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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung ist auf neuartige, gereinigte und isolierte IL-1 zeta,
IL-1 zeta Spleißvarianten
und Fragmente davon, auf Nukleinsäuren, welche solche Polypeptide
kodieren, auf Verfahren für
die Herstellung rekombinanter Formen solcher Polypeptide, auf gegen
diese Polypeptide erzeugte Antikörper,
auf von diesen Polypeptiden abgeleitete fragmentierte Peptide, und
auf Verwendungen davon gerichtet.
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Beschreibung des Standes
der Technik
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Interleukin-1
(IL-1) ist ein Mitglied einer großen Gruppe von Cytokinen, deren
primäre
Aufgabe Immun- und entzündliche
Antworten zu vermitteln ist. Es gibt fünf bekannte IL-1 Familienmitglieder,
welche IL-1 Alpha (IL-1α),
IL-1 Beta (IL-1β),
IL-1 Rezeptorantagonist (IL-1
ra), IL-1 Delta (IL-1δ – wie in
WO99/35268 offenbart), und IL-18 (bisher als IGIF und manchmal als
IL-1 Gamma bekannt). IL-1, welches von Makrophagen abgesondert wird,
ist eigentlich eine Mischung aus größtenteils IL-1β und etwas
IL-1α (Abbas
et al., 1994). IL-1α und IL-1β, welche
zuerst als 33 kD Vorläufer,
denen eine Signalsequenz fehlt, produziert werden, werden durch proteolytische
Spaltung weiter bearbeitet, um die abgesonderten, aktiven Formen,
mit jeweils etwa 17 kD zu erzeugen. Zusätzlich ist auch der 33 kD Vorläufer von
IL-1α aktiv.
Beide IL-1 Formen sind die Produkte von zwei unterschiedlichen Genen,
die auf Chromosom 2 lokalisiert sind. Obwohl die zwei Formen weniger
als 30 Prozent homolog zueinander sind, binden sie beide an denselben
Rezeptor und weisen eine ähnliche
Aktivität auf.
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Die
IL-1 Ligandenfamilie bindet an einen gewöhnlichen Rezeptor, der aus
einer Ligandenbindungskette, dem Typ I IL-1 Rezeptor (IL-1RI), und
einer notwendigen Signalgebungskomponente, und dem IL-1R Hilfsprotein
(AcP: accessory protein) besteht (Sims et al. 1988; Greenfeder et
al. 1995; Cullinan et al. 1998). Ein Typ II IL-1 Rezeptor (IL-1RII)
bindet und sondert den Agonist IL-1 (insbesondere IL-1β) ab, ohne
von sich aus irgendeine Signalantwort auszulösen (McMahan et al. 1991; Sims
et al. 1993; Colotta et al. 1993; Colotta et al. 1994). IL-1 Liganden
können
auch an ein lösliches
proteolytisches IL-1RII Fragment (sIL-1RII) binden (Colotta et al., 1993).
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IL-1ra,
eine biologisch inaktive Form von IL-1, ist zu IL-1 strukturell
homolog. IL-1ra wird mit einer Signalsequenz hergestellt, welche
die wirksame Sekretion in die extrazelluläre Region ermöglicht (Abbas
et al., 1994). Zusätzlich
bindet IL-1ra an den Typ I IL-1 Rezeptor, versagt jedoch die nachfolgende
Interaktion mit AcP zu bewirken. Folglich blockiert IL-1ra IL-1RI
und verhindert die Wirkung des Agonisten IL-1 (Hannum et al. 1990;
Eisenberg et al. 1990).
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Die
Hauptquelle von IL-1 ist der aktivierte Makrophage oder der mononukleäre Phagozyt.
Zu anderen IL-1 produzierenden Zellen zählen Epithel- und Endothelzellen
(Abbas et al., 1994). Die IL-1 Sekretion aus Makrophagen tritt auf,
nach dem die Makrophagen mit Gram-negativen Bakteria zusammenstoßen und
diese aufnehmen. Solche Bakteria enthalten Lipopolysaccharid (LPS)-Moleküle, auch
als Endotoxin bekannt, in der bakteriellen Zellwand. LPS Moleküle sind
die aktiven Komponenten, die Makrophagen stimulieren, um Tumornekrosefaktor
(TNF) und IL-1 zu
erzeugen. In diesem Fall wird IL-1 als Antwort auf LPS und der TNF-Produktion
erzeugt. Bei niederen Konzentrationen stimuliert LPS Makrophaten
und aktiviert B-Zellen und andere Wirtsantworten, die benötigt werden,
um die bakterielle Infektion zu eliminieren; bei hohen Konzentrationen kann
LPS jedoch schwere Gewebeschädigung,
Schock und sogar den Tod hervorrufen.
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Zu
den biologischen Funktionen von IL-1 zählen das Aktivieren von vaskulären Endothelzellen
und Lymphozyten, die lokale Gewebezerstörung, und Fieber (Janeway et
al., 1996). Bei niederen Konzentrationen stimuliert IL-1 Makrophagen
und vaskuläre
Endothelzellen, um IL-6 zu erzeugen, reguliert Moleküle auf der Oberfläche von
vaskulären
Endothelzellen hinauf, um die Leukozytenadhäsion zu erhöhen, und aktiviert indirekt
entzündliche
Leukozyten, indem mononukleäre
Phagozyten und andere Zellen stimuliert werden, um bestimmte Chemokine
zu erzeugen, die entzündliche
Leukozyten aktivieren. Zusätzlich
ist IL-1 an anderen entzündlichen
Reaktionen beteiligt, wie etwa der Induktion von Prostaglandinen,
Stickoxidsynthase, und Metalloproteinasen. Diese IL-1 Funktionen
sind während
mikrobiellen Infektionen auf niedrigem Niveau ausschlaggebend. Wenn
jedoch die mikrobielle Infektion eskaliert, wirkt IL-1 durch Induzieren
von Fieber, Stimulieren mononukleärer Phagozyten, um IL-1 und
IL-6 herzustellen, Erhöhen
der Produktion von Serumproteinen aus Hepatozyten, und Aktivieren
des Koagulationssystems systematisch. Zusätzlich ruft IL-1 nicht die
hämorrhagische
Nekrose von Tumoren hervor, unterdrückt die Knochenmark-Stammzellenteilung,
und IL-1 ist bei hohen Konzentrationen für Menschen tödlich.
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Angesichts
der wichtigen Funktion von IL-1, gibt es einen Bedarf zusätzliche
Mitglieder der IL-1 Ligandenfamilie und der IL-1 Rezeptorfamilie
zu identifizieren. In Anbetracht des anhaltenden Interesses an der
Proteinforschung und des Immunsystems sind weiters die Entdeckung,
Identifizierung und Aufgaben von neuen Proteinen und ihrer Inhibitoren
an der vordersten Stelle der modernen Molekularbiologie und Biochemie.
Trotz des wachsenden Wissens gibt es nach wie vor einen Bedarf im
Fachgebiet, die Identität
und Funktion von Proteinen, die an zellulären und Immunreaktionen beteiligt
sind, zu entdecken.
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In
einem anderen Aspekt ist die Identifizierung der Primärstruktur,
oder Sequenz, eines unbekannten Proteins der Höhepunkt eines anstrengenden
Experimentierungsvorgangs. Um ein unbekanntes Protein zu identifizieren
kann der Forscher auf einen Vergleich des unbekannten Proteins mit
bekannten Peptiden unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken,
die Fachleuten bekannt sind, angewiesen sein. Zum Beispiel werden
Proteine routinemäßig unter
Verwendung von Techniken wie Elektrophorese, Sedimentation, Chromatographie,
Sequenzierung und Massenspektroskopie analysiert.
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Insbesondere
die einzigartige Natur der Zusammensetzung eines Proteins in Bezug
auf die spezifischen Aminosäurebestandteile
führt zu
einer einzigartigen Positionierung von Spaltstellen innerhalb des
Proteins. Die spezifische Fragmentierung eines Proteins durch chemische
oder enzymatische Spaltung führt
zu einem einzigartigen „Peptid-Fingerprint" (D. W. Cleveland
et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977; M. Brown et al.,
J. Gen. Virol. 50: 309–316,
1980). Infolgedessen führt
die Spaltung an spezifischen Stellen zu einer reproduzierbaren Fragmentierung
eines gegebenen Proteins in Peptide mit einem bestimmten Molekulargewicht.
Weiters besitzen diese Peptide einzigartige Ladungscharakteristika,
die den isoelektrischen pH des Peptids bestimmen. Diese einzigartigen
Charakteristika können
unter Verwendung einer Vielzahl von elektrophoretischen und andren
Techniken ausgenutzt werden (Brock et al., Biology of Microorganisms,
S. 76–77, Prentice
Hall 6. Ausgabe, 1991). Die Fragmentierung von Proteinen wird weiters
für die
Aminosäure-Zusammensetzungsanalyse
und Proteinsequenzierung verwendet (P. Matsudiara, J. Biol. Chem.
262: 10035–10038, 1987;
C. Eckerskorn et al., Elektrophoresis 9: 830–838, 1988), insbesondere die
Herstellung von Fragmenten von Proteinen mit einem „blockierten" N-Terminus. Zusätzlich können fragmentierte
Proteine für
die Immunisierung, für
die Affinitätsselektion
(R. A. Brown, U.S. Patent No. 5.151.412), für die Bestimmung der Modifikationsstellen
(z.B. Phosphorylierung), für
die Herstellung von aktiven, biologischen Verbindungen (Brock et
al., Biology of Microorganisms, S. 300–301, Prentice Hall 6. Ausgabe,
1991), und für
die Unterscheidung von homologen Proteinen (M. Brown et al., J.
Gen. Virol. 50: 309–316,
1980) verwendet werden.
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Wenn
ein Peptid-Fingerprint eines unbekannten Proteins erhalten wird,
kann es zusätzlich
mit einer Datenbank von bekannten Proteinen verglichen werden, um
bei der Identifizierung des unbekannten Proteins mittels Massenspektrometrie
zu helfen (W. J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011–5010, 1993; D.
Fenyo et al., Elektrophoresis 19: 998–1005, 1998). Eine Vielzahl
von Computer-Softwareprogrammen sind über das Internet zugänglich,
um diese Vergleiche zu erleichtern, wie z.B. Protein Prospector
(Internetseite: prospector.uscf.edu), MultiIdent (Internetseite:
www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Internetseite:
www.mann.embl-heidelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearchForm.html)
und ProFound (Internetseite www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/protid-frag.html).
Die Programme ermöglichen
dem Benutzer das Spaltungsmittel und die Molekulargewichte der fragmentierten
Peptide innerhalb einer vorgesehenen Toleranz zu spezifizieren.
Die Programme vergleichen diese Molekulargewichte zu Protein-Molekulargewicht-Informationen,
die in Datenbanken gespeichert sind, um beim Bestimmen der Identität des unbekannten
Proteins zu helfen. Genaue Information hinsichtlich der Anzahl der
fragmentierten Peptide und dem genauen Molekulargewicht dieser Peptide
ist für
die genaue Identifikation erforderlich. Deshalb sollte die Erhöhung der
Genauigkeit beim Bestimmen der Anzahl der fragmentierten Peptiden
und ihres Molekulargewichts zu einer verbesserten Erfolgswahrscheinlichkeit
bei der Identifizierung des unbekannten Proteins führen.
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Zusätzlich können Peptidverdaue
von unbekannten Proteinen mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) sequenziert
werden und die resultierende Sequenz wird gegen Datenbanken abgefragt
(J.K. Eng et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 5: 976–989, 1994; M. Mann et al.,
Anal. Chem. 66: 4390–4399,
1994; J.A. Taylor et al., Rapid Comm. Mass Spec. 11: 1067–1075, 1997).
Suchprogramme, die für
diesen Vorgang verwendet werden können, existieren im Internet,
wie z.B. Lutefisk 97 (Internetseite: www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html), und
die oben beschriebenen Protein Prospector, Peptide Search und ProFound-Programme.
Deshalb kann das Hinzufügen
einer Gensequenz und der vorhergesagten Proteinsequenz und Peptidfragmente
zu einer Sequenzdatenbank bei der Identifizierung von unbekannten
Proteinen mittels Tandem-Massenspektroskopie
helfen.
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Folglich
besteht auch ein Bedarf im Fachgebiet für Polypeptide, die für die Verwendung
bei Peptid-Fragmentierungsuntersuchungen, für die Verwendung bei Molekulargewichtsmessungen,
und für
die Verwendung bei der Proteinsequenzierung mittels Tandem-Massenspektroskopie
geeignet sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt isolierte Nukleinsäuren und Polypeptide bereit,
die durch die Nukleinsäuren
für einen
IL-1 Familienliganden, „IL-1
zeta" genannt und
zwei Spleißvarianten von
IL-1 zeta, TDZ.1 und TDZ.2 genannt, kodiert sind. Somit ist in einem
Aspekt, die Erfindung auf ein isoliertes Polynukleotid gerichtet, welches
ein Nukleinsäure-Molekül aufweist,
dass ein Polypeptid kodiert, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend
aus:
- (a) einem Polypeptid, welches die SEQ
ID Nr. 3 aufweist;
- (b) einem Polypeptid, welches die SEQ ID Nr. 8 aufweist;
- (c) einem Polypeptid, welches die SEQ ID Nr. 9 aufweist;
- (d) einem Polypeptid das zumindest zu 95% identisch zu dem Polypeptid
a) oder c) ist, wobei das Polypeptid an ein IL-1R Familienmitglied
bindet; und
- (e) einem Fragment des Polypeptids der SEQ ID Nr. 3, dessen
N-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
21–51
und dessen C-terminate Aminosäure
aus den Aminosäuren
188–192
ausgewählt
ist und welches an ein IL-1R Familienmitglied bindet, wobei das
Fragment nicht die Aminosäuren
24–192,
28–192 oder
34–192
der SEQ ID Nr. 3 sind;
- (f) einem Fragment des Polypeptides der SEQ ID Nr. 8 dessen
N-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
41–61
und dessen C-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
214–218
ausgewählt
ist und welches an ein IL-1R Familienmitglied bindet, wobei das
Fragment nicht die Aminosäuren
43–218,
54–218 oder
60–218
der SEQ ID Nr. 8 sind; und
- (g) einem Fragment des Polypeptides der SEQ ID Nr. 9 dessen
N-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
21–41
und dessen C-terminate Aminosäure
aus den Aminosäuren
193–197
ausgewählt
ist und welches an ein IL-1R Familienmitglied bindet, wobei das
Fragment nicht die Aminosäuren
33–197
oder 39–197 der
SEQ ID Nr. 9 sind.
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Das
Nukleinsäure-Molekül kann die
Sequenz der SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 6 aufweisen.
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In
einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf ein isoliertes Polypeptid
gerichtet, welches ein Polypeptid aufweist, das ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus:
- (a) einem Polypeptid,
welches die SEQ ID Nr. 3 aufweist;
- (b) einem Polypeptid, welches die SEQ ID Nr. 8 aufweist;
- (c) einem Polypeptid, welches die SEQ ID Nr. 9 aufweist;
- (d) einem Polypeptid das zumindest zu 95% identisch zu dem Polypeptid
a) bis c) ist, wobei das Polypeptid an ein IL-1R Familienmitglied
bindet;
- (e) einem Fragment des Polypeptids der SEQ ID Nr. 3 dessen N-terminale
Aminosäure
aus den Aminosäuren
21–51
und dessen C-terminate Aminosäure
aus den Aminosäuren
188– 192
ausgewählt
ist und welches an ein IL-1R Familienmitglied bindet, wobei das
Fragment nicht die Aminosäuren
24–192,
28–192
oder 34–192
der SEQ ID Nr. 3 sind;
- (f) einem Fragment des Polypeptides der SEQ ID Nr. 8 dessen
N-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
41–61
und dessen C-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
214–218
ausgewählt
ist und welches an ein IL-1R Familienmitglied bindet, wobei das
Fragment nicht die Aminosäuren
43–218,
54–218 oder
60–218
der SEQ ID Nr. 8 sind; und
- (g) einem Fragment des Polypeptides der SEQ ID Nr. 9 dessen
N-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
21–41
und dessen C-terminale Aminosäure
aus den Aminosäuren
193–197
ausgewählt
ist und welches an ein IL-1R Familienmitglied bindet, wobei das
Fragment nicht die Aminosäuren
33–197
oder 39–197 der
SEQ ID Nr. 9 sind.
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In
dem Polynukleotid und dem Polypeptid der Erfindung, wobei die N-terminale
Aminosäure
des Fragments des Polypeptids der SEQ ID Nr. 8 die Aminosäure 52 und
die N-terminale Aminosäure
des Fragments des Polypeptids der SEQ ID Nr. 9 die Aminosäure 31 sein
kann.
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Die
Erfindung stellt auch ein oligomeres Polypeptid bereit, welches
ein Polypeptid der Erfindung aufweist.
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Sowohl
einzelsträngige
als auch doppelsträngige
RNA und DNA Nukleinsäure-Moleküle sind
durch die Erfindung umfasst. Die Erfindung umfasst auch ein Expressionsvektor,
welcher ein Polynukleotid der Erfindung aufweist und eine Wirtszelle,
die mit einem solchen Vektor transformiert oder transfiziert ist.
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Die
oben erwähnten
Nukleinsäuren
können
verwendet werden, um Nukleinsäuren
zu identifizieren, die Proteine mit einer mit IL-1 Familienliganden
und Rezeptoren assoziierten Aktivität kodieren. Somit können IL-1 zeta
Nukleinsäure-Moleküle verwendet
werden, um den IL-1 zeta Rezeptor zu identifizieren.
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Zusätzlich können diese
Nukleinsäuren
verwendet werden, um die menschlichen Chromosome, mit welchen die
Nukleinsäuren
assoziiert sind zu identifizieren. Folglich können die IL-1 zeta, TDZ.1 und
TDZ.2 Nukleinsäuren
verwendet werden, um das menschliche Chromosom 2 zu identifizieren.
Dementsprechend können
diese Nukleinsäuren
auch verwendet werden, um Gene auf dem menschlichen Chromosom 2
zu kartieren; um Gene zu identifizieren, die mit bestimmten Krankheiten,
Syndromen, oder anderen mit dem menschlichen Chromosom 2 assoziierten
menschlichen Zuständen
assoziiert sind, und um die Zellsignalübertragung und das Immunsystem
zu studieren.
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Sense
oder Antisense Oligonukleotide der Nukleinsäuren der SEQ ID NO: 1, 2, 5,
6, und 7 können verwendet
werden, um die Expression des entsprechenden Polynukleotids, welches
durch die Nukleinsäuren kodiert
ist, zu inhibieren.
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Die
Erfindung umfasst weiters ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids,
welches das Kultivieren einer Wirtszelle unter Bedingungen aufweist,
die die Expression des Polypeptids fördern. Das Polypeptid kann
dann aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Insbesondere wird die
Expression dieser Polypeptide in Bakteria, Hefe-, Pflanzen-, Insekten-
oder tierischen Zellen durch die Erfindung umfasst.
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Im
Allgemeinen können
die Polypeptide der Erfindung verwendet werden, um die zellulären Vorgänge wie
Immunregulation, Zellproliferation, Zelltod, Zellmigration, Zell-Zell-Wechselwirkung, und
entzündliche
Reaktionen untersucht werden. Zusätzlich können diese Polypeptide verwendet
werden, um Proteine zu identifizieren, die mit IL-1 zeta, TDZ.1
und TDZ.2 assoziiert sind.
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Zusätzlich können diese
Polypeptide in Untersuchungen benutzt werden, um auf wirksame Aktivitätsinhibitoren,
die mit Polypeptid-Counter-Strukturmolekülen assoziiert sind, und auf
therapeutische Wirkstoffe für die
Behandlung von Krankheiten, die durch Polypeptid-Counter-Strukturmolekülen vermittelt
sind, zu screenen. Weiters können
diese Polypeptide in der Entwicklung von Inhibitoren (z.B. biotechnologisch-hergestellte Rezeptoren,
die als Inhibitoren wirken) davon verwendet werden.
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Die
IL-1 zeta Nukleinsäuresequenzen,
die vorhergesagten Aminosäure-Sequenzen
des Polypeptids oder Fragmente davon, oder eine Kombination der
vorhergesagten Aminosäuresequenzen
des Polypeptids und Fragmente davon können beim Abfragen einer elektronischen
Datenbank verwendet werden, um bei der Identifikation von Probennukleinsäuren und/oder
Proteinen zu helfen. Die hierin offenbarten Polypeptide können als
Kontrollen für
das Feststellen des Ausmaßes
der Proteinfragmentierung verwendet werden.
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Isolierte
polyklonale oder monoklonale Antikörper, die an diese Polypeptide
binden, sind ebenfalls durch die Erfindung umfasst. Diese Antikörper können verwendet
werden, um beim Reinigen der Polypeptide der Erfindung zu helfen.
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Kurze Beschreibung der
Figuren
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1 zeig
die genomische Struktur des IL-1 zeta Locus.
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2 repräsentiert
ein molekulares Modell, welches die sekundäre Struktur von IL-1 zeta zeigt,
in welcher die β-Stränge in Gelb
gezeigt sind, wobei ihre Richtung durch die Pfeilköpfe angezeigt
werden; die β-Schleifen
in Blau gezeigt sind; und die Knäuel
in Grün
gezeigt sind. Die IL-1 zeta Struktur ist in zwei unterschiedlichen
Darstellungen gezeigt.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
in der Erfindung umfassten Nukleinsäure-Moleküle beinhalten die folgenden
Nukleotid-Sequenzen: Name:
IL-1-zeta
Name:
Xrec2 (durch die Erfindung nicht umfasst)
Name:
TDZ.1
Name:
TDZ.2
Name:
TDZ.3 (durch die Erfindung nicht umfasst)
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Zu
den Aminosäure-Sequenzen
der Polypeptide, die durch die Nukleotid-Sequenzen der Erfindung kodiert
sind, zählen: Name:
IL-1 zeta (polypeptid)
Name:
Xrec2 (Polypeptid) (durch die Erfindung nicht umfasst)
TDZ.1
(Polypeptid)
Name:
TDZ.2 (Polypeptid)
Name:
TDZ.3 (Polypeptid) (durch die Erfindung nicht erfasst)
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Die
Entdeckung der IL-1 zeta, der IL-1 zeta Spleißvarianten (TDZ.1, TDZ.2, und
TDZ.3) und der Xrec2 Nukleinsäuren
ermöglicht
die Konstruktion von Expressionsvektoren, welche die Nukleinsäuresequenzen
aufweisen, die die entsprechenden Polypeptide kodieren, und Wirtszellen,
die mit dem Expressionsvektor transfiziert oder transformiert sind.
