JPH11500601A

JPH11500601A - Ｉｒｓ遺伝子のファミリー

Info

Publication number: JPH11500601A
Application number: JP8512162A
Authority: JP
Inventors: エフ．ホワイト，モリス; ジャンスン，シャオ; エイチ．ピアス，ジャカリン
Original assignee: US Department of Health and Human Services; Joslin Diabetes Center Inc
Current assignee: US Department of Health and Human Services; Joslin Diabetes Center Inc
Priority date: 1994-10-03
Filing date: 1995-10-03
Publication date: 1999-01-19
Also published as: CA2201474A1; WO1996010629A1; AU710856B2; EP0781326A1; US5858701A; EP0781326A4; AU3830195A

Abstract

(57)【要約】ＩＲＳ−２ポリペプチドをコードする配列を含む実質的に純粋な核酸、ＩＲＳ−２ポリペプチドの実質的に純粋な標品、及び関連する方法。

Description

【発明の詳細な説明】ＩＲＳ遺伝子のファミリー発明の背景この発明は、国立衛生研究所からの政府支援を伴ってなされたものである。従って、政府は、この発明に一定の権利を保持している。この発明は、幾つかの分子例えばインシュリンレセプター、ＩＬ−４レセプター及びＩＬ−１５レセプターに対する基質である蛋白質をコードするＩＲＳ遺伝子例えばＩＲＳ−２に関係する。発明の要約発明者は、ＩＲＳ−２、インシュリンレセプター基質−２を発見した。かれらは又、機能及び構造的特性を共有するＩＲＳ−２様遺伝子のファミリーの存在をも発見した。従って、この発明は、下記の特性の１つ以上を有するＩＲＳポリペプチドの精製標品又は組換えＩＲＳペプチドを特徴とする：（ｉ）ＩＲＳポリペプチドは、少なくとも１つのＩＲＳ共通チロシン含有リン酸化部位（ＩＲＳ−ＣＰＳ）を含む；（ii）ＩＲＳポリペプチドは、ＩＲＳ相同性ドメイン１（ＩＨ１）、ＩＲＳ相同性ドメイン２（ＩＨ２）及びＩＲＳ相同性ドメイン３（ＩＨ３）の群から選択する少なくとも１つのＩＲＳ相同性ドメイン（ＩＨ）を含む；（iii）ＩＲＳポリペプチドは、インシュリンレセプターと結合することができ且つインシュリンレセプターによりリン酸化され得る；（iv）ＩＲＳポリペプチドは、ＩＬ−４レセプター複合体と結合することができ且つＩＬ−４レセプター複合体によりリン酸化され得る；そして（ｖ）ＩＲＳポリペプチドは、ＩＬ−５レセプター複合体と結合することができ且つＩＬ−１５レセプター複合体によりリン酸化され得る；そして（vi）ＩＲＳポリペプチドは、ＳＨ２ドメイン含有蛋白質に結合することができる。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、ＩＲＳ−１以外のものである。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３ＩＲＳ−ＣＰＳを含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ１及び２を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ３を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ８を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ９を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ１０を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ１１を含み；少なくとも５又は１０ＩＲＳ−ＣＰＳを含む。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、更に、ＩＲＳ−ＣＰＳ以外のチロシン含有リン酸化部位即ち非共通部位を含む。非共通部位は、ＩＨドメイン例えばＩＨ１、ＩＨ２若しくはＩＨ３中に又は他の領域中に存在し得る。好適具体例において、１つ以上の非共通部位は、Ｃ末端領域にあるであろうし；ＩＲＳポリペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８又は９の非共通部位を含む。好適具体例において、ＩＲＳ−ＣＰＳのチロシンの各々の側の４アミノ酸の配列は、本質的に同じであり又は、図８に示した側の配列と１若しくは２残基だけ異なっている。他の具体例においては、この（これらの）チロシンの位置は、本質的に、図８に示したものと同じであるが、ＩＲＳ−ＣＰＳのチロシンの各々の側の４アミノ酸は、完全に又は殆ど異なっている。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、ＩＨ１を含み；ＩＨ２を含み；ＩＨ３を含み；ＩＨ１及びＩＨ３を含み；ＩＨ１及びＩＨ２を含み；ＩＨ２を含みＩＨ３を含み；ＩＨ１、ＩＨ２及びＩＨ３を含む。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、インシュリンレセプター；インターロイキン４レセプター；インターロイキン１３レセプター；インシュリン様成長因子レセプター；又はＩＬ−１５レセプターと結合する。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、ＳＨ２ドメイン含有蛋白質例えばＰＩ３’−キナーゼ、Ｇｒｂ−２、ＳＨ−ＰＴＰ−２、ｎｃｋ又はｃ−ｆｙｎと結合する。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約１６５〜１９０ｋｄの分子量を有する。他の面において、この発明は、ＩＲＳ−２ポリペプチド、好ましくはＩＲＳ− ２ポリペプチドの実質的に純粋な標品、又は組換えＩＲＳ−２ポリペプチドを特徴とする。好適具体例において、このポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、それは、インシュリンレセプターに特異的に結合し；それは、リガンド（例えば、インシュリン、ＩＧＦ−１又はＩＬ−４）刺激の後に、ＰＩ３’−キナーゼに（好ましくは、ＰＩ３’−キナーゼのＳＨ２領域に）結合し；それは、インシュリンレセプター又は他のチロシンキナーゼによりリン酸化され；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％又は９９％相同なアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは、SEQ ID NO:１のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；このポリペプチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００又は１５０アミノ酸長であり；このポリペプチドは、少なくとも５の、好ましくは少なくとも１０の、一層好ましくは少なくとも２０の、更に好ましくは少なくとも５０、１００、１５０、５００、７５０又は１，０００の、SEQ ID NO:１由来の連続するアミノ酸を含み；ＩＲＳ−２ポリペプチドは、天然のＩＲＳ−２の生物学的活性のアゴニスト又はアンタゴニストである（ｐ７０ｓｂｋアゴニスト）。好適具体例において、この発明には、生物学的活性を有するＩＲＳ−２ポリペプチド例えば、インシュリンレセプターに結合することのできるポリペプチド；リガンド（例えば、インシュリン、ＩＧＦ−１若しくはＩＬ−４）刺激後にＰＩ３’−キナーゼに（好ましくは、ＰＩ３’−キナーゼのＳＨ２領域に）結合することのできるポリペプチド；インシュリンレセプター若しくは他のチロシンキナーセによりリン酸化され得るポリペプチドが含まれる。好適具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１の配列と少なくとも１、２、３、５又は１０残基においてアミノ酸配列が異なる主題のＩＲＳ−２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を有するペプチドを含む。更に別の好適具体例は、第２のポリペプチド部分例えばSEQ ID NO:１の１つにより表される蛋白質に関連のないアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む組換え融合蛋白質である。この第２のポリペプチド部分は、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ポリメラーゼ活性化ドメインであってよい。好適具体例において、この融合蛋白質は、２−ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。更に別の好適具体例は、SEQ ID NO:１と相同なポリペプチドを含み、そのポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約１６５〜１９０キロダルトンの分子量例えば約１７０又は１８０ｋＤの分子量を有する。他の面において、この発明は、免疫原標品中にＩＲＳ−２ポリペプチドを含む免疫原を特徴とし、この免疫原は、ＩＲＳ−２ポリペプチドに特異的な免疫応答；体液性応答例えば抗体応答；又は細胞性応答を誘出することができる。好適具体例において、この免疫原は、抗原決定基例えばSEQ ID NO:１により表される蛋白質由来のユニークな決定基を含む。他の面において、この発明は、ＩＲＳ−２ポリペプチドと特異的に反応性の抗体標品例えばモノクローナル抗体標品を特徴とする。好適具体例において、この抗体は、ＩＲＳ−１と反応せず；この抗体は、ホスホチロシン残基以外のＩＲＳ −２上の部位に対して特異的である。他の面において、この発明は、下記の特徴の１つ以上を有するＩＲＳポリペプチドをコードする実質的に純粋なＩＲＳ核酸を特徴とする：（ｉ）ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、少なくとも１つのＩＲＳ共通チロシン含有リン酸化部位（ＩＲＳ−ＣＰＳ）を含み；（ii）ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、ＩＲＳ相同性ドメイン１（ＩＨ１）、ＩＲＳ相同性ドメイン２（ＩＨ２）及びＩＲＳ相同性ドメイン３（ＩＨ３）の群から選択する少なくとも１つのＩＲＳ相同性ドメイン（ＩＨ）を含み；（iii）ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、インシュリンレセプターと結合することができ且つインシュリンレセプターによりリン酸化されることができ；そして（iv）ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、ＩＬ−４レセプター複合体と結合することができ且つＩＬ−４レセプターによりリン酸化されることができ；（ｖ）ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、ＩＬ−１５レセプター複合体と結合することができ且つＩＬ−１５レセプター複合体によりリン酸化されることができ；そして（vi）。ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、ＳＨ２ドメイン含有蛋白質に結合することができる。好適具体例において、ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、ＩＲＳ−１以外のものである。好適具体例において、ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２若しくは１３のＩＲＳ−ＣＰＳを含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ１及び２を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ３を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ８を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ９を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ１０を含み；ＩＲＳ−ＣＰＳ１１を含み；少なくとも５若しくは１０のＩＲＳ−ＣＰＳを含む。好適具体例において、ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、更に、ＩＲＳ− ＣＰＳ以外のチロシン含有リン酸化部位即ち非共通部位を含む。非共通部位は、ＩＨドメイン中に例えばＩＨ１、ＩＨ２若しくはＩＨ３中に、又は他の領域中に存在し得る。好適具体例においては、１つ以上の非共通部位がＣ末端領域にあるであろうし；ＩＲＳにコードされるボリペプチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８若しくは９の非共通部位を含む。好適具体例において、ＩＲＳ−ＣＰＳのチロシンの各々の側の４アミノ酸の配列は、本質的に同じであり又は、図８に示した部位の配列と１若しくは２残基だけ異なっている。他の具体例において、この（これらの）チロシンの位置は、本質的に図８と同じであるが、ＩＲＳ−ＣＰＳのチロシンの各々の側の４アミノ酸は、完全に又は殆ど異なっている。好適具体例において、ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、ＩＨ１；ＩＨ２；ＩＨ３；ＩＨ１及びＩＨ３；ＩＨ１及びＩＨ２；ＩＨ２及びＩＨ３；ＩＨ１、ＩＨ２及びＩＨ３を含む。好適具体例において、ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、インシュリンレセプター；インターロイキン４レセプター；インターロイキン１３レセプター；インシュリン様成長因子レセプター；又はＩＬ−１５レセプターと結合する。好適具体例において、ＩＲＳにコードされるポリペプチドは、ＳＨ２ドメイン含有蛋白質例えばＰＩ３’−キナーゼ、Ｇｒｂ−２、ＳＨ−ＰＴＰ−２、ｎｃｋ又はｃ−ｆｙｎと結合する。好適具体例において、ＩＲＳポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定して、約１６５〜１９０ｋｄの分子量を有する。他の面において、この発明は、ＩＲＳ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する実質的に純粋な核酸を特徴とする。好適具体例において、コードされるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、それは、インシュリンレセプターに特異的に結合し；それは、リガンド（例えば、インシュリン、ＩＧＦ−１又はＩＬ−４）刺激後にＰＩ３’−キナーゼに（好ましくは、ＰＩ３’− キナーゼのＳＨ２領域に）結合し；それは、インシュリンレセプター又は他のチロシンキナーゼによりリン酸化され；コードされるポリペプチドは、SEQ ID NO: １のアミノ酸配列と少なくとも４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％相同なアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、SE Q ID NO:１のアミノ酸配列と本質的に同じアミノ酸配列を有し；コードされるポリペプチドは、少なくとも５、１０、２０、５０、１００若しくは１５０アミノ酸長であり；コードされるポリペプチドは、少なくとも５の、好ましくは少なくとも１０の、一層好ましくは少なくとも２０の、一層好ましくは少なくとも５０、１００、１５０、５００、７５０若しくは１，０００のSEQ ID NO:１由来の連続したアミノ酸を含み；コードされるＩＲＳ−２ポリペプチドは、ＩＲＳ−２の生物学的活性のアゴニスト若しくはアンタゴニスト例えばＰＨ３’−キナーゼ、ｐ７０ｓｂｋアゴニストである。好適具体例において、コードされるポリペプチドは、生物学的活性を有し、例えば、コードされるポリペプチドは、インシュリンレセプターに結合することができ；ＩＬ−４レセプターに結合することができ；リガンド（例えば、インシュリン、ＩＧＦ−１若しくはＩＬ−４）刺激後にＰＩ３’−キナーゼに（好ましくは、ＰＩ３’−キナーゼのＳＨ２領域に）結合することができ；インシュリンレセプター若しくは他のチロシンキナーゼによりリン酸化され得る。好適具体例において、この発明は、SEQ ID NO:１お配列と１、２、３、５若しくは１０残基においてアミノ酸配列が異なる主題のＩＲＳ−２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を有するコードされるペプチドを含む。更に別の好適具体例において、コードされるポリペプチドは、第２のポリペプチド部分を含む組換え融合蛋白質であり、例えば、第２のポリペプチドは、SEQ ID NO:１の１つにより表される蛋白質に関連のないアミノ酸配列を有する。第２のポリペプチド部分は、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ＤＮＡ結合ドメイン、ポリメラーゼ活性化ドメインであってよい。好適具体例においては、この融合蛋白質は、２−ハイブリッドアッセイにおいて機能的である。