KR20000053017A

KR20000053017A - 사이토킨에 대한 세포 반응을 조절하는 치료 및 진단시약

Info

Publication number: KR20000053017A
Application number: KR1019990703904A
Authority: KR
Inventors: 더글라스제이. 힐턴; 워렌에스. 알렉산더; 엘리자베스엠. 비니; 트레이시에이. 윌슨; 라첼티. 리차드슨; 로빈 스타; 산드라이. 니콜슨; 도날드 메트칼프; 니코스에이. 니콜라
Original assignee: 더 월터 앤드 엘리자 홀 인스티튜트 오브 메디컬 리서치
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2000-08-25
Also published as: KR20060053007A; DK0948522T3; CA2270171A1; CN101280305A; GB9905020D0; GB2331753A; JP2009060903A; US20080166730A1; NO992116D0; ES2308785T3; DE69738767D1; EP1975234A2; EP0948522A1; WO1998020023A1; NO992116L; JP2001502183A; CN1253565A; EP0948522B1; KR100719080B1; EP0948522A4

Abstract

본 발명은 일반적으로 치료 및 진단 시약에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 예를 들어 사이토킨-매개 신호 전달과 같은 신호 전달(signal transduction)을 조절할 수 있는 치료분자를 제공한다. 그러나 본 발명은 상기 예에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 분자는 예를 들어 내인성(endogenous) 혹은 외인성 (exogenous) 분자, 항원, 세균 및 세균 생산물, 바이러스 또는 이의 구성분, 이온, 호르몬 및 기생자와 같은 신호 전달의 다른 매개체들 및 사이토킨에 대한 세포반응을 조절하는 데에 유용하다.

Description

사이토킨에 대한 세포반응을 조절하는 치료 및 진단 시약{Therapeutic and diagnostic agents capable of modulating cellular responsiveness to cytokines}

세포는 미래의 행동에 영향을 미치는 생리적 및 생화학적 과정을 조절하기 위해서 환경을 계속하여 모니터한다. 보통, 세포가 초기에 주변환경과 상호작용하는 것은 원형질 막에 발현된 수용체를 통해 일어난다. 이들 수용체의 활성화(activation)는 내인성 리간드(ligand)(이를테면 사이토킨)이든 외인성 리간드이든 이를 결합하는 것을 통해서, 세포막으로부터 세포질을 통해 세포핵으로 생화학적 연쇄과정(cascade)을 시작하게 한다.

내인성 리간드 중에서 사이토킨은 특히 중요한 다방면의 그룹(versatile group)이다.

사이토킨은 체내의 다양한 세포의 생존, 증식, 분화(differentiation) 및 기능을 조절하는 단백질이다[Nicola, 1994]. 조혈세포(haemopoietic) 사이토킨은 공통적으로 4-알파 나선형 번들(bundle) 구조를 가지며, 구조적으로 관계된 세포 표면 수용체 패밀리, 즉 타입 I 및 타입 II 사이토킨 수용체와 대부분 상호작용한다[Bazan, 1990; Sprang, 1993]. 항상, 세포내 신호 전달 연쇄과정을 개시할 때 리간드-유도 수용체가 집합하는 것은 중요한 현상(event)인 것으로 보인다. 일부 사이토킨, 즉 예를 들면 성장 호르몬, 에리스로포이에틴(erythropoietin, Epo) 및 과립구-콜로니-자극 인자(G-CSF)는 수용체 동형이량화(homodimerisation)를 시작하게 하며, 다른 사이토킨에 있어서는 수용체 동형이량화 혹은 이형이량화가 중요하다. 후자의 경우, 몇몇 사이토킨은 공통의 수용체 서브유닛을 공유하며 이에 기초하여 세포내 유사한 활성화 패턴 및 유사한 자극효과(stimulating effect)를 갖는 3개의 서브패밀리(subfamily) 그룹으로 나눌 수 있다[Hilton, 1994]. 인터루킨-3(interleukin-3, IL-3), IL-5 및 과립구-대식세포(macrophage) 콜로니-자극 인자(GM-CSF)는 공통의 β-수용체 서브유닛(βc)을 사용하며 각각의 사이토킨은 과립구 및 대식세포의 생성 및 기능적인 활동을 자극한다. IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 각각은 공통의 γ-체인(γc)을 사용하며, IL-4 및 IL-13은 대안으로서의 γ-체인(γ'c 혹은 IL-13 수용체 α-체인)을 공유한다. 이들 사이토킨 각각은 림프계(lymphoid system) 내의 획득된 면역을 조절함에 있어 중요한 역할을 한다. 마지막으로, IL-6, IL-11, 백혈병 억제인자(LIF), 옹코스타틴- M(oncostatin-M, OSM), 실리어리 뉴로트로픽 (ciliary neurotrophic) 인자(CNTF) 및 카디오트로핀(cardiotrophin)(CT)은 수용체 서브유닛, gp130을 공유한다. 이들 사이토킨 각각은 조혈세포계 내부 및 외부에 영향을 미치고 있어 매우 다면적인 것으로 보인다[Nicola, 1994].

상기 경우 모두, 각각의 수용체 복합체 중 적어도 하나의 서브유닛은 이들이 세포질 테일(tail) 내에 박스1 및 박스2라고 하는 보존된(conserved) 서열 요소(element)를 포함한다[Murakami, 1991]. 박스1은 산성의 박스2 요소보다 세포막 통과 영역(transmemebrane domain)에 더 가까운 곳에 놓인 프롤린이 풍부한 모티프(motif)이다. 박스-1은 JAK(Janus kinases)라고 하는 세포질 티로신 키나아제 류에 대한 결합지점으로서 작용한다. 리간드-유도 수용체 이량화는 교차-인산화(cross-phosphorylation)를 통해, 관련된 JAK의 촉매 활성을 증가시키는 작용을 한다. 이어서 활성화된 JAK는 수용체 자신을 포함하여, 몇몇 기질을 티로신 인산화 시킨다. 이때 수용체 상의 특정한 포스포티로신 잔기(residues)는 SH2 함유 단백질에 대한 결합지점으로서 작용하며, 이의 최상의 특징은 전사(transcription)의 신호 전달자 및 잔사 활성체(STAT) 및 아답터 단백질, shc이다. 이어서 STAT는 아마도 JAK에 의해서 티로신이 인산화되어, 수용체로부터 분리되고, 한 STAT의 SH2 영역과, 다른 STAT의 포스포티로신 잔기와 상호작용을 통해서 동형이량체(homodimer)나 이형이량체(heterodimer)를 형성한다. 이어서 STAT 이량체는 세포핵에 전달되고 여기서 이들은 특정 사이토킨에 반응하는 프로모터에 결합하여 전사를 활성화한다[Darnell, 1994; Ihle, 1995; Ihle, 1995]. 다른 경로에서, 티로신포스포릴레이트된 shc는 다른 SH2 영역-함유 프로테인 Grb-2와 상호작용하여 종국에는 MAP 키나아제 패밀리의 일원 및 이어서 포스(fos) 및 준(jun)과 같은 전사 인자를 활성화시키게 된다[Sato, 1993; Cutler, 1993]. 이들 경로는 수용체 티로신키나아제를 결합하는 사이토킨이 STAT 및 MAP 키나아제 족의 구성원들을 활성화할 수 있기 때문에 사이토킨 수용체 패밀리의 일원에 고유한 것은 아니다[David, 1996; Leaman, 1996; Shual, 1993, Sato, 1993; Cutler, 1993].

세포질 티로신 키나아제의 JAK 패밀리 중 4개의 구성원인 JAK1, JAK2, JAK3, TYK2를 기술하였는데, 그 각각은 사이토킨 수용체 서브유닛의 특정한 부분집합에 결합한다. 6개의 STAT를 기술하였는데(STAT1 내지 STAT6), 이들 역시 별개의 사이토킨/수용체 복합체에 의해 활성화된다. 예를 들면, STAT1는 기능적으로 인터페론계에 특효가 있는 것으로 보이며, STAT4는 IL-12에 특효가 있는 것으로 보이며, STAT6은 IL-4 및 IL-13에 특효가 있는 것으로 보인다. 따라서, 활성화 메카니즘이 공통적이어도 어느 정도의 사이토킨 특이성은 특정한 JAK 및 STAT를 사용하여 달성될 수 있다[Thierfelder, 1996; Kaplan, 1996; Takeda, 1996; Shimoda, 1996; Meraz, 1996; Durbin, 1996].

전술한 바 외에도, 명백히 이들 경로의 다른 활성화 메카니즘이 있다. 예를 들면, JAK/STAT 경로는 shc-유도 경로와 무관하게 MAP 키나아제를 활성화할 수 있는 것으로 보이며[David, 1995], STAT는 수용체에 결합됨이 없이, 가능하게는 JAK와 직접적인 상호작용에 의해 그들 스스로 활성화될 수 있다[Gupta, 1996]. 반대로, STAT가 완전히 활성화하기 위해서는 JAK의 작용 외에도 MAP 키나아제의 작용이 필요할 수 있다[David, 1995; Wen, 1995].

이들 신호전달 경로의 활성화를 점점 잘 이해하고 있기는 하나, 네가티브 혹은 포지티브 피드백 루프의 사용을 포함하여, 이들 경로의 조절(regulation)에 대해선 거의 모르고 있다. 이것은 중요한 것으로, 그 이유는 세포가 일단 자극에 반응하기 시작하였으면, 반응의 강도 및 지속시간이 조정되고 신호 전달이 정지(swtich-off)되는 것이 중요하기 때문이다. 마찬가지로, 반응의 강도를 계통적으로 혹은 상황이 요구할 때에는 지역적으로도 증가시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 이르기까지의 작업에서, 발명자들은 신호 전달의 네가티브 조절자(negative regulators)를 분리해 내려고 하였다. 본 발명자들은 이제 신호 전달의 조절자로서 작용할 수 있는 새로운 단백질 패밀리를 확인하였다. 새로운 단백질 패밀리는 사이토킨-매개 시그날링을 억제하기 위해서 초기에 확인된 사이토킨 시그날링 서프레서(suppressor)(SOCS)의 분자들의 능력에 기초하여 SOCS 패밀리로서 정의된다. 그러나, SOCS 패밀리의 모든 구성원이 반드시 서프레서 기능을 공유하거나 단독으로 사이토킨-매개 시그날링을 목표로 할 필요는 없다는 것에 유념한다. SOCS 패밀리는 SOCS 박스라 불리우는 C-말단 모티프의 N-말단에 놓인 아미노산 서열 모티프에 기초하여 적어도 3개 부류의 단백질 분자를 포함한다. 이러한 새로운 패밀리의 조절 분자(regulating molecules)의 확인으로 신호 전달을 조절할 수 있는 일정한 이펙터(effector) 혹은 조절자 분자가 탄생될 수 있으며, 따라서 사이토킨을 포함하는 일련의 분자에 대한 세포 반응이 탄생할 수 있다. 그러므로 본 발명은 SOCS 단백질 및 이의 유도체(derivatives), 동족체(homologues), 유사체(analoguous) 및 이의 의체(mimetics) 뿐만 아니라 작용제(agonistst) 및 SOCS 프로테인의 길항제(antagonists)에 기초한 치료 및 진단 시약을 제공한다.

[발명의 요약]

본 발명은 단백질 그 자신 뿐만 아니라 SOCS 단백질 패밀리의 구성원을 암호화하는 분자, 그 중에서도 특히 핵산 분자를 제공한다. 이하 "SOCS"라 하는 것은 SOCS 패밀리의 구성원 중 어느 것 혹은 그 모든 것을 포함한다. 특정의 SOCS 분자는 수치적으로 이를테면 S0C1, SOCS2, SOCS3과 같이 정한다. SOCS로부터 얻어진 종(species)은 첨두에 한 문자 약호로 표시할 수 있으며, "h"는 사람, "m"은 마우스와 뮤린(murine), "r"은 래트이다. 따라서, "mSOCS1"은 마우스와 뮤린의 특정한 SOCS가 된다. 여기서 "SOCS"라고 하는 것은 이를테면 호르몬 혹은 다른 내인성 혹은 외인성 분자, 세균 및 세균 생성물, 바이러스 혹은 이의 구성분, 이온, 호르몬 및 기생자에 의해서 분자가 다른 이팩터-매개 신호 전달을 조절(modulate)할 수도 있기 때문에 단백질 단독으로 사이토킨-매개 신호 전달을 억제하는 것을 의미하는 것이 아니다. "조절(modulate)"이라고 하는 용어는 특정한 수준의 유지관리 뿐만 아니라, 상향-조절(up-regulation), 하향-조절(down-regulation) 을 포함한다.

본 발명의 한 특징은 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체(mimetic)를 암호화하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃, 덜 엄격한(low stringent) 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자에 있으며, 상기 단백질은 C-말단 부위에 SOCS 박스를 포함한다.

본 발명의 다른 특징은 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃, 덜 엄격한 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자에 있으며, 상기 단백질은 C 말단 부위 및 단백질:분자 상호작용 부위내에 SOCS 박스를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃, 덜 엄격한 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자에 있으며, 상기 단백질은 C-말단 부위 및 상기 SOCS 박스의 N-말단에 놓인 단백질:분자 상호작용 부위를 포함한다.

바람직하게, 단백질:분자 상호작용 부위는 단백질:DNA 혹은 단백질:단백질 결합부위이다.

본 발명의 또 다른 특징은 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화하는 서열에 상보적이거나 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃, 덜 엄격한 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자에 있으며, 상기 단백질은 C-말단 부위내의 SOCS 박스와 SOCS 박스 N-말단에 하나 이상의 SH2 영역, 상기 WD-40 반복배열 또는 안키린(ankyrin) 반복배열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화하는 서열에 상보적이거나 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃, 덜 엄격한 조건하에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자에 있으며, 상기 단백질은 C-말단 부위내에 SOCS 박스를 포함하며, 상기 SOCS 박스는,

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆[X_i]_nX₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃[X_j]_nX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

[X_i]_n은 n이 1∼50인 n개의 아미노산 서열이고, 서열 X_i은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

[X_j]_n은 n이 1∼50인 n개의 아미노산 서열이고, 서열 X_j은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P;

인 아미노산 서열 및 SOCS 박스의 하나 이상의 SH2 영역, WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복 배열 N-말단으로 한정되지 않으나 이와 같은 단백질:분자 상호작용 부위를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃, 덜 엄격한 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자에 있으며, 상기 단백질은

( i ) C-말단 부위의 SOCS 박스가

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

[X_i]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_i은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

[X_j]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_j은 임의의 아미노산잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)

인 아미노산 서열을 포함하고,

(ii) SOCS 박스의 N 말단 부위내에 SH2 영역, WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열 또는 기타 단백질:분자 상호작용 영역 중 적어도 하나를 포함하는 특징을 나타낸다.

바람직하게, SOCS 분자는 이를테면 사이토킨이나 호르몬 혹은 다른 내인성 혹은 외인성 분자, 세균 혹은 세균 생산물, 항원 혹은 기생자로부터 신호 전달을 조절한다.

더욱 바람직하게, SOCS 분자는 사이토킨 매개 신호 전달을 조절한다.

(i) 신호 전달을 조절할 수 있으며;

(ii) C-말단 부위의 SOCS 박스가,

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)

인 아미노산 서열을 포함하며,

(iii) SOCS 박스의 부위 N-말단 부위내에 SH2 영역, WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열 또는 기타 단백질:분자 상호작용 영역 중 적어도 하나를 포함하는 특징을 나타낸다.

바람직하게, 신호 전달은 하나 이상의 EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-12, IFNγ, TNFα, IL-1 및/또는 M-CSF와 같은 사이토킨에 의해 매개된다.

바람직하게, 신호 전달은 하나 이상의 인터루킨-6(IL-6), 백혈병 억제 인자(LIF), 옹코스타틴 M(OSM), 인터페론(IFN)-α 및/또는 트롬보포이에틴에 의해 매개된다.

바람직하게, 신호 전달은 IL-6에 의해 매개된다.

특히, 바람직한 핵산분자는 실질적으로 서열번호: 3(mSOCS1), 서열번호:5(mSOCS2), 서열번호:7(mSOCS3), 서열번호:9(hSOCS1), 서열번호:11(rSOCS1), 서열번호:13(mSOCS4), 서열번호P:15 및 서열번호:16(hSOCS4), 서열번호:17(mSOCS5), 서열번호:19(hSOCS5), 서열번호:22(mSOCS6), SEG ID NO:22 및 서열번호:23(hSOCS6), 서열번호:24(hSOCS7), 서열번호:26 및 서열번호:27(hSOCS7), 서열번호:28(mSOCS8), 서열번호:30(mSOCS9), 서열번호:31(hSOCS9), 서열번 호:32(mSOCS10), 서열번호L:33 및 서열번호:34(hSOCS10), 서열번호:35(hSOCS11), 서열번호:37(mSOCS12), 서열번호:38 및 서열번호:39(hSOCS12), 서열번호:40(mSOCS13), 서열번호:42(hSOCS13), 서열번호:43(mSOCS14), 서열번호:45(mSOCS15) 및 서열번호:47(hSOCS15)에 나타낸 것이나, 또는 기재된 서열 중 전체 또는 일부 또는 기재된 서열과 42℃, 덜 엄격한조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열과 15% 이상의 상사도를 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 C-말단 부위에 SOCS 박스를 포함하는 단백질 또는 이의 유도체, 동족체 또는 의체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 C-말단 부위의 SOCS 박스 및 단백질:분자 상호작용 부위를 포함하는 단백질 혹은 이의 유도체, 동족체, 유사체 혹은 의체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 SOCS 박스의 N-말단 부위 내에 위치한 상호작용 부위를 포함하는 단백질 혹은 이의 유도체, 동족체, 유사체 혹은 의체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은 C-말단 부위의 SOCS 박스 및 SOCS 박스의 N-말단에 위치한 SH2 영역, WD-40 반복배열, 또는 안키린 반복배열을 포함하는 단백질 혹은 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 특징은

(i) 아미노산 서열로서,

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)을 갖는 SOCS 박스를 C-말단 부위에 포함하며,

(ii) SOCS 박스의 N-말단 부위내에 SH2 영역, WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열 혹은 기타 단백질:분자 상호작용 영역 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 혹은 이의 유도체, 동족체, 유사체, 혹은 의체를 제공한다.

바람직하게, 단백질은 사이토킨-매개 신호 전달과 같은 신호 전달을 조절한다.

바람직한 사이토킨은 EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-12, IFNγ, TNFα, IL-1 및/또는 M-CSF이다.

특히 바람직한 사이토킨은 IL-6이다.

본 발명의 또 다른 특징은

(i) 사이토킨 매개 신호 전달과 같은 신호 전달을 조절할 수 있으며,

(ii) 아미노산 서열로서,

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, V, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)을 갖는 C-말단 부위내의 SOCS 박스를 포함하며,

(iii) SOCS 박스의 N-말단 부위 내에 SH2 영역, WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열 혹은 기타 단백질:분자 상호작용 영역 중 적어도 하나를 포함하는 특성을 나타내는 단백질 혹은 이의 유도체, 동족체, 유사체, 혹은 의체를 제공한다.