Die Isolierung und Reinigung von biologisch aktivem IL-1 zeta, den
IL-1 zeta Spleißvarianten,
und des Xrec2 Polypeptids und Fragmente davon wird ebenfalls ermöglicht.
Die Nukleinsäuren
oder Oligonukleotide davon können
als Sonden verwendet werden, um Nukleinsäuren, die Proteine mit assoziierten
Aktivitäten
kodieren, zu identifizieren. Somit können IL-1 zeta und die IL-1
zeta Spleißvarianten
verwendet werden, um Aktivitäten
zu identifizieren, die mit IL-1 Familienliganden assoziiert sind
und Xrec2 kann verwendet, um Aktivitäten zu identifizieren, mit
IL-1 Familienrezeptoren assoziiert sind. Zusätzlich können die Nukleinsäuren oder
Oligonukleotide davon von IL-1 zeta TDZ.1, TDZ.2, und TDZ.3 verwendet
werden, um die menschlichen Chromosome 2 zu identifizieren, während jede
von Xrec2 verwendet werden können,
um das menschliche Chromosom X zu identifizieren. In ähnlicher
Weise können
diese Nukleinsäuren
oder Oligonukleotide davon verwendet werden, um Gene auf den menschlichen
Chromosomen 2 bzw. X zu kartieren, und um Gene zu identifizieren,
die mit bestimmten Krankheiten, Syndromen oder anderen menschlichen
Zuständen
assoziiert sind, die mit menschlichen Chromosomen 2 und X in Verbindung
stehen. Folglich können
die Nukleinsäuren
oder Oligonukleotide davon von IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, und TDZ.3
verwendet werden, um Glaucome, ektodermale Dysplasie, Insulin-abhängigen Diabetes
mellitus, Faltenhaut-Syndrom, T-Zell Leukämie/Lymphoma und tibiale Muskeldystrophie
zu identifizieren, während
die Nukleinsäuren
oder Olgionukleotide davon von Xrec2 verwendet werden können, um
Retinoschisis, Lissenzephalie, subkortikale Laminalheteropie, mentale
Retardation, Cowchock-Syndrom,
Bazex-Syndrom, Hypertichosis, lymphoproliferatives Syndrom, Immundefizienz,
Langer mesomele Dysplasie, und Leukämie. Schließlich können einzelsträngige Sense oder
Antisense-Oligonukleotide von diesen Nukleinsäuren verwendet werden, um die
Expression von Polynukleotiden zu inhibieren, die durch die IL-1
zeta bzw. Xrec2 Gene kodiert werden.
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Weiters
können
die IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 und Xrec2 Polypeptide und lösliche Fragmente davon
verwendet werden, um vaskuläre
Endothelzellen und Lymphozyten zu aktivieren und/oder deren Aktivierung
zu inhibieren, um die lokale Gewebezerstörung und Fieber zu induzieren
und/oder deren Induktion zu inhibieren (Janeway et al., 1996), um
Makrophagen und vaskuläre
Endothelzellen zu inhibieren und/oder stimulieren, um IL-6 zu erzeugen,
um Prostaglandine, Stickoxidsynthase, und Metalloproteinasen zu
induzieren und/oder deren Induktion zu inhibieren, und um die Moleküle an der
Oberfläche
von vaskulären
Endothelzellen hinauf zu regulieren und/oder die Aufwärtsregulierung
zu inhibieren. Zusätzlich
können
diese Polypeptide und fragmentierten Polypeptide auch verwendet
werden, um entzündliche
Mediatoren, wie Transkirptionsfaktoren NF-κB und AP-1, MAP Kinasen JNK
und p38, COX-2, iNOS, und alle der durch diese Moleküle stimulierten Aktivitäten zu induzieren
und/oder die Induktion zu inhibieren.
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Zusätzlich können diese
Polypeptide und fragmentierten Peptide auch als Kontrolle für die Peptid-Fragmentierung
verwendet werden. Schließlich
können
diese Polypeptide und Fragmente davon verwendet werden, um Antikörper zu
erzeugen, und die Erfindung schließt die Verwendung von solchen
Antikörpern ein,
um IL-1 zeta und Xrec2 Polypeptide zu reinigen.
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NUKLEINSÄURE-MOLEKÜLE
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In
einer besonderen Ausführungsform
betrifft die Erfindung bestimmte isolierte Nukleotidsequenzen, die
frei von verunreinigendem endogenem Material sind. Eine „Nukleotidsequenz" betrifft ein Polynukleotidmolekül in Form
eines getrennten Fragments oder als Komponente eines größeren Nukleinsäurekonstrukts.
Das Nukleinsäuremolekül wurde
von DNA oder RNA abgeleitet, die zumindest einmal in einer im Wesentlichen
reinen Form und in einer Menge oder Konzentration isoliert wurde,
die eine Identifikation, Manipulation und Gewinnung der Nukleotidsequenzen
deren Komponenten mittels biochemischer Standardverfahren ermöglicht (wie
jene, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,
1989 dargelegt sind). Solche Sequenzen werden vorzugsweise in Form
eines offenen Leserahmens, der durch interne nicht-translatorische
Sequenzen, oder Introns, nicht unterbrochen ist, die in typischen
eukaroyotischen Genen vorhanden sind, bereitgestellt und/oder konstruiert.
Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' von einem offenen Leserahmen vorliegen,
wo die gleichen nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden
Region interferieren.
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Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung
schließen
DNA in sowohl einzelsträngiger
als auch doppelsträngiger
Form, sowie das RNA-Komplement davon ein. DNA schließt, zum
Beispiel, cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, durch
PCR amplifizierte DNA, und Kombinationen davon ein. Genomische DNA kann
durch herkömmliche
Techniken isoliert werden, z.B., unter Verwendung der cDNA der SEQ
ID NO: 1, 2, 5, 6, 7 oder eines geeigneten Fragments davon als eine
Sonde.
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Die
DNA Moleküle
der Erfindung beinhalten Gene voller Länge sowie Polynukleotide und
Fragmente davon. Die Gene voller Länge können das N-terminale Signalpeptid
einschließen.
Andere Ausführungsformen beinhalten
DNA, die eine lösliche
Form kodiert, z.B. die die extrazelluläre Domäne des Proteins, mit oder ohne Signalpeptid
kodiert.
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Die
Nukleinsäuren
der Erfindung sind vorzugsweise von menschlichen Quellen abgeleitet,
jedoch schließt
die Erfindung jene ebenso mit ein, die von nicht-menschlichen Spezies
abgleitet sind.
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Bevorzugte Sequenzen
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Die
besonders bevorzugten Nukleinsäuremoleküle der Erfindung
sind jene, die in SEQ ID NO: 1 und 6 für IL-1 zeta bzw. TDZ.2 gezeigt
sind. cDNA Klone mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NOs:
1 und 2 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Die Sequenzen
der Aminosäuren
von IL-1 zeta und Xrec2, die durch die DNAs der SEQ ID NO: 1 und
2 kodiert sind, werden in den SEQ ID NO: 3 bzw. 4 gezeigt. cDNA
Klone mit der Nukleinsäuesequenz
der SEQ ID NO: 5, 6, und 7 wurden wie in Beispiel 8 beschrieben
isoliert. Die Sequenzen der Aminosäuren von TDZ.1, TDZ.2 und TDZ.3,
die durch die DNAs der SEQ ID NO: 5, 6, und 7 kodiert sind, werden
in den SEQ ID NO: 8, 9 bzw. 10 gezeigt.
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SEQ
ID NO: 1–4
identifizieren das IL-1 zeta der SEQ ID NO: 3 als ein Mitglied der
IL-1 Familie und das Xrec2 der SEQ ID NO: 4 als ein Mitglied der
IL-1 Rezeptorfamilie. Die Homologien, auf welche diese beruht, sind
in Tabelle I dargelegt.
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Die
IL-1 Spleißvarianten
wurden in einem Abschnitt von genomischer DNA Sequenz (X22304.gbn)
gefunden. Diese genomische Sequenz enthält auch die unterschiedlichen
IL-1 zeta Exons und eine andere, als Tango-77 (WO 99/06426) bekannte
Spleißvariante.
Der Vergleich der cDNA Sequenzen der klonierten IL-1 zeta, TDZ.1,
TDZ.2, TDZ.3 und Tango-77 mit der genomischen Sequenz liefert einen
Einblick in die Bildung der Spleißvorgängen. 1 zeigt
die genomische Struktur des IL-1 zeta Locus und die durch alternatives
Spleißen gebildeten
cDNAs. Die nummerierten Boxen weisen auf die individuellen Exons
1–6 hin
und die ungefähre
Größe der dazwischenliegenden
Introns ist darüber
angegeben. Der Asterisk (*) weist auf das Vorhandensein eines Stoppkodons
am Ende der kodierenden Sequenz (Exon 6) oder als ein im-Rahmen Stoppkodon
(Exon 3) hin. „M" bedeutet ein potentielles
auslösendes
Methionin, welches entweder von Exon 1 oder Exon 3 stammt. Tango-77
ist die in WO 99/06426 offenbarte cDNA-Struktur. Ein wesentliches
Merkmal von IL-1 zeta und ihren Spleißvarianten ist das Vorhandensein
oder die Abwesenheit von Exon 4. Exon 4 ist in IL-1 zeta, TDZ.1
und TDZ.2, nicht jedoch in Tango-77 oder TDZ.3 vorhanden. Die durch
Exon 4 kodierte Aminosäuresequenz
richtet sich gut mit den Aminosäuresequenzen
von anderen IL-1 Familienmitgliedern in den ersten wenigen Beta-Strängen des
reifen Peptids aus. Im Gegensatz dazu richten sich die durch Exons
1 und 2 von Tango-77 und Exon 1 von TDZ.3 cDNAs kodierten Aminosäurensequenzen,
welche das Exon 4 von IL-1 zeta, TDZ.1 und TDZ.2 eher ersetzen als
ergänzen,
nicht gut mit anderen IL-1 Familienmitgliedern in dieser selben
Region aus. IL-1 zeta, Tango-77, TDZ.1, TDZ.2, und TDZ.3 richten
sich alle gut mit den Aminosäuresequenzen
von anderen IL-1 Familienmitgliedern in den C-terminalen 2/3 des
reifen Peptids aus (die durch Exons 5 und 6 kodierte Region, die
allen dieser Spleißisoformen
gemeinsam ist). Folglich ist es wahrscheinlich, dass die durch IL1
zeta, TDZ.1 und TDZ.2 DNAs kodierten „reifen Peptide", funktionale IL-1
artige Moleküle
repräsentieren.
Dies ist im Gegensatz zu den durch Tango-77 oder TDZ.3 DNAs kodierten
Polypeptiden, die weniger wahrscheinlich sind, ein funktionales
IL-1 ähnliches
Molekül
zu repräsentieren.
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Es
ist wahrscheinlich, dass alle der Spleißisoformen, mit Ausnahme von
TDZ.3, Proformen eines IL-1 ähnlichen
Cytokins kodieren, da sich die cDNAs in N-terminaler Richtung weit über den
N-Terminus von reifen IL-1s erstrecken. Diese Beobachtung sagt voraus,
dass IL-1 zeta, TDZ.1 und TDZ.2 dasselbe reife Peptid kodieren.
In Zusammenhang mit dieser Beobachtung sind es die Prodomänen (sowie
5' UTRs) die sich
zwischen IL-1 zeta, TDZ.1 und TDZ.2 unterscheiden.
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Tabelle
III, welche die Gewebeverteilung von IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3
und Tango-77 detailliert beschreibt,
zeigt, dass die Expression von Tango-77 weiter verbreitet ist als
die von IL-1 zeta. Tabelle III zeigt auch, dass die TDZ.1 Expression
vergleichbar, und beinahe vollständig überlappend,
mit der von Tango-77 ist. Die Gewebeverteilungsdaten zusammen mit
der Ausrichtungsinformationen der 1 zeigen,
dass TDZ.1 das einzige Mitglied der Spleißvarianten ist, die sich gut
mit anderen IL-1 Familienmitgliedern ausrichtet, und in ihrer Expression
weit verbreitet ist. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass
TDZ.1 die bedeutendste Spleißvariante
bezüglich
der Relevanz zu biologischen Antworten sein kann.
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Zusätzliche Sequenzen
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Aufgrund
der bekannten Degeneriertheit des genetischen Kodes, worin mehr
als ein Kodon dieselbe Aminosäure
kodieren kann, kann eine DNA Sequenz von der in den SEQ ID NO: 1,
2, 5, 6 und 7 gezeigten abweichen und dennoch ein Polypeptid mit
der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 bzw. 10 kodieren. Solche abweichende DNA
Sequenzen können
von versehentlichen Mutationen (die z.B. während der PCR-Amplifizierung
auftreten) resultieren, oder können
das Produkt einer absichtlichen Mutagenese einer nativen Sequenz
sein.
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Die
Erfindung bietet isolierte DNA-Sequenzen, die Polypeptide der Erfindung
kodieren, ausgewählt aus:
(a) DNA, die die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, 5 und 6 kodieren,
und (b) DNA, die die Polypeptide der SEQ ID NO: 3, 8 und 9 kodieren.
Natürlich
sind die durch solche DNA-Sequenzen kodierten Polypeptide durch
die Erfindung umfasst.
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Wie
hierin verwendet, können
Bedingungen mäßiger Stringenz
leicht durch einen Durchschnittsfachmann basierend zum Beispiel
auf der Länge
der DNA bestimmt werden. Die grundlegenden Bedingungen sind in Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band
1, S. 1.101–104,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 dargelegt, und beinhalten
die Verwendung einer Vorwaschlösung
für die
Nitrozellulose-Filter 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), Hybridisierungsbedingungen
von etwa 50% Formamid, 6XSSC bei etwa 42°C (oder einer anderen ähnlichen
Hybridisierungslösung,
wie etwa Stark's
Lösung
in etwa 50% Formamid bei etwa 42°C),
und Waschbedingungen von etwa 60°C,
0,5XSSC, 0,1% SDS. Bedingungen höherer
Stringenz können
ebenfalls leicht durch den Durchschnittsfachmann basierend auf,
zum Beispiel, der Länge
der DNA, bestimmt werden. Im Allgemeinen sind solche Bedingungen
als Hybridisierungsbedingungen, wie oben, definiert, und mit Waschen
bei ungefähr
68°C, 0,2XSSC,
0,1% SDS. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur und Waschlösung-Salzkonzentration
nach Bedarf eingestellt werden können,
wie z.B. gemäß Faktoren,
wie der Länge
der Sonde.
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Ebenfalls
als eine Ausführungsform
der Erfindung eingeschlossen ist eine DNA, die bestimmte Polypeptidfragemente
und Polypeptide kodieren, die inaktivierte N-Glycosylierungsstellen, inaktivierte
Protease-Bearbeitungsstellen, oder konservative Aminosäuresubstitutionen
aufweisen, wie unten beschrieben ist.
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Nukleinsäuremoleküle können Nukleotidsequenzen
aufweisen, die zumindest 80% identisch, zumindest 90% identisch,
zumindest 95% identisch, zumindest 98% identisch, zumindest 99%
identisch oder zumindest 99,9% identisch zu einer nativen Sequenz
sind.
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Die
prozentuelle Identität
kann durch visuelle Begutachtung und mathematische Berechungen bestimmt
werden. Alternativ kann die prozentuelle Identität von zwei Nukleinsäuresequenzen
durch Vergleichen der Sequenzinformationen unter Verwendung des
GAP Computerprogramms, Version 6,0, von Devereux et al., Nucl. Acids
Res. 12:387, 1984, das beschrieben und von der University of Wisconsin
Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist, bestimmt werden.
Die bevorzugten Voreinstellungen für das GAP-Programm beinhalten:
(1) eine unäre
Vergleichsmatrix (enthält
einen Wert von 1 für
Identitäten
und 0 für
Nicht-Identitäten) für Nukleotide,
und die gewichtete Vergleichsmatirx von Gribskov und Burgess, Nucl.
Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, Hrsg. Atlas
of Protein Sequence and Structure, S. 353–358, National Biomedical Research
Foundation, 1979; (2) einen Strafpunkt von 3,0 für jede Lücke und einen zusätzlichen
Strafpunkt von 0,10 für
jedes Symbol in jeder Lücke;
und (3) kein Strafpunkt für
Endlücken.
Andere Programme die von Fachleuten auf dem Gebiet des Sequenzvergleichs
verwendet werden, können
ebenso eingesetzt werden.
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Die
Erfindung bietet isolierte Nukleinsäuren, die in der Herstellung
von Polypeptiden nützlich
sind. Solche Polypeptide können
durch irgendeine einer Vielzahl von herkömmlichen Techniken hergestellt
werden. Ein DNA Sequenz, die ein Polypeptid der Erfindung kodiert,
oder ein gewünschtes
Fragment davon, kann in einen Expressionsvektor für die Herstellung
des Polypeptids oder Fragments subkloniert werden. Die DNA Sequenz wird
vorteilhafterweise mit einer Sequenz fusioniert, die eine geeignete
Leitsequenz oder ein geeignetes Signalpeptid kodiert. Alternativ
kann das gewünschte
Fragment mittels bekannter Techniken chemisch synthetisiert werden.
DNA Fragmente können
auch durch Restriktion-Endonuklease-Verdau einer klonierten DNA
Sequenz voller Länge
und Isolieren durch Elektrophorese auf einem Agarosegel hergestellt
werden. Wenn notwendig können
Oligonukleotide, die den 5' oder
3' Terminus bis
zu einem gewünschten
Punkt rekonstruieren, zu einem DNA Fragment, das durch Restriktionsenzymverdau
erzeugt wurde, ligiert werden. Solche Oligonukleotde können zusätzlich eine
Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle stromaufwärts von
der gewünschten
kodierenden Sequenz enthalten und positionieren ein Startkodon (ATG)
an den N-Terminus der kodierenden Sequenz.
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Das
bekannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahren kann auch eingesetzt
werden, um eine DNA Sequenz, die ein gewünschtes Proteinfragment kodiert,
zu isolieren und zu amplifizieren. Oligonukleotide, die die gewünschten
Termini des DNA Fragments definieren, werden als 5' und 3' Primer eingesetzt.
Die Oligonukleotide können
zusätzlich
Erkennungsstellen für
Restriktionsendonukleasen enthalten, um die Einfügung des amplifizierten DNA
Fragments in einen Expressionsvektor zu erleichtern. PCR-Techniken
sind in Saiki et al., Science, 239:487, 1988; Wu et al., Hrsg. Recombinant
DNA Methodology, S. 189–196,
Academic Press, Inc., San Diego, 1989; und Innis et al., Hrsg. PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press,
Inc., 1990, beschrieben.
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Polypeptide und Fragmente
davon
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Die
Erfindung umfasst Polypeptide und Fragmente davon in verschiedenen
Formen, einschließlich
jener, die natürlich
vorkommen oder durch verschiedene Techniken hergestellt sind, wie
etwa Verfahren, die die rekombinante DNA Technologie einbinden.
Zu solchen Formen zählen,
ohne jedoch darauf beschränkt
zu sein, Derivate, Varianten, oder Oligomere sowie Fusionsproteine
oder Fragmente davon.
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Zu
den Polypeptiden der Erfindung zählen
Proteine voller Länge,
die durch die oben dargelegten Nukleinsäuresequenzen der Erfindung
kodiert werden. Polypeptide von IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 und Xrec2
weisen die Aminosäuresequenz
der SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 bzw. 10 auf. Für IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2,
und TDZ.3 kodiert der N-Terminus kein klassisches Signalpeptid,
aber die extra Länge
in Bezug auf die reife Form von anderen IL-1 Familienmitgliedern
weist darauf hin, dass der N-Terminus als eine Prodomäne wirken
kann. Eine vorausgesagte Spaltungsstelle ist der Punkt, an welchem
der konservierte strukturelle Abschnitt eines Proteins beginnt.
Strukturelle Modellierungsdaten unterstützen diese Annahme. Für IL-1 zeta,
TDZ.1, und TDZ.2 ist diese Stelle, irgendwo in der Nähe des N-terminalen
Endes der durch Exon 4 kodierten Aminosäuresequenz. Folglich beinhaltet
das Polypeptid von IL-1 zeta, wie in der SEQ ID NO: 3 dargelegt,
eine mutmaßliche
Prodomäne,
die sich über
die Aminosäuren
1 bis x erstreckt, wobei x eine ganze Zahl zwischen 20 bis 50 ist. Ähnlicherweise
enthält
TDZ.1 der SEQ ID NO: 8 eine mutmaßliche Prodomäne, die
sich über
die Aminosäuren
1 bis x' erstreckt,
wobei x' eine ganze
Zahl zwischen 40 bis 60 ist und am meisten bevorzugt ist x' etwa 52. TDZ.2 der
SEQ ID NO: 9 enthält
eine mutmaßliche
Prodomäne,
die sich über
die Aminosäuren
1 bis x'' erstreckt, wobei
x'' eine ganze Zahl
zwischen 20 und 40 ist und am meisten bevorzugt ist x'' 31.
