DE69926480T2

DE69926480T2 - Acpl dna und polypeptide

Info

Publication number: DE69926480T2
Application number: DE69926480T
Authority: DE
Inventors: E. John SIMS; L. Teresa BORN
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1999-01-22
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2019-01-23
Also published as: US7993845B2; US7270817B2; EP1049777B1; DE69926480D1; CA2318030A1; US20040248254A1; JP2002500887A; ATE301195T1; US20110027805A1; IL212140A; US6693171B2; NZ505499A; IL137037A; AU750767B2; CA2318030C; US7838248B2; US20030100062A1; IL212140A0; US20090004674A1; ES2245085T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung ist auf gereinigte und isolierte ACPL-Polypeptide gerichtet, auf Nukleinsäuren, die solche Polypeptide kodieren, auf Verfahren zur Herstellung rekombinanter Formen solcher Polypeptide, auf Antikörper, die gegen diese Polypeptide entwickelt werden, auf fragmentierte Peptide, die aus diesen Polypeptiden abgeleitet sind, auf die Verwendung dieser Polypeptide und fragmentierter Peptide als Molekulargewichts-Marker auf die Verwendung solcher Polypeptide und fragmentierter Peptide als Kontrollen für Peptidfragmentierung, und auf Ausrüstungssätze, die diese Reagensen umfassen. Die Erfindung ist außerdem gerichtet auf die Verwendung von ACPL-Polypeptiden, auf Nukleinsäuren, die diese Polypeptide kodieren, und auf Antikörper, die gegen diese Polypeptide entwickelt werden in einer Zellsignalisierungsstudie als Reaktion auf IL-18-Stimulation, und induzierbarer Proteinexpressionssysteme, die auf der Einbeziehung von ACPL-Polypeptiden bei der Zellsignalisierung basiert.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Der IL-1-Typ-1Rezeptor (IL-1R) vermittelt die biologischen Wirkungen von IL-1. Aktivitäten, die IL-1α und IL-1β zugeordnet werden, beinhalten die Induktion inflammatorischer Zytokine und andere inflammatorische Reaktionen einschließlich Prostagladine, Metalloproteinasen, Adhesionsmoleküle, Akutphasen Proteine, Hematopoiesis, Fieber, Knochenresorption und Th2-Zellwachstum und Differenzierung.
IL-1 wurde mit chronisch inflammatorischen Krankheiten, wie rheumatische Arthritis und inflammatorische Darmerkrankungen, in Verbindung gebracht. Es gibt zunehmend Beweise, dass IL-1 eine Rolle bei Osteoporose spielt. Alle diese Aktivitäten wurden durch die Signalfunktion des zytoplasmischen Teils des Typs I IL-1R hervorgerufen. IL-1ra hindert die Aktivitäten von IL-1 durch die Bindung des Typs I IL-1-Rezeptors, und damit wird der Zugang zu IL-1α und IL-1β blockiert, während keine eigene biologische Reaktion ausgelöst wird.
IL-18 ist ein Homolg von IL-1α und IL-1β, und kann seine Aktivitäten über einen Rezeptor vermitteln, der homolog zu einem IL-1R-, IL-1-Rezeptor-verwandtem Protein 1 (IL-1RrpI) ist, (siehe Parnet et el., J. Biol. Chem. 271: 3967, 1996 und Torigoe et al., J. Biol. Chem. 272: 25737, 1997). IL-18 fungiert als Stimulator des Th1-Zwellwachstums und -differenzierung und als ein starker Erreger der Interferonproduktion aus Th1-Zellen. IL-18 steigert die Abtötungsaktivität der NK-Zellen und wurde mit septischem Schock, Leberzirrhose und Diabetes in Verbindung gebracht. Außerdem zeigt IL-18 in vivo Antitumoreffekte bei Mäusen, die immunologisch vermittelt werden (Micallef et al., Cancer Immunol. Immunother. 43: 361, 1997). Die Entdeckung und Identifizierung der Proteine steht an vorderster Front der modernen Molekularbiologie und Biochemie.
Die Identifikation der Primärstruktur, oder -sequenz, eines Probenproteins ist der Höhepunkt eines beschwerlichen Experimentierprozesses. Um ein unbekanntes Probenprotein zu identifizieren, kann der Untersuchende auf den Vergleich eines unbekannten Probenproteins mit bekannten Peptiden vertrauen, wobei eine Reihe von Techniken, die den Fachleuten dieses Bereichs bekannt sind, verwendet werden. Zum Beispiel werden Proteine routinemäßig durch das Anwenden von Techniken wie Elektrophorese, Sedimentation, Chromatographie und Massespektrometrie analysiert.
Der Vergleich einer unbekannten Proteinprobe mit Polypeptiden mit bekanntem Molekulargewicht ermöglicht die Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts der unbekannten Proteinprobe (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microoganisms 76–77 (Prentice Hall, 6d Ausg. 1991)). Proteinmolekulargewichtstandards sind im Handel verfügbar, um die Einschätzung des Molekulargewichts unbekannter Proteinproben zu unterstützen (New England Biolabs Inc. Katalog: 130–131, 1995; J. L. Hartley, US-Patentschrift Nr. 5,449,758). Jedoch können die Molekulargewichtstandards nicht genau genug der Größe der unbekannten Probenproteine entsprechen, um eine exakte Einschätzung eines scheinbaren Molekulargewichts zu ermöglichen.
Die Schwierigkeit bei der Schätzung des Molekulargewichts wird in dem Fall von Proteinen erhöht, die der Fragmentation durch chemische oder enzymatische Mittel unterliegen (A. L. Lehninger, Biochemistry 106–108 (Worth Books, 2d Ausg. 1981)). Chemische Fragmentation kann durch die Inkubation eines Proteins mit einer Chemikalie, wie Zyanbromid, erreicht werden, die zur Spaltung der Peptidbindung auf der Carboxylseite von Methioninrückständen führt (E. Gross, Methods in Enz. 11: 238–255, 1977). Enzymatische Fragmentation eines Proteins kann durch Inkubation eines Proteins mit einer Protease erreicht werden, die bei multiplen Aminosäurerückständen spaltet (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977). Enzymatische Fragmation eines Proteins kann ebenso erreicht werden durch die Inkubation eines Proteins mit einer Protease, wie Achromobacter-Protease I (F. Sakiyama und A. Nakata, US-Patentschrift Nr. 5,248,599; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 44–50, 1981; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 51–55, 1981), die zur Spaltung der Peptidbindung auf der Carboxylseite von Lysinrückständen führt. Die Molekulargewichte der fragmentierten Peptide können eine große Domäne an Molekulargewichten umfassen und die Peptide können zahlreich sein. Variationen des Grades der Fragmentation können ebenso durchgeführt werden (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977).
Das einmalige Wesen der Zusammensetzung eines Proteins hinsichtlich seiner spezifischen Aminosäurebestandteile führt zu einer einzigartigen Positionierung der Spaltungsorte innerhalb des Proteins. Spezifische Fragmentation eines Proteins durch chemische oder enzymatische Spaltung führt zu einem einmaligen „Peptid-Fingerabdruck" (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977; M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50: 309–316, 1980). Folglich führt die Spaltung an spezifischen Orten zur reproduzierbaren Fragmentation eines bestimmten Proteins in Peptide mit exakten Molekulargewichten. Außerdem besitzen diese Peptide einmalige Ladungseigenschaften, die den isoelektrischen pH des Peptides bestimmen. Diese einmaligen Eigenschaften können durch die Anwendung einer Vielzahl von elektrophoretischen und anderen Techniken genutzt werden (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76–77 (Prentice Hall, 6d Ausg. 1991)).
Wenn ein Peptid-Fingerabdruck eines unbekannten Proteins erhalten wird, kann dieser mit einer Datenbank bekannter Proteine verglichen werden, die die Identifizierung des unbekannten Proteins unterstützt (W. J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011–5015, 1993; B. Thiede et al., Electrophoresis 1996, 17: 588–599, 1996). Eine Vielzahl von Computer-Softwareprogrammen stehen dem Fachmann im Internet zur Erleichterung solcher Vergleiche zur Verfügung, wie MultiIdent (Internet-Seite: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), Peptide-Search (Internet-Seite: www.mann.embl-heidelberg.de...deSearch/Fr_PeptideSearchForm.html), und ProFound (Internet-Seite: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html). Diese Programme ermöglichen es dem Nutzer, den Spaltungswirkstoff und die Molekulargewichte der fragmentierten Peptide innerhalb einer festgelegten Toleranz zu bestimmen. Die Programme vergleichen diese Molekulargewichte mit den Proteindatenbanken, um die Klärung der Identität des Probenproteins zu unterstützen. Genaue Information hinsichtlich der Anzahl von fragmentierten Peptiden und das exakte Molekulargewicht dieser Peptide werden für eine genaue Identifizierung benötigt. Daher soll ein Erhöhen der Genauigkeit bei der Bestimmung der Anzahl fragmentierter Peptide und des exakten Molekulargewichts dieser Peptide zu einem größeren Erfolg bei der Identifizierung unbekannter Peptide führen.
Fragmentation von Proteinen wird außerdem verwendet zur Erzeugung von Fragmenten für die Analyse der Zusammensetzung von Aminosäuren und Proteinsequenzierung (P. Matsudiara, J. Biol. Chem. 262: 10035–10038, 1987; C. Eckerskorn et al., Electrophoresis 1988, 9: 830–838, 1988), besonders die Erzeugung von Fragmenten von Proteinen mit einem „blockierten" N-Terminus. Außerdem kann Fragmentation von Proteinen zur Vorbereitung von Peptiden für die Massespektrometrie (W. J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011–5015, 1993; B. Thiede et al., Electrophoresis 1996, 17: 588–599, 1996), zur Immunisierung, zur Affinitätsselektion (R. A. Brown, US-Patentschrift Nr. 5,151,412), zur Bestimmung von Modifikationsorten (z.B. Phosphorylisierung), zur Erzeugung aktiver biologischer Verbindungen (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms 300–301 (Prentice Hall, 6d Ausg. 1991)), und zur Differenzierung homologer Proteine (M. Brown et al., J. Gen, Virol. 50: 309–316, 1980) genutzt werden.
Reinigung und Charakterisierung des humanen Interleukin-18-Rezeptors, von Torigoe K. et al., „Purification and Characterization of the interleukin-18 receptor", Journal of Biological Chemistry Band 273, Nr. 41, 10. Oktober 1997, pp 25737–25742, offenbart, dass Interleukin(IL)-18 als Molekül identifiziert wurde, das die IFN-γ-Produkion induziert und die Zytotoxizität von NK-Zellen erhöht.
Im Hinblick auf das fortdauernde Interesse an Proteinforschung und der Klärung von Proteinstruktur und -eigenschaften besteht ein Bedarf in der Technik an Polypeptiden, die zur Anwendung bei Untersuchungen der PeptidFragmentation und für Molekulargewichtsmessungen geeignet sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung umfasst isolierte Nukleinsäuremoleküle, die DNA-Sequenzen der kodierenden Region von SEQ ID NO: 1, der kodierenden Region SEQ ID NO: 6 aufweisen, und isolierte Nukleinsäuremoleküle, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7 kodieren. Die Erfindung umfasst auch Nukleinsäuremoleküle die zu diesen Sequenzen komplementär sind. So beinhaltet die Erfindung zweisträngige Nukleinsäuremoleküle, die die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 und die kodierende Region von SEQ ID NO: 6 aufweisen, und isolierte Nukleinsäuremoleküle, die die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7 kodieren. Sowohl einsträngige als auch doppelsträngige RNA- und DNA-ACPL-Nukleinsäuremoleküle werden von der Erfindung umfasst. Diese Moleküle können genutzt werden, um sowohl einsträngige als auch doppelsträngige RNA- und DNA-Varianten von ACPL zu ermitteln, die von der Erfindung umfasst werden. Eine doppelsträngige DNA-Sonde ermöglicht die Ermittlung von Nukleinsäuremolekülen, die jedem Strang des Nukleinsäuremoleküls entsprechen. Isolierte Nukleinsäuremoleküle, die mit einer denaturierten, doppelsträngigen DNA, die die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 aufweist, oder ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 kodiert, unter moderat stringenten Bedingungen in 50% Formamid und 6 × SSX, bei 42°C mit Waschbedingungen von 60°C, 0,5 × SSC, 0,1% SDS hybridisieren, sind von der Erfindung mitumfasst.
Die Erfindung umfasst außerdem Nukleinsäuremoleküle, die durch in vitro-Mutagenese aus SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6 abgeleitet werden. In vitro-Mutagense beinhaltet zahlreiche Techniken, die Fachleuten bekannt sind, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, zielgerichtete Mutagenese, Zufallsmutagenese und in vitro-Nukleinsäuresynthese. Die Erfindung umfasst ebenso isolierte Nukleinsäuremoleküldegenearate aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6, als ein Ergebnis des genetischen Codes; isolierte Nukleinsäuremoleküle, die alle Varianten der humanen ACPL DNA, oder einer Spezies homolog zu ACPL DNA sind. Die Erfindung umfasst ebenso rekombinante Vektoren, die die Expression dieser Nukleinsäuremoleküle und Wirtszellen, die durch diese Vektoren transformiert oder transfiziert sind, steuern.
Die Erfindung umfasst ebenso isolierte Polypetide, die durch diese Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, einschließlich isolierter Polypeptide, die ein Molekulargewicht von ungefähr 70 kD haben, wie durch SDS-PAGE und isolierte Polypeptide in nichtglykolysierter Form bestimmt ist. Isolierte polyklonale oder monoklonale Antikörper, die an diese Polypeptide binden, werden von der Erfindung umfasst. Die Erfindung umfasst außerdem Verfahren zur Produktion von ACPL-Polypeptiden einschließlich der Kultivierung einer Wirtszelle unter Bedingungen, die Expression und Rückgewinnung des Polypeptids vom Kulturmedium fördern. Besonders die Expression von ACPL-Polypeptiden in Bakterien, Hefen, Pflanzen und tierischen Zellen wird von der Erfindung umfasst.
Zusätzlich sind Untersuchungen, die ACPL-Polypeptide anwenden, um Aktivitätshemmstoffe im Verbindung mit ACPL-Polypeptid-Gegenstrukturmolekülen oder ACPL-bindende Proteine zu untersuchen, und Verfahren, die ACPL-Polypeptide als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung von Krankheiten, die mittelbar mit ACPL-Polypetide-Gegenstrukturmolekülen oder bindende Proteine verbunden sind, anwenden, von der Erfindung umfasst. Außerdem sind Verfahren, die ACPL-Polypeptide in Form von Hemmstoffen davon anwenden, ebenso ein Aspekt der Erfindung.
Die Erfindung umfasst außerdem die fragmentierten Peptide, die aus ACPL-Polypetiden zur chemische oder enzymatische Behandlung hergestellt werden. Zusätzlich sind Formen von Molekulargewichtsmarkern von ACPL-Polypeptiden und davon fragmentierter Polypeptide, wobei mindestens einer der Orte, die für die Fragmentation durch chemische oder enzymatische Mittel notwendig sind, mutiert wurde, ein Aspekt der Erfindung.
Die Erfindung umfasst ebenso ein Verfahren zur Visualisierung von Molekulargewichtsmarker von ACPL-Polypeptiden und davon fragmentierten Peptiden, das Elektrophorese anwendet. Die Erfindung beinhaltet außerdem ein Verfahren zur Anwendung von Molekulargewichtsmarkern von ACPL-Polypeptiden und davon fragmentierten Peptiden als Molekulargewichtsmarker, die die Einschätzung des Molekulargewichts einer Protein- oder einer fragmentierten Proteinprobe ermöglichen. Die Erfindung umfasst außerdem Verfahren zur Anwendung von ACPL-Polypeptiden und davon fragmentierten Peptiden als Marker, die die Bestimmung des isoelektrischen Punktes eines Musterproteins unterstützen. Die Erfindung umfasst ebenso Verfahren zur Anwendung von ACPL-Polypeptiden und davon fragmentierter Peptide als Steuerungen zum Festlegen des Umfangs der Fragmentation einer Proteinprobe.
Ausrüstungssätze, die die Bestimmung der Molekulargewichte eines Probenproteins unter Anwendung von Molekulargewichtsmarkern von ACPL-Polypetiden, davon fragmentierter Peptide und Formen von Molekulargewichtsmarkern von Polypeptiden unterstützen, wobei mindestens einer der Stellen, die für die Fragmentation durch chemische oder enzymatische Mittel notwendig sind, mutiert wurde, sind vorgesehen.
Ebenso werden von dieser Erfindung Prozesse erfasst, die mit induzierbaren Proteinexpressionssystemen, die auf ACPL-abhängiger Induktion basieren, verbunden sind Diese Systeme können, sind aber nicht darauf beschränkt, ACPL-abhängige Induktion von NFkB-vermitteltes Signalisierung als Reaktion auf IL-18-Stimulation und Ap-1-übertragener Signalisierung als Reaktion auf IL-18-Stimulation enthalten. Außerdem werden von der vorliegenden Erfindung Prozesse umfasst, die mit Reaktionen auf die IL-18-Induktion von der MAP-Kinasefamilie, den Kinasen JNK und p38, in Verbindung stehen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
cDNA, die ACPL-Polypeptide von Mäusen und Menschen kodieren, wurden isoliert und und in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 gezeigt. Diese Entdeckung der cDNA, die ACPL-Polypeptide kodieren, ermöglicht den Aufbau von Expressionsvektoren, die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die ACPL-Polypeptide und Fragmente von ACPL-Polypeptiden kodieren; den Aufbau von Wirtszellen, die durch die Expressionsvektoren transformiert oder transfiziert sind; den Aufbau biologisch aktiver ACPL- Polypeptide und Molekulargewichtsmarker von ACPL als isolierte und gereinigte Proteine; und die Vorbereitung von Antikörpern, die mit ACPL-Polypeptiden immunoreaktiv sind.
ACPL-Nukleotide und -Polypeptide wurden wie folgt erhalten. Der IMAGE-Klon der EST-Sequenz AA203986, der von einem Mäusethymus stammt, wurde besorgt und sequenziert. Diese Sequenzinformation wurde genutzt, um eine cDNA-Bibliothek von T-Zellen von Mäusen (EL4) zu screenen, und ein Mäuseklon von ACPL DNA in voller Länge wurde isoliert und sequenziert. Die ACPL-Sequenz stellt die Sequenz von mindestens drei unabhängigen Isolaten über den gesamten offenen Leserahmen dar. Die Sequenz der kodierenden Region von ACPL DNA von Mäusen ist in SEQ ID NO: 1 wiedergegeben. Die Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NO: 1 kodiert ist, ist SEQ ID NO: 2 dargestellt. Die ACPL von Mäusen, die durch SEQ ID: 1 kodiert ist, beinhaltet eine extrazellulare Domäne von 356 Aminosäuren (Reste 1–356 von N- bis C-Terminus von SEQ ID NO: 2), die ein Signalpeptid von 14 Aminosäuren enthält (Reste 1–14 von SEQ ID NO: 2); einen transmembrane Region von 24 Aminosäuren (Reste 357–380 von SEQ ID NO: 2) und eine zytoplasmische Domäne von Aminosäuren (Reste 381–614 von SEQ ID NO: 2).
Die Sequenz des Klons zeigt Ähnlichkeit mit der Sequenz der Mitglieder der IL-1-Rezeptorfamilie und weist infolgedessen nach, das die ACPL DNA von Mäusen (SEQ ID NO: 1) einen Rezeptor kodiert (SEQ ID NO: 2), der ein Mitlied der IL-1-Rezeptorfamilie ist.
Ein Klon, der von einer humanen NK-Zellbibliothek erhalten wurde, QQ1352, wurde als ein humanes Homolog von ACPL DNA von Mäusen identifiziert. Klon QQ1352 stellt einen teilweise gespleißten mRNA-Klon dar, und ein Teil der Sequenz ist identisch mit einem Exon das in einem genomischen DNA-Klon eines BAC gefunden wurde, der in der Genbank unter der Zugriffsnummer B64403 hinterlegt wurde. Außerdem stimmt diese Sequenz (Nukleotide 179–244 von SEQ ID NO: 5) in Position mit Exon 7 des humanen Typs I IL-R überein, und zeigt eine Beteiligung von ACPL-Polypeptid bei der Übertragung von entzündlichen Reaktionen an.
Die Aminosäuresequenz, die durch den QQ1352-Klon kodiert ist, wurde mit der ACPL-Polypeptidsequenz von Mäusen verglichen. Die am Besten harmonierenden Vergleiche wurden mit der ACPL-Polypeptidsequenz von Mäusen mit Translationen in 3 verschiedenen Rahmen der QQ1352-Sequenz, beginnend bei Nukleotid 522, durchgeführt. Aus dieser Ausrichtung ist erkennbar, dass es mindestens zwei Rahmenverschiebungen gibt, die zu einer wesentlichen Homologie zwischen den Sequenzen von Menschen und Mäusen in allen drei Rahmen in Abhängigkeit von der Position in der Sequenz führt, was nachweist, dass der QQ1352 ein Anteil an humaner ACPL enthält.
Um eine humane ACPL voller Länge zu erhalten, wurde der humane cDNA-Klon, QQ1352, genutzt, um Klone aus PBL-, PBT und NK-cDNA-Archiven zu untersuchen. Die Region von Klon QQ1352, die als Sonde genutzt wurde, war homolog zu den ACPL-Nukleotiden 1196 bis 1753 von Mäusen. Ein Klon voller Länge wurde aus keiner der Bibliotheken enthalten, so wurde vektorverankerte PCR in jeder Bibliothek durchgeführt, um das 5' End des Leserrahmens zu erhalten. Die komplette DNA-Sequenz von humaner APCL wird in SEQ ID NO: 6 offengelegt. Die Aminosäuresequenz, die von SEQ ID NO: 6 kodiert wird, ist in SEQ ID NO: 7 dargelegt. Die APCL, die von SEQ ID NO: 6 kodiert wird, beinhaltet eine extrazellulare Domäne von 356 Aminosäuren (Reste 1–356 von N- bis C-Terminus von SEQ ID NO: 7), die ein Signalpeptid von 14 Aminosäuren enthält (Reste 1–14 von SEQ ID NO: 7); eine transmembrane Region von 25 Aminosäuren (Reste 357–381 von SEQ ID NO: 7) und eine zytoplasmische Domäne von Aminosäuren (Reste 382–599 von SEQ ID NO: 7).
Die Koexpression von ACPL und IL-1Rrp1 führt zu einer dramatischen Steigerung der NFkB-Aktivität in Zellen, die mit IL-18 stimuliert sind. Demgegenüber führt die Expression von ACPL oder IL-1Rrp1 allein nicht zu 7 IL-18-Empfindlichkeit. Daher spielt ACPL eine Rolle beim Vermitteln von IL-18-Reaktionen und kann ein Bestandteil des IL-18-Rezeptorkomplexes sein. Zusätzlich kann ein Rezeptor für IL-18 als Hemmstoff bei durch IL-18 induzierte entzündlichen Reaktionen genutzt werden. Dementsprechend beinhaltet eine Ausführung der vorliegenden Erfindung den extrazellulären Anteil.
