ES2334408T3 - Receptor de hematopoyetina y secuencias geneticas que lo codifican. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A UN NUEVO RECEPTOR DE LA HEMOPOYETINA, O A COMPONENTES O PARTES DEL MISMO, Y A LAS SECUENCIAS GENETICAS QUE LO CODIFICAN. LAS MOLECULAS RECEPTORAS Y SUS COMPONENTES Y/O PARTES, Y LAS SECUENCIAS GENETICAS QUE LOS CODIFICAN SEGUN LA PRESENTE INVENCION SON UTILES PARA EL DESARROLLO DE UNA AMPLIA GAMA DE AGONISTAS, ANTAGONISTAS Y REACTIVOS TERAPEUTICOS Y DIAGNOSTICOS BASADOS EN LA INTERACCION DEL LIGANDO CON SU RECEPTOR.

Description

Receptor de hematopoyetina y secuencias genéticas que lo codifican.

\global\parskip0.800000\baselineskip

La presente invención se relaciona de manera general con un receptor de hematopoyetina novedoso o componentes o partes del mismo como se define aquí y con secuencias genéticas que codifican el mismo. Las moléculas del receptor y sus componentes y/o partes y las secuencias genéticas que lo codifican de la presente invención son útiles en el desarrollo de un amplio rango de agonistas, antagonistas, reactivos terapéuticos y diagnósticos con base en la interacción del ligando con su receptor.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas numéricamente en esta especificación se agrupan al final de la descripción. Los números de identidad de secuencia (SEQ ID NOs.) para las secuencias de nucleótido y aminoácido referidas en la especificación se definen luego de la bibliografía.

A través de la especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto indique otra cosa, la palabra "comprende", o variaciones tal como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un entero establecido o grupo de interés pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros.

El receptor de hematopoyetina preferido de la presente invención se denomina aquí como "NR4". El receptor NR4 interactúa con IL-13 y se denomina aquí como el receptor IL-13 o más particularmente la cadena \alpha del receptor IL-13 (IL-13R\alpha). Estos términos se utilizan intercambiablemente a lo largo de la especificación objeto. Las especies de las que un NR4 particular se deriva se dan en una abreviatura de única letra. Por ejemplo, murino es "M" y humano es "H", Una forma recombinante puede tener el prefijo "r".

La sofisticación rápidamente incrementada de técnicas de ADN recombinantes facilita grandemente la investigación en los campos de salud, médico y afines. La investigación de citoquina es de particular importancia, especialmente cómo estas moléculas regulan la proliferación, diferenciación y función de una amplia variedad de células. La administración de citoquinas recombinantes o la función de citoquina reguladora y/o síntesis llegan a ser crecientemente el foco de búsqueda médica en el tratamiento de un rango de afecciones de enfermedad.

A pesar del descubrimiento de un rango de citoquinas y otros reguladores secretados de la función celular, comparativamente pocas citoquinas se utilizan directamente o se objetivan en regímenes terapéuticos. Una razón, para esto es la naturaleza pleiotrópica de muchas citoquinas. Por ejemplo, interleuquina (IL)-11 es una molécula funcionalmente pleiotrópica (1,2), caracterizada inicialmente por su capacidad para estimular la proliferación de la estirpe celular de plasmacitoma dependiente de IL-6, T11 65 (3). Otras acciones biológicas de IL-11 incluyen la inducción de la proliferación celular progenitora de hemapoyetina multipotencial (4,5,6), el mejoramiento de la formación de plaqueta y de megacariocito (7,8,9,10), la estimulación de la síntesis de proteína de fase aguda (11) y la inhibición de la actividad de lipasa lipoproteína de adipocito (12, 13).

La interleuquina-13 (IL-13) es otra citoquina importante que comparte un número de características estructurales con interleuquina-4 (IL-4) [revisión en 14 y 15]. Los genes para IL-4 y IL-13 tienen una estructura de intrón/exón relacionada y se ubican cerca junto al cromosoma 5 en el humano y la región sinténica del cromosoma 11 en el ratón (14, 15). En el nivel de proteína, la IL-4 y IL-13 tiene aproximadamente 30% de identidad de aminoácido, que incluye cuatro residuos cisteína. Biológicamente, la IL-13 y IL-4 que son también similares, se producen por células T activadas y actúan, por ejemplo, macrófagos para inducir la diferenciación y suprime la producción de citoquinas inflamatorias. Adicionalmente, la IL-13 humano puede actuar como una señal coestimuladora para La proliferación de célula B y afectan el cambio de isotipo de inmunoglobulina (14, 15). La función pleiotrópica y diversa de IL-13 y otras citoquinas hemopoyéticas hace a este grupo importante para estudio, especialmente en el nivel de interacción de los citoquina con sus receptores. La manipulación y control de receptores de citoquina y de la interacción del receptor de citoquina es potencialmente muy importante en muchas situaciones terapéuticas, especialmente donde la citoquina objetivo es fun-
cionalmente pleiotrópica y se desea bloquear ciertas funciones de una citoquina objetivo pero no todas las funciones.

La investigación de IL-13 y su receptor se ha visto obstaculizada debido a la incapacidad de clonar secuencias genéticas que codifican todo o parte del receptor IL-13. Zurawski et. al. (J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, No. 23, p13869-13878) describe la identificación de una proteína de unión primaria para IL-13 en números bajos en células hemopoyéticas. Obiri et al. (J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, No. 15, p8797-8804) también identifica una proteína de unión de IL-13 en una variedad de células. No se describen las secuencias de nucleótido que codifican estas o cualquier otra proteína de unión de IL-13. De acuerdo con la presente invención, las secuencias genéticas que ahora se han clonado codificando la cadena \alpha del receptor IL-13, una subunidad del receptor que también comparte con el receptor IL-4. La disponibilidad de estas secuencias genéticas permite el desarrollo de un rango de agentes diagnósticos y terapéuticos capaz de modular o monitorear la actividad IL-13 así como también la actividad de citoquinas relacionadas con IL-13 en el nivel de estructura o función. De acuerdo con la presente invención, un ejemplo de una citoquina relacionada en estructura y función a IL-13 es IL-4.

Se describe aquí una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o com-
plementan una secuencia que codifican un receptor de hematopoyetina de un animal o un

\hbox{derivado de dicho
receptor.}

Más particularmente, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o complementa una secuencia que codifica un receptor de hematopoyetina de animal o un derivado del mismo, se describe dicho receptor capaz de interacción con IL-13 o un derivado de IL-13.

En una realización relacionada, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o complementan a una secuencia que codifican un receptor de hematopoyetina animal o un derivado del mismo, en donde dicho receptor:

(i) es capaz de interacción con IL-13 o sus derivados; y

(ii) es capaz de interacción con un complejo entre IL-4 y se describe la cadena \alpha del receptor IL-4.

De acuerdo con estas realizaciones, un derivado de IL-13 incluye agonistas, antagonistas, anticuerpos e imitadores.

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o complementan a una secuencia que codifica una cadena \alpha del receptor IL-13 de animal o un derivado del mismo.

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican o complementan a una secuencia que codifican un componente de un receptor IL-4 animal o un derivado del mismo.

Preferiblemente, el animal es un mamífero o una especie de ave. Particularmente, los animales preferidos incluyen humanos, animales de prueba de laboratorio (por ejemplo primates, ratones, conejos, hámsteres, conejillos de indias), animales de ganado (por ejemplo ovejas, cabras, caballos, cerdos, vacas, burros), animales de compañía (por ejemplo perros, gatos), animales silvestres en cautiverio (por ejemplo zorros, canguros, dingos) y aves de corral (por ejemplo pollos, gansos, patos) y aves de caza (por ejemplo emús, avestruces). Aunque la presente invención se ejemplifica con respecto a los ratones y humanos, el alcance de la invención objeto se extiende a todos los animales y aves.

De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótido que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica un polipéptido, dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácido

(i)

como se establece en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido; o

(ii)

que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia en (i); o dicha secuencia de nucleótidos tienen una secuencia de nucleótido

(iii)

como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o una parte de la misma que comprende la secuencia de dicha secuencia de nucleótido que codifica la porción de unión de IL-13; o

(iv)

que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia en (iii), o

(v)

capaz de hibridar a la secuencia de nucleótido como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o una forma complementaria de la misma bajo condiciones altamente exigentes, utilizando de por lo menos 31% v/v a por lo menos 50% v/v formamida y de por lo menos 0.01 M a por lo menos 0.15M sal para hibridación, y por lo menos 0.01 M a por lo menos 0.15M para lavado, o

(vi)

que es una secuencia complementaria de una secuencia de (iii) a (v),

en donde dicho polipéptido es capaz de interacción con IL-13. Preferiblemente dicha secuencia de (v) comprende una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 70% de similitud con la secuencia establecida en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. En una característica preferida adicional, la molécula de ácido nucleico codifica un receptor de hematopoyetina capaz de interacción con IL-13, cuya interacción es capaz de inhibición competitiva mediante IL-4 en células que expresan una cadena \alpha del receptor IL-4. En todavía un aspecto adicional, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido en la forma de una proteína de fusión o en una forma soluble o codifica una cadena \alpha del receptor IL-13 madura o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

La presente invención se basa en parte en una capacidad para identificar miembros de la familia del receptor de hematopoyetina en la base de similitud de secuencia. Con base en este alcance, se identifica una secuencia genética de acuerdo con la presente invención que codifica un receptor de hematopoyetina. La secuencia genética expresada se denomina aquí como "NR4". De acuerdo con la presente invención, el NR4 tiene una masa molecular evidente cuando se sintetiza mediante células transfectadas COS de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000 daltons, y más preferiblemente de aproximadamente 55,000 a aproximadamente 65,000 daltons. El NR4 une a IL-13 específicamente y con baja afinidad y se considera, por lo tanto, por ser una cadena \alpha del receptor IL-13. De acuerdo con lo anterior, los términos "NR4" y "cadena \alpha del receptor IL-13" (o "IL-13 R\alpha") se utilizan intercambiablemente a través de la especificación objeto. Adicionalmente, la IL-13 que une a su receptor se ha encontrado que se inhibe competitivamente mediante IL-4 o un componente del mismo en células que expresan la cadena \alpha del receptor IL-4 y esto puede proporcionar un método para controlar la interacción del receptor IL-13 y también se proporcionará una base para la preparación y construcción de imitadores.

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena \alpha del receptor IL-13 que tiene una secuencia de aminoácido como se establece en la SEQ ID NO:2 o 4 o que tiene por lo menos aproximadamente 50%, preferiblemente por lo menos 60% de similitud con todo o parte del mismo. En aspectos preferidos de la invención, el porcentaje de similitud para una cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 4 o una parte de la misma es por lo menos de aproximadamente 80-85% y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90-95% o más. La referencia a todo o parte de una secuencia está destinada a incluir lo definido en una molécula híbrida que comprende partes de dos receptores. Esto no está destinado a abarcar aminoácidos sencillos.

\global\parskip0.900000\baselineskip

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican la cadena \alpha del receptor IL-13 y tienen una secuencia de nucleótido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:1 o 3 o que tiene por lo menos aproximadamente 50%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 60%.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención se extiende a la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:1 o 3 o la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO:2 o 4 o el nucleótido único o múltiple o las sustituciones de aminoácido, eliminaciones y/o adiciones del mismo como se define en las reivindicaciones.

