JP2003520577A - Ｅｐｏ一次応答遺伝子１、ｅｐｒｇ１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＥＰＲＧ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドならびにかかるポリペプチドの組換え技法による生成方法が開示される。治療および治療のための診断アッセイにおいてＥＰＲＧ１ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを使用する方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、新たに同定されたポリペプチドおよびかかるポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド、治療におけるそれらの使用および潜在的に治療に有用な
アゴニスト、アンタゴニストおよび／または阻害物質である化合物の同定におけ
るそれらの使用、ならびにかかるポリペプチドおよびポリヌクレオチドの生成に
関する。

【０００２】 （発明の背景） 創薬プロセスは、現在、根本的な大変革が行われていおり、「機能ゲノム科学
」、すなわち、高処理ゲノムベースまたは遺伝子ベース生物学を含むものとなっ
ている。この方法は、急速に、「位置クローニング」に基づく初期の方法に取っ
て代わりつつある。表現型、すなわち、生物学的機能または遺伝病を同定し、次
いで、これをその遺伝子地図位置に基づいて原因遺伝子まで辿って戻る。

【０００３】 機能ゲノム科学は、現在利用可能な多くの分子生物学データから目的のもので
ある可能性のある遺伝子配列を同定するために生命情報科学の種々の手段に非常
に頼っている。創薬の標的としてのさらなる遺伝子およびそれらの関連ポリペプ
チド／タンパク質の同定および特徴付けがなおも必要とされて続けている。

【０００４】 ＥＰＲＧ１（ＳＯＣＳ−３）は、増殖のためにＥＰＯを必要とするヒト造血細
胞系から単離された。ＥＰＲＧ１の発現は、ＥＰＯにより誘発され、その発現の
維持にはＥＰＯの存在が必要とされる。ＥＰＲＧ１は、ＥＰＯ依存性細胞の増殖
に関与しており、赤血球系列および他の造血系列の増殖および発生において重要
である。ＥＰＲＧ１の発現は、Ｇ−ＣＳＦで処理されたヒト骨髄中で高レベルに
誘発され、胎児肝臓、末梢血白血球、肺中で、およびＥＰＯで刺激されたヒト骨
髄中でもまた実質的なレベルのＥＰＲＧ１が発現される。さらにまた、一次遺伝
的応答を表すＥＰＲＧ１の発現は、シクロヘキシミドの存在下、ＥＰＯにより、
およびＴＰＯにより誘発される。一次応答遺伝子として、ＥＰＲＧ１の発現は、
ＥＰＯまたはＴＰＯとそれらの同族受容体との結合後のシグナル伝達経路の活性
化の直接的結果である。これらのデータは、ＥＰＲＧ１が、貧血症、好中球減少
症および血小板減少症を含む血球減少症（遺伝因子、骨髄抑制性癌化学療法、放
射線療法または偶発的照射により引き起こされるものを含む）；赤血球増加症；
癌；代謝性または遺伝性の成長不足；肥満症；免疫刺激による感染；ワクチン療
法のアジュバント増強による感染症または癌；ＡＩＤＳ；薬剤誘発性貧血症；慢
性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症のような自己免疫疾患；ならびに喘息お
よびアレルギーのような炎症性疾患を包含するがそれらに限定されない機能障害
または疾患を予防、緩解または矯正するのに有用であることを示している。

【０００５】 （発明の概要） 本発明は、ＥＰＲＧ１、特に、ＥＰＲＧ１ポリペプチドおよびＥＰＲＧ１ポリ
ヌクレオチド、組換え体ならびにそれらの生成方法に関する。別の態様において
、本発明は、特に、貧血症、好中球減少症および血小板減少症を含む血球減少症
（遺伝因子、骨髄抑制性癌化学療法、放射線治療または偶発的照射により引き起
こされるものを含む）；赤血球増加症；癌；代謝性または遺伝性の成長不足；肥
満症；免疫刺激による感染；ワクチン療法のアジュバント増強による感染症また
は癌；ＡＩＤＳ；薬物誘発性貧血症；慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化症
のような自己免疫疾患；ならびに喘息およびアレルギーのような炎症性疾患（以
下、「当該疾患」と記す）の治療または予防を含む、かかるポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドを用いる方法に関する。さらなる態様において、本発明は、本
発明によって得られる物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニスト／阻害物質
を同定し、同定された化合物を用いてＥＰＲＧ１不均衡に伴う症状を治療する方
法に関する。さらなる態様において、本発明は、不適当なＥＰＲＧ１活性または
レベルに伴う疾患を検出するための診断アッセイに関する。

【０００６】 （発明の記載） 第１の態様において、本発明は、ＥＰＲＧ１ポリペプチドに関する。かかるペ
プチドは、配列番号２の全長にわたって配列番号２のものに対して少なくとも７
０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少な
くとも９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性、最も好
ましくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ポ
リペプチドを包含する。かかるポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含
むものを包含する。

【０００７】 本発明のさらなるペプチドは、アミノ酸配列が配列番号２の全長にわたって配
列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少な
くとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、さらに好
ましくは、少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも９７〜９９
％の同一性を有する単離ポリペプチドを包含する。かかるポリペプチドは、配列
番号２のポリペプチドを包含する。

【０００８】 本発明のさらなるペプチドは、配列番号１に含まれる配列を含むポリヌクレオ
チドによりコードされる単離ポリペプチドを包含する。

【０００９】 本発明のＥＰＲＧ１ポリペプチドは、また、配列番号４の全長にわたって配列
番号４のものに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０
％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは、
少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも９７〜９９％の同一性
を有するアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを包含する。かかるポリペプチド
は、配列番号４のアミノ酸を含むポリペプチドを包含する。

【００１０】 本発明のさらなるペプチドは、アミノ酸配列が配列番号４の全長にわたって配
列番号４のアミノ酸に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少なくと
も８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、さらに好まし
くは、少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは、少なくとも９７〜９９％の
同一性を有する単離ポリペプチドを包含する。かかるポリペプチドは、配列番号
４のポリペプチドを包含する。

【００１１】 本発明のさらなるペプチドは、配列番号３に含まれる配列を含むポリヌクレオ
チドによりコードされる単離ポリペプチドを包含する。

【００１２】 本発明のポリペプチドは、ポリペプチドのＳＯＣＳファミリーのメンバーであ
ると考えられる。したがって、このファミリー中の遺伝子は、細胞増殖および分
化因子からのシグナル伝達経路の活性化を調節するので、本発明のポリペプチド
は、目的のものである。これらの特性を、以下、「ＥＰＲＧ１活性」または「Ｅ
ＰＲＧ１ポリペプチド活性」または「ＥＰＲＧ１の生物活性」と記す。また、こ
れらの活性としては、ＥＰＲＧ１ポリペプチドの抗原性活性および免疫原性活性
、特に、配列番号２または４のポリペプチドの抗原性活性および免疫原性活性が
挙げられる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの、ＥＰＲ
Ｇ１の生物活性を示す。

【００１３】 本発明のポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形態であってもよく、または
、融合タンパク質のような大きいタンパク質の一部であってもよい。分泌もしく
はリーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製を助ける配列、ま
たは組換え体生成の間の安定性のための付加配列を含む付加アミノ酸配列を包含
するのが好都合な場合がある。

【００１４】 本発明は、また、上記ポリペプチドの変種、すなわち、残基が類似の特徴を有
する別の残基によって置換される保存的アミノ酸置換により対照と異なるポリペ
プチドを包含する。典型的なかかる置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌ
ｅの間のもの；ＳｅｒおよびＴｈｒの間のもの；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの
間のもの；ＡｓｎおよびＧｌｎの間のもの；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの間
のもの；芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間のものである。数個、５〜１０個、
１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸がいずれかの組合せで置換
、欠失、または付加されている変種が特に好ましい。

【００１５】 本発明のポリペプチドは、いずれもの適当な方法で調製することができる。か
かるポリペプチドは、単離された自然発生のポリペプチド、組換えにより生成さ
れたポリペプチド、合成により生成されたポリペプチド、またはこれらの方法の
組合せにより生成されたポリペプチドを包含する。かかるポリペプチドの調製手
段は、当該技術分野においてよく理解されている。

【００１６】 さらなる態様において、本発明は、ＥＰＲＧ１ポリヌクレオチドに関する。か
かるポリヌクレオチドは、配列番号２の全長にわたって配列番号２のアミノ酸配
列に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性
、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも
９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離
ポリヌクレオチドを包含する。これに関して、少なくとも９７％の同一性を有す
るポリペプチドは非常に好ましく、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するも
のはさらに好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するものは最も好ましい。
かかるポリヌクレオチドは、配列番号２のポリペプチドをコードする配列番号１
に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。

【００１７】 本発明のさらなるポリヌクレオチドは、全コード領域にわたって配列番号２の
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性
、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％
の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド
配列を含む単離ポリヌクレオチドを包含する。これに関して、少なくとも９７％
の同一性を有するポリヌクレオチドは非常に好ましく、少なくとも９８〜９９％
の同一性を有するものはさらに好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するも
のは最も好ましい。

【００１８】 本発明のさらなるポリヌクレオチドは、配列番号１の全長にわたって配列番号
１に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性
、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも
９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを包含す
る。これに関して、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドは非常
に好ましく、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するものはさらに好ましく、
少なくとも９９％の同一性を有するものは最も好ましい。かかるポリヌクレオチ
ドは、配列番号１のポリヌクレオチドだけでなく配列番号１のポリヌクレオチド
を含むポリヌクレオチドも包含する。

