JP4224135B2 - 新規なヘモポエチン受容体およびそれをコードする遺伝子配列 - Google Patents
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Description
本発明は新規なヘモポエチン受容体またはその成分またはその部分そしてそれをコードする遺伝子配列に広く関係する。本発明のこのような受容体分子およびそれらの成分および／または部分そしてそれをコードする遺伝子配列はその受容体とリガンド相互作用により機能するアゴニスト、アンタゴニスト、治療剤および診断試薬などの広範囲のものの開発に有用である。
本明細書で数値により言及する出版物の文献的詳細は明細書の末尾に集めてある。本明細書で言及したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の配列番号は文献の次に記載してある。
本明細書およびそれに続く請求の範囲を通じて、文脈上他の意味を必要とする場合を除き、「コンプライズ（含む）」という用語、あるいは「コンプライジーズ」または「コンプライジング」などのそれらの変形は、述べられた実体または一群の実体の包含を意味し、他の実体または他の一群の実体の排除を意味するものではないと理解すべきである。
本発明の好ましいヘモポエチン受容体は本明細書では「ＮＲ４」と言及される。このＮＲ４受容体はインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）と相互作用する、従って本明細書ではＩＬ−１３受容体、より具体的にはＩＬ−１３受容体α−鎖（ＩＬ−１３Ｒα）と呼ばれる。これらの用語は特定の主題について互換的に使用される。特定のＮＲ４の起源となる種は１個の縮小文字で与えられる。例えば、ねずみ（murine）は「Ｍ」そしてヒトは「Ｈ」である。組換え型は接頭辞「ｒ」が付されることがある。
組換えＤＮＡ技術の精密化の迅速な発展により、医学分野や類似の保健衛生分野への研究が大いに促進された。サイトカインの研究は特に重要である。とりわけ、多様な細胞の増殖、分化および機能を調節するこれらの分子は重要である。組換えサイトカインの投与やサイトカインの機能および／または合成の調節がある範囲の疾病状態の治療のための医学的研究の焦点となる場合が増加しつつある。
ある範囲のサイトカインや他の分泌される細胞機能調節物質の発見にもかかわらず、比較的僅かなサイトカインしか治療分野で直接使用されたり標的とされたりしていない。この理由の一つは多数のサイトカインが多面的な性質を持っていることである。例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１１は機能的に多面的な分子であり（１，２）、ＩＬ−６依存性の形質細胞腫の細胞株、Ｔ１１６５の増殖を刺激する能力によって特徴付けられたのが最初である（３）。ＩＬ−１１の他の生物学的作用には、多機能性ヘモポエチン原始体の細胞増殖の誘導（４，５，６）、巨核球や血小板の形成の増強（７、８、９、１０）、急性タンパク合成の刺激（１１）および脂肪細胞リポタンパクリパーゼ活性の阻害（１２、１３）が含まれる。
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）はインターロイキン−４（ＩＬ−４）と幾つかの構造的特徴を共有するもう一つの重要なサイトカインである（１４および１５を参照）。ＩＬ−４の遺伝子とＩＬ−１３の遺伝子とは関連のあるイントロン／エキソン構造を持っておりそしてヒト染色体５の上に共に近くに局在しており、またネズミでも染色体１１のシンテニー領域に存在する（１４、１５）。タンパクレベルでは、ＩＬ−４とＩＬ−１３は４個のシステイン残基を含め約３０％のアミノ酸同一性を共有している。生物学的にも、ＩＬ−１３とＩＬ−４は類似しており、活性化されたＴ−細胞により産生されそして、例えば、マクロファージに作用して分化を誘発しそして炎症性サイトカインの産生を抑制する。さらに、ヒトＩＬ−１３はＢ−細胞増殖に対する共−刺激シグナルとして作用しそして免疫グロブリン・イソタイプ・スイッチングに影響を与えることができる（１４、１５）。ＩＬ−１３および他のヘモポエチンサイトカインの多様かつ多面的な機能はこのグループを重要な研究対象とし、特にサイトカインとその受容体との相互作用のレベルでの研究が重要である。サイトカイン受容体およびサイトカイン−受容体相互作用の操作および制御は多くの治療分野で、とりわけ標的サイトカインが機能的に多面的でありそして標的サイトカインのある機能を阻止したいがそのすべての機能を阻止したくはない場合には、潜在的に極めて重要である。
ＩＬ−１３およびその受容体に関する研究はＩＬ−１３受容体のすべてまたは部分をコードする遺伝子配列をクローニングすることができなかったため妨げられてきた。本発明によれば、ＩＬ−１３受容体α−鎖、すなわちＩＬ−４受容体とも共有されている受容体サブユニットをコードする遺伝子配列が今やクローニングされたのである。これらの遺伝子配列の利用可能性により、構造または機能のレベルにおいてＩＬ−１３の活性並びにＩＬ−１３に関連するサイトカインの活性を調節または監視することができる一群の治療薬および診断薬の開発が可能となる。本発明によれば、構造および機能においてＩＬ−１３に関連するサイトカインの１例はＩＬ−４である。
従って、本発明の一つの側面は動物由来のヘモポエチン受容体または該受容体の誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
より具体的には、本発明は動物ヘモポエチン受容体−該受容体はＩＬ−１３またはＩＬ−１３の誘導体と相互作用をすることができるものであるが−またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
関連する一つの態様で、本発明は、該受容体が、
（ｉ）ＩＬ−１３またはその誘導体と相互作用をすることができ、そして
（ii）ＩＬ−４とＩＬ−４受容体α−鎖との間でできる複合体と相互作用をすることができる、
ものである、動物ヘモポエチン受容体またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
これらの態様により、ＩＬ−１３の誘導体には、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体および擬症物質（mimetics）が含まれることになる。
本発明は動物ＩＬ−１３受容体α−鎖またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関する。
関連する一つの態様では、本発明は動物ＩＬ−４受容体またはその誘導体の１成分をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含する。
この動物は哺乳類または鳥の１種であることが好ましい。とりわけ好ましい動物としては、ヒト、実験室テスト動物（例えば、霊長類、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、羊、山羊、馬、豚、牛、ロバ）、愛玩動物（例えば、犬、猫）、捕獲した野生の動物（例えば、キツネ、カンガルー、ディンゴー）および家禽（例えば、鶏、鵞鳥、鴨）およびゲーム鳥（例えば、エミュー、ダチョウ）などが挙げられる。本発明はマウスやヒトを例としてあげるが、主題である本発明の範囲はすべての動物および鳥類に及ぶものである。
本発明は配列類似性に基づきヘモポエチン受容体ファミリーのメンバーを同定する能力について部分的に予言する。このアプローチにより、ヘモポエチン受容体をコードする一つの遺伝子配列が本発明により同定された。発現された遺伝子配列は本明細書で「ＮＲ４」と呼ばれる。本発明によれば、ＮＲ４はトランスフェクトされたＣＯＳ細胞により合成されたとき、約５０，０００〜約７０，０００ダルトン、より好ましくは約５５，０００〜約６５，０００ダルトンの見掛けの分子量を持っている。ＮＲ４はＩＬ−１３と特異的にかつ低親和性をもって結合する、それ故、ＩＬ−１３受容体α−鎖であると考えられる。従って、「ＮＲ４」と「ＩＬ−１３受容体α−鎖」（または「ＩＬ−１３Ｒα」）とは本明細書を通して互換可能なものとして使用される。さらに、ＩＬ−１３のその受容体への結合はＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞内でＩＬ−４またはその成分により競争的に阻害されることが見出された、そしてこれはＩＬ−１３と受容体との相互作用を制御する方法を提供できるものであり、そして擬症物質の調製および構築のための基礎をも提供するものである。
本発明の別の側面では、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を持つＩＬ−１３受容体α−鎖またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。配列の全部または一部に言及しているのは、二つの受容体の各部分を含むハイブリッド分子を定義して含めることを意図している。単一アミノ酸を包含することは意図していない。
本発明のさらなる態様では、ＩＬ−１３受容体α−鎖をコードしそして配列番号：１に実質的に記載されたヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
本発明のさらに別の側面では、配列番号：４に記載されたアミノ酸配列を有するＩＬ−１３受容体α−鎖またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
本発明のさらなる態様では、ＩＬ−１３受容体α−鎖をコードしそして配列番号：３に記載されたようなヌクレオチド配列を実質的に有するヌクレオチド配列またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
従って、本発明は配列番号：１または配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列または配列番号：２または配列番号：４に記載されたアミノ酸配列またはこれらに対し１個または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失および／または付加がなされたものに及ぶことになる。
本発明はさらに、低厳格条件下で配列番号：１または配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの相補型とハイブリッドを形成することができる核酸分子に及ぶことになる。
本発明は組換えヘモポエチン受容体および特に組換えＮＲ４およびＮＲ４を含む組換えハイブリッドに及ぶ。組換えポリペプチドはＩＬ−１３と低親和性で相互作用することが好ましく、高い親和性で相互作用すればより一層好ましい。
とりわけ好ましい態様では、ポリペプチドは下記の特性のうちの少なくとも二つを有するものである。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と少なくとも低親和性で相互作用すること、および
（iv）ＣＯＳ細胞で発現させたとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を有すること。
関連する態様では、このポリペプチドは下記の特性のうちの少なくとも三つを有する。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と少なくとも低親和性で相互作用すること、および
（iv）ＣＯＳ細胞で発現させたとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を有すること、
（ｖ）ＩＬ−４受容体α−鎖由来のアミノ酸配列を含むこと、そして
（vi）ＩＬ−１３と相互作用をすることができ、かつその相互作用がＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞中でＩＬ−４により競争的に阻害されること。
本明細書で「組換えヘモポエチン受容体」、「ＮＲ４」、「ＩＬ−１３受容体」または「ＩＬ−１３受容体α−鎖」と言及するときは、それらの一部、断片、部分、相同体、ハイブリッドまたはアナログなどのそれらの誘導体への言及も含まれる。誘導体は機能的であってもなくてもよく、または非機能的ではあるが受容体の全部または一部に対する抗体と免疫学的に相互作用し得るものであってもよい。受容体の誘導体は受容体−リガンド相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストをも包含する。機能とは、ＩＬ−１３またはその誘導体と相互作用するＮＲ４の能力あるいは可溶性ＮＲ４の場合にはＩＬ−１３で誘発されたある細胞の活性と競合する能力により便宜的に定義される。
本発明により提供される特に好ましい誘導体には、高親和性でＩＬ−１３とまたは高親和性でＩＬ−１３およびＩＬ−４と結合することができるＩＬ−１３受容体α−鎖の誘導体が含まれ、また誘導体にはＩＬ−１３受容体α−鎖と、例えば、ＩＬ−１３とも高親和性で結合するＩＬ−４受容体α−鎖の間などのキメラ分子が包含される。
本発明により提供される他の融合分子またはキメラ分子には、ＮＲ４とヘモポエチン受容体ファミリーのメンバー、受容体チロシンキナーゼ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体およびＧタンパク質−共役受容体の間のものが含まれる。例えば、キメラにはＮＲ４とＩＬ−１３結合タンパク、ＩＬ−４受容体α−鎖、ＩＬ−２受容体γ−鎖またはＩＬ−５などの気管支喘息やアレルギーに関与する他のサイトカインに対する受容体との間に生じ得る。他の重要なキメラにはＮＲ４と免疫グロブリンまたは特定の細胞または組織にＮＲ４を標的化させる他の分子、ＮＲ４と毒素、およびＮＲ４と成長因子が含まれる。
本明細書において４２℃の低厳格性というときは、ハイブリッド形成条件においては少なくとも約１％ｖ／ｖから少なくとも約１５％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩を、そして洗浄条件においては少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩を範囲として包含する。必要なときは、中度の厳格性などの別の厳格条件を適用することもできる。中度の厳格性は、ハイブリッド形成条件においては少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくとも約３０％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍの塩を、そして洗浄条件においては少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍの塩を範囲として包含し、あるいは高厳格性は、ハイブリッド形成条件においては少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を、そして洗浄条件においては少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を範囲として包含する。
本発明のもっと別の側面では、ＩＬ−１３受容体α−鎖をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列を有するものあるいは構造的に類似するＩＬ−１３受容体α−鎖またはその誘導体をコードしそして配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはその相補型に低厳格性条件下でハイブリッドを形成することができる核酸分子が提供される。
本発明のさらに別の側面では、配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列を持つＩＬ−１３受容体α−鎖をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が、または配列番号：２または配列番号：４に記載された配列に少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、かつ配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列に低厳格性条件下でハイブリッドを形成することができるものを含む核酸分子が提供される。
本発明により提供される核酸分子は一般に単離された形のものであり、一本鎖でも二本鎖でも、直鎖状でも閉じた環状のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）でも、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡでも、あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの形などのそれらの結合物でもよい。特に好ましい態様では、核酸分子はベクターの形であり、特定の宿主細胞内で発現させることができる発現ベクターが最も好ましい。特に有用な宿主細胞としては原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞および昆虫細胞が挙げられる。この細胞は細胞株の形であってもよい。
本発明のこの側面により、本明細書で先に述べたＩＬ−１３受容体α−鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクターが提供される。該発現ベクターは特定の宿主細胞内で発現することができる。
本発明の別の側面では、配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドが提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
本発明により提供される組換えポリペプチドは、従って、ＩＬ−１３受容体α−鎖の成分、部分、断片、誘導体、相同体、またはアナログを含み、そして配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列、またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有する分子、または配列番号：１または配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの相補型とハイブリッドを形成することができる分子によりコードされることが好ましい。この組換え分子はグリコシル化されていてもいなくてもよい。グリコシル化型であるときは、グリコシル化は天然に生ずるＩＬ−１３受容体α−鎖と実質的に同じであってもよく、またはグリコシル化の修飾型であってもよい。グリコシル化の変更または相違はＩＬ−１３受容体α−鎖の結合活性に影響を与えることも与えないこともある。
組換えＩＬ−１３受容体α−鎖は可溶性の形であることも、細胞表面上に発現されることもまたは固体支持体または別の分子に結合したりまたは融合したりしていることもある。
本発明はさらに下記の特性のうちの少なくとも二つを有する組換えポリペプチドを製造する方法を提供する。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはそれに少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と低親和性で相互作用すること、そして
（iv）ＣＯＳ細胞中で発現させるとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を持つこと。
該方法は、本発明の遺伝子構築物を含む細胞を、該遺伝子構築物中の核酸分子を発現して組換えポリペプチドを産生するのに十分な時間および条件の下で培養する工程、そして該組換えポリペプチドを単離する工程を含んで成る方法である。
別の態様は下記の特性のうちの少なくとも三つを有する組換えポリペプチドを製造する方法を提供する。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と少なくとも低親和性で相互作用すること、
（iv）ＣＯＳ細胞中で発現させたとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を持つこと、
（ｖ）ＩＬ−４受容体α−鎖由来のアミノ酸配列を含むこと、そして
（vi）ＩＬ−１３と相互作用をすることができること、かつ、その相互作用がＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞内でＩＬ−４により競争的に阻害されること。
該方法は、本発明の融合遺伝子構築物を含む細胞を、該融合遺伝子構築物内の核酸分子が発現し組み換えポリペプチドを産生するのに十分な時間および条件の下で培養する工程および該組換えポリペプチドを単離する工程を含んで成る方法である。
本発明はさらに上記の組換えポリペプチドを発現する動物細胞などの細胞にまで及ぶ。
本発明の別の態様では、組換えＩＬ−１３受容体α−鎖の化学的アナログが提供される。
上に述べたように、本発明はさらにＮＲ４のある範囲の誘導体を提供する。誘導体には、ＮＲ４ポリペプチドおよび対応する遺伝子配列の断片、一部、部分、変異体、ハイブリッド（融合分子やキメラ分子を含む）、相同体およびアナログが含まれる。一つの好ましい態様では、この誘導体は高親和性でもってＩＬ−１３と結合する。他の好ましい誘導体はアゴニスト、アンタゴニストまたは擬症物質として作用する。これらの誘導体には、ＮＲ４に１個または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたもの、およびＮＲ４をコードする遺伝子配列に１個または複数のヌクレオチドが置換、欠失、および／または付加されたものも含まれる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列への「付加」には、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合またはヌクレオチド配列への融合も含まれる。本明細書で「ＮＲ４」と言及するときは、機能的誘導体や「ＮＲ４」と免疫学的に相互作用し得る誘導体も含めそのすべての誘導体を指している。本発明はネズミＮＲ４、ヒトＮＲ４またはそれらの誘導体の間などのハイブリッド分子にも及ぶ。特に好ましいハイブリッドはＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を含むものである。
本明細書において提供されるＮＲ４の類似体には、側鎖の修飾、ペプチド合成、ポリペプチド合成またはタンパク合成の間における非天然型アミノ酸および／またはそれらの誘導体の取り込み、および架橋剤や、タンパク性分子またはそれらのアナログにコンホーメーション上の制約を加える他の方法の使用などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明によって提供される側鎖の修飾の例としては、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化に続くＮａＢＨ4による還元、メチルアセチミデートを用いるアミジノ化（amidination）、無水酢酸を用いるアシル化、シアネートを用いるアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸および無水テトラハイドロフタル酸を用いるアミノ基のアシル化、およびピリドキサル−５−リン酸に続いてＮａＢＨ4で還元することによるリシンのピリドキシレーションなどのアミノ基の修飾が挙げられる。
アルギニン残基のグアニジン基は２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサルなどの試薬を用いて複素環縮合産物の形成により修飾することができる。
カルボキシル基はＯ−アシルイソウレア形成を経るカルボジイミド活性化それに続く、例えば対応するアミドへの誘導により修飾することができる。
スルフヒドリル基はヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いるカルボキシメチレーション、システイン酸への過ギ酸酸化、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、４−クロロマーキュリベンゾエート、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、フェニルマーキュリクロライド、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を用いる水銀誘導体の形成、アルカリ性ｐＨでシアネートを用いるカルバモイル化などの諸方法により修飾することができる。