특히, 바람직한 SOCS 단백질은 서열번호: 4(mSOCS1), 서열번호:6 (mSOCS2),서열번호:8(mSOCS3), 서열번호:10(hSOCS1), 서열번호:12(rSOCS1), 서열번호:14(mSOCS4 ) , 서열번호P:18(mSOCS5), 서열번호:21(mSOCS6), 서 열번호:25(mSOCS7), 서열번호:29(mSOCS8), 서열번호:36(hSOCS11), SEG ID NO:41(mSOCS13), 서열번호:44(mSOCS14), 서열번호:46(mSOCS15) 및 서열번호:48(hSOCS15)에 나타낸 것이나, 또는 기재된 서열 중 전체 또는 일부, 또는 기재된 서열과 15% 이상의 상사도를 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 세포내의 SOCS 단백질 레벨을 조절하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 SOCS 단백질 레벨을 조절하기에 충분한 조건하에 일정기간동안 SOCS 유전자 함유 세포를 유효량의 SOCS 유전자 발현 조절자 또는 SOCS 단백질 활성 조절자와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포내의 SOCS 단백질 레벨을 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 관련된 특징은 신호 전달을 조절하기에 충분한 시간동안에 SOCS 유전자 함유 세포를 유효량의 SOCS 유전자 발현 조절자 또는 SOCS 단백질 활성 조절자와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 SOCS 함유 세포내의 신호 전달을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 관련된 또 다른 특징은 하나 이상의 세포가 SOCS 유전자를 함유하는 세포간의 상호작용에 영향을 미치는 방법에 있어서, 상기 방법은 신호 전달을 조절하기에 충분한 시간동안 SOCS 유전자 함유 세포를 유효량의 SOCS 유전자 발현조절자 또는 SOCS 단백질 활성 조절자와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포간의 상호작용에 영향을 미치는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따라 [Xi]n 및 [Xj]n에서 n은 1-50인 것에 더하여, 1-30, 1-20, 1-10 및 1-5일 수 있다.

본 명세서에서 언급된 서열 번호를 표 1에 요약하였다.

[표 1]

한글자와 세글자 약어가 아미노산 잔기들(residues)을 표시하는데 사용되고 이들은 표2에 요약되었다.

[표 2]

본 발명은 일반적으로 치료 및 진단 시약에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 예를 들어 사이토킨-매개 신호 전달과 같은 신호 전달(signal transduction)을 조절할 수 있는 치료분자를 제공한다. 그러나 본 발명은 상기 예에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 분자는 예를 들어 내인성(endogenous) 혹은 외인성(exogenous) 분자, 항원, 세균 및 세균 생산물, 바이러스 또는 이의 구성분, 이온, 호르몬 및 기생자와 같은 신호 전달의 다른 매개체들 및 사이토킨에 대한 세포반응을 조절하는 데에 유용하다.

본 명세서 작성자가 이 명세서에서 언급한 간행물의 서지적 사항은 본 명세서 말미에 모아 놓았다. 본 명세서에서 언급된 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 서열번호(SEQ ID NOs)는 간행물 목록 다음에 정의해 놓았다. 서열번호를 표1에 요약하였다.

본 명세서 및 이에 이은 청구범위 전체를 통해서, 다른 것을 필요로 하지 않는 한 "포함하다"라는 단어, 혹은 "포함하는"과 같은 상기 단어의 변화형은 언급된 정수(integer) 혹은 정수 그룹을 포함하는 것으로 이해될 것이나 그렇다고 해서 어떤 다른 정수나 정수 그룹을 배제하는 것이 아니다.

일부 도면에서는 특정 결합 모티프(binding motif)를 가진 SOCS 단백질을 표시하는데 약어들을 사용한다. WD-40 반복배열(repeat)서열을 함유하는 SOCS 단백질은 WSB1-WSB4로 표시한다. 안키린(ankyrin) 반복배열을 가진 SOCS 단백질은 ASB1-ASB3으로 표시한다.

도 1은 레트로바이러스 감염에 의한 IL-6-비반응성(unresponsive) M1 클론(clone)의 생성을 도식적으로 나타낸 것이다. RUFneo 레트로바이러스는 경계 제한 엔도뉴클레아제(landmark restriction endonuclease)의 절단 지점들의 위치, 4A2 cDNA 삽입 위치 및 PCR 프라이머 서열 위치를 나타낸다.

도 2는 서던(Southern) 및 노던(Northern) 분석을 사진으로 나타낸 것이다. 좌측 및 우측 패널은 클론 4A2 및 대조군(control)인 감염된 M1 클론(control infected M1 clone)에서 추출된 게놈(genomic) DNA의 서던 블랏(blot) 분석이다. DNA는 각 클론에 의하여 전달된 레트로바이러스의 개수를 밝히기 위하여 BamH I로 절단하였고, 레트로바이러스 cDNA 삽입 서열의 크기를 측정하기 위하여 Sac I로 절단하였다. 좌측 패널은 네오(neo)로 검사(probe)한 것이고, 우측 패널은 Xho I-절단 4A2 PCR 산물로 검사한 것이다. 우측 패널은 클론 4A2 및 대조군인 감염된 M1클론에서 추출한 전체 RNA를 Xho I-절단 4A2 PCR 산물로 검사한 노던 블랏 분석이다. 두 밴드는 레트로바이러스 게놈상의 스플라이스 도너 악셉터 지점(splice donor-acceptor site)들에서 스플라이스된 또는 스플라이스되지 않은 레트로바이러스 복제물(transcript)을 나타낸다.

도 3은 SOCS1 유전자의 뉴클레오티드(nucleotide) 서열 및 구조를 나타낸 것이다. 도 3A. 프로타민(protamine) 유전자와 관련된 SOCS1의 게놈 콘텍스트(context)는 마우스 염색체 16번에 모여 있다. 이러한 유전자좌(locus)의 수탁번호(accession number)는 마우스에서 MMPRMGNS[직접 기탁(direct submission); G. Schlueter, 1995)이고 래트(rat)에서 BTPRMTNP2(직접 기탁; G. Schlueter, 1996)이다. 도 3B. SOCS1 cDNA의 뉴클레오티드 서열과 유추된(deduced) 아미노산 서열. 통상적인 한 문자 약어가 아미노산 서열에 대하여 사용되고 별표는 종료 코돈(stop codon)을 표시한다. 폴리아데닐화된(polyadenylation) 시그널 서열은 밑줄 쳐 있다. 암호(coding) 부위는 대문자로 표시되어 있고 비번역(untranslated) 부위는 소문자로 표시되어 있다.

도 4는 사이토킨(cytokine)이 존재하는 상태에서 세포 분화(differentiation)의 그래프를 나타낸 것이다. SOCS1을 발현하는 M1 세포(4A2 및 M1.mpl.SOCS1) 및 모(parental) M1 세포(M1 및 M1.mpl)의 반고체 한천 배양(semi-solid agar culture)이 이용되었으며, 1 mg/ml IL-6(●), 10O ng/ml LIF(◇), 1 mg/ml OSM(□), 10O ng/ml IFN-γ (▲), 50O ng/ml TPO(●), 또는 3× 10^-6M 덱사메타존(dexamethasone)(*) 적정(titration)에 반응(response)하여 분화된 콜로니(colony)의 비율이 결정되었다.

도 5는 10 ng/ml IL-6 또는 염(saline)이 존재하는 상태에서 4일 동안 배양한 SOCS1을 발현하는 M1 세포(4A2 및 M1.mpl.SOCS1) 및 모 M1 세포(M1 및 M1.mpl)의 액체 배양의 사이토스핀(cytospin)을 사진으로 나타낸 것이다. 모 M1 세포와 달리, IL-6에서 배양된 때 SOCS1을 항상적으로 발현하는 M1 세포(4A2 및 M1.mpl.SOCS1)에서는 대식세포(macrophage) 분화와 일치하는 형태적 특징(morphological features)이 관찰되지 않는다.

도 6은 SOCS1에 의한 시그널링(signalling) 분자의 인산화반응(phosphorylation)의 억제(inhibition)를 사진으로 나타낸 것이다. 모 M1 세포(M1 및 M1.mpl) 및 SOCS1을 발현하는 M1 세포(4A2 및 M1.mpl.SOCS1)는 37℃에서 4분동안 IL-6의 10 ng/ml의 부재(-) 또는 존재(+) 상태에서 배양되었다. 그후, 세포들은 용균(lysed)되고 추출물은 SDS-PAGE 이전에 항-마우스(anti-mouse) gp130 항체를 사용하여 면역침강반응(immunoprecipitate)되거나(두개의 상단 패널) 또는 직접 전기영동(electrophorese)법으로 분리되었다(두개의 하단 패널). 겔(gel)에 블랏(blot)한 후, 필터를 항-포스포티로신(anti-phosphotyrosine)(상부 패널), 항-gp130 항체(두번째 상단 패턴), 항-포스포-STAT3(두번째 하단 패널) 또는 항-STAT3(하단 패널)을 사용하여 검사(probe)하였다. 블랏(blot)은 퍼록시다아제(peroxidase)-결합(conjugated) 이차 항체와 인핸스 케미루미니슨스(Enhanced Chemiluminescence)(ECL) 시약(reagent)을 사용하여 가시화 하였다.

도 7은 염을 함유하는 10ml 무혈청(serum-free) DME, 10O ng/ml IL-6 또는 100 ng/ml IFN-γ 에서 37℃로 10분 동안 배양한 (A) M1세포 또는 SOCS1을 발현하는 M1 세포(4A2)와, (B) M1.mpl 세포 또는 M1.mpl.SOCS1 세포로부터 준비된 단백질 추출물을 나타낸 것이다. 결합(binding) 반응은 4-6㎍ 단백질(주어진 실험에서 일정함), 고-친화성(high-affinity) SIF(c-sis 유도 인자) 결합 지점을 암호화하는 5ng³²P-라벨 m67 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 800ng의 초음파처리된 연어 정자 DNA를 포함한다. 특정 실험에서는 단백질 시료는 과량의 비표지(unlabelled) m67 올리고뉴클레오티드, 또는 STAT1이나 STAT3중 어느 하나에 대하여 특이적인 항체와 함께 사전 배양되었다.

도 8은 노던 하이브리디제이션(hybridisation)을 사진으로 나타낸 것이다.

마우스에 2㎍을 정맥 주사하고 각종 시간 주기 후에 간을 제거하고, 폴리A+mRNA을 정제하였다. 폴리A+mRNA를 분리한 후에 M1 세포를 IL-6 500ng/ml을 사용하여 각종시간 길이동안 자극하였다. mRNA를 전기영동에 의해 분획하고 나일론 필터상에 고정시켰다. 노던 블랏은 사전 하이브리드하고 랜덤-프라임(random-primed)³²P-라벨 SOCS1 또는 GAPDH DNA 단편(fragment)으로 하이브리드한 다음에 세정 후 사진광에 노출시켰다.

도 9는 SOCS1, SOCS2, SOCS3 및 CIS의 아미노산 서열의 비교예를 나타낸 것이다. 유추된 아미노산 서열은 마우스(mm), 인간(hs) 및 래트(rat)(rr)의 SOCS1, SOCS2, SOCS3 및 CIS으로 배열되었다. 이들 음영표시된 잔기(residue)는 세 개 또는 네 개의 마우스 SOCS 패밀리 구성원(family member)에서 보존되고 있다. SH2 영역(domain)은 실선으로 박스로 표시되어 있고, SOCS 박스는 이중선으로 구획되어있다.

도 10은 IL-6 비반응성 M1 세포 클론인 4A2의 표현형을 사진으로 나타낸 것이다. 모 M1 세포(좌측 패널) 및 클론 4A2(우측 패널)의 콜로니는 염 또는 100ng/ml IL-6에서 7일동안 반고체 한천에서 배양한 것이다.

도 11은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 SOCS 패밀리 구성원의 mRNA 발현을 사진으로 나타낸 것이다.

(A) 한정된 개수의 조직에서 SOCS 패밀리 구성원의 항상적 발현을 보이는 마우스 기관(organ)에서 분리한 mRNA의 노던 분석

(B) SOCS 패밀리 구성원의 유도 발현을 보이는 간 및 M1 세포에서의 mRNA의 노던 분석 및 IL-6에서의 노출

(C) 사이토킨(cytokine)에 의하여 SOCS 패밀리 구성원의 발현이 유도되는 골수(bone marrow)에서 분리한 mRNA의 역 전사효소(reverse transcriptase) PCR 분석

도 12는 SOCS1이 gp130 및 STAT-3의 인산화 및 활성화를 억제하는 것을 사진으로 나타낸 것이다.

(A) 100ng/ml IL-6의 존재(+) 또는 부재(-)로 자극된 모 M1 세포(M1 및 M1.mpl) 및 SOCS1을 발현하는 M1 세포(4A2 및 M1.mpl.SOCS1)에서 추출한 추출물의 웨스턴(Western) 블랏. 상단 : 항-gp130(α gp130)으로 면역침강반응되고 항-포스포티로신(α PY-STAT3) 또는 단백질의 동일한 로딩(loading)을 표시하기 위하여 친-STAT3(α STAT3)으로 이뮤노블랏(immunoblotted)된 추출물. 밴드의 분자량은 우측에 표시되어 있다.

(B) 100ng/ml IL-6 또는 100ng/ml IFNγ 의 존재(+) 및 부재(-)로 자극된 M1.mpl 및 M1.mpl.SOCS1 세포의 EMSA. DNA-결합 복합체(binding complex) SIF A,B 및 C는 좌측에 표시되어 있다.

도 13은 SOCS 단백질의 아미노산 서열의 비교예를 나타낸 것이다. (A) WD-40 반복배열(WSB) 및 안키린 반복배열(ASB)을 함유하는 단백질을 포함하는 SOCS 단백질의 구조를 개략적으로 나타낸 것. (B) SOCS 단백질의 N-말단 부위의 배열. (C) CIS, SOCS1,2,3,5,9,11 및 14의 SH2 영역의 배열. (D) SOCS4, SOCS6, SOCS13 및 SOCS15의 WD-40 반복배열의 배열(alignment). (E) SOCS7 및 SOCS10의 안키린 반복배열의 배열. (F) SH2, WD-40과 안키린 반복배열과 SOCS 박스 사이의 부위의 배열. (G) SOCS 박스의 배열. 각각의 경우에 있어서, 아미노산에 대하여는 불특정 동일물(identity)의 잔기를 X로 표시하고 콘티그(contig)의 시작 및 끝을 ○○○ 로 표시하면서 통상적인 한 문자 약어를 사용하고 있다. 분리된 cDNA에서 유도된 핵산 서열의 개념적 번역(translation)을 통해 취득한 아미노산 서열은 대문자로 표시하고, EST의 개념적 번역에 의하여 취득한 아미노산 서열은 소문자로 표시하고 있다. (LIVMA), (FYW), (DE), (QN), (C,S,T), (KRH), (PG)로 정의된 보존 잔기는 SH2 영역, WD-40 반복배열, 안키린 반복배열 및 SOCS 박스에서 음영으로 표시하고 있다. SH2 영역, WD-40 반복배열 및 안키린 반복배열의 배열에 대한 공통 서열(consensus sequence)은 상단에 표시하고 있다. 각각의 경우에 있어서, 공통 서열은 대량 및 다종 영역에 대한 시험을 통하여 유도하였다(Neer et al, 1994; Bork, 1993).

도 14(A) 및 (B)는 마우스 SOCS1 및 SOCS5과 WD-40 반복배열(WSB2) 및 안키린 반복배열(ASB1)을 함유하는 SOCS의 mRNA 발현 분석을 사진으로 나타낸 것이다

도 15는 마우스 SOCS4 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 유추된 ATG "시작" 코돈에서 종료 코돈까지의 성숙 암호(mature coding) 부위를 암호화하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시하고, 유추된 5' 및 3' 비번역(untranslated) 부위는 소문자로 표시하고 있다. 마우스 cDNA 서열과 마우스 및 인간 EST 콘티그의 관계는 도 17에 도시하고 있다.

도 16은 도 15의 뉴클레오티드 서열에서 유도된 마우스 SOCS4 단백질의 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 13에 도시한 SOCS 박스는 밑줄 쳐 있다.

도 18은 표 4.1에 기입된 EST의 분석에서 유도된 인간 SOCS4 cDNA 콘티그 h4.1 및 h4.2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 이들 콘티그와 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 17에 도시하고 있다.

도 19는 마우스 SOCS5 게놈(57-2) 및 cDNA(5-3-2) 클론과, 마우스 EST(표 5.1)과 인간 cDNA 클론(5-94-2) 및 EST(표 5.2) 분석에서 유도된 콘티그 사이의 관계를 나타낸 것이다. 마우스 SOCS5 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 도 20에 도시하고 있고, 인간 SOCS5 콘티그(h5.1)의 서열은 도 21에 도시하고 있다. 단백질의 구조는 개략적으로 나타내고 있으며, SH2 영역은 ()로 표시하고 있고 SOCS 박스는 ()로 표시하고 있다. 추정 5' 및 3' 번역 부위는 가는 실선으로 나타내고 있다.

도 20(A)는 게놈 및 cDNA 클론의 분석에서 유도된 마우스 SOCS5의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 유추된 ATG "시작" 코돈에서 종료 코돈까지의 성숙암호 부위를 암호화하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시하고 있고, 유추된 5' 및 3'비번역 부위는 소문자로 표시하고 있다. 마우스 cDNA 서열과 마우스 및 인간 EST콘티그 사이의 관계는 도 19에 도시하고 있다.

도 20(B)는 도 20(A)의 뉴클레오티드 서열에서 유도된 마우스 SOCS5 단백질의 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 13에 나타낸 SOCS 박스는 밑줄 쳐있다.

도 21은 cDNA 클론 5-94-2 및 표 5.2에 기입된 EST의 분석에서 유도된 인간 SOCS5 cDNA 콘티그 h5.1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 이들 코트그와 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 19에 도시하고 있다.

도 22는 마우스 SOCS6 cDNA 클론(6-1A,6-2A,6-5A,6-4N,6-18,6-29,6-3N 및 6-5N)과, 마우스 EST(표 6.1) 및 인간 EST(표 6.2) 분석에서 유도된 콘티그의 관RP를 나타낸 것이다. 마우스 SOCS-6 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 도 23에 도시하고 있고, 인간 SOCS6 콘티그(h6.1 및 h6.2)의 서열은 도 24에 도시하고 있다. 마우스 SOCS6의 유도된 아미노산 서열은 도 23(B)에 도시하고 있다. 단백질의 구조는 개략적으로 도시하고 있으며, WD-40 반복배열은 ()로 표시하고 있고 SOCS 박스는 ( )로 표시하고 있다. 추정 5' 및 3' 비번역 부위는 가는 실선으로 도시하고 있다.

