JP2006502702A - 免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、引用により完全に本明細書に含まれるものとする。
バイオインフォマティクスツールの潜在能力及び精度が高まっているために、前記ツールは通常の生化学的特徴付け技術と急速に置き換えられつつある。実際、本発明の同定に用いた高度なバイオインフォマティクスツールは、今や、高い信頼性をもった結果を出力する能力を有する。
配列データが利用可能になるにつれ、種々の研究機関及び企業組織がそれらを調査し、重要な発見が絶え間なく達成され続けている。しかしながら、研究及び薬剤発見のための標的として、更なる遺伝子及びそれらがコードするポリペプチドを同定し特徴付ける必要性は引き続き存在している。
個々のデータリソース由来のタンパク質及び核酸配列データを統合することの背後に存在する目的は、配列自体及び各配列に関連する情報について、可能な限り多くのデータを一つの統合リソースにまとめることである。コード化タンパク質の三次元構造に関するデータを含め、各配列に関する利用可能な全てのデータが、利用可能である場合、各配列についての既知情報を利用するために一緒に統合されることによって、前記配列の比較から最も知識に基づく予測を行うことが可能となる。データベースにおいて得られる、各配列エントリーに伴って生じる注釈付け(アノテーション)は、生物学的に関連性がある状況を配列情報に与える。
前記データリソースは、タンパク質機能を配列のみから精密に予測することを可能にしている。そのような予測は、通常の技術を用いるのであれば、同じ機能性ファミリーの他のタンパク質に対して高度な配列同一性(約20%〜30%より高い同一性)を示すタンパク質についてのみ可能である。機能が既知な他の近縁タンパク質に対して非常に低度の配列相同性を示すタンパク質については、精密な予測が不可能である。
細胞が細胞外タンパク質を作って分泌する能力は、多くの生物学的過程の中心となる。酵素、増殖因子、細胞外基質タンパク質及びシグナル分子は、全て細胞によって分泌されている。このような分泌は、分泌小胞と形質膜との融合を介している。全部ではないが、ほとんどの場合、タンパク質は、シグナルペプチドによって、小胞体に方向付けられて分泌小胞内へと移動させられる。シグナルペプチドは、細胞質から分泌小胞のような膜結合区画へのペプチド鎖輸送に影響を与えるシス作用性配列である。分泌小胞を標的とするポリペプチドは、細胞外基質へと分泌されるか、又は形質膜内に保持される。形質膜内に保持されているポリペプチドは、1又はそれより多くの膜貫通ドメインを有するであろう。細胞の機能において中心的な役割を果たしているシグナルペプチド含有タンパク質の例は、サイトカイン、ホルモン、細胞外基質タンパク質、接着分子、受容体、プロテアーゼ、成長因子及び分化因子である。
免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子は、多様な生理学的機能において役割を果たすことが示されており、そのような分子の大部分は、疾患過程において役割を果たし得る。前記分子の活性の変化は疾患表現型を変える手段であり、多くの疾患、特に炎症性疾患、腫瘍学及び心疾患において役割を果たし得ることから、新規な免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子の同定それ自体が高度に関連している。免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子は生物学的過程の範囲に関与しており、前記生物学的過程としては、次のようなものが挙げられる:胚発生(Martin-Bermudo, M.D. et al, Development. 2000 127(12):2607-15; Chen, L.M., et al., J Neurosci. 2000 20(10):3776-84; Zweegman, S., et al, Exp Hematol. 2000 28(4):401-10; Darribere, T., et al., Biol Cell. 2000 92(1):5-25)、組織完全性の維持(Eckes, B., et al., J Cell Sci. 2000 113(Pt 13):2455-2462; Buckwalter, J.A., et al., Instr Course Lect. 2000 49:481-9; Frenette, P.S., et al.,. J Exp Med. 2000 191(8):1413-22; Delmas, V., et al, Dev Biol. 1999 216(2):491-506; Humphries, M.J., et al., Trends Pharmacol Sci. 2000 21(1):29-32; Miosge, N., et al, Lab Invest. 1999 79(12):1591-9; Nagaoka T, et al. Am J Pathol 2000 Jul 157:1 237-47; Nwariaku FE, et al. J Trauma 1995 39(2): 285-8; Zhu X, et al. Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi 1999 15(1): 53-5)、白血球血管外遊走/炎症(Lim, L.H., et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 22(6):693-701; Johnston, B., et al., Microcirculation. 2000 7(2):109-18; Mertens, A.V., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23(10):868-73; Chcialowski, A., et al., Pol Merkuriusz Lek. 2000 7(43):13-7; Rojas, A.I., et al, Crit Rev Oral Biol Med. 1999 10(3):337-58; Marinova-Mutafchieva, L., et al., Arthritis Rheum. 2000 43(3):638-44; Vijayan, K.V., et al, J Clin Invest. 2000 105(6):793-802; Currie, A.J., et al,. J Immunol. 2000 164(7):3878-86; Rowin, M.E., et al., Inflammation. 2000 24(2):157-73; Johnston, B., et al., J Immunol. 2000 164(6):3337-44; Gerst, J.L., et al., J Neurosci Res. 2000 59(5):680-4; Kagawa, T.F., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97(5):2235-40; Hillan, K.J., et al., Liver. 1999 19(6):509-18; Panes, J., 1999 22(10):514-24; Arao, T., et al., J Clin Endocrinol Metab. 2000 85(1):382-9; Souza, H.S., et al., Gut. 1999 45(6):856-63; Grunstein, M.M., et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 278(6):L1154-63; Mertens, A.V., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23(10):868-73; Berends, C., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23(11):926-33; Fernvik, E., et al., Inflammation. 2000 24(1):73-87; Bocchino, V., et al., J Allergy Clin Immunol. 2000 105(1 Pt 1):65-70; Jones SC, et al, Gut 1995 36(5):724-30; Liu CM, et al, Ann Allergy Asthma Immunol 1998 81(2):176-80; McMurray RW Semin Arthritis Rheum 1996 25(4):215-33; Takahashi H, et al Eur J Immunol 1992 22(11): 2879-85; Carlos T, et al J Heart Lung Transplant 1992 11(6): 1103-8; Fabrega E, et al, Transplantation 2000 69(4): 569-73; Zohrens G, et al, Hepatology 1993 18(4): 798-802; Montefort S, et al. Am J Respir Crit Care Med 1994 149(5): 1149-52)、腫瘍形成(Orr, F.W., et al., Cancer. 2000 88(S12):2912-2918; Zeller, W., et al., J Hematother Stem Cell Res. 1999 8(5):539-46; Okada, T., et al., Clin Exp Metastasis. 1999 17(7):623-9; Mateo, V., et al., Nat Med. 1999 5(11):1277-84; Yamaguchi, K., et al., J Exp Clin Cancer Res. 2000 19(1):113-20; Maeshima, Y., et al., J Biol Chem. 2000 275(28):21340-8; Van Waes, C., et al., Int J Oncol. 2000 16(6):1189-95; Damiano, J.S., et al., Leuk Lymphoma. 2000 38(1-2):71-81; Seftor, R.E., et al., Cancer Metastasis Rev. 1999 18(3):359-75; Shaw, L.M., J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1999 4(4):367-76; Weyant, M.J., et al., Clin Cancer Res. 2000 6(3):949-56)、脈管形成(Koch AE, et al Nature 1995 376 (6540): 517-9; Wagener C & Ergun S. Exp Cell Res 2000 261(1): 19-24; Ergun S, et al. Mol Cell 2000 5(2): 311-20)、骨吸収(Hartman GD, & Duggan ME. Expert Opin Investig Drugs 2000 9(6): 1281-91; Tanaka Y, et al. J Bone Miner Res 1995 10(10): 1462-9; Lark MW, et al. J Pharmacol Exp Ther 1999 291(2): 612-7; Raynal C, et al. Endocrinology 1996 137(6):2347-54; Ilvesaro JM, et al. Exp Cell Res 1998 242(1): 75-83)、神経機能不全(Ossege LM, et al. Int Immunopharmacol 2001 1:1085-100; Bitsch A, et al, Stroke 1998 29:2129-35; Iadecola C & Alexander M. Curr Opin Neurol 2001 14:89-94; Becker K, et al Stroke 2001 32(1): 206-11; Relton JK, et al Stroke 2001 32(1): 199-205; Hamada Y, et al J Neurochem 1996 66:1525-31)、血栓形成(Wang, Y.G., et al., J Physiol (Lond). 2000 526(Pt 1):57-68; Matsuno, H., et al., Nippon Yakurigaku Zasshi. 2000 115(3):143-50; Eliceiri, B.P., et al., Cancer J Sci Am. 2000 6(Suppl 3):S245-9; von Beckerath, N., et al., Blood. 2000 95(11):3297-301; Topol, E.J., et al., Am Heart J. 2000 139(6):927-33; Kroll, H., et al., Thromb Haemost. 2000 83(3):392-6)、及び宿主細胞に対する細菌性病原体の侵入/付着(Dersch P, et al. EMBO J 1999 18(5): 1199-1213)。
1.インテグリンに対する対(counter)受容体を代表する免疫グロブリン接着分子であり、細胞内接着分子(ICAM)及び脈管細胞接着分子(VCAM)が含まれる。そのメンバーは、変動し得る数の球状免疫グロブリン様細胞外ドメインで構成されている。このファミリーの幾つかのメンバー、例えばPECAM-1(CD31)及びNCAMは、ホモタイプな接着を媒介する。このファミリーの幾つかのメンバー、例えばICAM-1及びVCAM-1は、インテグリンとの相互作用を介する接着を媒介する。