También se describen las moléculas de ácido nucleico capaces de hibridar bajo bajas condiciones de exigencia a la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO:1 o 3 o una forma complementaria de la misma.

La presente invención se extiende a hemopoyetinas del receptor recombinante y en particular NR4 recombinante e híbridos recombinantes que contienen NR4 como se describe en las reivindicaciones. Los polipéptidos recombinantes preferidos interactúan con IL-13 con baja afinidad y aún más preferiblemente con alta afinidad.

Un polipéptido que tiene por lo menos dos de los siguientes:

(i)

comprende una secuencia de aminoácido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o que tiene por lo menos aproximadamente 50% de similitud con todo o parte del mismo;

(ii)

se codifica por una secuencia de nucleótido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o que tiene por lo menos aproximadamente 50% de similitud con todo o parte del mismo;

(iii)

interactúa con IL-13 o sus derivados con por lo menos baja afinidad; y

(iv)

tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000 daltons como se determina por Análisis Western blot se describe cuando se expresa en células COS.

\vskip1.000000\baselineskip

Un polipéptido que tiene por lo menos tres de las siguientes características:

(i)

comprende una secuencia de aminoácido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o que tiene por lo menos aproximadamente 50% de similitud con todo o parte del mismo;

(ii)

se codifica por una secuencia de nucleótido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o que tiene por lo menos aproximadamente 50% de similitud con todo o parte del mismo;

(iii)

interactúa con IL-13 o sus derivados con por lo menos baja afinidad:

(iv)

tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000 daltons como se determina por Análisis Western blot cuando se expresa en células COS;

(v)

comprende una secuencia de aminoácido derivada de la cadena \alpha del receptor IL-4; y

(vi)

es capaz de interacción con IL-13 que se inhibe competitivamente también se describe mediante IL-4 en células que expresan una cadena \alpha del receptor IL-4.

Así la presente invención proporciona un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos (i) como se establece en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido; o (ii) que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia en (i) o codificada por una secuencia de nucleótido (iii) como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o una parte de la misma que comprende la secuencia de dicha secuencia de nucleótido que codifica la porción de unión de IL-13; o (iv) que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia en (iii) o una secuencia complementaria de la misma, dicho polipéptido es capaz de interacción con IL-13. Preferiblemente la interacción con IL-13 es con baja afinidad, especialmente y preferiblemente con media a alta afinidad. En una realización particularmente preferida dicho polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000 daltons como se determina por Análisis Western blot cuando se expresa en células COS. En un aspecto adicionalmente preferido, el polipéptido es capaz de interacción con IL-13 que se inhibe competitivamente mediante IL-4 en células que expresan una cadena \alpha del receptor IL-4.

La referencia aquí a "hemopoyetina del receptor recombinante", "NR4", "receptor IL-13" o "cadena \alpha del receptor IL-13" incluye referencia a derivados de los mismos tal como partes, fragmentos, porciones, homólogos, híbridos o análogos de los mismos. Los derivados pueden ser o no funcionales o no pueden ser funcionales pero inmunológicamente interactivos con anticuerpos para todo o parte del receptor. Los derivados del receptor también cubren agonistas o antagonistas de la interacción de ligando-receptor. La función se define convenientemente mediante una capacidad de NR4 para interactuar con IL-13 o sus derivados o para NR4 soluble para competir con actividades inducidas por IL-13 de ciertas células.

Particularmente los derivados preferidos contemplados por la presente invención incluyen derivados de cadena \alpha del receptor IL-13 que son capaces de unir IL-13 con alta afinidad o con IL-13 y IL-4 con alta afinidad; los derivados también abarcan moléculas quiméricas tal como entre la cadena \alpha del receptor IL-13 y, por ejemplo, la cadena \alpha del receptor IL-4 que también une IL-13 con alta afinidad.

Otras moléculas quiméricas o de fusión contempladas por la presente invención incluyen aquellas entre NR4 y miembros de la familia del receptor de hematopoyetina, receptor tirosina quinasa. Los receptores TNF/NGF y los receptores acoplados a la proteína G. Por ejemplo, las quimeras pueden estar entre NR4 y la proteína de unión de IL-13, la cadena \alpha del receptor IL-4, cadena \gamma del receptor IL-4 o receptores para otras citoquinas involucradas o implicadas en asma y alergia tal como IL-5. Otras quimeras importantes incluyen NR4 e inmunoglobulinas u otras moléculas que permite objetivar el NR4 a células o tejidos particulares, NR4 y toxinas y NR4 y factores de crecimiento.

Así, en un aspecto preferido, el polipéptido está en la forma de una proteína de fusión. En un aspecto adicionalmente preferido el polipéptido es una cadena \alpha del receptor IL-13 madura o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido. En todavía aspectos preferidos adicionales la presente invención proporciona un receptor híbrido de hemopoyetina capaz de interacción con por lo menos dos citoquinas en donde por lo menos una de dichas citoquinas es IL-13 y en donde dicho receptor híbrido comprende una secuencia de aminoácido que incluye todas las secuencias de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido o un receptor híbrido de hemopoyetina capaz de interacción de alta afinidad con por lo menos una citoquina en donde por lo menos una de dichas citoquinas es IL-13 y en donde dicho receptor híbrido comprende una secuencia de aminoácido que incluye todas las secuencias de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

Preferiblemente dicho receptor es capaz de interacción con una citoquina seleccionada de IL-4, IL-2, IL-5, IL-7, IL-9 y IL-15. La presente invención también proporciona una proteína de fusión que comprende una primera porción capaz de interacción con IL-13, en donde dicha primera porción se codifica por una molécula de ácido nucleico de la invención como se describió aquí anteriormente y una segunda porción derivada de un receptor de hematopoyetina, un receptor tirosina quinasa, un receptor TNF/NGF o una proteína G acoplada al receptor, en donde preferiblemente la segunda porción comprende toda o una proteína funcional de La proteína de unión de IL-13, La cadena \alpha del receptor IL-4, cadena \gamma del receptor IL-4 o un receptor para una citoquina implicada en asma o alergia.

La referencia aquí a una baja exigencia a 42ºC incluye y abarca por lo menos aproximadamente 1% v/v a por lo menos aproximadamente 15% v/v formamida y por lo menos aproximadamente 1M a por lo menos aproximadamente 2M de sal para hibridación, y por lo menos aproximadamente 1 M a por lo menos aproximadamente 2M de sal para condiciones de lavado. Las condiciones exigentes alternativas se pueden aplicar cuando sea necesario, tal como exigencia media, que incluye y abarca por lo menos aproximadamente 16% v/v a por lo menos aproximadamente 30% v/v formamida y de por lo menos aproximadamente 0.5M a por lo menos aproximadamente 0.9M de sal para hibridación, y por lo menos aproximadamente 0.5M a por lo menos aproximadamente 0.9M de sal para condiciones de lavado, o alta exigencia, que incluye y abarca de por lo menos aproximadamente 31% v/v a por lo menos aproximadamente 50% v/v formamida y de por lo menos aproximadamente 0.01 M a por lo menos aproximadamente 0.15M de sal para hibridación,
y por lo menos aproximadamente 0.01 M a por lo menos aproximadamente 0.15M de sal para condiciones de lavado.

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica una cadena \alpha del receptor IL-13, dicha molécula de ácido nucleico tienen una secuencia de nucleótido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:1 o 3 o una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena \alpha del receptor IL-13 estructuralmente similar o un derivado del mismo y que es capaz de hibridar a la secuencia de nucleótido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:1 o 3 o una forma complementaria de la misma bajo bajas condiciones exigentes.

También se describe una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica la cadena \alpha del receptor IL-13 tiene una secuencia de aminoácido sustancialmente como se establece en la SEQ ID NO:2 o 4 o comprende una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos aproximadamente 50% de similitud con la secuencia establecida en la SEQ ID NO:2 o 4 y es capaz de hibridar a la secuencia establecida en la SEQ ID NO:1 o 3 bajo bajas condiciones exigentes.

Las moléculas de ácido nucleico contempladas por la presente invención están generalmente en forma aislada y pueden ser ADN mono o bicatenarios, lineales o de círculo cerrado (por ejemplo ADN genómico), cADN o mARN o combinaciones de los mismos tal como en la forma de híbridos de ADN:ARN. En una realización particularmente preferida, las moléculas de ácido nucleico están en vectores y más preferiblemente los vectores de expresión permiten la expresión en una célula anfitriona adecuada. Particularmente las células anfitrionas útiles incluyen células procarióticas, células de mamífero, células de levadura y células de insecto. Las células también pueden estar en la forma de una estirpe celular.

De acuerdo con lo anterior se proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifican la cadena \alpha del receptor IL-13 como se describió aquí anteriormente, dicho vector de expresión es capaz de la expresión en una célula anfitriona particular.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Preferiblemente, el porcentaje de similitud tao una cualquiera de las SEQ ID NOs 1 a 4 o una parte de la misma es por lo menos aproximadamente 80-85% y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90-95% o más.

El polipéptido recombinante contemplado por la presente invención incluye, por lo tanto, componentes, partes, fragmentos, derivados, homólogos o análogos de la cadena \alpha del receptor IL-13 de acuerdo con las reivindicaciones y es preferiblemente codificada por una secuencia de nucleótido como se establece en la SEQ ID NO:1 o 3 o una molécula que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con todo o parte del mismo o a molécula capaz de hibridar a la secuencia de nucleótido establecida en la SEQ ID NO:1 o 3 o una forma complementaria de la misma bajo condiciones altamente exigentes como se establece en las reivindicaciones. La molécula recombinante se puede glucosilar o no glucosilar. Cuando en forma glucosilada, la glucosilación puede ser sustancialmente la misma como la cadena \alpha del receptor IL-13 de ocurrencia natural o puede ser una forma modificada de glucosilación. Los estados de glucosilación alterados o diferenciales pueden o no afectar la actividad de unión de la cadena \alpha del receptor IL-13.

La cadena recombinante \alpha del receptor IL-13 puede estar en forma soluble o se puede expresar en una superficie celular o conjugar o fusionar a un soporte sólido u otra molécula.

La presente invención contempla adicionalmente un método para producir un polipéptido recombinante de la invención como se estableció aquí anteriormente, dicho método comprende células de cultivo que comprenden las construcciones genéticas de la presente invención durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para expresar la molécula de ácido nucleico en dicha construcción genética para producir un polipéptido recombinante y aislar dicho polipéptido recombinante.

La presente invención se extiende adicionalmente a células de animal aisladas que comprenden la construcción genética de la invención descrita aquí y que expresan los polipéptidos recombinantes mencionados anteriormente producidos por el método descrito anteriormente.

La presente invención como se define en las reivindicaciones abarca análogos químicos de la cadena recombinante \alpha del receptor IL-13.