도 23(A)는 cDNA 클론 64-10A-11 분석에서 유도된 마우스 SOCS6의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 종료 코돈에서 종료하는 유추된 암호 부위의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시하고 있으며, 유추된 3' 비번역 부위는 소문자로 표시하고 있다. 마우스 cDNA 서열과 마우스 및 인간 EST 콘티그 사이의 관계는 도 22에 도시하고 있다.

도 23(B)는 도 23(A)의 뉴클레오티드 서열에서 유도된 마우스 SOCS6 단백질의 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 l3에 도시한 SOCS 박스는 밑줄 쳐있다.

도 24는 cDNA 클론 5-94-2 및 표 6.2에 기입된 EST의 분석에서 유도된 인간 SOCS6 cDNA 콘티그 h6.1의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것이다. 이들 콘티그와 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 22에 도시하고 있다.

도 25는 마우스 SOCS7 cDNA 클론(74-10A-11)과, 마우스 EST(표 7.1) 및 인간 EST(표 7.2) 분석에서 유도된 콘티그 사이의 관계를 나타낸 것이다. 마우스 SOCS7의 뉴클레오티드 서열은 도 26에 도시하고 있고, 인간 SOCS7 콘티그(h7.1 및 h7.2)의 서열은 도 27에 도시하고 있다. 마우스 SOCS7의 유도된 아미노산 서열은 도 26(B)에 도시하고 있다. 단백질의 구조는 개략적으로 도시하고 있으며, 안키린 반복배열은 ()로 표시하고 있고 SOCS 박스는 ()로 표시하고 있다. 추정 5' 및 3' 비번역 부위는 마우스에서 가는 실선으로, h7.2에서 파상선으로 표시하고 있다. 일자(date)와 EST로 분리된 클론 분석에 근거하면, mSOCS7 및 hSOCS7의 3' 비번역 부위는 거의 상사도를 갖고 있지 않다.

도 26(A)는 cDNA 클론 74-10A-11의 분석에서 유도된 마우스 SOCS7의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 종료 코돈에서 종료하는 유추된 암호 부위의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시하고 있으며, 유추된 3' 비번역 부위는 소문자로 표시하고 있다. 마우스 cDNA 서열과, 마우스 및 인간 EST 콘티그 사이의 관계는 도 25에 도시하고 있다.

도 26(B)는 도 26(A)의 뉴클레오티드 서열에서 추정된 마우스 SOCS7 단백질의 유추된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 13에 도시한 SOCS 박스는 밑줄 쳐있다.

도 27은 표 7.2에 기입된 EST의 분석에서 추정된 인간 SOCS7 cDNA 콘티그 h7.1 및 h7.2의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것이다. 이들 콘티그과 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 25에 도시하고 있다.

도 28은 마우스 SOCS8 EST(표 8.1 및 도 29(A)) 분석에서 추정된 서열과, 마우스 SOCS8의 유추된 단백질 구조 사이의 관계를 나타낸 것이다. 마우스 SOCS8의 부분적 유추 아미노산 서열은 도 29B에 도시하고 있다. 단백질의 구조는 개략적으로 도시하고 있으며 SOCS 박스는 ( )로 강조 표시하고 있다. 추정 3' 비번역 부위는 가는 실선으로 표시하고 있다.

도 29(A)는 EST 분석에서 추정된 마우스 SOCS8 cDNA(콘티그 8.1)의 뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸 것이다. 종료 코돈에서 종료하는 유추된 암호 부위의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시하고 있으며 유추된 비번역 부위는 소문자로 표시하고 있다.

도 29(B)는 는 도 29(A)의 뉴클레오티드 서열에서 유도된 마우스 SOCS8 단백질의 부분적 유추 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 13에 도시한 SOCS 박스는 밑줄 쳐 있다.

도 30은 마우스 SOCS9 EST(표 9.1)과 인간 EST(표 9.2) 사이의 관계를 나타낸 것이다. 마우스 SOCS9 콘티그(m9.1)의 뉴클레오티드 서열은 도 31에 도시하고 있고, 인간 SOCS9 콘티그(h9.1)의 서열은 도 32에 도시하고 있다. 인간 SOCS9의 유추된 아미노산 서열은 개략적으로 도시하고 있으며, SH2 영역은 ()로 표시하고 있고 SOCS 박스는 ()로 표시하고 있다. 추정 3' 비번역 부위는 가는 실선으로 표시하고 있다.

도 31은 표 9.1에 기입된 EST의 분석에서 유도된 마우스 SOCS9 cDNA(콘티그 m9.1)의 부분적 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 이들 콘티그와 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 30에 도시하고 있다.

도 32는 표 9.2에 기입된 EST 분석에서 유도된 인간 SOCS9 cDNA(콘티그 m9.1)의 부분적 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 이들 콘티그와 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 30에 도시하고 있다.

도32는 표 9.2에 기입된 EST 분석에서 유도된 인간 SOCS9 cDNA(콘티그 m9.1)의 부분적 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 콘티그 h9.1이 단백질을 SH2 영역 및 SOCS 박스로 암호화하는 것이 명백하더라도, 서열의 품질은 단일의 명백한 오픈 리딩 프레임(single unambiguous open reading frame)을 유도하기에는 충분히 높지 않다. 이들 콘티그와 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 30에 도시하고 있다.

도 33은 마우스 SOCS10 cDNA 클론(10-9,10-12,10-23 및 10-24)과, 마우스 EST(표 10.1) 및 인간 EST(표 10.2)의 분석에서 유도된 콘티그 사이의 관계를 나타낸 것이다. 마우스 SOCS10의 뉴클레오티드 서열은 도 10.2에 도시하고 있으며, 인간 SOCS 10 콘티그(h10.1 및 h10.2)의 서열은 도 35에 도시하고 있다. 단백질의 유추된 구조는 개략적으로 도시하고 있으며, 안키린 반복배열은 ()으로 표시하고 있고 SOCS 박스는 ()로 표시하고 있다. 추정 3' 비번역 부위는 마우스에서 가는 실선으로, h10.2에서 파상선으로 표시하고 있다. 일자(date)과 EST로 분리된 클론 분석에 근거하면, mSOCS-10 및 hSOCS-10의 3' 비번역 부위는 거의 상사도를 갖고있지 않다.

도 34는 cDNA 클론 10-9,10-12,10-23 및 10-24의 분석에서 유도된 마우스 SOCS10의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 종료 코돈에서 종료하는 유추된 암호 부위의 부분을 암호화하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시하고, 유추된 3' 비번역 부위는 소문자로 표시하고 있다. 콘티그 m10.1이 단백질을 일련의 안키린과 하나의 SOCS 박스로 암호화하는 것이 명백하더라도, 서열의 품질은 단일의 명백한 개방 판독 프레임을 유도하기에는 충분히 높지 않다. 마우스 cDNA 서열과 인간 EST 콘티그의 관계는 도 33에 도시하고 있다.

도 35는 표 10.2에 기입된 EST의 분석에서 유도된 인간 SOCS10 cDNA 콘티그 h10.2 및 h10.2의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 이들 콘티그와 마우스cDNA 서열의 관계는 도 33에 도시하고 있다.

도 36(A)는 표 11.1에 기입된 EST의 분석에서 유도된 인간 SOCS11 cDNA의 부분적 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. 유추된 ATG "시작" 코돈에서 종료 코돈까지의 성숙 암호 부위를 암호화하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시하고, 유추된 5' 및 3' 비번역 부위는 소문자로 표시하고 있다. EST에서 유도된 부분적 cDNA 서열과 유추된 단백질의 관계는 도 37에 도시하고 있다.

도 36(B)는 도 36(A)의 뉴클레오티드 서열에서 유도된 인간 SOCS11 단백질의 부분적 유추 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 13에 도시한 SOCS 박스는 밑줄쳐 있다

도 37은 인간 SOCS-11 EST(표 11.1 및 도 36A)에서 유도된 서열과, 인간 SCOS11의 유추된 단백질 구조의 관계를 나타낸 것이다. 인간 SOCS11의 유도된 부분적 아미노산 서열은 도 36(B)에 도시하고 있다. 단백질의 구조는 개략적으로 도시하고 있으며, SH2 영역은 ()로 표시하고 SOCS 박스는 ()로 강조 표시하고 있다. 유추된 3' 비번역 부위는 가는 선으로 표시하고 있다.

도 38은 마우스 SOCS12 cDNA 클론(12-1)과, 마우스 EST(표 12.1) 및 인간 EST(표 12.1)의 분석에서 유도된 콘티그의 관계를 나타내는 것이다. 마우스 SOCS12 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 도 12.2에 도시하고 있으며, 인간 SOCS12 콘티그(h12.1 및 h12.2)의 서열은 도 40에 도시하고 있다. 마우스 SOCS12의 유도된 부분적 아미노산 서열은 도 39에 도시하고 있다. 단백질의 구조는 개략적으로 도시하고 있으며, 안키린 반복배열은 ()로 표시하고 SOCS 박스는 ()로 표시하고 있다. 추정 3' 비번역 부위는 마우스에서 가는 실선으로, h12.2에서 파상선으로 표시하고 있다. 일자 및 EST에 분리된 클론 분석에 근거하면, mSOCS12 및 hSOCS12의 3' 비번역 부위는 거의 상사도를 갖고 있지 않다.

도 39는 마우스 SOCS12의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것으로서, 이 서열은 표12.1에 게재된 복제마우스 cDNA 12-1 및 EST의 분석을 통해 얻어진 것이다. 종료 코돈(stop codon)을 포함하여, 예측된 코딩 부위의 일부를 암호화하는 뉴클레오티드는 위의 사례에 설명되고, 예측된 3' 비번역 부위는 아래 사례에 설명되어 있다.인간 S0C12와의 상동성에 의해, 콘티그 m12.1은 일련의 안키린 반복배열과 SOCS 박스를 가지는 단백질을 암호화하는 것이 분명하며, 그 서열의 특질만으로는 하나의 단일하고 명백한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 유추해 내기에는 부족함이 있다. 마우스 cDNA서열과 마우스와 인간의 EST 콘티그와의 상관관계는 도 38에나타나 있다.

도 40은 인간의 SOCS12c DNA 콘티그 h12.1 및 h12.2의 뉴클레오티드 서열을나타낸 것으로서, 이 서열은 표12.2에 게재된 ESTs의 분석을 통해 얻어진 것이다. 이들 콘티그와 마우스 cDNA 서열의 관계는 도 38에 나타나 있다.

도 41은 콘티그 m13.1과 콘티그 h13.1과의 관계를 다이아그램화시켜 나타낸것이다. 콘티그 m13.1은 마우스 SOCS13 cDNA(62-1,62-6-7,62-14)와 마우스 ESTs(표13.1)의 분석을 통해 얻어진 것이고, 콘티그 h13.1은 인간 ESTs(표13.2)의 분석결과로 얻어진 것이다. 마우스 SOCS13 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 도 42에 나타난 바와 같고, 인간 SOCS13 콘티그(h13.1) 뉴클레오티드 서열은 도 43에 나타난 바와 같다. 마우스 SOC13의 추론된 아미노산 서열은 도 42B에 나타나 있다. 그 단백질 구조는 개략적, 도식적으로 설명되어 있으며, WD-40 반복배열 또한 ()부분으로 강조되어 표시되고 있으며, SOCS 박스 또한 ()부분으로 강조되어 있다. 3' 비번역부위는 가는 선과 진한 선으로 나타나 있다.

도 42A는 SOCS13의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것으로서, 이 서열은 cDNA 클론 62-1, 62-6-7 및 62-14의 분석을 통해 얻어진 것이다. 종료 코돈에서 끝나는, 코딩 부위의 뉴클레오티드 암호화 부분은 위의 사례에 나타나 있으며, 예측된 3' 비번역 부위를 암호화하는 뉴클레오티드는 아래 사례에 나타나 있다. 마우스 cDNA서열의 마우스와 인간 EST 콘티그의 관계는 도 41에 나타난 있다.

도 42B는 마우스 SOCS13 단백질의 예측된 아미노산 서열을 나타낸 것으로서,이 서열은 도 42A의 뉴클레오티드 서열을 통해 얻어진 것이다. 역시 도13에 나타난 SOCS 박스는 밑줄로 강조되어 있다.

도 43은 인간 SOCS13 cDNA 콘티그 h13.1의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것으로서, 이 서열은 표13.2에 기재된 ESTs의 분석을 통해 얻어진 것이다. 이 콘티그와마우스 cDNA 서열의 관계는 도 41에 나타난 바와 같다.

도 44는 부분적 마우스 SOCS14 cDNA 클론 부분(14-1)과 표14.1에 나타난 마우스 EST의 분석을 통해 얻어진 콘티그의 관계를 다이아그램화시켜 나타낸 것이다. 마우스 SOCS14 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 도 45에 나타낸다. 마우스 SOCS14의 추론된 부분적 아미노산 서열이 도 45B에 보여진다. 그 단백질 구조는 개략적, 도식적으로 나타나 있는데, SH3 영역과 SOC 박스는 각각 ()부분으로 강조되고 있다. 추정 3' 비번역 부위는 가는 선으로 표시되어 있다.

도 45A는 마우스 SOCS14의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것으로서, 이 서열은게놈 및 cDNA복제물의 분석을 통해 얻어진 것이다. 예측된 ATG "시작" 코돈부터 종료 코돈에 이르는 숙성 코딩 부위를 암호화하는 뉴클레오티드는 위의 사례에 설명되어 있으며, 예측된 5' 및 3' 비번역 부위는 아래 사례에 나타나 있다. 마우스 cDNA 서열과 마우스와 인간의 EST 콘티그와의 관계는 도 44에 나타난 바와 같다.

도 45B는 마우스 SOCS14의 에측된 아미노산 서열을 나타내는 것으로서, 이 서열은 [도45B]의 뉴클레오타이드서열로부터 얻어진 것이다. SOCS 박스 역시 도 13에 밑줄로 강조되고 있다.

도 46은 콘티그 m15.1과 콘티그 h15.1의 관계를 다이아그램화시켜 표시한 것이다. 콘티그 m15.1은 마우스 BAC 및 마우스 ESTs(표15.1)의 분석을 통해 얻어진 것이고, 콘티그 h15.1은 인간의 BAC 및 인간의 ESTs(표15.2)의 분석을 통해 얻어진 것이다. 마우스 SOCS15 콘티그의 뉴클레오티드 서열 및 인간 SOCS15 콘티그(h15.1)의 뉴클레오티드 서열은 도 47에 나타낸 바와 같다. 마우스 SOCS15의 추정 아미노산 서열은 도 47B에 나타낸 바와 같다. 그 단백질 구조는 개략적, 도시적으로 나타나 있는데, WD-40 반복배열 및 그 SOCS 박스는 각각 ()로 강조되여 있다. 5' 및 3' 비번역 부위는 가는 선과 진한 선으로 표시되어 있다. 코딩 부위를 방해하는 인트론은 ^로 표시되어 있다.

도 47은 마우스 SOCS15 유전자를 커버하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것으로서, 이 서열은 표15.1에 열거된 마우스 BAC의 분석을 통해 얻어진 것이다. 예측된 코딩 부위를 암호화하는 뉴클레오티드는 ATG에서 시작해서 종료 코돈에서 끝나며, 이는 위 사례에 나타나 있고, 예측된 5' 비번역 부위를 암호화하는 뉴클레오티드, 인트론 및 3' 비번역 부위는 아래 사례에 설명되어 있다. 마우스 BAC와, 마우스 및 인간 ESTs 콘티그의 관계는 도46에 나타난 바와 같다.

도 47B는 마우스 SOCS15의 예측된 아미노산 서열을 나타낸 것으로서,이 서열은 도 47A에 나타난 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 것이다. SOCS 박스 또한 도 13에 나타나고 밑줄로 강조되고 있다.

도 48A는 인간 SOCS15의 유전자를 지배하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것으로서, 이 서열은 표15.2에 기재된 인간 BAC의 분석을 통해 얻어진 것이다. 예측된 코딩 부위를 암호화하는 뉴클레오티드는 ATG에서 시작해서 종료 코돈에서 끝나고 있는데, 이는 위 사례에 나타나 있고, 예측된 5' 비번역 부위를 암호화하는 뉴클레오티드, 인트론 및 3' 비번역 부위는 아래 사례에 설명되어 있다. 인간 BAC와,마우스 및 인간 ESTs 콘티그의 관계는 도46에 나타난 바와 같다.

도 47B는 인간 SOCS15의 예측된 아미노산 서열을 나타낸 것으로서,이 서열은도 48A에 나타난 뉴클레오티드 서열로부터 얻어진 것이다. SOCS 박스 또한 도 13에나타나고 밑줄로 강조되고 있다.

도 49는 JAK2 키나제 활성의 SOCS1 억제를 사진으로 나타내 보인 것이다. (A) 상단 패널; Cos M6 세포는 플래그-태그된 mJAK2 및 mSOCS-1 DNA(SOCS1) 또는 플래그-mJAK2 DNA 단독으로 일시적으로 형질감염되고, 용균되고, JAK2 단백질은 안티-JAK2 항체를 사용하여 면역침강되고, 시험관내 기나제 검출이 가해진다. 하단패널; JAK2의 면역침강된 안티-JAK2 항체로 웨스턴 블롯되었다. (B) 상단 패널; Cos M6 세포는 플래그-mJAK2 및 플래그-mSOCS-1 DNA(SOCS1) 또는 플래그-mJAK2 DNA단독으로 일시적으로 형질감염되고, 용균되고, JAK2 단백질은 안티-JAK2 항체(UB1)를 사용하여 면역침강되고, SDS/PAGE 겔에 의해 분리되었다. 면역침강물은 이후 안티-포스포티로신 항체로 웨스턴 블롯을 통해 분석되었다. 하단 패널; JAK2 발현. Cos 세포 용균액은 SDS/PAGE 겔에 의해 분리되고 안티-FLAG 항체(M)로 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.

도 50는 JAK2와 SOCS 단백질 사이의 상호작용을 사진으로 나타내 보인 것이다. (A) Cos M6 세포는 플래그-태그된 mJAK2 및 각종 플래그-태그된 SOCS DNAs(SOCS-1;S1, SOCS-2;S2, SOCS-3;S3, CIS) 또는 플래그-mJAK2 단독으로 일시적으로 형질감염되고, 용균되고, JAK2 단백질은 안티-JAK2(UB1)를 사용하여 면역침강되고, SDS/PAGE 겔에 의해 분리되었다. 면역침강물은 안티-FLAG 항체(M2)로 웨스턴블롯을 통해 분석되었다. (B) (A)에 기재된 Cos 세포 용균액은 SDS/PAGE 겔에 의해 분리되고 각종 단백질의 발현 레벨은 안티-FLAG 항체(M2)로 웨스턴 블롯에 의해 측정되었다.(C) JAK2 티로신 포스포릴레이션. (A)에 기재된 Cos 세포 용균액은 SDS/PAGE 겔에 의해 분리되고, 단백질은 안티-포스포티로신 항체로 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다.