Bevorzugte DNA- und Aminosäureausgestaltungen der vorliegenden Erfindung beinhalten die kodierende Region von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6 und die Aminosäuren, die von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6 kodiert beziehungsweise in SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7 gezeigt werden. Zusätzliche, bevorzugte Ausgestaltungen sind Domänen der ACPL-Aminosäuresequenzen und Nukleotidsequenzen, die die Domänen kodieren. Zu SEQ ID NO: 7 beinhalten die Domänen: eine extrazelluläre Domäne von 356 Aminosäuren (Reste 1–356 von N- bis C-Terminus von SEQ ID NO: 7), die ein Signalpeptid von 14 Aminosäuren enthält (Reste 1– 14 von SEQ ID NO: 7); einen transmembranen Bereich von 25 Aminosäuren (Reste 357–381 von SEQ ID NO: 7) und eine zytoplasmische Domäne von Aminosäuren (Reste 382–599 von SEQ ID NO: 7). Zu SEQ ID NO: 2 beinhalten die ACPL-Aminosäuresequenzdomänen der vorliegenden Erfindung eine extrazelluläre Domäne von 356 Aminosäuren: (Reste 1–356 von N- bis C-Terminus von SEQ ID NO: 2), die ein Signalpeptid von 14 Aminosäuren enthält (Reste 1–14 von SEQ ID NO: 2); einen transmembranen Bereich von 24 Aminosäuren (Reste 357–380 von SEQ ID NO: 2) und eine zytoplasmische Domäne von Aminosäuren (Reste 381–614 von SEQ ID NO: 2).
Die Entdeckung der Nukleinsäuren der Erfindung ermöglicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, die Polypeptide kodieren; Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transifiziert oder transformiert sind; und isolierten und gereinigten, biologisch aktiven Polypeptiden und Fragmenten davon. Außerdem ermöglicht die Entdeckung der geoffenbarten Nukleinsäuren, und Fragmenten oder Oligonukleotiden davon, ihre Anwendung als Sonden, um Nukleinsäuren, die Proteine mit einer Homologie zu IL-18 kodieren, zu identifizieren und um Nukleinsäuren, die Proteine kodieren, die eine Rolle bei von IL-18 vermittelten Reaktionen spielen, zu identifizieren. Außerdem finden Nukleinsäuren und Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung Anwendung, um DNA am humanen Chromosom 2q zu entschlüsseln und um Gene zu identifizieren, die mit bestimmten Krankheiten, Syndromen verbunden sind und anderen humanen Zuständen, die mit dem humanen Chromosom Nummer 2q verbunden sind. Die unten stehende Tabelle führt eine Anzahl solcher Krankheiten, Syndrome oder Zustände auf.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Anwendung von Einsträngigen Sense- und Antisenseoligonukleotiden von den Nukleinsäuren, um die Expression von Polynukleotid, das vom ACPL-Gen kodiert ist, zu hemmen. Die Polypeptide und löslichen Fragmente der vorliegenden Erfindung (z.B. extrazellulare Domänen von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7 und aktive Fragmente davon) können genutzt werden um von IL-18 vermittelte Reaktionen zu hemmen und Prozesse zu untersuchen, die mit induzierbaren Proteinexpressionssystemen, die ACPL-abhängiger Induktion beruhen, in Verbindung stehen. Diese Systeme können beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, ACPL-abhängige Induktion von NFkB-vermittelter Signalisierung als Reaktion auf IL-18-Stimulation und Ap-1-übertragener Signalisierung als Reaktion auf IL-18-Stimulation. Ähnlich beinhalten diese Prozesse solche, die mit Reaktionen auf IL-18-Induktion der Kinasen JNK und p38 der MAP-Kinase-Familie in Verbindung stehen.
Polypeptide und ihre fragmentierten Peptide der vorliegenden Erfindung finden außerdem Verwendung als Molekulargewichtsmarker, als Kontrollreagenten für die Peptidfragmentation und als Bestandteile von Ausrüstungssätzen, die diese Reagenten umfassen. Zusätzlich sind die Polypeptide und Polypeptidfragmente der vorliegenden Erfindung nützlich für die Erzeugung von Antikörpern. So erzeugte Antikörper sind von der vorliegenden Erfindung mitumfasst und nützlich als Therapeutika und in Prozessen zum Reinigen von Polypeptiden und Polypeptidfragmenten der vorliegenden Erfindung.
Nukleinsäuren
In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf bestimmte isolierte Nukleotidsequenzen, die frei von verunreinigendem endogenen Material sind. Eine „Nukleotidsequenz" bezieht sich auf ein Polynukleotidemolekül in Form eines separaten Fragments einer größeren Nukleinsäurenkonstruktion. Das Nukleinsäuremolekül wurde von DNA oder RNA abgeleitet, die wenigstens einmal in wesentlich reiner Form oder in einer Menge oder Konzentration isoliert wurde, die Identifizierung, Handhabung oder Gewinnung ihrer Bestandteile als Nukleotidsequenzen nach biologischen Standardverfahren ermöglicht (wie die von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) dargelegt). Diese Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserahmens, die von internen nichttranslatierten Sequenzen oder Intronen unterbrochen werden, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorhanden sind, geliefert und/oder konstruiert. Sequenzen nichttranslatierter DNA können 5' oder 3' von einem offenem Leserahmen vorhanden sein, wo diese nicht die Handhabung oder Expression der kodierenden Region beeinträchtigen.
Nukleinsäuremoleküle der Erfindung beinhalten DNA sowohl in einsträngiger und in doppelsträngiger Form sowohl als auch RNA-Komplement davon. DNA beinhaltet zum Beispiel cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, durch PCR verlängerte DNA oder Kombinationen davon. Genomische DNA kann durch konventionelle Techniken isoliert werden, z.B. durch das Nutzen der cDNA von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 oder eines geeigneten Fragments davon als eine Sonde.
Die DNA-Moleküle der Erfindung beinhalten Gene voller Länge wie auch Polynukleotide und Fragmente davon. Das Gen voller Länge kann das N-terminales Signalpeptid enthalten. Andere Ausführungsformen enthalten DNA, die eine lösliche Form kodiert, z.B. die, die extrazellulare Domäne des Proteins entweder mit oder ohne einem Signalpeptid kodiert.
Die Nukleinsäuren der Erfindung sind vorzugsweise von humanen Quellen abgeleitet, aber die Erfindung beinhaltet ebenso die von nichthumanen Spezies.
Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes, wobei mehr als ein Codon die gleiche Aminosäure kodieren kann, kann eine DNA-Sequenz von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 6 gezeigten abweichen und noch ein Polypeptid kodieren, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7 aufweist. Diese abweichenden DNA-Sequenzen können aus stillen Mutationen (z.B., die während PCR-Verlängerung auftreten) stammen oder können das Produkt langsamer Mutagenese einer ursprünglichen Sequenz sein.
Die Erfindung sieht somit isolierte DNA-Sequenzen vor, die Polypeptide der Erfindung kodieren, ausgewählt aus: (a) DNA, die die Kodierungssequenzen von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 6 aufweist; (b) DNA, die die Polypeptide von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 7 kodiert; (c) DNA, die zur Hybridisierung einer DNA von (a) oder (b) unter moderat stringenten Bedingungen in der Lage ist und die Polypeptide mit ACPL-Aktivität kodiert; (d) DNA, die zur Hybridisierung einer DNA von (a) oder (b) unter hoch stringenten Bedingungen in der Lage ist und Polypeptide der Erfindung kodiert; und (e) DNA, die aufgrund des genetischen Codes zu einer in (a), (b), (c) oder (d) beschriebenen DNA degeneriert ist und die Polypeptide der Erfindung kodiert. Natürlich werden Polypeptide, die von diesen DNA-Sequenzen kodiert werden, von der Erfindung mitumfasst.
Wie hierbei angewendet, können moderat stringente Bedingungen leicht von durchschnittlichen Fachleuten, z.B. auf der Grundlage der Länge der DNA, bestimmt werden. Die grundlegenden Bedingungen sind von Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Bd. 1, pp. 1. 101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) dargelegt, und beinhalten die Nutzung einer Vorwaschlösung für die Nitrozellulosefilter 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), Hybridisierungsbedingungen von ungefähr 50% Formamid, 6 × SSC bei rund 42°C (oder eine andere ähnliche Hybridisierungslösung, wie Stark's Lösung, in ungefähr 50% Formamid bei rund 42°C) und Waschbedingungen bei rund 60°C, 0,5 × SSC, 0,1% SDS. Hoch stringente Bedingungen können auch leicht von Fachleuten, z.B. auf der Grundlage der Länge der DNA, bestimmt werden. Im Allgemeinen sind diese Bedingungen wie die oben beschriebenen Hybridisierungsbedingungen und mit Waschung bei rund 68°C, 0,2 × SSC, 0,1% SDS. Der Fachmann wird feststellen, das die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung wie benötigt entsprechend den Faktoren, wie der Länge der Probe, angepasst werden können.
Eine Ausführungsform der Erfindung beinhaltet auch DNA, die Polypeptidfragmente und Polypeptide, die inaktivierte N-Glycosylationsort(e), inaktivierte Proteaseverarbeitungsort(e) oder herkömmliche Aminosäuresubstitution(en), wie unten beschrieben, umfassen, kodiert.
Bei einer anderen Ausführungsform umfassen die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung ebenso Nukleotidsequenzen, die mindestens zu 80% mit einer nativen Sequenz identisch sind. Es werden auch Ausführungsformen erwogen, bei denen ein Nukleinsäuremolekül eine Sequenz umfasst, die mindestens zu 90%, mindestens zu 95%, mindestens zu 98%, mindestens zu 99% oder mindestens zu 99,9% mit einer nativen Sequenz identisch ist.
Die prozentuale Übereinstimmung kann durch visuelle Überprüfung und mathematische Berechnung bestimmt werden. Im anderen Falle kann die prozentuale Übereinstimmung von zwei Nukleinsäuresequenzen durch den Vergleich der Sequenzinformation bestimmt werden, wobei das GAP-Computerprogramm, Version 6,0 genutzt wird, das von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) beschrieben und bei der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) verfügbar ist. Die bevorzugten Standardparameter für das GAP-Programm beinhalten: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Übereinstimmungen und 0 für Nichtübereinstimmungen enthält) für Nukleotide, und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acis Res. 14: 6745, 1986, wie beschrieben von Schwartz und Dayhoff, Herausg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353–358, 1979; (2) eine Penalty von 3,0 für jede Lücke und zusätzliche 0,10 Strafe für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Strafe für Schlusslücken. Andere Programme, die von einem Fachmann für Sequenzvergleich angewendet werden, können auch genutzt werden.
Die Erfindung liefert auch isolierte Nukleinsäuren, die für die Produktion von Polypeptiden nützlich sind. Diese Polypeptide können durch jede von einer Vielzahl von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine DNA-Sequenz, die ein ACPL-Polypeptid oder ein gewünschtes Fragment davon kodiert, kann in einen Expressionsvektor zur Produktion des Polypeptids oder des Fragments subkloniert werden. Die DNA-Sequenz wird vorzugsweise an eine Sequenz, die ein Leader- oder Signalpeptid kodiert, fusioniert. Im anderen Falle kann das gewünschte Fragment unter Nutzung der bekannten Techniken chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können auch durch Restriktionsendonuklease-Aufschluss einer lebensgroßen, klonierten DNA-Sequenz erzeugt und durch Elektrophorese auf Agarosegels isoliert werden. Wenn notwendig können Oligonukleotide, die den 5' und 3' Terminus bis zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, an ein DNA-Fragment gebunden werden, das durch Restriktions-Enzymaufschluss erzeugt wird. Diese Oligonukleotide können zusätzlich einen Restriktionsendonuklease-Spaltungsstelle oberhalb der gewünschten Kodierungssequenz enthalten und ein Initiationscodon (ATG) auf dem N-Terminus der Kodierungssequenz positionieren.
Das weithin bekannte Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (PCR) kann ebenso eingesetzt werden, um eine DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Proteinfragment kodiert, zu isolieren und zu verlängern. Oligonukleotide, die die gewünschten Termini des DNA-Fragments beschreiben, werden als 5' und 3' Primer eingesetzt. Die Oligonukleotide können zusätzlich Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, um das Einfügen des verlängerten DNA-Fragments in einen Expressionsvektor zu erleichtern. PCR-Techniken sind in Saiki et al. Science 239: 487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., Herausg., Academic Press, Inc., San Diego (1989), S. 189–196; und PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Herausg., Academic Press, Inc. (1990) beschrieben.
POLYPEPTIDE UND FRAGMENTE DAVON
Die Erfindung umfasst Polypeptide und Fragmente davon in verschiedenen Formen, einschließlich jener, die natürlich auftreten oder durch verschiedene Techniken, wie Verfahren, die rekombinante DNA-Technologie einbeziehen, erzeugt werden. Diese Formen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Derivative, Varianten und Oligomere ebenso Fusionsproteine oder Fragmente davon.
Der Fachmann wird erkennen, dass die oben beschriebenen Grenzen von ACPL-Polypeptiddomänen (z.B. die extrazellulare Domäne, Signalpeptid, transmembraner Bereich, zytoplasmische Domäne) angenähert sind, und dass die Grenzen des transmembranen Bereichs und des Signalpeptides (die unter Nutzung eines für diesen Zweck verfügbaren Computerprogramms vorausgesagt werden können) von den oben beschriebenen abweichen können.
Die Polypeptide der Erfindung können membrangebunden sein, oder sie können sekretiert und somit löslich sein. Lösliche Polypeptide sind in der Lage, von den Zellen, in denen sie expremiert sind, sekretiert zu werden. Im Allgemeinen können lösliche Polypeptide identifiziert werden (und von nichtlöslichen membrangebundenen Gegenstücken unterschieden werden) durch das Abtrennen intakter Zellen, die das gewünschte Polypeptid von dem Kulturmedium exprimieren, z.B. durch Zentrifugieren und Untersuchen des Mediums (Überstand) auf das Vorhandensein des gewünschten Polypeptids. Das Vorhandensein in dem Medium zeigt an, dass das Polypeptid von den Zellen sekretiert wurde und somit eine lösliche Form des Proteins ist.
In einer Ausführungsform umfassen die löslichen Polypeptide und Fragmente davon die gesamte oder einen Teil der extrazellularen Domäne, aber es fehlt ihnen der transmembrane Bereich, der das Zurückhalten des Polypeptides an der Zellmembran bewirken würde. Ein lösliches Polypeptid kann eine zytoplasmische Domäne oder einen Teil davon beinhalten, solange das Polypeptid von der Zelle, in der es erzeugt wird, sekretiert wird. Zusätzliche Beispiele löslicher Polypeptide sind die, denen nicht nur die zytoplasmische Domäne und der transmembrane Bereich fehlt, sonder auch der gesamte oder ein Teil des oben beschriebenen Spacerregion.
Im Allgemeinen ist die Nutzung löslicher Formen für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Das Reinigen der Polypeptide von rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Polypeptide von den Zellen sekretiert werden. Lösliche Polypeptide sind allgemein besser geeignet für intravenöse Verabreichung. Außerdem können lösliche Polypeptide nützlich sein, um die Aktivität, die mit ACPL-bindenden Proteinen in Verbindung stehen, zu hemmen.
Die Erfindung liefert auch Polypeptide und Fragmenten davon, die die gewünschte biologische Aktivität (z.B. die extrazellulare Domäne) erhalten. Bestimmte Ausführungen sind auf Polypeptidfragmente gerichtet, die die Fähigkeit behalten, ein ACPL-bindendes Protein oder einen Bindungspartner zu binden. Solch ein Fragment kann ein lösliches Protein wie oben beschrieben sein. In einer anderen Ausführung beinhalten die Polypeptide und Fragmente vorzugsweise Bereiche, die in der IL-1Rezeptorfamilie wie oben beschrieben konserviert sind.
Hierbei werden auch Polypeptidfragmente geliefert, die mindestens 20 oder mindestens 30 benachbarte Aminosäuren der Sequenz von SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 7 aufweisen. Fragmente, die von der zytoplasmischen Domäne abgeleitet sind, finden Anwendung bei Untersuchungen von Signaltransduktion und beim Steuern zellularer Prozesse, mit der Transduktion biologischer Signale in Verbindung stehen. Polypeptidfragment können auch als Immunogene bei der Erzeugung von Antikörpern eingesetzt werden.
Varianten
Natürlich auftretende Varianten ebenso wie derivierte Varianten der Polypeptide und Fragmente sind hierin vorgesehen.
Varianten können Aminosäuresequenzen darstellen, die mindestens zu 80% identisch sind. Ebenso werden Ausführungen in Erwägung gezogen, bei denen ein Polypeptid oder Fragment eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens zu 90%, mindestens zu 95%, mindestens zu 98%, mindestens 99% oder mindestens 99,9% mit dem bevorzugten Polypeptid oder Fragment davon identisch ist. Die prozentuale Übereinstimmung kann durch visuelle Überprüfung und mathematische Berechnung bestimmt werden. Im anderen Falle kann die prozentuale Übereinstimmung von zwei Nukleinsäuresequenzen durch den Vergleich der Sequenzinformation bestimmt werden, wobei das GAP-Computerprogramm, das auf dem Algorithmus von Needleman und Wunsch (J. Mol. Bio. 48: 443, 1970) beruht und bei der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) verfügbar ist, genutzt wird. Die bevorzugten Standardparameter für das GAP-Programm beinhalten: (1) eine Punktmatrix, blosum62, wie von Henikoff und Henikoff beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1992); (2) ein Lückengewicht von 12; (3) ein Lückenlängengewicht von 4; und (4) keine Strafe für Schlusslücken. Andere Programme, die von einem Fachmann für Sequenzvergleich angewendet werden, können auch genutzt werden.
Die Varianten der Erfindung beinhalten zum Beispiel jene, die sich aus alternierenden mRNA-Spleißvorgängen oder aus proteolytischer Abspaltung ergeben. Alternierendes Spleißen von mRNA kann zum Beispiel ein gestutztes, jedoch biologisch aktives Protein ergeben, wie eine natürlich auftretende lösliche Form des Proteins. Variationen, die der Proteolyse zuzuordnen sind, beinhalten zum Beispiel Unterschiede in den N- oder C-Termini auf Expression in verschieden Typen von Wirtszellen, aufgrund proteolytischer Entfernung einer oder mehrerer endständiger Aminosäuren vom Protein (im Allgemeinen von 1–5 endständigen Aminosäuren). Proteine, bei denen Unterschiede in der Aminosäuresequenz genetischem Polymorphismus (allele Variation zwischen Individuen, die Protein erzeugen) zuzuordnen sind, werden hierbei auch erwogen.
Zusätzliche Varianten im Rahmen der Erfindung beinhalten Polypeptide, die modifiziert werden können, um Derivative davon durch die Bildung kovalenter oder aggregativer Konjugate oder anderer chemischer Gruppen, wie Glykosylgruppen, Lipide, Phosphat, Acetylgruppen und ähnliche, zu bilden. Kovalente Derivative können durch das Anbinden der chemischen Gruppen an funktionale Gruppen auf Aminosäureseitenketten oder auf den N-Terminus oder C-Terminus eines Polypeptids erzeugt werden. Konjugate, die diagnostische (feststellbare) oder therapeutische Wirkstoffe, die damit verbunden sind, umfassen, werden hierbei betrachtet, wie weiter unten ausführlicher besprochen wird.
Andere Derivative beinhalten kovalente oder aggregative Konjugate der Polypeptide mit anderen Proteinen oder Polypeptide, wie durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Beispiele für Fusionsproteine werden unten im Zusammenhang mit Oligomeren besprochen. Außerdem können Fusionsproteine Peptide umfassen, die hinzugeben werden, um Reinigung und Identifizierung zu erleichtern. Diese Peptide beinhalten zum Beispiel poly-His oder die antigenischen Identifizierungspeptide, beschrieben in US-Patentschrift Nr. 5,011,912 oder in Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988. Ein solches Peptid ist das FLAG^®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, das hochgradig antigenisch ist und ein Epitop liefert, das reversibel an einen monoklonalen Antikörper gebunden ist, und das eine schnelle Prüfung und leichte Reinigung von exprimiertem, rekombinatem Protein ermöglicht. A Mäusehybridoma, als 4E11 bezeichnet, erzeugt einen monoklonalen Antikörper, der das FLAG^®-Peptide bei Vorhandensein bestimmter divalenter Metallkationen bindet, wie in US-Patentschrift 5,011912, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. Die 4E11-Hybridomazelllinie unter der Zugriffsnr. HB 9259 bei der American Type Culture Collection hinterlegt. Monoklonale Antikörper, die das FLAG^®-Peptid binden, sind bei Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Conneticut, erhältlich.
Unten Variantenpolypeptiden, die hierin vorgesehen sind, sind Varianten nativer Polypeptide, die die native biologische Aktivität oder das wesentliche Äquvivalent davon erhält. Ein Beispiel ist eine Variante, die an ihr Bindungsprotein oder Bindungspartner mit der im Wesentliche gleichen Bindungsaffinität wie es die native Form macht, bindet. Bindungsaffinität kann mit konventionellen Verfahren gemessen werden, z.B. wie in US-Patentschrift Nr. 5,512,457 beschrieben und unten ausgeführt wird.
Varianten beinhalten Polypeptide, die im Wesentlichen homolog zu der nativen Form sind, die jedoch eine Aminosäuresequenz haben, die von der der nativen Form aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen abweicht. Besondere Ausführungen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Polypeptide, die im Vergleich zur natürlichen Sequenz eine bis zehn Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäurerückständen umfassen.
Eine bestimmte Aminosäure kann zum Beispiel durch einen Rest ersetzt werden, der ähnliche physiochemische Eigenschaften hat. Beispiele dieser konservativen Substitutionen beinhalten die Substitution eines aliphatischen Restes durch einen anderen, wie Ile, Val, Leu oder Ala durch einen anderen; Substitutionen eines polaren Restes durch den anderen, wie zwischen Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn; oder Substitutionen eines aromatischen Restes durch einen anderen, wie Phe, Trp oder Tyr durch einen anderen. Andere konservative Substitutionen, die z.B. Substitutionen ganzer Bereiche, die ähnliche hydrophobe Eigenschaften haben, umfassen, sind weithin bekannt.
Entsprechend beinhalten die DNA der Erfindung Varianten, die von einer natürlichen DNA-Sequenz aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen abweichen, die jedoch ein biologisch aktives Polypeptid kodieren.