【００１９】 本発明は、また、上記ポリヌクレオチドの全てに対して相補的なポリヌクレオ
チドをも提供する。

【００２０】 配列番号１のヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ配列であり、配列番号２のポリペ
プチドである２２５アミノ酸のポリペプチドをコードするポリペプチドコード配
列（ヌクレオチド２８から７０５）を含む。配列番号２のポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列は、配列番号１に含まれるポリペプチドコード配列と同一
であってもよく、または、遺伝暗号の重複性（縮重）の結果として配列番号２の
ポリペプチドをコードする、配列番号１に含まれる配列以外の配列であってもよ
い。本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわけ、相同
ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物機能／特性を有すると考えら
れる。さらにまた、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、
少なくとも１つのＥＰＲＧ１活性を有する。

【００２１】 本発明は、また、配列番号１および配列番号２の対応する全長配列の決定前に
まず同定された部分または他のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列に関す
る。

【００２２】 したがって、さらなる態様において、本発明は、 （ａ）配列番号５の全長にわたって配列番号５に対して少なくとも７０％の同
一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９
０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性、さらにまた好ま
しくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離
ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号５の全長にわたって配列番号５に対して少なくとも７０％の同
一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９
０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性、さらにまた好ま
しくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離
ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号５のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号５のポリヌクレオチド；または （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドに対して相補
的なポリヌクレオチド を提供する。

【００２３】 さらなる態様において、本発明は、 （ａ）配列番号３の全長にわたって配列番号３に対して少なくとも７０％の同
一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９
０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性、さらに好ましく
は、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリ
ヌクレオチド； （ｂ）配列番号３のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列に対して少なく
とも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは
、少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性、
さらに好ましくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｄ）配列番号３のポリヌクレオチド；または （ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドに対して相補
的なポリヌクレオチド を提供する。

【００２４】 本発明は、また、配列番号３に含まれる配列を含むポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチドに加えて、 （ａ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のものに対して少なくとも７０
％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なく
とも９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性、さらに好
ましくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペ
プチド； （ｂ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列に対して少なく
とも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは
、少なくとも９０％の同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の同一性、
さらに好ましくは、少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有
するポリペプチド； （ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および （ｄ）配列番号４のポリペプチドであるポリペプチド を提供する。

【００２５】 配列番号５のヌクレオチド配列は、ＥＳＴ（発現遺伝子配列タグ）配列に由来
する。必然的に、ＥＳＴ配列においていくつかのヌクレオチド配列誤読があると
いうことは当業者によって認識されている（Adams, M. D. et al., Nature 377
(supp) 3, 1995 を参照のこと）。したがって、配列番号５のヌクレオチド配列
は、配列精度において同様の固有の制限を受ける。

【００２６】 本発明のポリヌクレオチドは、発現遺伝子配列タグ（ＥＳＴ）分析を用い、ヒ
ト骨髄細胞および造血細胞のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーから標準
的なクローニングおよびスクリーニング技法を用いて得ることができる（Adams,
M. D., et al., Science (1991) 252:1651-1656；Adams M. D. et al., Nature
, (1992) 355:632-634；Adams, M. D., et al., Nature (1995) 377 Supp:3-174
）。本発明のポリヌクレオチドは、また、ゲノムＤＮＡライブラリーのような天
然源から得ることもでき、または、周知および市販の技法を用いて合成すること
もできる。

【００２７】 本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え体生成に用いる場
合、該ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコード配列自体；またはリーダ
ーもしくは分泌配列、プレ−もしくはプロ−もしくはプレプロ−タンパク質配列
または他の融合ペプチド部分をコードするコード配列のような他のコード配列を
有する読み枠中の成熟ポリペプチドのコード配列を包含することができる。例え
ば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードすることができ
る。本発明のこの態様のある種の好ましい実施態様において、マーカー配列は、
ｐＱＥベクター（キアジェン，インコーポレイテッド（Qiagen, Inc.））におい
て提供され、かつ、Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:821
-824 に開示されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、または、Ｈ
Ａタグである。該ポリヌクレオチドは、また、転写されるが翻訳されない配列、
スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍ
ＲＮＡを安定化する配列などの非コード５'および３'配列をも含む。

【００２８】 本発明のさらなる実施態様は、配列番号２または４のアミノ酸配列を含み、数
個、例えば、５〜１０個、１〜５個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸
残基がいずれかの組合せで置換、欠失または付加されているポリペプチド変種を
コードするポリヌクレオチドを包含する。

【００２９】 配列番号１、３または５に含有されるヌクレオチド配列に対して同一または十
分に同一であるポリヌクレオチドを、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイ
ブリダイゼーションプローブとして、または、核酸増幅（ＰＣＲ）反応に対する
プライマーとして用いて、本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡおよ
びゲノムクローンを単離することができ、配列番号１、３または５に対して高い
配列類似性を有する他の遺伝子（ヒト以外の種由来のホモログおよびオルソログ
をコードする遺伝子を包含する）のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するこ
とができる。典型的には、これらのヌクレオチド配列は、対照のものに対して、
７０％同一であり、好ましくは、８０％同一であり、より好ましくは、９０％同
一であり、最も好ましくは、９５％同一である。プローブまたはプライマーは、
一般に、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３０ヌクレオチ
ドを含んでおり、少なくとも５０ヌクレオチドを有することもある。特に好まし
いプローブは、３０〜５０ヌクレオチドを有する。

【００３０】 ヒト以外の種由来のホモログおよびオルソログを包含する本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、３または５の配列またはその
フラグメントを有する標識プローブを用いてストリンジェントハイブリダイゼー
ション条件下で適当なライブラリーをスクリーニングする工程；ならびに該ポリ
ヌクレオチド配列を含有する全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程
を含む方法により得ることができる。かかるハイブリダイゼーション技法は、当
業者によく知られている。好ましいストリンジェンハイブリダイゼーション条件
は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン
酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５ｘデンハルト
溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡ
を含む溶液中にて４２℃で一夜インキュベートすること；次いで、約６５℃で０
.１ｘＳＳＣでフィルターを洗浄することを包含する。かくして、本発明は、ま
た、配列番号１、３または５の配列またはそのフラグメントを有する標識プロー
ブを用いてストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリ
ーをスクリーニングすることにより得ることができるポリヌクレオチドを包含す
る。

【００３１】 当業者は、多くの場合、単離ｃＤＮＡ配列は、該ポリペプチドをコードする領
域がｃＤＮＡの５'末端で中断されるという点で不完全であるということを認識
している。これは、第１鎖ｃＤＮＡ合成の間にｍＲＮＡ鋳型のＤＮＡコピーを完
成しない、本質的に低い「プロセシビティ（processivity）」（酵素の、重合反
応の間じゅう鋳型に結合したままである能力の尺度）を有する酵素であるリバー
ストランスクリプターゼの結果である。

【００３２】 全長ｃＤＮＡを得るのにまたは短いｃＤＮＡを伸長させるのに利用可能で当業
者によく知られているいくつかの方法があり、例えば、ｃＤＮＡ末端の高速増幅
（ＲＡＣＥ）法（例えば、Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988を参
照のこと）に基づく方法がある。Ｍａｒａｔｈｏｎ^ＴＭ法（クローンテク・ラボ
ラトリーズ・インコーポレイテッド（Clontech Laboratories Inc.））により例
示される技法の最近の変法は、例えば、長いｃＤＮＡの検索を有意に簡単にした
。Ｍａｒａｔｈｏｎ^ＴＭ法において、ｃＤＮＡは、選択組織から抽出されたｍＲ
ＮＡから調製され、各末端に「アダプター」配列が連結される。次いで、遺伝子
特異的およびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用
いて核酸増幅（ＰＣＲ）を行ってｃＤＮＡの「失われている」５'末端を増幅す
る。次いで、「ネステッド」プライマー、すなわち、増幅生成物の範囲内にアニ
ールするように設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列中のさらな
る３'にアニールするアダプター特異的プライマーおよび既知の遺伝子配列中の
さらなる５'にアニールする遺伝子特異的プライマー）を用いてＰＣＲ反応を繰
り返す。次いで、この反応の生成物をＤＮＡ配列決定によって分析し、次いで、
存在しているｃＤＮＡに該生成物を直接結合して完全配列を得ること、または５
'プライマーの設計に関する新しい配列情報を用いて別個の全長ＰＣＲを行うこ
とによって全長ｃＤＮＡを構築することができる。

【００３３】 本発明の組換えポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から
当該技術分野でよく知られている方法によって調製することができる。したがっ
て、さらなる態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（複数も可）
を含む発現系、かかる発現系を用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え
技法による本発明のポリペプチドの生成に関する。また、無細胞翻訳系を用い、
本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質を生成することも
できる。

【００３４】 組換え体生成について、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明のポリヌクレオチ
ドに対して発現系またはその一部を取込むことができる。ポリヌクレオチドの宿
主細胞への導入は、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986
) 中のおよび Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2n
d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (19
89) などの多くの標準研究室マニュアルに開示されている方法によって行うこと
ができる。好ましいかかる方法としては、例えば、リン酸カルシウムトランスフ
ェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベク
ション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ・ローディング、弾
道的導入または感染が挙げられる。