他の好適具体例において、ＩＲＳ−２核酸は、転写調節配列好ましくはＩＲＳ −２調節配列以外の配列を含む。この転写調節配列は、転写プロモーター又は転写エンハンサー配列を含むことができる。好適具体例において、この配列は、ＩＲＳ−２遺伝子配列に操作可能に結合され、例えば、そのＩＲＳ−２遺伝子配列を発現ベクターとして用いるのに適したものにする。好適具体例において、核酸は、緊縮条件下で、SEQ ID NO:１の少なくとも１２の連続するヌクレオチドに対応する核酸プローブと；一層好ましくはSEQ ID NO: １の少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プローブと；一層好ましくはSEQ ID NO:１の少なくとも４０の連続するヌクレオチドに対応する核酸プローブとハイブリダイズする。他の面において、この発明は、ＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター；そのベクターでトランスフェクトされた宿主細胞；及びその細胞を例えば細胞培養培地にて培養すること及びその細胞又は細胞培養培地からＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドを単離することを含む、組換えＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドを生成する方法を含む。他の面において、この発明は、細胞標品を特徴とし、例えば、ＩＲＳトランスジーン（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２トランスジーンを有する細胞の標品を特徴とする。この細胞標品は、ヒト又は非ヒト細胞例えばゲッ歯類例えばマウス若しくはラットの細胞、ウサギ細胞又はブタ細胞よりなるものであってよい。好適具体例において、これらの細胞は、異質型のＩＲＳ−２遺伝子例えばトランスジーン例えばヒト由来の遺伝子（非ヒト細胞の場合）又は外因性若しくは内因性ＩＲＳ−２遺伝子を誤発現する遺伝子を含む（そして、好ましくは、発現する）。好適具体例において、これらの細胞は、ＩＲＳ−２以外のインシュリン応答性遺伝子例えばＩＲＳ−１の誤発現を生じる障害を含み；これらの細胞は、ＩＲＳ−２以外のインシュリン応答性遺伝子例えばＩＲＳ−１についてのトランスジーンを含み、好ましくは、そのトランスジーンは誤発現される。この発明の細胞は、インシュリン関連疾患例えばインシュリン耐性インシュリン関連疾患例えばII型糖尿病、免疫疾患、望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気、又はＩＲＳ−２、ＩＲＳ−１若しくはこれら両方の突然変異若しくは誤発現により特徴付けられる病気を研究するためのモデルとして働くことができる。ここで論じているように、かかる細胞は又、薬物スクリーニングにも用いることができる。他の面において、この発明は、ＩＲＳ（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）トランスジーン例えばＩＲＳ−２トランスジーンを有するトランスジェニック非ヒト動物例えばゲッ歯類例えばマウス若しくはラット、ウサギ又はブタを特徴とする。好適具体例において、この動物は、異質型のＩＲＳ−２遺伝子例えばヒトから誘導された遺伝子又は外因性若しくは内因性ＩＲＳ−２遺伝子を誤発現する遺伝子を含む（そして、好ましくは、発現する）。好適具体例において、この動物は、更に、ＩＲＳ−２以外のインシュリン応答性遺伝子例えばＩＲＳ−１の誤発現を生じる障害を含み；この動物は、更に、ＩＲＳ−２以外のインシュリン応答性遺伝子例えばＩＲＳ−１についてのトランスジーンを含み、好ましくは、そのトランスジーンは誤発現される。この発明のトランスジェニック動物は、インシュリン関連疾患例えばインシュリン耐性インシュリン関連疾患例えばII型糖尿病、免疫疾患、望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気、又はＩＲＳ− ２、ＩＲＳ−１若しくはこれら両方の突然変異若しくは誤発現により特徴付けられる他の病気を研究するためのモデルとして働くことができる。ここで論じているように、かかる動物は又、薬物スクリーニングにも用いることができる。他の面において、この発明は、例えば病気例えばインシュリン関連疾患例えばインシュリン耐性インシュリン関連疾患例えばII型糖尿病、免疫疾患、又は望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気のモデルとして有用な非ヒト動物を特徴とする。好適具体例において、この非ヒト動物は、突然変異した又は誤発現される遺伝子（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２遺伝子を有する。好適具体例において、この非ヒト動物は、哺乳動物例えばゲッ歯類例えばマウス若しくはラット、ウサギ又はブタである。好適具体例において、この突然変異した遺伝子は、大きい染色体再配置例えば欠失、重複、逆位若しくは転座を含み；点突然変異を含み；突然変異した若しくは誤発現される遺伝子は、ＩＲＳ−２遺伝子である。好適具体例において、この非ヒト動物は、更に、第２の変異した若しくは誤発現される遺伝子を含む。この第２の遺伝子は、インシュリン応答性遺伝子例えばＩＲＳ−１遺伝子であってよい。これらの第１、第２の遺伝子又はこれら両方は、トランスジーン例えばノックアウトであってよい。他の面において、この発明は、患者が病気例えばインシュリン関連疾患例えばインシュリン耐性インシュリン関連疾患例えばII型糖尿病、又は免疫疾患、又は望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気の危険にあるか否かを測定する方法を特徴とする。この患者は、哺乳動物例えばヒトであってよい。好適具体例において、この病気は、ＩＲＳ遺伝子（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２の構造又は代謝における異常により特徴付けられる。病気がＩＲＳ−２に関連する場合には、この方法は、哺乳動物におけるＩＲＳ−２代謝状況を評価することを含み、ＩＲＳ−２代謝の異常レベルはこの病気の診断である。好適具体例は、評価が、例えば試料中の例えば組織試料（組織試料は、ここで用いる場合、任意の適当な試料例えば古典的なインシュリン感受性組織例えば筋肉、脂肪若しくは肝組織を含む試料又は一層容易に入手できる組織例えば循環血液細胞若しくは繊維芽細胞を含む試料を意味する）中のＩＲＳ−２蛋白質を測定することを含むもの；評価が、例えば組織試料中の、ＩＲＳ−２のリン酸化のレベルを測定することを含むもの；評価が、ＩＲＳ−２のキナーゼ活性のレベルを測定することを含むもの；及び評価が、例えば組織試料中の、ＩＲＳ−２をコードするＲＮＡの量を測定することを含むものを含む。この方法が、ここでは、ＩＲＳ−２について記載されていても、このファミリーの他のメンバー（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）を用いることはできる。他の面において、この発明は、患者が、インシュリン関連疾患例えばインシュリン耐性インシュリン関連疾患例えばII型糖尿病、又は免疫疾患、又は望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気の危険にあるか否かを好ましくは出生前に測定する方法を特徴とする。患者は、哺乳動物例えばヒトであってよい。この方法は、ＩＲＳ遺伝子（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２遺伝子の構造を測定することを含み、異常な構造は、病気の危険を指示する。他の面において、この発明は、例えばインシュリン関連疾患又は免疫疾患又は望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気を治療するために用いられる治療の効果を評価する方法を特徴とする。この方法は、ＩＲＳ遺伝子（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）を誤発現する試験用細胞又は生物を用いる。誤発現される遺伝子がＩＲＳ−２である場合において、この方法は、治療を試験用細胞若しくは生物例えば培養細胞若しくは哺乳動物に施与すること及びその治療のＩＲＳ−２代謝状況に対する効果を評価することを含む。ＩＲＳ−２代謝状況に対する効果は、この治療の効果を示す。好適具体例において、インシュリン関連疾患は、インシュリン耐性疾患であり；ＩＲＳ−２代謝状況に対する効果は、ＩＲＳ −２リン酸化レベルの変化、ＩＲＳ−２結合活性のレベルの変化、ＩＲＳ−２ｍＲＮＡレベルの変化、ＩＲＳ−２蛋白質レベルの変化である。更に別の好適具体例においては、試験用細胞又は生物は、インシュリン応答性遺伝子例えばＩＲＳ −１、ＩＲＳ−２若しくはこれら両方を誤発現する。この方法が、ここでは、ＩＲＳ−２遺伝子について記載されていても、このファミリーの他のメンバー（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）を用いることはできる。幾つかの病気は、患者の遺伝子の不十分な発現により特徴付けられ、発現を増大させる治療の能力は、その治療の有用性を示す。他の面において、この発明は、例えばインシュリン関連疾患、又は免疫疾患、又は望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気を治療するために用いられる治療の効果を評価する方法を特徴とする。この方法は、ＩＲＳ遺伝子（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２を誤発現する試験用細胞又は生物例えば培養細胞又は哺乳動物を用意すること；治療をこの動物又は細胞に施与すること；その治療のインシュリン代謝状況に対する効果を評価することを含む。インシュリン代謝状況に対する効果は、治療の効果を示す。好適具体例において、インシュリン関連疾患は、インシュリン耐性疾患であり；インシュリン代謝状況に対する効果は、ＩＲＳ−２若しくはＩＲＳ−１リン酸化のレベルの変化、ＩＲＳ−２若しくはＩＲＳ−１結合活性レベルの変化、ＩＲＳ−２若しくはＩＲＳ−１ｍＲＮＡレベルの変化、ＩＲＳ−２若しくはＩＲＳ−１蛋白質レベルの変化又はインシュリンに対する任意の応答の変化である。更に別の好適具体例において、試験用細胞又は生物は、第２のインシュリン応答性遺伝子（ＩＲＳ−２以外のもの）例えばＩＲＳ−１を誤発現する。好適具体例においては、ＩＲＳ遺伝子の誤発現は、病気例えばインシュリン関連疾患を真似る。他の面において、この発明は、ＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドとＩＲＳ−２結合リガンド例えば天然のリガンド例えばインシュリンレセプターとの結合を調節する能力について、化合物を評価する方法を特徴とする。ＩＲＳ−２ポリペプチドの場合には、この方法は、（ｉ）ＩＲＳ−２ポリペプチド、ＩＲＳ−２結合リガンド例えば蛋白質と化合物とを合わせ；そして（ii）ＩＲＳ−２ポリペプチドとＩＲＳ結合リガンドとを含む複合体の形成を検出することを含む。この化合物の存在下での複合体の形成の（例えば、この化合物の不在時における形成と比較しての）調節は、ＩＲＳ−２ポリペプチドとＩＲＳ−２結合リガンドとの間の相互作用の調節を示す。他のＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）も又、この方法にて用いることができる。他の面において、この発明は、治療を評価するための２相法（例えば、最初にイン・ビトロの相を有し、次にイン・ビボの相を有する方法）を特徴とする。この方法を用いて、治療を、インシュリン代謝状況例えばＩＲＳ代謝状況を調節（例えば、阻止若しくは促進）する能力について評価し、又は試験化合物を治療剤としての使用について評価するために用いることができる。この方法は、（ｉ）試験化合物を、ＩＲＳ−１調節配列以外のＩＲＳ調節配列例えばＩＲＳ−２調節配列に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含む細胞又は無細胞系と接触させるイン・ビトロの相及び、そのレポーター遺伝子の発現の調節を検出すること並びに（ii）もし試験化合物が発現を調節するならば、その試験化合物を動物に投与してその化合物のインシュリン代謝状況例えばインシュリンに対する応答若しくはＩＲＳ−２発現に対するイン・ビボでの効果を評価することを含む。他の面において、この発明は、インシュリンの第１の効果、ＩＲＳ（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２により媒介される第１の効果を真似するが、インシュリンの第２の効果を真似しない治療の効果を評価する方法を特徴とする。ＩＲＳ−２の場合、この方法は、治療を試験用生物例えば培養若しくは哺乳動物にて成長した細胞に施与して、ＩＲＳ−２代謝状況例えばＩＲＳ− ２発現レベル、ＩＲＳ−２のキナーゼ活性、ＩＲＳ−２の細胞若しくは細胞内分布又はＩＲＳ−２リン酸化レベルに対するその治療の効果を評価することを含む。ＩＲＳ−２代謝状況に対する効果は、治療の効果を示す。他のＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）も又、この方法において用いることができる。他の面において、この発明は、ＹＭＸＭ含有部位（SEQ ID NO:２）以外の図８のチロシンリン酸化部位の１つのアミノ酸配列を含む基質をリン酸化するチロシンキナーゼの能力を変える治療の効果を評価する方法を特徴とする。この方法は、その治療を試験用生物例えば培養細胞若しくは哺乳動物に施与して、ＹＭＸＭ含有部位（SEQ ID NO:２）以外の図８のチロシンリン酸化部位の１つのアミノ酸配列を含む基質例えば天然のチロシンキナーゼの基質若しくは合成の基質のリン酸化のレベルを測定することを含む。他の面において、この発明は、非野生型活性を有するＩＲＳ−２ポリペプチド例えば天然のＩＲＳ−２のアンタゴニスト、アゴニスト又はスーパーアゴニストを作成する方法を特徴とする。この方法は、ＩＲＳ−２ポリペプチドの配列を変えること例えば非共通リン酸化部位の配列を変えること及びその変えたポリペプチドを所望の活性について試験することを含む。他の面において、この発明は、非野生型活性を有するＩＲＳポリペプチド（例えば、ＩＲＳポリペプチド、好ましくはＩＲＳ−１以外のもの例えばＩＲＳ−２）例えば天然のＩＲＳのアンタゴニスト、アゴニスト又はスーパーアゴニストを作成する方法を特徴とする。この方法は、ポリペプチドのＩＲＳ−ＣＰＳの１つ以上の配列を変えること又はＩＨ１、ＩＨ２若しくはＩＨ３の配列を変えること及びその変えたポリペプチドを所望の活性について試験することを含む。他の面において、この発明は、天然のＩＲＳ−２の生物学的活性を有するＩＲＳ−２ポリペプチドの断片又はアナログを作成する方法を特徴とする。この方法は、ＩＲＳ−２ポリペプチドの配列を変えること例えば非共通リン酸化部位の配列を変えること及びその変えたポリペプチドを所望の活性について試験することを含む。他の面において、この発明は、天然のＩＲＳの生物学的活性を有するＩＲＳポリペプチド（例えば、ＩＲＳポリペプチド、好ましくはＩＲＳ−１以外のもの、例えばＩＲＳ−２）の断片又はアナログを作成する方法を特徴とする。この方法は、ＩＲＳポリペプチドのＩＲＳ−ＣＰＳの１つ以上の配列を変えること又はＩＨ１、ＩＨ２若しくはＩＨ３の１つ以上の配列を変えること及びその変えたポリペプチドを所望の活性について試験することを含む。他の面において、この発明は、化合物を、ＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドに結合する能力について評価する方法を特徴とする。この方法は、その化合物をこのポリペプチドと接触させて、そのポリペプチドと複合体を形成するその化合物の能力を評価することを含む。他の面において、この発明は、化合物を、ＩＲＳ調節配列（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２調節配列をコードする核酸と結合する能力について評価する方法を特徴とする。この方法は、その化合物をこの核酸と接触させて、その核酸と複合体を形成するその化合物の能力を評価することを含む。他の面において、この発明は、病気例えば免疫系疾患、望ましくない細胞増殖により特徴付けられる病気、又はインシュリン関連疾患例えばＩＲＳ代謝例えばＩＲＳ−２若しくはＩＲＳ−１代謝の異常により特徴付けられる病気の危険にある哺乳動物例えばヒトを治療する方法を特徴とする。この方法は、その動物に、治療例えば治療上有効な量の、インシュリン代謝状況を変えるＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２を施与することを含む。好適具体例において、この疾患は、ＩＲＳ−２若しくはＩＲＳ−１のリン酸化によるインシュリンレセプターのインシュリンに対する応答の不能により特徴付けられる。他の好適具体例において、この治療は、例えばキナーゼの活性を増し又はホスファターゼの活性を減じることによりＩＲＳ−２のリン酸化を増す。他の好適具体例において、この治療は、例えばキナーゼの活性を減じ又はホスファターゼの活性を増すことによりＩＲＳ−２のリン酸化を減じる。他の面において、この発明は、病気例えばチロシンキナーゼにより引き起こされる病気の危険にある哺乳動物例えばヒトを治療する方法を特徴とする。この方法は、その哺乳動物に、治療例えば、内因性ＩＲＳ−２の能力を改変する治療上有効な量のＩＲＳ−２ポリペプチドを施与してチロシンキナーゼのリン酸化を変え、それにより、チロシンキナーゼの活性を変えることを含む。