JP4833467B2 - 新規カリウムチャネル及び同カリウムチャネルをコードする遺伝子 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は新規カリウムチャネル及び同チャネルをコードする遺伝子に関する。より具体的には、本発明はKCNQ5カリウムチャネルサブユニットをコードする単離されたポリヌクレオチド、同ポリヌクレオチドで形質転換された細胞、遺伝子突然変異を含むトランスジェニック動物ならびにKCNQ5サブユニット含有カリウムチャンネルに作用する化合物の試験管内(インビトロ)及び生体内(インビボ)スクリーニングにおける前記形質転換細胞及びトランスジェニック動物の使用を提供する。
【0002】
従来技術
カリウムチャネルは興奮性細胞における電気的シグナル伝達の調節に関与し、生物学的液体のイオン組成を調節する。遺伝性心不整脈(場合によって難聴を伴なう)、新生児癲癇及び高齢者の進行性聴力損失(老人性難聴)の根底にはK+チャネル遺伝子ファミリーのKCNQブランチの3つの既知遺伝子中の突然変異がある。
【0003】
イオンチャネルはシグナル伝達の調節ならびに細胞内液及び細胞外液のイオン組成の調節に重要な役割を果たす。KCNQ1は6つの膜貫通ドメインを持ち第5膜貫通ドメインと第6膜貫通ドメインの間に位置するポア領域を持つ電位開口型カリウムチャネルスーパーファミリーの典型的メンバーである。minK蛋白質(KCNE1又はIsKとしても知られている。)は膜貫通区間を一つだけ持ち、単独ではカリウムチャネルを形成できない。しかしこの蛋白質はKCNQ1によって媒介される電流をβ-サブユニットとして増進し調整する。これらのヘテロマー型チャネルは心臓活動電位の再分極に関与する。KCNQ1又はKCNE1の一定の突然変異は常染色体優性QT延長症候群(LQTS)(不整脈と突然死をもたらす心臓活動電位の再分極異常を特徴とする疾患)の一形態を引き起こす。興味深いことにいずれかの遺伝子に別の突然変異があると、LQTSと先天性難聴とを併せ持つ劣性ジャーベル・ランゲニールセン(JLN)症候群が起こる。難聴を引き起こすには、KCNQ1/minK電流を、心不整脈を引き起こすには既に十分に低いレベルまで低下させる必要がある。
【0004】
突然変異及び非突然変異KCNQ2及びKCNQ3カリウムチャネルは国際特許出願公開(WO)第99/07832号、第99/21875号及び第99/31232号に記載されている。
【0005】
発明の要旨
ここに我々はカリウムチャネル蛋白質のKCNQファミリーの新規メンバーであるKCNQ5をクローン化し、特徴づけた。KCNQ5は他のKCNQチャネルサブユニット(特にKCNQ3及びKCNQ4)と共にヘテロマー型チャネルを形成する。
【0006】
本発明はカリウムチャネルスーパーファミリーのこの興味深いブランチの特徴づけと利用にとって重要な意味を持っている。
【0007】
したがって本発明はその第1の態様として配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列配列、その相補鎖又はその部分配列と少なくとも中ストリンジェンシー条件でハイブリダイズできる核酸配列を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0008】
もう一つの態様として本発明は本発明のポリヌクレオチドによってコードされる組換え生産ポリペプチドを提供する。
【0009】
第3の態様として本発明は、本発明異種ポリヌクレオチドの取り込みによって遺伝子操作された細胞を提供する。
【0010】
第4の態様として本発明は少なくとも1つのKCNQ5チャネルサブユニットを含んでなるカリウムチャネルでの活性を阻害又は活性化又は他の形で調整するための化合物のスクリーニング方法であって、その化合物をKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞に作用させる工程及びそのKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞の膜電位、電流、カリウム流束又は二次的カルシウム流入を監視する工程を含む方法を提供する。
【0011】
第5の態様として本発明は神経学的疾患を患っている人々から得られる遺伝物質をKCNQ5遺伝子中の突然変異に関してスクリーニングするための本発明ポリヌクレオチド配列の使用に関する。
【0012】
第6の態様として本発明は本発明の方法によって同定される化合物に関し、特に以下のCNSの疾患又は悪い状態を診断、処置又は緩和するための前記化合物の使用に関し、そのCNSの疾患又は悪い状態は情動障害、アルツハイマー病、不安、運動失調、CNS損傷(外傷、脳卒中又は神経変性病によって起こるもの)、認知欠損、強迫行動、痴呆、抑うつ、ハンチントン病、躁病、記憶欠陥(memory impairment)、記憶障害、記憶機能異常(memory dysfunctions)、動作障害(motion disorders)、運動障害、神経変性疾患、パーキンソン病及びパーキンソン様運動障害、恐怖症、ピック病、精神病、精神分裂病、脊髄損傷、脳卒中、振せん、発作、痙攣及びてんかんを含む。
【0013】
第7の態様として本発明は、内因性KCNQ5遺伝子のノックアウト突然変異、突然変異KCNQ5遺伝子による置換もしくは突然変異KCNQ5遺伝子の追加発現を含むトランスジェニック動物、又はKCNQ5遺伝子を過剰発現させるためもしくは突然変異KCNQ5遺伝子を過剰発現させるために遺伝子操作されたトランスジェニック動物を提供する。
【0014】
第8の態様として本発明は治療用化合物のインビボスクリーニングにおける上記トランスジェニック動物の使用に関する。
【0015】
本発明の他の目的は以下の詳細な説明と実施例から当業者には明らかになるだろう。
【0016】
発明の詳細な説明
本発明は新規電位開口型カリウムチャネル及び同チャネルをコードする遺伝子を提供する。また本発明はそれらの遺伝子で形質転換された細胞、遺伝子突然変異を含むトランスジェニック動物及びKCNQ5含有カリウムチャネルに作用する薬物のインビトロ及びインビボスクリーニングにおける前記形質転換細胞及びトランスジェニック動物の使用も提供する。
【0017】
ポリヌクレオチド
本発明はその第1の態様としてKCNQ5蛋白質のすべて又は一部を含有するポリヌクレオチドをコードする新規核酸分子を提供する。
【0018】
好ましい実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは配列番号1(SEQ ID NO:1)として示されるポリヌクレオチド配列、その相補鎖又はその部分配列と少なくとも中(medium)ストリンジェンシー条件でハイブリダイズできる核酸配列を有するようなポリヌクレオチドである。
【0019】
本発明のポリヌクレオチドはDNA、cDNA及びRNA配列ならびにアンチセンス配列を包含し、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド及び意図的に操作したポリヌクレオチドを包含する。また本発明のポリヌクレオチドは遺伝コードの結果として縮重している配列も包含する。
【0020】
本明細書に定義する用語「ポリヌクレオチド」は少なくとも10塩基長、好ましくは少なくとも15塩基長の重合体型ヌクレオチドを指す。「単離されたポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが由来する生物の天然のゲノムでそのポリヌクレオチドのすぐ隣にあるコード配列の両方(すなわち5'末端に一つ、3'末端に一つ)がすぐ隣にはないポリヌクレオチドをいう。したがってこの用語は発現ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス又は原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに取り込まれている組換えDNA、又は他のDNA配列からは独立した単独の分子(例えばcDNA)として存在する組換えDNAを包含する。
【0021】
また本発明のポリヌクレオチドには、配列番号1に記載の配列とは1種以上のヌクレオチド位置で相違するヌクレオチド配列を含む対立遺伝子変異体及び「突然変異ポリヌクレオチド」も包含される。突然変異ポリヌクレオチドとしては特に、配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むが変異体ポリペプチドの発現が起こるようにその配列が配列番号1とは異なっている本発明のポリヌクレオチドを挙げることができる。突然変異ポリヌクレオチドとしては、1個以上の位置が改変されたアミノ酸配列を持つカリウムチャネルをコードするヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチドを挙げることができる。突然変異ポリヌクレオチドとしては特に、下記表1に定義する保存領域にある1個以上の位置が改変されたアミノ酸配列を有するカリウムチャネルをコードするヌクレオチド配列を有する本発明のポリヌクレオチドを挙げることができる。
【0022】
ハイブリダイゼーションプロトコル
本発明のポリヌクレオチドは、以下に詳述するように、配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列配列、その相補鎖又はその部分配列と少なくとも中、中/高又は高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズできる核酸配列を有するようなポリヌクレオチドである。
【0023】