【００３５】 適当な宿主の代表例としては、連鎖球菌（streptococci）、ブドウ球菌（stap
hylococci）、イー・コリ（E. coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）お
よびバシラス・サチリス（Baccilus subtilis）細胞；真菌細胞、例えば、酵母
細胞およびアスペルギルス（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えば、ドロソフ
ィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞；動物細
胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ
２９３およびボーウェス（Bowes）メラノーマ細胞；ならびに植物細胞が挙げら
れる。

【００３６】 例えば、染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミ
ド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、
挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、パポバウ
イルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイ
ルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクタ
ー、ならびに、コスミドおよびファージミドのようなプラスミドおよびバクテリ
オファージ遺伝因子由来のベクターのようなそれらの組合せに由来するベクター
などの非常に多様な発現系を用いることができる。該発現系は、発現を引き起こ
すだけでではなく調節もする調節領域を含んでいてもよい。一般に、宿主におい
てポリヌクレオチドを維持、増幅または発現してポリペプチドを生成することが
できる系またはベクターを用いることができる。適当なヌクレオチド配列は、Sa
mbrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL（上掲）に示される
技法のような種々のよく知られている慣用的な技法のいずれかによって発現系に
挿入することができる。適当な分泌シグナルを所望のポリペプチドに取込ませて
翻訳タンパク質を小胞体内腔、周辺腔または細胞外環境に分泌させてもよい。こ
れらのシグナルは、該ポリペプチドに内在していてもよく、または、それらは、
異種シグナルであってもよい。

【００３７】 本発明のポリペプチドがスクリーニングアッセイにおける使用のために発現さ
れるべきである場合、一般に、該ポリペプチドは、細胞の表面で生成されるのが
好ましい。この場合には、該細胞を、スクリーニングアッセイでの使用の前に収
穫することができる。該ポリペプチドが培地中に分泌される場合、該培地を回収
してポリペプチドを回収および精製することができる。細胞内で生成される場合
、ポリペプチドを回収する前にまず該細胞を溶解しなければならない。

【００３８】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグ
ラフィー、疎水性相互反応クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラ
フィーを包含するよく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収および精
製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを精製に用
いる。該ポリペプチドが単離および／または精製の間に変性する場合、タンパク
質を再生するのによく知られている技法を用いて、再び活性なコンフォメーショ
ンとすることができる。

【００３９】 本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドの診断試薬としての使用に関する
。機能障害に関連する配列番号１、３または５のポリヌクレオチドにより特徴付
けられる遺伝子の変異型の検出は、遺伝子の過少発現、過剰発現または変化した
発現により引き起こされる疾患または疾患に対する感受性の診断に付加すること
ができるかまたは該診断を定義することができる診断手段を提供する。該遺伝子
において変異を有する個体を、種々の技法によりＤＮＡレベルで検出することが
できる。本発明は、また、配列番号１、３または５のものと比べた個体における
ＥＰＲＧ１ポリヌクレオチドの変化の存在または不在を検出する方法であって、
該個体から得られた試料に含まれるＥＰＲＧ１ポリヌクレオチド配列を、各々、
配列番号１、３または５のものと比較する工程を含む方法を意図する。

【００４０】 診断用核酸は、血液、尿、唾液、組織生検または剖検材料などからの対象の細
胞から得られる。ゲノムＤＮＡを検出に直接用いてもよく、または、分析前にＰ
ＣＲもしくは他の増幅技法を用いることにより酵素的に増幅することができる。
ＲＮＡまたはｃＤＮＡもまた同様に用いることができる。正常な遺伝子型と比較
して増幅生成物のサイズの変化により欠失および挿入を検出することができる。
増幅ＤＮＡを標識ＥＰＲＧ１ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることによっ
て点突然変異を同定することができる。ＲＮａｓｅ消化によって、または融解温
度の差異によって、完全に適合した配列をミスマッチ二重鎖と区別することがで
きる。変性剤を用いるかもしくは用いずにゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気
泳動移動度の変化によって、または、直接ＤＮＡ配列決定によって、ＤＮＡ配列
差異もまた検出することができる（例えば、Myers et al., Science (1985) 230
:1242 を参照のこと）。また、ＲＮａｓｅおよびＳ１保護または化学的開裂法な
どのヌクレアーゼ保護アッセイによって特定位置での配列変化を明らかにするこ
ともできる（Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 85:4397-440
1 を参照のこと）。別の実施態様において、ＥＰＲＧ１ヌクレオチド配列または
そのフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例え
ば、遺伝的変異の有効なスクリーニングを行うことができる。アレイ技法は、よ
く知られており、一般的な適応性を有しており、遺伝子発現、遺伝連鎖、および
遺伝的可変性を包含する分子遺伝学における種々の問題と取り組むために用いる
ことができる（例えば、M. Chee et al., Science, Vol. 274, pp. 610-613 (19
96) を参照のこと）。

【００４１】 診断アッセイは、記載した方法によりＥＰＲＧ１遺伝子における変異の検出に
より当該疾患を診断するかまたは当該疾患に対する感受性を判定する方法を提供
する。さらに、かかる疾患は、対象体由来の試料からポリペプチドまたはｍＲＮ
Ａのレベルの異常な減少または増加を判定することを含む方法によって診断する
ことができる。発現の減少または増加は、例えば、核酸増幅、例えば、ＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダ
イゼーション法などのポリヌクレオチドの定量化について当該技術分野でよく知
られている方法のいずれかを用いてＲＮＡレベルで測定することができる。宿主
由来の試料において本発明のポリペプチドのようなタンパク質のレベルを決定す
るのに用いることができるアッセイ技法は、当業者によく知られている。かかる
アッセイ法は、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット
分析法およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。

【００４２】 かくして、別の態様において、本発明は、 （ａ）本発明のポリヌクレオチド、好ましくは、配列番号１、３または５のヌ
クレオチド配列、またはそのフラグメント； （ｂ）（ａ）のものに対して相補的なヌクレオチド配列； （ｃ）本発明のポリペプチド、好ましくは、配列番号２または４のポリペプチ
ド、またはそのフラグメント；または （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体、好ましくは、配列番号２または４
のポリペプチドに対する抗体 を含む診断キットに関する。

【００４３】 いずれものかかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実
質的な成分を含んでいてもよいことが理解されるであろう。かかるキットは、疾
患、特に、とりわけ、貧血症、好中球減少症および血小板減少症を含む血球減少
症（遺伝因子、骨髄抑制性癌化学療法、放射線療法または偶発的照射により引き
起こされるものを含む）；赤血球増加症；癌；代謝性または遺伝性の成長不足；
肥満症；免疫刺激による感染；ワクチン療法のアジュバント増強による感染症ま
たは癌；ＡＩＤＳ；薬剤誘発性貧血症；慢性関節リウマチ、糖尿病、多発性硬化
症のような自己免疫疾患；ならびに喘息およびアレルギーのような炎症性疾患、
または該疾患に対する感受性を診断するのに有用であろう。

【００４４】 本発明のヌクレオチド配列は、また、染色体同定にも役立つ。該配列は、個々
のヒト染色体上の特定の部位を特異的に標的とし、該部位とハイブリダイズする
ことができる。本発明の染色体に関連した配列のマッピングは、これらの配列を
遺伝子関連疾患と関連付けるのに重要な第１段階である。いったん配列を正確な
染色体位置にマッピングすれば、染色体上の配列の物理的位置を遺伝地図データ
と関連付けることができる。かかるデータは、例えば、V. McKusick、Mendelian
Inheritance in Man （ジョンズ・ホプキンズ・ユニバーシティ・ウェルチ・メ
ディカル・ライブラリー（Johns Hopkins University Welch Medical Library）
によりオンラインにて入手可能）において見出される。次いで、連鎖分析（物理
的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同じ染色体領域にマッピングされた遺伝
子と疾患との関係を同定する。

【００４５】 罹患している個体と罹患していない個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の
差異もまた決定することができる。罹患している個体のいくつかまたは全てにお
いて変異が観察されるが、正常な個体においては該変異が観察されない場合、該
変異は、疾患の原因因子である可能性がある。

【００４６】 本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメントまたはそのアナログ、また
はそれらを発現する細胞もまた、本発明のポリペプチドに対して免疫特異的な抗
体を生成するための免疫原として用いることができる。「免疫特異的」なる用語
は、抗体が、本発明のポリペプチドに対する方が先行技術における他の関連ポリ
ペプチドに対するよりも実質的に大きい親和性を有することを意味する。

【００４７】 本発明のポリペプチドに対して生じる抗体は、慣用のプロトコールを用いて、
ポリペプチドまたはエピトープ含有フラグメント、アナログまたは細胞を、動物
、好ましくは、非ヒト動物に投与することにより得ることができる。モノクロー
ナル抗体の調製のためには、連続的な細胞系培養により生成される抗体を提供す
る技法を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and
Milstein, C., Nature (1975) 256:495-497）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ技法（Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72）およびＥ
ＢＶ−ハイブリドーマ技法（Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER
THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985）が挙げられる。

【００４８】 米国特許第4,946,778号に開示されているような一本鎖抗体を生成するための
技法を用いて、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を生成することもでき
る。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を包含する他の生物
を用いてヒト化抗体を発現することもできる。