Como se indicó anteriormente, la presente invención abarca un rango de derivados de NR4. Los derivados incluyen fragmentos, partes, porciones, mutantes, híbridos (que incluyen fusión y moléculas quiméricas), homólogos y análogos del polipéptido NR4 y la secuencia genética correspondiente. En una realización preferida, los derivados unen a IL-13 con alta afinidad. Otros derivados preferidos actúan con agonistas, antagonistas o imitadores. Los derivados también incluyen sustituciones de aminoácido únicas o múltiples, eliminaciones y/o adiciones a NR4 o sustituciones de nucleótido únicas o múltiples, eliminaciones y/o adiciones a la secuencia genética que codifican NR4. Las "adiciones" a las secuencias de aminoácido o las secuencias de nucleótido incluyen fusiones con otros péptidos, polipéptidos o proteínas o fusiones para las secuencias de nucleótido. La referencia aquí a "NR4" incluye referencia a todos los derivados de los mismos que incluyen derivados funcionales o derivados inmunológicamente interactivos "NR4". La presente invención también se extiende a moléculas híbridas, tal como entre NR4 murino o humano o derivados de los mismos. Un híbrido particularmente preferido comprende NR4 y la cadena \alpha del receptor IL-4.

Los análogos de NR4 contemplados aquí incluyen, pero no se limitan a, la modificación a cadenas laterales, que se incorporan de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante síntesis de péptido, polipéptido o proteína y el uso de reticuladores y otros métodos que imponen restricciones conformacionales en la molécula proteinácea o sus análogos.

Ejemplos de modificaciones de cadena lateral contempladas por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino tal como mediante alquilación reductiva mediante reacción con un aldehído seguido por reducción con NaBH4; amidinación con metilacetimidato; acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianato; trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2, 4, 6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS); acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguido por reducción con NaBH4.

El grupo guanidina de residuos arginina se puede modificar mediante la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos tal como 2,3-butanediona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo se puede modificar mediante la activación de carbodiimida por vía de la formación de O-acilisourea seguido por derivación posterior, por ejemplo, a la amida correspondiente.

Los grupos sulfhidrilo se puede modificar mediante métodos tal como carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidacín de ácido perfórmico a ácido cistéico; formación de una mezcla de disulfuros con otros compuestos tiol; reacción con maleimida, anhídrido maleico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercuriales utilizando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromercuri-4-nitrofenol y otros mercuriales; carbamoilación con cianato en pH alcalino.

Los residuos triptofan se pueden modificar mediante, por ejemplo, oxidación con N- bromosuccinimida o alquilación del anillo indol con bromuro 2-hidroxi-5-nitrobencilo o haluros sulfenilo. Los residuos tirosina por otra parte, se pueden alterar mediante nitración con tetranitrometano para formar un derivado 3-nitrotirosina.

La modificación del anillo imidazol de un residuo histidina se puede llevar a cabo mediante alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carbetoxilación con dietilpirocarbonato.

Ejemplos para incorporar aminoácidos no derivados y derivados durante péptido síntesis incluyen, pero no se limitan a, uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, ácido t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienil alanina y/o isómeros D de aminoácidos. Una lista de aminoácidos no naturales, contemplados aquí se muestra en la Tabla 1.

Se pueden utilizar reticuladores, por ejemplo, para estabilizar las conformaciones 3D, utilizando reticuladores homobifuncionales tal como los ésteres imido bifuncionales (CH_{2})_{n} de grupos espaciadores con n=1 a n=6, glutaraldehído, ésteres N-hidroxisuccinimida y reactivos hetero-bifuncionales que contienen usualmente un grupo funcional amino-reactivo tal como N-hidroxisuccinimida y otro grupo funcional específico-reactivo tal como maleimido o grupo funcional ditio (SH) o carbodiimida (COOH).

Adicionalmente, los péptidos se pueden restringir conformacionalmente mediante, por ejemplo, la incorporación de aminoácidos C_{\alpha} y N_{\alpha}-metilo, la introducción de enlaces dobles entre átomos C_{\alpha} y C_{\beta} de aminoácidos y la formación de péptidos cíclicos o análogos al introducir enlaces covalentes tal como formar un enlace amida entre el terminal N y C, entre dos cadenas laterales o entre una cadena lateral y el terminal N o C.

Estos tipos de modificaciones pueden ser importantes para estabilizar NR4 si se administra a un individuo o para uso como un reactivo para diagnóstico.

La presente invención abarca adicionalmente análogos químicos de NR4 capaces de actuar como antagonistas o agonistas de NR4 o que pueden actuar como análogos funcionales de NR4. Los análogos químicos no se pueden derivar necesariamente de NR4 pero puede tener ciertas similitudes conformacionales. Alternativamente, los análogos químicos se pueden diseñar específicamente para imitar ciertas propiedades fisicoquímicas de NR4. Los análogos químicos se pueden sintetizar químicamente o se pueden detectar luego, por ejemplo, detección de producto natural.

La identificación de NR4 permite la generación de un rango de moléculas terapéuticas capaces de modular la expresión de NR4 o modular la actividad de NR4. Tal modulador incluye agonistas y antagonistas de la expresión del gen NR4 o la actividad de la proteína NR4. Los antagonistas de la expresión de gen NR4 incluyen moléculas anticodificantes, ribozimas y moléculas de cosupresión. Los agonistas incluyen moléculas que incrementan la capacidad del promotor o interfiere con mecanismos reguladores negativos. Los agonistas de la proteína NR4 incluyen anticuerpos, ligandos e imitadores. Los antagonistas de NR4 incluyen anticuerpos y fragmentos de péptido inhibidor. Donde una célula co-expresa NR4 y la cadena \alpha del receptor IL-4, agonistas y antagonistas pueden objetivar la cadena \alpha del receptor IL-4.

TABLA 1

1

2

3

Otros derivados abarcados por la presente invención incluyen un rango de variantes de glucosilación de una molécula completamente no glucosilada en una molécula modificada glucosilada. Los patrones de glucosilación alterados pueden resultar de la expresión de moléculas recombinantes en diferentes células anfitrionas.

Los moduladores como se describe aquí se pueden utilizar en un método para modular la expresión del gen NR4 en un humano, dicho método comprende poner en contacto el gen NR4 que codifican NR4 con una cantidad efectiva de un modulador de la expresión NR4 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para aumentar o reducir o de otra forma modular la expresión de NR4. Una molécula de ácido nucleico que codifica NR4 o un derivado del mismo también se puede introducir en una célula para mejorar o alterar las actividades relacionadas NR4 del que célula incluyen reemplazar una secuencia del gen NR4 endógena que puede, por ejemplo, ser defectuosa o llevar una o más mutaciones indeseadas. Por el contrario, las secuencias anticodificantes NR4 (o las secuencias codificantes para co-supresión) tal como oligonucleótidos se pueden introducir en la reducción de actividades relacionadas con NR4 de cualquier célula que expresa el gen NR4 endógeno. También se pueden utilizar ribozimas.

La actividad de NR4 se puede modular en un humano mediante un método que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad efectiva modulada de una molécula durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para incrementar o reducir la actividad de NR4. La molécula puede ser una molécula proteinácea o una entidad química y también puede ser un derivado de NR4 o su ligando o un análogo químico o mutante de truncación de NR4 o su ligando.

Por ejemplo, la IL-13 y IL-4 se han implicado en la modulación de las respuestas inmunes y en la producción de IgE que es el isotipo inmunoglobulina asociado con enfermedades alérgicas o atópicas tal como asma. Las interacciones de modulación entre IL-13/IL-4 y sus receptores puede ser importante en tratar afecciones inflamatorias tal como afecciones alérgicas. Los niveles elevados de IL-4/IL-13 y IgE también son importantes en enfermedades tal como el síndrome nefrótico, vernal y queratoconjuntivitis. Otras enfermedades, el tratamiento el que se contempla aquí incluye asma bronquial, rinitis perenne y dermatitis atópica. Otras afecciones de enfermedad para la que la modulación del receptor IL-13-receptor que puede ser importante incluye aquellas afecciones donde la IL-13 induce la formación de citoquina que a su vez involucra en el inicio, progresión y/o severidad de enfermedades. De forma similar, modular la interacción del receptor IL-4 también puede ser importante para controlar afecciones de enfermedad. Por ejemplo, algunos cánceres se pueden exacerbar mediante la citoquina IL-13 o IL-4 que induce efectos inmunes represivos o moléculas efectoras que a su vez reducen la capacidad del cuerpo de responder al crecimiento de los cánceres.

Para el método descrito anteriormente una composición farmacéutica que comprende NR4 o un derivado del mismo o un modulador de la expresión NR4 o la actividad de NR4 por ejemplo una hemopoyetina del receptor recombinante como se describió aquí anteriormente o un ligando (por ejemplo IL-13) que se une a la porción del mismo o un ligando (por ejemplo IL-13) para la hemopoyetina del receptor recombinante como se describió aquí anteriormente y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables se pueden utilizar. Estos componentes se refieren como los "ingredientes activos".

A este respecto se proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido recombinante como se describió aquí anteriormente y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Tales composiciones se pueden utilizar en un método de tratamiento de un animal que comprende administrar a dicho animal un tratamiento de cantidad efectiva de una hemopoyetina del receptor recombinante como se describió aquí anteriormente o un ligando que une la porción del mismo o un ligando (por ejemplo IL-13) a dicho receptor de hematopoyetina durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para dicho tratamiento por ser sustancialmente afectado o las afecciones a ser sustancialmente aliviadas.

Así en un aspecto adicional la presente invención proporciona un polipéptido recombinante de la invención como se describió aquí anteriormente para uso como un medicamento, preferiblemente para tratar asma, alergia o una afección exarcebada por la producción de IgE.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde es soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión o puede estar en la forma de una crema u otra forma adecuada para aplicación tópica. Esto puede ser estable bajo condiciones de fabricación y almacenamiento y se puede preservar contra la acción contaminante de los microorganismos tal como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), las mezclas adecuadas del mismo, y aceites vegetales. El fluido propio se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como licitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensoactivos. Las prevenciones de la acción de los microorganismos se puede traer aproximadamente por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, tirmerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar por el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan soluciones inyectables estériles al incorporar los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización de filtrado. Generalmente, se preparan dispersiones al incorporar los varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado por vacío y la técnica de secado por congelamiento que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de la solución previamente filtrada estéril del mismo.

Cuando los ingredientes activos se protegen adecuadamente ellos se pueden administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable, o este se puede encerrar en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o se puede comprimir en tabletas, o se puede incorporar directamente con el alimento de la dieta. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y se utiliza en la forma de comprimidos que se pueden ingerir, comprimidos bucales, píldoras, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, wafers, y similares. Tales composiciones y preparaciones deben contener por lo menos 1% en peso del compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, por supuesto, puede variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente 5 a aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad del compuesto activo en tales composiciones terapéuticamente útiles de tal forma que obtendrá la dosificación adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan de tal forma que una dosificación unitaria oral contiene entre aproximadamente 0.1 ug y 2000 mg del compuesto activo.

Los comprimidos, tropastillas, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener los componentes como se lista adelante: un algutinante tal como goma, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tal como fosfato de dicalcio; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y se puede agregar un agente endulzante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente saborizante tal como menta, aceite de alazor, o sabor a cereza. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, esta puede contener, adicionalmente materiales de los anteriores tipos, un portador líquido. Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o de otra forma para modificar la forma física de la dosificación unitaria. Por ejemplo, comprimidos, píldoras, o cápsulas se pueden recubrir con shellac, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como un agente endulzante, metilo y propilparabenos como conservantes, un tinte y saborizante tal como sabor a cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material utilizado para preparar cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente pura y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Adicionalmente, el compuesto activo se puede incorporar en preparaciones de liberación sostenida y formulaciones.