好ましい一実施形態として本ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド(好ましくは配列番号2(SEQ ID NO:2)に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド)をコードするDNAに、以下に詳述する少なくとも中、中/高又は高ストリンジェンシー条件で、当該断片をハイブリダイズさせるのに十分な少なくとも15塩基長の断片である。
【0024】
ヌクレオチドプローブと相同DNA又はRNA配列の間のハイブリダイゼーションを決定するのに適した実験条件では、ハイブリダイズさせるDNA断片又はRNAを含有するフィルターを5×SSC[塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム、Sambrookら著「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1989)参照]に10分間予浸し、そのフィルターを5×SSC、5×デンハルト液[Sambrookら(前掲)参照]、0.5×SDS及び100μg/ml変性超音波処理サケ精子DNA[Sambrookら(前掲)参照]の溶液中でプレハイブリダイズした後、濃度10ng/mlのランダムプライム[Feinberg AP及びVogelstein B,Anal. Biochem. 1983 132 6-13]32P-dCTP標識(比活性>1×109cpm/μg)プローブを含有する同じ溶液中、約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを行なう。
【0025】
次にそのフィルターを2×SSC、0.5%SDS中、少なくとも、少なくとも60℃(中ストリンジェンシー条件)、好ましくは少なくとも65℃(中/高ストリンジェンシー条件)、より好ましくは少なくとも70℃(高ストリンジェンシー条件)、さらに一層好ましくは少なくとも75℃(超高ストリンジェンシー条件)の温度で30分間にわたって2回洗浄する。
【0026】
これらの条件でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子はX線フィルムを使って検出できる。
【0027】
DNA 配列ホモロジー
好ましい一態様として、本発明のポリヌクレオチドは配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列配列に対して少なくとも65%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、さらに一層好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%のホモロジーを示す。
【0028】
本明細書に定義するDNA配列ホモロジーは、第1配列の第2配列からの派生(derivation)を示す2つのDNA配列間の一致度として決定することができる。ホモロジーはGCGプログラムパッケージに含まれるGAP[Needleman SB及びWunsch CD,Journal of Molecular Biology 1970 48 443-453]などといった当技術分野で公知のコンピュータープログラムにより、そのデフォルトパラメーターを使って、適宜決定できる。
【0029】
クローン化ポリヌクレオチド
本発明の単離されたポリヌクレオチドとしては特にクローン化ポリヌクレオチドを挙げることができる。
【0030】
本明細書に定義する用語“クローン化ポリヌクレオチド”は、DNAのセグメント(これは特にcDNA、すなわちRNAから酵素的に誘導されたものであってよい)をそれ本来の位置から異なる部位に移転してそこで増殖させるために、現在遺伝子操作に使用されている標準的クローニング法に従ってクローン化されたポリヌクレオチド又はDNA配列を指す。
【0031】
クローニングは、所望のDNAセグメントの切り出しと単離、そのDNA片のベクター分子への挿入及びその組換えベクターの細胞(この細胞で当該DNAセグメントの複数コピー又はクローンが複製される)への取り込みによって、mRNAの逆転写によって(逆転写酵素法)ならびにポリメラーゼ転写反応で配列特異的オリゴヌクレオチドとDNAポリメラーゼを使用することによって(PCR法)達成できる。
【0032】
本発明のクローン化ポリヌクレオチドは“DNAコンストラクト”又は“単離されたDNA配列”と呼ぶこともでき、特に相補DNA(cDNA)を挙げることができる。
【0033】
カリウムチャネルが異なるサブユニットから構成されるヘテロマー型チャネルを形成できることは十分に立証されている。同様に本発明のカリウムチャネルは他のKCNQ(特にKCNQ3及びKCNQ4)と同時発現させるとそれら他のサブユニットとヘテロマーを形成できることが見出された。更に、カリウムチャネルはそれらのチャネルを同時に集め、そして機能的に調整できるか又は細胞内で特定の局在をもたらす非相同サブユニット(β−サブユニット)、たとえばKCNE1(minK又はIskとしても知られている)、KCE2(minK関連ペプチドプラスミド(MiRP1)としても知られている)、KCE3(MiRP2としても知られている)、KCE4(MiRP3としても知られている)及び(又は)KCE5(KCNE1Lとしても知られている)とも会合できる。
【0034】
したがって好ましい一態様として本発明のポリヌクレオチドをクローン化し、単独で発現させるか、他のサブユニットをコードするポリヌクレオチド、特にKCNQ3チャネルサブユニットをコードするポリヌクレオチド又はKCNQ4チャネルサブユニットをコードするポリヌクレオチドと同時発現させる。
【0035】
本発明のもう一つの態様として、単離されかつ精製されたKCNQ5アンチセンスオリゴヌクレオチドは1種以上のKCNQ5アンチセンスオリゴヌクレオチドを管理することを含む細胞によってKCNQ5の発現レベルを減少させるために利用される方法に使用することができる。KCNQ5アンチセンスオリゴヌクレオチドとは、KCNQ5の発現を減少させるようにKCNQ5の発現に関与する特異的相補性核酸配列との塩基対合によって相互作用するヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを示す。好ましくはKCNQ5の発現に関与する核酸配列は、KCNQ5をコードするゲノムDNA分子又はmRNA分子である。このゲノムDNA分子はKCNQ5の調節領域、KCNQ5遺伝子のプレ―又は プロ―位置又は成熟KCNQ5蛋白質をコードする配列を有することができる。
【0036】
KCNQ5アンチセンスオリゴヌクレオチド及びこれに関する方法において“ヌクレオチド配列に相補”なる用語は細胞中で、すなわち生理学的条件下でその配列にハイブリダイゼイションさせるような配列に十分に相補することを意味する。KCNQ5アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは約8〜約100個のヌクレオチド、更に好ましくは約15〜約30個のヌクレオチドを有する配列から成る。
【0037】
KCNQ5アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸分解耐性を与える種々の修飾を有する誘導体、たとえば修飾されたインターヌクレオシド、修飾された核酸塩基及び(又は)糖類等も含むことができる。このような誘導体の例は、骨格修飾、たとえばホスホトリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスフェート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート及びホルムアセタール並びにモルホリノ、ペプチド核酸同族物及びジチオエート繰り返し単位を含む。
【0038】
アンチセンス分子の有用性は、たとえばToulme & Helene, Gene 1988 72 51-58; Inouye, Gene 1988 72 25-34; Uhlmann & Peyman, Chemical Reviews 1990 90 543-584; Robertson, Nature Biotechnology 1997 15 209;及びGibbons & Dzau, Science 1996 272 689-693に記載されている。これらの文献は参考資料として本明細書に組み込まれるものとする。
【0039】
生物学的起源
本発明の単離されたポリヌクレオチドは任意の適当な供給源から得ることができる。好ましい一態様として本発明のポリヌクレオチドは例えば網膜、骨格筋又は脳、特に大脳皮質、大脳後頭極、前頭葉及び側頭葉、被殻及び海馬、梨状皮質、内側嗅領、橋髄質、顔面神経核、及び小脳のcDNAライブラリーからクローン化されるか、それらcDNAライブラリーに基づいて製造される。更に好ましい態様において、本発明のポリヌクレオチドは視床のcDNAライブラリーからクローン化されるか又はこれに基づいて製造される。市販のcDNAライブラリーは例えばStratageneやClontechなどから入手できる。
【0040】
本発明のKCNQ5遺伝子は染色体6(6q14)の長軸(long arm)に局在化される。
【0041】
本発明の単離されたポリヌクレオチドは例えば下記実施例に記載するような当技術分野公知の方法によって得ることができる。
【0042】
好ましいポリヌクレオチド
好ましい一態様として本発明のポリヌクレオチドは配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列配列からなる。
【0043】
もう一つの好ましい態様として本発明のポリヌクレオチドは1種以上の置換を含むKCNQ5チャネルサブユニットをもたらす配列である。
【0044】
もう一つの好ましい態様として本発明のポリヌクレオチドは以下により詳しく定義する保存領域中に1種以上の置換を含むKCNQ5チャネルサブユニットをもたらす配列である。