Die Erfindung beinhaltet außerdem Polypeptide mit oder ohne assoziierter Glykolisation mit natürlichem Muster. Polypetide, die Hefe oder Expressionssystem von Säugetieren (z.B. COS-1- oder COS-7-Zellen) exprimiert werden, können ähnlich oder wesentlich unterschiedlich zu einem natürlichen Polypeptid hinsichtlich Molekulargewicht und Glykolisationsmuster sein, und zwar in Abhängigkeit von der Wahl des Expressionssystems. Die Expression von Polypeptiden der Erfindung in bakteriellen Expressionssystem, wie E. coli, liefert nichtglykolisierte Moleküle. Ein bestimmtes Präparat kann außerdem vielfältige, unterschiedlich glykolisierte Spezies des Proteins beinhalten. Glykosylgruppen können durch konventionelle Verfahren entfernt werden, insbesondere jene, die Glykopeptidase anwenden. Im Allgemeinen können glykolisierte Polypeptide der Erfindung mit einem molaren Überschuss an Glykopetidase (Boehringer Mannheim) erzeugt werden.
Dementsprechend werden DNA-Konstrukte, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder Sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen kodieren, von der Erfindung umfasst. N-Glykolisierungsstellen in der extrazellularen Polypeptiddomäne können zum Beispiel modifiziert werden, um Glykolisierung zu verhindern, und die Expression eines reduzierten Kohlenhydrats analog in Expressionssystemen bei Säugetieren und Hefe zu ermöglichen. N-Glykosilierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind gekennzeichnet ein Aminosäuretriplet Asn-X-Y, wobei X eine Aminosäure außer Pro und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen bei der Nukleotidsequenz, die diese Triplets kodiert, führen zum Verhindern des Verknüpfens von Karbohydratresten mit der Asn-Seitenkette. Die Veränderung eines einzelnen Nukleotids, der so ausgewählt wird, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, ist zum Beispiel ausreichend, einen N-Glykolisationsort zu inaktivieren. Alternativ können Ser und Thr durch eine andere Aminosäure, wie Ala, ersetzt werden. Bekannte Verfahren zum Inaktivieren von N-Glykolisationsorten in Proteinen beinhalten jene, die in der US-Patentschrift 5,071,972 und EP 276,846 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben sind.
Bei einem anderen Beispiel von Varianten können Sequenzen, die Cys-Rückstände kodieren, die für biologische Aktivität nicht erforderlich sind, verändert werden, um zu versuchen, dass Cys-Rückstände deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, wobei die Bildung inkorrekter intramolekularer Disulfidbrücken durch Falten oder Renaturierung verhindert wird.
Andere Varianten werden durch Modifikation angrenzender dibasischer Aminosäurerückstände gebildet, um die Expression in Hefesystemen, in denen KEX2-Proteaseaktivität stattfindet, zu steigern. EP 212,914 zeigt die Anwendung ortsspezifischer Mutagenese, um KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen in einem Protein zu inaktivieren. KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen werden inaktiviert durch Deletion, Addition oder Substitution von Resten, um Arg-Arg-, Arg-Lys- und Lys-Arg-Paare zu verändern, um das Auftreten dieser angrenzenden basischen Reste auszuschließen. Lys-Lys-Paare sind wesentlich weniger anfällig für KEX2-Abspaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt ein konservatives und bevorzugtes Herangehen zum Inaktivieren von KEX2-Stellen dar.
Oligomere
Von der Erfindung mitumfasst sind Oligomere oder Fusionsproteine, die ACPL-Polypeptide enthalten. Diese Oligomere können in Form kovalentgebundener oder nichtkovalentgebundener Multimere, einschließlich Dimere, Trimere oder höherer Oligomere, sein. Wie oben angemerkt, sind bevorzugten Polypeptide löslich und somit können diese Oligomere lösliche Polypeptide enthalten. In einem Aspekt der Erfindung behalten die Oligomere die Bindungsaktivität der Polypeptidebestandteile bei und liefern daher bivalente, trivalente usw. Bindungsstellen.
Eine Ausführung der Erfindung ist auf Oligomere gerichtet, die multiple Polypeptide umfassen, die durch kovalente oder nichtkovalente Interaktionen zwischen Peptidgruppen, die mit den Polypeptide fusioniert sind, verbunden sind. Diese Peptide können Peptidlinker (Spacer) oder Peptide sein, die die Fähigkeit zur Förderung von Oligomerisation besitzen. Leucinzipper und bestimmte Polypeptide, die von Antikörpern abgeleitet sind, gehören zu den Peptiden, die die Oligomerisation der dort verknüpften Polypeptide fördern, wie dies weiter unten ausführlich beschrieben wird.
Oligomere auf Immunoglobulinbasis
Als eine Alternative wird ein Oligomer hergestellt, das Polypeptide nutzt, die von Immunoglobulinen abgeleitet sind. Die Erzeugung von Fusionsproteinen, die bestimmte heterologe Polypeptide enthalten, die mit verschiedenen Anteilen von Antikörpern abgeleiteten Polypeptiden fusioniert sind, wurde beschrieben, z.B. von Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990) und Hollenbaugh und Aruffo („Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Erg. 4, Seiten 10.19.1–10.19.11, 1992).
Eine Ausführung der vorliegenden Erfindung ist auf einen Dimer gerichtet, das zwei Fusionsproteine aufweist, die durch Fusionieren eines Polypeptids der Erfindung mit einem von einem Antikörper abgeleiteten Fc-Polypeptid geschaffen werden. Eine Genfusion, die das Poylpeptid-/Fc-Fusionsprotein kodiert, ist in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Polypeptid-/Fc-Fusionsproteine werden in Wirtszellen exprimiert, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformiert sind und sich sehr ähnlich wie Antiköpermoleküle zusammenfügen gelassen werden, wobei zwischen den Ketten befindliche Disulfidbindungen sich zwischen den Fc-Gruppen bilden, um divalente Moleküle zu liefern.
Der Begriff „Fc-Polypeptid", wie hier verwendet, beinhaltet natürlich und muteine Formen von Polypeptiden, die vom Fc-Bereich eines Antikörpers gebildet sind, der eine oder alle CH-Domänen des FC-Bereichs aufweist. Gestutzte Formen dieser Polypeptide, die den flexiblen Bereich, der Dimerisation fördert, aufweisen, sind ebenfalls beinhaltet. Bevorzugte Polypeptide weisen ein FC-Polypeptid auf, das von einem humanen IgG1-Antikörper abgeleitet wird.
Ein geeignetes Fc-Polypeptid, das in der PCT-Anwendung WO 93/10151 (hiermit durch Bezugnahme aufgenommen) beschrieben wird, ist ein Einzelkettenpolypeptid, das sich vom N-terminalen Bereich zum natürlichen C-Terminus des Fc-Bereichs eines humanen IgG1-Antikörpers erstreckt. Ein anderes nativen Fc-Polypeptid ist das Fc-Mutein, das in der US-Patenschrift 5,457,035 und in Baum et al. (EMBO J. 13: 3992–4001, 1994), hierin durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben wird. Die Aminosäuresequenz diese Muteins ist identisch mit der der natürlichen FC-Sequenz, die in WO 93/10151 dargestellt ist, außer dass sich Aminosäure 19 von Leu zu Ala gewandelt hat, sich Aminosäure 20 von Leu zu Glu gewandelt hat und sich Aminosäure 22 von Gly zu Ala gewandelt hat. Das Mutein zeigt verringerte Affinität für Fc-Rezeptoren.
Die oben beschriebenen Fusionsproteine, die Fc-Gruppen (und daraus gebildete Oligomere) umfassen, bieten den Vorteil, die Reinigung durch Affinitätschromatographie über Protein A- oder Protein G-Säulen zu erleichtern.
Bei anderen Ausführungen können die Polypeptide der Erfindung an Stelle des variablen Anteils einer schweren oder leichten Antikörperkette eingesetzt werden. Wenn die Fusionsproteine sowohl aus schweren als auch aus leichten Ketten eines Antikörpers bestehen, ist es möglich, ein Oligomer mit wenigsten vier extrazellularen ACPL-Bereichen zu bilden. Alternativ dazu können Fusionsproteine erzeugt werden, in denen ACPL oder ein lösliches Fragment von ACPL, z.B. die extrazellulare Region, und IL-1Rrp1 oder ein lösliches Fragment von IL-1Rrp1, z.B. die extrazellulare Region, an Stelle des variablen Anteils einer schweren oder leichten Antikörperkette eingesetzt werden.
Oligomere auf Peptidlinkerbasis
Alternativ dazu ist das Oligomer ein Fusionsprotein, das multiple Polypeptide aufweist, und zwar mit oder ohne Peptidlinkern (Spacerpeptide). Unter den geeigneten Peptidlinkern befinden sich jene, die in den US-Patenschriften 4,751,180 und 4,935,233 beschrieben werden, die hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Eine DNA-Sequenz, die einen gewünschten Peptidlinker kodiert, kann zwischen den und im gleichen Leserahmen wie die DNA-Sequenzen der Erfindung eingefügt werden, die eine geeignete konventionelle Technik anwenden. Ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid, das den Linker kodiert, kann zum Beispiel zwischen den Sequenzen eingebunden sein. Bei bestimmten Ausführungen weist ein Fusionsprotein zwei oder vier lösliche ACPL-Polypeptide auf, die durch Peptidlinker getrennt sind. Ähnlich wie oben beschrieben kann das Fusionsprotein zwei ACPL-Polypeptide oder Fragmente und zwei IL-1Rrp1 Polypeptide oder Fragmente beinhalten.
Leucin-Zipper
Ein anderes Verfahren zum Herstellen der Oligomere der Erfindung bezieht die Verwendung eines Leucine-Zippers ein. Leucin-Zipperdomänen sind Peptide, die die Oligomerisation der Proteine, in denen sie gefunden werden, fördern. Leucin-Zipper wurden ursprünglich in verschiedenen DNA-bindenden Proteinen identifiziert (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988) und wurden seitdem in einer Vielzahl verschiedener Proteine gefunden. Unter den bekannten Leucin-Zippern sind natürliche vorkommende Peptide und Derivative davon, die dimerisieren und trimerisieren.
Die Zipperdomäne (hierin auch als eine oligomerisierende oder oligomerbildende Domäne bezeichnet) umfasst ein repetitives „Heptad Repeat", oft mit vier oder fünf Leucinrückständen, die mit anderen Aminosäuren durchsetzt sind. Beispiele für Zipperdomänen sind jene, die im Hefetranskriptionsfaktor GCN4 gefunden werden und ein wärmebeständiges DNA-bindendes Protein, das in Rattenleber gefunden wird (C/EBP, Landschulz et al., Science 243: 1681, 1989). Zwei Kerntransformationsproteine, fos und jun, zeigen auch Zipperdomänen, wie das Genprodukt der Proto-Onkogene von Mäusen, c-myc (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988), auch aufweist. Die Produkte der Kernonkogene fos und jus weisen Zipperdomänen auf, die vorzugsweise Heterodimer bilden (O'Shea et al., Science 245: 646, 1989, Turner und Tjian, Science 243: 1689, 1989). Die Zipperdomäne ist für die biologische Aktivität (DNA-bindend) in diesen Proteinen notwendig.
Fusogene Proteine mehrerer verschiedener Viren, einschließlich Paramyxovirus, Coronavirus, Masernvirus und viele Retroviren besitzen auch Zipperdomänen (Buckland und Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart und Mosialos, AIDS Research and Retroviruses 6: 703, 1990). Die Zipperdomänen in diesen fusogenen viralen Proteinen befinden sich in der transmembranen Region der Proteine; es wurde angedeutet, dass Zipperdomänen zur oligomen Struktur der fusogenen Proteine beitragen könnten. Oligomersisation von fusogenen viralen Proteinen ist an der Fusionsporenbildung beteiligt (Spruce et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3523, 1991). Es wurde kürzlich auch berichtet, dass Zipperdomänen eine Rolle bei der Oligomerisation von Hitzeschock-Traskriptionsfaktoren spielen (Rabindran et al., Science 259: 230, 1993).
Zipperdomänen falten sich als kurze, parallelgewundene Windung (O'Shea et al., Science 254: 539; 1991). Die allgemeine Architektur der parallelgewundenen Windungen wurde gut gekennzeichnet als eine „Knöpfe-in-Löcher"-Packung, wie Crick es 1953 vorgeschlagen hat (Acta Crystallogr. 6: 689). Das Dimer, das durch eine Zipperdomäne gebildet wird, wird durch das Heptad Repeat stabilisiert, das (abcdefg)_n bezeichnet wird, gemäß der Aufzeichnung von McLachlan and Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293; 1975), in der Reste a und d grundsätzlich hydrophobe Reste sind, wobei d ein Leucin ist, das sich auf der gleichen Oberfläche einer Helix anordnet. Gegensätzlichgeladene Reste treten im Allgemeinen auf den Positionen g und e auf. Somit sind in einer parallelgewundenen Windung, die von zwei spiralförmigen Zipperdomänen gebildet wird, die „Knöpfe", die von hydrophoben Nebenketten der ersten Helix gebildet werden, in die „Löcher", die zwischen den Nebenketten der zweiten Helix gebildet werden, gepackt.
Die Reste auf Position d (oftmals Leucin) liefern hohe hydrophobe Stabilisierungsenergien und sind wichtig für die Oligomerbildung ((Krystek et al., Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991). Lovejoy et al. (Science 259: 1288, 1993) berichteten kürzlich von der Synthese eines dreisträngigen α-Helixbündels, in dem die Helices auf-auf-nieder laufen. Ihre Untersuchungen bestätigten, dass hydrophobe Stabilisierungsenergie die Haupttriebkraft für die Bildung von parallelgewundenen Windungen von gebundenen Wicklungen liefert. Diese Untersuchungen weisen auch darauf hin, dass elektrostatische Wechselwirkungen zur Stöchiometrie und zur Geometrie von gewundenen Wicklungen beitragen. Eine weitere Erörterung der Struktur von Leucin-Zippern ist in Harbury et al (Science 262: 1401, 26. November 1993) zu finden.
Beispiele von Leucin-Zipperdomänen, die für das Erzeugen von löslichen oligomeren Proteinen geeignet sind, werden in der PCT-Anwendung WO 94/10308 beschrieben, ebenso werden die Leucin-Zipper, die von dem Lungenoberflächenprotein D (SPD) abgeleitet sind in Hoppe et al. (FEBS Letters 344: 191, 1994), hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben. Die Nutzung eines modifizierten Leucin-Zippers, der eine stabile Trimerisation damit fusionierten heterologen Proteins ermöglicht, ist in Fanslow et al. (Semin. Immunol. 6: 267–278, 1994) beschrieben. Rekombinante Fusionsproteine, die mit dem Leucin-Zipperpeptid fusioniert sind, werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert, und das lösliche Oligomer, das sich bildet, wird aus dem Kulturüberstand gewonnen.
Bestimmte Leucin-Zippergruppen bilden vorzugsweise Trimere. Ein Beispiel ist ein Leucin-Zipper, der vom oben angeführten Lungenoberflächenprotein D (SPD) abgeleitet ist, wie in Hoppe et al. (FEBS Letters 344: 191, 1994) und in der US-Patentschrift 5,716,805, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen werden, beschrieben. Dieses von Lungen-SPD abgeleitete Zipperpeptid umfasst die Aminosäurefrequenz Pro Asp Val Ala Ser Leu Arg Gln Gln Val Glu Ala Leu Gln Gly Gln Val Gln His Leu Gln Ala Ala Phe Ser Gln Tyr.
Ein anderes Beispiel eines Leucin-Zippers, der die Trimerisation fördert, ist ein Peptid, das die Aminosäuresequenz Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Arg umfasst, wie in der US-Patenschrift 5,716,805 beschrieben. Bei einer alternativen Ausführung wird ein N-terminaler Asp-Rest hinzugefügt; bei einer weiteren fehlt dem Peptid der N-terminale Asp-Rest.
Fragmente der vorerwähnten Zipperpeptide, die die Eigenschaft Oligomerisation zu fördern beibehalten, können ebenso genutzt werden. Beispiele dieser Fragmente beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Peptide, denen ein oder zwei der N-terminal- oder C-terminale Reste, die in den vorerwähnten Aminosäuresequenzen angegeben wurden, fehlen. Leucin-Zipper können von natürlich auftretenden Leucin-Zipperpeptiden abgeleitet werden, z.B. durch konservative Substitution(en) in der natürlichen Aminosäuresequenz, wobei die Fähigkeit des Peptids, Oligomerisation zu fördern, erhalten bleibt.
Andere Peptide, die von natürlich auftretenden trimeren Proteinen abgeleitet werden, können zum Erzeugen oligomerer ACPL, einschließlich trimerer ACPL, eingesetzt werden. Alternativ dazu können synthetische Peptide, die Oligomerisation fördern, eingesetzt werden. Bei bestimmten Ausführungen werden Leucinrückstände in einer Leucin-Zippergruppe durch Isoleucin-Zipper ersetzt. Diese Peptide, die Isoleucine umfassen, können als Isoleucin-Zipper bezeichnet werden, werden aber von der Bezeichnung „Leucin-Zipper", wie hierin benutzt, eingeschlossen.
HERSTELLUNG VON POLYPEPTIDEN UND FRAGMENTEN DAVON
Expression, Isolation und Purifikation der Polypeptide und Fragmente können mit jeder geeigneten Technik durchgeführt werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf das Folgende:
Expressionssysteme
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Klonierungs- und Expressionsvektoren, die DNA enthalten, sowie Wirtszellen, die die rekombinanten Vektoren enthalten. Expressionsvektoren, die DNA aufweisen, können genutzt werden, um die Polypeptide oder Fragmente der Erfindung, die durch die DNA kodiert werden, zu erzeugen. Ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden enthält das Kultivieren von Wirtszellen, die durch einen rekombinanten Expressionsvektor transformiert werden, der Polypeptid kodiert, und zwar unter Bedingungen, die die Expression des Polypeptids fördern, danach die Gewinnung der exprimierten Polypeptide aus der Kultur. Der Spezialist wird erkennen, das der Vorgang des Reinigens der exprimierten Polypeptid verschieden sein wird entsprechend solcher Faktoren, wie der Typ der eingesetzten Wirtszellen, und ob das Polypeptid membrangebunden ist oder eine lösliche Form ist, die von der Wirtszelle sekretiert wird.
Jedes geeignete Expressionssystem kann eingesetzt werden. Die Vektoren beinhalten DNA, die ein Polypeptid oder ein Fragment der Erfindung kodiert, wirkungsmäßig verbunden mit geeigneten transkriptionalen oder translatorischen, regelnden Nukleotidsequenzen, wie jene, die von einem Säugetier-, Mikroben-, Viren- oder Insektengen abgeleitet sind. Beispiele von regulatorischen Sequenzen beinhalten Promoter, Operatoren und Verstärker, eine mRNA-ribosomalbindenden Stelle, und entsprechende Sequenzen, die Transkriptions- und Translationsbeginn und -ende steuern. Nukleotidsequenzen sind wirkungsmäßig verbunden, wenn die regelnde Sequenz sich funktional auf die DNA-Sequenz bezieht. So ist eine Promoternukleotidsequenz dann wirkungsmäßig mit einer DNA-Sequenz verbunden, wenn die Promoternukleotidsequenz die Transkription der DNA-Sequenz steuert. Eine Quelle von Reproduktion, die die Fähigkeit zu reproduzieren auf die gewünschte Wirtzelle überträgt, und ein Selektionsgen, durch das die Transformanten identifiziert werden, sind generell in den Expressionsvektor eingeschlossen.
Zusätzlich kann eine Sequenz, die ein geeignetes Signalpeptid (nativ oder heterolog) kodiert, in den Expressionsvektor eingegliedert werden. Eine DNA-Sequenz für Signalpeptid (Sekretionsleader) kann im Rahmen mit der Nukleinsäuresequenz der Erfindung fusioniert werden, so dass die DNA zuerst transkribiert wird and die mRNA translatiert in ein Fusionsprotein, das das Signalpeptid enthält. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigten Wirtszellen wirksam ist, fördert extrazellulare Sekretion des Polypeptids. Das Signalpeptid wird vom Polypeptid abgespalten bei Sekretion von Polypeptid von der Zelle.
Der Fachmann wird ebenso feststellen, dass die Position(en), an denen das Signalpeptid abgespalten wird, von denen, die vom Computerprogramm vorausgesagt werden, abweichen kann (können) und entsprechend solcher Faktoren, wie den Typ der Wirtszellen, die bei der Expression eines rekombinanten Polypeptids eingesetzt werden, variieren kann (können). Eine Proteinherstellung kann eine Mischung von Proteinmolekülen, die verschiedene N-terminale Aminosäuren haben, die sich aus der Abspaltung des Signalpeptids an mehr als einem Ort ergeben, beinhalten.
Geeignete Wirtszellen zur Expression von Polypeptiden beinhalten Prokaryote, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen. Säugetier- oder Insektenzellen werden allgemeine für die Verwendung als Wirtszellen bevorzugt. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Nutzung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Säugetier Zellwirten werden zum Beispiel in Pouwels et al. Cloning vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985), beschreiben. Zellenfreie Translationssysteme können auch eingesetzt werden, um Polypeptide unter Verwendung von RNA herzustellen, die von DNA-Konstrukten, die hierin gezeigt werden, abgeleitet werden.
Prokaryotische Systeme
Prokaryote beinhalten gram-negative und gram-positive Organismen. Geeignete prokaryotische Wirtszellen zur Transformation beinhalten zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus. In einer prokaryotischen Wirtszelle, wie E. coli, kann ein Polypeptide einen N-termalen Methioninrest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale. Met kann von dem exprimierten rekombinanten Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren zur Nutzung in prokaryotischen Wirtszellen enthalten allgemein ein oder mehrere phenotypisch selektierbare Markergene. Ein phenotypisch selektierbares Markergen ist zum Beispiel ein Gen, das ein Protein kodiert, das antibiotische Resistenz überträgt oder das eine autotrophe Voraussetzung liefert. Beispiele nützlicher Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen beinhalten jene, die von kommerziell verfügbaren Plasmiden, wie dem Kloningvektor pBR322 (ATCC 27017) abgeleitet werden. PBR322 enthält Gene für ampicilline und tetracycline Resistenz und liefert somit Mittel zum Identifiezieren transformierter Zellen. Ein geeigneter Promoter und eine DNA-Sequenz werden in den pBR322-Vektor eingefügt. Weitere kommerziell verfügbare Vektoren beinhalten zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Upsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Promotersequenzen, die gewöhnlich für rekombinante prokaryotische Wirtszellenexpressionsvektoren verwendet werde, beinhalten β-Lactamase (Penicillinase), Lactose-Ppromotersystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), Tryptophan(trp)-Promotersystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EP-A-36776) und Tac-Promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labratory, S. 412, 1982). Ein besonders nützliches Wirtszellenexpressionssystem setzt einen Phage-λP_L-Promoter und eine cI857ts thermolabile Repressorsequenz ein. Plasmidvektoren, die bei der American Type Culture Collection verfügbar sind, und die Derivative des λP_L-Promoters einschließen, beinhalten Plasmid pHUB2 (in E. coli-Linie JMB9, ATCC 37092, resident) und pPLc28 (in E. coli RR1, ATCC 53082, resident).