【００４９】 上記抗体を用いて、該ポリペプチドを発現するクローンを単離もしくは同定す
るか、または、アフィニティークロマトグラフィーにより該ポリペプチドを精製
することができる。

【００５０】 本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、とりわけ、当該疾患を治療する
こともできる。

【００５１】 さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメ
ント、および種々のサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｉ
ｇＥ）の重鎖または軽鎖の定常部の種々の部分を含む遺伝子操作した可溶性融合
タンパク質に関する。免疫グロブリンとしては、ヒトＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１の
重鎖の定常部が好ましく、この場合、融合はヒンジ部で生じる。特定の実施態様
において、血液凝固因子Ｘａを用いて開裂することができる開裂配列を取込むこ
とによりＦｃ部分を簡単に除去することができる。さらにまた、本発明は、遺伝
子操作によるこれらの融合タンパク質の生成方法、ならびに薬物スクリーニング
、診断および治療のためのその使用に関する。本発明のさらなる態様は、また、
かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質
技術の例は、国際特許出願公開WO94/29458およびWO94/22914にて見出すことがで
きる。

【００５２】 本発明の別の態様は、哺乳動物における免疫学的応答の誘発方法であって、該
哺乳動物に抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生成するのに適当な本発明のポ
リペプチドを接種して該動物をとりわけ上記した当該疾患から保護することを含
む方法に関する。さらに、本発明の別の態様は、哺乳動物における免疫学的応答
の誘発方法であって、ポリヌクレオチドの発現を指向するベクターにより本発明
のポリペプチドをデリバリーし、インビボで該ポリペプチドをコードし、抗体を
生じさせるような免疫学的応答を誘発して該動物を疾患から保護することを含む
方法に関する。

【００５３】 本発明のさらなる態様は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含
む、哺乳動物宿主に導入した場合に該哺乳動物において本発明のポリペプチドに
対する免疫学的応答を誘発する免疫学的／ワクチン処方物（組成物）に関する。
該ワクチン処方物は、さらに、適当な担体を含んでもよい。ポリペプチドは、胃
で破壊されうるので、好ましくは、非経口投与される（例えば、皮下注射、筋肉
注射、静脈注射、または皮内注射）。非経口投与に適した処方物は、抗酸化剤、
緩衝剤、静菌剤、および該処方物をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有
してもよい水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに懸濁化剤または増粘剤を含
有していてもよい水性および非水性滅菌懸濁剤を包含する。該処方物は、単位投
与または複数投与用容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル中にて提
供され、使用直前に滅菌液体担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で貯蔵する
ことができる。該ワクチン処方物は、また、水中油系および当該技術分野で知ら
れている他の系のような該処方物の免疫原性を増強するためのアジュバント系を
含んでもよい。投与量は、ワクチンの比活性に依存し、慣用的な実験法により容
易に決定することができる。

【００５４】 本発明のポリペプチドは、多くの生物学的機能に関与しており、該機能には多
くの病態、詳細には上記した当該疾患が包含される。それゆえ、当該ポリペプチ
ドの機能を刺激する化合物または阻害する化合物を同定するためのスクリーニン
グ法を工夫することが望ましい。したがって、さらなる態様において、本発明は
、当該ポリペプチドの機能を刺激する化合物または阻害する化合物を同定するた
めの化合物をスクリーニングする方法を提供する。一般的には、アゴニストまた
はアンタゴニストを上記した当該疾患の治療目的および予防目的に用いてもよい
。種々の源、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリーおよび天然産物の
混合物から化合物を同定できる。そのようにして同定されたかかるアゴニスト、
アンタゴニストまたは阻害物質は、場合によっては当該ポリペプチドの、天然ま
たは修飾基質、リガンド、受容体、酵素などであってもよく、またはそれらの構
造上または機能上の模倣物であってもよい（Coligan et al., Current Protocol
s in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991) を参照のこと）。

【００５５】 スクリーニング法は、単に、候補化合物の、当該ポリペプチドへの、または当
該ポリペプチドを有する細胞もしくは膜またはその融合タンパク質への結合を、
該候補化合物に直接的または間接的に結合した標識により測定するものであって
もよい。別法として、スクリーニング法は標識競争物質との競争を用いるもので
あってもよい。さらに、これらのスクリーニング法は、当該ポリペプチド有する
細胞に適した検出系を用いて、当該ポリペプチドの活性化または阻害により生じ
るシグナルを候補化合物が引き起こすかどうかを試験するものであってもよい。
一般的には、既知アゴニストの存在下で活性化の阻害物質をアッセイし、次いで
、候補化合物の存在による、アゴニストによる活性化に対する効果を観察する。
候補化合物が本質的に活性なポリペプチドの活性化の阻害を引き起こすかどうか
を試験することにより、本質的に活性なポリペプチドを、アゴニストまたは阻害
物質の不在下で反アゴニストまたは反阻害物質を探すスクリーニング法に用いて
もよい。さらに、スクリーニング法は、単に、候補化合物と本発明のポリペプチ
ドを含有する溶液とを混合して混合物を形成し、混合物中のＥＰＲＧ１活性を測
定し、次いで、混合物のＥＰＲＧ１活性を標準と比較する工程を含むことができ
る。上記したＦｃ部分およびＥＰＲＧ１ポリペプチドから調製されるような融合
タンパク質を高処理量スクリーニングアッセイのために用いて本発明のポリペプ
チドのアンタゴニストを同定することもできる（D. Bennett et al., J. Mol. R
ecognition, 8:52-58 (1995)；および K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 2
70(16):9459-9471 (1955) を参照のこと）。

【００５６】 ＳＨ２ドメインとホスホチロシンペプチドとの相関関係は、所定のＳＨ２ドメ
インおよびその特定のペプチド基質に対して非常に特異的である。ＥＬＩＳＡま
たは会合の検出に適当な他の手段を用いてインビトロ高処理量スクリーンを形成
するためにこの複合体の形成を基準として用いることができる。

【００５７】 当該ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および本発明のポリペプチドに対する
抗体を用いて、細胞中のｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの生成に対する添
加化合物の影響を検出するためのスクリーニング方法を組み立ててもよい。例え
ば、当該技術分野において知られている標準的な方法によりモノクローナルおよ
びポリクローナル抗体を用いてポリペプチドの分泌または細胞結合レベルを測定
するためにＥＬＩＳＡアッセイを構築してもよい。これを用いて、適当に操作さ
れた細胞または組織からのポリペプチドの生成を阻害しうる作用剤または促進し
うる作用剤（各々、アンタゴニストまたはアゴニストという）を見いだすことが
できる。

【００５８】 当該技術分野において知られている標準的な受容体結合法によるとしても、当
該ポリペプチドを用いて膜結合または可溶性受容体を同定することができる。こ
れらの方法としては、ポリペプチドを放射性同位体（例えば、^１２５Ｉ）で標識
するか、化学修飾（例えば、ビオチン化）するか、または検出もしくは精製に適
したペプチド配列に融合され、推定上の受容体の源（例えば、細胞、細胞膜、細
胞上清、組織抽出物、体液）とともにインキュベートする、リガンド結合および
架橋アッセイが挙げられるが、それに限られるものではない。他の方法としては
、表面プラスモン共鳴および分光分析法が挙げられる。これらのスクリーニング
方法を用いて、ポリペプチドのその受容体への結合と競争するポリペプチドのア
ゴニストおよびアンタゴニストがあったとしてもそれを同定することができる。
かかるアッセイを行うための標準的方法は当該技術分野においてよく理解されて
いる。

【００５９】 潜在的なポリペプチドアンタゴニストの例としては、抗体、または、ある場合
には、場合によっては該ポリペプチドの、リガンド、基質、受容体、酵素などに
密接に関係するオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えば、該リガンド、基
質、受容体、酵素などのフラグメント；または、本発明のポリペプチドに結合す
るが応答を誘発せず、その結果、ポリペプチドの活性を阻害することとなる小分
子が挙げられる。

【００６０】 アンタゴニストの定義には、配列番号６および７の配列を含むアンチセンスオ
リゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が包含される。 （アンチセンス） gaCCATGGCGCACGGAGccA （配列番号６） （アンチセンス） gcTGTGGGTGACCATGGcgC （配列番号７） 小文字のヌクレオチド塩基は、３'−ホスホロチオエート結合を示している。

【００６１】 かくして、別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドに対するアゴ
ニスト、アンタゴニスト、リガンド、受容体、基質、酵素など；またはかかるポ
リペプチドの生成を低下させるかまたは増強する化合物を同定するためのスクリ
ーニングキットであって、 （ａ）本発明のポリペプチド； （ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞； （ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または （ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体 を含み、該ポリペプチドが好ましくは配列番号２または４のものであるキットに
関する。 いずれものかかるキットにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実
質的な成分を含んでいてもよいことが理解されるであろう。

【００６２】 また、 （ａ）まず第１に、該ポリペプチドの三次元構造を決定すること； （ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質の反応部位または結合部位
と考えられる部位について三次元構造を推定すること； （ｃ）推定された結合部位または反応部位と結合または反応すると予想される
候補化合物を合成すること；および （ｄ）候補化合物が、実際に、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質で
あるか否かを試験すること により、該ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質の構造に
基づく設計のための方法においても本発明のポリペプチドを用いることができる
ことは、当業者に容易に理解されるであろう。さらに、これは、通常、相互に作
用するプロセスであることが理解されるであろう。