【0045】
KCNQチャネルは選択的スプラインシングを示すことが多く、したがって同じ遺伝子に由来するアイソフォームとして存在しうることが実証されている。このようなアイソフォームと、それらの派生源となった様々なcDNA配列も、本発明の範囲に包含される。
【0046】
最後に、ヒト以外の種でKCNQチャネルサブユニットをコードしている遺伝子はヒト遺伝子とはわずかに異なることが見出されている。しかし他の種(例えばマウス、ラット、サル、ウサギなど)の遺伝子も本発明の範囲に包含される。
【0047】
組換え生産ポリペプチド
もう一つの態様として本発明は、新規KCNQ5蛋白質に関する。更に詳しくは本発明は、KCNQ5チャネル又はKCNQ5チャネルサブユニットの電気生理学的及び薬理学的特性を持つ実質的に純粋な機能的ポリペプチドに関する。本発明の新規ポリペプチドは本発明のポリヌクレオチドにより、標準的な組換えDNA技術を使って得ることができる。
【0048】
好ましい一態様として本発明のポリペプチドは、配列番号2に記載のアミノ酸配列及びその生物学的活性断片を含んでなるKCNQ5カリウムチャネルサブユニットである。
【0049】
この一次アミノ酸配列の修飾は、無修飾対応ポリペプチドと比較して実質的に等価な活性を持ち、それゆえに親蛋白質の機能的類似物とみなすことができる蛋白質をもたらしうる。このような修飾は、例えば部位特異的突然変異導入などのように作為的な修飾であっても、自然に起こる修飾であってもよく、スプライス変異体、アイソフォーム、他の種に由来するホモログ及び多型を包含する。このような機能的類似物も本発明に包含される。
【0050】
さらに、この一次アミノ酸配列の修飾は、親蛋白質の生物学的活性を保っていない蛋白質、例えばドミナントネガティブ型などをもたらす場合もある。ドミナントネガティブ蛋白質は野生型ポリペプチドに結合するか、そうでなければ野生型ポリペプチドと通常機能的に相互作用する調節物質(例えば上流又は下流成分など)を封鎖することによって、野生型蛋白質を妨害しうる。このようなドミナントネガティブ型も本発明に包含される。
【0051】
本発明では“変異体ポリペプチド”という用語は、配列番号2に記載の配列とは1個以上の位置で相違するアミノ酸配列を有するポリペプチド(又は蛋白質)を意味する。このような変異体ポリペプチドには上記の修飾ポリペプチドならびに保存的置換、スプライス変異体、アイソフォーム、他の種に由来するホモログ及び多型が包含される。
【0052】
本明細書に定義する用語“保存的置換”は生物学的に類似する別の残基によるアミノ酸残基の置換を表す。保存的置換の例としてはイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンなどの疎水性残基同士の置換又は極性残基同士の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換もしくはグルタミンによるアスパラギンの置換などがある。保存的置換という用語は、当該置換ポリペプチドに対して産生させた抗体が無置換ポリペプチドとも免疫反応するという条件で、無置換親アミノ酸残基の代わりに置換アミノ酸残基を使用することも包含する。
【0053】
KCNQ1 ナンバーリングシステム
本発明では既成の1文字記号を使ってアミノ酸残基(及び核酸塩基)を特定する。
【0054】
本発明ポリペプチドのアミノ酸配列を既知ポリペプチドのアミノ酸配列と整列させることにより、アミノ酸配列が分かっている任意のKCNQチャネル蛋白質中の任意のアミノ酸に1つのアミノ酸位置番号を明瞭に割り当てることが可能な特有のアミノ酸ナンバーリングシステムを使用することができる。
【0055】
そのような整列を下記表1に示す。ClustalXコンピュータ整列プログラム[Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,Jeanmougin F及びHiggins DG「The ClustalX windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools(ClustalXウィンドウズインターフェース:品質分析ツールを援用した多重配列整列のための自由度の高い戦略)」Nucleic Acids Res. 1997 25(24)4876-82]とそのデフォルトパラメーターとを使って、本発明ポリペプチド(hKCNQ5)のアミノ酸配列及び既知ポリペプチドhKCNQ2〜4のアミノ酸配列を、既知ポリペプチドhKCNQ1(以前はKvLQT1と呼ばれていた)のアミノ酸配列と、hKCNQ1のアミノ酸配列を基準として整列させる。本発明ではこのナンバーリングシステムをKCNQ1ナンバーリングシステムと呼ぶ。
【0056】
本発明によって製造又は意図される様々な蛋白質変異体を記載するにあたって参照が容易なように「元のアミノ酸/位置/置換アミノ酸」という命名法を応用した。
【0057】
この命名法によれば表1の329位でのセリンによるグリシンの置換は「G329S」と表される。
【0058】
表1
CLUSTAL X多重配列整列
KCNQ1ナンバーリング
【0059】
【表1】
【0060】
【表2】
【0061】
【表3】
【0062】
【表4】
【0063】
hKCNQ1:ヒトKCNQ1[Wang,Qら,Nature Genet. 1996 12 17-23]
hKCNQ2:ヒトKCNQ2[Biervertら,Science 1998 279 403-406]
hKCNQ3:ヒトKCNQ3[Schroederら,Nature 1998 396 687-690]
hKCNQ4:ヒトKCNQ4[Kubischら,Cell 1999 96 (3) 437-46]
hKCNQ5:ヒトKCNQ5;本発明の蛋白質
-:この位置にはアミノ酸がない。
★:単一の完全に保存された残基を持つ位置(保存領域)を示す。
【0064】
好ましい変異体は、下記のアミノ酸残基を有する432〜476位(KCNQ1ナン バーリング)でのスプライス変異体である。
【0065】
【外1】
【0066】
もう一つ好ましい変異体はG329S(KCNQ1ナンバーリング)又はKCNQ5/G278S(“KCNQ1ナンバーリング”)である。
【0067】
生物学的活性
イオンチャネルは薬剤に対する優れたターゲットである。本発明のポリヌクレオチドはKCNQ5と呼ばれたカリウムチャネルをコードする。
【0068】
KCNQ5、又はKCNQ5を有するヘテロマーチャネルは、情動障害、アルツハイマー病、不安、運動失調、CNS損傷(外傷、脳卒中又は神経変性病によって起こるもの)、認知欠損、強迫行動、痴呆、抑うつ、ハンチントン病、躁病、記憶欠陥、記憶障害、記憶機能異常、動作障害、運動障害、神経変性疾患、パーキンソン病及びパーキンソン様運動障害、恐怖症、ピック病、精神病、精神分裂病、脊髄損傷、脳卒中、振せん、発作、痙攣及びてんかんを含むCNSの疾患又は悪い状態に関連する疾病の治療に特に興味深いターゲットであることができる。
【0069】
本発明の新規ポリヌクレオチドはそれ自体で治療剤又は診断剤として使用することができる。遺伝子治療に関して、当業者はセンス又はアンチセンス核酸分子をKCNQ関連症状用治療剤として使用することができる。
【0070】
KCNQ サブユニットによって形成されるヘテロマー
今までに記載されたKCNQチャネルは生理学的にはヘテロマーとして機能する。KCNQ1はKCNE1(minK又はIsKとしても知られている)と会合し、KCNQ2とKCNQ3はいくつかの神経伝達物質によって調節されるニューロン興奮性の重要な決定因子であるM電流の基礎をなし、そしてKCNQ4はKCNQ3と結合して外側毛髪細胞中にIM−様電流を仲介すると考えられる。
【0071】
他のKCNQチャネルサブユニットと同様にKCNQ5も他のサブユニット、例えばKCNE1又は他のKCNQチャネルサブユニット、特にKCNQ3と、及びKCNQ4と相互に作用することができる。ホモマー型KCNQ3による電流は非常に小さく、アフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞バックグラウンド電流と区別できないことが多い。KCNQ3をKCNQ5と同時発現させたところ電流振幅が著しく増加した。KCNQ4をKCNQ5と同時発現させたところ電流振幅が著しく減少した。
【0072】
抗体
本発明のポリペプチドはこれらのポリペプチドのエピトープに対して免疫反応性を持つ又は結合する抗体を生産するために使用できる。本質的に様々な特異性を持つモノクローナル抗体の集まりから成るるポリクロナール抗体及び個別のモノクローナル抗体調製物を提供できる。様々な特異性を持つモノクローナル抗体の集まりから構成されるポリクロナール抗体及び個別のモノクローナル抗体調製物を提供できる。
【0073】
ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の製造は当技術分野では周知である。ポリクローナル抗体は特に、Green等:“Production of Polyclonal Antisera”、Immunochemical Protocols(Manson編,Humana Press,1992)、第1頁 〜第5頁;Coligan等:“Production of Polyclonal Antisera in rabbits, rats, Mice and Hamsters”、 Current Protocols in Immunology(1992)、Section2.4.1;及びEd Harlow 及び David Lane (編集者)、“Antibodies; A laboratory manual”、Cold Spring Harbor Lab. Press 1988などに記載されている方法で得ることができる。これらのプロトコルは参考資料として本明細書に組み込まれるものとする。