Hefesysteme
Alternativ dazu können die Polypeptide in Hefewirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise von der Saccharomyces-Gattung (z.B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen, wie Pichia oder Kluyveromyces, können ebenfalls eingesetzt werden. Hefevektoren werden häufig einen Anfang von Reproduktionssequenz vom 2 μ-Hefeplasmid, eine autonom reproduzierende Sequenz (ARS), eine Promoterregion, Sequenzen für Polydenylation, Sequenzen für Transkriptionsende und ein selektierbares Markergen enthalten. Geeignete Promotersequenzen für Hefevektoren beinhalten unter Anderem Promoter für Metallothionein, 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofruktokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, 3-Phosphoclycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phospho-Glukose-Isomerase und Glukokinase. Andere geeignete Vektoren und Promoter für die Verwendung in Hefeexpression werden näher beschrieben in Hitzeman, EPA-73,657. Eine andere Alternative ist der Glukose-repressible ADH2-Promoter, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300: 724, 1982) beschrieben ist. Shuttlevektoren, die sowohl in Hefe als auch E. coli reproduzierbar sind, können durch Einfügen von DNA-Sequenzen von pBR322 für Selektion und Reproduktion in E. coli (Amp'-Gen und Quelle von Reproduktion) in die oben beschriebenen Hefevektoren konstruiert werden.
Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz kann für die direkte Sekretion des Polypeptids eingesetzt werden. Die α-Faktor-Leadersequenz wird häufig zwischen die Promotersequenz und die strukturelle Gensequenz eingefügt. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982 und Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984. Andere Leadersequenzen, die zum Erleichtern der Sekretion rekombinanter Polypeptide von Hefe geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leadersequenz kann in der Nähe ihres 3' Terminus modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Das wird die Fusion der Leadersequenz mit dem strukturellen Gen erleichtern.
Hefetransformationsprotokolle sind den Fachleuten bekannt. Eines dieser Protokolle wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al.-Protokoll wählt Trp⁺-Transformanten in einem selektiven Medium aus, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefenitrogenbase, 0,5% Casaminosäure, 2% Glukose, 10 mg/ml Adenin und 20 mg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die durch Vektoren transformiert sind, die eine ADH2-Promotersequenz enthält können, für induzierende Expression in einem „reichen" Medium gezüchtet werden. Ein Beispiel für ein reiches Medium ist eines, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glukose besteht, ergänzt durch 80 mg/ml Adenin und 80 mg/ml Uracil. Derepression des ADH2-Promoters tritt auf, wenn Glukose im Medium aufgebraucht ist.
Säugetier- oder Insektensysteme
Säugetier- oder Insektenwirtszellensysteme können ebenfalls angewendet, um rekombinante ACPL-Polypeptide zu exprimieren. Bacculovirussysteme zur Herstellung heterologer Proteine in Insekten wurden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988) besprochen. Eingeführte Zelllinien aus Säugetierquellen können auch eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Säugetierwirtszellenlinien beinhalten die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL1651)(Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Eierstockzellen vom chinesischen Hamster (CHO), HeLa-Zellen und BHK(ATCC CRL 10)-Zelllinien, und die CV1/EBNA-Zelllinie, die von der Zelllinie CV1 (ATCC CCL 70) der Nieren der „Afrikanischen Grünen Meerkatze" abgeleitet ist, wie es von McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben wurde.
Eingeführte Verfahren zum Einfügen von DNA in Säugetierzellen wurden beschrieben (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15–69). Zusätzliche Protokolle, die kommerziell verfügbare Reagenzien, wie Lipofectamin-Lipid-Reagens (Gibco/BRL) oder Lipofectamin-Plus-Lipid-Reagens können genutzt werden, um Zellen zu transfizieren (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417, 1987). Zusätzlich kann Elektroporation angewendet werden, um Säugetierzellen zu transfizieren, wobei konventionelle Verfahren genutzt werden, wie jene in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Auswahl von stabilen Transformanten kann vorgenommen werden, wobei auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren angewendet werden, wie zum Beispiel Resistenz gegen zytotoxische Drogen. Kaufman et al., Meth. In Enzymology 185: 487–511, 1990, beschreibt verschiedenen Selektionsschemata, wie Dihydrofolat-Reduktase(DHFR)-Resistenz. Eine geeignete Wirtskette für DHFR-Selektion kann CHO-Linie DX-B11, die in DHFR unzureichend vorhanden ist (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216–4220, 1980). Ein Plasmid, das die DHFR-cDNA exprimiert, kann der Linie DX-B11 zugeführt werden, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können in dem geeigneten selektiven Medium wachsen. Andere Beispiele für selektierbare Marker, die in einen Expressionsvektor integriert werden können, beinhalten cDNA, die Resistenz gegenüber Antibiotika übertragen, wie G418 und Hycromycin B. Zellen, die den Vektor beherbergen, können auf der Grundlage der Resistenz gegenüber diesen Verbindungen selektiert werden.
Transkriptionale und translatorische Steuersequenzen für Säugetierwirtszellen-Expressionsvektoren können von Virusgenomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Verstärkersequenzen werden vom Polyomavirus, Adenovirus 2, Affenvirus 40 (SV 40) und vom humanen Zytomegalovirus abgeleitet. DNA-Sequenzen, die vom SV 40 viralen Genom abgeleitet werden, zum Beispiel, SV40-Ursprung, früher und später Promoter, Verstärker, Spleißung und Polyadenylationsstellen können genutzt werden, um andere genetisch Elemente zur Expression einer strukturellen Gensequenz in einer Säugetierwirtszelle vorzusehen. Virale frühe und späte Promoter sind besonders nützlich, weil beide leicht aus einem viralen Genom als ein Fragment gewonnen werden können, das auch eine virale Quelle der Reproduktion enthalten kann (Fiers et al. Nature 273: 113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990. Kleinere oder größere Fragmente können auch genutzt werden, vorausgesetzt die ungefähr 250 bp Sequenz, die sich von der Hind-III-Stelle zum Bgl-I-Stelle erstreckt, die sich in dem SV40 viralen Ursprungsstelle der Reproduktion befinden, ist vorhanden.
Weitere Steuersequenzen, die nachgewiesen werden, um die Expression heterologer Gene von Säugetierexpressionsvektoren zu verbessern, beinhalten solche Element wie das Sequenzelement der Expressionsteigerung (EASE), das von CHO-Zellen abgeleitet ist (Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, Seiten 529–534 und PCT Anmeldung WO 97/25420), und der dreiteilige Leader (TPL) und VA-Gen-RNA vom Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257: 13475–13491, 1982). Die inneren Ribosomeingangsstellen (IRES)-Sequenzen ermöglichen dicistronischen mRNA wirksam translatiert zu werden (Oh und Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3: 295–300, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24: 2697–2700, 1996). Es wurde gezeigt, daß Expression einer heterologen cDNA als Teil einer dicistronischen mRNA gefolgt von dem Gen für einen selektierbaren Marker (z.B. DHFR) die Transfizierbarkeit des Wirtes und Expression der heterologen cDNA verbessert (Kaufman, Meth. In Enzymology, 1990). Exemplarische Expressionsvektoren, die dicistronische mRNA anwenden, sind pTR-DC/GFP, beschrieben von Mosser et al., Biotechniques 22: 150–161, 1997, und p2A5I, beschrieben von Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, Seiten 529–534.
Ein nützlicher hoher Expressionsvektor, pCAVNOT, wurde von Mosley et al., Cell 59: 335–348, 1989, beschrieben. Andere Expressionsvektoren für die Verwendung in Säugetierwirtszellen können gebildet werden wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983) geoffenbart. Ein nützliches System für stabile, auf hohem Niveau liegende Expression von Säugetier-cDNA in C127-Brustepithelzellen von Mäusen kann konstruiert werden, wie es im wesentlichen von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben ist. A nützlicher Vektor hoher Expression, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche Säugetierexpressionsvektoren sind in EP-A-0367566 und in WO 91/18982, hierin durch Bezugnahme aufgenommen beschrieben. Bei noch einer weiteren Alternative können die Vektoren von Retroviren abgeleitet werden.
Andere nützliche Expressionsvektoren, pFLAG^® und pDC311, können auch genutzt werden. FLAG^®-Technologie konzentriert sich auf die Fusion eines niedrigen Molekulargewichts (1 kD) aufweisenden, hydrophilen FLAG^®-Markerpeptids an den N-Terminus eines rekombinanten Proteins, das durch FLAG^®-Expressionsvektoren exprimiert wird. PDC311 ist ein weiterer spezialisierter Vektor, der genutzt wird, Proteine in CHO-Zellen zu exprimieren. pDC311 ist gekennzeichnet durch ein bicistronische Sequenz, die das interessante Gen und ein Dihydrofolat-Reduktase(DHFR)-Gen mit einem inneren Ribosombindungsort für DHFR-Translation, eine Sequenzelement der Expressionssteigerung, den humanen CMV-Promoter, eine dreiteilige Leadersequenz und einen Polyadenylationsort enthält.
Hinsichtlich der Signalpeptide, die eingesetzt werden können, kann das natürliche Signalpeptid, wenn gewünscht, durch ein heterologes Signalpeptid oder Leadersequenz ersetzt werden. Die Auswahl des Signalpeptids oder Leaders, kann von Faktoren abhängen wie dem Typ von Wirtszellen, in denen das rekombinante Polypeptid erzeugt werden soll. Zur Verdeutlichung, Beispiele heterologer Signalpeptide, die in Säugetierwirtszellen funktional sind, beinhalten die Signalsequenz von Interleukin-7 (IL-7), beschrieben in der US-Patenschrift 4,965,195; die Signalsequenz für den Interleukin-2 Rezeptor, beschrieben in Cosman et al., Nature 312: 768 (1984); das Interleukin-4-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP 367,566 ; das Typ I-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in der US-Patentschrift 4,968,607 und das Typ II-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP 460,846 .
Isolation und Reinigung
Die Erfindung beinhaltet auch Verfahren zur Isolation und Reinigung von ACPL-Polypeptiden und Fragmenten davon.
Die „isolierten" Polypeptide oder Fragmente, die von dieser Erfindung umfasst werden, sind ACPL-Polypeptide oder Fragmente, die sich nicht in einem Umfeld befinden, das mit dem Umfeld, in dem es oder sie sich in der Natur gefunden werden können, identisch ist. Die „gereinigten" Polypetide oder Fragmente davon, die in der Erfindung umfasst werden, sind im Wesentlichen frei von Assozierung mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, zum Beispiel als Reinigungsprodukt von rekombinanten Expressionssystemen wie jene, die oben beschrieben wurden, oder als ein nichtgereinigtes Produkt von einer nichtgereinigten Quelle, wie natürlich auftretende Zellen und/oder Gewebe.
Bei einer bevorzugten Ausführung kann die Reinigung rekombinanter Polypeptide oder Fragmente durch Nutzung von Fusionen von Polypeptiden oder Fragmenten der Erfindung an ein anderes Polypeptid durchgeführt werden, um die Reinigung von Polypeptiden oder Fragmenten der Erfindung zu unterstützen. Diese Fusionspartner können das poly-His- oder andere antigenische Identifizierungspeptide, die oben beschrieben werden, sowie früher beschriebene Fc-Einheiten beinhalten.
Bezüglich jeden Typs von Wirtszellen, der dem Fachmann bekannt ist, werden Verfahren zur Reinigung eines rekombinanten Polypeptids oder Fragments, in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie Typ der eingesetzten Wirtszellen und ob das rekombinante Polypeptid oder Fragment in das Kulturmedium sekretiert wird oder nicht unterschiedlich sein.
Im Allgemeinen kann rekombinantes ACPL-Polypeptid oder Fragment von den Wirtszellen, sofern es nicht sekretiert sind, oder von dem Medium oder Überstand, wenn sie löslich oder sekretiert sind, isoliert werden, gefolgt von einer oder mehreren Konzentrationen, Aussalzung, Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Affinitätsreinigung oder Schritte der Größenausschluss-Chromotographie. Hinsichtlich spezifischer Wege zum Ausführen dieser Schritte kann das Kulturmedium zuerst konzentriert werden, wobei ein kommerziell verfügbarer Proteinkonzentrationsfilter, zum Beispiel Amicon- oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, verwendet wird. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie ein Gelfiltrationsmedium, aufgebracht werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz eingesetzt werden, zum Beispiel eine Matrix oder Substrat, die sich anhängende Diethyl-Aminoethyl(DEAE)-Gruppen besitzen. Die Matrizes können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere Typen, die allgemein in der Proteinreinigung eingesetzt werden, sein. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt vorgenommen werden. Geeignete Kationenaustauscher beinhalten verschiedene Matrizes, die Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen enthalten. Zusätzlich kann ein Chromatofokusierungs-Schritt eingesetzt werden. Alternativ dazu kann ein Chromatographieschritt der hydrophoben Wechselwirkung eingesetzt werden. Geeignete Matrizes können Phenyl- oder Octyl-Gruppen, die an Harze gebunden sind, sein. Zusätzlich kann Affnitätschromtographie, die das rekombinante Protein selektiv bindet, eingesetzt werden. Beispiele für diese eingesetzten Harze sind Lectinsäulen, Farbstoffsäulen und Metallchelat bildende Säulen. Schließlich können Schritte der Hochleistungs-Flüssigkeits-Umkehrphasen-Chromotographie, die hydrophobe RP-HPLC-Medien einsetzen (z.B. Kieselerdegel oder Polymerharz, das sich anhängende Methyl-, Octyl-, Octyldecyl- oder andere aliphatische Gruppen besitzt) eingesetzt werden, um die Polypeptide zu reinigen. Einige oder alle der vorangehenden Reinigungsschritte, in verschiedenen Kombinationen, sind weithin bekannt und können eingesetzt werden, um ein isoliertes und gereinigtes rekombinantes Protein zu liefern.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, die ein ACPL-polypeptidbindendes Protein enthält, wie ein monoklonaler Antikörper, der gegen ein ACPL-Polypeptid oder Fragment davon entwickelt wurde, um exprimierte Polypeptide zu affinitätsreinigen. Diese gereinigten ACPL-Polypeptide können von einer Affinitätssäule durch konventionelle Techniken entfernt werden, z.B. in einem hohen Salzelutionspuffer und dann zur Verwendung dialysiert in einen niedrigen Salzpuffer oder durch Wechselndes pH-Wertes oder andere Bestandteile, die von der genutzten Affinitätsmatrix abhängen, oder können kompetetiv entfernt werden durch die Verwendung des natürlich auftretenden Substrats der Affinitätsgruppe, wie ein von der Erfindung abgeleitetes Polypeptid.
Bei diesem Aspekt der Erfindung können ACPL-polypeptidbindende Proteine, wie die anti-Polypeptid Antikörper und andere Proteine, die mit ACPL-Polypeptid in Wechselwirkung treten können, an einen Träger der festen Phase wie eine Säulenchromatographiematrix oder ein ähnliches Substrat gebunden sein, das geeignet ist, Zellen, die Polypeptide der Erfindung auf ihrer Oberfläche exprimieren, zu identifizieren, separieren oder purifizieren. Adhäsion von ACPL-polypeptidbindenden Proteinen an einer Kontaktoberfläche der festen Phase kann mit jedem Mittel durchgeführt werden, zum Beispiel können magnetische Mikrosphären mit diesen polypeptidbindenden Proteinen beschichtet und durch ein magnetisches Feld in dem Inkubationsgefäß gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen kommen mit der festen Phase in Kontakt, die diese polypeptidbindenden Proteine darauf hat. Zellen, die ACPL-Polypeptide auf ihrer Oberfläche haben, binden an das fixierte polypeptidbindende Protein und ungebundene Zellen werden dann weggewaschen. Dieses Affinitätsbindungs-Verfahren ist nützlich, diese polypeptid-expressierende Zellen zu reinigen, zu untersuchen oder von der Lösung zu separieren. Verfahren zum Freisetzen positiv ausgewählter Zellen von der festen Phase sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen zum Beispiel die Nutzung von Enzymen. Solche Enzyme sind vorzugsweise nicht toxisch und nicht schädlich und sind vorzugsweise dazu da, den Zelloberflächenbindungspartner direkt abzuspalten.
Alternativ dazu können Mischungen von Zellen, von den vermutet wird, dass sie ACPL-polypeptidexprimierende Zellen enthalten, zuerst mit biotinyliertem ACPL-polypeptidbindenden Protein inkubiert werden. Inkubationsperioden sind typischerweise mindestens eine Stunde, um eine ausreichende Bindung der Polypeptide der Erfindung zu sichern. Die daraus resultierende Mischung wird dann durch eine Säule, die mit avidinbeschichteten Perlen bestückt ist, hindurchgeleitet, wobei die hohe Affinität von Biotin für Avidin die Bindung der polypeptidbindenden Zellen an die Perlen gewährleistet. Die Verwendung von avidinbeschichteten Perlen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe Berenson, et al. j. Cell. Biochem., 10D: 239 (1986). Das Waschen ungebundenen Materials und die Freisetzung der gebundenen Zellen wird mit konventionellen Verfahren durchgeführt.
Der gewünschte Reinheitsgrad hängt vom beabsichtigten Verwendungszweck des Proteins ab. Ein relativ hoher Reinheitsgrad wird gewünscht, wenn das Polypeptid in vivo verabreicht werden soll. In diesem Fall werden die Polypeptide so gereinigt, dass keine Proteinbanden, die mit anderen Proteinen übereinstimmen, durch Analyse mit Hilfe von SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) nachweisbar sind. Es wird von einem Fachmann dieses Gebiets erkannt werden, dass mulitiple Banden, die dem Polypeptid entsprechen, durch SDS-PAGE, aufgrund Differenzierungsglykolisation, post-translationaler Differenzierungsbehandlung und desgleichen visualisiert werden können. Am meisten ist bevorzugt, wenn das Polypeptid der Erfindung zu im wesentlichen Homogenität gereinigt ist, wie von einer einzelnen Proteinkette nach Analyse durch SDS-PAGE angezeigt wird. Die Proteingruppe kann durch Silberfärbung, Comassie-Blaufärbung oder (wenn das Protein radiaktiv markiert ist) durch Autoradiographie visualisiert werden.
Analysen
Die gereinigten Polypeptide der Erfindung (einschließlich Proteine, Polypeptide, Fragmente, Varianten, Oligomere und anderer Formen) können in jeder Analyse auf ihre Fähigkeit zur Bindung getestet werden, wie eine konventionelle Bindungsanalyse. Um das zu verdeutlichen, kann das Polypeptid mit einem nachweisbaren Reagens (z.B. ein Radionuklid, Chromophor, Enzym, das colorimetrische oder flourometrische Reaktionen katalysiert, u. dgl.) markiert werden. Das markierte Polypeptid wird mit Zellen in Kontakt gebracht, die ein geeignetes ACPL-bindendes Protein exprimieren, z. B. ein Anti-ACPL-Antikörper. Dann werden die Zellen gewaschen, um ungebundenes markiertes Polypeptid zu entfernen, und das Vorhandensein des zellgebundenen markierten Materials wird durch eine geeignete Technik, die nach der Herkunft des markierten Materials ausgewählt werden, bestimmt.
Ein Beispiel eines Bindungsanalyseverfahrens ist Folgendes. Ein rekombinanter Expressionsvektor, der ACPL-bindendes Protein cDNA enthalt, wird erzeugt. CV1-EBNA-1-Zellen werden in 10 cm²-Schalen mit dem rekombinanten Expressionsvektoren transfiziert. CV-1/EBNA-1-Zellen (ATCC CRL 10478) exprimieren konstitutiv EBV-Kernantigen-1 aus, das aus dem CMV-nahen frühen Verstärker/Promoter gelenkt wird. CV-I-EBNA-1 wurde von der Nierenzelllinie CV-1 (ATCC CCL 70) von der „Afrikanischen Grünen Meerkatze" abgeleitet, wie von McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben wurde.
Die transfizierten Zellen werden 24 Stunden kultiviert, und die Zellen in jeder Schale werden dann in einer 24-Vertiefungen-Platte aufgeteilt. Nach zusätzlichen 48 Stunden des Kultivierens werden die transfizierten Zellen (rund 4 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) mit BMNFDM gewaschen, das das Bindungsmedium (RPMI 1640, das 25 mg/ml bovines Serumalbium, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes pH 7,2 enthält) ist, dem 50 mg/ml entfetteter Trockenmilch hinzugegeben wurde. Die Zellen werden danach 1 Stunde bei 37°C inkubiert mit verschiedenen Konzentrationen von zum Beispiel einem löslichen Polypeptid-/Fc-Fusionsprotein, das wie oben erläutert hergestellt wurde. Die Zellen werden dann gewaschen und mit einer konstanten Sättigungskonzentration eines ¹²⁵I-Maus-anti-humanen IgG in Bindungsmedium inkubiert, bei sanften Bewegen für 1 Stunde bei 37°C. Nach ausgiebigem Waschen werden die Zellen mittels Trypsinisation freigesetzt.
Das oben eingesetzte Maus-anti-Mensch IgG ist gegen den Fc-Bereich des humanen IgG gerichtet und kann von Jackson Immunoresearch Labotatories, Inc., West Grove, PA, bezogen werden. Der Antikörper ist radio-iodiniert, das klassische Chlorami-T-Verfahren angewendet ist. Der Antikörper wird an den FC-Anteil eines jeden Polypeptid-/Fc-Proteins binden, das sich an die Zellen gebunden hat. Bei allen Analysen wird nichtspezifisch bindender ¹²⁵I-Antikörper in Abwesenheit des Fc-Fusionsproteins/Fc sowie bei Vorhandensein des Fc-Fusionsproteins und eines 200-fachen molaren Überschusses von unmarkiertem Maus-anti-humanen IgG-Antikörper analysiert.
Zellgebundener ¹²⁵I-Antikörper wird durch einen Packard-Autogammazähler quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) werden von RS/1 (BBN Software, Boston, MA) durchgeführt, das auf einem Microvax-Computer läuft.
Ein anderer Typ einer geeigneten Bindungsanalyse ist die kompetetive Bindungsanalyse. Um dies zu verdeutlichen kann biologische Aktivität einer ACPL-Variante durch Analyse der Fähigkeit der Variante, mit dem nativen Protein zur Bindung an ein ACPL-Protein zu konkurrieren, bestimmt werden.
