BRPI0619118A2

BRPI0619118A2 - composições e métodos para o tratamento de doenças e desordens associadas com a sinalização de citocina

Info

Publication number: BRPI0619118A2
Application number: BRPI0619118-5A
Authority: BR
Inventors: Yvonne Man-Yee Chen; Anan Chuntharapai; Dimitry Danilenko; Wenjun Ouyang; Susan Sa; Patricia Valdez; Terence Wong; Jianfeng Wu; Yan Zheng
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-12-02
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2011-09-13
Also published as: US20100316596A1; US20130224146A1; RU2008126932A; IL191824A; EP2623516B1; HK1222870A1; JP2016029056A; HK1185895A1; JP5860790B2; EP3006466B1; US7737259B2; JP2013060443A; EP3006466A2; EP1954719A2; EP3006466A3; RU2011116181A; KR101453570B1; EP2623516A2; US9555107B2; WO2007126439A2

Abstract

COMPOSIçõES E MéTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENçAS E DESORDENS ASSOCIADAS COM A SINALIZAçãO DE CITOCINA. A presente invenção refere-se a composições e métodos são fornecidos para o diagnóstico e tratamento de inflamação e desordens auto-imunes, tal como psoríase. Composições e métodos para modular a sinalização de IL-23 ou IL-22 são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI- ÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS E DESOR- DENS ASSOCIADAS COM A SINALIZAÇÃO DE CITOCINA".

Esse pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. 60/741.640, depositado em 2 de dezembro de 2005 e do Pedido Provisório U.S. No. 60/822.597, depositado em 16 de agosto de 2006, cujas descrições estão incorporadas aqui por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições e métodos úteis para o diagnóstico e tratamento de doenças e desordens associadas com a sinalização de citocina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Várias doenças e desordens estão associadas com inflamação. Inflamação é um processo associado com o recrutamento de células infla- matórias (por exemplo, leucócitos) para um sítio de lesão ou infecção. Infla- mação geralmente protege o corpo de infecção e lesão. Entretanto, inflama- ção excessiva ou inapropriada pode ter efeitos deletérios. Desordens autoi- munes, por exemplo, freqüentemente desencadeiam inflamação resultando na destruição de tecidos corporais normais. A inflamação também está Iiga- da ao câncer. Vide, por exemplo, Coussens et al. (2002) Nature 420:860- 867. Por exemplo, inflamação crônica associada com doença inflamatória do intestino (IBD) está fortemente correlacionada com carcinogênese de cólon. Durante a resposta inflamatória, certas células inflamatórias produzem agen- tes que promovem angiogênese, reduzem a atividade antitumoral de células- T citotóxicas e induzem mutações no DNA, assim criando um ambiente que promove a progressão do tumor. Id.

IL-23 é uma citocina heterodimérica que desempenha um papel dominante em desordens autoimunes/inflamatórias e em particular, inflama- ção crônica. Por exemplo, estudos em camundongos revelaram que IL-23 é essencial para o desenvolvimento de encefalomielite alérgica experimental (inflamação autoimune do cérebro), que é um modelo para esclerose múlti- pla; artrite induzida por colágeno, que é um modelo para artrite reumatóide; e hipersensibilidade do tipo tardio. IL-23 também funciona para manter a co- lite estabelecida (uma forma de IBD). A expressão transgênica de IL-23 leva a resposta inflamatória sistêmica e a desregulação de IL-23 leva a doença eczematosa da pele (uma condição inflamatória da pele). IL-23 estimula uma população única de células T (células ThiL-17), que por sua vez induzem a produção de IL-17 e citocinas pró-inflamatórias. Para revisão dos papéis de IL-23 na inflamação e auto-imunidade, vide, por exemplo, Hunter (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:521-531; e Holscher (2005) Curr. Qpin. Invest. Drugs 6:489- 495. IL-23 também mostrou promover o crescimento tumoral pelo aumento da angiogênese e diminuição da infiltração do tumor pelas células T citotóxi- cas. Langowski et al. (2006) Nature 442:461 -465. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos úteis para o diagnóstico e tratamento de desordens inflamatórias e desordens autoimunes (por exemplo, psoríase) são fornecidos. Composições e métodos úteis para modular a sinalização de IL-23 ou IL-22 também são fornecidos. Essas e outras modalidades da in- venção são fornecidas aqui. A presente invenção é baseada, em ptécnica, na elucidação de uma via de sinalização na qual IL-23 age através de IL-22 pela indução da expressão de IL-22 a partir de um subgrupo recentemente descoberto de células T auxiliares (células Th), isto é, a linhagem Th|L-i7·

Em um aspecto, um anticorpo que se liga especificamente a IL-22 é fornecido, em que o anticorpo é (a) um anticorpo produzido por um hibrido- ma selecionado a partir de 3F11.3 (No. de Acesso ATCC PTA-7312), hibri- doma 11 H4.4 (No. de Acesso ATCC PTA-7315) e hibridoma 8E11.9 (No. de Acesso ATCC PTA-7319); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c).

Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo que se liga especifi- camente a IL-22R, em que o anticorpo é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a partir de 7E9 (No. de Acesso ATCC PTA-7313), hibridoma 8A12 (No. de Acesso ATCC PTA-7318) e hibridoma 8H11 (No. de Acesso ATCC PTA-7317); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c).

Em outro aspecto, um método de tratar uma desordem autoimu- ne é fornecido, em que a desordem autoimune não é artrite, o método com- preendendo administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma for- mulação farmacêutica que compreende um antagonista de IL-22. Em tal mo- dalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22. Em uma modalidade, o anticorpo que se liga especificamente a IL- 22 é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a partir de 3F11.3 (No. de Acesso ATCC PTA-7312), hibridoma 11 H4.4 (No. de Acesso ATCC PTA-7315) e hibridoma 8E11.9 (No. de Acesso ATCC PTA-7319); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c). Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22R. Em tal modalidade, o anticorpo que se liga especificamente a IL-22R é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a partir de 7E9 (No. de Acesso ATCC PTA- 7313), hibridoma 8A12 (No. de Acesso ATCC PTA-7318) e hibridoma 8H11 (No. de Acesso ATCC PTA-7317); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c). Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é IL-22BP. Em uma modalidade, a desordem autoimune é doença inflamatória do intestino. Em uma modalida- de, a desordem autoimune é psoríase. Em uma modalidade, o método ainda compreende administrar pelo menos um anticorpo selecionado a partir de um anticorpo que se liga especificamente a IL20Ra, um anticorpo que se liga especificamente a IL20Rb e um anticorpo que se liga especificamente a IL- 22R. Em uma modalidade, o método ainda compreende administrar pelo menos um anticorpo selecionado a partir de um anticorpo que se liga especi- ficamente a IL-22, um anticorpo que se liga especificamente a IL20Ra e um anticorpo que se liga especificamente a IL20Rb.

Em outro aspecto, um método para tratamento de inflamação é fornecido, em que a inflamação não é inflamação artrítica, o método com- preendendo administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma for- mulação farmacêutica que compreende um antagonista de IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especifica- mente a IL-22. Em tal modalidade, o anticorpo que se liga especificamente a IL-22 é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a partir de 3F11.3 (No. de Acesso ATCC PTA-7312), hibridoma 11 H4.4 (No. de Acesso ATCC PTA-7315) e hibridoma 8E11.9 (No. de Acesso ATCC PTA-7319); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c). Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22R. Em tal modalidade, o anticorpo que se liga especificamente a IL-22R é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a partir de 7E9 (No. de Acesso ATCC PTA- 7313), hibridoma 8A12 (No. de Acesso ATCC PTA-7318) e hibridoma 8H11 (No. de Acesso ATCC PTA-7317); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c). Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é IL-22BP. Em uma modalidade, a inflamação é inflamação autoimune. Em uma modalidade, a inflamação é inflamação de pele. Em uma modalidade, a inflamação é inflamação crônica.

Em outro aspecto, um método de inibir a progressão do tumor é fornecido, o método compreendendo administrar a um mamífero uma quan- tidade eficaz de uma formulação farmacêutica que compreende um antago- nista de IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22. Em tal modalidade, o anticorpo que se liga especificamente a IL-22 é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a partir de 3F11.3 (No. de Acesso ATCC PTA-7312), hibridoma 11H4.4 (No. de Acesso ATCC PTA-7315) e hibridoma 8E11.9 (No. de Aces- so ATCC PTA-7319); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c). Em uma modali- dade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22R. Em tal modalidade, o anticorpo que se liga especificamente a IL-22R é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a partir de 7E9 (No. de Acesso ATCC PTA-7313), hibridoma 8A12 (No. de Acesso ATCC PTA-7318) e hibridoma 8H11 (No. de Acesso ATCC PTA-7317); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do an- ticorpo de (a), (b), ou (c). Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é IL- 22BP.

Em outro aspecto, um método de estimular uma via de sinaliza- ção mediada por IL-23 em um sistema biológico é fornecido, o método com- preendendo fornecer um agonista de IL-22 ao sistema biológico. Em uma modalidade, o agonista de IL-22 é IL-22. Em outro aspecto, um método de inibir uma via de sinalização mediada por IL-23 em um sistema biológico é fornecido, o método compreendendo fornecer um antagonista de IL-22 ao sistema biológico. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticor- po que se liga especificamente a IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22R.

Em outro aspecto, é fornecido um método de estimular a função da célula ThIL-17, o método compreendendo expor uma célula ThIL-17 a um agonista de IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22. Em outro aspecto, é fornecido um método de inibir a função da célula ThIL-17, o método compreendendo expor uma célula ThIL-17 a um antagonista de IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especifi- camente a IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticor- po que se liga especificamente a IL-22R.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) de um cDNA que codifica uma IL-22 humana nativa.

Figura 2 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada da seqüência codificante de SEQ ID NO: 1 mostrada na Figura 1.

Figura 3 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de um IL-22R humano nativo.

Figura 4 mostra a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de um IL-22BP humano nativo.

Figura 5 é uma lista de todos os anticorpos de IL-22 gerados e suas respectivas propriedades, como descrito no Exemplo 1. Coloração in- tracelular é abreviada como IC.

Figura 6 mostra que anticorpos anti-IL-22 são capazes de blo- quear a ativação de STAT3, como descrito no Exemplo 2.

Figura 7 mostra que três anticorpos anti-IL-22 específicos blo- queiam IL-22 humana de uma maneira dependente da dose, como descrito no Exemplo 3.

Figura 8 mostra que três anticorpos anti-IL-22 específicos blo- queiam IL-22 de murino de uma maneira dependente da dose, como descrito no Exemplo 4.

Figura 9 é um cálculo da afinidade de anticorpos anti-IL-22 para IL-22 humana, como descrito no Exemplo 5.

Figura 10 mostra que anticorpos anti-IL-22 detectam a expres- são intracelular de IL-22, como descrito no Exemplo 6.

Figura 11 mostra a marcação intracelular por FACS para IL-22 usando anticorpos anti-IL-22 marcados como descrito no Exemplo 6.

Figura 12 mostra a expressão de IL-22 em células Th1 de muri- no como determinado pela análise de nuclease 5', como descrito no Exem- plo 7.

Figura 13 mostra a expressão de IL-22 em células T yδ de muri- no como determinado pela análise de nuclease 5', como descrito no Exem- plo 8.

Figura 14 mostra a expressão de IL-22 em células T humanas ativadas como determinado por análise de microarranjos, como descrito no Exemplo 9.

Figura 15 mostra o nível de expressão de IL-22 em células T por FACS, como descrito no Exemplo 10.

Figura 16 mostra o teste de anticorpos anti-IL-22R em células 293 que expressam IL-22R, como descrito no Exemplo 11.

Figura 17 mostra que anticorpos anti-IL-22R podem bloquear a expressão induzida de IL-22 de um constructo repórter de STAT3, como descrito no Exemplo 12.

Figura 18 mostra a expressão de IL-22R e IL-10R2 sobre a su- perfície de queratinócitos primários, como descrito no Exemplo 13.

Figura 19 mostra que IL-22 induz o espessamento da epiderme humana, como descrito no Exemplo 14.

Figura 20 mostra que IL-22 induz a expressão de citoqueratina 16, um marcador de modificação de queratinócito, como descrito no Exem- plo 14.

Figura 21 mostra que o tratamento da epiderme humana com IL- 22 causa indução da expressão de psoriasina, um gene altamente expresso na psoríase, como descrito no Exemplo 14.

Figura 22 mostra que o tratamento de queratinócitos com IL-22 eleva a expressão de vários genes, incluindo psoriasina, como descrito no Exemplo 15.

Figura 23 mostra que a expressão de psoriasina é reduzida pelo tratamento com anticorpos anti-IL-22 e anti-IL-22R, como descrito no Exem- pio 14.

Figura 24 mostra que o espessamento epidérmico é reduzido pelo tratamento com anticorpos anti-IL-22 e anti-IL-22R, como descrito no Exemplo 14.

Figura 25 mostra que o espessamento epidérmico é reduzido pelo tratamento com anticorpos anti-IL-22 e anti-IL-22R, como descrito no Exemplo 14.

Figura 26 mostra que IL-23 e IL-12 induzem espessamento epi- dérmico com aspectos histológicos distintos, como descrito no Exemplo 16.

Figura 27 mostra que IL-23 induz a expressão de IL-22 e IL-22 induz inflamação dérmica e espessamento epidérmico in vivo, como descrito nos Exemplos 17 e 18.

Figura 28 mostra que IL-12 e IL-23 induzem a expressão de gru- pos distintos de citocinas, como descrito no Exemplo 17.

Figura 29 mostra que o tratamento com um anticorpo monoclo- nal anti-IL-22 reduz significativamente a acantose epidérmica induzida por IL-23 in vivo, como descrito no Exemplo 20.

Figura 30 mostra a estratégia usada para romper o gene de IL- 22 em camundongos e evidência confirmando que a expressão de IL-22 está ausente em camundongos IL-2ZA, como descrito no Exemplo 20.

Figura 31 mostra que a acantose induzida por IL-23 é significati- vamente reduzida em camundongos deficientes em IL-22, como descrito no Exemplo 20.

Figura 32 mostra que a deficiência de IL-22 não teve efeito sobre a acantose induzida por IL-12, como descrito no Exemplo 20.

Figura 33 mostra que IL-23 induz a produção de IL-22 a partir de vários linfócitos ativados por IL-23, como descrito no Exemplo 21.

Figura 34 mostra que IL-22 é uma nova citocina efetora da li- nhagem de Thn_-17, como descrito no Exemplo 22.

Figura 35 mostra que IL-22 e IL-17 são produzidas pela mesma linhagem de Th (ThiL-17), como descrito no Exemplo 22.

Figura 36 mostra que IL-23 estimula a produção de IL-22 a partir da ativação de células T virgens, como descrito no Exemplo 22.

Figura 37 mostra que IL-19, IL-20, IL-22 e IL-24 induzem espes- samento epidérmico, como descrito no Exemplo 23.

Figura 38 mostra a quantificação de acantose epidérmica induzi- da por IL-19, IL-20, IL-22 e IL-24, como descrito no Exemplo 23.

Figura 39 mostra que componentes dos receptores para IL-19, IL-20 e IL-22 são expressos em queratinócitos humanos, como descrito no Exemplo 24.

Figura 40 mostra que anticorpos bloqueadores para componen- tes dos receptores para IL-19, IL-20 e IL-22 reduzem a expressão de psoria- sina, como descrito no Exemplo 24.

Figura 41 mostra que anticorpos para IL-20Ra e IL-22R, quando usa- dos em combinação, bloqueiam eficazmente a expressão de psoriasina in- duzida por IL-20.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES I. DEFINIÇÕES

O termo "polipeptídeo de IL-22" ou "IL-22" refere-se a vários po- lipeptídeos de interleucina-22 (também referido como "ligante de interleuci- na-22" ou "IL-22L" na técnica). O termo abrange polipeptídeos de IL-22 de seqüência nativa e variantes desses (que são definidos aqui posteriormen- te). Os polipeptídeos de IL-22 descritos aqui podem ser isolados de uma va- riedade de fontes, tais como tecido humano ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. Uma IL-22 nativa pode ser de qualquer espécie, por exemplo, de murino ('mlL-22") ou humana ("hlL-22").

O termo "polipeptídeo de IL-22R" ou "IL-22R" refere-se a um componente polipeptídico de um heterodímero receptor de interleucina-22 ou um heterodímero receptor de interleucina-20. O termo abrange polipeptídeos de IL-22R de seqüência nativa e variantes desses (que são definidos aqui mais tarde). Os polipeptídeos de IL-22R descritos aqui podem ser isolados de uma variedade de fontes, tais como tecido humano ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. Um IL-22R nativo po- de ser de qualquer espécie, por exemplo, de murino ('mlL-22R") ou humano ("hlL-22R"). Polipeptídeos de IL-22R de seqüência nativa são também refe- ridos na técnica como "IL-22R1" e "IL-22RA".

Um "polipeptídeo de IL-22 de seqüência nativa" ou um "polipeptídeo de IL-22R de seqüência nativa" refere-se a um polipeptídeo que compreende a mesma seqüência de aminoácidos que o polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R correspondente derivado da natureza. Tais polipeptídeos de IL-22 ou IL-22R de seqüência nativa podem ser isolados da natureza ou pode ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. Os termos abrangem especificamen- te formas que ocorrem naturalmente truncadas ou secretadas do polipeptí- deo específico de IL-22 ou IL-22R (por exemplo, uma IL-22 que não tem seu peptídeo de sinal associado), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas que sofreram splicing alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipeptídeo. Em várias modalidades da invenção, os polipeptídeos de IL-22 ou IL-22R de seqüência nativa descritos aqui são po- lipeptídeos de seqüência nativa maduros ou de extensão completa. As Figu- ras 2 e 3 mostram IL-22 e IL-22R humanos de extensão completa exempla- res, respectivamente. Um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo mostra- do na Figura 2 é mostrado na Figura 1. Os códons de início e de parada são mostrados em negrito e sublinhados naquela figura. Apesar das seqüências dos polipetídeos de IL-22 e IL-22R descritas nas figuras anexas serem mos- tradas começar com resíduos de metionina, designados aqui como posição de aminoácido 1, é concebível e possível que outros resíduos de metionina localizados tanto à montante quanto a montante da posição de aminoácido 1 nas figuras possam ser empregados como resíduo de aminoácido de início para os polipeptídeos de IL-22 ou IL-22R.

Uma "variante de IL-22", uma "variante de IL-22R", uma "varian- te do polipeptídeo de IL-22" ou uma "variante do polipeptídeo de IL-22R" significa um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R ativo como definido acima que tem pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácidos com uma seqüência do polipeptídeo de IL-22R ou IL-22 de seqüência nativa de extensão completa. Geralmente, uma variante do polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R terá pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de a - minoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 81% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 82% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 83% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 84% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternati- vãmente pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência de aminoá- cidos, alternativamente pelo menos cerca de 86% de identidade de seqüên- cia de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 87% de identida- de de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 88% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo me- nos cerca de 89% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativa- mente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência de aminoáci- dos, alternativamente pelo menos cerca de 91% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência de aminoácidos, al- ternativamente pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 97% de identidade de seqüência de aminoácidos, alternativamente pelo menos cerca de 98% de identidade de seqüência de aminoácidos e alternativamente pelo menos cer- ca de 99% de identidade de seqüência de aminoácidos com uma seqüência do polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R de seqüência nativa de extensão comple- ta ou madura.

"Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos, com relação às seqüências dos polipeptídeos de IL-22 ou IL-22R identifica- das aqui, é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos em uma seqüência do polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R específica, após o alinhamento das seqüências e a introdução de intervalos, se necessário, para se obter o percentual máximo de identidade de seqüência e não consi- derando nenhuma substituição conservativa como ptécnica da identidade de seqüência. O alinhamento com o propósito de determinar o percentual de identidade de seqüência pode ser obtido de várias maneiras que estão den- tro do conhecimento da técnica, por exemplo, usando programas de compu- tador disponíveis ao público tais como BLAST, BLAST-2, ALIGN ou o pro- grama Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determi- nar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quais- quer algoritmos necessários para se obter o alinhamento máximo pela ex- tensão completa das seqüências sendo comparadas. Para comparações de seqüência de aminoácidos, o % de identidade de seqüência de aminoácidos de uma dada seqüência da aminoácidos A a, com ou contra uma dada se- qüência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente expressa como uma dada seqüência de aminoácidos A que tem ou compreende um certo % de identidade de seqüência de aminoácidos a, com ou contra uma dada se- qüência de aminoácidos B), é calculado como se segue: 100 vezes a fração X/Y

onde X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como combina- ções idênticas pelo programa de alinhamento de seqüência naquele alinha- mento do programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de ami- noácidos em B. Será observado que, onde a extensão da seqüência de ami- noácidos A não for igual a extensão da seqüência de aminoácidos Β, o % de identidade de seqüência de aminoácidos de A para B não será igual ao % de identidade de seqüência de aminoácidos de B para A. Como exemplos de cálculos de % de identidade de seqüência de aminoácidos usando esse mé- todo, as Tabelas 2 e 3 demonstram como calcular o % de identidade de se- qüência de aminoácidos da seqüência de aminoácidos designada "Proteína de Comparação" com a seqüência de aminoácidos designada "IL-22 ou IL- 22R", em que "IL-22 ou IL-22R" representa a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R de interesse, "Proteína de Comparação" representa a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo contra o qual o polipeptídeo de "IL-22 ou IL-22R" de interesse está sendo comparado e "X", "Y" e "Z" representam cada resíduos de aminoácidos diferentes.

Tabela 2

IL-22 ou IL-22R XXXXXXXXXXXXXXX (Extensão = 15 aminoácidos) Proteína de Comparação XXXXXYYYYYYY (Extensão = 12 aminoácidos) % de identidade de seqüência de aminoácidos = (número de resíduos de aminoácidos que combinam identicamente entre as duas seqüências de po- lipeptídeos) dividido por (número total de resíduos de aminoácidos do poli- peptídeo de IL-22 ou IL-22R) = 5 dividido por 15 = 33,3%

Tabela 3

IL-22 or IL-22R XXXXXXXXXX (Extensão = 10 aminoácidos) Proteína de Comparação XXXXXYYYYYYZZYZ (Extensão = 15 amino- ácidos)

% de identidade de seqüência de aminoácidos = (o número de resíduos de aminoácidos que combinam identicamente entre as duas seqüências de po- lipeptídeos) dividido por (número total de resíduos de aminoácidos do poli- peptídeo de IL-22 ou IL-22R) = 5 dividido por 10 = 50%

O termo "IL-19" refere-se a qualquer IL-19 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos e macacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra maneira. O termo abrange "IL-19 de extensão completa", não processada assim como qualquer forma de IL-19 que resulte de processamento na célula. O termo também abrange variantes de IL-19 de ocorrência natural, por exemplo, variantes de splicing, variantes alélicas e outras isoformas. O termo tamb4ém abrange fragmentos ou variantes de uma IL-19 nativa que mantêm pelo menos uma atividade biológica de IL-19.

O termo "IL-20" refere-se a qualquer IL-20 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos e macacos) e roedores (por exemplo camundongos e ratos), a menos que indicado de outra maneira. O termo abrange "IL-20 de exten- são completa", não processada assim como qualquer forma de IL-20 que resulte de processamento na célula. O termo também abrange variantes de IL-20 de ocorrência natural, por exemplo, variantes de splicing, variantes alélicas e outras isoformas. O termo também abrange fragmentos ou varian- tes de uma IL-20 nativa que mantêm pelo menos uma atividade biológica de IL-20.

O termo "IL-24" refere-se a qualquer IL-24 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos e macacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra maneira. O termo abrange "IL-24 de exten- são completa", não processada, assim como qualquer forma de IL-24 que resulte de processamento na célula. O termo também abrange variantes de IL-24 de ocorrência natural, por exemplo, variantes de splicing, variantes alélicas e outras isoformas. O termo também abrange fragmentos ou varian- 30 tes de uma IL-24 nativa que mantêm pelo menos uma atividade biológica de IL-24.

O termo "IL-22BP" refere-se a qualquer IL-22BP nativa de qual- quer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por e- xemplo, seres humanos e macacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra maneira. O termo abrange "IL-22BP de extensão completa", não processada, assim como qualquer forma de IL- 22BP que resulta de processamento na célula. O termo também abrange variantes de IL-22BP de ocorrência natural, por exemplo, variantes de spli- cing, variantes alélicas e outras isoformas. O termo também abrange frag- mentos ou variantes de uma IL-22BP nativa que mantêm pelo menos uma atividade biológica de IL-22BP. IL-22BP nativa também é referida como "IL- 22RA2" na técnica.

O termo IL-20Ra refere-se a um componente polipeptídico de um heterodímero receptor de IL-19 ou um heterodímero receptor de IL-20. O termo abrange qualquer IL-20Ra nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos e ma- cacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indi- cado de outra maneira. O termo abrange "IL-20Ra de extensão completa", não processado, assim como qualquer forma de IL-20Ra que resulte de pro- cessamento na célula. O termo também abrange variantes de IL-20Ra que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing, variantes alélicas e outras isoformas. O termo também abrange fragmentos ou variantes de 1 uma IL-20Ra nativa que mantêm pelo menos uma atividade biológica de IL- 20Ra. IL-20Ra nativa também é referida como "IL-20R1" na técnica.

O termo IL-20Rb refere-se a um componente polipeptídico de um heterodímero receptor de IL-19 ou um heterodímero receptor de IL-20. O termo abrange qualquer IL-20Rb nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos e ma- cacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indi- cado de outra maneira. O termo abrange "IL-20Rb de extensão completa", não processado assim como qualquer forma de IL-20Rb que resulte de pro- cessamento na célula. O termo também abrange variantes de IL-20Rb que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing, variantes alélicas e outras isoformas. O termo também abrange fragmentos ou variantes de uma IL-20RÒ nativa que mantêm pelo menos uma atividade biológica de IL- 20Rb. IL-20Rb nativa também é referida como "IL-20R2" na técnica.

O termo IL-10R2 refere-se a um componente polipeptídico de um heterodímero receptor de IL-22 ou um heterodímero receptor de IL-20. O termo abrange qualquer IL-10R2 nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos e ma- cacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indi- cado de outra maneira. O termo abrange "IL-10R2 de extensão completa", não processado, assim como qualquer forma de IL-10R2 que resulte de pro- cessamento na célula. O termo também abrange variantes de IL-10R2 que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing, variantes alélicas e outras isoformas. O termo também abrange fragmentos ou variantes de uma IL-10R2 nativa que mantêm pelo menos uma atividade biológica de IL- 10R2. IL-10R2 nativa também é referida como "IL-10Rb" na técnica.

Uma molécula biológica "isolada", tais como os vários polipeptí- deos, polinucleotídeos e anticorpos descritos aqui, refere-se a uma molécula biológica que foi identificada ou separada e/ou recuperada de pelo menos um componente de seu ambiente natural.

"Ativa" ou "atividade", com relação a IL-22 ou IL-22R, refere-se a uma atividade biológica e/ou imunológica de uma IL-22 ou IL-22R nativa, em que atividade "biológica" refere-se a uma função biológica de uma IL-22 ou IL-22R nativa diferente da habilidade de induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído pela IL-22 ou IL-22R nativa. Uma ati- vidade "imunológica" refere-se a habilidade de induzir a produção de um an- ticorpo contra um epitopo antigênico possuído pela IL-22 ou IL-22R nativa.

O termo "antagonista" é usado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que bloquea, inibe ou neutraliza parcialmente ou total- mente uma atividade biológica de um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R nativo. Também abrangidas por "antagonista" estão mo- léculas que inibem totalmente ou parcialmente a transcrição ou tradução de mRNA que codifica o polipeptídeo. Moléculas antagonistas adequadas inclu- em, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpos antagonistas; fragmentos ou variantes de seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo nativo; peptídeos; oligonucleotídeos anti-sentido; moléculas orgânicas pe- quenas; e ácidos nucléicos que codificam antagonistas do polipeptídeo ou anticorpos antagonistas. A referência a "um" antagonista abrange um único antagonista ou uma combinação de dois ou mais antagonistas diferentes.

O termo "agonista" é usado no sentido mais amplo e inclui qual- quer molécula que mimetize parcialmente ou totalmente uma atividade bio- lógica de um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R nati- vo. Também abrangidas por "agonista" estão as moléculas que estimulam a transcrição ou tradução de mRNA que codifica o polipeptídeo. Moléculas agonistas adequadas incluem, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de anticorpos agonistas; um polipeptídeo nativo; fragmentos ou variantes de seqüências de aminoácidos de um polipeptídeo nativo; peptídeos; oligonu- cleotídeos anti-sentido; moléculas orgânicas pequenas; e ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos ou anticorpos agonistas. A referência a "um" agonista abrange um único agonista ou uma combinação de dois ou mais agonistas diferentes.

"Alívio" refere-se tanto ao tratamento terapêutico como profilático ou medidas preventivas, em que o objetivo é prevenir ou retardar (diminuir) a condição ou desordem patológico visado. Aqueles que necessitam de trata- mento incluem aqueles já com a desordem assim como aqueles propensos a ter a desordem ou aqueles nos quais a desordem deve ser prevenido.

Administração "crônica" refere-se a administração de um agen- te(s) de um modo contínuo oposto a um modo agudo, de maneira a manter o efeito terapêutico inicial por um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é o tratamento que não é feito consecutivamente sem interrup- ção, mas de preferência é cíclico por natureza.

"Mamífero" para os propósitos de tratamento refere-se a um a- nimal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, roedores (por exemplo, camundongos e ratos) e macacos; animais domésticos e de fazenda; e animais de zoológico, esportes, laboratório ou de estimação, tais como cães, gatos, gado, cavalos, carneiros, porcos, cabras, coelhos, etc.. Em algumas modalidades, o mamífero é selecionado a partir de um ser hu- mano, roedor ou macaco.

Administração "em combinação com" um ou mais agentes tera- pêuticos adicionais inclui administração simultânea (concomitante) e conse- cutiva em qualquer ordem.

"Veículos" como usados aqui incluem veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a cé- lula ou mamífero exposto a eles nas dosagens e concentrações emprega- das. Freqüentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa com pH tamponado. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitá- veis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecu- lar (menos do que 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelati- na ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; mo· nossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, mano- se e dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; alcoóis de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN™, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS®.

"Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteínas que têm características estruturais similares. Enquanto anticorpos exibem especificidade de ligação a um antígeno específico, imunoglobulinas incluem tanto anticorpos como outras moléculas semelhantes a anticorpo que geral- mente não têm especificidade antigênica. Polipeptídeos do último tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfóide e em níveis elevados por mielomas.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados intercambi- avelmente no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais de extensão completa ou intactos), anti- corpos policlonais, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anti- corpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que eles exibam a atividade biológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpo (como descrito em maiores detalhes aqui). Um anti- corpo pode ser quimérico, humano, humanizado e /ou de afinidade madura.