好適具体例において、チロシンキナーゼは、オンコジーンの産物である。他の面において、この発明は、病気例えば異常な細胞増殖により特徴付けられる病気の危険にある哺乳動物例えばヒトを治療する方法を特徴とする。ここで用いる場合、異常な細胞増殖は、新生物疾患及び非新生物疾患の両方を含み、それ故に、癌及びアテローム性動脈硬化症等の病気を含む。この方法は、その哺乳動物に、治療例えば、インシュリン代謝状況例えばＩＲＳ−２代謝状況を変えるＩＲＳ−１ポリペプチド以外のＩＲＳポリペプチドの治療上有効な量を施与することを含む。好適具体例において、インシュリン代謝状況は、ＩＲＳ−２リン酸化である。他の好適具体例において、インシュリン代謝状況は、ＩＲＳ−２のキナーゼ活性のレベルである。他の面において、この発明は、病気例えばチロシンキナーゼの基質のリン酸化により特徴付けられる病気の危険にある哺乳動物例えばヒトを治療する方法を特徴とし、この基質は、ＹＭＸＭ含有部位（SEQ ID NO:２）以外の図８のチロシンリン酸化部位の１つのアミノ酸配列を含む。チロシンキナーゼは、例えばレセプターチロシンキナーゼ例えばインシュリンレセプター、上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプター、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）レセプター若しくはインシュリン様成長因子（ＩＬＧ）レセプター、又はオンコジーン産物例えばｓｒｃ、ａｂｌ若しくはｆｍｓ遺伝子産物であってよい。この方法は、治療例えば治療上有効な量の、ＹＭＸＭ含有部位（SEQ ID NO:２）以外の図８のチロシンリン酸化部位の１つのアミノ酸配列を含む治療例えばＩＲＳ−２ポリペプチドを施与することを含む。好適具体例において、この治療は、天然の基質のリン酸化を、その天然の基質の競争又は非競争阻害によってブロックする。免疫系疾患は、望ましくない免疫応答により又は正常の免疫応答の不在若しくは減少により特徴付けられる病気である。ここで用いる場合、インシュリン関連疾患は、インシュリン代謝状況が混乱する病気若しくは状態又は、インシュリン作用が一因となっている疾患である。ここで用いる場合、インシュリン耐性インシュリン関連疾患は、正常量のインシュリンが正常より低い生物学的応答を生じる任意の病気又は状態である。インシュリン耐性疾患の例には、II型糖尿病、肥満、加齢に関連したインシュリン耐性及び感染症、ホルモン以上又はその他の原因に次いで生じるインシュリン耐性が含まれる。ベクターは、ここで用いる場合、自律的に複製する核酸分子である。異質プロモーターは、ここで用いる場合、遺伝子又は精製核酸と自然には結合されていないプロモーターである。ＩＲＳポリペプチド（ＩＲＳ−１以外）の精製標品又は実質的に純粋な標品は、ここで用いる場合、天然において伴う他の蛋白質、脂質及び核酸から分離されたＩＲＳポリペプチドを意味する。好ましくは、ＩＲＳポリペプチドは又、それを精製するのに用いられる物質例えば抗体若しくはゲルマトリックス例えばポリアクリルアミドからも分離される。好ましくは、ＩＲＳポリペプチドは、精製標品の少なくとも１０乾重量％を構成する。好ましくは、この標品は、蛋白質配列決定を可能にするのに十分なＩＲＳポリペプチド；少なくとも１、１０若しくは１００μｇのＩＲＳポリペプチド；少なくとも１、１０若しくは１００ｍｇのＩＲＳポリペプチドを含む。ＩＲＳ−２の精製標品又は実質的に純粋な標品は、ここで用いる場合、天然において伴っている他の蛋白質、脂質及び核酸から分離されたＩＲＳ−２を意味する。好ましくは、ＩＲＳ−２は又、それを精製するのに用いられる物質例えば抗体若しくはゲルマトリックス例えばポリアクリルアミドからも分離される。好ましくは、ＩＲＳ−２は、精製標品の少なくとも１０乾重量％を構成する。好ましくは、この標品は、蛋白質配列決定を可能にするのに十分なＩＲＳ−２；少なくとも１、１０若しくは１００μｇのＩＲＳ−２ポリペプチド；少なくとも１、１０若しくは１００ｍｇのＩＲＳ−２ポリペプチドを含む。ＳＨ２ドメインは、ここで用いる場合、Ｆｐｓ、ｓｔｃ、Ａｂ１、ＧＡＰ、ＰＬＣλ、ｖ−Ｃｒｋ、Ｎｃｋ、ｐ８５及びＶａｖを含む多くのシグナル変換蛋白質中に見出される約１００アミノ酸の保存された見掛け上非触媒的配列をいう。 Koch等、1991、Science 252:668 を参照されたい（本明細書中に、参考として援用する）。２７蛋白質のＳＨ２ドメインのアミノ酸配列は、Koch等、1991に与えられている。ＳＨ２ドメインは、ＳＨ２含有蛋白質と他の蛋白質との間の蛋白質 −蛋白質相互作用を、第２の蛋白質上の特異的部位の認識により媒介する。ＳＨ２／第２の蛋白質部位の相互作用は、通常、ＳＨ２接触蛋白質と第２の蛋白質の結合を生じる。ここで用いる場合、ＳＨ２ドメインは、天然のＳＨ２ドメインと少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、一層好ましくは、少なくとも９０％の配列相同性を有する任意の配列及び、結合をＹＦＩＮ（SEQ ID NO: ３）含有ペプチドに結合する能力として測定したときに、そのドメインの天然の変異物の結合活性の少なくとも５０％を示すＳＨ２ドメインの任意のアナログ若しくは断片をいう。細胞の精製標品は、植物若しくは動物細胞の場合には、細胞のイン・ビトロ調製物をいい、完全な無傷の植物若しくは動物ではない。培養細胞又は微生物細胞の場合には、それは、患者の細胞の少なくとも１０％の、一層好ましくは５０％の調製物からなる。異常な細胞増殖は、ここで用いる場合、新生物疾患及び非新生物疾患の両方を含み、それ故、癌及びアテローム性動脈硬化症等の病気を含む。突然変異は、ここで用いる場合、核酸における大きい又は微細な構造の変化を意味する。一般的な突然変異の例は、ヌクレオチドの欠失及び挿入である。この突然変異は、更に、ＩＲＳ−２の誤発現を生じるＩＲＳ−２をコードするＤＮＡの突然変異であってよい。治療は、ここで用いる場合、任意の治療例えば治療用薬剤又は物質例えば薬物の施与を含む。物質の代謝は、ここで用いる場合、その物質の発現、機能、作用又は調節の任意の状況を意味する。物質の代謝は、その物質の改変例えば共有結合又は非共有結合による改変を含む。物質の代謝は、その物質が他の物質中に誘導する改変例えば共有結合又は非共有結合による改変を含む。物質の代謝は又、その物質の分布の変化をも含む。物質の代謝は、その物質が他の物質の分布に誘導する変化を含む。実質的に純粋な核酸例えば実質的に純粋なＤＮＡは、その核酸が由来する生物の天然のゲノム中で直接隣接している両コード配列（即ち、５’末端のもの及び３’末端のもの）と直接隣接しないものの一方若しくは両方；又はその核酸が由来する生物中で伴って存在する核酸配列を実質的に含まない核酸である。この用語は、例えば、ベクター例えば自律的に複製するプラスミッド若しくはウイルス中に若しくは原核若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれた組換えＤＮＡ、又は他のＤＮＡ配列と独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲ若しくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。実質的に純粋なＤＮＡは又、更なるＩＲＳ−２配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡをも含む。相同は、２つのＩＲＳ−２分子間の又は２つの核酸分子間の配列類似性をいう。２つの比較される配列の両方にある１つの位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットにより占められる場合、例えば、もし、２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンにより占められるならば、それらの分子は、その位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、それら２つの配列に共有されるマッチング位置若しくは相同な位置の数を比較される位置の数で除して１００倍した関数である。例えば、２つの配列中の位置の１０の内の６がマッチし又は相同であるならば、これら２つの配列は、６０％相同である。例えば、ＤＮＡ配列ATTGCC及びTATGGCは、５０％相同性を共有する。一般に、２つの配列が最大の相同性を与えるように配置して比較を行なう。用語ペプチド、蛋白質及びポリペプチドは、ここでは、交換可能に用いる。用語「トランスジーン」は、ここで用いる場合、それが導入されるトランスジェニック動物若しくは細胞に対して部分的に若しくは完全に異質即ち外来であるか又はそれが導入されるトランスジェニック動物若しくは細胞の内因性遺伝子に対して相同であるが、それが挿入された細胞のゲノムを変えるような仕方で動物ゲノムに挿入されるようにデザインされ又は挿入される（例えば、それは、天然の遺伝子の位置と異なる位置に挿入され又はその挿入はノックアウトを生じる）核酸配列（例えば、１つ以上の造血ペプチドをコードするもの）を意味する。トランスジーンは、選択した核酸の最適の発現に必要であり得（すべて、選択した核酸に操作可能に結合される）、エンハンサー配列を含み得る１つ以上の転写制御配列及び任意の他の核酸例えばイントロンを含んでよい。用語「トランスジェニック細胞」は、ここで用いる場合、トランスジーンを含む細胞をいう。「トランスジェニック動物」は、ここで用いる場合、その動物の１つ以上の細胞が、好ましくは、本質的にすべての細胞がトランスジーンを含む任意の動物である。トランスジーンは、マイクロインジェクション若しくは組換えウイルスの感染による等の意図的遺伝子操作として、直接細胞に導入することができ、又はその細胞の前駆体に導入することにより間接的に導入することができる。この分子は、染色体内にインテグレートされ得るか又は染色体外で複製するＤＮＡであってよい。ポリペプチドは、次の特性の１、２、３個、好ましくはそれ以上を有するならば、ＩＲＳ−２生物学的活性を有する：（１．）そのペプチドは、インシュリンレセプターに結合することができる；（２．）そのペプチドは、ＩＬ−４レセプター複合体に結合することができる；（３．）そのペプチドは、ＩＬ−１５レセプター複合体に結合することができる；（４．）そのペプチドは、特異的なＩＲＳ抗体に結合することができる；（５．）そのペプチドは、リガンド刺激の後に、Ｇｒｂ−２、ＳＨ−ＰＴＰ−２、ｎｃｋ及びｃ−ｆｙｎのＳＨ２ドメインと結合することができる；（６．）そのペプチドは、リガンド刺激後に、ＰＩ３’− キナーゼと、好ましくは、ＰＩ３’−キナーゼのＳＨ２領域に結合することができ、；（７．）そのペプチドは、インシュリンレセプター若しくは他のチロシンキナーゼによりリン酸化され得る。ポリペプチドは、それが、上記の７つの特性の１つを有するポリペプチドのアンタゴニスト、アゴニスト若しくはスーパーアゴニストであるならば、生物学的活性を有する。誤発現は、ここで用いる場合、遺伝子発現の非野生型パターンをいう。それは、非野生型レベルの発現即ち過剰若しくは過少発現を含み；遺伝子が発現される時期若しくはステージに関して野生型と異なる発現パターン例えば予め決められた発生の期間若しくはステージにおける（野生型と比較して）増大した若しくは減少した発現パターンを含み；予め決められた細胞型若しくは組織型における（野生型と比較して）減少した発現によって野生型と異なる発現パターンを含み；ＩＲＳ−２のサイズ、アミノ酸配列、トランジション後修飾若しくは生物学的活性に関して野生型と異なる発現パターンを含み；遺伝子発現に対する環境刺激若しくは細胞外刺激の効果に関して野生型と異なる発現パターン例えば、刺激の強さの増大若しくは減少時における（野生型と比較して）増大した若しくは減少した発現パターンを含む。ＩＨ１は、ここで用いる場合、ＩＲＳ相同性ドメイン１（プレクストリン相同性ドメイン（ＰＨ）とも呼ぶ）をいう。このＩＨ１は、通常、天然のＩＲＳポリペプチドのＮ末端領域にある。典型的ＩＨ１、ＩＲＳ−２ＩＨ１は、ＩＲＳ−２（SEQ ID NO:１）の３０〜１４１残基に見出される。一般に、ＩＨ１配列は、約９０〜１２０アミノ酸長であり、一層好ましくは約１１２アミノ酸長であろう。他の典型的ＩＨ１は、ＩＲＳ−１のＩＨ１である（ＩＲＳ−１の１３〜１１３残基）。一般に、ＩＨ１配列は、SEQ ID NO:１の３０〜１４１残基と又はＩＲＳ− １のＩＨ１と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同性を有するであろう。ＩＨ２は、ここで用いる場合、ＩＲＳ相同性ドメイン２をいう。このＩＨ２は、通常、天然のＩＲＳポリペプチドのＮ末端領域内にある。典型的ＩＨ２、ＩＲＳ−２ＩＨ２は、SEQ ID NO:１の１９０〜３６６残基に見出される。一般に、ＩＨ２配列は、約１５０〜２００アミノ酸長であり、一層好ましくは、約１７５アミノ酸長であろう。他の典型的ＩＨ２は、ＩＲＳ−１の１５５〜３２８残基に見出されるＩＲＳ−１のＩＨ２である。一般に、ＩＨ２配列は、SEQ ID NO:１のＩＲＳ−２の１９０〜３６６残基と又はＩＲＳ−１の１５５〜３２８残基と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同性を有するであろう。ＩＨ３は、ここで用いる場合、ＩＲＳ相同性ドメイン３をいう。このＩＨ３は、通常、天然のＩＲＳポリペプチドのＮ末端領域内にある。典型的ＩＨ３、ＩＲＳ−２ＩＨ３は、SEQ ID NO:１の４８１〜５２７残基に見出される。一般に、ＩＨ３配列は、約２５〜７５アミノ酸長であり、一層好ましくは、約５０アミノ酸長であろう。他の典型的ＩＨ３は、ＩＲＳ−１の４０８〜４５２残基に見出されるＩＲＳ−１のＩＨ３である。一般に、ＩＨ３配列は、SEQ ID NO:１の４８１〜５２７残基と又はＩＲＳ−１の４０８〜４５２残基と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％相同性を有するであろう。ＩＲＳ蛋白質は、ＩＲＳ共通チロシン含有リン酸化部位（ＩＲＳ−ＣＰＳ）の配列を含む。ＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２は、下記の表１に詳述したようにＩＲＳＣＰＳを共有する。（注）ＣＰＳ配列については、図８を参照されたい。この発明の方法を用いて、ＩＲＳ遺伝子（ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２の構造及び代謝における異常により特徴付けられる疾患の存在を診断することができる。この疾患は、免疫疾患、インシュリン関連疾患、又は望ましくない細胞増殖により特徴付けられる疾患であってよい。この発明は、例えばインシュリンレセプター機能の測定、例えばインシュリン刺激された基質リン酸化の検出のために、代謝例えばインシュリン代謝の種々の状況の分析を可能にする。この発明は又、上に列記した疾患を治療し又は診断するのに用いられる薬剤を試験し及び開発するための有用な道具をも提供する。この発明の方法は又、種々の疾患例えばインシュリン関連疾患、インシュリン耐性疾患、異常な細胞増殖により特徴付けられる病気又はチロシンキナーゼによる基質のリン酸化と関連する病気の治療をも与える。この発明の他の特徴及び利点は、下記の好適具体例の説明及び請求の範囲から明らかとなろう。発明の詳細な説明図面を、最初に、簡単に説明する。図面：図１は、抗ＰＩ３’−キナーゼ抗体（抗ｐ８５）を用いたＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１の同時免疫沈降のゲルである。図２は、ＩＲＳ−２の大規模精製の生成物を示すゲルである。図３は、ＩＲＳ−２のクローニングからのクローン及び制限部位のマップである。図４は、ＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２ＤＮＡ配列のアラインメントである。四角形で囲んだ配列は、１００％同一性の領域を示す。図５は、ＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２のｃＤＮＡ配列間の類似性のグラフである。図６は、ＩＲＳ−２の翻訳される配列のマップである。図７は、ＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２アミノ酸配列のアラインメントである。四角形で囲んだ配列は、１００％同一性の領域を示す。図８は、演繹されたＩＲＳ−２アミノ酸配列のＩＲＳ−１のそれとの比較である。ＩＲＳ−２がＩＲＳ−１から区別されるという証拠ＩＲＳ−１と同様に、ＩＲＳ−２は、リガンド刺激後に、ＰＩ３’−キナーゼと強く結合する。これは、インシュリン、ＩＬ−４若しくはＩＧＦ−１で刺激した骨髄前駆体（ＦＤＣ）細胞由来のＰＩ３’−キナーゼ（ｐ８５α）の調節サブユニットの免疫沈降物において示される。ｐ８５α免疫沈降物は、αＰＹで検出されるＩＲＳ−２を含んだ（図１）。更に、ＩＲＳ−２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ＣＨＯ細胞から類似の方法により得られたＩＲＳ−１と一緒に移動する（図１、レーンｊ）。ＩＲＳ−２は、殆どのＩＲＳ−１抗体と反応せず、更にそのユニークな性質を支持する。ＩＲＳ−１のアミノ末端（αＮＴ）、カルボキシ末端（αＣＴ）又は中間領域（αＰｅｐ８０）に対して高められた抗体は、インシュリン刺激されたＦＤＣ−Ｐ２細胞由来のＩＲＳ−２を免疫沈降させない。更に、組換えＩＲＳ− １を注射したウサギから得られたあるポリクローナル抗体（αＩＲＳ−１−＃１）は、ＩＲＳ−２と反応しなかったが、別のもの（αＩＲＡ−１−＃２）はＩＲＳ−２と反応する。これらの結果は、ＩＲＳ−２がＩＲＳ−１と部分的に関連する別個の蛋白質であるという免疫学的証拠を提供する。いわゆるプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを構成するＩＲＳ−１中の最初の１３０アミノ酸に対する抗体を調製した（ＰＨドメインは、蛋白質−蛋白質相互作用に対して重要であり得る）。このＰＨドメイン抗体は、ＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１と反応し、これは、これら２つの蛋白質においてこの領域が保存されているであろうことを示唆している。ＩＲＳ−１がすべてのＩＲＳ−１抗体と反応することができないように骨髄性細胞にて修飾されるということは、ＦＤＣ−Ｐ１細胞で発現されるＩＲＳ−１が αＩＲＳ−１と容易に反応するので、事実ではないことが示された。これを示す鋭敏な方法は、αＩＲＳ−１免疫沈降物についてＰＩ３’−キナーゼアッセイを行なうことである。抗ホスホチロシン（αＰＹ）は、ＩＬ−４刺激後のＦＤＣ− Ｐ１細胞由来のＰＩ３’−キナーゼ活性を免疫沈降するが、αＩＲＳ−１−＃１抗体は、免疫沈降しない。しかしながら、ＦＤＣ−Ｐ１細胞中でのＩＲＳ−１の発現後に、αＰＹで免疫沈降されるＰＩ３’−キナーゼの量は、増大し、ＰＩ３ ’−キナーゼは又、αＩＲＡ−１−＃１免疫沈降物中にも見出された。従って、骨髄性細胞中のαＩＲＳ−１は、αＩＲＳ−１と反応することができるが、ＩＲＳ−２は、反応しない。これは、ＩＲＳ−２が別個の基質であるという証拠である。ＩＲＳ−１遺伝子は、ＩＲＳ−２含有ＦＤＣ−Ｐ２細胞中には存在しないＩＲＳ−１はＦＤＣ−Ｐ２細胞には存在しないので、この源からＩＲＳ−２を精製することは可能と思われる。マウスＦＤＣ−Ｐ２細胞からＩＲＳ−２をクローニングすることの可能性を測定するために、指向性ｃＤＮＡ発現ベクターを、ＦＤＣ−Ｐ２細胞から単離したｍＲＮＡを用いてλＥＸｌｏｘベクター中に調製した。このλＥＸｌｏｘｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲ分析及びＩＲＳ−１ｃＤＮＡプローブを用いる低緊縮スクリーニングにより分析した。１４のＰＣＲプライマー対を選択して、マウスＩＲＳ−１の全コード領域中で３００〜６００ｂｐの生成物を生成した。これらのプライマー対の各々は、予想されるサイズの生成物をＩＲＳ−１を含むことが知られたライブラリーから産出したが、このライブラリーから得られたＰＣＲ生成物の何れもがＩＲＳ−１から予想される結果とマッチしなかった。この結果は、ＩＲＳ−１ｃＤＮＡがこのライブラリーでは示されていないか、非常に低濃度なので我々の方法によっては検出できないことを示唆する。更に、１８０ｋＤａのホスホチロシン蛋白質（ＩＲＳ−２）は、ＩＲＳ−１から区別されなければならない。次に、ＦＤＣ−Ｐ２ライブラリーを、低緊縮及び高緊縮条件にて、ポリグルタミン領域（CAG）₃₀を欠く完全長ＩＲＳ−１ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。陽性クローンは、ＩＲＳ−１を含む肝細胞、脂肪又は筋肉のｃＤＮＡライブラリーにおいて通常認められる高緊縮条件で同定されなかった。従って、ＩＲＳ−１遺伝子は、ＦＤＣ−Ｐ２ライブラリーにおいて見出されなかった。２００の弱い陽性のクローンを、ポリグルタミン領域（CAG）₃₀を欠く完全長ＩＲＳ−１プローブを用いるλＥＸｌｏｘの低緊縮スクリーニングにより得た。８つの最強の陽性クローンを単離して、配列決定した。これらのクローンは、マウス酸性リボソームリン蛋白質（ｍＡＲＰ）として同定された。ｍＡＲＰは、ｃＤＮＡレベルでＩＲＳ−１に対して同一性の多くのストレッチを含む１０９４塩基によりコードされる３６ｋＤａの蛋白質である。全体的同一性は、約４６％である。しかしながら、リーディングフレームが異なるために、アミノ酸配列レベルでは、類似性は存在しない。これらのクローンのＰＣＲ分析は、このライブラリーからのＰＣＲ生成物がこのｃＤＮＡから生じることはありそうであることを示す。低緊縮ＩＲＳ−１スクリーニングから得られた更なる１９２クローンを論理的にスクリーニングする方法を工夫することは困難であるので、このアプローチは、放棄した。更に、ＰＣＲクローニングは、ＩＲＳ−２遺伝子を示すことができなかった。ＦＤＣ−Ｐ２細胞はＩＲＳ−１を含まず且つＩＲＳ−２は、単純な技術によっては得られないと、暫定的に結論した。ＩＲＳ−２の精製ＩＲＳ−２を精製するためのストラテジーは、部分的に、ＩＲＳ−２が、インシュリン又はＩＬ−４刺激後に、ＰＩ３’−キナーゼと結合するという事実に依存する。前節のデータは、この結合がＩＲＳ−１により用いられるのと同じ機構により生じることを示唆する。このモデルにおいて、ＩＲＳ−２中のチロシンリン酸化部位は、ｐ８５中のＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインに結合することが予想され得る。従って、固定化されたｐ８５のＳＨ２ドメインをアフィニティー試薬として用いて、インシュリン刺激されたＦＤＣ−Ｐ２細胞からＩＲＳ−２を精製した。ＳＨ２アフィニティーカラムの効率を、抗ホスホチロシン抗体を用いて作成したアフィニティーカラムのそれと比較した。抗ホスホチロシン抗体αＰＹ、又はｐ８５（ＧＳＴ−ＳＨ^P85）、Ｆｙｎ（ＧＳＴ−ＳＨ２^fyn）、ＧＲＢ２（ＧＳＴ −ＳＨ２^GRB2）、ＳＨ−ＰＴＰ２（ＧＳＴ−ＳＨ２^syp）のＳＨ２ドメインを含むグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）細菌融合蛋白質に結合するＩＲＳ−２の効率を試験した。ＦＤＣＰ−２細胞を、０．７×１０⁶細胞／ｍｌまで生育させた。実験前に、これらの細胞（３．５×１０⁶／ｍｌ）を、高グルコース及び５０μＭＶＯ₄を含むＤＭＥＭ中で、２時間インキュベートした。等量のインシュリン刺激した又は刺激してない細胞から調製した細胞溶解物を、α ＰＹと又は種々のＳＨ２ドメインを含む様々なＧＳＴ融合蛋白質とインキュベートした。αＰＹ免疫複合体はプロテインＡセファロースで沈殿され、溶解緩衝液で３回洗った。ＧＳＴ融合蛋白質複合体は、グルタチオン−セファロースで沈殿され、その樹脂をＧＳＴ結合緩衝液で２回簡単に洗った。結合された蛋白質を、０．１ＭＤＴＴを含むＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液にて５分間煮沸することにより、プロテインＡセファロース樹脂から除去した。溶出された蛋白質混合物を、７．５％ＳＤＳｐａｇｅゲル上で成分に分離し、ニトロセルロース膜にトランスファーした。ＩＲＳ−２を、αＰＹ免疫ブロッティングにより検出した。ＧＳＴｎＳＨ２^p85（ｐ８５のアミノ末端ＳＨ２を含むＧＳＴ−ＳＨ２^p85）は、αＰＹ（３μｇ）と比較して等量のＩＲＳ−２を沈殿させた。第２回の沈殿では検出可能なＩＲＳ−２はなかったので、融合蛋白質の量を５μｇから２０μｇまで増大させることは、溶解物中の殆どすべてのＩＲＳ−２を沈殿させた。下記を含む幾つかの理由の故に、αＰＹではなく、ＧＳＴｎＳＨ２^p85を、ＩＲＳ−２の精製用に選択した：１．純粋な融合蛋白質を、短期間で、大量に製造することができる。２．高い容量のアフィニティーカラムをパックするのが容易である。３．ＧＳＴｎＳＨ２^p85結合蛋白質は、２０ｍＭグルタチオンを用いて、特異的に溶出させることができる。この選択を評価するために、ＦＤＣＰ−２細胞をインシュリンで刺激し、抽出物を小さいＳＨ２^p85アフィニティーカラムを通した。溶出物の幾つかの画分を集めてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ＩＲＳ−２は、画分２〜４において、蛋白質染色により容易に検出された。高容量アフィニティーラムを、４ｍｇのＧＳＴｎＳＨ２^p85を０．４ｍｌのグルタチオンセファロースを含むカラムを通して流し、洗浄用緩衝液（２００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含むＰＢＳ中の１０ｍＭＤＴＴ）で十分洗うことにより作成した。ＦＤＣ−Ｐ２細胞溶解物を、３０リットルのインシュリン刺激性ＦＤＣＰ −２細胞から調製し、ＧＳＴｎＳＨ２^p85アフィニティーカラムに加えた。そのカラムを、１０ｍｌの洗浄用緩衝液及び１０ｍｌのＢＳＡを含まない洗浄用緩衝液で洗った。これらの蛋白質を、２×１ｍｌの溶出用緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中の２０ｍＭグルタチオン、２０ｍＭＤＴＴ、２５０ｍＭＮａＣｌ）を用いて溶出し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０にて濃縮した。これらの蛋白質を、ＤＴＴを含む（終濃度０．１Ｍ）Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で５分間煮沸し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーして、ポンソーＳで染色した。二重のバンドが、対照として用いた組換えＩＲＳ−１と膜上の同じ位置に現れた。ＩＲＳ−１の定量及びポンソーＳ染色の濃さに基づく精製ＩＲＳ−２の凡その量は、約５μｇであった。これらの関心ある蛋白質バンドは、四角形で囲んである（図２）。これらのＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１を含むバンドを切り出して、別々に、プロテアーゼＬｙｓ−Ｃ消化にかけた。その結果生じたペプチドをＨＰＬＣにて分離し、それらのＯＤ₂₁₄での溶出プロフィルはデテルミナントであった。これらのＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１についてのペプチドマップは、著しく異なっており、ＩＲＳ−２がＩＲＳ−１とは異なる分子であることを示唆している。８つの主要な新規なペプチドを、アミノ酸配列決定にかけた。それらの各アミノ酸配列を表２に示す。これらのペプチドの内の７つは、蛋白質データバンクの如何なるペプチド配列とも相同性を有しなかった。これらのペプチドの１つ（ｐ９０）は、ＩＲＳ−１中の配列と８０％相同性を共有した。これらのデータは、ＩＲＳ−２が新規な蛋白質であることを示し、ＩＲＳ−２がＩＲＳ−１と関連していることを強く示した。ＩＲＳ−２のクローニング λＥＸｌｏｘ（商標）中に調製したマウスＦＤＣＰ−２細胞ｃＤＮＡライブラリー及びλＦＩＸベクター（Stratagene）中のマウスゲノムライブラリーを、オリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングした。このプローブ（PROBE- 60）は、表２のｐ６０のアミノ酸配列に基づいて、１０ヌクレオチドの重複を有する１対のオリゴヌクレオチドを用いて調製した：各オリゴヌクレオチド（０．６ｐモル）の対を、１０μｌの標識用緩衝液（Am ersham）中でアニールさせた。［³²Ｐ］ｄＡＴＰ（１ｍＣｉ／ｍｌの２１０μｌ、３０００Ｃｉ／ｍモル）及び［³²Ｐ］ｄＣＴＰ（２０ｍＣｉ／ｍｌの２１μｌ、６０００Ｃｉ／ｍモル）をミクロ遠心機用チューブ中で混合して凍結乾燥し、その後、２６μｌのＨ₂Ｏ、４μｌの５×標識用緩衝液、４μｌのｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、１０μｌのアニールしたオリゴヌクレオチドを加え、過剰のクレノー（Amersham）を用いて伸長させた。この混合物を、室温で２時間インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間インキュベートした。標識されたプローブをＥｌｕｔｉｐ（Schleicher and Schuell）を用いて、遊離のｄＮＴＰから分離した。比活性は、プローブ６０について、８×１０⁸ｃｐｍ／ｐモルであった。約百万のプラークを、１５０ｍｍプレート当り４０，０００プラークの密度でプレートし、ニトロセルロースフィルター（Schleicher and Schuell）へトランスファーして、プローブ６０（２．５×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ）を用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、２０％ホルムアミド、１０％デキストランスルフィド、６×ＳＳＣ及び５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）を含む５× Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む）中で、一晩行なった。これらのフィルターを、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、２２℃ で３回洗い、次いで、０．２×ＳＳＣで３０分間及び０．１％ＳＤＳで、３７℃ で３０分間洗った。これらの乾燥させたブロットをＫｏｄａｋＸＡＲ−５フィルムに、Ｑｕａｎｔａｌ１１増感スクリーンを伴って、−７０℃で、露出させた。１つのｃＤＮＡ（ｃ９−４）及び１つのゲノムＤＮＡ（ｇ９）が、各ライブラリーの百万のクローンにおいて同定された。クローンｃ９−４は、ｃＤＮＡの３ ’末端を示すポリＡ領域を含む２．４ｋｐｂの挿入物を含む（図３）。ｃ９−４のヌクレオチド配列は、マウスＩＲＳ−１配列との比較的低レベルであるが認識し得る相同性（３０〜４０％）を含み；しかしながら、翻訳されたペプチド配列は、ＩＲＳ−１中のものと類似のアミノ酸配列モチーフ中に幾つかのチロシンリン酸化部位の存在を示した。これらの結果は、ＩＲＳ−２がＩＲＳ−１と関連していることを確認する。この最初のｃＤＮＡ断片を用いて、マウスの肺のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。Ｌｃ−６（ＳＫ）と呼ばれる１つの新規なｃＤＮＡクローンが得られた（図３）。このクローンは、この最初のクローンと重複し且つ５’方向に配列を伸ばした。ＩＲＳ−１コード領域がそのコード領域中にイントロンを欠くことは、ＩＲＳ−２のゲノム配列がイントロンを欠くであろうこと及び完全長のコード領域を単離するために用いることができるであろうことを示唆した。ｃ９−４クローンの５’末端からのＳａｃＩ断片をプローブとして用いて、サザーンブロットによりゲノムＤＮＡ制限断片を調べた。１．４ｋｂｐのＫｐｎＩ断片は、このプローブとハイブリダイズし、５’末端配列を含むことが予想された。この１．４ｋｂｐの断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化して配列決定した。ゲノムＤＮＡ断片を、１．４ｋｂｐ（ｇＫｐｎ１．４）をプローブとして用いて再び調べた（暫定的に更なる５’末端ＤＮＡ配列であるとされる２ｋｂｐのＳａｃＩ断片を示す）。両ゲノムＤＮＡ断片を配列決定したが、リーディングフレームには、ＩＲＳ−２から得られるペプチド配列が従い、ＩＲＳ−１と相同性であった（図３）。アラインメントを図３に示す。対応するｃＤＮＡが単離されていないので最初の４５０ヌクレオチド中には誤りがあることがあり得る。しかしながら、配列アラインメントは、正しい配列が編集されたことを示唆している。この部分的ｃＤＮＡは、４１００ｂｐ長であり且つ、ヌクレオチド４０のＫｏｚａｃの開始部位から、ヌクレオチド３９００の最初のTAG 停止コドンまで伸びるオープンリーディングフレームを含む。ＩＲＳ−２とＩＲＳ−１のヌクレオチド配列を、図４で比較してある。５’末端に比較的高い（７０％近くに達する）同一性の３つの領域がある。これらの同一性を、図５に、グラフにより示す。ＩＲＳ−２の部分的ｃＤＮＡ配列を、最大のオープンリーディングフレームの演繹されたアミノ酸配列と共に示す（図６）。精製ＩＲＳ−２蛋白質から得られた９つのペプチド配列の内の５つが、この演繹されたＩＲＳ−２のアミノ酸配列中に見出された。このＩＲＳ−２ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームをＩＲＳ−１のそれと比較する（図７）；ギャップを除いて、全体的同一性は５１％である。最初の５００アミノ酸中に位置する３つの同一性（６５〜７０％）の領域があるが、３’末端の相同性は５０％未満であった。このＩＲＳ−２転写物の組織分布を、マウス組織及びＦＤＣＰ−２細胞からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザンブロットにより調べた。このブロットを、全くＩＲＳ−１との相同性を有しないＩＲＳ−２特異的なオリゴヌクレオチド（ペプチド６０から演繹）をプローブとして用いて検査した。ＩＲＳ−２発現が、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣及びＦＤＣ−Ｐ２細胞において検出された。当業者は、常例的方法を適用して、他の種例えばヒトからＩＲＳ−２核酸を得ることができる。例えば、ヒトＩＲＳ−２のゲノムクローンを、ヒトゲノムＤＮＡを増幅するための特異的ＩＲＳ−２オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲクローニングによって得ることができる。こうして得られた増幅断片を、適当なベクター例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中にクローン化し、次いで、配列決定することができる。或は、ヒトｃＤＮＡライブラリーを、マウスＩＲＳ−２配列から得られたオリゴヌクレオチドプローブを用いて又はマウスＩＲＳ−２ｃＤＮＡ断片を用いて低緊縮ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることができる。これらのスクリーニングの何れかから得られた陽性クローンを、上記のベクター中にクローン化して配列決定することができる。