Kompetitive Bindungsanalysen können mit der konventionellen Methodologie ausgeführt werden. Reagenzien, die bei kompetitiven Bindungsanalysen eingesetzt werden können, beinhalten radioaktiv markierte ACPL und intakte Zellen, die ein ACPL-bindendes Protein (endogen oder rekombinant) auf der Zelloberfläche exprimieren. Ein radioaktiv markiertes lösliches ACPL-Fragment kann zum Beispiel genutzt werden, um mit einer löslichen ACPL-Variante bei der Bindung an ein Zelloberflächen-ACPL-bindendes Protein zu konkurrieren. Anstelle intakter Zellen kann ein lösliches ACPL-bindendes Protein/Fc-Fusionsprotein, jenes ersetzen, das an eine feste Phase durch die Wechselwirkung von Protein A oder Protein G (auf der festen Phase) mit der Fc-Einheit gebunden ist. Chromatographiesäulen, die Protein A und Protein G enthalten, beinhalten jene, die bei Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ, verfügbar sind.
Ein anderer Typ der Konkurrenzbindungsanalyse verwendet radioaktiv markiertes lösliches ACPL-bindendes Protein, wie ein ACPL-bindendes Protein/Fc-Fusionsprotein, und intakte Zellen, die ACPL exprimieren. Qualitative Ergebnisse können von kompetitiven autoradiographischen Plattenbindungsanalysen erhalten werden, während Scatchard-Plots (Scatchard, Ann. N. Y. Accad. Sci. 51: 660, 1949) zum Erzielen quantitativer Ergebnisse genutzt werden können.
VERWENDUNG VON ACPL-NUKLEINSÄURE ODER OLIGONUKLEOTIDEN
Zusätzlich zur Verwendung, Polypeptide wie oben beschrieben zu exprimieren, können die Nukleinsäuren der Erfindung, einschließlich DNA, und Oligonukleotide davon verwendet werden:

– humanes Chromosom Nummer 2q zu identifizieren
– Gene auf humanem Chromosom Nummer 2q abzubilden.
– Gene, die mit gewissen Krankheiten, Syndromen oder anderen Zuständen im Zusammenhang mit Chromosom Nummer 2q in Verbindung stehen, zu identifizieren;
– als einzelsträngige Sense- oder Antisense-Oligeonukleotide, um Expression von durch das ACPL-Gen kodiertes Polypeptid zu hemmen;
– zu helfen, defekte Gene in einem Individuum zu ermitteln; und
– Gentherapie Sonden

Unter den Verwendungszwecken der Nukleinsäuren der Erfindung befindet sich die Verwendung von Fragmenten als Sonden oder Primer. Solche Fragmente umfassen im Allgemeinen mindestens 30 oder mindestens 60 zusammenhängende Nukleotide einer DNA-Sequenz auf. Bei anderen Ausführungen weist ein DNA-Fragment mindestens 30 oder mindesten 60 zusammenhängende Nukleotide einer DNA-Sequenz auf.
Weil Homologe von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 von einer anderen Säugetierspezies hierin betrachtet werden, können Sonden, die auf der DNA-Sequenz von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 basieren, genutzt werden, um cDNA-Bibliotheken zu durchsuchen, die von anderen Säugetierspezies unter Verwendung konventioneller Kreuz-Hybridisierungstechniken zwischen den Spezies abgeleitet sind.
Unter Nutzung der Kenntnis des genetischen Codes in Verbindung mit oben angeführten Aminosäuresequenzen können Sätze degenerierter Oligonukleotide erzeugt werden. Solche Oligonukleotide sind nützlich als Primer, z.B. bei Polymerase-Kettenreaktionen (PCR), wobei DNA-Fragmente isoliert und amplifiziert werden.
Chromosomenkartierung
Alles oder ein Teil der Nukleinsäuren von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 6, einschließlich Oligonukleotide, kann vom Fachmann unter Verwendung der weithin bekannten Techniken genutzt werden, um humane 2q und den spezifischen Ort davon zu identifizieren, der die DNA- und IL-1R-Familienmitglieder, einschließlich IL-1-Rezeptoren I und II, ST2 und IL-1RrpI, enthält. Nützliche Techniken beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die Verwendung der Sequenz oder Teile davon, einschließlich Oligonukleotide, als Sonde in verschieden weithin bekannten Techniken, wie Strahlungshybridkartierung (hohe Auflösung), in-situ-Hybridisierung zu Chromosomenverbreitung (moderate Auflösung) und Southern-Blot-Hybridisierung, an Hybridzelllinien, die einzelne humane Chromosomen (niedrige Auflösung) enthalten.
Chromosomen können zum Beispiel durch Strahlungshybridisierung kartiert werden. Zuerst wird die PCR unter Anwendung des Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research Genebridge4-Panels von 93 Strahlungshybriden (http://www.genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/rhmap/genebridge4.html) ausgeführt. Es werden Primer verwendet, die innerhalb eines vermeintlichen Exon des interessanten Gens liegen und die ein Produkt aus humaner genomischer DNA amplifizieren, aber genomische DNA von Hamstern nicht verstärken. Die Ergebnisse der PCR werden in einen Datenvektor umgewandelt, der auf die Whitehead/MIT Radiation Mapping-Site im Internet (http://www-seq.wi.mit.edu) übertragen wird. Die Daten werden ausgewertet und es erfolgt die chromosmale Zuordnung und Platzierung entsprechend der bekannten Sequence Tag Site (STS)-Marker auf der Strahlungshybridkarte. Die folgende Website liefert zusätzliche Informationen zu Strahlungshybridkartierung:
http//www.genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human_STS_releases/july97/07-97.INTRO.html).
Identifizierung zugehöriger Krankheiten
Wie oben ausgeführt wurde die DNA von SEQ ID NO: 6 dem Chromosome 2q zugeordnet. Diese Region steht im Zusammenhang mit bestimmten Krannkheiten, die jene in Tabelle 1, oben, identifizierten beinhalten, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Somit kann die Nukleinsäure von SEQ ID NO: 6 oder ein Fragment davon durch einen Fachmann genutzt werden um unter Anwendung der bekannten Techniken Abnormalitäten, die der Genkartierung zu Chromosom 2q zugeordnet sind, zu analysieren. Das ermöglicht, die Bedingungen zu unterscheiden, unter denen dieser Marker neugeordnet oder entfernt wird. Zusätzlich können Nukleotide von SEQ ID NO: 6 oder ein Fragment davon als Positionsmarker verwendet werden, um andere Gene eines unbekannten Ortes zu kartieren.
Die DNA kann bei der Entwicklung von Behandlungsmethoden für jede Störung genutzt werden, die durch defekte oder unzureichende Menge an Genen, die hinsichtlich der Nukleinsäuren der Erfindung entsprechen, (direkt oder indirekt) vermittelt werden. Der Nachweis von nativen Nukleotidsequenzen erlaubt dabei das Erkennen defekter Gene und deren Ersetzung durch normale Gene. Defekte Gene können durch diagnostische in vitro-Analysen und durch den Vergleich einer natürlichen Nukleotidsequenz, die hierin geoffenbart ist, mit der eines Gens, das von einer Person deriviert wurde, bei der vermutet wird, dass sie einen Defekt in diesem Gen in sich trägt, ermittelt werden.
Sense-Antisense
Andere nützliche Fragmente der Nukleinsäuren beinhalten Antisense- oder Sense-Oligonukleotide, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die in der Lage ist, an Ziel-mRNA(Sense)- oder DNA(Antisense)-Sequenzen zu binden. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide entsprechend der vorliegenden Erfindung enthalten ein Fragment der DNA von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 6. Ein solches Fragment weist im Allgemeinen mindestens ungefähr 14 Nukleotide auf, vorzugsweise 14 bis etwa 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder Sense-Oligonukleotide zu derivieren, die auf einer cDNA-Sequenz, die ein gegebenes Protein kodiert, beruht, ist zum Beispiel beschrieben in Stein und Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) und van der Krol et al. (Bio Techniques 6: 958, 1988).
Das Binden von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden an Zielnukleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Duplexen, die Proteinexpression durch eines von verschieden Mitteln blockieren und hemmen, einschließlich verstärkten Abbaus der mRNA durch RNAseH, Hemmen der Spleißung, vorzeitiger Beendigung von Transkription oder Translation oder anderer Mittel. Die Antisense-Oligonukleotide können so genutzt werden, die Expression von Proteinen zu blockieren. Antisense- oder Sense-Oligonuleotide weisen außerdem Oligonukleotide auf, die eine modifizierte Zuckerphosphodiester-Hauptkette (oder andere Zuckerbindungen, wie die in WO91/06629 beschriebenen) besitzen und wobei diese Zuckerbindungen gegen endogene Nukleasen resistent sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerbindungen sind stabil in vivo (z.B. in Lage, enzymatischem Abbau zu widerstehen), aber erhalten die Sequenzspezifität, um Zielnukleotidsequenzen zu binden.
Andere Beispiele von Sense- oder Antisense-Oligonukleotiden beinhalten die Oligonukleotide, die kovalent an organische Anteile, wie in WO 90/10448 beschriebenen, und an andere Anteile gebunden sind, die die Affinität des Oligonukleotids für eine Zielnukleinsäuresequenz, wie Poly-(L-Lysin), steigern. Außerdem können noch Einlagerungswirkstoffe, wie Ellipticin, und alkylierende Wirkstoffe oder Metallkomplexe an Sense- oder Antisense-Oligonukleotide angelagert werden, um die Bindungsspezifitäten des Antisense- oder Sense-Nukleotids für die Zielnukleotidsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können in eine Zelle eingeführt werden, die die Zielnukleinsäuresequenz enthält, durch jedes Gentransferverfahren, einschließlich zum Beispiel Lipofektion, durch CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren, wie Epstein-Barr-Virus.
Sense- oder Antisense-Oligonukleotide können auch in eine Zelle eingeführt werden, die die Zielnukleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Konjugats mit einem ligandbindenden Molekül, wie in WO 91/04753 beschrieben. Geeignete ligandbindende Moleküle, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Zytokine oder andere Liganden, die an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise stört Konjugation des ligandbindenden Moleküls im Wesentlichen nicht die Fähigkeit des ligandbindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder einen Rezeptor zu binden, oder blockiert nicht den Eintritt des Sense- oder Antisense-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle.
Alternativ dazu kann ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid in eine Zelle eingeführt werden, die die Zellnukleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipidkomplexes, wie in WO 90/10448 beschrieben. Der Sense- oder Antisense-Oligonukleotid-Lipidkomplex wird bevorzugt durch endogene Lipase innerhalb der Zelle dissoziiert.
VERWENDUNG VON ACPL-POLYPEPTIDEN UND FRAGMENTIERTEN POLYPEPTIDEN
Verwendungen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Folgendes:

– Reinigung von Proteinen und Messung der Aktivität davon
– Abgabewirkstoffe
- Therapeutische und Forschungsreagenzien
– Molekulargewichts- und isoelektrisch konzentrierende Marker
– Steuerungen für Peptidfragmentierung
– Identifizierung unbekannter Proteine
– Erzeugung von Antikörpern

Reinigungswirkstoffe
Die Polypeptide der Erfindung finden Verwendung als ein Proteinreinigungswirkstoff. ACPL-Polypeptide können zum Beispiel an ein festes Trägermaterial angeheftet und dazu verwendet werden, ACPL-bindende Proteine durch Affinitätschromatographie zu reinigen. Bei bestimmten Ausführungen wird ein Polypeptid (in jeder Form, die hierin beschrieben wird, die in der Lage ist, an ein ACPL-bindendes Protein zu binden) durch konventionelle Verfahren an einen festen Träger angeheftet. Beispielsweise sind Chromatographiesäulen, die funktionale Gruppen enthält, die mit funktionalen Gruppen auf Aminosäure-Seitenketten von Proteinen reagieren, verfügbar (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). Bei einer Alternative wird ein Polypeptid/Fc-Protein (wie oben erörtert) an eine Protein A oder Protein G enthaltende Chromatographiesäule durch Interaktion mit dem Fc-Anteil angeheftet.
Das Polypeptid findet auch Anwendung beim Reinigen oder Identifizieren von Zellen, die ein ACPL-bindendes Protein auf der Zelloberfläche exprimieren. Polypeptide werden an eine feste Phase, wie eine Säulenchromatographiematrix oder ein ähnlich geeignetes Substrat gebunden. Zum Beispiel können magnetische Mikrokugeln mit den Polypeptiden beschichtet und durch ein Magnetfeld in einem Inkubationsgefäß gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen, die ACPL-bindendes, proteinexprimierende Zelle enthalten, werden in Kontakt mit der festen Phase gebracht, auf der Polypeptide sind. Zellen, die ACPL-bindendes Protein auf der Zelloberfläche exprimieren, binden an die befestigten Polypeptide, und ungebundene Zellen werden dann weggewaschen.
Alternativ dazu können Polypeptide an eine erkennbare Gruppe konjugiert werden, dann mit Zellen, die auf Bindungsproteinexpression untersucht werden sollen, inkubiert werden. Nach der Inkubation wird ungebundenes markiertes Material entfernt und das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der feststellbaren Gruppe auf den Zellen wird bestimmt.
Bei einer anderen Alternative werden Mischungen von Zellen, bei denen vermutet wird, dass sie ACPL-bindende Proteinzellen enthalten, mit biotynilierten Polypeptiden inkubiert.
Inkubationszeiten sind typischerweise wenigstens eine Stunde, um ausreichende Bindung zu sichern. Die sich ergebende Mischung wird dann durch eine Säule, die mit avidinbeschichteten Perlen bestückt ist, hindurchgeleitet, wobei die hohe Affinität von Biotin für Avidin die Bindung der gewünschten Zellen an die Perlen gewährleistet. Verfahren zur Verwendung von avidinbeschichteten Perlen sind bekannt (siehe Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D: 239, 1986). Das Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, und das Freisetzen der gebundenen Zellen erfolgt unter Nutzung konventioneller Verfahren.
Aktivitätsmessung
Polypeptide finden auch Anwendung beim Messen der biologischen Aktivität von ACPL-bindenden Proteinen hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität. So können die Polypeptide von jenen eingesetzt werden, „Qualitätssicherungs"-Studien durchführen, um Haltbarkeitsdauer und Stabilität von Protein unter unterschiedlichen Bedingungen zu überprüfen. Die Polypeptide können zum Beispiel bei einer Bindungsaffinitätsuntersuchung eingesetzt werden, um die biologische Aktivität eines ACPL-bindenden Proteins zu messen, das bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert und in unterschiedlichen Zelltypen erzeugt worden ist. Die Proteine können auch genutzt werden um zu bestimmen, ob biologische Aktivität nach Modifizierung eines ACPL-bindenden Proteins (z.B. chemische Modifizierung, Abstumpfung, Mutation usw.) erhalten bleibt. Die Bindungsaffinität des modifizierten ACPL-bindenden Proteins wird mit der eines nichtmodifizierten ACPL-bindenden Proteins verglichen, um nachteilige Auswirkungen der Modifizierungen auf die biologische Aktivität des ACPL-bindenden Proteins zu ermitteln. Die biologische Aktivität eines ACPL-bindenden Proteins kann somit festgestellt werden, bevor es zum Beispiel in einer Forschungsstudie verwendet wird.
Abgabewirkstoffe
Die Polypeptide finden auch Verwendung als Träger für daran befestigte Abgabewirkstoffe an Zellen, die ein ACPL-bindendes Protein tragen. Die Polypeptide können so genutzt werden, um diagnostische oder therapeutische Wirkstoffe an diese Zellen (oder an Zelltypen, bei denen festgestellt wird, dass ACPL-bindendes Protein auf der Oberfläche exprimieren) in in vitro- oder in vivo-Verfahren abzugeben.
Ermittelbare (diagnostische) und therapeutische Wirkstoffe, die an ein Polypeptid angeheftet werden können, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Toxine, andere zytotoxische Wirkstoffe, Arzneimittel, Radionuklide, Chromophore, Enzyme, die eine colorimetrische oder fluorometrische Reaktion, und dergleichen mit dem bestimmten Wirkstoff, der in Übereinstimmung mit der beabsichtigten Anwendung ausgesucht wird, katalysieren. Unter den Toxinen befinden sich Ricin, Abrin, Diphterietoxin, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A, ribosomal inaktivierende Proteine, Mycotoxine wie Trichothecene, und Derivative und Fragmente (z.B. Einzelketten) davon. Radionuklide, die für eine diagnostische Nutzung geeignet sind, beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ¹²³I, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br. Beispiel für Radionuklide, die für die therapeutische Nutzung geeignet sind, sind ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu und ⁶⁷Cu.
Diese Wirkstoffe können an das Polypeptid durch jedes konventionelle Verfahren angeheftet werden. Das Polypeptid weist funktionale Gruppen und Aminosäureseitenketten auf, die mit funktionalen Gruppen eines gewünschten Wirkstoffs zur Reaktion gebracht sind, um zum Beispiel kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ dazu kann das Protein oder der Wirkstoff derivatisiert werden, um eine gewünschte reaktive funktionale Gruppe zu generieren oder beizufügen. Die Derivatisierung kann das Anheften eines der bifunktionalen Kopplungsreagenzien, für das Beifügen verschiedener Moleküle zu Proteinen verfügbar sind, einschließen (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Eine Anzahl von Techniken des radioaktiven Markierens von Proteinen sind bekannt. Radionuklidmetalle können an Polypeptide zum Beispiel unter Verwendung eines geeigneten biofunktionalen chelatbildenden Wirkstoffs angeheftet werden.
Konjugate, die Polypeptide und einen geeigneten diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoff enthalten (vorzugsweise kovalent verbunden), werden so erzeugt. Die Konjugate werden in einer Menge, die für die bestimmte Anwendung geeignet ist, verabreicht oder anderweitig eingesetzt.
Therapeutische Wirkstoffe
Polypeptide der Erfindung können genutzt werden, um Behandlungen für jede Krankheit, die durch defekte, überschüssige oder unzureichende Mengen von ACPL oder von Bindungspartnern, einschließlich IL-Polypeptide vermittelt wird (direkt oder indirekt), zu entwickeln. Isolierte oder gereinigte ACPL-Polypeptide oder Fragmente davon können selbst als therapeutischer Wirkstoff zum Verhindern von IL-1- und TNF-Signalisierung nützlich sein. Diese therapeutischen Verwendungen von ACPL schließen ihre Verabreichung durch Einfügen des ACPL-Polypeptids oder Fragments in die intrazelluläre Umbebung durch weithin bekannte Mittel, ein. Eines dieser Mittel ist, das Protein in Liposome einzuschließen oder es an einen monoklonalen Antikörper, der auf einen bestimmten Zelltyp abzielt, zu koppeln.
Die Polypeptide können auch zum Hemmen einer biologischen Aktivität eines ACPL-bindenden Proteins, in in vitro- oder in vivo-Verfahren, eingesetzt werden. Ein ACPL-gereinigtes Polypeptid oder ein lösliches Fragment davon können zum Beispiel dazu verwendet werden, die Bindung eines ACPL-bindenden Proteins an einen endogenen Zelloberflächen-ACPL-bindenden Partner zu verhindern. Biologische Auswirkungen, die aus der Bindung eines Bindungspartners an endogene Rezeptoren entstehen, werden somit verhindert.
ACPL-Polypeptide können zusätzlich einem Säugetier verabreicht werden, um eine Erkrankung, die durch einen ACPL-bindenden Partner hervorgerufen wird, zu behandeln. Diese vom Bindungspartner vermittelte Krankheiten beinhalten Zustände, die durch den Bindungspartner verursacht (direkt oder indirekt) oder verschlimmert werden.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten ein Polypeptid in einer hierin beschriebenen Form, wie native Proteine, Varianten, Derivative, Oligomere und biologisch aktive Fragmente. Bei bestimmten Ausführungen enthält die Zusammensetzung ein lösliches Polypeptid oder ein Oligomer, das lösliche ACPL-Polypeptide aufweist, z.B. die extrazelluläre Domäne von ACPL oder biologisch aktiver Fragmente davon, die sich an den Bindungspartner bindet.
Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge eines ACPL-Polypetids oder Fragments davon der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit anderen Bestandteilen, wie physiologisch vertretbare Verdünnungsmittel, Träger oder Grundmassen, enthalten, werden hierin bereitgestellt. Die Polypeptide können nach den bekannten Verfahren, die zum Herstellen pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen genutzt werden, formuliert werden. Sie können mit Zusatzstoffen, entweder als allein aktives Material oder mit anderen bekannten Materialen, die für die gegebene Indikation geeignet sind, mit pharmazeutisch vertretbaren Verdünnungsmitteln (z.B. physiologische Kochsalzlösung, Tris-HCl, Azetat und Phosphat-Pufferlösungen), Konservierungsmitteln (z.B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Lösungsmitteln, Hilfsstoffen und/oder Trägern kombiniert werden. Geeignete Formeln für pharmazeutische Zusammensetzungen beinhalten jene, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg. 1980 Mack Publishing Company, Easton, PA beschrieben sind.
Zusätzlich können diese Zusammensetzungen mit Polyethylen-Glykol (PEG), Metallionen zu Komplexen geformt werden, oder in polymerische Verbindungen wie Polyessigsäure, Polyglykolsäure Hydrogele, Dextran usw. eingebaut werden, oder in Liposome, Mikroemulsionen, Mizelle, unilamellare und multilamellare Vesikel, Blutkörperchenschatten oder Spheroblaste eingebaut werden. Diese Verbindungen beeinflussen den physischen Status, die Löslichkeit, die Stabilität, die Rate der in vivo-Freisetzung, und die Rate der in vitro-Freisetzung, und kann somit entsprechend der beabsichtigten Anwendung ausgesucht werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können in jeder geeigneten Form verabreicht, z.B. topisch, parenteral oder durch Inhalation. Der Begriff „parenteral" beinhaltet Injektion, z.B. subkutan, intravenös, intrazelluläre oder intramuskuläre Wege, einschließlich auch lokalisierte Verabreichung, z.B. an einem Ort der Krankheit oder Verletzung. Verzögerte Freisetzung von einem Implantat wird ebenso in Betracht gezogen. Ein Fachmann des einschlägigen Fachgebiets wird erkennen, dass geeignete Dosierungen variieren werden, was von solchen Faktoren wie die Herkunft der zu behandelnden Krankheit, das Körpergewicht des Patienten, das Alter und der Allgemeinzustand, und der Verabreichungsweg abhängt. Einleitende Dosen können anhand von Tierversuchen bestimmt werden, und das Festlegen der Dosierungen für die Verabreichung an Menschen erfolgt nach den auf dem Fachgebiet anerkannten Praktiken.
Zusammensetzungen, die Nukleinsäuren in physiologisch vertretbaren Formulierungen enthalten werden auch erwogen. DNA kann zum Beispiel für Injektion formuliert werden.