도 51은 pβgalpAloxneo를 다이아그램화하여 나타낸 것이다.

도 52은 pβgalpAloxneoTK를 다이아그램화하여 나타낸 것이다.

도 53은 SOCS1 넉아웃(knockout) 구성을 다이아그램화하여 나타낸 것이다.

본 발명은 새로운 패밀리의 신호전달 조절자들을 제공하는 것이다. 이러한 과의 초기 구성원은 사이토킨 시그날링을 억제하였으므로, "싸이토킨 시그날링 억제유전자"패밀리로서 "SOCS"라고 불린다. SOCS과는 "SOCS 박스"로 불리는 C-말단부위의 존재에 의해 정의된다. SOCS 분자의 다른 부류는 배타적이지는 않으나 일반적으로 가 위치한 SOCS박스의 N-말단에 의해 정의되며 가령 단백질:DNA 또는 단백질:단백질 상호작용과 같은 단백질:분자 상호작용에 의해 포함된다. 특히 바람직한 모티프는 SH2 영역, WD-40 반복배열그리고 안키린 반복배열으로부터 선택된다.

WD-40 반복배열은 원래 G-단백질의 β-서브유닛에서 인식된다. WD-40반복배열은 β-프로펠러 같은 구조를 형성하는 것으로 보이며 단백질-단백질 상호작용에관여할 수 있다. 안키린 반복배열은 원래 사이토스켈레탈(cytoskeletal) 단백질 안키린에서 인식된다.

SOCS패밀리의 구성원은 여러 수단에 의해 확인된다. 예를 들면, SOCS1에서 SOCS3 까지는 사이토킨이 매개된 신호전달을 억제하는 능력 여부에 의해 확인되며 따라서 활성에 근거하여 확인된다. SOCS4에서 SOCS15 까지는 SOCS 박스의 수준에서 상사도를 나타내는 뉴클레오티드 서열로써 확인된다.

SOCS 박스는 SOCS분자의 C-말단 부위에 위치한 보존된 모티프이다. 본 발명에 따르면, SOCS 박스의 아미노산 서열은;

이다. 여기서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P;

X₂는 임의의 아미노산 잔기;

X₃은 P, T 또는 S;

X₄는 L, I, V, M, A또는 P;

X₅는 임의의 아미노산;

X₆은 임의의 아미노산;

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W;

X₈은 C, T, 또는 S;

X₉는 R, K, 또는 H;

X₁₀은 임의의 아미노산;

X₁₁은 임의의 아미노산;

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P;

X₁₃은 임의의 아미노산;

X₁₄는 임의의 아미노산;

X₁₅는 임의의 아미노산;

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C ,T 또는 S;

[X_i]_n은 n 은 1부터 50까지의 n 개의 아미노산 서열이고, 서열X_i는 임의의 아미노산 잔기로부터 선택된 동일한 또는 다른 아미노산으로 구성된다.

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P;

X₁₈은 임의의 아미노산;

X₁₉는 임의의 아미노산;

X₂₀은 L, I, V, M, A,또는 P;

X₂₁은 P;

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G;

X₂₃은 P 또는 N;

[X_j]_n은 n 은 1부터 50까지의 n 개의 아미노산 서열이고, 서열X_j는 임의의 아미노산 잔기로부터 선택된 동일한 또는 다른 아미노산으로 구성된다.

X₂₄는 L, I, V, M, A, 또는 P;

X₂₅는 임의의 아미노산;

X₂₆은 임의의 아미노산;

X₂₇은 Y 또는 F; 그리고

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P.

위에서 언급한 바와 같이 본 발명에 있어서,SOCS 단백질은 가령 SH2영역, WD40-반복배열 그리고 안키린 반복배열이 위치한 SOCS박스의 N- 말단과 같은 단백질:분자 상호작용 부위의 존재에 근거하여 별개의 부류로 나뉜다. 후자의 3개의 영역은 단백질:단백질 상호작용 영역이다.

SH2 영역을 포함하는 SOCS 단백질의 예에는 SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS5, SOCS9, SOCS11, SOCS14 가 포함된다. WD-40 반복배열을 포함하는 SOCS 의 예에는 SOCS4, SOCS6, 그리고SOCS15가 포함된다. 안키린 반복배열을 포함하는 SOCS의 예에는 SOCS7, SOCS10 그리고 SOCS12 가 포함된다.

본 발명은 그중에서도 특히 SOCS 단백질을 암호화 하고 SOCS 단백질의 재조합형태 뿐만 아니라 정제된 자연적으로 발생된 SOCS 단백질을 제공하며, SOCS 단백질의 활성 또는 SOCS 유전자의 발현을 조절함으로써 신호전달을 조절하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는 신호전달은 예를 들면 EPO, TPO, G-CSF, GN1-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-2, IFNγ, TFNα, IL-1 및/또는 M-CSF를 포함하는 사이토킨에 의해 매개된다. 특히, 바람직한 사이토킨은 IL-6, LIF, OSM, IFN-γ및/또는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)을 포함한다.

따라서, 본 발명의 한가지 측면은 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 이의 의체를 암호화 하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42도 의 덜 엄격한 조건하에서 하이브리디레이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자를 제공하는 것이다. 여기서 상기 단백질은 C-말단 부위에 SOCS 박스의 선택적으로 SOCS 박스의 N-말단부위에 있는 단백질:분자 상호작용 영역을 포함한다.

바람직하게는 단백질:분자 상호작용 영역은 단백질:DNA 또는 단백질:단백질상호작용 영역이다. 가장 바람직하게는 단백질:분자 상호작용 영역은 SH2 영역, WD-40반복배열 및/또는 안키린 반복배열중 하나이다.

상기한 바와 같이, 바람직하게는 SOCS 재료가 사이토킨 매개 신호전달을 조절한다. 그러나, 본 발명은 가령 다른 내인성 또는 외인성분자, 항원, 세균 그리고 세균생성물, 바이러스 또는 그들의 구성분,이온, 호르몬, 기생자에 의해 매개되는다른 이펙터 매개 신호전달을 조절하는 SOCS 분자에 까지 확장된다. 여기에서 내인성 분자는 SOCS 분자를 운반하는 세포내에서 생산된 분자이며, 외인성 분자는 다른세포에 의해서 생산되거나 체내에 유입된 것이다.

바람직하게는 핵산분자 또는 SOCS 단백질은 분리되거나 정제된 형태이다. "분리된" 또는 "정제된"는 분자가 다른 물질로부터 분리되어 적어도 한번의 정제단계를 거친 것을 의미한다.

바람직하게는, 핵산분자는 분리형태이고, 가령 cDNA 또는 게놈DNA와 같은 DNA 이다. DNA는 자연적으로 발생하는 SOCS 와 동일한 아미노산 서열을 암호화 하고, SOCS는 하나 이상의 아미노산 치환, 삭제 및/또는 첨가를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 게놈암호서열(액손과 인트론을 포함하는)과 일치하거나 또는 게놈 유전자로부터 전사된 mRNA로부터의 유래된 cDNA 에서의 뉴클레오티드 서열에 일치하거나 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 삭제 및/또는 첨가를 수반할 수 있다.

하나의 바람직한 실시예에서, 핵산분자는 암호화의 서열 또는 SOCS단백질또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화 하는 서열에 상보적이거나이를 암호화하는 서열을 포함하며, 여기서 상기 SOCS단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 :4(mSOCS1), 서열 번호 :6(mSOCS2), 서열 번호 :8(mSOCS3), 서열 번호 :10(hSOCS1), 서열 번호 :12(rSOCS1), 서열 번호 :14(mSOCS4), 서열 번호 :18(mSOCS5), 서열 번호 :21(mSOCS6), 서열 번호 :25(mSOCS27), 서열 번호 :29(mSOCS8), 서열 번호 :36(hSOCS11), 서열 번호 :41(mSOCS13), 서열 번호 :44(mSOCS14), 서열 번호 :46(mSOCS15) 그리고 서열 번호 :48(mSOCS15) 로부터 선택되거나 또는 상기 SOCS단백질의 아미노산 서열은 상기 나열된 순서에 대해 단수 또는 복수의 아미노산 치환, 삭제 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 암호화 하거나, 또는 42도 의 덜 엄격한조건하에서 교배가 가능한 뉴클레오티드 서열이다.

더욱 바람직한 실시예에서, 본 발명은 뉴클레오티드 암호화의 서열 또는 SOCS단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화 하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화 하는 서열을 포함하는 핵산분자를 제공하는 것이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 :3(mSOCS1), 서열 번호 :5(mSOCS2), 서열 번호 :7(mSOCS3), 서열 번호 :9(hSOCS11), 서열 번호 :11(rSOCS1), 서열 번호 :13(mSOCS4), 서열 번호 :15 그리고 서열 번호 :16(hSOCS4), 서열 번호 :17(mSOCS5), 서열 번호 :19(hSOCS5),서열 번호 :20(mSOCS6), 서열 번호 :22 그리고 서열 번호 :23(hSOCS6),서열 번호 :23(mSOCS7),서열 번호 :26 그리고, 서열 번호 :27(hSOCS7),서열 번호 :28(mSOCS8),서열 번호 :30(mSOCS9), 서열 번호 :31(hSOCS9), 서열 번호 :32(mSOCS10), 서열 번호 :33 그리고, 서열 번호 :34(hSOCS10),서열 번호 :35(hSOCS11), 서열 번호 :37(mSOCS12) 서열 번호 :38 그리고 서열 번호 :39(hSOCS12), 서열 번호 :40(mSOCS13) 서열 번호 :42(hSOCS13),서열 번호 :43(mSOCS14),서열 번호 :45(mSOCS15), 그리고 서열 번호 :47(hSOCS15) 에 실질적으로 설명된 뉴클레오티드 서열로부터 선택되거나 또는 모든 서열에 대해 적어도 15%의 상사도를 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 상기 나열된 임의의 서열의 부위 또는 42도 의 덜 엄격한 조건하에서 교배가 가능한 뉴클레오티드 서열 중에서 선택된다.

여기서 저 42도 에서의 덜 엄격한 것에 대해 참조해보면 적어도 약 1 %의 v/v에서 적어도 15%의 v/v 포름아미드(formamide)와, 교배를 위해 적어도 1M에서 2M의 소금을, 그리고 세척 조건을 위해 적어도 1M에서 2M 의 소금을 포함한다. 택일적인 엄격한 조건은 필요하다면, 중간 정도의 엄격한 것과 같은 것에 적용될 수 있으며 이것은 적어도 약 16 %의 v/v에서 적어도 30%의 v/v 포름아미드와, 교배를 위해 적어도 O.5M에서 0.9M의 소금을, 그리고 세척 조건을 위해 적어도 0.5M에서 0.9M 의 소금을 포함하며, 고도의 엄격함은 적어도 약 31%의 v/v에서 적어도 50%의 v/v 포마마이드와, 교배를 위해 적어도 0.0lM에서 0.15M의 소금을, 그리고 세척 조건을 위해 적어도 0.01M에서 0.15M 의 소금을 포함한다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 SOCS 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 이의 의체에 관련되며, 여기서 상기 SOCS 단백질은 다음과 같이 확인된다.

EST81149, EST180909, EST182619, ya99H09, ye70co4, yh53c09, yh77g11, yh87h05, yi45h07, yj04e06, yq12h06, yq56a06, yq60e02, yq92g03, yq97h06, yr90f01, yt69c03, yv30a08, yv55f07, yv57f09, yv87h02, yv98e11,yw68d10, yw82a03, yx08a07, yx72h06, yx76b09, yy37h08, yy66b02, za81f08, zb18f07, zc06e08, zd14d06, zd51h12, zd52b09, ze25g11, ze69f02, zf54f03, zv66h12, zs83a08 그리고 zs83g08 에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS4;

mc65f04, mf42e06, mp10c10, mr81g09 그리고 mt19h12 에 의해 특징 지워 지는 마우스 SOCS-4;

EST15B103, EST15B105, EST27530, 그리고 zf50fO1에 의해 특징 지워 지는 휴먼SOCS-5;

mc55a01, mh98f09,my26h12, 그리고 ve24e06에 의해 특징 지워 지는 마우스 SOCS-5;

yf61e08, yf93a09, yg05f12, yg41f04, yg45c02, yh11h10, yh13b05, zc35a12,ze02h08, zl09a03, zl69e10, zn39d08 그리고 zo9e06에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS-6;

mc04c05, md48a03, mf31d03, mh26b07, mh78e11, mh88h09, mh94h07, mi27a04, 그리고 mj29c05, mp66g04, mw75g03, va53b05, vb34h02, vc55d07, vc59e05, vc67d03, vc68d10, vc97h01, vc99c08, vd07h03, vd08c01, vd09b12, vd19b02, vd29a04 그리고 vd46d06에 의해 특징 지워 지는 마우스 SOCS-6;

STS WI30171, ESTO0939, EST12913, yc29b05, yp49f10, zt1Of03 그리고 zx73g04에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS-7;

mj39a01 그리고 vi52h07에 의해 특징 지워 지는 마우스 SOCS-7;

mj6e09m 그리고 vj27a09 에 의해 특징 지워 지는 마우스 SOCS-8;

CSRL-82f2-u, EST114054, yy06b07, yy06gO6, zr40cO9 , zr72h01, yx92c08, yx93b08 그리고 hfe0662에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS-9;

me65d05 에 의해 특징 지워 지는 마우스 SOCS-9;

aa48h10, zp35h01, zp97h12, zq08hO1, zr34g05, EAT73000 그리고 HSDHEI005에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS-10;

mb14d12, mb40f06, mg89b1l, mq89e12, mp03g12 그리고 vh53c11에 의해 특징지워 지는 마우스 SOCS-10;

zt24h06 그리고 zr43b02에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS-11;

EST59161에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS-13;

ma39a09, me60c05, mi78g05, mk10c11, mo48g12, mp94a01, vb57c07 그리고 vh07c11에 의해 특징 지워 지는 마우스 SOCS-13;

mi75e03, vd29a11 그리고 vd53g07에 의해 특징 지워 지는 인간SOCS-14;

또는 42도의 덜 엄격한조건하에서 상기 나열된 EST 의 임의의 것에 교배가 가능한 핵산분자에 의해 특징 지워 지는 상기 EST의 유도체 또는 동족체.

또 다른 실시예에서, 뉴클레오티드 서열은 다음의 아미노산 서열을 암호화 한다.

여기서,

X₁은 L, I, V, M, A 또는 P;

X₂는 임의의 아미노산 잔기;

X₃는 P, T 또는 S;

X₄는 L, I, V, M, A또는 P;

X₅는 임의의 아미노산;

X₆는 임의의 아미노산;

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W;

X₈은 C, T, 또는 S;

X₉는 R, K, 또는 H;

X₁₀은 임의의 아미노산;

X₁₁은 임의의 아미노산;

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P;

X₁₃은 임의의 아미노산;

X₁₄는 임의의 아미노산;

X₁₅는 임의의 아미노산;

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S;

[X_i]_n은 n아미노산의 서열이며 n 은 1부터 50까지의 아미노산이고 여기서 서열X_i는 임의의 아미노산 잔기로부터 선택된 동일한 또는 다른 아미노산으로 구성된다.

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P;

X₁₈은 임의의 아미노산;

X₁₉는 임의의 아미노산;

X₂₀은 L, I, V, M, A,또는 P;

X₂₁은 P;

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G;

X₂₃은 P 또는 N;

[X_j]_n은 n아미노산의 서열이며 n 은 1부터 50까지의 아미노산이고 여기서 서열X_j는 임의의 아미노산 잔기로부터 선택된 동일한 또는 다른 아미노산으로 구성된다.

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P;

X₂₅는 임의의 아미노산;

X₂₆은 임의의 아미노산;

X₂₇은 Y 또는 F; 그리고

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P.

상기 서열 비교는 바람직하게는 분자 전체에 대해서 행해진 것이나 부분적으로 행해질 수도 있다. 바람직하게는 상기 비교는 적어도 대략 21개의 뉴클레오티드와 적어도 5개의 아미노산의 인접한 시리즈에 대해 행해진다. 더욱 바람직하게는 상기 비교는 적어도 대략 21개의 인접한 뉴클레오티드 또는 적어도 7개의 인접한 아미노산에 대해서 행해진다. 또한 비교는 SOCS박스 부위 또는 가령 SH2 영역 WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열과 같은 단백질:분자 상호작용 부위를 포함하는 부위에 대해 행해진다.

또한 본 발명의 또 다른 실시예는 분리 폴리펩티드 또는 유도제, 동족체, 유사체 또는 C- 말단 부위에 있는 SOCS 박스를 포함하는 그들의 유사체에 주목한다.

바람직하게는 폴리펩티드는 가령 단백질:DNA 또는 단백질:단백질 상호작용 영역과 같은 단백질:분자 상호작용 영역을 더욱 포함한다. 바람직하게는 이 영역은 SOCS 박스의 N-말단에 위치한다. 특히 단백질:분자 상호작용 영역은 적어도 SH2 영역 ,WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열 중에서 하나인 것이 바람직하다.

바람직하게는 신호전달이 EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-2, IFNγ , TFNα, IL-1 및/또는 M-CSF로부터 선택된 사이토킨에 의해 매개된다. 바람직한 사이토킨은 IL-6, LIF, OSM, IFN-γ 및/또는 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 이다.

더욱 바람직하게는, 단백질은 하기 아미노산 서열을 가지는 SOCS 박스로 구성된다.

여기서,

X₁은 L, I, V, M, A 또는 P;

X₂는 임의의 아미노산 잔기;

X₃는 P, T 또는 S;

X₄는 L, I, V, M, A또는 P;

X₅는 임의의 아미노산;

X₆는 임의의 아미노산;

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W;

X₈은 C, T, 또는 S;

X₉는 R, K, 또는 H;

X₁₀은 임의의 아미노산;

X₁₁은 임의의 아미노산;

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P;

X₁₃은 임의의 아미노산;

X₁₄는 임의의 아미노산;

X₁₅는 임의의 아미노산;

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S;

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P;

X₁₈은 임의의 아미노산;

X₁₉는 임의의 아미노산;

X₂₀은 L, I, V, M, A,또는 P;

X₂₁은 P;

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G;

X₂₃은 P 또는 N;

X₂₄는 L, I, V, M, A,또는 P;

X₂₅는 임의의 아미노산;

X₂₆은 임의의 아미노산;

X₂₇은 Y 또는 F; 그리고

X₂₈은 L, I, V, M, A,또는 P.