Um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno particu- lar refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar ao antígeno com afini- dade suficiente tal que o anticorpo é útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico em atingir o antígeno. Preferivelmente, a extensão de liga- ção de tal anticorpo a um polipeptídeo não-alvo é menor do que 10% da li- gação do anticorpo ao antígeno alvo como medido, por exemplo, por radioi- munoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga a um antígeno alvo tem uma constante de dissociação (Kd) de < ΙμΜ, <100 nM, < 10 nM, < 1 nM, ou < 0,1 nM.

A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere- se aos domínios amino-terminais da cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como "VH". O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como "VL". Esses domínios são geralmente as ptécnicas mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação de antígeno.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem acentuadamente em seqüência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo em particular para seu antígeno em particular. Entretanto, a variabilidade não uniforme- mente distribuída através dos domínios variáveis de anticorpos. Ela é con- centrada em três segmentos chamados regiões determinantes de comple- mentaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis (HVRs), ambas nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões de arcabouço (FR). Os domínios variáveis de cada cadeia pesada e leve nativas compre- endem cada quatro regiões FR, adotando amplamente uma configuração de fita-beta, conectadas por três CDRs, que formam alças que conectam, e em alguns casos fazem ptécnica, da estrutura de fita-beta. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos (vide Kabat et al., Seauences of Proteins of Immuno- loqical Interest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na liga- ção de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de an- ticorpo.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser designadas a um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa (κ) e Iambda (λ), baseado nas seqüências de a- minoácidos de seus domínios constantes.

Dependendo das seqüências de aminoácidos dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, anticorpos (imunoglobulinas) podem ser designados em diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ainda ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem as di- ferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ, e μ, respecti- vamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem-conhecidas e comumente descritas, por exemplo, em Abbas et ai Cellular and Mol. Immunoloqy, 4a ed. (2000). Um anticorpo pode ser ptécnica de uma molécula de fusão maior, formada pela associação covalente ou não-covalente do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos.

Os termos "anticorpo de extensão completa", "anticorpo intacto" e "anticorpo completo" são usados aqui intercambiavelmente para se referir a um anticorpo na sua forma substancialmente intacta, não a fragmentos de anticorpo como definidos abaixo. Os termos referem-se particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm a região Fc.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção retém pelo menos uma e até a maioria ou todas as funções normalmente associadas com aquela porção quando pre- sente em um anticorpo intacto. Em uma modalidade, um fragmento de anti- corpo compreende um sítio de ligação de antígeno do anticorpo intacto e assim mantém a habilidade de se ligar ao antígeno. Em outra modalidade, um fragmento de anticorpo, por exemplo, um que compreende a região Fc, retém pelo menos uma das funções biológicas associadas com a região Fc quando presente no anticorpo intacto, tal como ligação a FcRn, modulação da meia vida do anticorpo, função de ADCC e ligação ao complemento. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma meia vida in vivo substancialmente similar a um anticorpo in- tacto. Por exemplo, tal fragmento de anticorpo pode compreender um braço de ligação de antígeno ligado a uma seqüência de Fc capaz de conferir es- tabilidade in vivo ao fragmento.

A digestão com papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação ao antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua habilidade de cristalizar rapidamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação ao antígeno e é capaz ainda de reação cruzada com o antígeno.

"Fv" é o mínimo fragmento de anticorpo que contém um sítio de ligação de antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pe- sada e um de cadeia leve em associação estreita, não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia única (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem estar covalentemente ligados por um Iigante peptídico flexível tal que as cadeias leve e pesada podem se associar em uma estrutura"dimérica" análoga àquela em uma espécie de Fv de duas ca- deias. É nessa configuração que as três CDRs de cada domínio variável in- teragem para definir um sítio de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero de VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade ao anticorpo de ligação ao antígeno. Entretanto, até mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específi- cas para um antígeno) tem a habilidade de reconhecer e se ligar ao antíge- no, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab contém os domínios variáveis de cadeia pesa- da e leve e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos na terminação carboxi do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes sustentam um grupo tiol li- vre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 eram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm dobradiças de cisteína entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conheci- dos.

"Fv de cadeia única" ou fragmentos de anticorpo "scFv" compre- endem os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo de scFv ainda compreende um Iigante de polipeptídio entre os domínios VH e VL que possibilita que ο scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv vide Pluckthun, em The Pharmacoloav of Monoclonal Antibodies. vol. 113, Rosenburg & Moore eds., Springer- Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti- corpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreen- dem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Pelo uso de um Iigante que é pequeno demais para permitir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de liga- ção de antígeno. Diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Diacor- pos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP 404.097; W093/1161; Hudson et ai (2003) Nat. Med. 9:129-134; e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et ai (2003) Nat. Med. 9: 129- 134. O termo "anticorpo monoclonal" como usado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homo- gênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocor- rência natural, que podem estar presentes em quantidades mínimas. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos. Em certas modalidades, tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que compreende uma seqüência de polipeptídeo que se liga ao alvo, em que a seqüência de polipeptídeo que se liga ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma se- qüência de polipeptídeo que se liga a um único alvo de uma pluralidade de seqüências de polipeptídeo. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone de uma pluralidade de clones, tal como um grupo de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve ser entendido que uma seqüência de ligação ao alvo selecionada pode ainda ser alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade pelo alvo, para humanizar a seqüência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção em cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anti- corpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a seqüência de ligação ao alvo alterada também é um anticorpo monoclonal dessa inven- ção. Em contraste a preparações de anticorpo policlonal que incluem tipica- mente anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo mo- noclonal é direcionado contra um único determinante sobre um antígeno. Além de sua especificidade, preparações de anticorpo monoclonal são van- tajosas em que elas não são tipicamente contaminadas por outras imuno- globulinas.

O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo produção de anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a se- rem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método do hibridoma (por exemplo, Kohler et al, Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al, Antibodies: A Laboratorv Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563- 681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinantes (vide, por e- xemplo, Patente U.S. No. 4.816.567), métodos de apresentação em fago (vide, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. MoL BioL 338(2): 299- 310 (2004); Lee etal., J. MoL Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee etal., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), e tecnologias para produção de anticor- pos humanos ou semelhantes a seres humanos em animais que tem ptécni- cas ou todos os Ioci de imunoglobulinas humanas ou genes que codificam seqüências de imunoglobulinas humanas (vide, por exemplo, WO98/24893; WO96/34096; W096/33735; WO91/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. A- cad. Sci USA 90: 2551 (1993); Jakobovits etal., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patente U.S. Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg etal., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biote- chnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) e Lonberg & Huszar, lntern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anti- corpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia pesada e/ou cadeia leve é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos deri- vados de uma espécie em particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às seqüências correspondentes em anticorpos deriva- dos de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anti- corpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851 -6855 (1984)). Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem- plo, de murino) são anticorpos quiméricos que contêm a seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) na qual re- síduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano que têm a espe- cificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resí- duos de região de arcabouço (FR) da imunoglobulina humana são substituí- dos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para refinar mais o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipi- camente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não- humana e todas ou substancialmente todas as FR são aquelas de uma se- qüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para maiores detalhes, vide Jones et aí, Nature 321:522-525 (1986); Riech- mann et al, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Vide também os seguintes artigos de revisão e referências citadas nesses: Vaswani & Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & /mmunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soe. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle & Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que tenha sido feito usando qualquer uma das técnicas para fazer anticorpos humanos como descrito aqui. Essa definição de um anticor- po humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compre- ende resíduos de ligação de antígeno não-humanos. Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constan- te de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM e várias dessas podem ainda ser divididas em subclas- ses (isotipos), por exemplo, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2.

Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais HVRs desses que resultam em melhora na afi- nidade do anticorpo por um antígeno, comparado a um anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Em uma modalidade, um anticorpo de afinidade madura tem afinidades de nanomolar ou mesmo picomolar pelo antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779- 783 (1992) descreve a maturação de afinidade pelo embaralhamento de domínios de VH e VL. Mutagênese aleatória de HVR e/ou resíduos de arca- bouço é descrita por Barbas et aí. Proc Nat. Acad. Sei. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al Gene 169:147-155 (1995); Yèlton et aí. J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Haw- kins et al, J. Mol Biol. 226:889-896 (1992).

Um anticorpo "bloqueador", anticorpo "neutralizante" ou anticor- po "antagonista" é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antíge- no ligado a ele. Tais anticorpos podem inibir substancialmente ou completa- mente a atividade biológica do antígeno.

Um "anticorpo agonista", como usado aqui, é um anticorpo que mime- tiza parcialmente ou totalmente uma atividade biológica de um polipeptídeo de interesse.

"Funções efetoras" de anticorpo referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüência nativa ou re- gião Fc de variante de seqüência de aminoácido) de um anticorpo e podem variar com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação a C1q e citotoxicidade dependente de complemento; ligação ao receptor Fc; citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCG); fa- gocitose; receptores negativa de receptores da superfície celular (por exem- pio, receptor de célula B); e ativação de célula B.

"Afinidade de ligação" geralmente refere-se à força da soma total de interações não-covalentes entre um sítio de ligação único de uma molé- cula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra maneira, como usado aqui, "afini- dade de ligação" refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y pode geral- mente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade po- de ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aque- les descritos aqui. Anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao an- tígeno lentamente e tendem a se dissociar rapidamente, enquanto que anti- corpos com alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno mais rapidamen- te e tendem a permanecer ligados mais tempo. Uma variedade de métodos para medir a afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer um dos quais pode ser usado para os propósitos da presente invenção. Modalidades ilustrativas específicas estão descritas a seguir.

Em uma modalidade, o "Kd" ou "valor de Kd" de acordo com es- sa invenção é medido por um ensaio de ligação ao antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antí- geno como descrito pelo seguinte ensaio. Afinidade de ligação em solução de Fabs para um antígeno é medida por equilibrar Fab com uma concentra- ção mínima de antígeno marcado com (I125) na presença de uma série de titulações de antígeno não-marcado, então capturando antígeno ligado com uma placa coberta com anticorpo anti-Fab (Chen, et al, (1999) J. Moi Biol. 293:865-881). Para capturar as condições para o ensaio, placas de microtitu- lação (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 pg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9.6) e subseqüentemente bloqueadas com albumina sérica bovina 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não adsorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM de [I125]-antígeno são misturados com diluições seriadas de um Fab de interes- se (por exemplo, compatível com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab- 12, em Presta et al., (1997) CancerRes. 57:4593-4599). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; entretanto, a incubação pode continuar por um período maior (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equi- líbrio seja alcançado. Após isso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação a temperatura ambiente (por exemplo, por uma ho- ra). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com Tween-20 0,1% em PBS. Quando as placas estiverem secas, 150 μl/cavidade de cinti- lante ((MicroScint-20; Packard) são adicionados e as placas são contadas em um contador gama Topcount (Packard) por 10 minutos. Concentrações de cada Fab que dão menos ou igual a 20% da ligação máxima são escolhi- das para uso em ensaios de ligação competitiva.

De acordo com outra modalidade, o Kd ou valor de Kd é medido por ensaios de ressonância de plasma de superfície usando um BlAcore®- 2000 ou um BIAcore®-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com chips CM5 de antígeno imobilizado em -10 unidades de resposta (RU). Re- sumidamente, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BlAco- re Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N- (3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instru- ções do fabricante. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, para 5 pg/ml (~ 0,2 μΜ) antes da injeção em uma taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto para se obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após injeção de antígeno, etanolamina 1 M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medidas de cinética, diluições seri- 25 adas duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com Tween 20 0,05% (PBST) a 25QC em uma taxa de fluxo de aproximadamente μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calcu- ladas usando um modelo de ligação de Langmuir simples um a um (BlAcore Evaluation Software versão 3.2) pelo ajuste simultâneo dos sensorgramas de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon- Vide, por exemplo, Chen, Y., et ai, (1999) J. Mol. Bioi 293:865-881. Se a taxa de ligação excede 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância de plasma de superfície acima, então a taxa de ligação pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa-faixa de 16 nm) a 25gC de um anticorpo antiantígeno a 20 nM (forma de Fab) em PBS, pH 7,2 na pre- sença de concentrações crescentes de antígeno como medido em um es- pectrofotômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com válvula "stop- flow" (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

Uma "taxa de ligação", "taxa de associação ou "W de acordo com essa invenção também pode ser determinada como descrito acima u- sando um sistema BIAcore®-2000 ou BIAcore®-3000 (BlAcore, Inc., Pisca- taway, NJ).

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Componentes con- taminantes de seu ambiente natural são materiais que poderão interferir com os usos de diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo e podem incluir en- zimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais do que 95% em peso do anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e o mais preferivelmente para mais do que 99% em peso, (2) para um grau sufi- ciente para se obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos N-terminais ou internos pelo uso de um seqüenciador de copo giratório ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não- redutoras usando azul de Coomassie, ou preferivelmente, coloração com prata. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombi- nantes já que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Comumente, entretanto, o anticorpo isolado será pre- parado por pelo menos uma etapa de purificação.

A palavra "marcador" quando usada aqui refere-se a um com- posto ou composição detectáveis que são conjugados diretamente ou indire- tamente a uma molécula (tal como um ácido nucléico, um polipeptídeo ou anticorpo) de maneira a gerar uma molécula "marcada". O marcador pode ser detectável por si só (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou mar- cadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catali- sar a alteração química de um composto ou composição de substrato, resul- tando em um produto detectável.

Por "fase sólida" entende-se uma matriz não-aquosa a qual uma molécula (tal como um ácido nucléico, um polipeptídeo ou anticorpo) pode aderir. Exemplos de fases sólidas abrangidos aqui incluem aquelas forma- das parcialmente ou completamente por vidro (por exemplo, vidro com poro controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, polies- tireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas modalidades, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o cavidade de uma placa de en- saio; em outras, ela é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade). Esse termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas separadas, tais como aquelas descritas na Paten- te U.S. No. 4.275.149.

Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para a liberação de um fármaco (tal como um ácido nucléico, um polipeptídeo, anticorpo, agonis- ta ou antagonista) para um mamífero. Os componentes do lipossoma estão comumente arranjados em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas.

Uma "pequena molécula" ou "pequena molécula orgânica" é de- finida aqui como uma molécula orgânica que tem um peso molecular abaixo de cerca de 500 Dáltons.

Um "oligopeptídeo" que se liga a um polipeptídeo alvo é um oli- gopeptídeo que é capaz de se ligar ao polipeptídeo alvo com afinidade sufi- ciente tal que o oligopeptídeo é útil como agente de diagnóstico e/ou tera- pêutico em atingir o polipeptídeo. Em certas modalidades, o grau de ligação de um oligopeptídeo a um polipeptídeo não relacionado, não alvo é menor do que cerca de 10% da ligação do oligopeptídeo com o polipeptídeo alvo como medido, por exemplo, por um ensaio de ressonância de plasma de superfície. Em certas modalidades, um oligopeptídeo se liga a um polipeptí- deo alvo com uma constante de dissociação (Kd) de < ΙμΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, ou < 0,1 nM.

Uma "molécula orgânica" que se liga a um polipeptídeo alvo é uma molécula orgânica diferente de um oligopeptídeo ou anticorpo como definidos aqui, que é capaz de se ligar a um polipeptídeo alvo com afinidade suficiente tal que a molécula orgânica é útil como agente diagnóstico e/ou terapêutico em atingir o polipeptídeo. Em certas modalidades, o grau de li- gação de uma molécula orgânica a um polipeptídeo não relacionado, não alvo é menor do que cerca de 10% da ligação da molécula orgânica com o polipeptídeo alvo como medido, por exemplo, por um ensaio de ressonância de plasma de superfície. Em certas modalidades, uma molécula orgânica se liga a um polipeptídeo alvo com uma constante de dissociação (Kd) de < ΙμΜ, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, ou < 0,1 nM.

Um sistema biológico" é um sistema in vitro, ex vivo ou in vivo que compreende células de mamífero que partilham uma via de sinalização comum.

O termo "doença relacionada à imunidade" significa uma doença na qual um componente do sistema imune de um mamífero causa, media ou contribui de outra maneira para a morbidade do mamífero. Também são in- • cluídas as doenças nas quais a estimulação ou intervenção da resposta i- mune tem um efeito de melhora da progressão da doença. Incluídas dentro desse termo estão as doenças inflamatórias mediadas pela imunidade, do- enças inflamatórias não mediadas pela imunidade, doenças infecciosas, do- enças por imunodeficiência e neoplasia.

O termo "doença medida por célula T" significa uma doença na qual as células T mediam diretamente ou indiretamente ou contribuem de outra maneira para a morbidade em um mamífero. A doença mediada por célula T pode estar associada com efeitos mediados por células, efeitos me· diados por linfocinas, etc. e até mesmo efeitos associados com células B se as células B forem estimuladas, por exemplo, pelas linfocinas secretadas por células T. Como usado aqui, o termo "psoríase" é definido como uma con- dição caracterizada pela erupção de macropápulas circunscritas, discretas e confluentes, avermelhadas, escamosas prateadas, principalmente nos coto- velos, joelhos, couro cabeludo ou tronco.

O termo "tumor", como usado aqui, refere-se a todo crescimento e proliferação celular neoplásica, quer maligna ou benigna, e todas as célu- las e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos "câncer", "cancero- so", "desordem celular proliferativa", "doença proliferativa" e "tumor" não são mutuamente exclusivos como referido aqui.

O termo "progressão do tumor" refere-se ao crescimento e/ou proliferação de um tumor.

O termo "câncer" e "canceroso" refere-se ou descreve a condi- ção fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo cresci- mento/proliferação celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a carcinoma, Iinfoma (por exemplo, Iinfoma de Hodgkin e não-Hodgkin), blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de célula pequena, adenocarcinoma de pulmão, carcinoma escamoso do pul- mão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, cân- cer pancreático, glioma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer re- tal, câncer gástrico, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glându- la salivar, câncer de rim, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de vulva, câncer de tireóide, carcinoma hepático, leucemia e outras desordens linfoproliferativas e vários tipos de cânceres de cabeça e pescoço.

Uma "desordem autoimune" ou "auto-imunídade" refere-se a qualquer condição na qual uma resposta imune humoral ou mediada por cé- lula é criada contra um tecido do próprio corpo. Uma "desordem autoimune mediada por IL-23" é qualquer desordem autoimune que é causada, mantida ou exacerbada pela atividade de IL-23.

"Inflamação" refere-se ao acúmulo de leucócitos e à dilatação dos vasos sangüíneos em um local de lesão ou infecção, tipicamente cau- sando dor, edema e vermelhidão.

"Inflamação crônica" refere-se a inflamação na qual a causa da inflamação persiste e é difícil ou impossível de remover.

"Inflamação autoimune" refere-se a inflamação associada com uma 5 "Inflamação artrítica" refere-se a inflamação associada com artri- te.

"Doença inflamatória do intestino" ou "IBD" refere-se a uma de- sordem crônica caracterizada por inflamação do trato gastrointestinal. IBD abrange colite ulcerativa, que afeta o intestino grosso e/ou reto e doença de Crohn, que pode afetar todo o sistema gastrointestinal, mas afeta mais co- mumente o intestino delgado (íleo) e possivelmente o intestino grosso.

"Artrite" refere-se à inflamação das articulações e inclui, mas não é limitada a osteoartrite, gota, artrite associada à infecção, artrite da síndro- me de Reiter, e artrite associada com desordens autoimunes, tais como artri- te reumatóide, artrite psoriásica, artrite associada ao lúpus, espondilartrite e artrite associada à esclerodermia.

O termo "quantidade eficaz" é uma concentração ou quantidade de uma molécula (por exemplo, um ácido nucléico, polipeptídeo, agonista ou antagonista) que resulta na obtenção de um propósito particular estabeleci- do. Uma "quantidade eficaz" pode ser determinada empiricamente. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma concentração ou quantidade de uma molécula que é eficaz para a obtenção de um efeito terapêutico estabe- lecido. Essa quantidade também pode ser determinada empiricamente.

O termo "agente citotóxico" como usado aqui refere-se à uma substância que inibe ou evita a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, I131i I125, Y90 e Re186), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas enzimati- camente ativas de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou frag- mentos dessas.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tra- tamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem adriami- cina, doxorrubicina, epirrubicina, 5-fluorouracil, citosina arabinosídeo ("Ara- C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, citoxina, taxóides, por exemplo, pacli- taxel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), e doxetaxel (Taxotere, Rhone -Poulenc Rorer, Antony, France), toxotere, metotrexato, cisplatina, melfalan, vinblastina, bleomicina, etoposídeo, ifosfamida, mitomi- cina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatina, teniposídeo, dau- nomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, espe- ramicinas (vide Pat. U.S. No. 4.675.187), melfalan e outras mostardas nitro- genadas relacionadas. Também são incluídos nessa definição agentes hor- monais que atuam para regular ou inibir a ação do hormônio sobre o tumor tal como tamoxifen e onapristona.

Um "agente inibidor do crescimento" quando usado aqui, refere- se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de câncer que superexpressa qualquer um dos genes identificados aqui, tanto in vitro quanto in vivo. Assim, um agente ini- bidor do crescimento é aquele que reduz significativamente o percentual de células que superexpressâm tais genes na fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como agentes que indu- zem a parada de G1 e parada da fase M. Bloqueadores da fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxol e inibidores de topo II tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposídeo e bleomicina. Aqueles agentes que param G1 também interferem na parada da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA tais como tamoxifen, prednisona, da- carbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexate, 5-fluorouracil e ara-C. Informação adicional pode ser encontrada em The Molecular Basis of Cân- cer, Mendelsohn & Israel, eds., Capítulo 1, entitulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Fi- ladélfia, 1995), especialmente p. 13.

O termo "citocina" é um termo geral para proteínas liberadas por uma população celular que atuam em outra população celular como media- doras intercelulares. Exemplos de tais citocinas são as linfocinas, monocinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão o hormônio do crescimento tal como o hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio do crescimento bovino; hormônio paratireoidiano; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina;

pró-relaxina; hormônios glicoprotéicos tais como hormônio folículo- estimulante (FSH)1 hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio Iutei- nizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibro- blasto; prolactina; lactogênio placentário; fator de necrose tumoral α e β; substância inibidora de hormônio mulleriano; peptídeo associado a gonado- tropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento de nervo tais como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento transformantes (TGFs) tais como TGF-α e TGF- β; fator-l e Il de crescimento semelhante à insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interfe- rons tais como interferon-α, -β, e -γ; fatores estimuladores de colônia (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF) e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL- 3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; fatores de necrose tumoral tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos incluindo Iigante de LIF e kit (KL). Como usado aqui, o termo citocinas inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de seqüência nativa.

Como usado aqui, o termo "células inflamatórias" designa célu- las que aumentam a resposta inflamatória tais como células mononucleares, eosinófilos, macrófagos e neutrófilos polimorfonucleares (PMN).

II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DA INVENÇÃO

A. Polinucleotídeos e Polípeptídeos de IL-22 ou IL-22R

A presente invenção fornece polipeptídeos de IL-22 ou IL-22R isolados e seqüências de nucleotídeos isoladas que codificam esses poli- peptídeos. Polipeptídeos de IL-22 ou IL-22R abrangem polipeptídeos de IL- 22 ou IL-22R nativos de extensão completa ou maduros assim como varian- tes de IL-22 ou IL-22R. Variantes de IL-22 ou IL-22R podem ser preparadas pela introdução de alterações de nucleotídeos apropriadas no DNA de IL-22 ou IL-22R e/ou pela síntese do polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R desejado. Aqueles versados na técnica apreciarão que as alterações de aminoácidos podem alterar o processamento pós-traducional de IL-22 ou IL-22R, tal como alterar o número ou posição de sítios de glicosilação ou alterar as caracterís- ticas de ancoragem da membrana.

Variações em IL-22 ou IL-22R nativos ou em vários domínios de IL-22 ou IL-22R, como descrito aqui, podem ser feitas, por exemplo, usando qualquer uma das técnicas ou normas para mutações conservativas e não conservativas descritas, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.364.934. Varia- ções podem ser substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons que codificam IL-22 ou IL-22R que resultem em uma alteração na seqüência de aminoácidos de IL-22 ou IL-22R quando comparada com uma seqüência nativa de IL-22 ou IL-22R. Opcionalmente, a variação é por substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido em um ou mais domínios de IL-22 ou IL-22R. A orientação na determinação de que resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar adver- samente a atividade desejada pode ser encontrada por comparar a seqüên- cia de IL-22 ou IL-22R com aquela de moléculas de proteínas homólogas conhecidas e minimizar o número de alterações de seqüência de aminoáci- dos feitas em regiões de alta homologia. Substituições de aminoácidos po- dem ser o resultado de substituição de um aminoácido por outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares, tal como a substi- tuição de uma Ieucina por uma serina, isto é, substituições conservativas de aminoácidos. Inserções ou deleções podem estar, opcionalmente, na faixa de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada por fazer inserções, deleções ou substituições sistematicamente na seqüên- cia de aminoácidos e testar as variantes resultantes quanto a atividade exi- bida pela seqüência nativa de extensão completa ou madura.

Em modalidades particulares, substituições conservativas de interesse são mostradas na Tabela 6 sob o título de substituições preferidas. Se tais substituições resultam em uma alteração na atividade biológica, en- tão alterações mais substanciais, denominadas substituições exemplares na Tabela 6 ou como descritas abaixo em referência a classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos rastreados.

Tabela 6

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Modificações substanciais na função ou identidade imunológica do polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R são obtidas por selecionar substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da es- trutura do arcabouço do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicida- de da molécula no sítio alvo ou (c) do volume da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em dois grupos com base nas pro- priedades comuns da cadeia lateral:

(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílico neutro: cys, ser, thr;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromático: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas implicarão em troca de um membro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos em sítios de substituição conservativa ou mais preferivelmente, nos sítios remanescentes (não conservados).

As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos na técnica tais como mutagênese (direcionada ao sítio) mediada por oligonu- cleotídeo, rastreamento de alanina e mutagênese por PCR. Mutagênese di- recionada ao sítio [Ctécnicar et ai, Nucl. Acids Res.. 12:4331 (1986); Zoller et al, Nucl. Acids Res.. 10:6487 (1987)], mutagênese de cassete [Wells et ai, Gene, 34:315 (1985)], mutagênese por seleção de restrição [Wells et ai, Philos. Trans. R. Soe. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas co- nhecidas podem ser realizadas sobre o DNA clonado para produzir um DNA variante de IL-22 ou IL-22R.

Fragmentos de polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R também são for- necidos aqui. Tais fragmentos podem ser truncados na terminação N ou terminação C ou podem carecer de resíduos internos, por exemplo, quando comparados com a proteína nativa de extensão completa. Certos fragmentos não têm resíduos de aminoácidos que não são essenciais para a atividade biológica desejada do polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R. Conseqüentemente, em certas modalidades, um fragmento de IL-22 ou IL-22R é biologicamente ativo. Em certas modalidades, um fragmento de IL-22 de extensão completa não tem a seqüência do peptídeo de sinal N terminal. Em certas modalida- des, um fragmento de IL-22R de extensão completa é uma forma solúvel de IL-22R que não está ligado à membrana, por exemplo, uma forma de IL-22R que não tem um domínio transmembrana. Por exemplo, uma forma solúvel de IL-22R humana pode não ter todo ou uma porção substancial do domínio transmembrana de cerca dos aminoácidos 229-251 de SEQ ID NO:3.

Modificações covalentes de IL-22 ou IL-22R estão incluídas den- tro do escopo dessa invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reagir resíduos de aminoácidos marcados de um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadei- as laterais selecionadas ou resíduos N- ou C-terminais de IL-22 ou IL-22R. Derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticulação de IL-22 ou IL-22R com uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para uso no método para purificação de anticorpos anti-IL-22 ou IL-22R e vice-versa. Agentes para reticulação comumente usados incluem, por e- xemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N- hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imido- ésteres homobifunctionais, incluindo ésteres de disuccinimidila tais como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais tais como bis-N- maleimido-1,8-octano e agentes tal como metil-3-[(p- azidofenil)ditio]propioimidato.

Outras modificações incluem a desamidação de resíduos gluta- minil e asparaginil para os resíduos correspondentes glutamila e aspartila, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hi- droxila de resíduos de serila ou treonila, metilação de grupos α-amino de cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [Τ. E. Creighton, Proteins: S- tructure and Molecular Properties. W. H. Freeman & Co., São Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxila C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente de um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R incluída dentro do escopo dessa invenção compreende alterar o padrão nativo de glicosilação do polipeptídeo. "Alterar o padrão nativo de glicosilação do polipeptídeo" pretende significar para os propósitos aqui con- tidos, deletar uma ou mais porções de carboidrato encontradas em IL-22 ou IL-22R de seqüência nativa (tanto pela remoção do sítio de glicosilação sub- jacente quanto pela deleção da glicosilação por meios químicos e/ou enzi- máticos) e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estão pre- sentes em IL-22 ou IL-22R de seqüência nativa. Além disso, a expressão inclui alterações qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, envolven- do uma alteração na natureza e proporções das várias porções de carboidra- to presentes.

Um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R da presente invenção tam- bém pode ser modificado de maneira a formar uma molécula quimèrica que compreende IL-22 ou IL-22R fundida com outro polipeptídeo ou seqüência de aminoácidos heterólogo. Em uma modalidade, uma molécula quimèrica compreende a fusão de IL-22 ou IL-22R com um polipeptídeo de sinalização que fornece um epitopo ao qual um anticorpo anti-sinalizador pode se ligar seletivamente. O sinalizador de epitopo é geralmente colocado na termina- ção amino ou carboxila dé IL-22 ou IL-22R. A presença de tais formas com epitopo sinalizado de IL-22 ou IL-22R pode ser detectada usando um anti- corpo contra o polipeptídeo sinalizador. Também, o fornecimento de um si- nalizador de epitopo possibilita que IL-22 ou IL-22R sejam rapidamente puri- ficadas por purificação por afinidade usando um anticorpo anti- sinalizador ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao epitopo sinalizador. Vá- rios polipeptídeos sinalizadores e seus respectivos anticorpos são bem- conhecidos na técnica. Exemplos incluem sinalizadores de poli-histidina (po- 25 li-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipeptídeo sinalizador HA da gripe e seu anticorpo 12CA5 [Field et al, Mol. Cell. Biol, 8:2159-2165 (1988)]; o sinalizador c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para ele [Evan et al., Molecular and Cellular Bioloqy, 5:3610-3616 (1985)]; e o sinali- zador de glicoproteína D (gD) do vírus de Herpes Simples e seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineerinq. 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipeptí- deos sinalizadores incluem o peptídeo Flag [Hopp et al., BioTechnoIogy, 6:1204-1210 (1988)]; o epitopo de peptídeo KT3 [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; um epitopo de peptídeo de alfa-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o sinalizador de peptídeo da prote- ína 10 do gene T7 [Lutz-Freyermuth et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397(1990)].

