traducidas de mRNAs
alternativamente remodelados. Se dice que los polipéptidos de
receptor están sustancialmente exentos de segmentos polipeptídicos
transmembranales e intracelulares cuando carecen de suficientes
porciones de estos segmentos para proporcionar el anclaje a la
membrana o la transducción de señales, respectivamente.
El análisis de la distribución tisular del mRNA
correspondiente a este nuevo DNA mostró que el nivel de mRNA era
máximo en el páncreas, seguido por niveles mucho menores en el timo,
el colon y el intestino delgado. El receptor ha sido denominado
"Zcytor11".
Las subunidades de los receptores citoquínicos se
caracterizan por una estructura de múltiples dominios que comprende
un dominio de unión a ligandos y un dominio efector que está
típicamente implicado en la transducción de señales. Los receptores
citoquínicos multímeros incluyen homodímeros [por ejemplo, las
isoformas \alpha\alpha y \beta\beta del receptor de PDGF, el
receptor de eritropoyetina, MPL (receptor de trombopoyetina) y el
receptor de G-CSF], heterodímeros, cada una de
cuyas subunidades posee dominios efectores y de unión a ligandos
(por ejemplo, la isoforma \alpha\beta del receptor de PDGF), y
multímeros que tienen subunidades componentes con funciones dispares
(por ejemplo, los receptores de IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7 y
GM-CSF). Algunas subunidades de receptor son
comunes a una pluralidad de receptores. Por ejemplo, la subunidad
AIC2B, que no puede unirse al ligando por sí misma pero incluye un
dominio intracelular de transducción de señales, es un componente de
los receptores de IL-3 y GM-CSF.
Muchos receptores citoquínicos pueden ser dispuestos en una de
cuatro familias relacionadas, basándose en sus estructuras y
funciones. Por ejemplo, los receptores hematopoyéticos de clase I
se caracterizan por la presencia de un dominio que contiene restos
de cisteína conservados y el motivo WSXWS. En ciertos receptores
hematopoyéticos están presentes dominios adicionales, incluyendo
dominios de proteína quinasa; dominios de fibronectina tipo III; y
dominios inmunoglobulínicos, que se caracterizan por bucles
enlazados por disulfuros. La estructura del receptor de citoquinas
ha sido revisada por Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26:
221-228 (1.991), y Cosman, Cytokine 5:
95-106 (1.993). Se cree generalmente que, bajo la
presión selectiva que hace que los organismos adquieran nuevas
funciones biológicas, surgen nuevos miembros de la familia de
receptores a partir de la duplicación de genes de receptor
existentes, lo que conduce a la existencia de familias multigénicas.
De este modo, miembros de la familia contienen vestigios del gen
ancestral, y estos rasgos característicos pueden ser explotados en
el aislamiento y la identificación de miembros familiares
adicionales.
adicionales.
Los receptores citoquínicos de la superficie
celular se caracterizan además por la presencia de dominios
adicionales. Estos receptores están anclados en la membrana celular
por un dominio transmembranal caracterizado por una secuencia de
restos de aminoácido hidrófobos (típicamente, aproximadamente
21-25 restos), que está comúnmente flanqueada por
restos positivamente cargados (Lys o Arg). En el extremo opuesto de
la proteína a partir del dominio extracelular, y separado de él por
el dominio transmembranal, hay un dominio intracelular.
El nuevo receptor del presente invento, Zcytor11,
es un receptor citoquínico de clase II. Estos receptores se unen
normalmente a citoquinas con haces de cuatro hélices. La
interleuquina 10 y los interferones tienen receptores de esta clase
(por ejemplo, las cadenas alfa y beta del interferón gamma y las
cadenas alfa y beta del receptor del interferón alfa/beta. Los
receptores citoquínicos de clase II se caracterizan por la
presencia de uno o más módulos de receptor citoquínico (CRM; del
inglés, cytokine receptor module) en sus
dominios extracelulares. Los CRMs de los receptores citoquínicos de
clase II son algo diferentes a los mejor conocidos CRMs de los
receptores citoquínicos de clase I. Aunque los CRMs de clase II
contienen dos dominios similares a fibronectina tipo III, difieren
en cuanto a la organización.
Zcytor11, como todos los receptores de clase II
conocidos salvo la cadena alfa del receptor del interferón
alfa/beta, sólo tiene un único CRM de clase II en su dominio
extracelular. Parece que Zcytor11 es un receptor para una citoquina
helicoidal de la clase interferón/IL-10. Usando el
receptor Zcytor11, se pueden identificar ligandos y compuestos
adicionales que tengan un significativo valor terapéutico.
Como se indicó anteriormente, Zcytor11 es similar
a la cadena \alpha del receptor del interferón \alpha [Uze et
al., Cell 60, 255-264 (1.996)]. El
análisis de un clon de cDNA humano que codifica Zcytor11 (ID. SEC.
nº 1) reveló un marco de lectura abierto que codificaba 574
aminoácidos (ID. SEC. nº 2) que comprendían un dominio extracelular
de unión a ligandos, de aproximadamente 211 restos de aminoácido
(restos 18-228 de la ID. SEC. nº 2), un dominio
transmembranal de aproximadamente 23 restos de aminoácido (restos
229-251 de la ID. SEC. nº 2) y un dominio
intracelular de aproximadamente 313 restos de aminoácido (restos
252 a 574 de la ID. SEC. nº 2). Los expertos en la técnica
reconocerán estos límites de dominio son aproximados y se basan en
alineaciones con proteínas conocidas y predicciones de la plegadura
proteica. Es posible la deleción de restos de los extremos de los
dominios.
En realizaciones preferidas del invento, los
polinucleótidos aislados se hibridarán con regiones de similar
tamaño de la ID. SEC. nº 1 o con unas secuencias complementarias de
las mismas, bajo condiciones rigurosas. En general, se seleccionan
unas condiciones rigurosas para que la temperatura sea
aproximadamente 5ºC menor que el punto de fusión térmico (T_{m})
de la secuencia específica para una fuerza iónica y un pH
definidos. La T_{m} es la temperatura (bajo una fuerza iónica y
un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida
con una sonda perfectamente apareada. Son condiciones rigurosas
típicas aquéllas en que la concentración salina es hasta
aproximadamente 0,03 M en un pH de 7 y la temperatura es al menos
aproximadamente 60ºC. Como se indicó previamente, los
polinucleótidos aislados del presente invento incluyen DNA y RNA.
Los métodos para aislar DNA y RNA son bien conocidos en la técnica.
Se prefiere generalmente aislar RNA de tejidos de páncreas o
próstata, aunque también puede prepararse cDNA usando RNA de otros
tejidos o aislarse como DNA genómico. Puede prepararse RNA total
usando una extracción con guanidina\cdotHCl, seguida de
aislamiento por centrifugación en un gradiente de CsCl [Chirgwin
et al., Biochemistry 18: 52-94
(1.979)]. Se prepara poli(A)+ RNA a partir de RNA total
usando el método de Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
69: 1.408-12 (1.972). Se prepara DNA
complementario (cDNA) a partir de poli(A)+ RNA usando métodos
conocidos. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos Zcytor11
son luego identificados y aislados mediante, por ejemplo,
hibridación o reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés,
polymerase chain reaction).
Los expertos en la técnica reconocerán que las
secuencias descritas en las ID. SEC. números 1 y 2 representan
alelos individuales del receptor Zcytor11 humano. Pueden clonarse
variantes alélicas de estas secuencias al sondar bancos de cDNA o
genómicos procedentes de individuos diferentes, de acuerdo con
procedimientos estándares.
El presente invento proporciona además los
correspondientes receptores y polinucleótidos de otras especies
("ortólogos de especie"). Son de particular interés los
receptores Zcytor11 de otras especies de mamífero, incluyendo
receptores murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos,
equinos y de primates no humanos. Los ortólogos de especie del
receptor Zcytor11 humano pueden ser clonados usando información y
composiciones proporcionadas por el presente invento en combinación
con técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un cDNA
puede ser clonado usando mRNA obtenido de un tipo tisular o celular
que exprese el receptor. Las fuentes de mRNA adecuadas pueden ser
identificadas al sondar transferencias Northern con sondas diseñadas
a partir de las secuencias aquí descritas. Luego se prepara un
banco a partir de mRNA de una línea tisular o celular positiva. Un
cDNA que codifica el receptor puede ser luego aislado mediante una
diversidad de métodos, tales como mediante sonda con un cDNA
completo o parcial de ser humano y otros primates o con uno o más
conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas.