2.細胞表面増殖因子受容体。増殖因子は、細胞外に存在しており、生物学的効果を示す目的で、標的細胞の形質膜上に位置する特異的な高親和性受容体と相互作用する。種々の異なる増殖因子受容体の分子特徴は、それら受容体が規定されるファミリー(チロシンキナーゼ受容体、Gタンパク質結合7回膜貫通受容体、及びセリン/トレオニンキナーゼ受容体)に分類されることを明らかにした。チロシンキナーゼ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインによって、特徴付けられている。VEGFR、PDGFR、FGFR、CSF-1R及びc-KITも、細胞外部分に免疫グロブリンドメインを含んでいるチロシンキナーゼ増殖因子受容体の例である。増殖因子機能の調節不全は、数多くの様々な疾患表現型をもたらす。そのような疾患表現型としては、次のものが挙げられるが、これだけに限られない:腫瘍疾患(Bartucci M et al, (2001) Cancer Res. Sep 15;61(18):6747-54, Dias S et al., (2001) Proc Natl Acad Sci U S A. Sep 11;98(19):10857-62, Djavan B et al., (2001) World J Urol. 19(4):225-33)、炎症疾患(Fiocchi C. (2001) J Clin Invest. Aug;108(4):523-6, Hodge S et al., (2001) Respirology. Sep;6(3):205-211, Fenwick SA et al., (2001) J Anat. Sep;199(Pt 3):231-40)、神経疾患(Cooper JD et al., (2001) Proc Natl Acad Sci U S A 98(18):10439-44, Fahnestock M et al, (2001) Mol Cell Neurosci 18(2):210-20)、及び代謝性疾患(Vickers MH et al., (2001) Endocrinology. 142(9):3964-73)。
本発明の第一の観点の一態様では、以下のポリペプチドが提供される:
(i) 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16若しくはINSP052細胞外ドメインで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又はそれらのアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能的等価物。
“(i)のポリペプチドの活性”という表現によって、免疫グロブリンドメイン細胞表面認識分子の活性に言及する。“免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性”という表現によって、免疫グロブリンドメインを含有する細胞表面認識分子ファミリーの範囲内の保存的特徴として同定され得るアミノ酸配列又は構造的特徴を含むポリペプチドに言及する。
本明細書で用いられる“INSP052エクソンポリペプチド”という用語は、INSP052エクソン1ポリペプチド、INSP052エクソン2ポリペプチド、INSP052エクソン3ポリペプチド、INSP052エクソン4ポリペプチド、INSP052エクソン5ポリペプチド、INSP052エクソン6ポリペプチド、INSP052エクソン7ポリペプチド、INSP052ポリペプチド及びINSP052細胞外ドメインを含むポリペプチド、並びにこれらからなるポリペプチドを含む。
ある態様では、該態様のポリペプチドが、配列番号16で示されるアミノ酸配列からなるか、又はそのフラグメント若しくは機能的等価物である。別の態様では、ポリペプチドが、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12若しくは配列番号14又はそれらの変異体で示されるアミノ酸配列からなる。
(i) INSP052細胞外ドメインのアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる、ポリペプチド;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能的等価物。
INSP052細胞外ドメインは、1〜240番目のアミノ酸に対応する(実施例を参照)。INSP052細胞外ドメインについては、図7も参照されたい。
本発明の第一の観点の第二態様では、以下のポリペプチドが提供される:
(i) 配列番号18で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる、ポリペプチド;
(ii) (i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能的等価物。
“(i)のポリペプチドの活性”という表現によって、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子の活性に言及する。
好ましくは、本態様のポリペプチドが、配列番号18で示されるアミノ酸配列からなるか、又はそのフラグメント若しくは機能的等価物である。
配列番号18で示される配列を有するポリペプチドを、これ以降では“INSP055ポリペプチド”と呼ぶ。
好ましくは、前記精製核酸分子が、配列番号1(INSP052エクソン1ポリペプチドをコードしている)、配列番号3(INSP052エクソン2ポリペプチドをコードしている)、配列番号5(INSP052エクソン3ポリペプチドをコードしている)、配列番号7(INSP052エクソン4ポリペプチドをコードしている)、配列番号9(INSP052エクソン5ポリペプチドをコードしている)、配列番号11(INSP052エクソン6ポリペプチドをコードしている)、配列番号13(INSP052エクソン7ポリペプチドをコードしている)、配列番号15(INSP052ポリペプチドをコードしている)若しくは配列番号17(INSP055ポリペプチドをコードしている)で示される核酸配列を含む若しくはそれらの核酸配列からなるか、又は前記配列のいずれかの余剰的(redundant)等価物若しくはフラグメントである。
配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11及び配列番号13で示される配列を組合せて、配列番号15で示される配列が生じる。
本発明の第二の観点の一態様では、INSP052細胞外ドメインを含む又はそれからなるポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。好ましくは、核酸分子が、図7に示す核酸配列又は図7に示す核酸配列のコード部分を、含む又はそれらからなる。
第四の観点では、本発明は、本発明の第二又は第三の観点の核酸分子を含むベクター、例えば発現ベクターを提供する。
第五の観点では、本発明は、本発明の第四の観点のベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
第六の観点では、本発明は、本発明の第一の観点のポリペプチドに特異的に結合するリガンド、好ましくは本発明の第一の観点のポリペプチドの活性を阻害するリガンドを提供する。
“本発明のポリペプチドの活性”及び同様な表現によって、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子に特有な活性に言及する。
第七の観点では、本発明は、本発明の第一の観点のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させるか、又は本発明の第一の観点のポリペプチドの活性を調節するために有効な化合物を提供する。
本発明の第七の観点の化合物は、前記ポリペプチドの遺伝子発現又は活性のレベルを増加させ得るか(アゴニスト作用)、又は低下させ得る(アンタゴニスト作用)。
重要なことに、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドの機能を同定することによって、疾患の治療及び/又は診断に有効な化合物を同定し得るスクリーニング方法のデザインが可能となる。本発明の第六及び第七の観点のリガンド及び化合物は、前記方法を用いて同定され得る。これらの方法は、本発明の観点として含まれる。
本発明の第一の観点のポリペプチドを検出する好ましい方法は、以下の工程を含む:(a)本発明の第六の観点のリガンド(例えば抗体)と生物学的サンプルとを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適した条件下で接触させる工程;及び(b)前記複合体を検出する工程。
本発明の第九の観点によると、例えば短いプローブによる核酸ハイブリダイゼーション法、点変異分析、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、及び、抗体を用いて異常なタンパク質レベルを検出する方法といった種々の異なる方法が存在することは、当業者には明らかであろう。同様な方法を短期又は長期ベースで用いて、モニターされる疾患の治療を可能にすることができる。本発明はまた、前記疾患診断方法に有用なキットも提供する。
第十の観点では、本発明は、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子としての、本発明の第一の観点のポリペプチドの使用を提供する。細胞表面受容体におけるIgドメインの重要性は、Lokker NAらの論文“Functional importance of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor extracellular immunoglobulin-like domains. Identification of PDGF binding site and neutralizing monoclonal antibodies”(J Biol Chem 1997 Dec 26;272(52):33037-44)に記載されている。
本発明は、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性を有するタンパク質を発現させるための、本発明の第二又は第三の観点の核酸分子の使用も提供する。本発明は、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性をもたらす方法も提供し、前記方法は、本発明の第一の観点のポリペプチドを利用している。
第十一の観点では、本発明は、医薬として許容される担体と共に、本発明の第一の観点のポリペプチド、又は本発明の第二若しくは第三の観点の核酸分子、又は本発明の第四の観点のベクター、又は本発明の第五の観点の宿主細胞、又は本発明の第六の観点のリガンド、又は本発明の第七の観点の化合物を含む医薬組成物を提供する。
本発明の第一の観点のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現、又は本発明の第一の観点のポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現又は活性レベルと比較したとき罹患対象者で低下する疾患については、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物がアゴニストであるべきである。逆に、前記天然の遺伝子の発現、又は前記ポリペプチドの活性が、健常な対象者の発現又は活性レベルと比較したとき罹患対象者で上昇する疾患については、前記患者に投与される前記ポリペプチド、核酸分子、リガンド又は化合物がアンタゴニストであるべきである。前記アンタゴニストの例にはアンチセンス核酸分子、リボザイム及びリガンド(例えば抗体)が含まれる。
第十四の観点では、本発明は、本発明の第一の観点のポリペプチドを高レベルで、又は低レベルで発現させるために、又は全く発現させないように形質転換したトランスジェニック又は遺伝子ノックアウト非ヒト動物を提供する。前記トランスジェニック動物は、疾患の研究用モデルとして非常に有用であり、さらに前記疾患の治療又は診断に有効な化合物の同定を目的とするスクリーニング方法で用いることもできる。
本発明のポリペプチド及び核酸について求められる保護範囲は、天然の供給源に存在する核酸又はポリペプチドまで拡張されないことが、理解されるべきである。むしろ、本発明によってクレームされているポリペプチド及び核酸は、“単離されている”か又は“精製されている”ものとして認識され得る。本明細書中で用いられる“単離(されている)”及び“精製(されている)”という用語は、核酸又はポリペプチドと一緒に天然の供給源に存在している少なくとも1つの他の成分(例えば、核酸又はポリペプチド)から分離された核酸又はポリペプチドを指す。従って、例えば、組織抽出物に含まれるポリペプチドは、合成的又は組換え的に生成されたポリペプチドのように、“単離”又は“精製”ポリペプチドを構成し得る。ある態様では、核酸又はポリペプチドは、一緒に存在するものが溶媒、緩衝液、イオン又は核酸若しくはポリペプチドの溶液中に通常存在している他の成分といったもののみであることが見出される。
“単離(されている)”及び“精製(されている)”という用語は、ポリペプチド若しくは核酸が得られる方法、又は調製物の純度レベルを示さないことが注記されるべきである。従って、前記単離若しくは精製されている種が、組換え的に生成されてもよく、対象の細胞若しくは組織から直接的に単離されてもよく、又は決定された配列に基づいて合成的に生成されてもよい。
本明細書では、ヌクレオチド及びアミノ酸についての標準的な略語が用いられる。
本発明の実施では別に指示がなければ、分子生物学、微生物学、リコンビナントDNA技術及び免疫学の通常の技術が用いられるであろう。前記技術は当業者の技術範囲内である。
前記のような技術は、文献で完全に説明されている。特に適切な解説書の例には以下が含まれる:Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), 特にvolumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986)。
本発明のポリペプチドは成熟タンパク質の形態を有するものでもよく、またプレ-、プロ-又はプレプロ-タンパク質であってプレ-、プロ-又はプレプロ-部分の切断によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生じるタンパク質でもよい。そのようなポリペプチドでは、プレ-、プロ-又はプレプロ-配列がリーダー配列若しくは分泌配列であっても、又は成熟ポリペプチド配列の精製のために用いられる配列であってもよい。
本発明の第一の観点のポリペプチドは、融合タンパク質の一部分を形成することができる。例えば、1つ又は2つ以上の付加アミノ酸配列を含むことがしばしば有利である。前記付加アミノ酸配列は、分泌若しくはリーダー配列、プロ-配列、精製に役立つ配列、又は例えばリコンビナント形成の間により高いタンパク質安定性を付与する配列を含んでもよい。あるいは、又は前記に加えて、前記成熟ポリペプチドを別の化合物、例えば前記ポリペプチドの半減期を増加させるような化合物(例えばポリエチレングリコール)と融合させることができる。
改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ末端又はカルボキシ末端を含むポリペプチド内のいずれの場所に存在してもよい。実際、共有結合改変によるポリペプチドのアミノ末端若しくはカルボキシ末端又はその両端の閉塞(blockage)は、天然に存在するポリペプチド及び合成ポリペプチドで一般的であり、そのような改変は本発明のポリペプチドにも存在し得る。