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Im
Unterschied zu IL-1 zeta und seinen Spleißvarianten enthält das Polypeptid
von Xrec2, wie in SEQ ID NO: 4 dargelegt, eine N-terminale hydrophobe
Region, welche als Signalpeptid wirkt, gefolgt von einer extrazellulären Domäne, welche
die Aminosäuren
19 bis 359 aufweist, einer Transmembrandomäne, welche die Aminosäure 360
bis 378 aufweist, und einer C-terminalen
cytoplasmatischen Domäne,
welche die Amionsäuren
379 bis 696 aufweist. Computeranalyse sagt voraus, dass das Signalpeptid
den Resten 1 bis 19 der SEQ ID NO: 4 entspricht (obwohl die nächste wahrscheinliche
Computer-vorausgesagte Signalpeptid-Spaltungsstelle, in abnehmender Reihenfolge,
nach den Aminosäuren
20 und 16 der SEQ ID NO: 4 auftritt). Die Abspaltung des Signalpeptids
würde folglich
ein reifes Protein ergeben, welches die Aminosäuren 19 bis 696 der SEQ ID
NO: 4 aufweist.
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Der
Fachmann wird erkennen, dass die oben beschriebenen Grenzen von
solchen Regionen von Polypeptiden nur ungefähr sind. Zur Veranschaulichung,
die Grenzen der Transmembranregion (welche mittels Computerprogrammen,
die für
diesen Zweck erhältlich
sind, vorausgesagt werden können)
können
von jenen, die oben beschrieben sind, abweichen.
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Die
Polypeptide der Erfindung können
Membran-gebunden sein oder sie können
sezerniert und somit löslich
sein. Lösliche
Polypeptide sind in der Lage von den Zellen, in welchen sie exprimiert
werden, sezerniert zu werden. Im Allgemeinen können lösliche Polypeptide durch das
Abtrennen von intakten Zellen, die das gewünschte Polypeptid exprimieren,
vom Kulturmedium, z.B. durch Zentrifugation und Untersuchen des
Mediums (Überstand)
auf die Gegenwart des gewünschten
Polypeptids identifiziert werden (und von nicht-löslichen,
Membran-gebundenen Gegenstücken
unterschieden werden). Das Vorhandensein des Polypeptids im Medium
weist darauf hin, dass das Polypeptid aus den Zellen sezerniert
wurde und somit eine lösliche
Form des Proteins ist.
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In
einer Ausführungsform
weisen die löslichen
Polypeptide und Fragmente davon die gesamte oder Teile der extrazellulären Domäne auf,
es fehlt ihnen jedoch die Transmembranregion, die die Zurückhaltung des
Polypeptids an der Zellmembran verursachen würde. Ein lösliches Polypeptid kann die
cytoplasmatische Domäne,
oder einen Teil davon, enthalten, solange das Polypeptid aus den
Zellen, in welchen es produziert wird, sezerniert wird.
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Im
Allgemeinen ist die Verwendung löslicher
Formen für
bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung der Polypeptide
aus rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen
Polypeptide aus den Zellen sezerniert werden. Weiters sind lösliche Polypeptide
im Allgemeinen für
die intravenöse
Verabreichung geeigneter.
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Die
Erfindung bietet auch bestimmte Polypeptide und Fragmente der extrazellulären Domäne, die
eine gewünschte
biologische Aktivität
beibehalten. Besondere Ausführungsformen
sind auf Polypeptid-Fragmente der SEQ ID NO: 3, 8 und 9 gerichtet,
die die Fähigkeit
an native Verwandte, Substrate oder Gegenstrukturen („Bindungspartner") zu binden, beibehalten.
Solch ein Fragment kann ein lösliches
Polypeptid, wie oben beschrieben, sein. In einer anderen Ausführungsform
enthalten die Polypeptide und Fragment vorteilhafterweise Regionen,
die in den IL-1 Liganden und der IL-1 Rezeptorfamilie, wie oben
beschrieben, konserviert sind.
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Polypeptidfragmente
können
zumindest 20, oder zumindest 30, zusammenhängende Aminosäuren der
Sequenzen der SEQ ID NO: 3, 4, 8, 9 und 10 aufweisen. Von der cytoplasmatischen
Domäne
von Xrec2 der SEQ ID NO: 4 abgeleitete Fragmente finden bei Signalübertragungsstudien,
und beim Regulieren zellulärer
Prozesse, die mit der Übertragung
von biologischen Signalen assoziiert sind, Verwendung. Peptidfragmente
können
auch als Immunogene, beim Herstellen von Antikörpern eingesetzt werden.
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Varianten
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Natürlich vorkommende
Varianten sowie abgeleitete Varianten der Polypeptide und Fragmente
sind hierin bereitgestellt.
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Varianten
können
Aminosäuresequenzen
aufweisen, die zumindest 80% identisch, zumindest 90% identisch,
zumindest 95% identisch, zumindest 98% identisch, zumindest 99%
identisch oder zumindest 99,9% identisch sind zu dem bevorzugten
Polypeptid oder Fragment davon. Die vorliegende Erfindung stellt
ein isoliertes Polypeptid, das zumindest 95% identisch zu einem
Polypeptid ist, welches die SEQ ID NO: 3, 8 oder 9 aufweist, wobei
das Polypeptid an ein IL-1R Familienmitglied bindet, und ein isoliertes
Polynukleotid bereit, welches ein Nukleinsäuremolekül aufweist, das ein solches
Polypeptid kodiert. Die prozentuelle Identität kann durch visuelle Inspektion
und mathematische Berechnung bestimmt werden. Alternativ kann die
prozentuelle Identität
von zwei Proteinsequenzen durch Vergleichen der Sequenzinformation
unter Verwendung des GAP Computerprogramm basierend auf dem Algorithmus
von Needleman und Wunsch (J. Mol. Bio 48:443, 1970) und erhältlich von
der University von Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) bestimmt
werden. Die bevorzugten Voreinstellungen für das GAP-Programm beinhalten:
(1) eine Scoring-Matrix, blosum62, wie von Henikoff et al., Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 89:10915, 1992; (2) ein Lückengewicht von 12; (3) ein
Gewicht für die
Lückenlänge von
4; und (4) keinen Strafpunkt für
Endlücken.
Andere Programme, die von einem Fachmann auf dem Gebiet des Sequenzvergleiches
verwendet werden, können
auch eingesetzt werden.
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Die
Varianten der Erfindung beinhalten, zum Beispiel, jene, die von
alternativen mRNA-Spleißvorgängen oder
einer proteolytischen Spaltung resultieren. Alternatives Spleißen von
mRNA kann, zum Beispiel, ein verkürztes, jedoch biologisch aktives
Protein ergeben, wie z.B. eine natürlich vorkommende, lösliche Form
des Proteins. Variationen, die der Proteolyse zugeschrieben werden
können,
beinhalten, zum Beispiel, Unterschiede in den N- oder C-Termini
bei der Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen, aufgrund
der proteolytischen Entfernung von einer oder mehreren terminalen
Aminosäuren
von dem Protein (im Allgemeinen zwischen 1–5 terminale Aminosäuren). Proteine,
in welchen Aminosäure-Sequenzunterschiede
dem genetischen Polymorphismus (allelische Variation unter Individuen,
die das Protein erzeugen) zuzuschreiben sind, sind ebenfalls hierin
vorgesehen.
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Zusätzliche
Varianten innerhalb des Umfangs der Erfindung beinhalten Polypeptide,
die modifiziert werden können,
um Derivate davon durch Bilden kovalenter oder aggregativer Konjugate
mit anderen chemischen Anteilen, wie Glycosyl-Gruppen, Lipiden,
Phosphaten, Acetyl-Gruppen und dergleichen, zu erzeugen. Kovalente
Derivate können
durch Verbinden der chemischen Anteile mit funktionellen Gruppen
von Aminosäuren-Seitenketten
oder an den N-Terminus
oder C-Terminus eines Polypeptids hergestellt werden. Konjugate, die
diagnostische (detektierbare) oder therapeutische Wirkstoffe, die
daran angeheftet sind, aufweisen, werden hierin in Erwägung gezogen,
wie unten detaillierter diskutiert ist.
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Andere
Derivate beinhalten kovalente oder aggregative Konjugate der Polypeptide
mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie durch Synthese in rekombinanter
Kultur als N-terminale
oder C-terminale Fusionen. Beispiele von Fusionsproteinen sind unten
im Zusammenhang mit Oligomeren diskutiert. Fusionsproteine können weiters
hinzugefügte
Peptide aufweisen, um die Reinigung und Identifikation zu erleichtern.
Zu solchen Peptiden zählen,
zum Beispiel, poly-His oder die im U.S. Patent No. 5.011.912 und
in Hopp et al. Bio/Technology, 6:1204, 1988 beschriebenen antigenen
Identifikationspeptide. Ein solches Peptid ist das Flag®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(SEQ ID NO: 11), welches hoch antigen ist und ein Epitop bereitstellt,
welches durch einen spezifischen monoklonalen Antikörper reversibel
gebunden wird, was eine schnelle Untersuchung ermöglicht und
die Reinigung von exprimiertem rekombinantem Protein erleichtert.
Ein als 4E11 bezeichnetes Murin-Hybridom erzeugt einen monoklonalen
Antikörper,
der das Flag®-Peptid
in der Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Metallkationen, wie
im U.S. Patent 5.011.912 beschrieben, bindet. Die 4E11 Hybridom-Zelllinie
wurde bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer
HB 9259 hinterlegt. Monoklonale Antikörper, die das Flag®-Peptid
binden, sind von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Divison,
New Haven Connecticut erhältlich.
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Unter
den hierin bereitgestellten Polypeptid-Varianten sind Varianten
von nativen Polypeptiden, die die native biologische Aktivität oder das
substantielle Äquivalent
davon beibehalten. Ein Beispiel ist eine Variante, die im Wesentlichen
mit der gleichen Bindungsaffinität
bindet, wie es die native Form tut. Die Bindungsaffinität kann durch
herkömmliche
Verfahren, z. B., wie in U.S. Patent No 5.512.457 beschrieben und
unten dargelegt ist, gemessen werden.
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Zu
Varianten zählen
Polypeptide, die im Wesentlichen homolog zu der nativen Form sind,
aber welche eine Aminosäure-Sequenz
aufweisen, die sich von der der nativen Form, aufgrund von einer
oder mehreren Deletionen, Insertionen oder Substitutionen, unterscheidet.
Besondere Ausführungsformen
beinhalten, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polypeptide, die
eine bis zehn Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäure-Resten
aufweisen, wenn sie mit einer nativen Sequenz verglichen werden.
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Eine
gegebene Aminosäure
kann, zum Beispiel, durch einen Rest mit ähnlichen physiochemischen Charakteristika
ersetzt werden. Beispiele von solchen konservativen Substitutionen
umfassen Substitutionen von einem aliphatischen Rest durch einen
anderen, wie Ile, Val, Leu, oder Ala für einander, Substitutionen
von einem polaren Rest durch einen anderen, wie zwischen Lys und
Arg, Glu und Asp, oder Gln und Asn; oder Substitutionen von einem
aromatischen Rest durch einen anderen, wie Phe, Trp, oder Tyr für einander.
Andere konservative Substitutionen, die beispielsweise Substitutionen
von ganzen Regionen mit ähnlichen
Hydrophobizität-Charakteristica
einschließen,
sind bekannt.
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Ähnlicherweise
beinhalten die DNAs der Erfindung Varianten, die sich von einer
nativen DNA-Sequenz aufgrund einer oder mehreren Deletionen, Insertionen
oder Substitutionen unterscheiden, jedoch ein biologisch aktives
Polypeptid kodieren.
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Die
Erfindung beinhaltet weiters Polypeptide der Erfindung mit oder
ohne assoziierten Glycosylierung nativen Musters. In Hefe oder Säugetier-Expressionssystemen
(z.B., COS-1 oder COS-7 Zellen) exprimierte Polypeptide können zu
einem nativen Polypeptid in Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster,
abhängig von
der Wahl des Expressionssystems, ähnlich oder wesentlich verschieden
sein. Die Expression von Polypeptiden der Erfindung in bakteriellen
Expressionsystemen, wie E. coli, liefert nicht-glycosylierte Moleküle. Eine
gegebene Zubereitung kann weiters mehrere unterschiedlich glycosylierte
Spezies des Proteins enthalten. Glycosyl-Gruppen können durch
herkömmliche
Verfahren entfernt werden, insbesondere jenen die Glycopeptidase
benutzten. Im Allgemeinen können
glycosylierte Polypeptide der Erfindung mit einem molaren Überschuss
an Glycopeptidase inkubiert werden (Boehringer Mannheim).
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Dementsprechend
sind ähnliche
DNA Konstrukte, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von
Aminosäuren-Resten
oder Sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder internen Resten
oder Sequenzen kodieren, durch die Erfindung umfasst. Zum Beispiel
können
N-Glycosylierungsstellen
in der extrazellulären
Domäne
des Polypeptids modifiziert werden, um die Glycosylierung zu verhindern,
was die Expression eines reduzierten Kohlenhydrat-Analogons in Säugetier-
und Hefe-Expressionsystemen ermöglicht.
Die N-Glycosylierungsstellen
in eukaryotischen Polypeptiden sind durch ein Aminosäure Triplett
Asn-X-Y gekennzeichnet,
wobei X eine beliebige Aminosäure,
außer
Pro ist und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Substitutionen, Additionen
oder Deletionen zu der Nukleotidsequenz, die diese Tripletts kodiert,
werden zu der Verhinderung der Anlagerung on Kohlenhydratresten
an die Asn-Seitenkette führen.
Die Änderung
eines einzelnen Nukleotids, welches so ausgewählt ist, dass Asn zum Beispiel
durch eine unterschiedliche Aminosäure ersetzt wird, ist ausreichend,
um eine N-Glycoslyierungsstelle zu inaktivieren. Alternativ kann
das Ser oder Thr durch eine andere Aminosäure, wie Ala, ersetzt sein.
Bekannte Verfahren für
das Inaktivieren der N- Glycosylierungsstellen
in Proteinen beinhalten jene, die im U.S Patent 5.071.972 und
EP 276.846 beschrieben sind.
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In
einem anderen Beispiel von Varianten können Sequenzen, die Cys-Reste
kodieren, die für
die biologische Aktivität
nicht essentiell sind, verändert
werden, um zu bewirken, dass Cys-Reste
deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die
Ausbildung von inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei der
Faltung oder Renaturierung zu verhindern.
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Andere
Varianten werden durch Modifizierung von benachbarten zweiwertigen
Aminosäure-Resten hergestellt,
um die Expression in Hefesystemen, in welchen KEX2 Protease-Aktivität vorhanden
ist, zu erhöhen.
EP 212.914 offenbart die
Verwendung einer ortsspezifischen Mutagenese, um die KEX2-Protease-Bearbeitungsstellen
in einem Protein zu inaktivieren. KEX2-Protease-Bearbeitungsstellen
werden durch Deletieren, Addieren oder Substituieren von Resten,
um Arg-Arg, Arg-Lys, und Lys-Arg-Paare zu verändern, um das Auftreten von
diesen benachbarten basischen Resten zu eliminieren, inaktiviert.
Lys-Lys-Paarungen sind wesentlich weniger empfänglich gegenüber einer
KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys
stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für das Inaktivieren
von KEX2-Stellen dar.
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Oligomere
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Durch
die Erfindung umfasst sind Oligomere oder Fusionsproteine, die IL-1
zeta, TDZ.1 oder TDZ.2 Polypeptide enthalten. Wenn das Polypeptid
der Erfindung ein Typ I Membranprotein ist, dann der Fusionspartner
an den C-Terminus des Typ I Membranproteins gebunden ist. Solche
Oligomere können
in Form von kovalent-gebundenen oder nicht-kovalent-gebundenen Multimeren
sein, einschließlich
Dimeren, Trimeren oder höhere
Oligomeren. Wie oben erwähnt
ist, sind bevorzugte Polypeptide löslich und folglich können diese Oligomere
lösliche
Polypeptide aufweisen. In einem Aspekt der Erfindung bewahren die
Oligomere die Bindungsfähigkeit
der Polypeptid-Komponenten und bieten dafür zwei-, dreiwertige, etc.
Bindungsstellen.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung ist auf Oligomere gerichtet, die mehrere Polypeptide
aufweisen, die über
kovalente oder nicht-kovalente Interaktionen zwischen Peptidanteilen
verbunden sind, die an die Polypeptide fusioniert sind. Solche Peptide
können
Peptidlinker (Spacer) oder Peptide, die Oligomerisierung-fördernde
Eigenschaften aufweisen, sein. Leucin-Zipper und bestimmte von Antikörper abgeleitete
Polypeptide sind unter den Peptiden, die die Oligomerisierung von
daran angelagerten Polypeptiden fördern, wie detaillierter unten
beschrieben ist.
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Immunglobulin-basierende
Oligomere
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Als
eine Alternative wird ein Oligomer unter Verwendung von Polypeptiden,
die von Immunglobulinen abgleitet sind, hergestellt. Die Herstellung
von Fusionsproteinen, die bestimmte heterologe Polypeptide, die mit
verschiedenen Abschnitten von Antikörperabgeleiteten Polypeptiden
(einschließlich
der Fc-Domäne)
fusioniert sind, aufweisen, wurde z.B. in Ashkenazi et al., PNAS
USA 88:10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; und Hollenbaugh
und Aruffo, „Construction
of Immunoglobulin Fusion Proteins," in Current Protocols in Immunology,
Suppl. 4, S. 10.19.1–10.19.11,
1992 beschrieben.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist auf ein Dimer gerichtet, das zwei
Fusionsproteine aufweist, die durch Fusionieren eines Polypeptids
der Erfindung an ein von einem Antikörper abgeleitetes Fc-Polypeptid
hergestellt wurden. Eine Genfusion, die das Polypeptid/Fc Fusionsprotein
kodiert, wird in einen geeigneten Expresssionsvektor eingeführt. Polypeptid/Fc
Fusionsproteine werden in Wirtszellen, die mit dem rekombinanten
Expressionsvektor transformiert sind, exprimiert, und es wird ihnen
ermöglicht,
sich ähnlich
wie Antikörpermoleküle zusammenzulagern,
woraufhin sich Zwischenketten-Disulfidbindungen zwischen den Fc-Anteilen
ausbilden, um zweiwertige Moleküle
zu ergeben.
-
Der
Begriff „Fc
Polypeptid", so
wie hierin verwendet, umfasst native und Muteinformen von Polypeptiden,
die aus der Fc-Region eines Antikörpers aufgebaut sind, der eine
beliebige oder alle der CH-Domänen der
Fc-Region ausweist. Verkürzte
Formen solcher Polypeptide, die die Hinge-Region enthalten, die
die Dimerisierung fördert,
sind ebenfalls eingeschlossen. Bevorzugte Polypeptide weisen ein
Fc-Polypeptid auf, welches von einem humanen IgG1-Antikörper abgeleitet
ist.
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Ein
geeignetes Fc-Polypeptid, beschrieben in der PCT Anmeldung WO 93/10151,
ist ein einkettiges Polypeptid, welches sich von der N-terminalen
Hinge-Region bis zu dem nativen C-Terminus der Fc Region eines menschlichen
IgG1 Antikörpers
erstreckt. Ein anderes nützliches
Fc-Polypeptid ist das im U.S. Patent 5.457.035 und in Baum et al.,
EMBO J. 13: 3992–4001,
1994 beschriebene Fc-Mutein. Die Aminosäure-Sequenz dieses Muteins
ist identisch zu der nativen Fc-Sequenz, die in WO 93/10151 dargestellt
ist, mit der Ausnahme, dass die Aminosäure 19 von Leu auf Ala, Aminosäure 20 von
Leu zu Glu, und Aminosäure
22 von Gly zu Ala geändert
wurde. Das Mutein zeigt eine verringerte Affinität für Fc-Rezeptoren.
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Die
oben-beschriebenen Fusionsproteine, die Fc-Anteile (und daraus gebildete
Oligomere) aufweisen, bieten den Vorteil einer leichten Reinigung
durch Affinitätschromatographie über Protein
A oder Protein G-Säulen.
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In
anderen Ausführungsformen
können
die Polypeptide der Erfindung durch den variablen Abschnitt einer
schweren oder leichten Kette eines Antikörpers ersetzt werden. Wenn
Fusionsproteine sowohl mit den schweren als auch leichten Ketten
eines Antikörpers
hergestellt werden, ist es möglich,
ein Oligomer mit bis zu vier Polypeptid extrazellulären Regionen
zu bilden.
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Peptidlinker-basierende
Oligomere
-
Alternativ
ist das Oligomer ein Fusionsprotein, welches mehrere Polypeptide,
mit oder ohne Peptidlinker (Spacer-Peptide) aufweist. Unter den
geeigneten Peptidlinker sind jene, die in den U.S. Patenten 4.751.180
und 4.935.233 beschrieben sind. Eine DNA Sequenz, die einen gewünschten
Peptidlinker kodiert, kann zwischen, und in den gleichen Leserahmen
wie, die DNA Sequenzen der Erfindung unter Verwendung einer beliebigen
geeigneten konventionellen Technik eingeführt werden. Zum Beispiel kann
ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, welches den Linker
kodiert, zwischen die Sequenzen ligiert werden. In besonderen Ausführungsformen
weist ein Fusionsprotein von zwei bis vier lösliche Polypeptide der Erfindung,
die durch Peptidlinker getrennt sind, auf.
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Leucin-Zipper
-
Ein
anderes Verfahren zum Herstellen von Oligomeren der Erfindung schließt die Verwendung
eines Leucin-Zippers ein. Leucin-Zipper-Domänen sind Peptide, die die Oligomerisierung
der Proteine, in welchen sie gefunden werden, fördern. Leucin-Zipper wurden
ursprünglich
in mehreren DNA-Bindungsproteinen (Landschulz et al., Science 240:1759,
1988) identifiziert, und sind seit damals in einer Vielzahl von
unterschiedlichen Proteinen gefunden worden. Unter den bekannten
Leucin-Zippers sind natürlich
vorkommende Peptide und Derivate davon, die dimerisieren oder trimerisieren.
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Die
Zipper-Domäne
(hierin auch als oligomerisierende oder Oligomer-bildende Domäne bezeichnet) weist
eine sich wiederholende Sequenz von sieben Aminosäuren (heptad
repeat) auf, die häufig
mit vier bis fünf
Leucin-Resten, die mit anderen Aminosäuren durchsetzt sind, aufweisen.