Un cDNA puede ser también clonado usando la reacción en cadena de
la polimerasa o PCR (Mullis, Patente de EE.UU. nº 4.683.202),
usando cebadores diseñados a partir de las secuencias aquí
descritas. En un método adicional, el banco de cDNA puede ser usado
para transformar o transfectar células huésped, y la expresión del
cDNA de interés puede ser detectada con un anticuerpo hacia el
receptor. Técnicas similares pueden ser también aplicadas al
aislamiento de clones genómicos.
El presente invento también proporciona
polipéptidos de receptor aislados que son sustancialmente homólogos
al polipéptido de receptor de la ID. SEC. nº 2. Por "aislado"
se quiere significar una proteína o polipéptido que se halla en un
estado que no es su ambiente nativo, tal como separado de sangre y
tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está
sustancialmente exento de otros polipéptidos, particularmente de
otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los
polipéptidos en forma muy purificada, es decir, con una pureza
superior a 95%, más preferiblemente con una pureza superior a 99%.
La expresión "sustancialmente homólogo" se usa aquí para
significar polipéptidos que tienen 50%, preferiblemente 60%, más
preferiblemente al menos 80%, de identidad de secuencia con
respecto a las secuencias mostradas en la ID. SEC. nº 2. Más
preferiblemente, dichos polipéptidos serán al menos 90% idénticos,
y muy preferiblemente 95% o más idénticos, a la ID. SEC. nº 2. El
porcentaje de identidad de secuencia es determinado por métodos
convencionales; véanse, por ejemplo, Altschul et al.,
Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1.986), y
Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
10.915-10.919 (1.992). En resumen, se alinean dos
secuencias de aminoácidos para optimizar las calificaciones de
alineación usando una penalización de apertura de huecos de 10, una
penalización de extensión de huecos de 1, y la matriz de
calificación "blossom 62" de Henikoff y Henikoff (ibídem)
mostrada en la Tabla 1 (los aminoácidos son indicados mediante los
códigos de una letra estándares). El porcentaje de identidad es
luego calculado de la manera siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Número total de apareamientos idénticos\+\+\cr
---------------------------------------------------------------------------------------------------\+
x 100\+\cr (longitud de la secuencia más larga más el número de
huecos introducidos en la\+\+\cr secuencia más larga con objeto de
alinear las dos
secuencias)\+\+\cr}
La identidad de secuencia de moléculas
polinucleotídicas es determinada mediante métodos similares usando
una relación como la anteriormente descrita.
Las proteínas y polipéptidos sustancialmente
homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones,
deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son
preferiblemente de naturaleza menor, es decir, sustituciones de
aminoácidos conservativas (véase la Tabla 2) y otras sustituciones
que no afectan significativamente a la plegadura ni a la actividad
de la proteína o el polipéptido; pequeñas deleciones, típicamente
de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas prolongaciones
amino- o carboxilo-terminales, tales como un resto
amino-terminal de metionina, un pequeño péptido
conector de hasta aproximadamente 20-25 restos, o
una pequeña prolongación que facilita la purificación (una etiqueta
de afinidad), tal como un tramo de polihistidina, proteína A
[Nilsson et al., EMBO J. 4: 1.075 (1.985); Nilsson
et al., Methods Enzymol. 198: 3 (1.991)], glutatión S
transferasa [Smith y Johnson, Gene 67: 31 (1.988)], u otro
epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford
et al., Protein Expression and Purification 2:
95-107 (1.991). Los DNAs que codifican etiquetas de
afinidad se pueden obtener de proveedores comerciales (por ejemplo,
Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, EE.UU.).
| Básicos: | arginina | |
| lisina | ||
| histidina | ||
| Ácidos: | ácido glutámico | |
| ácido aspártico | ||
| Polares: | glutamina | |
| asparagina | ||
| Hidrófobos | leucina | |
| isoleucina | ||
| valina | ||
| Aromáticos | fenilalanina | |
| triptófano | ||
| tirosina | ||
| Pequeños: | glicocola | |
| alanina | ||
| serina | ||
| treonina | ||
| metionina |
Los aminoácidos esenciales de los polipéptidos de
receptor del presente invento pueden ser identificados de acuerdo
con procedimientos conocidos en la técnica, tal como mutagénesis
dirigida al sitio o mutagénesis por barridos de alanina [Cunningham
y Wells, Science 244, 1.081-1.085 (1.989);
Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:
4.498-4.502 (1.991)]. En la segunda técnica, se
introducen mutaciones puntuales de alanina en cada resto de la
molécula y se analizan las moléculas mutantes resultantes en cuanto
a actividad biológica (por ejemplo, unión a ligandos y transducción
de señales) para identificar los restos de aminoácido que son
críticos para la actividad de la molécula. Los sitios de
interacción ligando-receptor pueden ser también
determinados por análisis de la estructura cristalina, según se
determina por técnicas tales como resonancia magnética nuclear,
cristalografía y marcación de fotoafinidad; véanse, por ejemplo, de
Vos et al., Science 255: 306-312
(1.992); Smith et al., J. Mol. Biol. 224:
899-904 (1.992); Wlodaver et al., FEBS
Lett. 309: 59-64 (1.992)]. Las identidades de
los aminoácidos esenciales pueden ser también inferidas del análisis
de homologías con receptores relacionados.
Pueden hacerse y analizarse múltiples
sustituciones de aminoácidos utilizando métodos de mutagénesis y
barrido conocidos, tales como los descritos por
Reidhaar-Olson y Sauer, Science 24:
53-57 (1.988), o Bowie y Sauer, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86: 2.152-2.156 (1.989). En
resumen, estos autores describen métodos para simultáneamente
aleatorizar dos o más posiciones de un polipéptido, seleccionar el
polipéptido funcional y luego secuenciar los polipéptidos mutados
para determinar el espectro de sustituciones admisibles en cada
posición. Otros métodos que pueden ser utilizados incluyen
despliegue en fagos [por ejemplo, Lowman et al., Biochem.
30: 10.832-10.837 (1.991); Ladner et
al., Patente de EE.UU. nº 5.223.409; Huse, Publicación WIPO WO
92/06204] y mutagénesis dirigida a la región [Derbyshire et
al., Gene 46: 145 (1.986); Ner et al., DNA
7: 127 (1.988)].
Métodos de mutagénesis como los anteriormente
descritos pueden ser combinados con métodos de exploración de alta
eficacia para detectar en células huésped la actividad de receptores
mutados y clonados. A este respecto, los ensayos preferidos
incluyen ensayos de proliferación celular y ensayos de unión a
ligando basados en biosensores, que se describen más adelante. Las
moléculas de DNA mutadas que codifican receptores activos o
porciones de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a
ligandos) pueden ser recuperadas de las células huésped y ser
rápidamente secuenciadas utilizando un equipo moderno. Estos
métodos permiten la rápida determinación de la importancia de restos
de aminoácido individuales en un polipéptido de interés, y pueden
ser aplicados a polipéptidos de estructura desconocida.
Usando los métodos anteriormente discutidos,
quien tenga una experiencia normal en la técnica podrá preparar una
diversidad de polipéptidos que sean sustancialmente homólogos a los
restos 18 a 228 de la ID. SEC. nº 2 o variantes alélicas de los
mismos y conserven las propiedades de unión a ligandos del receptor
de tipo silvestre. Dichos polipéptidos pueden incluir aminoácidos
adicionales procedentes de un dominio extracelular de unión a
ligandos de un receptor Zcytor11, así como parte o todo de los
dominios transmembranal e intracelular. Dichos polipéptidos pueden
incluir también segmentos polipeptídicos adicionales, como se
describió en general anteriormente.
Los polipéptidos de receptor del presente
invento, incluyendo receptores de longitud completa, fragmentos de
receptor (por ejemplo, fragmentos de unión a ligandos) y
polipéptidos de fusión, pueden ser producidos de acuerdo con
técnicas convencionales en células huésped genéticamente
construidas. Son células huésped adecuadas aquellos tipos celulares
que pueden ser transformados o transfectados con DNA exógeno y ser
desarrollados en cultivo, e incluyen bacterias, células fúngicas, y
células eucarióticas superiores en cultivo. Se prefieren células
eucarióticas, particularmente células de organismos multicelulares
en cultivo. Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, EE.UU. (1.989), y Ausubel
et al., ibídem, que se incorporan aquí por referencia,
describen técnicas para manipular moléculas de DNA clonadas e
introducir DNA exógeno en una diversidad de células huésped.
En general, una secuencia de DNA que codifica un
polipéptido de receptor Zcytor11 está operativamente enlazada a
otros elementos genéticos necesarios para su expresión, que
incluyen generalmente un promotor y un terminador de transcripción,
en un vector de expresión. El vector también contendrá comúnmente
uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de
replicación, aunque los expertos en la técnica reconocerán que, en
ciertos sistemas, los marcadores seleccionables pueden estar
dispuestos en vectores diferentes y que la replicación del DNA
exógeno puede obtenerse por integración en el genoma de la célula
huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores
seleccionables, vectores y otros elementos es una cuestión de diseño
rutinario dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica.