【００６３】 さらなる態様において、本発明は、ＥＰＲＧ１ポリペプチド活性の過剰発現ま
たは過少発現のいずれかに関係する、例えば、貧血症、好中球減少症および血小
板減少症を含む血球減少症（遺伝因子、骨髄抑制性癌化学療法、放射線療法また
は偶発的照射により引き起こされるものを含む）；赤血球増加症；癌；代謝性ま
たは遺伝性の成長不足；肥満症；免疫刺激による感染；ワクチン療法のアジュバ
ント増強による感染症または癌；ＡＩＤＳ；薬剤誘発性貧血症；慢性関節リウマ
チ、糖尿病、多発性硬化症のような自己免疫疾患；ならびに喘息およびアレルギ
ーのような炎症性疾患などの異常な状態の治療または予防方法を提供する。

【００６４】 ポリペプチドの活性が過剰である場合、いくつかの方法を用いることができる
。一の方法は、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの結合をブロックす
ることまたは二次的シグナルを阻害することなどによりポリペプチドの機能を阻
害するのに有効な量の上記阻害化合物（アンタゴニスト）を、所望により、医薬
上許容される担体とともに、処置を必要とする対象体に投与し、そのことにより
異常な症状を軽減することを含む。もう１つの方法において、やはり内在性ポリ
ペプチドと競争してリガンド、基質、酵素、受容体などと結合する能力を有する
可溶性形態のポリペプチドを投与してもよい。かかる競争物質の典型例としては
、ＥＰＲＧ１ポリペプチドのフラグメントが挙げられる。

【００６５】 さらにもう１つの方法において、発現ブロッキング法を用いて内在性ＥＰＲＧ
１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害することができる。かかる既知
方法の例は、体内で生じるかまたは別個に投与される、配列番号６または７の配
列を含むアンチセンス配列のようなアンチセンス配列の使用を包含する（例えば
、Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC
Press, Boca Raton, FL (1988) 中の O'Connor, J. Neurochem (1991) 56:560
を参照のこと）。別法として、遺伝子療法に基づく方法を用いて、インビボで、
直接、アンチセンスメッセージの生成のために発現カセットをデリバリーするこ
とができる。該アンチセンスメッセージは、大きさおよび位置により有効性を最
適化することができ、人工オリゴヌクレオチドに付随する毒性問題を回避するこ
とができる。さらに別の方法において、遺伝子とともに三重らせんを形成するオ
リゴヌクレオチドを提供することができる（例えば、Lee et al., Nucleic Acid
s Res (1979) 6:3073；Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al
., Science (1991) 251:1360 を参照のこと）。これらのオリゴマーをそれ自体
投与することができるか、または関連するオリゴマーをインビボで発現させるこ
ともできる。

【００６６】 ＥＰＲＧ１は、フィードバック阻害物質として作用する負の調節因子である。
ＥＰＲＧ１機能の阻害は、造血細胞の増殖および分化を増強する。結果として、
幹細胞動員プロトコール後の骨髄、臍帯血または血液由来の造血前駆細胞／幹細
胞のエキソビボ処理は、造血回復の有効性を改善すると考えられる。処理は、阻
害物質（例えば、オリゴヌクレオチド）摂取が生じ得る条件下、一定の期間、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のようなＥＰＲＧ１に対して特異的な
阻害物質を造血細胞と一緒にインキュベートすることからなる。ＥＰＲＧ−１阻
害物質処理した造血細胞を、幹細胞移植を必要としている患者に直接移植するこ
とができるか、または、移植前に前駆細胞／幹細胞の数を増加させるために１種
類またはそれ以上の造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ
−１１、ＩＬ−３、ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ（ポリエチレングリコール結合組換
えヒト巨核球成長および発達因子）、ＦＬＴ−３、ＮＥＳＰ（新規赤血球形成刺
激タンパク質）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ ＳＤなど）を含有する増殖培地中でエキソ
ビボで培養することができる。上記について、該阻害物質の一の特定の予想され
る使用は、血球減少症の治療のためのインビボ投与である。該血球減少症症状は
、遺伝的であってもよく、または、骨髄抑制性癌化学療法、放射線療法または偶
発的照射によるものであってもよい。ＥＰＲＧ−１の阻害物質のインビボ投与は
、単独で、または最適にはサイトカイン療法（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＥＧ−ｒ
ＨｕＭＧＤＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ−１１、ＩＬ−３、ＦＬＴ−３、ＮＥＳＰ
、ＮＥＵＰＯＧＥＮ ＳＤなど）と併用して有効である。

【００６７】 一の好ましい態様において、本発明は、ＥＰＲＧ１アンチセンスオリゴヌクレ
オチドに関する。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、好ましくは
、ＳＯＣＳ−３ ｍＲＮＡと有効にハイブリダイズしてＳＯＣＳ−３タンパク質
生成を阻害するヌクレオチド配列を含む化学的に合成されたホスホロチオエート
結合オリゴヌクレオチド；およびヌクレアーゼ抵抗性を与えるように行われた他
の骨格修飾を有するＳＯＣＳ−３ ｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる
いずれもの他のオリゴヌクレオチドが挙げられる。かかる化学的に合成されたホ
スホロチオエート結合オリゴヌクレオチドの例は、配列番号６または７の配列を
含む配列である。

【００６８】 他の好ましい態様において、本発明は、ヒト造血前駆細胞／幹細胞をＥＰＲＧ
１の阻害物質で処理することにより造血幹細胞移植の有効性および移植を増強す
る方法であって、 （ａ）ＥＰＲＧ１阻害物質と造血前駆細胞および幹細胞を含む溶液とをエキソ
ビボで混合し、次いで、移植を必要とする患者に造血細胞を移植すること；また
は （ｂ）ＥＰＲＧ１阻害物質とエキソビボ幹細胞増殖培養系中に造血細胞を含む
溶液とを混合し、次いで、該患者に造血細胞を移植すること；または （ｃ）造血幹細胞移植のまたは血球減少症（例えば、化学療法誘発性の好中球
減少症、貧血症、血小板減少症）の治療の間の補助剤としてインビボでＥＰＲＧ
１阻害物質を投与すること を含む方法に関する。好ましいＥＰＲＧ１阻害物質は、アンチセンスオリゴヌク
レオチド、特に、配列番号６または７の配列を含む配列である。

【００６９】 別の態様において、本発明は、造血幹細胞への遺伝子療法トランスファーの効
力を増強する方法であって、（ａ）造血幹細胞または修飾幹細胞系を単離するこ
と、および遺伝病の治療（例えば、ＡＤＡ欠損症遺伝子療法）に有用な目的の矯
正遺伝子を含むプラスミドベクターでトランスフェクトする前にＥＰＲＧ１阻害
物質と一緒にインキュベートすることを含む方法に関する。好ましいＥＰＲＧ１
阻害物質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、配列番号６または７の配
列を含む配列である。

【００７０】 ＥＰＲＧ１およびその活性の過少発現に関する異常な症状を治療するために、
いくつかの方法を用いることができる。一の方法は、治療上有効量の、本発明の
ポリペプチドを活性化する化合物（すなわち、上記アゴニスト）を、医薬上許容
される担体とともに、対象体に投与し、そのことにより異常な症状を軽減するこ
とを含む。別法として、遺伝子療法を用いて、対象体において関連する細胞によ
るＥＰＲＧ１の内在生産を行うことができる。例えば、本発明のポリヌクレオチ
ドを、上記で検討したように、複製欠損レトロウイルスベクターにおける発現の
ために遺伝子操作することができる。次いで、レトロウイルス発現構築物を単離
し、本発明のポリペプチドをコードするレトロウイルスプラスミドベクター含有
ＲＮＡで形質導入されたパッケージング細胞に導入し、その結果、パッケージン
グ細胞は、すぐに目的の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を生成する。これ
らのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を遺伝子操作するために、およびイ
ンビボでポリペプチドを発現させるために、対象体に投与できる。遺伝子療法の
概観については、Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS
Scientific Publishers Ltd (1996) 中の Chapter 20, Gene Therapy and other
Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches （そこに引用されている文
献）を参照のこと。別の方法は、治療上有効量の本発明のポリペプチドを適当な
医薬担体と合わせて投与することである。

【００７１】 別の態様において、本発明は、治療上有効量の、ポリペプチド（例えば、本発
明の可溶性形態のポリペプチド）、アゴニスト／アンタゴニストペプチドまたは
小分子化合物を医薬上許容される担体または賦形剤と合わせて含む医薬組成物を
提供する。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース
、水、グリセロール、エタノール、およびそれらを組み合わせたものが挙げられ
るが、これらに限定されるものではない。本発明は、また、上記した本発明の組
成物の１種類またはそれ以上の成分を充填した１つまたはそれ以上の容器を含む
医薬用パック剤およびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物
は、単独で用いても、または、治療用化合物のような他の化合物と併用してもよ
い。

【００７２】 当該組成物は、例えば、全身経路または経口経路によるような投与経路に適合
させる。好ましい全身投与剤形としては、注射、典型的には、静脈注射による注
射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いること
ができる。別の全身投与法としては、胆汁酸塩もしくはフシジン酸のような浸透
剤または他の界面活性剤を用いる経粘膜投与および経皮投与が挙げられる。さら
に、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を腸溶剤またはカプセル剤に処方す
ることができる場合、経口投与もまた可能である。これらの化合物の投与は、ま
た、軟膏剤、パスタ剤、ゲル剤などの形態で、局所的および／または局在的であ
ってもよい。