더욱이 또 다른 실시예는 분리 폴리펩티드 또는 유도체, 동족체, 유사체 또는 서열 번호 :4(mSOCS1), 서열 번호 :6(mSOCS2), 서열 번호 :8(mSOCS3), 서열 번호 :10(hSOCS1), 서열 번호 :12(rSOCS1), 서열 번호 :14(mSOCS4), 서열 번호 :18(mSOCS5), 서열 번호 :21(mSOCS6), 서열 번호 :25(mSOCS27), 서열 번호 :29(mSOCS8), 서열 번호 :36(hSOCS11), 서열 번호 :41(mSOCS13), 서열 번호 :44(mSOCS14), 서열 번호:46(mSOCS15) 그리고 서열 번호 :48(mSOCS15)에서 실질적으로 설명된 아미노산의 서열을 포함하는 그들의 유사체를 제공하거나 또는 모든 서열에 대해 적어도 15% 상사도를 가지는 서열 또는 상기 나열된 서열의 일부분을제공한다.

바람직한 뉴클레오티드 퍼센트 상사도는 적어도 대략 20%, 적어도 대략 40%, 적어도 대략50%, 적어도 대략70%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 90% 또는 93%, 95%, 98%, 99% 이상과 같은 것을 포함한다.

바람직한 아미노산 상사도는 적어도 대략 20%, 적어도 대략 30%, 적어도 대략 40%, 적어도 대략50%, 적어도 대략 60%, 적어도 대략70%, 적어도 대략 80%, 적어도 대략 90% 적어도 대략 95%, 적어도 대략 97%, 또는 98%, 또는 그 이상을 포함한다.

상기한 대로, 상사도는 모든 분자에 대해서 또는 적어도 대략 21개의 뉴클레오티드 또는 적어도 7개의 아미노산을 포함하는 부위에 대해서 측정된다. 바람직하게는 상사도는 가령 SH2 영역 WD-40 반복배열, 안키린 반복배열 또는 단백질:분자 상호작용 영역 또는 SOCS 박스와 같은 보존부위에서 측정된다.

"상사도"이라는 용어의 의미는 서열 사이의 완전한 일치 또는 서열은 다르더라도 다른 아미노산들이 구조, 기능, 생화학적 및/또는 배열 차원에서 상호 연관되어 있다는 것을 포함한다.

핵산분자는 가령 인간, 영장류, 가축동물(e.g. 말, 소, 양, 당나귀, 돼지),연구실용 시험동물(e.g. 쥐, 들쥐 ,토끼 햄스터, 돼지쥐), 애완용 동물(e.g. 개,고양이) 또는 포획된 야생 동물(e.g. 사슴, 여우,캥거루)등으로부터 채취될 수 있다.

유도체라는 용어는 핵산분자에 관련된 것이건 단백질에 관련된 것이건 간에파트, 돌연변이, 프레그넌트, 그리고 하이브리드 또는 융합 분자외에도 유사체 그리고 글리코실레이션 변형체를 포함한다. 특히 유용한 유도체는 단일 또는 복수의 아미노산 치환 삭제/ 및 또는 SOCS 아미노산 서열에의 첨가를 포함한다.

바람직하게는, 유도체는 기능적 활동을 하거나 길항제 또는 작용제로서 택일적으로 행동한다. 본 발명은 다른 동물류로 부터 얻어진 것으로서 기능적으로 또는 구조적으로 관련이 있는 분자를 포함하는 SOCS의 동족체에 까지 확장된다. 본 발명은 또한 유사체와 유사체를 포함한다. 유사체는 반드시 그렇지는 않으나 일반적으로 비아미노산 구조를 갖는 분자 구성원을 포함하며 유사체는 모방을 의미하므로 기능적으로는 단백질(이 경우에는 SOCS)과 유산한 방식으로 거동할 수 있다. 유사체는 탄수화물 방향환(芳香環), 지질, 또는 다른 복잡한 화학구조를 포함하거나, 또는 조성에 있어서 단백질 가수분해 효소일 수 있다. 여기서 고려된 길항제와 작용제 외에도 유사체는 가령 산호, 해양과 민물의 하천바닥, 식물상과 바이러스조직과 같은 환경을 조직적으로 조사함으로써 찾아낼 수 있다. 이 것은 종종 자연산물 검색(natural product screening)이라고도 부른다. 택일적으로 합성 화합물의 라이브러리(library)는 잠정적으로 유용한 분자에 대해 걸러질 수 있다. 상기한 대로 본 발명은 SOCS의 길항제와 작용제에 관한 것이다. 길항제의 한 예는 엔티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide)서열이다. 유용한 올리고 뉴클레오티드는 적어도 단백질 코드화의 일부분 또는 뉴클레오티드 서열의 "센스"서열에 보완적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 것들이다. 이 엔티센스 뉴클레오티드는 엔티센스구성과 목표가 된 mRNA를 짝짓는 보완적인 토대에 의한 유전자 발현의 특유한 억제를 야기하는데 사용될 수 있으며, 이 엔티센스 접근은 엔티 페럴러 듀플렉스(anti-paraller duplex)를 형성함으로써 유전자의 발현을 명백히 억제할 수 있으며, 결과적으로 유전정보번역의 교배정지를 야기하는 것 같다. 리보자임(Ribozime)과 공동 억제분자(co-suppression molecule)또한 이용될 수 있다. 엔티센스 또는 다른 핵산 분자들은 우선 세포막 투과를 허용하도록 화학적으로 수정될 필요가 있고 또는 혈청의 생존기간을 절반정도 상승기키거나 그렇지 않으면 생체 조건 내에서의 관리를 위해 더욱 안정한 상태로 만들어 줄 필요가 있을 것이다. 항체는 비록 진단 적용시나 SOCS단백질의 정제시에 더욱 유용할지라도, 길항제 또는 작용제로서도 역시 행동할 있다. 길항제 또는 작용제는 다음의 자연산물 검색 또는 화학화합물의 라이브러리 검색에 의해 확인될 수 있으며, SOCS단백질의 유도체 또는 유사체일 수도 있다.

따라서, 본 발명은 본 발명의 SOCS단백질의 유사체에 까지 미친다. 예를 들면 유사체는 가령 자기면역, 면역억제, 또는 과민성면역, 또는 헤모포이에틱(haemopoietic), 내분비, 간장 그리고 신경계통에 관한 질병과 같은 사이토킨이 매개된 기능장애의 치료 또는 예방법에 사용될 수 있으나 이에 한정된느 거은 아니다. 가령 호르몬, 내인성 또는 외인성 분자, 항체, 바이러스, 바이러스의 생산물, 바이러스, 또는 그 구성분, 이온, 호르몬 그리고 기생물과 같은 신호전달 요소에 의해 매개된 기능장애들은 본 발명에 의해 고려된 것들이다.

여기서 고려된 단백질 유사체들은 측쇄에 대한 변경, 비자연적 아미노산 및 또는 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질합성시의 그들의 유도체를 혼입, 그리고 크로스링커(crosslinkers)의 사용과, 단백질 가수분해효소 단백질 또는 그들의 유사체상의 배열상의 제약을 가하는 방법을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의해 고려된 측쇄 변경의 예에는 가령 알데히드 반응에 의한 환원적 알킬화(reductive alkylation) 후에 NaBH₄의 환원에 의하거나, 메틸아세티미데이트(methylacetimidate)의 아미드화(amidination), 아세트산 무수물(aceticanhydride)의 아실화(acylation), 시아네이트(cynate)를 갖는 아미노 그룹의 카바모일화(carbamoylation), 2,4,6-트리니트로벤젠 설포닉(sulphonic) 산 (TNBS)을 갖는 아미노그룹의 트리니트로벤질레이션(trinitrobenzylation), 숙신산 무수물(succininc anhydride)와 테트라하이드로프탈산 무수물(tetrahydrophthalic anhydride)를 갖는 아미노기의 아실화(acylation), 그리고 피리독살-5-포스페이트(pyridoxal-5-phosphate)를 갖는 리신(lysine)의 피리독실화(pyridoxylation) 후에 NaBH₄과 같은 방법에 의한 아미노그룹의 변경을 포함한다.

아르기닌 잔기의 구아디닌 그룹은 가령 2,3-부타니디온(butanidione), 페닐글리옥살(phenylglyoxal) 그리고 글리옥살(glyoxal) 같은 시약으로 이종환식의 응축산물을 형성함으로써 변경될 수 있다.

카르복실기는(carboxyl group) 예를 들면 오-아실리소리아 (O-acylisourea) 형성을 거쳐, 카보디이미드(cabodiimide) 활성화한 후에 대응하는 아미드에 연이은 유도체화 함으로써 변경된다.

설피드릴(sulphydryl) 그룹은 가령, 요드아세트 산(iodoacetic acid) 또는 요드아세트아미드(iodoacetamide)를 갖는 카르복실메틸화(carboxlmethylaton), 시세틱 산(cycetic acid)으로의 과포름 산(performic acid)의 산화, 다른 디올(thiol)화합물을 갖는 혼합 디설파이드(disulphides)의 형성, 말레이미드(maleimide), 말레산 무수물(maleic anhydride)또는 치환 말레이미드를 수반하는 반응, 4-클로로머큐리벤조에이트(4-chloromercuribenzoate), 4-클로로머큐리페닐설포폰 산(4-chloromecuriphenylsulphonic acid), 페닐머큐리 클로라이드(phenylmercury chloride), 2-클로로머큐리 -4 니트로페놀(2-chloromercuri-4-nitrophenol) 그리고 다른 머큐리(mercurials)를 이용하는 머큐리얼 유도체의 형성, 알칼린 pH에서 시아네이트(cyanate)를 수반하는 카르바밀화(carbamolyation) 과 같은 방법에 의해 변경된다. ·

트립토판 잔기는 예를 들면, N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide)의 산화, 2-하이드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 설페닐 할라이드를 갖는 인돌 고리(indole ring)의 알킬화(alkylation)에 의해 변경된다.

반면 티록신 잔기는 테트라니트로메탄(tetranitromethane)이 3-니트로티로신 유도체를 형성하는 니트로화(nitration)에 의해 변경될 수 있다.

히스티딘 잔기의 이미다졸 링(imidazole ring)의 변경은 요드아세트산(isodoacetic acid) 유도체의 알킬화(alkylation) 또는 디에틸파이로카보네이트(diethylpyrocarbonate)의 N-카르브에톡실화(N-carbethoxylation)에 의해 수행될 수 있다.

펩티드 합성시의 비천연 아미드산과 유도체를 혼입하는 예는 놀류신(norleucine), 4-아미노 뷰트릭(4-amino butryc), 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜타노익 산(4-amino-3-hydroxy-5-phenylpentanoic acid), 6-아미노헥사노익 산(6-aminohexanoic acid), t-부틸글리신(t-butylglycine), 노발린(norvaline), 페닐글리신(phenylglycine), 오르니틴, 사코신(sarcosine), 4-아미노-3-하이드록시-5-페닐펜타노익 산(4-amino-3-hydroxy-6-methylhepatanoic acid), 2-티에닐 알라닌(2-thienyl alanine) 및 /또는 아미노산의 D-이소머(D-isomers)의 사용을 포함하나 이에 한정된는 것은 아니다. 여기서 고려된 비자연산 아미노산의 리스트를 표 3 에 나타내었다.

[표 3]

표 7

예컨대, (CH₂)_N(n=1 내지 n=6)의 스페이서 그룹을 갖는 2작용기 아미도 에스테르(imido ester), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), N-하이드록시석신이미드 에스테르(N-hydroxysuccinimide ester)와 같은 호모 2 작용기 교차 결합자(crosslinker) 및 N-하이드록시석신이미드 와 같은 아미노-반응성 모이어티(moiety)와 말레이미도 또는 디티오 모이어티(SH) 또는 카르보디이미드 (COOH)와 같은 다른 그룹에 특정한 반응성 모이어티를 일반적으로 포함하는 헤테로 2작용기 시약을 사용하여 3차원 분자구조를 안정화하기 위해 교차 결합자가 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드는, 예컨대 C_α및 N_α-메틸아미노산의 혼입, 아미노산의 C_α원자 및 C_β원자 사이의 이중 결합의 도입 및 N과 C 말단 사이에 또는 두 개의 측쇄 사이에 또는 측쇄와 N 또는 C 말단(terminus) 사이에 아미드 결합을 형성하는 것과 같은 공유 결합을 도입함에 의한 시클릭 펩타이드 또는 유사체의 형성 등에 의하여 분자구조적으로 제한될 수 있다.

개인에게 투여되거나 진단 시약으로서 사용되는 경우에 사이토킨을 안정화하는데에 이러한 형식의 변형이 중요하다.

본 발명의 다른 실시예로는, 완전한 비글리코실화 분자로부터 변형된 글리코실화 분자로의 일정한 범위의 글리코실화 변이체를 포함한다. 변경된 글리코실화 패턴은 서로 다른 주 세포의 재조합형 분자의 발현으로부터 기인할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 포유류에서 SOCS 단백질의 발현을 조절하기 위한 방법이 개시되는 바, 상기 방법은 SOCS의 발현을 상향 조정하거나 하향 조정하거나 기타 방식으로 조절하기 위하여 충분한 시간과 조건하에서 효과적인 양의 SOCS 발현 조절자와 SOCS를 인코딩하는 유전자 또는 SOCS 유전자의 발현을 제어하는 데에 관여하는 인자/요소(factor/element)를 접촉하는 것을 포함한다. 조절자(modulator)의 한 예로는 IL-6 또는 SOCS 발현의 다른 전사 조정자(regulator)와 같은 사이토킨이 있다.

발현에는 전사(transcription) 또는 번역(translation) 또는 양자 모두가 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 인체에서의 SOCS의 활성을 조절하는 방법이 개시되는 바, 상기 방법은 SOCS 활성을 증가 또는 감소시키기에 충분한 시간과 조건하에서 조절에 효과적인 양의 분자를 상기 포유류에 투여하는 것을 포함한다. 상기 분자는 단백질성 분자(proteinaceous molecule)이거나 화학물(chemical entity)일 수 있으며, SOCS의 유도체이거나 화학적 유사체 또는 SOCS의 결손형 돌연변이체(truncation mutant)일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 SOCS가 생성되기에 충분한 시간과 조건하에서 상기 SOCS를 유도할 수 있는 효과적인 양의 사이토킨으로 SOCS 유전자를 포함하는 세포를 접촉하는 것을 포함하는, SOCS의 합성 또는 SOCS를 전사/번역을 유도하는 방법을 개시한다. 예를 들면, SOCS1은 IL-6에 의하여 유도될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 하나의 세포에서 SOCS 단백질의 수준을 조절하기 위한 방법을 개시하는 바, 상기 방법은 상기 SOCS 단백질의 수준을 조절하기에 충분한 시간과 조건하에서 SOCS 유전자 발현 또는 SOCS 단백질 활성의 조절자의 충분한 양으로 SOCS 유전자를 포함하는 세포를 접촉하는 것을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 신호 전달을 조절하기에 충분한 시간동안 SOCS 유전자 발현 또는 SOCS 단백질 활성의 조절자의 충분한 양으로 상기 세포를 접촉하는 것을 포함하는, SOCS 유전자를 포함하는 세포에서의 신호 전달을 조절하기 위한 방법이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 최소한 하나의 세포가 하나의 SOCS 유전자를 운반하는 세포들 사이의 상호작용에 영향을 미치는 방법을 개시하는 바, 상기방법은 신호 전달을 조절하기에 충분한 시간동안 SOCS 유전자 발현 또는 SOCS 단백질 활성의 조절자의 충분한 양으로 상기 SOCS 유전자를 운반하는 세포를 접촉하는 것을 포함한다.

상기한 바와 같이 본 발명은 상기 SOCS의 작용제(agonist)로서 또는 길항제(antagonist)로서 작용할 수 있는 일정한 범위의 유사제(mimetics) 또는 소형 분자들에 관한 것이다. 상기와 같은 분자들은 산호, 표토, 식물 또는 대양이나 남극 환경 등과 같은 천연물의 스크린(natural product screening)으로부터 획득할 수 있다. 또는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 라이브러리(protein library) 또는 화학물 라이브러리는 용이하게 스크린될 수도 있다. 예컨대, SOCS를 발현하는 M1 세포들은 IL-6의 존재하에서는 분화(differentiation)되지 않는다. 이러한 시스템은 IL-6와 SOCS의 존재하에서의 분화를 허용하는 분자를 스크린하는데 사용될 수 있다. 일정한 범위의 시험 세포들은 소정 범위의 사이토킨에 대한 길항제와 작용제에 대하여 스크린하도록 준비될 수 있다. 상기와 같은 분자들은 작은 분자들인 것이 바람직하며, 아미노산 기원(amino acid origin)이거나 화학물 기원(chemical origin)일 수 있다. 시그날 발생 단백질(예컨대, JAKS)과 상호작용하는 SOCS 분자들은 이 상호작용을 방해하거나 진작시키는 분자들을 검출하기 위한 스크린을 제공한다. 상기와 같은 스크린 프로토콜(screening protocol)은 자연물 스크린을 관여 시킨다.

따라서, 본 발명은, SOCS 또는 그 유도체 또는 SOCS 발현이나 SOCS 활성의 조절자 및 하나 또는 그 이상의 약리적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물(pharmaceutical composition)을 개시한다. 이러한 구성분을 "활성 성분(active ingredient)"이라 칭한다. 본 발명의 상기한 측면들은 모든 SOCS 분자들에 적용되는 것이며, 또한 SOCS1 내지 SOCS15에 국한되는 것은 아니다.

주사 가능한 용도에 적절한 활성 성분을 포함하는 약학적 형태(pharmaceutical form)는, 살균된 주사가능 용액을 즉각 조제하기 위한 살균 수성용액(수용성) 살균 분말을 포함한다. 이들은 제조 및 보존 상태하에서 안정적이어야 하며, 박테리아나 곰팡이 등과 같은 미생물의 오염 활동으로부터 보호되어야 한다. 상기 담체는 용매(solvent)이거나 또는 물, 에탄올, 폴리올(polyol)(예컨대, 글리세롤, 프로릴렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 조성물이거나 식물성 기름 등을 포함하는 분산매(dispersion medium)일 수 있다. 예를 들어, 리시틴(licithin) 등의 코팅물을 사용하거나, 분산물인 경우 요구되는 입자의 크기를 유지함으로써 또한 수퍼팩턴트(superfactant)를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 예컨대 파라벤(paraben), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산(sorbic acid), 티메로살(thirmerosal) 등의 다양한 항균제나 항진균제를 사용함으로써 미생물의 활동을 방지할 수 있다. 다양한 경우에, 예컨대 설탕이나 소금과 같은 등장용제(isotonic agent)를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트(aluminium monostearate)와 젤라틴(gelatin)과 같은 흡수를 지연시키는 용제를 사용함으로서 주사 가능한 성분의 흡수를 연장시킬 수 있다.

상기한 다양한 다른 성분을 요구되는 대로 구비한 적절한 용매에 요구되는 양만큼의 활성 화합물(active compound)을 혼합하고 여과 살균함으로써 살균된 주사 가능 용액을 조제할 수 있다. 살균된 주사 가능 용액을 조제하기 위한 살균 분말의 경우에는, 미리 살균 여과된 그의 용액으로부터 활성 성분 및 원하는 임의의 추가적 성분을 구비한 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조 기술이 바람직한 조제 방법이다.