Muchos de tales elementos son descritos en la bibliografía y se
pueden obtener de proveedores comerciales.
Para dirigir un polipéptido de receptor Zcytor11
a la ruta secretora de una célula huésped, se proporciona una
secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder,
preprosecuencia o presecuencia) en el vector de expresión. La
secuencia señal secretora puede ser la del receptor o puede proceder
de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o
ser sintetizada de novo. La secuencia señal secretora es
unida a la secuencia de DNA de Zcytor11 en el marco de lectura
correcto. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en
5' con respecto a la secuencia de DNA que codifica el polipéptido
de interés, aunque ciertas secuencias señal pueden colocarse en
otra parte de la secuencia de DNA de interés (véanse, por ejemplo,
Welch et al., Patente de EE.UU. nº 5.037.743; Holland et
al., Patente de EE.UU. nº 5.143.830).
Otra realización del presente invento
proporciona un péptido o polipéptido que comprende una porción de
un polipéptido del invento que lleva epítopo. El epítopo de esta
porción de polipéptido es un epítopo inmunogénico o antigénico de un
polipéptido del invento. Una región de una proteína a la que puede
unirse un anticuerpo es definida como "epítopo antigénico";
véase, por ejemplo, H. M. Geysen et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81; 3.998-4.002 (1.984).
En cuanto a la selección de péptidos o
polipéptidos que llevan un epítopo antigénico (es decir, que
contienen una región de una molécula proteica a la que puede unirse
un anticuerpo), es bien sabido en la técnica que péptidos
sintéticos relativamente cortos que remedan parte de una secuencia
proteica son rutinariamente capaces de generar un antisuero que
reacciona con la proteína parcialmente remedada; véase J. G.
Sutcliffe et al., Science 219:
660-666 (1.983). Los péptidos capaces de generar
sueros reactivos con proteínas están frecuentemente representados
en la secuencia primaria de una proteína, pueden ser caracterizados
mediante un conjunto de reglas químicas sencillas y no están
limitados a regiones inmunodominantes de proteínas intactas (es
decir, epítopos inmunogénicos) ni a los extremos amínico y
carboxílico. Los péptidos que son muy hidrófobos y los de seis
restos o menos son generalmente ineficaces para provocar
anticuerpos que se unan a la proteína remedada; los péptidos
solubles más largos, especialmente los que contienen restos de
prolina, son normalmente eficaces.
Por lo tanto, los péptidos y polipéptidos del
invento que llevan epítopo antigénico son útiles para generar
anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unan
específicamente a un polipéptido del invento. Los péptidos y
polipéptidos del presente invento que llevan epítopo antigénico
contienen una secuencia de al menos nueve, preferiblemente de entre
15 y aproximadamente 30, aminoácidos contenidos en la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido del invento. Sin embargo, los
péptidos o polipéptidos que comprenden una porción más grande de
una secuencia de aminoácidos del invento, que contienen de 30 a 50
aminoácidos, o cualquier longitud hasta, e incluyendo, la secuencia
completa de aminoácidos de un polipéptido del invento, son también
útiles para provocar anticuerpos que reaccionen con la proteína.
Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del péptido que lleva
epítopo es seleccionada para conseguir una solubilidad sustancial
en disolventes acuosos (es decir, la secuencia incluye restos
relativamente hidrófilos y se evitan preferiblemente los restos
hidrófobos), y se prefieren particularmente las secuencias que
contienen restos de prolina. Todos los polipéptidos mostrados en la
lista de secuencias contienen epítopos antigénicos para ser usados
de acuerdo con el presente invento; sin embargo, los epítopos
antigénicos específicamente diseñados incluyen los péptidos
definidos por las ID. SEC. números 7 y 8.
Las células de mamífero en cultivo son huéspedes
preferidos en el presente invento. Los métodos para introducir DNA
exógeno en células huésped de mamífero incluyen transfección mediada
por fosfato cálcico [Wigler et al., Cell 14: 725
(1.978); Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603
(1.981); y Graham y Van der Eb, Virology 52: 456 (1.973)],
electroporación [Neumann et al., EMBO J. 1:
841-845 (1.982)], transfección mediada por
DEAE-dextrano (Ausubel et al., redactores,
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,
Inc., New York, EE.UU., 1.987), y transfección mediada por
liposomas [Hawley-Nelson et al., Focus
15: 73 (1.993); y Ciccarone et al., Focus 15: 80
(1.993)], que se incorporan aquí por referencia. La producción de
polipéptidos recombinantes en células de mamífero en cultivo es
descrita, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de EE.UU.
nº 4.713.339; Hagen et al., Patente de EE.UU. nº 4.784.950;
Palmiter et al., Patente de EE.UU. nº 4.579.821; y Ringold,
Patente de EE.UU. nº 4.656.134. Las células de mamífero en cultivo
adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC
nº CRL 1650), COS-7 (ATCC nº CRL 1651), BHK (ATCC nº
CRL 1632), BHK 570 (ATCC nº CRL 10314), 293 (ATCC nº CRL 1573;
Graham et al., J. Gen. Virol. 36:
59-72, 1.977) y ovárica de hámster chino (por
ejemplo, CHO-K1, ATCC nº CCL 61). Líneas celulares
adecuadas adicionales son conocidas en la técnica y son asequibles
de depositarías públicas tales como la Colección Americana de
Cultivos Tipo (ATCC; del inglés, American Type Culture Collection),
Rockville, Maryland, EE.UU. En general, se prefieren promotores de
transcripción potentes, tales como promotores del virus 40 de
simios (SV-40; del inglés, simian
virus 40) o citomegalovirus; véase, por ejemplo, la Patente
de EE.UU. nº 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen los de
genes de la metalotioneína (Patentes de EE.UU. números 4.579.821 y
4.601.978) y el promotor tardío principal de adenovirus.
Se usa generalmente la selección por fármacos
para seleccionar las células de mamífero en cultivo en que se ha
insertado DNA extraño. A dichas células se hace comúnmente
referencia como "transfectantes". A las células que han sido
cultivadas en presencia del agente selectivo y son capaces de pasar
el gen de interés a su progenie se hace referencia como
"transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido
es un gen que codifica resistencia al antibiótico neomicina. La
selección es llevada a cabo en presencia de un fármaco de tipo
neomicina, tal como G-418 o similar. Pueden usarse
también sistemas de selección para aumentar el nivel de expresión
del gen de interés, un procedimiento al que se hace referencia como
"multiplicación". La multiplicación es llevada a cabo
cultivando transfectantes en presencia de un bajo nivel del agente
selectivo y aumentando luego la cantidad de agente selectivo para
seleccionar las células que producen niveles elevados de los
productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable y
multiplicable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere
resistencia al metotrexato. Pueden usarse también otros genes de
resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a higromicina,
resistencia a múltiples fármacos, y puromicina
acetiltransferasa).
Pueden usarse también otras células eucarióticas
superiores como huéspedes, incluyendo células de insectos, células
de plantas y células aviares. La transformación de células de
insectos y la producción de polipéptidos extraños en ellas son
descritas por Guarino et al., Patente de EE.UU. nº
5.162.222; Bang et al., Patente de EE.UU. nº 4.775.624; y la
publicación WIPO WO 94/06463, que se incorporan aquí por
referencia. El uso de Agrobacterium rhizogenes como un
vector para expresar genes en células de plantas ha sido revisado
por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:
47-58 (1.987).
En el presente invento pueden también usarse
células fúngicas, incluyendo células de levadura, y particularmente
células del género Saccharomyces, tal como para producir
fragmentos de receptor o fusiones de polipéptidos. Métodos para
transformar células de levadura con DNA exógeno y producir
polipéptidos recombinantes a partir de las mismas son descritos,
por ejemplo, por Kawasaki, Patente de EE.UU. nº 4.599.311; Kawasaki
et al., Patente de EE.UU. nº 4.931.373; Brake, Patente de
EE.UU. nº 4.870.008; Welch et al., Patente de EE.UU. nº
5.037.743; y Murray et al., Patente de EE.UU. nº 4.845.075.