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドを用いる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイドまたはスルフェニルハライドを用いるインドール環のアルキル化により修飾することができる。チロジン残基は、他方、テトラニトロメタンを用いる硝酸化により改変し３−ニトロチロジン誘導体を形成することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾はヨード酢酸誘導体を用いるアルキル化またはジエチルピロカーボネートを用いるＮ−カルボエトキシレーションにより達成することができる。
ペプチド合成の間に非天然型アミノ酸および誘導体を取り込む例としては、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、ザルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で提供される非天然型アミノ酸のリストを表１に示す。
架橋剤は、例えば、３Ｄコンホーメーションを安定化するために使用することができ、ｎ＝１からｎ＝６までのスペーサー基（ＣＨ2）nを持つ二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ−二官能性架橋剤および通常Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ−反応性部分とマレイミドまたはジチオ部分（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基の特異的反応性部分とを持つヘテロ−二官能性試薬を使用する。また、ペプチドのコンホーメーションは、例えば、ＣαおよびＮα−メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のＣαとＣβ原子の間に二重結合の導入、およびＮ末端とＣ末端の間、二つの側鎖の間または側鎖とＮ末端またはＣ末端との間にアマイド結合を形成させるなどして共有結合を導入することにより環状ペプチドまたは環状アナログの形成により制約することができる。
これらのタイプの修飾は個体に投与するとき、あるいは診断試薬として使用するために、ＮＲ４を安定化するために重要である。
本発明はさらにＮＲ４のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することができる、すなわちＮＲ４の機能的アナログとして作用することができるＮＲ４の化学的アナログを提供する。化学的アナログは必ずしもＮＲ４から誘導されるとは限らず、ある種のコンホーメーションの類似性を共有するものであってもよい。また、化学的アナログはＮＲ４のある種の物理化学的性質を真似するように特別に設計することもできる。化学的アナログは化学的に合成することができまたは例えば天然物のスクリーニングにより検出することができる。
ＮＲ４の同定により、ＮＲ４の発現を調節したりＮＲ４の活性を調節したりすることができる１群の治療に有用な分子の誕生を可能とする。本発明により提供される調節物質にはＮＲ４遺伝子発現またはＮＲ４タンパク活性のアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。ＮＲ４遺伝子発現のアンタゴニストにはアンチセンス分子、リボザイムおよび共−抑制分子（co-suppression molecules）が含まれる。アゴニストにはプロモーター能を増強したりまたは負の調節機構を妨害したりする分子が含まれる。ＮＲ４タンパクのアゴニストには抗体、リガンドおよび擬症物質が含まれる。ＮＲ４のアンタゴニストには抗体および阻害ペプチド断片が含まれる。細胞がＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を共−発現するときは、アゴニストおよびアンタゴニストはこのＩＬ−４受容体α−鎖を標的とすることができる。
本発明により提供される他の誘導体には、完全に脱グリコシル化された分子から修飾されたグリコシル化分子までのある範囲のグリコシル化変異型が含まれる。改変されたグリコシレーションパターンは異なる宿主細胞中での組換え分子の発現から生ずることがある。
本発明の別の態様では、ヒトにおけるＮＲ４遺伝子の発現を調節する方法が提供される。この方法はＮＲ４をコードするＮＲ４遺伝子をＮＲ４発現の調節物質の有効量と、ＮＲ２の発現を高く調節しまたは低く調節しまたは別の仕方で調節するのに十分な時間および条件の下で、接触させることを含んでなる方法である。ＮＲ４をコードする核酸分子またはその誘導体を細胞内に導入して、例えば、欠陥を持つまたは一つ以上の望ましくない変異を持つ内因性ＮＲ４遺伝子配列の置換を含め、その細胞のＮＲ４関連活性を増強したり改変したりすることができる。逆に、オリゴヌクレオチドなどのＮＲ４アンチセンス配列（または共−抑制のためのセンス配列）を導入して、内因性のＮＲ４遺伝子を発現しているどの細胞のＮＲ４関連活性をも減少させることができる。リボザイムも使用することができる。
本発明の別の側面は、ヒトにおけるＮＲ４の活性を調節する方法を提供する。この方法はＮＲ４活性を増加または減少させるのに十分な時間および条件の下である分子の調節有効量を該哺乳類に投与することを含んでなる方法である。この分子はタンパク性の分子であっても化学的実体であってもよくそしてＮＲ４の誘導体またはそのリガンドまたは化学的アナログまたはＮＲ４の切断変異体またはそのリガンドであってもよい。
例えば、ＩＬ−１３とＩＬ−４は免疫応答の調節に関与し、そして喘息などのアレルギー性またはアトピー性疾患と関連する免疫グロブリン・イソタイプであるＩｇＥの産生に関与している。ＩＬ−１３／ＩＬ−４とそれらの受容体との相互作用を調節することはアレルギー状態などの炎症状態を治療するのに重要であり得る。ＩＬ−４／ＩＬ−１３およびＩｇＥのレベルの上昇はネフローゼ症候群、春季カタルおよび角結膜炎などの疾病にも重要である。本明細書でその治療法が提供される他の疾病としては、気管支喘息、鼻炎（perennial rhinitis）およびアトピー性皮膚炎が挙げられる。ＩＬ−１３−受容体相互作用の調節が重要となり得る他の病態としては、ＩＬ−１３がサイトカイン形成を誘発し、今度はこのサイトカインが疾病の開始、進行および／または重篤度に関与するような病態が含まれる。同様に、ＩＬ−４−受容体相互作用の調節も疾病状態を制御するのに重要である。例えば、一部の癌はサイトカインＩＬ−１３またはＩＬ−４により悪化させられることがある。これらは免疫抑制効果または免疫抑制効果分子を誘発し、今度はこれが癌の成長に応答する身体の能力を減退させるのである。
従って、本発明はＮＲ４またはその誘導体またはＮＲ４発現またはＮＲ４活性の調節物質および１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含んでなる薬学的組成物を提供する。これらの成分は「活性成分」と呼ばれる。
これについては、前に記載した組換えヘモポエチン受容体またはそのリガンド（例えば、ＩＬ−１３）結合性部分および１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含んでなる薬学的組成物が提供される。
別の態様では、前に述べた組換えヘモポエチン受容体に対するリガンド（例えば、ＩＬ−１３）および１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含んでなる薬学的組成物が提供される。
本発明のさらなる側面は、動物の治療方法を提供する。この方法は前に記載した組換えヘモポエチン受容体またはそのリガンド結合性部分または該ヘモポエチン受容体に対するリガンド（例えば、ＩＬ−１３）の治療有効量を、該治療が実質的に達成されるのに十分な時間および条件の下であるいは実質的に改善される条件の下で、該動物に投与することを含むものである。
注射可能な用途に適する薬学的剤形としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌した注射可能な溶液または分散剤の用時調製のための滅菌粉末が挙げられ、あるいはクリームの形状であってもまたは局所適用に適した他の剤形であってもよい。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌や糸状菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は溶媒または分散剤であることができ、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール、およびその他のもの）、それらの適当な混合物、および植物性油などを含む。例えば、リシチン（licithin）などの皮膜の使用により、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によりそしてスーパーファクタントの使用により、適当な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌物質および抗かび物質、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサル（thirmerosal）およびその他により可能となる。多くの場合、等張物質、例えば、砂糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期間吸収は吸収を遅延させる物質、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物の中で使用することにより可能とすることができる。
注射可能な滅菌溶液は必要な量の活性化合物を必要な場合は上に挙げた他の様々な成分と共に適当な溶媒の中に溶解し次いで無菌ろ過を行うことにより調製される。一般に、分散剤は様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上に挙げたものの中の必要な他の成分を含む滅菌担体の中に取り込むことにより調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥法および凍結−乾燥法である。これらは予めそれらの無菌ろ過された溶液から、活性成分プラス付加的な必要成分の粉末を生ずる。
活性成分を適当に保護するときは、例えば、不活性な希釈剤または資化し得る食用の担体と共に経口投与することができ、あるいはそれを固いまたは軟らかい殻のゼラチンカプセルの中に閉じ込めることができ、あるいはそれを錠剤中に圧縮することができ、あるいは食事の食品と共に直接摂取することができる。治療のための経口投与を行うためには、活性化合物は賦形剤と混ぜ、消化可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリクサル、懸濁剤、シロップ、ウェハース、その他の形で使用される。このような組成物および調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含むべきである。この組成物および調製物のパーセンテージは、もちろん、変動するものであり、単位重量の約５％から約８０％までの間にあるのが便宜である。治療上有用な組成物の中の活性化合物の量は適当な投与量が得られるようなものである。本発明による組成物または調製物は経口投与の単位形態が活性化合物を約０．１μｇと２０００ｍｇの間で含むように調製されることが好ましい。
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなども後にリストされる成分を含むことができる。ガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどのバインダー、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、その他の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤またはペパーミント、サリチル酸メチル（oil of wintergreen）、または桜の芳香などの芳香剤を添加することができる。投与単位の形態がカプセルのときは、上のタイプの物質に加えて液体の担体を含めることができる。投与単位の物理的形態を被覆あるいは別の仕方で修飾するための様々な物質がほかにもある。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルはシェラック、砂糖または両方で被覆することができる。シロップまたはエリクサルは活性化合物、甘味剤として砂糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素および桜またはオレンジなどの芳香剤を含むことができる。もちろん、いかなる投与単位形態を作る場合に使用されるどんな物質も薬学的に純粋でありそしてその使用量では実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物（単数または複数）は制御放出（sustained-release）用の調製物や処方に加えることもできる。
本発明はクリーム、ローションおよびゲルなどの局所適用に適した形態をも包含する。
薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤としては、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗細菌および抗かび剤、等張物質および吸収遅延物質などのいずれかおよびすべてが挙げられる。このような媒体や物質を薬学的に活性な物質に使用することは当技術分野では良く知られている。通常の媒体または物質が活性成分と配合禁忌である場合を除き、治療用組成物にそれらを使用することは本発明に包含される。補充的な活性成分もこの組成物の中に取り込むことができる。
投与の容易および投与量の均一性のため投与単位の形態で非経口的組成物を処方することはとりわけ有利である。本明細書で使用されるとき投与単位形態とは治療すべき対象哺乳類に対し１回投与に適した物理的に区別された単位を指し、各単位は必要な薬学的担体との組み合わせで望まれる治療効果を生じさせるように計算された活性物質の予め計測された量を含んでいる。本発明の新規な投与単位形態の仕様は、（ａ）活性物質のユニークな特性および達成すべき具体的治療効果、および（ｂ）身体の健康が損なわれている疾病状態を持つ生物対象における疾病の治療のためにこのような活性物質を混ぜ合わせる技術上の固有の制約、により支配されそして直接それらに依存している。
主要な活性成分は便利で効果的な投与のために、前に開示したような投与単位形態で、その有効量が薬学的に許容され得る適当な担体と混ぜ合わされる。単位の投与形態は、例えば、０．５μｇから約２０００ｍｇにわたる量で主要な活性化合物を含むことができる。比率で表すと、活性化合物は一般に担体の１ｍｌ当たり約０．５μｇから約２０００ｍｇまで存在する。補充的活性成分を含む組成物の場合は、投与量は該成分の通常の投与量および投与方法を参照して決定する。
薬学的組成物は標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターのような遺伝子分子を含むこともでき、該ベクターはＮＲ４発現またはＮＲ４活性を調節することができる核酸分子を担っている。このベクターは例えばウイルスベクターであることができる。
本発明のさらに別の側面はＮＲ４に対する抗体およびその誘導体またはそのリガンド（例えば、ＩＬ−１３）に関する。このような抗体はモノクローン抗体またはポリクローン抗体であることができ、そして天然に生ずるＮＲ４への抗体から選択することができ、あるいはＮＲ４またはその誘導体に対し特異的に高めることもできる。後者の場合は、ＮＲ４またはその誘導体はまず担体分子と結合することが必要になることがある。本発明の抗体および／または組換えＮＲ４またはその誘導体は治療剤または診断試薬として特に有用である。
例えば、ＮＲ４およびその誘導体はＮＲ４への天然に生ずる抗体のスクリーニングに使用することができる。これらは、例えば、自己免疫疾患の一部で生ずる。また、ＮＲ４をスクリーニングするために特異的抗体を使用することができる。このような試験の技法は当技術分野で良く知られており、例えば、サンドイッチ試験やＥＬＩＳＡが含まれる。ＮＲ４レベルおよび／またはＩＬ−１３レベルの知識はある種の癌または癌の素因の診断のためまたはある種の治療プロトコルの監視のために重要であり得る。特に、ＩｇＥ応答またはＩＬ−１３またはＩＬ−４またはその両方を監視することが重要である。これらは、今度は免疫系に影響を及ぼすからである。
本発明のＮＲ４に対する抗体はモノクローンでもポリクローンでもよい。また、Ｆａｂ断片などの抗体の断片も使用することができる。さらに、本発明は組換え抗体および合成抗体に及びそして抗体ハイブリッドにまで及ぶ。「合成抗体」は本明細書では抗体の断片および抗体のハイブリッドを含むと考える。本発明のこの側面の抗体は免疫治療法にとりわけ有用であり、受容体または受容体−リガンド相互作用の評価または治療計画のプログラムの監視のための診断手段として使用することもできる。
例えば、特異的抗体をＮＲ４タンパクのスクリーニングに使用することができる。後者は、例えば、細胞抽出液または他の生物学的液体中のＮＲ４レベルをスクリーニングするための手段としてまたは培養物上清から組換え手段で調製されたＮＲ４を精製するための手段として重要であろう。本明細書で提供される試験のための技法は当技術分野で知られており、例えば、サンドイッチ試験やＥＬＩＳＡが含まれる。
上に論じた最初に述べた抗体に対するいかなる第２の抗体（モノクローン抗体、ポリクローン抗体または抗体断片または合成抗体）も本発明の範囲に含まれるべきものである。第１および第２の抗体は両方とも検出試験に使用することができ、あるいは第１の抗体は市場で入手可能な抗−免疫グロブリン抗体と共に使用することができる。本明細書で提供される抗体にはＮＲ４のどの領域に特異的な抗体であってもすべて含まれる。
ポリクローン抗体およびモノクローン抗体は両方とも受容体で免疫化することにより取得することができ、そしていずれのタイプも免疫試験に利用することができる。両方のタイプの血清を得る方法は当技術分野で良く知られている。ポリクローン血清はあまり好ましくないが、適当な実験室動物にＮＲ４またはその抗原部分の有効量を注射し、その動物から血清を集め、そして既知の免疫吸着法のいずれかにより特異的な血清を単離することにより、比較的容易に調製される。この方法により製造された抗体は事実上どのタイプの免疫試験にも利用可能であるが、この生産物の潜在的不均質性のため一般的にはあまり好ましくない。
免疫試験でのモノクローン抗体の使用は、大量にそれを作る能力があることおよび生産物の均質性のためとりわけ好ましい。不死の細胞株と免疫原調製物に対して感作させたリンパ球を融合させて作成したモノクローン抗体生産用のハイブリドーマ細胞株の調製は当技術分野で熟練した者に良く知られた技法により行うことができる。
本発明の別の側面は主体からの生物試料内のＮＲ４を検出する方法を提供する。該方法は該生物試料をＮＲ４またはその誘導体または同族体に特異的な抗体と、抗体−ＮＲ４複合体が形成するのに十分な時間および条件の下で接触させ、そして該複合体を検出することを含んで成る。
ＮＲ４が存在することはウエスタン・ブロッティングやＥＬＩＳＡによるなどの幾つかの方法で確認できる。広い範囲の免疫試験法が利用できることは米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および第４，０１８，６５３号を参照することにより見ることができる。これらは、もちろん、従来の競争的結合試験におけると同様に非−競争的タイプの１部位試験および２部位試験の両方または「サンドイッチ」試験を含んでいる。これらの試験は標的への標識化抗体の直接結合をも含んでいる。
サンドイッチ試験は中でも最も有用でありそして普通に使用されている試験であって、本発明における使用にとっても好ましい。サンドイッチ試験法は幾つかの変法があり、それらのすべてが本発明に包含されるものである。簡単に言えば、典型的なホワード試験（forward assay）では、非標識化抗体が固体基質上に固定化されておりそして試験対象の試料が結合した分子と接触させられる。適当な時間、すなわち抗体−抗原複合体の形成を行わせるのに十分な時間、インキュベートした後、抗原に特異的な第２の抗体であって検出可能なシグナルを形成することができるレポーター分子で標識された抗体を次に添加し、抗体−抗原−標識化抗体の別の複合体が形成するのに十分な時間インキュベートする。未反応物質をすべて洗い流し、そしてレポーター分子が形成したシグナルの観察により抗原の存在が測定される。この結果は可視的なシグナルの簡単な観察による定性的なものであることもあり、また既知の量のハプテンを含む対照試料と比較することにより定量化することもできる。ホワード試験の変法には試料と標識化抗体の両方が結合抗体に同時に添加される同時試験が含まれる。これらの技法は当技術分野の熟練した者に良く知られており、容易に分かるような僅かな修飾を包含するものである。本発明によれば、試料は細胞抽出物、組織生検またはおそらく血清、唾液、粘液分泌物、リンパ液、組織液および呼吸液などのＮＲ４を含むかも知れないものである。試料は、従って、一般に生物学的液体、細胞抽出液、骨髄またはリンパ液、組織抽出物（例えば、腎臓、肝臓、脾臓、など）、醗酵液および細胞培養物や細胞条件化培地からの上清を含む生物試料である。
典型的なホワードサンドイッチ試験では、ＮＲ４またはその抗原部分に特異性を有する第１の抗体は固体表面に共有結合または受動的に結合している。固体表面はガラスまたはポリマーが代表的であり、最も普通に使用されるポリマーはセルローズ、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は管、ビーズ、ミクロプレートの平円盤の形、または免疫試験を行うのに適した表面であればなんでもよい。結合工程は当技術分野で良く知られており、一般に架橋共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は試験試料の調製の際に洗浄される。試験対象の試料の一部をとり、ついで固相複合体に加え、そして抗体中に存在するサブユニットのいずれかと結合するのに十分な時間（例えば、２〜４０分）および適当な条件（例えば、２５℃）の下でインキュベートする。インキュベーション期間の後に、抗体サブユニット固相を洗浄し乾燥し、そしてこのハプテンの一部に特異的な第２の抗体とインキュベートする。第２の抗体はレポーター分子に結合しており、この分子が第２の抗体のハプテンへの結合を示すために用いられる。
別の方法は生物試料中の標的分子を固定化し、ついでレポーター分子で標識されまたはされていない特異的抗体にこの固定化された標的を曝す。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度に依存して、結合した標的は抗体による直接の標識化により検出可能となる。また、第１の抗体に特異的な第２の標識化抗体を標的−第１の抗体複合体と接触させ、標的−第１抗体−第２抗体の三次複合体を形成させる。この複合体はレポーター分子が発するシグナルにより検出される。
本明細書で使用されるとき「レポーター分子」は、その化学的性質により抗原−結合抗体の検出を可能とする、分析的に同定可能なシグナルを供給する分子を意味する。検出は定性的にも定量的にも行うことができる。このタイプの試験で最も普通に用いられるレポーター分子は、酵素、発蛍光団または放射性核種を含む分子（すなわち、放射性同位元素）および化学発光性分子である。酵素免疫試験の場合には、酵素を通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により第２の抗体に結合させる。しかし、容易に分かるように、熟練した技術者に容易に利用可能な多様な異なる結合手段が存在する。通常使用される酵素としては、中でも、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコーズオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。特異的酵素と共に使用されるべき基質は一般に対応する酵素による加水分解の際の検出可能な色変化の生成に対して選択される。適当な酵素の例としては、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。発蛍光性基質を採用することも可能である。これは上に述べた発色原性基質よりもむしろ蛍光性の生産物を生ずる。全ての場合に、酵素−標識化抗体を第１抗体ハプテン複合体に添加して、結合させ、ついで過剰の試薬を洗い流す。ついで、適当な基質を含む溶液を抗体−抗原−抗体の複合体に添加する。この基質は第２の抗体に結合した酵素と反応し、定性的な視覚的シグナルを生じ、これは通常分光学的に定量化することができ、試料中に存在したハプテンの量の指標を与える。「レポーター分子」はラテックスビーズなどの上での赤血球などの細胞凝集または凝集の阻害の利用にも広がっている。