활성 성분이 적절히 보호되는 경우, 예컨대 불활성 희석제와 함께 또는 흡수가능한 식용 담체와 함께 그들을 구강 투여할 수 있으며, 또는 그들을 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 봉합시키거나 정제로 압축시킬 수도 있다. 구강 치료 투약시에는, 상기 활성 화합물은 부형제(excipient)와 함께 혼합되어 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키(troche), 캡슐, 엘릭시르(elixir), 현택액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 상기와 같은 조성물 및 조제물은 활성 화합물을 중량에 있어서 적어도 1%를 포함하여야 한다. 물론, 상기 화합물 및 조제물의 비율은 단일 단위체의 중량의 약 5 내지 80% 사이에서 필요에 따라 변화할 수 있다. 적절한 복용량에서 치료적으로 유용한 조성물에서의 활성 화합물의 양을 구할 수 있다. 본 발명에 의한 바람직한 조성물 또는 조제물은, 구강 복용 단위 형태가 약 0.1㎍ 내지 2000 mg의 활성 화합물을 포함하도록 조제된다.

정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 이하에 나열된 구성분을 또한 포함할 수 있다. 검(gum), 아카시아(acacia), 콘 스타치(corn starch), 젤라틴 등의 바인더(binder); 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate) 등의 부형제; 콘 스타치, 감자녹말, 알긴산(alginic acid) 등의 붕해제(disintegrating agent); 마크네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 수크로스, 락토스 또는 사카린 등의 감미제 또는 페퍼민트, 노루발풀 기름이나 체리향 등의 방향제 등이 추가된다. 복용 단위 형태가 캡슐인 경우에는 상기한 형식의 제재들에 추가하여 액체 담체가 포함된다. 다양한 다른 제재들이 코팅물나 또는 복용 단위의 물리적 형식을 달리 변경하기 위하여 제공될 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 셸랙 또는 설탕이나 두가지 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및 프로필 파라벤, 체리 또는 오랜지 향 등의 염료 및 방향제 등을 포함한다. 물론, 임의의 복용 단위 형태를 조제하는데에 사용되는 임의의 제제는 약학적으로 순수하여야 하며, 채용된 양에서 본질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 상기 활성화합물은 서방성 제제 및 제형으로 편입된다.

본 발명은 또한 크림, 로숀 및 젤 등과 같은 국부적 외용에 적합한 형식으로 확장될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제에는 임의의 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 상기와 같은 약학적 활성물을 위한 매체(medium)와 작용제(agent)는 본 발명의 기술 분야에 이미 널리 알려져 있다. 어떤 통상적인 매체나 작용제가 상기 활성 성분과 양립할 수 없는 경우 이외에는, 상기의 치료 조성물에 그들을 사용하는 것을 고려할 수 있다. 보충적인 활성 성분도 상기 조성물에 포함될 수 있다.

투약의 편이와 복용의 일관성을 위하여 복용 단위 형태에 모조성물(parental composition)을 공식화하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 복용 단위 형태는 치료될 포유동물에 대한 단위 복용량에 적절한 물리적으로 개별적인 단위체를 칭하는 것으로서, 각 단위체는 요구된 약학적 담체와 결합되어 원하는 치료 효과를 발생시키도록 계산된 활성 물질의 소정량을 포함한다. 본 발명의 새로운 복용 단위형태의 상세는 (a) 활성 물질 및 달성될 특정의 치료 효과의 고유 특성 및 (b) 이하에서 상세히 개시되는 바와 같이 신체적인 건강이 훼손된 병적 질병을 가진 생물의 질병을 치료하기 위한 상기와 같은 활성 물질을 합성하는 기술 분야에 내재된 한계 등에 의하여 지배되며 직접적으로 의존한다.

주요한 활성 성분은, 편리하고 효과적인 투약을 위하여 상기한 바와 같은 복용 단위 형태의 약학적으로 허용 가능한 적절한 담체와 함께 효과적인 양으로 혼합된다. 유닛 복용 형식은, 예를 들면, 상기 주요 활성 화합물을 약 0.5 ㎍으로부터약 2000mg의 범위내에서 포함한다. 부분적으로 발현되면, 상기 활성 화합물은 일반적으로 담체 1mg 당 약 0.5 ㎍으로부터 약 2000mg의 범위의 담체에 존재한다. 보충적 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우에는, 상기 복용은 상기 성분의 일반적인 복용량(dose)과 투약 방식을 참조하여 결정된다. 상기 효과적인 양은 또한 체중의 kg 당 소정량의 형식으로 편리하게 표현될 수도 있다. 예를 들면, 약 0.01ng 내지 10,000mg/kg 체중이 투여될 수 있다.

약학적 조성물은 또한, SOCS 발현 또는 SOCS 활동을 조절할 수 있는 핵산 분자를 운반하여 목표 세포를 감염시킬 수 있는 벡터(vector)와 같은 유전적 분자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 바이러스성 벡터일 수 있다. 본 발명에 의하면, 이 경우에는 특정의 세포를 격리시키고, 유전적으로 조작하여 동일한 피검자(subject) 또는 유전적으로 관련있거나 유사한 피검자에게 복귀시키는 것을 포함하는 일정한 범위의 유전적 치료가 고려된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, SOCS의 항체 및 그 유도체에 관한 기술사상이 개시된다. 상기의 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있으며, 자연적으로 발생하는 SOCS의 항체로부터 선택되거나, SOCS 또는 그 유도체에 대하여 특정적으로 성장될 수도 있다. 후자의 경우에는, SOCS 또는 그 유도체는 먼저 운반자 분자와 결합될 필요가 있다. 본 발명에 의한 상기 항체 및/또는 재조합형(recombinant) SOCS 또는 그 유도체는 특히 치료제 또는 진단제로서 유용하다.

예컨대, SOCS 및 그 유도체는 자연적으로 발생한 SOCS의 항체에 대하여 스크린하는 데에 사용될 수 있다. 이것은 예를 들면 소정의 자기면역 질병에서 발생할 수 있다. 다르게는, SOCS에 대하여 스크린하기 위하여 특정의 항체를 사용할 수 있다. 상기와 같은 시험을 위한 기술은 본 발명의 기술 분야에 널리 알려져 있으며, 예컨대 샌드위치 시험 및 ELISA를 포함한다. SOCS 수준에 대한 지식은 특정의 암진단, 암에 걸리기 쉬운 소질의 진단 또는 사이토킨이 매개된 세포 반응성 감시 또는 특정의 치료적 프로토콜을 감시하기 위하여 증요하다.

본 발명에 의한 SOCS의 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 또는, 항체의 절편은 팹 절편(Fab fragment)로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 재조합형 및 합성 항체(recombinant and synthetic antibody)와 항체 하이브리드(antibody hybrid)에도 확장된다. 여기에서 "합성 항체"는 절편과 항체의 하이브리드를 포함하는 것으로 이해한다. 본 발명의 이러한 측면에 의한 항체는 특히 면역요법에 유용하며, 아폽토시스(apoptosis)의 평가 또는 치료적 양생(therapeutic regimen) 프로그램을 감시하기 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다.

예를 들면, 특정의 항체를 SOCS 단백질에 대하여 스크린하는데에 사용할 수있다. 이것은, 예를 들면 세포 추출물(cell extract) 또는 다른 생화학적 의체의 SOCS 수준에 대하여 스크린하기 위한 수단 또는 배양 상등액(supernatant fluid)으로부터의 재조합 수단에 의하여 생성된 SOCS를 정화하기 위한 수단으로서 중요하다. 여기에서 고려된 시험 기술은 본 발명의 기술 분야에 널리 알려져 있으며, 예컨대 샌드위치 시험이나 ELISA가 포함된다.

상기에서 언급된 1가 항체로 유도되는 임의의 2가 항체(second antibody)(모노클로날, 폴리클로날 또는 항체의 절편 또는 합성 항체)는 본 발명의 범위에 속한다. 1가 및 2가 항체는 모두 검출 시험에 사용될 수도 있으며, 1가 항체는 상용화된 항-면역글로불린(anti-immunoglobulin) 항체와 사용될 수도 있다. 여기에서 언급하는 항체는 SOCS의 임의의 부위에 특유한 임의의 항체를 모두 포함한다.

폴리클로날 및 모노클로날 항체 모두 효소 또는 단백질을 면역조치함으로써 획득할 수 있으며, 어느 것이나 면역 시험에 사용될 수 있다. 두 타입의 혈청을 획득하는 방식은 널리 알려져 있다. 폴리클로날 혈청은 덜 선호되지만, 적절한 실험실용 동물에 효과적인 양의 SOCS나 그의 항원부(antigenic part)를 주사하고, 그 동물로부터 혈청을 수집하여 알려진 임의의 면역 흡착 기술로 특정의 혈청을 격리 시킴으로써 상대적으로 용이하게 조제할 수 있다. 이러한 방법으로 생성된 항체는 거의 모든 형식의 면역 시험에 사용될 수 있지만, 제품의 잠재적인 이질성(heterogeneity)로 인해 일반적으로 선호되지 않는다.

면역 시험에 모노클로날 항체를 사용하는 것은, 그들을 대량으로 생산할 수 있다는 것과 그 제품의 균질성(homogeneity)으로 인하여 특히 선호된다. 영속적인세포주와 면역 유전적 조제에 민감해진 임파구를 융합함으로써 유도되는 모노클로날 항체의 생성을 위한 하이브리도마 세포주의 조제는 본 발명의 기술 분야에 널리 알려진 기술에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 피검자로부터의 생화학적 견본에서 SOCS를 검출하기 위한 방법을 개시하는 바, 상기 방법은 항체-SOCS 복합체가 형성되기에 충분한 시간과 조건하에서 SOCS 또는 그 유도체나 동족체에 특유한 항체로 상기 생화학적 견본에 접촉하고 상기 복합체를 검출하는 것을 포함한다.

SOCS의 존재는 웨스턴 블로팅(Western blotting)이나 ELISA 프로시져 등과 같은 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 미국 특허 제 4,016,043 호, 제 4,424,279호 및 제 4,018,653 호를 참조하면 광범위한 면역 시험 기술이 활용가능함을 알 수있다. 물론, 이러한 것들에는 비경쟁 형식(non-competitive type) 시험으로서 1 지점 및 2 지점 시험 또는 "샌드위치" 시험과 전통적인 경쟁적 결합 시험이 포함된다. 이러한 시험에는 표적에 라벨을 붙인 항체를 직접 결합하는 것도 포함된다.

샌드위치 시험은 가장 유용하고 널리 사용되는 시험으로서 본 발명에서도 선호된다. 샌드위치 시험 기술에는 다수의 변형이 있는데, 본 발명은 그 모두를 포괄한다. 간단히 전형적인 전방 시험을 설명하면, 라벨을 붙이지 않은 항체를 고체 기판에 고정시키고 시험될 견본을 상기 결합된 분자와 접촉하도록 접근시킨다. 항체-항원 복합체가 형성되기에 충분한 적절한 시간 동안 배양한 후에, 상기 항원에 특유한 것으로서 검출 시그날을 생성할 수 있는 리포터 분자(reporter molecule)로 표지가 부착된 2가 항체를 추가시키고 항체-항원-표지가 붙은 항체의 또 다른 복합체가 형성되기에 충분한 시간 동안 배양한다. 반응하지 않은 모든 제재를 소제하고, 상기 리포터 분자에 의하여 생성된 시그날을 관찰함으로써 항원의 존재를 판단한다. 그 결과는 단순히 가시적인 시그날을 관찰함에 의하여 정성적일 수도 있으며, 기지의 양의 합텐(hapten)을 포함하는 제어 견본과 비교함으로써 정량적일 수 도 있다. 전방 시험의 변형으로서 동시 시험(simultaneous assay)이 포함되는데, 여기에서는 견본과 표지가 붙은 항체 모두가 상기 결합된 항체에 동시에 추가된다. 이러한 기술은 본 발명의 기술 분야에 널리 알려진 것으로서, 명백한 작은 변형은 모두 여기에 포함된다. 본 발명에 의하면, 상기 견본은, 세포 추출물, 이탈 조직(tissue biopsy)이나 혈청, 타액, 점액질의 분비물, 림프액, 조직액 및 호흡액 등을 포함하는 SOCS를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 샘플은 일반적으로 생화학적 액체를 포함하는 생화학 견본일 뿐만 아니라, 세포 배양 등으로부터의 발효액과 상등액으로 확장된다.

전형적인 전방 샌드위치 시험에서는, SOCS 또는 그의 항원부에 대한 특이성을 갖는 1가 항체는 고체 표면에 공유적으로 또는 수동적으로 결합된다. 상기 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 폴리머인데, 가장 널리 사용되는 폴리머로는 세포룰로즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비널 클로라이드 또는 폴리프로필렌 등이 있다. 상기 고체 지지기(solid support)는 관, 구슬, 초소형 접시인 원판 또는 면역 시험을 수행하기에 적당한 임의의 어떤 표면이어도 좋다. 결합 프로세스는 이미 널리 알려져 있으며, 일반적으로 교차 링크 공유 결합(cross-linking covalent binding)이나 물리적 흡착을 포함하며, 폴리머-항체 복합체는 시험 견본을 조제하면서 소제된다. 그 다음에, 상기 시험될 견본의 부분 표본(aliquot)을 상기 고체 상태의 복합체에 추가시키고 상기 항체에 존재하는 임의의 서브유닛(subunit)의 결합이 가능하기에 충분한 시간(예컨대, 2 내지 40분 또는 보다 편리하게는 밤새도록)과 조건(예컨대, 실온 내지 37℃)하에서 배양한다. 배양 주기 이후에, 상기 고체 상태의 항체 서브유닛을 소제하고 건조시켜, 합텐의 일부에 특이한 2가 항체로 배양한다. 상기 2가 항체는 상기 2가 항체가 상기 합텐에 결합된 것을 지시하는데 사용되는 리포터 분자에 링크된다.

다른 방법에 의하면, 상기 표적 분자를 생화학적 견본에 고정시키고 그 다음에 리포터 분자로 표지를 붙이거나 붙이지 않은 특정의 항체에 상기 고정된 표적을 노출시킨다. 표적의 양과 리포터 분자의 시그널의 강도에 따라, 항체에 직접 표지를 붙임으로써 결합된 표적을 검출할 수 있다. 또는, 표적-1가 항체-2가 항체의 3차 복합체를 형성하기 위하여, 상기 표적-1가 항체 복합체에 상기 1가 항체에 특이한 것으로서 표지를 붙인 2가 항체를 노출시킨다. 상기 복합체는 상기 보고서 분자에 의하여 발산되는 시그널에 의하여 검출된다.

본원의 명세서에서 "보고서 분자"라 함은, 그 화학적 특성에 의하여 항원-결합 항체를 검출할 수 있도록 하는 해석적으로 식별 가능한 시그널을 제공하는 분자를 의미한다. 검출은 정성적일 수도, 정량적일 수도 있다. 이러한 형식의 시험에서 가장 널리 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단(fluorophore) 또는 방사성 핵종함유 분자(예컨대, 방사성 동위원소) 및 화학 발광 분자 등이다.

효소 면역 시험의 경우에는, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의하여 상기 2가 항체에 접합된다. 그러나, 이미 알려진 바와 같이, 다양한 다른 접합 기술이 존재한다. 널리 사용되는 효소에는, 무엇보다도 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 베타갈락토시다제(betagalactosidase) 및 알카리성 포스파타아제(phosphatase) 등이 있다. 특정의 효소에 사용될 기질은 일반적으로 해당 효소에 의한 검출 가능한 색상의 변화를 생성하도록 선택된다. 적절한 효소의 예로는, 알칼리성 포스파타아제와 과산화효소가 포함된다. 형광발생적 기질(fluorogenic substrate)을 채용할 수도 있으며, 이는 상기한 색원적 기질(chromogenic substrate)과 달리 형광물질을 산출한다. 모든 경우에, 효소-표시된 항체를 상기 1가 항체 합텐 복합체에 추가하여 결합시키고, 그 다음에 초과하는 시약은 소제한다. 그 다음에 적절한 기질을 포함하는 용액을 항체-항원-항체 복합체에 추가한다. 상기 기질은 2가 항체에 결합된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 시그널을 생성하고, 이는 다시 상기 견본에 존재하는 합텐의 양에 대한 지수(indication)을 제공하도록 분광 측광적으로 정량화된다. "리포터 분자"는 또한 세포 응집의 사용 또는 유액 구슬 상의 적혈구 등과 같이 응집의 억압으로도 확장된다.

또는, 플루오레세인(fluorescein)과 로다민(rhodamine)과 같은 형광 화합물(flourescent compound)은 그 결합능(binding capacity)의 변화없이 항체와 화학적으로 결합될 수 있다. 특정 파장의 빛으로 조사되어 활성화되면, 형광 색소로 표지가 붙은 항체는 빛 에너지를 흡수하여 분자내에 여기 상태를 유도하고, 광학 현미경으로 시각적으로 검출 가능한 특성색의 빛을 발산한다. EIA에서와 같이, 형광 표지가 붙은 항체는 상기 1가 항체-합텐 복합체와 결합할 수 있게 된다. 결합되지 않은 시료를 소제한 후에, 잔류하는 3차 복합체는 적절한 파장의 빛에 노출되어 관찰되는 형광은 합텐의 존재를 나타낸다. 면역 형광(immunofluorescene) 및 EIA 기술은 본 발명의 기술 분야에서 이미 확립된 기술이며, 본 발명의 방법에서 선호된다. 그러나, 방사성 동위 원소, 화학 루미네슨스 또는 생화학 루미네슨스 분자와 같은 다른 리포터 분자도 채용될 수 있다.

본 발명은 또한 SOCS 유전자 또는 그 유도체를 검출하기 위한 PCR 분석 등과 같은 유전적 시험을 개시한다. 그에 연관되어 사용되는 다른 방법에는, 특정의 올리고뉴클레오티드 이종교배(oligonucleotide hybridization)과 같은 단일 스트랜드 정합 다형 분석(Single Stranded Conformation Polymorphisms Anlyis; SSCP)이나 직접 단백질 결손 시험(direct protein truncation test)와 같은 직접적인 뉴클레오티드 서열화(sequencing) 또는 돌연변이 스캐닝이 포함된다.

사이토킨은 일부 SOCS 분자의 전사에 관여하므로, SOCS의 검출에 의하여 사이토킨 또는 사이토킨의 활성에 대한 대용 마커(surrogate marker)를 제공하게 된다. 이것은, 예를 들어 류마티스성 관절염, 당뇨병 및 스티프맨 증후군(Stiff Man Syndrome)과 같은 질병을 자기 면역되게 하는 등과 같은 소정 범위의 질병으로 피검자를 평가하는 데에 유용하다.

본 발명에 의한 핵산 분자는 DNA이거나 RNA일 수 있다. 상기 핵산 분자가 DNA 형태라면, 그것은 게놈 DNA(genomic DNA)이거나 cDNA일 수 있다. 본 발명에 의한 RNA 형태의 핵산 분자는 일반적으로 mRNA이다.