Em outra modalidade, uma molécula quimérica pode compreen- der uma fusão de um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R com uma imunoglobu- lina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma biva- lente da molécula quimérica (também referida como "imunoadesina"), tal fu- são poderia ser à região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig inclu- em preferivelmente a substituição de uma forma solúvel de um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R no lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula de lg. Em uma modalidade particularmente preferida, a fusão da imunoglobulina inclui a dobradiça, CH2 e CH3 ou a dobradiça, regiões CH1, CH2 e CH3 de uma molécula de IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina vide também a Patente U.S. No. 5.428.130 editada em 27 de junho de 1995.

1. Preparação de IL-22 ou IL-22R

IL-22 ou IL-22R podem ser preparadas por métodos recombi- nantes de rotina, por exemplo, cultivo de células transformadas ou transfec- tadas com um vetor que contem um ácido nucléico que codifica uma IL-22 ou IL-22R, como exemplificado pelo ácido nucléico mostrado na Figura 1, que codifica uma IL-22. Células hospedeiras que compreendem qualquer um de tais vetores também são fornecidas. Como forma de exemplo, células hospedeiras podem ser células CHO, E. coli ou levedura. Um processo para produção de qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui ainda é fornecido e compreende cultivar células hospedeiras sob condições adequadas para expressão do polipeptídeo desejado e recuperar o polipeptídeo desejado da cultura celular.

Em outras modalidades, a invenção fornece moléculas quiméri- cas que compreendem qualquer um dos polipeptídeos descritos aqui fundi- dos a um polipeptídeo ou seqüência de aminoácidos heteróloga. Exemplo de tais moléculas quiméricas compreende qualquer um dos polipeptídeos des- critos aqui fundidos a uma seqüência de sinalizador de epitopo ou a uma região Fc de uma imunoglobulina.

É contemplado, logicamente, que métodos alternativos, que são bem-conhecidos na técnica, podem ser empregados para preparar IL-22 ou IL-22R. Por exemplo, a seqüência de IL-22 ou IL-22R ou porções dessa po- de ser produzida por síntese direta de peptídeo usando técnicas de fase só- lida [vide, por exemplo, Stewart et ai, Solid-Phase Peptide Svnthesis. W.H. Freeman Co., São Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soe, 85:2149-2154 (1963)]. A síntese de proteína in vitro pode ser realizada u- sando técnicas manuais ou por automação. A síntese automática pode ser obtida, por exemplo, usando um Sintetizador de Peptídeo Applied Biosys- tems (Foster City, CA) usando as instruções do fabricante. Várias porções de IL-22 ou IL-22R podem ser sintetizadas quimicamente separadamente e combinadas usando métodos químicos ou enzimáticos para produzir IL-22 ou IL-22R de extensão completa.

IL-22 ou IL-22R expressos recombinântemente podem ser recu- perados de um meio de cultura ou de Iisados de célula hospedeira. Os se- guintes procedimentos são exemplares de procedimentos de purificação a- dequados: por fracionamento em uma coluna de troca de íons; precipitação com etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em resina de troca de cátion tal como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipita- ção com sulfato de amônio; filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sefarose para remover contaminantes tais co- mo IgG; e colunas quelantes de metal para ligar formas com epitopo silizado de IL-22 ou IL-22R. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por e- xemplo, em Deutscher, Methods in Enzvmology. 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlaq. Nova Iorque (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(rão), por exemplo, da natureza do processo de produção usado e da IL-22 ou IL-22R produzidas em particular. 2. Detecção de Expressão Gênica

Expressão de um gene que codifica IL-22 ou IL-22R pode ser detectada por vários métodos da técnica, por exemplo, pela detecção da expressão de mRNA que codifica IL-22 ou IL-22R. Como usado aqui, o ter- mo "detectar" abrange a detecção quantitativa ou qualitativa. Pela detecção da expressão do gene de IL-22 ou IL-22R, pode-se identificar, por exemplo, aqueles tecidos que expressam um gene de IL-22 ou IL-22R. A expressão gênica pode ser medida usando certos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, Northern blotting, (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77:5201-5205 [1980]); PCR quantitativo; ou hibridização in situ, usando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas seqüên- cias fornecidas aqui. Alternativamente, a expressão gênica pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imunohistoquímica de se- ções de tecido e ensaio de cultura de célula ou de fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto do gene. Anticorpos úteis para marcação imuno-histoquímica e/ou ensaio de amostra de fluidos a- brangem qualquer um dos anticorpos fornecidos aqui. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra uma seqüência nativa do polipeptí- deo de IL-22 ou IL-22R; contra um peptídeo sintético que compreende um fragmento da seqüência do polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R; ou contra uma seqüência exógena fundida a um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R ou um fragmento desse (incluindo um peptídeo sintético).

B. Anticorpos

Anticorpos que se ligam a qualquer um dos polipeptídeos descri- tos acima ou abaixo são fornecidos. Em uma modalidade, um anticorpo iso- lado que se liga a um polipeptídeo de IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-20Ra, IL- 20Rb, IL-10R2, ou IL-22R. Anticorpos exemplares incluem anticorpos poli- clonal, monoclonal, humanizado, humano, biespecífico e heteroconjugado. Um anticorpo pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um frag- mento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2. Em uma modalidade, um anticorpo isolado que se liga a IL-22 ou IL-22R é fornecido. Em tal modalidade, um anticorpo bloqueia parcialmente ou completamente a atividade de um poli- peptídeo de IL-22 ou IL-22R (isto é, um anticorpo "bloqueador").

Anticorpos monoclonais exemplares que se ligam a IL-22 ou IL- 22R são fornecidos aqui e descritos nos Exemplos. Esses anticorpos inclu- em os anticorpos anti-IL-22 designados 3F11.3 ("3F11"), 11H4.4 (Ί1Η4"), e 8E11.9 ("8E11") e os anticorpos anti-IL-22R designados 7E9.10.8 ("7E9"), 8A12.32 ("8A12"), 8H11.32.28 ("8H11"), e 12H5. Em uma modalidade, um hibridoma que produz qualquer um desses anticorpos é fornecido. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais que competem com 3F11.3, 11 H4.4, ou 8E11.9 pela ligação com IL-22 são fornecidos. Em outra modalidade, an- ticorpos monoclonais que se ligam ao mesmo epitopo que 3F11.3, 11H4.4, ou 8E11.9 são fornecidos. Em outra modalidade, os anticorpos monoclonais que competem com 7E9, 8A12, 8H11, ou 12H5 pela ligação com IL-22R são fornecidos. Em outra modalidade, anticorpos monoclonais que se ligam ao mesmo epitopo que com 7E9, 8A12, 8H11, ou 12H5 são fornecidos. Várias modalidades de anticorpos são fornecidas abaixo:

1. Anticorpos policlonais

Anticorpos podem compreender anticorpos policlonais. Métodos de preparar anticorpos policlonais são conhecidos pelo versado na técnica. Anticorpos policlonais podem ser feitos em um mamífero, por exemplo, por uma ou mais injeções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvan- te. Tipicamente, um agente imunizante e/ou adjuvante serão injetados no mamífero através de múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir o polipeptídeo de interesse ou uma proteína de fusão desse. Pode ser útil conjugar o agente imunizante a uma proteína conhecida por ser imunogênica no mamífero a ser imunizado. Exemplos de tais proteínas imunogênicas incluem, mas não se limitam, a hemocianina de keyhole limpet, albumina sérica, tireoglobulina bovina e inibidor da tripsina de soja. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem o ad- juvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil Lipídio A, dicorinomicolato de trealose sintético). O protocolo de imunização pode ser selecionado pelo versado na técnica sem experimentação exaustiva. 2. Anticorpos Monoclonais

Anticorpos podem ser, alternativamente, anticorpos monoclo- nais. Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos de hibridoma, tais como aqueles descritos por Kohler & Milstein, Nature, 256:495 (1975). Em um método de hibridoma, um camundongo, hamster ou outro animal hospedeiro apropriado é tipicamente imunizado com um agente imunizante para fazer surgir linfócitos que produzem ou são capazes de pro- duzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Alter- nativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

O agente imunizante incluirá tipicamente o polipeptídeo de inte- resse ou uma proteína de fusão desse. Geralmente, ou linfócitos do sangue periférico ("PBLs") são usados se células de origem humana forem deseja- das ou células esplênicas ou células de linfonodos são usadas se fontes de mamífero não humano forem desejadas. Os linfócitos são então fundidos com uma linhagem celular imortalizada usando um agente de fusão adequa- do, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Linhagens de células imortalizadas são geralmente células de ma- míferos transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, bovi- no ou de origem humana. Geralmente, linhagens celulares de mieloma de rato ou camundongo são empregadas. As células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura adequado que contém preferivelmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência de cé- lulas imortalizadas não fundidas. Por exemplo, se as células parentais não têm a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou H- PRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), cujas substâncias impedem o cresci- mento de células deficientes em HGPRT.

As linhagens celulares imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficazmente, suportam alto nível de expressão estável de anti- corpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Linhagens celulares imortalizadas mais prefe- ridas são as linhagens de mieloma de murino, que podem ser obtidas, por exemplo, do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia e American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. Linhagens celulares de mieloma ser humano e heteromieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Koz- bor, J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur et ai, Monoclonal Antibodv Pro- duction Technigues and Applications. Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, (1987) pp. 51-63],

O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas pode então ser testado quanto à presença de anticorpos monoclonais que se ligam ao polipeptídeo de interesse. Preferivelmente, a especificidade de liga- ção de anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimu- noensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do an- ticorpo monoclonal pode ser, por exemplo, determinada pela análise Scat- chard de Munson & Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Após as células desejadas do hibridoma serem identificadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição Iimitante e cultivados por métodos padronizados [Goding, supral. Meios de cultura ade- quados para esse propósito incluem, por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo em ascite em um mamífero.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura ou líquido de ascite por pro- cedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia com hidroxilapatita, eletrofore- se em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Anticorpos monoclonais podem ser feitos pelo uso de bibliotecas combinatórias para rastrear anticorpos com a atividade ou atividades dese- jadas. Por exemplo, uma variedade de métodos são conhecidos na técnica para gerar bibliotecas de apresentação em fago e rastrear tais bibliotecas quanto à anticorpos que possuem as características de ligação desejadas. Tais métodos são descritos geralmente em Hoogenboom et aí. (2001) Me- thods in Molecular Biology 178:1-37 (O1Brien et al., ed., Human Press, Toto- wa, NJ), e em certas modalidades, em Lee et al. (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093.

A princípio, clones sintéticos de anticorpo são selecionados pelo rastreamento de bibliotecas de fago que apresentam vários fragmentos de região variável (Fv) de anticorpo fundidos a proteína de revestimento do fa- go. Tais bibliotecas de fagos são rastreadas por cromatografia de afinidade contra o antígeno desejado. Clones que expressam fragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado são adsorvidos pelo antígeno e então sepa- rados dos clones não Iigantes da biblioteca. Os clones Iigantes são então eluídos do antígeno e podem ser enriquecidos ainda por ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígeno. Qualquer um dos anticorpos da invenção po- de ser obtido pelo delineamento de um procedimento de rastreamento de antígeno adequado para selecionar o clone de fago de interesse seguido pela construção de um clone de anticorpo de extensão completa usando as seqüências Fv do clone de fago de interesse e seqüências de região cons- tante (Fc) adequadas descritas em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Publicação do NIH 91-3242, Bethes- da MD (1991), vols. 1-3.

Os anticorpos monoclonais também podem ser feitos por méto- dos de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na Patente U.S. No 4.816.567. DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção podem ser rapidamente isolados e seqüenciados usando procedimentos convencio- nais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). As células de hibridoma da invenção servem como a fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outra maneira não produzem a proteí- na imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, pela substituição da seqüência codificante por domínios cons- tantes da cadeia pesada e leve humana no lugar das seqüências homólogas de murino [Patente U.S. No. 4.816.567; Morrison et ai, supral ou por unir covalentemente à seqüência codificante de imunoglobulina, toda ou ptécnica da seqüência codificante de um polipeptídeo não imunoglobulina. Tal poli- peptídeo não imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo da invenção ou pode ser substituído pelos domínios variá- veis de um sítio que se combina ao antígeno de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.

3. Anticorpos Monovalentes

Anticorpos monovalentes também são fornecidos. Métodos para preparar anticorpos monovalentes são bem-conhecidos na técnica. Por e- xemplo, um método envolve a expressão recombinante de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto da região Fc a fim de evitar a ligação cruzada da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido ou são deletados a fim de evi- tar a ligação cruzada.

Métodos in vitro também são adequados para preparar anticor- pos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos des- ses, particularmente fragmentos Fab, pode ser obtida usando técnicas de rotina conhecidas na técnica.

4. Fragmentos de Anticorpo

Fragmentos de anticorpo também são fornecidos. Fragmentos de anticorpo podem ser gerados por meios tradicionais, tal como digestão enzimática, ou por técnicas recombinantes. Em certas circunstâncias exis- tem vantagens em se usar fragmentos de anticorpo, ao invés de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida depuração e pode levar a um acesso melhorado em tumores sólidos. Para uma revisão de cer- tos fragmentos de anticorpo, vide Hudson et ai (2003) Nat. Med. 9:129-134. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de frag- mentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos eram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et ai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan et ai, Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses frag- mentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e scFv podem ser todos expressos e secretados a partir de E. coli, assim permitindo a fácil produção de grandes quantidades desses fragmentos. Fragmentos de anticorpo po- dem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab1-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Ctécni- car et ai, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra aborda- gem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Fragmento Fab e F(ab')2 com meia-vida aumenta- da in vivo compreendendo resíduos de epitopo de ligação de receptor selva- gem são descritos em Pat. U.S. No. 5.869.046. Outras técnicas para a pro- dução de fragmentos de anticorpo serão claras para o técnico praticante. Em certas modalidades, um anticorpo é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Vide WO 93/16185; Pat. U.S. Nos. 5.571.894 e 5.587.458. Fv e scFv são as únicas espécies com sítios de combinação intactos que são despro- vidos de regiões constantes; assim, eles podem ser adequados para ligação inespecífica reduzida durante o uso in vivo. Proteínas de fusão de scFv po- dem ser construídas para fornecer fusão de uma proteína efetora tanto na terminação amino quanto na terminação carbóxi de um scFv. Vide Antibodv Engineerinq1 ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na Pat. U.S. No. 5.641.870, por exemplo. Tais anticorpos lineares podem ser monoespecífi- cos ou biespecíficos.

5. Anticorpos Humanizados

Anticorpos humanizados também são fornecidos. Vários méto- dos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de ami- noácidos introduzidos nele de uma fonte que é não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são geralmente referidos como resíduos "im- portados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado".

A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et ai (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 '; Verhoeyen et ai. (1988) Science 239:1534-1536), pela substituição de seqüências de região hipervariável pe- las sequencias correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüente- mente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Pat. U.S. No. 4.816.567) em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espé- cie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anti- corpos humanos nos quais alguns resíduos de região hipervariável e possi- velmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios aná- logos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve como pe- sado, a ser usados para fazer os anticorpos humanizados pode ser impor- tante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método assim chama- do "best-fit", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra a biblioteca completa de seqüências de domínio variável humano conhecidas. A seqüência humana que é mais próxima daquela do roedor é então aceita como o arcabouço humano para o anticorpo humani- zado (Sims etal. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Moi Bioi 196:901. Outro método usa um arcabouço particular derivado de uma seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo parti- cular de cadeias leves e pesadas. O mesmo arcabouço pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (Ctécnicar et ai (1992) Proc. Nati Acad. Sci USA, 89:4285; Presta et al (1993) J. immunol, 151:2623.

Ainda é geralmente desejável que anticorpos sejam humaniza- dos com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para se obter essa meta, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise de se- qüências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando mo- delos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos tridi- mensionais de imunoglobulinas estão comumente disponíveis e são familia- res àqueles versados na técnica. Programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas estão disponíveis. A inspeção dessas apresentações permite a análise da provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a habilidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno. Desse modo, resíduos de FR podem ser selecio- nados e combinados a partir do receptor e seqüências importadas tal que a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumentada para o(s) antígeno(s) alvo, é obtida. Em geral, resíduos de região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da liga- ção ao antígeno.

6. Anticorpos Humanos Também são fornecidos anticorpos humanos. Anticorpos huma- nos podem ser construídos pela combinação de seqüência(s) de domínio variável de clone de Fv selecionada(s) de bibliotecas de apresentação em fago derivadas de humanos com seqüência(s) de domínio constante huma- nas conhecida(s) como descrito acima. Alternativamente, anticorpos mono- clonais humanos da invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma ser humano e heteromieloma de camun- dongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foi descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol, 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51- 63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987);e Boerner et al, J. Immunol, 147: 86(1991).

Agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, por imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobuli- na endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção (JH) da cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linhagem germinativa resulta em inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do arranjo do gene da imunoglobulina de linhagem germinativa humana em tais camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos hu- manos pela estimulação com antígeno. Vide, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al, Year in Immunol, 7: 33 (1993).

O embaralhamento de genes também pode ser usado para deri- var anticorpos humanos de anticorpos não humanos, por exemplo, de roedo- res, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo não humano de partida. De acordo com esse método, que também é chamado de "impressão de epitopo", tanto a região variável da cadeia pe- sada quanto da cadeia leve de um fragmento de anticorpo não humano obti- da por técnicas de apresentação em fago descritas aqui é substituída por um repertório de genes do domínio V humano, criando uma população de qui- meras de scFv ou Fab de cadeia não humana/cadeia humana, em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação ao antígeno destruído pela remo- ção da cadeia não humana correspondente no clone primário de apresenta- ção em fago, isto é, o epitopo governa (imprime) a escolha da cadeia huma- na correlacionada. Quando o processo é repetido a fim de substituir a cadeia não humana remanescente, um anticorpo humano é obtido (vide PCT WO 93/06213 publicado em 1 de abril de 1993), Diferente da humanização tradi- cional de anticorpos não humanos pelo enxerto de CDR, essa técnica forne- ce anticorpos completamente humanos, que não tem resíduos de FR ou CDR de origem não humana.

7. Anticorpos Biespecíficos

Anticorpos biespecíficos também são fornecidos. Anticorpos bi- específicos são anticorpos monoclonais que tem especificidades de ligação por pelo menos dois antígenos diferentes. Em certas modalidades, anticor- pos biespecíficos são anticorpos humanos ou humanizados. Em certas mo- dalidades, uma das especificidades de ligação é por um polipeptídeo de inte- resse e a outra é por qualquer outro antígeno. Em certas modalidades, anti- corpos biespecíficos podem se ligar a dois epitopos diferentes de um poli- peptídeo de interesse. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam um polipeptí- deo de interesse, tal como um polipeptídeo de superfície celular. Esses anti- corpos possuem um braço de ligação de TAT226 e um braço que se liga a um agente citotóxico, tal como, por exemplo, saporina, antiinterferon-α, alca- lóide da vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno de isótopo radioa- tivo. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de extensão completa ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos bi- específicos F(ab')2).

Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecí- ficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas tem especificidades diferentes (Milstein & Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Devido à seleção a- leatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas diferentes de anticorpo, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A puri- ficação da molécula correta, que geralmente é feita por etapas de cromato- grafia de afinidade, é um pouco trabalhosa e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos similares estão descritos em WO 93/08829 publicado em 13 de maio de 1993, e em Traunecker et al, EMBO J., 10: 3655 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combina- ção de anticorpo-antígeno) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão, por exemplo, é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos ptécnica das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. Em certas modalidades, a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) que contém o sítio necessário pa- ra ligação com a cadeia leve, está presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões da cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de ex- pressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mú- tuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando propor- ções desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção for- necem os rendimentos ótimos. É possível, entretanto, inserir as seqüências codificantes para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um ve- tor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de poli- peptídeo em proporções iguais resulta em altos rendimentos ou quando as proporções não são de significância particular.

Em uma modalidade dessa abordagem, os anticorpos biespecí- ficos são compostos de uma cadeia pesada híbrida de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par híbrido de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Foi descoberto que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de com- binações indesejáveis de cadeia de imunoglobulina, já que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica fornece um modo fácil de separação. Essa abordagem é descri- ta na WO 94/04690. Para maiores detalhes da geração de anticorpos bies- pecíficos vide, por exemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser manipulada para maximizar o percentual de heterodímeros que são recuperados da cultura de célula recombinante. A interface compreende pelo menos uma ptécnica do domínio Ch3 de um do- mínio constante de anticorpo. Nesse método, uma ou mais cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou tripto- fano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das cadeias laterais grandes são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo pela substituição das cadeias laterais grandes de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um me- canismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados tais como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos com ligação cruzada ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos, por exemplo, têm sido propostos para direcionar células do sistema imune para células indesejadas (Patente U.S. No. 4.676.980) e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/00373, e EP 03089). Anticorpos de hetero- conjugados podem ser feitos usando qualquer método de reticulação conve- niente. Agentes de reticulação adequados são bem-conhecidos na técnica e estão descritos na Patente U.S. No. 4.676.980, junto com uma série de téc- nicas de reticulação.

Técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento no qual anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de comple- xação de ditiol, arsenito de sódio para estabilizar ditióis vizinhos e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são en- tão convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é então reconvertido para Fab'-ditiol pela redução com mercap- toetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecífi- cos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seleti- va de enzimas.

Progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar an- ticorpos biespecíficos. Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) des- crevem a produção de uma molécula de anticorpo F(ab')2 biespecífica total- mente humanizada. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente por E. coli e submetido ao acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor de HER2 e células T normais humanas, assim como desencadear a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama ser humano.

Várias técnicas para fazer e isolar fragmentos de anticorpo bies- pecífico diretamente da cultura celular recombinante também foram descri- tas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al, J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptí- deos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão gênica. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e então re-oxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Esse método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia do "diacorpo" descrita por Hollinger et al, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico. Os fragmentos compreendem um do- mínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um Iigante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear com os domínios VH e VL complementares de outro fragmento, formando dessa maneira dois sítios de ligação ao antígeno. Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso de dímeros de Fv de cadeia única (scFv) também já foi relatada. Vide See Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt etaIJ. Immu- nol 147: 60 (1991).

8. Anticorpos Multivalentes

Anticorpos multivalentes também são fornecidos. Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticor- pos multivalentes (que não são da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressão recombinante de ácido nucléico que codifica as cadeias de polipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de liga- ção de antígeno. Em certas modalidades, o domínio de dimerização com- preende (ou consiste em) uma região Fc ou região de dobradiça. Nesse ce- nário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais sítios de liga- ção de antígeno amino-terminais à região Fe. Em certas modalidades, um anticorpo multivalente compreende (ou consiste em) três a cerca de oito sí- tios de ligação de antígeno. Em uma de tal modalidade, um anticorpo multi- valente compreende (ou consiste em) quatro sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, duas cadeias de polipeptídeo), em que a(s) cadeia(s) de poli- peptídeo compreende(m) dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo pode(m) compreender VD1(X1)n -VD2-(X2)n -Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia de polipeptídeo de uma região Fc, X1 e X2 repre- sentam um aminoácido ou polipeptídeo e η é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) ca- deia(s) de polipeptídeo pode(m) compreender VH-CH1 -Iigante flexível-VH- CHI- região Fc da cadeia; ou VH-CH1 -VH-CH1 - região Fc da cadeia. O anticorpo multivalente aqui contido pode ainda compreender pelo menos dois (por exemplo, quatro) polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve. O anticorpo multivalente aqui contido pode compreender, por exemplo, cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável da cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve contemplados aqui com- preendem um domínio variável de cadeia leve e opcionalmente ainda com- preendem um domínio CL.

9. Anticorpos de Domínio Único

Anticorpos de domínio único também são fornecidos. Um anti- corpo de domínio único é uma única cadeia de polipeptídeo que compreende todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada e todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas mo- dalidades, um anticorpo de domínio único é anticorpo de domínio único hu- mano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, Patente U.S. No. 6.248.516 B1). Em uma modalidade, um anticorpo de domínio único consiste em todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo.

10. Variantes de Anticorpo Em algumas modalidades, modificações da seqüência de ami- noácidos dos anticorpos aqui descritos são contempladas. Por exemplo, po- de ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de seqüência de aminoácidos do anticor- po podem ser preparadas pela introdução das alterações apropriadas na seqüência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou subs- tituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita pa- ra se chegar ao constructo final, desde que o constructo final possua as ca- racterísticas desejadas. As alterações de aminoácidos podem ser introduzi- das na seqüência de aminoácidos do anticorpo em questão no momento em que a seqüência é feita.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são as localizações preferidas para mutagênese é chama- do de "mutagênese por rastreamento de alanina" como descrito por Cunnin- gham & Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negati- vamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para afetar a inte- ração dos aminoácidos com o antígeno. Aquelas localizações de aminoáci- dos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refi- nadas pela introdução de variantes adicionais ou outras variantes em, ou para, os sítios de substituição. Assim, enquanto o sítio para introdução de uma variação de seqüência de aminoácido é predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, a mutagênese por ras- treamento de ala ou aleatória é conduzida na região ou códon alvo e as imu- noglobulinas expressas são rastreadas quanto à atividade desejada.

As inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões nas terminações amino e/ou carboxila que variam em extensão de um resíduo até polipeptídeos que contém uma centena ou mais resíduos, assim como inserções intra-seqüência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionil N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula do anticorpo incluem a fusão a terminação N ou C do anticorpo a uma enzima (por exem- plo, ADEPT) ou a um polipeptídeo que aumente a meia-vida sérica do anti- corpo.

Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão na qual o anticorpo é glicosilado. Gli- cosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigada quanto O-ligada. N- Iigada refere-se ao acoplamento de uma porção de carboidrato à cadeia late- ral de um resíduo de asparagina. As seqüências tripeptídicas de asparagina- X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto pro- • lina, são as seqüências de reconhecimento para o acoplamento enzimático da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. A glicosilação O-Iigada refere-se ao acoplamento de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidrixiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.

Adição ou deleção de sítios de glicosilação ao anticorpo é con- venientemente obtida pela alteração da seqüência de aminoácidos tal que uma ou mais das seqüências tripeptídicas acima descritas (para sítios de glicosilação N-ligados) é criada ou removida. A alteração também pode ser feita pela adição, deleção ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O- ligados).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc1 o carboidrato a- coplado a ele pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato madura que não tem fucose acoplada a uma região Fc do anticorpo são descritos no Pedido de Pat U.S. No 2003/0157108 (Presta, L.). Vide também, U.S. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Anticor- pos com uma N-acetilglicosamina (GIcNAc) de bipartição (bisecting) no car- boidrato acoplado a uma região Fc do anticorpo são referidos na WO 2003/011878, Jean-Mairet et ale Patente U.S. No. 6.602.684, Umana et ai. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactosé no oligossacarídeo acoplado a uma região Fc do anticorpo são relatados em WO 1997/30087, Patel etal. Vide também WO 1998/58964 (Râju, S.) e WO 1999/22764 (Ra- ju, S.) com relação a anticorpos.com carboidrato alterado acoplado à região Fc desses. Vide também, U.S. 2005/0123546 (Umana et ai) sobre molécu- las de ligação ao antígeno com glicosilação modificada.

Em certas modalidades, uma variante de glicosilação compreen- de uma região Fe, na qual uma estrutura de carboidrato acoplada à região Fc não tem fucose. Tais variantes têm função de ADCC melhorada. Opcio- nalmente, a região Fc ainda compreende uma ou mais substituições de ami- noácidos nela que melhoram ainda mais a ADCC, por exemplo, substitui- ções nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração Eu de resí- duos). Exemplos de publicações relacionadas a anticorpos "defucosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: U.S. 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; U.S. 2003/0115614; U.S. 2002/0164328; U.S. 2004/0093621; U.S. 2004/0132140; U.S. 2004/0110704; U.S. 2004/0110282; U.S. 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; Okazaki et ai J. Mol Biol. 336: 1239- 1249 (2004); Yamane-Ohnuki etal. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exem- pios de linhagens celulares que produzem anticorpos defucosilados incluem células CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteína Ripka et ai Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Pat U.S. No U.S. 2003/0157108 Α1, Presta, L; e WO 2004/056312 Al, Adams et aí, especial- mente no Exemplo 11), e linhagens celulares "knockout", tais como o gene de alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO "knockout" (Yamane- Ohnuki ef a/Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Outro tipo de variante é uma variante por substituição de amino- ácido. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molé- cula do anticorpo substituído por um resíduo diferente. Sítios de interesse para mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR também são contempladas. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 6 acima sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em uma alteração desejável na atividade bio- lógica, então alterações mais substanciais, denominadas "substituições e- xemplares" na Tabela 6, ou como ainda descrito acima em relação a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os anticorpos resultantes rastrea- dos quanto às propriedades de ligação desejadas.

Um tipo de variante de substituição envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exem- plo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) re- sultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) as propri- edades biológicas modificadas (por exemplo, melhoradas) em relação ao anticorpo parental a partir do qual ela(s) é(são) gerada(s). Uma maneira conveniente para gerar tais variantes de substituição envolve a maturação por afinidade usando apresentação em fago. Resumidamente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar to- das as substituições de aminoácidos possíveis em cada sítio. Os anticorpos assim gerados são apresentados a partir de partículas de fago filamentoso como fusões a pelo menos ptécnica de uma proteína de revestimento do fago (por exemplo, produto do gene III de M13) empacotados dentro de cada partícula. As variantes apresentadas em fagos são então rastreadas quanto as suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação). A fim de identificar sítios candidatos de região hipervariável para modificação, a mu- tagênese por rastreamento (por exemplo, rastreamento de alanina) pode ser realizada para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para ligação ao antígeno. Alternativamente, ou adicional- mente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antí- geno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antí- geno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas conhecidas, incluindo aquelas elabo- radas aqui. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido ao rastreamento usando técnicas conhecidas, incluindo aquelas descritas aqui, e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Moléculas de ácido nucléico que codificam variantes de seqüên- cia de aminoácidos do anticorpo são preparados por uma variedade de mé- todos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não são limitados ao isolamento a partir de fonte natural (no caso de variantes de seqüência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por mutagênese medi- ada por oligonucleotídeo (ou direcionada ao sítio), mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou de uma versão não variante do anticorpo.

Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de ami- noácido em uma região Fc de anticorpos da invenção, gerando dessa forma uma variante da região Fe. A variante da região Fc pode compreender uma seqüência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos que incluem aquela de uma cisteína da dobradiça.