Las células transformadas son seleccionadas mediante el fenotipo
determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la
resistencia a fármacos o la capacidad para crecer en ausencia de un
nutriente concreto (por ejemplo, leucina). Un sistema vector
preferido para uso en levadura es el sistema vector POT1
descrito por Kawasaki et al. (Patente de EE.UU. nº
4.931.373), que permite que las células transformadas sean
seleccionadas por crecimiento en medios que contienen glucosa. Los
promotores y terminadores adecuados para uso en levadura incluyen
los procedentes de genes de enzimas glicolíticas (véanse, por
ejemplo, Kawasaki, Patente de EE.UU. nº 4.599.311; Kingsman et
al., Patente de EE.UU. nº 4.615.974; y Bitter, Patente de
EE.UU. nº 4.977.092) y genes de alcohol deshidrogenasa; véanse
también las Patentes de EE.UU. números 4.990.446, 5.063.154,
5.139.936 y 4.661.454. En la técnica se conocen sistemas de
transformación para otras levaduras, incluyendo Hansenula
polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis,
Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia
methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa;
véanse, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol.
132: 3.459-3.465 (1.986), y Cregg, Patente de
EE.UU. nº 4.882.279. Pueden utilizarse células de
Aspergillus de acuerdo con los métodos de McKnight et
al., Patente de EE.UU. nº 4.935.349. Sumino et al.,
Patente de EE.UU. nº 5.162.228, describen métodos para transformar
Acremonium chrysogenum. Lambowitz, Patente de EE.UU. nº
4.486.533, describe métodos para transformar Neurospora.
Las células huésped transformadas o transfectadas
son cultivadas de acuerdo con procedimientos convencionales en un
medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes
requeridos para el desarrollo de las células huésped escogidas. En
la técnica se conoce una diversidad de medios adecuados, incluyendo
medios definidos y medios complejos, medios que incluyen
generalmente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno,
aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios pueden
también contener componentes tales como factores de crecimiento o
suero, según se requiera. El medio de desarrollo seleccionará
generalmente las células que contengan el DNA exógenamente añadido,
mediante, por ejemplo, selección por fármacos o deficiencia en un
nutriente esencial que es complementado por el marcador
seleccionable llevado por el vector de expresión o introducido en la
célula huésped por cotransfección.
En un aspecto del presente invento, un nuevo
receptor es producido por una célula en cultivo, y la célula es
usada para explorar ligandos para el receptor, incluyendo el
ligando natural, así como agonistas y antagonistas del ligando
natural. Para resumir este planteamiento, un cDNA o gen que codifica
el receptor es combinado con otros elementos genéticos requeridos
para su expresión (por ejemplo, un promotor de transcripción), y el
vector de expresión resultante es insertado en una célula huésped.
Las células que expresan el DNA y producen un receptor funcional son
seleccionadas y son usadas en una diversidad de sistemas de
exploración.
Las células de mamífero adecuadas para uso en la
expresión de receptores Zcytor11 y la transducción de una señal
mediada por el receptor incluyen células que expresan otras
subunidades de receptor que pueden formar un complejo funcional con
Zcytor11. Estas subunidades pueden incluir las de la familia de
receptores de interferones o de otros receptores citoquínicos de
clase II o clase I. También se prefiere usar una célula de la misma
especie que la del receptor que se va a expresar. En una
realización preferida, para su proliferación, la célula depende de
un factor de crecimiento hematopoyético exógenamente suministrado.
Son líneas celulares preferidas de este tipo la línea celular
TF-1 humana (ATCC número CRL-2003) y
la línea celular AML-193 (ATCC número
CRL-9589), que son líneas celulares leucémicas
humanas dependientes de GM-CSF, y BaF3 [Palacios y
Steinmetz, Cell 41: 727-734 (1.985)], que es
una línea de células pre-B murinas dependiente de
IL-3. Otras líneas celulares incluyen las células
BHK, COS-1 y CHO.
Pueden construirse células huésped adecuadas para
que produzcan las subunidades de receptor necesarias u otro
componente celular necesario para la respuesta celular deseada. Este
planteamiento es ventajoso porque pueden construirse líneas
celulares para que expresen subunidades de receptor de cualquier
especie, superando por ello las posibles limitaciones que surjan de
la especificidad de especie. Pueden clonarse ortólogos de especie
del cDNA de receptor humano y usarse en líneas celulares de la
misma especie, tal como cDNA de ratón en la línea celular BaF3. De
este modo pueden construirse líneas celulares que dependan de un
factor de crecimiento hematopoyético, tal como
GM-CSF o IL-3, para que se vuelvan
dependientes de un ligando de Zcytor11.
Células que expresan un receptor funcional son
usadas en ensayos de exploración. En la técnica se conocen diversos
ensayos adecuados. Estos ensayos se basan en la detección de una
respuesta biológica en una célula diana. Uno de tales ensayos es un
ensayo de proliferación celular. Se cultivan células en presencia o
ausencia de un compuesto de ensayo y se detecta la proliferación
celular, por ejemplo, midiendo la incorporación de timidina
tritiada o mediante un ensayo colorimétrico basado en la
descomposición metabólica de bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
[MTT; Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63
(1.983)]. En una forma de ensayo alternativa se utilizan células
que están adicionalmente construídas para que expresen un gen
informador. El gen informador está ligado a un elemento promotor
que es sensible a la ruta ligada al receptor, y mediante el ensayo
se detecta la activación de la transcripción del gen informador. A
este respecto, un elemento promotor preferido es un elemento de
respuesta a suero o SRE (del inglés, serum response element);
véase, por ejemplo, Shaw et al., Cell 56;
563-572 (1.989). Un gen preferido de dichos genes
informadores es un gen de luciferasa [de Wet et al., Mol.
Cell. Biol. 7: 725 (1.987)]. La expresión del gen de
luciferasa es detectada por luminiscencia usando métodos conocidos
en la técnica [por ejemplo, Baumgartner et al., J. Biol.
Chem. 269: 29.094-29.101 (1.994); Schenborn y
Goiffin, Promega_Notes 41: 11 (1.993)]. Los sistemas para
ensayo de actividad luciferasa pueden obtenerse comercialmente de,
por ejemplo, Promega Corp., Madison, Wisconsin, EE.UU. Pueden usarse
líneas celulares diana de este tipo para explorar bancos de
productos químicos, medios de cultivo acondicionados por células,
caldos fúngicos, muestras de suelo, muestras de agua, y similares.
Por ejemplo, un banco de muestras de medios acondicionados por
células puede ser analizado en una célula diana para identificar las
células que producen ligando. Las células positivas son luego
usadas para producir un banco de cDNA en un vector de expresión de
mamífero, el cual es dividido en colecciones, introducido en
células huésped por transfección, y dejado expresar. Las muestras de
medios procedentes de las células transfectadas son luego
analizadas, con la subsiguiente división de colecciones,
retransfección, subcultivo y reanálisis de células positivas, para
aislar un cDNA clonado que codifica el ligando.
Puede identificarse también un ligando natural
para el receptor Zcytor11 al someter a mutagénesis una línea celular
que expresa el receptor y cultivarla bajo condiciones que permitan
seleccionar un crecimiento autocrino; véase la publicación WIPO WO
95/21930. En un procedimiento típico, células BaF3 dependientes de
IL-3 que expresan Zcytor11 y las necesarias
subunidades adicionales son sometidas a mutagénesis, tal como con
metanosulfonato de etilo (EMS). Después se deja que las células se
recuperen en presencia de IL-3 y luego se
transfieren a un medio de cultivo que carece de
IL-3 e IL-4. Las células
supervivientes son exploradas en cuanto a la producción de un
ligando de Zcytor11, tal como añadiendo receptor soluble al medio
de cultivo o analizando medios acondicionados en células BaF3 de
tipo silvestre y células BaF3 que expresan el receptor.
Un planteamiento de exploración adicional
proporcionado por el presente invento incluye el uso de polipéptidos
de receptor híbridos. Estos polipéptidos híbridos se dividen en dos
clases generales. En la primera clase, el dominio intracelular de
Zcytor11, que comprende aproximadamente los restos 252 a 574 de la
ID. SEC. nº 2, está unido al dominio de unión a ligandos de un
segundo receptor. Se prefiere que el segundo receptor sea un
receptor de citoquinas hematopoyéticas, tal como el receptor mpl
[Souyri et al., Cell 63: 1.137-1.147
(1.990)]. El receptor híbrido comprenderá además un dominio
transmembranal, que puede proceder de cualquier receptor. Una
construcción de DNA que codifica el receptor híbrido es luego
insertada en una célula huésped. Las células que expresan el
receptor híbrido son cultivadas en presencia de un ligando para el
dominio de unión y son analizadas en cuanto a una respuesta. Este
sistema proporciona un medio para analizar la transducción de
señales mediada por Zcytor11 mientras se usan ligandos fácilmente
asequibles. Este sistema puede ser también usado para determinar si
líneas celulares particulares son capaces de responder a señales
transducidas por Zcytor11. Una segunda clase de polipéptidos de
receptor híbridos comprende el dominio extracelular (de unión a
ligandos) de Zcytor11 (aproximadamente los restos 18 a 228 de la
ID. SEC. nº 2) con un dominio intracelular de un segundo receptor,
preferiblemente un receptor de citoquinas hematopoyéticas, y un
dominio transmembranal. Los receptores híbridos de esta segunda
clase se expresan en células de las que se sabe que son capaces de
responder a señales transducidas por el segundo receptor. Juntas,
estas dos clases de receptores híbridos permiten la identificación
de un tipo celular sensible para el desarrollo de un ensayo para
detectar un ligando de Zcytor11.