本発明のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製することができる。そのようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド(例えば、細胞培養物から精製される)、組換え的に生成されたポリペプチド(融合タンパク質を含む)、合成的に生成されたポリペプチド、又は前記方法の組合せによって生成されたポリペプチドが含まれる。
本発明の第一の観点の機能的に等価なポリペプチドは、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドと相同なポリペプチドであり得る。本明細書で用いる用語として、2つのポリペプチドは、前記ポリペプチドの一方の配列が他方のポリペプチドの配列に対して充分に高い同一性又は類似性を有する場合、“相同である”と称される。“同一性”とは、アラインメントを施した配列のどの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で同一であることを示す。“類似性”は、アラインメントを施した配列のいずれの特定の場所においても、アミノ酸残基が前記配列間で類似の種類であることを示す。同一性及び類似性の度合いは、容易に計算できる(Computational Molecular Biology, A.M. Lesk ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing. Informatics and Genome Projects, D.W. Smith ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, A.M. Griffin and H.G. Griffin eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press, 1987;及びSequence Analysis Primer, M. Gribskov and J. Devereux eds., M. Stockton Press, New York, 1991)。
本発明の第一の観点の機能的に等価なポリペプチドはまた、構造的アラインメントの1つ又は2つ以上の技術を用いて同定されたポリペプチドであってもよい。例えば、バイオペンジウム検索データベースの作製に用いられる検索ツールの一角を構成するインファーマティカ=ゲノムスレッダー(Inpharmatica Genome Threader)(商標)技術を用いて(国際公開第01/69507号パンフレットとして公開されている同時係属PCT特許出願(PCT/GB01/01105)を参照されたい)、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドと比較して低い配列同一性しかもたないが、INSP052及びINSP055ポリペプチド配列と有意な構造的相同性を共有するという理由から免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子であると予測される、現在のところ機能が未知なポリペプチドを同定することができる。そのような方法は、本発明の第一の観点のポリペプチドを利用する。“有意な構造的相同性”とは、インファーマティカ=ゲノムスレッダー(商標)が、2つのタンパク質は少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上の確実性を有して構造的相同性を共有すると予測することを意味する。
本発明の第一の観点のポリペプチドはまた、INSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドのフラグメント並びにINSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドの機能的等価物のフラグメントを含むが、ただし、これらフラグメントが、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性を保持すること又はINSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドと共通の抗原決定基を有することを条件とする。
そのようなフラグメントは、“独立的存在(free-standing)”(すなわち、他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部でもなく、他のアミノ酸若しくはポリペプチドの一部に融合されているのでもない)であってもよく、又はより大きなポリペプチドに含まれて、前記ポリペプチドの一部分又は領域を形成してもよい。より大きなポリペプチドの内部に含まれている場合、本発明のフラグメントは、最も好ましくは連続するただ1つの領域を形成する。例えばある種の好ましい態様は、前記フラグメントのアミノ末端に融合したプレ−及び/又はプロ−ポリペプチド領域を有するフラグメント、及び/又は前記フラグメントのカルボキシ末端に融合した付加的領域を有するフラグメントに関する。しかしながら、いくつかのフラグメントがただ1つのより大きなポリペプチドの内部に含まれていてもよい。
本発明のポリペプチド又はその免疫原性フラグメント(少なくとも1つの抗原決定基を含む)を用いて、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体といった、前記ポリペプチドに免疫特異的なリガンドを作製することができる。そのような抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現しているクローンを単離若しくは同定するか、又はアフィニティークロマトグラフィーで本発明のポリペプチドを精製することができる。前記抗体はまた、当業者には明らかなように、他の用途のうち診断的又は治療的補助としても用いることができる。
“実質的に強い親和性”という表現によって、本発明のポリペプチドに対する親和性が、既知の免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子に対する親和性と比較して、測定可能に増加することを意味している。
好ましくは、本発明のポリペプチドに対する親和性が、既知の免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子に対する親和性よりも、少なくとも1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍強い。
本発明の第一の観点のポリペプチドに対するモノクローナル抗体もまた、当業者は容易に生成できる。ハイブリドーマ技術を用いてモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は、周知である(例えば以下を参照されたい:G. Kohler & C. Milstein, Nature 256:495−497(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., 77−96 “Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”, Alan R. Liss, Inc. (1985))。
また、非ヒト可変領域がヒト定常領域と結合又は融合されているキメラ抗体(例えば以下を参照されたい:Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3439(1987))も有用であり得る。
抗体は、例えばヒト化により、改変して個体での免疫原性を減少させることができる(例えば以下を参照されたい:Jones et al., Nature,321:522(1986); Verhoeyen et al., Science, 239:1534(1988); Kabat et al., J. Immunol., 147:1709(1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029(1989); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:34181(1991); Hodgson et al., Bio/Technology 9:421(1991))。本明細書で用いられる“ヒト化抗体”という用語は、非ヒトドナー抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメイン中のCDRアミノ酸及び選択した他のアミノ酸がヒト抗体の等価なアミノ酸に代えて置換されている抗体分子を指す。従って、ヒト化抗体はヒトの抗体とよく似ているが、ドナー抗体の結合能力を有する。
ファージディスプレー技術を用いて、本発明のポリペプチドに対する結合活性を有する抗体をコードしている遺伝子を、関連する抗体の保有についてスクリーニングされたヒト由来のリンパ球のPCR増幅V-遺伝子レパートリー、又は未感作ライブラリーのいずれかから選択することができる(J. McCafferty et al., (1990) Nature 348:552−554; J. Marks et al., (1992) Biotechnology 10:779−783)。前記抗体の親和性は、鎖のシャッフリングによって改善することもできる(T. Clackson et al., (1991) Nature 352:624−628)。
上記の技術によって作製された抗体は、ポリクローナルであれモノクローナルであれ、免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で試薬として用いることができるという点で、更なる有用性を有する。これらの用途では、これら抗体を、分析的に検出可能な試薬(例えば放射性同位元素、蛍光分子又は酵素)で標識することができる。
本発明の第二及び第三の観点の好ましい核酸分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14及び/又は配列番号16、又は配列番号18に記載のポリペプチド配列並びに機能的に等価なポリペプチドをコードするものである。これら核酸分子は、本明細書に記載した方法及び用途で用いることができる。本発明の核酸分子は、好ましくは本明細書で開示される配列に由来する少なくともn個の連続するヌクレオチドを含み、この場合、前記個々の配列に応じてnは10又はそれより大きい(例えば12、14、15、18、20、25、30、35、40又はそれより大きい)。
本発明の核酸分子は、RNA(例えばmRNA)、又はDNA(例えばcDNA、合成DNA又はゲノムDNAを含む)の形態であってもよい。そのような核酸分子は、クローニングによって、化学合成によって、又はそれらの組合せによって得ることができる。前記核酸分子は、固相ホスホルアミダイト化学合成のような技術を用いる化学合成によって、ゲノム又はcDNAライブラリーから、又は生物体からの分離によって調製することができる。RNA分子は、一般的にはDNA配列のin vitro又はin vivo転写によって作製され得る。
核酸分子は、二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖DNAは、コード鎖(センス鎖としても知られる)でも、非コード鎖(アンチセンス鎖とも称される)でもよい。
“核酸分子”という用語には、DNA及びRNAのアナログ(例えば改変骨格を含むもの)、並びにペプチド核酸(PNA)も含まれる。本明細書で用いられる“PNA”という用語は、アンチセンス分子又は抗遺伝子作用因子を指し、長さが少なくとも5ヌクレオチドであってアミノ酸残基のペプチド骨格に結合されたオリゴヌクレオチドを含む。前記ペプチド骨格は好ましくはリジンで終わり、前記末端リジンは当該組成物に可溶性を付与する。PNAは、PEG化(pegylated)されて細胞内での寿命が延長されてもよい{細胞内では、PNAは優先的に相補性一本鎖DNA及びRNAと結合して転写物の伸長を停止させる(P.E. Nielsen et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53−63)}。
このような変種の中では、特にヌクレオチドの置換、欠失又は挿入によって前述の核酸分子と異なる変種が挙げられる。置換、欠失又は挿入には、1つ又は2つ以上のヌクレオチドが関与し得る。変種は、コード領域又は非コード領域又はその両方において変化していてもよい。コード領域における変化は、保存的又は非保存的なアミノ酸置換、欠失又は挿入を生成し得る。
本発明の核酸分子はまた、多様な理由で、当技術分野で一般的に知られている方法を用いて操作されてもよく、前記方法としては、遺伝子産物(ポリペプチド)のクローニング、プロセッシング及び/又は発現の改変が挙げられる。ランダムフラグメント化によるDNAシャッフリング並びに遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのPCRリアッセンブリーは、ヌクレオチド配列の操作に用いられ得る技術に含まれる。部位特異的突然変異誘発を用いて、新規な制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドンの優先性の変化、スプライシング変種の生成、変異の導入などを行うことができる。
本発明の核酸分子には、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子と部分的に相補的であり、従ってそのコード核酸分子とハイブリダイズする(ハイブリダイゼーション)アンチセンス分子も含まれる。そのようなアンチセンス分子(例えばオリゴヌクレオチド)は、当業者にはよく知られるように、本発明のポリペプチドをコードする標的核酸を認識し、その標的核酸と特異的に結合してその転写を妨げるようにデザインすることができる(例えば以下の文献を参照されたい:J.S. Cohen, Trends in Pharm. Sci., 10:435(1989); J. Okano, Neurochem. 56:560(1991); J. O’ Connor, Neurochem. 56:560(1991); Lee et al., Nucleic Acids Res. 6:3073(1979); Cooney et al., Science 241:456(1988); Dervan et al., Science 251:1360(1991))。
完全に相補的な分子と標的分子とのハイブリダイゼーションの阻害は、当業者に知られるハイブリダイゼーションアッセイを用いて調べることができる(例えばSambrook et al.(上掲書)を参照されたい)。従って、実質的に相同な分子は、文献(G.M. Wahl and S.L. Berger, 1987, Methods Enzymol. 152:399−407; A.R. Kimmel, 1987, Methods Enzymol. 152:507−511)で教示されるように、完全に相同な分子と標的分子との結合を種々のストリンジェンシー条件下で競合させ阻害するであろう。