De acordo com essa descrição e os ensinamentos da técnica, é contemplado que em algumas modalidades, um anticorpo da invenção pode compreender uma ou mais alterações quando comparado com o anticorpo equivalente selvagem, por exemplo, na região Fc. Esses anticorpos, contu- do, reteriam substancialmente as mesmas características necessárias para a utilidade terapêutica quando comparados com os seus anticorpos equivalen- tes selvagens. Por exemplo, acredita-se que certas alterações podem ser feitas na região Fc que resultariam em ligação a C1q e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC) alteradas (isto é, tanto melhoradas quanto diminuídas), por exemplo como descrito em W099/51642. Vide tam- bém Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); Patente U.S. No. 5.648.260; Patente U.S No. 5.624.821; e W094/29351 com relação a outros exemplos de variantes de região Fc. W000/42072 (Presta) e WO 2004/056312 (Lowman) descrevem variantes de anticorpo com ligação me- lhorada ou diminuída a FcRs. O conteúdo dessas publicações de patentes está especificamente incorporado aqui por referência. Vide também Shields et al. J. Bioi Chem. 9(2): 6591- 6604 (2001). Anticorpos com meias-vidas aumentadas e ligação melhorada ao receptor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et ai, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et ai, J. Immunol. 24:249 (1994)), são des- critos em US2005/0014934A1 (Hinton et ai). Esses anticorpos compreen- dem uma região Fc com uma ou mais substituições nele que melhoram a ligação da região Fc a FcRn. Variantes de polipeptídeo com seqüências de aminoácidos de região Fc alteradas e capacidade de ligação a C1q aumen- tada ou diminuída estão descritos na Patente U.S. No. 6.194.551 B1, WO99/51642. Os conteúdos dessas publicações de patentes estão especifi- camente incorporados aqui por referência. Vide também Idusogie et ai J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos que compreen- dem modificações na interface de polipeptídeos de Fc que compreendem a região Fc, em que as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimeri- zação. Essas modificações compreendem a introdução de uma protuberân- cia dentro de um primeiro polipeptídeo de Fc e uma cavidade em um segun- do polipeptídeo de Fc, em que a protuberância é posicionável na cavidade a fim de promover a formação de complexo do primeiro e segundo polipeptí- deos de Fe. Métodos de gerar anticorpos com essas modificações são co- nhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na Pat. U.S. No. 5.731.168.

11. Derivados de Anticorpo

Anticorpos podem ainda ser modificados para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e facilmente dis- poníveis. Preferivelmente as porções adequadas para derivatização do anti- corpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de políme- ros solúveis em água incluem, mas não são limitados a polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6- trioxano, copolímero de etileno/anidrido maléico, poliaminoácidos (tanto ho- mopolímeros quanto copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirroli- dona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de oxido de proliprópileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas desses. Propionaldeido de polietileno glicol pode ter vantagens na produção devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e se mais do que um polímero estiver acoplado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para deri- vatização pode ser determinado com base em considerações que incluem, mas não se limitam às propriedades ou funções particulares do anticorpo a ser melhorado, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

Em outra modalidade, conjugados de um anticorpo e uma por- ção não-proteinácea que podem ser seletivamente aquecidos por exposição à radiação são fornecidos. Em uma modalidade, a porção não-proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. 102: 11600- 11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e in- clui, mas não se limita a comprimentos de onda que não danificam células comuns, mas que aquecem a porção não-proteinácea a uma temperatura na qual as células próximas ao anticorpo-porção não-proteinácea são mortas.

Em certas modalidades, um anticorpo pode ser marcado e/ou pode ser imobilizado sobre um suporte sólido. Em um aspecto adicional, um anticorpo é um anticorpo antiidiotípico. 12. Anticorpos Heteroconjugados

Anticorpos heteroconjugados também são fornecidos. Anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos unidos covalentemen- te. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para atingir células do sis- tema imune quanto a células indesejadas [Patente U.S. No. 4.676.980] e para tratamento de infecção por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. É contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro u- sando métodos conhecidos em química de proteína sintética, incluindo aque- les que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando uma reação de troca de dissulfeto ou pela formação de ligação de tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esse propósi- to incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 4.676.980.

13. Anticorpos Citotóxicos

Anticorpos citotóxicos também são fornecidos. Em certas moda- lidades, um anticorpo citotóxico é um anticorpo anti-IL-22, tal como aqueles fornecidos abaixo, que afeta uma função efetora e/ou induz morte celular. Em certas modalidades, um anticorpo citotóxico anti-IL-22R se liga ao domí- nio extracelular de um IL-22R.

14. Manipulação de Função Efetora

Pode ser desejável modificar um anticorpo com relação à função efetora, a fim de intensificar, por exemplo, a eficácia de um anticorpo no tra- tamento de uma doença tal como câncer. Por exemplo, resíduo(s) de cisteí- na pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, permitindo dessa maneira a for- mação de ligação de dissulfeto intercadeia nessa região. O anticorpo homo- dimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização aumentada e/ou morte celular mediada por complemento e citotoxicidade celular depen- dente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Vide, por exemplo, Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) e Shopes, J. Immunol.. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral intensificada também podem ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais co- mo descrito em Wolff et al. Câncer Research, 53: 2560-2565 (1993). Alterna- tivamente, um anticorpo pode ser manipulado para ter regiões Fc duplas e pode ter dessa maneira Iise de complemento e capacidades ADCC intensifi- cadas. Vide Stevenson et al., Anti-Cancer Drua Desian. 3: 219-230 (1989).

15. Vetores, Células Hospedeiras e Métodos Recombi- nantes

Para a produção recombinante de um anticorpo, em uma moda- lidade, o ácido nucléico que o codifica é isolado e inserido em um vetor repli- cável, para clonagem posterior (amplificação do DNA) ou para expressão. DNA que codifica o anticorpo é prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonu- cleotídeo que são capazes de se ligar especificamente a genes que codifi- cam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Vários vetores estão disponí- veis. A escolha do vetor depende em ptécnica da célula hospedeira a ser usada. Geralmente células hospedeiras são tanto de origem procariótica quanto eucariótica (geralmente de mamíferos). Será apreciado que regiões constantes de qualquer isotipo podem ser usadas para esse propósito, inclu- indo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE e que tais regiões cons- tantes podem ser obtidas a partir de qualquer humano ou espécie animal.

a) Geração de anticorpos usando células hospedeiras pro- carióticas:

(1) Construção de Vetor

Seqüências de polinucleotídeos que codificam componentes po- lipeptídicos de um anticorpo podem ser obtidas usando técnicas recombi- nantes padrão. As seqüências de polinucleotídeos desejadas podem ser iso- ladas e seqüenciadas a partir de células produtoras de anticorpo tais como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sinteti- zados usando um sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as seqüências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólo- gos em hospedeiros procarióticos. Vários vetores que estão disponíveis e conhecidos na técnica podem ser usados para esse propósito da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucléicos a ser inseridos no vetor e da célula hospedei- ra particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários com- ponentes, dependendo de sua função (amplificação ou expressão de polinu- cleotídeos heterólogos, ou ambas) e de sua compatibilidade com a célula hospedeira particular na qual ele reside. Os componentes do vetor geral- mente incluem, mas não se limitam a uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação ao ribossomo (RBS), uma seqüência de sinal, o inserto de ácido nucléico heterólogo e uma se- qüência de terminação da transcrição.

Em geral, vetores de plasmídeo contendo replicon e seqüências de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospe- deira podem ser usados em relação a esses hospedeiros. O vetor geralmen- te carrega um sítio de replicação, assim como seqüências marcadoras que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformada usando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. pBR322 contém genes que codificam a resistência a ampicilina (Amp) e tetraciclína (Tet) e assim fornece meios fá- ceis para identificação de células transformadas. pBR322, seus derivados e outros plasmídeos microbianos ou bacteriófagos também podem conter, ou ser modificados para conter, promotores que podem ser usados pelo orga- nismo microbiano para expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 usados para expressão de anticorpos particulares es- tão descritos em detalhes em Ctécnicar e tal, Patente U.S. No. 5.648.237.

Além disso, vetores de fago contendo replicon e seqüências de controle que são compatíveis com o microrganismo hospedeiro podem ser usados como vetores transformantes em relação a esses hospedeiros. Por exemplo, bacteriófago tal com AGEM.TM.-11 pode ser utilizado na produção de um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hos- pedeiras suscetíveis tal como E. coli LE392.

Um vetor de expressão da invenção pode compreender dois ou mais pares de promotor-cistron, codificando cada um dos componentes do polipeptídeo. Um promotor é uma seqüência regulatória não traduzida Iocali- zada à montante (5') de um cístron que modula sua expressão. Promotores procarióticos são classificados tipicamente em duas classes, induzíveis e constitutivos. Promotor induzível é um promotor que inicia níveis aumenta- dos de transcrição do cístron sob seu controle em resposta a alterações da condição da cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma alteração na temperatura.

Um grande número de promotores reconhecidos por uma varie- dade de potenciais células hospedeiras é bem-conhecido. O promotor sele- cionado pode ser operativamente ligado ao DNA cistrônico que codifica a cadeia leve ou pesada pela remoção do promotor do DNA fonte através de digestão com enzima de restrição e inserção da seqüência do promotor iso- lada no vetor da invenção. Tanto a seqüência nativa do promotor como vá- rios promotores heterólogos podem ser usados para direcionar a amplifica- ção e/ou expressão dos genes alvo. Em algumas modalidades, promotores heterólogos são usados já que eles geralmente permitem maior transcrição e rendimentos mais altos do gene alvo expresso quando comparados com o promotor do polipeptídeo alvo nativo.

Promotores adequados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor PhoA, sistemas de promotores de β-galactamase e Iac- tose, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos tal como o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores bacterianos e de fago conhecidos) também são adequados. Suas seqüências de nucleotídeos foram publica- das, permitindo assim que um versado na técnica os ligue operativamente a cístrons que codificam as cadeias alvo leve e pesada (Siebenlist etal. (1980) Cell 20: 269) usando Iigantes ou adaptadores para fornecer quaisquer sítios de restrição necessários.

Em um aspecto da invenção, cada cístron dentro do vetor re- combinante compreende um componente de seqüência de sinal de secreção que direciona a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a seqüência de sinal pode ser um componente do ve- tor ou ela pode ser uma ptécnica do DNA do polipeptídeo alvo que está inse- rido no vetor. A seqüência de sinal selecionada para o propósito dessa in- venção deve ser aquela que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam as seqüências de sinal nati- vas para os polipeptídeos heterólogos, a seqüência de sinal é substituída por uma seqüência de sinal procariótica selecionada do grupo que consiste em, por exemplo, fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp ou líderes de enterotoxina Il termoestável (STII), LamB, PhoE, PeIB1 OmpA e MBP. Em uma modalidade da invenção, as seqüências de sinal usadas em ambos os cístrons do siste- ma de expressão são seqüências de sinal de STII ou variantes dessas.

Em outro aspecto, a produção de imunoglobulinas de acordo com a invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto não requer a presença de seqüências de sinal de secreção dentro de cada cístron. Com relação a isso, as cadeias leve e pesada de imunoglobulina são expressas, enoveladas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas cepas hospedeiras (por exemplo, cepas de E. coli trxB) fornecem condições no citoplasma que são favoráveis a formação de ligações de dissulfeto, permitindo dessa maneira o enovelamento e a montagem apropriada de subunidades expressas de proteína. Proba & Pluckthun Gene, 159:203(1995).

Anticorpos da invenção também podem ser produzidos pelo uso de um sistema de expressão no qual a proporção quantitativa de componen- tes expressos de polipeptídeo pode ser modulada a fim de maximizar o ren- dimento de anticorpos secretados e apropriadamente enovelados da inven- ção. Tal modulação é obtida, pelo menos em ptécnica, por modular simulta- neamente as forças traducionais para os componentes do polipeptídeo.

Uma técnica para modular força traducional é descrita em Sim- mons et ai, Pat. U.S. No. 5.840.523. Ela utiliza variantes da região de inicia- ção da tradução (TIR) dentro de um cístron. Para uma dada TlR, uma série de variantes de seqüência de aminoácidos ou de ácido nucléico pode ser criada com uma faixa de forças de tradução, fornecendo dessa maneira um meio conveniente pelo qual esse fator é ajustado para o nível de expressão desejado da cadeia específica. Variantes de TIR podem ser geradas por técnicas de mutagênese convencionais que resultam em alterações de có- don que podem alterar a seqüência de aminoácidos. Em certas modalida- des, alterações na seqüência de nucleotídeos são silenciosas. Alterações na TIR podem incluir, por exemplo, alterações no número ou espaçamento de seqüências de Shine-Dalgarno1 junto com alterações na seqüência de sinal. Um método para gerar seqüências de sinal mutantes é a geração de um "banco de códon" no início de uma seqüência codificante que não altera a seqüência de aminoácidos da seqüência de sinal (isto é, as alterações são silenciosas). Isso pode ser obtido pela alteração da posição do terceiro nu- cleotídeo de cada códon; além disso, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina e arginina, tem primeira e segunda posições múltiplas que podem a- dicionar complexidade na criação do banco. Esse método de mutagênese está descrito em detalhes em Yansura et al. (1992) METHODS: A Compani- on to Methods in Enzymol. 4: 151 -158.

Em uma modalidade, é gerado um grupo de vetores com uma variação de forças de TIR para cada cístron neles. Esse grupo limitado for- nece uma comparação de níveis de expressão de cada cadeia assim como o rendimento dos produtos de anticorpo desejados sob várias combinações de força de TIR. Forças de TIR podem ser determinadas pela quantificação do nível de expressão de um gene repórter como descrito em detalhes em Simmons etal., Pat. U.S. No. 5.840.523. Com base na comparação de força de tradução, as TIRs individuais desejadas são selecionadas para serem combinadas nos constructos de vetor de expressão da invenção.

Células hospedeiras procarióticas adequadas para expressar os anticorpos da invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria1 tais como or- ganismos Gram-negativos e Gram-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), Bacilos (por exemplo, B. subtilis), Enterobactérias, espécies de Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobial Vitreoscilla, ou Paracoccus. Em uma modalidade, são usadas cé- lulas gram-negativas. Em uma modalidade, são usadas células de E. coli como hospedeiras da invenção. Exemplos de cepas de E. coli incluem a ce- pa W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; No. de De- pósito ATCC. 27.325) e derivados dessa, incluindo a cepa 33D3 que tem o genótipo W3110 ∆fhuA (∆tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ∆ompT∆(nmpc-fepE) degP41 kanR (Pat. U.S. No. 5.639.635). Outras cepas e derivados dessas, tais como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli Β, E. coliA 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308(ATCC 31.608) também são adequadas. Esses exemplos são mais ilustrativos do que limitantes. Métodos para construção de deriva- dos de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que têm genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Bass et ai, Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar as bac- térias apropriadas levando em consideração a replicabilidade do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies de E. coli, Serratia ou Sal- monella podem ser adequadamente usadas como hospedeiro quando plas- mídeos bem-conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são usados para fornecer o replicon. Tipicamente a célula hospedei- ra deveria secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas e inibido- res de protease adicionais podem ser desejavelmente incorporados na cultu- ra celular.

(2) Produção de Anticorpo

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de ex- pressão descritos acima e cultivadas em meio nutriente convencional como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar genes que codificam as seqüências desejadas.

Transformação significa introduzir DNA no hospedeiro procarióti- co tal que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossômi- co quanto por um integrante cromossômico. Dependendo da célula hospe- deira usada, a transformação é feita usando técnicas apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio é geralmente usado para células bacterianas que contêm barreiras substanciais na parede celular. Outro método de transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Outra técnica usada ainda é a eletroporação.

Células procarióticas usadas para produzir os polipeptídeos da invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e adequados para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequa- dos incluem caldo luria (LB) mais suplementos nutrientes necessários. Em algumas modalidades, o meio também contém um agente de seleção, esco- lhido com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletiva- mente o crescimento de células procarióticas que contêm o vetor de expres- são. Por exemplo, ampicilina é adicionada ao meio para o crescimento de células que expressam o gene de resistência à ampicilina.

Quaisquer suplementos necessários além de carbono, nitrogênio e fontes de fosfato inorgânico, podem ser também incluídos nas concentra- ções apropriadas sozinhos ou em mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e di- tiotreitol.

As células hospedeiras procarióticas são cultivadas em tempera- turas adequadas. Em certas modalidades, para o crescimento de E. coli, as temperaturas de cultura variam entre cerca de 20°C a cerca de 39°C; entre cerca de 25°C a cerca de 37°C; ou cerca de 30°C. O pH do meio pode ser qualquer pH variando entre cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principal- mente do organismo hospedeiro. Em certas modalidades, para E. coli, o pH está entre cerca de 6,8 a cerca de 7,4 ou cerca de 7,0.

Se um promotor induzível é usado no vetor de expressão da in- venção, a expressão de proteína é induzida sob condições adequadas para ativação do promotor. Em um aspecto da invenção, promotores PhoA são usados para controlar a transcrição dos polipeptídeos. Conseqüentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio com limi- tação de fosfato para indução. Em certas modalidades, o meio com limitação de fosfato é o meio C.R.A.P. (vide, por exemplo, Simmons et al, J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com o constructo de vetor empregado, como é conhecido na técnica.

Em uma modalidade, os polipeptídeos expressos da presente invenção são secretados e recuperados do periplasma das células hospedei- ras. A recuperação de proteína envolve tipicamente a ruptura do microrga- nismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicação ou lise. Uma vez que as células estão rompidas, restos celulares ou células inteiras podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem ser purificadas, por exemplo, por cromatografia de afinidade em resina. Altema- tivamente, as proteínas podem ser transportadas no meio de cultura e isola- das nele. As células podem ser removidas da cultura e o sobrenadante da cultura ser filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser ainda isolados e identifi- cados usando métodos comumente conhecidos na técnica tais como βίβλο- forese em gel de poliacrilamida (PAGE) e ensaio Western blot.

Em um aspecto da invenção, a produção de anticorpo é condu- zida em grande quantidade por um processo de fermentação. Vários proce- dimentos de fermentação "fed-batch" em grande escala estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. Fermentações em grande es- cala tem pelo menos 1000 litros de capacidade e em certas modalidades, cerca de 1000 a 100.000 litros de capacidade. Esses fermentadores usam impulsores de agitação para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (a fonte preferida de carbono/energia). Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em um fermentador que não tem mais do que 100 litros de capacidade volumétrica e pode variar de cerca de 1 litro a cerca de 100 litros.

Em um processo de fermentação, a indução de expressão de proteína é iniciada tipicamente após as células terem sido cultivadas sob condições adequadas até uma densidade desejada, por exemplo, uma OD550 de cerca de 180-220, em cujo estágio as células estão na fase esta- cionária precoce. Uma variedade de indutores pode ser usada, de acordo com o constructo de vetor empregado, como é conhecido na técnica e des- crito acima. As células podem ser cultivadas por períodos curtos antes da indução. As células são geralmente induzidas por cerca de 12-50 horas, em- bora períodos mais longos ou mais curtos de tempo de indução possam ser usados.

Para melhorar o rendimento da produção e a qualidade dos poli- peptídeos da invenção, várias condições de fermentação podem ser modifi- cadas. Por exemplo, para melhorar a montagem e enovelamento apropriado dos polipeptídeos de anticorpo secretados, vetores adicionais que superex- pressam proteínas chaperonas, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (uma peptidilprolil cis,trans-isomerase com atividade de chaperona) podem ser usados para co-transformar as células hospedeiras procarióticas. As proteínas chaperonas tem demonstrado facili- tar o enovelamento apropriado e a solubilidade de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et aí. (1999) J. Biol. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou et ai, Patente U.S. No. 6.083.715; Ge- orgiou et ai, Patente U.S. No. 6.027.888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie etal. (200I) Mol. Microbiol. 39:199-210.

Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente aquelas que são proteoliticamente sensíveis), certas cepas hospedeiras deficientes em enzimas proteolíticas podem ser usadas na pre- sente invenção. Por exemplo, cepas celulares hospedeiras podem ser modi- ficadas para efetuar mutações genéticas nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT, DegP1 Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e combinações dessas. Algumas cepas de E. co//'deficientes em protease são disponíveis e descritas em, por exemplo, Joly et ai (1998), supra; Georgiou et al., Patente U.S. No. 5.264.365; Georgiou etal., Patente U.S. No. 5.508.192; Hara et ai, Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

Em uma modalidade, cepas de E. coli deficientes em enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que superexpressam uma ou mais proteínas chaperonas são usadas como células hospedeiras no siste- ma de expressão da invenção.

(3) Purificação de Anticorpo

Em uma modalidade, um anticorpo aqui produzido é purificado para se obter preparações que são substancialmente homogêneas para en- saios e usos posteriores. Métodos de purificação de proteína padrão conhe- cidos na técnica podem ser empregados. Os seguintes procedimentos são exemplares de procedimentos de purificação adequados: fracionamento em colunas de imunoafinidade ou troca de íon, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em resina de troca de cátion tal co- mo DEAE, cromatofocalização, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de a- mônio e filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75.

Em um aspecto, Proteína A imobilizada sobre uma fase sólida é usada para purificação por imunoafinidade dos produtos de anticorpo da in- venção. Proteína A é um proteína de 41 kD da parede celular de Staphylo- coccus aureus que se liga com grande afinidade a região Fc de anticorpos. Lindmark et a/(1983) J Immunol. Meth. 62: 1-13= A fase sólida na qual a Pro- teína A está imobilizada pode ser uma coluna que compreende uma superfí- cie de vidro ou sílica ou uma coluna de vidro com poro controlado ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna é revestida com um reagente, tal como glicerol, para possivelmente prevenir a aderência de contaminantes não específicos.

Como a primeira etapa de purificação, uma preparação derivada da cultura celular como descrito acima pode ser aplicada sobre uma fase sólida com Proteína A imobilizada para possibilitar a ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida pode então ser lavada pa- ra remover contaminantes não especificamente ligados à fase sólida. Final- mente o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.

b) Geração de anticorpos usando células hospedeiras eu- carióticas:

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariótica geralmente inclui um ou mais dos seguintes componentes não limitantes: uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um ele- mento intensificador, um promotor e uma seqüência de terminação da trans- crição.

(1) Componente da seqüência de sinal

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucariótica geralmente contém uma seqüência de sinal ou outro polipeptídeo que tem um sítio de clivagem específico na terminação N da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A seqüência de sinal heteróloga selecionada pode ser aquela que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Em expressão em célula de mamífero, seqüências de sinal de mamífero assim como líderes secretórias virais, por exemplo, sinal dD de herpes simples, estão disponíveis. O DNA de tal região precursora é ligado na fase de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

(2) Origem de replicação

Geralmente, um componente de origem de replicação não é ne- cessário para vetores de expressão de mamíferos. Por exemplo, a origem de SV40 pode tipicamente ser usada apenas por que ela contém o promotor precoce.

(3) Componente de gene de seleção

Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência à antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, metotrexato ou tetraciclina, (b) com- plementem deficiências auxotróficas, onde relevante ou (c) suprem nutrien- tes críticos não disponíveis no meio complexo.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para parar o crescimento da célula hospedeira. Aquelas células que são transfor- madas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e assim sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido mi- cofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos são aqueles que possibilitam a identificação de células competentes para absorver o ácido nucléico do anticorpo, tais como DHFR, timidina quinase, metalotioneina-l e II, preferivelmente genes de metalotione- ína de primata, adenosina desaminase, ornitina decarboxilase, etc.

Por exemplo, em algumas modalidades, células transformadas com gene de seleção de DHFR são identificadas primeiro por cultivar todos os transformantes em um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira apropriada, quando DHFR selvagem é empregado, é a linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospe- deiras selvagens que contêm DHFR endógeno) transformadas ou co- transformadas com seqüências de DNA que codificam um anticorpo, a prote- ína DHFR selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Vide Patente U.S. No. 4.965.199.

(4) Componente promotor

Vetores de expressão e clonagem geralmente contêm um pro- motor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse (por exem- plo, um anticorpo). Seqüências promotoras são conhecidas para eucariotos. Por exemplo, virtualmente quase todos os genes eucarióticos têm uma regi- ão rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases à montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada 70-80 bases à montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos está uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda de poli-A na terminação 3' da seqüência codificante. Em certas modalidades, qualquer uma ou todas essas seqüências podem ser adequadamente inseridas nos vetores de expressão eucarióticos. A transcrição a partir de vetores em células hospedeiras de ma- mífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de vírus tais como o vírus de polioma, vírus da bouba aviária, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Simian Virus 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamífero, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira.

Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenien- temente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também con- tém a origem de replicação viral de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição de Hindlll E. Um sistema para expressar DNA em hospedeiros mamíferos usando o vírus do papiloma bovino como um vetor é descrito na Patente U.S. No. 4.419.446= Uma modificação desse sistema está descrita na Patente U.S. No. 4.601.978. Vide também, Reyes et al, Nature 297:598- 601 (1982), que descreve a expressão de c-DNA de interferon-β humano em células de camundongo sob o controle de um promotor de timidina quinase do vírus do herpes simples. Alternativamente, a repetição terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous pode ser usada como promotor.

(5) Componente do elemento intensificador

A transcrição de DNA que codifica um anticorpo dessa invenção por eucariotos superiores é geralmente aumentada pela inserção de uma seqüência intensificadora no vetor. Várias seqüências intensificadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumi- na, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, será usado um inten- sificador de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o intensifica- dor de SV40 sobre a porção final da origem de replicação (bp 100-270), in- tensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de po- lioma da porção final da origem de replicação e intensificadores de adenoví- rus. Vide também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) que descreve elementos intensificadores para ativação de promotores eucarióticos. O intensificador pode ser combinado no vetor na posição 5' ou 3' da seqüência que codifica o polipeptídeo do anticorpo, mas está geralmente localizado em um sítio 5' do promotor.

(6) Componente de terminação da transcrição

Vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióti- cas também podem conter seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumen- te disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não tra- duzida do mRNA que codifica o anticorpo. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Vide W094/11026 e o vetor de expressão descrito nele.

(7) Seleção e transformação de células hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de DNA em vetores aqui contidos incluem células eucarióticas superiores des- critas aqui, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrado em cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedi- mento de rotina. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 sub- clonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et ai, J. Gen Viroi 36:59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10);; células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et ai, Proc. Natl. Acad. Sci USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde da África (VERO-76, ATCC CRL- 1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamá- rio de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai, Annals N.Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e li- nhagem de hepatoma ser humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem acima descritos para produção de anticorpo e culti- vadas em meio nutriente convencional modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

(8) Cultivando as células hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo des- sa invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios co- mercialmente disponíveis tais como F10 Ham (Sigma), Meio Mínimo Essen- cial (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) são adequados para o cultivo de células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pat. U.S. Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente U.S. Re. 30.985 podem ser usados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidér- mico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióti- cos (tal como o fármaco GENTAMYCIN®), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa de micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quais- quer outros suplementos também podem ser incluídos nas concentrações apropriadas que deverão ser conhecidas por aqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similaress, são aque- las previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expres- são e serão claras para o técnico qualificado.

(9) Purificação de anticorpo Quando técnicas recombinantes são usadas, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente ou secretado diretamente no meio. Se o an- ticorpo é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os restos particulados, tanto das células hospedeiras quanto fragmentos lisados, po- dem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou uItrafiItração. Onde o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expres- são podem ser primeiramente concentrados usando um filtro de concentra- ção de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer das etapas anteriores para inibir a pro- teólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar o crescimento de con- taminantes adventícios.

A composição de anticorpo preparada a partir dessas células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia com hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia por afinidade, com a cromatogra- fia por afinidade sendo uma técnica conveniente. A adequabilidade de Prote- ína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e isotipo de qual- quer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. Proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Methods 62:1- 13 (1983)). Proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundon- go e para γ3 humana (Guss et ai, EMBO J. 5: 15671575 (1986)). A matriz a qual o Iigante de afinidade está acoplado pode ser agarose, mas outras ma- trizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro com poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que aqueles obti- dos com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Ou- tras técnicas para purificação de proteína tais como fracionamento sobre uma coluna de troca de íon, precipitação com etanol, HPLC de Fase Rever- sa, cromatografia em sílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE®, cromatografia sobre resina de troca de ânion ou cátion (tal como coluna de ácido poliaspártico), cromatofocalização, SDS-PAGE e precipitação com sul- fato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Após qualquer uma das etapas de purificação preliminares, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a purificação adicional, por exemplo, por cromatografia de intera- ção hidrofóbica em pH baixo usando um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferivelmente realiza com baixas concentrações de sal (por exemplo, entre cerca de 0-0,25 M de sal).

Em geral, várias metodologias para preparação de anticorpos para uso em pesquisa, teste e uso clínico estão bem-estabelecidas na técni- ca, compatíveis com as metodologias descritas acima e/ou como considera- do apropriado por aquele versado na técnica para um anticorpo partículas de interesses.

C. Imunoconjugados

Imunoconjugados ou "conjugados de anticorpo-fármaco" são úteis para liberação local de agentes citotóxicos no tratamento de câncer. Vide, por exemplo, Syrigos et al. (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz et al. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; Pat. U.S. No. 4.975.278. Imunoconjugados permitem a liberação direcionada de uma porção de fármaco para um tumor, enquanto que a administração sistêmica de agentes citotóxicos não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais assim como as células do tumor que se procura eliminar. Vide Baldwin et al. (Mar. 15, 1986) Lancet pp. 603-05; Thorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biologieal and Clinicai Applications (A. Pinchera et al., eds.) pp. 475- 506.

Em um aspecto, um imunoconjugado compreende um anticorpo que se liga a IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL22R, IL-20Ra, IL-20Rb, ou IL-10R2, tais como aqueles fornecidos aqui e um agente citotóxico, tal como um agen- te quimioterápico, um agente inibidor do crescimento, uma toxina (por exem- plo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, de planta ou animal ou fragmentos dessas) ou isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjuga- dos foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos dessas que podem ser usadas incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não-ligante de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomo- nas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de mode- cina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteí- nas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mito- gelina, restritocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjuga- dos. Exemplos incluem 212Bi, 1311,131In, 90Y1 e 186Re.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes de acoplamento a proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)propionato (SPDP)i iminotioiano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato dimetila de HCL), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidil), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p- diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolieno 2,6- diisocianato) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser prepara- da como descrito em Vitetta et al, Science. 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentacético (MX-DTPA) marcado com Carbono 14 é um exemplar de agente quelante para conjugação de ra- dionuclídeo com o anticorpo. Vide W094/11026.

Conjugados de um anticorpo e uma ou mais moléculas peque- nas de toxina, tais como caliqueamina, maitansinóides, tricoteno e CC1065 e os derivados dessas toxinas que tem atividade de toxina, também são con- templados aqui.