La presente invención también se extiende a formas adecuadas para aplicación tópica tal como cremas, lociones y geles.

Los portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medio de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de retraso isotónicos de absorción y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional o agente es incompatible con el ingrediente activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones terapéuticas. Los ingredientes activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.

Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria para el caso de la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria como se utiliza aquí se refiere a unidades físicamente discreta adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitaria novedosa de la invención se dictan por y son directamente dependientes de (a) las características únicas del material activo y el efecto terapéutico particular a ser alcanzado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de compuesto tal como un material activo para el tratamiento de la enfermedad en seres vivos que tienen una afección de enfermedad en el que la salud corporal se deteriora.

El ingrediente activo principal se compone para la administración conveniente y efectiva en cantidades efectivas con un portador farmacéuticamente aceptable en forma de dosificación unitaria como se describió aquí anteriormente. Una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, pueden contener el compuesto activo principal en cantidades que varían de 0.5 mg a aproximadamente 2000 mg. Se expresa en proporciones, el compuesto activo está generalmente presente en aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 2000 mg/ml del portador. En el caso de composiciones que contienen ingredientes activos complementarios, se determinan las dosificaciones mediante referencia en la dosis usual y la forma de administración de los dichos ingredientes.

La composición farmacéutica también puede comprender moléculas genéticas tal como un vector capaz de transfectar células objetivo donde los portadores de vector de una molécula de ácido nucleico es capaz de modular la expresión NR4 o la actividad de NR4. El vector, por ejemplo, puede ser un vector vírico. Así en un aspecto adicional la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención como se describió aquí anteriormente y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Todavía otro aspecto de la presente invención se dirige a anticuerpos de NR4 y sus derivados de la invención como se describió aquí anteriormente. De acuerdo con lo anterior la presente invención proporciona un anticuerpo específico al polipéptido recombinante de la invención como se describió aquí anteriormente. Tales anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden seleccionar de anticuerpos de ocurrencia natural a NR4 o se pueden elevar específicamente a NR4 o derivados de los mismos. En el caso último, el NR4 o sus derivados primero se pueden necesitar para ser asociados con una molécula portadora. Los anticuerpos y/o NR4 recombinante o sus derivados de la presente invención son particularmente útiles como agentes diagnósticos o terapéuticos. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona adicionalmente anticuerpos de la invención para uso como un medicamento.

Por ejemplo, el NR4 y sus derivados se pueden utilizar para detectar anticuerpos de ocurrencia natural a NR4. Esto puede ocurrir, por ejemplo en algunas enfermedades autoinmunes. Alternativamente, los anticuerpos específicos se pueden utilizar para detectar NR4. La técnica para tales ensayos es bien conocida en el arte e incluyen, por ejemplo, ensayos de emparedado y ELISA. El conocimiento de los niveles NR4 y/o niveles IL-13 puede ser importante para el diagnóstico de ciertos cánceres o una predisposición a cánceres o para monitorear ciertos protocolos terapéuticos. En particular, puede ser importante monitorear una respuesta IgE o niveles de IL-13 o IL-4 o ambos que a su vez tienen un efecto en el sistema inmune.

Los anticuerpos para NR4 de la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales. Alternativamente, los fragmentos de anticuerpos se pueden utilizar tal como fragmentos Fab. Adicionalmente, la presente invención se extiende a anticuerpos sintéticos y recombinantes y a híbridos de anticuerpo. Un "anticuerpo sintético" se considera aquí que incluye fragmentos y híbridos de anticuerpos. Los anticuerpos de este aspecto de la presente invención son particularmente útiles para inmunoterapia y también se pueden utilizar como una herramienta diagnóstica para evaluar receptor o la interacción de ligando-receptor o monitorear el programa de un régimen terapéutico.

Por ejemplo, los anticuerpos específicos se pueden utilizar para detectar las proteínas NR4. Lo último sería importante, por ejemplo, como un medio para detectar niveles de NR4 en un extracto celular u otro fluido biológico o purificar NR4 hecho por medios recombinantes del fluido de sobrenadante de cultivo. Las técnicas para ensayos contemplados aquí se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de emparedado y ELISA.

Está dentro del alcance de esta invención incluir cualesquier segundos anticuerpos (monoclonal, policlonal o fragmentos de anticuerpos o anticuerpos sintéticos) dirigidos a los primeros anticuerpos mencionados discutidos anteriormente. El primer y segundo anticuerpos se pueden utilizar en ensayos de detección o un primer anticuerpo se puede utilizar con un anticuerpo antiinmunoglobulina disponible comercialmente. Un anticuerpo como se contempla aquí incluye cualquier anticuerpo específico a cualquier región de NR4.

Los anticuerpos policlonal y monoclonal son obtenibles mediante inmunización con el receptor y el tipo es utilizable para inmunoensayos. Los métodos para obtener ambos tipos de suero son bien conocidos en la técnica. El suero policlonal es menos preferido pero se prepara relativamente fácil mediante la inyección de un animal de laboratorio adecuado con una cantidad efectiva de NR4, o partes antigénicas del mismo, recolectar suero del animal, y aislar suero específico mediante cualquiera de las técnicas inmunoadsorbentes conocidas. Aunque los anticuerpos producidos por este método son utilizables virtualmente en cualquier tipo de inmunoensayo, existen generalmente menos favores debido a la heterogeneidad potencial del producto.

El uso de anticuerpos monoclonales en un inmunoensayo se prefiere particularmente debido a la capacidad para producirlos en grandes cantidades y la homogeneidad del producto. La preparación de estirpes celulares de hibridoma para la producción de anticuerpo monoclonal derivado al utilizar una estirpe celular inmortal y linfocitos sensibles contra la preparación inmunogénica se puede hacer mediante técnicas bien conocidas por aquellos quienes son expertos en la técnica.

Los anticuerpos como se describe aquí se pueden utilizar en un método para detectar NR4 en una muestra biológica de un sujeto donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra biológica con un anticuerpo específico para NR4 o sus derivados o homólogos durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para un complejo de anticuerpo-NR4 para formar, y luego detectar dicho complejo.

La presencia de NR4 se puede llevar a cabo en un número de formas tal como mediante procedimientos Western blotting y ELISA. Un amplio rango de técnicas de inmunoensayo están disponibles como se puede ver mediante referencia a la Patente Estadounidense Nos. 4,016,043, 4, 424,279 y 4,018,653. Esto, por supuesto, incluye ensayos de sitio único y de dos sitios o "emparedado" de los tipos no competitivos, así como también en los ensayos de unión competitiva tradicional. Estos ensayos también incluyen unión directa de un anticuerpo marcado a un objetivo.

Los ensayos de emparedado están entre los más útiles y los ensayos se utilizan comúnmente y se favorecen para uso en la presente invención. Un número de variaciones de la técnica de ensayo de emparedado existe, y se pueden utilizar. En resumen, en un ensayo de interés típico, se inmoviliza un anticuerpo no marcado en un sustrato sólido y la muestra se prueba en contacto con la molécula unida. Después de un periodo adecuado de incubación, durante un periodo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo específico al antígeno, marcado con una molécula indicadora capaz de producir una señal detectable luego se agrega y se incuba, permitiendo el tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo-antígeno- anticuerpo marcado. Cualquier material que no reacciona se lava, y la presencia del antígeno se determina mediante la observación de una señal producida por la molécula indicadora. Los resultados pueden ser cualitativos, mediante observación simple de la señal visible, o se pueden cuantificar al comparar con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de hapteno. Las variaciones del ensayo de interés incluyen un ensayo simultáneo, en el que la muestra y el anticuerpo marcado se agregan simultáneamente al anticuerpo unido. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, que incluyen cualesquier variaciones menores como será fácilmente evidente. La muestra es una que puede contener NR4 que incluye el extracto celular, la biopsia de tejido o posiblemente suero, saliva, secreciones mucosales, plasma, fluido de tejido y fluido respiratorio. La muestra es, por lo tanto, generalmente una muestra biológica que comprende fluid biológico, extracto celular, médula ósea o plasma, extracto de tejido (por ejemplo de riñón, hígado, bazo, etc.), fluido de fermentación y fluido sobrenadante tal como de un cultivo celular y medio acondicionado celular.

En el ensayo de emparedado de interés típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad para el NR4 o partes antigénicas del mismo, se une covalentemente o pasivamente a una superficie sólida. La superficie sólida es típicamente cristal o un polímero, los polímeros más comúnmente utilizados son celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en la forma de tubos, glóbulos, discos de microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para conducir un inmunoensayo. Los proceso se unión son bien conocidos en la técnica y generalmente consisten de unión covalentemente reticulada o adsorción física, se lava el complejo de polímero-anticuerpo en preparación de la muestra de prueba. Una alícuota de la muestra a ser probada luego se agrega al complejo de fase sólido y se incuba durante un periodo suficiente (por ejemplo 2-40 minutos) y bajo condiciones adecuadas (por ejemplo 25ºC) para permitir la unión de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Luego del periodo de incubación, la fase sólida de subunidad de anticuerpo se lava y se seca y se incuba con un segundo anticuerpo específico para una porción del hapteno. El segundo anticuerpo se une a una molécula indicadora que se utiliza para indicar la unión del segundo anticuerpo al hapteno.

Un método alternativo involucra inmovilizar las moléculas objetivo en la muestra biológica y luego exponer el objetivo inmovilizado al anticuerpo específico que puede o no se puede marcar con una molécula indicadora. Dependiendo de la cantidad de objetivo y la potencia de la señal de la molécula indicadora, un objetivo unido se puede detectar mediante marca directa con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, específico al primer anticuerpo se expone en el complejo de primer anticuerpo-objetivo para formar un complejo terciario de objetivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta mediante la señal emitida por la molécula indicadora.

Mediante "molécula indicadora" como se utiliza en la presente especificación, significa una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección del anticuerpo unido-antígeno. La detección puede ser cualitativa o cuantitativa. Las moléculas reportadas más comúnmente utilizadas en este tipo de ensayo son enzimas, fluoróforos o radionuclidos que contienen moléculas (es decir radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes. En el caso de un inmunoensayo de enzima, se conjuga una enzima al segundo anticuerpo, generalmente mediante por medio de glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, existe una variedad amplia de diferentes técnicas de conjugación, que están fácilmente disponibles por el artesano experto. Las enzimas comúnmente utilizadas incluyen peroxidasa de rábano, oxidasa de glucosa, betagalactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos a ser utilizados con las enzimas específicas se seleccionan generalmente para la producción, luego de hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que producen un producto fluorescente que los sustratos cromogénicos notados anteriormente. En todos los casos, se agrega el anticuerpo marcado de enzima al primer complejo de anticuerpo hapteno, que permite unión, y luego se lava el exceso de reactivo. Una solución que contiene el sustrato apropiado luego se agrega al complejo de anticuerpo-antígeno. El sustrato reaccionará con la enzima ligada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que se puede cuantificar adicionalmente, usualmente espectrofotométricamente, para dar una indicación de la cantidad de hapteno que está presente en la muestra. La "molécula indicadora" también se extiende al uso de la aglutinación celular o la inhibición de aglutinación tal como glóbulos rojos en glóbulos de látex, y similares.