Beispiele von Zipper-Domänen sind
jene, die in dem Hefe-Transkriptionsfaktor GCN4 gefunden werden
und einem in Rattenleber gefundenen hitzestabilen DNA-Bindungsprotein (C/EBP;
Landschulz et al., Science, 243:1681, 1989). Zwei Kerntransformierende
Proteine, fos und jun, weisen ebenfalls Zipper-Domänen auf,
sowie das Genprodukt der murinen Protoonkogens, c-myc (Landschulz
et al., Science 240:1759, 1988). Die Produkte der nuklearen Onkogene
fos und jun weisen Zipper-Domänen
auf, die vorzugsweise Heterodimere bilden (O'Shea et al., Science, 245:646, 1989;
Turner et al., Science, 243:1689, 1989). Die Zipper-Domäne ist für die biologische
Aktivität
(DNA Bindung) in diesen Proteinen notwendig.
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Die
fusogenen Proteine mehrere unterschiedlicher Viren, einschließlich Paramyxovirus,
Coronavirus, Masernvirus und viele Retroviren, besitzen auch Zipper-Domänen (Buckland
et al., Nature, 338:547, 1989; Britton, Nature, 353:394, 1991; Delwart
und Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses, 6:703, 1990). Die
Zipper-Domänen
in diesen fusogenen viralen Proteinen sind in der Nähe der Transmembranregion
der Proteine; es ist vorgeschlagen worden, dass die Zipper-Domänen zu der
oligomeren Struktur der fusogenen Proteine beitragen könnten. Die
Oligomerisierung von fusogenen viralen Proteinen ist in der Fusionsporenbildung
eingebunden (Spruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3523,
1991). Es ist kürzlich
von Zipper-Domänen
berichtet worden, dass sie eine Rolle in der Oligomerisierung von
Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren (Rabindran
el al., Science, 25:230, 1993) spielen.
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Zipper-Domänen falten
als kurze, parallele coiled coils (O'Shea et al., Science, 254:539, 1991).
Die allgemeine Architektur von parallelen coiled coils sind gut
charakterisiert worden, mit einer „Knauf in Loch" (knobs-into-holes)-Packung,
wie von Crick in 1953 vorgeschlagen wurde (Crick, Acta Crystallogr.
6:689, 1953). Das durch eine Zipper-Domäne gebildete Dimer wird durch
das „heptad
repeat" stabilisiert,
mit der Bezeichung (abcdefg)n gemäß der Notation
von McLachlan und Stewart, J. Mol. Biol., 98:293, 1975, bei welcher
die Reste a und d im Allgemeinen hydrophobe Reste sind, wobei d
Leucin ist, das sich auf der gleichen Fläche der Helix anreiht. Für gewöhnlich treten
entgegengesetzt-gelandene Reste an den Positionen g und e auf. Somit
sind in einer parallelen coiled Coil, die aus zwei helicalen Zipper-Domänen gebildet
sind, die durch die hydrophoben Seitenkette der ersten Helix gebildeten „Knäufe" in die durch die
Seitenketten der zweiten Helix gebildeten „Löcher" gepackt.
-
Die
Reste an Position d (häufig
Leucin) tragen eine hohe hydrophobe Stabilisierungsenergie bei,
und sind für
die Oligomer-Bildung wichtig (Krystek et al., Int. J. Peptide Res.,
38:229, 1991). Lovejoy et al., Science, 259:1288, 1993, haben vor
kurzem über
die Synthese eines dreisträngigen α-helikalen
Bündels
berichtet, in welchem die Helices nach oben-oben-unten verlaufen.
Ihre Studien bestätigten,
dass die hydrophobe Stabilisierungserergie, die Hauptantriebskraft
für die
Bildung von coiled coils aus helikalen Monomeren bereitstellt. Diese
Studien weisen auch darauf hin, dass elektrostatische Interaktionen
zu der Stoichiometrie und Geometrie von coiled coils beitragen.
Eine weitere Erörterung
der Struktur von Leucin-Zippers kann in Harbury et al., Science,
262:1401, 1993 gefunden werden.
-
Beispiele
von Leucin-Zipper-Domänen,
die für
das Herstellen löslicher
oligomerer Proteine geeignet sind, sind in der PCT-Anmeldung WO
94/10308 beschrieben, und der vom Lungen oberflächenaktiven Protein D (SPD)
abgeleitete Leucin-Zipper ist in Hoppe et al., FEBS Letters, 344:191,
1994 beschrieben. Die Verwendung eines modifizierten Leucin-Zippers,
der eine stabile Trimerisierung eines daran fusionierten heterologen Proteins
ermöglicht,
wird in Fanslow et al., Semin. Immunol., 6: 267–278, 1994 beschrieben. Rekombinante Fusionsproteine,
die ein an ein Leucin-Zipper-Peptid fusioniertes lösliches
Polypeptid aufweisen, werden in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert,
und das sich bildende lösliche
Oligomer wird aus dem Kulturüberstand gewonnen.
-
Bestimmte
Leucin-Zipper-Anteile bilden vorzugsweise Trimere. Ein Beispiel
ist ein Leucin-Zipper,
der vom Lungen-oberflächenaktiven
Protein D (SPD) abgeleitet ist, wie in Hoppe et al., FEBS Letters,
344:191, 1994, und im U.S. Patent 5.716.805 beschrieben ist. Dieses
Lungen-SPD-abgeleitete
Leucin-Zipper-Peptid weist die Aminosäuresequenz Pro Asp Val Ala
Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His Leu
Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr (SEQ ID NO: 12) auf.
-
Ein
anderes Beispiel eines Leucin-Zippers, der die Trimerisierung fördert, ist
ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz
Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile
Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu
Arg (SEQ ID NO: 13) aufweist, wie im U.S. Patent 5.716.805 beschrieben ist.
Bei einer alternativen Ausführungsform
wird ein N-terminaler Asp-Rest hinzugefügt; in einer anderen, fehlt dem
Peptid der N-terminale Arg-Rest.
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Fragmente
der vorangehenden Zipper-Peptide, die die Eigenschaften des Förderns der
Oligomerisierung beibehalten, können
auch eingesetzt werden. Zu Beispielen von solchen Fragmenten zählen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Peptide, denen eine oder zwei der N-terminalen oder C-terminalen Reste,
die in den vorangehenden Aminosäure-Sequenzen
dargestellt sind, fehlen. Leucin-Zippers können von natürlich vorkommenden
Leucni-Zipper-Domänen abgeleitet
sein, z.B. über
konservate Substitution(en) in der natürlichen Aminosäuresequenz,
wobei die Fähigkeit
des Peptids, die Oligomerisierung zu fördern, beibehalten wird.
-
Andere
Peptide, die von natürlich
vorkommenden trimeren Proteinen abgeleitet sind, können beim Herstellen
trimerer Oligomere eingesetzt werden. Alternativ können synthetische
Peptide, die die Oligomerisierung fördern, eingesetzt werden. In
bestimmten Ausführungsformen
werden die Leucin-Reste in einem Leucin-Zipper-Anteil durch Isoleucin-Reste
ersetzt. Solche Isoleucin aufweisende Peptide können als Isoleucin-Zippers
bezeichnet werden, sind aber durch den Begriff „Leucin-Zippers", wie hierin eingesetzt,
umfasst.
-
Herstellung von Polypeptiden
und Fragmenten davon
-
Expression,
Isolierung und Reinigung der Polypeptide und Fragmente der Erfindung
kann durch jede geeignete Technik erreicht werden, einschließlich, ohne
jedoch darauf beschränkt
zu sein, die Folgende:
-
Expressionssystem
-
Die
vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante DNA enthaltende Klonierungs-
und Expressionsvektoren bereit, sowie Wirtszelle, die die rekombinanten
Vektoren enthalten. DNA enthaltende Expressionsvektoren können verwendet
werden, um die durch die DNA kodierten Polypeptide oder Fragmente
der Erfindung herzustellen. Ein Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden
weist das Kultivieren von mit einem rekombinanten Expressionsvektor,
der das Polypeptid kodiert, transformierten Wirtszellen unter Bedingungen,
die die Expression des Polypeptids fördern, und dann das Gewinnen
des exprimierten Polypeptids aus der Kultur auf. Der Fachmann wird
erkennen, dass das Verfahren zum Reinigen der exprimierten Polypeptide
in Abhängigkeit
von Faktoren wie der Art der eingesetzten Wirtszellen, und ob das
Polypeptid Membran-gebunden oder eine lösliche Form ist, die aus der
Wirtszelle sezerniert wird, variieren wird.
-
Jedes
geeignete Expressionssystem kann eingesetzt werden. Die Vektoren
enthalten eine wirkungsmäßig an geeignete
transkriptionale oder translatorische regulatorische Nukleotidsequenzen
gebundene DNA, die ein Polypeptid oder Fragment der Erfindung kodiert,
wie jene die von einem Säugetier-,
mikrobiellen, viralen oder Insektengen abgeleitet sind. Zu Beispielen
von regulatorischen Sequenzen zählen
Transkriptionspromotoren, Operatoren, Enhancer, eine mRNA ribosomale
Bindungsstelle, und geeignete Sequenzen, die die Transkription und
Translation- Initiierung und Termination steuern. Nukleotidsequenzen
sind wirkungsmäßig verbunden,
wenn sich die regulatorische Sequenz funktionell auf die DNA Sequenz
bezieht. Somit ist eine Promotor-Nukleotidsequenz wirkungsmäßig mit
einer DNA Sequenz verbunden, wenn die Promotor Nukleotidsequenz
die Transkription der DNA Sequenz steuert. Ein Replikationsursprung,
der die Fähigkeit
verleiht, in den gewünschten
Wirtszellen zu replizieren, und eine Selektionsgen, durch welches
Transformanten identifiziert werden, sind im Allgemeinen in dem
Expressionsvektor eingebaut.
-
Zusätzlich kann
eine ein geeignetes Signalpeptid (nativ oder heterolog) kodierende
Sequenz in die Expressionsvektor eingebaut werden. Eine DNA Sequenz
für ein
Signalpeptid (Leitsequenz) kann im Rahmen zu der Nukleinsäuresequenz
der Erfindung fusioniert sein, sodass die DNA anfänglich transkribiert
wird, und die mRNA, in das Fusionsprotein, welches das Signalpeptid
aufweist, translatiert wird. Ein Signalpeptid, welches in der beabsichtigten
Wirtszelle funktionell ist, fördert
die extrazelluläre
Sekretion des Polypeptids. Das Signalpeptid wird von dem Polypeptid
bei der Sekretion des Polypeptids aus der Zelle abgespalten.
-
Der
Fachmann wird auch erkennen, dass die Position(en), an welcher(n)
das Signalpeptid gespalten wird, von der(n) durch Computerprogramme
vorausgesagten abweichen kann, und kann gemäß Faktoren wie der Art der
zum Exprimieren eines rekombinanten Polypeptids eingesetzten Wirtszelle
variieren. Eine Proteinzubereitung kann eine Mischung von Proteinmolekülen mit
unterschiedlichen N-terminalen Aminosäuren enthalten, was daher resultiert,
dass das Signalpeptid an mehr als einer Stelle gespalten wird. Zu
bestimmtes Beispielen von reifen Proteinen zählen, ohne darauf beschränkt zu sein,
Proteine, die den Rest an den Positionen 6, 23, 25, 26, 39, 41,
oder 48 der SEQ ID NO: 3 und an den Positionen 1 oder 19 der SEQ
ID NO: 4 als die N-terminale Aminosäure aufweisen.
-
Geeignete
Wirtszellen für
die Expression von Polypeptiden umfassen Prokaryoten, Hefe, oder
höhere eukaryotische
Zellen. Säugetier-
oder Insektenzellen sind im Allgemeinen für die Verwendung als Wirtszellen bevorzugt.
Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit Bakterien,
Pilz, Hefe und Säugetierzell-Wirten
sind zum Beispiel in Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory
Manual, Elsevier, New York, 1985 beschrieben. Zellfreie Translationssystem
könnten
auch eingesetzt werden, um Polypeptide unter Verwendung von RNAs,
die von hierin offenbarten DNA Konstrukten abgeleitet sind, herzustellen.
-
Prokaryotische Systeme
-
Zu
Prokaryoten zählen
gram-negative oder gram-positive Organismen. Zu geeigneten prokaryotischen
Wirtszellen für
die Transformation zählen,
zum Beispiel, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium,
und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattung Pseudomonas,
Streptomyces und Staphylococcus. In einer prokaryotischen Wirtszelle,
wie etwa E. coli, kann ein Polypeptid einen N-terminalen Methionin-Rest
enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der
prokaryotischen Wirtszelle zu fördern.
Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten Polypeptid
abgespalten werden.
-
Expressionsvektoren
für die
Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen weisen im Allgemeinen
ein oder mehrere phänotypisch-selektierbare
Markergene auf. Ein phänotypischselektierbares
Markergen ist, zum Beispiel, ein Gen, das ein Protein kodiert, welches
antibiotische Resistenz verleiht oder das eine autotrophe Anforderung
bereitstellt. Zu Beispielen für
nützliche
Expressionsvektoren für
prokaryotische Wirtszellen zählen jene,
die von kommerziell erhältlichen
Plasmiden abgeleitet sind, wie etwa der Klonierungsvektor pBR322 (ATCC
37017). pBR 322 enthält
Gene für
Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit einfache Mittel für das Identifizieren
von transformierten Zellen bereit. Ein geeigneter Promotor und eine
DNA Sequenz werden in den pBR322 Vektor eingeführt. Zu anderen kommerziell
erhältlichen
Vektoren zählen
zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)
und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
-
Zu
Promotorsequenzen, die häufig
für rekombinante
prokaryotische Wirtszell-Expressionsvektoren verwendet
werden, zählen β-Lactamase
(Penicillinase), Lactose Promotorsystem (Chang et al., Nature, 275:615,
1978; und Goeddel et al., Nature, 281:544, 1979), Tryptophan (trp)
Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acid Res., 8:4057, 1980; und
EP-A-36776) und
tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
S. 412, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Ein besonders nützliches
prokaryotisches Wirtszellen-Expressionssystem
wendet einen Phage λPL Promotor und eine cI857ts thermolabile
Repressorsequenz an. Zu Plasmidvektoren, die von der American Type
Culture Collection erhältlich
sind, die Derivate des λPL Promotors einschließen, zählen Plasmid pHUB2 (innewohnend
in E. coli Stamm JMB9, ATCC 37092) und pPLc28 (innewohnend in E.
coli RR1, ATCC 53082)
-
Hefesysteme
-
Alternativ
können
die Polypeptide in Hefe-Wirtszellen, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces (z.B.
S. cerevisiae) exprimiert werden. Andere Hefegattungen, wie Pichia
oder Kluyveromyces können
auch eingesetzt werden. Hefevektoren werden häufig eine Replikationsursprungssequenz
des 2μ Hefeplasmids, eine
autonom replizierende Sequenz (ARS: autonomously relicating sequence),
eine Promotorsequenz, Sequenzen für Polyadenylierung, Sequenzen
für die
Transkriptionstermination und ein selektierbares Markergen enthalten.
Zu geeigneten Promotor-Sequenzen für Hefevektoren zählen unter
anderem die Promotoren für Metallothionein,
3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073,
1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme
Reg. 7:149, 1968; Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978) wie Enolase,
Glyceraldahyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase,
Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase,
Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phospho-Glucose-Isomerase, und Glucokinase.
Andere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung in der Hefe-Expression
sind weiters in Hitzeman, EPA-73.657 beschrieben. Eine andere Alternative ist
der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al.
J. Biol. Chem. 258:2674, 1982; und Beier et al., Nature 300:724,
1982 beschrieben wurde. In sowohl Hefe als auch E. coli replizierbare
Shuttle-Vektoren können
durch Einfügen
von DNA Sequenzen aus pBR322 für
die Selektion und Replikation in E. coli (Ampr-Gen
und Replikationsursprung) in den obenbeschriebenen Hefe-Vektor,
konstruiert werden.
-
Die
Hefe α-Faktor
Leitsequenz kann für
die direkte Sekretion von Polypeptiden verwendet werden. Die α-Faktor Leitsequenz
wird oft zwischen die Promotorsequenz und die Strukturgensequenz
eingefügt.
(Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; und Bitter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81:5330, 1984.) Andere Leitsequenzen, die für das Erleichtern
der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet
sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leitsequenz kann in der
Nähe ihres
3' Endes modifiziert
werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies
wird die Fusion der Leitsequenz mit dem Strukturgen erleichtern.
-
Hefe-Transformationsprotokolle
sind den Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen
et al. Protokoll selektiert für
Trp+ Transformanten in einem selektiven
Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoffbase, 0,5%
Casamino Säuren,
2% Glucose, 10 μg/ml
Adenin und 20μg/ml
Uracil besteht.
-
Hefewirtszellen,
die mit Vektoren, die eine ADH2-Promotor-Sequenz enthalten, transformiert
sind, können
für die
Expressionsinduktion in einem „reichen" Medium gezüchtet werden.
Ein Beispiel für
ein reiches Medium ist eines, welches aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton,
und 1% Glucose, ergänzt
mit 80μg/ml
Adenin und 80 μg/ml
Uracil besteht. Die Aufhebung der Unterdrückung des ADH2-Promotors tritt
ein, wenn die Glucose im Medium erschöpft ist.
-
Säugetier- oder Insektenzellsystem
-
Säugetier
oder Insekten-Wirtszellsysteme können
auch eingesetzt werden, um rekombinante Polypeptide zu exprimieren.
Bacculovirus-Systeme für
die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden
von Luckow et al. Bio/Technology 6:47, 1988 beschrieben. Etablierte
Zelllinien mit Säugetierursprung können ebenfalls
eingesetzt werden. Zu Beispielen von geeigneten Säugetier-Wirtszelllinien
zählen
die COS-7 Linie von Affennieren-Zellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman
et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127 Zellen, 3T3 Zellen (ATCC
CCL 163), chinesische Hamsterovarium-Zellen (CHO), HeLa Zellen,
und BHK (ATCC CRL 10) Zelllinien, und die CV1/EBNA Zelllinie, die
aus Afrikanischen Grünen
Meerkatzen der Nierenzelllinie CV1 (ATCC CCL 70) abgeleitet ist,
wie von Mc Mahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991 beschrieben ist.
-
Etablierte
Verfahren, um DNA in Säugetierzellen
einzuführen,
wurden von Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, Seiten
15–69,
1990 beschrieben. Zusätzliche
Protokolle unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzien, wie etwa
Lipofectamin-Lipidreagens
(Gibco/BRL) oder Lipofectamin-Plus Lipdreagens, können verwendet
werden, um Zellen zu transfizieren (Felgner et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84: 7413–7417,
1987). Zusätzlich
kann die Elektroporation verwendet werden, um Säugetierzellen unter Verwendung
konventioneller Prozeduren zu transfizieren, wie jene in Sambrook
et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band
1–3, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Die Selektion von stabilen Transformanten
kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren
durchgeführt
werden, wie zum Beispiel, Resistenz gegenüber zytotoxischen Arzneimitteln.
Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185: 487–511, 1990, beschreiben mehrere
Selektionsschemata, wie Dihydrofolat-Reductase (DHFR)-Resistenz. Ein
geeigneter Wirtsstamm für
die DHFR Selektion kann der CHO Stamm DX-B11 sein, welcher DHFR-defizient
ist (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216–4220, 1980).
Ein Plasmid, das die DHFR cDNA exprimiert, kann in den Stamm DX-B11
eingeführt
werden, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können in den
entsprechenden selektiven Medien wachsen. Andere Beispiele von selektierbaren
Markern, die in einen Expressionsvektor eingebaut werden können, beinhalten
cDNAs, die Antibiotika-Resistenz verleihen, wie G418 und Hygromycin
B. Zellen, die den Vektor enthalten, können auf der Basis der Resistenz
gegenüber
diesen Verbindungen selektiert werden.
-
Transkriptionale
und translatorische Steuersequenzen für Säugetier-Wirtszell-Expressionsvektoren können von
viralen Genomen herausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotor-Sequenzen
und Enhancer-Sequenzen sind von Polyoma-Virus, Adenovirus-2, Simian-Virus
40 (SV40), und humanem Cytomegalievirus abgeleitet. DNA Sequenzen,
die vom SV40 viralen Genom abgeleitet sind, wie zum Beispiel, SV40
Ursprung, früher
und später
Promotor, Enhancer, Spleiß,
und Polyadenylierungsstellen können
verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression
einer Strukturgensequenz in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen.
Virale frühe
und späte
Promotoren sind besonders nützlich,
da beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment erhalten werden
können,
das ebenfalls den viralen Replikationsursprung enthält (Fiers et
al., Nature 273:113, 1978; und Kaufman, Meth in Enzymology, 1990).
Kürzere
oder längere
SV40 Fragmente können
auch verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bplange Sequenz, die
sich von der HindIII-Stelle in Richtung BglI-Stelle erstreckt, die
im SV40 viralen Replikationsursprung lokalisiert ist, ist eingeschlossen.
-
Zusätzliche
Steuersequenzen, die gezeigt haben, die Expression von heterologen
Genen von Säugetier-Expressionsvektoren
zu verbessern, beinhalten solche Elemente wie das Expression-Anreicherungs-Sequenz-Element
(EASE), welches von CHO-Zellen abgeleitet ist (Morris et al., Animal
Cell Technology, S. 529–534,
1997; und PCT Anmeldung WO 97/25420) und den dreiteiligen Leiter
(TPL) und VA Gen RNAs vom Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol.
Chem. 257: 13475–13491,
1982). Die internen Ribosomeneintrittsstellen (IRES)-Sequenzen viralen
Ursprungs erlauben die effektive Translation von dicistronischen
mRNAs (Oh et al., Current Opinion in Genetics and Development 3:
295–300,
1993; und Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24: 2697–2700, 1996).
Es wurde gezeigt, dass die Expression einer heterologen cDNA als
Teil einer dicistronischen mRNA, gefolgt von einem Gen für einen
selektierbaren Marker (z.B., DHFR) die Transfizierbarkeit des Wirtes
und die Expression der heterologen cDNA verbessert (Kaufman, Meth.
in Enzymology, 1990). Beispielhafte Expressionsvektoren, die dicistronische
mRNAs verwenden, sind pTR-DC/GFP, beschrieben von Mosser et al.