Las células en que se ha hallado la expresión del
ligando son luego usadas para preparar un banco de cDNA a partir del
cual puede aislarse del modo anteriormente descrito el cDNA que
codifica el ligando. De este modo, el presente invento proporciona,
además de nuevos polipéptidos de receptor, métodos para clonar
ligandos polipeptídicos para los receptores.
La especificidad tisular de la expresión de
Zcytor11 sugiere un papel en el desarrollo del páncreas, el
intestino delgado, el colon y el timo. A la vista de la
especificidad tisular observada para este receptor, los agonistas
(incluyendo el ligando natural) y antagonistas tienen un enorme
potencial en aplicaciones tanto in vitro como in
vivo. Los compuestos identificados como agonistas de receptor
son útiles para estimular la proliferación y el desarrollo de
células diana in vitro e in vivo. Por ejemplo, los
compuestos agonistas son útiles como componentes de medios de
cultivo celular definidos y pueden ser usados solos o en combinación
con otras citoquinas y hormonas para reemplazar el suero que se usa
comúnmente en el cultivo celular. Los agonistas o antagonistas
pueden ser útiles para regular específicamente el crecimiento y/o
el desarrollo de células de origen pancreático, gastrointestinal o
tímico en cultivo. Estos compuestos son útiles como reactivos de
investigación para caracterizar sitios de interacción
ligando-receptor. In vivo, los agonistas o
antagonistas de receptor pueden hallar aplicación en el tratamiento
de enfermedades pancreáticas, gastrointestinales o tímicas.
Los agonistas o antagonistas relativos a Zcytor11
pueden incluir pequeñas familias de péptidos. Estos péptidos pueden
ser identificados empleando condiciones de selección por afinidad
que son conocidas en la técnica, a partir de una población de
candidatos presente en un banco de péptidos. Los bancos de péptidos
incluyen bancos combinatorios sintetizados químicamente y
presentados en un soporte sólido [Lam et al., Nature
354: 82-84 (1.991)] o en disolución [Houghten
et al., BioTechniques 13: 412-421
(1.992)], expresados y luego ligados a DNA plasmídico [Cull et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
1.865-1.869 (1.992)], o expresados y posteriormente
desplegados en las superficies de virus o células [Boder y Wittrup,
Nature Biotechnology 15: 553-557 (1.997);
Cwirla et al., Science 276:
1.696-1.699 (1.997)].
Zcytor11 puede ser también usado en sistemas
diagnósticos para la detección de niveles de ligando circulante. En
una realización relacionada, anticuerpos u otros agentes que se
unen específicamente a Zcytor11 pueden ser usados para detectar
polipéptidos de receptor circulantes. Niveles elevados o reducidos
de polipéptidos de ligando o receptor pueden ser indicativos de
estados patológicos, incluyendo el cáncer.
Pueden prepararse polipéptidos de receptor
Zcytor11 al hacer que se exprese un DNA truncado que codifica el
dominio extracelular, por ejemplo, un polipéptido que contenga los
restos 18 a 228 de un receptor Zcytor11 humano (ID. SEC. nº 2) o la
correspondiente región de un receptor no humano. Se prefiere que los
polipéptidos de dominio extracelular sean preparados en una forma
sustancialmente exenta de segmentos polipeptídicos transmembranales
e intracelulares. Por ejemplo, el extremo C del polipéptido de
receptor puede estar en el resto 228 de la ID. SEC. nº 2 o en la
correspondiente región de una variante alélica o un receptor no
humano. Para dirigir la salida del dominio de receptor desde la
célula huésped, el DNA de receptor es unido a un segundo segmento
de DNA que codifica un péptido secretor, tal como un péptido
secretor t-PA. Para facilitar la purificación del
dominio de receptor secretado, una prologación
C-terminal, tal como una etiqueta de polihistidina,
sustancia P, péptido Flag™ [Hopp et al., Biotechnology
6: 1.204-1.210 (1.988); asequible de Eastman
Kodak Co., New Haven, Connecticut, EE.UU.] u otro polipéptido o
proteína para el cual se dispone de un anticuerpo u otro agente
ligante específico, puede fusionarse con el polipéptido de
receptor.
En un planteamiento alternativo, un dominio
extracelular de receptor puede ser expresado como una fusión con
regiones constantes de cadena pesada inmunoglobulínica, típicamente
un fragmento F_{C}, que contiene dos dominios de región constante
y una región bisagra pero carece de la región variable. Dichas
fusiones son típicamente secretadas como moléculas multímeras en que
las porciones F_{C} están enlazadas entre sí por disulfuros y dos
polipéptidos de receptor están dispuestos muy próximos uno de otro.
Las fusiones de este tipo pueden ser usadas para purificar por
afinidad el ligando afín de una disolución, como una herramienta de
ensayo in vitro, para bloquear señales in vitro al
titular específicamente el ligando, y como antagonistas in
vivo al administrarlas parenteralmente para que se unan al
ligando circulante y lo eliminen de la circulación. Para purificar
el ligando, se añade una quimera Zcytor11-Ig a una
muestra que contiene el ligando (por ejemplo, medios de cultivo
acondicionados por células, o extractos tisulares) bajo condiciones
que facilitan la unión receptor-ligando
(típicamente, una temperatura, un pH y una fuerza iónica casi
fisiológicas). El complejo quimera-ligando es luego
separado de la mezcla usando proteína A que está inmovilizada en un
soporte sólido (por ejemplo, glóbulos de resina insoluble). El
ligando es luego eluido usando técnicas químicas convencionales,
tal como con un gradiente de sal o pH. Alternativamente, la propia
quimera puede ser unida a un soporte sólido, llevándose a cabo la
unión y la elución como antes. Las quimeras pueden ser usadas in
vivo para regular funciones gastrointestinales, pancreáticas o
tímicas. Las quimeras con alta afinidad de unión se administran
parenteralmente (por ejemplo, mediante inyección intramuscular,
subcutánea o intravenosa). Las moléculas circulantes se unen al
ligando y son eliminadas de la circulación mediante procesos
fisiológicos normales. Para uso en ensayos, las quimeras se unen a
un soporte a través de la región F_{C} y se usan en forma de
ensayo de inmunosorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés,
enzyme-linked immunosorption assay).
En un sistema de ensayo preferido en que se
emplea un fragmento de receptor de unión a ligando se usa un
instrumento biosensor comercialmente asequible (BIAcore™, Pharmacia
Biosensor, Piscataway, New Jersey, EE.UU.), fragmento de receptor
que está inmovilizado en la superficie de un chip receptor. El uso
de este instrumento es descrito por Karlsson, J. Immunol.
Methods 145: 229-240 (1.991) y por Cunningham y
Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-563 (1.993). Un
fragmento de receptor es fijado covalentemente, usando una química
de aminas o sulfhidrilos, a fibras de dextrano que están fijadas a
una película de oro en la célula de flujo. Una muestra de ensayo es
hecha pasar a través de la célula. Si está presente ligando en la
muestra, se unirá al polipéptido de receptor inmovilizado, lo que
causará un cambio en el índice de refracción del medio, cambio que
es detectado como un cambio en la resonancia del plasmón de
superficie de la película de oro. Este sistema permite la
determinación de velocidades de asociación y disociación, a partir
de las cuales puede calcularse la afinidad de unión, y la
valoración de la estequiometría de la unión.
Los polipéptidos de receptor de unión a ligandos
pueden ser también usados en otros sistemas de ensayo conocidos en
la técnica. Dichos sistemas incluyen el análisis de Scatchard para
determinación de la afinidad de unión [véase Scatchard, Ann. NY
Acad. Sci. 51: 660-672 (1.949)] y ensayos
calorimétricos [Cunningham et al., Science 253:
545-548 (1.991); Cunningham et al.,
Science 254: 821-825 (1.991)].