【0074】
モノクローナル抗体は特に、Kohler & Milstein,Nature 1975 256 495;Coligan等,Current Protocols in Immunology(1992)、Sections 2.5.1〜2.6.7; Harlow等,Antibodies:A Laboratory Manual;Cold Spring HarborPub., 1988, 第726頁などに記載されている方法で得ることができる。これらのプロトコルは参考資料として本明細書に組み込まれるものとする。
【0075】
簡単に述べるとモノクローナル抗体は例えばマウスに抗原を含む組成物を注射し、抗体産生が起こっていることを血清試料の採取によって確認し、Bリンパ球を得るために脾臓を摘出し、そのBリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作成し、そのハイブリドーマをクローニングし、前記抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、そのハイブリドーマ培養物から抗体を単離することによって得ることができる。
【0076】
モノクローナル抗体は例えばプロテインAセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどといった様々な確立した技術によってハイブリドーマから単離、精製できる。例えばColigan等,Current Protocols in Immunology(1992)、Sections 2.7.1〜2.7.12とSections 2.9.1〜2.9.3;及びBarnes等、“Purification of Immunoglobulin G (IgG)”、 Methods in Molecular Biology(Humana Press,1992、第10巻、第79頁〜第104頁を参照されたい。
【0077】
上記ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、場合によりその抗体を産生させる際に使用したポリペプチドを結合したマトリックスに抗体を結合させ、同マトリックスから抗体を溶出させることなどによって、さらに精製できる。
【0078】
本発明のポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチド又は免疫抗原として関心がもたれる小ペプチドを含有する断片を使って製造できる。動物の免疫化に使用するポリペプチドは組換えDNA技術又は化学合成によって得ることができ、要すれば担体蛋白質に結合してもよい。ペプチドに化学結合される担体蛋白質でよく使用されるものにはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、破傷風トキソイドなどがある。次に結合させたペプチドを使って動物を免疫化する。この動物としては特にマウス、ラット、ハムスター又はウサギを挙げることができる。
【0079】
遺伝子操作された細胞
第3の態様として本発明は本発明異種ポリヌクレオチドの取り込みによって遺伝子操作された細胞を提供する。本発明の細胞としては特に、上に定義したKCNQ5チャネルサブユニットを一過性もしくは安定に発現するか、過剰発現するか、同時発現するように遺伝子操作された細胞を挙げることができる。一過性導入と安定導入の方法は当技術分野では知られている。
【0080】
本発明のポリヌクレオチドは発現ベクター(例えばプラスミド、ウイルス又は他の発現媒体)に挿入し、発現制御配列に、それら発現制御配列に適合する条件でコード配列の発現が達成されるように、ライゲーションによって機能的に連結することができる。適切な発現制御配列にはプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン、イントロンのためのスプライスシグナル及び停止コドン(いずれもmRNAの適切な翻訳が可能なように本発明ポリペプチドの正しい読み枠に維持されたもの)が包含される。発現制御配列にはリーダー配列や融合パートナー配列などといった追加成分を含めてもよい。
【0081】
プロモーターとしては特に構成的プロモーター又は誘導性プロモーターを挙げることができる。細菌系でのクローニングにはバクテリオファージγのpL、plac、ptrp、ptac(ptrap-lacハイブリッドプロモーター)などといった誘導性プロモーターを使用できる。哺乳類系でのクローニングには哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター、例えばTKプロモーターもしくはメタロチオネインプロモーター、又は哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター、例えばレトロウイルス末端反復配列、アデノウイルス後期プロモーターもしくはワクシニアウイルス7.5Kプロモーターなどを使用できる。組換えDNA法又は合成法によって得られるプロモーターを使って本発明ポリヌクレオチドの転写に備えてもよい。
【0082】
適切な発現ベクターは通例、発現起点(origin of expression)、プロモーター及び形質転換細胞の表現型選択を可能にする特有の遺伝子を含み、細菌発現用のT7系発現ベクター[Rosenbergら,Gene 1987 56 125]、哺乳動物細胞発現用のpMSXND発現ベクター[Lee及びNathans,J. Biol. Chem. 1988 263 3521]、昆虫細胞発現用のバキュロウイルス由来ベクター及び卵母細胞発現ベクターPTLN[Lorenz C,Pusch M及びJentsch TJ「Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties(新規な特性を持つヘテロ多量体型CLC塩素チャネル)」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 13362-13366]のようなベクターを包含する。
【0083】
好ましい一態様として本発明の細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞、卵母細胞又は酵母細胞である。より好ましい態様として本発明の細胞はヒト胎児腎臓(HEK)細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞(XLO)、COS細胞又はKCNQカリウムチャネルを発現できる他の任意の細胞株である。
【0084】
本発明の細胞が真核細胞である場合、本発明の異種ポリヌクレオチドの取り込みは特に感染(ウイルスベクターを使用)、トランスフェクション(プラスミドベクターを使用)又はリン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション又は当技術分野公知の他の物理化学的方法によって行なうことができる。
【0085】
さらにもう一つの好ましい態様では、KCNQ5及びKCNQ1チャネルサブユニット;KCNQ5及びKCNQ2チャネルサブユニット;KCNQ5及びKCNQ3チャネルサブユニット;KCNQ5及びKCNQ4チャネルサブユニット;KCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ2チャネルサブユニット;KCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ3チャネルサブユニット; KCNQ5及びKCNQ2及びKCNQ3チャネルサブユニット; KCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ4チャネルサブユニット; KCNQ5及びKCNQ2及びKCNQ4チャネルサブユニット; KCNQ5及びKCNQ3及びKCNQ4チャネルサブユニット; KCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ2及びKCNQ3チャネルサブユニット; KCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ2及びKCNQ4チャネルサブユニット; KCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ3及びKCNQ4チャネルサブユニット又は KCNQ5及びKCNQ2及びKCNQ3及びKCNQ4チャネルサブユニットが同時発現するように、本発明の細胞を遺伝子操作する。
【0086】
もう一つの好ましい態様において、膜調製物を提供する。本発明の膜調製物はスクリーニング目的に使用することができ、標準的技術によって得ることができる。
【0087】
本発明の凍結された完全な細胞(intact cell)を冷水に懸濁しながら均質化し、膜ペレットを遠心分離後集める。ついでこのペレットを冷水中で洗浄し、アッセイにおいて結合を競合する可能性がある内因性リガンドを除去するために透析することができる。透析された膜はそのまま又は凍結乾燥された形で保存した後に使用することができる。
【0088】
KCNQ5活性化合物
もう一つの態様として本発明は1種以上のKCNQ5サブユニットを含有するカリウムチャネルに結合しそこで活性を示すことができる化合物に関する。本発明ではそのような化合物をKCNQ5活性化合物と呼ぶ。
【0089】
本発明のKCNQ5活性化合物は治療能力を持ち、医薬組成物の製造に使用できる。
【0090】