Alternativamente, los compuestos fluorescentes, tal como fluoresceína y rodamina, se pueden acoplar químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de unión. Cuando se activa por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo adsorbe la energía de la luz, que induce un estado de excitabilidad en la molécula, seguido por la emisión de la luz en un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en la EIA, el anticuerpo marcado fluorescente se le permite unir al primer complejo de anticuerpo- hapteno. Después de lavado del reactivo no unido, el complejo terciario restante luego se expone a la luz de la fluorescencia de longitud de onda apropiada indica la presencia del hapteno de interés. Las técnicas de Inmunofluorescencia y EIA se establecen bien en la técnica y se prefieren particularmente por el actual método. Sin embargo, otras moléculas reporteras, tal como radioisótopo, moléculas quimioluminescente o bioluminiscente, también se pueden emplear.

Otra forma de ensayo involucra células capaces de expresar NR4 y la cadena \alpha del receptor IL-4. Por ejemplo, si la cadena \alpha del receptor IL-4 y NR4 se co-expresan en células, tal como células COS, luego la IL-13 une a NR4 con una alta afinidad en la presencia de IL-4.

Aunque no está destinado a limitar la presente invención por una cualquier teoría o modo de acción, cuando NR4 y el receptor IL-4 se expresan en la misma célula, ellos contribuyen a la formación de IL-4 y receptor IL-13. En el caso de IL-4, ocurre unión primero a través de la cadena \alpha del receptor IL-4 y luego el NR4 interactúa con este complejo. En el caso de IL-13, ocurre la unión primero de NR4 y luego la cadena \alpha del receptor IL-4 interactúa con el complejo para formar una alta afinidad receptor capaz de transducción de señal. Las consecuencias de la co-expresión de NR4 y la cadena \alpha del receptor IL-4 es que la IL-4 y 1L-13 puede competir con cada uno para unir a la cadena \alpha del receptor IL-4 y NR4.

Con base en este comportamiento, parecería que cualquier proteína o molécula pequeña que previene la IL-4 o IL-13 forma complejos de superficie de célula que contienen componentes del receptor que pueden ser antagonísticos. Tales moléculas pueden evitar la interacción de la citoquina con su receptor de baja afinidad. Por ejemplo, la IL-13BP soluble puede prevenir la interacción de IL-13 con NR4. De forma similar, la cadena \alpha del receptor IL-4 soluble puede evitar la unión de IL-4 a la superficie celular de la cadena \alpha del receptor IL-4. Estos reactivos serían antagonistas que son específicos para IL-4 o IL-13.

Por extensión, debido a su muy baja afinidad, el NR4 soluble es un antagonista IL-13 muy ineficiente. Si un mutante soluble NR4 se selecciona del que ahora une a IL-4 y también une a IL-13 con alta afinidad, esto sería un antagonista útil de IL-4 y IL-13.

Una alternativa para uso del receptor soluble, es generar un panel de anticuerpos monoclonales para NR4. Si se obtiene un anticuerpo que evita la interacción de NR4 con la cadena \alpha del receptor IL-4, un evento crítico en la formación del receptor IL-4 funcional y el receptor IL-13 funcional, luego de nuevo se inhibe la acción de ambas citoquinas.

Los anticuerpos de la invención que inhiben la interacción de un polipéptido como se describió aquí anteriormente con la cadena \alpha del receptor IL-4 forma aspectos preferidos de la invención.

El nivel de IL-4 en una muestra biológica se puede monitorear mediante un método que comprende incubar dicha muestra biológica con células que expresan NR4 y la cadena \alpha del receptor IL-4 junto con una cantidad efectiva de IL-13 para inhibir competitivamente la IL-4 que une a su receptor y determinar el grado de inhibición competitiva.

En un método relacionado el nivel de IL-13 en una muestra biológica se puede monitorear mediante un método que comprende incubar dicha muestra biológica con células que expresan NR4 y la cadena \alpha del receptor IL-4 junto con una cantidad efectiva de IL-4 para inhibir competitivamente la IL-13 que une a su receptor y determinar el grado de inhibición competitiva.

Preferiblemente, las citoquinas se marcan con una molécula indicadora como se describió anteriormente.

La muestra biológica incluye pero no se limita a sangre, suero, plasma, fluid de tejido, extracto de tejido, plasma, células T o extractos de los mismos, el sobrenadante de cultivo y el medio acondicionado.

El gen NR4 o sus derivados también se pueden detectar mediante ensayos genéticos tal como análisis que involucra PCR. Los métodos alternativos o métodos utilizados en conjunto incluyen secuencia de nucleótido directa o exploración de mutación tal como análisis de polimorfismos de conformación bicatenaria (SSCP) como hibridación de oligonucleótido específica, como métodos tal como pruebas de truncación de proteína directa. Tales pruebas genéticas pueden ser importantes, por ejemplo, en detección genética de animales (por ejemplo humanos) para la ausencia sustancial
o no expresión de la expresión o la expresión de formas mutantes de NR4 que conducen a afecciones de enfermedad.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser ADN o ARN. Cuando la molécula de ácido nucleico está en forma de ADN, este puede ser ADN genómico o cADN. El ARN que forma las moléculas de ácido nucleico de la presente invención es generalmente mRNA.

Aunque las moléculas de ácido nucleico de la presente invención están generalmente en forma aislada, ellas se pueden integrar en o ligar a o de otra forma fusionar o asociar con otras moléculas genéticas tal como moléculas vector y en particular la expresión de moléculas vector. Los vectores y los vectores de expresión son generalmente capaces de replicación y, si es aplicable, la expresión en una o ambas células procarióticas o una célula eucariótica. Preferiblemente, las células procarióticas incluyen E. coli, Bacillus sp y Pseudomonas sp. Las células eucarióticas preferidas incluyen levadura, células de hongos, mamíferos e insectos.

Así, se describe una construcción genética que comprende una porción del vector y una porción de gen de mamífero y más particularmente un NR4 humano, cuya porción de gen NR4 es capaz de codificar un polipéptido NR4 o un derivado funcional o inmunológicamente interactivo del mismo.

Preferiblemente, la porción de gen NR4 de la construcción genética se liga operablemente a un promotor en el vector de tal manera que dicho promotor es capaz de dirigir la expresión de dicha porción de gen NR4 en una célula apropiada.

Adicionalmente, la porción de gen NR4 de la construcción genética puede comprender todo o parte del gen fusionado a otra secuencia genética tal como una secuencia de nucleótido que codifica glutationa-S-transferasa o parte del mismo o una citoquina u otro receptor de hematopoyetina. Las moléculas de receptor híbrido son particularmente útiles en el desarrollo de agentes diagnósticos y terapéuticos multifuncionales.

La presente invención se extiende a tales construcciones genéticas y a células procarióticas y eucarióticas que comprenden las mismas. Así en un aspecto adicional la presente invención proporciona una construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención como se describió aquí anteriormente ligada operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula anfitriona.

La presente invención también se extiende a cualquiera o todos los derivados de NR4 que incluyen mutantes, parte, fragmentos, porciones, homólogos y análogos o su secuencia genética codificante que incluyen nucleótido único o múltiple o las sustituciones de aminoácido, adiciones y/o eliminaciones para el nucleótido de ocurrencia natural o secuencia de aminoácido como se abarca por las reivindicaciones.

El NR4 y su secuencia genética de la presente invención será útil en la generación de un rango de reactivos terapéuticos y diagnósticos y será especialmente útil en la detección de un ligando correspondiente. Por ejemplo, el NR4 recombinante se puede unir o fusionar a una molécula indicadora capaz de producir una señal identificable, que se pone en contacto con una muestra putativamente biológica que contiene un ligando y se detecta para la unión del NR4 marcado al ligando. Alternativamente, el NR4 marcado se puede utilizar para detectar colecciones de expresión de genes de ligando putativos o partes funcionales del mismo.

En otra realización, el NR4 se inmoviliza primero. De acuerdo con esta realización, se proporciona un método que comprende poner en contacto una muestra biológica que contiene un ligando putativo con dicho receptor de hematopoyetina o un ligando que une la porción del mismo inmovilizado en un soporte sólido durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para un complejo que se forma entre dicho receptor y dicho ligando si dicho ligando está presente en dicha muestra biológica, que provoca el ligando de unión y aísla el mismo.

Los polipéptidos solubles NR4 así como también varios híbridos también se contemplan por ser útiles en el tratamiento de la enfermedad, lesión o anormalidad en el sistema nervioso, por ejemplo en relación al sistema nervioso periférico o central para tratar Parálisis Cerebral, parálisis inducida por trauma, isquemia vascular asociada con apoplejía, tumores neuronales, enfermedad motoneurona, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, Esclerosis Múltiple, neuropatías periféricas asociadas con diabetes, toxicidad de metal pesado o alcohol, falla renal y enfermedades infecciosas tal como herpes, rubeola, roseola, viruela del pollo, VIH o HTLV-1. Los polipéptidos NR4 e híbridos también pueden ser importantes para regular la actividad de citoquina y/o hemopoyesis modular. Ellos también son importantes para tratar afecciones alérgicas o atópicas así como también otras afecciones inflamatorias tal como artritis reumatoide.

Como se indicó anteriormente, el NR4 o su ligando o sus derivados funcionales se pueden proporcionar en una composición farmacéutica junto con uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Adicionalmente, se describe aquí un método de tratamiento que comprende la administración de una cantidad efectiva de NR4. Los antagonistas y agonistas de NR4 y/o su ligando se pueden utilizar en composiciones terapéuticas y metodologías.

El NR4 o sus derivados funcionales se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de afecciones mediadas por NR4 defectuosas o deficientes.

La presente invención se describe adicionalmente mediante las siguientes Figuras y Ejemplos no limitantes.

En las Figuras:

La Figura 1 es una representación de la secuencia de nucleótido [SEQ ID NO:1] y de aminoácido predicha [SEQ ID NO:2] de NR4 murino. La región no traducida se muestra en el caso menor y la región traducida en el caso superior. Se emplea código de una letra convencional para aminoácidos, se destacan los sitios de glucosilación ligados a asparagina potencial y los residuos cisterna conservados y el motivo WSXWS [SEQ ID NO: 9] de los miembros de la familia del receptor de hematopoyetina se muestran en negrilla. La secuencia de señal predicha se destaca en negrilla aunque el dominio de transmembrana se destaca con guiones. La secuencia mostrada es un compuesto derivado del análisis de 8 clones de cADN derivados de 3 colecciones. El extremo 5 de la secuencia (nucleótidos -60 tao 351) se deriva de un clon de cADN único pero también está presente en clones de ADN genómico que se han aislado. La región de casilla del dominio del receptor de hematopoyetina típico, aminoácidos 118-340.

La Figura 2 es una representación fotográfica que muestra análisis northern de la expresión de mARN de NR4 de murino se selecciona de tejidos y órganos.

La Figura 3 es una representación gráfica que describe isotermos de saturación de la unión de 125I-IL-13 y 125I-IL-4; isotermos de saturación descritos como gráficas Scatchard de IL-4 (s) y IL-13 (\bullet) une a (A) células COS que expresan la IL-13R\alpha (NR4), (B) células CTLL y (C) células CTLL que expresan la IL-13R\alpha (NR4). Los datos se han normalizado para 1x10^{4} Células COS y 1x10^{6} células CTLL y la unión se lleva a cabo en hielo durante 2 a 4 horas.