Un polipéptido de receptor de unión a ligandos
pueden ser también usado para la purificación del ligando. El
polipéptido de receptor es inmovilizado en un soporte sólido, tal
como glóbulos de agarosa, agarosa reticulada, vidrio, resinas
celulósicas, resinas basadas en sílice, poliestireno, poliacrilamida
reticulada o materiales similares que son estables bajo las
condiciones de uso. Los métodos para unir polipéptidos a soportes
sólidos son conocidos en la técnica e incluyen química de aminas,
activación con bromuro de cianógeno, activación con
N-hidroxisuccinimida, activación con epóxidos,
activación con sulfhidrilos y activación con hidrazina. Los medios
resultantes serán generalmente configurados en forma de columna, y
los fluidos que contienen ligando son hechos pasar a través de la
columna una o más veces para permitir que el ligando se una al
polipéptido de receptor. El ligando es luego eluido usando cambios
en la concentración salina o el pH para deshacer la unión
ligando-receptor.
Los polipéptidos Zcytor11 pueden ser también
usados para preparar anticuerpos que se unan específicamente a
polipéptidos Zcytor11. Como se usa aquí, el término
"anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales, anticuerpos de cadena única y fragmentos ligantes de
antígeno de los mismos, tales como fragmentos F(ab')_{2} y
Fab, y similares, incluyendo anticuerpos genéticamente construidos.
Se define que los anticuerpos son específicamente ligantes si se
unen a un polipéptido Zcytor11 con una K_{a} superior o igual a
10^{7} /M. La afinidad de un anticuerpo monoclonal puede ser
fácilmente determinada por quien tiene una experiencia normal en la
técnica (véase, por ejemplo, Scatchard, ibídem).
Los métodos para preparar anticuerpos
policlonales y monoclonales son bien conocidos en la técnica;
véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, New York,
EE.UU. (1.989), y J. G. R. Hurrell, redactor, Monoclonal
Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press,
Inc., Boca Raton, Florida, EE.UU. (1.982), que se incorporan aquí
por referencia. Como resulta evidente a quien tiene una experiencia
normal en la técnica, pueden generarse anticuerpos policlonales en
una diversidad de animales de sangre caliente, tales como caballos,
vacas, cabras, ovejas, perros, gallinas, conejos, ratones y ratas.
La inmunogenicidad de un polipéptido Zcytor11 puede ser aumentada
por medio del uso de un adyuvante, tal como adyuvante completo o
incompleto de Freund. Una diversidad de ensayos conocidos por los
expertos en la técnica pueden ser utilizados para detectar
anticuerpos que se unan específicamente a polipéptidos Zcytor11. En
Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (redactores),
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1.988), se describen con
detalle ensayos ejemplares. Los ejemplos representativos de dichos
ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente,
radioinmunoensayos, radioinmunoprecipitaciones, ensayos de
inmunosorción con enzimas ligadas (ELISA), ensayos de transferencia
en forma de manchas, ensayos de inhibición o competición, y ensayos
de tipo sándwich.
Los anticuerpos hacia Zcytor11 pueden ser usados
para etiquetar células que expresan el receptor, para purificación
por afinidad, en ensayos diagnósticos para determinar niveles de
polipéptidos de receptor solubles circulantes, y como antagonistas
para bloquear la unión al ligando y la transducción de señales in
vitro e in vivo.
Los anticuerpos antiidiotípicos que se unen al
sitio de unión antigénica de anticuerpos hacia Zcytor11 son también
considerados parte del presente invento. De este modo, la región de
unión antigénica del anticuerpo antiidiotípico remedará la región
de unión a ligandos de Zcytor11. De este modo, un anticuerpo
antiidiotípico podría ser usado para explorar posibles ligandos del
receptor Zcytor11. De este modo, anticuerpos neutralizantes hacia
Zcytor11 pueden ser usados para producir anticuerpos
antiidiotípicos mediante métodos bien conocidos en la técnica, como
se describe en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (Cold Spring Harbor,
New York, EE.UU., 1.989), y J. G. R. Hurrell, redactor,
Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications
(CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, EE.UU., 1.982).
Zcytor11 mapea en 84.62 cR desde la parte
superior del cromosoma humano, un grupo de ligamiento del mapa de
híbridos por radiación del WICGR. El uso de marcadores circundantes
situaba a Zcytor11 en la región 1p35.2 a 35.1.
Por lo tanto, podría usarse Zcytor11 para generar
una sonda que pudiera permitir la detección de una aberración del
gen Zcytor11 en el cromosoma 1p, lo que puede indicar la presencia
de unas células cancerosas o una predisposición al desarrollo de
células cancerosas. Esta región del cromosoma 1 está frecuentemente
implicada en deleciones visibles o pérdida de heterocigosidad en
tumores procedentes de las células de las crestas neurales,
particularmente neuroblastomas y melanomas. Para más discusiones
sobre desarrollo de sondas polinucleotídicas e hibridación, véase
Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et
al., redactores (John Wiley and Sons Inc., 1.991).
El invento es adicionalmente ilustrado mediante
los siguientes ejemplos no restrictivos.
Zcytor11 fue clonado a partir de un banco de cDNA
de células de islotes pancreáticos, producido de acuerdo con el
procedimiento siguiente. RNA extraído de células de islotes
pancreáticos fue inversamente transcrito de la manera siguiente. La
mezcla de reacción para cDNA de primera cadena contenía 10 \mul
de poli (A)+ mRNA seleccionado con poli d(T), de células de
islotes pancreáticos humanos (Clontech, Palo Alto, California,
EE.UU.), en una concentración de 1,0 mg/ml, y 2 \mul del cebador
ZC6171 (ID. SEC. nº 6) de primera cadena, en una concentración de
20 picomoles/\mul, que contenía un sitio de restricción
Xho I. La mezcla fue calentada a 70ºC durante 2,5 minutos y
fue enfriada mediante refrigeración sobre hielo. La síntesis del
cDNA de primera cadena fue iniciada mediante la adición de 8 \mul
de tampón para primera cadena (tampón SUPERSCRIPT® 5x; Life
Technologies, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.), 4 \mul de
ditiotreitol 100 mM y 3 \mul de una disolución de trifosfatos de
desoxinucleótidos (dNTP; del inglés, deoxynucleotide
triphosphate) que contenía dTTP, dATP, dGTP y
5-metil-dCTP (Pharmacia LKB
Biotechnology, Piscataway, New Jersey, EE.UU.), cada uno en una
concentración 10 mM, a la mezcla de RNA-cebador. La
mezcla de reacción fue incubada a 40ºC durante 2 minutos, lo que
fue seguido de la adición de 10 \mul de transcriptasa inversa
RNAsa H^{-} (SUPERSCRIPT II®; Life Technologies) en una
concentración de 200 U/\mul. La eficacia de la síntesis de la
primera cadena fue analizada en una reacción paralela mediante la
adición de 3,7 x 10^{5} Bq de
^{32}P-\alphadCTP a una parte alícuota de 5
\mul de una de las mezclas de reacción, para marcar la reacción
para análisis. Las mezclas de reacción fueron incubadas a 40ºC
durante 5 minutos, a 45ºC durante 50 minutos y luego a 50ºC durante
10 minutos. El ^{32}P-\alphadCTP no incorporado
de la mezcla de reacción marcada fue separado por cromatografía en
una columna de filtración en gel con un tamaño de poro de 400
(Clontech Laboratories, Palo Alto, California, EE.UU.). Los
nucleótidos y cebadores no incorporados de las mezclas de reacción
para primera cadena no marcadas fueron separados por cromatografía
en una columna de filtración en gel con un tamaño de poro de 400
(Clontech Laboratories, Palo Alto, California, EE.UU.). La longitud
del cDNA de primera cadena marcado fue determinada por
electroforesis en gel de agarosa.
La mezcla de reacción para la segunda cadena
contenía 102 \mul del cDNA de primera cadena no marcado, 30 \mul
de tampón para polimerasa I 5x (Tris:HCl 125 mM, pH de 7,5, KCl,
500 mM, MgCl_{2} 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 50 mM),
2,0 \mul de ditiotreitol 100 mM, 3,0 \mul de una disolución que
contenía cada trifosfato de desoxinucleótido en una concentración
10 mM, 7 \mul de \beta-NAD 5 mM, 2,0 \mul de
DNA ligasa de E. coli (New England Biolabs, Beverley,
Massachusetts, EE.UU.) en una concentración de 10 U/\mul, 5
\mul de DNA polimerasa I de E. coli (New England Biolabs,
Beverley, Massachusetts, EE.UU.) en una concentración de 10
U/\mul, y 1,5 \mul de RNAsa H (Life Technologies, Gaithersburg,
Maryland, EE.UU.) en una concentración de 2 U/\mul. Una parte
alícuota de 10 \mul de una de las mezclas de reacción para
síntesis de la segunda cadena fue marcada mediante la adición de 3,7
x 10^{5} Bq de ^{32}P-\alphadCTP, para
controlar la eficacia de la síntesis de la segunda cadena. Las
mezclas de reacción fueron incubadas a 16ºC durante 2 horas, lo que
fue seguido de la adición de 1 \mul de una disolución 10 mM de
dNTP y 6,0 \mul de DNA polimerasa de T4 (10 U/\mul; Boehringer
Mannheim, Indianápolis, Indiana, EE.UU.), y fueron incubadas durante
10 minutos más a 16ºC. El ^{32}P-\alphadCTP no
incorporado de la mezcla de reacción marcada fue separado por
cromatografía a través de una columna de filtración en gel con un
tamaño de poro de 400 (Clontech Laboratories, Palo Alto,
California, EE.UU.), antes del análisis por electroforesis en gel
de agarosa. La reacción fue terminada mediante la adición de 10,0
\mul de EDTA 0,5 M y extracción con fenol/cloroformo y cloroformo
seguida de precipitación con etanol en presencia de acetato sódico
3,0 M y 2 \mul de agente coprecipitante Pellet Paint (Novagen,
Madison, Wisconsin, EE.UU.). Se estimó que la producción de cDNA
era aproximadamente 2 \mug a partir de 10 \mug de molde de mRNA
de partida.