本発明のKCNQ5活性化合物は特に情動障害、アルツハイマー病、不安、運動失調、CNS損傷(外傷、脳卒中又は神経変性病によって起こるもの)、認知欠損、強迫行動、痴呆、抑うつ、ハンチントン病、躁病、記憶欠陥、記憶障害、記憶機能異常、動作障害、運動障害、神経変性疾患、パーキンソン病及びパーキンソン様運動障害、恐怖症、ピック病、精神病、精神分裂病、脊髄損傷、脳卒中、振せん、発作、痙攣及びてんかんを含むCNSの疾患又は悪い状態に関連する疾患の診断、治療、予防又は緩和に使用できる。
【0091】
現在2つの化合物が同定されている。したがって好ましい態様として本発明は上記の疾患を診断、治療、予防又は緩和するための薬学的調合物の製造に使用される1,3-ジヒドロ-1-フェニル-3,3-ビス(4-ピリジルメチル)-2H-インドール-2-オン(リノピルジン)及び10,10-ビス(4-ピリジニルメチル)-9(10H)-アントラセノン(XE991)(XE991)を提供する。
【0092】
薬物のスクリーニング
さらなる態様として本発明はKCNQ5活性化合物、すなわち1種以上のKCNQ5サブユニットを含有するカリウムチャネルに結合しそこで活性を示す能力を持つ化合物に関するスクリーニング法を提供する。決定される活性としては阻害活性、刺激活性又は他の調節活性を挙げることができる。特にKCNQ5活性化合物としては、細胞の分子的特徴(例えばイオン流束、酵素活性化ならびにcAMP、cADP、cGMP及びcGDPなどの環状ヌクレオチドの変化など)の変化を引き起こす二次メッセンジャー応答を誘導するものが挙げられる。
【0093】
したがって本発明はもう一つの態様として、KCNQ5サブユニットを含んでなるヒトカリウムチャネルの機能的リガンドを同定する方法であって、細胞にKCNQ5チャネルサブユニットをコードする1種以上の本発明ポリペプチドをトランスフェクトし、レセプターへのリガンドの結合によってこれらの細胞で起こるシグナル伝達経路に対する影響を、レポーターシステムによって検出することからなる方法を提供する。
【0094】
そのような化合物は下記の方法の一方又は両方によって同定できる。
【0095】
結合試験
結合試験は通常、標的を、標識した選択的アゴニスト(結合剤)と結合させて、標識された複合体を形成させた後、その複合体に試験化合物を添加した時に起こる置換の程度を決定することによって行なわれる。
【0096】
具体的一態様として本発明は、少なくとも1つのKCNQ5チャネルサブユニットを含んでなるカリウムチャネルに結合する能力に関して化合物をスクリーニングする方法であって、(i)KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞にKCNQ5結合剤を作用させて、そのKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞との複合体を形成させ、(ii)工程(i)の複合体に試験対象化合物を作用させ、(iii)KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのKCNQ5結合剤の置換を検出するという各工程を含む上記方法。を提供する。
【0097】
KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞は上述した本発明の細胞であることが好ましい。
【0098】
KCNQ5結合剤は放射標識された1,3-ジヒドロ-1-フェニル-3,3-ビス(4-ピリジルメチル)-2H-インドール-2-オン(リノピルジン)又は10,10-ビス(4-ピリジニル-メチル)-9(10H)-アントラセノン(XE991)であることが好ましい。
【0099】
さらに一層好ましい態様では、結合剤が3Hで標識され、KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのKCNQ5結合剤の置換が通常の液体シンチレーション計数法で放射活性量を測定することによって検出される。
【0100】
活性試験
KCNQ5チャネルアゴニストは様々な形でカリウムチャネルに作用しうる。アゴニストは特に阻害活性、刺激活性又は他の調節活性を示しうる。
【0101】
具体的一態様として本発明は1種以上のKCNQ5サブユニットを含有するカリウムチャネルでの活性を決定する方法を提供する。この方法ではKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞に試験対象化合物を作用させ、そのKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞(好ましくは上述のように遺伝子操作された細胞)の膜電位、電流、カリウム流束又は二次的カルシウム流入を監視することによって活性を検出する。
【0102】
膜電位と電流は、パッチクランプ法を含む電気生理学的方法、例えば膜電流固定技術や二電極膜電位固定技術などによって、又は蛍光法などの分光法によって監視できる。
【0103】
好ましい一態様ではKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視がパッチクランプ法によって行なわれる。
【0104】
もう一つの好ましい態様では、KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視が例えば蛍光法などを用いて分光法によって行なわれる。より具体的な一態様ではKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞を、試験化合物の添加によって起こる細胞の膜電位の変化の決定を可能にする膜電位指示薬と混合する。膜電位指示薬としては特に蛍光指示薬、好ましくはDIBAC4(3)、DiOC5(3)及びDiOC2(3)を挙げることができる。
【0105】
さらにもう一つの好ましい態様では、KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視が、例えばFLIPRアッセイ(Fluorescence Image Plate Reader(蛍光画像プレートリーダー)、Molecular Devicesから入手できる)などを使った分光法によって行なわれる。
【0106】
遺伝物質のスクリーニング
さらなる態様として本発明は遺伝物質のスクリーニングにおける本発明ポリヌクレオチド配列の使用に関する。この方法により本発明のポリヌクレオチドと同一又は相同な遺伝子を保有する個体を同定できる。
【0107】
本発明のスクリーニングでは本発明のポリヌクレオチド又はその任意の断片もしくはそのサブ配列を使用する。突然変異遺伝子を保有する個体の同定には、配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列の突然変異型を使用することが好ましい。
【0108】
本発明のスクリーニング法では実際に使用する方法に応じて短い配列だけを使用する必要がある。SSCAには数百塩基対が必要であり、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション又はPCRハイブリダイゼーションに必要な配列は約10〜約50塩基対に過ぎないだろう。
【0109】
スクリーニングはハイブリダイゼーション、SSCA解析、アレイ技術(DNAチップ技術)を含む従来の方法で行なうことができる。上述したハイブリダイゼーションプロトコルは本発明のスクリーニングでの使用に適したプロトコルの代表例である。
【0110】
トランスジェニック動物
トランスジェニック動物モデルはインビボで治療用化合物をスクリーニングする手段になる。KCNQ5は脳でも発現するので、CNS障害(例えば癲癇)に有効な薬物のスクリーニングにも役立ちうる。
【0111】
導入遺伝子とは、細胞に人工的に挿入されてその細胞から発生する生物のゲノムの一部になる任意のポリヌクレオチド片をいう。そのような導入遺伝子にはそのトランスジェニック生物にとって部分的に又は完全に異種(すなわち外来)である遺伝子を含めることができ、またそのような導入遺伝子はその生物の内因性遺伝子に相同な遺伝子に相当してもよい。
【0112】
トランスジェニック動物とは、人工的に挿入されたポリヌクレオチド配列を含んでいる細胞であってその細胞がその細胞から発生するトランスジェニック生物の一部になる細胞を保有する任意の生物をいう。そのような導入遺伝子はそのトランスジェニック動物にとって部分的に又は完全に異種の遺伝子であってよい。トランスジェニックマウスは本発明の好ましい一態様に相当するが、例えばトランスジェニックげっ歯類動物(例えばハムスター、モルモット、ウサギ及びラット)ならびにトランスジェニックブタ、ウシ、ヒツジ及びヤギなどといった(ただしこれらに限らない)他のトランスジェニック動物も標準的技術で作出することができ、本発明に包含される。
【0113】
好ましくは、導入遺伝子は核ゲノムに人工的に挿入される。
【0114】
ノックアウト動物とノックイン動物
トランスジェニックノックアウト動物モデルは、内因性遺伝子への挿入の結果として当該遺伝子の機能損失を引き起こすKCNQ5遺伝子由来のゲノム配列を含有するコンストラクトを使った胚性幹細胞の相同組換えによって開発できる。
【0115】
ノックアウト突然変異とは、ポリヌクレオチド配列の改変であって通常そこにコードされているポリペプチドの生物学的活性を低下させるものをいう。真のノックアウトモデルを作出するには、発現されるポリペプチドの生物学的活性を非突然変異遺伝子に対して少なくとも80%は低下させるべきである。突然変異としては特に置換、欠失、フレームシフト突然変異又はミスセンス突然変異を挙げることができる。突然変異は置換、挿入又は欠失であることが好ましい。
【0116】
KCNQ5の役割を生物レベルでさらに評価するには、完全なKCNQ5遺伝子を欠く動物又は突然変異したKCNQ5遺伝子を保有する動物(好ましくはマウス)の作出が望ましい。
【0117】