Biotechniques 22: 150–161,
1997, und p2A5I, beschrieben von Morris et al., Animal Cell Technology,
S. 529–534
1997.
-
Ein
nützlicher
Hochexpressionsvektor, pCAVNOT, ist von Mosley et al., Cell 59:
335–348,
1989 beschrieben worden. Andere Expressionsvektoren für Verwendung
in Säugetier-Wirtszellen können wie
von Okayama et al., (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart, konstruiert
werden. Ein nützliches
System für
die stabile Expression auf hohem Niveau von Säugetier cDNAs in C 127 murinen
Brustepithelzellen können
im Wesentlichen wie von Cosman et al. Mol. Immunol. 23:935, 1986
beschrieben, konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor,
PMLSV N1/N4, von Cosman et al. Nature 312:768, 1984, beschrieben,
wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetier-Expressionsvektoren
sind im EP-A-0367566 und im WO 91/18982 beschrieben. Bei einer anderen
Alternative können
die Vektoren von Retroviren abgeleitet sein.
-
Ein
weiterer nützlicher
Expressionsvektor, pFLAG® kann verwendet werden.
FLAG® Technologie
richtet sich auf die Fusion eines hydrophilen pFLAG®-Markerpeptids
mit niederem Molekulargewicht (1 kD) an den N-Terminus eines rekombinanten
Proteins, welches durch den pFLAG®-Expressionsvektor
exprimiert wird. pDC311 ist ein anderer spezialisierter Vektor,
der für
das Exprimieren von Proteinen in CHO Zellen verwendet wird. pDC311
wird durch eine bicistronische Sequenz gekennzeichnet, die das Gen
von Interesse und ein Dihydrofolat-Reduktase (DHFR)-Gen mit einer internen
Ribosomen-Bindungsstelle für
die DHFR-Translation, ein
Expression-Anreicherungs-Sequenz-Element (EASE), den menschlichen
CMV-Promotor, eine
dreiteilige Leitsequenz, und eine Polyadenylierungsstelle enthält.
-
Hinsichtlich
der Signalpeptide, die verwendet werden können, kann das native Signalpeptid
durch ein heterologes Signalpeptid oder eine Leitsequenz, falls
gewünscht,
ersetzt werden. Die Wahl des Signalpeptids oder der Leitsequenz
hängt von
Faktoren wie z.B. der Art der Wirtszellen, in welchen das rekombinante
Polypeptid produziert wird, ab. Zu Beispielen von heterologen Singalpeptiden,
die in Säugetier-Wirtszellen
funktionell sind, zählen
die Signalsequenz für
Interleukin-7(IL-7), beschrieben im U.S. Patent 4.965.195; die Signalsequenz
für Interleukin-2-Rezeptor,
beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768 (1984); das Interleukin-4 Rezeptor-Signalpeptid,
beschrieben im
EP 367.566 ;
das Typ I Interleukin-1-Rezeptor-Signalpeptid,
beschrieben im U.S. Patent 4.968.607; und das Typ II Interleukin-I
Rezeptor-Signalpeptid, beschrieben in
EP
460.846 .
-
Reinigung
-
Die
Erfindung umfasst auch Verfahren zum Isolieren und Reinigen der
Polypeptide und Fragmente davon.
-
Isolierung und Reinigung
-
Die „isolierten" Polypeptide oder
Fragmente davon, die durch diese Erfindung umfasst sind, sind Polypeptide
oder Fragmente, die nicht in einer Umgebung sind, die identisch
zu einer Umgebung ist, in welcher es oder sie in der Natur gefunden
werden können.
Die „gereinigten" Polypeptide oder
Fragmente davon, die durch diese Erfindung umfasst sind, sind im
Wesentlichen frei von der Assoziation mit anderen Proteinen oder Polypeptiden,
zum Beispiel, als ein Reinigungsprodukt von rekombinanten Expressionssystemen,
wie jene die oben beschrieben sind oder als ein gereinigtes Produkt
aus einer nicht-rekombinanten Quelle wie etwa natürlich vorkommende
Zellen und/oder Gewebe.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann die Reinigung von rekombinanten Polypeptiden oder Fragmenten
unter Verwendung von Fusionen von Polypeptiden oder Fragmenten der
Erfindung an andere Polypeptide, um bei der Reinigung der Polypeptide
oder Fragmente der Erfindung zu helfen, erreicht werden. Solche
Fusionspartner können
das poly-His oder andere antigene Identifikationspeptide, die oben
beschrieben sind, sowie die früher
beschriebenen Fc-Anteile
enthalten.
-
Im
Bezug auf eine beliebige Art von Wirtszelle, wie dem Fachmann bekannt
ist, variieren die Verfahren zum Reinigen eines rekombinanten Polypeptides
oder Fragments in Abhängigkeit
von Faktoren wie der Art der eingesetzten Wirtszelle und ob das
rekombinante Polypeptid oder Fragment in das Kulturmedium sekretiert wird
oder nicht.
-
Im
Allgemeinen kann das rekombinante Polypeptid oder Fragment aus der
Wirtszelle, falls es nicht sezerniert wird, oder aus dem Medium
oder Überstand,
falls es löslich
ist und sezerniert wird, isoliert werden, gefolgt von einem oder
mehreren Konzentrierungs-, Aussalzungs-, Ionenaustausch, hydrophobe
Wechselwirkungs-, Affinitätsreinigungs-
oder Größenausschußchromatographie-Schritten.
Um diese Wege, um diese Schritte zu erreichen, zu spezifizieren,
kann das Kulturmedium unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel, eine Amicon oder Millipore
Pellicon Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Im Anschluss
an den Konzentrierungsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie
ein Gelfiltrationsmedium, aufgetragen werden. Alternativ kann ein
Anionenaustauscherharz eingesetzt werden, zum Beispiel, eine Matrix
oder Substrat mit anhängenden
Diethyaminoethyl (DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran,
Cellulose, oder andere Arten, die häufig in der Proteinreinigung eingesetzt
werden, sein. Alternativ kann ein Kationenaustauscherschritt verwendet
werden. Zu geeigneten Kationenaustauschern zählen verschiedene unlösliche Matrizen,
die Sulfopropyl- oder
Carboxymethyl-Gruppen aufweisen. Zusätzlich kann ein Chromatofokussierungsschritt
angewendet werden. Alternativ kann ein hydrophober Wechselwirkungschromatographie-Schritt
eingesetzt werden. Geeignete Matrizen können an Harz gebundene Phenyl-
oder Octyl-Anteile sein. Zusätzlich
kann Affinitätschromatographie
mit einer Matrix, die das rekombinante Protein selektiv bindet,
verwendet werden. Zu Beispielen von solchen eingesetzten Harzen
zählen
Lektin-Säulen,
Farbstoff-Säulen,
und Metall-chelatbildende Säulen.
Schließlich
können
ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Schritte
(RP-HPLC), die hydrophobe RP-HPLC Medien (z.B. Silicagel oder Polymerharz
mit anhängenden
Methyl, Octyl, Oxtyldecyl oder anderen aliphatischen Gruppen) verwenden,
eingesetzt werden, um die Polypeptide weiter zu reinigen. Einige
oder alle der zuvorgenannten Reinigungsschritte, in verschiedenen
Kombinationen, sind bekannt und können verwendet werden, um ein
isoliertes und gereinigtes rekombinantes Protein bereitzustellen.
-
Es
ist auch möglich,
eine Affinitätssäule zu benutzen,
die ein Polypeptid-bindendes Protein der Erfindung aufweist, wie
ein gegen die Polypeptide der Erfindung erzeugte monoklonaler Antikörper, um
die exprimierten Polypeptide affinitätszureinigen. Diese Polypeptide
können
von einer Affinitätssäule mittels
herkömmlicher
Techniken entfernt werden, d.h. in einem Hochsalz-Elutionspuffer und
dann für
die Verwendung in einen Niedersalzpuffer dialysiert werden oder
durch Ändern
des pH-Wertes oder anderer Komponenten, in Abhängigkeit der eingesetzten Affinitätsmatrix,
oder durch kompetitives Entfernen unter Verwendung des natürlichvorkommenden
Substrats des Affinitätsanteils,
wie ein von der Erfindung abgeleitetes Polypeptid.
-
In
diesem Aspekt der Erfindung können
Polypeptid-bindende Proteine, wie die Anti-Polypeptid Antikörper der Erfindung oder andere
Proteine, die mit dem Polypeptid der Erfindung interagieren, an
einen Festphasenträger
gebunden werden, wie eine Säulenchromatographiematrix
oder ein ähnliches
Substrat, das für Identifizieren,
Trennen oder Reinigen von Zellen geeignet ist, die die Polypeptide
der Erfindung auf ihren Oberflächen
exprimieren. Das Anheften von Polypeptid-bindenden Proteinen der
Erfindung an eine Festphasen-Kontatkfläche kann durch ein beliebiges
Mittel erreicht werden. Zum Beispiel können magnetische Mikrokügelchen
mit diesen Polypeptid-bindenden Proteinen überzogen werden und im Inkubationsgefäß durch
ein magnetisches Feld gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen
werden mit der Festphase in Kontakt gebracht, die solche Polypeptidbindenden
Proteine darauf aufweist. Zellen mit Polypeptiden der Erfindung
auf ihrer Oberfläche
binden an das fixierte Polypeptid-bindende Protein und ungebundene
Zellen werden dann weggewaschen. Dieses Affinitätsbindungsverfahren ist für das Reinigen,
Screenen oder Abtrennen solcher Polypeptid-exprimierenden Zellen
aus Lösung
nützlich.
Verfahren zum Freisetzten von positiv ausgewählten Zellen von der Festphase
sind im Stand der Technik bekannt und umfassen zum Beispiel die
Verwendung von Enzymen. Solche Enzyme sind vorzugsweise für die Zellen
nicht-toxisch und nicht-schädlich
und sind vorzugsweise darauf gerichtet, die Zell-Oberflächen-Bindungspartner
zu spalten.
-
Alternativ
können
Mischungen von Zellen, die verdächtigt
werden, Polypeptid-exprimierende Zellen der Erfindung zu enthalten,
zuerst mit einem biotinyliertem Polypeptid-bindenden Protein der
Erfindung inkubiert werden. Die Inkubationsperioden sind üblicherweise
zumindest ein Stunde lang, um eine ausreichende Bindung an die Polypeptide
der Erfindung sicherzustellen. Die resultierende Mischung wird dann
durch eine mit Avidin-beschichteten Kügelchen gepackte Säule geleitet,
wobei die hohe Affinität
von Biotin für
Avidin die Bindung der Polypeptidbindenden Zellen an die Kügelchen
bereitstellt. Die Verwendung von Avidin-beschichteten Kügelchen
ist im Stand der Technik bekannt (Berenson et al., J. Cell. Biochem.,
10D:239, 1986). Auswaschen von ungebundenem Material und die Freisetzung
von den gebunden Zellen wird mittels herkömmlicher Verfahren durchgeführt.
-
Der
gewünschte
Reinheitsgrad hängt
von der beabsichtigten Verwendung des Proteins ab. Ein relativ hoher
Reinheitsgrad ist wünschenswert,
wenn das Polypeptid in vivo verabreicht werden soll. In einem solchen Fall
werden die Polypeptide so gereinigt, dass keine Proteinbanden, die anderen
Proteinen entsprechen, bei der Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) nachweisbar sind. Es ist für einen Fachmann erkennbar,
dass mehrere dem Polypeptid entsprechenden Banden durch SDS-PAGE
visualisiert werden können,
aufgrund unterschiedlicher Glycosylsierung, unterschiedlicher posttranslatorischer
Bearbeitung, und dergleichen. Am meisten bevorzugt wird das Polypeptid
der Erfindung im Wesentlichen zur Homogenität gereinigt, wie durch eine
einzelne Proteinbande bei der Analyse mittels SDS-PAGE angezeigt wird.
Die Proteinbande kann durch Silberfärbung, Coomassie-Blue-Färbung oder
(wenn das Protein radioaktiv markiert ist) durch Autoradiographie
visualisiert werden.
-
Untersuchungen
-
Die
gereinigten Polypeptide der Erfindung (einschließlich Proteine, Polypeptide,
Fragmente, Varianten, Oligomere und andere Formen) können auf
ihre Fähigkeit,
den Bindungspartner zu binden, in jeglicher geeigneten Untersuchung,
wie etwa einer herkömmlichen
Bindungsuntersuchung, getestet werden. Um dies zu illustrieren,
können
die Polypeptide mit einem nachweisbaren Reagenz (z.B. einem Radionuklid,
Chromophor, Enzym, welches eine kolorimetrische oder fluorometrische
Reaktion katalysiert, oder dergeichen) markiert sein. Das markierte
Polypeptid wird mit Zellen, die den Bindungpartner exprimieren,
in Kontakt gebracht. Die Zellen werden dann gewaschen, um ungebundes,
markiertes Polypeptid zu entfernen, und das Vorhandensein von Zell-gebundener
Markierung wird durch eine geeignete Technik, gewählt in Abhängigkeit
von der Natur der Markierung, bestimmt.
-
Ein
Beispiel einer Bindungsuntersuchungsprozedur ist wie folgt. Ein
rekombinanter Expressionsvektor, der die Bindungspartner cDNA enthält, wird
unter Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt.
CV1-EBNA-1 Zellen in 10 cm2 Platten werden
mit dem rekombinanten Expressionsvektor transfiziert. CV-1/EBNA-1
Zellen (ATCC CRL 10478) exprimieren konstitutiv das EBV-Kernantigen-1,
angetrieben von dem CMV-unmittelbar-frühen Enhancer/Promotor.
CV1-EBNA-1 wurde von der afrikanischen Grünen Meerkatzen-Nierenzelllinie
CV-1 (ATCC CCL 70), wie von McMahan et al. (EMBO J.10:2821, 1991)
beschrieben, abgeleitet.
-
Die
transfizierten Zellen wurden für
24 Stunden kultiviert, und die Zellen in jeder Platte werden dann in
eine 24-Kammer-Platte aufgeteilt. Nach dem Kultivieren für zusätzliche
48 Stunden werden die transfizierten Zellen (etwa 4 × 104 Zellen/Kammer) mit BM-NFDM gewaschen, welches
Bindungsmedium ist (RPMI 1640, welches 25 mg/ml Rinderserumalbumin,
2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes pH 7,2 enthält), zu welchem 50 mg/ml fettfreie
Trockenmilch hinzugegeben wurde. Die Zellen werden dann für 1 Stunde
bei 37°C
mit verschiedenen Konzentrationen von, zum Beispiel, einem löslichen
Polypeptid/Fc Fusionprotein, das wie oben dargelegt hergestellt
wurde, inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit einer
konstanten sättigenden Konzentration
von einem 125I Maus-anti-Mensch IgG in Bindungsmedium
unter sanftem Agitieren bei 37°C
für 1 Stunde
inkubiert. Nach einem extensiven Waschen wurden die Zellen mittels
Trypsinisierung freigesetzt.
-
Der
oben eingesetzte Maus-anti-Human IgG ist gegen die Fc Region von
humanem IgG gerichtet und kann von Jackson Immunoresearch Laboratories
Inc, West Grove, PA, erhalten werden. Der Antikörper wird unter Verwendung
des Standard Choramin-T-Verfahrens radioiodiniert. Der Antikörper wird
an den Fc-Teil eines beliebiegen Polypeptid/Fc-Proteins, welches
an Zellen gebunden ist, binden. In allen Untersuchungen wird die
nicht-spezifische Bindung von 125I-Antikörper in
der Abwesenheit von Fc Fusionprotein/Fc, sowie in der Gegenwart
des Fc Fusionsproteins und einem 200-fachen molaren Überschuss
an unmarkiertem Maus-anti-Human IgG Antikörper untersucht.
-
Zell-gebundener 125I-Antikörper wurde auf einem Packard
Autogamma-Zähler
quantifiziert. Affinitätsberechnungen
(Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660, 1949) werden auf einem
RS/1 (BBN Software, Boston, MA), das auf einem Microvax Computer
läuft,
erzeugt.
-
Eine
andere Art einer geeigneten Bindungsuntersuchung ist eine kompetitive
Bindungsuntersuchung. Um dies zu illustrieren, kann die biologische
Aktivität
einer Variante durch Untersuchen der Fähigkeit der Variante, mit dem
nativen Protein um die Bindung zu dem Bindungspartner zu konkurrieren,
bestimmt werden.
-
Kompetitive
Bindungsuntersuchungen können
durch herkömmliche
Methoden durchgeführt
werden. Reagenzien, die in kompetitiven Bindungsuntersuchungen eingesetzt
werden können,
umfassen radiomarkierte Polypeptide der Erfindung und intakte Zellen,
die den Bindungspartner exprimieren (endogen oder rekombinant).
Zum Beispiel kann ein radiomarkiertes, lösliches IL-1 zeta Fragment
verwendet werden, um mit einer löslichen
IL-1 zeta-Variante um die Bindung an Zelloberflächen IL-1 zeta Rezeptoren zu
konkurrieren. Anstelle von intakten Zellen könnte man diese durch ein lösliches
Bindungspartner/Fc-Fusionsprotein, welches durch die Wechselwirkung
von Protein A oder Protein G (auf der Festphase) mit dem Fc Anteil
an eine Festphase gebunden ist, austauschen. Zu Chromatographie-Säulen, die
Protein A oder Protein G enthalten, zählen jene, die von Pharmacia
Biotech, Inc., Piscataway, NJ. erhältlich sind.
-
Eine
andere Art einer kompetitiven Bindungsuntersuchung nutzt radiomarkierte
lösliche
Bindungspartner, wie eine lösliche
IL-1 zeta Rezeptor/Fc-Fusion oder Xrec2 Ligand/Fc Fusionsprotein,
und intakte Zellen, die den Bindungspartner exprimieren. Qualitative
Ergebnisse können
durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsuntersuchungen
erhalten werden, während
Scatchard-Plots (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660, 1949)
benutzt werden können,
um quantitative Ergebnisse zu erzeugen.
-
VERWENDUNG VON IL-1 ZETA,
TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 UND Xrec2 NUKLEINSÄUREN ODER OLIGONUKLEOTIDE
-
Zusätzlich zur
Verwendung zum Exprimieren von Polypeptiden, wie oben beschrieben,
können
die IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 und Xrec2 Nukleinsäuren, einschließlich DNA,
RNA, mRNA und Oligonukleotide davon verwendet werden:
- – als
Sonden, um Nukleinsäure,
die Proteine der IL-1 Ligand und Rezeptorfamilien kodieren, zu identifizieren;
- – um
die menschlichen Chromosome 2 und X zu identifizieren;
- – um
Gene auf den menschlichen Chromosomen 2 und X zu kartieren;
- – um
Gene zu identifizieren, die mit bestimmten Krankheiten, Syndromen,
oder anderen Zuständen,
die mit den menschlichen Chromosomen 2 und X assoziiert sind, in
Verwindung stehen;
- – als
einzelsträngige
Sinn oder Gegensinn-Oligonukleotide, um die Expression von Polypeptiden,
die durch IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 und Xrec2 Gene kodiert
sind, zu inhibieren;
- – um
bei der Ermittlung von defekten Genen in einem Individuum zu helfen;
und
- – für die Gentherapie.
-
Sonden
-
Unter
den Verwendungen der hierin offenbarten Nukleinsäuren ist die Verwendung von
Fragmenten als Sonden oder Primer. Solche Fragmente weisen im Allgemeinen
zumindest etwa 17, zumindest 30, oder zumindest 60 zusammenhängende Nukleotide
einer DNA-Sequenz auf.
-
Da
Homologe der SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 und 7, von anderen Säugetierspezies,
hierin betrachtet werden, können
Sonden, die auf den humanen DNA Sequenzen der SEQ ID NO: 1, 2, 5,
6 und 7 basieren, verwendet werden, um cDNA Bibliotheken, die von
anderen Säugetierspezies
abgeleitet sind, unter Verwendung herkömmlicher Kreuz-Spezies-Hybridisierungstechniken
zu durchsuchen.
-
Unter
Verwendung der Kenntnis des genetischen Kodes zusammen mit den oben
dargelegten Aminosäuresequenzen
können
Sätze von
degenerierten Oligonukleotiden hergestellt werden.
-
Solche
Oligonukleotide sind als Primer, z.B. in Polymerase Kettenreaktionen
(PCR) nützlich,
wobei DNA Fragmente isoliert und amplifiziert werden.
-
Chromosom-Kartierung
-
Alle
oder ein Teil der Nukleinsäuren
von IL-1 zeta der SEQ ID NO: 1 oder IL-1 zeta Spleißvarianten
der SEQ ID NO: 5, 6, und 7, einschließlich Oligonukleotide, können von
Fachleuten verwendet werden, um mittels im Stand der Technik bekannter
Verfahren das humane Chromosom 2, sowie den spezifischen Locus darauf, der
die DNA der IL-1 Ligandenfamilienmitglieder enthält, zu identifizieren. Zusätzlich können alle
oder ein Teil der Nukleinsäuren
von Xrec2 der SEQ ID NO: 2, einschließlich Oligonukleotide, verwendet
werden, um das menschliche Chromosom X, sowie den spezifischen Locus
darauf, der die DNA der IL-1 Rezeptorfamilienmitglieder enthält, zu identifizieren.
Zu nützlichen
Techniken zählen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, die Verwendung der Sequenz oder Teile, einschließlich Oligonukleotide,
als eine Sonde in verschiedenen bekannten Techniken wie Radiation-Hybrid-Kartierung (hohe
Auflösung),
in-situ Hybridisierung an Chromosomenverteilungen (mäßige Auflösung), und
Southern blot-Hybridisierung an Hybrid-Zelllinien, die individuelle
humane Chromosomen enthalten (niedere Auflösung).
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Zum
Beispiel können
Chromosomen durch Radiation-Hybridisierung kartiert werden. PCR
wird mittels des Whitehead Institute/MIT Center für Genome
Research Genebrdige 4 Gruppe von 93 Radiation-Hybriden druchgeführt (http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STSreleases/july97/rhmap/genebridge4.html).