본 발명에 의한 핵산 분자는 일반적으로 격리된 형태를 취하지만, 벡터 분자및 특히 발현 벡터 분자 등과 같은 다른 유전적 분자에 혼입되거나 결찰되거나 그와 융합되거나 연관될 수 있다. 벡터 및 발현 벡터는 일반적으로 복제될 수 있으며, 가능한 경우에는 원핵 세포(prokaryotic cell) 또는 진핵 세포(eukaryotic cell)의 어느 하나 또는 그 모두로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 원핵 세포는 대장균, 바실러스 속 및 수도모나스 속(E. coli, Bacillus sp and Pseudomonas sp)를 포함한다. 바람직하게는, 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 포유류, 및 곤충 세포를 포함한다.

따라서, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 벡터 부분 및 포유류와 특히 인간의 SOCS 유전자 부분을 포함하는 유전자 구조를 개시하는 바, 상기 SOCS 유전자 부분은 SOCS 폴리펩티드 또는 작용적 또는 면역적으로 상호작용적인 그의 유도체를 암호화할 수 있다.

바람직하게는, 상기 유전자 구조의 SOCS 유전자 부분은 벡터의 프로모터와 동작적으로 결합되어 상기 프로모터는 적절한 세포에서 상기 SOCS 유전자 부분의 발현을 유도할 수 있게 된다.

또한, 상기 유전자 구조의 상기 SOCS 유전자 부분은, 글루타티온-S-전이효소 또는 그 일부 등과 같은 다른 유전자 서열에 융합된 유전자의 전부 또는 일부를 포함한다.

본 발명은 이러한 유전적 구조 및 이것을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에 미친다.

본 발명은 또한 돌연변이체, 파트(part), 절편(fragments), 포션(portions), 동족체 및 유사체, 또는 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 대한 단일의 또는 다수의 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환, 부가 및/또는 삭제를 포함하는 그들의 암호화 유전적 서열을 포함하는 SOCS의 모든 유도체에 미친다. 본 발명은 또한 SOCS의 유사제(mimetics), 작용제(agonists) 및 길항제(antagonists)에 미친다.

본 발명의 SOCS 및 그 유전자 서열은 일정 범위의 치료 및 진단시약의 생성에 유용할 것이며, 특히 특정 세포반응에 포함된 사이토킨 또는 그 사이토킨의 수용체의 검출에 유용할 것이다. 예를들어 SOCS1 유전자를 발현시키는 M1 세포와 같은 SOCS 유전자 발현 세포는, SOCS1, IL-6의 경우에서와 같이 특정 사이토킨에 반응하지 않을 것이다. 명확하게, 본 발명은 SOCS1부터 SOCS15까지와 같은 어떤 SOCS유전자를 발현하는 M1세포 같은 세포들에 주목한다. 더 나아가 본 발명은 치료적 사이토킨의 능력을 조절하고 강화시키는 분자의 용도를 제공한다. 예를들어, 어떤 SOCS 활성을 차단하는 분자는 잠재적인 치료적 사이토킨 활성에 작용할 수 있다. (예를들어, G-CSF)

가용성 SOCS 폴리펩티드는, 또한 고도 면역증(hyperimmunity), 면역 억제증, 알레르기, 고혈압 등과 같은 사이토킨 매개 세포 반응을 포함하는 질병, 손상 또는 이상의 치료에 특히 유용하다고 주목되고 있다.

본 발명의 추가적인 특징은 사이토킨 매개 세포 반응을 포함하는 질환의 치료제의 생산에 있어서 SOCS 또는 그의 기능적 유도체의 용도에 주목하고 있다는 것이다.

본 발명은 또한 SOCS 유전자를 발현하는 트란스제닉(transgenic) 포유동물의 세포에 주목하고 있다. 이러한 세포들은 사이토킨 기능의 억제를 검출하는데 유용한 인디케이터 세포주(cell line)이다. 한 예는 SOCS 유전자를 발현하는 M1 세포이다. 이러한 세포주들은 사이토킨을 스크린하는데, 또는 식물, 산호, 미생물, 또는 생물유기화학적 활성 토양 또는 물로부터 자연적으로 발생하는 사이토킨 길항제 또는 작용제로서 작용할 수 있는 분자들을 스크린하는데 유용할 것이다.

본 발명은 또한 동종 또는 이종 동물 종들로부터 유래된 서로 다른 SOCS 간의 하이브리드에 주목한다. 예를 들면, 어떤 하이브리드는 마우스 SOCS1과 인간SOCS1의 전부 또는 어떤 기능성 부분(part) 사이에서 형성될 수 있다. 다른 경우에, 그 하이브리드는 마우스 SOCS1과 인간 SOCS2의 전부 또는 어떤 기능성 부분(part) 사이에서 형성될 수 있다. 모든 이러한 하이브리드가 본 발명에서 주목되고, 다상유전적(pleiotropic) 분자의 개발에 특히 유용하다.

본 발명은 또한 SOCS 유전자 결함을 가진 개인을 가려내는 일정 범위의 유전자 기반(based) 진단법에 주목한다. 이러한 돌연변이(mutation)는 특정 사이토킨에 반응하지 않거나 일정 질병을 유발하는 과잉반응을 일으키는 세포 타입을 초래할 수 있다. 이 SOCS 유전자 서열은 일정범위의 PCR 또는 유전자 내에 돌연변이가 있는지 판별하는 다른 기술을 사용하여 쉽게 확인될 수 있다. 그리고 나서 적절한 유전자 치료 또는 다른 조정적(interventionist) 치료가 채택될 수 있다.

본 발명은 또한 아래의 예시적인 실시예에 의해 설명된다. 실시예 1-16은 활성에 따라 분류된 SOCS1, SOCS2, 및 SOCS3에 관한 것이다. 실시예 17-24는 유전자 서열의 상사도에 따라 최초로 클론된 SOCS4 내지 SOCS15의 다양한 특징에 관한 것이다. 실시예 25-36은 SOCS4 내지 SOCS15의 각각의 특정한 특징에 관한 것이다.

실시예 1

세포배양 및 사이토킨

M1 세포주는 SL 마우스[Ichikawa, 1969]에서 자연적으로 발생한 백혈병으로부터 추출했다. 본 연구에 사용된 M1 모세포는 약 10년 동안 오스트랄리아, 빅토리아, 멜버른에 있는 Walter and Eliza Hall Institute for medical Research에서 사용되어 왔다. M1 세포는 10%(v/v) 소 태아 혈청(foetal bovine serum; FCS)을 포함하는 둘베코 수정 이글 배양액(Dulbecco's modified Eagle's medium; DME)에서 1주일 동안 유지시켰다. 재조합 사이토킨은 일반적으로 상업적 원료로부터 얻을 수있거나 또는 공지된 방법에 의해 준비하였다. 재조합 쥐과 LIF는 이미 알려진 것처럼 [Gearing, 1989] 대장균(Escherichia coli)에서 생성되어 정제되었다. 정제된 인간 옹코스타틴(oncostatin) M은 PeproTech Inc(Rocky Hill, NJ, USA)로부터 구입 하였으며, 정제된 쥐과 IFN-γ 는 Genzyme Diagnostics(Cambrige, MA, USA)로부터 얻었다. 재조합 쥐과 트롬보포이에틴(thrombopoietin)은 CHO 세포에서 FLAGTM-표시 된 융합 단백질로서 생성하고 정제하였다.

실시예 2

한천 콜로니 검출법(AGAR COLONY ASSAYS)

사이토킨에 반응하는 M1 세포의 분화를 검출하기 위해서, 300 개의 세포를, 20%(v/v) 소태아혈청(FCS), 0.3%(w/v) 한천, 및 IL-6, LIF, OSM, IFN-γ, tpo 또는 덱사메타존(Sigma Chemical Company, St Louis, MI)의 0.1ml의 순차적 희석액으로 채운 DME 1ml를 포함하는 35mm 페트리 접시에서 배양했다. 공기 중에 10%(v/v) CO2를 포함하고 37도C의 포화습도상태에서 7일간 배양한 후 M1세포 콜로니의 수를 세었고, 콜로니가 분산된 세포들로 구성되었는지 또는 밀집된 중심부를 가진 분산된 세포의 코로나 형태인지에 따라 분화를 분류하였다.

실시예 3

레트로바이러스 라이브러리의 생성(GENERATION OF RETROVIRAL LIBRARY)

cDNA 발현 라이브러리는 본질적으로 [Rayner, 1994]에서 알려진 FDC-P1(factor-dependent haemopoietic cell line)으로부터 구성하였다. 간단하게 cDNA는 레트로바이러스 벡터 pRUFneo로 클론된 후 암포트로픽 팩킹 세포주(amphotrophic packing cell line; PA317)속으로 감염시켰다. 하이 티터 바이러스-생성 세포주(high titre virus-producing cell line)를 생성하기 위하여, 일시적으로 생성된 바이러스를 48시간의 후형질감염(posttransfection)시 세포 상징액으로부터 추출하여 Y2 이코트로픽 팩킹 세포(ecotropic packing cell)를 감염하는데 사용되었다.

실시예 4

M1 세포의 레트로바이러스 감염

10⁶감염된 Ψ2 세포액을 (30OOrad)로 방사선에 쪼이고, 37 ℃에서 2일 동안 10%(v/v) FCS 및 4㎍/ml 폴리브렌(polybrene)으로 채운 DME에서 10⁶M1세포와 공동배양하였다. IL-6 비반응 클론을 선택하기 위해, 레트로바이러스 감염된 M1 세포를 DME에서 한 번 세척하고, 40O㎍/ml 제네티신(geneticin)(GibcoBRL, Grand Island, NY) 및 100ng/ml IL-6를 포함한 1ml 한천 배양액에서 약 2x10⁴세포/m1로 배양했다. M1 세포의 감염 효율은 단지 제네티신 존재하에서 그 감염 세포를 한천에 이식함으로써 예측된 대로 1%-2%였다.

실시예 5

PCR

레트로바이러스 감염된 M1 세포로부터의 게놈 DNA를 Sac I으로 절단한 후, 1㎍의 페놀/클로로포름 추출 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의해 증폭시켰다. 삽입된(integrated) 레트로바이러스로부터의 cDNA 삽입(insert)의 증폭에 사용된 프라이머(primer)는, 벡터 개그(gag) 서열 약 30 bp 5' 다중 클로닝 지점에 해당하는 GAG3 (5' CACGCCGCCCACGTGAAGGC 3' [서열번호:1]) 및 pMC1neo 서열 약 20O bp 3' 다중 클로닝 지점에 해당하는 HSVTK (5' TTCGCCAATGACAAGACGCT 3' [서열번호:2])였다. PCR은 94도C에서 5분 동안 초기 변성(denaturation)하고, 94도C에서 1분 동안 변성을 35 주기 행한 후, 56도C에서 2분동안 어닐링하고, 72도C에서 3분동안 익스텐션(extension)한 후 마지막으로 10분동안 익스텐션했다. PCR 생성물은 겔 정화한 후 pGEM-T 플라스미드(Promega, Madison, WI)와 연결시키고, ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit 및 Model 373 Automated DNA Sequencer(Applied Biosystems Inc. , Foster City, CA)를 사용하여 시퀀스했다(sequenced).

실시예 6

cDNA의 클로닝 (CLONING OF cDNAs)

마우스 SOCS1을 암호화(encoding)하는 독립적 cDNA 클론들은 쥐과 동물의 흉선 cDNA 라이브러리로부터 본질적으로 힐튼등의 방법(Hilton 등 1994)에 의해 분리되었다. 마우스 SOCS1 cDNA의 뉴클리오티드 및 유추된 아미노산 서열은 BLASTN 및 TFASTA 알고리즘을 사용하는 데이터 베이스와 비교하였다(Pearson 및 Lipman 1988; Pearson, 1990; Altshcul 등, 1990). 올리고뉴클리오티드는 사람의 SOCS1, 마우스의 SOC-1 및 마우스의 SOCS3를 암호화하는 EST들로부터 디자인되었으며, 시판되는마우스의 흉선 및 비장 cDNA 라이브러리를 검출하는 데 사용되었다. 시퀀싱은 제조자의 권고에 따라 ABI 자동화 시퀸서를 사용하여 수행하였다.

실시예 7

서던 및 노던 블롯 분석 및 RT-PCR

(SOUTHERN AND NORTHERN BLOT ANALYSES AND RT-PCR)

³²P-라벨 프로브(probe)는 랜덤 데카뉴클리오티드 라벨링 키트(random decanucleotide labelling kit)(Bresatec, Adelaide, 남부오스트레일리아)를 사용하여, 플라스미드 pPGKneo의 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycin phosphotransfease)를 암호화하는 600 bP Pst I 절편, 1.4kbp PCR 산물을 Xho I로 절단하여 얻은 SOCS1 유전자의 1070bp 절편, SOCS2, SOCS3, CIS 및 치킨 글리세르알데히드(glyceraldehyde) 3-인산 디하이드로게네이즈(phosphate dehydrogenase) 유전자의 1.2kbp 절편으로부터 생성되었다.

게놈 DNA는 본질적으로는 프로테이나제(proteinase) K-소듐 도데칠(dodecyl)설페이드 과정에 기술된 방법을 사용하여 세포로부터 분리되었다. 15 마이크로그램의 DNA를 SacI 또는 BamHI 중 하나로 절단하고, 0.8%(w/v) 아가로스(agarose) 겔상에서 분획하고, 진TM크린플러스(GeneScreen Plus) 멤브레인(Du Pont NEN, 보스톤 MA)으로 전이시켜, 프리-하이브리다이즈 한 다음 (prehybridsed), 랜덤-프라임드(random- primed)³²P-라벨 DNA 절편으로 하이브리다이즈하고, 알려진 바[Sambrook, 1989]와 본질적으로 같은 방법으로 세정하였다.

전체 RNA는 제조자(GilcoBRL. Grand Island, NY)에 의해 권고된 바와 같이 트리졸 시약(Trizol reagent)을 사용하여 세포 및 조직으로부터 분리되었다. 요구된 폴리 A + mRNA가 알려진 방법으로[Alexander, 1995] 정제되었다. 노던 블롯들은 프리-하이브리다이즈 되고, 랜덤-프라임드 32P 라벨 DNA 절편으로 하이브리다이즈되고, 알려진 방법으로(alexander, 1995) 세정되었다.

IL-6에 의한 SOCS 유전자의 유도(induction)를 평가하기 위하여, 마우스 (C57BL6)들에게, 5㎍ IL-6이 정맥주사 되었고, 주사 후 지정된 시점에서 간을 채취하였다. M1 세포는 20ng/ml IL-6의 존재하에 배양되어 지정된 시간에 채취하였다. RT-PCR 분석을 위해서, 골수(bone marrow) 세포가 알려진 방법(Metaclf 등 1995)으로 채취되었으며, 100ng/ml의 사이토킨(cytokine)류로 37℃에서 1시간 동안 자극되었다. RT-PCR은 알려진 방법(Metcalf 등 1995)에 의해 전체 RNA에 대해 수행되었다. PCR 산물은 아가로스 겔에 대해서 용해되어, 서던 블롯은 각 SOCS 패밀리 구성원에 대해 특이적인 프로브와 하이브리다이즈 되었다.β -액틴의 발현이 균일한 증폭(amplification)을 확인하기 위해서 평가되었다.

실시예 8

DNA 구성 및 형질감염(DNA CONSTRUCTS AND TRANSFECTOON)

에피토프-표지(epitope-tagged) SOCS1을 암호화하는 cDNA는, pEF-BOS 발현 벡터 내로[Mizushima, 1990] 전체 SOCS1 코딩 영역을 서브클로닝(subcloning)하여 생성되었고, 개시 메티오닌의 인프레임 FLAG 에피토프 다운스트림(pF- SOCS1)을 암호화하도록 처리되었다. 알려진 방법[Hilton, 1994]인 일렉트로포레이션(electroporation)을 사용하여, 트롬보포이에틴 수용체(thrombopoietin receptor)를 발현하는 M1세포는 Aat Ⅱ-절단 pF-SOCS1 발현 플라스미드 20㎍ 및 Sca I-절단 플라스미드로 형질 감염되었다. 이때, 퓨로마이신(puromycin) N-아세틸 전이효소를 암호화하는 cDNA의 전사(transcription)는 마우스 포스포글세로키나제(phosphoglcerokinase) 프로모터로부터 유도된다. 48시간의 배양후에, 형질감염된 세포는 20㎍/ml 퓨로마이신(Sigma Chemical Company, St Louis MO)에 의해 선택되었고, 제조자(Eastman Kodak, Rochester NY)의 지시에 따라 M2 항-FLAG 모노클로날 항체를 사용하여, 웨스턴(Western) 블로팅에 의해 SOCS1의 발현을 스크린하였다. 다른 실험에서 M1 세포는 pF-SOCS1 플라스미드 또는 대조군만으로 형질 감염되었으며, IL-6 100ng/ml의 존재하에서 한천에서 성장시킬 수 있는 능력으로 선택되었다.

실시예 9

면역침강 및 웨스턴 블로팅

(IMMUNOPRECIPITATION AND WESTERN BLOTTING)

면역침강 또는 웨스턴 블로팅에 앞서서, 10⁷M1세포 또는 그 유도체들은 두번 세척되고, DME 1ml에 재현탁(resuspend)되었고, 37℃에서 30분간 인큐베이트되었다. 그후에 세포는 염(salin) 또는 100ng/ml IL-6으로 37℃에서 4분간 자극되었고, 그 후에 바나드산염 나트륨(sodium vanadate)(sigma chemical Co., St Louis, MI)이 1mM의 농도로 부가되었다. 세포들은 아이스(ice) 위에 놓여졌고, 1mM 바나드산염 나트륨을 포함하는 염으로 한 번 세척되었으며, 그 후 컴플리트 프로데아제인히비터(Complete protease inhibitors: Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 및 1mM 바나드산염 나트륨을 포함하는 300㎕ 1%(v/v) 트리톤(Triton) X-100, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM 트리스(Tris)-HCl pH 7.4로 아이스 위에서 5분동안 가용화되었다. 용균액(Lysate)은 원심분리에 의해 정제되었으며, 코마쉬 단백질 분석액(Coomassie Protein Assay Reagent: Pierce, Rockford IL)를 사용하여 정량하였다.