また、フルオレッセインやローダミンなどの蛍光性化合物は抗体の結合活性を変えることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定波長の光を照射することにより活性化すると、フルオロクロム−標識化抗体が光エネルギーを吸収し、分子内で励起状態を誘発し、続いて光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を発射する。ＥＩＡの場合のように、蛍光性標識化抗体は第１抗体−ハプテン複合体に結合させられる。未結合試薬を洗い流した後、残りの三次複合体を次に適当な波長の光に曝すと、観察される蛍光は問題のハプテンの存在の証拠となる。免疫蛍光法およびＥＩＡ法は両方とも当技術分野で十分に確立されており、本発明の方法にとってとりわけ好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光性分子または生物発光性分子などの他のレポーター分子も採用することができる。
ＮＲ４およびＩＬ−４受容体α−鎖を発現することができる細胞の場合は別の形の試験ができる。例えば、ＩＬ−４受容体α−鎖とＮＲ４がＣＯＳ細胞などの細胞上に共−発現されるときは、ＩＬ４の存在下でＩＬ−１３は高親和性でＮＲ４に結合する。
一つの理論または一つの作用様式に本発明を制限する積もりはないが、ＮＲ４とＩＬ−４受容体とが同一細胞中で発現されるとき、これらはＩＬ−４受容体およびＩＬ−１３受容体両方の形成に寄与する。ＩＬ−４の場合には、結合はまずＩＬ−４受容体α−鎖を介して起こり、ついでこの複合体にＮＲ４が相互作用する。ＩＬ−１３の場合には、結合はまずＮＲ４に対して起こり、ついでこの複合体とＩＬ−４受容体α−鎖が相互作用してシグナル伝達を可能とする高親和性受容体を形成する。ＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖との共−発現の結果は、ＩＬ−４とＩＬ−１３がＩＬ−４受容体α−鎖およびＮＲ４と結合するために相互に競争することになることである。
この挙動に基づけば、ＩＬ−４またはＩＬ−１３が両受容体成分を含む細胞表面複合体を形成するのを阻止するタンパク質または低分子はアンタゴニストとなり得るということであろう。このような分子はこのサイトカインとその低親和性受容体との相互作用を阻止することができる。例えば、可溶性ＩＬ−１３ＢＰはＩＬ−１３とＮＲ４との相互作用を阻止することができる。同様に、可溶性ＩＬ−４受容体α−鎖はＩＬ−４の細胞表面ＩＬ−４受容体α−鎖への結合を阻止することができる。これらの作用物質はＩＬ−４またはＩＬ−１３に特異的なアンタゴニストとなるであろう。
敷衍すると、可溶性ＮＲ４はその低親和性のためＩＬ−１３の極めて無能なアンタゴニストである。もしＩＬ−４に結合しそしてＩＬ−１３とも高親和性で結合する可溶性ＮＲ４突然変異体が選択されるならば、これはＩＬ−４とＩＬ−１３の両方の有用なアンタゴニストとなるであろう。
可溶性受容体の利用のもう一つは、ＮＲ４に対するモノクローン抗体のパネルを作ることである。機能的ＩＬ−４受容体と機能的ＩＬ−１３受容体の両方の形成における決定的な事象である、ＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖との相互作用を阻止する抗体が得られるならば、そのときは、両方のサイトカインの作用がさらに阻止される。
一つの特殊な態様においては、本発明は生物学的試料中のＩＬ−４のレベルを監視する方法を提供する。該方法はＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞と該生物学的試料を、ＩＬ−４がその受容体と結合するのを競争的に阻害するのに有効な量のＩＬ−１３と共にインキュベートする工程および競争的阻害の程度を測定する工程とを含んで成る方法である。
本発明の関連する態様においては、生物学的試料中のＩＬ−１３のレベルを監視する方法を提供する。該方法はＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞と該生物学的試料を、ＩＬ−１３がその受容体と結合するのを競争的に阻害するのに有効な量のＩＬ−４と共にインキュベートする工程および競争的阻害の程度を測定する工程とを含んで成る方法である。
このサイトカインは上述のようにレポーター分子で標識することが好ましい。
この生物学的試料には、血液、血清、血漿、組織液、組織抽出物、リンパ液、Ｔ細胞またはその抽出物、培養上清および培養条件化培地などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明はＮＲ４遺伝子またはその誘導体を検出するためＰＣＲ分析を含むような遺伝子試験をも提供する。別の方法または関連して用いられる方法には、一本鎖コンホーメーション多形性分析（ＳＳＣＰ）、特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成、直接タンパク切断テストのような方法などの直接ヌクレオチド配列決定法または突然変異スキャニングが含まれる。このような遺伝子テストは、例えば、疾病状態をもたらすＮＲ４の非−発現または実質的な発現の欠如または突然変異型の発現について動物（例えば、ヒト）の遺伝子をスクリーニングする場合に重要である。
本発明の核酸分子はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。核酸分子がＤＮＡ型であるときは、それはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。本発明の核酸分子のＲＮＡ型は一般にｍＲＮＡである。
本発明の核酸分子は一般に単離型であるが、それはベクター分子そして特に発現ベクター分子などの他の遺伝子分子中に組み込まれたりまたはそれに連結されたりまたはそれと別な仕方で融合したりまたはそれと集合状態にあったりすることができる。ベクターおよび発現ベクターは一般に複製することができ、そして適用可能なときは、原核細胞または真核細胞の一方または両方の中で発現する。原核細胞は大腸菌、バチルス・スピーシーズおよびシュードモナス・スピーシーズを含むことが好ましい。真核細胞は酵母、カビ、哺乳類および昆虫の細胞を含むことが好ましい。
従って、本発明の別の側面はベクター部分と哺乳類の、より具体的にはヒトのＮＲ４遺伝子部分を含む遺伝子構築物を提供する。このＮＲ４遺伝子部分はＮＲ４ポリペプチドまたは機能的または免疫学的に相互作用するその誘導体をコードすることができるものである。
遺伝子構築物のＮＲ４遺伝子部分は、適当な細胞中でプロモーターが該ＮＲ４遺伝子部分の発現を指令することができるようにベクター上の該プロモーターに機能的に連結させることが好ましい。
また、遺伝子構築物のＮＲ４遺伝子部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはその部分またはサイトカインまたは別のヘモポエチン受容体をコードするヌクレオチド配列などの別の遺伝子配列と融合した遺伝子の全部または一部を含むことができる。ハイブリッド受容体分子は多機能性治療薬および診断薬の開発において特に有用である。
本発明はこのような遺伝子構築物を包含しそして該構築物を含む原核細胞または真核細胞をも包含する。
本発明はＮＲ４の変異体、一部、断片、部分、同族体およびアナログを含むＮＲ４のすべての誘導体またはそれらをコードする遺伝子配列に及ぶ。この遺伝子配列には、天然に生ずるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において１個または多重のヌクレオチドまたはアミノ酸が置換、付加および／または欠失することにより生ずる遺伝子配列も包含される。
本発明のＮＲ４およびその遺伝子配列はある範囲の治療薬および診断薬の創薬に有用でありそして対応するリガンドの検出にとりわけ有用である。例えば、組換えＮＲ４は同定可能なシグナルを形成することができるレポーター分子に結合または融合し、リガンドを含むと考えられる生物試料と接触させ、そして標識化ＮＲ４のリガンドへの結合についてスクリーニングをすることができる。また、標識化ＮＲ４は、リガンド遺伝子と考えられるものまたはその機能的部分の発現ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
別の態様では、ＮＲ４がまず固定化される。この態様によれば、リガンドと考えられるものを含む生物試料を、固体支持体に固定化されたヘモポエチン受容体またはそのリガンド結合部分と、該生物試料中にリガンドが存在するときは該受容体と該リガンドとの間で複合体が形成されるのに十分な時間および条件の下で接触させる工程、および結合したリガンドを溶出しそしてそれを単離する工程を含んで成る方法が提供される。
可溶性ＮＲ４ポリペプチドも種々のハイブリッドと同様に神経系における疾病、障害または異常の治療において有用であると考えられる。例えば、中枢神経系または末梢神経系に関して脳性麻痺、外傷により誘発される麻痺、発作と関連する血管虚血症、ニューロン腫瘍、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病と関連する末梢神経症、重金属またはアルコール毒性、腎不全、およびヘルペス、風疹、麻疹、チキンポックス、ＨＩＶまたはＨＴＬＶ−１などの感染症の治療である。ＮＲ４ポリペプチドおよびハイブリッドはサイトカイン活性を調節したり、造血を調節したりするのにも重要である。これらは慢性関節リューマチなどの他の炎症性症状と同様にアレルギー性またはアトピー性症状の治療にも重要である。
上に述べたように、本発明のＮＲ４またはそのリガンドまたはその機能的誘導体は１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と共に薬学的組成物中に提供され得る。さらに、本発明は本発明のＮＲ４の有効量の投与を含む治療方法を提供する。本発明はＮＲ４のアンタゴニストおよびアゴニストおよび／またはそのリガンドをも包含しそして治療用の組成物および治療の方法論におけるそれらの使用をも包含する。
本発明のさらなる側面はＮＲ４に起因する欠陥状態または欠損状態の治療用の医薬品の製造におけるＮＲ４またはその機能的誘導体の使用を提供する。
本発明については下記の非−制限的な図および実施例を参照してさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
図１はネズミＮＲ４の配列番号：１に記載のヌクレオチド配列および配列番号：２に記載の予言されるアミノ酸配列を示す。非翻訳部分は下方の箱の中にそして翻訳部分は上方の箱の中に示してある。アミノ酸については、通常の１文字符号が略号が用いられ、グリコシレーション部位にリンクすると考えられるアスパラギンには下線を付し、保存されているシステイン残基とヘモポエチン受容体ファミリー・メンバーのＷＳＸＷＳモチーフは太字で示してある。予想されるシグナル配列は太字で下線を付し、一方膜貫通ドメインはダッシュで下線を付している。示した配列は３種のライブラリー由来の８個のｃＤＮＡクローンの分析から得られたものの合成物である。この配列の５’−末端（ヌクレオチド−６０から３５１まで）は１個のｃＤＮＡクローンから由来するが、単離されたゲノムＤＮＡクローン中にも存在する。箱領域は：典型的なヘモポエチン受容体ドメインであり、アミノ酸１１８〜３４０である。
図２は選択された組織および器官でのネズミＮＲ４ｍＲＮＡ発現のノーザン分析を示す写真である。
図３は125Ｉ−ＩＬ−１３および125Ｉ−ＩＬ−４結合の飽和等温線、すなわち、ＩＬ−４（○）およびＩＬ−１３（●）の（Ａ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＯＳ細胞への結合、（Ｂ）ＣＴＬＬ細胞への結合、そして（Ｃ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合のスカチャードプロットとして図示された飽和等温線を示すグラフである。データは１×１０4ＣＯＳ細胞および１×１０6ＣＴＬＬ細胞に規格化し、そして結合は２〜４時間氷上で行った。
図４はＩＬ−４とＩＬ−１３の結合、すなわち、ＩＬ−４（○）およびＩＬ−１３（●）が125Ｉ−ＩＬ−１３の（Ａ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＯＳ細胞への結合および（Ｃ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合と競争する能力、または125Ｉ−ＩＬ−４の（Ｂ）ＣＴＬＬ細胞への結合および（Ｄ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合と競争する能力、の特異性を示すグラフである。結合は４℃で２〜４時間行われそしてデータは競争物質（△）の横座標で観察された特異的結合のパーセンテージとして表された。
図５はＮＲ４を発現する細胞の因子依存性増殖を示すグラフである。（Ａ）ＣＴＬＬ細胞または（Ｂ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞の２００個をサイトカインの非存在下にまたは種々の濃度のＩＬ−２（□）、ＩＬ−４（○）またはＩＬ−１３（●）と共にインキュベートした。４８時間後に生存細胞を計測し、データをＩＬ−２の最高濃度で観察された生存数のパーセンテージとして表した。
図６はＮＲ４（ＩＬ−１３Ｒα）遺伝子の種間保存を示す写真である。
図７はネズミおよびヒトのＮＲ４（ＩＬ−１３Ｒα）遺伝子のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列の表示である。ヒト（Ｈ）およびネズミ（Ｍ）のＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のヌクレオチド配列および予言されるアミノ酸配列を眼で配列しそして配列が最適となるようにギャップ（−）を挿入して配列した。ネズミクローンについての数字付けは、コード領域の部分を形成するヌクレオチドは上方の箱に、一方非翻訳領域のヌクレオチドは下方の箱に示してある。ネズミの予言されたタンパクとヒトの予言されたタンパクの間で同一なアミノ酸は（*）で指摘してある。ネズミのシグナル配列をコードするＤＮＡは下線を付してあり、成熟タンパクの予言された第１アミノ酸はＡ２６またはＴ２７である。
図８は可溶性ＮＲ４に架橋している125Ｉ−ＩＬ−１３を示す写真である。レーン：125Ｉ−ＩＬ−１３（１００，０００ｃｐｍ）＋２μｇ／ｍｌ可溶性ＮＲ４、レーン２：過剰の非標識ＩＬ−１３の存在下における125Ｉ−ＩＬ−１３（１００，０００ｃｐｍ）＋２μｇ／ｍｌ可溶性ＮＲ４、レーン３：過剰の非標識ＩＬ−４の存在下における125Ｉ−ＩＬ−１３（１００，０００ｃｐｍ）＋２μｇ／ｍｌ可溶性ＮＲ４。
図９はＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）と架橋している125Ｉ−ＩＬ−１３の抗−ＮＲ４ポリクローン抗血清による免疫沈降反応の写真である。レーン９〜１１：125Ｉ−ＩＬ−１３（７５０，０００ｃｐｍ）に架橋している可溶性ＩＬ−１３Ｒα（３μｇ／ｍｌの３０μｌ）、およびそれぞれ、対照のウサギ血清で沈降させたもの、または１００μｇ／ｍｌＦＬＡＧペプチドの存在下または非存在下において抗−ＮＲ４ポリクローン抗血清で沈降させたものである。レーン１２〜１４：０．５μｇ／ｍｌの非標識ＩＬ−１３の存在下における125Ｉ−ＩＬ−１３（７５０，０００ｃｐｍ）に架橋している可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）（３μｇ／ｍｌの３０μｌ）、およびそれぞれ１００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドの存在下または非存在下に抗−ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）ポリクローン抗血清で沈降させたものである。
図１０はネズミＮＲ４のＮ−末端アミノ酸配列の表示である。
アミノ酸残基に対する下記の１文字略号および３文字略号が本明細書で使用される。
実施例１
ＮＲ４をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの単離
胚幹細胞株から抽出されたＡｐｏＩ消化ゲノムＤＮＡをλＺＡＰIIバクテリオファージ（ストラタジーン、LaJolla, CA）の中にクローニングした。このライブラリーから得た約１０6プラークを配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（１６）に対応する32Ｐ標識オリゴヌクレオチドでスクリーニングした。ハイブリッド形成陽性のクローンを自動化ＤＮＡシークェンサー（アプライド・バイオシステムズ、Foster City、ＣＡ）を用い製造者の指示に従って配列決定を行った。一つのクローンがヘモポエチン受容体ファミリーの新規なメンバーの一部をコードするように見えた。このゲノムＤＮＡ配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計しそしてマウス腹膜マクロファージ（クロンテク・ラボラトリーズ、Palo Alto、CA）の、マウス皮膚の、マウス肺の、マウス腎のそしてＷＥＨＩ−３Ｂ（ストラタジーン、LaJolla、CA）のλ−バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーからクローンを単離するために通常の方法で使用した。
実施例２
発現ベクターの構築および細胞のトランスフェクション
ＰＣＲを使用して、ＮＲ４の成熟コード領域（Ｔｈｒ２７からＰｒｏ４２４まで、図１）の前にあるＩＬ−３シグナル配列（配列番号：５）およびＮ−末端ＦＬＡＧエピトープ−標識（配列番号：６）をコードするＮＲ４ｃＤＮＡの誘導体を作成した。このＰＣＲ産物を哺乳類発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（１７）の中にクローニングした。使用に先立ち、構築物の全体の配列決定を行った。細胞をトランスフェクトし、そして既に述べられたように選択した（１６、１８）。
実施例３
ノーザン・ブロット
ノーザン・ブロットは既に記載されたように行った（１６）。ハイブリッド形成用プローブの起源は次のものである。すなわち、ＮＲ４については、ヌクレオチド３２〜９８４（図１）からのＰＣＲ産物であり、そしてＧＡＰＤＨに対しては、ｃＤＮＡ断片スパンニングヌクレオチド（１９）である。
実施例４
サイトカイン類と放射性ヨード化サイトカインの使用
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１５は市販品を使用した（Ｒ ＆ Ｄシステムズ、Minneapolis MN）。放射性ヨード化のために、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＰＢＳ）、０．０２％ｖ／ｖトゥイーン２０および０．０２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム、ｐＨ７．４に、サイトカインを１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＩＬ−１３の２μｇをヨードモノクロリド法（２０、２１）を用いて放射性ヨード化し、一方ＩＬ−４の２μｇをジ−ヨード−ボルトン−ハンター試薬（１６）を用いて放射標識した。結合の研究および比放射活性の測定および標識化サイトカインの結合可能性については既に記載されたように行った（２）。
架橋実験のために、組換えネズミＩＬ−１３をＦＬＡＧ標識化タンパクとしてピチア・パストリス中で製造した。
架橋試験のために、精製した可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）の一定量を競争剤の存在下または非存在下に最終容量２０μｌで少なくとも３０分間４０℃で125Ｉ−ＩＬ−１３とインキュベートした。次いで、０．０２％ｖ／ｖトゥイーン２０を含むＰＢＳ中のＢＳ3（スベリン酸ビス（スルホスクシミジル）の１２ｍＭ溶液の５μｌを添加し、そして混合物を４℃で３０分間インキュベートした。試料を４×ＳＤＳ試料緩衝液の８μｌと混合しそして１３％ｗ／ｖＳＤＳ−ＰＡＧＥにより非還元条件下で分析した。ゲルを乾燥しそしてオートラジオグラフィーまたはホスフォイメージャー（PhosphoImager）のいずれかで可視化した。
実施例５
増殖試験
サイトカインに応じて得られるＢａ／Ｆ３細胞およびＣＴＬＬ細胞の増殖をラックス６０ミクロ穴ＨＬ−Ａプレート（ヌンク・インク、IL、USA）中で測定した。細胞を、２０％ｖ／ｖ新生児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で３回洗浄し、同培地に２×１０4細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。この細胞懸濁液の１０μｌ部分を５μｌの種々の濃度の精製組換えサイトカインと共に培養穴の中に入れた。空気中１０％ｖ／ｖＣＯ2を含む完全加湿インキュベーター中で３７℃で２日間インキュベートした後、生存細胞を倒立顕微鏡を用いて計測した。
実施例６
ネズミＮＲ４のクローニングと特性決定
胚幹細胞由来のゲノムＤＮＡのＡｐｏＩ消化物を用いてλＺＡＰII中に一つのライブラリーを構築しそしてヘモポエチン受容体ファミリーの多くのメンバーに見出されるアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒをコードする32Ｐ標識化オリゴヌクレオチドのプールでスクリーニングした。ハイブリッドを形成する一つのバクテリオファージクローンがヘモポエチン受容体ファミリーの新規なメンバーの一部をコードするように見える配列を含むことが見出された。この受容体はＮＲ４という機能的名称が与えられた。このゲノムクローンの配列を使用して、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞の、腹膜マクロファージの、骨髄の、皮膚の、そして腎のライブラリーからＮＲ４をコードするｃＤＮＡを単離した。これらのｃＤＮＡの合成物であるヌクレオチド配列（配列番号：１）および予言されたアミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。このＮＲ４ｃＤＮＡは４２４のアミノ酸残基からなるタンパクをコードすることを予言する。このタンパクの中には、シグナル配列および膜貫通ドメインと思われるものが含まれる。このタンパクの細胞外領域は、保存された４個のシステイン残基と特徴的なＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフ（図１、ＷＳＸＷＳとして太字で記載）を含む典型的なヘモポエチン受容体ドメイン（アミノ酸１１８〜３４０）に加えて、免疫グロブリン−様ドメイン（アミノ酸２７〜１１７）を含んでいた。この新規な受容体の細胞質テール（cytoplasmic tail）は長さが６０アミノ酸であった。
実施例７
ＮＲ４ｃＤＮＡの発現パターン
ＮＲ４ｍＲＮＡの発現パターンをノーザン分析で検討した。５．２ｋｂおよび２．２ｋｂの２個のハイブリッド形成物を多くの組織由来のｍＲＮＡ中に検出した（図２）。ＮＲ４ｍＲＮＡは骨格筋には検出できなかった（図２）。図８はマウス組織内のＮＲ４の発現を示す。
実施例８
ＮＲ４はＩＬ−１３受容体の特異的結合サブユニットであるＩＬ−１３受容体α−鎖（ＩＬ−１３Ｒα）をコードする