Forschungswirkstoffe
Eine weitere Verwendung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung ist ein Forschungswerkzeug für die Untersuchung der Biologischen Auswirkungen, davon herrühren, dass ACPL-bindende Wechselwirkungen von Partner/ACPL- auf verschiedenen Zelltypen gehemmt werden. Polypetipde können auch in in vivo-Analysen eingesetzt werden, um ACPL-bindende Partner oder ACPL oder deren Wechselwirkung zu ermitteln.
ACPL-Polypeptide und Antikörper gegen ACPL-Polypeptide können als Reagenzien bei einer Vielzahl von Forschungsprotokollen genutzt werden. Eine Auswahl solcher Forschungsprotokolle sind in Sambrook et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Labaratory Press, (1989) wiedergegeben. Diese Reagenzien können zum Beispiel als Marker für zellspezifische oder gewebespezifische Expression von RNA oder Proteinen dienen. In ähnlicher Weise können diese Reagenzien verwendet werden, um konstitutive oder transiente Expression von ACPL-RNA oder Proteinen zu untersuchen. ACPL-DNA kann verwendet werden die chromosomale Lage von ACPL-DNA zu bestimmen und die Gene in Bezug auf diese chromosomale Lage zu kartieren. ACPL-DNA kann auch dazu genutzt werden, genetische Heterogenität und Heredität durch Verwendung solcher Techniken, wie dem genetischen Fingerabdruck, sowie Risiken, die mit genetischen Störungen zusammenhängen, zu identifizieren. ACPL-DNA kann weiters genutzt werden, um zusätzliche Gene, die ACPL-DNA in Zusammenhang stehen, zu identifizieren, und Evolutionsbäume, die auf dem Vergleich von Sequenzen beruhen, aufzustellen. ACPL-DNA und Polypeptide können verwendet werden, die Gene oder Proteine, die homolog sind zu ACPL-DNA oder Polypeptiden, zu selektieren durch positive Auswahlverfahren wie Southern Blotting und Immunoblotting und durch negative Auswahlverfahren wie Subtraktion.
ACPL-Polypeptide können auch als Reagens genutzt, werden um (a) jedes Protein, das ACPL-Polypeptid reguliert, und (b) andere Proteine, mit denen es in Wechselwirkung treten könnte, zu identifizieren. ACPL-Polypeptide können durch Bindung von rekombinantem Protein an eine Affinitätsmatrix genutzt werden oder durch Verwendung als Köder (Bait) im 2-Hybridsystem. ACPL-Polypeptide und Fragmente davon können als Reagenzien verwendet werden, um die Signalpfade, die von Rezeptoren der IL-1R-Familie genutzt werden, zu untersuchen und um Signalisierung durch IL-18 und möglicherweise andere Liganden der IL-1-Familie zu blockieren.
Eine andere Ausführung der Erfindung bezieht sich Verwendungsarten von ACPL, um die Zellsignaltransduktion zu untersuchen. ACPL-Polypeptide spielen eine Rolle bei Immunreaktionen, die zellulare Signaltransduktion beinhalten. So können Veränderungen der Expression und/oder Aktivierung von ACPL tiefgreifende Auswirkungen auf eine Fülle zellularer Prozesse haben. Expression von geklonter ACPL, funktional inaktiver Mutanten von ACPL können genutzt werden um die Rolle zu identifizieren, die ein bestimmtes Protein beim Übertragen spezifischer Signalereignisse spielt.
Zellulare Signalisierung schließt häufig eine molekulare Aktivierungskaskade ein, während der ein Rezeptor ein von einem Liganden vermitteltes Signal durch die spezifische Aktivierung von intrazellularen Kinasen, die Zielsubstrate phosphorylieren verbreitet. Die Substrate können selbst Kinasen sein, die nach der Phosphorylierung aktiviert werden. Alternativ dazu können sie Adaptermoleküle sein, die Abwärtssignalisierung durch Protein-Protein-Wechselwirkung nach der Phosphorylierung erleichtern. Ungeachtet der Herkunft der/des Substratmolekül(e)s können exprimierte funktional aktive Versionen von ACPL bei Analysen, wieder Hefe-2-Hybrid-Analyse, verwendet werden, um zu identifizieren, welche(s) Substrat(e) von ACPL-bindenden Partnern erkannt und aktiviert werden. Als solche kann diese neue ACPL als Reagens verwendet werden, um neue Moleküle, die in Signaltransduktionspfade einbezogen sind, zu identifizieren.
Außerdem können ACPL-Polypeptide und Fragmente davon als Reagenzen bei der Untersuchung der IL-18-Signalpfade als ein Reagens zum Blockieren der IL-18-Signalisierung, genutzt werden. Die Entdeckung, dass ACPL-Polypeptid bei der NFkB-Signalisierung eine Rolle spielt, ermöglicht die Verwendung von ACPL-Polypeptiden bei Untersuchungen von NFkB-Signalisierung, insbesondere hinsichtlich der Induktion von NFkB-Signalisierung durch IL-18. Die Entdeckung von ACPL-Polypeptid und seiner Rolle bei NFkB-Siganlisierung ermöglicht außerdem seine Verwendung als Reagens in Forschungsprotokollen, um die Rolle von IL-1Rrp1 und IL-18 bei der Zellsignalisierung aufzuklären.
IL-18 induziert viele zusätzliche Signalreaktionen. Unter diesen Signalreaktionen ist die Induktion der Kinasen JNK und p38 der MAP-Kinasefamilie. So können ACPL-Polypeptide und Fragmente davon als Reagenzien bei der Untersuchung von IL-18 induzierten Signalreaktionen der Kinasen JNK und p38 der MAP-Kinasefamilie verwendet werden.
Die Entdeckung, dass ACPL-Polypeptide die Erzeugung eines spezifischen Proteins als Reaktion auf IL-18 anregt, ermöglicht die Entwicklung von induzierbaren Proteinexpressionssystemen. Bei einer Ausführung kann das Gen, das das interessante Protein kodiert, innerhalb eines Vektors platziert werden, der drei NFkB-Stellen, die Expression des Proteins vermitteln, aufweist. Der Fachmann erkennt, dass viele verschiedene Vektoren genutzt werden können, um mit NFkB-Expression gekoppelte Expression zu erzielen, was von dem Zelltyp, der für Expression gewünscht wird, abhängt. Als ein Beispiel können 10⁷-S49.1-Zellen durch Elektroporation in 0,7 ml mit 40 μg einem NFkB-gebundenen Expressionsvektor und 20 μg von Expressionsvektoren transfiziert werden, die ACPL-Polypeptide von Mäusen und IL-1-Rp1 von Mäusen bei 960 μF und 320 V kodieren. Die Zellen können 2 Tage inkubiert werden und dann mit 40 ng/ml IL-18 von Mäusen (PeproTech) stimuliert werden. Die Addition von IL-18 kann Expression des NFkB-Gens 300-fach induzieren. Es versteht sich, dass viele verschiedene Herangehensweisen genutzt werden können, um Induktion von Proteinexpression unter Verwendung von ACPL-Polypeptid und IL-18-Stimulation zu erzielen, und dass diese Ausführung keineswegs den Umfang der Erfindung einschränkt.
Aufgrund der geregelten Erzeugung des NFkB-verbundenen Proteins kann der Grad dieses Proteins in den Zellen entsprechend der Stimulation mit IL-18 reguliert werden. Die Verwendung eines Markergens, wie Luciferase, ermöglicht die Erklärung von Hemmern und Regulatoren von IL-18-stimulierter NFkB-Signalisierung. Zusätzlich ermöglicht die Steuerung des Grades und des Zeitablaufs von Proteinexpression dem Fachmann, sowohl die zeitlichen als auch kumulativen Auswirkungen des interessanten Proteins zu untersuchen. Antikörper gegen ACPL-Polypeptide können außerdem verwendet werden, um IL-18-stimulierte NFkB- Signalisierung bei diesen Experimenten zu hemmen, was eine detailliertere Analyse der Schritte, die in die NFkB-Signalisierung eingeschlossen sind, ermöglicht.
Die gereinigten ACPL-Polypeptide entsprechend der Erfindung werden die Entdeckung von Hemmern von ACPL-Polypetiden erleichtern. Die Verwendung eines gereinigten ACPL-Polypeptides beim Screenen von potentiellen Hemmern davon ist wichtig und kann die Möglichkeit von Grenzreaktionen mit Kontaminanten ausschließen oder verringern.
Zusätzlich können ACPL-Polypeptide zum auf Struktur basierendem Aufbau von ACPL-Polypeptidhemmern verwendet werden. Dieser auf Struktur basierende Aufbau ist auch als „rationale Wirkstoffentwicklung" bekannt. Die ACPL-Polypetide können dreidimensional analysiert werden, zum Beispiel durch Röntgenkristallographie, Nuklear-Magnetische-Resonanz oder Homologiemodellierung, die alle weithin bekannte Verfahren sind. Die Nutzung von strukturellen Informationen von ACPL-Polypeptid in Softwaresystemen zur molekularen Modellierung, um den Hemmeraufbau und die Hemmer-ACPL-Polypeptid-Wechselwirkung zu unterstützen, wird von der Erfindung auch umfasst. Die computergestützte Modellierung und der Drogenaufbau können Informationen, wie chemische Konformationsanalyse, elektrostatisches Potential der Moleküle, Proteinfaltung usw. nutzen. Der größte Teil des Aufbaus von klassenspezifischen Metalloproteasen ist zum Beispiel auf Versuche, das katalytische Zinkatom zu chelatieren und zu binden, gerichtet. Synthetische Hemmer werden üblicherweise so aufgebaut, dass sie einen negativ geladenen Anteil enthalten, an den eine Reihe anderer Gruppen angefügt wird, die so aufgebaut sind, dass in die Spezifitätstaschen der bestimmten Protease passen. Ein besonderes Verfahren der Erfindung umfasst die Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der ACPL-Polypeptide auf mögliche Bindungsorte von Substraten, die ein neues Molekül synthetisieren, das eine vorhersehbare reaktive Stelle enthält und das oben beschriebene neue Moleküle analysiert.
Molekulargewicht, Isoelektrische Punktmarker
Die vorliegende Erfindung beinhaltet außerdem Verfahren, die ACPL-Polypeptide als Molekulargewichts-Marker zum Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts eines Musterproteins durch Gel-Elektrophorese benützen. Ein isolierter und gereinigter Mäuse ACPL-Polypeptid Molekulargewichts-Marker, entsprechend der Erfindung, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 70.048 Dalton bei Fehlen von Glykosylierung. Das ACPL-Polypeptid, zusammen mit dem Probenprotein, kann durch Denaturisierungs-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese mit konventionellen Mitteln (U. K. Laemmli, Nature 227: 680–685, 1970) in zwei getrennte Gelbahnen aufgelöst werden, die Natrium-Didodecyl-Sulfat enthalten und eine Konzentration von 6–20% haben. Proteine auf dem Gel können unter Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens sichtbar gemacht werden. Die ACPL-Polypeptideptide Molekulargewichts-Marker können als Molekulargewichts-Marker beim Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts des Probenproteins verwendet werden. Die unikale Aminosäuresequenz von ACPL von Mäusen (SEQ ID NO: 2) weist ein Molekulargewicht von ungefähr 70.048 Dalton auf. Demzufolge dienen die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid besonders gut als Molekulargewichtsmarker zum Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts von Probenproteinen, die ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 70.048 Dalton haben. Die Nutzung dieser Polypeptid-Molekularegewichts-Marker ermöglicht eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 70.048 Dalton haben. Humanes ACPL-Polypeptid (SEQ ID NO: 7) kann in ähnlicher Weise als Molekulargewichts-Marker zum Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts von Probenproteinen verwendet werden. Es ist natürlich verständlich, dass viele verschiedene Techniken zur Bestimmung des Molekulargewichts eines Probenproteins unter Verwendung von ACPL-Polypeptiden genutzt werden können, und dass diese Ausführung in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränkt.
Eine andere bevorzugte Ausführung der Erfindung ist die Verwendung von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid, die durch chemische Fragmentation von ACPL-Polypeptiden erzeugt werden, als Molekulargewichtsmarker zum Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts-Markern eines Probenproteins durch Gel-Elektrophorese. Isoliertes und gereinigtes ACPL-Polypeptid kann mit Cyanbromid unter konventionellen Bedingungen behandelt werden, was zur Fragmentation des Molekulargewichts-Markers von ACPL-fragmentiertem Polypeptid durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Methioninrückstände innerhalb des ACPL-Polypeptids führt (E. Gross. Methods in Enz. 11: 238–255, 1967). Aufgrund der unikalen Aminosäure-Sequenz des ACPL-Polypeptids erzeugt die Fragmentation von Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid mit Cyanbromid einen unikalen Satz von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid. ACPL-Polypeptide von Menschen und von Mäusen werden zum Beispiel jeweils einen unikalen Satz von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid erzeugen. Die Größe dieser Molekulargewichts-Marker kann unter Verwendung verfügbarer Computerprogramme vorhergesagt werden. Die Verteilung von Methioninrückständen bestimmt die Anzahl von Aminosäuren in jedem Peptid, und die unikal Aminosäurezusammensetzung eines jeden Peptids bestimmt sein Molekulargewicht.
Der unikale Satz von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid, der durch die Behandlung von ACPL-Polypeptid von Mäusen mit Cyanbromid erzeugt wird, umfasst die Größenordnung von 10 fragmentierten Peptiden und mindestens 10 Aminosäuren. Das Peptid, das von Aminosäuren 2–87 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 9.724 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 88–105 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 2.020 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 111–136 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 3.094 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 137–188 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 5.502 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 189–207 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 2.354 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 208–299 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 10.617 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 300–369 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 8.293 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 370–558 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 21.559 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 568–593 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 2.963 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 594–614 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 2.343 Dalton.
Demnach erzeugt die Abspaltung vom ACPL-Polypetid von Mäusen durch chemische Behandlung mit Cyanbromid einen unikalen Satz von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid. Die unikale und bekannte Aminosäure-sequenz dieser fragmentierten Peptide ermöglicht die Bestimmung des Molekulargewichts dieser Molekulargewichts-Markern von fragmentiertem Peptid. In diesem Fall haben die Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid Molekulargewichte von ungefähr 9.724; 2.020; 3.094; 5,502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963 und 2.343 Dalton.
Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid, zusammen mit einem Probenprotein, können durch Denaturierungs-Polyacrylamid-Elektrophorese mit konventionellen Mitteln in zwei getrennte Gelbahnen, die Natrium-Didodecyl-Sulfat enthalten und eine Konzentration von 10–20% haben, aufgelöst werden. Proteine auf dem Gel können unter Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens sichtbar gemacht werden. Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid können als Molkulargewichts-Marker zum Abschätzen des scheinbaren Molekulargewichts eines Probenproteins genutzt werden. Die unikale Aminosäuresequenz von ACPL von Mäusen weist ein Molekulargewicht von ungefähr 9.724; 2.020; 3.094; 5,502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963 und 2.343 Dalton für die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid auf. Demzufolge dienen die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid besonders gut als Molekulargewichts-Marker zum Abschätzen des scheinbaren Molekulargewichts von Probenproteinen, das ein scheinbares Molekulargewicht nahe 9.724; 2.020; 3.094; 5,502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963 und 2.343 Dalton haben. Demzufolge ermöglicht die Verwendung dieser Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die scheinbare Molekulargewichte nahe 9.724; 2.020; 3.094; 5,502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963 und 2.343 Dalton haben. Es ist natürlich verständlich, dass die unikale Aminosäuresequenz von humanen ACPL-Polypeptid (SEQ ID NO: 13) ähnlich verwendet werden kann, um einen unikalen Satz von humanen Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid zu erzeugen. Die Fragmentgrößen können leicht unter Nutzung verfügbarer Computerprogramme bestimmt werden.
Bei einer weiteren Ausführung können das Probenprotein und das ACPL-Polypeptid gleichzeitig, jedoch getrennt, mit Cyanbromid mit konventionellen Mitteln behandelt werden, was zur Fragmentation des Probenproteins und des ACPL-Polypeptids durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Methioninrückstände innerhalb des Probenproteins und des ACPL-Polypeptids führt. Wie oben beschrieben, haben die Molekulargewichts-Marker von fragmentiertem Peptid, die durch Abspaltung des ACPL-Polypeptids mit Cyanbromid erzeugt werden, scheinbare Molekulargewichte von etwa 9.724; 2.020; 3.094; 5,502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963 und 2.343 Dalton.
Die fragmentierten Peptide von sowohl dem ACPL-Polypetid als auch dem Probenprotein können durch Denaturierungs-Polyacrylamid-Elektrophorese mit konventionellen Mitteln in zwei getrennte Gelbahnen, die Natrium-Didodecyl-Sulfat enthalten und eine Konzentration von 10–20% haben, aufgelöst werden. Fragmentierte Peptide auf dem Gel können durch Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens sichtbar gemacht werden. Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid können als Molekulargewichts-Marker beim Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts der fragmentierten Proteine, die vom Probenprotein hergeleitet werden, genutzt werden. Wie oben besprochen, dienen Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid besonders gut als Molekulargewichts-Marker zum Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die scheinbare Molekulargewichte nahe 9.724; 2.020; 3.094; 5,502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963 und 2.343 Dalton haben. Folglich ermöglicht die Verwendung dieser Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die scheinbare Molekulargewichte von etwa 9.724; 2.020; 3.094; 5,502; 2.354; 10.617; 8.293; 21.559; 2.963 und 2.343 Dalton haben. Das Ausmaß der Fragmentierung des ACPL-Polypeptids wird außerdem als eine Kontrolle genutzt, um die Bedingungen, die für die komplette Fragmentation des Probenproteins erwartet werden, zu bestimmen. Es ist natürlich verständlich, dass viele Chemikalien verwendet werden können, um ACPL-Polypeptide zu fragmentieren, und dass diese Ausführung in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränkt.
Bei einer anderen Ausführung, können Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid von ACPL-Polypeptid erzeugt werden, wobei Enzyme verwendet werden, die das Polypeptid an bestimmten Aminosäureresten schneiden. Aufgrund der unikalen Natur der Aminosäuresequenz des ACPL-Polypeptids führt das Schneiden an unterschiedlichen Aminosäureresten zur Erzeugung von verschiedenen Sätzen von Molekulargewichts-Markern von fragmentiertem Peptid.
Ein isoliertes und gereinigtes ACPL-Polypeptid kann mit Achromobacter-Protease I unter konventionellen Bedingungen behandelt werden, was zur Fragmentation des ACPL-Polypeptids durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Lysinreste innerhalb des Polypeptids führt (T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 44–50, 1981; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 51–55, 1981). Aufgrund der unikalen Aminosäuresequenz des APCL-Polypeptids erzeugt die Fragementierung von Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid mit Achromobacter-Protease I einen unikalen Satz von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid. Die Verteilung der Lysinreste bestimmt die Anzahl der Aminosäuren in jedem Peptid und die unikale Aminosäurezusammensetzung bestimmt sein Molekulargewicht.
Der unikale Satz von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid, der durch die Behandlung von ACPL-Polypeptid von Mäusen mit Achromobacter-Protease I umfasst die Größenordnung von 20 fragmentierten Peptiden und mindestens 10 Aminosäuren. Die Erzeugung von 20 fragmentierten Peptiden mit dieser Enzymbehandlung des ACPL-Polypeptids verdeutlicht im Vergleich mit der Erzeugung von 10 fragmentierten Peptide mit Cyanbromidbehandlung des ACPL-Polypeptid deutlich, das die Größe der Molekulargewichts-Markern von fragmentiertem Peptid in Abhängigkeit von der Fragmentationsbehandlung, die genutzt wird, um das ACPL-Polypeptid zu fragmentieren, variieren wird. Sowohl Größe als auch Anzahl dieser Fragmente wird von der Aminosäuresequenz des ACPL-Polypeptids vorgeschrieben. Demnach wird Anzahl fragmentierter Peptide ebenso Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid variieren. Zusätzlich führt Fragmentation von humanen ACPL-Polypeptid (SEQ ID NO: 7) zu unikalen Sätzen fragmentierter Peptide, die von der Aminosäuresequenz des ACPL-Polypeptids vorgeschrieben werden.
Das Peptid, das von Aminosäuren 1–16 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.897 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 1–16 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.897 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 17–28 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.236 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 56–71 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.721 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 79–141 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 7.285 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 148–192 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 4.893 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 203–238 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 4.123 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 250–266 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.866 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 267–283 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.989 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 292–305 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.757 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 313–333 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 2.601 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 334–353 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 2.324 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 355–395 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 4.765 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 406–471 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 7.339 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 473–507 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 3.885 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 513–527 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.785 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 529–539 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1282 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 543–561 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 2.329 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 562–576 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1.855 Dalton. Das Peptid, das von Aminosäuren 596–612 von SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 1858 Dalton.
Demzufolge erzeugt Abspaltung des ACPL-Polypeptids von Mäusen durch enzymatische Behandlung mit Achromobacter-Protease I einen unikalen Satz von Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid. Die unikale und bekannte Aminosäuresequenz dieser fragmentierten Peptide ermöglichen die Bestimmung des Molekulargewichts dieser Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid. In diesem speziellen Fall haben diese Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid Molekulargewichte von ungefähr 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855 und 1.858 Dalton.
Noch einmal, die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid können, zusammen mit einem Probenprotein, durch Denaturierungs-Polyacrylamid-Elektrophorese mit konventionellen Mitteln in zwei getrennte Gelbahnen, die Natrium-Didodecyl-Sulfat enthalten und eine Konzentration von 10–20% haben, aufgelöst werden. Proteine auf dem Gel können durch Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens sichtbar gemacht werden. Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid dienen besonders gut als Molekulargewichts-Marker für die Überprüfung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die ein scheinbares Molekulargewicht nahe 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855 und 1.858 Dalton haben. Die Nutzung dieser Molekulargewichts-Marker von fragmentiertem Peptid ermöglicht eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbarem Molekulargewichts von Proteinen, die ein scheinbares Molekulargewicht nahe 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855 und 1.858 Dalton haben. Es ist natürlich verständlich, dass die unikale Aminosäuresequenz von humanen ACPL-Polypeptid (SEQ ID NO: 13) ähnlich verwendet werden kann, um einen unikalen Satz von humanen Molekulargewichts-Markern von ACPL-fragmentiertem Peptid zu erzeugen. Die Fragmentgrößen können leicht unter Nutzung verfügbarer Computerprogramme bestimmt werden.