La Figura 4 es una representación gráfica que muestra la especificidad de la unión de IL-4 y IL-13; la capacidad de IL-4 (s) y IL-13 (\bullet) para competir por 125I-IL-13 une a (A) células COS que expresan la IL-13R\alpha (NR4) y (C) las células CTLL que expresan la IL-13R\alpha (NR4) o para competir por ^{125}I-IL-4 que une a (B) células CTLL y (D) células CTLL que expresan la IL-13R\alpha (NR4). La unión se lleva a cabo a 4ºC durante 2 a 4 horas y los datos se expresan como un porcentaje de la unión específica observada en la ausencia de un competidor (\Delta).

La Figura 5 es una representación gráfica que muestra factor dependiente de la proliferación de células que expresan NR4. Se incuban dos mil (A) células CTLL o (B) células CTLL que expresan la IL-13R\alpha (NR4) en la ausencia de citoquina o con varias concentraciones de IL-2 (h), IL-4 (s) o IL-13 (\bullet). Después de 48 horas se cuentan células viables y los datos se expresan como un porcentaje del número de células viables observadas con una concentración máxima de IL-2.

La Figura 6 es una representación fotográfica que muestra la conservación de especies cruzadas del gen NR4 (IL-13R\alpha).

La Figura 7 es una representación del nucleótido y la secuencia de aminoácido correspondiente de genes de NR4 murino y humano (IL-13R\alpha). La secuencia de nucleótido y aminoácido predicha de humano (H) y murino (M) LL-13R\alpha (NR4) se alinean a ojo, con espacios (-) insertados para optimizar la alienación. La numeración es para el clon de murino, los nucleótidos que forman parte de la región codificante se muestran en el caso superior, mientras que aquellas de las regiones no traducidas se muestran en el caso menor. Los aminoácidos idénticos entre las proteínas de murino y humano predichas se indican por (*). EL ADN que codifica la secuencia de señal de murino se destaca, con A26 o T27 que es el primer aminoácido predicho de la proteína madura.

La Figura 8 es una representación fotográfica que muestra ^{125}I-IL-13 ligado cruzadamente a NR4 soluble. Línea: ^{125}I-IL-13 (100,000 cpm) + 2 mg/ml NR4 soluble; Línea 2: ^{125}I-IL-13 (100,000 cpm) + 2 mg/ml de NR4 soluble en la presencia de exceso de IL-13 no marcado; Línea 3: ^{125}I-IL-13 (100,000 cpm) + 2 mg/ml de NR4 soluble en la presencia de exceso de IL-4 no marcado.

La Figura 9 es una representación fotográfica de inmunoprecipitación mediante suero anti-policlonal NR4 de ^{125}IIL-13 reticulado con IL-13R\alpha (NR4). Líneas 9-11: IL-13R\alpha soluble (30 ml de 3 mg/ml) reticulado a ^{125}I-IL-13 (750,000 cpm) y se inmunoprecipita con suero de conejo de control, o con antisuero anti-policlonal NR4 en la presencia o ausencia de 100 mg/ml de péptido FLAG, respectivamente; Líneas 12-14: IL-13R\alpha soluble (NR4) (30 ml de 3 mg/ml) reticulado a ^{125}IIL-13 (750,000 cpm) en la presencia de 0.5 mg/ml de IL-13 no marcado y se inmunoprecipita con un anticuerpo policlonal anti-IL-13R\alpha (NR4) también en la presencia o ausencia de 100 mg/ml del péptido FLAG, respectivamente.

La Figura 10 es una representación de la secuencia de aminoácido de Terminal N de murino NR4. [SEQ ID NOs:10 y 11].

\newpage

Las siguientes abreviaturas de una y tres letras para los residuos de aminoácido se utilizan en la especificación:

4

Ejemplo 1 Aislamiento de cADN y cADN genómico que codifican NR4

El ADN genómico digerido de ApoI, se extrae de una estirpe celular de tallo embriónico, se clona en el bacteriófago \lambdaZAPII (Stratagene, LaJolla, CA). Aproximadamente 10^{6} placas de esta colección se detectan con un oligonucleótido marcado 32P que corresponde a la secuencia Trp-Ser-Asp-Trp-Ser (16). Los clones hibridados positivamente se secuencian utilizando una secuencia de ADN automatizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Un clon parece codificar parte de un nuevo miembro de la familia del receptor de hematopoyetina. Se diseñan oligonucleótidos en la base de esta secuencia de ADN genómico y se utilizan en la forma convencional para aislar clones de macrófago peritoneal de ratón (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), piel de ratón, pulmón de ratón, hígado de ratón, y WEHI-3B (Stratagene, LaJolla, CA) colecciones de cADN de bacteriófago \lambda.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Construcción de los vectores de expresión y transfección de células

Utilizando PCR, un derivado del cADN NR4 se genera que codifica la secuencia de señal IL-3 [SEQ ID NO:5] y una etiqueta de epítopo FLAG de Terminal N [SEQ ID NO:6] que precede la región codificante madura de NR4 (Thr27 a Pro424; Figura 1). El producto PCR se clona en el vector de expresión de mamífero pEF-BOS (17). Se secuencian construcciones en su técnica completa para uso. Se transfectan células y se seleccionan como se describió previamente (16, 18).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Northern blots

Se desarrollan Northern blots como se describió previamente (16). La fuente de sondas de hibridación es como sigue: NR4 - un producto PCR de nucleótido 32 a 984 (Figura 1) y GAPDH - un fragmento de cADN que abarca los nucleótidos (19).

Ejemplo 4 Citoquinas y experimentos utilizando citoquinas radioyodinadas

Se obtienen IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 y IL-15 comercialmente (R & D Systems, Minneapolis MN). Para radioyodinación, se disuelven citoquinas en una concentración de 100 mg/ml en 10 mM de fosfato de sodio, 150 mM NaCl (PBS), 0.02% v/v Tween 20 y 0.02% p/v de azida de sodio a pH 7.4. Una cantidad de 2 mg de IL-13 se radioyodina utilizando el método de monocloruro de yodo (20, 21), aunque 2 mg de IL-4 se radioetiqueta utilizando reactivo di-iodo-Bolton-Hunter (16). Los estudios de unión y la determinación de la radioactividad específica y se desarrolla el ligado de citoquinas marcadas como se describió previamente (2).

Para experimentos de reticulación, se produce IL-13 de murino recombinante como una proteína etiquetada FLAG en Pichia pastoris.

Para ensayos de reticulación, las alícuotas de IL-13R\alpha soluble purificado (NR4) se incuban con 125I-IL-13 en la presencia o ausencia de un competidor en un volumen final de 20 ml durante por lo menos 30 min a 40ºC luego 5 ml de una solución al 12 mM de BS3 (Bis (Sulfosuccimidil) suberato) en PBS que contiene 0.02% v/v Tween-20 se agrega y las mezclas se incuban durante 30 min a 4ºC. Se mezclan muestras con 8 ml de 4XSDS de amortiguador de mezcla y se analiza por 13% p/v de SDS-PAGE bajo condiciones de no reducción. Se secan geles y se visualizan mediante autoradiografía o con un PhosphoImager.

Ejemplo 5 Ensayos de proliferación

La proliferación de células Ba/F3 y CTLL en respuesta a las citoquinas se miden en placas de Lux 60 micropozos HL-A (Nunc Inc. IL, USA). Se lavan células tres veces en DMEM que contienen 20% v/v de suero de becerro recién nacido y se resuspenden en una concentración de 2 x 10^{4} células por ml en el mismo medio. Las alícuotas de 10 ml de la suspensión celular se colocan en pozos de cultivo con 5 ml de varias concentraciones de citoquinas recombinantes purificadas. Después de 2 días de incubación a 37ºC en un incubador completamente humidificado que contiene 10% v/v CO_{2} en aire, se cuentan células viables utilizando un microscopio invertido.

Ejemplo 6 Clonación y Caracterización de NR4 Murino

Se construye una colección en \lambdaZAP II utilizando ADN genómico digerido de ApoI de células de tallo embriónico y se detectan con un grupo de oligonucleótidos marcados 32P que codifican la secuencia de aminoácido Trp-Ser-Asp-Trp-Ser encontrada en muchos miembros de la familia del receptor de hematopoyetina. Un clon de bacteriófago hibridado se encuentra que contiene una secuencia que parece codificar parte de un miembro novedoso de la familia del receptor de hematopoyetina. Este receptor se da el nombre operacional NR4. La secuencia del clon genómico se utiliza para aislar cADN que codifican NR4 de célula WEHI-3B, macrófago peritoneal, médula ósea, colecciones de piel y riñón. Un compuesto de la secuencia de nucleótido [SEQ ID NO:1] y la secuencia de aminoácido predicha [SEQ ID NO:2] de estos cADN se muestra en la Figura 1. El cADN NR4 se predice que codifica una proteína de 424 residuos de aminoácido, que contienen una secuencia de señal putativa y dominio de transmembrana. La región extracelular de la proteína contiene un dominio similar a inmunoglobulina (aminoácidos 27-117), adicionalmente en un dominio del receptor de hematopoyetina típico (aminoácidos 118-340) que incluye cuatro residuos cisterna conservados y el motivo Trp-Ser-Asp-Trp-Ser característico [SEQ ID NO: 12] (Figura 1; en negrilla como WSXWS).La cola citoplásmica del nuevo receptor ess 60 aminoácidos en longitud.

Ejemplo 7 El patrón de expresión de cADN NR4

El patrón de expresión de mARN de NR4 mARN se examina mediante análisis Northern. Se detectan dos especies hibridadas de 5.2 y 2.2 kb en longitud en mARN de más tejidos (Figura 2). El mARN de NR4 mARN no es detectable en el músculo esquelético (Figura 2). La Figura 8 muestra la expresión de NR4 en tejidos de ratón.