ＣＯＳ細胞で発現したＮＲ４を抗−ＦＬＡＧ抗体を用いるウエスタン・ブロットから評価すると、見掛けの分子量は約５０，０００から約７０，０００ダルトンであり、より具体的には約５５，０００から約６５，０００である。これはＮＲ４がＩＬ−１３受容体の結合性サブユニットをコードするかも知れないということを示唆した。この可能性をテストするため、ＮＲ４をＣＯＳ細胞で発現させた。トランスフェクトされていないＣＯＳ細胞は比較的低レベルのＩＬ−４受容体およびＩＬ−１３受容体を発現した。ＮＲ４ｃＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクトすると、ＣＯＳ細胞によって発現されるＩＬ−１３の数は劇的に増加した（図３Ａ、細胞当たり１００，０００から５００，０００まで）が、ＩＬ−４受容体の数は増加しなかった。ＣＯＳ細胞により発現されたＮＲ４に対するＩＬ−１３の親和性は低かった（ＫDは約２〜１０ｎＭ）そしてこのＮＲ４は非標識ＩＬ−１３と競争できた（図４Ａ）がＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９またはＩＬ−１５を含む他のサイトカインとは競争できなかったから、その結合は特異的であった。これらの結果から、ＮＲ４がＩＬ−１３受容体α−鎖（ＩＬ−１３Ｒα）であることが示唆された。
実施例９
ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）およびＩＬ−４ＲαはＩＬ−４受容体およびＩＬ−１３受容体の成分を共有する。
ＩＬ−４受容体とＩＬ−１３受容体の間の関係を研究するため、ＩＬ−４に応答する細胞株ＣＴＬＬを検討した。親のＣＴＬＬ細胞は１個のクラスのＩＬ−４受容体（ＫD約６６０ｐＭ、約３６００受容体／細胞）を発現したがＩＬ−１３受容体は検出されなかった（図３Ｂ）。ＣＴＬＬ細胞によって発現されたＩＬ−４受容体は、125Ｉ−ＩＬ−４の結合が非標識ＩＬ−４と競争できたがＩＬ−１３とは競争できなかったから（図４Ｂ）、特異的であるように見えた。ＣＴＬＬ細胞中でＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）が発現する際、ＩＬ−４受容体の数および親和性には変化がみられなかったが、一方、高親和性ＩＬ−１３受容体の１個のクラスが検出された（図３Ｃ、ＫD約７５ｐＭ、１３５０受容体／細胞）。ＣＴＬＬ細胞内で発現したＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）に対するＩＬ−１３の親和性はＣＯＳ細胞中よりも高かった。これは前者がＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）と相互作用しＩＬ−１３に対する親和性を増強することができるあるタンパクを発現したことを示唆する。以前の研究に基づく同様な候補はＩＬ−４Ｒαである。この可能性を解明するため、ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合に対し125Ｉ−ＩＬ−１３と競争するＩＬ−４の能力を評価した。図４Ｂは125Ｉ−ＩＬ−１３の結合に対する競争ではＩＬ−４とＩＬ−１３は同等に効果的であった（ＩＣ50は約３００ｐＭ、図４Ｃ）のであり、そしてさらにこれらは125Ｉ−ＩＬ−４とも結合に対して競争できたのであった（ＩＣ50は約３００ｐＭ、図４Ｄ）。
実施例１０
ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）はＩＬ−１３による増殖性シグナルの形質導入に必要である。
ＣＴＬＬ細胞は生存および増殖に外因性サイトカイン類の添加を必要とする。ＩＬ−２はＣＴＬＬ細胞に対し強力な増殖性刺激を有する（ＥＣ50は約１００〜２００ｐＭ）一方、ＩＬ−４は比較的弱く（ＥＣ50は２〜７ｎＭ）そしてＩＬ−１３は不活性であった（図５Ａ）。ＣＴＬＬ細胞中にＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）が発現することにより、ＩＬ−１３に応答して（ＥＣ50は約７００ｐＭ）弱く生き残りそして増殖する能力が、そしてＩＬ−４に応答して（ＥＣ50は約７００ｐＭ、図５Ｂ）親細胞よりもややより強く増殖する能力が生じた。
実施例１１
ヒトＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のクローニング
ネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）に相同な遺伝子が他の脊椎動物種に存在するか否かを決定するため、ネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のヌクレオチド８４０〜１２７０を包含するプローブを、ＥｃｏＲＩで消化した種々の種由来のゲノムＤＮＡとハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成は５００ｍＭリン酸水素二ナトリウム（約５×ＳＳＣ）中５０℃で一晩行った。フィルターを４０ｍＭリン酸水素二ナトリウム（約０．２×ＳＳＣ）中５０℃で２時間洗浄し、オートラジオグラフィー様フィルムに４８時間曝した。図６はヒトを含む種々の種由来のゲノムＤＮＡの中に比較的少数（１〜５）のハイブリッド形成バンドが観察されることを示す。これはネズミｃＤＮＡプローブを使用してヒトＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）をクローニングすることが容易であることを示唆する。従って、λＺＡＰIIバクテリオファージ中のヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリーのクローンをネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）ｃＤＮＡ由来の二つのプローブ（ヌクレオチド８２〜８４０およびヌクレオチド８４０〜１２７０）でスクリーニングした。ハイブリッド形成は６×ＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖＳＤＳ中４２℃で一晩行った。フィルターを２×ＳＳＣ：０．１％ｗ／ｖＳＤＳ中５０℃で２時間洗浄しそしオートラジオグラフィー様フィルムに４８時間曝した。両方のネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）プローブとハイブリッドを形成したプラークを釣り上げ、通常の方法で精製した。ハイブリッドを形成するバクテリオファージ由来のこのｃＤＮＡ挿入物をpBluescriptプラスミドの中に切り取り、そしてＡＢＩ自動化シークェンサーを用いてその全体の配列決定を行った。図７は単離されたクローンの配列の合成体を示し、そしてこれらのクローンがネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）と高度の配列類似性を共有する一つのタンパクをコードすることを明らかにする。これらのクローンはこのタンパクの全コード領域をコードする。高度の配列類似性（３２０／４２５アミノ酸、約７５％）はこのｃＤＮＡがネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のヒト同族体であることを予言する。ヌクレオチド配列は配列番号：３として表されそしてそのアミノ酸配列は配列番号：４である。
実施例１２
可溶性ネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）はＩＬ−１３と結合する
Ｎ−末端「ＦＬＡＧ」エピトープ（インターナショナル・バイオテクノロジーズ／イーストマン・コダック、New Haven CT）を持つＮＲ４の可溶性バージョンを発現するような構築物を構築した。まず、哺乳類発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳの誘導体を、それがネズミＩＬ−３のシグナル配列（ＭＶＬＡＳＳＴＴＳＩＨＴＭＬＬＬＬＬＭＬＦＨＬＧＬＱＡＳＩＳ（配列番号：５））をコードするＤＮＡおよびＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：６））を含みそれに続いてユニークなＸｂａＩクローニング部位を含むように作成した。このベクターをｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧと名付けた。成熟ＮＲ４コード領域（Ｔｈｒ２７〜Ｔｈｒ３４４）の細胞外部分はプライマー１４７８および１４８０を用いるＰＣＲによって作成した。生じた産物をＸｂａＩで消化しそしてｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧのＸｂａＩ部位にクローニングしてｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧ／ｓｏ１ＮＲ４を得た。この構築物の同定はジデオキシ配列決定法により確認された。
ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし、発現させた後、抗−ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）アフィニティカラム上でＣＨＯ細胞コンディション化培地から可溶性ＮＲ４を吸着させ遊離のＦＬＡＧペプチド（サイエンス・イメージング・システムズ）で溶出することにより精製した。
ＣＯＳ細胞により発現されたＮＲ４に対しＩＬ−１３の親和性が低いことと一致して、精製した可溶性ＮＲ４はゲルろ過クロマトグラフィーで評価するとＩＬ−１３と結合することができないようであった。しかしながら、感度の高い架橋試験を用いると、可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のＩＬ−１３に結合する能力が証明された（図８、レーン１）。この相互作用は非標識ＩＬ−１３により競争されたが非標識ＩＬ−４によっては競争されることはなかった（図８、レーン２およびレーン３）。
実施例１３
可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）に対するポリクローン抗血清
精製した可溶性ＮＲ４をウサギに注射し３ヵ月後に採血してＮＲ４に対するポリクローン抗血清を調製した。この抗血清は125Ｉ−ＩＬ−１３の可溶性ＮＲ４との架橋産物を免疫沈降させた（図９、レーン１１）が、免疫化前（pre-immune）の血清では免疫沈降は観察されなかった（図９、レーン９）。複合体の免疫沈降はＦＬＡＧペプチドによっては阻害されなかった（図９、レーン１０）。
免疫沈降反応試験は次のように行われた。
架橋反応はトリス−塩酸、ｐＨ７．５を最終濃度４０ｍＭになるまで添加することにより終了させた。次いで、試料を１：５０希釈の対照ウサギ血清またはＦＬＡＧペプチドの存在下にまたは非存在下に予めインキュベートしておいた抗−ＮＲ４血清と混合した。４℃で３０分間インキュベートした後、混合物に５０％ｖ／ｖタンパク質Ｇ−セファロースゲルスラリー（ファルマシア）の４０μｌを添加しそして４℃で３０分間インキュベートした。試料を遠心分離しタンパク質Ｇビーズを３×０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２×濃縮ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の４０μｌと混ぜ、９５℃で２分間加熱した。この上清を非還元条件下で１３％ｗ／ｖＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
実施例１４
ＮＲ４のＮ−末端アミノ酸配列
ＮＲ４のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。これを図１０に示す。
実施例１５
ＩＬ−１３の試験
ＩＬ−１３は喘息などのアレルギー性疾患において重要な免疫グロブリンイソタイプであるＩｇＥの産生に関与するサイトカインである。ＩＬ−１３のレベルを監視することは、従って、重要な診断学的意味がある。ＩＬ−４とＩＬ−１３は多くの生物学的効果を共有しているから、これらのサイトカインを識別する試験法を作成することも重要である。
ＣＯＳ細胞で発現したＮＲ４は125Ｉ−ＩＬ−１３と結合する。この結合はウシ血清やヒト血清などの無関係のタンパクの大量の存在下で非標識ＩＬ−１３により投与量依存的に阻害される。ＩＬ−４はこの状況下では125Ｉ−ＩＬ−１３結合に対して競争する能力を示さない、従って、この試験はＩＬ−１３に対して特異的であるように見える。
この試験法は可溶性ＮＲ４をＥＬＩＳＡプレート上に被覆し、そして、例えば、蛍光標識ＩＬ−１３をプローブとして使用することにより組立てられる。次いで、試験用試料中の非標識ＩＬ−１３の存在が蛍光シグナルの減少として記録される。
ＮＲ４およびＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞を用いることにより、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方を測定する同様な試験法が組み立てられる。これらの細胞には正常にＩＬ−４受容体α−鎖を発現しそしてＮＲ４を発現するように工学的に処理されるＣＴＬＬ細胞が含まれる。125Ｉ−ＩＬ−１３または125Ｉ−ＩＬ−４の結合はＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方の非標識型により阻害することができる。
実施例１６
ＩＬ−４およびＩＬ−１３の修飾
機能的に重要であると予測される分子の領域に突然変異を導入する。ＮＲ４の場合には、この領域は、このサイトカインがＩＬ−４受容体α−鎖に結合するときは、ＩＬ−１３と相互作用する領域、ＩＬ−４受容体α−鎖と相互作用する領域またはＩＬ−４と相互作用する領域を含む。これらの領域は直接の実験、例えば、ＮＲ４の構造またはＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−４受容体α−鎖のような他のタンパクとＮＲ４との複合体の構造を解明することにより、またはその構造に関する情報が存在する類似のタンパク、例えば、成長ホルモン／成長ホルモン受容体の複合体に基づきこれらのタンパクをモデル化することにより決定される。次いで、得られるＮＲ４突然変異体を機能の改善の有無につき個々にテストする。
別の方法では、分子内に無差別突然変異が作られる。適当な技術としては、正しくないｄＮＴＰの取り込みを促進するようなポリメラーゼや反応条件を使用するＮＲ４ｃＤＮＡの合成や、ＤＮＡシャフリングと呼ばれる技術が挙げられる（２３、２４、２５、２６）。
目的のｃＤＮＡの無差別突然変異体を作成した後、潜在的に有用な突然変異体を選別する。ＮＲ４の場合には、一つの試験法は、もしＮＲ４がＩＬ−４受容体α−鎖を欠如している細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）の中で発現されるときは、ＩＬ−４とは如何なる検出感度でも結合できないがＩＬ−１３とは低親和性で結合する細胞が得られるという知識に基づくものである。このようにして、もしＣＯＳ細胞をＮＲ４でトランスフェクトし、そしてＦＩＴＣ−結合ＩＬ−４およびフィコエリトリン−結合ＩＬ−１３と結合させ、未結合リガンドを洗い流すものとすれば、ＩＬ−４は全く結合せずそして結合したＩＬ−１３は洗浄の間に解離するであろう。
これらの細胞をＦＡＣＳ−選別するときは、ＦＩＴＣ−チャンネルにもＰＥ−チャンネルにもシグナルはほとんどあるいは全く得られないであろう。ＣＯＳ細胞をＮＲ４の無差別突然変異体１０6〜１０7でトランスフェクトしそして結合試験のために処理する。野生のＮＲ４でトランスフェクトされたものよりも強くサイトカインに結合するとして選別される細胞はすべてＦＡＣＳで選別することができる。これらの「改良された」ＮＲ４ｃＤＮＡを含むプラスミドを回収し、大腸菌で増やし、そして再度ＣＯＳ細胞を用いてその改良度を確認する。一貫して改良された突然変異体は次にさらにもう一度無差別変化の導入のために使用してさらに改良された分子を得ることができる。この反復プロセスを数回繰り返してもよい。
当技術分野で熟練した者は本明細書に記載された発明が具体的に記載されたこと以外の変更や修正を受け得るものであることを認めるであろう。本発明はそのような変更や修正のすべてを包含することが理解されるべきである。本発明はまた本明細書で個々にあるいはまとめて言及しあるいは指摘した工程、特徴、組成物および化合物のすべてを、そして該工程あるいは特徴のいかなる２以上の組み合わせをも包含する。
引用文献
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配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：アムラド オペレーションズ ピーティーワイ．
エルティーディー．（Amrad Operations PTY. LTD.）
（ii）発明の名称：新規なヘモポエチン受容体およびそれをコードする遺伝子配列
（iii）配列の数：８
（iv）通信宛て名：
（A）名宛人：デイビース コリソン ケイブ（Davies Collison Cave）
（B）街：１リトル コリンス ストリート
（C）市：メルボルン
（D）州：ビクトリア
（E）国：オーストラリア
（F）郵便番号：3000
（v）コンピュータ解読可能形式：
（A）媒体型：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC互換機
（C）オペレイティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウエア：パテントイン リリース#1.0,
バージョン#1.25
（vi）本出願データ：
（A）出願番号：PCT/AU96/00668
（B）出願日：1996年10月23日
（vii）優先権主張の基礎となる出願のデータ：
（A）出願番号：PN6135/95
（B）出願日：1995年10月23日
（A）出願番号：PN7276/95
（B）出願日：1995年12月22日
（A）出願番号：PO2208/96
（B）出願日：1996年09月09日
（viii）代理人情報：
（A）氏名：イー ジョン エル ヒューズ（E John L Hughes）博士
（C）照会先／ドケット番号：ＥＪＨ／ＥＫ
（ix）テレコミュニケーション情報：
（A）電話番号：+61 3 9254 2777
（B）テレファックス：+61 3 9254 2770
（２）配列番号：１に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：1680
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
生物名：ムス・ムスキュルス（mus musculus）
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：61..1332
（xi）配列：配列番号：１
（２）配列番号：２に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：424
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
生物名：ムス・ムスキュルス（mus musculus）
（xi）配列：配列番号：２
（２）配列番号：３に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：1383
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
生物名：ヒト
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：61..1338
（xi）配列：配列番号：３
（２）配列番号：４に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：426
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
生物名：ヒト
（xi）配列：配列番号：４
（２）配列番号：５に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：30
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：ネズミIL-3のシグナル配列
（xi）配列：配列番号：５
（２）配列番号：６に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：８
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：Ｎ末端のFLAGエピトープによる標識
（xi）配列：配列番号：６
（２）配列番号：７に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：31
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：オリゴ1478 5’
（xi）配列：配列番号：７
（２）配列番号：８に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：30
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：オリゴ1480 5’
（xi）配列：配列番号：８
（２）配列番号：９に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：５
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：NR4モチーフ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：MISC＿FEATURE
（B）存在位置：3..3
（x）他の情報：
Ｘは任意のアミノ酸であってよい。
（xi）配列：配列番号：９
（２）配列番号：10に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：27
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：ｍＮＲ４（major）のＮ末端アミノ酸配列
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：MISC＿FEATURE
（B）存在位置：24..24
（x）他の情報：
Ｘは任意のアミノ酸であってよい。
（xi）配列：配列番号：10
（２）配列番号：11に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：27
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：ｍＮＲ４（minor）のＮ末端アミノ酸配列
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：MISC＿FEATURE
（B）存在位置：24..24
（x）他の情報：
Ｘは任意のアミノ酸であってよい。
（xi）配列：配列番号：11
（２）配列番号：12に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：５
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：ヘモポエチン受容体ファミリーの多数の構成員に見出されるペプチドモチーフ
（xi）配列：配列番号：12
本明細書で数値により言及する出版物の文献的詳細は明細書の末尾に集めてある。本明細書で言及したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の配列番号は文献の次に記載してある。
本明細書およびそれに続く請求の範囲を通じて、文脈上他の意味を必要とする場合を除き、「コンプライズ（含む）」という用語、あるいは「コンプライジーズ」または「コンプライジング」などのそれらの変形は、述べられた実体または一群の実体の包含を意味し、他の実体または他の一群の実体の排除を意味するものではないと理解すべきである。
本発明の好ましいヘモポエチン受容体は本明細書では「ＮＲ４」と言及される。このＮＲ４受容体はインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）と相互作用する、従って本明細書ではＩＬ−１３受容体、より具体的にはＩＬ−１３受容体α−鎖（ＩＬ−１３Ｒα）と呼ばれる。これらの用語は特定の主題について互換的に使用される。特定のＮＲ４の起源となる種は１個の縮小文字で与えられる。例えば、ねずみ（murine）は「Ｍ」そしてヒトは「Ｈ」である。組換え型は接頭辞「ｒ」が付されることがある。