組換えヒトポリペプチドを、これらの単離されたクローンから発現させることができる。ＩＲＳ−２のアミノ酸配列ＩＲＳ−２の演繹されたアミノ酸配列を、ＩＲＳ−１のそれと比較した（図８）。ＩＲＳ−１中の主要なリン酸化部位及び潜在的チロシンリン酸化部位の殆どは、ＩＲＳ−２において保存されている。上流のキナーゼ又は下流の分子との相互作用において重要であると考えられるＰＨドメインは、ＩＲＳ−１とＩＲＳ−２の間で高度に保存されており、ＩＲＳ−２構造におけるその機能的重要性を確認する。Ｎ末端に位置するリン酸化部位以外の３つの相同性領域ＩＨ１、ＩＨ２及びＩＨ３がある（図８）。特に重要なことには、多数のリン酸化部位が、ＩＲＳ−２において、ＩＲＳ−１と同じ位置に見出される。幾つかの場合には、ＩＲＳ−２の周囲の配列はＩＲＳ−１に非常に似ているが、他の場合には、周囲の配列はユニークである（図７及び８）。これらの結果は、ＩＲＳ−２がＩＲＳ−１と機能的に関連しており、それがＩＲＳシグナリングファミリーの第２のメンバーとして含まれることを正当化することを確認する。他のＩＲＳファミリーメンバーの単離当業者は、常例的方法を適用して、他のＩＲＳファミリーのメンバーを得ることができる。例えば、縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを、１つ以上のＩＲＳ遺伝子に共有される相同性領域例えば前にクローン化されたＩＲＳ遺伝子例えばＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２のＩＨ１、ＩＨ２又はＩＨ３ドメインから合成することができる。これらのプライマーの縮重の程度は、特定のアミノ酸配列について用いられる遺伝暗号の縮重に依存する。これらの縮重したプライマーは又、次のクローニングを容易にするために、５’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位をも含むべきである。組織例えば古典的インシュリン感受性組織例えば筋肉、脂肪又は肝臓組織から全ｍＲＮＡを得て、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素キットを用いて逆転写することができる。このキットで与えられるオリゴ（ｄＴ）プライマーの代りに、３’縮重オリゴヌクレオチドプライマーの１つを用いて反応の特異性を増すことができる。第１鎖合成後に、得られたｃＤＮＡを、上記の縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅にかけることができる。ＰＣＲ条件は、アニーリング温度、Ｍｇ⁺⁺濃度及びサイクル持続期間について最適化されるべきである。一度適当なサイズの断片が増幅されたならば、それを、クレノーで充填し、適当な制限酵素で切断してゲル精製すべきである。かかる断片を、次いで、ベクター例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中にクローン化することができる。適当なサイズの挿入物を有するクローンを、制限酵素で消化して、生成した断片を、他のＩＲＳファミリーのメンバー例えばＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２のものと比較することができる。これらの別々の消化プロフィルを有するクローンを、配列決定することができる。或は、前にクローン化したＩＲＳ遺伝子例えばＩＲＳ−１又はＩＲＳ−２の保存された領域に対する抗体を作成して、発現スクリーンディファレントライブラリーに用いることができる。更に別の方法は、前にクローン化したＩＲＳ遺伝子例えばＩＲＳ−１及びＩＲＳ−２の保存されたリン酸化部位からＰＣＲプライマーを合成して、適当なライブラリースクリーニングに用いることもできる特異的なプローブを作成することを含む。ＩＬ−４とＩＲＳファミリーメンバーとの相互作用インターロイキン４（ＩＬ−４）は、病原体に対する免疫応答の際に、Ｔ細胞、マスト細胞及び好塩基球により産生される多能性サイトカインである。ＩＬ− ４は、防護的免疫応答の調節において重要な役割を演じる。それは、抗炎症性因子として関係し、自己免疫による組織傷害の制限に関係する。ＩＬ−４は又、ＩｇＭからＩｇＧ１（ヒトにおけるＩｇＧ４）及びＩｇＥ｛一般に、アレルギー疾患（喘息及び枯草熱）に関係しており、蠕虫に対する免疫において役割を演じ得る｝へのＢ細胞のＩｇクラススイッチングにおいて主要な役割を演じることが知られている。ＩＬ−４が著しい抗腫瘍活性を有するという観察は、それがある種の腫瘍細胞の免疫排除を促進する強力な生物学的分子であることを示唆する。従って、ＩＬ−４は、多くの医学的に重要な過程に関係する免疫応答において重要な役割を演じる。殆どのサイトカインと同様に、ＩＬ−４は、細胞に対して系統を変える多くの強力な生物学的効果を有する：それは、Ｂ細胞におけるＭＨＣクラスII分子及びＣＤ２３、リンパ球におけるそれ自身のレセプター及び内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１の発現を誘導し又は増大させる。最後に、ＩＬ−４は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びマスト細胞に対する成長因子である。ＩＬ−４の多面発現性効果を媒介するＩＬ−４レセプター複合体は、広範囲の造血系及び非造血系細胞型に存在する。マウスとヒトの両方のＩＬ−４レセプターのαサブユニット（ＩＬ−４αＲ）をコードするｃＤＮＡの分子クローニング及びそれらのＣＯＳ７細胞における発現は、約１３０ｋＤａの一本鎖が高アフィニティーのＩＬ−４結合部位を含むことを示した。しかしながら、ＩＬ−２レセプターのγ共通サブユニット（ＩＬ−２γ_cＲ）は、ＩＬ−４αＲと物理的に結合し、ＩＬ−４の一層高いアフィニティー結合及びＩＬ−４誘導されるチロシンリン酸化及び細胞増殖のためのＩＬ−４レセプター複合体の必須成分である。ＩＬ−４αレセプターとＩＬ−２γ_cレセプターの両方は、システイン残基の対及びＷＳＸＷＳ（SEQ ID NO:５６）モチーフ（細胞外ドメイン中）により特徴付けられる造血系レセプタースーパーファミリーに属する。両細胞質ドメインは、シグナル変換に必須である。ＩＬ−４αレセプターの細胞質ドメインは、ヒト、マウス及びラット間で保存されている２つの酸性領域と５つの潜在的なチロシンリン酸化部位を含む。ＩＬ−４ａレセプターの内部欠失の研究は、両酸性領域がトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３細胞においてＩＬ−４に応答して細胞増殖するのに必要であることを示唆した。第２の酸性領域のＮ末端近くには、やはり、インシュリン及びインシュリン様成長因子１のレセプター中に見出されるＮＰＸＹ（SEQ ID NO:５７）モチーフがある。このモチーフ中の突然変異は、細胞蛋白質のリン酸化及びＩＬ−４に応答しての増殖を誘導し得ないレセプターを生じる。ＩＬ−２γ_cレセプターの細胞質ドメインは、ＳＨ２サブドメインを含む。造血系レセプタースーパーファミリーの他のメンバー同様、ＩＬ−４αレセプターもＩＬ−２γ_cレセプターも、チロシン又はセリン／スレオニンキナーゼの特徴的な如何なるコンセンサス配列をも含まない。ＩＬ−４は、多くの細胞型においてＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１のリン酸化を誘導するＩＬ−４αレセプター及びＩＬ−２γ_cレセプターは、チロシンキナーゼドメインを含まないが、ＩＬ−４は、レセプター自身及びＩＲＳ−２（１７０ｋＤａの蛋白質−初めは、ＩＬ−４誘導されたホスホチロシン基質（４ＰＳ）と呼ばれた）を含む幾つかの蛋白質の迅速且つ明白なチロシンリン酸化を誘導する。ＩＲＳ−２のリン酸化は、多くの細胞株で認められ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ及びエリスロポエチンがそれらのレセプターも造血系レセプタースーパーファミリーに属するのにＩＲＳ−２のリン酸化を誘導しないので、該リン酸化は、ＩＬ−４に特異的である。ＩＬ−４は、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３’−キナーゼ）のＩＲＳ−２との結合を誘導する。この効果は、インシュリンへの応答におけるＰＩ３’−キナーゼに対するＩＲＳ−１の効果に似ている。更に、ＦＤＣ−Ｐ１及び３２Ｄ骨髄性前駆体細胞におけるＩＲＳ−１の過剰発現は、ＩＬ−４に対する応答におけるＩＲＳ−１のリン酸化を生じる。従って、ＩＬ−４及びインシュリンは、部分的に重複するシグナル変換経路を有するものと思われ、ＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１は、一定の構造及び機能的類似性を有する。ＩＲＳ−１は、インシュリン及びＩＧＦ−１刺激の際にチロシンリン酸化を受ける主要なインシュリンレセプター基質である。ＩＲＳ−１の分子クローニングは、ラット、マウス及びヒトの間で保存されているアミノ末端近くの潜在的ヌクレオチド結合部位があることを示した。しかしながら、蛋白質キナーゼの特徴のある配列は他には存在しない。ＩＲＳ−１は、ＩＲＳ−１の最も高度に保存された領域であるアミノ酸残基７と１２０の間のプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメインを含む。ＩＲＳ−１は、２０を超える潜在的チロシンリン酸化部位を含む。活性化されたインシュリンレセプターによるリン酸化を受ける少なくとも８つのチロシン残基が、公式に同定されている。ＩＲＳ−１のチロシンリン酸化は、「分子スイッチ」として作用して、インシュリン刺激の際に、蛋白質をＳｒｃ相同性２ドメイン（ＳＨ２蛋白質）と組み合わせることができる。ＳＨ２ドメインは、約１００アミノ酸からなり、多くのシグナリング分子中に見出されている。各々の特定のＳＨ２ドメインは、特定のアミノ酸配列モチーフ内に存在するホスホチロシンと結合すると考えられる。リン酸化されたＩＲＳ−１は、ＰＩ３’−キナーゼと、その８５ｋＤａの調節サブユニット（ｐ８５）内に存在するＳＨ２ドメインの、ＩＲＳ−１内のホスホチロシン６０８及び９３９との相互作用により、結合して活性化する。ＰＩ３’−キナーゼは、哺乳動物における細胞成長及び代謝の制御並びに酵母における蛋白質区分けに関係する。別のシグナリング潜在能力を有する幾つかの他のＳＨ２蛋白質も又、ＧＲＢ−２（ｐ２１^ras調節）、ＳＨ−ＰＴＰ２（蛋白質チロシンホスファターゼ）及びｎｃｋ（ＳＨ２／ＳＨ３含有アダプター蛋白質）を含むリン酸化されたＩＲＳ−１と結合することが見出されている。これらの相互作用は、インシュリンの多面発現性作用の媒介に対して重要であると考えられる。ＩＲＳ−２は、おそらく、ＩＲＳ−１と同様の仕方で作用して、ＩＬ−４誘導される多面発現性作用を媒介するのであろう。ＩＲＳ−２又はＩＲＳ−２様蛋白質のリン酸化は又、他のシグナリングシステムにおいても同定されている。一次Ｂ細胞及びＢａｌ−１７細胞株において、１７０ｋＤａの蛋白質は、ＩｇＭ刺激の際に、チロシンにおいて急速にリン酸化され；類似のサイズのチロシンリン酸化された蛋白質は又、幾つかのＢ細胞株例えばＤａｕｄｉ、Ｕ−２６６並びにＭＯＬＴ−４及びＭＯＬＴ−１６細胞株においてもＩ型インターフェロンに応答して認められた（本書の他所参照）。ＩＲＳ− ２と同様に、これらの分子は、ＩＲＳ−１に免疫学的に弱く関係している（即ち、幾つかの抗ＩＲＳ−１抗体は、それらを弱く認識するが、他のものは認識しない）。これらの分子の幾つかの正体は、特性決定されるべきままでいる。従って、ＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１又は関連分子は、様々なシグナル変換パスウェーに関係する分子の独自の群を規定することができる。ＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１の生物学的重要性ＩＬ−４及びインシュリンシグナリングパスウェーにおけるＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１の生物学的重要性は、低レベルの高アフィニティーＩＬ−４レセプターを含むがＩＲＳ−２又はＩＲＳ−１を含まない３２Ｄ骨髄性前駆体細胞において明確に示された。３２Ｄ細胞は、ＩＬ−４又はインシュリンにさらされた際に増殖せず；ＩＬ−４又はインシュリンに対するレセプターの増大した発現は、ＩＲＳ−２又はＩＲＳ−１の不在時には、これらの因子に対する有糸分裂促進性応答に対して殆ど影響を有しなかった。これらの細胞におけるＩＲＳ−１の単独での発現は、ＩＬ−４に対する細胞の有糸分裂促進性応答を効果的に増大させたが、インシュリンに対しては、該増大効果はもっと弱かった。しかしながら、ＩＬ −４又はインシュリンのレセプターを発現している細胞におけるＩＲＳ−１の発現は、両成長因子が非常に効果的に有糸分裂誘発を誘導すること及び個々のリガンドの存在下でのこれらの細胞の長期の成長を維持することを可能にした。従って、ＩＲＳ−１は、ＩＬ−４及びインシュリン誘導される増殖に対する必須要素であるらしい。ＩＲＳ−１に対する類推により、ＩＲＳ−２は、おそらく、ＩＬ −４誘導される有糸分裂誘発を媒介するのであろう。ＩＬ−４シグナリングにおけるＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１の重要性は又、ヒトＩＬ−４αレセプター突然変異体の分析によっても示された。切り詰められたヒトＩＬ−４αレセプター（４３７〜ＣＴ残基を欠く）は、３２Ｄ／ＩＲＳ−１細胞において発現されたときに、ＩＲＳ−１をリン酸化することができなかった。これらの細胞は、ｈＩＬ−４で処理したときに、増殖し得なかった。ＮＰＸＹＸＳ（SEQ ID NO:５８）中のチロシン４９７のフェニルアラニンへの突然変異は、殆ど又は全くＩＲＳ−１リン酸化を引き起こさないＩＬ−４ａレセプターを生じ、ｈＩＬ−４刺激の際に３２Ｄ／ＩＲＳ−１細胞増殖を媒介することができなかった。更に、ＩＬ−２γ_cレセプターが、ＩＲＳ−１のＩＬ−４誘導によるリン酸化及び有糸分裂誘発に必要である。これらの研究において、ＩＲＳ−１のリン酸化とＩＬ−４媒介の増殖とは密接に関係しており、ＩＬ−４シグナリングパスウェーにおけるＩＲＳ−１／ＩＲＳ−２の非常に重要な役割を示している。驚くべきことに、ジーンターゲティングによる遺伝子破壊により生成したＩＲＳ−１（−／−）マウスが生きて誕生して、繁殖し（大きさが５０％小さいが）、これは、ＩＲＳ−１が哺乳動物の生存に必須でないことを示す。インシュリンレセプターが細胞成長及び代謝パスウェーを調節するために利用することのできる他のＩＲＳファミリー分子（おそらくＩＲＳ−２）があるのではないかと考えることは妥当である。実際、ＩＲＳ−１抗体の幾つかにより弱く認識される蛋白質は、インシュリン投与後に、ＩＲＳ−１ノックアウトマウスの肝臓及び筋肉においてリン酸化されてＰＩ３’−キナーゼと結合するようである。この蛋白質がＩＲＳ−２であるか否かは、決定されるべきままである。ＩＬ−４刺激は、幾つかの蛋白質チロシンキナーゼを活性化し、ＩＲＳ−２及びＩＲＳ−１様の細胞性蛋白質のチロシンリン酸化を誘導して、転写因子のリン酸化、活性化及び核への移動を引き起こし、これは、細胞成長又は分化に必要な遺伝子の転写の調節へと導く。しかしながら、これらの重要なステップの各々の間の連鎖は、未だ、明確には確立されていない。ＩＲＳ−２は、ＩＬ−４誘導される細胞増殖に非常に重要であると考えられるので、ＩＲＳ−２は、おそらくこのＩＬ−４シグナリングネットワークにおいて重要な役割を演じているのであろう。ＩＲＳ−２活性の調節（例えば、阻害又は促進）を用いて、これらの効果を調節することができる。ＩＲＳファミリー及びＩ型インターフェロンＩ型インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮω）は、正常細胞及び新生物細胞に対して、様々な生物学的効果を発揮する（抗ウイルス活性及び抗増殖活性を含む）。ＩＦＮα刺激直後に、レセプター複合体中の幾つかのシグナリング蛋白質は、チロシンリン酸化される（Ｉ型ＩＦＮレセプターのα及びβサブユニット、並びにＴｙｋ−２及びＪａｋ−１チロシンキナーゼを含む）。両キナーゼは、Ｉ型ＩＦＮレセプターの成分と結合し、ＩＦＮαシグナリングカスケードの早期におけるそれらの活性化は、種々の下流のシグナリング分子のチロシンリン酸化を調節すると考えられる。Ｊａｋ−１及びＴｙｋ−２の発現は、ある種の非感受性細胞株におけるＩＦＮα応答をレスキューし、これは、Janus 科のこれらのチロシンキナーゼ又は関連するメンバーがＩＦＮα作用に必須であることを示唆する。幾つかの蛋白質は、ＩＦＮα依存チロシンキナーゼ活性に対する基質である。細胞のＩＦＮα処理に応答して、転写アクチベーターＩＳＧＦ３αのｓｔａｔ− １１３、Ｓｔａｔ−９１及びＳｔａｔ−８４成分は、チロシンにおいて、急速にリン酸化され、４８ｋＤ蛋白質（ＩＳＧＦ３γ）と結合して活性複合体を形成する。この複合体は、核に移動して、インターフェロン刺激された応答要素（ＩＳＲＥ）への結合中に遺伝子転写を開始する。更に、ｖａｖプロトオンコジーン生成物（ｐ９５^vav）は、ＩＦＮα刺激中にチロシンリン酸化される；しかしながら、ＩＦＮαのシグナル変換中のその正確な役割は、決定されるべきままである。ＩＦＮαシグナリングにおける多くのパスウェーの掛かり合いは、細胞及び組織に対する多面発現性の生物学的効果と一致する。上皮成長因子及び血小板由来成長因子に対するものを含む多くの成長因子レセプターは、直接、それらの自己リン酸化部位によって、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、Ｇｒｂ−２、ＳＨ−ＰＴＰ２、ＰＬＣγ及びｒａｓＧＡＰを含む、ＳＨ２ドメインを含むシグナリング蛋白質の共通セットと結合する。