Bei einer weiteren Ausführung können das Probenprotein und das ACPL-Polypeptid gleichzeitig, jedoch getrennt, mit Achromobacter-Protease I mit konventionellen Mittel behandelt werden, was zur Fragmentation des Probenproteins und des ACPL-Polyptids durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Lysinreste innerhalb des Probenproteins und des ACPL-Polypeptids führt. Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid und die fragmentierten Peptide, die von dem Probenprotein deriviert sind, werden durch Denaturierungs-Polyacrylamid-Elektrophorese mit konventionellen Mitteln in zwei getrennte Gelbahnen, die Natrium-Didodecyl-Sulfat enthalten und eine Konzentration von 10–20% haben, aufgelöst. Fragmentierte Peptide auf dem Gel können durch Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens sichtbar gemacht werden. Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid können als Molekulargewichts-Marker beim Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts des Probenproteins verwendet werden. Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-fragmentiertem Peptid dienen besonders gut als Molekulargewichts-Marker für die Überprüfung des scheinbaren Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die ein scheinbares Molekulargewicht nahe 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855 und 1.858 Dalton haben. Die Nutzung dieser Molekulargewichts-Marker von fragmentiertem Peptid ermöglicht eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbarem Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die ein scheinbares Molekulargewicht nahe 1.897; 1.236; 3.100; 1.721; 7.285; 4.893; 4.123; 1.866; 1.989; 1.757; 2.601; 2.324; 4.765; 7.339; 3.885; 1.785; 1.282; 2.329; 1.855 und 1.858 Dalton haben. Das Ausmaß der Fragmentation des ACPL-Polypeptids wird außerdem als eine Kontrolle genutzt, um die Bedingungen, die für die komplette Fragmentation des Probenproteins erwartet werden, zu bestimmen. Es ist natürlich verständlich, dass viele Enzyme verwendet werden können, um ACPL-Polypeptide zu fragmentieren, und dass diese Ausführung in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränkt.
Bei einer anderen Ausführung können monoklonale und polyklonale Antikörper gegen ACPL-Polypeptide erzeugt werden. Balb/c-Mäuse können intraperitonal zweimal in Intervallen von 3 Wochen mit 10 μg isoliertem und gereinigtem ACPL-Polypeptid oder Peptiden, die auf der Aminosäuresequenz von ACPL-Polypeptiden basiert, in Gegenwart von RIBI-Adjuvans (RIBI Corp., Hamiltion, Montana) injiziert werden. Mäuseseren werden dann durch konventionelle Dot-Blot-Technik oder Antikörperfangen [Antibody-Capture (ABC)] analysiert, um zu bestimmen, welches Tier das Beste zur Fusion ist. Drei Wochen später bekommen die Mäuse einen intravenösen Schub von 3 μg des ACPL-Polypeptides oder der Peptide, die in steriler PBS suspendiert werden. Drei Tage später werden die Mäuse getötet, und Milzzellen werden mit Ag8.653-Myelomazellen (ATCC) entsprechend der bekannten Protokolle fusioniert. Kurz gesagt, Ag8.653-Zellen werden mehrmals in serumfreien Medien gewaschen und und mit Mäusemilzzellen in Verhältnis von drei Milzzellen zu einer Myelomazelle fusioniert. Der Wirkstoff für die Fusion ist 50% PEG: 10% DMSO (Sigma). Fusion wird in zwanzig 96-Vertiefungen-Flachbodenplatten (Corning), die HAT-ergänzte DMEM-Medien enthalten ausplattiert und acht Tage wachsen gelassen. Überstände aus resultierenden Hybridomen werden gesammelt und einer 96-Vertiefungen-Platte für 60 Minuten hinzugegeben, die zuerst mit Ziege-Antimaus-Ig beschichtet ist. Bei nachfolgenden Waschgängen wird ¹²⁵I-ACPL-Polypetid oder Peptide jeder Vertiefung hinzugegeben, 60 Minuten inkubiert und vier Mal gewaschen. Positive Vertiefungen können daraufhin durch Autoradiographie bei –70°C unter Verwendung von Kodak X-Omat S-Film ermittelt werden. Positive Klone können in Großkulturen gezüchtet werden, und Überstände werden danach über eine Protein A-Säule (Pharmacia) gereinigt. Es versteht sich natürlich, dass viele Techniken zur Erzeugung von Antikörpern gegen ACPL-Polypeptide und fragmentierte Peptide davon verwendet werden können, und dass diese Ausführung in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränkt.
Bei einer anderen Ausführung können Antikörper, die gegen ACPL-Polypeptide und fragmentierter Peptide derselben erzeugt werden, in Verbindung mit Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid verwendet werden, um die Genauigkeit der Nutzung dieser Molekulargewichts-Marker zu erhöhen, um das scheinbare Molekulargewicht und den isoelektrischen Punkt eines Probenproteins zu bestimmen. Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid können mit einem molaren Überschuss eines Probenproteins gemischt werden, und die Mischung kann mit konventionellen Mitteln durch zweidimensionale Elektrophorese aufgelöst werden. Polypeptide können an eine geeignete proteinbindende Membran, wie Nitrozellulose, mit konventionellen Mitteln übertragen werden.
Polypetide auf der Membran können durch zwei unterschiedliche Verfahren sichtbar gemacht werden, die eine unterschiedliche Behandlung des Probenproteins und der Molekulargewichts-Marker ermöglichen. Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid können unter Verwendung von Antikörpern, die gegen diese Marker erzeugt werden, und durch konventionelle Immunoblotting-Techniken sichtbar gemacht werden. Die Ermittlung wird unter konventionellen Bedingung durchgeführt, die nicht zu einer Ermittlung des Probenproteins führt. Es ist verständlich, dass es nicht möglich sein kann, Antikörper gegen alle ACPL-Polypeptidfragmente zu erzeugen, da kleine Peptide möglicherweise keine immunogenen Epitope enthalten. Außerdem ist verständlich, dass nicht alle Antiköper bei dieser Analyse funktionieren; jedoch können jene Antikörper, die ACPL-Polypeptide und Fragmente binden können, leicht durch konventionelle Techniken bestimmt werden.
Das Probenprotein wird unter Nutzung konventioneller Färbeverfahren sichtbar gemacht. Der molare Überschuss von Probenprotein zu Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid ist so, dass das konventionelle Färbeverfahren vorwiegend das Probenprotein ermittelt. Das Niveau der Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid ist so, dass er wenig oder keine Ermittlung diese Marker durch konventionelle Färbeverfahren ermöglicht. Der bevorzugte Überschuss von Probenprotein zu Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid liegt zwischen 2- und 100.000-fach. Es wird mehr bevorzugt, dass der bevorzugte molare Überschuss des Probenproteins zu Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid zwischen 10- und 10.000-fach und insbesondere zwischen 100- und 1.000-fach liegt.
Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid können als Molekulargewichts- und Isoelektrischer-Punkt-Marker bei der Überprüfung des scheinbaren Molekulargewichts und des isoelektrischen Punkts des Probenproteins verwendet werden. Die Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid dienen besonders gut als Molekulargewichts- und Isoelektrischer-Punkt-Marker bei der Überprüfung der scheinbaren Molekulargewichte und der isoelektrischen Punkte von Probenproteinen, die scheinbare Molekulargewicht und isoelektrische Punkte nahe der der Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid haben. Die Fähigkeit, gleichzeitig die Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid und das Probenprotein unter identischen Bedingungen aufzulösen, ermöglicht eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts und des isoelektrischen Punktes des Probenproteins. Das ist von besonderem Interesse bei Techniken, wie die zweidimensionale Elektrophorese, wo die Natur des Verfahrens vorschreibt, das jeder Marker gleichzeitig mit Probenprotein aufgelöst wird.
Bei einer anderen Ausführung können Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid oder fragmentiertem Peptid als Molekulargewichts- und Isoelektrischer-Punkt-Marker bei der Überprüfung des scheinbaren Molekulargewichts und des isoelektrischen Punkts fragmentierter Peptide verwendet werden, die durch Behandlung eines Probenproteins mit einem Abspaltungswirkstoff abgeleitet werden. Es ist verständlich, dass viele Techniken für die Bestimmung des Molekulargewichts und des isoelektrischen Punkts eines Probenproteins und fragmentierter Peptide davon unter Verwendung von Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid und Peptidfragmenten davon genutzt werden können, und dass diese Ausführung in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränkt.
Molekulargewichts-Marker von ACPL-Polypeptid, die von der Erfindung umfasst werden, können in Abhängigkeit von der Wirtszelle, in der sie expressiert werden, variable Molekulargewichte haben. Glykosylierung von Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid und Peptidfragmenten davon in verschiedenen Zelltypen kann zu Abweichungen des Molekulargewichts dieser Marker in Abhängigkeit von Ausmaß der Modifizierung führen. Die Größe von Molekulargewichts-Markern von ACPL-Polypeptid kann sehr heterogen bei Fragmenten von ACPL-Polypeptid sein, die von einem extrazellulären Teil des Polypeptids abgeleitet sind. Konsistente Molekulargewichts-Marker können durch Verwendung von Polypeptiden, die komplett von transmembranen und zytoplastischen Bereichen abgeleitet sind, durch die Vorbehandlung mit N-Glykanase, um die Glykosylation zu entfernen, oder durch Expression der Polypeptide in bakteriellen Wirten erhalten werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können der Fragmentierung in kleinere Peptide durch chemische oder enzymatische Mittel unterliegen, und die so hergestellten Peptidfragmente können für die Untersuchung anderer Proteine oder Polypeptide genutzt werden. Diese Peptidfragmente können zum Beispiel als Molekulargewichts-Marker von Peptid, Isoelektrischer-Punkt-Marker von Peptid oder bei der Untersuchung des Grades von Peptidfragmentation verwendet werden. So beinhaltet die Erfindung auch diese Polypeptide und Peptidfragmente. Ausrüstungssätze zur Unterstützung der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts und des isoelektrischen Punkts eines unbekannten Proteins und Ausrüstungssätze zu Einschätzung des Grades von Fragmentierung eines unbekannten Proteins, die hier ebenfalls ins Auge gefasst werden, sind nicht Teil der Erfindung.
Natürlich können die Peptide und Fragmente der Polypeptide der Erfindung auch durch konventionelle rekombinante Verfahren und synthetische Verfahren, die auf dem Fachgebiet weithin bekannt sind, hergestellt werden. Hinsichtlich der rekombinanten Verfahren können die Polypeptide und Peptidfragmente, die von der Erfindung umfasst werden, variable Molekulargewichte, in Abhängigkeit von der Wirtszelle, in denen sie exprimiert werden, aufweisen. Glykosylierung von Polypeptiden oder Peptidfragmenten der Erfindung in verschiedenen Zelltypen kann in Abhängigkeit vom Ausmaß der Modifizierung. zu Abweichungen des Molekulargewichts dieser Stücke führen. Die Größe dieser Stücke kann sehr heterogen sein zu Fragmenten von Polypeptid, die von dem extrazellulären Teil des Polypeptids abgeleitet werden. Konsistente Polypeptide und Peptidfragmente können durch Verwendung von Polypeptiden, die komplett von transmembranen und zytoplastischen Bereichen abgeleitet sind, durch die Vorbehandlung mit N-Glykanase, um die Glykosylierungen zu entfernen, oder durch Expression der Polypeptide in bakteriellen Wirten erhalten werden.
Das Molekulargewicht dieser Polypeptide kann auch variiert werden, indem zusätzliche Peptidsequenzen sowohl mit den amino- als auch den carboxyl terminalen Enden von Polypeptiden der Erfindung fusioniert werden. Fusionen von zusätzlichen Peptidsequenzen an die amino- und carboxyl-terminalen-Enden von Polypeptiden der Erfindung können genutzt werden, Expression dieser Polypeptide zu steigern und die Reinheit des Proteins zu unterstützen. Zusätzlich werden Fusionen von zusätzlichen Peptidsequenzen an den amino- und carboxyl-terminalen-Enden von Polypeptiden der Erfindung einige, aber gewöhnlich nicht alle, der fragmentierten Peptide der Polypeptide, die durch enzymatische oder chemische Behandlung erzeugt werden, verändern. Natürlich können Mutationen in Polypeptide der Erfindung durch die Verwendung routinemäßiger und bekannter Techniken der Mikrobiologie eingeführt werden. Eine Mutation kann zum Beispiel so aufgebaut werden, um eine Stelle von proteolytischer Abspaltung durch ein bestimmtes Enzym oder einen von Abspaltung durch ein bestimmtes chemisch induziertes Fragmentationsverfahren zu eliminieren. Die Eliminierung der Stelle wird den Peptidfingerabdruck von Polypeptiden der Erfindung nach Fragmentation mit einem bestimmten Enzym oder chemischen Verfahren verändern.
Die Polypeptide und die resultierenden fragmentierten Peptide können durch Verfahren einschließlich Sedimentation, Elektrophorese, Chromatographie und Massespektrometrie untersucht werden, um ihre Molekulargewichte zu bestimmen. Weil die unikale Aminosäuresequenz eines jeden Stücks ein Molekulargewicht bestimmt, können diese Stücke danach als Molekulargewichts-Marker dienen, die solche Techniken verwenden, um bei der Bestimmung des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins, Polypeptids oder Fragmenten davon zu helfen. Die Molekulargewichts-Marker der Erfindung dienen besonders gut als Molekulargewichts-Marker beim Überprüfen des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die ähnliche scheinbare Molekulargewichte haben, und ermöglich demzufolge eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung von scheinbarem Molekulargewicht von Proteinen.
Wenn sich die Erfindung auf die Verwendung von Molekulargewichts-Markern von fragmentiertem Peptid bezieht, sind diese Marker in einer Größenordnung von mindestens 10 Aminosäuren. Es wird mehr bevorzugt, dass diese Molekulargewichts-Marker von fragmentiertem Peptid in der Größenordnung zwischen 10 und 100 Aminosäuren sind. Noch bevorzugter sind Molekulargewichts-Marker von fragmentiertem Peptid in einer Größenordnung zwischen 10 und 50 Aminosäuren und besonders in einer Größenordnung zwischen 10 und 35 Aminosäuren. Am meisten bevorzugt werden Molekulargewichts-Marker von fragmentiertem Peptid in einer Größenordnung zwischen 10 und 20 Aminosäuren.
Unter den Verfahren zur Bestimmung des Molekulargewichts sind Sedimentation, Gel-Elektrophorese, Chromatographie und Massespektrometrie. Eine besonders bevorzugte Ausführung ist Denaturierungs-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (U. K. Laemmli, Nature 227: 680–685, 1970). Das Verfahren verwendet konventionell zwei getrennte Bahnen eines Gel, das Natrium-Dodecyl-Sulfat enthält und eine Konzentration von Acrylamid zwischen 6–20% hat. Die Fähigkeit, den Marker und die Probe gleichzeitig unter identischen Bedingungen aufzulösen, ermöglicht eine größere Genauigkeit. Es ist natürlich verständlich, dass viele verschiedene Techniken zur Bestimmung des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins und Verwendung von Polypeptiden der Erfindung genutzt werden können, und daß diese Ausführung in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränkt.
Jedes unglykolisierte Polypeptid oder Fragment davon hat ein pI, das wirklich durch seine unikale Aminosäuresequenz (deren pI durch den Fachmann durch Verwendung eines der gegenwärtig verfügbaren Computerprogramme, die für die Voraussage von pI-Werten entwickelt wurden, durch Berechnung unter Verwendung einer weithin bekannten Aminosäure-pKa-Tabelle oder empirisch gemessen werden kann) bestimmt. Daher können diese Polypeptide oder Fragmente davon als spezifische Marker dienen, um bei der Bestimmung des isoelektrischen Punkts eines unbekannten Proteins, Polypeptids oder fragmentierten Peptids zu helfen, wobei Techniken wie isoelektrische Fokussierung verwendet werden. Diese Marker von Polypeptid oder fragmentiertem Peptid dienen besonders gut beim Überprüfen scheinbarer isoelektrischer Punkte unbekannter Proteine, die scheinbare isoelektrische Punkte haben, die dem des Markers von Polypeptid oder fragmentiertem Peptid der Erfindung nahe kommen.
Die Technik des isoelektrischen Fokussierens kann außerdem mit anderen Techniken, wie Gel-Elektrophorese, kombiniert werden, um ein Protein gleichzeitig auf der Grundlage von Molekulargewicht und Ladung zu trennen. Die Fähigkeit, diese Polypeptide oder Marker von fragmentiertem Peptid und das unbekannte Protein unter identischen Bedingungen gleichzeitig aufzulösen, ermöglicht eine größere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren isoelektrischen Punkts des unbekannten Proteins. Das ist besonders interessant bei Techniken, wie zweidimensionale Elektrophorese (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76–77 (Prentice Hall, 6. Ausg. 1991)), wo die Natur des Verfahrens vorschreibt, dass jeder Marker gleichzeitig mit dem unbekannten Protein aufgelöst werden soll. Zusätzlich können bei diesen Verfahren diese Polypeptide und fragmentierten Peptide davon bei der Bestimmung sowohl des isoelektrischen Punkts als auch des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins oder fragmentierter Peptide helfen.
Polypeptide und fragmentierte Peptide können unter Verwendung von zwei verschiedenen Verfahren sichtbar gemacht werden, die eine Unterscheidung zwischen dem unbekannten Protein und den Molekulargewichts-Markern ermöglichen. Bei einer Ausführung können das Polypeptid und die Molekulargewichts-Marker fragmentierten Peptids sichtbar gemacht werden, indem Antikörper, die gegen diese Marker erzeugt wurden, und konventionelle Immunoblotting-Techniken verwendet werden. Dieser Nachweis wird unter konventionellen Bedingungen durchgeführt, die nicht zum Nachweis des unbekannten Proteins führen. Es ist verständlich, dass es nicht möglich sein kann, Antikörper gegen alle Polypeptidfragmente der Erfindung zu erzeugen, da kleine Peptide möglicherweise keine immunogenen Epitope enthalten. Es ist außerdem verständlich, dass nicht alle Antikörper bei dieser Analyse funktionieren, jedoch können jene Antikörper, die Polypeptide und Fragmente der Erfindung binden können, leicht unter Verwendung konventioneller Techniken bestimmt werden können.
Das unbekannte Protein wird auch unter Verwendung konventioneller Färbeverfahren sichtbar gemacht. Der molare Überschuss von unbekanntem Protein zu Molekulargewichts-Markern von Polypeptid oder fragmentiertem Peptid der Erfindung ist so, dass das konventionelle Färbeverfahren vorwiegend das unbekannte Protein nachweist. Das Niveau dieser Molekulargewichts-Marker von Polypeptid oder fragmentiertem Peptid ist so, dass er wenig oder keinen Nachweis dieser Marker durch das konventionelle Färbeverfahren ermöglicht. Der bevorzugte molare Überschuss von unbekanntem Protein zu Molekulargewichts-Markern von Polypeptid ist zwischen 2- und 100.000-fach. Es ist mehr bevorzugt, dass der bevorzugte molare Überschuss von unbekanntem Protein zu diesen Molekulargewichts-Markern von Polypeptid zwischen 10- und 10.000-fach und besonders zwischen 100- und 1.000-fach ist.
Es ist verständlich, dass viele Techniken zur Bestimmung und zum Nachweis von Molekulargewicht und isoelektrischem Punkt eines unbekannten Proteins, von Polypeptiden und fragmentierten Peptiden davon unter Verwendung von diesen Molekulargewichts-Markern von Polypeptid und Peptidfragmenten davon genutzt werden können, und dass diese Ausführungen in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.
Bei einer anderen Ausführung kann die Untersuchung der progressiven Fragmentierung der Polypeptide der Erfindung in spezifische Peptide (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977), wie durch Veränderung der Zeit oder Temperatur der Fragmentierungsreaktion als Kontrolle des Ausmaßes von Abspaltung eines unbekannten Proteins verwendet werden kann. Abspaltung der gleichen Menge von Polypeptid oder unbekanntem Protein unter identischen Bedingungen kann zum Beispiel keinen direkten Vergleich des Ausmaßes von Fragmentierung ermöglichen. Bedingungen, die zur vollständigen Fragmentierung des Polypeptids führen, können auch zur vollständigen Fragmentierung des unbekannten Proteins führen.
Die Bestandteile der Ausrüstungssätze können variieren, enthalten aber typischerweise die Molekulargewichts-Marker von Polypeptid oder fragmentiertem Peptid. Diese Ausrüstungssätze können ebenfalls die Polypeptide enthalten, wobei eine Stelle, der für Fragmentierung notwendig ist, entfernt wurde. Außerdem können die Ausrüstungssätze Reagenzien für die spezifische Abspaltung des Polypeptids und des unbekannten Proteins durch chemische oder enzymatische Abspaltung enthalten. Ausrüstungssätze können außerdem Antikörper enthalten, die gegen Polypeptide oder Fragmente davon der Erfindung gerichtet sind.
Identifizierung von unbekanntem Protein
Wie oben angeführt kann ein Polypeptid- oder Peptidfingerabdruck in eine Datenbank bekannter Proteine eingegeben oder damit verglichen werden, um bei der Identifizierung des unbekannten Proteins unter Verwendung von Massespektrometrie zu helfen (W. J. Henzel et al., Nat. Acad. Sci. USA 90: 5011–5015, 1993; D. Fenyo et al., Electrophoresis 19: 988–1005, 1998). Eine Vielzahl von Computerprogrammen, die diese Vergleiche erleichtern, sind über das Internet verfügbar, wie Protein Inspector (Internetsite: prospector.uscf.edu), MultiIdent (Internetseite: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Internetseite: www.mann.embl-heidelberg.de...deSearch/FR_PeptideSearch Form.html) und ProFound (Internetseite: www.chait.sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html). Diese Programme ermöglichen dem Nutzer, den Abspaltungswirkstoff und die Molekulargewichte der fragmentierten Peptide innerhalb einer bestimmten Toleranz zu bestimmen. Die Programme vergleichen wahrgenommene Molekulargewichte mit vorausgesagten Molekulargewichten, die von Sequenzdatenbanken entnommen werden, um bei der Bestimmung der Identität des unbekannten Proteins zu helfen.
Zusätzlich kann eine Polypeptid- oder Peptidauflösung unter Verwendung von Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) sequenziert werden, und die sich daraus ergebende Sequenz in Datenbanken gesucht werden (J. K. Eng et al. J. Am. Soc. Mass Spec. 5: 976–989 (1994); M. Mann und M. Wilm, Anal. Chem. 66: 4390–4399, (1994); J. A. Taylor und R. S. Johnson, Rapid Comm. Mass Spec. 11: 1067–1075 (1997)). Suchprogramme, die für dieses Verfahren verwendet werden können, befinden sich im Internet, wie Lutefisk 97 (Internetseite: www.lsbc.com:70/Lutefisk97.html) und die Protein Prospector-, Peptid Search- und ProFound-Programme, die oben beschrieben wurden.
Demzufolge kann des Eingeben der Sequenz eines Gens oder seiner vorausgesagten Proteinsequenz und Peptidfragmente in eine Datenbank bei der Identifizierung eines unbekannten Proteins unter Verwendung von Massesspektrometrie helfen.