Primer wurden verwendet, welche innerhalb eines mutmaßlichen
Exons des Gens von Interesse liegt und welche ein Produkt der humanen
genomischen DNA amplifizieren, jedoch keine genomische Hamster DNA
amplifizieren. Die Ergebnisse der PCRs werden in einen Daten-Vektor umgewandelt,
welcher der Whitehaead/MIT Radiation Kartierungsseite (Mapping site)
im Internet (http://www-seq.wi.mit.edu) vorgelegt wurde. Die Daten
werden bewertet und die chromosomale Zuordnung und Platzierung in
Bezug auf bekannte Sequenz-Tag-Stellen (STS)-Marker auf der Radiation-Hybridkarte wird
bereitgestellt. Die folgenden Internetseiten (web sites) bieten
zusätzliche
Information über
die Radiation-Hybrid-Kartierung:
http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STSreleases/july97/07-97.INTRO.html).
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Identifizieren von assoziierten
Krankheiten
-
Wie
unten dargelegt ist, wurden die Nukleinsäuren von IL-1 zeta der SEQ
ID NO: 1, und IL-1
zeta Spleißvarianten
der SEQ ID NO: 5, 6 und 7 durch Radiation-Hybridisierung und Hoch-Durchsatz-Schrottschuß (shotgun)-Sequenzierung
der 2g11-12 Region des menschlichen Chromosoms 2 kartiert. Das menschliche Chromosom
2 ist mit spezifischen Krankheiten assoziiert, zu welchen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Glaucoma, ektodermale Dysplasie, Insulin-abhängiger Diabetes
mellitus, Faltenhaut (Wrinkly-Skin-Syndrom), T-Zellen Leukämie/Lymphom,
und tibiale Muskeldystrophie zählen.
Die Nukleinsäuren
von Xrec2 der SEQ ID NO: 2 wurden durch Radiation-Hybridisierung
und Hoch-Durchsatz-Schrottschuß (shotgun)-Sequenzierung der
Xp22 Region des menschlichen Chromosoms X kartiert. Das menschliche
Chromosom X ist mit Retinoschisis, Lissenzephalie, subkorticale
Laminalheteropie, Entwicklungsverzögerung, Cowchock-Syndrom, Bazex-Syndrom,
Hypertrichosis, lymphoproliferatives Syndrom, Immunodefizienz, Langer
mesomele Dysplasie, und Leukämie
assoziiert. Somit können
die Nukleinsäuren
der SEQ ID NO: 1, 5, 6, 7 und 2 oder ein Fragment davon durch einen
Fachmann unter Verwendung von bekannten Techniken verwendet werden,
um Anormalitäten,
die mit Genkartierung der Chromosome 2 und X assoziiert sind, zu
analysieren. Dadurch wird ermöglicht,
Bedingungen, bei welchen dieser Marker umgeordnet oder deletiert
ist, zu unterscheiden. Zusätzlich können Nukleinsäure-Moleküle der SEQ
ID NO: 1, 2, 5, 6 und 7 oder ein Fragment davon als ein positioneller Marker
verwendet werden, um andere Gene an unbekannten Stellen zu kartieren.
-
Die
DNA kann bei der Entwicklung von Behandlung für jede Krankheit, die (direkt
oder indirekt) durch defekte, oder unzureichende Mengen der Gene,
die den Nukleinsäuren
der Erfindung entsprechen, vermittelt sind, verwendet werden. Die
Offenbarung hierin von nativen Nukleotid-Sequenzen erlaubt die Ermittlung
von defekten Genen, und den Austausch davon mit normalen Genen.
Defekte Gene können
in in vitro diagnostischen Untersuchungen und durch Vergleich einer
hierin offenbarten nativen Nukleotidsequenz mit der eines Gens,
welches von einer Person stammt, von der vermutet wird, dass sie
einen Defekt in diesem Gen trägt, ermittelt
werden.
-
Sinn-Gegensinn
-
Andere
nützliche
Fragmente der Nukleinsäuren
schließen
Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide
ein, welche eine einzelsträngige
Nukleinsäuresequenz
(entweder RNA oder DNA) aufweisen, die in der Lage sind, an Ziel
mRNA (Sinn) oder DNA (Gegensinn)-Sequenzen zu binden. Gegensinn-
oder Sinn-Oligonukleotide können
ein Fragment der DNA (SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6 und 7) aufweisen. Solch
ein Fragment weist im Allgemeinen zumindest etwa 14 Nukleotide,
vorzugsweise etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide auf. Die Fähigkeit
ein Gegensinn- oder
ein Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz, die ein
gegebenes Protein kodiert, abzuleiten, ist zum Beispiel in Stein
et al., Cancer Res., 48:2659, 1998; und van der Krol et al., BioTechniques,
6:958, 1988 beschrieben.
-
Bindung
von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen
führt zu
der Bildung von Duplexen, die die Proteinexpression durch eines
von mehreren Mitteln blockiert oder inhibiert, einschließlich des
verstärkten
Abbaus der mRNA durch RNAseH, der Inhibierung des Spleißens, der
vorzeitigen Termination der Transkription oder Translation, oder
durch andere Mittel. Die Gegensinn-Oligonukleotide können somit
verwendet werden, um die Expression von Proteinen zu blockieren.
Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide weisen weiters Oligonukleotide
mit modifizierten Zucker-Phosphodiester-Rückgraten (oder andere Zuckerbindungen,
wie jene, die in WO 91/06629 beschrieben sind) auf, und wobei solche
Zuckerbindungen gegen endogene Nukleasen resistent sind. Solche
Oligonukleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind in vivo stabil
(d.h. in der Lage einem enzymatischen Abbau zu widerstehen), aber
bewahren die Sequenzspezifität,
um in der Lage zu sein, an die Ziel-Nukleotidsequenzen zu binden.
-
Andere
Beispiele von Sinn oder Gegensinn-Oligonukleotiden schließen jene
Oligonukleotide ein, die kovalent an organische Anteile gebunden
sind, wie jene, die in WO 90/10448 beschrieben sind, und andere Anteile,
die die Affinität
der Oligonukleotide für
eine Ziel-Nukleinsäure-Sequenz,
wie ein poly-(L-Lysin) erhöhen.
Weiters noch können
Einlagerungsmittel, wie Ellipticin, und Alkylanzien oder Metallkomplexe
an die Sinn oder Gegensinn-Oligonukleotide angelagert werden, um
die Bindungsspezifitäten
der Gegensinn oder Sinn-Oligonukleotide für die Ziel-Nukleotidsequenz
zu modifizieren.
-
Gegensinn
oder Sinn-Oligonukleotide können
in eine Zelle, die die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthält, mittels jeden Gentransfer-Verfahren
eingeführt
werden, einschließlich,
zum Beispiel, Lipofektion, CaPO4-vermittelte
DNA-Transfektion, Elektroporation, oder durch Verwenden von Gentransfer-Vektoren,
wie Epstein-Barr-Virus.
-
Gegensinn
oder Sinn-Oligonukleotide können
in eine Zelle, die die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz enthält, durch Bilden eines Konjugats
mit einem Ligandenbindungsmolekül
eingeführt
werden, wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Zu geeigneten Ligandenbindungsmoleküle zählen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Zelloberflächenrezeptoren,
Wachstumsfaktoren, andere Cytokine, oder andere Liganden, die an
Zelloberflächenrezeptoren
binden. Vorzugsweise beeinträchtigt
die Konjugation des Ligandenbindungsmoleküls die Fähigkeit des Ligandenbindungsmoleküls nicht
wesentlich, um an das entsprechende Molekül oder Rezeptor zu binden,
oder blockiert den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotids
oder ihrer konjugierten Version in die Zelle.
-
Alternativ
kann ein Sinn- oder ein Gegensinn-Oligonukleotid in eine Zelle,
die die Ziel-Nukleinsäure-Sequenz
enthält,
durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipid-Komplexes eingeführt werden,
wie in WO 90/10448 beschrieben ist. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipid-Komplex wird vorzugsweise
innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase aufgelöst.
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VERWENDUNG VON IL-1 ZETA,
TDZ.1, TDZ.2, TDZ.3 UND Xrec2 POLYPEPTIDEN UND FRAGMENTIERTEN POLYPEPTIDEN
-
Zu
den Verwendungen zählen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, die Folgenden:
- – Reinigung von Proteinen und
Messen der Aktivität
davon
- – Abgabemittel
- – Therapeutische
und Forschungsreagenzien
- – Kontrollen
für die
Peptidfragmentierung
- – Identifikation
von unbekannten Proteinen
- – Herstellung
von Antikörpern.
-
Reinigungsreagenzien
-
Jedes
der Polypeptide der Erfindung findet als ein Proteinreinigungsreagenz
Verwendung. Die Polypeptide können
an ein festes Trägermaterial
angelagert werden, und verwendet werden, um die Bindungspartnerproteine
durch Affinitätschromatographie
zu reinigen. In besonderen Ausführungsformen
wird ein Polypeptid (in einer beliebigen hierin beschriebenen Form,
die in der Lage ist, die Bindungspartner zu binden) an einen Feststoffträger durch
konventionelle Verfahren angelagert. Als ein Beispiel sind Chromatographie-Säulen, die funktionelle
Gruppe enthalten, die mit funktionellen Gruppen von Aminosäure-Seitenketten
der Proteine reagieren werden, erhältlich (Pharmacia Biotech,
Inc., Piscataway, NJ). Bei einer Alternative wird ein Polypeptid/Fc-Protein
(wie oben diskutiert) an Protein A oder Protein G-enthaltende Chromatographie-Säulen durch die
Wechselwirkung mit dem Fc-Anteil angelagert.
-
Das
Polypeptid findet auch beim Reinigen oder Identifizieren von Zellen,
die den Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimiert, Verwendung.
Polypeptide werden an eine Festphase, wie Säulenchromatographiematrix oder
ein ähnlich-geeignetes
Substrat gebunden. Zum Beispiel können magnetische Mikrokügelchen
mit den Polypeptiden beschichtet werden und durch ein Magnetfeld
in einem Inkubationsgefäß gehalten werden.
Suspensionen von Zellmischungen, die die Bindungspartner-exprimierenden
Zellen enthalten, werden mit der Festphase mit den Polypeptiden
darauf in Kontakt gebracht. Zellen, die den Bindungspartner auf der
Zelloberfläche
exprimieren, binden an die fixierten Polypeptide, und ungebundene
Zellen werden dann weggewaschen.
-
Alternativ
können
die Polypeptide an einen detektierbaren Anteil konjugiert sein und
dann mit den Zellen, die auf die Bindungspartner-Expression getestet
werden sollen, inkubiert werden. Nach der Inkubation wird ungebundenes,
markiertes Material entfernt und die Gegenwart oder die Abwesenheit
des detektierbaren Anteils auf den Zellen wird bestimmt.
-
In
einer weiteren Alternative werden Mischungen von Zellen, von denen
vermutet wird, dass sie Bindungspartner-exprimierende Zellen enthalten,
mit biotinylierten Polypeptiden inkubiert. Die Inkubationsperioden
sind üblicherweise
zumindest 1 Stunde lang, um eine ausreichende Bindung sicherzustellen.
Die resultierende Mischung wird dann durch eine mit Avidinbeschichteten
Kügelchen
gepackten Säule
geleitet, wobei die hohe Affinität
von Biotin für
Avidin die Bindung der gewünschten
Zellen an die Kügelchen
bereitstellt. Verfahren zum Verwenden von Avidin-beschichteten Kügelchen
sind bekannt (Berenson et al., J. Cell. Biochem. 10D:239, 1986).
Das Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und die Freisetzung
der gebundenen Zellen werden mittels herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
-
Messen der Aktivität
-
Polypeptide
finden auch Verwendung beim Messen der biologischen Aktivität des Bindungspartnerproteins
bezüglich
ihrer Bindungsaffinität.
Die Polypeptide können
folglich von jenen eingesetzt werden, die „Qualitätssicherungs"-Studien durchführen, z.B.
um die Haltbarkeit und Stabilität
von Protein unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Zum Beispiel können die
Polypeptide in Bindungsaffinitätsstudien
eingesetzt werden, um die biologische Aktivität eines Bindungpartnerproteins,
welches bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert oder in unterschiedlichen
Zellarten erzeugt wurde, zu messen. Die Proteine können auch verwendet
werden, um zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach der
Modifizierung eines Bindungspartnerproteins beibehalten wird (z.B.
durch chemische Modifizierung, Verkürzung, Mutation, etc.). Die
Bindungsaffinität
des modifizierten Bindungspartnerproteins wird mit der eines unmodifizierten
Bindungspartnerproteins verglichen, um nachteilige Auswirkungen
der Modifikationen auf die biologische Aktivität des Bindungspartners zu ermitteln.
Die biologische Aktivität
eines Bindungspartners kann somit bestimmt werden, bevor es zum
Beispiel in einer Forschungsstudie verwendet wird.
-
Abgabemittel
-
Die
Polypeptide finden auch Verwendung als Träger für Abgabemittel, die daran angeheftet
sind, an Zellen, die den Bindungspartner tragen. Die Polypeptide
können
somit verwendet werden, um diagnostische oder therapeutische Wirkstoffe
an solche Zellen (oder an andere Zellarten, bei denen festgestellt
wurde, dass sie die Bindungspartner auf der Zelloberfläche exprimieren)
in in vitro oder in vivo Verfahren abzugeben.
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Zu
detektierbaren (diagnostischen) und therapeutischen Wirkstoffen,
die an ein Polypeptid angeheftet werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein,
Toxine, andere cytototoxische Wirkstoffe, Arzneimittel, Radionuklide,
Chromophore, Enzyme, die eine kolorimetrische oder fluorometrische
Reaktion katalysieren, und dergleichen, wobei der bestimmte Wirkstoff
gemäß der beabsichtigten
Anwendung ausgewählt
ist. Unter den Toxinen sind Ricin, Abrin, Diphteria-Toxin, Pseudomonas
aeruginosa Exotoxin A, Ribosomeninaktivierende Proteine, Mycotoxine,
wie Trichothecenen, und Derivate und Fragmente (z.B. Einzelketten)
davon. Zu für die
diagnostische Verwendung geeigneten Radionukliden zählen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, 123I, 131I, 99mTc, 111In und 76Br. Zu Beispielen von Radionukliden, die
für die
therapeutische Verwendung geeignet sind, zählen 131I, 211At, 77Br, 186Re, 188Re, 212Pb, 212Bi, 109Pd, 64Cu, und 67Cu.
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Solche
Wirkstoffe können
an das Polypeptid durch jedes beliebige, geeignete herkömmliche
Verfahren angeheftet werden. Das Polypeptid weist funktionelle Gruppen
an den Aminosäure-Seitenketten auf,
die mit funktionellen Gruppen auf dem gewünschten Wirkstoff reagiert
werden können,
um zum Beispiel kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ kann das
Protein oder der Wirkstoff derivatisiert werden, um eine gewünschte reaktive
funktionelle Gruppe zu erzeugen oder anzuheften. Die Derivatisierung
kann die Anheftung eines der bifunktionellen Kopplungsreagenzien,
die für
das Anheften verschiedener Moleküle
an Proteine (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) erhältlich sind,
einschließen.
Eine Reihe von Techniken für
das Radiomarkieren von Proteinen sind bekannt. Radionuklid-Metalle
können
an die Polypeptide mittels zum Beispiel eines geeigneten bifunktionellen
Chelatbildners angeheftet werden.
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Konjugate,
die Polypeptide und einen geeigneten diagnostischen oder therapeutischen
Wirkstoff (vorzugsweise kovalent gebunden) aufweisen, werden auf
diese Weise hergestellt. Die Konjugate werden in einer Menge verabreicht
oder anderweitig eingesetzt, die für die bestimmte Anwendung passend
ist.
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Therapeutische Wirkstoffe
-
Polypeptide
der Erfindung können
beim Entwickeln von Behandlungen für jede Krankheit, die (direkt oder
indirekt) durch defekte, oder unzureichende Mengen der Polypeptide
vermittelt sind, verwendet werden. Diese Polypeptide können einem
Säugetier
verabreicht werden, welches an einer solchen Krankheit leidet.
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Die
hierin offenbarten Polypeptide können
beim Inhibieren einer biologischen Aktivität des Bindungspartners in in
vitro oder in vivo Prozeduren eingesetzt werden. Zum Beispiel kann
ein gereinigtes Xrec2-Rezeptorpolypeptid verwendet werden, um die
Bindung von einem Xrec2-Liganden
an einen endogenen Zelloberflächen
Xrec2-Rezeptor zu inhibieren, oder ein gereinigtes IL-1 zeta Polypeptid,
oder irgendeines ihrer Spleißvarianten
kann verwendet werden, um die Bindung von endogenem IL-1 zeta oder
Spleißvarianten
an ihren Zelloberflächen-Rezeptor zu inhibieren.
Biologische Wirkungen, die von der Bindung von Xrec2-Ligand an endogene
Xrec2-Rezeptoren herrühren,
werden somit inhibiert.
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Polypeptide
der Erfindung können
einem Säugetier
verabreicht werden, um eine Bindungspartner-vermittelte Krankheit
zu behandeln. Zu solchen Bindungspartner-vermittelten Krankheiten
zählen
Zustände,
die (direkt oder indirekt) durch den Bindungspartner hervorgerufen
oder verschlimmert werden.
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Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid in jeder hierin beschriebenen Form,
wie native Proteine, Varianten, Derivate, Oligomere, und biologisch
aktive Fragmente enthalten. In besonderen Ausführungsformen weisen die Zusammensetzungen
ein lösliches
Polypeptid oder eine Oligomer auf, welches lösliche Polypeptide der Erfindung
enthält.
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Bestimmte
Regionen von Interesse in dem IL-1 zeta Polypeptid können von
dem in 2 gebotenen molekularen Modell abgeleitet sein,
welche die Sekundärstruktur
es Moleküls
zeigt. Das Modell basiert auf den Kristallstrukturen von IL-1β und IL-1ra.
In der Figur sind die β-Stränge in Gelb
gezeigt, wobei ihre Richtung durch die Pfeilspitze angezeigt wird. β-Schleifen
sind in Blau gezeigt, und Coils sind in Grün gezeigt. Das Modell demonstriert,
dass es möglich
ist, die IL-1 zeta Struktur auf die IL-1β und IL-1ra-Struktur zu überlagern, ohne
das Molekül
zu beanspruchen. Der hohe Vertrauensgrad dieses molekularen Modells
ermöglicht,
dass es in der rationellen Arzneimittelkonstruktion verwendet werden
kann, um therapeutische Moleküle,
die vom IL-1 zeta abstammen, zu erzeugen.
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Zusammensetzungen,
die eine wirksame Menge eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung
enthalten, in Kombination mit anderen Komponenten, wie ein physiologischakzeptables
Verdünnungsmittel,
Träger oder
Exzipient, sind hierin bereitgestellt. Die Polypeptide können gemäß bekannten
Verfahren, die verwendet werden, um pharmazeutisch nützliche
Zusammensetzungen herzustellen, formuliert werden. Sie können in Beimischungen
kombiniert werden, entweder als das einzige aktive Material oder
mit anderen bekannten aktiven Materialien, die für eine gegebene Indikation
geeignet sind, mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln
(z.B. Salzlösung,
Tris-HCl, Acetat, und Phosphat-gepufferte Lösungen), Konservierungsmitteln (z.B.,
Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Solubilisatoren,
Adjuvansien und/oder Träger.
Zu geeigneten Formulierungen für
pharmazeutische Zusammensetzungen zählen jene, die in Remington's Pharmaceutical
Science, 16. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980
beschrieben sind.
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Zusätzlich können solche
Zusammensetzungen mit Polyethylenglycol (PEG), Metallionen komplexiert sein,
oder in polymere Verbindungen, wie Polyessigsäure, Glykolsäure, Hydrogele,
Dextran etc. eingebaut sein, oder in Liposome, Mikroemulsionen,
Mizellen, unilamellare oder mulitlamellare Vesikeln, Erythrozytenschatten
oder Sphäroblasten
enthalten sein. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen
Zustand, Löslichkeit,
Stabilität,
in vivo Freisetzungsrate, und in vivo Klärungsrate beeinflussen, und
werden somit gemäß der beabsichtigten
Anwendung ausgewählt.
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung können in jeder geeigneten Art
und Weise verabreicht werden, z.B., topisch, parenteral, oder durch
Inhalation. Der Begriff „parenteral" umfasst Injektion,
z.B. durch subkutane, intravenöse
oder intramuskuläre
Wege, ebenso eingeschlossen ist die lokale Verabreichung, z.B. an der
Stelle der Krankheit oder Verletzung. Die verzögerte Freisetzung aus Implantaten
ist ebenfalls vorgesehen. Ein Fachmann wird erkennen, dass geeignete
Dosierungen in Abhängigkeit
von Faktoren wie der Natur der zu behandelnden Krankheit, dem Körpergewicht
des Patienten, Alter, und dem allgemeinen Gesundheitszustand, und
dem Verabreichungsweg variieren werden.
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Vorläufige Dosierungen
können
entsprechend von Tierversuchen bestimmt werden, und die Skalierung
von Dosierungen für
die menschliche Verabreichung wird gemäß der im Stand der Technik
akzeptierten Gewohnheiten durchgeführt.
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Zusammensetzungen,
die die Nukleinsäuren
in physiologisch akzeptablen Formulierungen aufweisen, sind ebenfalls
vorgesehen. DNA kann zum Beispiel für die Injektion formuliert
sein.
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Forschungsreagenzien
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Eine
andere Verwendung der hierin offenbarten Polypeptide ist als ein
Forschungswerkzeug für
das Untersuchen der biologischen Wirkungen, die von der Wechselwirkung
von IL-1 zeta, oder einer beliebigen ihrer Spleißvarianten mit ihrem Bindungspartner,
und von Xrec2 mit ihren Bindungspartner, oder von der Inhibierung
dieser Wechselwirkungen auf unterschiedlichen Zellarten herrühren. Polypeptide
können
auch in in vitro Untersuchungen für das Detektieren von IL-1
zeta, Xrec2, der entsprechenden Bindungspartnern oder der Wechselwirkungen
davon eingesetzt werden.