“ストリンジェンシー”とは、異なる分子の会合よりも非常に類似した分子の会合に適したハイブリダイゼーション反応の条件を指す。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、以下を含む溶液(50%のホルムアミド、5倍のSSC(150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5倍のデンハルト溶液、10%の硫酸デキストラン、及び20μg/mLの変性せん断サケ精子DNA)中で42℃にて一晩インキュベーションし、続いてフィルターを約65℃にて0.1倍のSSC中で洗滌すると定義される。低ストリンジェンシー条件は、35℃にて実施されるハイブリダイゼーション反応を含む(Sambrook et al.(上掲書)を参照されたい)。好ましくは、ハイブリダイゼーションに用いられる条件が高ストリンジェンシー条件である。
本発明はまた、以下の工程を含む、本発明の核酸分子を検出する方法を提供する:(a)二重鎖を形成するハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸プローブを生物学的サンプルと接触させる工程;及び(b)形成された前記の二重鎖を全て検出する工程。
これに関しては、当技術分野で既知の他の技術のうち、特に以下の技術を利用することができる。これらの技術は、例示として下記で考察される。DNAのシークエンシング及び解析の方法は周知であって、当技術分野では一般的に利用可能であり、本明細書で考察される本発明の態様の多くを実施するために実際に用いることができる。そのような方法では、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、シークエナーゼ(US Biochemical Corp., Cleaveland, OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、耐熱性T7ポリメラーゼ(Amersham, Chicago, IL)、又はポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼの組合せ(例えば市販(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)のELONGASE増幅システムで見出されるようなもの)のような酵素を利用することができる。好ましくは、シークエンシング過程は、例えばハミルトンマイクロラブ(Hamilton Micro Lab)2200(Hamilton, Reno, NV)、ペルティエサーマルサイクラー(Peltier Thermal Cycler)PTC200(MJ Research, Watertown, MA)、ABIカタリスト並びに373及び377DNAシークエンサー(Perkin Elmer)のような機器を用いて自動化することができる。
本発明のある態様では、染色体上の位置特定のために、本発明の核酸分子を用いることができる。この技術では、核酸分子は個々のヒト染色体上の特定の位置に対して特異的に標的化され、個々のヒト染色体上の特定の位置とハイブリダイズさせることができる。本発明の関連配列の染色体上へのマッピングは、遺伝子関連疾患に関する配列の相関性確認において重要な工程である。いったん染色体の正確な位置に配列がマッピングされたら、前記配列の染色体上の物理的な位置を遺伝子地図データと相関させることができる。そのようなデータは、例えば以下で見出すことができる:V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(ジョーンズホプキンス大学、ウェルチ医学図書館を通じてオンラインで利用可能である)。同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との関係を、次に連鎖解析(物理的に近接する遺伝子の同時遺伝(coinheritance))によって同定する。これにより、ポジショナルクローニング又は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報が提供される。いったん疾患又は症候群の位置が遺伝連鎖によって特定のゲノム領域で大まかに限局されたら、前記領域にマッピングされるいずれの配列も、更なる解析のための関連遺伝子又は調節遺伝子となることができる。前記核酸分子はまた、正常な個体、キャリア個体又は罹患個体間で転座、逆位などによる染色体位置上の相違を検出するために用いることができる。
遺伝子サイレンシングアプローチを実施して、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の内在性発現をダウンレギュレートすることもできる。RNA干渉(RNAi)(S.M. Elbashir et al. Nature 2001, 411, 494-498)は、使用可能な配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのための1つの方法である。短いdsRNAオリゴヌクレオチドをin vitroで合成して細胞内に導入する。これらdsRNAの配列特異的結合によって標的mRNAの分解が開始され、標的タンパク質の発現が減少又は阻害される。
上記に述べた遺伝子サイレンシングの有効性は、ポリペプチド発現の測定(例えばウェスタンブロッティングによる)、又はタックマン(TaqMan)に基づく方法を用いるRNAレベルの測定によって評価することができる。
本発明のポリペプチドは、宿主細胞内に含まれるベクター中の前記ポリペプチドをコードする核酸分子の発現によって、リコンビナント形態で調製することができる。前記のような発現方法は当業者によく知られており、多くは以下の文献でより詳細に記述されている:Sambrook et al.(上掲書)及びFernandez & Hoeffler(1998, eds. “Gene expression systems. Using nature for the art of expression”, Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto)。
適切な発現系の例には、例えば染色体系、エピソーム系及びウイルス由来系、例えば以下に由来するベクターが含まれる:細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、パポーバウイルス(例えばSV40)、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス及びレトロウイルス、又は上記の組合せ、例えばプラスミドとバクテリオファージの遺伝子エレメントに由来するもの(例えばコスミド及びファージミドを含む)。ヒト人工染色体(HAC)もまた、プラスミドに包含させ発現させるよりも大きいDNAフラグメントを搬送するのに用いることができる。
本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の宿主細胞への導入は、多くの標準的な実験室マニュアル(例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)及び上掲書(Sambrook et al.))に記載された方法によって達成できる。特に適切な方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン仲介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、陽イオン脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、擦過ローディング(scrape loading)、弾道導入又は感染が含まれる(以下を参照されたい:Sambrook et al.(1989)上掲書;Ausubel et al.(1991)上掲書;Spector, Goldman & Leinwald,(1998))。真核細胞では、発現系は、その系の要求に応じて一過性(例えば、エピソーム性)又は永続的(染色体組込み)であり得る。
コントロール配列の他に、宿主細胞の増殖に関連して前記ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましい場合がある。調節配列の例は、化学的又は物理的刺激(調節化合物の存在を含む)又は多様な温度若しくは代謝条件に応答して遺伝子の発現を増加させたり低下させたりする配列である。調節配列は、ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター並びに5’及び3’非翻訳領域である。これらは、宿主細胞タンパク質と相互作用して、転写及び翻訳を実行する。そのような調節配列は、その強度及び特異性を変化させることができる。利用されるベクター系及び宿主に依存して、多くの適切な転写及び翻訳エレメント(構成性及び誘発性プロモーターを含む)を用いることができる。例えば、細菌系でクローニングするときは、誘発性プロモーター、例えばBluescriptファージミド(Stratagene, La Jolla, CA)又はpSportl(商標)プラスミド(Gibco BRL)などのハイブリッドlacZプロモーターを用いることができる。バキュロウイルスポリヘドリン(polyhedrin)プロモーターは、昆虫細胞で用いることができる。植物細胞ゲノムに由来するプロモーター又はエンハンサー(例えば熱ショック、RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子)又は植物ウイルスに由来するプロモーター又はエンハンサー(例えばウイルスプロモーター又はリーダー配列)は、ベクターへクローニングすることができる。哺乳類細胞系では、哺乳類遺伝子由来又は哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。配列の多数コピーを含む細胞株の作製が必要な場合、SV40又はEBVをベースとするベクターが、適切な選択マーカーとともに用いられ得る。
コントロール配列及び他の調節配列は、ベクターへの挿入の前に核酸コード配列に連結させることができる。あるいは、コントロール配列及び適切な制限部位を既に含む発現ベクターへ、コード配列を直接クローニングすることができる。
リコンビナントポリペプチドの長期的かつ高収量の生成のためには、安定な発現が好ましい。例えば、対象のポリペプチドを安定に発現する細胞株は、ウイルスの複製起点及び/又は内因性発現エレメント並びに選択マーカー遺伝子を同じ又は別個のベクター上に含む発現ベクターを用いて形質転換させることができる。ベクターの導入に続き、選択培地に切り替える前に細胞を栄養(enriched)培地で1−2日間増殖させることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することで、選択マーカーの存在によって、導入された配列をうまく発現する細胞の増殖及び回収が可能になる。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞の種類に適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
バキュロウイルス系では、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系のための材料は、特にインビトロジェン(Invitrogen, San Diego, CA)からキットの形態で(“MaxBac”キット)商業的に入手可能である。そのような技術は一般的に当業者に知られており、文献には完全に記載されている(Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))。この系での使用に特に適切な宿主細胞には、昆虫細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)S2細胞及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf9細胞が含まれる。
当技術分野で公知である多くの植物細胞培養及び植物体(whole plant)遺伝子発現系が存在する。適切な植物細胞遺伝子発現系の例には、米国特許第5,693,506号、5,659,122号及び5,608,143号に記載されるものが含まれる。植物細胞培養における遺伝子発現の更なる例は、文献に記載されている(Zenk (1991) Phytochemistry 30:3861−3863)。
特に、プロトプラストを単離し、これを培養して完全な再生植物を形成することが可能な植物は全て利用することができ、それによって移入遺伝子を含む完全な植物が回収できる。特に、サトウキビ、サトウダイコン、綿花、果実及び他の樹木、マメ類及び野菜の主要な種の全てを含む(ただしこれらに限定されない)全ての植物は、培養細胞又は培養組織から再生させることができる。
真菌での発現に特に適切な宿主細胞の例には、酵母細胞(例えばS.セレビシエ(cerevisiae))及びアスペルギルス細胞が含まれる。
形質転換細胞株の回収に用いることができる多くの選択系は、当技術分野で公知である。そのような例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(M. Wigler et al.(1977) Cell 11:223−32)及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(I. Lowy et al.(1980) Cell 22:817−23)の遺伝子が挙げられ、これらはそれぞれtk−又はaprt±細胞で用いることができる。
さらにまた、抗代謝物質耐性、抗生物質耐性又は除草剤耐性を選択基準として用いてもよい。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)はメトトレキセートに対する耐性を付与し(M. Wigler et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567−70)、nptはアミノグリコシド系ネオマイシン及びG−418に対する耐性を付与し(F. Colbere−Garapin et al.(1981) J. Mol. Biol. 150:1−14)、さらにals又はpatはそれぞれクロロスルフロン(chlorsulfuron)及びホスフィノトリシン(phosphinotricin)アセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する。さらに別の選択可能な遺伝子が報告されており、それらの例は当業者には明白であろう。