現在までのところ、これらのＩ型ＩＦＮレセプターの成分とかかるＳＨ２蛋白質との間の直接的相互作用の証拠はない。同様に、インシュリン、ＩＧＦ−１及びＩＬ −４のレセプターは、公知のＳＨ２蛋白質と強く結合しない。それよりも、それらは、ＩＲＳシグナリングファミリー中のドッキング蛋白質、特に種々のＳＨ２蛋白質に直接結合するＩＲＳ−１のチロシンリン酸化を刺激する。ＩＲＳ−１は、２１の潜在的チロシンリン酸化部位を含み、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に約１７５ｋＤａに移動する。ＩＦＮα及びインシュリンの両者は、造血細胞中の共通の１７０〜１７５ｋＤａ蛋白質のチロシンリン酸化を刺激し、これは、ＩＦＮαがＩＲＳシグナリング蛋白質を利用してある種の生物学的応答を媒介することを示唆する。（ＩＦＮα又はインシュリンにより誘導されるチロシンリン酸化のパターンを、次のように、Ｕ−２６６細胞にて研究した：細胞を、指示したように、１０⁴Ｕ／ｍｌのＩＦＮαの存在又は不在にて、３７℃で、５分間、インキュベートした。細胞は、刺激しないか又は、３７℃で、５分若しくは３０分間、１μＭのインシュリンで刺激した。全細胞溶解物からの蛋白質の等量（１００μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（４Ｇ−１０）を用いて免疫ブロットした。細胞溶解及び増強した化学ルミネセンス（ＥＣＬ）法を用いる免疫ブロッティングは、標準的方法により行なった。）ＩＲＳ−１がＩＦＮαシグナリングに関与するか否かを決定するために、対照用の又は刺激したＵ−２６６若しくはＤａｕｄｉ細胞由来の細胞溶解物を、組換えラットＩＲＳ−１に対するポリクローナル抗体で免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ−１０）を用いて免疫ブロットした。１７０ｋＤａ蛋白質の基礎的チロシンリン酸化が、Ｕ−２６６細胞において再現可能に検出されたが、Ｄａｕｄｉ細胞においては検出されなかった。ＩＦＮα及びインシュリンは、両細胞株に由来するαＩＲＳ−１免疫沈降物中の１７０ｋＤａ蛋白質のチロシンリン酸化を強く刺激した。（１７０ｋＤａＩＲＳシグナリング蛋白質のＩＦＮα及びインシュリンに対する応答におけるチロシンリン酸化を、次のように測定した：Ｕ −２６６又はＤａｕｄｉ細胞を、ＩＦＮα（１０⁴Ｕ／ｍｌ）又はインシュリン（１μＭ）の存在又は不在にて、３７℃で、３分間インキュベートした。細胞溶解物を、指示したように、対照用の正常ウサギ免疫グロブリン（ＲＩｇＧ）（Si gma）又はバキュロウイルス生成されたラットＩＲＳ−１に対する抗体を用いて免疫沈降させた。細胞を、１０⁴Ｕ／ｍｌのＩＦＮαを用いて種々の時点で刺激し、細胞溶解物を、対照用抗体（ＲＩｇＧ）又は組換えラットＩＲＳ−１に対する抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ポリビニジルフルオリド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、Millipore）にトランスファーして、抗ホスホチロシンを用いて免疫ブロットした。これらのブロットを、ＥＣＬ法を用いて顕出させた。ブロット中のＩＲＳシグナリング蛋白質の上下に移動するバンドは、非特異的である。）１７０ｋＤａ蛋白質のリン酸化が、Ｄａｕｄｉ細胞又はＭｏｌｔ−４細胞のＩＦＮαでの処理後１分以内に生じ、９０分後に減少した。このリン蛋白質は又ＩＲＳ−１のプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメイン（αＩＲＳ−１^PH）に対する抗体によっても免疫沈降された。（ＩＲＳシグナリング蛋白質のＤａｕｄｉ細胞中のＰＩ３’−キナーゼのｐ８５調節サブユニットとの結合を、次のように研究した：細胞（４×１０⁷／レーン）を、指示したように、ＩＦＮα（１０４ｕ／ｍｌ）と共に、３７℃で５分間刺激し、細胞溶解物を、指示したように、正常ＲＩｇＧ、又はＰＩ３’−キナーゼのｐ８５調節サブユニットに対するポリクローナル抗体、又はＩＲＳ−１のプレクストリン相同性ドメイン（αＩＲＳ−１^PH）に対するポリクローナル抗体を用いて免疫沈降させた。）免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、抗ホスホチロシンを用いて免疫ブロットした。他の実験においては、細胞（５×１０⁷／レーン）を、ＩＦＮα又はインシュリンの存在又は不在にて、３７℃で７分間インキュベートし、細胞溶解物を、ＩＲＳ−１のプレクストリン相同性ドメインに対する抗体又はｐ８５に対するポリクローナル抗体又は正常ＲＩｇＧを用いて免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ｐ８５αに対するモノクローナル抗体（Upstate Bi otechnology）を用いて免疫ブロットした。他の実験においては、細胞（９×１０⁷／レーン）を、指示したように、ＩＦＮα又はインシュリンを用いて、３７ ℃で５分間刺激し、細胞溶解物をＧＳＴのみ又はｐ８５αのＮ末端ＳＨ２ドメイン（アミノ酸残基３２１〜４４０）を含むＧＳＴ融合蛋白質（これらの両者は、グルタチオンセファロースビーズ（Pharmacia）に結合された）の何れかと共に４℃で３時間インキュベートした。これらのビーズを洗って、結合蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリビニジルフルオリド膜にトランスファーして、抗ホスホチロシンを用いて免疫ブロットした。これらのブロットをＥＣＬ法を用いて顕出させた。これらのブロット中のＩＲＳシグナリング蛋白質の上下に移動するバンドは、非特異的であった。） αＩＲＳ−１^PH抗体との強い反応性にもかかわらず、この蛋白質は、ＩＲＳ− １のＣ又はＮ末端に存在する特異的配列に対する抗体により認識されなかったので、ＩＲＳ−１と同一ではない。それは未だ、ＩＲＳ−２と同じ蛋白質であるか否か決定されていない。チロシンリン酸化後に、ＩＲＳ−１は、ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼの８５ｋＤａの調節サブユニット（ｐ８５）を含む幾つかのＳＨ２蛋白質に結合する。１７０ｋＤａのＩＲＳ関連リン蛋白質が、ＩＦＮα刺激の際にｐ８５に結合するか否かを決定するために、Ｄａｕｄｉ細胞溶解物から抗ｐ８５抗体を用いて得られた免疫沈降物を、抗ホスホチロシン（４Ｇ−１０）を用いて免疫ブロットした。これらの細胞のＩＦＮα又はインシュリン処理に続いて、１７０ｋＤａのチロシンリン酸化された蛋白質が、抗ｐ８５免疫沈降物中に検出された。このリン蛋白質は、αＩＲＳ−１^PHを用いて直接免疫沈降された１７０ｋＤのＩＲＳ関連蛋白質と一緒に移動した。更に、αＩＲＳ−１^PH抗体を用いて得られた免疫沈降物は、ＩＦＮα又はインシュリン刺激後にのみｐ８５αを含んだ。ＩＦＮα又はインシュリン刺激した細胞からのＩＲＳ関連リン蛋白質は又、ｐ８５のＮ末端ＳＨ２ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質にも結合した。同様の結果が、ｐ８５のＣ末端ＳＨ２ドメインを含むＧＳＴ融合蛋白質を用いて得られた。従って、ＩＦＮα及びインシュリンの両者は、ＩＲＳシグナリング蛋白質のＰＩ３’−キナーゼとの結合を刺激し、この相互作用は、おそらく、ｐ８５中のＳＨ２ドメインを必要とするに違いない。ホスファチジルイノシトール３’−キナーゼ（ＰＩ３’−キナーゼ）は、種々の生物学的応答における重要な役割を演じるようであり、多くの成長因子及びサイトカインにより活性化される。そのインシュリンによる活性化は、チロシンリン酸化されたＩＲＳ−１との結合の際に生じる。ＩＦＮαが、Ｄａｕｄｉ細胞中でＰＩ３’−キナーゼ活性のＩＲＳシグナリング蛋白質との結合を刺激するか否かを測定するために、ＰＩ３’−キナーゼアッセイを、ａＩＲＳ−１^PH免疫沈降物について行なった。刺激前に、基礎レベルのＰＩ３’−キナーゼ活性を、αＩＲＳ−１^PHの免疫沈降物にて検出した（これは、免疫化前ウサギ血清を用いた免疫沈降物にて検出された非特異的活性に等しかった）。（Ｄａｕｄｉ細胞におけるＩＦＮα及びインシュリンによるＰＩ３’−キナーゼの活性化を次のように研究した：細胞を、示したように、ＩＦＮα（１０４Ｕ／ｍｌ）又はインシュリン（１００ｎＭ）の不在又は存在にて、５分間処理し、細胞溶解物を、αＩＲＳ− １^PH抗体又は免疫化前血清を用いて免疫沈降させて、免疫沈降物を、三連で、ＰＩ３’−キナーゼ活性についてアッセイした。）ＩＦＮα又はインシュリンは、ＰＩ３’−キナーゼ活性の、αＩＲＳ−１^PHで特異的に免疫沈降されたＩＲＳ関連蛋白質との結合を刺激した。ＰＩ３’−キナーゼが、ＩＲＳシグナリング蛋白質との結合の際にＩＦＮα又はインシュリンによって活性化されることは、ありそうなことである。原形質膜と核との間のＩＦＮαシグナリングの理解における相当の進歩が為された。Ｊａｋ−Ｓｔａｔパスウェーは、ＩＦＮ刺激された応答要素（ＩＳＲＥ）を含む遺伝子の発現を調節するＩＳＧＦ−３の調節されたアセンブリーのもっともらしい機構を提供する。しかしながら、他のシグナリングパスウェーを調節するためにＩＦＮαにより用いられる分子機構は、完全には理解されていない。ＩＦＮαが１７０ｋＤａのＩＲＳシグナリング蛋白質のチロシンリン酸化を刺激するという発見は、ＩＦＮα刺激の際の更なるＳＨ２シグナリング蛋白質の調節された組合せのためのパスウェーの存在を示唆する。現在まで、Ｉ型ＩＦＮレセプターとＰＩ３’−キナーゼ、Ｇｒｂ−２、ＳＨ−ＰＴＰ２及びｎｃｋとの間の分子的リンクは存在しない。ＩＲＳ−１又は関連蛋白質のチロシンリン酸化は、これらの下流シグナリング要素に対する直接的リンクを与える。Ｄａｕｄｉ、Ｕ− ２６６及びＭｏｌｔ−４細胞における１７０ｋＤのリン蛋白質は、ＩＲＳ−１の種々の領域に対する抗体との反応性パターンにより測定して、ＩＲＳ−１と関連しているが同一ではない。しかしながら、それは、インシュリン刺激の際にチロシンリン酸化されてＰＩ３’−キナーゼと結合するので、機能的にＩＲＳ−１と類似している。ＩＦＮαに対する応答並びにＩＦＮβ及びＩＦＮωに対する応答においてこのＩＲＳ関連蛋白質により組み合わされる他のＳＨ２蛋白質を同定することは重要であろう（それらは、同蛋白質のチロシンリン酸化をも誘導する）。造血細胞における研究は、ＩＬ−４又はインシュリン刺激の際にチロシンリン酸化される１７０ｋＤａのＩＲＳ関連蛋白質の存在を示唆した。この蛋白質は、初めは４ＰＳと呼ばれたが（現在は、ＩＲＳ−２という）、チロシンリン酸化後にＰＩ３’−キナーゼに結合し、αＩＲＳ−１^PHと強く反応するがＣ及びＮ末端特異的なαＩＲＳ−１抗体とは反応しない。ＩＲＳ−２のこれらの特徴は、ＩＦＮα又はインシュリン刺激の際にＤａｕｄｉ、Ｕ−２６６及びＭｏｌｔ−４細胞中で検出される１７０ｋＤａのＩＲＳシグナリング蛋白質の特徴と同じようである。ＩＲＳ−２を、インシュリン刺激ＦＣＤ−Ｐ２細胞から精製し、部分的アミノ酸配列から調製した最適化ｃＤＮＡプローブを用いてそのｃＤＮＡを単離した。演繹されたアミノ酸配列は、ＩＲＳ−１と約４８％同一であるが、αＩＲＳ− １^PH抗体との強い反応性を表すよく保存されたＰＨドメインを含む蛋白質を予言する。暫定的にＩＲＳ−２と呼ばれるこのＩＲＳシグナリングファミリーの新しいメンバーは、ＩＦＮα刺激の際に検出される１７０ｋＤａのリン蛋白質と同一であり得るが、更なるイソ型が存在し得るので、決定的証明は、ＩＲＳ−２に対する特異的抗体の調製を待つ。ＩＲＳシグナリング蛋白質は、種々の疎水性コンテキストにおいて、多くの潜在的なチロシンリン酸化部位を含む。これらのチロシン残基は、上流のチロシンキナーゼの基質として及び下流のＳＨ２蛋白質に対する特異的ドッキング部位としての二重の役割を演じる。ＩＲＳ−１中の少なくとも８つのチロシン残基は、残基４６０、６０８、６２８、９３９及び９８７を含む活性化インシュリンレセプターによるリン酸化を受ける（これらは、ＹＸＸＭ（SEQ ID NO:５９）／ＹＭＸＭ（SEQ ID NO:２）モチーフであり、ＰＩ３’−キナーゼを活性化するｐ８５に結合する）。３つの他のモチーフもインシュリンレセプターによりリン酸化される（Ｇｒｂ−２に結合するＹ⁸⁹⁵ＶＮＩ（SEQ ID NO:６０）並びにＳＨ−ＰＴＰ２（２３）に結合するＹ¹⁷²¹ＩＤＬ（SEQ ID NO:６１）及びＹ¹²²²ＡＳＩ（SE Q ID NO:６２）を含む）。これらの部位のすべてではないが多くは、ＩＲＳ−２において保存されており、これは、ＩＲＳ−１とＩＲＳ−２の差別的発現が、インシュリン、ＩＬ−４又はＩＦＮα刺激の際に達成されるユニークなリン酸化パターンを伴って、シグナリング特異性における重要な役割を演じ得ることを示唆する。インシュリンレセプターチロシンキナーゼは、ＩＲＳシグナリング蛋白質のインシュリン依存性リン酸化を調節するようであるが、ＩＬ−４及びＩＦＮαのレセプターはＪａｎｕｓファミリーチロシンキナーゼを用いてかかるリン酸化を達成する；しかしながら、ＩＦＮα及びＩＬ−４刺激の際のＪａｎｕｓキナーゼの掛かり合いの直接的証拠は、得られるべきままでいる。多くのレセプターは、チロシンキナーゼのＪａｎｕｓファミリーを活性化するが、それらの殆どは、ＩＲＳシグナリング蛋白質をリン酸化しない。この選択性の原因である要素の正体は、知られていない。興味深いことには、インシュリン、ＩＧＦ及びＩＬ−４のレセプターは、共通のアミノ酸配列モチーフＬｘｘｘｘＮＰｘＹｘｓｓ（SEQ ID N 0:６３）を含む（これは、これらのレセプターのＩＲＳ−１との相互作用に寄与する）；しかしながら、この配列モチーフは、Ｉ型ＩＦＮレセプターのクローン化成分中には見出されず、これは、異なるモチーフが関与しているか又は他のサブユニットが見出されるべきままでいることを示唆する。ＩＲＳシグナリングパスウェーの共用は、インシュリン、ＩＧＦ−１、ＩＬ− ４及びＩＦＮαについての見掛け上異なるシグナリングシステム間の共通のリンクを確立する。ＩＬ−４は、単球及び関連細胞株におけるＩＦＮ誘導された細胞遺伝子発現の転写活性化を減衰させることができる。これらの結果は、ＩＲＳシグナリングシステムにおける蛋白質の共通利用により生じるＩＦＮαとＩＬ−４との間の拮抗を示唆する。もしそれが正しければ、インシュリン及びＩＧＦ−１も又、ＩＦＮαシグナリングに影響し得る。遺伝子治療この発明の遺伝子構築物は又、遺伝子治療プロトコールの一部として用いて、ＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト形態をコードする核酸を送達することもできる。ＩＲＳ−２の場合に、この発明は、ＩＲＳ−２が誤発現される細胞においてＩＲＳ−２ポリペプチドの機能を再構成し或は排除するための、特定の細胞型におけるＩＲＳ−２ポリペプチドのイン・ビボトランスフェクション及び発現のための発現ベクターを特徴とする。主題のＩＲＳ−２ポリペプチドの発現構築物及びその突然変異体を、任意の生物学的に有効なキャリアー例えばＩＲＳ−２遺伝子をイン・ビボで細胞に有効に送達することのできる任意の配合物又は組成物にて投与することができる。アプローチは、主題の遺伝子の、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び単純ヘルペスウイルス１型を含むウイルスベクター又は細菌性若しくは真核生物の組換えプラスミッド中への挿入を含む。ウイルスベクターは、細胞を直接トランスフェクトし；プラスミッドＤＮＡは、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクチン）又は誘導体化（例えば、抗体結合）されたポリリジン結合体、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ若しくはそのような他の細胞内キャリアーの助けにより、並びに遺伝子構築物の直接的注入又はイン・ビトロで行なうＣａＳＯ₄沈澱を用いて送達することができる。適当な標的細胞の形質導入は遺伝子治療の重要な第１ステップを意味するので、特定の遺伝子送達システムの選択は、意図される標的の表現型及び投与の経路例えば局所投与か又は全身投与か等の因子に依存するであろうということは認められよう。更に、ＩＲＳ−２発現のイン・ビボ形質導入用に準備した特定の遺伝子構築物は又、細胞のイン・ビトロ形質導入例えば上述の診断用アッセイでの使用にも有用であるということは認められよう。核酸の細胞へのイン・ビボ導入のための好適アプローチは、ＩＲＳ−２ポリペプチドをコードする核酸例えばｃＤＮＡを含むウイルスベクターの利用によるものである。細胞のウイルスベクターでの感染は、標的細胞の大きい割合が核酸を受け得るという利点を有する。更に、例えばウイルスベクター内に含まれるｃＤＮＡによりコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞内で効率的に発現される。外因性遺伝子の特にヒトへのイン・ビボでのトランスファーのための組換え遺伝子送達システムとして、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターを用いることができる。これらのベクターは、遺伝子の細胞への効率的な送達を提供し、トランスファーされた核酸は、宿主の染色体ＤＮＡ中に安定にインテグレートされる。レトロウイルスの利用のために前以て必要な主なことは、それらの利用の安全性特に細胞集団における野生型ウイルスの拡散の可能性に関する安全性を確実にすることである。複製欠損レトロウイルスのみを生成する特殊化した細胞株の開発（「パッキング細胞」と呼ぶ）は、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性を増大させ、欠損レトロウイルスは、遺伝子治療目的のための遺伝子トランスファーにおける利用のためによく特性決定されている（総説としては、Miller,A.D.