ノックアウトモデルの作出に使用できる置換型標的ベクターは、例えば129/Svなどのマウス系統由来の同系ゲノムクローン(Stratagene Inc.、カリフォルニア州ラホーヤ)を使って構築することができる。標的ベクターを胚性幹(ES)細胞の適当な派生株にエレクトロポレーションによって導入することで、著しく切断された形のKCNQ5遺伝子を保有するES細胞株を作出することができる。次にその標的細胞株をマウス胞胚期胚に注入してキメラファウンダーマウスを作出することができる。ヘテロ接合型子孫を交配してホモ接合性を得ることができる。
【0118】
過剰発現に関する動物モデルは、標準的技術によってゲノムに1種以上の本発明ポリヌクレオチド配列を組込むことによって作出できる。
【0119】
核酸の分子操作を伴なう本明細書に記載の手法は当業者には知られており、例えばFredrick MAら[Fredrick MAら,Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons,1995]やSambrookら[Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版,コールドスプリングハーバー研究所,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー,1989]によって、またAlexandra LJ編,Gene Targeting: A practical approach(オックスフォード大学出版局,オックスフォード・ニューヨーク・東京,1993)などに記載されている。
【0120】
図面の簡単な説明
本発明を添付の図面を参照して、さらに説明する。
【0121】
図1はKCNQ5電流の電気生理学的特性を示す[時間/秒に対するl/uA]。KCNQ5 cRNAを注入したアフリカツメガエル卵母細胞からの二電極電圧固定電流トレース。−80mVの保持電位から出発して細胞を−80〜+40mVの電位に+10mVステップで2秒間固定した後、−30mVへの定テストパルスを与えた。
【0122】
図2はKCNQ5とKCNQ3との同時発現から生じる電流の電気生理学的特性を示す[時間/秒に対するl/uA]。−80mVの保持電位から出発して細胞を−80〜+40mVの電位に+10mVステップで2秒間固定した後、−30mVへの定テストパルスを与えた。
【0123】
図3はKCNQ5とKCNQ4(2B)との同時発現から生じる電流の電気生理学的特性を示す[時間/秒に対するl/uA]。−80mVの保持電位から出発して細胞を−80〜+40mVの電位に+10mVステップで2秒間固定した後、−30mVへの定テストパルスを与えた。
【0124】
図4A−GはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。スプライス変異体I(脳中に見られる)及びスプライス変異体III(筋肉中に見られる)の両方をアフリカツメガエル卵母細胞中で発現させ、二電極膜電位固定によって試験した。両方の変異体は脱分極しながら徐々に活性化したが、型I(4A)は初めにIII(4B)に比べてゆっくり活性化した。−80mVの保持電位から出発して細胞を−80〜+40mVの電位に+10mVステップで0.8秒間固定した後、−30mVへの定テストパルスを与えた(挿入図、パネルA参照)。脱分極によるチャネル活性化を3つの指数関数の合計によってフィットさせた(2秒ステップに関して)。+20mVへのステップに関して、速度定数はスプライス変異体Iについては^o1=37.2±2.2ms、^o2=246±17ms及び^o3=1112±91msであった。一方、これらの定数は^o1=24.5±0.8ms、^o2=163±6ms及び^o3=1690±46ms(±SEM,n=16)であった。動力学におけるこの相違は典型的M−電流プロトコルを使用した場合(4C、変異体I;4D、変異体III)異なる曲線も結果として生じた。変異体IはM−電流に動力学的に似る電流を誘発する。このプロトコルにおいて、膜電位は−30mVの保持電位から出発して細胞を−30〜−90mVの電位に−10mVステップで1秒間固定した.その後−30mVへのステップを続けた(パネルC、挿入図)。(4E,4F)、上記方法で記載されているようにテール電流解析から得られた電圧の関数としての変異体I(4E)及び変異体III(4F)の見かけの開口確率。12個の卵母細胞から得られた平均値を示す。ボルツマン方程式に当てはめると、V1/2=−46±1mV及び見かけのゲート電荷はイソホルムIに関してz=2.8±0.1、V1/2=−48±1mV及び見かけのゲート電荷はイソホルムIIIに関してz=2.5±0.1を生じた。このフィットに関して、+10mVよりも正の電位の値は除かれた。というのはこれらがより正の電位で見かけPopen の減少を導く第二(不活性化)ゲート処理によって影響されるからである。(4G)、KCNQ5電流のイオン選択性(変異体I)。細胞外ナトリウムを等モル量のカリウムで置き換えた。逆転電位をカリウム濃度の関数として示す。これは51mV/decadeのカリウム濃度の傾斜を生じ、これは高度に選択的なカリウムチャネルを指し示す。データは2つの別個のバッチからの10個の卵母細胞に由来する。
【0125】
図5A−CはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。(5A)細胞外リノピリジンによるKCNQ5ホモマーの阻害(下向き三角形)、XE991(上向き三角形)及びTEA(四角)。それぞれ51±5μM、65±4μM及び71±17mMのIC50 値はプロットされたフィット曲線から得られた。(5B)ニフルミン酸(niflumic acid)は見かけPopen の電圧依存を変えた。ニフルミン酸500μM(白丸)の存在で、電圧依存は負の電位へ約20mMずれる。(5C)TEA敏感性はKCNQ3/5 ヘテロマーで変わる。KCNQ5及びKCNQ3(1:1)(ひし形)の同時発現はIC50 値を~30mMに増加させ、KCNQ3(T323Y)突然変異体(丸)との同時発現はIC50 値を~30mMに減少させる。パネルA及びCでのデータポイントは4〜12個の個々の測定値の平均±SEMである。Popen は図3におけるように決定した。
【0126】
図6は、アフリカツメガエル卵母細胞中で同時発現させたM1レセプターを刺激することによるKCNQ5電流の阻害を示す。
【0127】
(6A)M1レセプターを刺激する前の電流。
【0128】
(6B)ムスカリン10μMを投与3分後に観察された電流。パルスプロトコルはパネルbの挿入図に示される。10μMのムスカリン又はオキソトレモリンメチオダイドの作用はKCNQ5のみが注入された卵母細胞中で観察されなかった。
【0129】
図7A−CはKCNQ2とKCNQ5の相互作用(7A、7B)及びKCNQ3とKCNQ5の相互作用(7C)を示す。
【0130】
(7A)KCNQ cRNAsの種々の組み合わせ(常に全量10ngのRNA)が注入された卵母細胞の−80mVの保持電位から出発して0mVへの2つの第二パルスの最終電流。KCNQ2及びKCNQ5の同時注入により誘発された電流振幅は電流の線形スーパーポジションによって説明することができる。KCNQ5とドミナントネガティブ突然変異KCNQ2(G279S)の同時注入又はKCNQ2と同等の突然変異KCNQ5(G278S)の同時注入は電流振幅におおよそ50%減少を導き、この減少は相互作用がないことと一致する。というのはWTcRNAの50%しか注入されなかったからである。
【0131】
(7B)パネル(A)で使用された実験の標準化された電流トレース。パルスを0mMに脱分極することによって誘発された電流。KCNQ2(標識されたQ2)はKCNQ5(Q5)及び線形スーパーポジションによって説明することができる両方に生じる電流に比べて速く活性化する。KCNQ2とドミナントネガティブ(及びさもなければ非官能性)突然変異KCNQ5(G278S)の同時注入は、KCNQ2と動力学的に類似する電流を生じ、そしてKCNQ5/KCNQ2(G279S)の同時注入から得られる電流はKCNQ5電流に似ていた。
【0132】
(7C)パネル(a)におけるように測定されたKCNQ3とKCNQ5の間の相互作用。KCNQ3はアフリカツメガエル卵母細胞中で極めて小さい電流しか生じなかった。少量のKCNQ3とKCNQ5を同時発現した場合、電流は増加し、多量のKCNQ3と同時発現した場合、電流は減少する。ドミナントネガティブ突然変異KCNQ3(G318S)はこの実験でWT KCNQ5 cRNAの注入された50%から予想されるであろうWT KCNQ5電流の50%以下に電流を著しく減少させた。
【0133】
実施例
下記の実施例を参照して本発明をさらに例証するが、下記の実施例は特許請求の範囲に記載する本発明の範囲をいかなる形でも限定するものではないものとする。
【0134】
実施例1
KCNQ5 cDNAのクローニングと特徴づけ
ほぼ完全な長さのKCNQ3カリウムチャネルcDNAをプローブとして使用して、ヒト視床cDNAλGT11ファージライブラリー(Clontech、#HL5009b)をスクリーニングして、KCNQカリウムチャネルに相同な蛋白質断片をコードする部分cDNAクローンを単離した。これは既知のメンバーKCNQ1(KvLQT1)、KCNQ2、KCNQ3及びKCNQ4と異なっていた。我々はこの新規遺伝子をKCNQ5と名付けた。上記のcDNAライブラリーを再スクリーニングし、Marathonキット(Clontech)とヒト脳cDNAとを使ったRACE(rapid amplification of cDNA ends)実験で5'末端を伸張することにより、全オープンリーディングフレームを包含するオーバーラップしたcDNA群を得た。完全なcDNAを組立て、卵母細胞発現ベクターPTLN[Lorenz C,Pusch M及びJentsch TJ「Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties(新規な特性を持つヘテロ多量体型CLC塩素チャネル)」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93 13362-13366]にクローニングした。