Se ligaron adaptadores Eco RI a los
extremos 5' del cDNA anteriormente descrito, para permitir la
clonación en un vector de expresión. Se mezclaron una parte
alícuota de 12,5 \mul de cDNA (\sim2,0 \mug) y 3 \mul de
adaptador Eco RI (Pharmacia LKB Biotechnology Inc.,
Piscataway, New Jersey, EE.UU.) en una concentración de 69
picomoles/\mul, con 2,5 \mul de tampón para ligasa 10x
(Tris-HCl 660 mM, pH de 7,5, MgCl_{2} 100 mM),
2,5 \mul de ATP 10 mM, 3,5 \mul de DTT 0,1 M, y 1 \mul de DNA
ligasa de T4 (Promega Corp., Madison, Wisconsin, EE.UU.) en una
concentración de 15 U/\mul. La mezcla de reacción fue incubada 1
hora a 5ºC, 2 horas a 7,5ºC, 2 horas a 10ºC, 2 horas a 12,5ºC y 16
horas a 10ºC. La reacción fue terminada mediante la adición de 65
\mul de H_{2}O y 10 \mul de tampón H 10x (Boehringer
Mannheim, Indianápolis, Indiana, EE.UU.) e incubación a 70ºC durante
20 minutos.
Para facilitar la clonación direccional del cDNA
en un vector de expresión, el cDNA fue sometido a digestión con
Xho I para dar lugar a un cDNA que tenía un extremo cohesivo
Eco RI 5' y un extremo cohesivo Xho I 3'. El sitio de
restricción Xho I del extremo 3' del cDNA había sido
previamente introducido. La digestión con enzima de restricción fue
llevada a cabo en una mezcla de reacción mediante la adición de 1,0
\mul de Xho I (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana,
EE.UU.) en una concentración de 40 U/\mul. La digestión fue
llevada a cabo a 37ºC durante 45 minutos. La reacción fue terminada
por incubación a 70ºC durante 20 minutos y cromatografía a través de
una columna de filtración en gel con un tamaño de poro de 400
(Clontech Laboratories, Palo Alto, California, EE.UU.).
El cDNA fue precipitado con etanol, lavado con
etanol al 70%, dejado secar al aire y resuspendido en 10,0 \mul de
agua, 2 \mul de tampón para quinasa 10x (Tris-HCl
660 mM, pH de 7,5, MgCl_{2} 100 mM), 0,5 \mul de DTT 0,1 M, 2
\mul de ATP 10 mM y 2 \mul de polinucleótido quinasa de T4 (10
U/\mul, Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.).
Después de una incubación a 37ºC durante 30 minutos, el cDNA fue
precipitado con etanol en presencia de acetato amónico 2,5 M y fue
sometido a electroforesis en un gel de agarosa de bajo punto de
fusión al 0,8%. Los adaptadores contaminantes y el cDNA con una
longitud inferior a 0,6 kb fueron escindidos del gel. Los
electrodos fueron invertidos y el cDNA fue sometido a electroforesis
hasta que quedó concentrado cerca del origen del carril. La zona
del gel que contenía el cDNA concentrado fue escindida y fue
introducida en un tubo de microcentrífuga, y se determinó el volumen
aproximado de la rodaja de gel. Se añadieron al tubo una parte
alícuota de agua de aproximadamente tres veces el volumen de la
rodaja de gel (300 \mul) y 35 \mul de tampón para
\beta-agarosa I 10x (New Englands Biolabs) y se
fundió la agarosa por calentamiento a 65ºC durante 15 minutos. Tras
ser equilibrada la muestra a 45ºC, se añadieron 3 \mul de
\beta-agarosa I (New Englands Biolabs, Beverley,
Massachusetts, EE.UU.) en una concentración de 1 U/\mul y se
incubó la mezcla durante 60 minutos a 45ºC para digerir la agarosa.
Después de la incubación, se añadieron 40 \mul de acetato sódico
3 M a la mezcla y se incubó la mezcla sobre hielo durante 15
minutos. La muestra fue centrifugada a 14.000 x g durante 15 minutos
a temperatura ambiental para separar la agarosa no digerida. El
cDNA fue precipitado con etanol, lavado en etanol al 70%, dejado
secar al aire y resuspendido en 40 \mul de agua.
Tras su recuperación del gel de agarosa de bajo
punto de fusión, el cDNA fue clonado en los sitios Eco RI y
Xho I del vector pBLUESCRIPT SK+ (Gibco/BRL, Gaithersburg,
Maryland, EE.UU.) y fue introducido en células DH10B por
electroporación. Se identificaron colonias bacterianas que contenían
etiquetas de secuencias expresadas (EST; del inglés,
expressed sequence tags) de genes conocidos y
se eliminaron del análisis de secuencias por ciclos reiterativos
de hibridación de sondas con series de filtros de colonias de alta
densidad (Genome Systems, St. Louis, Michigan, EE.UU.). Se reunieron
cDNAs de genes conocidos en grupos de 50-100
insertos y se marcaron con ^{32}P-\alphadCTP
usando un sistema de marcación MEGAPRIME (Amersham, Arlington
Heights, Illinois, EE.UU.). Las colonias que no se hibridaron con la
mezcla de sondas fueron seleccionadas para secuenciación. La
secuenciación fue realizada usando un secuenciador ABI 377 usando el
cebador de T3 o el cebador inverso. Se analizaron los datos
resultantes, lo que dio lugar a la identificación de la EST
LISF104376 (ID. SEC. nº 3).
La etiqueta de secuencia expresada (EST)
LISF104376 (ID. SEC. nº 3) contenida en el plásmido pSLIS4376 fue
aislada de un banco de cDNA de células de islotes pancreáticos
humanos. Después de la secuenciación del inserto de cDNA pSLIS4376
entero, se determinó que no codificaba un polipéptido Zcytor11 de
longitud completa.
Un cDNA que codificaba Zcytor11 de longitud
completa fue aislado al explorar un banco de cDNA de islotes humanos
usando una sonda que fue generada por los cebadores de PCR ZC14,295
(ID. SEC. nº 4) y ZC14294 (ID. SEC. nº 5) y el molde pSLIS4376 (para
detalles sobre la construcción del banco de cDNA de células de
islotes pancreáticos, véase el Ejemplo 2 más adelante). La sonda
resultante de 276 pares de bases (bp; del inglés, base
pairs), que contenía los nucleótidos 142 a 417 de la ID.
SEC. nº 1, fue purificada por cromatografía a través de una columna
para centrifugación con un tamaño de poro de 100 (Clontech
Laboratories, Palo Alto, California, EE.UU.). La sonda purificada
fue marcada con ^{32}P-\alphaCTP usando un
sistema de marcación MEGAPRIME® (Amersham Corp., Arlington Heights,
Illinois, EE.UU.). La sonda marcada fue purificada en una columna
de purificación NUCTRAP® (Stratagene Cloning Systems, La Jolla,
California, EE.UU.) para la exploración de bancos.