【００７３】 必要な投与範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物の選択、投与経路、処
方物の性質、対象体の状態の性質、および主治医の判断に依存する。しかしなが
ら、適当な投与量は、対象体の体重１ｋｇ当たり０.１〜１００μｇの範囲であ
る。しかしながら、必要な投与量の広範囲に及ぶ変化量は、入手可能な化合物の
多様性および種々の投与経路の異なる効力の点から予想される。例えば、経口投
与は、静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想されるであろう
。これらの投与量における変化量は、当該技術分野においてよく理解されている
ように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて調節することができる
。

【００７４】 治療に用いるポリペプチドは、また、しばしば上記した「遺伝子療法」と称さ
れる治療様式で、対象体において内在的に得ることができる。かくして、例えば
、対象体からの細胞を、ポリペプチドをエキソビボでコードするためにＤＮＡま
たはＲＮＡのようなポリヌクレオチドを用いて、および、例えば、レトロウイル
スプラスミドベクターの使用により、遺伝子操作することができる。次いで、該
細胞を該対象体に導入する。

【００７５】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、同様のホモロジーを有するさら
なる配列を同定するために役立つ情報源を形成する。これは、コンピューター判
読可能な媒体中に該配列を保存し、次いで、保存したデータを用い、ＧＣＧのよ
うなよく知られている検索ツールを用いて配列データベースを検索することによ
り、最も簡単に促進される。したがって、さらなる態様において、本発明は、配
列番号１、３または５の配列を含むポリヌクレオチドおよび／またはそれにより
コードされるポリペプチド配列を保存しているコンピューター判読可能媒体を提
供する。

【００７６】 上記でよく用いたある種の用語の理解を容易にするために以下の定義を提供す
る。

【００７７】 本明細書で用いる場合、「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナ
ル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を包含するＦａｂフラグメントを包含する。

【００７８】 「単離」とは、「人間の手により」自然の状態から改変されたことを意味する
。「単離」された組成物または物質が天然において生じる場合、その最初の環境
から変えられているかもしくは取り除かれているか、またはその両方である。例
えば、生きている動物中に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド
は「単離」されていないが、その自然の状態の共存する物質から分取された同ポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離」されており、本明細書ではこの用
語を用いるものである。

【００７９】 「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドをいい、それは未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾Ｒ
ＮＡもしくはＤＮＡであってよい。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本
鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本
鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、一本鎖も
しくはより典型的には二本鎖、または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であっ
てもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定
されるものではない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ
またはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む三本鎖領域をいう。「ポリヌクレオチド」
なる語はまた、１つまたはそれ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲ
ＮＡ、および安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮ
Ａを包含する。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化された塩基およびイ
ノシンのような通常でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに
対してなされ得る；かくして、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然におい
て見いだされるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾さ
れた形態、ならびにウイルスおよび細胞の特性を示すＤＮＡおよびＲＮＡの化学
的形態を包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチ
ドと称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。

【００８０】 「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によりお互いに結
合している２個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質、す
なわち、ペプチドアイソスターをいう。「ポリペプチド」は、通常、ペプチド、
オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖と、一般に、タンパク質と称さ
れる長鎖との両方をいう。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされている２０
種のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。「ポリペプチド」は、翻訳後プ
ロセシングのような自然のプロセス、または当該技術分野においてよく知られて
いる化学的修飾技法のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列を包含する。かか
る修飾は、膨大な研究文献においてのみならず、基本テキストおよびさらに詳細
な研究論文にて詳しく記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖お
よびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのどこででも起こり得
る。同一の型の修飾が所定のポリペプチドの幾つかの部位で、同一または異なる
程度に存在し得ることは理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くの種類
の修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドはユビキチネーションの結果として分
岐していてもよく、それらは、分岐しているかまたはしていない、環状であって
もよい。環状の、分岐のおよび分岐した環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロ
セスにより生じたものであってもよく、または合成法により調製されたものであ
ってもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミ
ド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオ
チド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシ
トールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル、共有架橋形
成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル
化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミ
リストイル化、酸化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、
ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質
へのトランスファー−ＲＮＡ媒介付加、ならびにユビキチネーションが挙げられ
る（例えば、PROTEINS‐STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E.
Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, (1993)；POSTTRANSLATION
AL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press
, New York, 1983 中の Wold, F., Post-translational Protein Modifications
: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12；Seifter et al.,“Analysis for p
rotein modifications and nonprotein cofactors”, Meth Enzymol (1990) 182
:626-646および Rattan et al.,“Protein Synthesis: Post-translational Mod
ifications and Aging”, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 を参照のこと）
。

【００８１】 「変種」なる語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、
本質的な特性を保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを表す。典
型的なポリヌクレオチドの変種は、ヌクレオチド配列が別の対照ポリヌクレオチ
ドとは異なる。変種のヌクレオチド配列における変化は、対照ポリヌクレオチド
によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列と変わっていてもよく、または
変わっていなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、以下に記載するように、対照
配列によりコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸置換、付加、欠失、融合
および末端切断をもたらしうる。典型的なポリペプチドの変種はアミノ酸配列が
別の対照ポリペプチドとは異なる。一般に、差異は、対照ポリペプチドおよび変
種の配列が、全体的に極めて類似しており、多くの領域で同一であるように制限
される。変種および対照ポリペプチドは、アミノ酸配列が１またはそれ以上の置
換、付加、欠失のいずれかの組み合わせにより異なっていてもよい。置換または
挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によりコードされたものであってもよく、
またはそうでなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変種は、対
立遺伝子変種のような自然発生のものであってもよく、または自然に発生するこ
とが知られていない変種であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
の非自然発生変種は、変異誘発技術により、または直接的合成により調製できる
。

【００８２】 「同一性」は、当該技術分野にて知られているように、場合によっては２つも
しくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオ
チド配列を比較することにより決定される、その配列間の関係である。当該技術
分野において、「同一性」はまた、場合によっては一連のかかる配列の鎖間の対
合により決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性
の程度を意味する。「同一性」は、以下の文献に記載されている方法を包含する
がそれらに限定されない公知方法により容易に計算することができる（Computat
ional Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New Y
ork, 1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., e
d., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data,
Part I, Griffin, A.M. および Griffin, H.G.., eds., Humana Press, New Jer
sey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje, G., Acade
mic Press, 1987；および Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Dever
eux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；および Carillo, H. and
Lipman, D., SIAM J.Applied Math., 48: 1073 (1988)）。同一性を決定する方
法は、試験される配列間で最大の対合が得られるように設計される。さらにまた
、同一性を決定する方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムに集成さ
れている。２つの配列間の同一性を判定するためのコンピュータープログラム法
としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acid
s Research 12(1): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴ
Ａ（Atschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403−410 (1990)）が挙げら
れるが、それらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣ
ＢＩおよび他の供給源（BLAST Manual，Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH B
ethesda，MD 20894；Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403−410 (19
90)）から公に利用可能である。周知のスミス・ウォーターマン・アルゴリズム
（Smith Waterman algorithm）を用いて同一性を決定してもよい。

【００８３】 ポリペプチド配列比較のためのパラメーターは以下のものを包含する： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (197
0) 比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
89: 10915-10919 (1992) からのＢＬＯＳＳＵＭ６２ ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターに関して有用なプログラムは、ウィスコンシン州マディ
ソンのジェネティクス・コンピューター・グループ（Genetics Computer Group
）から「ギャップ」プログラムとして公に利用可能である。上記パラメーターは
、ペプチド比較のためのデフォールトパラメーターである（エンドギャップにつ
いてペナルティーを伴わない）。

【００８４】 ポリヌクレオチド比較のためのパラメーターは以下のものを包含する： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (197
0) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ ウィスコンシン州マディソンのジェネティクス・コンピューター・グループか
らの「ギャップ」プログラムが利用可能である。これらは核酸比較のためのデフ
ォールトパラメーターである。

【００８５】 ポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての「同一性」に関する好ましい
意味は、場合によっては、下記（１）および（２）にて示される。

【００８６】 （１）さらに、ポリヌクレオチドの具体例は、配列番号１の対照配列に対して
少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の
同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを包含し、該
ポリヌクレオチド配列は、配列番号１の対照配列と同一であってもよく、または
対照配列と比較してある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい
。かかる変化は、少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジション
およびトランスバージョンを包含）または挿入からなる群より選択され、該変化
は、対照ヌクレオチド配列の５'もしくは３'末端の位置、またはこれら末端位置
の間の位置において、対照配列中のヌクレオチドにおいて個々に散在して、また
は対照配列中の１もしくはそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号
１中の全ヌクレオチド数に同一性パーセントを示す整数を１００で割った値をか
けて、その積を配列番号１中の全ヌクレオチド数から差し引くことによりヌクレ
オチド変化数を決定する。あるいはこのことは下式により説明される： ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ） 式中、ｎ_nは、ヌクレオチド変化の数であり、ｘ_nは、配列番号１中の全ヌクレオ
チド数であり、ｙは、５０％については０.５０、６０％については０.６０、７
０％については０.７０、８０％については０.８０、８５％については０.８５
、９０％については０.９０、９５％については０.９５、９７％については０.
９７、または１００％については１.００であり、・は、乗法演算についての記
号であり、ここで、ｘ_nとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数と
した後、ｘ_nから差し引く。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列の変化は、このコード配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレーム
シフト変異をもたらす可能性があり、それにより、かかる変化の後のポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドも変化する。