組換えＤＮＡ技術の精密化の迅速な発展により、医学分野や類似の保健衛生分野への研究が大いに促進された。サイトカインの研究は特に重要である。とりわけ、多様な細胞の増殖、分化および機能を調節するこれらの分子は重要である。組換えサイトカインの投与やサイトカインの機能および／または合成の調節がある範囲の疾病状態の治療のための医学的研究の焦点となる場合が増加しつつある。
ある範囲のサイトカインや他の分泌される細胞機能調節物質の発見にもかかわらず、比較的僅かなサイトカインしか治療分野で直接使用されたり標的とされたりしていない。この理由の一つは多数のサイトカインが多面的な性質を持っていることである。例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１１は機能的に多面的な分子であり（１，２）、ＩＬ−６依存性の形質細胞腫の細胞株、Ｔ１１６５の増殖を刺激する能力によって特徴付けられたのが最初である（３）。ＩＬ−１１の他の生物学的作用には、多機能性ヘモポエチン原始体の細胞増殖の誘導（４，５，６）、巨核球や血小板の形成の増強（７、８、９、１０）、急性タンパク合成の刺激（１１）および脂肪細胞リポタンパクリパーゼ活性の阻害（１２、１３）が含まれる。
インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）はインターロイキン−４（ＩＬ−４）と幾つかの構造的特徴を共有するもう一つの重要なサイトカインである（１４および１５を参照）。ＩＬ−４の遺伝子とＩＬ−１３の遺伝子とは関連のあるイントロン／エキソン構造を持っておりそしてヒト染色体５の上に共に近くに局在しており、またネズミでも染色体１１のシンテニー領域に存在する（１４、１５）。タンパクレベルでは、ＩＬ−４とＩＬ−１３は４個のシステイン残基を含め約３０％のアミノ酸同一性を共有している。生物学的にも、ＩＬ−１３とＩＬ−４は類似しており、活性化されたＴ−細胞により産生されそして、例えば、マクロファージに作用して分化を誘発しそして炎症性サイトカインの産生を抑制する。さらに、ヒトＩＬ−１３はＢ−細胞増殖に対する共−刺激シグナルとして作用しそして免疫グロブリン・イソタイプ・スイッチングに影響を与えることができる（１４、１５）。ＩＬ−１３および他のヘモポエチンサイトカインの多様かつ多面的な機能はこのグループを重要な研究対象とし、特にサイトカインとその受容体との相互作用のレベルでの研究が重要である。サイトカイン受容体およびサイトカイン−受容体相互作用の操作および制御は多くの治療分野で、とりわけ標的サイトカインが機能的に多面的でありそして標的サイトカインのある機能を阻止したいがそのすべての機能を阻止したくはない場合には、潜在的に極めて重要である。
ＩＬ−１３およびその受容体に関する研究はＩＬ−１３受容体のすべてまたは部分をコードする遺伝子配列をクローニングすることができなかったため妨げられてきた。本発明によれば、ＩＬ−１３受容体α−鎖、すなわちＩＬ−４受容体とも共有されている受容体サブユニットをコードする遺伝子配列が今やクローニングされたのである。これらの遺伝子配列の利用可能性により、構造または機能のレベルにおいてＩＬ−１３の活性並びにＩＬ−１３に関連するサイトカインの活性を調節または監視することができる一群の治療薬および診断薬の開発が可能となる。本発明によれば、構造および機能においてＩＬ−１３に関連するサイトカインの１例はＩＬ−４である。
従って、本発明の一つの側面は動物由来のヘモポエチン受容体または該受容体の誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。
より具体的には、本発明は動物ヘモポエチン受容体−該受容体はＩＬ−１３またはＩＬ−１３の誘導体と相互作用をすることができるものであるが−またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
関連する一つの態様で、本発明は、該受容体が、
（ｉ）ＩＬ−１３またはその誘導体と相互作用をすることができ、そして
（ii）ＩＬ−４とＩＬ−４受容体α−鎖との間でできる複合体と相互作用をすることができる、
ものである、動物ヘモポエチン受容体またはそれらの誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
これらの態様により、ＩＬ−１３の誘導体には、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体および擬症物質（mimetics）が含まれることになる。
本発明は動物ＩＬ−１３受容体α−鎖またはその誘導体をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子にも関する。
関連する一つの態様では、本発明は動物ＩＬ−４受容体またはその誘導体の１成分をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を包含する。
この動物は哺乳類または鳥の１種であることが好ましい。とりわけ好ましい動物としては、ヒト、実験室テスト動物（例えば、霊長類、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、羊、山羊、馬、豚、牛、ロバ）、愛玩動物（例えば、犬、猫）、捕獲した野生の動物（例えば、キツネ、カンガルー、ディンゴー）および家禽（例えば、鶏、鵞鳥、鴨）およびゲーム鳥（例えば、エミュー、ダチョウ）などが挙げられる。本発明はマウスやヒトを例としてあげるが、主題である本発明の範囲はすべての動物および鳥類に及ぶものである。
本発明は配列類似性に基づきヘモポエチン受容体ファミリーのメンバーを同定する能力について部分的に予言する。このアプローチにより、ヘモポエチン受容体をコードする一つの遺伝子配列が本発明により同定された。発現された遺伝子配列は本明細書で「ＮＲ４」と呼ばれる。本発明によれば、ＮＲ４はトランスフェクトされたＣＯＳ細胞により合成されたとき、約５０，０００〜約７０，０００ダルトン、より好ましくは約５５，０００〜約６５，０００ダルトンの見掛けの分子量を持っている。ＮＲ４はＩＬ−１３と特異的にかつ低親和性をもって結合する、それ故、ＩＬ−１３受容体α−鎖であると考えられる。従って、「ＮＲ４」と「ＩＬ−１３受容体α−鎖」（または「ＩＬ−１３Ｒα」）とは本明細書を通して互換可能なものとして使用される。さらに、ＩＬ−１３のその受容体への結合はＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞内でＩＬ−４またはその成分により競争的に阻害されることが見出された、そしてこれはＩＬ−１３と受容体との相互作用を制御する方法を提供できるものであり、そして擬症物質の調製および構築のための基礎をも提供するものである。
本発明の別の側面では、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を持つＩＬ−１３受容体α−鎖またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。配列の全部または一部に言及しているのは、二つの受容体の各部分を含むハイブリッド分子を定義して含めることを意図している。単一アミノ酸を包含することは意図していない。
本発明のさらなる態様では、ＩＬ−１３受容体α−鎖をコードしそして配列番号：１に実質的に記載されたヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
本発明のさらに別の側面では、配列番号：４に記載されたアミノ酸配列を有するＩＬ−１３受容体α−鎖またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
本発明のさらなる態様では、ＩＬ−１３受容体α−鎖をコードしそして配列番号：３に記載されたようなヌクレオチド配列を実質的に有するヌクレオチド配列またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
従って、本発明は配列番号：１または配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列または配列番号：２または配列番号：４に記載されたアミノ酸配列またはこれらに対し１個または複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、欠失および／または付加がなされたものに及ぶことになる。
本発明はさらに、低厳格条件下で配列番号：１または配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの相補型とハイブリッドを形成することができる核酸分子に及ぶことになる。
本発明は組換えヘモポエチン受容体および特に組換えＮＲ４およびＮＲ４を含む組換えハイブリッドに及ぶ。組換えポリペプチドはＩＬ−１３と低親和性で相互作用することが好ましく、高い親和性で相互作用すればより一層好ましい。
とりわけ好ましい態様では、ポリペプチドは下記の特性のうちの少なくとも二つを有するものである。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と少なくとも低親和性で相互作用すること、および
（iv）ＣＯＳ細胞で発現させたとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を有すること。
関連する態様では、このポリペプチドは下記の特性のうちの少なくとも三つを有する。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と少なくとも低親和性で相互作用すること、および
（iv）ＣＯＳ細胞で発現させたとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を有すること、
（ｖ）ＩＬ−４受容体α−鎖由来のアミノ酸配列を含むこと、そして
（vi）ＩＬ−１３と相互作用をすることができ、かつその相互作用がＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞中でＩＬ−４により競争的に阻害されること。
本明細書で「組換えヘモポエチン受容体」、「ＮＲ４」、「ＩＬ−１３受容体」または「ＩＬ−１３受容体α−鎖」と言及するときは、それらの一部、断片、部分、相同体、ハイブリッドまたはアナログなどのそれらの誘導体への言及も含まれる。誘導体は機能的であってもなくてもよく、または非機能的ではあるが受容体の全部または一部に対する抗体と免疫学的に相互作用し得るものであってもよい。受容体の誘導体は受容体−リガンド相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストをも包含する。機能とは、ＩＬ−１３またはその誘導体と相互作用するＮＲ４の能力あるいは可溶性ＮＲ４の場合にはＩＬ−１３で誘発されたある細胞の活性と競合する能力により便宜的に定義される。
本発明により提供される特に好ましい誘導体には、高親和性でＩＬ−１３とまたは高親和性でＩＬ−１３およびＩＬ−４と結合することができるＩＬ−１３受容体α−鎖の誘導体が含まれ、また誘導体にはＩＬ−１３受容体α−鎖と、例えば、ＩＬ−１３とも高親和性で結合するＩＬ−４受容体α−鎖の間などのキメラ分子が包含される。
本発明により提供される他の融合分子またはキメラ分子には、ＮＲ４とヘモポエチン受容体ファミリーのメンバー、受容体チロシンキナーゼ、ＴＮＦ／ＮＧＦ受容体およびＧタンパク質−共役受容体の間のものが含まれる。例えば、キメラにはＮＲ４とＩＬ−１３結合タンパク、ＩＬ−４受容体α−鎖、ＩＬ−２受容体γ−鎖またはＩＬ−５などの気管支喘息やアレルギーに関与する他のサイトカインに対する受容体との間に生じ得る。他の重要なキメラにはＮＲ４と免疫グロブリンまたは特定の細胞または組織にＮＲ４を標的化させる他の分子、ＮＲ４と毒素、およびＮＲ４と成長因子が含まれる。
本明細書において４２℃の低厳格性というときは、ハイブリッド形成条件においては少なくとも約１％ｖ／ｖから少なくとも約１５％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩を、そして洗浄条件においては少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍまでの塩を範囲として包含する。必要なときは、中度の厳格性などの別の厳格条件を適用することもできる。中度の厳格性は、ハイブリッド形成条件においては少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくとも約３０％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍの塩を、そして洗浄条件においては少なくとも約０．５Ｍから少なくとも約０．９Ｍの塩を範囲として包含し、あるいは高厳格性は、ハイブリッド形成条件においては少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖまでのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を、そして洗浄条件においては少なくとも約０．０１Ｍから少なくとも約０．１５Ｍの塩を範囲として包含する。
本発明のもっと別の側面では、ＩＬ−１３受容体α−鎖をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列を有するものあるいは構造的に類似するＩＬ−１３受容体α−鎖またはその誘導体をコードしそして配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはその相補型に低厳格性条件下でハイブリッドを形成することができる核酸分子が提供される。
本発明のさらに別の側面では、配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列を持つＩＬ−１３受容体α−鎖をコードするヌクレオチド配列またはコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が、または配列番号：２または配列番号：４に記載された配列に少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、かつ配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列に低厳格性条件下でハイブリッドを形成することができるものを含む核酸分子が提供される。
本発明により提供される核酸分子は一般に単離された形のものであり、一本鎖でも二本鎖でも、直鎖状でも閉じた環状のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）でも、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡでも、あるいはＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの形などのそれらの結合物でもよい。特に好ましい態様では、核酸分子はベクターの形であり、特定の宿主細胞内で発現させることができる発現ベクターが最も好ましい。特に有用な宿主細胞としては原核細胞、哺乳類細胞、酵母細胞および昆虫細胞が挙げられる。この細胞は細胞株の形であってもよい。
本発明のこの側面により、本明細書で先に述べたＩＬ−１３受容体α−鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクターが提供される。該発現ベクターは特定の宿主細胞内で発現することができる。
本発明の別の側面では、配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドが提供される。この類似性パーセンテージは少なくとも約６０％が好ましく、少なくとも約７０％がより好ましく、少なくとも約８０〜８５％がさらに好ましく、そして少なくとも約９０〜９５％またはそれ以上がさらに一層好ましい。
本発明により提供される組換えポリペプチドは、従って、ＩＬ−１３受容体α−鎖の成分、部分、断片、誘導体、相同体、またはアナログを含み、そして配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列、またはその全部または一部と少なくとも約５０％の類似性を有する分子、または配列番号：１または配列番号：３に記載されたヌクレオチド配列またはそれらの相補型とハイブリッドを形成することができる分子によりコードされることが好ましい。この組換え分子はグリコシル化されていてもいなくてもよい。グリコシル化型であるときは、グリコシル化は天然に生ずるＩＬ−１３受容体α−鎖と実質的に同じであってもよく、またはグリコシル化の修飾型であってもよい。グリコシル化の変更または相違はＩＬ−１３受容体α−鎖の結合活性に影響を与えることも与えないこともある。
組換えＩＬ−１３受容体α−鎖は可溶性の形であることも、細胞表面上に発現されることもまたは固体支持体または別の分子に結合したりまたは融合したりしていることもある。
本発明はさらに下記の特性のうちの少なくとも二つを有する組換えポリペプチドを製造する方法を提供する。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはそれに少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と低親和性で相互作用すること、そして
（iv）ＣＯＳ細胞中で発現させるとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を持つこと。
該方法は、本発明の遺伝子構築物を含む細胞を、該遺伝子構築物中の核酸分子を発現して組換えポリペプチドを産生するのに十分な時間および条件の下で培養する工程、そして該組換えポリペプチドを単離する工程を含んで成る方法である。
別の態様は下記の特性のうちの少なくとも三つを有する組換えポリペプチドを製造する方法を提供する。
（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に実質的に記載されたアミノ酸配列またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するアミノ酸配列を含むこと、
（ii）配列番号：１または配列番号：３に実質的に記載されたヌクレオチド配列またはその全部または一部に少なくとも約５０％の類似性を有するヌクレオチド配列によりコードされるものであること、
（iii）ＩＬ−１３またはその誘導体と少なくとも低親和性で相互作用すること、
（iv）ＣＯＳ細胞中で発現させたとき、ウエスタン・ブロット分析により測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を持つこと、
（ｖ）ＩＬ−４受容体α−鎖由来のアミノ酸配列を含むこと、そして
（vi）ＩＬ−１３と相互作用をすることができること、かつ、その相互作用がＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞内でＩＬ−４により競争的に阻害されること。
該方法は、本発明の融合遺伝子構築物を含む細胞を、該融合遺伝子構築物内の核酸分子が発現し組み換えポリペプチドを産生するのに十分な時間および条件の下で培養する工程および該組換えポリペプチドを単離する工程を含んで成る方法である。
本発明はさらに上記の組換えポリペプチドを発現する動物細胞などの細胞にまで及ぶ。
本発明の別の態様では、組換えＩＬ−１３受容体α−鎖の化学的アナログが提供される。
上に述べたように、本発明はさらにＮＲ４のある範囲の誘導体を提供する。誘導体には、ＮＲ４ポリペプチドおよび対応する遺伝子配列の断片、一部、部分、変異体、ハイブリッド（融合分子やキメラ分子を含む）、相同体およびアナログが含まれる。一つの好ましい態様では、この誘導体は高親和性でもってＩＬ−１３と結合する。他の好ましい誘導体はアゴニスト、アンタゴニストまたは擬症物質として作用する。これらの誘導体には、ＮＲ４に１個または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加されたもの、およびＮＲ４をコードする遺伝子配列に１個または複数のヌクレオチドが置換、欠失、および／または付加されたものも含まれる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列への「付加」には、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合またはヌクレオチド配列への融合も含まれる。本明細書で「ＮＲ４」と言及するときは、機能的誘導体や「ＮＲ４」と免疫学的に相互作用し得る誘導体も含めそのすべての誘導体を指している。本発明はネズミＮＲ４、ヒトＮＲ４またはそれらの誘導体の間などのハイブリッド分子にも及ぶ。特に好ましいハイブリッドはＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を含むものである。
本明細書において提供されるＮＲ４の類似体には、側鎖の修飾、ペプチド合成、ポリペプチド合成またはタンパク合成の間における非天然型アミノ酸および／またはそれらの誘導体の取り込み、および架橋剤や、タンパク性分子またはそれらのアナログにコンホーメーション上の制約を加える他の方法の使用などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明によって提供される側鎖の修飾の例としては、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化に続くＮａＢＨ4による還元、メチルアセチミデートを用いるアミジノ化（amidination）、無水酢酸を用いるアシル化、シアネートを用いるアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸および無水テトラハイドロフタル酸を用いるアミノ基のアシル化、およびピリドキサル−５−リン酸に続いてＮａＢＨ4で還元することによるリシンのピリドキシレーションなどのアミノ基の修飾が挙げられる。
アルギニン残基のグアニジン基は２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサルなどの試薬を用いて複素環縮合産物の形成により修飾することができる。
カルボキシル基はＯ−アシルイソウレア形成を経るカルボジイミド活性化それに続く、例えば対応するアミドへの誘導により修飾することができる。
スルフヒドリル基はヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いるカルボキシメチレーション、システイン酸への過ギ酸酸化、他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、４−クロロマーキュリベンゾエート、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、フェニルマーキュリクロライド、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を用いる水銀誘導体の形成、アルカリ性ｐＨでシアネートを用いるカルバモイル化などの諸方法により修飾することができる。
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドを用いる酸化または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイドまたはスルフェニルハライドを用いるインドール環のアルキル化により修飾することができる。チロジン残基は、他方、テトラニトロメタンを用いる硝酸化により改変し３−ニトロチロジン誘導体を形成することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾はヨード酢酸誘導体を用いるアルキル化またはジエチルピロカーボネートを用いるＮ−カルボエトキシレーションにより達成することができる。
ペプチド合成の間に非天然型アミノ酸および誘導体を取り込む例としては、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、ザルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書で提供される非天然型アミノ酸のリストを表１に示す。