(1990)Blood 76:271 を参照されたい）。従って、レトロウイルスのコード配列（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）の部分がそのレトロウイルスを複製欠損にする主題のレセプターの１つをコードする核酸により置換された組換えレトロウイルスを構築することができる。この複製欠損レトロウイルスを、次いで、標準的技術により、ヘルパーウイルスの利用によって、標的細胞に感染させるのに用いることのできるビリオン中にパッケージする。組換えレトロウイルスを生成し、かかるウイルスをイン・ビトロ又はイン・ビボで細胞に感染させるためのプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel,F. M.等（編）Greene Publishing Associates,(1989)，第9.10-9.14 節及び他の標準的実験マニュアル中に見出すことができる。適当なレトロウイルスの例には、当業者に周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ及びｐＥＭが含まれる。環境栄養性及び両栄養性の両レトロウイルスシステムに適したパッケージングウイルス株の例には、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、ψ２及びψＡｍが含まれる。レトロウイルスは、種々の遺伝子を上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にイン・ビボ及び／又はイン・ビトロで導入するために用いられてきた（例えば、Eglitis等(1985)Science 2 30:1395-1398; Danos及びMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464 ; Wilson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018;Armentano 等(1990)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145; Huber等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 8:8039-8043; Ferry等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381; Chowdhury 等(1991)Science 254:1802-1805: van Beusechem等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:7640-7644; Kay等(1992)Human Gene Therapy 3:641-647; Dai等(1992)Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895; Hwu等(1993)J.Immunol.150:4104-4115 ；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５号；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３号を参照されたい）。主題のＩＲＳ−２遺伝子用の遺伝子送達システムとしてレトロウイルスベクターを選択するときは、殆どのレトロウイルスによる標的細胞の上首尾の感染及びそれ故組換えＩＲＳ−２遺伝子の安定な導入に前以て必要なことはそれらの標的細胞が分裂していなければならないということであるということに注意することが重要である。リンパ腺癌等の一定の例外はあるが、かかる要求は、レトロウイルスベクターの利用に対して障害とはならないであろう。更に、ウイルス粒子の表面上のウイルス性パッケージング蛋白質を修飾することによりレトロウイルスの感染スペクトルを制限し従ってレトロウイルスベースのベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが示されている（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２５２３４号及びＷＯ９４／０６９２０号を参照されたい）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルの改変のためのストラテジーには、細胞表面抗原に特異的な抗体をこのウイルスのｅｎｖ蛋白質に結合すること（Roux等(1989)PNAS 86:9079-9083; Julan等(1992)J.Gen Viro l 73:3251-3255; 及びGoud等(1983)Virology 163:251-254）；又は細胞表面レセプターリガンドをこのウイルスのｅｎｖ蛋白質に結合すること（Neda等(1991)J Biol Chem 266:14143-14146）が含まれる。結合は、蛋白質又は他の変種との化学的架橋の形態であってよく（例えば、ｅｎｖ蛋白質をアシアロ糖蛋白質に変換するラクトース）、並びに融合蛋白質（例えば、一本鎖の抗体／ｅｎｖ融合蛋白質）を生成することによってもよい。この技術は、感染を一定の組織型に限定し或は向けるのに有用出あるが、環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターに変換するために用いることもできる。その上、レトロウイルス遺伝子送達の利用は、更に、そのレトロウイルスベクターのＩＲＳ−２遺伝子の発現を制御する組織又は細胞特異的な転写調節配列の利用により促進することができる。本発明において有用な他のウイルス性遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来のベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、関心ある遺伝子産物をコードして発現するが、正常の溶菌性ウイルス生活環において複製する能力に関して不活性化されるように操作することができる。例えば、Berkner 等(1988)Bi oTechniques 6:616; Rosenfeld等(1991)Science 252:431-434;及びRosenfeld 等 (1992)Cell 68:143-155 を参照されたい。アデノウイルスＡｄ５型ｄ１３２４株又は他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から誘導された適当なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。組換えアデノウイルスは、それらが分裂しない細胞に感染し得ない一定の状況において有利であり得て、上皮細胞を含む広範囲の種々の細胞型に感染させるのに用いることができる（Rosenfeld 等(1992)前出）。更に、そのウイルス粒子は、比較的安定であって、精製及び濃縮に柔順であり、上述のように、その感染性スペクトルに影響を与えるように改変することができる。更に、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及び、そこに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムにインテグレートされずにエピソームのままでおり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主ゲノム中にインテグレートされる状況（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）において挿入による突然変異誘発の結果として生じ得る潜在的問題を回避する。更に、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡに対する収容力（最大で８キロベース）は、他の遺伝子送達ベクターと比較して大きい（Berkner 等、前出; Haj-Ahmand及びGraham (1986)J.Viro.57:267）。現在使用されており従って本発明により好まれる殆どの複製欠損アデノウイルスベクターは、そのウイルスのＥ１及びＥ３遺伝子の全部又は部分を欠失しているが、そのアデノウイルスの遺伝物質の８０％を保持している（例えば、Jones 等(1979)Cell 16:683; Berkner等、前出;及びGraham等 Methods in Molecular Biology,E.J.Murray 編（ニュージャージー、Clifton在、Humana）第７巻、第109-127 頁を参照されたい）。挿入されたＩＲＳ−２遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）及び関連するリーダー配列、Ｅ３プロモーター、又は外来の加えられたプロモーター配列の制御下にあってよい。主題のＩＲＳ−２遺伝子の送達に有用な更に他のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製及び生産的生活環のために他のウイルス例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルスをヘルパーウイルスとして必要とする天然の欠損ウイルスである。（総説としては、Muzyczka等、Curr.Topics in Micro．and Immunol.(1992)158:97-129を参照されたい）。それは又、非分裂細胞にＤＮＡをインテグレートすることのできる少数のウイルスの１つであり、高率で安定なインテグレーションを示す（例えば、Flotte等(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356; Samulski 等(198 9)J.Viroll.63:3822-3828;及びMcLaughlin等(1989)J.Virol.2:1963-1973 を参照されたい）。ＡＡＶの３００塩基対程僅かしか含まないベクターは、パッケージされ得て且つインテグレートされ得る。外因性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限られている。Tratschin 等(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260に記載されたようなＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡを細胞中に導入することができる。種々の核酸が、ＡＡＶベクターを用いて、種々の細胞型に導入された（例えば、Hermonat等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470; Tratschin等(198 5)Mol.Cell.Biol.4:2072-2081; Wondisford 等(1988)Mol.Endocrinol.2:32-39; Tratschin等(1984)J.Virol.51:611-619; 及びFlotte等(1993)J.Biol. Chem.268:3781-3790を参照されたい）。上に説明したようなウイルストランスファー方法に加えて、非ウイルス的方法を用いて、動物の組織におけるＩＲＳ−２ポリペプチドの発現を引き起こすこともできる。殆どの非ウイルス的な遺伝子トランスファー方法は、巨大分子の取り込み及び細胞内輸送のために哺乳動物細胞により用いられている通常の機構に依存する。好適具体例において、本発明の非ウイルス的遺伝子送達システムは、標的細胞による主題のＩＲＳ−２遺伝子の取り込みのために、エンドサイトーシスパスウェーに依存する。この型の典型的遺伝子送達システムには、リポソーム由来のシステム、ポリリジン結合体及び人工ウイルスエンベロープが含まれる。代表的具体例において、ＩＲＳ−２ポリペプチドをコードする遺伝子は、表面に陽性電荷を有するリポソーム（例えば、リポフェクチン）中に捕らえることができ、（適宜）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体で標識される（Mizuno等(1 992)No Shinkei Geka 20:547-551; ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６３０９号；日本国特許出願第１０４７３８１号；及び欧州特許公開ＥＰ−Ａ−４３０７５号）。臨床においては、治療用のＩＲＳ−２遺伝子のための遺伝子送達システムは、当分野で周知の多くの方法の何れかによって患者に導入することができる。例えば、遺伝子送達システムの医薬調製物を、例えば静脈注射によって全身に導入することができ、標的細胞における蛋白質の特異的形質導入は、主として、遺伝子送達ビヒクルにより与えられるトランスフェクションの特異性、レセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞型若しくは組織型発現又はこれらの組合せから生じる。他の具体例において、組換え遺伝子の最初の送達は、非常に局在化された動物への導入により一層限定されている。例えば、遺伝子送達用ビヒクルをカテーテルにより（米国特許第５，３２８，４７０号参照）又は定位注射により（例えば、Chen等(1994)PNAS 91:3054-3057）導入することができる。遺伝子治療用構築物の医薬調製物は、本質的に、許容し得る希釈剤中の遺伝子送達システムからなるものであってよく、遺伝子送達用ビヒクルが埋め込まれているゆっくり放出するマトリックスを含んでよい。或は、完全な遺伝子送達システムが組換え細胞から無傷で生成し得る場合には（例えば、レトロウイルスベクター）、この医薬調製物は、その遺伝子送達システムを生成する１つ以上の細胞を含むことができる。ペプチド模倣物この発明は又、主題のＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドの蛋白質結合ドメインの減少を与えて、この場合、本発明のＩＲＳ−２のＩＲＳ−２結合蛋白質（例えば、天然のリガンド例えばインシュリンレセプター）との結合を分裂させることのできる模倣物例えばペプチド又は非ペプチド因子をも生成する。従って、かかる突然変異誘発技術は、例えば主題のＩＲＳ−２ポリペプチドのＩＲＳ−２結合蛋白質への結合に関与する蛋白質−蛋白質相互作用に関係するＩＲＳ−２のデテルミナントをマップするのに特に有用である。説明のために、ＩＲＳ−２結合蛋白質の分子認識に関与する主題のＩＲＳ−２ポリペプチドの重要な残基を決定して、ＩＲＳ−２のＩＲＳ−２結合蛋白質との結合を競争的に阻害するＩＲＳ−２由来のペプチド模倣物を生成するために用いることができる（例えば、「Peptide inhibitors of huma n papillomavirus protein binding to retinoblastoma gene protein」欧州特許出願ＥＰ−４１２，７６２Ａ及びＥＰ−Ｂ３１，０８０Ａを参照されたい）。例えば、ＩＲＳ−２結合蛋白質への結合に関与する特定のＩＲＳ−２ポリペプチドのアミノ酸残基をマップするために突然変異誘発を走査することを採用することにより、ペプチド模倣化合物（例えば、ジアゼピン又はイソキノリン誘導体）を生成することができ、これらは、ＩＲＳ−２結合蛋白質への結合におけるそれらの残基を模倣し、それ故、ＩＲＳ−２のＩＲＳ−２結合蛋白質への結合を阻止することができ、それにより、ＩＲＳ−２の機能を邪魔することができる。例えば、かかる残基の加水分解可能でないペプチドアナログを、ベンゾジアゼピン（例えば、Freidinger等、Peptides 中：Chemistry and Biology，G.R.Marshall編、ESCOM Publisher: オランダ、Leiden 在、1988参照）、アゼピン（例えば、Huffman 等、Peptids中: Chemistry and Biology，G.R.Marshall 編、ESCOM Publisher: オランダ、Leiden在、1988参照）、置換されたガンマーラクタム環（Garvey等、Pept ides 中: Chemistry and Biology，G.R.Marshall 編、ESCOM Publisher: オランダ、 Leiden在、1988）、ケト−メチレン偽ペプチド（Ewenson 等(1986)J Med Chem 2 9:295;及びEwenson 等、Peptides 中: Structure and Function（Proceedings o f the 9th American Peptide Symposium）Pierce Chemical Co．イリノイ、Rockland在、1985）、β−ターンジペプチドコア（Nagai 等 (1985)Tetrahedron Lett 26:647;及びSato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231）及びβ−アミノアルコール（Gordon等(1985)Biochem Biophys Res Commun 126:419;及びDann等(1986)Biochem Biophys Res Commun 134:71）を用いて生成することができる。薬物スクリーニングアッセイ精製された及び組換えのＩＲＳポリペプチド（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）例えばＩＲＳ−２ポリペプチドを作製することにより、本発明は、この場合には、主題のＩＲＳ−２の正常な細胞機能又はインシュリン関連疾患におけるそれらの役割のアゴニスト又はアンタゴニストである薬物についてスクリーニングするために用いることのできるアッセイを提供する。