【0135】
このcDNAは99kDaの予想分子量を持つ897アミノ酸のポリペプチドをコードする(配列番号2)。KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3及びKCNQ4に対する全体的アミノ酸一致度はそれぞれ43%、58%、54%及び61%である。このポリペプチドはこれらの蛋白質と共に全体として電位開口型カリウムチャネルスーパーファミリーの独特なブランチを形成する。この遺伝子ファミリーの典型的メンバーとして、KCNQ5は6つの予想膜貫通ドメインを持ちかつ膜貫通ドメインS5とS6の間にPループを持つ。同一の又は相同なサブユニットの四量体であるカリウムチャネルでは、これらの高度に保存されたPループ4つが結合してイオン感受性ポアを形成する。他のKCNQチャネルと同様に、KCNQ5は同蛋白質の約半分を占める長い予想細胞質カルボキシ末端を持つ。KCNQ1、2及び3のカルボキシ末端に存在する保存領域はKCNQ5にも存在する。
【0136】
KCNQ5の配列から、プロテインキナーゼCによるリン酸化を受ける可能性のある部位が数ヶ所予測される。しかしKCNQ1及びKCNQ2とは対照的に、アミノ末端のcAMP依存的リン酸化コンセンサス部位は無い。
【0137】
ヒト多組織ノーザンブロット(Multiple Tissue Northern Blot、Clontech、#7760-1)を、KCNQ5のcDNA断片でプローブした。この断片はRediprime標識キット(Amersham)を使って32Pで標識した。ハイブリダイゼーションはExpressHyb溶液中で、その製造者(Clontech)の使用説明に従って行なった。次にフィルターをKodak BioMaxフィルムに4日間露光した。
【0138】
ヒト組織におけるKCNQ5発現のノーザン解析により、脳に約9kbのバンドが明らかになった。
【0139】
実施例2
KCNQ5カリウムチャネルサブユニットの機能的発現
アフリカツメガエル卵母細胞中でKCNQ5を発現させ、その活性を二電極膜電位固定法で調べた。
【0140】
KCNQ5含有pTLNベクターをHpaIで線状化した後、mMessage mMachine cRNA合成キット(Ambion)を使ってキャップcRNAをインビトロで転写した。通常5〜15ngのcRNAを手作業による濾胞除去と短いコラーゲナーゼ処理によって先に単離したアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。同時発現実験ではcRNAを1:1の比で注入した。卵母細胞を改良バース(Modified Barth's)溶液(90mM NaCl、1mM KCl、0.41mM CaCl2、0.33mM Ca(NO3)2、0.82mM MgS04、10mM HEPES、100Uペニシリン-100μgストレプトマイシン/ml、pH7.6)中、17℃に保った。
【0141】
標準的二電極電圧固定測定を、Turbotec05増幅器(npi instruments、ドイツ・タム)とpClamp5.5ソフトウェア(Axon Instruments)を使って、注入の2〜4日後に室温で行なった。電流は通常、ND98溶液で記録した(表2参照)。リノピルジン(RBI、マサチューセッツ州ネーティック)はDMSO中に100mM原液として調製し、最終濃度が200μMになるようにND98に添加した。
【0142】
表2
溶液の内容物(濃度、単位mM)
【0143】
【表5】
【0144】
見かけの開口確率の電位依存性を決定するために、卵母細胞を−80mVから+40mVまでの値に10mVステップで4秒間固定した後、一定の−30mVテストパルスを与えた。t=0に外挿したテール電流を一指数関数フィット(mono-exponential fit)から得て、0mVでの値に規格化し、見かけのPopenの解析に用いた。データ解析にはPClamp6とMicrocal Origin 5.0を使った。
【0145】
KCNQ1、KCNQ2、KCNQ3及びKCNQ4と同様にKCNQ5も脱分極時に活性化する電流を与える(図1)。しかしKCNQ1、KCNQ2及びKCNQ2/3チャネルと比較して、電流活性化は遅く、+20mVで600ms程度の時定数で起こる(KCNQ2/KCNQ3チャネルの場合、対応する時定数は約300msである)。この時定数は温度の変化に極めて敏感である。生理学的静止電位(約−30mV)での電流の不活化はかなり速い(図1)。KCNQ2と同様に巨視的な電流は正の電位で多くの場合、多少の内向き整流を示した。KCNQ5電流は5mMBa++で80%以上阻害された。
【0146】
KCNQ1はminK(KCNE1又はIsKとしても知られている)と共に組み立てられて、より大きい電流を与え、より緩慢に活性化するチャネルを形成する。そこで我々は、minKがKCNQ5にも作用するかどうかを同時発現によって試験した。並行実験でKCNQ1電流に激しい変化をもたらす濃度(1ng minK cRNA/卵母細胞)では、KCNQ5電流に有意な変化はなかった。
【0147】
異なるKCNQサブユニットはヘテロマー型チャネルを形成できる。KCNQ2をKCNQ3と同時発現させるとホモマー型チャネルの場合より約10倍大きい電流が得られたが、KCNQ2をKCNQ1と同時発現させた場合はそうならない。KCNQ2、KCNQ3及びKCNQ4は脳で発現されるので、我々はこれらの蛋白質が機能的に相互作用するかどうかを調べた。KCNQ2及びKCNQ5 cRNAを(総cRNA濃度を同じにして)同時注入した卵母細胞は、それぞれのホモマー型チャネルによる電流の線形重ね合わせと相違しないと思われる電流を生じた。
【0148】
これに対し、KCNQ3をKCNQ5と同時発現させると、それぞれのホモマー型チャネルによる電流の重ね合わせで説明できるものより有意に大きい電流が得られた(図2A)。さらにKCNQ5及びKCNQ4の同時発現はホモマー型チャネルと比較すると電流を減少させた(図2B)。
【0149】
M電流の強力でかなり特異的な阻害剤であるリノピルジンは200μMの濃度でKCNQ2/KCNQ3チャネルをほぼ完全に阻害する。
【0150】
このリノピルジン濃度でKCNQ5は約80%阻害された。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1はKCNQ5電流の電気生理学的特性を示す[時間/秒に対するl/uA]。
【図2】 図2はKCNQ5とKCNQ3との同時発現から生じる電流の電気生理学的特性を示す[時間/秒に対するl/uA]。
【図3】 図3はKCNQ5とKCNQ4(2B)との同時発現から生じる電流の電気生理学的特性を示す[時間/秒に対するl/uA]。
【図4A】 図4AはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。
【図4B】 図4BはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。
【図4C】 図4CはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。
【図4D】 図4DはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。
【図4E】 図4EはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。
【図4F】 図4FはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。
【図4G】 図4GはKCNQ5の電気生理学的特性を示す。
【図5A】 図5AはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。
【図5B】 図5BはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。
【図5C】 図5CはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。
【図5D】 図5DはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。
【図5E】 図5EはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。
【図5F】 図5FはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。
【図5G】 図5GはKCNQ5及びKCNQ3/5ヘテロマーの薬理学を示す。
【図6】 図6は、アフリカツメガエル卵母細胞中で同時発現させたM1レセプターを刺激することによるKCNQ5電流の阻害を示す。
【図7A】 図7AはKCNQ2とKCNQ5の相互作用を示す。
【図7B】 図7BはKCNQ2とKCNQ5の相互作用を示す。
【図7C】 図7CはKCNQ3とKCNQ5の相互作用を示す。
【配列表】
Claims (34)