Ejemplo 8 El NR4 codifica la cadena \alpha del receptor IL-13 (IL-13R\alpha) - de una subunidad de unión específico del receptor IL-13

La masa molecular evidente es de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000 daltons y más particularmente aproximadamente 55,000 a aproximadamente 65,000 daltons para NR4 se expresa en células COS estimado de Western blots utilizando un anticuerpo anti-FLAG. Esto sugiere que el NR4 puede codificar la subunidad de unión del receptor IL-13 con el fin de probar su posibilidad, el NR4 se expresa en células COS. Las células no transfectadas COS expresan relativamente bajos niveles del IL-4 y Receptor IL-13 luego de transfección con un plásmido que contiene el cADN de NR4, el número del receptor IL-13 pero no de los receptores IL-4 que se expresa por células COS se incrementa dramáticamente (Figura 3A; 100,000 a 500,000 receptores por célula). La afinidad de IL-13 para NR4 expresada por células COS es baja (KD-2-10 nM) y la unión es específica ya que esta puede competir con IL-13 no marcado (Figura 4A) pero no con otras citoquinas que incluyen IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 o IL-15. Estos resultados sugieren que el NR4 es la cadena \alpha del receptor IL-13 (IL-13R\alpha).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Los componentes IL-13R\alpha (NR4) y IL-4R\alpha se comparten los receptores IL-4 y IL-13

Con el fin de investigar la relación entre el receptor IL-4 y IL-13, se examina la estirpe celular CTLL que responde a IL-4. Las células CTLL progenitoras expresan una clase única del receptor IL-4 (K_{D}-660 pM; -3600 receptores por célula) pero no el receptor detectable IL-13 (Figura 3B). El receptor IL-4 se expresa por células CTLL que parecen ser específicas ya que la unión de 125I-IL-4 puede competir con IL-4 no marcado pero no con IL-13 (Figura 4B). Luego de la expresión del IL-13R\alpha (NR4) en células CTLL no se observa cambio en el número o afinidad de los receptores IL-4, aunque se detecta una única clase de receptores de alta afinidad IL-13 (Figura 3C; K_{D}-75 pM; 1350 receptores por célula). La afinidad de IL-13 para la IL-13R\alpha (NR4) que se expresa en células CTLL es mayor que en células COS, que sugieren que el formador expresa una proteína capaz de interactuar con la IL-13R\alpha (NR4) para incrementar la afinidad de IL-13. Un candidato similar con base en estudios previos es la IL-4R\alpha. Con el fin de explorar esta posibilidad se evalúa la capacidad de IL-4 para competir con ^{125}I-IL-13 para unir a células CTLL que expresan la IL-13R\alpha (NR4). La Figura 4B muestra que IL-4 y IL-13 son igualmente efectivos en competir con la unión de ^{125}I-IL-13 (IC_{50} - 300 pM; Figura 4C) y, adicionalmente, son capaces de competir con ^{125}I-IL-4 para unión (IC_{50} - 300 pm;
Figura 4D).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Expresión del IL-13R\alpha (NR4) si es necesario para transducción de una señal proliferativa por IL-13

Las células CTLL requieren la adición de citoquinas exógenas para la supervivencia y proliferación. Se encuentra que la IL-2 es un estímulo proliferativo potente para células CTLL (EC_{50} - 100-200 pM), aunque la IL-4 es relativamente débil (EC_{50} 2-7 nM) y la IL-13 es inactivo (Figura 5A). La expresión del IL-13R\alpha (NR4) en células CTLL resulta en la capacidad de sobrevivir y proliferar débilmente en respuesta a IL-13 (EC_{50} - 700 pM) y para proliferar algo más fuerte que las células progenitoras en respuesta a IL-4 (EC_{50} - 700 pM; Figura 5B).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Clonación de la IL-13R\alpha humano (NR4)

Con el fin de determinar si los genes homólogos de IL-13R\alpha murino (NR4) existen en otras especies de vertebrados, una sonda abarca nucleótidos 840 a 1270 de IL-13R\alpha murino (NR4) se hibrida a EcoRI digerido de ADN genómico de varias especies. Se lleva a cabo hibridación en 500 mM de Na_{2}HPO_{4} (-5xSSC) a 50ºC durante la noche. El filtro se lava en 40 mM de Na_{2}HPO_{4} (-0.2xSSC) a 50ºC durante 2 horas y se expone a película autoradiográfica durante 48 horas. La Figura 6 ilustra que relativamente pocas bandas de hibridación (1 a 5) se observan en ADN genómico de varias especies, que incluyen humano. Esto sugiere que es fácil clonar la IL-13R\alpha humano (NR4) utilizando una sonda de cADN de murino. Una colección de clones de cADN de médula ósea de humano en el bacteriófago \lambdaZAPII por lo tanto se detecta con dos sondas (nucleótidos 82-840 y 840 a 1270) del cADN IL-13R\alpha de murino (NR4). Se lleva a cabo hibridación durante la noche en 6xSSC, 0.1% p/v SDS a 42ºC. Los filtros se lavan a 2xSSC, 0.1% p/v SDS a 50ºC durante 2 horas y se exponen durante 48 horas para película autoradiográficas. Las placas que hibridan a sondas de murino IL-13R\alpha (NR4) se recolectan y se purifican en la forma convencional. Los insertos de cADN que forma el bacteriófago de hibridación se cortan en el plásmido pBluescript y se secuencian completamente utilizando un secuenciador automatizado ABI. La Figura 7 muestra un compuesto de la secuencia de los clones aislados y revela que los clones codifican una proteína que comparte un alto grado de similitud de secuencia con murino IL-13R\alpha (NR4). Los clones codifican la región codificante completa de la proteína. El alto grado de similitud de secuencia (320/425 aminoácidos - 75%) predice que este cADN es el homólogo humano del IL-13R\alpha de murino (NR4). La secuencia de nucleótido se representa como SEQ ID NO:3 y la secuencia de aminoácido es SEQ ID NO:4.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 El IL-13R\alpha de murino soluble (NR4) une a IL-13

Se construyen por ingeniería construcciones para expresar versiones solubles de NR4 con un epítopo "FLAG" de Terminal N (International Biotechnologies/Eastman Kodak, New Haven CT). Primero, un derivado del vector de expresión pEF-BOS de mamífero se gen era ya que este contiene ADN que codifica la secuencia de señal de IL-3 de murino (MVLASSTTSIHTMLLLLLMLFHLGLQASIS [SEQ ID NO:5]) y el epítopo FLAG (DYKDDDDK [SEQ ID NO:6]), seguido por un sitio de clonación XbaI único. Este vector se llama pEF/IL3SIG/FLAG. La parte extracelular madura que codifica NR4 (Thr27 a Thr344) se genera por PCR utilizando los cebadores 1478 y 1480. El producto resultante se digiere con XbaI y se clona en el sitio XbaI de pEF/IL3SIG/FLAG para dar pEF/IL3SIG/FLAG/sol NR4. La identidad de la construcción se confirma por el secuenciamiento dideoxi.

	OLIGO 1478	5' AGCTTCTAGAACAGAAGTTCAGCCACCTGTG 3'	[SEQ ID NO:7];
	OLIGO 1480	5' AACTCCACCTTCTACACCACCTGATCTAGA 3'	[SEQ ID NO:8].

Después de transfección en células CHO, expresado, el NR4 soluble se purifica del medio acondicionado de célula CHO en una columna de afinidad de anticuerpo anti-FLAG (M2) mediante elución con el péptido FLAG libre (Science Imaging Systems).

Consistente con la baja afinidad del IL-13 para NR4 expresado por células COS, se purifica NR4 soluble que parece incapaz de unir a IL-13 como se evalúa por la cromatografía de filtración de gel. Sin embargo, utilizando ensayos de reticulación, se demuestra la capacidad del IL-13R\alpha soluble (NR4) para unir IL-13 (Figura 8, línea 1). Esta interacción compite para la IL-13 no marcado pero no por la IL-4 no marcado (Figura 8, líneas 2 y 3).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13 Un Antisuerpo Policlonal para IL-13R\alpha Soluble (NR4)

Un antisuero policlonal para NR4 se prepara al inyectar NR4 soluble purificado en conejos que se sangran después de 3 meses. Este antisuero inmunoprecipitado del producto reticulado de 125I-IL-13 con NR4 soluble (Figura 9, línea 11) aunque no se observa inmunoprecipitación con suero pre- inmune (Figura 9, línea 9). No se inhibe inmunosupresión del complejo mediante el péptido FLAG (Figura 9, línea 10).

Se conduce ensayo de inmunoprecipitación como sigue:

Se terminan las reacciones reticuladas mediante la adición de Tris-HCl, pH 7.5, en una concentración final de 40 mM. Las muestras luego se mezclan con 1:50 diluido con suero de conejo control o anti-suero NR4 que se ha preincubado con o sin el péptido FLAG. Después de incubación durante 30 min a 4ºC, las mezclas se agregan a 40 ml de 50% v/v de suspensión de gel de G-Sefarosa de proteína (Pharmacia) y se incuba durante 30 min a 4ºC. Las muestras se centrifugan y los glóbulos de proteína G se lavan 3 x 0.5 ml PBS, se mezclan con 40 ml de 2X amortiguador de muestra SDS-PAGE concentrado y se calientan durante 2 min a 95ºC. Se analizan sobrenadantes mediante 13% p/v SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14 Secuencia de Aminoácido de Terminal N de NR4

La secuencia de aminoácido de Terminal N de NR4 se determina y se muestra en La Figura 10.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15 Ensayo para IL-13

la IL-13 es una citoquina que se implica en la producción de IgE, el isotipo de inmunoglobulina es importante en enfermedades alérgicas tal como asma. Monitorear los niveles de IL-13, por lo tanto, puede ser un diagnóstico importante. Ya que la IL-4 y IL-13 tienen muchos efectos biológicos, generando un ensayo que discrimina estas citoquinas es también importante.

El NR4 se expresa en células COS que une 125I-IL-13. Esta unión se inhibe en una forma dependiente de dosis mediante IL-13 no marcado, en la presencia de una gran cantidad de proteína irrelevante tal como suero de becerro o suero de humano. La IL-4 no muestra capacidad de competir para la unión de ^{125}I-IL-13 en esta situación y, por lo tanto, este ensayo parece ser específico para IL-13.

El ensayo se establece mediante recubrimiento de NR4 soluble en placas ELISA y utilizando, por ejemplo, IL-13 marcado fluorescente como la sonda. La presencia del IL-13 no marcado en una muestra de prueba luego registra como una reducción en la señal fluorescente.

Se establecen ensayos similares que miden IL-4 y IL-13 al utilizar células que expresan NR4 y la cadena \alpha del receptor IL-4. Estos incluyen células CTLL que expresan normalmente la cadena \alpha del receptor IL-4 y que se construyen por ingeniería para expresar NR4. La unión de ^{125}I-IL-13 o ^{125}I- IL-4 se puede inhibir mediante formas no marcadas de IL-4 y IL-13.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16 Modificaciones para IL-4 y IL-13

Se introducen mutaciones en regiones de las moléculas que se predicen son funcionalmente importantes. En el caso de NR4, esto incluye la región que interactúa con IL-13, la región que interactúa con la cadena \alpha del receptor IL-4 o la región que interactúa con IL-4 cuando esta citoquina se une a la cadena \alpha del receptor IL-4. Estas regiones se determinan mediante experimento directo, por ejemplo, al resolver la estructura de NR4 o complejos de NR4 con otras proteínas como IL-4, IL-13 y la cadena \alpha del receptor IL-4 o al modelar estas proteínas en proteínas similares para las que existe información estructural, por ejemplo, el crecimiento del complejo de receptor de hormona/crecimiento de hormona. Los mutantes NR4 resultantes luego se prueban individualmente para función mejorada.

En un método alternativo, se generan mutaciones aleatorias en las moléculas. Las técnicas adecuadas incluyen síntesis de cADN de NR4 utilizando condiciones de reacción y polimerasa que promueven la incorporación del dNTP incorrecto y uso de una técnica llamada mezcla de ADN (23, 24, 25, 26).

Después de generar mutantes aleatorios del cADN de interés, se seleccionan mutantes potencialmente útiles. En el caso de NR4, un ensayo es con base en el conocimiento que si el NR4 se expresa en células que carecen de la cadena \alpha del receptor IL-4 (por ejemplo células COS), luego se obtienen células que no se pueden unir a IL-4 con cualquier afinidad detectable y se une a IL-13 con baja afinidad. Así, si las células COS se transfectan con Nr4 y permiten la unión de IL-4 conjugado con FITC y IL-13 conjugado con ficoeritrina, el ligando no unido se lava, la IL-4 no se unirá y cualquier IL-13 que se ha unido se disociaría durante el lavado.