1. Maitansina e maitansinóides Em uma modalidade, um imunoconjugado compreende um anti- corpo conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinóide. Maitansinóides são inibidores mitóticos que atuam pela inibição da polimerização da tubuli- na. Maitansina foi isolada inicialmente de um arbusto do leste africano May- tenus serrata (Patente U.S. No. 3.896.111). Subseqüentemente, foi desco- berto que certos micróbios também produzem maitansinóides, tais como maitansinol e ésteres de C-3 maitansinol (Patente U.S. No. 4.151.042). Mai- tansinol sintético e derivados e análogos desse estão descritos, por exem- plo, nas Patentes U.S. Nos. 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608;

4.265.814 4.313.946 4.364.866 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533, cujas descrições estão expressamente incorporadas aqui por referência.

Em uma tentativa de melhorar seu índice terapêutico, maitansina e maitansinóides foram conjugados com anticorpos que se ligam a antígenos sobre a superfície de células do tumor. Imunoconjugados que contêm mai- tansinóides e seu uso terapêutico estão descritos, por exemplo, na Patente U.S. Nos. 5.208.020, 5.416.064 e na Patente Européia EP 0 425 235 B1, cujas descrições estão expressamente incorporadas aqui por referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imuno- conjugados que compreendem um maitansinóide designado DM1 ligado a um anticorpo monoclonal C242, dirigido contra câncer colorretal humano. O conjugado foi descoberto ser altamente citotóxico contra células de câncer de cólon cultivadas e mostrou atividade antitumor em um ensaio de cresci- mento tumoral in vivo. Chari etal., Câncer Research 52:127-131 (1992) des- creveram imunoconjugados nos quais um maitansinóide foi conjugado atra- vés de uma ligação de dissulfeto ao anticorpo A7 de murino que se liga a um antígeno sobre as linhagens celulares de câncer de cólon humano ou a outro anticorpo monoclonal TA.1 de murino que se liga ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado de TA.1-maitansinóide foi testada in vitro na li- nhagem celular de câncer de mama ser humano SK-BR-3, que expressa 3 χ 105 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de fármaco al- cançou um grau de citotoxicidade similar ao do fármaco maitansinóide livre, que poderia ser aumentado pelo aumento do número de moléculas de mai- tansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinóide mos- trou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.

Conjugados de anticorpo-maitansinóide são preparados pela ligação química de um anticorpo a uma molécula de maitansinóide sem di- minuir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da molécula de maitansinóide. Uma média de 3-4 moléculas de maitansinóide conjuga- das por molécula de anticorpo mostrou eficácia em intensificar a citotoxici- dade de células alvo sem afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora até uma molécula de toxina por anticorpo seja esperada intensificar a citotoxicidade contra o uso do anticorpo nu. Maitansinóides são bem-conhecidos na técnica e podem ser sintetizados usando técnicas co- nhecidas ou isolados de fontes naturais. Maitansinóides adequados estão descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.208.020 e em outras patentes e publicações não-patente referidas aqui acima. Maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tal como vários èsteres de maitansinol.

Existem vários grupos de ligação conhecidos na técnica para produção de conjugados de anticorpo-maitansinóide, por exemplo, aqueles descritos na Patente U.S. No. 5.208.020 ou EP 0 425 235 B1 e em Chari et al, Câncer Research 52:127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem gru- pos dissulfeto, grupos tioéter, grupos ácido- lábeis, grupos fotolábeis, grupos peptidase-lábeis ou grupos esterase-lábeis, como descrito nas patentes aci- ma identificadas; grupos dissulfeto e tioéter sendo preferidos.

Conjugados de anticorpo e maitansinóide podem ser feitos u- sando uma variedade de agentes de acoplamento a proteína bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato(SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) cicloexano-1-carboxilato, iminotiolana (IT), derivados bi- funcionais de imidoésteres (tais como dimetil adipimidato HCL), ésteres ati- vos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeí- do), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), de- rivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis- ativos (tais como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Certos agentes de acopla- mento, incluindo N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP) (Carlsson et ai, Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2- piridilti- o)pentanoato (SPP), fornecem uma ligação dissulfeto.

O Iigante pode estar acoplado à molécula de maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, uma ligação de éster pode sér formada pela reação de um grupo hidroxila usando técni- cas de acoplamento convencionais. A reação pode ocorrer na posição C-3 que tem um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila e na posição C-20 que tem um grupo hidroxila. Em uma modalidade preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou um análogo de maitansinol.

2. Auristatinas e dolastatinas

Em algumas modalidades, um imunoconjugado compreende um anticorpo conjugado a uma dolastatina ou análogo ou derivado peptídico de dolastatina, por exemplo, uma auristatina (Patente U.S. Nos. 5635483; 5780588). Dolastatinas e auristatinas mostraram interferir com a dinâmica de microtúbulo, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke etal(2001) Antimicrob. Aqents and Chemother. 45(12):3580-3584) e têm atividade anti- câncer(Pat. U.S. No. 5663149) e antifúngica Pettit et a/(1998) Antimicrob. Aaents Chemother. 42:2961-2965). A porção do fármaco dolastatina ou au- ristatina pode ser acoplada ao anticorpo através da terminação N (amino) ou terminação C (carboxila) da porção do fármaco peptídico moiety (WO 02/088172).

Modalidades exemplares de auristatina incluem as porções DE e DF do fármaco monometilauristatina ligadas a terminação N, descrito em "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands," Publi- cação de Pedido de Patente U.S. No. U.S. 2005-0238649 A1, cuja descrição está expressamente incorporada por referência em sua totalidade. Tipicamente, porções de fármaco baseadas em peptídeo podem ser preparadas pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de peptídeo. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (vide E. Schroder & K. Lübke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Press) que é bem-conhecido no campo de química de pep- tídeo. As porções do fármaco auristatina/dolastatina podem ser preparadas de acordo com os métodos de: U.S. 5635483; U.S. 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drua Desian 13:243-277: Pettit, G.R., et al. Svnthesis. 1996, 719-725; e Pet- tit et ali 1996) J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863. Vide também Doro- nina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; Publicação de Pedido de Paten- te U.S. No. 2005-0238649 A1, incorporado aqui por referência em sua totali- dade (descrevendo, por exemplo, Iigantes e métodos de preparação de com- postos de monometilvalina tais como MMAE e MMAF conjugados a Iigan- tes).

3. Caliqueamicina

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família caliquea- micina de antibióticos é capaz de produzir quebras no DNA fita-fita em con- centrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide patentes U.S. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas para Ameri- can Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que po- dem ser usados incluem, mas não são limitados a γ1', α2', α3', N-acetyl-γ1', PSAG e θ1' (Hinman et al., Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al., Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes U.S. antes men- cionadas para American Cyanamid). Outro fármaco antitumoral ao qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato. Tanto a caliquea- micina como QFA tem sítios de ação intracelulares e não cruzam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a absorção celular desses agentes atra- vés de internalização mediada por anticorpo intensifica consideravelmente seus efeitos citotóxicos.

4. Outros agentes citotóxicos

Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados a um anticorpo incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracil, a famí- lia de agentes conhecidos coletivamente como complexo LL-E33288 descrita nas Patentes U.S. 5.053.394, 5.770.710 assim como esperamicinas (Patente U.S. 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos dessas que po- dem ser usadas incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não- ligantes de toxina diftérica, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aerugi- nosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa- sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charan- tia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restritocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232 publicada em 28 de Outubro de 1993.

Em outro aspecto, um imunoconjugado pode compreender um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, um ribo- nuclease ou uma DNA endonuclease tal como desoxiribonuclease; DNase).

Para destruição seletiva de um tumor, um imunoconjugado pode compreender um anticorpo anthFGFR2 e um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de um anticorpos anti-FGFR2 radioconjugados. Exemplos incluem At211, I1311 Y90, Re 186, Sm153. Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é usado para diagnóstico, ele pode compreender um átomo ra- dioativo para estudos cintilográficos, por exemplo tc99m ou I131 ou um "spin label" para imagem de ressonância nuclear magnética (NMR) (também co- nhecida como imagem de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolí- nio, manganês e ferro.

Os marcadores radioativos ou outros podem ser incorporados no imunoconjugado de maneiras conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou sintetizado por síntese química de aminoácido usando precursores de aminoácidos adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tais como tc99m, I131, Re 186, Re 188 e In131 podem ser acoplados através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser acoplado através de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigra- phy" (Chatal,CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhes.

D. Antagonistas e agonistas

Antagonistas de IL-22 são fornecidos. Tais antagonistas abran- gem aqueles que agem diretamente sobre IL-22 (por exemplo, um anticorpo anti-IL-22) e aqueles que afetam indiretamente a atividade de IL-22 (por e- xemplo, um anticorpo anti-IL-22R). Tais antagonistas são úteis, por exemplo, para 1) tratar desordens inflamatórias e desordens autoimunes, e 2) modular sinalização de IL-23 ou IL-22. Em uma modalidade particular, uma composi- ção que compreende um antagonista de IL-22 ou IL-22R é útil para reduzir a quantidade de tecido psoriásico em um mamífero. Em outra modalidade par- ticular, uma composição que compreende um antagonista de IL-22 ou IL- 22R é útil para inibir parcialmente ou completamente a proliferação de célula tu moral.

Em um aspecto, um antagonista de IL-22 é um anticorpo anti- IL-22 ou um anticorpo anti-IL-22R. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-22 é um anticorpo bloqueador que bloqueia completamente ou parci- almente a interação de IL-22 com seu receptor. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-22R é um anticorpo bloqueador que bloqueia completamen- te ou parcialmente a interação de IL-22R com IL-22. Em certas modalidades, um anticorpo anti-IL-22R se liga ao domínio de ligação ao Iigante extracelu- lar de um IL-22R. Por exemplo, um anticorpo anti-IL-22R pode se ligar a um domínio de ligação ao Iigante extracelular de IL-22R humano, que é encon- trado em SEQ ID NO: 3 a partir de cerca dos aminoácidos 18- 228.

Em outro aspecto, um antagonista de IL-22 é um oligopeptídeo que se liga a IL-22 ou IL-22R. Em uma modalidade, um oligopeptídeo se liga ao domínio de ligação ao Iigante extracelular de IL-22R. Oligopeptídeos po- dem ser sintetizados quimicamente usando metodologia conhecida de sínte- se de oligopeptídeo ou podem ser preparados e purificados usando tecnolo- gia recombinante. Tais oligopeptídeos têm geralmente cerca de 5 aminoáci- dos de extensão, alternativamente pelo menos cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 aminoácidos de extensão. Tais oligo- peptídeos podem ser identificados sem experimentação excessiva usando técnicas bem-conhecidas. Com relação a isso, é observado que técnicas para rastrear bibliotecas de oligopeptídeos que são capazes de se ligar es- pecificamente a um alvo de polipeptídeo são bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente U. S. Nos. 5.556.762; 5.750.373; 4.708.871; 4.833.092; 5.223.409; 5.403.484; 5.571=689; 5.663.143; Publicações PCT Nos. WO 84/03506 e W084/03564; Geysen et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.. 81:3998-4002 (1984); Geysen et aL Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 178-182 (1985); Geysen et aí, in Svnthetic Peptides as Antiaens. 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et ai, J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistrv, 30: 10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. etal. i 1991), J. Mol. Biol, 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363, e Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668). Em certas modalida- des, um oligopeptídeo pode ser conjugado a um agente citotóxico.

Em ainda outro aspecto, um antagonista de IL-22 é uma molé- cula orgânica que se liga a IL-22 ou IL-22R, diferente de um oligopeptídeo ou anticorpo como descrito aqui. Uma molécula orgânica pode ser, por e- xemplo, uma molécula pequena. Em uma modalidade, uma molécula orgâni- ca se liga ao domínio extracelular de um IL-22R. Uma molécula orgânica que se liga a IL-22 ou IL-22R pode ser identificada e sintetizada quimicamente usando metodologia conhecida (vide, por exemplo, Publicações PCT Nos. WO00/00823 e WOOO/39585). Tais moléculas orgânicas tem geralmente menos do que cerca de 2000 dáltons de tamanho, alternativamente, menos do que cerca de 1500, 750, 500, 250 ou 200 dáltons de tamanho, em que tais moléculas orgânicas que são capazes de se ligar a IL-22 ou IL-22R po- dem ser identificadas sem experimentação excessiva usando técnicas bem- conhecidas. Com relação a isso, é observado que técnicas para rastrear bi- bliotecas de moléculas orgânicas por moléculas que são capazes de se ligar a um alvo de polipeptídeo são bem-conhecidas na técnica (vide, por exem- pio, Publicação PCT Nos. WO00/00823 e WOOO/39585). Em certas modali- dades, uma molécula orgânica pode ser conjugada a um agente citotóxico

Em outro aspecto ainda, um antagonista de IL-22 é um receptor de IL-22 solúvel, por exemplo, uma forma de IL-22R que não é ligada à membrana. Tais formas solúveis de IL-22R podem competir com IL-22R li- gado à membrana pela ligação a IL-22. Em certas modalidades, uma forma solúvel de IL-22R pode compreender todo ou uma porção de um domínio de ligação extracelular de IL-22R, por exemplo, todo ou uma porção de um do- mínio de ligação ao Iigante de um polipeptídeo que compreende os aminoá- cidos 18-228 de SEQ ID NO: 3. Em certas modalidades, uma forma solúvel de IL-22R não tem um domínio transmembrana. Por exemplo, uma forma solúvel de IL-22R pode não ter todo ou uma porção substancial do domínio transmembrana de cerca de dos aminoácidos 229-251 de SEQ ID NO: 3.

Um receptor solúvel, de ocorrência natural para IL-22 foi relata- do. Vide Dumoutier L. et ai, "Cloning and characterization of IL-22 binding protein, a natural antagonist of IL-10-related T cell-derived inducible factor/IL- 22," J. Immunol. 166:7090-7095 (2001); e Xu W. et ai, "A soluble class II cytokine receptor, IL-22RA2, is a naturally occurring IL-22 antagonist," Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 98:9511-9516 (2001). Este receptor é variavelmente designado "IL-22BP" ou "IL-22RA2" na técnica. A seqüência de um IL-22BP humano é mostrada na Figura 4. O termo "IL-22BP" ou "proteína de ligação de IL-22" como usado aqui refere-se a qualquer IL-22BP nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos tais como primatas (por exemplo, seres humanos e macacos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra maneira.

Em outro aspecto ainda, um antagonista de IL-22 é um ácido nucléico anti-sentido que diminui a expressão do gene de IL-22 ou IL-22R (isto é, que diminui a transcrição do gene de IL-22 ou IL-22R e/ou a tradução de mRNA de IL-22 ou IL-22R mRNA). Em certas modalidades, um ácido nu- cléico anti-sentido se liga a um ácido nucléico (DNA ou RNA) que codifica IL- 22 ou IL-22R. Em certas modalidades, um ácido nucléico anti-sentido é um oligonucleotídeo de cerca de 10-30 nucleotídeos de extensão (incluindo ιο- dos os pontos entre pontos finais). Em certas modalidades, um oligonucleo- tídeo anti-sentido compreende cadeia principal modificados por açúcar (ou outras ligações de açúcar como descrito em WO 91/06629), em que tais ca- deia principal modificados por açúcar são resistentes a nucleases endóge- nas. Em uma modalidade, um ácido nucléico anti-sentido é um oligodesoxir- ribonucleotídeo, que resulta na degradação e/ou transcrição ou tradução reduzida de mRNA que codifica IL-22 ou IL-22R. Em certas modalidades, um ácido nucléico anti-sentido é um RNA que reduz a expressão de um ácido nucléico alvo por "interferência de RNA" ("RNAi"). Para revisão de RNAi, vi- de, por exemplo, Novina et al. (2004) Nature 430: 161-164. Tais RNAs são derivados de, por exemplo, pequenos RNAs de interferência (siRNAs) e mi- croRNAs. siRNAs, por exemplo, podem ser sintetizados como oligorribonu- cleotídeos de fita fita de cerca de 18-26 nucleotídeos de extensão. Id.

Em outro aspecto ainda, agonistas de IL-22 são fornecidos. A- gonistas exemplares incluem, mas não são limitados a, IL-22 ou IL-22R nati- vos; fragmentos, variantes ou formas modificadas de IL-22 ou IL-22R que mantêm pelo menos uma atividade do polipeptídeo nativo; agentes que são capazes de se ligar e ativar IL-22R; e agentes que induzem a superexpres- são de IL-22 ou IL-22R ou ácidos nucleicos que codificam IL-22 ou IL-22R.

E. Formulações farmacêuticas

A invenção fornece formulações farmacêuticas. Em uma modali- dade, uma formulação farmacêutica compreende 1) um agente ativo, por exemplo, qualquer um dos polipeptídeos descritos acima, anticorpos, agonis- tas ou antagonistas, e 2) um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade adicional, uma formulação farmacêutica ainda compreende pelo menos um agente terapêutico adicional.

Formulações farmacêuticas são preparadas para armazena- mento por misturar um agente que tem o grau desejado de pureza com veí- culos, excipientes e estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington1S Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. [1980]), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipien- tes, ou estabilizadores aceitáveis são atóxicos para os receptores nas dosa- gens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenílico, butílico ou benzílico; alquil parabenos tal como metil ou propil para- beno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídios de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofíli- cos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou Usina; monosacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelan- tes tais como EDTA; açúcares tais como saçarose, manitol, trealose, ou sor- bitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio, complexos de metais (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais co- mo TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

Lipofecções ou Iipossomos também podem ser usados para li- berar um agente em uma célula. Onde o agente é um fragmento de anticor- po, o menor fragmento inibidor que se liga especificamente à proteína alvo é preferido. Por exemplo, com base das seqüências da região variável de um anticorpo, moléculas de peptídeos podem ser desenhadas, as quais retêm a habilidade se ligar a seqüência de proteína alvo. Tais peptídeos podem ser sintetizados quimicamente e/ou produzidos por tecnologia de DNA recombi- nante (vide, por exemplo, Marasco etal, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 7889- 7893 [1993]). Anticorpos descritos aqui também podem ser formulados como imunolipossomos. Lipossomos que contêm um anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82: 3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl Acad. Sei.

USA, 77: 4030 (1980); e Pat. U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com tempo de circulação aumentado são descritos na Patente U.S. No. 5.013.556. Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo méto- do de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídio que com- preende fosfatidileolina, colesterol, e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Os Iipossomos são extrusados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomos com o diâmetro desejado. Frag- mentos Fab' de um anticorpo da presente invenção podem ser conjugados a lipossomos como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem.. 257: 286-288 (1982) através de uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterá- pico (tal como doxorrubicina) é opcionalmente contido dentro do lipossomo. Vide Gabizon etal, J. National Câncer Inst.. 81(19): 1484 (1989).

Um agente também pode ser encerrado em microcápsulas pre- paradas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroe- mulsões. Tais técnicas são descritas em Remington1S Pharmaceutical Scien- ces 16§ edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação sustentada de um agente podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos conten- do o agente, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por e- xemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação susten- tada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli)2-hidroxietil- metacrilato), poli(vinilálcool), polilactídeos (Pat. U.S. No. 3.773.919), copolí- meros de ácido L-glutâmico e γ-etil-L-glutamato, acetato de vinil-etileno não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradável tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolide), e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico. Embora polímeros tais como acetato de vinil-etileno e ácido lático-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 di- as, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo tem- po, eles podem desnaturar ou se agregar como um resultado de exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda da atividade biológica em possí- veis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser deline- adas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser formação de ligação S-S intermolecular através de troca de tio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida por modificação de resíduos de sulfidrila, liofilização a partir de solu- ções ácidas, controle de conteúdo de umidade, uso de aditivos apropriados, e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas=

Uma formulação farmacêutica aqui contida pode também conter mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação parti- cular sendo tratada. Por exemplo, em um aspecto, uma formulação farma- cêutica que contém mais do que um composto ativo compreende 1) pelo menos um antagonista de IL-22, por exemplo, um anticorpo que se liga a IL- 22 e/ou um anticorpo que se liga a IL-22R, e 2) pelo menos um anticorpo que se liga a IL-19, IL-20, IL-24, IL20Ra, IL-20Rb, ou IL-10R2 (em que qual- quer quantidade dos anticorpos listados em 2) podem ser selecionados em qualquer combinação. Em outro aspecto, uma formulação farmacêutica con- tém dois ou mais compostos ativos que têm atividades complementares. Por exemplo, em uma modalidade, uma formulação farmacêutica pode compre- ender a) pelo menos um antagonista de IL-22, por exemplo, um anticorpo que se liga a IL-22 e/ou um anticorpo que se liga a IL-22R; e 2) um antago- nista de TNF-α ou IL-12. Ainda em outro aspecto, uma formulação farmacêu- tica que contém mais do que um composto ativo pode compreender um a- gente citotóxico ou agente inibidor de crescimento. F. Métodos de tratamento

Métodos terapêuticos que usam qualquer uma das composições ou formulações farmacêuticas acima são fornecidos. Tais métodos incluem métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo, a menos que indicado de ou- tra maneira. Em vários aspectos, métodos de estimular ou inibir uma via de sinalização mediada por IL-23 são fornecidos. Métodos de estimular ou inibir uma função de célula ThIL-17 são fornecidos. Métodos de tratar desordens inflamatórias e/ou autoimunes também são fornecidos. Métodos de tratar desordens associadas com a sinalização de IL-23 ou IL-22 são ainda forne- cidos. Métodos de tratar desordens mediadas por ThIL-i7 também são forne- cidos. Esses e outros aspectos da invenção são fornecidos abaixo.

Em um aspecto, é fornecido um método de estimular uma via de sinalização mediada por IL-23 em um sistema biológico, o método com- preendendo fornecer um agonista de IL-22 ao sistema biológico. Sistemas biológicos incluem, por exemplo, células de mamífero em um sistema de cultura de célula in vitro ou em um organismo in vivo. Sistemas biológicos exemplares que são modelos de psoríase são fornecidos nos Exemplos e incluem epiderme humana reconstituída (RHE) (Exemplo 14) ou modelos animais (Exemplo 16). Em uma modalidade, um agonista de IL-22 é IL-22. Em outro aspecto, é fornecido um método de inibir uma via de sinalização mediada por IL-23 em um sistema biológico, o método compreendendo for- necer um antagonista de IL-22 ao sistema biológico. Em uma modalidade o antagonista de IL-22 é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-IL-22 neutralizante e/ou um anticorpo anti-IL-22R neutralizante.

Em outro aspecto, é fornecido um método de estimular uma função de célula ThIL-17, o método compreendendo expor uma célula ThIL-17a um agonista de IL-22. Em uma modalidade, um agonista de IL-22 é IL-22. Em outro aspecto, é fornecido um método de inibir uma função de célula ThIL-17, o método compreendendo expor uma célula ThIL-17 a uma antagonista de IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-IL-22 neutralizante e/ou um anticorpo anti-IL-22R neutralizante. Funções de célula ThIL-17 exemplares incluem, mas não são limitadas a, estimulação de imunidade mediada por célula (hipersensibilida- de do tipo tardio); recrutamento de células imunes inatas, tal como células mielóides (por exemplo, monócitos e neutrófilos) para locais de inflamação; e estimulação de infiltração de células inflamatórias em tecidos. Em uma mo- dalidade, uma função de célula Th|L-i7 é mediada por IL-23.

Ainda em outro aspecto, é fornecido um método de tratar infla- mação, o método compreendendo administrar a um mamífero que necessita de tal tratamento uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que compreende um antagonista de IL-22. Em uma modalidade, o antago- nista de IL-22 é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-IL-22 neutrali- zante e/ou um anticorpo anti-IL-22R neutralizante. Inflamação inclui, mas não é limitada a, inflamação autoimune (inflamação associada com uma de- sordem autoimune), inflamação crônica, inflamação de pele, inflamação artrí- tica (incluindo inflamação associada com artrite reumatóide), e resposta in- flamatória sistêmica. Em uma modalidade, a inflamação é mediada por IL- 23.

Ainda em outro aspecto, é fornecido um método de tratar uma desordem autoimune, o método compreendendo administrar a um mamífero que necessite de tal tratamento uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que compreende um antagonista de IL-22. Em uma modalida- de, o antagonista de IL-22 é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti- IL-22 neutralizante e/ou um anticorpo anti-IL-22R neutralizante. Desordens autoimunes incluem, mas não são limitadas a, doença de tecido conjuntivo, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, artrites inflamatórias (por exemplo, artrite reumatóide), inflamação pulmonar autoimune, síndrome de Guillain-Barre, tireoidite autoimune, diabetes melito dependente de insulina, uveíte, miastenia grave, doença enxerto-versus-hospedeiro, doença ocular inflamatória autoimune, psoríase, artrite associada com auto-imunidade (por exemplo, artrite reumatóide), inflamação autoimune do cérebro, a doença inflamatória do intestino. Em uma modalidade, a desordem autoimune é uma desordem autoimune mediada por IL-23.

Em um aspecto particular, métodos para o tratamento de psorí- ase e/ou desordens caracterizadas por sintomas psoriásicos são fornecidos. Psoríase é considerada uma doença autoimune nas quais células T do sis- tema imune reconhecem uma proteína na pele e atacam a área onde esta proteína é encontrada, causando crescimento muito rápido de novas células da pele, e lesões dolorosas, elevadas e escamosas. Essas lesões são ca- racterizadas por hiperproliferação de queratinócitos, e acúmulo de células T ativadas na epiderme das lesões psoriásicas. Embora a causa molecular inicial da doença seja desconhecida, ligações genéticas foram mapeadas a pelo menos 7 Ioci de susceptibilidade à psoríase (Psorl em 6p21.3, Psor2 em 17q, Psor3 em 4q, Psor4 em 1 cent-q21, Psor5 em 3q21, Psor6 em 19p13, e Psor7 em 1p). Alguns desses Ioci estão associados com outras doenças autoimunes/inflamatórias, incluindo artrite reumatóide, dermatite atópica, e doença inflamatória do intestino (IBD). Abordagens recentes para o tratamento de psoríase incluem a administração de antagonistas de IL-12 ou TNF-α. Vide, por exemplo, Nickoloff et al. (2004) J. Clin. Invest. 113: 1664-1675; Bowcock et al. (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:699-711; Kauffman et al. (2004) J. Invest. Dermatol. 123: 1037-1044. Os dados fornecidos aqui, entretanto, implicam uma via de sinalização de IL-23/IL-22 distinta na pato- gênese de psoríase. Conseqüentemente, terapêuticos que modulam essa via de sinalização podem fornecer uma alternativa ou podem complementar outras abordagens para o tratamento de psoríase.

Em uma modalidade, um método de tratar psoríase compreen- de administrar a um paciente uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que compreende um antagonista de II-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo anti-IL-22 neutralizante e/ou um anticorpo anti-IL-22R neutralizante. Em várias modali- dades, o método compreende ainda administrar (tanto na mesma formulação farmacêutica, como em uma formulação farmacêutica separada) pelo menos um agente terapêutico adicional. Em tal modalidade, o agente terapêutico adicional é pelo menos um antagonista de uma citocina selecionada a partir de IL-19, IL-20, e IL-24. Tais antagonistas incluem, mas não são limitados a, um anticorpo que se liga a IL-19, IL-20, IL-24, IL-20Ra, IL-20Rb, ou IL-10R2. Qualquer quantidade de tais anticorpos podem ser selecionados em qual que combinação. Em outra modalidade, o agente terapêutico adicional é um agente conhecido por ser eficaz no tratamento de psoríase. Certos de tais agentes terapêuticos são descritos, por exemplo, em Nickoloff etal. (2004) J. Clin. Invest. 113: 1664-1675; Bowcock et al. (2005) Nat. Rev. Immunol. 5:699-711; e Kauffman etal. (2004) J. Invest. DermatoL 123:1037-1044. Tais agentes incluem, mas não são limitados a agentes terapêuticos que atingem células T, por exemplo, efalizumab e/ou alefacept; um antagonista de IL-12, por exemplo, um anticorpo bloqueador que se liga a IL-12 ou ao seu recep- tor, e um antagonista de TNF-α, por exemplo, um anticorpo bloqueador que se liga a TNF-α ou ao seu receptor.

Ainda em outro aspecto, é fornecido um método de inibir a pro- gressão do tumor, o método compreendendo administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que compreende um antagonista de IL-22. Em uma modalidade, o antagonista de IL-22 é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo neutralizante anti-IL-22 e/ou um anti- corpo neutralizante anti-IL-22R. Em uma modalidade, a progressão do tumor é mediada por IL-23.

Composições da presente invenção (por exemplo, polipeptí- deos, anticorpos, agonistas e formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anteriores), são administradas a um mamífero, preferivel- mente um humano, de acordo com métodos conhecidos, tal como adminis- tração intravenosa como um bolo ou por infusão contínua por um período de tempo, pelas vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcu- tânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, ou por inalação (in- tranasal, intrapulmonar). Administração intravenosa ou por inalação de poli- peptídeos e anticorpos é preferida.

Em certas modalidades, administração de um agente anticâncer pode ser combinada com a administração de uma composição da presente invenção. Por exemplo, um paciente a ser tratado com uma composição da invenção também pode receber um agente anticâncer (agente quimioterápi- co) ou terapia com radiação. Esquemas de preparação e dosagem para tais agentes quimioterápicos também podem ser usados de acordo com as ins- truções do fabricante ou como determinado empiricamente pelo versado na técnica. Os esquemas de preparação e dosagem para tal quimioterapia tam- bém são descritos em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). O agente quimioterápico pode preceder ou suceder a administração da composição ou pode ser dado ao mesmo tempo que ela. Adicionalmente, um composto antiestrogênio, tal como tamoxifeno, ou um anti-progesterona tal como onapristona (vide, EP 616812) podem ser dados em dosagens conhecidas para tais moléculas.

Também pode ser desejável administrar anticorpos contra ou- tros antígenos associados a doenças imunes ou associados a tumor, tais como anticorpos que se ligam a CD20, CD11a, CD18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, ou fator éndotelial vascular (VEGF). Alternativamente, ou além disso, dois ou mais anticorpos que se ligam ao mesmo ou a dois ou mais antígenos diferentes descritos aqui também podem ser co-administrados ao paciente. Em certas modalidades, pode ser benéfico administrar também uma ou mais citocinas a um paciente. Em certas modalidades, uma composição da inven- ção é co-administrada com um agente inibidor de crescimento. Por exemplo, o agente inibidor de crescimento pode ser administrado antes, após, con- temporaneamente com a administração da composição. Dosagens adequa- das para o agente inibidor de crescimento são aquelas usadas atualmente e podem ser reduzidas devido a ação combinada (sinergia) do agente inibidor de crescimento e da composição.

Para o tratamento ou redução na severidade de uma doença imune, a dosagem apropriada de uma composição da invenção dependerá do tipo de doença a ser tratada, como definido acima, da severidade e do curso da doença, se o agente será administrado para fins profiláticos ou te- rapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente e da resposta ao composto, e da decisão do médico assistente. O composto é adminístra- do adequadamente ao paciente uma vez ou por uma série de tratamentos.