【００８７】 例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号２の対照配列と同一であ
ってもよく、すなわち、１００％同一であってもよく、または対照配列と比較し
てある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性パ
ーセントは１００％未満の同一性である）。かかる変化は、少なくとも１個の核
酸の欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを包含）または挿入
からなる群より選択され、該変化は対照ポリヌクレオチド配列の５'もしくは３'
末端の位置またはこれら末端位置の間の位置において、対照配列中のヌクレオチ
ドにおいて個々に散在して、または対照配列中の１またはそれ以上の連続した群
として生じてもよい。配列番号２中の全アミノ酸数に同一性パーセントを示す整
数を１００で割った値をかけて、その積を配列番号２中の全アミノ酸数から差し
引くことにより所定の同一性パーセントについての核酸変化数を決定する。ある
いはこのことは下式により説明される： ｎ_n≦ｘ_n−（ｘ_n・ｙ） 式中、ｎ_nは、アミノ酸変化の数であり、ｘ_nは、配列番号２中の全アミノ酸数で
あり、ｙは、例えば、７０％については０.７０、８０％については０.８０、８
５％について０.８５であり、・は、乗法演算の記号であり、ここで、ｘ_nとｙと
の整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_nから差し引く。

【００８８】 （２）さらに、ポリペプチドの具体例は、配列番号２のポリペプチド対照配列
に対して少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１
００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む単離ポリペプチドを包含し、該
ポリペプチド配列は、配列番号２の対照配列と同一であってもよく、または対照
配列と比較してある程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい。かかる
変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置
換を包含）または挿入からなる群より選択され、該変化は、対照ポリペプチド配
列のアミノ−もしくはカルボキシ−末端の位置、またはこれら末端位置の間の位
置において、対照配列中のアミノ酸において個々に散在して、または対照配列中
の１もしくはそれ以上の連続した群として生じてもよい。配列番号２中の全アミ
ノ酸数に同一性パーセントを示す整数を１００で割った値をかけて、その積を配
列番号２中の全アミノ酸数から差し引くことによりアミノ酸変化数を決定する。
あるいはこのことは下式により説明される： ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ） 式中、ｎ_aは、アミノ酸変化の数であり、ｘ_aは、配列番号２中の全アミノ酸数で
あり、ｙは、５０％については０.５０、６０％については０.６０、７０％につ
いては０.７０、８０％については０.８０、８５％については０.８５、９０％
については０.９０、９５％については０.９５、９７％については０.９７、ま
たは１００％については１.００であり、・は、乗法演算についての記号であり
、ここで、ｘ_aとｙとの整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、
ｘ_aから差し引く。

【００８９】 例えば、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２の対照配列と同一であって
もよく、すなわち、１００％同一であってもよく、または対照配列と比較してあ
る程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性パーセ
ントは１００％未満の同一性である）。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ
酸の欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を包含）または挿入からなる群
より選択され、該変化は対照ポリペプチド配列のアミノ−もしくはカルボキシ−
末端の位置またはこれら末端位置の間の位置において、対照配列中のアミノ酸に
おいて個々に散在して、または対照配列中の１またはそれ以上の連続した群とし
て生じてもよい。配列番号２中の全アミノ酸数に同一性パーセントを示す整数を
１００で割った値をかけて、その積を配列番号２中の全アミノ酸数から差し引く
ことにより所定の同一性パーセントについてのアミノ酸変化数を決定する。ある
いはこのことは下式により説明される： ｎ_a≦ｘ_a−（ｘ_a・ｙ） 式中、ｎ_aは、アミノ酸変化の数であり、ｘ_aは、配列番号２中の全アミノ酸数で
あり、ｙは、例えば、７０％については０.７０、８０％については０.８０、８
５％について０.８５であり、・は、乗法演算の記号であり、ここで、ｘ_aとｙと
の整数でない積は切り捨てにより最も近い整数とした後、ｘ_aから差し引く。

【００９０】 「融合タンパク質」は、２種の、しばしば無関係の融合遺伝子またはそのフラ
グメントによりコードされたタンパク質をいう。一例において、EP-A-0 464には
、免疫グロブリン分子の定常部の種々の部分を別のヒトタンパク質またはその一
部と一緒に含む融合タンパク質が開示されている。多くの場合、免疫グロブリン
Ｆｃ部分を融合タンパク質の一部分として用いることは、治療および診断におけ
る使用に有利であり、例えば、改善された薬物動態学的特性が得られる［例えば
、EP-A 0232 262 を参照のこと］。他方、いくつかの用途には、融合タンパク質
が発現、検出および精製された後、Ｆｃ部分を欠失できることが望ましいであろ
う。

【００９１】 本明細書にて引用した特許および特許出願を包含するがこれらに限定されない
全ての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別
的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典
明示により本明細書の一部とする。

【００９２】 実施例１ ＵＴ７−ＥＰＯ細胞のノーザンブロット上で、ＥＰＲＧ１が単一の２.４ｋｂ
メッセージとして観察される。１０％ＦＢＳおよびｒｈ−ＥＰＯで補足した培地
中で増殖している対数期細胞において低いレベルでＥＰＲＧ１を検出することが
できる。一夜、ＥＰＯについて飢餓状態にすると、メッセージレベルは、検出不
可能なレベルに低下する。ＥＰＲＧ１は、ＥＰＯ刺激により迅速に誘発され、１
／２時間で容易に検出可能になり、約１時間で最大レベルに達する。細胞がＥＰ
ＯだけでなくＦＢＳについても飢餓状態にされた場合は、多少高いレベルが得ら
れる。次いで、ＥＰＲＧ１の発現は減少するが、少なくとも６時間は依然として
上昇したままである。

【００９３】 たとえタンパク質合成阻害物質であるシクロヘキシミドを単独で添加した場合
にＥＰＲＧ１の誘発がなくても、ＥＰＲＧ１は、シクロヘキシミドの存在下でＥ
ＰＯによって誘発される。ＥＰＯ＋シクロヘキシミドでの処理は、ＥＰＲＧ１メ
ッセージレベルをＥＰＯ単独で得られるものよりもわずかに多く誘発させる。Ｅ
ＰＲＧ１は、また、ヒト巨核芽球性白血病細胞系であるＭＯ７ｅおよびＣＭＫに
おいてＴＰＯによっても誘発され、シクロヘキシミドの存在下で刺激された場合
にはさらに誘発される。これらの観察結果は、ＥＰＲＧ１がＥＰＯおよびＴＰＯ
一次応答遺伝子であり、その発現の誘発が新しいタンパク質合成に依存しないこ
とを示している。したがって、ＥＰＲＧ１発現の誘発は、ＥＰＯおよびＴＰＯに
よるシグナル伝達経路の直接活性化により生じるはずである。

【００９４】 ヒト骨髄において、ＥＰＲＧ１は、また、ノーザンブロット上で単一の２.４
ｋｂメッセージとして発現される。それは、ＥＰＯでの処理によりインビトロ培
養中で誘発されるが、発現は、Ｇ−ＣＳＦでの刺激により非常により強く誘発さ
れる。ＥＰＲＧ１の上昇した発現は、少なくとも７日間、培養中で該細胞により
持続され、これは、ＥＰＲＧ１がおそらく種々の造血系列の発生および成熟にお
いて重要な機能を果たすことを示している。

【００９５】 ＥＰＲＧ１の発現は、他の組織由来のＲＮＡを用いてノーザンブロットをプロ
ーブすることにより見出された。骨髄、胎児肝臓、末梢血白血球および肺を包含
する造血関連組織において最高レベルが生じる。ＥＰＲＧ１は、また、脾臓およ
び胸腺においてより低い程度に発現される。

【００９６】 ＲＮＡ転写体（配列番号３のヌクレオチド＃４７５−２１１１）の３'−ＵＴ
Ｒセグメントは、３'−ＵＴＲが遺伝子に固有であり、配列特異的であるので、
診断目的に有用である。さらに、３'−ＵＴＲは、ＲＮＡ安定性および代謝回転
率を調節する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイの開発において役立
つ。該メッセージの定常状態レベルの低下は、細胞における翻訳タンパク質の量
を減少させ、タンパク質の作用をアンタゴナイズする。ＳＯＣＳファミリーのメ
ンバーは、増殖因子シグナル伝達の負の調節因子であるので、ＳＯＣＳアンタゴ
ニストは、増殖因子のアゴニストとして機能する。この結果を達成する一の方法
は、ＥＰＲＧ１メッセージを減少または除去するためのアンチセンス技法による
。ＲＮＡ安定性の決定因子はしばしば３'−ＵＴＲ配列に関連しているので、第
二の手段は、ＥＰＲＧ１メッセージの代謝回転を支配する細胞メカニズムを調節
することを含む。