架橋剤は、例えば、３Ｄコンホーメーションを安定化するために使用することができ、ｎ＝１からｎ＝６までのスペーサー基（ＣＨ2）nを持つ二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ−二官能性架橋剤および通常Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ−反応性部分とマレイミドまたはジチオ部分（ＳＨ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基の特異的反応性部分とを持つヘテロ−二官能性試薬を使用する。また、ペプチドのコンホーメーションは、例えば、ＣαおよびＮα−メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のＣαとＣβ原子の間に二重結合の導入、およびＮ末端とＣ末端の間、二つの側鎖の間または側鎖とＮ末端またはＣ末端との間にアマイド結合を形成させるなどして共有結合を導入することにより環状ペプチドまたは環状アナログの形成により制約することができる。
これらのタイプの修飾は個体に投与するとき、あるいは診断試薬として使用するために、ＮＲ４を安定化するために重要である。
本発明はさらにＮＲ４のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することができる、すなわちＮＲ４の機能的アナログとして作用することができるＮＲ４の化学的アナログを提供する。化学的アナログは必ずしもＮＲ４から誘導されるとは限らず、ある種のコンホーメーションの類似性を共有するものであってもよい。また、化学的アナログはＮＲ４のある種の物理化学的性質を真似するように特別に設計することもできる。化学的アナログは化学的に合成することができまたは例えば天然物のスクリーニングにより検出することができる。
ＮＲ４の同定により、ＮＲ４の発現を調節したりＮＲ４の活性を調節したりすることができる１群の治療に有用な分子の誕生を可能とする。本発明により提供される調節物質にはＮＲ４遺伝子発現またはＮＲ４タンパク活性のアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる。ＮＲ４遺伝子発現のアンタゴニストにはアンチセンス分子、リボザイムおよび共−抑制分子（co-suppression molecules）が含まれる。アゴニストにはプロモーター能を増強したりまたは負の調節機構を妨害したりする分子が含まれる。ＮＲ４タンパクのアゴニストには抗体、リガンドおよび擬症物質が含まれる。ＮＲ４のアンタゴニストには抗体および阻害ペプチド断片が含まれる。細胞がＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を共−発現するときは、アゴニストおよびアンタゴニストはこのＩＬ−４受容体α−鎖を標的とすることができる。
本発明の別の態様では、ヒトにおけるＮＲ４遺伝子の発現を調節する方法が提供される。この方法はＮＲ４をコードするＮＲ４遺伝子をＮＲ４発現の調節物質の有効量と、ＮＲ２の発現を高く調節しまたは低く調節しまたは別の仕方で調節するのに十分な時間および条件の下で、接触させることを含んでなる方法である。ＮＲ４をコードする核酸分子またはその誘導体を細胞内に導入して、例えば、欠陥を持つまたは一つ以上の望ましくない変異を持つ内因性ＮＲ４遺伝子配列の置換を含め、その細胞のＮＲ４関連活性を増強したり改変したりすることができる。逆に、オリゴヌクレオチドなどのＮＲ４アンチセンス配列（または共−抑制のためのセンス配列）を導入して、内因性のＮＲ４遺伝子を発現しているどの細胞のＮＲ４関連活性をも減少させることができる。リボザイムも使用することができる。
本発明の別の側面は、ヒトにおけるＮＲ４の活性を調節する方法を提供する。この方法はＮＲ４活性を増加または減少させるのに十分な時間および条件の下である分子の調節有効量を該哺乳類に投与することを含んでなる方法である。この分子はタンパク性の分子であっても化学的実体であってもよくそしてＮＲ４の誘導体またはそのリガンドまたは化学的アナログまたはＮＲ４の切断変異体またはそのリガンドであってもよい。
例えば、ＩＬ−１３とＩＬ−４は免疫応答の調節に関与し、そして喘息などのアレルギー性またはアトピー性疾患と関連する免疫グロブリン・イソタイプであるＩｇＥの産生に関与している。ＩＬ−１３／ＩＬ−４とそれらの受容体との相互作用を調節することはアレルギー状態などの炎症状態を治療するのに重要であり得る。ＩＬ−４／ＩＬ−１３およびＩｇＥのレベルの上昇はネフローゼ症候群、春季カタルおよび角結膜炎などの疾病にも重要である。本明細書でその治療法が提供される他の疾病としては、気管支喘息、鼻炎（perennial rhinitis）およびアトピー性皮膚炎が挙げられる。ＩＬ−１３−受容体相互作用の調節が重要となり得る他の病態としては、ＩＬ−１３がサイトカイン形成を誘発し、今度はこのサイトカインが疾病の開始、進行および／または重篤度に関与するような病態が含まれる。同様に、ＩＬ−４−受容体相互作用の調節も疾病状態を制御するのに重要である。例えば、一部の癌はサイトカインＩＬ−１３またはＩＬ−４により悪化させられることがある。これらは免疫抑制効果または免疫抑制効果分子を誘発し、今度はこれが癌の成長に応答する身体の能力を減退させるのである。
従って、本発明はＮＲ４またはその誘導体またはＮＲ４発現またはＮＲ４活性の調節物質および１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含んでなる薬学的組成物を提供する。これらの成分は「活性成分」と呼ばれる。
これについては、前に記載した組換えヘモポエチン受容体またはそのリガンド（例えば、ＩＬ−１３）結合性部分および１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含んでなる薬学的組成物が提供される。
別の態様では、前に述べた組換えヘモポエチン受容体に対するリガンド（例えば、ＩＬ−１３）および１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤を含んでなる薬学的組成物が提供される。
本発明のさらなる側面は、動物の治療方法を提供する。この方法は前に記載した組換えヘモポエチン受容体またはそのリガンド結合性部分または該ヘモポエチン受容体に対するリガンド（例えば、ＩＬ−１３）の治療有効量を、該治療が実質的に達成されるのに十分な時間および条件の下であるいは実質的に改善される条件の下で、該動物に投与することを含むものである。
注射可能な用途に適する薬学的剤形としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散剤および滅菌した注射可能な溶液または分散剤の用時調製のための滅菌粉末が挙げられ、あるいはクリームの形状であってもまたは局所適用に適した他の剤形であってもよい。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌や糸状菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は溶媒または分散剤であることができ、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール、およびその他のもの）、それらの適当な混合物、および植物性油などを含む。例えば、リシチン（licithin）などの皮膜の使用により、分散剤の場合には必要な粒子サイズの維持によりそしてスーパーファクタントの使用により、適当な流動性を維持することができる。微生物の作用の防止は種々の抗細菌物質および抗かび物質、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チルメロサル（thirmerosal）およびその他により可能となる。多くの場合、等張物質、例えば、砂糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期間吸収は吸収を遅延させる物質、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物の中で使用することにより可能とすることができる。
注射可能な滅菌溶液は必要な量の活性化合物を必要な場合は上に挙げた他の様々な成分と共に適当な溶媒の中に溶解し次いで無菌ろ過を行うことにより調製される。一般に、分散剤は様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体および上に挙げたものの中の必要な他の成分を含む滅菌担体の中に取り込むことにより調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥法および凍結−乾燥法である。これらは予めそれらの無菌ろ過された溶液から、活性成分プラス付加的な必要成分の粉末を生ずる。
活性成分を適当に保護するときは、例えば、不活性な希釈剤または資化し得る食用の担体と共に経口投与することができ、あるいはそれを固いまたは軟らかい殻のゼラチンカプセルの中に閉じ込めることができ、あるいはそれを錠剤中に圧縮することができ、あるいは食事の食品と共に直接摂取することができる。治療のための経口投与を行うためには、活性化合物は賦形剤と混ぜ、消化可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ、カプセル、エリクサル、懸濁剤、シロップ、ウェハース、その他の形で使用される。このような組成物および調製物は少なくとも１重量％の活性化合物を含むべきである。この組成物および調製物のパーセンテージは、もちろん、変動するものであり、単位重量の約５％から約８０％までの間にあるのが便宜である。治療上有用な組成物の中の活性化合物の量は適当な投与量が得られるようなものである。本発明による組成物または調製物は経口投与の単位形態が活性化合物を約０．１μｇと２０００ｍｇの間で含むように調製されることが好ましい。
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなども後にリストされる成分を含むことができる。ガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどのバインダー、ジカルシウムホスフェートなどの賦形剤、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、その他の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤、およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤またはペパーミント、サリチル酸メチル（oil of wintergreen）、または桜の芳香などの芳香剤を添加することができる。投与単位の形態がカプセルのときは、上のタイプの物質に加えて液体の担体を含めることができる。投与単位の物理的形態を被覆あるいは別の仕方で修飾するための様々な物質がほかにもある。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルはシェラック、砂糖または両方で被覆することができる。シロップまたはエリクサルは活性化合物、甘味剤として砂糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素および桜またはオレンジなどの芳香剤を含むことができる。もちろん、いかなる投与単位形態を作る場合に使用されるどんな物質も薬学的に純粋でありそしてその使用量では実質的に無毒であるべきである。さらに、活性化合物（単数または複数）は制御放出（sustained-release）用の調製物や処方に加えることもできる。
本発明はクリーム、ローションおよびゲルなどの局所適用に適した形態をも包含する。
薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤としては、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗細菌および抗かび剤、等張物質および吸収遅延物質などのいずれかおよびすべてが挙げられる。このような媒体や物質を薬学的に活性な物質に使用することは当技術分野では良く知られている。通常の媒体または物質が活性成分と配合禁忌である場合を除き、治療用組成物にそれらを使用することは本発明に包含される。補充的な活性成分もこの組成物の中に取り込むことができる。
投与の容易および投与量の均一性のため投与単位の形態で非経口的組成物を処方することはとりわけ有利である。本明細書で使用されるとき投与単位形態とは治療すべき対象哺乳類に対し１回投与に適した物理的に区別された単位を指し、各単位は必要な薬学的担体との組み合わせで望まれる治療効果を生じさせるように計算された活性物質の予め計測された量を含んでいる。本発明の新規な投与単位形態の仕様は、（ａ）活性物質のユニークな特性および達成すべき具体的治療効果、および（ｂ）身体の健康が損なわれている疾病状態を持つ生物対象における疾病の治療のためにこのような活性物質を混ぜ合わせる技術上の固有の制約、により支配されそして直接それらに依存している。
主要な活性成分は便利で効果的な投与のために、前に開示したような投与単位形態で、その有効量が薬学的に許容され得る適当な担体と混ぜ合わされる。単位の投与形態は、例えば、０．５μｇから約２０００ｍｇにわたる量で主要な活性化合物を含むことができる。比率で表すと、活性化合物は一般に担体の１ｍｌ当たり約０．５μｇから約２０００ｍｇまで存在する。補充的活性成分を含む組成物の場合は、投与量は該成分の通常の投与量および投与方法を参照して決定する。
薬学的組成物は標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターのような遺伝子分子を含むこともでき、該ベクターはＮＲ４発現またはＮＲ４活性を調節することができる核酸分子を担っている。このベクターは例えばウイルスベクターであることができる。
本発明のさらに別の側面はＮＲ４に対する抗体およびその誘導体またはそのリガンド（例えば、ＩＬ−１３）に関する。このような抗体はモノクローン抗体またはポリクローン抗体であることができ、そして天然に生ずるＮＲ４への抗体から選択することができ、あるいはＮＲ４またはその誘導体に対し特異的に高めることもできる。後者の場合は、ＮＲ４またはその誘導体はまず担体分子と結合することが必要になることがある。本発明の抗体および／または組換えＮＲ４またはその誘導体は治療剤または診断試薬として特に有用である。
例えば、ＮＲ４およびその誘導体はＮＲ４への天然に生ずる抗体のスクリーニングに使用することができる。これらは、例えば、自己免疫疾患の一部で生ずる。また、ＮＲ４をスクリーニングするために特異的抗体を使用することができる。このような試験の技法は当技術分野で良く知られており、例えば、サンドイッチ試験やＥＬＩＳＡが含まれる。ＮＲ４レベルおよび／またはＩＬ−１３レベルの知識はある種の癌または癌の素因の診断のためまたはある種の治療プロトコルの監視のために重要であり得る。特に、ＩｇＥ応答またはＩＬ−１３またはＩＬ−４またはその両方を監視することが重要である。これらは、今度は免疫系に影響を及ぼすからである。
本発明のＮＲ４に対する抗体はモノクローンでもポリクローンでもよい。また、Ｆａｂ断片などの抗体の断片も使用することができる。さらに、本発明は組換え抗体および合成抗体に及びそして抗体ハイブリッドにまで及ぶ。「合成抗体」は本明細書では抗体の断片および抗体のハイブリッドを含むと考える。本発明のこの側面の抗体は免疫治療法にとりわけ有用であり、受容体または受容体−リガンド相互作用の評価または治療計画のプログラムの監視のための診断手段として使用することもできる。
例えば、特異的抗体をＮＲ４タンパクのスクリーニングに使用することができる。後者は、例えば、細胞抽出液または他の生物学的液体中のＮＲ４レベルをスクリーニングするための手段としてまたは培養物上清から組換え手段で調製されたＮＲ４を精製するための手段として重要であろう。本明細書で提供される試験のための技法は当技術分野で知られており、例えば、サンドイッチ試験やＥＬＩＳＡが含まれる。
上に論じた最初に述べた抗体に対するいかなる第２の抗体（モノクローン抗体、ポリクローン抗体または抗体断片または合成抗体）も本発明の範囲に含まれるべきものである。第１および第２の抗体は両方とも検出試験に使用することができ、あるいは第１の抗体は市場で入手可能な抗−免疫グロブリン抗体と共に使用することができる。本明細書で提供される抗体にはＮＲ４のどの領域に特異的な抗体であってもすべて含まれる。
ポリクローン抗体およびモノクローン抗体は両方とも受容体で免疫化することにより取得することができ、そしていずれのタイプも免疫試験に利用することができる。両方のタイプの血清を得る方法は当技術分野で良く知られている。ポリクローン血清はあまり好ましくないが、適当な実験室動物にＮＲ４またはその抗原部分の有効量を注射し、その動物から血清を集め、そして既知の免疫吸着法のいずれかにより特異的な血清を単離することにより、比較的容易に調製される。この方法により製造された抗体は事実上どのタイプの免疫試験にも利用可能であるが、この生産物の潜在的不均質性のため一般的にはあまり好ましくない。
免疫試験でのモノクローン抗体の使用は、大量にそれを作る能力があることおよび生産物の均質性のためとりわけ好ましい。不死の細胞株と免疫原調製物に対して感作させたリンパ球を融合させて作成したモノクローン抗体生産用のハイブリドーマ細胞株の調製は当技術分野で熟練した者に良く知られた技法により行うことができる。
本発明の別の側面は主体からの生物試料内のＮＲ４を検出する方法を提供する。該方法は該生物試料をＮＲ４またはその誘導体または同族体に特異的な抗体と、抗体−ＮＲ４複合体が形成するのに十分な時間および条件の下で接触させ、そして該複合体を検出することを含んで成る。
ＮＲ４が存在することはウエスタン・ブロッティングやＥＬＩＳＡによるなどの幾つかの方法で確認できる。広い範囲の免疫試験法が利用できることは米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号および第４，０１８，６５３号を参照することにより見ることができる。これらは、もちろん、従来の競争的結合試験におけると同様に非−競争的タイプの１部位試験および２部位試験の両方または「サンドイッチ」試験を含んでいる。これらの試験は標的への標識化抗体の直接結合をも含んでいる。
サンドイッチ試験は中でも最も有用でありそして普通に使用されている試験であって、本発明における使用にとっても好ましい。サンドイッチ試験法は幾つかの変法があり、それらのすべてが本発明に包含されるものである。簡単に言えば、典型的なホワード試験（forward assay）では、非標識化抗体が固体基質上に固定化されておりそして試験対象の試料が結合した分子と接触させられる。適当な時間、すなわち抗体−抗原複合体の形成を行わせるのに十分な時間、インキュベートした後、抗原に特異的な第２の抗体であって検出可能なシグナルを形成することができるレポーター分子で標識された抗体を次に添加し、抗体−抗原−標識化抗体の別の複合体が形成するのに十分な時間インキュベートする。未反応物質をすべて洗い流し、そしてレポーター分子が形成したシグナルの観察により抗原の存在が測定される。この結果は可視的なシグナルの簡単な観察による定性的なものであることもあり、また既知の量のハプテンを含む対照試料と比較することにより定量化することもできる。ホワード試験の変法には試料と標識化抗体の両方が結合抗体に同時に添加される同時試験が含まれる。これらの技法は当技術分野の熟練した者に良く知られており、容易に分かるような僅かな修飾を包含するものである。本発明によれば、試料は細胞抽出物、組織生検またはおそらく血清、唾液、粘液分泌物、リンパ液、組織液および呼吸液などのＮＲ４を含むかも知れないものである。試料は、従って、一般に生物学的液体、細胞抽出液、骨髄またはリンパ液、組織抽出物（例えば、腎臓、肝臓、脾臓、など）、醗酵液および細胞培養物や細胞条件化培地からの上清を含む生物試料である。
典型的なホワードサンドイッチ試験では、ＮＲ４またはその抗原部分に特異性を有する第１の抗体は固体表面に共有結合または受動的に結合している。固体表面はガラスまたはポリマーが代表的であり、最も普通に使用されるポリマーはセルローズ、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は管、ビーズ、ミクロプレートの平円盤の形、または免疫試験を行うのに適した表面であればなんでもよい。結合工程は当技術分野で良く知られており、一般に架橋共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体は試験試料の調製の際に洗浄される。試験対象の試料の一部をとり、ついで固相複合体に加え、そして抗体中に存在するサブユニットのいずれかと結合するのに十分な時間（例えば、２〜４０分）および適当な条件（例えば、２５℃）の下でインキュベートする。インキュベーション期間の後に、抗体サブユニット固相を洗浄し乾燥し、そしてこのハプテンの一部に特異的な第２の抗体とインキュベートする。第２の抗体はレポーター分子に結合しており、この分子が第２の抗体のハプテンへの結合を示すために用いられる。
別の方法は生物試料中の標的分子を固定化し、ついでレポーター分子で標識されまたはされていない特異的抗体にこの固定化された標的を曝す。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度に依存して、結合した標的は抗体による直接の標識化により検出可能となる。また、第１の抗体に特異的な第２の標識化抗体を標的−第１の抗体複合体と接触させ、標的−第１抗体−第２抗体の三次複合体を形成させる。この複合体はレポーター分子が発するシグナルにより検出される。
本明細書で使用されるとき「レポーター分子」は、その化学的性質により抗原−結合抗体の検出を可能とする、分析的に同定可能なシグナルを供給する分子を意味する。検出は定性的にも定量的にも行うことができる。このタイプの試験で最も普通に用いられるレポーター分子は、酵素、発蛍光団または放射性核種を含む分子（すなわち、放射性同位元素）および化学発光性分子である。酵素免疫試験の場合には、酵素を通常グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸により第２の抗体に結合させる。しかし、容易に分かるように、熟練した技術者に容易に利用可能な多様な異なる結合手段が存在する。通常使用される酵素としては、中でも、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコーズオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。特異的酵素と共に使用されるべき基質は一般に対応する酵素による加水分解の際の検出可能な色変化の生成に対して選択される。適当な酵素の例としては、アルカリホスファターゼおよびペルオキシダーゼが挙げられる。発蛍光性基質を採用することも可能である。これは上に述べた発色原性基質よりもむしろ蛍光性の生産物を生ずる。全ての場合に、酵素−標識化抗体を第１抗体ハプテン複合体に添加して、結合させ、ついで過剰の試薬を洗い流す。ついで、適当な基質を含む溶液を抗体−抗原−抗体の複合体に添加する。この基質は第２の抗体に結合した酵素と反応し、定性的な視覚的シグナルを生じ、これは通常分光学的に定量化することができ、試料中に存在したハプテンの量の指標を与える。「レポーター分子」はラテックスビーズなどの上での赤血球などの細胞凝集または凝集の阻害の利用にも広がっている。
また、フルオレッセインやローダミンなどの蛍光性化合物は抗体の結合活性を変えることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定波長の光を照射することにより活性化すると、フルオロクロム−標識化抗体が光エネルギーを吸収し、分子内で励起状態を誘発し、続いて光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を発射する。ＥＩＡの場合のように、蛍光性標識化抗体は第１抗体−ハプテン複合体に結合させられる。未結合試薬を洗い流した後、残りの三次複合体を次に適当な波長の光に曝すと、観察される蛍光は問題のハプテンの存在の証拠となる。免疫蛍光法およびＥＩＡ法は両方とも当技術分野で十分に確立されており、本発明の方法にとってとりわけ好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光性分子または生物発光性分子などの他のレポーター分子も採用することができる。
ＮＲ４およびＩＬ−４受容体α−鎖を発現することができる細胞の場合は別の形の試験ができる。例えば、ＩＬ−４受容体α−鎖とＮＲ４がＣＯＳ細胞などの細胞上に共−発現されるときは、ＩＬ４の存在下でＩＬ−１３は高親和性でＮＲ４に結合する。