Por exemplo, dependendo do tipo e da severidade de uma do- ença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1-20 mg/kg) de um poli- peptídeo ou anticorpo é uma dosagem inicial candidata para administração a um paciente, quer, por exemplo, por uma ou mais administrações separa- das, quer por infusão contínua. Uma dosagem diária típica varia de cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima.

Para administrações repetidas, por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que uma supressão de sintomas da doença ocorra. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

G. Métodos de Diagnóstico e Métodos de Detecção

Em um aspecto, é fornecido um método de diagnosticar psoría- se em um mamífero, o método compreendendo detectar o nível de expres- são de um gene que codifica um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R em uma amostra de teste de células de tecido obtidas do mamífero, em que um nível de expressão maior na amostra de teste quando comparado a uma amostra controle (por exemplo, uma amostra de células de tecido normal conhecidas do mesmo tipo celular) indica a presença de psoríase no mamífero a partir do qual a amostra de teste foi obtida. A detecção pode ser quantitativa ou qualitativa. Em uma modalidade, a amostra de teste compreende sangue ou soro. Em uma modalidade, detectar o nível de expressão de um gene que 1 codifica um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R compreende (a) colocar um an- ticorpo anti-IL-22 ou anti-IL-22R em contato com uma amostra de teste obti- da do animal, e (b) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo e um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R na amostra de teste. O anticorpo pode estar ligado a um marcador detectável. Formação de complexo pode ser monitorada, por exemplo, por microscopia de luz, citometria de fluxo, fluori- metria, ou outros procedimentos conhecidos na técnica. A amostra de teste pode ser obtida de um indivíduo suspeito de ter psoríase.

Em uma modalidade, detectar o nível de expressão de um gene que codifica um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R compreende detectar o ní- vel de transcrição de mRNA do gene. Níveis de transcrição de mRNA podem ser detectados, tanto quantitativamente como qualitativamente, por vários métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Níveis de transcrição de RNAm também podem ser detectados diretamente ou indiretamente por de- tectar os níveis de cDNA gerados a partir do mRNA. Métodos exemplares para detectar níveis de transcrição de mRNA incluem, mas não são Iimita- dos, a RT-PCR quantitativo em tempo real, e ensaios baseados em hibridi- zação, incluindo ensaios baseados em microarranjos e ensaios baseados em filtros, tal como Northern blots.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um kit de diagnóstico que contém um anticorpo anti-IL-22 ou anti-IL-22R em uma em· balagem adequada. O kit contém preferivelmente instruções para usar o an- ticorpo para detectar um polipeptídio de IL-22 ou IL-22R. Em um aspecto, o kit de diagnóstico é um kit de diagnóstico para psoríase.

H. Ensaios

1. Ensaios a base de células e modelos animais

Ensaios a base de células e modelos animais para doenças i- munes são úteis na prática de certas modalidades da invenção. Certos en- saios a base de células fornecidos nos Exemplos abaixo são úteis, por e- xemplo, para testar a eficácia de antagonistas ou agonistas de IL-22.

Modelos animais in vivo também são úteis na prática de certas modalidades da invenção. Modelos animais exemplares também são descri- tos nos Exemplos abaixo. A natureza in vivo de tais modelos os torna predi- tivos de respostas em pacientes humanos. Modelos animais de doenças re- lacionadas à imunidade incluem tanto animais não- recombinantes como recombinantes (transgênicos). Modelos animais não recombinantes incluem, por exemplo, roedores, por exemplo, modelos murinos. Tais modelos podem ser gerados por introduzir células em camundongos singênicos usando téc- nicas padrão, por exemplo, injeção subcutânea, injeção pela veia da cauda, implante no baço, implante intraperitoneal, implante sob a cápsula renal, etc..

Modelos de doença de enxerto-versus-hospedeiro fornecem um meio de avaliar a reatividade de célula T contra antígenos de MHC e antíge- nos de transplante menos importantes. Doença enxerto-versus-hospedeiro ocorre quando células imunocompetentes são transplantadas em pacientes imunossuprimidos ou tolerantes. As células doadoras reconhecem e respon- dem a antígenos do hospedeiro. A resposta pode variar de inflamação seve- ra que põe em risco a vida a casos leves de diarréia e perda de peso, Um procedimento adequado para avaliar doença enxerto-verus-hospedeiro é descrito em Current Protocols in Immunology, acima, unidade 4.3.

Um modelo animal para rejeição de aloenxerto de pele é um meio de testar a habilidade de células T mediarem destruição de tecido in vivo e uma medida de seu papel em rejeição de transplante. Os modelos mais comuns e aceitos usam enxertos de pele de cauda de murino. Experi- mentos repetidos mostraram que rejeição de aloenxerto de pele é mediada por células T, células T auxiliares e células T efetoras de morte, em não an- ticorpos. Auchincloss, H. Jr. & Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2- ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992. Um procedimento a- dequado é descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, acima, unidade 4.4. Outros modelos de rejeição de transplante que podem ser usa- dos para testar os compostos da invenção são os modelos de transplante de coração alogeneico descritos por Tanabe, M. et al, Transplantation (1994) 58:23 e Tinubu, S. A. etal, J. Immunol. (1994) 4330-4338.

Hipersensibilidade de contato é um ensaio simples in vivo para função imune mediada por célula (hipersensibilidade do tipo tardio). Nesse procedimento, a exposição cutânea a haptenos exógenos que dão origem a uma reação de hipersensibilidade do tipo tardio que é medida e quantificada. A sensibilidade de contato envolve uma fase de sensibilização inicial seguida por uma fase de indução. A fase de indução ocorre quando os linfócitos T encontram um antígeno ao qual eles tiveram contato anterior. Ocorrem in- chaço e inflamação, tornando esse um excelente modelo de dermatite de contato alérgica humana. Um procedimento adequado é descrito em detalhe em Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek1 D. H. Margulies, Ε. M. Shevach & W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unidade 4.2. Vide também Grabbe, S. & Schwarz, T, lmmun. Today 19 (1): 37-44(1998). Adicionalmente, as composições da invenção podem ser testa- das em modelos animais para doenças semelhantes a psoríase. Por exem- plo, composições da invenção podem ser testadas no modelo de camun- dongo scid/scid descrito por Schon, Μ. P. et al, Nat. Med. (1997) 3: 183, no qual os camundongos demonstram lesões de pele histopatológicas que lem- bram psoríase. Outro modelo adequado é o modelo de quimeras de camun- dongo scid/pele humana preparado como descrito por Nickoloff, B. J. et al, Am. J. Path. (1995) 146:580. Outro modelo adequado é descrito por Boyman et ai, J Exp Med. (2004) 199(5):731-6, no qual pele pré-psoriásica humana é enxertada em camundongos AGR129, levando ao desenvolvimento de le- sões de pele psoriásicas.

Animais "knockout" podem ser construídos, os quais têm um gene defeituoso ou alterado que codifica um polipeptídeo identificado aqui, como um resultado de recombinação homóloga entre o gene endógeno que codifica o polipeptídio e uma molécula de DNA na qual o gene tenha sido alterado. Por exemplo, cDNA que codifica um polipeptídeo particular pode ser usado para clonar DNA genômico que codifica aquele polipeptídeo de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do DNA genômico que co- difica um polipeptídeo particular pode ser deletada ou substituída por outro gene, tal como um gene que codifica um marcador selecionável que pode ser usado para monitorar a integração. Tipicamente, vários quilobases de DNA flanqueador inalterado (tanto nas extremidades 5' como 3') estão inclu- ídos no vetor [vide, por exemplo, Thomas & Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para uma descrição de vetores de recombinação homóloga. O vetor é intro- duzido em uma linhagem de célula tronco embrionária (por exemplo, por ele- troporação) e as células nas quais o DNA introduzido tenha recombinado homologamente com o DNA endógeno são selecionadas [vide, por exemplo, Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. As células selecionadas são então injetadas em um blastocisto de um animal (por exemplo, um camundongo ou rato) pa- ra formar quimeras de agregação [vide, por exemplo, Bradley, em Teratocar- einomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approaeh, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Um embrião quimérico pode então ser implantado em um animal fêmea adotiva pseudográvida adequado e o em- brião trazido a termo para criar um animal "knockout". Progênie que carrega o DNA homologamente recombinado nas suas células germinativas pode ser identificada por técnicas padrão e usada para gerar animais nos quais todas as células do animal contenham o DNA homologamente recombinado. Ani- mais "knockout" podem ser caracterizados por exemplo, por sua habilidade de preservar certas condições patológicas e pelo seu desenvolvimento de condições patológicas devido a ausência do polipeptídeo.

2. Ensaios de Rastreamento por Candidatos a Fárma- cos.

Ensaios de rastreamento por candidatos a fármacos são dese- nhados para identificar compostos que se ligam ou formam complexo com um polipeptídeo identificado aqui ou um fragmento biologicamente ativo des- se, ou interferem de outra forma com a interação de um polipeptídeo com outras proteínas celulares. Tais ensaios de rastreamento incluirão ensaios passíveis a rastreamento de alta produtividade de bibliotecas químicas, tor- nando-os particularmente adequados para identificar candidatos a fármacos de pequena molécula. Pequenas moléculas contempladas incluem compos- tos orgânicos e inorgânicos sintéticos, incluindo peptídeos, preferivelmente peptídeos solúveis fusões de (poli)peptídeo-imunoglobulina e, em particular 1 anticorpos incluindo sem limitação, anticorpos e fragmentos de anticorpos poli- e monoclonais, anticorpos de cadeia única, anticorpos antiidiotípicos, e versões quiméricas ou humanizadas de tais anticorpos ou fragmentos, assim como anticorpos e fragmentos de anticorpos humanos. Os ensaios podem ser realizados em uma variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de rastreamento bioquímico, imunoensaios e en- saios a base de células, que são bem-caracterizados na técnica. Todos os ensaios são comuns em que eles requerem contato de um composto de tes- te com um polipeptídeo identificado aqui sob condições e por um tempo sufi- ciente para permitir que o polipeptídeo interaja com o composto de teste.

Em ensaios de ligação, a interação é ligação e o complexo for- mado pode ser isolado ou detectado na mistura de reação. Em uma modali- dade particular, um polipeptídeo ou o composto de teste é imobilizado sobre uma fase sólida, por exemplo, em uma placa de microtitulação, por ligações covalentes e não covalentes. Ligação não-covalente geralmente é realizada por revestir a superfície sólida com uma solução do polipeptídeo ou compos- to de teste e secagem. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por e- xemplo, um anticorpo monoclonal específico para um polipeptídeo a ser i- mobilizado, pode ser usado para ancorar o polipeptídeo a uma superfície sólida. O ensaio é realizado por adicionar o componente não imobilizado, que pode ser marcado por um marcador detectável, ao componente imobili- zado, por exemplo, a superfície revestida contendo o componente ancorado. Quando a reação termina, os componentes não reagidos são removidos, por exemplo, por lavagem, e complexos ancorados sobre a superfície sólida são detectados. Quando o componente originalmente não imobilizado carrega um marcador detectável, a detecção do marcador imobilizado sobre a super- fície indica que ocorreu complexação. Onde o componente originalmente não imobilizado não carrega um marcador, a complexação pode ser detec- tada, por exemplo, pelo uso de um anticorpo marcado ligando especifica- mente o complexo imobilizado.

Se o composto de teste interage, mas não se liga a um polipep- tídeo particular identificado aqui, sua interação com aquela proteína pode ser testada por métodos bem-conhecidos para detectar interações proteína- proteína. Tais ensaios incluem abordagens tradicionais, tais como, ligação reticulada, co-imunoprecipitação, e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, interações proteína-proteína podem ser monitoradas pelo uso de um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e colaboradores [Fields & Song, Nature (London) 340. 245-246 (1989); Chien et al, Proc. NatL Acad. Sci USA 88, 9578-9582 (1991)] como descrito por Chevray & Nathans1 Proc. Nati Acad. Sci USA 89, 5789-5793 (1991). Muitos ativadores transcricionais, tal como GAL4 de Ieve- dura, consistem em dois domínios modulares fisicamente distintos, um agin- do como o domínio de ligação ao DNA, enquanto que o outro funciona como o domínio de ativação de transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações anteriores (geralmente referido como o "sistema de dois híbridos") leva vantagem dessa propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma na qual a proteína alvo é fundida ao domínio de ligação ao DNA de GAL4, e outra, na qual proteínas ativadoras candidatas são fundidas ao domínio de ativação. A expressão de um gene repórter de GAL1 -IacZ sob o controle de um promotor ativado por GAL4 depende da reconstituição da atividade de GAL4 através de interação proteína-proteína. Colônias que con- têm peptídeos em interação são detectadas com um substrato cromogênico para β-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKER®) para identificar interações proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando a téc- nica de dois híbridos é disponível comercialmente por Clontech. Esse siste- ma também pode ser estendido para mapear domínios de proteína envolvi- dos em interações de proteínas específicas assim como resíduos de amino- ácidos precisos que são cruciais para essas interações.

Para identificar compostos que interferem com a interação de um polipeptídeo identificado aqui e outros componentes intra- ou extracelula- res, uma mistura de reação pode ser preparada contendo o polipeptídeo e o componente sob condições que permitem a interação do polipeptídeo com o componente. Para testar a habilidade de um composto de teste em inibir a interação, a mistura de reação é preparada na ausência e na presença do composto de teste. Se há uma diminuição na interação do polipeptídeo com o componente na presença do composto de teste, então o composto de tes- te é dito inibir a interação do polipeptídeo com o componente.

Em certas modalidades, métodos para identificar agonistas ou antagonistas de um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R compreendem colocar um polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R em contato com uma molécula agonista ou antagonista candidate e medir uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo de IL-22 ou IL-22R. Tais atividades incluem, mas não limitadas àquelas descritas nos Exemplos abaixo.

3. Ensaios de ligação de anticorpo

Estudos de ligação de anticorpo podem ser realizados em qual- quer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Ensaios de ligação competitiva contam com a habilidade de um padrão marcado competir com o analito da amostra de teste pela ligação com uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de proteína alvo na amostra de teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se torna ligada aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que fica ligado, os anticorpos preferivelmente são insolubilizados antes ou após a competição, a fim de que o padrão e o analito que estão ligados aos anticorpos possam ser convenientemente separados do padrão e do analito que permanecem não ligados.

Ensaios sanduíche envolvem o uso de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a uma porção imunogênica diferente, ou epitopo, da prote- ína a ser detectada. Em um ensaio sanduíche, ò analito da amostra de teste é ligado por um primeiro anticorpo que é imobilizado sobre um suporte sóli- do, e após isso um segundo anticorpo se liga ao analito, assim formando um complexo insolúvel de três ptécnicas. Vide, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.376.110. O próprio segundo anticorpo pode ser marcado com uma porção detectável (ensaios sanduíche diretos) ou pode ser medido usando um anti- corpo antiimunoglobulina que é marcado com uma porção detectável (ensaio sanduíche indireto). Por exemplo, um tipo de ensaio sanduíche é um ensaio ELISA, em cujo caso a porção detectável é uma enzima.

Imunohistoquímica também pode ser usada para determinar a localização celular de um antígeno ao qual um anticorpo se liga. Para imu- nohistoquímica, a amostra de tecido pode ser fresca ou congelada ou pode ser embebida em parafina e fixada com um conservante tal como formalina, por exemplo.

Artigos de fabricação

Em outro aspecto, um artigo de fabricação que compreende composições úteis para o diagnóstico ou tratamento das desordens descritas acima é fornecido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e uma instrução. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, e tubos de teste. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para diagnosticar ou tratar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bol- sa ou frasco de solução intravenosa que tem uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O agente ativo na composição é geralmente um polipeptídeo, um anticorpo, um agonista, ou um antagonista da invenção.

Uma instrução ou rótulo sobre, ou associado com, o recipiente indica que a composição é usada para diagnosticar ou tratar a condição de escolha. O artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como solução sali- na tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ela pode ainda incluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.

Em uma modalidade, a invenção fornece um artigo de fabrica- ção, que compreende:

(a) uma composição de interesse que compreende um ago- nista ou antagonista de IL-22 ou IL-22R;

(b) um recipiente que contém a dita composição; e

(c) um rótulo fixado ao dito recipiente, ou uma bula incluída no dito recipiente, referindo-se ao uso do dito antagonista no tratamento de uma doença relacionada com a imunidade ou câncer. A composição pode com- preender uma quantidade eficaz do antagonista.

Os seguintes exemplos são oferecidos para fins ilustrativos a- penas, e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de nenhuma forma.

Todas as referências de patente e literatura citadas na presente especificação estão por meio desse incorporadas por referência na sua tota- lidade. III. EXEMPLOS

Reagentes disponíveis comercialmente referidos nos exemplos foram usados de acordo com as instruções do fabricante a menos que indi- cado de outra maneira. A fonte dessas células identificadas nos exemplos a seguir, e por toda a especificação, por números de acesso ATCC é a Ameri- can Type Culture Collection, Manassas, VA.

EXEMPLO 1: Geração de anticorpos anti-IL-22 e anti-IL-22R

Esse exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a IL-22 ou IL-22R. Técnicas empregadas para produzir os anticorpos monoclonais foram baseadas naquelas conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, em Goding, supra. Os imunógenos empregados foram IL-22 humana purificada de extensão completa (hlL-22) ou IL-22R humano purificado de extensão completa (hlL-22R). Resumida- mente, os camundongos foram imunizados com cerca de 1-100 microgra- mas do imunógeno hlL-22 ou hlL-22R emulsificado em adjuvante. Os ca- mundongos imunizados foram então estimulados 10 a 12 dias depois com imunógeno adicional emulsificado em adjuvante. Amostras de soro foram obtidas periodicamente dos camundongos para testar em ensaios ELISA para detectar anticorpos anti-IL-22 ou IL-22R.

Após uma titulação de anticorpo adequada ter sido detectada, os animais "positivos" para os anticorpos foram sacrificados e as células esplê- nicas coletadas. As células esplênicas foram então fundidas (usando polieti- Ieno glicol a 35%) a uma linhagem celular de mieloma murino. As fusões geraram células de hibridoma que foram clonadas em meio contendo HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina). As células de hibridoma foram rastre- adas em um ELISA quanto a reatividade contra IL-22 ou IL-22R (vide Figura 5). Uma listagem dos anticorpos produzidos por esses hibridomas e suas respectivas propriedades é encontrada na Figura 5.

EXEMPLO 2: Sinalização de IL-22 é bloqueada por anticorpos anti-IL-22

A ativação de STAT-3 é uma característica da ativação do re- ceptor de IL-22 e sinalização intracelular. Anticorpos gerados contra IL-22 foram testados quanto à habilidade de bloquear a ativação de STAT-3 indu- zida por IL-22. Células T 293 expressando o heterodímero receptor de IL-22 humano (hlL-22R/hlL-10R2) foram plaqueadas a 0,2 X 106 / cavidade em uma placa de 24 cavidades. As células foram transfectadas com um repórter de Luciferase STAT3 (TK-SIE-SRE-S) usando Lipofectamina 2000® (Invitro- gen). Portanto, quando STAT3 é ativado, as células produzirão luciferase, uma atividade enzimática que pode ser detectada pela adição de luciferina. Uma redução da atividade de luciferase significa que STAT3 é bloqueada. No dia seguinte, 0,5 nM de hlL-22 (R&D Systems) foi adicionado a cada ca- vidade junto com 20 pg/ml de anticorpo. Dezesseis horas depois, as células foram lisadas e as amostras lidas em um luminômetro. Os dados mostrados na Figura 6 são atividade de luciferase em relação ao controle interno de Renilla, que é uma medida de ativação relativa de STAT-3. Como mostrado na Figura 6, os anticorpos 3F11.3, 11H4.4, e 8E11.9 tiveram habilidade de bloqueio significativa. EXEMPLO 3: Dose versus resposta de anticorpos anti-IL-22.

Uma variação de doses de anticorpos gerados contra IL-22 hu- mana foi testada quanto a habilidade de bloquear IL-22 humano em um en- saio de ativação de STAT3. Células 293 expressando hlL-22R/hlL-10R2 fo- ram plaqueadas a 0,2 X 106 / cavidade em uma placa de 24 cavidades. As células foram transfectadas com um repórter de Luciferase STAT3 (TK-SIE- SRE-S) usando Lipofectamina 2000® (Invitrogen). No dia seguinte, 0,5 nM de hlL-22 (R&D Systems) foi adicionada a cada cavidade junto com concen- trações variadas dos anticorpos anti-IL-22 3F11, 8E11 ou 11H4. A variação de concentrações para o anticorpo começou em 40 pg/ml com diluições de 2 vezes até uma concentração final de 0,012 pg/ml. Dezesseis horas depois, as células foram Iisadas e as amostras lidas em um luminômetro. Os três anticorpos mostram uma curva dose/resposta similar para bloqueio de ativa- ção de STAT3, como mostrado na Figura 7. EXEMPLO 4: Dose versus resposta de anticorpos anti-IL-22.

Uma variação de doses de anticorpos gerados contra IL-22 foi testada quanto a habilidade de bloquear IL-22 de murino (mlL-22) em um ensaio de ativação de STAT3. Células 293 expressando mlL-22R/mlL-10Rb foram plaqueadas a 0,2 X 106 / cavidade em uma placa de 24 cavidades. As células foram transfectadas com um repórter de Luciferase STAT3 (TK-SIE- SRE-S) usando Lipofectamina 2000® (Invitrogen). No dia seguinte, 0,5 nM de mlL-22 (marcado com poli-histidina) foi adicionada a cada cavidade junto com concentrações variadas de anticorpo 3F11, 8E11 ou 11H4. A variação de concentração para o anticorpo começou em 40 pg/ml com diluições de 2 vezes até 0,012 pg/ml. Dezesseis horas depois, as células foram Iisadas e as amostras lidas em um luminômetro. A Figura 8 mostra que os anticorpos anti-IL-22 sofreram reação cruzada com IL-22 de murino e mostraram uma dose/resposta similar, mas não tão robusta. Isso mostra que os anticorpos anti-IL-22 podem ser usados em experimentos em murinos.

EXEMPLO 5: Afinidade de anti-IL-22 por IL-22 humana

A figura 9 mostra a afinidade de anti-IL-22 por IL-22 humana. A afinidade foi medida por análise BIACore. Várias quantidades de IgGs anti- IL-22 foram imobilizadas em um chip CM 5 (845 RU (unidades de referência) para IgG 11H4, 1933 RU para IgG 8E11, & 7914 RU para IgG 3F11) através de química de acoplamento de cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS). Diluições seriadas duas vezes de IL-22 foram preparadas abrangendo a faixa de 0,5 - 250 nM. As amostras de antígeno foram injetadas sobre a superfície com IgG imobiliza- da em uma taxa de fluxo de 20 μΙ/min por 6 minutos, e os complexos ligados foram deixados dissociar por 10 minutos. As superfícies de IgG foram rege- neradas com Gly 10 mM, pH 1,5 após cada ciclo de injeção de antígeno. Como uma célula de fluxo de controle negativo, uma IgG irrelevante (enxerto de RF 3A5) foi imobilizada para subtração da resposta de fundo. O tampão de corrida, PBS contendo Tween 20 0,05% com NaN3 0,01% foi usado para todas as diluições de amostra e o experimento de ligação foi feito a 25°C. Os dados foram analisados por ajuste global com um modelo de ligação 1:1. Esses resultados mostram que os anticorpos anti-IL-22 têm afinidade muito boa por IL-22 humana.

EXEMPLO 6: Anticorpos anti-IL-22 detectam IL-22 na célula

Anticorpos contra IL-22 foram testados quanto à habilidade de detectar IL-22 intracelular.

Parai marcação intracelular de FACS de IL-22, as seguintes li- nhagens de células 293 foram usadas: células expressando hlL-22-GFP, mlL-22-GFP, mlL20-GFP, e somente GFP. Os anticorpos testados foram anticorpos anti-IL-22 humana 3F11, 8E11, e 17F6. Anti-gp120 de camun- dongo foi usado como um controle isotípico. O anticorpo secundário usado foi anti-lgG de camundongo-PE de Jackson labs. As células foram incubadas com Brefeldina A por 2 horas, lavadas em PBS, e então fixadas com para- formaldeído 2% durante a noite a 4°C. As células foram então lavadas em PBS, e incubadas em 5 ml de Tween-20 0,2% por 30 minutos a 37°C. A marcação com anticorpo foi realizada por 30 minutos a 4°C, e a seguir lava- gem com solução de Tween-20. As células foram ressuspensas em tampão de FACS e analisadas em um FACScan. A Figura 10 mostra os resultados de FACS. Os resultados de FACS mostram que os anticorpos 3F11 e 8E11 causam uma mudança no padrão de marcação da célula, indicando que es- ses anticorpos se ligam IL-22 intracelular tanto de murino como de humano,

O anticorpo anti-IL-22 3F11 foi usado em experimentos de mar- cação celular adicionais. O anticorpo 3F11 foi conjugado com Alexa 647, um fluoróforo de ficoeritrina. lgG2a de camundongo conjugado a Alexa 647 foi usado como um controle isotípico (Caltag). Linhagens de células 293 ex- pressando hlL-22-GFP e somente GFP foram testadas quanto a ligação do anticorpo 3F11. As células 293 foram fixadas com paraformaldeído 2% por 30 minutos, e então lavadas duas vezes PBS/FCS 2%. As células foram ressupensas em saponina 0,5% por 15 minutos. Soro de camundongo nor- mal foi adicionado por mais 15 minutos, e então anticorpos foram adiciona- dos a 0,5 pg/milhão de células por 30 minutos. As células foram lavadas e ressupensas em tampão de FACS e analisadas em um FACScan. A Figura 11 mostra no painel inferior esquerdo uma mudança das células para dentro do quadrante superior direito. Esse resultado indica que o anticorpo 3F11 conjugado está ligando IL-22 intracelular.

EXEMPLO 7: Expressão de IL-22 em células T Th1

Quando células T CD4+ amadurecem no timo e entram no sis- tema linfático periférico, elas geralmente mantêm seu fenótipo virgem nativo antes de encontrar antígenos específicos para seu receptor de célula T (T- CR) [Sprent et al., Annu Rev Immunol. (2002); 20:551-79]. A ligação do TCR a antígenos específicos apresentados por células apresentadoras de antíge- no (APC)1 gera a ativação de célula T. Dependendo do ambiente e do estí- mulo de citocina, células T CD4+ T podem se diferenciar em um fenótipo Th1 ou Th2 e se tornar células efetoras ou de memória [Sprent et al., Annu Rev Immunol. (2002); 20:551-79 e Murphy et al., Nat Rev Immunol. (2002) Dez; 2(12):933-44]. Esse processo é conhecido como ativação primária. Tendo sofrido ativação primária, as células T CD4+ se tornam células efeto- ras ou de memória, e elas mantêm seu fenótipo como Th1 ou Th2. Uma vez que essas células encontram o antígeno novamente, elas sofrem ativação secundária, mas nesse momento a resposta ao antígeno será mais rápida do que a ativação primária e resulta nà produção de citocinas efetoras como determinado pela ativação primária. [Sprent et al., Annu Rev Immunol. (2002); 20:551-79 e Murphy et al., Annu Rev Immunol. 2000;18:451-94]. Es- tudos descobriram que durante a ativação primária e secundária de células T CD4+ a expressão de certos genes é variável [Rogge et al., Nature Gene- tics. 25, 96 - 101 (2000) e Ouyang et al., Proc Natl Acad Sci USA. (1999) Mar 30; 96(7):3888-93].

Para condições de ativação primária, células T virgens podem ser ativadas por Ova e APC. RNA isolado das células nessa condição po- dem fornecer informação sobre que genes são diferenciadamente regulados durante a ativação primária, e que citocinas afetam a expressão gênica du- rante o desenvolvimento de Th1 e Th2. Após a ativação primária, as células T CD4+ podem ser mantidas em cultura. Já que a ativação anterior e o tra- tamento com citocina ficaram gravados nessas células, elas se tornaram tanto células efetoras como de memória. Durante esse período, pelo fato de não haver APCs ou antígenos, as células T CD4+ entram em um estágio de repouso. Esse estágio de repouso fornece informação sobre as diferenças entre células virgens vs. de memória, e células Th1 de memória em repouso vs. Th2 de memória em repouso. As células Th1 e Th2 de memória em re- pouso então sofrem ativação secundária com anticorpos anti-CD3/CD28 o estimulação com citocinas IL-12/IL-18. Essas condições fornecem informa- ção sobre as diferenças entre as células T virgens ativadas e de memória ativadas, e as diferenças entre células Th 1 de memória ativadas vs. Th2 de memória ativadas.

Para o experimento mostrado na Figura 12, esplenócitos de camundongos D011.10 foram isolados e ativados por OVA em condições para Th1: [IL- 12 (1 ng/ml), IFN-γ, e IL-4 (Ιμ/ml)]; condições para ThO: [(anti- IL12, anti-IFN-γ, e anti-IL4)]; ou condições para Th2: [(anti-IL-12 (0,5 pg/ml), anti-IFN- γ, e IL-4 (5 ng/ml]). RNA foi coletado 48 h depois (estímulo primá- rio). O restante das células foi mantido na cultura até o dia 7, e então reesti- mulado (estimulação secundária) por OVA e esplenócitos de Balb/c irradia- dos. Um subgrupo das células da condição de Th1 também foi estimulado por IL-12 e IL- 18 sozinhos. 48 h após o RNA foi colhido. A expressão de IL- 22, IFN-γ, e IL-4 nessas amostras de RNA foi analisada por análise de nu- clease 5' (TaqMan®). A expressão foi primeiro normalizada contra sondas de HPRT de genes constitutivos, e então representada graficamente como número de vezes de aumento em comparação com o nível de expressão dos esplenócitos. O resultado é mostrado na Figura 12, e os dados mostram que IL-22 é altamente expressa em células Th1 por estimulação secundária. Por- •tanto, terapêuticos anti-IL-22 poderiam ser úteis em atingir essas células, tanto para o tratamento de desordens mediadas por Th 1 quando seria dese- jável retirar as células Th1 do sangue como para diagnóstico para desordens mediadas porThl onde acredita-se que IL-22 desempenhe um papel.