【００９７】 実施例２ ＥＰＲＧ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用性を以下の実施例により例
示する。無血清培地中でのヒト骨髄細胞と配列番号６および配列番号７のアンチ
センス配向オリゴヌクレオチドとの（配列番号８のセンス配向オリゴヌクレオチ
ドと一緒ではない）数時間のインキュベーションは、コロニー刺激因子の最適お
よび最適下濃度に骨髄前駆細胞／幹細胞の応答性を増強させる。例えば、１０ｎ
ｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦの添加は、約４０コロニー／ウェル（５０,０００骨髄細
胞／ウェル）を生じる。配列番号８のＥＰＲＧ１センスオリゴヌクレオチドと一
緒にインキュベートした骨髄細胞は、平均約４１コロニー／ウェルを生じた。対
照的に、配列番号７のＥＰＲＧ１アンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒にイン
キュベートした骨髄細胞は、平均約６１コロニー／ウェルを生じた。 配列番号６： gaCCATGGCGCACGGAGccA 配列番号７： gcTGTGGGTGACCATGGcgC 配列番号８： ccGTGCGCCATGGTCACccA 小文字のヌクレオチド塩基は、３'−ホスホロチオエート結合を示す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/04 ４Ｃ０８４ 48/00 3/10 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 3/04 5/00 ４Ｃ０８６ 3/10 7/06 ４Ｈ０４５ 5/00 11/06 7/06 25/00 11/06 29/00 25/00 １０１ 29/00 31/00 １０１ 31/18 31/00 35/00 31/18 37/02 35/00 37/08 37/02 43/00 １０７ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０７ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ケネス・エイ・ロード アメリカ合衆国19426ペンシルベニア州カ レッジビル、レジナルド・レイン488番 (72)発明者 アンドリュー・ジー・キング アメリカ合衆国19422ペンシルベニア州ブ ルー・ベル、シルバン・ドライブ1649番 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 BA11 BB50 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 EA04 GA11 HA12 4B063 QA01 QA12 QA17 QA18 QA19 QQ20 QQ43 QR55 QR59 QR62 QR80 QS24 QS25 QS28 QS34 4B064 AG01 AG27 AG31 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZA012 ZA552 ZA592 ZA702 ZA962 ZB072 ZB112 ZB132 ZB152 ZB222 ZB262 ZB322 ZC022 ZC352 ZC552 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA55 ZA59 ZA70 ZA96 ZB07 ZB11 ZB13 ZB15 ZB22 ZB26 ZB32 ZC02 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 EA24 EA50 FA71 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ｉ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配
   列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有する群から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド； （ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド；または （ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列である単離ポリペプチド よりなる群から選択される単離ポリペプチド。
2. 【請求項２】 （ｉ）配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配
   列に対して少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチ
   ド； （ｉｉ）配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して全
   長にわたって少なくとも （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するヌクレオチド配列を含む単離ヌクレオチド； （ｉｉｉ）配列番号３の全長にわたって配列番号３ののものに対して少なくと
   も （ａ）７０％の同一性； （ｂ）８０％の同一性； （ｃ）９０％の同一性；または （ｄ）９５％の同一性 を有するヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｉｖ）配列番号４のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離
   ポリヌクレオチド； （ｖｉ）配列番号３のポリヌクレオチドである単離ポリヌクレオチド；または （ｖｉ）配列番号３の配列またはそのフラグメントを有する標識プローブを用
   いてストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で適当なライブラリーをス
   クリーニングすることにより得ることができる単離ポリヌクレオチド；または 該単離ポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列 よりなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 請求項１記載のポリペプチドに対して免疫特異的な抗体。
4. 【請求項４】 （ｉ）請求項１記載のポリペプチドの活性または発現の増強
   を必要とする対象の治療法であって、 （ａ）治療上有効量の、該ポリペプチドに対するアゴニストを該対象に投与
   すること；および／または （ｂ）インビボにおいて該ポリペプチド活性の生成をもたらすような形態で
   該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを該
   対象に投与すること を含む方法；または （ｉｉ）請求項１記載のポリペプチドの活性または発現の阻害を必要とする対
   象の治療法であって、 （ａ）治療上有効量の、該ポリペプチドに対するアンタゴニストを該対象に
   投与すること；および／または （ｂ）該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を阻害する核酸
   分子を該対象に投与すること；および／または （ｃ）治療上有効量の、該ポリペプチドとそのリガンド、基質または受容体
   について競争するポリペプチドを該対象に投与すること を含む方法。
5. 【請求項５】 対象における請求項１記載のポリペプチドの発現または活性
   に関連した該対象における疾患または疾患に対する感受性を診断する方法であっ
   て、 （ａ）該対象のゲノム中の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にお
   ける変異の存在または不在を調べること；および／または （ｂ）該対象由来の試料中の該ポリペプチド発現の存在または量を分析するこ
   と を含む方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載のポリペプチドの機能を刺激または阻害する化
   合物を同定するためのスクリーニング方法であって、 （ａ）候補化合物に直接または間接的に結合した標識を用いることによって該
   ポリペプチド（または該ポリペプチドを有する細胞もしくは膜）またはその融合
   タンパク質への候補化合物の結合を測定すること； （ｂ）標識された競争物質の存在下において該ポリペプチド（または該ポリペ
   プチドを有する細胞もしくは膜）またはその融合タンパク質への候補化合物の結
   合を測定すること； （ｃ）該ポリペプチドを有する細胞または細胞膜に適した検出系を用いて、該
   ポリペプチドの活性化または阻害により発生するシグナルを候補化合物が発生さ
   せるか否かを調べること； （ｄ）請求項１のポリペプチドを含有する溶液と候補化合物とを混合して混合
   物を得、該混合物中の該ポリペプチドの活性を測定し、該混合物の活性を標準と
   比較すること；または （ｅ）例えばＥＬＩＳＡアッセイを用いて、細胞中の該ポリペプチドをコード
   するｍＲＮＡおよび該ポリペプチドの生成に対する候補化合物の影響を検出する
   こと からなる群から選択される方法を含む方法。
7. 【請求項７】 請求項１記載のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニ
   スト。
8. 【請求項８】 適合する宿主細胞中に存在する場合に請求項１記載のポリペ
   プチドを生成しうるポリヌクレオチドを含む発現系。
9. 【請求項９】 組換え宿主細胞の生成方法であって、該宿主細胞が適当な培
   養条件下で配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列に対して少な
   くとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成するよう
   に請求項８記載の発現系で細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを含
   む方法。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の方法により生成された組換え宿主細胞。
11. 【請求項１１】 配列番号４の全長にわたって配列番号４のアミノ酸配列に
    対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを発
    現する請求項１０記載の組換え宿主細胞の膜。
12. 【請求項１２】 ポリペプチドを生成するのに十分な条件下にて請求項１０
    記載の宿主細胞を培養し、該培養物から該ポリペプチドを回収することを含むポ
    リペプチドの生成方法。
13. 【請求項１３】 （ａ）配列番号５の全長にわたって配列番号５に対して少
    なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％の同一性を有するヌクレオチ
    ド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号５のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号５のポリヌクレオチド；または （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドに対して相補的なポリ
    ヌクレオチド からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
14. 【請求項１４】 （ａ）配列番号１の全長にわたって配列番号１に対して少
    なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％の同一性を有するヌクレオチ
    ド配列を含む単離ポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号１のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号１のポリヌクレオチド；または （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチドに対して相補的なポリ
    ヌクレオチド からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 血球減少症の治療方法であって、かかる治療を必要とする
    患者に有効量のＥＰＲＧ１阻害物質を投与することを含む方法。
16. 【請求項１６】 さらにサイトカインを共投与することを含む請求項１６記
    載の方法。
17. 【請求項１７】 サイトカインがＧ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＩＬ−１１
    、ＩＬ−３、ＰＥＧ−ｒＨｕＭＧＤＦ、ＦＬＴ−３、ＮＥＳＰまたはＮＥＵＰＯ
    ＧＥＮ ＳＤである請求項１７記載の方法。
18. 【請求項１８】 配列番号６または７の配列を含むＡＳＯである請求項１６
    のＥＰＲＧ１阻害物質。
19. 【請求項１９】 ヒト造血前駆細胞／幹細胞をＥＰＲＧ１の阻害物質で処理
    することにより造血幹細胞移植の有効性および移植を増強する方法であって、 （ａ）ＥＰＲＧ１阻害物質と造血前駆細胞および幹細胞を含む溶液とをエキソ
    ビボで混合し、次いで、かかる移植を必要とする患者に造血細胞を移植すること
    ；または （ｂ）エキソビボ幹細胞増殖培養系にてＥＰＲＧ１阻害物質と造血細胞を含む
    溶液とを混合し、次いで、該患者に造血細胞を移植すること；または （ｃ）造血幹細胞移植のまたは血球減少症の治療の間の補助剤としてインビボ
    でＥＰＲＧ１阻害物質を投与すること を含む方法。
20. 【請求項２０】 ＥＰＲＧ１阻害物質が配列番号６または７の配列を含むＡ
    ＳＯである請求項２０記載の方法。
21. 【請求項２１】 造血幹細胞への遺伝子療法トランスファーの効力を増強す
    る方法であって、（ａ）造血幹細胞または修飾幹細胞系を単離すること；および
    （ｂ）遺伝病を治療するのに有用な目的の矯正遺伝子を含むプラスミドベクター
    でトランスフェクトする前にＥＰＲＧ１阻害物質と一緒にインキュベートするこ
    とを含む方法。
22. 【請求項２２】 ＥＰＲＧ１阻害物質が配列番号６または７の配列を含むＡ
    ＳＯである請求項２２記載の方法。
23. 【請求項２３】 配列番号６または７の配列を含むＡＳＯ。