一つの理論または一つの作用様式に本発明を制限する積もりはないが、ＮＲ４とＩＬ−４受容体とが同一細胞中で発現されるとき、これらはＩＬ−４受容体およびＩＬ−１３受容体両方の形成に寄与する。ＩＬ−４の場合には、結合はまずＩＬ−４受容体α−鎖を介して起こり、ついでこの複合体にＮＲ４が相互作用する。ＩＬ−１３の場合には、結合はまずＮＲ４に対して起こり、ついでこの複合体とＩＬ−４受容体α−鎖が相互作用してシグナル伝達を可能とする高親和性受容体を形成する。ＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖との共−発現の結果は、ＩＬ−４とＩＬ−１３がＩＬ−４受容体α−鎖およびＮＲ４と結合するために相互に競争することになることである。
この挙動に基づけば、ＩＬ−４またはＩＬ−１３が両受容体成分を含む細胞表面複合体を形成するのを阻止するタンパク質または低分子はアンタゴニストとなり得るということであろう。このような分子はこのサイトカインとその低親和性受容体との相互作用を阻止することができる。例えば、可溶性ＩＬ−１３ＢＰはＩＬ−１３とＮＲ４との相互作用を阻止することができる。同様に、可溶性ＩＬ−４受容体α−鎖はＩＬ−４の細胞表面ＩＬ−４受容体α−鎖への結合を阻止することができる。これらの作用物質はＩＬ−４またはＩＬ−１３に特異的なアンタゴニストとなるであろう。
敷衍すると、可溶性ＮＲ４はその低親和性のためＩＬ−１３の極めて無能なアンタゴニストである。もしＩＬ−４に結合しそしてＩＬ−１３とも高親和性で結合する可溶性ＮＲ４突然変異体が選択されるならば、これはＩＬ−４とＩＬ−１３の両方の有用なアンタゴニストとなるであろう。
可溶性受容体の利用のもう一つは、ＮＲ４に対するモノクローン抗体のパネルを作ることである。機能的ＩＬ−４受容体と機能的ＩＬ−１３受容体の両方の形成における決定的な事象である、ＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖との相互作用を阻止する抗体が得られるならば、そのときは、両方のサイトカインの作用がさらに阻止される。
一つの特殊な態様においては、本発明は生物学的試料中のＩＬ−４のレベルを監視する方法を提供する。該方法はＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞と該生物学的試料を、ＩＬ−４がその受容体と結合するのを競争的に阻害するのに有効な量のＩＬ−１３と共にインキュベートする工程および競争的阻害の程度を測定する工程とを含んで成る方法である。
本発明の関連する態様においては、生物学的試料中のＩＬ−１３のレベルを監視する方法を提供する。該方法はＮＲ４とＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞と該生物学的試料を、ＩＬ−１３がその受容体と結合するのを競争的に阻害するのに有効な量のＩＬ−４と共にインキュベートする工程および競争的阻害の程度を測定する工程とを含んで成る方法である。
このサイトカインは上述のようにレポーター分子で標識することが好ましい。
この生物学的試料には、血液、血清、血漿、組織液、組織抽出物、リンパ液、Ｔ細胞またはその抽出物、培養上清および培養条件化培地などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明はＮＲ４遺伝子またはその誘導体を検出するためＰＣＲ分析を含むような遺伝子試験をも提供する。別の方法または関連して用いられる方法には、一本鎖コンホーメーション多形性分析（ＳＳＣＰ）、特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成、直接タンパク切断テストのような方法などの直接ヌクレオチド配列決定法または突然変異スキャニングが含まれる。このような遺伝子テストは、例えば、疾病状態をもたらすＮＲ４の非−発現または実質的な発現の欠如または突然変異型の発現について動物（例えば、ヒト）の遺伝子をスクリーニングする場合に重要である。
本発明の核酸分子はＤＮＡでもＲＮＡでもよい。核酸分子がＤＮＡ型であるときは、それはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。本発明の核酸分子のＲＮＡ型は一般にｍＲＮＡである。
本発明の核酸分子は一般に単離型であるが、それはベクター分子そして特に発現ベクター分子などの他の遺伝子分子中に組み込まれたりまたはそれに連結されたりまたはそれと別な仕方で融合したりまたはそれと集合状態にあったりすることができる。ベクターおよび発現ベクターは一般に複製することができ、そして適用可能なときは、原核細胞または真核細胞の一方または両方の中で発現する。原核細胞は大腸菌、バチルス・スピーシーズおよびシュードモナス・スピーシーズを含むことが好ましい。真核細胞は酵母、カビ、哺乳類および昆虫の細胞を含むことが好ましい。
従って、本発明の別の側面はベクター部分と哺乳類の、より具体的にはヒトのＮＲ４遺伝子部分を含む遺伝子構築物を提供する。このＮＲ４遺伝子部分はＮＲ４ポリペプチドまたは機能的または免疫学的に相互作用するその誘導体をコードすることができるものである。
遺伝子構築物のＮＲ４遺伝子部分は、適当な細胞中でプロモーターが該ＮＲ４遺伝子部分の発現を指令することができるようにベクター上の該プロモーターに機能的に連結させることが好ましい。
また、遺伝子構築物のＮＲ４遺伝子部分はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはその部分またはサイトカインまたは別のヘモポエチン受容体をコードするヌクレオチド配列などの別の遺伝子配列と融合した遺伝子の全部または一部を含むことができる。ハイブリッド受容体分子は多機能性治療薬および診断薬の開発において特に有用である。
本発明はこのような遺伝子構築物を包含しそして該構築物を含む原核細胞または真核細胞をも包含する。
本発明はＮＲ４の変異体、一部、断片、部分、同族体およびアナログを含むＮＲ４のすべての誘導体またはそれらをコードする遺伝子配列に及ぶ。この遺伝子配列には、天然に生ずるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列において１個または多重のヌクレオチドまたはアミノ酸が置換、付加および／または欠失することにより生ずる遺伝子配列も包含される。
本発明のＮＲ４およびその遺伝子配列はある範囲の治療薬および診断薬の創薬に有用でありそして対応するリガンドの検出にとりわけ有用である。例えば、組換えＮＲ４は同定可能なシグナルを形成することができるレポーター分子に結合または融合し、リガンドを含むと考えられる生物試料と接触させ、そして標識化ＮＲ４のリガンドへの結合についてスクリーニングをすることができる。また、標識化ＮＲ４は、リガンド遺伝子と考えられるものまたはその機能的部分の発現ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。
別の態様では、ＮＲ４がまず固定化される。この態様によれば、リガンドと考えられるものを含む生物試料を、固体支持体に固定化されたヘモポエチン受容体またはそのリガンド結合部分と、該生物試料中にリガンドが存在するときは該受容体と該リガンドとの間で複合体が形成されるのに十分な時間および条件の下で接触させる工程、および結合したリガンドを溶出しそしてそれを単離する工程を含んで成る方法が提供される。
可溶性ＮＲ４ポリペプチドも種々のハイブリッドと同様に神経系における疾病、障害または異常の治療において有用であると考えられる。例えば、中枢神経系または末梢神経系に関して脳性麻痺、外傷により誘発される麻痺、発作と関連する血管虚血症、ニューロン腫瘍、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病と関連する末梢神経症、重金属またはアルコール毒性、腎不全、およびヘルペス、風疹、麻疹、チキンポックス、ＨＩＶまたはＨＴＬＶ−１などの感染症の治療である。ＮＲ４ポリペプチドおよびハイブリッドはサイトカイン活性を調節したり、造血を調節したりするのにも重要である。これらは慢性関節リューマチなどの他の炎症性症状と同様にアレルギー性またはアトピー性症状の治療にも重要である。
上に述べたように、本発明のＮＲ４またはそのリガンドまたはその機能的誘導体は１以上の薬学的に許容され得る担体および／または希釈剤と共に薬学的組成物中に提供され得る。さらに、本発明は本発明のＮＲ４の有効量の投与を含む治療方法を提供する。本発明はＮＲ４のアンタゴニストおよびアゴニストおよび／またはそのリガンドをも包含しそして治療用の組成物および治療の方法論におけるそれらの使用をも包含する。
本発明のさらなる側面はＮＲ４に起因する欠陥状態または欠損状態の治療用の医薬品の製造におけるＮＲ４またはその機能的誘導体の使用を提供する。
本発明については下記の非−制限的な図および実施例を参照してさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
図１はネズミＮＲ４の配列番号：１に記載のヌクレオチド配列および配列番号：２に記載の予言されるアミノ酸配列を示す。非翻訳部分は下方の箱の中にそして翻訳部分は上方の箱の中に示してある。アミノ酸については、通常の１文字符号が略号が用いられ、グリコシレーション部位にリンクすると考えられるアスパラギンには下線を付し、保存されているシステイン残基とヘモポエチン受容体ファミリー・メンバーのＷＳＸＷＳモチーフは太字で示してある。予想されるシグナル配列は太字で下線を付し、一方膜貫通ドメインはダッシュで下線を付している。示した配列は３種のライブラリー由来の８個のｃＤＮＡクローンの分析から得られたものの合成物である。この配列の５’−末端（ヌクレオチド−６０から３５１まで）は１個のｃＤＮＡクローンから由来するが、単離されたゲノムＤＮＡクローン中にも存在する。箱領域は：典型的なヘモポエチン受容体ドメインであり、アミノ酸１１８〜３４０である。
図２は選択された組織および器官でのネズミＮＲ４ｍＲＮＡ発現のノーザン分析を示す写真である。
図３は125Ｉ−ＩＬ−１３および125Ｉ−ＩＬ−４結合の飽和等温線、すなわち、ＩＬ−４（○）およびＩＬ−１３（●）の（Ａ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＯＳ細胞への結合、（Ｂ）ＣＴＬＬ細胞への結合、そして（Ｃ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合のスカチャードプロットとして図示された飽和等温線を示すグラフである。データは１×１０4ＣＯＳ細胞および１×１０6ＣＴＬＬ細胞に規格化し、そして結合は２〜４時間氷上で行った。
図４はＩＬ−４とＩＬ−１３の結合、すなわち、ＩＬ−４（○）およびＩＬ−１３（●）が125Ｉ−ＩＬ−１３の（Ａ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＯＳ細胞への結合および（Ｃ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合と競争する能力、または125Ｉ−ＩＬ−４の（Ｂ）ＣＴＬＬ細胞への結合および（Ｄ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合と競争する能力、の特異性を示すグラフである。結合は４℃で２〜４時間行われそしてデータは競争物質（△）の横座標で観察された特異的結合のパーセンテージとして表された。
図５はＮＲ４を発現する細胞の因子依存性増殖を示すグラフである。（Ａ）ＣＴＬＬ細胞または（Ｂ）ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞の２００個をサイトカインの非存在下にまたは種々の濃度のＩＬ−２（□）、ＩＬ−４（○）またはＩＬ−１３（●）と共にインキュベートした。４８時間後に生存細胞を計測し、データをＩＬ−２の最高濃度で観察された生存数のパーセンテージとして表した。
図６はＮＲ４（ＩＬ−１３Ｒα）遺伝子の種間保存を示す写真である。
図７はネズミおよびヒトのＮＲ４（ＩＬ−１３Ｒα）遺伝子のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配列の表示である。ヒト（Ｈ）およびネズミ（Ｍ）のＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のヌクレオチド配列および予言されるアミノ酸配列を眼で配列しそして配列が最適となるようにギャップ（−）を挿入して配列した。ネズミクローンについての数字付けは、コード領域の部分を形成するヌクレオチドは上方の箱に、一方非翻訳領域のヌクレオチドは下方の箱に示してある。ネズミの予言されたタンパクとヒトの予言されたタンパクの間で同一なアミノ酸は（*）で指摘してある。ネズミのシグナル配列をコードするＤＮＡは下線を付してあり、成熟タンパクの予言された第１アミノ酸はＡ２６またはＴ２７である。
図８は可溶性ＮＲ４に架橋している125Ｉ−ＩＬ−１３を示す写真である。レーン：125Ｉ−ＩＬ−１３（１００，０００ｃｐｍ）＋２μｇ／ｍｌ可溶性ＮＲ４、レーン２：過剰の非標識ＩＬ−１３の存在下における125Ｉ−ＩＬ−１３（１００，０００ｃｐｍ）＋２μｇ／ｍｌ可溶性ＮＲ４、レーン３：過剰の非標識ＩＬ−４の存在下における125Ｉ−ＩＬ−１３（１００，０００ｃｐｍ）＋２μｇ／ｍｌ可溶性ＮＲ４。
図９はＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）と架橋している125Ｉ−ＩＬ−１３の抗−ＮＲ４ポリクローン抗血清による免疫沈降反応の写真である。レーン９〜１１：125Ｉ−ＩＬ−１３（７５０，０００ｃｐｍ）に架橋している可溶性ＩＬ−１３Ｒα（３μｇ／ｍｌの３０μｌ）、およびそれぞれ、対照のウサギ血清で沈降させたもの、または１００μｇ／ｍｌＦＬＡＧペプチドの存在下または非存在下において抗−ＮＲ４ポリクローン抗血清で沈降させたものである。レーン１２〜１４：０．５μｇ／ｍｌの非標識ＩＬ−１３の存在下における125Ｉ−ＩＬ−１３（７５０，０００ｃｐｍ）に架橋している可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）（３μｇ／ｍｌの３０μｌ）、およびそれぞれ１００μｇ／ｍｌのＦＬＡＧペプチドの存在下または非存在下に抗−ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）ポリクローン抗血清で沈降させたものである。
図１０はネズミＮＲ４のＮ−末端アミノ酸配列の表示である。
アミノ酸残基に対する下記の１文字略号および３文字略号が本明細書で使用される。
ＮＲ４をコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの単離
胚幹細胞株から抽出されたＡｐｏＩ消化ゲノムＤＮＡをλＺＡＰIIバクテリオファージ（ストラタジーン、LaJolla, CA）の中にクローニングした。このライブラリーから得た約１０6プラークを配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（１６）に対応する32Ｐ標識オリゴヌクレオチドでスクリーニングした。ハイブリッド形成陽性のクローンを自動化ＤＮＡシークェンサー（アプライド・バイオシステムズ、Foster City、ＣＡ）を用い製造者の指示に従って配列決定を行った。一つのクローンがヘモポエチン受容体ファミリーの新規なメンバーの一部をコードするように見えた。このゲノムＤＮＡ配列に基づいてオリゴヌクレオチドを設計しそしてマウス腹膜マクロファージ（クロンテク・ラボラトリーズ、Palo Alto、CA）の、マウス皮膚の、マウス肺の、マウス腎のそしてＷＥＨＩ−３Ｂ（ストラタジーン、LaJolla、CA）のλ−バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーからクローンを単離するために通常の方法で使用した。
実施例２
発現ベクターの構築および細胞のトランスフェクション
ＰＣＲを使用して、ＮＲ４の成熟コード領域（Ｔｈｒ２７からＰｒｏ４２４まで、図１）の前にあるＩＬ−３シグナル配列（配列番号：５）およびＮ−末端ＦＬＡＧエピトープ−標識（配列番号：６）をコードするＮＲ４ｃＤＮＡの誘導体を作成した。このＰＣＲ産物を哺乳類発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ（１７）の中にクローニングした。使用に先立ち、構築物の全体の配列決定を行った。細胞をトランスフェクトし、そして既に述べられたように選択した（１６、１８）。
実施例３
ノーザン・ブロット
ノーザン・ブロットは既に記載されたように行った（１６）。ハイブリッド形成用プローブの起源は次のものである。すなわち、ＮＲ４については、ヌクレオチド３２〜９８４（図１）からのＰＣＲ産物であり、そしてＧＡＰＤＨに対しては、ｃＤＮＡ断片スパンニングヌクレオチド（１９）である。
実施例４
サイトカイン類と放射性ヨード化サイトカインの使用
ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１５は市販品を使用した（Ｒ ＆ Ｄシステムズ、Minneapolis MN）。放射性ヨード化のために、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＰＢＳ）、０．０２％ｖ／ｖトゥイーン２０および０．０２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム、ｐＨ７．４に、サイトカインを１００μｇ／ｍｌの濃度で溶解した。ＩＬ−１３の２μｇをヨードモノクロリド法（２０、２１）を用いて放射性ヨード化し、一方ＩＬ−４の２μｇをジ−ヨード−ボルトン−ハンター試薬（１６）を用いて放射標識した。結合の研究および比放射活性の測定および標識化サイトカインの結合可能性については既に記載されたように行った（２）。
架橋実験のために、組換えネズミＩＬ−１３をＦＬＡＧ標識化タンパクとしてピチア・パストリス中で製造した。
架橋試験のために、精製した可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）の一定量を競争剤の存在下または非存在下に最終容量２０μｌで少なくとも３０分間４０℃で125Ｉ−ＩＬ−１３とインキュベートした。次いで、０．０２％ｖ／ｖトゥイーン２０を含むＰＢＳ中のＢＳ3（スベリン酸ビス（スルホスクシミジル）の１２ｍＭ溶液の５μｌを添加し、そして混合物を４℃で３０分間インキュベートした。試料を４×ＳＤＳ試料緩衝液の８μｌと混合しそして１３％ｗ／ｖＳＤＳ−ＰＡＧＥにより非還元条件下で分析した。ゲルを乾燥しそしてオートラジオグラフィーまたはホスフォイメージャー（PhosphoImager）のいずれかで可視化した。
実施例５
増殖試験
サイトカインに応じて得られるＢａ／Ｆ３細胞およびＣＴＬＬ細胞の増殖をラックス６０ミクロ穴ＨＬ−Ａプレート（ヌンク・インク、IL、USA）中で測定した。細胞を、２０％ｖ／ｖ新生児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で３回洗浄し、同培地に２×１０4細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。この細胞懸濁液の１０μｌ部分を５μｌの種々の濃度の精製組換えサイトカインと共に培養穴の中に入れた。空気中１０％ｖ／ｖＣＯ2を含む完全加湿インキュベーター中で３７℃で２日間インキュベートした後、生存細胞を倒立顕微鏡を用いて計測した。
実施例６
ネズミＮＲ４のクローニングと特性決定
胚幹細胞由来のゲノムＤＮＡのＡｐｏＩ消化物を用いてλＺＡＰII中に一つのライブラリーを構築しそしてヘモポエチン受容体ファミリーの多くのメンバーに見出されるアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒをコードする32Ｐ標識化オリゴヌクレオチドのプールでスクリーニングした。ハイブリッドを形成する一つのバクテリオファージクローンがヘモポエチン受容体ファミリーの新規なメンバーの一部をコードするように見える配列を含むことが見出された。この受容体はＮＲ４という機能的名称が与えられた。このゲノムクローンの配列を使用して、ＷＥＨＩ−３Ｂ細胞の、腹膜マクロファージの、骨髄の、皮膚の、そして腎のライブラリーからＮＲ４をコードするｃＤＮＡを単離した。これらのｃＤＮＡの合成物であるヌクレオチド配列（配列番号：１）および予言されたアミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。このＮＲ４ｃＤＮＡは４２４のアミノ酸残基からなるタンパクをコードすることを予言する。このタンパクの中には、シグナル配列および膜貫通ドメインと思われるものが含まれる。このタンパクの細胞外領域は、保存された４個のシステイン残基と特徴的なＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフ（図１、ＷＳＸＷＳとして太字で記載）を含む典型的なヘモポエチン受容体ドメイン（アミノ酸１１８〜３４０）に加えて、免疫グロブリン−様ドメイン（アミノ酸２７〜１１７）を含んでいた。この新規な受容体の細胞質テール（cytoplasmic tail）は長さが６０アミノ酸であった。
実施例７
ＮＲ４ｃＤＮＡの発現パターン
ＮＲ４ｍＲＮＡの発現パターンをノーザン分析で検討した。５．２ｋｂおよび２．２ｋｂの２個のハイブリッド形成物を多くの組織由来のｍＲＮＡ中に検出した（図２）。ＮＲ４ｍＲＮＡは骨格筋には検出できなかった（図２）。図８はマウス組織内のＮＲ４の発現を示す。
実施例８
ＮＲ４はＩＬ−１３受容体の特異的結合サブユニットであるＩＬ−１３受容体α−鎖（ＩＬ−１３Ｒα）をコードする
ＣＯＳ細胞で発現したＮＲ４を抗−ＦＬＡＧ抗体を用いるウエスタン・ブロットから評価すると、見掛けの分子量は約５０，０００から約７０，０００ダルトンであり、より具体的には約５５，０００から約６５，０００である。これはＮＲ４がＩＬ−１３受容体の結合性サブユニットをコードするかも知れないということを示唆した。この可能性をテストするため、ＮＲ４をＣＯＳ細胞で発現させた。トランスフェクトされていないＣＯＳ細胞は比較的低レベルのＩＬ−４受容体およびＩＬ−１３受容体を発現した。ＮＲ４ｃＤＮＡを含むプラスミドをトランスフェクトすると、ＣＯＳ細胞によって発現されるＩＬ−１３の数は劇的に増加した（図３Ａ、細胞当たり１００，０００から５００，０００まで）が、ＩＬ−４受容体の数は増加しなかった。ＣＯＳ細胞により発現されたＮＲ４に対するＩＬ−１３の親和性は低かった（ＫDは約２〜１０ｎＭ）そしてこのＮＲ４は非標識ＩＬ−１３と競争できた（図４Ａ）がＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９またはＩＬ−１５を含む他のサイトカインとは競争できなかったから、その結合は特異的であった。これらの結果から、ＮＲ４がＩＬ−１３受容体α−鎖（ＩＬ−１３Ｒα）であることが示唆された。
実施例９
ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）およびＩＬ−４ＲαはＩＬ−４受容体およびＩＬ−１３受容体の成分を共有する。
ＩＬ−４受容体とＩＬ−１３受容体の間の関係を研究するため、ＩＬ−４に応答する細胞株ＣＴＬＬを検討した。親のＣＴＬＬ細胞は１個のクラスのＩＬ−４受容体（ＫD約６６０ｐＭ、約３６００受容体／細胞）を発現したがＩＬ−１３受容体は検出されなかった（図３Ｂ）。ＣＴＬＬ細胞によって発現されたＩＬ−４受容体は、125Ｉ−ＩＬ−４の結合が非標識ＩＬ−４と競争できたがＩＬ−１３とは競争できなかったから（図４Ｂ）、特異的であるように見えた。ＣＴＬＬ細胞中でＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）が発現する際、ＩＬ−４受容体の数および親和性には変化がみられなかったが、一方、高親和性ＩＬ−１３受容体の１個のクラスが検出された（図３Ｃ、ＫD約７５ｐＭ、１３５０受容体／細胞）。ＣＴＬＬ細胞内で発現したＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）に対するＩＬ−１３の親和性はＣＯＳ細胞中よりも高かった。これは前者がＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）と相互作用しＩＬ−１３に対する親和性を増強することができるあるタンパクを発現したことを示唆する。以前の研究に基づく同様な候補はＩＬ−４Ｒαである。この可能性を解明するため、ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）を発現するＣＴＬＬ細胞への結合に対し125Ｉ−ＩＬ−１３と競争するＩＬ−４の能力を評価した。図４Ｂは125Ｉ−ＩＬ−１３の結合に対する競争ではＩＬ−４とＩＬ−１３は同等に効果的であった（ＩＣ50は約３００ｐＭ、図４Ｃ）のであり、そしてさらにこれらは125Ｉ−ＩＬ−４とも結合に対して競争できたのであった（ＩＣ50は約３００ｐＭ、図４Ｄ）。