あるいは、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記ポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られている多様な手法で同定することができる。前記手法には、DNA−DNA又はDNA−RNAハイブリダイゼーション及びタンパク質バイオアッセイ、例えば蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)又はイムノアッセイ技術(例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)及び放射性イムノアッセイ(RIA))が含まれ(ただしこれらに限定されない)、核酸又はタンパク質の検出及び/又は定量のためにメンブレン、溶液又はチップをベースとする技術が含まれる(例えば以下を参照されたい:R. Hampton et al.(1990) Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN;及びD.E. Maddox et al.(1983) J. Exp. Med. 158:1211−1216)。
検出を容易にするために用いられ得る適切なレポーター分子又は標識には、放射性核種、酵素及び蛍光、化学発光又は色素生産性物質、基質、コファクター、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。
ポリペプチドは、周知の方法によってリコンビナント細胞培養物から回収し精製することができる。前記周知の方法には、硫安又はエタノール沈澱、酸性抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸化セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーが含まれる。高性能液体クロマトグラフィーは、精製に特に有用である。単離及び精製の間にポリペプチドが変性した場合には、タンパク質のリフォールディングのためによく知られている技術を用いて活性な高次構造を再生することができる。
本発明のポリペプチドを用いて、種々の薬剤スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。そのような化合物は、本発明のポリペプチドの遺伝子発現レベル又は活性レベルを活性化させる(アゴニスト作用)か、又は阻害する(アンタゴニスト作用)ことができ、本発明のさらなる観点を形成し得る。好ましい化合物は、本発明の第一の観点のポリペプチドをコードする天然の遺伝子の発現を変化させることに有効であるか、又は本発明の第一の観点のポリペプチドの活性を調節することに有効である。
アゴニスト化合物又はアンタゴニスト化合物は、例えば細胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリー又は天然物混合物から単離することができる。これらのアゴニスト又はアンタゴニストは、天然の又は改変された、基質、リガンド、酵素、レセプター、構造的模倣物質若しくは機能的模倣物質であってもよい。前記のようなスクリーニング技術の適切な概論については、以下を参照されたい:Coligan et al.(1991) Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5。
このようなスクリーニング技術で用いられる本発明のポリペプチドは、溶液中で遊離していても、固相支持体に固定されていても、細胞表面に保持されていても、又は細胞内に位置していてもよい。一般に、このようなスクリーニングの方法は、前記のポリペプチドを発現している適切な細胞又は細胞膜を用いることを含み、前記細胞又は細胞膜をテスト化合物と接触させて、結合又は機能的応答の刺激若しくは阻害を観察する。続いて前記テスト化合物と接触させた細胞の機能的応答を、前記テスト化合物と接触させなかったコントロール細胞と比較する。このようなアッセイによって、前記ポリペプチドの活性化によって生じるシグナルをテスト化合物がもたらすか否かを、適切な検出系を用いて評価することができる。活性化の阻害剤は、一般的には既知のアゴニストの存在下でアッセイを行われ、テスト化合物の存在下でのアゴニストによる活性化の影響が観察される。
(a)本発明の第一の観点のポリペプチドをその表面に発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で被検化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、前記化合物とポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されており;さらに
(b)前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用によって生じるシグナルのレベルを測定することにより、前記化合物が前記ポリペプチドと結合しこれを活性化するか又は阻害するかを決定する工程。
本発明のポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するさらに好ましい方法は、以下の工程を含む:
(a)前記ポリペプチドをその表面に発現している細胞を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で被検化合物と接触させる工程であって、前記ポリペプチドは、前記化合物とポリペプチドとの結合に応答して検出可能なシグナルを提供することができる第二の成分と結合されており;さらに
(b)前記化合物と前記ポリペプチドとの相互作用によって生じるシグナルレベルを前記化合物が存在しないときのシグナルレベルと比較することにより、前記化合物が前記ポリペプチドと結合しこれを活性化するか又は抑制するかを決定する工程。
さらに好ましい態様では、上述の一般的な方法が、前記ポリペプチドに対する標識又は非標識リガンドの存在下でアゴニスト又はアンタゴニストの同定を行う工程をさらに含み得る。
本発明のポリペプチドをその表面に有する細胞とリガンドとの結合又は前記のポリペプチドを含む細胞膜とリガンドとの結合の抑制を、前記ポリペプチドとの結合を許容する条件下で候補化合物を存在させて決定する工程、及び前記ポリペプチドに結合したリガンドの量を決定する工程。リガンドの結合の減少をひき起こし得る化合物は、アゴニスト又はアンタゴニストであると考えられる。好ましくは、前記リガンドが標識されている。
より詳しくは、アンタゴニスト又はアゴニスト化合物をポリペプチドについてスクリーニングする方法は以下の工程を含む:
(a)本発明のポリペプチドをその表面に発現している全細胞又は本発明のポリペプチドを含む細胞膜と、標識リガンドとをインキュベートする工程;
(b)前記全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を測定する工程;
(c)工程(a)の標識リガンド及び前記全細胞又は細胞膜の混合物に候補化合物を添加し、前記混合物を平衡化させる工程;
(d)前記全細胞又は細胞膜と結合した標識リガンドの量を工程(c)の後で測定する工程;さらに
(e)工程(b)及び工程(d)で結合した標識リガンドの相違を比較する工程であって、それにより工程(d)結合の減少をひき起こす化合物はアゴニスト又はアンタゴニストであると考える前記工程。
当業者であれば、本発明のポリペプチドのモジュレーターを同定するためのアッセイを工夫し得るであろう。これに関連して、アンタゴニスト(この場合では、中和抗体)を同定するためのアッセイ例を報告しているLokker NAらの文献(J Biol Chem 1997 Dec 26;272(52):33037-44)が興味深い。
さらにまた本発明の範囲内に含まれるアッセイ方法は、過剰発現アッセイ又は除去(ablation)アッセイで本発明の遺伝子及びポリペプチドの使用を必要とするものである。前記のアッセイは、これら遺伝子/ポリペプチドの細胞内レベルの操作及びこの操作事象による前記被操作細胞の生理機能に対する影響の評価を含む。例えばそのような実験によって、特定の遺伝子/ポリペプチドが関与するシグナル伝達経路及び代謝経路の詳細が明らかにされ、本研究対象のポリペプチドが相互作用するポリペプチドのアイデンティティーに関する情報がもたらされ、さらに関連遺伝子及びタンパク質を調節する方法についての手がかりが提供される。
当技術分野で公知の標準的なレセプター結合技術により膜結合レセプター又は可溶性レセプターを同定するのに、本発明のポリペプチドが用いられ得る。前記標準的な技術は、例えばリガンド結合アッセイ及び架橋アッセイであり、そのようなアッセイでは、ポリペプチドが放射性同位体で標識されているか、化学的に改変されているか、又はその検出若しくは精製を容易にするペプチド配列と融合されており、推定上のレセプター供給源(例えば細胞の組成物、細胞膜、細胞上清、組織抽出物又は体液)とインキュベートされる。結合の有効性は、生物物理的技術、例えば表面プラズモン共鳴及び分光法を用いて測定することができる。結合アッセイは、レセプターの精製及びクローニングのために用いることができるが、ポリペプチドとそのレセプターとの結合に競合する前記ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定するためにも用いることができる。スクリーニングアッセイを実施する標準的方法は、当技術分野ではよく理解されている。
本発明は、上記アゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レセプター、基質及び酵素、並びに上記で述べる方法によって発見され、本発明のポリペプチドの活性又は抗原性を調節する他の化合物を含む。
本発明はまた、本発明のポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物を適切な医薬担体と組合せて含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、下記で詳細に説明するように、治療用若しくは診断用試薬として、ワクチンとして、又は他の免疫原性組成物として適切であり得る。
本明細書で用いられる専門用語にしたがえば、ポリペプチド、核酸、リガンド又は化合物{X}を含む組成物は、組成物中のX+Yの合計の少なくとも85質量%がXである場合に不純物(本明細書中ではY)を“実質的に含まない”。好ましくは、Xが組成物中のX+Yの合計の少なくとも約90質量%、より好ましくは少なくとも約95質量%、98質量%又は99質量%を構成する。
ヒト対象者に対する正確な有効量は、疾患状態の重篤度、対象者の全身の健康状態、対象者の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び投与回数、併用薬剤、反応感受性及び治療に対する許容性/応答性に依存するであろう。この量は、日常的検査により決定することができ、それは臨床医の判断の範囲内である。一般には、有効用量は、0.01mg/kgから50mg/kg、好ましくは0.05mg/kgから10mg/kgであろう。本組成物は、患者に個別に投与されてもよく、又は他の薬剤、医薬品又はホルモンと一緒に投与されてもよい。
医薬組成物に、医薬的に許容できる塩、例えば鉱酸塩(塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような);及び有機酸の塩(酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような)を用いることができる。医薬的に許容できる担体についての綿密な考察は以下のテキストで入手可能である:Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)。
治療用組成物中の医薬的に許容できる担体は、さらに液体、例えば水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールを含むことができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝物質などのような助剤が、前記組成物中に存在していてもよい。そのような担体は、患者が摂取できるように、前記医薬組成物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
本発明で用いられる医薬組成物は、多数の経路(経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜下腔内、心室内、経皮的アプリケーション(例えばWO98/20734を参照)、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸的手段が挙げられるが、ただしこれらに限定されない)によって投与できる。遺伝子銃又はハイポスプレーもまた、本発明の医薬組成物の投与に用いることができる。典型的には、本治療用組成物は、注射用物質(液体溶液又は懸濁剤のいずれか)として調製できる。注射に先立ち液体ビヒクルで溶液又は懸濁液とするのに適する固体を調製することもできる。
本組成物の直接的デリバリーは一般に、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内に注射することによって達成されるか、又は組織の間隙腔に送達されるであろう。前記組成物はまた、病巣に投与してもよい。投薬治療は、単回投与スケジュールでも複数回投与スケジュールでもよい。
本発明のポリペプチドの活性が特定の疾患状態において過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用可能である。あるアプローチは、医薬的に許容できる担体とともに上記のような阻害化合物(アンタゴニスト)を、前記ポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量で対象者に投与することを含む。前記ポリペプチドの機能の阻害は、例えばリガンド、基質、酵素、レセプターの結合を遮断することによって、又は第二のシグナルを阻害することによって成され、それによって異常な症状が緩和される。好ましくは、前記アンタゴニストが抗体である。最も好ましくは、そのような抗体が、先に記載するような免疫原性を最少にするキメラ抗体及び/又はヒト化抗体である。
また別のアプローチでは、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、内部で生成される又は別々に投与されるアンチセンス核酸分子(上述のような)の使用といった発現遮断技術を用いて、阻害することができる。遺伝子発現の改変は、ポリペプチドをコードする遺伝子の制御領域、5’領域又は調節領域(シグナル配列、プロモーター、エンハンサー及びイントロン)に対して相補的な配列又はアンチセンス分子(DNA、RNA又はPNA)をデザインすることによって達成できる。同様に、阻害は“三重らせん”塩基対方法論を用いて達成することができる。三重らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子又は調節分子の結合のために二重らせんが充分に開く能力を阻害することから有用である。三重らせんDNAを用いる近年の治療上の進歩は、文献に記載されている(J.E. Gee et al.(1994) In:B.E. Huber & B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY)。相補的配列又はアンチセンス分子をデザインし、リボソームに対する結合を妨げて転写を妨害することによってmRNAの翻訳を遮断することもできる。そのようなオリゴヌクレオチドは投与されてもよいし、またin vivoでの発現によりin situで生成させてもよい。