一具体例において、このアッセイは、ＩＲＳ−２ポリペプチドとＩＲＳ−２結合蛋白質（例えば、天然のリガンド例えばインシュリンレセプター）との間の結合を調節する化合物の能力を評価する。様々なアッセイ形式が十分であり、本発明に照らして、当業者により理解されよう。化合物及び天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定期間内に概観される化合物数を最大にするためには、高スループットアッセイが望ましい。精製した又は半精製した蛋白質を用いて誘導され得るような無細胞系において実施されるアッセイは、しばしば、迅速な顕出及び試験化合物により媒介される分子標的中の変化の比較的容易な検出を可能にするように生成され得る「一次」スクリーニングとして好適である。更に、試験化合物の細胞毒性及び／又は生物学的利用能の効果は、一般に、イン・ビトロシステムにおいては無視することができ、それよりも、このアッセイは、第一に、分子標的に対する薬物の効果に集中している（他の蛋白質との結合アフィニティーの変化又は分子標的の酵素的特性の変化において明白であろう）。従って、本発明の典型的なスクリーニングアッセイにおいては、関心ある化合物を、単離精製したＩＲＳ−２ポリペプチドと接触させる。この化合物とＩＲＳ−２ポリペプチドとの混合物を、次いで、ＩＲＳ−２結合蛋白質を含むがＩＲＳ−２を含まない組成物に加える。ＩＲＳ−２／ＩＲＳ−２結合蛋白質複合体の検出及び定量化は、ＩＲＳ−２ポリペプチドとＩＲＳ−２結合蛋白質との間の複合体形成の阻止（又は増強）におけるその化合物の効力を測定する手段を提供する。この化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから投与量応答曲線を生成することにより評価することができる。更に、対照用アッセイを行なって比較のためのベースラインを与えることもできる。対照用アッセイにおいては、単離精製したＩＲＳ−２を、ＩＲＳ−２ポリペプチドを含む組成物に加え、ＩＲＳ−２／ＩＲＳ−２結合蛋白質複合体の形成を、試験化合物の不在において定量する。その他の具体例下記の具体例は、ＩＲＳ−２について記載されているが、それらは、ＩＲＳファミリーの他のメンバー（好ましくは、ＩＲＳ−１以外のもの）に適用することができる。対立遺伝子変種；天然の突然変異体；誘導した突然変異体；SEQ ID NO:１のポリペプチドをコードする核酸に高緊縮又は低緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされる蛋白質（高緊縮及び低緊縮の定義については、Current Protocols in Molecular Biology，John Wi1ey & Sons，New York 在、1989、6.3. 1-6.3.6（参考として本明細書中に援用する）を参照されたい）；及びＩＲＳ− ２に対する抗血清により特にＩＲＳ−２の活性部位又は結合ドメインに対する抗血清により特異的に結合されるポリペプチドは、この発明に含まれる。この発明は又、ＩＲＳ−２の生物学的に活性な断片又はアナログをも含む。生物学的に活性な断片又はアナログは、SEQ ID NO:１に示したＩＲＳ−２の特徴である任意のイン・ビボ又はイン・ビトロ活性例えば上述の生物学的活性の１つ以上を有するものである。ＩＲＳ−２等のペプチドは、しばしば、ある範囲の生理学的特性を示し、かかる特性はその分子の種々の部分に帰することができるので、有用なＩＲＳ−２断片又はＩＲＳ−２アナログは、ＩＲＳ−２活性についての任意の生物学的アッセイにおいて生物学的活性を示すものである。最も好ましくは、この断片又はアナログは、任意のイン・ビボ又はイン・ビトロのＩＲＳ −２アッセイにおいて、ＩＲＳ−２（SEQ ID NO:１）の活性の１０％、好ましくは４０％又は少なくとも９０％を有する。アナログは、天然のＩＲＳ−２と、アミノ酸配列において若しくは配列を含まない様式で、又はこれら両方において異なってよい。この発明のアナログは、一般に、天然のＩＲＳ−２配列の２０アミノ酸残基の、好ましくは４０アミノ酸残基より多いセグメントと、又は一層好ましくは完全な配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％又は９９％相同性さえ示す。配列以外の修飾には、ＩＲＳ−２のイン・ビボ又はイン・ビトロの化学的誘導体化が含まれる。配列以外の修飾には、アシル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化又はグリコシル化の変化が含まれる。グリコシル化は、例えばＩＲＳ−２のグリコシル化パターンを、その合成及びプロセッシングの際に改変することにより、又は更なるプロセッシングステップにおいてＩＲＳ−２を、かかるプロセッシングを正常に与える細胞由来のグリコシル化作用をする酵素例えば哺乳動物のグリコシル化酵素にさらすことにより改変することができ；リン酸化は、ＩＲＳ−２をリン酸化作用をする酵素例えばキナーゼ又はホスファターゼにさらすことにより改変することができる。好適なアナログには、野生型の配列と、１つ以上の保存的アミノ酸置換により又は１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失若しくは挿入により異なる（これらは、ＩＲＳ−２の生物学的活性を排除しない）ＩＲＳ−２（又は、その生物学的に活性な断片）が含まれる。保存的置換には、典型的には、アミノ酸の他の類似の特性を有するアミノ酸での置換例えば次の群の中出の置換が含まれる：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。他の保存的置換は、下記の表から得ることができる。この発明中の他のアナログは、ペプチドの安定性を増大させる改変を有するものであり；かかるアナログは、例えば、１つ以上の非ペプチド結合（ペプチド結合に置き換わるもの）をそのペプチド配列中に含んでよい。天然のＬ−アミノ酸以外の残基例えばＤ−アミノ酸又は非天然の即ち合成のアミノ酸例えばβ若しくはγアミノ酸を含むアナログ；又は環状アナログも又、含まれる。ここで用いる場合、用語「断片」は、ＩＲＳ−２に適用する場合、通常、少なくとも約２０残基長、一層典型的には少なくとも約４０残基長、好ましくは少なくとも約６０残基長である。ＩＲＳ−２の断片は、当業者に公知の方法によって生成することができる。候補の断片のＩＲＳ−２の生物学的活性を示す能力は、ここに記載のように、当業者に公知の方法によって評価することができる。ペプチドの生物学的活性に必要でない残基を含むＩＲＳ−２又は別のｍＲＮＡスプライシング若しくは別の蛋白質プロセッシング事象から生じた残基を含むＩＲＳ− ２も又含まれる。ＩＲＳ−２遺伝子の全部又は部分をコードする核酸を用いて、細胞をトランスフォームすることができる。例えば、ＩＲＳ−２遺伝子例えばその誤発現型若しくは突然変異型（例えば、欠失）、又はＩＲＳ−２蛋白質若しくはペプチドをコードする他のＤＮＡを用いて、細胞をトランスフォームして、その細胞のゲノムＩＲＳ−２遺伝子がトランスフォームされた遺伝子により置き換えられた細胞を生成し、例えばＩＲＳ−２遺伝子について欠失された細胞を生成することができる。このアプローチを培養で成長できる細胞例えば培養幹細胞に用いて、この遺伝子の機能を研究することができる。同様に、ＩＲＳ−２遺伝子の全部又は部分をコードする核酸例えば遺伝子の誤発現型若しくは突然変異型（例えば、欠失）を用いて、細胞をトランスフォームし、次いで、該細胞からトランスジェニック動物例えばトランスジェニックマウスを生成することができる。このアプローチを用いて、例えば、ＩＲＳ−２遺伝子が例えば欠失により不活性化されたトランスジェニック動物を造ることができる。ホモ接合のトランスジェニック動物を、創出（founder）トランスジェニック動物の子孫間の交配により作成することができる。細胞培養物又は組織培養物を、トランスジェニック動物から誘導することができる。ＩＲＳ−２ポリペプチドを得るためには、従来法によって、ＩＲＳ−２をコードするＤＮＡを発現ベクター中に導入し、そのベクターを所望の蛋白質の発現に適した細胞中に導入し、そして、そのペプチドを回収して精製する。これらのペプチド（蛋白質）に対する抗体は、従来法によって、動物例えばウサギ又はマウスを免疫化し、そして、抗ＩＲＳ−２抗体を回収することにより作成することができる。ＩＲＳ−２の断片は、例えば、SEQ ID NO:１のＤＮＡ配列の制限消化により所望の断片をコードするようにイン・ビトロで操作したＩＲＳ−２ＤＮＡを発現させることにより作成することができる。アナログは、例えば、SEQ ID NO:１の配列のイン・ビトロでのＤＮＡ配列改変によって作成することができる。例えば、イン・ビトロ突然変異誘発を用いて、SEQ ID NO:１のＤＮＡ配列を、１つ以上のアミノ酸残基が置換（例えば、表３に記載した保存的置換）を受けたアナログをコードする配列に変換することができる。断片又はアナログを、ＩＲＳ−２活性の存在について、当業者に公知の方法により試験することができる。この発明は又、ＩＲＳ−２の他の蛋白質への結合を調節例えば阻止することのできるＩＲＳ−２模倣物例えばペプチド又は非ペプチド因子の生成を与える。一般に、種々の形態の突然変異誘発が、第２の蛋白質への結合に関与する蛋白質− 蛋白質相互作用に関係するＩＲＳ−２のデテルミナントをマップするために適用可能である。例えば、ＩＲＳ−２の相同物（アゴニスト形態及びアンタゴニスト形態の両方）を、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発等（Ruf 等(1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang 等(1994)J Biol Chem 269:3095-3099;Balint 等(1993)Gene 137:109-118; Grodberg等(1993)Eur J Biochem 218:597-601; Nag ashima等(1993)J Biol Chem 268:2888-2892; Lowman 等(1991)Biochemistry 30: 10832-10838;及びCunningham等(1989)Science 244:1081-1085）を用いて、リンカースキャニング突然変異誘発（Gustin等(1993)Virology193:653-660; Brown等 (1992)Mol Cell Biol 12:2644-2652; McKnight等(1982)Science 232:316）により、又は飽和突然変異誘発（Meyers等(1986)Science232:613）により生成させてスクリーニングすることができる。分子認識に関与するこの発明のペプチドの重要な残基を決定して、ＩＲＳ−２の他の蛋白質との結合を競争的に阻止するペプチド模倣物を生成するために利用することができる（例えば、「Peptide inhibitors of human papillomavirus p rotein binding to retinoblastoma gene protein」欧州特許出願ＥＰ−４１２，７６２４及びＥＰ−５３１，０８０Ａを参照されたい）。例えば、他の蛋白質への結合に関与するＩＲＳ−２の残基をマップするためのスキャニング突然変異誘発を用いることにより、他の蛋白質への結合に関与することが確かめられているＩＲＳ−２残基を模倣しそれ故信頼すべきＩＲＳ−２蛋白質のその蛋白質への結合を阻止するために用いることのできるペプチド模倣化合物を生成することができる。例えば、かかる残基の加水分解不能なペプチドアナログを、ベンゾジアゼピン（例えば、Freidinger等 Peptides 中: Chemistry and Biology,G.R.Mars hall編、ESCOM Publisher: オランダ、Leiden在、1988を参照されたい）、アセンピン（例えば、Huffman 等Peptides 中: Chemistry and Biology，G.R.Marshall編、E SCOM Publisher: オランダ、Leiden在、1988を参照されたい）、置換されたガンマーラクタム環（Garvey等 Peptides 中: Chemistry and Biology,G.R.Marshall編、E SCOM Publisher: オランダ、Leiden在、1988）、ケト−メチレン偽ペプチド（Ewenso n 等(1986)J Med Chem 29:295;及びEwenson 等Peptides 中:Structure and Func tion（Proceedings of the 9th American Peptide Symposium）Pierce Chemical Co．イリノイ、Rockland 在、1985）、β−ターンジペプチドコア（Nagai 等(1985) Tetrahedron Lett 26:647;及びSato等(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1:1231）及びβ−アミノアルコール（Gordon等(1985)Biochem Biophys Res Commun 126:4 19; 及びDann等(1986)Biochem Biophys Res Commun 134:71）を用いて生成することができる。他の具体例は、後述の請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/705 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ (72)発明者ホワイト，モリスエフ. アメリカ合衆国 02131 マサチューセッツ，ウエストロックスバリー，グレターロード 14 (72)発明者スン，シャオジャンアメリカ合衆国 02215 マサチューセッツ，ボストン，ピーターバラストリート 11 ナンバー16 (72)発明者ピアス，ジャカリンエイチ. アメリカ合衆国 20854 メリーランド, ポトマック，スパーホウィールレイン 11409

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の特性の１つ以上を有するＩＲＳポリペプチドの精製標品：（ｉ）該ＩＲＳポリペプチドは、少なくとも５つのＩＲＳ共通チロシン含有リン酸化部位を含む；（ｉｉ）該ＩＲＳポリペプチドは、ＩＲＳ相同性ドメイン１、ＩＲＳ相同性ドメイン２及びＩＲＳ相同性ドメイン３の群から選択する少なくとも１つのＩＲＳ相同性ドメインを含む；（ｉｉｉ）該ＩＲＳポリペプチドは、インシュリンレセプターに結合することができ且つインシュリンレセプターによりリン酸化されることができる；（ｉｖ）該ＩＲＳポリペプチドは、ＳＨ２ドメイン含有蛋白質に結合することができる、但し、該ＩＲＳポリペプチドは、ＩＲＳ−１以外のものである。２．ＩＲＳ−２ポリペプチドの実質的に純粋な標品。３．組換えＩＲＳ−２ポリペプチド。４．下記の特性の１つ以上を有するＩＲＳポリペプチドをコードする実質的に純粋なＩＲＳ核酸：（ｉ）該ＩＲＳコードされるポリペプチドは、少なくとも５つのＩＲＳ共通チロシン含有リン酸化部位を含む；（ｉｉ）該ＩＲＳコードされるポリペプチドは、ＩＲＳ相同性ドメイン１、ＩＲＳ相同性ドメイン２及びＩＲＳ相同性ドメイン３の群から選択する少なくとも１つのＩＲＳ相同性ドメインを含む；（ｉｉｉ）該ＩＲＳコードされるポリペプチドは、インシュリンレセプターと結合することができ且つインシュリンレセプターによりリン酸化されることができる；（ｉｖ）該ＩＲＳコードされるポリペプチドは、ＳＨ２ドメイン含有蛋白質に結合することができる、但し、該ＩＲＳポリペプチドは、ＩＲＳ−１以外のものである。５．ＩＲＳ−２ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む実質的に純粋な核酸。６．ＩＲＳ−２ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター。７．請求項４のベクターでトランスフェクトした宿主細胞。８．組換えＩＲＳ−２ポリペプチドを製造する方法であって、請求項５の細胞を細胞培養培地で培養し、該ＩＲＳ−２ポリペプチドを該細胞又は該細胞培養培地から単離することを含む、上記の方法。９．ＩＲＳ−２トランスジーンを含むトランスジェニック動物。１０．ＩＲＳ−２に結合するがＩＲＳ−１には結合しない抗体の精製標品。１１．患者が病気の危険にあるか否かを測定する方法であって、該患者におけるＩＲＳ−２代謝状況を評価することを含み、該代謝状況の異常なレベルが該病気の診断となる、上記の方法。１２．患者が病気の危険にあるか否かを測定する方法であって、ＩＲＳ−２を発現する遺伝子の構造を測定することを含み、異常な構造が該病気の診断となる、上記の方法。１３．ＩＲＳ−２代謝に対する治療（例えば、治療剤例えば薬物の投与）の効果を評価する方法であって、該治療を試験用細胞若しくは生物に施して、該剤のＩＲＳ−２代謝に対する効果を評価することを含み、該ＩＲＳ−２代謝状況の変化が該治療の効果を示す、上記の方法。１４．治療の効果を評価する方法であって、ＩＲＳ−２を誤発現する試験用細胞若しくは生物を用意し；その治療をその細胞若しくは生物に施し；そしてその治療の代謝状況に対する効果を評価し、代謝状況に対する効果がその治療の効果を示す、上記の方法。１５．ＩＲＳ−２代謝により引き起こされる病気を患っている又はその病気の危険にある哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に、ＩＲＳ−２代謝状況を変える治療剤の治療上有効な量を投与することを含む、上記の方法。