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Die
hierin offenbarten Polypeptide können
verwendet werden, um die Zellsignalübertragung zu untersuchen.
IL-1 Familienliganden und Rezeptoren spielen eine zentrale Rolle
im Schutz gegen Infektion und Immun-entzündlichen Reaktionen, die eine
zelluläre
Signalübertragung,
das Aktivieren vaskulärer
Endothelzellen und Lymphozyten, die Induktion von entzündlichen
Zytokienen, Akut-Phase-Proteine, Hämatopoiese, Fieber, Knochenresorption,
Prostaglandine, Metalloproteinasen, und Adhäsionsmoleküle beinhalten. Mit dem kontinuierlichen
Anstieg der Zahl der bekannten IL-1 Familienmitgliedern, basiert
ein geeignetes Klassifikationsschema auf dem Vergleich der Polypeptidstruktur
sowie der Funktion (Aktivierungs- und regulatorische Eigenschaften).
Somit wäre
es wahrscheinlich, dass IL-1 zeta, TDZ.1, TDZ.2 und TDZ.3, wie andere
IL-1 Familienliganden (IL-1α,
IL-1β und
IL-18) und Xrec2, wie andere IL-1R Familienrezeptoren (IL-1RI; IL-1RII; IL-1Rrp1,
und AcPL) sowohl in einige der oben erwähnten Funktionen eingebunden
sind als auch entzündliche Reaktionen
fördern
können
und vielleicht deshalb in die Ursache und Erhaltung einer entzündlichen
und/oder Autoimmunerkrankung, wie rheumatoide Arthritis, entzündliche
Darmerkrankung, und Psoriasis eingebunden sind. Als solches können Änderungen
in der Expression und/oder Aktivierung der hierin offenbarten Polypeptide
schwere Auswirkungen auf eine Unmenge von zellulären Vorgängen haben, einschließlich, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Aktivierung oder Inhibierung von zellspezifischen Reaktionen
und Proliferation. Die Expression von kloniertem IL-1 zeta, TDZ.1,
TDZ.2, TDZ.3, Xrec2, oder funktionell inaktiven Mutanten davon, kann
verwendet werden, um die Rolle eines bestimmten Proteins zu identifizieren,
die es beim Vermitteln spezifischer Signalisierungsvorgängen spielt.
Die zelluläre
Signalübertragung
schließt
häufig
eine molekulare Aktivierungskaskade ein, während welcher ein Rezeptor
ein Ligand-Rezeptor-vermitteltes Signal durch spezifisches Aktivieren
von intrazellulären
Kinasen, die Zielsubstrate phosphorylieren, verbreitet. Diese Substrate können selbst
Kinasen sein, welche im Anschluss an die Phosphorylierung aktiviert
werden. Alternativ können sie
Adaptor-Moleküle
sein, die die stromabwärtige
Signalübertragung
durch Protein-Protein-Wechselwirkung in Anschluss an die Phosphorylierung
fördern.
Unabhängig
von der Natur des(r) Substratmoleküle, können exprimierte funktionell-aktive
Formen von Xrec2, IL-1 zeta, IL-1 zeta Spleißvarianten, und ihrer Bindungspartner verwendet
werden, um festzustellen, welche Substrate durch die Polypeptide
erkannt und aktiviert wurden. Als solches können diese neuartigen Polypeptide
als Reagenzien verwendet werden, um neuartige Moleküle zu identifizieren,
die in Signalübertragungswege
eingebunden sind.
-
Identifikation von unbekannten
Proteinen
-
Ein
Polypeptid oder Peptid-Fingerprint kann in eine Datenbank bekannter
Proteine eingeben werden, oder mit dieser verglichen werden, um
bei der Identifikation des unbekannten Proteins mittels Massenspektroskopie
zu helfen (W.J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 5011–5015, 1993;
Fenyo et al., Electrophoresis, 19: 998–1005, 1998). Eine Vielzahl
von Computersoftware-Programm sind über das Internet zugänglich,
um diese Vergleiche zu erleichtern, wie Protein Prospector (Internet-Seite:
prospector.uscf.edu), MultiIdent (Internet-Stelle: www.expasy.ch/sprot/multiident.html),
PeptideSearch (Internet-Seite: www.mann.embl-heidelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearchForm.html);
und ProFound (Internet-Seite: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html).
Diese Programme ermöglichen
dem Benutzer, die Spaltungsmittel und die Molekulargewichte der
fragmentierten Peptide innerhalb einer vorgesehenen Toleranz zu
spezifizieren. Die Programme vergleichen beobachtete Molekulargewichte
mit vorausgesagten Molekulargewichten von Peptiden, die von Sequenz-Datenbanken
stammen, um beim Bestimmen der Identität des unbekannten Proteins
zu helfen.
-
Zusätzlich kann
ein Polypeptid oder Peptidverdau mittels Tandem-Massenspektrometrie
(MS/MS) sequenziert werden und die resultierende Sequenz wird gegen
Datenbanken durchsucht (Eng et al., J. Am. Soc. Mass Spec., 5: 976–989, 1994;
M. Mann et al., Anal. Chem., 66: 4390–4399, 1994; und J.A. Taylor
et al., Rapid Comm. Mass. Spec., 11: 1067–1075, 1997). Suchprogramm,
die in diesem Vorgang verwendet werden können, existieren im Internet,
wie Lutefisk 97 (Internet-Seite: www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html),
und die oben beschriebenen Protein Prospector, Peptide Search und
ProFound-Programme.
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Deshalb
kann das Hinzufügen
einer Gensequenz und der vorhergesagten Proteinsequenz und Peptidfragmente
zu einer Sequenzdatenbank bei der Identifizierung von unbekannten
Proteinen mittels Tandem-Massenspektroskopie helfen.
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Antikörper
-
Antikörper, die
mit den Polypeptiden der Erfindung immunoreaktiv sind, werden hierin
bereitgestellt. Solche Antikörper
binden spezifisch an die Polypeptide über die Antigenbindungsstellen
der Antikörper
(im Gegensatz zu nicht-spezifischer Bindung). Somit können die
Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsproteine, etc, wie oben
dargelegt, als Immunogene zum Herstellen von damit immunoreaktiven
Antikörpern
eingesetzt werden. Spezifischer enthalten die Polypeptide, Fragmente,
Varianten, Fusionsproteine, etc. antigene Determinanten oder Epitope,
die die Bildung von Antikörpern
auslösen.
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Diese
antigenen Determinanten oder Epitope können entweder linear oder konformativ
(diskontinuierlich) sein. Lineare Epitope bestehen aus einem einzigen
Abschnitt von Aminosäuren
des Polypeptids, während konformative
oder diskontinuierliche Epitope aus Aminosäuren-Abschnitte von unterschiedlichen
Regionen der Polypeptidkette bestehen, die bei der Proteinfaltung
in unmittelbare Nähe
gebracht werden (C.A. Janeway, Jr. und P. Travers, Immuno Biology,
3:9, Garland Publishing Inc., 2. Ausgabe, 1996). Da gefaltete Proteine komplexe
Oberflächen
aufweisen, ist die Anzahl der verfügbaren Epitope recht zahlreich;
jedoch aufgrund der Konformation des Proteins und der sterischen
Hinderung ist die Zahl der Antikörper,
die tatsächlich
an die Epitope binden, kleiner als die Zahl der verfügbaren Epitope
(C.A. Janeway, Jr. und P. Travers, Immuno Biology, 2:14, Garland
Publishing Inc., 2. Ausgabe, 1996). Epitope können durch jedes der im Stand
der Technik bekannten Verfahren identifiziert werden.
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Antigene
Epitope der Polypeptide der Erfindung sind für das Züchten von Antikörpern, insbesondere monoklonale
Antikörper
nützlich,
wie detaillierter unten beschrieben ist. Zusätzlich können die Epitope der Polypeptide
der Erfindung als Forschungreagenzien, in Untersuchungen, und zum
Reinigen von spezifisch bindenden Antikörpern aus Substanzen, wie polyklonalem
Sera oder Überständen von
kultivierten Hybridoma verwendet werden. Solche Epitope oder Varianten
davon können
mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie Festphasen-Synthese, chemische
oder enzymatische Spaltung von Polypeptiden, oder mittels rekombinanter
DNA Technologie hergestellt werden.
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Wie
bei den Antikörpern,
die durch die Epitope der Polypeptide der Erfindung ausgelöst werden,
können
auch wenn die Epitope isoliert wurden oder Teil des Polypeptids
bleiben, sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper mittels
herkömmlichen
Techniken hergestellt werden. Siehe zum Beispiel Kennet et al., (Hrsg.)
Monoclonal Antibodies, Hybridoms: A New Dimension in Biological
Analyses, Plenum Press, New York, 1980; und Harlow und Land (Hrsg.),
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1988.
-
Hybridom-Zelllinien,
die für
die Polypeptide der Erfindung spezifische monoklonale Antikörper erzeugen,
sind hierin ebenfalls vorgesehen. Solche Hybridome können durch
herkömmliche
Techniken erzeugt und identifiziert werden. Ein Verfahren zum Erzeugen
einer solchen Hybridom-Zelllinie weist das Immunisieren eines Tieres
mit einem Polypeptid, das Ernten der Milzzellen von dem immunisierten
Tier; das Fusionieren der Milzzellen mit einer Myelom-Zelllinie,
wodurch die Hybridom-Zelllinie erzeugt wird, und das Identifizieren
einer Hybridom-Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert,
der das Polypeptid bindet, auf. Der monoklonale Antikörper kann
durch konventionelle Techniken gewonnen werden.
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Die
monoklonalen Antikörper
der vorliegenden Erfindung schließen chimäre Antikörper, z.B humanisierte Versionen
eines murinen monoklonalen Antikörpers
ein. Solche humanisierte Antikörper
können
durch bekannte Techniken hergestellt werden, und bieten den Vorteil
einer reduzierten Immunogenität,
wenn die Antikörper
Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform weist ein humanisierter
monoklonaler Antikörper
die variable Region eines murinen Antikörpers (oder nur die Antigenbindungsstelle
davon) und eine von einem menschlichen Antikörper stammende konstante Region
auf. Alternativ kann ein humanisiertes Antikörper-Fragment die Antigen-Bindungsstelle
eines murinen monoklonalen Antikörpers
und ein Fragment der variablen Region (die Antigenbindungsstelle
fehlt), das von einem menschlichen Antikörper stammt, aufweisen. Verfahren
für die
Herstellung von chimären
und weiteren konstruierten monoklonalen Antikörper schließen jene ein, die in Riechmann
et al., Nature, 332:323, 1988; Liu et al., PNAS, 84:3439, 1987;
Larrick et al., Bio/Technology, 7:934, 1989; und Winter et al.,
TIPS, 14:139, 1993 beschrieben sind. Verfahren zum transgenen Herstellen
von Antikörpern
können
in
GB 2.272.440 , in
US Patent Nos. 5.569.825 und 5.545.806 und verwandten Patenten,
die von diesen die Priorität
beanspruchen, gefunden werden.
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Antigen-bindende
Fragmente der Antikörper,
die durch herkömmliche
Techniken hergestellt sind, sind durch die vorliegende Erfindung
ebenfalls umfasst. Zu Beispielen solcher Fragmente zählen, ohne
darauf beschränkt
zu sein, Fab und F(ab')2-Fragmente. Mittels Gentechnik hergestellte
Antikörper-Fragmente
und Derivate werden ebenfalls bereitgestellt.
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In
einer Ausführungsform
sind die Antikörper
spezifisch für
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung und reagieren nicht mit
anderen Proteinen kreuz. Screening-Verfahren durch welche solche
Antikörper
identifiziert werden können,
sind bekannt und können,
zum Beispiel, Immunaffinitätschromatographie,
einschließen.
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Verwendungen davon
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Die
Antikörper
der Erfindung können
in Untersuchungen verwendet werden, um das Vorhandensein der Polypeptide
oder Fragmente der Erfindung, entweder in vitro oder in vivo zu
ermitteln. Die Antikörper
können
auch zum Reinigen der Polypeptide oder Fragmente der Erfindung durch
Immunäffinitätschromatographie eingesetzt
werden.
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Jene
Antikörper,
die zusätzlich
die Bindung der Polypeptide der Erfindung an die Bindungspartner
blockieren, können
verwendet werden, um eine biologische Aktivität zu inhibieren, die von einer
solchen Bindung herrührt.
Solche Blockierungsantikörper
können
unter Verwendung jeder geeigneten Untersuchungsprozedur, wie zum
Beispiel durch Testen der Antikörper
auf die Fähigkeit,
die Bindung von IL-1 zeta, TDZ.1 oder TDZ.2 an bestimmte Zellen,
die die IL-1 zeta Rezeptoren exprimieren, zu inhibieren, identifiziert
werden. Alternativ können
Blockierungsantikörper
in Untersuchungen auf die Fähigkeit,
eine biologische Wirkung zu inhibieren, die von der Bindung der
Polypeptide der Erfindung an ihre Bindungspartner zu Zielzellen
herrührt,
identifiziert werden. Antikörper
können,
zum Beispiel, auf die Fähigkeit,
die IL-1 zeta-vermittelte, oder Bindungspartner-vermittelte Zelllyse
zu inhibieren, untersucht werden.
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Ein
solcher Antikörper
kann in einem in vitro Verfahren eingesetzt werden, oder in vivo
verabreicht werden, um eine biologische Aktivität zu inhibieren, die durch
die Einheit, die den Antikörper
erzeugte, vermittelt wird. Krankheiten, die durch die Wechselwirkung
der Polypeptide der Erfindung mit dem Bindungspartner hervorgerufen
oder verschlimmert werden (direkt oder indirekt), können folglich
behandelt werden. Ein therapeutisches Verfahren schließt die in
vivo Verabreichung eines Blockierungsantikörpers an ein Säugetier
in einer Menge ein, die wirksam ist, eine Bindungspartner-vermittelte
biologische Aktivität
zu inhibieren. Monoklonale Antikörper
werden im Allgemeinen für
die Verwendung in solchen therapeutischen Verfahren bevorzugt. In
einer Ausführungsform
wird ein Antigen-bindendes Antikörper-Fragment
eingesetzt.
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Antikörper können auf
agonistische (d.h. Ligand-imitierende) Eigenschaften gescreent werden.
Solche Antikörper
induzieren bei der Bindung an Zelloberflächen-Rezeptor biologische Wirkungen
(z.B. Übertragung von
biologischen Signalen), ähnlich
zu den induzierten biologischen Wirkungen, wenn IL-1 an die Zelloberflächen IL-1
Rezeptoren bindet. Agonistische Antikörper können verwendet werden, um vaskuläre Endothelzellen
und Lymphozyten zu aktivieren, um lokale Gewebszerstörung und
Fiber zu induzieren (Janeway et al., 1996), um Makrophagen und vaskuläre Endothelzellen
zu stimulieren, um IL-6 zu erzeugen, und um Moleküle auf der
Oberfläche
von vaskulären
Endothelzellen hinauf zu regulieren.
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Zusammensetzungen,
die einen gegen Polypeptide der Erfindung gerichteten Antikörper und
ein physiologisch akzeptables Verdünnungsmittel, Exzipient oder
Träger
enthalten, sind hierin vorgesehen. Geeignete Komponenten solcher
Zusammensetzungen sind oben für
Zusammensetzungen, die Polypeptide der Erfindung enthalten, beschrieben.
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Ebenfalls
hierin vorgesehen sind Konjugate, die einen nachweisbaren (d.h.
diagnostischen) oder therapeutischen Wirkstoff, der an den Antikörper angelagert
ist, aufweisen. Beispiele von solchen Wirkstoffen sind oben dargestellt.
Die Konjugate finden in in vitro oder in vivo – Verfahren Verwendung.
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Die
folgenden Beispiele sind vorgesehen, um bestimmte Ausführungsformen
der Erfindung weiter zu erläutern,
und sind nicht dahin auszulegen, dass sie den Umfang der vorliegenden
Erfindung beschränken.
Es ist zu erwähnen,
dass TDZ.3 und Xrec2 nicht in den Umfang der vorliegenden Erfindung
fallen.
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Beispiel 1: Isolierung
von IL-1 zeta und Xrec2-Nukleinsäuren
-
Die
humane IL-1 zeta Nukleinsäuresequenz
wurde durch Sequenzieren des EST IMAGE Klons 1628761, Zugangsnummer
AI014548, welcher einen partiellen offenen Leserahmen (ORF) kodiert,
erhalten. Eine Reihe von cDNA-Bibliotheken wurde mit internen Primer
durchsucht, um das Expressionsmuster des Polypeptids zu bestimmen.
Nach dem Durchführen
der PCR mittels zwei internen Primer der humanen IL-1 zeta Sequenz,
waren die folgenden cDNA-Bibliotheken für IL-1 zeta Sequenzen positiv:
Knochenmarkstroma, menschlicher Pankreastumor, und Raji (B-Zelllinie).
IL-1 zeta Klone wurden aus humanen genomischen DNA-Sequenzen, Knochenmarkstroma
und menschlichen Pankreastumor-Bibliotheken isoliert und sequenziert.
-
Menschliche
Xrec2-Sequenzen wurden durch Hoch-Durchsatz-Screening, PCR, und
5' RACE Reaktionen
erhalten. Hoch-Durchsatz-Schrottschuß (shotgun)-Sequenzierung der
chromosomalen Region Xp11 lieferte Sequenzen für Exons 4–6 von Xrec2 (Genbank Zugangsnummern
AL031466 und AL031575). Ähnlicherweise
ergab die Sequenzierung der Chromosomenregion Xp22-164-166 (Genban
Zugangsnummer AC005748) Sequenzen für Exons 10–12 von Xrec2.
-
PCR
(40 Zyklen) wurde an einer ersten Strang cDNA von menschlichem Hirn
unter Verwendung von Primer (10 picomol/Reaktion) innerhalb Exon
5 und 11 und Hotstar Taq-Polymerase
(Qiagen, Valencia, CA) durchgeführt,
wodurch Sequenzen für
Exons 7–9
erzeugt werden. 5' RACE
Reaktionen wurden dann mittels Hoden cDNA und verschachtelten Primer
innerhalb Exon 4, um Exon 3-Sequenzen zu erhalten, die das vorausgesagte
Initiator Methionin enthielten, durchgeführt. Sowohl PCR als auch die
5' RACE Reaktionen
wurden unter Verwendung von Standardprotokollen durchgeführt.
-
Beispiel 2: Verwendung
von gereinigten IL-1 zeta und Xrec2 Polypeptiden
-
Polypeptid-spezifischer
ELISA:
-
Linbro/Titerteck
96 Flachboden-Kammer-E.I.A. Mikrotitrationsplatten (ICN Biomedicals
Inc, Aurora, OH) werden mit seriellen Verdünnungen von IL-1 zeta oder
Xrec-2 enthaltenden Proben (in 50 mM NaHCO3, mit
NaOH auf pH 9 gebracht) bei 100:1/Kammer beschichtet. Nach der Inkubation
bei 4°C
für 16
Stunden wurden die Kammern sechsmal mit 200:1 0,05% Tween-20 enthaltendem PBS
(PBS-Tween) gewaschen. Die Kammern werden dann mit Flag®-Bindungspartner mit
1 mg/ml in PBS-Tween mit 5% fötalem
Kälberserum (FCS)
für 90
Minuten (100:1) inkubiert, gefolgt von Waschen wie oben angegeben.
Als nächstes
wird jede Kammer mit Anti-Flag® (monoklonaler Antikörper M2
mit 1 mg/ml in 5% FCS enthaltendem PBS-Tween für 90 Minuten (100:1 pro Kammer)
inkubiert, gefolgt von Waschen wie oben angegeben. Im Anschluss
daran werden die Kammern mit einem polyklonalen Ziegen-anti-mIgG1-spezifischen
Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antikörper (eine 1:5000 Verdünnung der
kommerziellen Stammlösung,
in 5% FCS enthaltendem PBS-Tween) für 90 Minuten (100:1 pro Kammer)
inkubiert. Der HRP-konjugierte Antikörper wird von Southern Biotechnology
Associates, Inc., Birmingham, Alabama erhalten. Die Kammern wurden
dann, wie oben, sechsmal gewaschen.
-
Für die Entwicklung
des ELISAs, wird eine Substratmischung [100:1 pro Kammer einer 1:1
Vormischung des TMB Peroxidase-Substrats und Peroxidase Lösung B (Kirkegaard
Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland)] zu den Kammern hinzugefügt. Nach
einer ausreichenden Farbreaktion wird die enzymatische Reaktion
durch Zugage von 2 N H2SO4 (50:1
pro Kammer) beendet. Die Farbintensität (zeigt die Ligand-Rezeptor-Bindung
an) wird durch Messen der Extinktion bei 450nm auf einem V Max Plattenlesegerätes (Molecular
Devices, Sunnyvale, CA) bestimmt.
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Beispiel 3: Aminosäure-Sequenz
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Die
Aminosäure-Sequenz
von IL-1 zeta und Xrec2 wurden durch Translation der vollständigen Nukleotidsequenzen
der SEQ ID NO: 1 bzw. 2 bestimmt.
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Beispiel 4: DNA und Aminosäure-Sequenzen
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Die
IL-1 zeta und Xrec2 Nukleinsäure-Sequenzen
wurden durch Standard-doppelsträngiges
Sequenzieren der Misch-Sequenz der EST IMAGE Klone (Zugangsnummer
AI014548 (IL-1 zeta) und Nr. AL031575 und Nr. AC005748 (Xrec2)),
und von zusätzlichen
durch PCR und 5' RACE
Reaktionen erhaltenden Sequenzen bestimmt.
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Die
Nukleotidsequenz der isolierten IL-1 zeta und Xrec2 DNA und der
dadurch kodierten Aminosäuresequenz
sind in den SEQ ID NO: 1–4
dargestellt. Die Sequenz des durch PCR isolierten IL-1 zeta DNA
Fragments entspricht den Nukleotiden 1 bis 579 der SEQ ID NO: 1,
welche die Aminosäuren
1 bis 192 der SEQ ID NO: 3 kodiert; und die Sequenz des durch PCR
isolierten Xrec2 DNA Fragments entspricht den Nukleotiden 1 bis
2088 der SEQ ID NO: 2, welche die Aminosäuren 1 bis 698 der SEQ ID NO:
4 kodiert.