- 配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列を含み、カリウムチャネルKCNQ5サブユニットをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1に記載のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90%相同であり、アフリカツメガエル卵母細胞中で発現させると脱分極時に活性化する電流を与えるカリウムチャネルKCNQ5サブユニットをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- クローン化ポリヌクレオチドである、請求項1または2のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドがcDNAライブラリーからクローン化されるか、cDNAライブラリーに基づいて製造される、請求項3の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号2によって表されるアミノ酸配列を含んでなるKCNQ5カリウムチャネルサブユニットをコードする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有するベクターコンストラクト。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされる組換え生産ポリペプチド。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を含んでなるKCNQ5カリウムチャネルサブユニットである、請求項7のポリペプチド。
- 分子量約99kDaを有する、請求項7又は8記載のポリペプチド。
- 6個の膜貫通ドメイン、P−ループ及びカルボキシ末端保存細胞質領域(“A−ドメイン”)を有する、請求項7〜9のいずれかに記載のポリペプチド。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項6記載のベクターコンストラクトの取り込みによって遺伝子操作された細胞。
- 配列番号2に記載のアミノ酸配列を含んでなるKCNQ5チャネルサブユニットの取り込みによって操作された、請求項11の細胞。
- 1種以上のKCNQチャネルサブユニットを同時発現するように遺伝子操作された、請求項11または12のいずれかに記載の細胞。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ1チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ2チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ3チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ4チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ2チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ3チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ4チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ2及びKCNQ3チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ2及びKCNQ4チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ3及びKCNQ4チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ2及びKCNQ3チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ2及びKCNQ4チャネルサブユニット;
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ1及びKCNQ3及びKCNQ4チャネルサブユニット又は
請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5及びKCNQ2及びKCNQ3及びKCNQ4チャネルサブユニットを同時発現するように遺伝子操作された請求項13の細胞。 - KCNQ2又はKCNQ3チャネルサブユニット及び請求項7〜10のいずれかに記載のKCNQ5ポリペプチドを同時発現するように遺伝子操作された、請求項13の細胞。
- 真核細胞である、請求項11〜15のいずれかに記載の細胞。
- 哺乳動物細胞、卵母細胞又は酵母細胞である、請求項16の細胞。
- ヒト胎児腎臓(HEK)細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞(XLO)細胞、COS細胞又はKCNQカリウムチャネルを発現できる他の任意の細胞株である、請求項16の細胞。
- 請求項11〜18のいずれか一項に記載の細胞から得られる膜調製物。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5サブユニットを含んでなるヒトカリウムチャネルの実質的に均一な供給源を得る方法であって、請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項6記載のベクターコンストラクトが発現可能な形で取り込まれている細胞宿主を培養し、次にその培養細胞を回収する各工程を含む上記方法。
- 培養細胞から膜調製物を得る後続工程を含む請求項20の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5チャネルサブユニットを少なくとも1つ含んでなるカリウムチャネルに結合する能力に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
(i) 請求項11〜18のいずれか一項に記載のKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞又は請求項19の膜調製物にKCNQ5結合剤を作用させて、そのKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞との複合体を形成させ、
(ii)工程(i)の複合体に試験対象化合物を作用させ、
(iii)KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのKCNQ5結合剤の置換を検出する、
という各工程を含み、前記KCNQ5結合剤が放射標識された1,3-ジヒドロ-1-フェニル-3,3-ビス(4-ピリジルメチル)-2H-インドール-2-オン(リノピルジン)または放射標識された10,10-ビス(4-ピリジニル-メチル)-9(10H)-アントラセノン(XE991)である、上記方法。 - 化合物が3Hで標識されている請求項22の方法。
- 請求項11〜18のいずれか一項に記載のKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞との複合体からのKCNQ5結合剤の置換が通常の液体シンチレーション計数法で放射活性量を測定することによって検出される、請求項22の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドにコードされるKCNQ5チャネルサブユニットを少なくとも1つ含んでなるカリウムチャネルに対する活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、
(i)その化合物を請求項11〜18のいずれか一項に記載のKCNQ5サブユニット含有細胞又は請求項19の膜調製物に作用させ、ついで
(ii)そのKCNQ5チャネルサブユニット含有細胞又は膜調製物の膜電位、電流、カリウム流束又は二次的カルシウム流入を監視する、
という各工程を含む上記方法。 - KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視がパッチクランプ法によって行なわれる請求項25の方法。
- KCNQ5チャネルサブユニット含有細胞の膜電位の監視が蛍光法を使って行なわれる請求項25の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項6記載のベクターコンストラクトを、当該遺伝子での突然変異を含む個体に関して哺乳類組織から集められた遺伝物質のスクリーニングに使用する方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項6記載のベクターコンストラクトを、当該遺伝子での突然変異を含む個体に関してヒト組織から集められた遺伝物質のスクリーニングに使用する方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の内因性KCNQ5ポリヌクレオチドのノックアウト突然変異を含む非ヒトトランスジェニック動物か、請求項1〜5のいずれか一項に記載のKCNQ5ポリヌクレオチドを過剰発現させるために遺伝子操作された非ヒトトランスジェニック動物。
- 遺伝子がホモ接合状態で完全に欠失しているノックアウト動物である、請求項30の非ヒトトランスジェニック動物。
- トランスジェニックげっ歯類動物、トランスジェニックブタ、トランスジェニックウシ、トランスジェニックヒツジ又はトランスジェニックヤギである請求項30または31のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- ハムスター、モルモット又はラットから選択されるトランスジェニックげっ歯類動物である、請求項30または31のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- ウサギである、請求項30または31のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
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