RNA分子は、細胞内安定性及び半減期を増加させるように改変されてもよい。可能な改変には、RNA分子の5’及び/又は3’末端へのフランキング配列の付加、又は分子の骨格内でホスホジエステル結合に代わるホスホロチオエート又は2’-O-メチルの使用が含まれるが、ただしこれらに限られない。この概念は、PNAの生成にも受け継がれ、内因性エンドヌクレアーゼによって同様に容易には認識されないイノシン、ケオシン(gueosine)及びブトシン(butosine)のような非慣用塩基、並びにアセチル-、メチル-、チオ-及び同様な改変形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの包含によってPNA分子の全てに広げられ得る。
遺伝子治療を用い、対象者の関連細胞によって本ポリペプチドの内因性産生を行わせることができる。遺伝子治療は、欠陥のある遺伝子を修正した治療用遺伝子と置き換えることによって、前記ポリペプチドの不適切な生成を永久的に治療することに用いられる。
本発明の遺伝子治療は、in vivo又はex vivoで実施することができる。ex vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離及び精製、治療用遺伝子の導入、及び遺伝的に改変した細胞を患者に戻して導入することを必要とする。対照的に、in vivo遺伝子治療は、患者の細胞の単離及び精製を必要としない。
本発明のポリペプチド又は核酸分子が疾患をひき起こす原因物質である場合には、本発明は、前記疾患をひき起こす原因物質に対する抗体を生成するワクチンとして用いることができる前記ポリペプチド又は核酸分子を提供する。
本発明のワクチンは、予防的(すなわち、感染を防ぐ)であっても治療的(すなわち、感染後の疾患を治療する)であってもよい。そのようなワクチンは、免疫性を付与する抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質又は核酸を、通常は上記で述べた医薬的に許容できる担体と組合せて含む。前記担体には、組成物を投与される個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体で誘発しない担体のいずれもが含まれる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤(“アジュバント”)として機能してもよい。さらにまた、前記抗原又は免疫原は、細菌の類毒素(例えばジフテリア、破傷風、コレラ、H.ピロリ菌(pyroli)由来の類毒素)及び他の病原体と結合されてもよい。
ポリペプチドは胃で分解されるので、ポリペプチドを含むワクチンは、好ましくは非経口的に(例えば皮下、筋肉内、静脈内又は皮内注射)投与される。非経口投与に適した製剤には、水性及び非水性の無菌注射溶液、並びに水性及び非水性の無菌懸濁剤が含まれる。前記無菌注射溶液は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤をレシピエントの血液に対して等張にする溶質を含んでいてもよく、前記無菌懸濁剤は、懸濁剤又は増粘剤を含んでもよい。
本発明のポリペプチドに結合する抗体の遺伝子デリバリーは、例えば国際特許出願WO98/55607に記載されているように行われてもよい。
ジェット式注射(jet injection)と呼ばれている技術(例えば、www.powderject.comを参照)が、ワクチン組成物の処方に有用であり得る。
ワクチン接種及びワクチンデリバリーシステムに適切な多数の方法が、国際特許出願WO 00/29428に記載されている。
診断のための核酸分子は、対象者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織生検又は剖検材料から入手できる。ゲノムDNAを直接検出に用いてもよいし、又はPCR、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)若しくは他の増幅技術を分析に先立って用いることによって、ゲノムDNAを酵素的に増幅してもよい(以下の文献を参照されたい:Saiki et al., Nature 324:163−166(1986); Bej et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26:301−334(1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35:117−126(1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8:291−294(1990))。
a)本発明の核酸分子と核酸プローブとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で、患者由来の組織サンプルを前記核酸プローブと接触させる工程;
b)工程a)で用いた条件と同じ条件下で、コントロールサンプルを前記プローブと接触させる工程;及び、
c)前記サンプル中のハイブリッド複合体の存在を検出する工程;
この場合、コントロールサンプル中のハイブリッド複合体レベルと異なるハイブリッド複合体レベルが患者サンプルで検出されることは、疾患を示唆する。
本発明のさらなる観点は、以下の工程を含む診断方法を含む:
a)疾患について検査される患者から、組織サンプルを入手する工程;
b)前記組織サンプルから、本発明の核酸分子を単離する工程;及び、
c)疾患に付随する前記核酸分子における変異の存在を検出することによって、患者を疾患について診断する工程。
正常な遺伝子型と比較すると、増幅産物におけるサイズの変化によって、欠失及び挿入が検出される。点変異は、増幅DNAを本発明の標識RNAとハイブリダイズさせるか、あるいは本発明の標識アンチセンスDNA配列とハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全にマッチした配列は、RNase消化によって、又は溶融温度における差異を評価することによって、ミスマッチを有する二重鎖と区別することができる。DNAをストリンジェントな条件下で前記DNAとハイブリダイズする核酸プローブと接触させてハイブリッド二本鎖分子を形成させること(前記ハイブリッド二本鎖は、疾患に付随する変異に対応するいずれかの部分で前記核酸プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分を有する)、及び、前記プローブ鎖のハイブリダイズしていない部分の有無を前記DNA鎖の対応部分における疾患付随変異の有無を示すものとして検出することによって、患者における変異の有無を検出することができる。
前記のような診断は特に出生前検査で有用であり、新生児検査でもなお有用である。
この方法の感受性は、PCRと併用したとき極めて増強される。さらに、点変異及び他の配列の変動(例えば多型性)は、例えば対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをただ1つのヌクレオチドが異なる配列のPCR増幅に用いることによって、上記のように検出することができる。
DNA配列の相違はまた、変性剤の存在下又は非存在下でのゲル内のDNAフラグメントの電気泳動移動度における変化によって、又は直接DNAシークエンシング(例えば、Myers et al., Science (1985) 230:1242)によっても検出することができる。特定の位置における配列の変化はまた、RNase及びS1保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって、又は化学切断法(Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-4401を参照)によっても明らかにすることができる。
すなわち、細胞内のDNA又はRNA配列は、それらを単離及び/又はメンブレン上に固定する必要なしに、変異について分析することができる。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)は、現在のところ最も一般的に用いられている方法で、FISHに関する多数の概論が存在する(例えば以下を参照されたい:Trachuck et al., Science, 250, 559-562(1990);及びTrask et al., Trends, Genet., 7, 149-154(1991))。
本発明の別の態様では、本発明の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、遺伝的変種、変異及び多型性の効率的スクリーニングを実施することができる。アレイ技術方法はよく知られていて一般的な応用性を有しており、遺伝子発現、遺伝連鎖及び遺伝的可変性を含む分子遺伝学における種々の疑問に取り組むのに用いることができる(例えば以下を参照されたい:M. Chee et al., Science (1996) , Vol 274, pp610-613)。
宿主に由来するサンプルで本発明のポリペプチドレベルを決定することに用いることができるアッセイ技術は当業者によく知られており、また上記でいくらか詳細に考察されている(ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析及びELISAアッセイを含む)。本発明のこの観点では、以下の工程を含む診断方法が提供される:(a)上記のようなリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適する条件下で、生物学的サンプルと接触させる工程;及び(b)前記複合体を検出する工程。
ELISA、RIA及びFACSのようなポリペプチドレベルを測定するためのプロトコルは、ポリペプチド発現の変化レベル又は異常レベルを診断するための基礎をさらに提供することができる。ポリペプチド発現の正常値又は標準値は、正常な哺乳類対象体(好ましくはヒト)から得られた体液又は細胞抽出物を、複合体形成に適した条件下で、前記ポリペプチドに対する抗体と混合することによって確立される。標準的な複合体形成量は、種々の方法、例えば分光測定方法によって定量することができる。
生検組織由来の、対象者、コントロール及び疾患サンプルで発現されているポリペプチドの量は、標準値と比較される。標準値と対象者の値との間の偏差は疾患診断のためのパラメータを確立する。診断アッセイを用いて、ポリペプチド発現の有無及び過剰を識別し、治療的処置の間のポリペプチドレベルの調節をモニターすることができる。そのようなアッセイはまた、動物実験、臨床試験又は個々の患者の治療モニタリングにおける特定の治療的処置方法の有効性を評価することに用いることができる。
(a)本発明の核酸分子;
(b)本発明のポリペプチド;又は
(c)本発明のリガンド。
本発明のある観点では、診断キットが、ストリンジェントな条件下で本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器;前記核酸分子を増幅させるために有用なプライマーを含む第二の容器;及び、疾患の診断を容易にするために前記プローブ及びプライマーの使用についての指示書を含み得る。前記キットは、ハイブリダイズしていないRNAを消化するための薬剤を保持している第三の容器をさらに含んでもよい。
本発明の別の観点では、診断キットが核酸分子のアレイを含んでもよく、前記核酸分子の少なくとも1つが本発明の核酸分子であってもよい。
本発明のポリペプチドを検出するために、診断キットは、本発明のポリペプチドと結合する1つ又は2つ以上の抗体;及び、前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応の検出に有用な試薬;を含み得る。
本発明の種々の観点及び態様は、特にINSP052ポリペプチド及びINSP055ポリペプチドに関連する実施例を介して、これからより詳細に説明されるであろう。
本発明の範囲を逸脱することなく細部の改変がなされ得ることは、理解されるであろう。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12及び配列番号14の組合せによって得られたポリペプチド配列、並びにINSP052に由来する連続する複数のエクソンの翻訳物を表している配列番号16は、ヒトゲノム配列に由来している。INSP055を表しているポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列である配列番号17及び配列番号18は、それぞれ、INSP052のマウスオーソログのポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列である。マウスオーソログの存在が、ヒト配列INSP052の遺伝子モデルを支持している。
配列番号16及び配列番号18によってそれぞれ表されているINSP052ポリペプチド配列及びINSP055ポリペプチド配列は、シグナルペプチド配列及び膜貫通ドメインを含むことが予測される。
配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12及び配列番号14の組合せによって得られたポリペプチド配列、並びにINSP052に由来する連続する複数のエクソンの翻訳物を表している配列番号16を、NCBI非重複的配列データベースに対するBLASTクエリーとして用いた。マッチングしたものの上位10番目までが図1に示されており、それらの全てが、免疫グロブリンドメイン含有タンパク質である。
図2は、最もマッチングした既知タンパク質である胆汁糖タンパク質H(マウス)の配列に対する、INSP052クエリー配列のアラインメントを示している。
NCBI非重複的配列データベースに対するBLASTクエリーとして、ポリペプチド配列INSP055を用いた。マッチングしたものの上位10番目までが、図3に示されている。図4は、最もマッチングした既知タンパク質である胆汁糖タンパク質B(マウス)の配列に対する、INSP055クエリー配列のアラインメントを示している。