Antikörper
Antikörper, die mit Polypeptiden der Erfindung immunoreaktiv sind, sind hierin vorgesehen. Diese Antikörper binden die Polypeptide spezifisch über die antigenen Stellen des Antikörpers (im Gegensatz zu nichtspezifischer Bindung). So können die Polypeptide, Fragmente, Varianten, Fusionsproteine usw., wie oben angeführt, als „Immunogene" bei der Herstellung von Antikörpern, die damit immunoreaktiv sind, eingesetzt werden. Genauer gesagt die Polypeptide, Fragmente, Varianten Fusionsproteine usw. enthalten antigene Determinanten oder Epitope, die die Bildung von Antikörpern auslösen.
Diese antigenen Determinanten oder Epitope können entweder linear oder konformativ (diskontinuierlich) sein. Lineare Epitope sind aus einem einzelnen Abschnitt von Aminosäuren der Polypeptide zusammengesetzt, während konformative oder diskontinuierliche Epitope aus Aminosäureselektionen von verschiedenen Bereichen der Polypeptidkette zusammengesetzt sind, die in unmittelbare Nähe mit der Proteinfaltung gebracht werden (C. A. Janeway, Jr. Und P. Travers, Immuno Biology 2: 14 (Garland Publishing Inc., 2. Ausg. 1996)). Epitope können mit jedem Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, identifiziert werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich somit auf antigene Epitope der Polypeptide der Erfindung. Diese Epitope sind nützlich, um Antikörper, insbesondere monoklonalen Antikörpern zu entwickeln, wie weiter unten ausführlicher beschrieben wird. Zusätzlich können Epitope von dem Polypeptid der Erfindung bei Analysen als Forschungsreagenzien verwendet werden, und um spezifisch bindende Antikörper von Substanzen, wie polyklonale Seren oder Überstände von kultivierten Hybridomen, zu reinigen. Diese Epitope oder Varianten davon können unter Nutzung von Techniken, die auf dem Fachgebiet weithin bekannt sind, hergestellt werden, wie Festphasensynthese, chemische oder enzymatische Abspaltung eines Polypeptids oder unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technik.
Bezüglich Antikörper, die durch die Epitope der Polypeptide der Erfindung ausgelöst werden können, unabhängig ob die Epitope isoliert wurden oder ob sie Teil des Polypeptids bleiben, können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper durch konventionelle Techniken erzeugt werden. Siehe zum Beispiel Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (Hrsg.), Plenum Press, New York (1980); und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Land (Hrsg.), Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988).
Zelllinien von Hybridomen, die monoklonale Antikörper, die für die Polypeptide der Erfindung spezifisch sind, erzeugen, sind hierin auch betrachtet. Diese Hybridomen können durch konventionelle Techniken hergestellt und identifiziert werden. Ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Hybridomazelllinie umfasst die Immunisierung eines Tieres mit einem Polypeptid; die Entnahme von Milzzellen von dem immunisierten Tier; die Fusion besagter Milzzellen mit einer Myelomazelllinie, wobei Hybridomazellen erzeugt werden; und die Identifizierung einer Hybridomazelllinie, die einen monoklonalen Antikörper, der das Polypeptid bindet, erzeugt. Die Antikörper können durch konventionelle Techniken gewonnen werden.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung beinhalten chimäre Antikörper, z.B. humanisierte Versionen monoklonaler Antikörper von Mäusen. Diese humanisierten Antikörper können durch bekannte Techniken erzeugt werden und bieten den Vorteil verringerter Immunogenität, wenn die Antikörper Menschen verabreicht werden. Bei einer Ausführung umfasst ein humanisierter monoklonaler Antikörper den variablen Bereich eines Antikörpers (oder einfach den Antigen-Bindungsort davon) von Mäusen und einen konstanten Bereich, der von einem humanen Antikörper abgeleitet ist. Alternativ dazu kann ein humanisiertes Antikörperfragment den Antigen-Bindungsort eines monoklonalen Antikörpers von Mausen und ein Fragment des variablen Bereichs (dem der Antigen-Bindungsort fehlt), das von einem humanen Antikörper abgeleitet ist, umfassen. Verfahren zur Herstellung von chimären und weiter konstruierten monoklonalen Antikörpern beinhalten jene die in Riechmann et al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et al. (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7: 934, 1989) und Winter und Harris (TIPS 14: 139, Mai, 1993) beschrieben sind. Verfahren, um Antikörper transgen zu erzeugen, können in der GB-Patentschrift 2,272,440, den US-Patentschriften Nr. 5,569,825 und Nr. 5,545,806 und in verwandten Patentschriften, die deren Priorität beanspruchen, die alle durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden.
Antigen-bindende Fragmente der Antikörper, die durch konventionelle Techniken hergestellt werden können, werden von der vorliegenden Erfindung ebenso umfasst. Beispiele für diese Fragmente beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, Fab- und F(ab')₂-Fragmente. Antikörperfragmente und Derivative, die durch genetische Konstruktions-techniken hergestellt werden, sind auch vorgesehen.
Bei einer Ausführung sind die Antikörper spezifisch für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung und sind mit anderen Proteinen nicht kreuzreaktiv. Untersuchungsmethoden, durch die diese Antikörper identifiziert werden können, sind weithin bekannt und können zum Beispiel Immunoaffinitäts-Chromatographie einschließen.
Verwendungen davon
Die Antikörper der Erfindung können in Analysen verwendet werden, um das Vorhandensein der Polypeptide oder Fragmente der Erfindung, entweder in vitro oder in vivo, nachzuweisen. Die Antikörper können auch angewendet werden, um Polypeptide oder Fragmente der Erfindung durch den Einsatz von Immunoaffinitäts-Chromatographie zu reinigen.
Diejenigen Antikörper, die zusätzlich das Binden der Polypeptide der Erfindung an ihren Bindungspartner blockieren, können genutzt werden, um eine biologische Aktivität, die aus einer solchen Bindung resultiert, zu hemmen. Diese blockierenden Antikörper können durch die Verwendung eines jeden geeigneten Analyseverfahrens identifiziert werden, wie dem Test der Antikörper auf die Fähigkeit, die Bindung von ACPL an gewisse Zellen, die den Bindungspartner exprimieren, zu hemmen. Alternativ dazu können blockierende Antikörper durch Analysen auf die Fähigkeit, eine biologische Auswirkung zu hemmen, die aus der Bindung von einem ACPL-bindenden Partner an Zielzellen resultiert, identifiziert werden. Antikörper können auf die Fähigkeit, vom Bindungspartner übertragenen Aktivität zu hemmen, analysiert werden.
Ein solcher Antikörper kann in einem in vitro-Verfahren eingesetzt werden, oder in vivo dargereicht werden, um eine biologische Aktivität zu hemmen, die durch die Einheit, die den Antikörper erzeugt, übertragen wird. Krankheiten, die durch die Wechselwirkung eines ACPL-bindenden Partners mit einem Rezeptor von einem Oberflächenbindungspartner verursacht oder verschlimmert werden, können somit behandelt werden. Ein therapeutisches Verfahren beinhaltet in vivo-Darreichung eines blockierenden Antikörpers an ein Säugetier in einer Menge, die ausreichend ist, eine durch einen Bindungspartner übertragenen biologische Aktivität zu hemmen. Monoklone Antikörper werden im Allgemeinen für die Verwendung bei diesen therapeutischen Verfahren bevorzugt. Bei einer Ausführung wird ein antigen-bindendes Antikörperfragment eingesetzt.
Antikörper können auf agonistische (z.B. ligand-nachahmende) Eigenschaften gescreent werden. Diese Antikörper induzieren, nachdem sie sich an einen Oberflächenbindungspartner gebunden haben, biologische Auswirkungen (z.B. Transduktion von biologischen Signalen), die den biologischen Auswirkungen ähnlich sind, die induziert werden, wenn ein ACPL-bindender Partner an eine Zelloberflächen-ACPL bindet. Agonistische Antikörper können genutzt werden, um durch IL-18 übertragene Aktivität zu induzieren.
Zusammensetzungen, die einen Antikörper, der gegen ACPL gerichtet ist, und ein physiologisch vertretbares Verdünnungsmittel, einen Excipienten oder einen Träger enthalten sind hierin vorgesehen. Geeignete Bestandteile dieser Zusammensetzungen sind wie oben beschrieben für Zusammensetzungen, die ACPL-Proteine enthalten.
Hierin vorgesehen werden auch Konjugate, die einen nachweisbaren (z.B. diagnostisch) oder therapeutischen Wirkstoff aufweisen, der an den Antikörper angeheftet ist. Beispiele solcher Wirkstoffe werden oben dargestellt. Die Konjugate finden bei in vitro- oder in vivo-Verfahren Verwendung.
Die nachfolgenden Beispiele sind vorgesehen, um bestimmte Ausführungen der Erfindung ausführlicher zu verdeutlichen, und sind nicht bestimmt, den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken. Die Beschreibung ist durchgehend im Sinne der Lehren der Literaturzitate zu verstehen, die in der Beschreibung angeführt und hiermit durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die Ausführungen in der Beschreibung und die nachfolgenden Beispiele bieten eine Verdeutlichung der Ausführungen der Erfindung und sollen nicht dazu ausgelegt werden, den Umfang der Erfindung einzuschränken. Der Fachmann erkennt, dass viele andere Ausführungen durch die eingereichte Erfindung umfasst werden. Bei den folgenden Beispielen sind alle beschriebenen Verfahren, wenn nicht anders spezifiziert, konventionell.
BEISPIEL 1: Isolation der Nukleinsäure von Mäusen
Eine ACPL cDNA von Mäusen wurde isoliert, indem die exprimierte Sequenztag Datenbank durchsucht wurde, wobei entdeckt wurde, dass der IMAGE-Klon 640615 (GenBank-Zugangsnummer AA203097) Homologie zu IL-1RacP besitzt. IMAGE-Klon 640615 wurde erhalten, durch Zufallsprimieren mit ³²P markiert und für die Untersuchung eines EL46.I(Thymozyt von Mäusen)-cDNA-Archivs verwendet. Die Hybridisierung wurde bei 42°C in einer Hybridisierungslösung, die 50% Formamid enthält, durchgeführt. Nachdem der offene Leserahmen in gesamter Länge durch einen EL46.1 cDNA-Klon definiert wurde, wurde es durch die Gewinnung von unabhängigen Isolaten aus 7B9 (T-Zelle von Mäusen)- und LDA11 (Knochenmarkgewebezellen von Mäusen)-cDNA-Bibliotheken unter Verwendung von PCR-Amplifizierung verifiziert. Primer entsprachen Nukleotiden –15 bis +13 und Nukleotiden 1892 bis 1916 (bezogen auf die auslösende ATG von +1 bis +3) der ACPL-Nukleotidsequenz von Mäusen.
BEISPIEL 2: Isolation einer humanen ACPL-Nukleinsäuresequenz
Bei einem humanen cDNA-Klon, QQ1352 benannt, der durch Zufallssequenzierung eines NK-Zellenarchivs erhalten wurde, wurde herausgefunden, dass er einen hohen Grad an Homologie zu einer ACPL von Mäusen, die wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert wurde, besitzt. Der Klon wurde als Sonde verwendet, um humane ACPL-Klone von periphen Blutlymphozyten, periphen Blut-T-Zellen und NK-cDNA-Bibliotheken zu isolieren. Die Region von Klon QQ1352, die als Sonde verwendet wurde, war homolog zu ACPL-Nukleotiden 1196–11753 von Mäusen. Ein Klon gesamter Länge wurde aus jeder der Bibliotheken erhalten, dabei wurde vektorenverankerte PCR in jeder der Bibliotheken durchgeführt, um das 5' Ende des offenen Leserahmens (SEQ ID NO: 6) zu erhalten.
BEISPIEL 3: Bestimmung der Position auf der Chromosomenkarte
Die Position von humaner ACPL auf der Chromosomenkarte wurde durch Strahlungs-Hybrid-Kartierung bestimmt, wobei das Stanford G3 Radiation Hybrid Panel-Verfahren (Research Genetics) genutzt wurde. Die Primer wurden nach ihrer Homologie nach IL-1R ausgewählt Amplifikation wurde unter Standard-PCR-Bedingungen für 40 Zyklen durchgeführt.
Die Ergebnisse platzierten humane ACPL auf Chromosom 2 sind sehr nahe an AFM316tg5 gebunden, mit einem Logarithmus-Odds-Score von 12.72. Das ist die gleiche Region von Chromosom 2, in der IL-1R-Typ I, IL-1R-Typ II, IL-1R-rp1 und T1/ST2 kartiert wurden.
BEISPIEL 4: Northern Blot-Analyse
Ein multipler menschlicher Gewebe-Blot wurde von CLONTECH Laboratories, Inc. gekauft, die 2 μg mRNA von normaler humaner Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm, Dickdarm und peripheren Blutleukozyten enthält. Diese wurde über Nacht mit einer 32P-gekennzeichneten Antisense- humanen ACPL-Riboprobe in Hybridisierungspuffer, der 50% Formamid enthält, bei 63°C hybridisiert und danach bei 68°C in 0,1 × SSC/0,1%SDS gewaschen. Nach der Exponierung wurde das Blot mit einer „Random Prime"-markierten Sonde rehybridisiert gegen β-Actin zur Standardisierung.
Die Ergebnisse verdeutlichten, dass humane ACPL stark in peripheren Blutleukozyten und der Milz exprimiert wird. In geringerem Umfang wird humane ACPL im Dickdarm exprimiert. Die Ergebnisse verdeutlichten außerdem, dass humane ACPL schwach in Prostata- und Dünndarm-mRNA exprimiert wird. Das vorherrschende Produkt war ungefähr 3,8 Kilobasen mit geringfügigeren Banden bei rund 2,6 und 8,0 Kilobasen. Expression wurde durch die Northern-Analyse auch in Lungen-mRNA nachgewiesen.
BEISPIEL 5: Exprimieren von ACPL-Polypeptid und ACPL:FC-Fusionen
Um ACPL-Polypeptide von Mäusen und Menschen zu exprimieren, wurden ACPL-Nukleotidsequenzen voller Länge von Mäusen und Menschen durch PCR erzeugt und in pDC304, eine Variante von pDC302, geklont. Für die Expression von humanen ACPL:Fc-Fusionsprotein wurde der extrazelluläre Anteil des humanen ACPL-Expressionsvektors (Aminosäuren 1–356) mit den CH2- und CH3-Domänen von humanem IgG1 verbunden, wie in Baum et al.; EMBO J. 13: 3992–4001 (1994) beschrieben.
BEISPIEL 6: Induktion von NFkB durch ACPL-Polypeptide in COS- und S49-Zellen
Um zu bestimmen, ob ACPL-Polypeptid von Mäusen (SEQ ID NO: 2) ein Rezeptor, der bei der IL-18-Signalisierung involviert ist, war, wurde in COS- und S49.1-Zellen überexprimiert und die Auswirkung von IL-18-Stimulierung auf NFkB-Aktivierung erhoben.
COS-7-Zellen wurden durch die DEAE/Dextran-Methode in einem 12-Vertiefungen-Format transfiziert. Jede Vertiefung wurde mit einer Gesamtmenge von 200 ng von Expressionsvektoren, die Rezeptor(en) kodieren, und 800 ng eines NFkB-Reporterplasmids, das 3 NFkB-Orte enthält, die Luciferaseexpression vermitteln, transfizier. Ungefähr 10⁷ S49.1-Zellen wurden durch Elektroporation in 0,7 ml mit 40 μg des NFkB-Luc-Reporterplasmids und einer Gesamtmenge von 20 μg von Rezeptoren, die Expressionsvektoren kodieren, transfiziert. Elektroporationen wurden bei 960 μg und 320 V durchgeführt.
Zellen wurden 2 Tage inkubiert und danach mit 40 ng/ml IL-18 von Mäusen (PeproTech) 4 Stunden stimuliert. Zellen wurden gewaschen, lysiert und auf Lucifersaaktivität analysiert, wobei Luciferase-Analyse-Reagenzien (Promega Corp.) entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet wurden.
Zellen, die nur mit Vektor allein, nur mit Expressionsvektor, der IL-1Rrp1 kodiert, allein, oder nur mit Expressionsvektor, der ACPL-Polypeptid allein kodiert, transfiziert wurden, zeigten keine Reaktion auf IL-18-Stimuliuerung. Außerdem wurde keine Funktion von ACPL bei IL-1-Signalisierung ermittelt, wenn der Expressionsvektor, der den Rezeptor kodiert, allein oder in Verbindung mit einem Expressionsvektor, der IL-1R-Typ oder IL-1RacP kodiert, transfiziert wurde. Jedoch induzierte die Hinzugabe von IL-18 zu Zellen, die mit Expressionsvektoren, die IL-Rrp1 und ACPL-Polypeptide kodieren, kotransfiziert wurden, die Expression des NFkB-gebundenen Gens 10-fach in COS-Zellen und 300-fach in S49-Zellen. Diese drastische Stimulierung von NFkB-Aktivität zeigt an, dass ACPL-Polypeptid ein Bestandteil des IL-18-Rezeptors ist, synergistisch mit IL-1Rrp1 kooperiert, um NFkB-Signalisierung als Reaktion auf IL-18-Stimulierung zu induzieren.
BEISPIEL 7: Aktivierung von JNK-Aktivität
Die Induktion von JNK-Aktivität ist ein Abwärtssignalisierungsgeschehen im IL-1-Pfad. Ähnlich der Induktion vom NFkB-Experiment oben wird untersucht, ob ACPL allein oder in Verbindung mit IL-1Rrp1 in der Lage war, die Induktion von JNK-Aktivität durch IL-18 zu vermitteln. Aktivierung von JNK-Aktivität wurde, wie in Bird et al. J. Biol. Chem. 269: 31836–31844, 1994, beschrieben, eingeschätzt. Zwei (2) Tage nach der Transfektion wurden COS7-Zellen 15 Minuten mit IL-18 stimuliert, lysiert und immunopräzipitiert mit einer Kombination aus zwei Anti-JNK-Antikörpern (c-17 und FL, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Dieser Immunokomplex wurde auf Aktivität durch die Hinzugabe von Glutathion-S-Transferase-c-Jun (Upstate Biotechnology, Inc.) und in [γ-³²]ATP in Kinasepuffer analysiert. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei danach Laemmli-Loading-Puffer hinzugegeben wurde, um die Reaktion zu stoppen, und die Ergebnisse auf einem 4–20%- Acrylamidgel elektrophoresiert, gefärbt, getrocknet und auf einem PhosphorImager untersucht wurden.
Ähnlich den Ergebnissen, die hinsichtlich der Aktivierung von NFkB erzielt wurden, war JNK-Aktivität nur von IL-18 in COS7-Zellen induziert worden, wenn IL-Rrp1 und ACPL koexprimiert waren.
SEQUENZLISTE

Claims

Wicklung (64) für eine Reluktanzmaschine, die aus nur einer Spule besteht, die einander gegenüberliegende Schenkelabschnitte (72) mit jeweils einem ersten und einem zweiten Ende, eine erste Endschleife (74, 76), welche die ersten Enden der Schenkelabschnitte anschließt, und eine zweite Endschleife (74, 76), welche die zweiten Enden anschließt, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine, die erste und/oder die zweite Endschleife, einen Bogen zwischen den Schenkelabschnitten definiert, derart, dass bei einem Betrachten in Richtung der Schenkelabschnitte eine umschlossene Öffnung (62) durch die Wicklung definiert ist, wobei die Öffnung ein Raum ist, worin im Einsatz ein Rotor (26) der Maschine, der sich dreht, angeordnet ist.
Wicklung nach Anspruch 1, wobei die andere der ersten und zweiten Endschleife ebenfalls einen Bogen zwischen den Schenkelabschnitten definiert, wobei die Bögen, die durch die erste und zweite Endschleife gebildet sind, in entgegengesetzte Richtungen vorstehen.
Wicklung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, einen Spulenkörper (60) einschließend, auf den die Wicklung aufgebracht ist.
Wicklung nach Anspruch 3, wobei eine elektrische Schaltung (90), beispielsweise eine elektronische Steuereinrichtung zur Steuerung der Erregung der Wicklung, auf dem Spulenkörper nahe der ersten Endschleife angebracht ist.
Wicklung nach Anspruch 3 oder 4, wobei an dem Spulenkörper ein Rotorpositionsmessaufnehmer angebracht ist.
Wicklung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wenigstens einen Magneten einschließend, der an wenigstens einer der Endschleifen angebracht ist.
Wicklung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Öffnung im Wesentlichen kreisförmig ist.
Wicklung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die erste Endschleife im Allgemeinen senkrecht in Bezug auf die Richtung der Schenkelabschnitte vorsteht.
Wicklung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die zweite Endschleife unter einem Winkel zur Richtung der Schenkelabschnitte vorsteht.
Verfahren zur Montage eines Stators (40) für eine Reluktanzmaschine, wobei der Stator Statorpole definiert, die eine Wicklung (64) nach einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweisen, wobei das Verfahren beinhaltet: Einbringen der zweiten Endschleife (74) der Wicklung in einen Raum in dem Stator, zwischen den Statorpolen; Kippen der Wicklung, so dass die Schenkelabschnitte (72) im Wesentlichen parallel zur Achse des Stators angeordnet sind; und Anordnen der Schenkelabschnitte derart, dass wenigstens einige der Statorpole erregt werden.
Verfahren nach Anspruch 10, ferner ein Anordnen der Wicklung in dem Stator aufweisend, derart, dass jeder Schenkelabschnitt im Wesentlichen einen interpolaren Raum zwischen den Polen ausfüllt.
Reluktanzmaschine, die einen Stator (40), der Statorpole definiert, einen Rotor (42), der Rotorpole definiert, und eine Wicklung (64) nach einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.
Maschine nach Anspruch 12, wobei jeder Schenkelabschnitt (72) einen interpolaren Raum zwischen den Statorpolen im Wesentlichen ausfüllt.
Maschine nach Anspruch 12 oder 13, wobei der Bogen oder die Bögen der Endschleife(n) (74, 76) der Wicklung für einen Freiraum für ein Einsetzen des Rotors längs seiner Drehachse sorgen.
Maschine nach einem der Ansprüche 12 bis 14, an dem Stator befestigte Sicherungsmittel aufweisend, die so beschaffen sind, dass sie die Wicklung an Ort und Stelle halten.
Maschine nach Anspruch 15, wobei die Sicherungsmittel Lagermittel einschließen und der Rotor eine Rotorwelle, die in den Lagermitteln angebracht ist, einschließt.
Maschine nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wenn die Wicklung einen Spulenkörper einschließt, wobei der Spulenkörper wenigstens eine Schürze aufweist, die so angeordnet ist, dass sie wenigstens einen der zwischen den Polen liegenden Zwischenräume in dem Stator absperrt.
Maschine nach Anspruch 17, wobei die Spule ein Lager-Bauelement trägt, um den Rotor zu lagern, der ein zu dem Lager komplementäres Bauelement aufweist.