EXEMPLO 8: IL-22 é produzida por células T νδ

Para analisar a expressão de IL-22 em células T γδ, as células foram isoladas de baço de camundongo e as células T γδ foram separadas por seleção por MACS. GL4 é um anticorpo anti-TCR de γδ que ativa especi- ficamente células T γδ (Becton- Dickinson). O kit de isolamento MINI RNA de Qiagen foi usado para isolar o RNA das células para análise de nuclease 5' (TaqMan®). Reagente One-step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems; 4309169) foi usado e os genes constitutivos RPL10 e SPF31 foram usados para normalização. Esplenócitos inteiros foram usados para determinar o nível relativo de expressão de IL-22. A Figura 13 mostra que IL-22 é alta- mente expressa em células T γδ estimuladas com anticorpo GL4. EXEMPLO 9: IL-22 é produzida por células T humanas ativadas

Microarranjos de ácidos nucleicos são úteis para identificar ge- nes diferentemente expressos em tecidos doentes quando comparados aos seus equivalentes normais. Usando microarranjos de ácidos nucleicos, a- mostras de mRNA de teste e controle de amostras de tecido de teste e de controle sofrem transcrição reversa e são marcados para gerar sondas de cDNA. As sondas de cDNA são então hibridizadas a um conjunto de ácidos nucleicos imobilizados sobre um suporte sólido. O arranjo é configurado tal que a seqüência e a posição de cada membro do arranjo seja conhecida. Por exemplo, uma seleção de genes conhecidos por ser expressos em cer- tos estados de doença pode ser disposta sobre um suporte sólido. A hibridi- zação de uma sonda marcada com um membro particular do arranjo indica que a amostra a partir da qual a sonda foi derivada expressa aquele gene. Se o sinal de hibridização de uma sonda de uma amostra de teste (nesse caso, células T CD4+ ativadas) é maior do que o sinal de hibridização de uma sonda de uma amostra de controle (nesse caso, células T CD4+ não estimuladas), o gene ou genes superexpressos no tecido de teste são identi- ficados. A implicação desse resultado é que uma proteína superexpressa em um tecido de teste é útil não apenas como um marcador de diagnóstico para a presença da condição de doença, mas também como um alvo terapêutico para o tratamento da condição de doença.

A metodologia de hibridização de ácidos nucleicos e tecnologia de microarranjo é bem-conhecida na técnica. Por exemplo, a preparação especifica de ácidos nucleicos para hibridização e sondas, lâminas e condi- ções de hibridização estão todas bem-detalhadas no Pedido de Patente PCT Série No. PCT/USO 1/10482, depositado em 30 de março de 2001, e que está aqui incorporado por referência.

Nesse experimento, células T CD4+ foram purificadas a partir de um único doador usando o protocolo de RossetteSep® de Stem Cell Tech- nologies (Vancouver BC) que usa anticorpos anti-CD8, anti-CD16, anti- CD19, anti-CD36 e anti-CD56 usados para isolar células T CD4+. Células T CD4+ isoladas foram ativadas com um anticorpo anti-CD3 (usado em uma concentração que não estimula a proliferação) junto com anticorpo de ICAM- 1 ou anti-CD28. Em 24 ou 72 horas as células foram colhidas, o RNA extraí- do e a análise corrida em chips de microarranjo Affimax (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Células não estimuladas (em repouso) foram colhidas i- mediatamente após purificação, e submetidas à mesma análise. Os genes foram comparados cuja expressão foi regulada positivamente em qualquer um dos dois momentos em células ativadas vs. em repouso.

Os resultados desse experimento são mostrados na Figura 14. Os resultados do microarranjo suportam e complementam os dados no E- xemplo 7. As células T Th1 produzem uma grande quantidade de IL-22 quando estimuladas, ao contrário das células TH2 que produzem IL-4 ou IL- 5. Esse resultado poderia permitir a separação de desordens imunes rela- cionadas com Th1 e Th2 com base no perfil de citocinas. Células Thl que expressam IL-22 e IFN-γ poderiam ser tratadas por terapêuticos direciona- dos para essas citocinas, sem afetar a população de células Th2.

EXEMPLO 10: Células Th1 expressam IL-22 intracelular

Para determinar o nível de expressão de IL-22 em células T por FACS, a marcação intracelular foi realizada em células Th1/Th2 de murino. Esplenócitos primários foram polarizados para Th 1 ou Th2. Para marcação de FACS, 1 milhão de células foram plaqueadas por cavidade em uma placa de 96 cavidades, e foram tratadas com PMA/lonomicina por 2 horas, e então Brefeldina A por mais 2 horas. Os anticorpos usados foram anti-IL-22 huma- na (anticorpo 3F11.1) e anti-gp120 como um controle. Anti-IFN-γ de camun- dongo-FITC e anti-IL-4 de camundongo-PE foram obtidos de BD Bioscience (San Diego CA). Anticorpo de cabra anti-lgG de camundongo conjugado a PE (também de BD Bioscience) foi usado como um anticorpo secundário. As células foram fixadas com paraformaldeído 2% por 30 minutos, e então la- vadas duas vezes com PBS/FCS 2%. As células foram então ressuspensas em saponina 0,5% por 15 minutos, e então os anticorpos foram adicionados a 0,5 ug/milhão de células por 30 minutos as células foram então lavadas duas vezes e o anticorpo secundário foi adicionado em saponina 0,5% por 15 minutos. Finalmente, as células foram lavadas e ressupensas em tampão de FACS e analisadas em um FACScan. A Figura 15 nos painéis superiores mostra que as células Th1 podem ser diferenciadas das células Th2. As cé- lulas Th1 são positivas para IFN-γ, negativas para IL4, e positivas para IL- 22. As células Th2 são na maioria negativas para IFN- γ, positivas para IL4, e negativas para IL-22.

EXEMPLO 11: Geração de anti-receptor de IL-22 (IL-22R)

Pará testar a ligação de anticorpos anti-IL-22R, células 293 ex- pressando hlL-22R e células expressando GFP foram usadas. Um milhão de células foram marcadas com diferentes anticorpos anti-hlL-22R em uma con- centração de 0,3 Mg/milhão de células. Os anticorpos testados foram 7E9, 8A12, 8H11, e 12H5. O anticorpo secundário foi de cabra anti-camundongo conjugado a PE (Jackson Labs) usado em um fator de diluição de 1:200. As células foram lavadas e marcadas em tampão de FACS (BSA 0.5%/PBS). A marcação com os anticorpos de teste foi realizada por 15 minutos a 4°C, e então as células foram lavadas, e o anticorpo secundário foi adicionado por mais 15 minutos a 4°C. As células foram lavadas duas vezes antes da análi- se no FACScan. Os resultados são mostrados na Figura 16. Para cada grá- fico nos quais os picos não se sobrepõem, o pico à esquerda corresponde ao controle, e o pico à direita corresponde ao anticorpo de teste. A Figura 16 mostra que todos os quatro anticorpos anti-IL-22R testados eram positivos para ligação a IL-22R em células 293 transfectadas. Os anticorpos 7E9, 8A12, 8H11, e 12H5 dão boa ligação com muito pouca interferência. EXEMPLO 12: Anticorpos bloqueadores de IL-22R

Para testar a atividade de bloqueio de anticorpos anti-IL-22R, um constructo repórter de Iuciferase (como descrito no Exemplo 2) foi usado. Se um anticorpo tiver uma atividade de bloqueio, STAT3 não será ativada e a resposta de luciferase será baixa. As células que expressam hlL- 22R/hlL10Rb foram plaqueadas a 0,2 X 106 / cavidade em uma placa de 24 cavidades e os repórteres de Iuciferase TK-SIE-SRE-S (0,8 Mg/cavidade) e RL-TK-Luc (0,16 pg/cavidade) foram transfectados nas células. No dia se- guinte, hIL-22 foi adicionada aos cavidades a 0,5 nM, e cada anticorpo foi adicionado a 20 pg/ml. Os anticorpos anti-IL-22R testados foram: 7E9, 8A12, 8H11 e 12H5. Os anticorpos de controle usados foram GP120 e 11H4, um anticorpo anti-hlL-22 mostrado ter atividade bloqueadora no Exemplo 2. De- zesseis horas depois as células foram Iisadas e as amostras lidas em um luminômetro para detectar a atividade de luciferase. A Figura 17 mostra que todos os quatro anticorpos anti-IL-22R testados bloquearam a interação de IL-22R-IL-22.

EXEMPLO 13: IL-22R é expresso em queratinócitos primários.

Os queratinócitos são a população celular que superprolifera du- rante a psoríase. Terapêuticos que atingem os queratinócitos são úteis no alívio de psoríase. Expressão de IL-22R em queratinócitos humanos primá- rios foi determinada por análise de FACS. Doadores de queratinócitos epi- dérmicos humanos normais (NHEK) lote 0526 foram obtidos de Cascade Biologies, passagem #2, cultivados para 80% de confluência, e foram mar- cados a 300-600K células por amostra. Soro anti-IL-22R foi usado em uma diluição de 1:50 e soro pré-marcado foi usado em uma diluição de 1:50 como o controle. Para marcação para IL10R2, anticorpo de R&D (clone #90220, IgG1 de murino) foi usado a 0,3 pg por amostra com controle isotípico de IgG1-PE murino (BD Pharmingen #33815X). O anticorpo secundário para soro anti-IL-22R foi anti-lgG1 de camundongo-PE (BD Pharmingen #550083), usado a 0,1 ug por amostra. A Figura 18 mostra que IL-22R e IL10R2 são expressos em NHEK. Portanto, o bloqueio do IL-22R oi IL-22 pode se provar útil no alívio de desordens associadas com hiperproliferação de queratinócitos, tal como psoríase.

EXEMPLO 14: Efeito de IL-22 sobre culturas epidérmicas.

Epiderme humana reconstituída (RHE) pode ser usada como um modelo para os efeitos de citocinas sobre a pele.

RHE e meio de cultura foram obtidos de MatTek Corporation (A- shland, MA). RHE foi equilibrada durante a noite (20-22 h) com 0,9 ml de meio a 37°C, 5% CO2, para se recuperar do transporte antes do início do experimento e então cultivado em interface ar-líquido com 5 ml de meio a 37°C, 5% CO2- O efeito de IL-22 sobre RHE foi testado usando três condi- ções diferentes. IL-22 (1,2 nM) ou fator de crescimento epidérmico (EGF- R&D Systems) (1 nM) foi adicionado ao meio. O controle consistiu em meio não tratado. RHE foi cultivada por 4 dias, com troca de meio a cada dois di- as, adicionando EGF fresco ou IL-22. RHE foram colhidas, fixadas em for- malina tamponada neutra (NBF) a 10% durante a noite, seccionadas e mar- cadas com hematoxilina e eosina (H&E). A Figura 19 mostra que o tratamen- to com IL-22 causa espessamento da epiderme. Isso indica que IL-22 causa hiperplasia, ou proliferação de células que formam a epiderme.

Quando as seções foram marcadas para citoqueratina 16 (K16), um marcador para proliferação de queratinócitos, as RHE tratadas com IL-22 mostraram significativamente mais marcação para K16. K16 é expresso a- penas em células da pele em proliferação tal como psoríase e cura de feri- das (revisado em Freedberg etal, Soe. Invest. Derm. 116:633-640 (2001)). A Figura 20 mostra a marcação de K16 em RHE tratada com IL-22 em relação a RHE não tratada e tratada com EGF. A RHE tratada com IL-22 mostrou K16 por todo o tecido, enquanto que a marcação é localizada nas seções de RHE não tratadas e tratadas com EGF.

O tratamento de RHE com IL-22 também induz psoriasina, um gene altamente expressão em psoríase. Psoriasina (S100A7) foi descoberta originalmente como uma proteína expressa na psoríase, mas não em pele normal (Madsen P., etal., J. Invest. Derm. 97: 701-712 (1991)). Psoriasina é expressa em queratinócitos cultivados e malignos ativados, e em células epiteliais de mama malignas (Watson et ai, Int. J. of Biochem. and Cell Bio. 30:567-571 (1998)). Dados atuais suportam um papel para psoriasina, doen- ça de pele inflamatória, quimiotaxia, e progressão de tumor de mama. A cor- relação de psoriasina com hiperplasia psoriasiforme da pele sugere um pa- pel na diferenciação de queratinócitos. A psoriasina também pode ser quimi- otática, estimulando a infiltração de neutrófilos e linfócitos T CD4+ da epi- derme que é uma característica de psoríase. A Figura 21 mostra o tratamen- to RHE com IL-22 induz altos níveis de expressão de psoriasina. Esse resul- tado confirma que IL-22 e IL-22R desempenham um papel na psoríase.

O efeito indutor da via de IL-22 sobre psorasina pode ser blo- queado por anticorpos direcionados para IL-22 ou IL-22R. O anticorpo anti- IL-22 8E11 administrado em uma concentração de 20 pg/ml reduziu a ex- pressão para níveis indetectáveis (vide a Figura 23). Quando usados em uma concentração de 20 pg/ml, o anticorpo anti-IL-22R (7E9) também redu- ziu significativamente a expressão de psoriasina como mostrado na Figura 23.

Os anticorpos anti-IL-22 e anti-IL-22R foram testados para de- terminar se eles poderiam reduzir o espessamento epidérmico observado quando RHE é tratada com IL-22. O anticorpo anti-IL-22 (8E11) administrado em uma concentração de 20 pg/ml mostrou redução significativa da espes- sura epidérmica (vide Figura 24). RHE tratada com IL-22 atingiu uma espes- sura de 80-90 pm, e o tratamento com anticorpo anti-IL-22 (8E11) reduziu a espessura de RHE para 50-60 pm (Figura 25). O anticorpo anti-IL-22R (7E9) também reduziu o espessamento da pele. Quando usando em uma concen- tração de 20 pg/ml, anticorpo anti-IL-22R reduziu a espessura de RHE de 80-90 pm para 55-60 pm (Figura 25). Esses dados mostram que anticorpos anti-IL-22 ou anti-IL-22R podem aliviar os sintomas associados com psoría- se, tal como proliferação e espessamento da epiderme.

EXEMPLO 15: Análise de microarranios de genes induzidos por IL-22

Para determinar quais genes eram induzidos por IL-22, querati- nócitos epidérmicos humanos normais (NHEK) derivados de um único doa- dor foram plaqueados e tratados para 70% de confluência por 24 h com 20 ng/ml de IL-22. Meios e suplementos (EpiLife® + HKGS) foram obtidos de Cascade Biologies® (Portland, OR). As células foram lavadas e lisadas. O RNA total foi purificado das células NHEK usando Qiagen RNeasy Mini Kit. O RNA foi submetido à análise de microarranjos, e a quantidade de expres- são gênica foi quantificada (Vide o Exemplo 9 acima para uma descrição de análise de microarranjos).

A psoriasina é induzida 81 vezes por estimulação por IL-22. SPR-2G é regulado positivamente 11 vezes. (Vide Figura 22.). Esses resul- tados indicam que a via de IL-22 está implicada na psoríase. Portanto, anti- corpos antagonistas e agonistas direcionados contra IL-22 ou IL-22R são úteis no alívio de psoríase.

EXEMPLO 16: IL-23 induz características de psoríase in vivo

Um modelo de camundongo foi usado para comparar a habilida- de de IL-12 e IL-23 induzirem características de pele psoriásica. Camundon- gos C57B1/6 foram injetados subcutaneamente na orelha com 500 ng de IL- 12 recombinante ou de IL-23 recombinante em um volume total de 20 μΙ de PBS. Camundongos de controle foram injetados com 20 μΙ de PBS apenas. Os camundongos foram injetados uma vez a cada dois dias por 16 dias. Ca- da grupo experimental consistiu em cinco camundongos. A espessura da orelha foi medida antes e em múltiplos pontos de tempo após injeção com um calibrador (Mitutoyo America Corporation) e é relatada como média ± desvio padrão. Para esse experimento e experimentos subseqüentes, o sig- nificado estatístico foi calculado por ANOVA de variância simples ou de vari- ância fita usando o programa Prism (GraphPad). Todos os valores de ρ < 0,05 foram considerados significativos. As orelhas dos camundongos foram coletadas para análise histológica de rotina usando coloração com hematoxi- lina-e-eosina (H&E).

Como mostrado na Figura 26A, injeção tanto com IL-12 como IL- 23 induziram um aumento significativo na espessura da orelha antes de uma semana após a primeira injeção. Para camundongos que receberam IL-12, ρ foi < 0,001 (dias 12, 14 e 16 vs controle com PBS, respectivamente). Para camundongos que receberam IL-23, ρ foi < 0,001 (dias 8, 12, 14 e 16 vs controle com PBS, respectivamente). Análise histológica revelou que orelhas injetadas tanto com IL-12 como IL-23 desenvolveram infiltração celular in- flamatória acentuada e espessamento epidérmico (acantose) em compara- ção com o grupo de controle tratado com PBS; entretanto, há algumas dife- renças histológicas claras entre esses dois grupos. Primeiro, IL-12 induziu acantose leve a moderada com uma infiltração celular inflamatória dérmica predominantemente mononuclear, acentuada (Fig. 26D, E) em comparação com o grupo de controle com PBS (Fig. 26B, C), enquanto que IL-23 induziu acantose acentuada com uma infiltração celular inflamatória dérmica mista de muitos leucócitos polimorfonucleares (Fig. 26F, G), incluindo neutrófilos e (setas) e eosinófilos. Hiperplasia epidérmica e a presença de leucócitos po- limorfonucleares são características histológicas de psoríase em humanos, assim como achados histológicos muito comuns em modelos de camundon- go de psoríase. Vide P. C. van de Kerkhof et al, Dermatológica 174: 224 (1987) e P. R. Mangan etal, Nature (2006) 441:235.

EXEMPLO 17: IL-22 age a montante de IL-23 in vivo

Para identificar citocinas que potencialmente agem a montante de IL-12 ou IL-23, PCR em tempo real foi usado para examinar a expressão de um painel de citocinas de amostras de pele da orelha injetadas com IL-12 ou IL-23. As injeções na pele da orelha e a análise histológica foram realiza- das como descrito no Exemplo anterior. No dia 8 do experimento, o RNA foi isolado de orelhas de camundongos individuais e PCR em tempo real foi realizado para quantificar os níveis de mRNA codificante de IFN-γ, IL-17, e IL-22. Especificamente, o RNA foi isolado por RNeasy Mini Kit (Qiagen, Va- lencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. RT-PCR em tempo real foi conduzido usando um Sistema ABI 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) com iniciadores e sondas usando rea- gentes TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems). As reações foram corridas em duplicata e as amostras foram normalizadas para o gene constitutivo de controle RPL-19 e relatados de acordo com o método AACt.

Como mostrado na Figura 27A, IL-12 induziu um aumento signi- ficativo na expressão de IFN-γ na orelha oito dias após a primeira injeção. IL-23 induziu produção de IL-17 e inibiu a produção de IFN-γ em relação ao grupo de controle tratado com PBS (Fig. 27A). De forma interessante, IL-22 também foi significativamente regulada positivamente após injeção de IL-23, mas não após injeção de IL-12 (Fig. 27A). Esses dados sugeriram uma liga- ção entre IL-23 e IL-22.

Para confirmar que as citocinas eram produzidas por linfócitos que infiltraram a orelha, os linfócitos foram eluídos das orelhas tratadas e a produção de citocina foi medida por ELISA mediante ativação. Compatível com os dados de RT-PCR em tempo real, as células de orelhas injetadas com IL-23 produziram preferivelmente IL-22 e IL-17, enquanto que células de orelhas injetadas com IL-12 secretaram grande quantidade de IFN-γ (Fig. 28).

EXEMPLO 18: IL-22 induz infiltração dérmica e hiperplasia epidérmica in vivo

Para determinar se IL-22, assim como IL-23, é capaz de induzir características de pele psoriásica in vivo, camundongos foram injetados sub- cutaneamente ná orelha com IL-22 ou com PBS sozinho, como descrito aci- ma no Exemplo 16. Como mostrado na Figura 27B, IL-22 induziu um aumen- to significativo na espessura da orelha em comparação ao grupo tratado com PBS. IL-20, outra citocina da família da IL-10, induziu apenas um aumento leve e localizado na espessura da orelha. Esse achado estava em contraste ao relato anterior onde superexpressão transgênica epidérmica de IL-20 in- duziu hiperplasia epidérmica acentuada, um resultado que sugeriu que IL-20 poderia potencialmente desempenhar um papel na função epidérmica assim como na psoríase. Vide Blumberg et al, Cell 104:9 (2001). A análise histoló- gica mostrou que orelhas de camundongos tratadas com IL-22 tinham uma aparência histológica similar às orelhas no grupo tratado com IL-23 mostrado na Figura 26F e G, exibindo acantose acentuada e infiltração celular dérmica mista (Fig. 27G, H), incluindo muitos neutrófilos (setas) e alguns eosinófilos. Em contraste, orelhas tratadas com IL-20 tinham apenas acantose focai le- ve-moderada apenas com inflamação mista muito focai e moderada (Fig. 27D, E) em relação ao grupo tratado com PBS (Fig. 27C, F). Esses dados sugeriram que IL-22 é essencial para inflamação e acantose de pele induzi- das por IL-23.

EXEMPLO 19: Um anticorpo bloqueador anti-IL-22 reduziu significati- vamente acantose induzida por IL-23.

Para confirmar que IL-23 age através de IL-22 para induzir ca- racterísticas de pele psoriásica, o efeito do anticorpo monoclonal anti-IL-22 8E11 sobre inflamação e acantose dérmica induzidas por IL-23 ou PBS co- mo descrito acima (Exemplo 16), exceto que as injeções foram executadas por um período de 14 dias. Os camundongos também foram injetados intra- peritonealmente com 8E11 ou com anticorpo monoclonal de controle do iso- tipo IgGI em uma concentração de 200 Mg por camundongo e em uma fre- qüência de uma vez a cada dois dias por 14 dias. No dia 14, as orelhas dos camundongos foram coletadas para análise histológica usando coloração com H&E.

Como mostrado na Figura 29A, 8E11 ("mAb anti-IL-22") reduziu significativamente a acantose epidérmica induzida por IL-23 (*p < 0,001) em relação ao tratamento com anticorpo IgGI de controle (Compare também as Figuras 29D e E (mAb anti-IL-22) com BeC (lgG1 de controle)). Além disso, camundongos tratados com mAb anti-IL-22 também demonstraram uma di- minuição moderada na inflamação dérmica. Entretanto, camundongos trata- dos com mAb anti-IL-22 ainda apresentaram uma infiltração celular infIama- tória moderada quando comparados às peles de orelhas tratadas com PBS (Compare as Figs. 29D e E (mAb anti- IL-22) com FeG (PBS)). EXEMPLO 20: Acantose induzida por IL-23 foi significativamente redu- zida em camundongos deficientes em IL-22.

Para confirmar ainda mais que IL-23 age através de IL-22 para induzir características de pele psoriásica, o efeito de IL-23 sobre camundon- gos selvagens de deficientes em IL-22 foi examinado. Camundongos defici- entes em IL-22 (isto é, camundongos "knockout" para IL-22 homozigotos, referidos como "camundongos IL-22"7"") foram gerados por quebra gênica direcionada de acordo com a estratégia descrita na Figura 30A. Os éxons 1 - 4 (retângulos fechados) da seqüência codificante de IL-22 foram substituídos por um cassete de resistência a neomicina flanqueado por sítios de IoxP. Camundongos heterozigotos carregando o alelo condicional eram cruzados com uma linhagem transgênica na qual o promotor de protamina 1 (Prm) direcionou a recombinase Cre. O alelo condicional foi retirado durante a es- permatogênese em machos heterozigotos compostos (isto é, heterozigotos para o alelo condicional e para o transgene PrmCre). Os machos heterozigo- tos compostos foram acasalados a fêmeas selvagens, e a progênie resultan- te foi rastreada para o alelo retirado e a perda do transgene PrmCre. A prole foi retrocruzada em antecedentes de C57B1/6 por pelo menos seis gera- ções. Os genótipos de camundongo foram confirmados por PCR usando os iniciadores indicados na Figura 30B.

A expressão de IL-22 foi examinada aos níveis de mRNA e pro- teína nas células Th de camundongos selvagens e IL-227-/-. Expressão de mRNA de IL-22 foi examinada em células Th1, Th2, e Th|L -17 de camundon- gos selvagens ("+/+") e IL-22 ' ("-/-") (Figura 30C) usando RT-PCR1 confir- mando que mRNA de IL-22 não foi detectado em camundongos IL-22-/-. A expressão de IL-22, IL- 17, IFN-γ, e IL-4 foi examinada em células Th1, Th2,e ThiL-17 de camundongos selvagens ("WT") e IL-22-/- ("KO") usando E- LISA. Os resultados são mostrados na Figura 30D para cada um de IL-22, IL-17, IFN-γ, e IL-4, como indicado na ptécnica superior de cada gráfico, com barras preenchidas e barras abertas indicando níveis de expressão em ca- mundongos WT e KO, respectivamente. Adicionalmente, células T CD4 de camundongos IL-22-/- eram capazes de ser ativadas e se diferenciar em to- dos os subgrupos de auxiliares T e eram capazes de produzir níveis normais de IL-17, IFN-γ, e IL-4 em relação a células T CD4. Como esperado, entre- tanto, IL-22 estava ausente em células T CD4 IL-22-/-. Foi observado que camundongos IL-22'7" se desenvolveram normalmente e tinham uma compo- sição de linfócitos similar e desenvolvimento em todos órgãos linfóides prin- cipais quando comparado com camundongos selvagens (dados não mostra- dos).

Ninhadas de camundongos IL-22-/- e selvagens e foram injeta- das subcutaneamente na orelha com IL-23 ou PBS como descrito acima (E- xemplo 16). No dia 16, as orelhas dos camundongos foram analisadas por análise histológica de rotina. Como mostrado na Figura 31A e B, IL-23 indu- ziu significativamente menos perda de espessura da orelha e espessamento epidérmico em camundongos IL-22-/- em comparação com os grupos de con- trole (camundongos IL-22-/- são referidos nessa figura e na Figura 32 como "KO" ou "IL-22 KO"; camundongos selvagens são referidos nessa figura e na Figura 32 como "WT" ou "IL-22 WT"). Por coloração histológica, tanto acan- tose epidérmica como inflamação dérmica foram reduzidos significativamen- te em camundongos IL-22"7" (Figs. 31E e F, respectivamente) em compara- ção com ninhadas selvagens tratadas com IL-23 (Figs. 31C e D, respectiva- mente). Ao contrário desses resultados, deficiência de IL-22 não teve ne- nhum efeito sobre a inflamação de pele da orelha induzida por IL-22 (Figura 32.) Portanto, os dados mostram que IL-22 desempenha um papel crucial na inflamação dérmica e acantose epidérmica induzidas por IL-22, mas não por IL-12.

EXEMPLO 21: IL-23 induz produção de IL-22 a partir de vários linfócitos ativados por IL-23

Para investigar ainda mais a habilidade de IL-23 induzir IL-22, várias populações de linfócitos foram isoladas e estimuladas in vitro sob as condições indicadas na Figura 33. ELISA foi realizado para detectar IL-22 nos sobrenadantes de cultura e é relatado na Figura 23A como média ± des- vio padrão. A capacidade de IL-23 induzir citocinas da família de IL-10 dife- rentes de IL-22 também foi examinada. EsDlenocitos de camundonaos com TCR transgênico DO 11.10 foram estimulados com peptídeo OVA 0,3 μΜ sob condições de polarização de célula T auxiliar por 4 dias, e então manti- das em repouso por dois dias e re-estimuladas com anti-CD3 ligado a placa (10 Mg/ml) e anti-CD28 solúvel (5 pg/ml) por mais 2 dias. RT-PCR em tempo real foi realizado em RNA isolado de células sob as condições indicadas pa- ra quantificar expressão de mRNA de IL-19, IL-20 e IL-24 de camundongo. RNA de esplenócitos de camundongo normais também foi incluído como um controle. Como mostrado na Figura 33B, IL-23 não induziu expressão de nenhuma das outras citocinas da família de IL-10 testadas.

EXEMPLO 22: IL-22 é uma nova citocina efetora da linhagem de Thn_-17

Recentemente, IL-23 foi ligada ao desenvolvimento de uma nova linhagem de célula T CD4+ efetora produtora de IL-17 (ThiL-17) L. E. Harring- ton., Nat. Immunol6: 1123 (2005); H. Park., Nat. Immunol. 6:1133 (2005). IL- 23 é capaz de induzir as células da linhagem Th!L -17 a partir de células T CD4+ virgens na presença de APC e antígeno, mas é incapaz de iniciar a produção de IL-17 quando aplicadas a células T virgens purificadas ativadas com anti-CD3/anti-CD28. L.E. Harrington et ai, Nat. Immunol 6: 1123 (2005); M. Veldhoen et al, Immunity 24: 179 (2006). Além disso, TGF-β e IL-6 foram sugeridas como os fatores de novo para diferenciação do subgrupo de Thn.- 17. M. Veldhoen et al., Immunity 24: 179 (2006).

Foram realizados experimentos para testar se IL-22 poderia ser uma citocina de célula T efetora adicional induzida por IL-23 sob estímulo de TCR autêntico. Células T CD4+ de camundongos com TCR transgênico DO11.10 foram ativadas com peptídeo OVA 0,3 μΜ por quatro dias sob con- dições polarizantes de Th1 (IL-12 e anti-IL-4), polarizantes de Th2 (IL-4, anti- IL-12 e anti-IFN-y), polarizantes de ThlL-17 (IL-23, anti-IFN-y e anti-IL-4) ou de ThO (anti-IL 12/23 p40, anti-IFN-y e anti-IL-4) como descrito anteriormente (L. E. Harrington et al, Nat Immunol 6: 1123 (2005)). RNA foi extraído das células e PCR èm tempo real foi realizado para detectar a expressão de mRNA codificante de várias citocinas de murino (indicado acima nos gráficos na Figura 34A). Adicionalmente, ELISA foi realizado nos sobrenadantes de cultura para detectar a expressão de várias citocinas ao nível de proteína. Como mostrado na Figura 34A, IL-17 foi induzida por IL-23, enquanto que IFN- e IL-4 foram produzidos por células Th1 e Th2, respectivamente. IL-22 foi produzida, tanto nos níveis de mRNA e proteína a partir de células ThIL-17 produtoras de IL-17.