Después de la recuperación del cDNA de islotes de
un gel de agarosa de bajo punto de fusión del Ejemplo 1, el cDNA fue
clonado en los sitios Eco RI y Xho I de pBLUESCRIPT
SK+ (Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.) y fue introducido en
células DH10B por electroporación. Clones bacterianos del banco de
cDNA resultante fueron dispuestos individualmente en una cuadrícula
de unas series de filtros de colonias de alta densidad (Genome
Systems, St. Louis, Michigan, EE.UU.) y fueron sondados con la
sonda Zcytor11 marcada anteriormente descrita. También se preparó un
depósito glicerólico de cada clon en cada cuadrícula para acelerar
el aislamiento de clones positivos. Los filtros fueron primero
prelavados en una disolución acuosa que contenía citrato sódico
estándar (SSC; del inglés, standard sodium
citrate) 0,25x, dodecilsulfato sódico (SDS; del inglés,
sodium dodecyl sulfate) al 0,25% y EDTA 1 mM
para eliminar los fragmentos celulares y fueron luego prehibridados
en una disolución de hibridación (SSC 5x, disolución de Denhardt
5x, SDS al 0,2% y EDTA 1 mM) que contenía 100 \mug/ml de DNA de
esperma de salmón cizallado y térmicamente desnaturalizado.
Cincuenta nanogramos de la sonda Zcytor11
procedente de PCR fueron radiomarcados con
^{32}P-\alphadCTP mediante cebado aleatorio
usando el sistema de marcación de DNA MEGAPRIME® (Amersham,
Arlington Heights, Illinois, EE.UU.). La disolución de
prehibridación fue sustituida por disolución de hibridación fresca
que contenía 1 x 10^{6} cpm/ml de sonda y fue dejada hibridar a
65ºC durante la noche. Los filtros fueron lavados en un tampón de
lavado que contenía SSC 0,25x, SDS al 0,25% y EDTA 1 mM, a
65ºC.
Después de la autorradiografía, se detectaron
tres señales entre 40.000 clones en las cuadrículas de la serie de
filtros. De las coordenadas de cuadrícula de las señales positivas,
se recuperaron los clones correspondientes,
pSLR11-1, pSLR11-2 y
pSLR11-3, del depósito glicerólico y se secuenciaron
sus insertos. Se determinó que el inserto de
pSLR11-1 tenía 2.831 pares de bases (bp) y
codificaba el polipéptido Zcytor11 de longitud completa.
Poli(A)+ RNAs aislados de cerebro, colon,
corazón, riñón, hígado, pulmón, ovario, páncreas, próstata,
placenta, leucocitos de sangre periférica, estómago, bazo, músculo
esquelético, intestino delgado, testículo, timo, tiroides, médula
espinal, ganglio linfático, tráquea, glándula suprarrenal y médula
ósea fueron hibridados bajo condiciones de alto rigor con una sonda
de DNA radiomarcada que contenía los nucleótidos
181-456 de la ID. SEC. nº 1. Se obtuvieron membranas
de Clontech. Las membranas fueron lavadas con SSC 0,1x, SDS al 0,1%
a 50ºC y fueron sometidas durante 24 horas a autorradiografía. Los
niveles de mRNA fueron máximos en el páncreas, con bajos niveles en
colon, intestino delgado y timo. La localización de mRNA del
receptor sugiere que Zcytor11 puede regular funciones
gastrointestinales, pancreáticas o tímicas.
Zcytor11 fue mapeado en el cromosoma 1 usando la
versión comercialmente asequible del "Genebridge 4 Radiation
Hybrid Panel" del Whitehead Institute/MIT Center for Genome
Research (Research Genetics, Inc., Huntsville, Alabama, EE.UU.). El
grupo Genebridge 4 de híbridos por radiación contiene DNAs,
multiplicables por PCR, de cada uno de 93 clones híbridos por
radiación, más dos DNAs testigo (el donante HFL y el receptor A23).
Un servidor de Internet públicamente asequible
(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)
permite mapear con relación al mapa de híbridos por radiación del
genoma humano del Whitehead Institute/MIT Center for Genome
Research (el mapa de híbridos por radiación "WICGR"), que fue
construido con el grupo Genebridge 4 de híbridos por radiación.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: ZymoGenetics, Inc.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: RECEPTOR CITOQUÍNICO DE MAMÍFERO - 11
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Zymogenetics
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1201 Eastlake Ave East
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Seattle
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Washington
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 98102
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows, versión 2.0
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS PREVIOS DE LA SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/906,713
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de AGOSTO de 1.997
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Lunn, Paul G.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32,743
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 97-52PC
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 206-442-6627
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 206-442-6678
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.831 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- REPRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia de codificación
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 34...1.755
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 574 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 2:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 354 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 4:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACATCCTGA CGTGGGACAG CGGGCCAGAG
\hfill30
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: Sí
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 5:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAGGTCACA TCAGGTGGCT TGAGGGTAGT
\hfill30
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 6:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTGGGTTC GCTACTCGAG GCGGCCGCTA TTTTTTTTTT TTTTTTTT
\hfill48
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp
Trp Val Ala Lys Lys}
\sac{Gly Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp
Gly His Arg Leu Thr}
\sac{Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 211 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Lue Phe Ser Met
Gly Phe Leu Val Ala}
\sac{Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. Nº 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 323 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. Nº 11:
Claims (27)
1. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido de receptor de unión a ligandos, polipéptido que es
definido por los restos de aminoácido 18 a 228 de la ID. SEC. nº
2.
2. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comprende además un
dominio transmembranal.
3. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 2, en el que dicho dominio transmembranal comprende
los restos 229 a 251 de la ID. SEC. nº 2.
4. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 2, en el que dicho polipéptido comprende además un
dominio intracelular.
5. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 4, en el que dicho dominio intracelular comprende los
restos 252 a 574 de la ID. SEC. nº 2.
6. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 1, que es un DNA como el mostrado en la ID. SEC. nº 1
desde el nucleótido 34 hasta el nucleótido 1.755.
7. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comprende además una
etiqueta de afinidad.
8. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 7, en el que dicha etiqueta de afinidad es
polihistidina, proteína A, glutatión S transferasa, sustancia P o
una región constante de cadena pesada inmunoglobulínica.
9. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido es DNA.
10. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido para un receptor citoquínico de clase II, o un dominio
funcional del mismo, seleccionado del grupo definido por las
siguientes porciones de la ID. SEC. nº 2: restos 1 a 228, restos 1 a
251, restos 1 a 574, restos 2 a 228, restos 2 a 251, restos 2 a
574, restos 229 a 251, restos 229 a 574, y restos 252 a 574.
11. Un vector de expresión que comprende los
siguientes elementos operativamente enlazados:
un promotor de transcripción;
un segmento de DNA que codifica un polipéptido de
receptor de unión a ligandos, polipéptido que es definido por los
restos de aminoácido 18 a 228 de la ID. SEC. nº 2; y
un terminador de transcripción.
12. Un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 11, en el que dicho polipéptido comprende además una
secuencia señal.
13. Un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 11, en el que dicho polipéptido comprende además un
dominio transmembranal.
14. Un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 11, en el que dicho dominio transmembranal comprende
los restos 229 a 251 de la ID. SEC. nº 2.
15. Un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 13, en el que dicho polipéptido comprende además un
dominio intracelular.
16. Un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 15, en el que dicho dominio intracelular comprende
los restos 252 a 574 de la ID. SEC. nº 2.
17. Un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 11, que comprende además una secuencia de DNA que
codifica una etiqueta de afinidad.
18. Un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 17, en el que la etiqueta de afinidad es un
polipéptido F_{C} de inmunoglobulina.
19. Una célula transformada o transfectada en que
se ha introducido un vector de expresión de acuerdo con la
Reivindicación 11, célula que expresa un polipéptido de receptor
codificado por el segmento de DNA.
\newpage
20. Un polipéptido aislado que codifica un
dominio funcional de un receptor citoquínico de clase II definido
por los restos 18-228 de la ID. SEC. nº 2.
21. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 20, que contiene además una secuencia que define un
dominio transmembranal o una secuencia que define un dominio
intracelular, o ambas.
22. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 21, en el que el dominio transmembranal es definido
por los restos de aminoácido 229-251 de la ID.
SEC. nº 2, y el dominio intracelular es definido por los restos de
aminoácido 252-574 de la ID. SEC. nº 2.
23. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
Reivindicación 20, que contiene además una secuencia que define una
etiqueta de afinidad.
24. Un método para detectar un ligando en una
muestra de ensayo, que comprende poner la muestra de ensayo en
contacto con un polipéptido que comprende los restos 18 a 228 de la
ID. SEC. nº 2, y detectar la unión de dicho polipéptido al ligando
en la muestra.
25. Un anticuerpo que se une específicamente a un
polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 20.
26. Un anticuerpo antiidiotípico que se une a un
sitio de unión antigénica de un anticuerpo de acuerdo con la
Reivindicación 25.
27. Un polipéptido aislado para un receptor
citoquínico de clase II, o un dominio funcional del mismo,
seleccionado del grupo que consiste en los restos 1 a 228, restos 1
a 251, restos 1 a 574, restos 2 a 228, restos 2 a 551 y restos 2 a
574 de la ID. SEC. nº 2.
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