ヒト及びマウスにおけるINSP052及びINSP055転写物を表している発現配列タグ(EST)は、次のcDNAライブラリーが起源である:脳(小脳、皮質、海馬、視床下部、延髄を含む);内耳;及び乳房。転写物は、乏突起膠腫、グリア芽細胞腫及び多発性硬化症病変部に由来するESTによっても表される。これらのことから、INSP052が上記組織からクローニングし得ること、またINSP052が上記組織の疾患と関連し得ることが示唆される。従って、本明細書に記載するポリペプチド、抗体及び他の部分(other moieties)は、上記組織の一つにおける疾患を治療することに有用性を有し得る。
INSP052完全長予測配列は、VEGF/PDGF受容体に関係し、免疫グロブリンスーパーファミリーに属している、416アミノ酸のI型膜タンパク質をコードしている。開始ATGコドンから始まってポリA鎖までの予測ヌクレオチド配列は、長さが2025ヌクレオチドである(図5)。コード配列(cds)は、7つのエクソンにわたる(図6)。推定上のシグナル配列(1〜33番目のアミノ酸をコードしている)は、エクソン1に位置している。予測膜貫通(TM)ドメイン(241〜263番目のアミノ酸)をコードしている配列は、エクソン3−4の境界に位置している。
1〜240番目のアミノ酸をコードしている細胞外(EC)ドメインを、エクソンアッセンブリーによって、ゲノムDNAからクローニングした。エクソンアッセンブリー法の概要を、以下にまとめる:
− PCRによって、ゲノムDNAから個別にエクソン1、2及び3を増幅した。エクソン3のリバースプライマーは、エクソン4の5’配列とオーバーラップする11塩基も含んでいた。
− ゲル精製したエクソンを混合して、第二のPCR反応を行い、リアッセンブリーされたDNAを増幅した。
− INSP052 ECドメインに対応する完全長PCR産物をゲル精製し、続いて、インビトロジェン・ゲートウェイ(Invitrogen Gateway)(商標)方法論を用いて、pDONR 201(ゲートウェイ・エントリーベクター)及びpEAK12d(発現ベクター)にサブクローニングした。
エクソン1、2及び3を個別に増幅するために、PCRプライマーを設計した(表2)。エクソン1のフォワードプライマー(INSP052-B1P-エクソン1F)は、ゲートウェイattB1部位の部分配列(5’GCAGGCTTC)及びコザック配列(5’GCCACC)も含んでいる。エクソン1のリバースプライマー(INSP052-エクソン1R)は、エクソン2とオーバーラップする18bpを、5’末端に有する。エクソン2のフォワードプライマー(INSP052-エクソン2F)は、エクソン1とオーバーラップする18bpを、5’末端に有する。エクソン2のリバースプライマー(INSP052-エクソン2R)は、エクソン3とオーバーラップする18bpを5’末端に有する。エクソン3のフォワードプライマー(INSP052-エクソン3F)は、エクソン2とオーバーラップする17bpを、5’末端に有する。エクソン3のリバースプライマー(INSP052-エクソン3R)は、エクソン4とオーバーラップする11bpを5’末端に有する。
INSP052エクソン1の増幅のために、最終容積50 μLでPCR反応を行った。前記50 μLのPCR反応液は、1.5 μLのヒトゲノムDNA(0.1 μg/μL、Novagen cat.no.69237)、2 μLの5 mM dNTPs(Amersham Pharmacia Biotech)、6 μLのINSP052-B1P-エクソン1F(10 μM)、6 μLのINSP052-エクソン1R、5 μLの10×Pwo緩衝液、及び0.5 μLのPwoポリメラーゼ(5 U/μL)(Roche, cat.no. 1644955)を含んでいた。PCR条件は、94℃にて2分間;94℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて1分間のサイクルを35回;72℃にて5分間の付加的な伸張サイクル;4℃の保持サイクルであった。反応産物を1.5%アガロースゲル(1×TAE)上に装荷し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen cat.no.28704)を用いて正しいサイズ(118 bp)のPCR産物をゲル精製し、50 μLの溶出緩衝液に溶出した。
エクソン2を、同一の反応条件を用いて、INSP052-エクソン2Fプライマー及びINSP052-エクソン2Rプライマーで増幅した。378 bpのPCR産物を、上述のようにゲル精製した。
エクソン3を、同一の反応条件を用いて、INSP052-エクソン3Fプライマー及びINSP052-エクソン3Rプライマーで増幅した。321 bpのPCR産物を、上述のようにゲル精製した。
5 μLのゲル精製した各エクソン、2 μLの5 mM dNTPs、6 μLのINSP052-B1P-エクソン1F(10 μM)、6 μLのINSP052-5HIS-R(10 μM)、5 μLの10×Pfu緩衝液、14.5 μLのH2O及び0.5 μLのPfuポリメラーゼ(3 U/μL;Promega cat. no. M774B)を含むPCR反応で、エクソン1、2及び3-4をリアッセンブリーした。反応条件は、次の通りであった:94℃にて4分間;94℃にて30秒間、48℃にて30秒間、70℃にて2分間のサイクルを10回;94℃にて30秒間、52℃にて30秒間、70℃にて2分間のサイクルを25回;70℃にて10分間の付加的な伸張工程;4℃にて保持サイクル。反応産物を、1.5%アガロースゲル(1×TAE)上で分析した。Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen cat.no.28704)を用いて正しいサイズ(750 bp)のPCR産物をゲル精製し、50 μLの溶出緩衝液(Qiagen)に溶出した。得られた産物(INSP052 EC ORF)は、5’末端でattB1部位及びコザック配列にフランキングされ、3’末端で5HISタグコード配列にフランキングされている、INSP052 ECドメインのORFを含む。
50 μLの最終容積中に2 μLのゲル精製INSP052 EC ORF、2μLの5 mM dNTPs(Amersham Pharmacia Biotech)、6 μLのGCP-フォワード(10 μM)、6 μLのGCP-リバース(10 μM)、 5 μLの10×Vent緩衝液及び0.5 μLのVent DNAポリメラーゼ(2 U/μL)(New England Biolabs, cat.no.M0254S)を含むPCR反応にて、完全長INSP052 ECドメイン配列の5’及び3’末端に、AttB1組換え部位及びattB2組換え部位を付加した。PCR条件は、次の通りであった:94℃にて2分間;94℃にて30秒間、55℃にて30秒間、72℃にて1分間のサイクルを30回;72℃にて3分間の付加的な伸張工程;4℃にて保持サイクル。反応産物を1.5%アガロースゲル(1×TAE)上で分析し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen cat.no.28704)を用いて正しいサイズ(808 bp)のPCR産物を、50 μLの溶出緩衝液(Qiagen)に溶出した。BPクロナーゼを用いて、精製PCR産物(ゲートウェイ改変INSP052 ECドメイン)を、次のようにpDONR201に導入した:5 μLのゲートウェイ改変INSP052 ECドメインを、1.5 μLのpDONR201(0.1 μg/μL)、2 μLのBP緩衝液及び1.5 μLのBPクロナーゼ酵素ミックス(Invitrogen)と共に室温にて1時間インキュベートした。プロテイナーゼK(2 μg)の添加によって反応を停止させ、さらに10分間、37℃にてインキュベートした。この反応物のアリコート(1 μL)を、バイオラッド・ジーンパルサー(Biorad Gene Pulser)を用いたエレクトロポーレーションによって、20 μLのE.coli DH10B細胞(H2Oで1/5に希釈したもの)にトランスフォームした。1 mLのSOC培地を添加することによって、エレクトロポーレーションした細胞を希釈し、37℃にて1時間インキュベートした。この形質転換体をLB-カナマイシンプレート上に蒔いて、37℃にて一晩インキュベートした。Qiaprep Turbo 9600 robotic system (Qiagen)を用いて、得られた1〜10のコロニーからプラスミド・ミニプレップDNAを単離し、製造元の指示に従ってビッグダイターミネーターシステム(BigDyeTerminator system)(Applied Biosystems cat.no.4390246)を用いて、pENTR-F1及びpENTR-R1シークエンシングプライマーと一緒にDNAシークエンシングを行った。Dye-EXカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアップ・プレート(Millipore cat.no.LSKS09624)を用いてシークエンシング反応物を精製して、Applied Biosystems 3700シークエンサーで解析した。
次に、INSP052 ECドメインの正しい配列を含むpDONR201クローンに由来するプラスミド溶出液(1.5 μL) (プラスミドID ♯ 13497)を、組換え反応に用いた。その反応液には、10 μLの最終容積中に1.5 LのpEAK12d(0.1 μg/μL)、2 μLのLR緩衝液及び1.5 μLのLRクロナーゼ(Invitrogen)も含む。この反応混合物を室温にて1時間インキュベートし、プロテイナーゼK(2 μg)の添加によって反応を停止させて、さらに10分間、37℃にてインキュベートした。この反応物のアリコート(1 μL)を用いて、上述のようにエレクトロポーレーションによって、E.coli DH10B細胞にトランスフォームした。1 mLのSOC培地を添加することによって、エレクトロポーレーションした細胞を希釈し、37℃にて1時間インキュベートした。LB-アンピシリンプレート上に形質転換体を蒔いて、37℃にて1時間インキュベートした。Qiaprep Turbo 9600 robotic system (Qiagen)を用いて、4つのコロニーからミニプレップDNAを調製し、50 μLの溶出緩衝液に溶出した。次に、2 μLの各ミニプレップに対し、2 μLの5 mM dNTPs、6 μLの10 μM pEAK12-F、6 μLの10 μM pEAK12-R、5 μLの10×アンプリタック(AmpliTaq)(商標)緩衝液及び0.5 μLのアンプリタック(商標)(Applied Biosystems cat.no. N808-0155)を含む50 μLの合計反応容積にて、PCRを行った。そのサイクリング条件は、次の通りであった:94℃にて2分間;94℃にて30秒間、55℃にて30秒間、72℃にて1分間のサイクルを30回;72℃にて3分間のサイクルを1回。このサンプルを、更なる分析の前に、4℃にて(保持サイクル)維持していた。
期待されるPCR産物サイズ(1074 bp)を与えるコロニーから、プラスミド・ミニプレップDNAを単離して、次にpEAK12-F及びpEAK12-Rシークエンシングプライマーと一緒にDNAシークエンシングを行った。
配列照合したクローンの500 mL培養物から、プラスミドpEAK12d-INSP052EC-6HIS(プラスミドID ♯ 13495)のCsClグラジエント精製マキシプレップDNAを調製して(Sambrook J. et al., in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)、滅菌水に1μg/μLの濃度で再懸濁して、−20℃にて保存した。
エプスタイン=バーウイルスの核抗原を発現しているヒト胚性腎293細胞(HEK293-EBNA, Invitrogen)を、Ex細胞VPRO無血清培地(シードストック、維持培地、JRH)に懸濁状態で維持した。トランスフェクションの16-20時間前(−1日目)に、細胞を2つのT225フラスコに播種した(2%FBS播種培地(JRH)を含むDMEM/F12(1:1)中に2x105細胞/mlの密度でフラスコ当たり50mL)。次の日(トランスフェクション0日目)、JetPEI(登録商標)試薬を用いてトランスフェクションを行った(プラスミドDNA2μL/μg、PolyPlus-トランスフェクション)。各フラスコについて、113μgのcDNA(プラスミド番号13495)を2.3μgのGFP(蛍光レポーター遺伝子)とコトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を2つの前記T225フラスコに加え、37℃(5% CO2)で6日間インキュベートした。より多くの材料を得る機会を増やすことを目的として、この手順をさらなる2つのフラスコで繰り返して、合計で200 mLを作製した。陽性トランスフェクションの確認は、1日目及び6日目に定量的蛍光試験によって実施した(Axiovert 10 Zeiss)。
6日目に(採集日)4つのフラスコから上清(200mL)をプールし、遠心分離して(4℃、400g)、固有の識別標を付したポットに入れた。
6Hisタグ付加タンパク質のQCのために(内部バイオプロセッシングQC)、アリコート(500μL)を保持した。
C末端6Hisタグを有する組換えタンパク質を含む200 mL培地サンプルを、冷緩衝液A(50 mMのNaH2PO4;600 mMのNaCl;8.7%(w/v)グルセロール;pH 7.5)を用いて、最終容積200 mLに希釈した。このサンプルを、0.22 μm滅菌フィルター(Milipore、500 mLフィルターユニット)を通して濾過し、250 mL滅菌四角培地瓶(Nalgene)中に入れて4℃にて維持した。
精製は、自動サンプル添加装置(Labomatic)に連結したVISIONワークステーション(Applied Biosystems)で4℃にて実施した。精製方法は、以下の2つの連続する工程を含んでいた:Niイオンで荷電されているPoros 20MC(Applied Biosystems)カラム(4.6x50mm、0.83mL)での金属アフィニティークロマトグラフィー、続いてセファデックスG-25中型(Amersham Pharmacia)カラム(1.0x10cm)でのゲルろ過。
最初のクロマトグラフィー工程のために、金属アフィニティーカラムを30カラム容積のEDTA溶液(100mMのEDTA;1MのNaCl;pH8.0)で再生させ、15カラム容積の100mM NiSO4溶液で洗浄してNiイオンを再荷電し、10カラム容積の緩衝液Aで洗浄し、続いて7カラム容積の緩衝液B(50mMのNaH2PO4;600mMのNaCl;8.7%(w/v)グリセロール;400mMのイミダゾール;pH7.5)で洗浄し、最後に15カラム容積の緩衝液A(15mMのイミダゾールを含む)で平衡化した。Labomaticサンプル添加装置でサンプルを200mLのサンプルループに移し、続いてNi金属アフィニティーカラムに流速10mL/分で装荷した。その後、前記カラムを12カラム容積の緩衝液Aで洗浄し、続いて28カラム容積の緩衝液A(20mMイミダゾールを含む)で洗浄した。20mMイミダゾール洗浄の間に、ゆるく付着していた混入タンパク質はカラムから溶出した。リコンビナントHisタグ付加タンパク質を、流速2mL/分、10カラム容積の緩衝液Bで最後に溶出させ、この溶出タンパク質を1.6mL画分で採集した。