実施例１０
ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）はＩＬ−１３による増殖性シグナルの形質導入に必要である。
ＣＴＬＬ細胞は生存および増殖に外因性サイトカイン類の添加を必要とする。ＩＬ−２はＣＴＬＬ細胞に対し強力な増殖性刺激を有する（ＥＣ50は約１００〜２００ｐＭ）一方、ＩＬ−４は比較的弱く（ＥＣ50は２〜７ｎＭ）そしてＩＬ−１３は不活性であった（図５Ａ）。ＣＴＬＬ細胞中にＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）が発現することにより、ＩＬ−１３に応答して（ＥＣ50は約７００ｐＭ）弱く生き残りそして増殖する能力が、そしてＩＬ−４に応答して（ＥＣ50は約７００ｐＭ、図５Ｂ）親細胞よりもややより強く増殖する能力が生じた。
実施例１１
ヒトＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のクローニング
ネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）に相同な遺伝子が他の脊椎動物種に存在するか否かを決定するため、ネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のヌクレオチド８４０〜１２７０を包含するプローブを、ＥｃｏＲＩで消化した種々の種由来のゲノムＤＮＡとハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成は５００ｍＭリン酸水素二ナトリウム（約５×ＳＳＣ）中５０℃で一晩行った。フィルターを４０ｍＭリン酸水素二ナトリウム（約０．２×ＳＳＣ）中５０℃で２時間洗浄し、オートラジオグラフィー様フィルムに４８時間曝した。図６はヒトを含む種々の種由来のゲノムＤＮＡの中に比較的少数（１〜５）のハイブリッド形成バンドが観察されることを示す。これはネズミｃＤＮＡプローブを使用してヒトＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）をクローニングすることが容易であることを示唆する。従って、λＺＡＰIIバクテリオファージ中のヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリーのクローンをネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）ｃＤＮＡ由来の二つのプローブ（ヌクレオチド８２〜８４０およびヌクレオチド８４０〜１２７０）でスクリーニングした。ハイブリッド形成は６×ＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖＳＤＳ中４２℃で一晩行った。フィルターを２×ＳＳＣ：０．１％ｗ／ｖＳＤＳ中５０℃で２時間洗浄しそしオートラジオグラフィー様フィルムに４８時間曝した。両方のネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）プローブとハイブリッドを形成したプラークを釣り上げ、通常の方法で精製した。ハイブリッドを形成するバクテリオファージ由来のこのｃＤＮＡ挿入物をpBluescriptプラスミドの中に切り取り、そしてＡＢＩ自動化シークェンサーを用いてその全体の配列決定を行った。図７は単離されたクローンの配列の合成体を示し、そしてこれらのクローンがネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）と高度の配列類似性を共有する一つのタンパクをコードすることを明らかにする。これらのクローンはこのタンパクの全コード領域をコードする。高度の配列類似性（３２０／４２５アミノ酸、約７５％）はこのｃＤＮＡがネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のヒト同族体であることを予言する。ヌクレオチド配列は配列番号：３として表されそしてそのアミノ酸配列は配列番号：４である。
実施例１２
可溶性ネズミＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）はＩＬ−１３と結合する
Ｎ−末端「ＦＬＡＧ」エピトープ（インターナショナル・バイオテクノロジーズ／イーストマン・コダック、New Haven CT）を持つＮＲ４の可溶性バージョンを発現するような構築物を構築した。まず、哺乳類発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳの誘導体を、それがネズミＩＬ−３のシグナル配列（ＭＶＬＡＳＳＴＴＳＩＨＴＭＬＬＬＬＬＭＬＦＨＬＧＬＱＡＳＩＳ（配列番号：５））をコードするＤＮＡおよびＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：６））を含みそれに続いてユニークなＸｂａＩクローニング部位を含むように作成した。このベクターをｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧと名付けた。成熟ＮＲ４コード領域（Ｔｈｒ２７〜Ｔｈｒ３４４）の細胞外部分はプライマー１４７８および１４８０を用いるＰＣＲによって作成した。生じた産物をＸｂａＩで消化しそしてｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧのＸｂａＩ部位にクローニングしてｐＥＦ／ＩＬ３ＳＩＧ／ＦＬＡＧ／ｓｏ１ＮＲ４を得た。この構築物の同定はジデオキシ配列決定法により確認された。
ＣＯＳ細胞により発現されたＮＲ４に対しＩＬ−１３の親和性が低いことと一致して、精製した可溶性ＮＲ４はゲルろ過クロマトグラフィーで評価するとＩＬ−１３と結合することができないようであった。しかしながら、感度の高い架橋試験を用いると、可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）のＩＬ−１３に結合する能力が証明された（図８、レーン１）。この相互作用は非標識ＩＬ−１３により競争されたが非標識ＩＬ−４によっては競争されることはなかった（図８、レーン２およびレーン３）。
実施例１３
可溶性ＩＬ−１３Ｒα（ＮＲ４）に対するポリクローン抗血清
精製した可溶性ＮＲ４をウサギに注射し３ヵ月後に採血してＮＲ４に対するポリクローン抗血清を調製した。この抗血清は125Ｉ−ＩＬ−１３の可溶性ＮＲ４との架橋産物を免疫沈降させた（図９、レーン１１）が、免疫化前（pre-immune）の血清では免疫沈降は観察されなかった（図９、レーン９）。複合体の免疫沈降はＦＬＡＧペプチドによっては阻害されなかった（図９、レーン１０）。
免疫沈降反応試験は次のように行われた。
架橋反応はトリス−塩酸、ｐＨ７．５を最終濃度４０ｍＭになるまで添加することにより終了させた。次いで、試料を１：５０希釈の対照ウサギ血清またはＦＬＡＧペプチドの存在下にまたは非存在下に予めインキュベートしておいた抗−ＮＲ４血清と混合した。４℃で３０分間インキュベートした後、混合物に５０％ｖ／ｖタンパク質Ｇ−セファロースゲルスラリー（ファルマシア）の４０μｌを添加しそして４℃で３０分間インキュベートした。試料を遠心分離しタンパク質Ｇビーズを３×０．５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２×濃縮ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液の４０μｌと混ぜ、９５℃で２分間加熱した。この上清を非還元条件下で１３％ｗ／ｖＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
実施例１４
ＮＲ４のＮ−末端アミノ酸配列
ＮＲ４のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。これを図１０に示す。
実施例１５
ＩＬ−１３の試験
ＩＬ−１３は喘息などのアレルギー性疾患において重要な免疫グロブリンイソタイプであるＩｇＥの産生に関与するサイトカインである。ＩＬ−１３のレベルを監視することは、従って、重要な診断学的意味がある。ＩＬ−４とＩＬ−１３は多くの生物学的効果を共有しているから、これらのサイトカインを識別する試験法を作成することも重要である。
ＣＯＳ細胞で発現したＮＲ４は125Ｉ−ＩＬ−１３と結合する。この結合はウシ血清やヒト血清などの無関係のタンパクの大量の存在下で非標識ＩＬ−１３により投与量依存的に阻害される。ＩＬ−４はこの状況下では125Ｉ−ＩＬ−１３結合に対して競争する能力を示さない、従って、この試験はＩＬ−１３に対して特異的であるように見える。
この試験法は可溶性ＮＲ４をＥＬＩＳＡプレート上に被覆し、そして、例えば、蛍光標識ＩＬ−１３をプローブとして使用することにより組立てられる。次いで、試験用試料中の非標識ＩＬ−１３の存在が蛍光シグナルの減少として記録される。
ＮＲ４およびＩＬ−４受容体α−鎖を発現する細胞を用いることにより、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方を測定する同様な試験法が組み立てられる。これらの細胞には正常にＩＬ−４受容体α−鎖を発現しそしてＮＲ４を発現するように工学的に処理されるＣＴＬＬ細胞が含まれる。125Ｉ−ＩＬ−１３または125Ｉ−ＩＬ−４の結合はＩＬ−４およびＩＬ−１３の両方の非標識型により阻害することができる。
実施例１６
ＩＬ−４およびＩＬ−１３の修飾
機能的に重要であると予測される分子の領域に突然変異を導入する。ＮＲ４の場合には、この領域は、このサイトカインがＩＬ−４受容体α−鎖に結合するときは、ＩＬ−１３と相互作用する領域、ＩＬ−４受容体α−鎖と相互作用する領域またはＩＬ−４と相互作用する領域を含む。これらの領域は直接の実験、例えば、ＮＲ４の構造またはＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−４受容体α−鎖のような他のタンパクとＮＲ４との複合体の構造を解明することにより、またはその構造に関する情報が存在する類似のタンパク、例えば、成長ホルモン／成長ホルモン受容体の複合体に基づきこれらのタンパクをモデル化することにより決定される。次いで、得られるＮＲ４突然変異体を機能の改善の有無につき個々にテストする。
別の方法では、分子内に無差別突然変異が作られる。適当な技術としては、正しくないｄＮＴＰの取り込みを促進するようなポリメラーゼや反応条件を使用するＮＲ４ｃＤＮＡの合成や、ＤＮＡシャフリングと呼ばれる技術が挙げられる（２３、２４、２５、２６）。
目的のｃＤＮＡの無差別突然変異体を作成した後、潜在的に有用な突然変異体を選別する。ＮＲ４の場合には、一つの試験法は、もしＮＲ４がＩＬ−４受容体α−鎖を欠如している細胞（例えば、ＣＯＳ細胞）の中で発現されるときは、ＩＬ−４とは如何なる検出感度でも結合できないがＩＬ−１３とは低親和性で結合する細胞が得られるという知識に基づくものである。このようにして、もしＣＯＳ細胞をＮＲ４でトランスフェクトし、そしてＦＩＴＣ−結合ＩＬ−４およびフィコエリトリン−結合ＩＬ−１３と結合させ、未結合リガンドを洗い流すものとすれば、ＩＬ−４は全く結合せずそして結合したＩＬ−１３は洗浄の間に解離するであろう。
これらの細胞をＦＡＣＳ−選別するときは、ＦＩＴＣ−チャンネルにもＰＥ−チャンネルにもシグナルはほとんどあるいは全く得られないであろう。ＣＯＳ細胞をＮＲ４の無差別突然変異体１０6〜１０7でトランスフェクトしそして結合試験のために処理する。野生のＮＲ４でトランスフェクトされたものよりも強くサイトカインに結合するとして選別される細胞はすべてＦＡＣＳで選別することができる。これらの「改良された」ＮＲ４ｃＤＮＡを含むプラスミドを回収し、大腸菌で増やし、そして再度ＣＯＳ細胞を用いてその改良度を確認する。一貫して改良された突然変異体は次にさらにもう一度無差別変化の導入のために使用してさらに改良された分子を得ることができる。この反復プロセスを数回繰り返してもよい。
当技術分野で熟練した者は本明細書に記載された発明が具体的に記載されたこと以外の変更や修正を受け得るものであることを認めるであろう。本発明はそのような変更や修正のすべてを包含することが理解されるべきである。本発明はまた本明細書で個々にあるいはまとめて言及しあるいは指摘した工程、特徴、組成物および化合物のすべてを、そして該工程あるいは特徴のいかなる２以上の組み合わせをも包含する。
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２６．グラメリら（1996）Nature Biotechnology 14：315-319。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：アムラド オペレーションズ ピーティーワイ．
エルティーディー．（Amrad Operations PTY. LTD.）
（ii）発明の名称：新規なヘモポエチン受容体およびそれをコードする遺伝子配列
（iii）配列の数：８
（iv）通信宛て名：
（A）名宛人：デイビース コリソン ケイブ（Davies Collison Cave）
（B）街：１リトル コリンス ストリート
（C）市：メルボルン
（D）州：ビクトリア
（E）国：オーストラリア
（F）郵便番号：3000
（v）コンピュータ解読可能形式：
（A）媒体型：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM PC互換機
（C）オペレイティングシステム：PC-DOS/MS-DOS
（D）ソフトウエア：パテントイン リリース#1.0,
バージョン#1.25
（vi）本出願データ：
（A）出願番号：PCT/AU96/00668
（B）出願日：1996年10月23日
（vii）優先権主張の基礎となる出願のデータ：
（A）出願番号：PN6135/95
（B）出願日：1995年10月23日
（A）出願番号：PN7276/95
（B）出願日：1995年12月22日
（A）出願番号：PO2208/96
（B）出願日：1996年09月09日
（viii）代理人情報：
（A）氏名：イー ジョン エル ヒューズ（E John L Hughes）博士
（C）照会先／ドケット番号：ＥＪＨ／ＥＫ
（ix）テレコミュニケーション情報：
（A）電話番号：+61 3 9254 2777
（B）テレファックス：+61 3 9254 2770
（２）配列番号：１に関する情報：
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：1680
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
生物名：ムス・ムスキュルス（mus musculus）
（ix）配列の特徴
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：61..1332
（xi）配列：配列番号：１
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：424
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
生物名：ムス・ムスキュルス（mus musculus）
（xi）配列：配列番号：２
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：1383
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
生物名：ヒト
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：CDS
（B）存在位置：61..1338
（xi）配列：配列番号：３
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：426
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
生物名：ヒト
（xi）配列：配列番号：４
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：30
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：ネズミIL-3のシグナル配列
（xi）配列：配列番号：５
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：８
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：Ｎ末端のFLAGエピトープによる標識
（xi）配列：配列番号：６
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：31
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：オリゴ1478 5’
（xi）配列：配列番号：７
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：30
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：DNA
（vi）起源
人工物
（x）他の情報：オリゴ1480 5’
（xi）配列：配列番号：８
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：５
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：NR4モチーフ
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：MISC＿FEATURE
（B）存在位置：3..3
（x）他の情報：
Ｘは任意のアミノ酸であってよい。
（xi）配列：配列番号：９
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：27
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：ｍＮＲ４（major）のＮ末端アミノ酸配列
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：MISC＿FEATURE
（B）存在位置：24..24
（x）他の情報：
Ｘは任意のアミノ酸であってよい。
（xi）配列：配列番号：10
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：27
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：ｍＮＲ４（minor）のＮ末端アミノ酸配列
（ix）配列の特徴：
（A）特徴を表す記号：MISC＿FEATURE
（B）存在位置：24..24
（x）他の情報：
Ｘは任意のアミノ酸であってよい。
（xi）配列：配列番号：11
（i）配列の特徴
（A）配列の長さ：５
（B）配列の型：アミノ酸
（ii）配列の種類：ペプチド
（vi）起源
不明
（ix）配列の特徴：
（x）他の情報：ヘモポエチン受容体ファミリーの多数の構成員に見出されるペプチドモチーフ
（xi）配列：配列番号：12
Claims (19)
- インターロイキン−１３と相互作用することができるポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、または該ポリペプチドをコードする配列と相補的であるヌクレオチドの配列を含む単離された核酸分子であって、
該ポリペプチドが、
（i）配列番号：２もしくは配列番号：４に記載のアミノ酸配列、もしくは
（ii）（i）の配列と少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列
を有し、または、
該ヌクレオチドの配列が、
（iii）配列番号：１もしくは配列番号：３に記載のヌクレオチド配列、
（iv）（iii）の配列と少なくとも９０％の同一性を持つヌクレオチド配列、
（v）配列番号：１もしくは配列番号：３またはそれらの相補型のヌクレオチド配列と高厳格条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、もしくは
（vi）（iii）から（v）の配列と相補的なヌクレオチド配列
を有する、前記核酸分子。 - （v）の配列が、配列番号：２または配列番号：４に記載された配列と少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
- インターロイキン−１３と相互作用することができるヘモポエチン受容体をコードする請求項１記載の単離された核酸分子であって、その相互作用はインターロイキン−４受容体α−鎖を発現する細胞内でインターロイキン−４により競争的に阻害することができるものである単離された核酸分子。
- コードされたポリペプチドが融合タンパク質の形である、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
- コードされたポリペプチドが可溶性の形である、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
- コードされたポリペプチドが成熟インターロイキン−１３受容体α−鎖である、請求項１、２または３のいずれか一項に記載の単離された核酸分子。
- 宿主細胞中で核酸分子の発現を指令することができるプロモーターに機能的に連結された請求項１、２、３、４、５または６のいずれか一項記載の核酸分子を含む遺伝子構築物。
- 請求項１の（i）もしくは（ii）の配列に記載のアミノ酸の配列、または請求項１の（iii）もしくは（iv）の配列に記載のヌクレオチド配列もしくはその相補配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む組換えポリペプチドであって、インターロイキン−１３と相互作用することができるものである組換えポリペプチド。
- インターロイキン−１３との相互作用がインターロイキン−４受容体α−鎖を発現する細胞内でインターロイキン−４により競争的に阻害されるものである請求項８記載の組換えポリペプチド。
- 該ポリペプチドがＣＯＳ細胞で発現されたときウエスタン・ブロット分析で測定すると約５０，０００から約７０，０００ダルトンの分子量を持つものである請求項８または９記載の組換えポリペプチド。
- ポリペプチドが融合タンパク質の形である、請求項８または９に記載の組換えポリペプチド。
- ポリペプチドが可溶性の形である、請求項８または９に記載の組換えポリペプチド。
- ポリペプチドが成熟インターロイキン−１３受容体α−鎖である、請求項８または９に記載の組換えポリペプチド。
- 請求項８、９、１０、１１、１２または１３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドに対し特異的な抗体。
- 該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４記載の抗体。
- 請求項８、９、１０、１１、１２または１３のいずれか一項記載の組換えポリペプチドを製造する方法であって、請求項７記載の遺伝子構築物を含む細胞を、該遺伝子構築物中の核酸分子を発現して組換えポリペプチドを生産するのに十分な時間および条件の下で培養する工程、および該組換えポリペプチドを単離する工程を含んで成る方法。
- 請求項１６記載の方法により製造される組換えポリペプチドを発現する動物細胞。
- 請求項１、２、３、４、５、または６のいずれか一項に記載の核酸分子によりコードされる、インターロイキン−１３と相互作用することができる第１部分と、ヘモポエチン受容体、受容体チロシンキナーゼ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）受容体またはＧタンパク質結合受容体由来の第２部分とを含んで成る、融合タンパク質。
- 該第２部分が、インターロイキン−４受容体α−鎖を含むものである、請求項１８記載の融合タンパク質。
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