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Die
Aminosäure-Sequenzen
der SEQ ID NO: 3 und 4 tragen eine signifikante Homologie zu anderen bekannten
IL-1 Ligand- bzw. Rezeptor-Familienmitgliedern.
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Beispiel 5: Monoklonale
Antikörper,
die Polypeptide der Erfindung binden
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Dieses
Beispiel erläutert
ein Verfahren zum Herstellen monoklonaler Antikörper, die IL-1 zeta Polypeptide
binden. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um monoklonale
Antikörper
herzustellen, die Xrec2 Polypeptide binden. Zu geeigneten Immunogene,
die zum Erzeugen solcher Antikörper
eingesetzt werden können,
zählen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, gereinigtes IL-1 zeta Polypeptid oder ein immunogenes Fragment
davon, wie die extrazelluläre
Domäne,
oder Fusionsproteine, die IL-1 zeta (z.B. ein lösliches IL-1 zeta/Fc Fusionsprotein)
enthalten.
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Gereinigtes
IL-1 zeta Polypeptid kann verwendet werden, um damit immunoreaktive
monoklonale Antikörper
mittels konventioneller Techniken, wie jene, die im U.S. Patent
4.411.993 beschrieben sind, herzustellen. In Kürze, Mäuse werden mit IL-1 zeta Immunogen
immunisiert, welches in kompleten Freund's Adjuvans emulgiert ist, und in Mengen
im Bereich von 10–100 μg subkutan
oder intraperitoneal injiziert wird. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten
Tiere mit zusätzlichem
IL-1 zeta, welches in unvollständigem Freund's Adjuvans emulgiert
ist, aufgefrischt. Die Mäuse
werden dann periodisch nach einen wöchentlichen oder zwei-wöchentlichen
Immunisierungsplan aufgefrischt. Serumproben werden periodisch durch
retroorbitale Blutabnahme oder Schwanzspitzenentfernung (tail-tip
excision) genommen, um auf IL-1 zeta Antikörper durch Dot-Blot-Untersuchungen,
ELISA (Enzymgebundene-Immunadsorptionsuntersuchung) oder Inhibierung
der IL-1 zeta Rezeptorbindung zu testen. Im Anschluss an die Detektion
eines geeigneten Antikörperliters werden
positive Tiere mit einer letzten intravenösen Injektion von IL-1 zeta
in Salzlösung
versorgt. Drei bis vier Tage später
werden die Tiere getötet,
die Milzzellen geerntet und die Milzzellen mit einer murinen Myelom-Zelllinie,
z.B., NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert.
Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, welche in mehrere Mikrotiterplatten
in einem HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin)-selektiven
Medium ausplattiert werden, um die Vermehrung der nicht-fusionierten
Zellen, der Myelom-Hybride und der Milzzellen-Hybride zu inhibieren.
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Die
Hybridom-Zellen werden mittels ELISA auf Reaktivität gegen
gereinigtes IL-1 zeta durch Anpassung der in Engvall et al., Immunochem.,
8:871, 1971 um im U.S. Patent 4.703.004, offenbarten Techniken gescreent.
Eine bevorzugte Screeinig-Technik ist die in Beckmann et al., J.
Immunol., 144:4212, 1990 beschriebenen Antikörper-Einfang-Technik. Positive
Hybridom-Zellen
können
intraperitoneall in syngene BALB/c Mäuse injiziert werden, um Asziten
zu erzeugen, die hohe Konzentrationen an Anti-IL-1 zeta monoklonalen
Antikörper
enthalten. Alternativ können
Hybridom-Zellen in vitro in Flaschen oder Rollerflaschen durch verschiedene
Techniken gezüchtet
werden. In Maus-Asziten erzeugte monoklonale Antikörper können durch
Ammoniumsulfat-Ausfällung,
gefolgt von Gelauschluss-Chromatographie gereinigt werden. Alternativ
kann Affinitätschromatographie,
die auf der Bindung von Antikörper
an Protein A oder Protein G basiert, ebenfalls verwendet werden,
wie auch die Affinitätschromotagraphie
basierend auf der Bindung an IL-1 zeta verwendet werden kann.
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Beispiel 6: Gewebeverteilung
von Xrec2 mRNA
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Die
Gewebeverteilung von Xrec2 mRNA wurde durch Nothern Blot Analyse
untersucht, wie Folgt. Ein Aliquot einer Xrec2-Riboprobe wurde zu
zwei unterschiedlichen mehrfachen menschlichen Gewebe-Northern-Blots
(Clontech, Palo Alto, CA; Biochain, Palo Alto, CA) hinzugefügt. Die
Blots wurden in 10X Denhardt's Lösung, 50
mM Tris pH 7,5, 900 mM NaCl, 0,1 % Na-Pyrophosphat, 1 % SDS, 200 μg/ml Lachssperma
DNA hybridisiert. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 63°C in 50 %
Formamid wie zuvor beschrieben (March et al., Nature 315: 641–647, 1985)
durchgeführt.
Die Blots wurden dann mit 2XSSC, 0,1%SDS bei 68°C für 30 Minuten gewaschen. Die
Zellen und Gewebe mit den höchsten
Konzentrationen an Xrec2 mRNA wurden durch Vergleich zu einer Kontrollsondierung
mit einer β-Aktinspezifischen
Sonde bestimmt.
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Xrec2
wurde in menschlichem Hirn- und Herzgewebe und zu einem geringeren
Ausmaß im
Eierstock detektiert. In diesen Geweben wurden zwei Xrec2 mRNAs
detektiert, und zwar ein 7,5 kb Transkript und ein 10,0 kb Transkript.
Ein 8,0 kB Xrec2 Transkript wurde im Skelettmuskel ermittelt. Die
PCR Analyse einer menschlichen cDNA Gewebegruppe ermittelte Xrec2
mRNA in Herz, Hirn, und Eierstock, und in einem geringeren Ausmaß in Mandeln,
fötaler
Leber, Prostata, Hoden, Dünndarm
und Kolon, nicht jedoch in Milz, Lymphknoten, Thymus, Knochenmark,
Leukozyten, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas.
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Dem
oben beschriebenen Verfahren folgend, wurde ein Northern Blot einer
aus Tumorzellen isolierten RNA mit Xrec2 sondiert. Ein 8,0 kb Transkript,
welches schwach mit der Sonde hybridisierte, wurde in SW480, einer
kolorektalen Andenokarzinom-Zelllinie, ermittelt. Xrec2 Transkripte
wurden nicht in HL-60 (Promyelozytenleukämie), S3 (HeLA Zellen), K-562
(chronische myelogene Leukämie),
MOLT-4 (lymphoblastische Leukämie),
Raji (Burkitt Lymphoma), A5 49 (Lungenkarzinom) oder G361 (Melanom)
Zellen ermittelt.
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Beispiel 7: Bindungsuntersuchung
für IL-1
zeta
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IL-1
zeta voller Länge
kann exprimiert und auf die Fähigkeit,
IL-1 zeta Rezeptoren zu binden, getestet werden. Die Bindungsuntersuchung
kann wie Folgt ausgeführt
werden.
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Ein
Fusionsprotein, welches ein an den N-Terminus eines löslichen
IL-1 zeta Polypeptid (LZ-IL-1
zeta) fusioniertes Leucin-Zipper-Peptid aufweist, wird in der Untersuchung
eingesetzt. Ein Expressionskonstrukt wird im Wesentlichen wie in
Wiely et al., Immunity, 3: 673–682,
1995, hierin durch Bezugnahme aufgenommen, für die Herstellung des FLAG®(IL-1
zeta) Expressionskonstrukts beschrieben, hergestellt, mit der Ausnahme, dass
DNA, die das FLAG®-Peptid kodiert, durch eine Sequenz,
die einen modifizierten Leucin-Zipper kodiert, der die Trimerisierung
ermöglicht,
ersetzt wurde. Das Konstrukt, im Expressionsvektor pDC409, kodiert
eine Leitsequenz, welche vom humanen Cytomegalievirus stammt, gefolgt
von dem an den N-Terminus
eines löslichen
IL-1 zeta Polypeptids fusionierten Leucin-Zipper-Anteil. Das LZ-IL-I
zeta wird in CHO-Zellen exprimiert, und aus dem Kulturüberstand
gereinigt.
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Der
als pDC409 bezeichnete Expressionsvektor ist ein Säugetier-Expressionsvektor,
der von dem pDC406 Vektor, beschrieben in McMahan et al., EMBO J.,
10: 2821–2832,
1991, hierin durch Bezugnahme aufgenommen, abgeleitet ist. Zu den
Merkmalen die dem pDC409 (im Vergleich zu pDC406) hinzugefügt wurden,
zählen
zusätzliche
Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle (mcs); drei
Stoppkodons (eines in jedem Leserahmen), die stromabwärts der
mcs platziert sind; und ein T7 Polymerase-Promotor, stromabwärts der
mcs, der die Sequenzierung der in die mcs eingefügten DNA erleichtert.
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Für die Expression
des humanen IL-1 zeta Proteins voller Lälnge wird die gesamte kodierende
Region (d.h., die in SEQ ID NO: 1 dargestellte DNA Sequenz) durch
Polymerase Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die in der PCR eingesetzte
Matrize ist der aus einer (Pankreastumor) cDNA-Bibliothek isolierte
cDNA Klon, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die isolierte und amplifizierte
DNA wird in den Expressionsvektor pDC409 eingefügt, um ein als pDC409-IL-1
zeta bezeichnetes Konstrukt zu ergeben.
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LZ-IL-1
zeta Polypeptid wird verwendet, um auf die Fähigkeit zu testen, an die Wirtszellen,
die IL-1 zeta-Rezeptoren rekombinant oder endogen exprimieren, zu
binden. IL-1 zeta Rezeptor exprimierende Zellen werden in mit 10%
fötalem
bovinem Serum, Penicillin, Streptomycin, und Glutamin ergänztem DMEM
kultiviert. Zellen werden mit LZ-IL-1 zeta (5 mg/ml) für etwa 1 Stunde
inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation werden die Zellen gewaschen,
um ungebundenes LZ-IL-1 zeta zu entfernen und vor der Analyse durch
Fluoreszenz-aktivierte Zellscanning (FACS) mit biotinyliertem anti-LZ
monoklonanlen Antikörper
(5 mg/ml) und Phycoerythrin-konjugiertem Streptavidin (1:400) inkubiert.
Die zytometrische Analyse wird auf einem FACscan (Beckton Dickinson,
San Jose, CA) durchgeführt.
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Die
IL-1 zeta Rezeptoren exprimierenden Zellen werden eine signifikant
höhrer
Bindung des IL-1 zeta, im Vergleich zu den Kontrollzellen, die keine
IL-1 zeta Rezeptoren exprimieren, zeigen.
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Beispiel 8: Identifikation
und Gewebeverteilung von IL-1 zeta und ihren Spleißvarianten,
TDZ.1, TDZ.2 und TDZ.3
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Die
Expression von IL-1 zeta in verschiedenen menschlichen Geweben wurde
durch RT PCR mit IL-1 zeta spezifischen Primer oder durch Durchsuchen
von cDNA Bibliotheken mit einer radiomarkierten DNA Sonde, die von
dem in Beispiel 1 beschriebenen IL-1 zeta EST abgeleitet ist, untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle II gezeigt.
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Ein „–" in Tabelle II, zeigt
an, dass in diesen Experimenten, die IL-1 zeta mRNA in dem/der bestimmten analysierten
Gewebe oder Zelllinie nicht ermittelt wurde. Angesichts der Einschränkungen
der verwendeten Untersuchung, ist es erkennbar, dass „–" nur anzeigt, dass
IL-1 in einem bestimmten
Gewebe in einem bestimmten Experiment nicht detektiert wurde, und
impliziert nicht, dass IL-1 zeta in diesem Gewebe niemals exprimiert
wird. Weiters könnten
unterschiedliche Expressionsmuster durch verschiedene Mengen des
RNA Quellenmaterials erklärt
werden, welches verwendet wurde, um die cDNA Gewebegruppen zu erzeugen.
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Positive
Ergebnisse wurden wie folgt abgeleitet: „a", durch PCR Analyse aus einer Gruppe
von Erst-Strang-cDNAs (Clontech); „b" durch cDNA-Screening; „c" durch die Existenz
eines ESTs; und „d" durch PCR Analyse
einer individuellen RNA. „e" zeigt an, dass die
Expression des Gens durch die Zugabe von LPS zu den Zellen erhöht wurde.
In der Quellenspalte für
Gewebe, war „Pool" eine Mischung aus
fötaler
Lunge, Hoden und B-Zellen. In der Spalte „Quelle" für
die menschlichen Zelllinie war „Makrophage-1" THP-1, „Makrophage-2" war U937; „BM Stroma" war eine unveröffentliche
Knochenmarkstroma-Zelllinie, IMTLH, die bei Immunex abgleitet wurde; „frühe Hemat" (early hemat.) war
die hämatopoetische
Vorläuferlinie
HL60; und „panc. Tumor" war HPT-4.
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Wie
in der Tabelle gezeigt ist, wurde IL-1 zeta mRNA in menschlichen
Lymphknoten, Thymus, Knochenmarkstroma, Lunge, Hoden, und Plazenta
detektiert. Zusätzlich
wurde IL-1 zeta mRNA in den menschlichen Makrophagen Zelllinien
THP-1 und U937, der hämatopoietischen
Vorläuferzelllinie
HL60 und der pankreatischen Tumor-Zelllinie HPT-4 detektiert.
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Die
Gewebeverteilung von IL-1 zeta wurde mit der Gewebeverteilung von
Tango-77 (WO 99/06426), einer alternativ gespleißten Form von IL-1 zeta, mittels
PCR verglichen. Die in der RT-PCR verwendeten Primer waren 5' Primer, die entweder
für das
erste Exon von Tango 77 (Exon (1) in 1) oder
das erste Exon von IL-1 zeta (Exon (3) in 1) spezifisch
sind, in Kombination mit einem gemeinsamen 3' Primer, der aus dem gemeinsamen terminalen
Exon (Exon (6) in 1) abgeleitet ist. Die PCR Reaktionen
wurden mittels Erst-Strang-cDNA aus multiplen menschlichen Gewebequellen,
die von Clontech, Palo Alto, CA, gekauft wurden, durchgeführt. PCR
Produkte der vorausgesagten Größe sowie
mehrere zusätzliche
PCR-Produkte unterschiedlicher
Größe wurden
detektiert. Drei PCR-Produkte, die eine unterschiedliche Größe als die
vorausgesagte Größe aufweisen,
wurden isoliert und verwendet, um Sequenzinformation von multiplen
Gewebe-cDNAs zu erhalten. Isolierung und Charakterisierung dieser
PCR Produkte offenbarte drei neuartige IL-1 zeta Spleißvarianten.
Die Nukleinsäure-Sequenzen
dieser Spleißvarianten
werden durch SEQ ID NO: 5, 6 und 7 dargestellt, die die Aminosäure-Sequenzen
kodieren, die durch SEQ ID NO: 8, 9 bzw. 10 dargestellt sind. Die
Organisation und Beziehung dieser Spleißvarianten ist in 1 gezeigt.
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Die
Spleißvarianten
wurden mit TDZ.1, TDZ.2, und TDZ.3 (Hoden-abgeleitete Zeta Varianten)
bezeichnet, da sie jeweils in Hoden exprimiert werden. Hoden ist
ein häufiges
Expressionsgewebe, es ist jedoch nicht das einzige Expressionsgewebe.
Tabelle III zeigt die Ergebnisse einer Gewebe-Expressionsstudie
für IL-1
zeta, Tango-77, TDZ.1, TDZ.2 und TDZ.3. TDZ.1 und TDZ.2 enthalten
Exons 4, 5, und 6, die in 1 gezeigt
sind, welche den letzten drei Exons von IL-1 zeta entsprechen und
entsprechen der konservierten Strukturdomäne des Moleküls. Wenn
es mit anderen Mitgliedern der IL-1 Familie ausgerichtet wird, wird
von den Exons 4, 5 und 6 gezeigt, dass sie viele konservierte Reste
innerhalb der konservierten Strukturmotive enthalten.
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Ein
Polymorphismus von Tango 77 in Exon (2) der 1 wird beobachtet.
In den isolierten cDNAs tritt ein Valin anstelle eines Glycins beim
dritten Rest von Exon (2) auf. In der Tango-77 Sequenz ist die Aminosäure-Sequenz
PAGSPLEP (SEQ ID NO: 14). In dem Polymorphismus ist die Sequenz
PAVSPLEP (SEQ ID NO: 15).
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Tabelle
III Gewebeverteilung
von IL-1 Zeta und IL-1 Zeta Spleißvarianten
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Beispiel 9: Signalisierungsaktivität von Xrec2
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Xrec2
voller Länge
wurde in den Expressionsvektor pDC304 kloniert. Der resultierende
Vektor und ein NFκB-angetriebenes
Luciferase Reporterplasmid wurde verwendet, um COS7-Zellen mittels dem
DEAE-Dextran-Verfahren, wie zuvor in Born et al., J. Biol. Chem.,
273: 29445–29450,
1998, beschrieben, hierin durch Bezugnahme aufgenommen, transfiziert.
Wenn die transfizierten Zellen für
4 Stunden mit IL-1α (10
ng/ml), IL-1β (10
ng/ml), oder hIL-18
(40 ng/ml) stimuliert wurden, wurde keine Luciferase-Aktivität detektiert.
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Mehrere
bekannte Mitglieder der IL-1R Familie sind Orphan-Rezeptoren, für welche
noch keine verwandten Liganden identifiziert wurden. Zu Beispielen
solcher Orphan-Rezeptoren zählen
IL-1Rrp2, T1/ST2 und SIGIRR. Etliche dieser Orphan-Rezeptoren können jedoch
die transkriptionale Aktivierung als Reaktion auf IL-1 vermitteln,
wenn sie als chimäre
Moleküle
exprimiert werden, in welchem die cytoplasmatische Domäne des Orphan-Rezeptors
mit den IL-1 R extrazellulären und
Transmembran-Domänen
(IL-1 Rextm) fusioniert ist. Zum Beispiel ist eine IL-1Rextm Chimäre, die
die cytoplasmatische Domäne
von T1/ST2 enthält,
in der Lage die transkriptionale Aktivierung als Reaktion zu der
IL-1 Stimulation zu vermitteln, wie in Mitcham et al., J. Biol.
Chem., 271: 5777–5783,
1996, hierin durch Bezugnahme aufgenommen, zusammengefasst ist.
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Um
die Fähigkeit
von Xrec2, die transkriptionale Aktivierung als Reaktion auf IL-1
zu vermitteln, zu testen, wurde die cytoplasmatische Domäne von Xrec2
(Xcrec2cyto) (Aminosäuren
382–696
der SEQ ID NO: 4) als ein chimäres
Molekül
mit IL-1 Rextm exprimiert. Das chimäre IL-1Rextm-Xrec2cyto wurde
in COS7 Zellen zusammen mit einem NFκB-angetriebenen Luciferase Reporterplasmid,
wie oben beschrieben, überexprimiert.
Im Anschluss an die IL-1 Stimulation dieser Zellen, wurde keine
Luciferase-Aktivität
ermittelt. Als Kontrolle wurde IL-1R voller Länge in COS7 Zellen überexprimiert,
und eine Induktion der transkriptionalen Aktivität als Reaktion auf die IL-1
Stimulierung in diesen Zellen wurde beobachtet.
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Das
Experiment wurde unter Verwendung eines IL-1Rextm-Xrec2cyto chimären Rezeptors
mit einem verkürzten
cytoplasmischen Schwanz (Aminosäuren
382–573
der SEQ ID NO: 4) wiederholt. Wiederum reagierte der chimäre Rezeptor
nicht auf IL-1 in diesen Untersuchungen, was darauf hinweist, dass
im Gegensatz zu einigen anderen Mitgliedern der IL-1R Familie, die
cytoplasmatische Domäne
von Xrec2 keine Signalübertragung
durch NFκB
vermittelt.
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Andere
Mitglieder der IL-1 Rezeptorfamilie agieren als Hilfsuntereinheiten, ähnlich zu
der IL-1R AcP, welche eine notwendige Signalisierungskomponente
des Typ I IL-1R ist. Um zu bestimmen, ob Xrec2 als eine Hilfsuntereinheit
des IL-1 Rezeptors agiert, wurde eine Reihe von chimären Rezeptoren
erzeugt. Die cytoplasmatische Domäne jedes identifizierten prototypischen
IL-1 R Familienmitglieds wurde an die extrazellulären und
Transmembran-Domänen
von sowohl IL-1R und AcP fusioniert, was zu einer Gruppe von sieben
IL-1R Chimären
und sieben AcP Chimären
führt.
Die IL-1R und AcP-Chimären
wurden in allen möglichen
Kombinationen in einer murinen T-Zell-Lymphom-Zelllinie (S49.1)
durch Elektroporation, zusammen mit einem NFκB-angetriebenen Luciferase Reporterplasmid
co-exprimiert. Zwei Tage nach der Elektroporation wurden die Zellen
mit IL-1α (10
ng/ml) oder IL-1β (10
ng/ml) für
4 Stunden stimuliert, und die Luciferase-Aktivität wurde wie in Born et al.
J. Biol. Chem. 273: 29445–29450,
1998 beschrieben, beurteilt. Normalerweise reagieren S49.1 Zellen
nicht auf IL-1. Bei der transienten Überexpression von sowohl IL-1R
als auch AcP, wurden jedoch S49.1 Zellen IL-1 empfindlich. Während andere AcP-artige Moleküle in diesem
System mit anderen IL-1R-artigen
Molekülen
zusammenwirkten, um S49.1 Zellen eine IL-1 Empfindlichkeit zu verleihen,
wirkte Xrec2 nicht so weder mit einer IL-1R noch mit einer AcP-Chimäre. Sequenzliste