クーマシー染色:NuPAGEゲルを0.1%のクーマシーブルーR250染色液(30%メタノール、10%酢酸)中で室温にて1時間染色し、続いてバックグラウンドが除かれてタンパク質のバンドが鮮明に見えるようになるまで、20%メタノール/7.5%酢酸中で脱染した。
ウェスタンブロット:電気泳動に続いて、タンパク質を4℃にて1時間、290mAでゲルからニトロセルロースメンブレンへ電気的に移した。前記メンブレンを、5%粉乳を含む緩衝液E(137mMのNaCl;2.7mMのKCl;1.5mMのKH2PO4;8mMのNa2HPO4;0.1%トゥイーン20(pH7.4))で室温にて1時間ブロッキングし、続いて2.5%粉乳を含む緩衝液E中で2つのウサギポリクローナル抗体混合物(G-18及びH-15、各々0.2μg/mL;Santa Cruz)とともに4℃で一晩インキュベートした。室温でさらに1時間インキュベートした後、前記メンブレンを緩衝液Eで洗滌し(10分、3回)、続いて2.5%粉乳を含む緩衝液Eで1/3000に希釈したHRP結合抗ウサギ二次抗体(DAKO、HRP0399)と室温で2時間インキュベートした。緩衝液Eで洗滌(10分、3回)した後、前記メンブレンをECLキット(Amersham Pharmacia)で1分処理した。続いて前記メンブレンをハイパーフィルム(Amersham Pharmacia)に露光し、前記フィルムを現像してウェスタンブロット画像を視覚的に分析した。
タンパク質アッセイ: BCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用い、ウシ血清アルブミンを標準物質として、タンパク質濃度を決定した。200 mLの培地から890 μgの精製タンパク質を回収した。
Claims (43)
- 以下の(i)〜(iii)のいずれかのポリペプチド:
(i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16若しくは図7に記載のINSP052細胞外ドメインで示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなるポリペプチド;
(ii)(i)のポリペプチドの活性を有するか、又は(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有する、(i)のフラグメント;又は
(iii)(i)又は(ii)の機能的等価物。 - 配列番号16で示されるアミノ酸配列を含むか、又は前記アミノ酸配列からなる、請求項1記載のポリペプチド。
- 配列番号16で示されるアミノ酸配列からなる、請求項2記載のポリペプチド。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16で示されるアミノ酸配列に相同的であって、免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子活性を有することを特徴とする、請求項1の(iii)記載の機能的等価物であるポリペプチド。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14若しくは配列番号16で示されるアミノ酸配列又はそれらの活性なフラグメントに対して84%以上の配列同一性、好ましくは85%、90%、95%、98%若しくは99%以上の配列同一性を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のフラグメント又は機能的等価物であるポリペプチド。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して有意な構造的相同性を示す、請求項1〜5のいずれか1項に記載の機能的等価物であるポリペプチド。
- 請求項1の(i)のポリペプチドと共通の抗原決定基を有し、配列番号16で示されるアミノ酸配列に由来する7又はそれ以上(例えば、8、10、12、14、16、20又はそれ以上)のアミノ酸残基からなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載のフラグメントであるポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードしている精製核酸分子。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13若しくは配列番号15で示される核酸配列を含むか、又はそれらの余剰的等価物又はフラグメントである、請求項8記載の精製核酸分子。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13若しくは配列番号15で示される核酸配列からなるか、又はそれらの余剰的等価物又はフラグメントである、請求項9記載の精製核酸分子。
- 高ストリンジェンシーの条件下で、請求項8〜10のいずれか1項に記載の核酸分子とハイブリダイズする、精製核酸分子。
- 請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項12記載のベクターで形質転換されている、宿主細胞。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドに特異的に結合し、好ましくは前記ポリペプチドの活性を阻害する、リガンド。
- 抗体である、請求項14記載のリガンド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドの発現レベル又は活性レベルを増加又は減少させる化合物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドに、前記ポリペプチドの生物学的作用のいずれをも誘導することなく結合する、請求項16記載の化合物。
- 天然であるか又は改変されている、基質、リガンド、酵素、受容体、構造的模倣物又は機能的模倣物である、請求項17記載の化合物。
- 疾患の治療又は診断に使用するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項12記載のベクター、請求項13記載の宿主細胞、請求項14若しくは15記載のリガンド、又は請求項16〜18のいずれか1項に記載の化合物。
- 患者由来の組織において、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする天然遺伝子の発現レベル、又は請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドの活性を評価すること;及び
前記発現又は活性のレベルをコントロールレベルと比較すること;
を含み、このとき前記コントロールレベルと異なるレベルは疾患を示唆している、患者の疾患を診断する方法。 - in vitroで実施される、請求項20記載の方法。
- (a)請求項14又は15記載のリガンドを、リガンド-ポリペプチド複合体の形成に適する条件下で、生物学的サンプルと接触させる工程;及び
(b)前記複合体を検出する工程;
を含む請求項20又は21記載の方法。 - (a)患者由来の組織サンプルと核酸プローブとを、請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子と前記プローブとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程;
(b)コントロールサンプルを、工程(a)で用いられるのと同じ条件下で前記プローブと接触させる工程;及び
(c)前記サンプルのハイブリッド複合体の存在を検出する工程;を含み、このときコントロールサンプルのハイブリッド複合体レベルと異なる患者サンプルのハイブリッド複合体レベルの検出が疾患を示唆している、請求項20又は21記載の方法。 - (a)患者の組織由来の核酸サンプルと核酸プライマーとを、請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子と前記プライマーとの間でハイブリッド複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で接触させる工程;
(b)コントロールサンプルを、工程(a)で用いられるのと同じ条件下で前記プライマーと接触させる工程;
(c)前記サンプルの核酸を増幅させる工程;及び、
(d)患者サンプル及びコントロールサンプルの両サンプルから、増幅核酸レベルを検出する工程;
を含み、このときコントロールサンプルの増幅核酸レベルと顕著に異なる患者サンプルの増幅核酸レベルの検出が疾患を示唆している、請求項20又は21記載の方法。 - (a)疾患について検査される患者から、組織サンプルを入手する工程;
(b)前記組織サンプルから、請求項8〜11のいずれか1項記載の核酸分子を単離する工程;及び、
(c)前記疾患に附随する変異の存在を、前記疾患の指標として前記核酸分子中で検出することによって、前記疾患について患者を診断する工程;
を含む請求項20又は21記載の方法。 - 核酸分子を増幅させて増幅産物を生成し、前記増幅産物で変異の有無を検出することをさらに含む、請求項25記載の方法。
- 該核酸分子を、その核酸分子にハイブリダイズする核酸プローブとストリンジェントな条件下で接触させて、疾患に附随する変異に対応する任意の部分に前記核酸プローブの非ハイブリダイズ部分を有するハイブリッド二本鎖分子を形成させること;及び
疾患に附随する変異の有無の指標として、前記プローブ鎖の非ハイブリダイズ部分の有無を検出すること;
によって、前記患者における変異の有無を検出する、請求項25又は26記載の方法。 - 疾患が、細胞増殖性疾患、自己免疫/炎症性疾患、心脈管系疾患、神経疾患、精神疾患、発育障害、遺伝子疾患、代謝性疾患、感染又は他の病的状態である、請求項20〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 免疫グロブリンドメイン含有細胞表面認識分子としての、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項12記載のベクター、請求項13記載の宿主細胞、請求項14若しくは15記載のリガンド、又は請求項16〜18のいずれか1項に記載の化合物を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド又は請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子を含む、ワクチン組成物。
- 細胞増殖性疾患、自己免疫/炎症性疾患、心脈管系疾患、神経疾患、精神疾患、発育障害、遺伝子疾患、代謝性疾患、感染及び他の病的状態からなる群より選択される疾患の治療用医薬品を製造することに使用するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項12記載のベクター、請求項13記載の宿主細胞、請求項14若しくは15記載のリガンド、請求項16〜18のいずれか1項に記載の化合物又は請求項30記載の医薬組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子、請求項12記載のベクター、請求項13記載の宿主細胞、請求項14若しくは15記載のリガンド、請求項16〜18のいずれか1項に記載の化合物又は請求項30記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の疾患を治療する方法。
- 疾患にかかっている患者における天然遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が健常な対象者における発現又は活性のレベルと比較した場合に低い疾患に対して、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアゴニストである、請求項33記載の方法。
- 疾患にかかっている患者における天然遺伝子の発現又はポリペプチドの活性が健常な対象者における発現又は活性のレベルと比較した場合に高い疾患に対して、前記患者に投与されるポリペプチド、核酸分子、ベクター、リガンド、化合物又は組成物がアンタゴニストである、請求項33記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドの発現若しくは活性のレベル、又は請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子の発現レベルを、ある期間にわたって前記患者由来の組織でモニターすることを含む、患者において疾患の治療をモニターする方法であって、
前記期間にわたる発現又は活性のレベルがコントロールレベルに対して変化することは、前記疾患の後退の指標である、前記方法。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチド又は請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子を、前記ポリペプチド又は核酸分子に対し結合親和性を有すると疑われる1つ又は2つ以上の化合物と接触させること;及び
前記核酸分子又はポリペプチドと特異的に結合する化合物を選択すること;
を含む、疾患の治療及び/又は診断で有効な化合物を同定する方法。 - 請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸プローブを含む第一の容器;前記核酸分子の増幅に有用なプライマーを含む第二の容器;及び疾患の診断を容易にするために前記プローブ及びプライマーを使用するための指示を含む、疾患の診断に有用なキット。
- ハイブリダイズしないRNAを消化するための薬剤を保有する第三の容器をさらに含む、請求項38のキット。
- 核酸分子のアレイを含むキットであって、前記核酸分子の少なくとも1つが請求項8〜11のいずれか1項に記載の核酸分子である前記キット。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドと結合する1つ又は2つ以上の抗体;及び
前記抗体と前記ポリペプチドとの間の結合反応を検出するのに有用な試薬;
を含むキット。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドを、より高いレベルで又はより低いレベルで発現するように又は発現しないように形質転換されている、非ヒトトランスジェニック動物又は非ヒトノックアウト動物。
- 請求項42記載の非ヒトトランスジェニック動物を候補化合物と接触させること、及び前記動物の疾患に対する前記化合物の作用を決定することによって、疾患の治療に有効な化合物をスクリーニングする方法。
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