Para determinar se IL-22 é uma nova citocina efetora da linha- gem de ThIL-17 completamente comprometida, células T polarizadas como descrito acima, foram deixadas em repouso por dois dias e re-estimuladas por dois dias com anti-CD3 ligado a placa (10 µg/ml) e anti-CD28 solúvel (5 µg/ml) na ausência ou presença de IL-23. ELISA foi realizado para detectar a expressão de citocinas de murino indicadas acima nos gráficos na Figura 34B. Os resultados demonstram que IL-17 foi produzida especificamente a partir do subgrupo de Th|L-i7, mesmo na ausência de IL-23, e IL-23 aumen- tou a produção de IL-17. IL-23 não promoveu produção de IL-17 a partir de células Th1 e Th2 comprometidas. IL-22 demonstrou um padrão de expres- são idêntico a IL-17, indicando que IL-22 era uma verdadeira citocina efetora expressa por esse novo subgrupo de ThIL-i7· Anteriormente, o receptor de IL-23 foi relatado ser expresso so- bre células T ativadas/memória C. Parham etal, J Immunol 168:5699 (2002). Os experimentos acima não excluíram a possibilidade de que IL-23 tivesse agido sobre células T de memória para produzir IL-22. Para dirigir-se a isso de forma mais crítica, os estudos acima foram repetidos usando células T CD4+ virgens isoladas de camundongos com TCR transgênico DO 11.10. Especificamente, células T CD4+ de camundongos com TCR transgênico DO11.10 Rag2-/- foram estimuladas com células T alimentadoras esplênicas de BALB/c pulsadas com peptídeo OVA (irradiadas, com células T depleta- das) por 72 horas em condições de polarização de Th1 (IL-1-2 e anti-IL-4), condições de polarização de Th2 (IL-4, anti-IL-12 e anti-IFN- γ), polarização de ThlL-17 (IL-23, anti-IFN-γ e anti-IL-4), ou outras condições conforme indi- cado na Fig. 35A. Como mostrado nesta figura, células Th|L-17 produziram os níveis mais elevados de IL-22, enquanto que células Th1 também secreta- ram níveis detectáveis de IL-22. Além disso, a adição tanto de IFN-γ como IL-4 aboliu completamente a produção de IL-17; entretanto, essas duas cito- cinas inibiram apenas moderadamente a produção de IL-22 (Fig. 35A). Es- ses dados sugerem vias potencialmente diferentes para a indução da ex- pressão de IL-17 versus IL-22. Entretanto, células ThIL-17 completamente es- tabelecidas produziram tanto IL-17 como IL-22 por reestimulação por 48 ho- ras nas condições secundárias indicadas (Fig. 35B). IL-23 ainda reforçou os níveis dessas citocinas de uma maneira que não poderia ser bloqueada tan- to por IFN-γ como IL-4 (Fig. 35B). Esses dados confirmam a estabilidade dessa linhagem de ThIL-17.

Para investigar ainda mais se IL-17 e IL-22 são produzidas pe- las mesmas células durante ativação, as células ThiL-17 foram estimuladas com PMA e ionomicina, e anticorpos para IL-22 ou IL-17 foram usados para marcação intracelular. Como mostrado na Figura 35C, células produtoras de IL-17 foram principalmente observadas a partir do eixo de Th|L-17 (painel a esquerda). Células produtoras de IL-22 foram preferivelmente detectadas a partir da linhagem de Th|L-17 (painel a direita). Co-marcação para IL-22 e IL- 17 revelou que uma porção substancial de células da linhagem de Th|L-17 estava produzindo tanto IL-22 como IL-17 simultaneamente, indicando que IL-22 e IL-17 são produzidas a partir das mesmas células.

Como discutido acima, estudos recentes sugerem que outros fatores de APC podem ser a força direcionadora primária por trás da diferen- ciação de células T produtoras de IL-17 a partir de células T CD4+ virgens, já que IL-23 não induziu produção de IL-17 de novo a partir de células T CD4+ virgens (M. Veldhoen et ai, Immunity 24: 179 (2006)). Dois dos fatores críti- cos para a produção de IL-17 a partir de células T CD4+ foram identificados como TGF-β e IL-6. Id. Para determinar se esses fatores também eram críti- cos para a produção de IL-22 em camundongos, células T CD4+ virgens (>98%) foram estimuladas com anti-CD3 ligado a placa (10 pg/ml) e anti- CD28 solúvel (5 pg/ml). Compatível com dados publicados, TGF-β e IL-6, ao invés de IL-23, induziram a produção de IL-17 (Fig. 36A, painel à direita). Surpreendentemente, ao contrário da indução de IL-17, IL-22 foi induzida apenas na presença de IL-23 e não pôde ser induzida por TGF-β e IL-6 (Fi- gura 36A, painel à esquerda). Esses dados sugeriram que a transcrição de IL-17 e IL-22 poderia ser regulada diferentemente. Entretanto, como relatado anteriormente, TGF-β e IL-6 não foram capazes estabeleceram uma linha- gem de célula T produtora de IL-17 a longo prazo sem IL-23 (Fig. 36B). Os dados assim demonstram que IL-23 poderia ser um dos fatores primários que direcionam um subgrupo de célula T a produzir IL-22.

A seguir, examinou-se uma linhagem de célula T produtora de IL-22 similar poderia ser estabelecida a partir de células T CD4+. Descobriu- se que IL-23 pôde induzir secreção de IL-22 a partir de células T CD4+ hu- manas virgens estimuladas com anti-CD3/anti-CD28 sob condições de pola- rização de ThiL-17 (Fig. 36C, painel a esquerda). Essas células produziram IL- 22 por reestimulação sem a adição de IL-23 exógena novamente (Fig. 36C, painel à direita), indicando a formação de uma linhagem de célula T estável. Embora essas células tenham sido cultivadas sob condições similares como nos estudos de murino acima, não pudemos detectar produção de IL-17 a- cima do limite do ensaio (dados não mostrados).

Em conclusão, os dados estabeleceram pela primeira vez que IL-23 pode induzir um subgrupo de célula T produtora de IL-22 a partir de células T CD4+ virgens de murino e humanas. A produção IL-17 por essa linhagem depende de outros fatores ambientais. Enquanto que sob condi- ções estimuladoras de antígeno e de APC autênticas, IL-23 direcionou o subgrupo de células T a produzir tanto IL-22 como IL-17. IL-23 também es- timulou a produção de IL-22 quando células T virgens foram ativadas por anti-CD3 e anti-CD28. TGF-β e IL-6, que podem induzir produção transitória de IL-17 a partir de células T virgens, mas não comprometimento de linha- gem a longo prazo, falharam em direcionar a produção de IL-22.

EXEMPLO 23: IL-19, IL-20. e IL-24 também induzem espessamenro epi- dérmico

IL-22 pertence a uma família de citocinas que inclui IL-19, IL-20, e IL-24, todas as quais mostram expressão elevada em pele psoriásica. Es- sas citocinas também foram testadas para determinar se elas, como IL-22, são capazes de induzir hiperplasia epidérmica e acantose. RHE foi cultivada por quatro dias e tratada com IL-19, IL20, IL- 22, ou IL-24 a 20 ng/ml ou EGF a 6 ng/ml. A RHE tratada foi corada com H&E. Os resultados são mostrados na Figura 37A. Todas as citocinas induziram acantose da epiderme nucleada viável, como mostrado pelo tamanho aumentado das setas de ponta fita. Compatível com observações anteriores (acima), IL-22 induziu hipogranulo- se, ou uma diminuição na camada de célula granular (pontas das setas), assim como hialinização do estrato córneo inferior (asteriscos). IL-22 tam- bém induziu paraqueratose em RHE cultivada por 7 dias (dados não mostra- dos). Hipogranulose e paraqueratose são características clínicas freqüente- mente observadas de psoríse. IL-19, IL-22, e IL-24 induziram apenas acan- tose epidérmica com pouco ou nenhum efeito aparente sobre a camada de célula granular ou do estrato córneo. EGF induziu acantose epidérmica com hipergranulose e compactação dos queratinócitos dentro do estrato granulo- so (setas). Espessamento epidérmico induzido por IL-19, IL20, IL-22, ou IL- 24 foi quantificado em um experimento independente e está representado graficamente na Figura 38. IL-22 teve o maior efeito. As citocinas inflamató- rias TNF-a, IFN-γ, e IL-Ιβ, que se acredita que desempenhem um papel na psoríase, não estimularam proliferação de queratinócitos nesse sistema de RHE (dados não mostrados). Dessa forma, essas citocinas podem desem- penhar um papel secundário na psoríase ou podem desempenhar um papel através de uma via independente de IL-19, IL-20, IL-22, e/ou IL -24.

Imunohistoquímica foi usada para detectar citoqueratina 16 (CK16), um marcador de hiperplasia epidérmica. IL-24, IL-22, e EGF induzi- ram expressão de CK16 através de epiderme não cornificada, enquanto que IL-19 e IL-20 induziram apenas expressão de CK16 na zona basal (Figura 37B.)

Imunohistoquímica também foi usada para detectar psoriasina (S100A7), uma de várias proteínas da família de S100 reguladas positiva- mente em certas condições de pele hiperproliferativas e inflamatórias, inclu- indo psoríase. IL-19, IL-20, IL-22, e IL-24 induziram expressão de S100A7 na epiderme suprabasal, com IL-22 e IL-24 tendo o maior efeito. (Figura 37C). Marcação para S100A7 foi observada no núcleo o no citoplasma de queratinócitos, com alguma proteína também parecendo ser extracelular. Os resultados mostrados nas Figuras 37B e C foram quantificados e apresenta- dos graficamente na Figura 37E e F.

Imunohistoquímica também foi usada para detectar pY(705)- STAT3, o forma de transativação de STAT3. STAT3 ativada foi mostrada estar elevada em pele de lesão psoriásica. IL-19, IL-20, IL-22 e IL-24 induzi- ram ativação de STAT3 persistente em queratinócitos de RHE encontrados em todas as camadas de células viáveis, demonstrado por sua localização nuclear (Figura 37D).

EXEMPLO 24: Anticorpos bloqueadores de receptores para IL-20 e IL- 22 reduzem a expressão de psoriasina

Tanto IL-19 como IL-20 sinalizam através de um heterodímero receptor de IL20Ra e IL20 Rb. IL20 também sinaliza através de um hetero- dímero receptor de IL-22R e IL-20Rb. IL-22 sinaliza através de um heterodí- mero de IL-22R e IL10R2. A expressão na superfície celular desses compo- nentes de receptor sobre queratinócitos isolados de RHE ou de culturas pri- márias de queratinócitos epidérmicos humanos normais (NHEK, de prepúcio neonatal doado) foi examinada por citometria de fluxo. Os seguintes anticor- pos monoclonais foram usados para citometria de fluxo: anti-IL20Ra (gerado em camundongo para os propósitos desse estudo); anti-IL20Rb (gerado em camundongo para os propósitos desse estudo); anticorpo 7E9 anti-IL-22R (descrito acima); e FAB874P anti-IL-10R2 (conjugado a PE) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Os resultados são mostrados na Figura 39. O componen- te de receptor ao qual cada anticorpo se liga é mostrado na porção superior direita de cada gráfico (IL-22R é designado como MIL-22R1"). IL-20Rb e IL10R2 foram consistentemente expressas sobre a superfície de NHEKs, independentemente de confluência, número de passagens ou níveis de cál- cio no meio (Figura 39A). Em contraste, a expressão na superfície celular tanto de IL-20Ra como de IL-22R1 sobre NHEK1 variou de doador para doa- dor e foi consistente em um nível relativamente baixo, mas detectável. (Figu- ra 39 A e dados não mostrados). Comparado a níveis de expressão em NHEK em monocamada, IL-20Ra e IL-22R foram expressas em níveis muito mais altos em queratinócitos isolados de RHE (Figura 39B). As razões para essa diferença são desconhecidas. Entretanto, é claro que todos os compo- nentes de receptor analisados são expressos sobre queratinócitos humanos. A expressão desses componentes de receptores sobre células imunes (célu- las T, células B, células natural killere monócitos) não foi detectada. (Dados • não mostrados). Assim, os Iigantes para esses componentes de receptor provavelmente fornecem uma ligação entre o sistema imune e anormalida- des de queratinócitos.

Para examinar se os anticorpos acima poderiam bloquear os efeitos do tratamento com IL-19, IL-20, e IL-22, como descrito no Exemplo anterior, 20 microgramas/ml de anti-IL20Ra, anti-IL20Rb ou anti-IL22R foram adicionadas ao meio de cultura de RHE uma hora antes da adição de 20 ng/ml de IL-19, IL-20, ou IL-22. RHE foi então cultivada por quatro dias, com o meio trocado no dia dois (4,5 ml de meio fresco incluindo citocina e anti- corpo). A RHE foi então corada por imuno-histoquímica para psoriasina (S100A7). Os resultados são mostrados na Figura 40. RHE tratadas com IL- 19, IL-20, e IL-22 são mostradas na primeira, segunda e terceira colunas, respectivamente. RHE pré-tratadas com anti-IL20Ra (alL-20Ra), anti-IL20Rb (alL-20Rb), ou anti-IL-22R (alL-22R1) são mostradas na terceira, quarta e quinta colunas, respectivamente. Controles sem anticorpo e controle isotípi- co são mostrados na primeira e segunda colunas.

Os resultados mostram que tanto anti-IL20Ra quanto anti- IL20Rb bloqueiam eficazmente a expressão de psoriasina induzida por IL- 19. Similarmente, anti-IL-22R bloqueou eficazmente a expressão de psoria- sina induzida por IL-22. Anti-IL20Rb bloqueou eficazmente a expressão de psoriasina induzida por IL-20, mas anti-IL-20Ra não. Similarmente, anti-IL- 22R foi incapaz de bloquear a expressão de psoriasina induzida por IL-20.

Para investigar ainda mais os efeitos de anti-IL-22R e anti- IL20Ra sobre a expressão de psoriasina induzida por IL-20, RHE foi pré- tratada com aqueles anticorpos tanto isoladamente quanto em combinação, antes do tratamento com IL-20. Os resultados são mostrados na Figura 41. Como descrito acima, tanto anti-IL-22R quanto IL-20Ra sozinhos foram in- capazes de bloquear a expressão de psoriasina induzida por IL-20 (segunda coluna, ambos os painéis). Entretanto, a combinação de ambos anti-IL20Ra e anti-IL-22R bloqueou eficazmente a expressão de psoriasina induzida por IL-20, sugerindo que IL-20Ra e IL-22R tem papéis complementares na sina- lização de IL-20 em queratinócitos humanos (painel inferior esquerdo).

EXEMPLO 25: IL-19, IL-20, IL-22 e IL-24 induzem perfis de expressão gênica similares

Para identificar os genes induzidos por IL-19, IL-20, IL-22 e IL- 24, RHE foi tratada com 20 ng/ml de IL-19, IL-20, IL-22 ou IL-24 por quatro dias. RNA foi preparado e cDNA foi hibridizado a Affymetrix U133 Plus Gene Chips (Affymetrix, Santa Clara, CA), que contém 54.675 conjuntos de sonda. Os dados foram analisados para genes cuja expressão estava aumentada em pelo menos 2 vezes. IL-20, IL-22, e IL-24 mostraram perfis de expressão gênica similares. Dos 20 genes mais comumente expressos por IL-20, IL-22, e IL-24, sete eram genes previamente relatados como estando associados com psoríase. Esses genes são psoriasina (S100A7), S100A12, SCCA2, SERPINB4, CCL20, CD36, e Stat3. Para examinar que genes induzidos por IL-20, IL-22, e IL-24 mostram regulação positiva na psoríase, as análises de microarranjos des- critas acima foram comparadas com um estudo anterior de microarranjo de pele psoriásica (Zhou et al. (2003) Physiol. Genomics 13:69-78). Como esse estudo foi realizado usando um chip de microarranjo diferente, apenas ref- seqs em comum entre esse estudo e o presente estudo foram comparadas. Das 468 refseqs que eram reguladas positivamente na pele psoriásica, 356 foram induzidas por por IL-20, IL-22, e IL-24 e 188 delas foram significativas (p < 0,05). Considerados juntos, os estudos acima demonstram superposi- ção substancial entre genes que são induzidos por IL-20, IL-22, e IL-24 e genes que são regulados positivamente na pele psoriásica.

EXEMPLO 26: Depósito de Materiais

A seguinte linhagem celular de hibridoma foi depositada na Ame- rican Type Çulture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 201 ΙΟ- 2209 USA (ATCC):

Designação de Hibridoma/Anticorpo ATCC No. Data do Depósito

Anti- L-22 (3F11.3) PTA-7312 13 de Janeiro de 2006

Anti- L-22 (11 H4.4) PTA-7315 13 de Janeiro de 2006

Anti- L-22 (8E11.9) PTA-7319 13 de Janeiro de 2006

Anti- L-22R (7E9.10.8) PTA-7313 13 de Janeirode 2006

Anti- L-22R (8A12.32) PTA-7318 13 de Janeiro de 2006

Anti- L-22R (8H 11.32.28) PTA-7317 13 de Janeiro de 2006

Esse depósito foi feito sob as cláusulas do Tratado de Budapes- te sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e as Regulamenta- ções sob ele (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável por 30 anos a partir da data do depósito. A linhagem celular será tornada disponibilizada pela ATCC sob os termos do Tratado de Buda- peste e submetida ao acordo entre Genentech, Inc. e ATCC, que assegura (a) que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência do pedido de patente para aquele determinado pelo Responsável a ser nomeado a ele sob 37 CFR §1.14 e 35 USC §122, e (b) que todas as restrições sobre a dis- ponibilidade ao público da cultura assim depositada será irrevogavelmente removida após a concessão da patente.

O cessionário do presente pedido concordou que se a cultura em depósito morrer ou for perdida ou destruída quando cultivada sob condi- ções adequadas, ela será prontamente resposta mediante notificação com um espécime viável da mesma cultura. A disponibilidade da linhagem celular depositada não deve ser considerada como uma licença para a prática da invenção em contradição aos direitos garantidos sob a autoridade de qual- quer governo de acordo com as leis de patente.

A especificação escrita anterior é considerada suficiente para permitir que um versado na técnica pratique a invenção. A presente inven- ção não deve estar limitada em escopo pelo material depositado, já que a modalidade depositada é pretendida como uma única ilustração de certos aspectos da invenção e quaisquer constructos que forem funcionalmente equivalente estão dentro do escopo dessa invenção. O depósito do material aqui contido não constitui uma admissão de que a descrição escrita aqui contida é inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto da inven- ção, incluindo o melhor modo desta, nem deve ser considerado como Iimi- tante do escopo das reivindicações às ilustrações específicas que ele repre- senta. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui se tornarão claras para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e estão dentro do escopo das reivindicações anexas. Listagem de seqüência

<110> GENENTECH, INC. Chen, Yvonne M. Chuntharapai, Anan Danilenko, Dimitry Ouyang, Wenjun Sal Susan Valdez, Patricia wong, Terence Wu1 Jianfeng Zheng, Van

<120> COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS E DE- SORDENS ASSOCIADAS COM A SINALIZAÇÃO DE CITOCINA".

<130> P2293R1 PCT

<141> 2006-11-30

<150> US 60/741,640

<151> 2005-12-02

<150> US 60/822,597

<151> 2006-08-16

<160> 4

<210> 1

<211> 1152

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cttcagaaca ggttctcctt ccccagtcac cagttgctcg agttagaatt 50 gtctgcaatg gccgccctgc agaaatctgt gagctctttc cttatgggga 100 ccctggccac cagctgcctc cttctcttgg ccctcttggt acagggagga 150 gcagctgcgc ccatcagctc ccactgcagg cttgacaagt ccaacttcca 200 gcagccctat atcaccaacc gcaccttcat gctggctaag gaggctagct 250 tggctgataa caacacagac gttcgtctca ttggggagaa actgttccac 300 ggagtcagta tgagtgagcg ctgctatctg atgaagcagg tgctgaactt 350 cacccttgaa gaagtgctgt tccctcaatc tgataggttc cagccttata 400 tgcaggaggt ggtgcccttc ctggccaggc tcagcaacag gctaagcaca 450 tgtcatattg aaggtgatga cctgcatatc cagaggaatg tgcaaaagct 500 gaaggacaca gtgaaaaagc ttggagagag tggagagatc aaagcaattg 550 gagaactgga tttgctgttt atgtctctga gaaatgcctg catttgacca 600 gagcaaagct gaaaaatgaa taactaaccc cctttccctg ctagaaataa 650 caattagatg ccccaaagcg atttttttta accaaaagga agatgggaag 700 ccaaactcca tcatgatggg tggattccaa atgaacccct gcgttagtta 750 caaaggaaac caatgccact tttgtttata agaccagaag gtagactttc 800 taagcataga tatttattga taacatttca ttgtaactgg tgttctatac 850 acagaaaaca atttattttt taaataattg tctttttcca taaaaaagat 900 tactttccat tcctttaggg gaaaaaaccc ctaaatagct tcatgtttcc 950 ataatcagta ctttatattt ataaatgtat ttattattat tataagactg 1000 cattttattt atatcatttt attaatatgg atttatttat agaaacatca 1050 ttcgatattg ctacttgagt gtaaggctaa tattgatatt tatgacaata 1100 attatagagc tataacatgt ttatttgacc tcaataaaca cttggatatc 1150

cc 1152

<210> 2 <211> 179 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 2

Met Ala Ala Leu Gln Lys ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr 1 5 10 15

Leu Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly 20 25 30

Gly Ala Ala Ala Pro Ile Ser ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser 35 40 45

Asn Phe Gln Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met-Leu Ala 50 55 60

Lys Glu Ala ser Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile 65 70 75

Gly Glu Lys Leu Phe His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr 80 85 90

Leu Met Lys Gln Val Leu Asn Phe Thr Leu Glu Glu vai Leu Phe 95 100 105

Pro Gln ser Asp Arg Phe Gln Pro Tyr Met Gln Glu Val vai Pro 110 115 120

Phe Leu Ala Arg Leu ser Asn Arg Leu Ser Thr Cys His Ile Glu 125 130 135

Gly Asp Asp Leu His lie Gln Arg Asn vai Gln Lys Leu Lys Asp 140 145 150

Thr vai Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile Lys Ala Ile Gly 155 160 165

Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met ser Leu Arg Asn Ala Cys Ile 170 175

<210> 3 <211> 574 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Arq Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly ser Leu Ala Ala 15 10 15

His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe 20 25 30

Gln Ser ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro 35 40 45

Glu Gly Thr Pro Asp Thr vai Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr 50 55 60

Gly Glu Arg Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr 65 70 75

Arg Lys ser Cys Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu 80 85 90

Leu Tyr Tyr Ala Arg Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser 95 100 105

Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg Phe Ser ser Leu Gln His Thr Thr 110 115 120

Leu Lys Pro Pro Asp vai Thr Cys Ile ser Lys Val Arg ser Ile 125 130 135

Gln Met lie Val His Pro Thr Pro Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp 140 145 150

Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe His Asp Leu Phe Tyr 155 160 165

His Leu Glu Leu Gln vai Asn Arg Thr Tyr Gln Met His Leu Gly 170 175 180

Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr Pro Asp Thr 185 190 195

Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys vai Pro Thr Trp Ala Lys 200 205 210

Glu ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp Arg . 215 220 225

Thr Trp Thr Tyr Ser Phe ser Gly Ala Phe Leu Phe ser Met Gly 230 235 240

Phe Leu Val Ala vai Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr vai Thr 245 250 255

Lys Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu 260 265 270

Thr Phe Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro 275 280 285

vai Phe Asp Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro vai Gln 290 295 300 Tyr Ser Gln Pro Gln Arg Asp Ile Ser Leu Ser Pro Pro Pro Ser Phe Tyr Ala Ala Pro Gln Cys Met Glu Ser Pro Lys Pro Ala Gly Thr Ser Leu

Ile Arg vai 305

His Ser Leu 320

lie Leu Gln 335

Leu ser Tyr 350

Tyr Ala Pro 365

Pro Gln Ala 380

Ala Thr Pro 395

Gly Ser Gly 410

His Leu Arg 425

Ser Cys Met 440

Ala Met Glu 455

Gly lie Cys 470

Leu His Ser Leu Pro Leu Leu Pro Leu Gly Pro Ser Asp Glu Ala Pro Thr Glu Gln Trp Glu

Gly Glu Glu 485

Leu Ser ser 500

Gln Pro Pro 515

Pro Trp Gly 530

Lys Ser Pro 545

Leu Asp Ser 560

Ser

Ser Gly Pro Arg Glu 310

Ser Glu Ile Thr Tyr 325

Pro Ser Asn vai Pro 340

Ala Pro Asn Ala Ala 355

Gln Val Thr Pro Glu 370

Ile Ser Lys vai Gln 385

Asp Ser Trp Pro Pro 400

Lys Asp Ser Pro Thr 415

Pro Lys Gly Gln Leu 430

Leu Gly Gly Leu Ser 445

Glu Ser Gln Glu Ala 460

Thr Asp Arg Thr Ser 475

Gly Thr Pro Gln Tyr 490

vai Gln Ile Glu Gly 505

Ser Gly Pro Cys Ser 520

Leu Leu Glu Ser Leu 535

Ala Pro Glu Thr Ser 550

Leu Phe Arg Gly Leu 565

Pro Ala Gly Ala 315

Leu Gly Gln Pro 330

Pro Pro Gln lie 345

Pro Glu Val Gly 360

Ala Gln Phe Pro 375

Pro ser ser Tyr 390

Ser Tyr Gly Val 405

Gly Thr Leu Ser 420

Gln Lys Glu Pro 435

Leu Gln Glu vai 450

Lys Ser Leu His 465

Asp Pro Asn Val 480

Leu Lys Gly Gln 495

His Pro Met Ser 510

Pro Ser Asp Gln 525

Val cys pro Lys 540

Asp Leu Glu Gln 555

Ala Leu Thr vai 570

<210> 4 <211> 263 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 4

Met Met Pro Lys His Cys Phe Leu Gly Phe Leu lie Ser Phe Phe

1 5 10 15

Leu Thr Gly vai Ala Gly Thr Gln Ser Thr His Glu Ser Leu Lys

20 25 30

Pro Gln Arg vai Gln Phe Gln Ser Arg Asn Phe His Asn Ile Leu

35 40 45

Gln Trp Gln Pro Gly Arg Ala Leu Thr Gly Asn Ser Ser Val Tyr

50 55 60

Phe Val Gln Tyr Lys Ile Met Phe Ser Cys Ser Met Lys Ser ser

65 70 75

His Gln Lys Pro Ser Gly Cys Trp Gln His Ile Ser Cys Asn Phe

80 85 90

Pro Gly Cys Arg Thr Leu Ala Lys Tyr Gly Gln Arg Gln Trp Lys

95 100 105

Asn Lys Glu Asp Cys Trp Gly Thr Gln Glu Leu Ser Cys Asp Leu

110 115 120

Thr Ser Glu Thr Ser Asp Ile Gln Glu Pro Tyr Tyr Gly Arg Val

125 130 135

Arg Ala Ala Ser Ala Gly Ser Tyr Ser Glu Trp ser Met Thr Pro

140 145 150

Arg Phe Thr Pro Trp Trp Glu Thr Lys Ile Asp Pro Pro vai Met

155 160 165

Asn Ile Thr Gln vai Asn Gly Ser Leu Leu Val Ile Leu His Ala

170 175 180

Pro Asn Leu Pro Tyr Arg Tyr Gln Lys Glu Lys Asn vai Ser Ile

185 190 195

Glu Asp Tyr Tyr Glu Leu Leu Tyr Arg vai Phe Ile Ile Asn Asn

200 205 210

Ser Leu Glu Lys Glu Gln Lys vai Tyr Glu Gly Ala His Arg Ala

215 220 225

vai Glu Ile Glu Ala Leu Thr Pro His Ser Ser Tyr Cys Val Val

230 235 240

Ala Glu Ile Tyr Gln Pro Met Leu Asp Arg Arg Ser Gln Arg Ser

245 250 255

Glu Glu Arg Cys Val Glu Ile Pro 260

Claims

1. Anticorpo que se liga especificamente a IL-22, em que o anti- corpo é (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a par- tir de 3F11.3 (No. de acesso ATCC PTA-7312), hibridoma 11H4.4 (No. de acesso ATCC PTA-7315), e hibridoma 8E11.9 (No. de Acesso ATCC PTA-7319); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c).

2. Anticorpo que se liga especificamente a IL-22R, em que o an- ticorpo e (a) um anticorpo produzido por um hibridoma selecionado a par- tir de 7E9 (No. de Acesso ATCC PTA-7313), hibridoma 8A12 (No. de Acesso ATCC PTA-7318), e hibridoma 8H11 (No. de Acesso ATCC PTA-7317); (b) uma forma de afinidade madura do anticorpo de (a); (c) um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo de (a) ou (b); ou (d) uma forma humanizada do anticorpo de (a), (b), ou (c).

3. Método de tratar uma desordem autoimune, em que a desor- dem autoimune não é artrite, o método compreendendo administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que com- preende um antagonista de IL-22.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o antagonis- ta de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo que se liga especificamente a IL-22 é um anticorpo como definido na reivin- dicação 1.

6. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o antagonis- ta de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22R.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o anticorpo que se liga especificamente a IL-22R é um anticorpo como definido na rei- vindicação 2.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o antagonis- ta de IL-22 é IL-22BP.

9. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a desordem autoimune é doença intestinal inflamatória.

10. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a desor- dem autoimune é psoríase.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, compreendendo adicionalmente pelo menos um anticorpo selecionado a partir de um anticor- po que se liga especificamente a IL20Ra, um anticorpo que se liga especifi- camente a IL-22R.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL- 22R.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, compreendendo adicionaimente administrar peio menos um anticorpo selecionado a partir de um anticorpo que se liga especificamente a IL-22, um anticorpo que se liga especificamente a IL20Ra, e um anticorpo que se liga especificamente a IL20Rb.

15. Método de tratar inflamação, em que a inflamação não é in- flamação artrítica, o método compreendendo administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica que compreende um antagonista de IL-22.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o anticor- po que se liga especificamente a IL-22 é um anticorpo como definido na rei- vindicação 1.

18. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL- 22R.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o anticor- po que se liga especificamente a IL-22R é um anticorpo como definido na reivindicação 2.

20. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o anta- gonista de IL-22 é IL-22BP.

21. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a infla- mação é inflamação autoimune.

22. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a infla- mação é inflamação de pele.

23. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a infla- mação é inflamação crônica.

24. Um método de inibir progressão tumoral, o método compre- endendo administrar a um mamífero uma quantidade eficaz de uma formula- ção farmacêutica que compreende um antagonista de IL-22.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o anticor- po que se liga especificamente a IL-22 é um anticorpo como definido na rei- vindicação 1.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL- 22R.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o anticor- po que se liga especificamente a IL-22R é um anticorpo de como definido na reivindicação 2.

29. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o anta- gonista de IL-22 é IL-22BP.

30. Método de estimular um via de sinalização mediada por IL- -23 em um sistema biológico, o método compreendendo fornecer um agonis- ta de IL-22 ao sistema biológico.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o agonis- ta de IL-22 é IL-22.

32. Método de inibir uma via de sinalização mediada por IL-23 em um sistema biológico, o método compreendendo fornecer um antagonis- ta de IL-22 ao sistema biológico.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22R.

35. Um método de estimular a função de uma célula ThIL-17, o método compreendendo expor uma célula ThIL-17 a um agonista de IL-22.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o agonis- ta de IL-22 é IL-22.

37. Método de inibir a função de uma célula ThIL-17, o método compreendendo expor uma célula ThIL -17 a um antagonista de IL-22.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22.

39. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o anta- gonista de IL-22 é um anticorpo que se liga especificamente a IL-22R.