Si estas células se clasifican FACS, luego el título o sin señal en el canal FITC o PE se obtendría. Las células COS se transfectan con 10^{6} a 10^{7} mutantes aleatorios de NR4 y se procesan para unión. Cualesquier células clasificadas que unen las citoquinas mejor que aquellas transfectadas con NR4 tipo intacto se pueden clasificar FACS. Los plásmidos que contienen estos cADN "mejorados" de NR4 se pueden recuperar, se expanden en E. coli y se utilizan de nuevo en células COS para confirmar el mejoramiento. Cualesquier mutantes que son consistentemente mejores se pueden utilizar luego para la introducción de cambios aleatorios adicionales en un orden para obtener moléculas aún mejores. Este proceso iterativo se puede repetir varias veces.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita aquí es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a aquellas específicamente descritas. Se entiende que la invención incluye todas tales variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos referidos a o indicados en esta especificación, individualmente o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera dos o más de dichas etapas o características.

\vskip1.000000\baselineskip

Bibliografía

1. Du, X.X. y Williams, D.A. (1994) Blood 83: 2023-2030.

2. Yang, Y.C. y Yin, T. (1992) Biofactors 4: 15-21.

3. Paul, S.R., Bennett, F., Calvetti, J.A., Kelleher, K., Wood, C.R., O'Hara, R.J.J., Leary, A.C., Sibley, B., Clark, S.C., Williams, D.A. y Yang, Y.-C. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 7512.

4. Musashi, M., Clark, S.C., Sudo, T., Urdal, D.L., y Ogawa, M. (1991) Blood 78: 1448-1451.

5. Schibler, K.R., Yang, Y.C. y Christensen, R.D. (1992) Blood 80: 900-3.

6. Tsuji, K., Lyman, S.D., Sudo, T., Clark, S.C., y Ogawa, M. (1992) Blood 79: 2855-60.

7. Burstein, S.A., Mei, R.L., Henthorn, J., Friese, P. y Turner, K. (1992) J. Cell. Physiol. 153: 305-12.

8. Hangoc, G., Yin, T., Cooper, S., Schendel, P., Yang, Y.C. y Broxmeyer, H.E. (1993) Blood 81: 965-72.

9. Teramura, M., Kobayashi, S., Hoshino, S., Oshimi, K. y Mizoguchi, H. (1992) Blood 79: 327-31.

10. Yonemura, Y., Kawakita, M., Masuda, T., Fujimoto, K., Kato, K. y Takatsuki, K. (1992) Exp. Hematol. 20: 1011-6.

11. Baumann, H. y Schendel, P. (1991) J. Biol. Chem. 266: 20424-7.

12. Kawashima, I., Ohsumi, J., Mita-Honjo, K., Shimoda-Takano, K., Ishikawa, H., Sakakibara, S., Miyadai, K. y Takiguchi, Y. (1991) Febs. Lett. 283: 199-202.

13. Keller, D.C., Du, X.X., Srour, E.f., Hoffman, R. y Williams, D.A. (1993) Blood 82: 1428-35.

14. McKenzie, A.N.J. y Zurawski, G. (1994) Guidebood to cytokines and their receptors, Oxford University Press. Oxford.

15. Zurawski, G. y de Vries, J.E. (1994) Immunol. Today 15: 19-26.

16. Hilton, D.J., Hilton, A.A., Raicevic, A., Rakar, S., Harrison-Smith, M., Gough, N.M., Begley, C.G., Metcalf, D., Nicola, N.A. y Wilson, T.A. (1994) EMBO J. 13: 4765-4775.

17. Mizushima, S. y Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 5322.

18. Lock, P., Metcalf, D. y Nicola, N.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 252-256.

19. Dugaiczyk, A. et al (1983) Biochemistry 22: 1605-1613.

20. Contreras, M.A., Bale, W.F. y Spar, I.L. (1983) Methods in Enzymol. 92: 277-292.

21. Hilton, D.J. y Nicola, N.A. (1992) J. Biol. Chem. 267: 10238-10247.

22. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

23. Stemmer, W.P.C., (1994) Nature 370: 389-391.

24. Stemmer, W.P.C., (1995) Biotechnology 13: 549-553.

25. Gassmann et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1292-1296.

26. Grameri et al (1996) Nature Biotechnology 14: 315-319.

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Operaciones AMRAD Pty Ltd (todos los Estados excepto US)

\hskip1cm Willson (Solo Estados Unidos), Tracey

\hskip1cm Nicola (Solo Estados Unidos), Nicos

\hskip1cm Hilton (Solo Estados Unidos),

\hskip1cm Douglas Metcalf (Solo Estados Unidos),

\hskip1cm Donald Zhang (Solo Estados Unidos), Jian

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Un receptor de hematopoyetina novedoso y secuencias genéticas que lo codifican

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 42.68173.ej

\vskip0.400000\baselineskip

<140> EP 96934193.2

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1996-10-23

\vskip0.400000\baselineskip

<150> AU PN6135

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1995-10-23

\vskip0.400000\baselineskip

<150> AU PN7276 5

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1995-12-22

\vskip0.400000\baselineskip

<150> AU PP2208

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1996-09-09

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.1 0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1680

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (61)..(1332)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm6

\hskip1cm7

\hskip1cm8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 424

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\hskip1cm9

\hskip1cm10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1383

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (61)..(1338)

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm11

\hskip1cm12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm13

\hskip1cm14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de señal de murino IL-3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Etiqueta de epítopo FLAG de Terminal N

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligo 1478 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcttctaga acagaagttc agccacctgt g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligo 1480 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactccacct tctacaccac ctgatctaga

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> motivo NR4

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X puede ser cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácido de Terminal N de mNR4 (principal)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X puede ser cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de aminoácido de Terminal N mNR4 (menor)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MISC_FEATURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)..(24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X puede ser cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> desconocido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> motivo de péptido encontrado en muchos miembros de la familia del receptor de hematopoyetina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm20

Claims (32)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria con una secuencia que codifica un polipéptido, dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácido

(i)

como se establece en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido; o

(ii)

que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia en (i); o dicha secuencia de nucleótidos tienen una secuencia de nucleótido

(iii)

como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o una parte de la misma que comprende la secuencia de dicha secuencia de nucleótido que codifica la porción de unión de IL-13; o

(iv)

que tiene por lo menos aproximadamente 70% de similitud con una secuencia in (iii), o

(v)

es capaz de hibridar a la secuencia de nucleótido como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o una forma complementaria de la misma bajo condiciones altamente exigentes, utilizando de por lo menos 31% v/v a por lo menos 50% v/v de formamida y de por lo menos 0.01M a por lo menos 0.15M de sal para hibridación, y por lo menos 0.01M a por lo menos 0.15M para lavado, o

(vi)

que es una secuencia complementaria de una secuencia de (iii) a (v), en donde dicho polipéptido es capaz de interacción con IL-13.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en la reivindicación 1 en donde dicha secuencia de (v) comprende una secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 70% de similitud con la secuencia establecida en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 que codifica un receptor de hematopoyetina capaz de interacción con IL-13, cuya interacción es capaz de inhibición competitiva mediante IL-4 en células que expresan una cadena \alpha del receptor IL-4.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el polipéptido codificado está en la forma de una proteína de fusión.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el polipéptido codificado está en una forma soluble.

6. Una molécula de ácido nucleico aislada como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el polipéptido codificado es una cadena \alpha del receptor IL-13 madura o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

7. Una construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ligada operablemente a un promotor capaz de dirigir la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula anfitriona.

8. Un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en las secuencias (i) o (ii) en la reivindicación 1 o codificada por una secuencia de nucleótido como se define en las secuencias (iii) o (iv) en la reivindicación 1 o una secuencia complementaria de la misma, dicho polipéptido es capaz de interacción con IL-13.

9. Un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 en donde la interacción con IL-13 se inhibe competitivamente mediante IL-4 en células que expresan una cadena \alpha del receptor IL-4.

10. Un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 en donde la interacción con IL-13 es con baja afinidad.

11. Un polipéptido recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 en donde la interacción con IL-13 es con medio a alta afinidad.

12. Un polipéptido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en donde dicho polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 70,000 daltons como se determina por Análisis Western blot cuando se expresa en células COS.

13. Un polipéptido recombinante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en donde dicho polipéptido está en la forma de una proteína de fusión.

14. Un polipéptido recombinante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en donde dicho polipéptido está en una forma soluble.

15. Un polipéptido recombinante como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 en donde dicho polipéptido es una cadena \alpha del receptor IL-13 madura o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

16. Un anticuerpo específico al polipéptido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.

17. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16 en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

18. Un receptor híbrido de hemopoyetina capaz de interacción con por lo menos dos citoquinas en donde por lo menos una de dichas citoquinas es IL-13 y en donde dicho receptor híbrido comprende una secuencia de aminoácido que incluye todas las secuencias de aminoácido establecidas en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de las mismas que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

19. Un receptor híbrido de hemopoyetina capaz de interacción de alta afinidad con por lo menos una citoquina en donde por lo menos una de dichas citoquinas es IL-13 y en donde dicho receptor híbrido comprende una secuencia de aminoácido que incluye todas las secuencias de aminoácido establecida en la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o una parte de la misma que comprende la porción de unión de IL-13 de dicha secuencia de aminoácido.

20. Un receptor híbrido de hemopoyetina de acuerdo con la reivindicación 18 o 19 capaz de interacción con IL-4.

21. Un receptor híbrido de hemopoyetina de acuerdo con la reivindicación 19 capaz de interacción con una citoquina seleccionada de IL-2, IL-5, IL-7, IL-9 y IL-15.

22. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

23. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

24. Un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para uso como un medicamento.

25. Un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para tratar asma, alergia o una afección exacerbada por la producción de IgE.

26. Uso de un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 en la preparación de un medicamento para tratar asma, alergia o una afección exacerbada por la producción de IgE.

27. Un método para producir un polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, dicho método que comprende células de cultivo que comprende la construcción genética de acuerdo con la reivindicación 7 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para expresar la molécula de ácido nucleico en dicha construcción genética para producir un polipéptido recombinante y aislar dicho polipéptido recombinante.

28. Células de animal aisladas que comprenden la construcción genética de acuerdo con la reivindicación 7 y que expresan el polipéptido recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 producido por el método de acuerdo con la reivindicación 27.

29. Una proteína de fusión que comprende una primera porción capaz de interacción con IL-13, en donde dicha primera porción se codifica por una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y una segunda porción derivada de un receptor de hematopoyetina, un receptor tirosina quinasa, un receptor TNF/NGF o una proteína G acoplada al receptor.

30. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 29 en donde la segunda porción comprende toda o una proteína funcional de La proteína de unión de IL-13, Cadena \alpha del receptor IL-4, cadena \gamma del receptor IL-4 o un receptor para una citoquina implicada en asma o alergia.

31. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 16 o 17 para uso como un medicamento.

32. Un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 16 o 17 en donde dicho anticuerpo inhibe la interacción de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 con la cadena \alpha del receptor IL-4.