면역침강(immnoprecipitation)을 위해서, 동일 농도의 단백질 추출물(1-2mg)을 1시간 동안 또는 밤새 4℃에서, 항-gp130 항체(M20; Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA) 4㎍ 또는 항-포스포티로신(anti-phosphotyrosine) 항체(4G10;Upstate Biotechnology Inc.Lake Placid NY), 4㎍ 중 하나와, 15㎕ 포장된 프로테인 G 세파로즈(Pharmacia, Uppsala, Sweden)[Hilton 등 1996]과 함께 인큐베이트 하였다. 면역침강물은 컴플리트 프로데아제 인히비터(Complete protease inhibitor: Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 및 1mM 바나드산염 나트륨을 포함하는 1%(v/v) NP40, 150mM NaCl, 50mM 트리스-HCl pH 8.0에서 세척되었다. 시료들은 SDS 시료 버퍼(625mM 트리스-HCl pH 6.8, 0.05%(w/v) SDS, 0.1%(v/v) 글리세롤, 브로모페놀, 0.125%(v/v) 2-머캅토에탄올)에서 95℃에서 5분간 가열되었으며, SDS-PAGE에 의해 분획되고, 전술한 것처럼 이뮤노블롯(immunoblott)되었다.

웨스턴 블롯팅을 위해서, 세포추출물로부터의 단백질 또는 면역침강 반응으로부터의 물질 10㎍ 이 4-15%의 Ready gels(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)상에 로딩되었으며, SDS-PAGE(sodium dodecyl sulgate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 용해되었다. 단백질은 100V에서 1시간 동안 PVDT 멤브레인(Micron Separations Inc. Westborough MA)으로 전달된다. 이 멤브레인은 다음의 1가 항체로 검출되었다; 항-티로신 인산화 STAT3(anti-tyrosine phosphorylated STAT3, 1:1000 희석; New England Biolabs, Beverly, MA); 항-STAT3(C-20; 1:1000 희석: Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz CA); 항-gp130(M20, 1:100 희석; Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz CA); 항-포스포티로신 (anti-phosphotyrosine : horseradish peroxidase-conjugate RC20, 1: 5000희석; Transduction Laboratories, Lexington KY); 항-티로신 인산화 MAP 키나제(kinase)와 항-MAP 키나제 항체(kinase antibody)(1:10OO 희석; New England Biolabs, beverly, MA). 블롯들은 퍼록시다제-결합 2가 항체(peroxidase-conjugated secondary antibody) 및 ECL(Enhanced Chemiluminescence) 시약을 사용하여 제조자(Piece, Rockford IL)의 지시에 따라 시각적으로 확인되었다.

실시예 10

일렉트로포레틱 운동성 전이 분석법

(ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAYS)

분석평가는 알려진 방법으로[Novak, 1995], 고친화력 SIF(c-sis-inducible factor) 결합 지점 m67[Wakao, 1994]을 사용하여 수행되었다. 단백질 추출물은 염, 100ng/ml IL-6 또는 100ng/ml IFN-γ 중 어느 하나를 포함하는 10ml의 무혈청(serum-free) DME에서 37℃에서 4-10분 동안 인큐베이트 된 M1 세포로부터 준비되었다. 결합반응은 4-6㎍단백질(주어진 실험 내에서 일정), 5ng³²p-표지 m67 올리고뉴클리오티드(oligonucleotide) 및 800ng 초음파 처리된 연어 정자 DNA을 포함하였다. 어떤 실험에서는, 알려진 바와 같이[Novak, 1995], 단백질 시료는 과량의 비표지(unlabelled) m67 올리고뉴클리오티드, STAT1(Transduction Laboratories, Lexington, KY) 또는 STAT3(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz CA) 중 어느 하나에 대해 특이적인 항체로 사전에 인큐베이트 처리되었다(preincubate).

웨스턴 블롯은 알려진 방법((Nocola 등, 1996)에서처럼, 항-티로신 인산화 STAT3(anti-tyrosine phosphorylated STAT3), 항-STAT3(New England Biolabs, Beverly, MA) 또는 항-gp130(Santa Cruz Biotechnology Inc.)을 사용하여 수행되었다. EMSA는 알려진 것처럼(Novak 등, 1995)m67 올리고뉴클리오티드 프로브를 사용하여 수행되었다.

실시예 11

사이토킨 신호 전달의 새로운 억제유전자의 발현 클로닝

(EXPRESSION CLONING OF A NOVEL SUPPRESSOR OF CYTOKINE SIGNAL TRANSDUCTION)

사이토킨 신호 전달(transduction)을 억제할 수 있는 cDNA들을 확인하기 위해서, 발현 클로닝 방법을 채택하였다. 이러한 전략은 M1세포와, 성숙한 매크로파지(mature macrophage)로 분화된 단핵 백혈병 세포주(monocylic leukaemia cell line)에 중점을 두었으며, 사이토킨 IL-6, LIF, OSM 및 IFN-γ , 그리고 스테로이드 덱사메타손(steroid daxamethasone)에 반응하여 분열증식(proliferation)을 중지한다. 모 M1 세포(paent M1 cell)들은 RUFneo 레트로바이러스(retro virus)로 감염시켰으며, 유전인자-의존(factor-dependent) 조혈 세포주(haemopoietic cell line) FDC-P1으로부터 cDNA들을 클론된다. 이 레트로바이러스에서, 네오마이신 저항 유전자 및 클론된 cDNA의 모두의 전사(transcription)는 레트로바이럴 LTR(retroviral LTR)(도 1)에서 제공된 강력한 구성 프로모터 (powerful constitutive promoter)를 드라이브 오프(drive off)시켰다. 반고체 상태의 한천(semi-solid agar)에서 배양될 때, 모 M1세포는 매우 긴하게 팩된 군체(colonies)를 형성한다. IL-6으로 자극할 때, M1세포는 빠른 분화(differentiate)를 겪게되고, 작은 분산된 세포 클러스터 또는 단일한 매크로파지만을 한전에서 형성하는 결과가 된다. IL-6에 반응하지 않는 레트로바이러스로 감염된 M1세포는, IL-6 및 제너티신(geneticin)의 존재 하에서 크고, 긴하게 팩된 군체를 형성할 수 있도록 배양된 반고체 상태의 한천에서 선택되어졌다. 단안정 가능한(single stable) IL-6-비반응 클론, 4A2는 10⁴의 감염된 세포를 조사하여 얻어진다.

네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자는 클론 4A2로부터 게놈 DNA의 서던 블롯을 검출하는 데 사용되었으며, 이것은 세포주가 길이가 1.4kbp인 cDNA를 포함하는 단일 레트로 바이러스로 감염되었다는 것을 확인시켜준다. cDNA 클로닝 지점을 접하는 레트로바이럴 벡터(retroviral vector)로부터 프라이머(primer)를 사용하는 PCR 증산은, 1.4kbp cDNA 삽입의 회복을 가능하게 하였으며, 그것을 사이토킨 시그널링-1의 억제자(suppressor of cytokine signalling-1) 또는 SOCS1이라고 명명하였다. 이 PCR 생성물은 4A2 게놈 DNA의 유사한 서던 블롯을 검출하도록 사용되고, 두 개의 절편에 대해 하이브리다이즈(hybridize)된다. 여기서 하나는 내생적인(endogenous) SOCS1 유전자에 대응하며, 다른 하나는 삽입된 fP트로바이러스(도 2)로 클론된 SOCS1 cDNAdp 대응하는 네오 프로브(neo probe)를 사용하여 관찰된 밴드의 크기에 매치(match)된다. 후자는 무관한(irrelevant) cDNA를 포함하는 레트로 바이러스에 감연된 하나의 M1세포 클론에서 관찰되지 않았다. 이와 유사하게, 노던 블롯 분석은 SOCS1 mRNA가 세포주 4A2에서 많지만, M1 세포 클론 감염된 대조구에서는 그렇지 않다는 것을 확인시켜준다.

실시예 12

SOCS1, SOCS2, SOCS3 및 CIS 가 단백질을 포함하는 SH2의 새로운 패밀리를 정의함

(SOCS1, SOCS2, SOCS3 AND CIS DEFINE A NEW FAMILY OF SH2-SONTAINING PROTEINS)

SOCS1 PCR 생성물은 마우스의 흉선 cDNA 라이브러리로부터 동족체(homologous)를 분리하기 위한 프로브로 사용된다. PCR 생성물과 동일한 것으로 판명 cDNA의 서열 SOCS1 단백질의, 돌연변이라기보다는 과잉 발현over expression)이나 구성은 IL-6 비반응된 표현형(phenotype)을 발생시키기 위해서는 충분하였다. SOCS1 cDNA의 서열을 뉴클리오티드 서열 데이터 베이스와 비교하면, 마우스 염색체 16 위에서 발견된 프로타민 유전자 클러스터를 포함하는 마우스 및 래트 게놈 DNA 클론 위에서 발현된다는 것을 확인할 수 있다. 보다 자세한 검사에 의하면, 1.4kb SOCS1 서열은 프로타민 유전자의 어떤 것에 대하여 동족체가 아니었으며, 오히려, 이러한 클론의 맨끝의(extreme) 3'에 위치하는 사전에 확인되지 않은 공개판독 프레임(previously unidentified open reading frame)을 나타내었다(도 3). 게놈 로커스(genomic locus)와 SOCS1 cDNA 순차 사이의 불연속한 리젼(region)이 없었으며, SOCS1이 단일 엑손(exon)에 의해 암호화되는 것으로 제안한다. 프로타민 유전자를 포함하는 게놈 클론에 부가하여, 일련의 뮤린 및 사람의 발현된 서열화된 택(ESTs: expressed sequenced tags) 또한 마우스 SOCS1에 대한 큰 블록의 뉴클리오티드 서열 동일성을 나타낸다. 사람의 EST에 의해 제공된 서열 정보는 사람의 SOCS1를 암호화하는 cDNA의 빠른 클로닝을 가능하게 한다.

마우스 및 래트 SOCS1 유전자는 212 아미노산 단백질을 암호화하는 한편, 사람의 SOCS1 유전자는 211 아미노산 단백질을 암호화한다. 마우스, 래트 및 사람의 SOCS1 단백질은 95-99%의 아미노산 동일성을 가지고 있다(도 9). SOCS1의 예측된 아미노산 서열을 가진 전달된 핵산 데이터 베이스의 검색으로, 최근의 클론된 사이토킨 유도 가능한 바로 전의 유전자 생성물, CIS 및 EST의 두가지 클래스에 가장 관련되었다는 것을 확인할 수 있다.

EST들의 두 개의 클래스로부터 전체 길이 cDNA는 분리되어지고, 유사한 길리및 전체 구조의 단백질을 SOCS1 및 CIS로 부호화하도록 된다. 이러한 클론들은 SOCS2 및 SOCS3라 명명된다. 4개의 단백질 각각은 중앙의 SH2 영역 및 SOCS 모티프로 종료되는(termed) C-말단 영역을 포함한다. SOCS1 단백질은 다른 종들 사이에서 매우 높은 정도의 아미노산 서열 상사도(95-99%동일성)으로 표현된다. 그러나, 동일한 동물로부터 SOCS1, SOCS2, SOCS3 및 CIS의 형태들은, 단백질을 포함하는 SH-2의 새로운 패밀리를 확실히 정의하는 동안 낮은 아미노산 동일성을 나타낸다. SOCS2 및 CIS는 거의 38%의 아미노산 동일성을 나타내며, 한편, 패밀리의 나머지 멤버는 약 25%의 아미노산 동일성(도 9)을 공유한다. SOCS2 및 CIS에 대한 유전자의 코딩영역이 하나 및 두 개의 인트론(intron)을 각각 포함하는 한편, SOCS1 및 SOCS3에 대한 유전자의 코딩 영역은 인트론을 포함하고 있지 않은 것으로 보인다.

여기에서 관련된 서열에 대한 젠뱅크 액새스 넘버(Genbank Access Numbers)는, 마우스 SOCS1 cDNA(U88325), 사람 SOCS1 cDNA(U8826), 마우스 SOSC2 cDNA(U88327), 마우스 SOCS4 cDNA(U88328)이다.

실시예 13

SOCS1의 구성 발현이 사이토킨 범위의 작용을 억제함

(CONSTITUTIVE EXPRESSION OF SOCS1 SUPPRESSES THE ACTION OF A RANGE OF CYTOKINES)

4A2 세포주의 표현형은, 이러한 세포에서 독립적으로 발생될 수도 있을 유전자 변화에 관련되지 않고, SOCS1의 발현에 직접적으로 관련된다는 내용을 수립하기 위해서, EF1α 프로모터의 대조구 하에서 SOCS1의 에피토프-택(epitope-tagged)된 버전을 암호화하는 cDNA는 모 MI세포로 감염되었으며, 이때, M1세포는 트롬보포이에틴, c-mpl(M1.mpl)을 위한 수용체를 발현한다. SOCS1 표현 벡터의 세포주으로의 감염은 IL-6 반응하지 않은 M1 세포의 빈도를 증가하게 하는 결과를 가져온다.

M1 세포 발현 SOCS1의 다중 독립 클론은, 웨스턴 블롯에 의해 검출된 것처럼, 4A2로부터 구별될 수 있는 시토킨-비반응 표현형을 표시하였다. 또한, 감염체(transfectants)들이 퓨로마이신에서 유지되지 않는다면, SOCS1의 발현은 시간을 상실하며, 세포는 시토키닌 반응성을 재획득한다. 시토키닌이 없을 때, 콜론을 발현하는 4A2 및 다른 SOCS1으로부터 얻은 콜로니는 특별히, 대조구 M1 세포에 의해 형성된 콜론보다도 작은 크기로 성장되었다(도 10).

시토키닌의 범위에 대해 M1세포의 반응에 대한 구성 SOCS1의 효과는 4A2 세포주 및 SOCS1을 발현하는 M1.mpl 세포의 클론을 사용하여 조사된다. 모M1 세포 및 M1.mpl 세포와 달리, SOCS1을 발현하는 두 개의 세포주는 계속하여 증식되며, IL-6, LIF, OSM, IFN-γ 중 어느 하나 또는 M.mpl. SOCS1세포주의 경우에 트롬보포이에틴에 반응하여 분화된 콜로니를 형성하는 데 실패한다.

그러나, 두 가지 모두의 세포주에 대해서, SOCS1은 그 자체로서 분화보다는특별히 영향받은 사이토킨 신호 전달에 영향을 준다고 가정하면, 덱사 메타손에 대한 정상적인 반응이 관찰된다. 이러한 데이터와 일관되게, L-6, 4A2에 반응하여 모 M1 세포 및 M1.mpl.가 커지고 액포가 발생되는 한편, SOCS1 세포는 IL-6 또는다른 사이토킨에 반응하여 형태학적 분화의 증거를 보여주지는 않는다.

실시예 14:

SOCS1은 STAT3 포스포릴레이션 및 활성화를 포함하여 IL-6 신호 전달 과정범위를 억제함.

세포면 수용체 성분 gp130, 세포질 티로신 키나아제 JAK1 및 전사 인자 STAT3의 포스포릴레이션은 IL-6 신호 전달에 중추적인 역할을 하는 것으로 추정된다. M1 M1.mpl 모세포계 및 이의 SOCS1 발현 카운터파트에서 비교를 행한다. 예상된 바와 같이, gp130은 두 모세포계의 IL-6에 반응하여 신속하게 포스포릴레이트되나, SOCS1을 발현하는 세포계에서는 5∼10배 감소된다(도 6). 마찬가지로, STAT3 포스포릴레이션은 또한 SOCS1을 발현하는 세포계에 반응하여 약 10배 감소된다(도 6). STAT3 포스포릴레이션의 감소와 일치하게, 전기이동법에 의한 이동도 전이 검정에 의해 측정된 바와 같이, 특이 STAT DNA 결합 복합체의 활성화도 감소된다. 그중에서도 특히, IL-6로 자극된 M1 세포에서 유도된 3개의 STAT 복합체인 SIF-A(STAT3 함유), SIF-B(STAT1/STAT3 헤테로다이머) 및SIF-C(STAT1 함유)의 생성이 감소된다(도 7). 유사하게는, SOCS1의 항상성 발현도 IFN₈γ로 자극된 p91 호모다이머의 생성을 억제한다(도 7). STAT 포스포릴레이션 및 활성화는 shc 및 MAT 키나아제를 포함하여, 다른 프로테인의 포스포릴레이션으로서 SOCS1 발현에 의해 행해지는 유일한 세포질 과정이 아니라, 유사한 정도로 감소된다(도 7).

실시예 15:

SOCS1 유전자의 전사는 시험관내 및 생체내에서 IL-6에 의해 자극됨.

M1 세포내에서 항상성 발현을 할 때에 SOCS1가 사이토킨 신호 전달을 억제할수 있더라도, 이는 반드시 SOCS1가 정상적으로 작용하여 IL-6 반응을 네가티브하게 조절하는 것을 나타내지는 않는다. 이러한 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 SOCS1 유전자의 전사가 IL-6에 대한 M1 세포의 반응에서 조절되고, 이러한 중요한역할 때문에 IL-6가 상처 및 감염에 대한 민감한 상 반응, 5mg IL-6의 정맥주사에 대한 간의 반응을 조절하는데 역할을 하는지를 결정했다. IL-6이 없는 경우에는, SOCS1 mRNA은 M1 세포 또는 간에서 검출할 수 없었다. 그러나, 두 종류의 세포에 있어서, 1.4kb SOCS1 유전정보가 IL-6에 의해 20∼40분 이내에 유도되었다(도 8). IL-6가 실험 전체를 통해 존재하는 M1 세포에 있어서는, 잔존하는 SOCS1 mRNA 레벨이 상승된다(도 8). 이와는 대조적으로, IL-6은 단순 정맥주사에 의해 생체내에 투여되어, 순환에 의해 신속하게 클리어되어, 간에 대하여 IL-6 자극 펄스를 유도한다. 이것과 일치하게, SOCS1 mRNA 의 일시적인 발현은 간에서 검출될 수 있는데, 이는 주사후 약 40분 후에 절정에 달하고 4시간 이내에 기저 레벨로 감소된다(도8).

실시예 16

SOCS유전자 조절

CIS는 사이토킨-유도 즉각 초기유전자(cytokine-inducible immediate early gene)로서 클론되었으므로 본 발명자들은 SOCS 1, SOCS2 및 SOCS3도 유사하게 조절되었는지를 조사하였다. 암수 C57B1/6쥐(도11A)로부터 채취한 여러 종류의 조직에서 얻어진 mRNA의 노턴블롯분석법(Northern blot analysis)을 이용하여 4개의 SOCS 유전자의 기본적인 발현 패턴을 조사하였다. 흉선(thymus)에서는 SOCS1의 항상적발현이 관찰되었으며, 비장과 폐에서는 이것이 별로 관찰되지 않았다. SOCS2 발현은주로 고환에서만 관찰되었고, 어떤 동물에서는 주로 간장 및 폐에서만 관찰되었다. SOCS3에 대해서는 폐, 비장 및 흉선에서 낮은 수준의 발현이 관찰되었고, 한편 CIS 발현은 고환, 심장, 폐, 신장 및 경우에 따라 간장을 포함하는 여러 장기에 넓게 분포되어 있었다.

본 발명자들은 4개의 SOCS 유전자의 발현이 IL-6에 의해 조절될 수 있는지의 여부를 확인해 보았다. 처리되지 않고 IL-6를 주사한 마우스의 간장으로부터 또는 자극을 주지않고 IL-6로 자극한 M1세포로부터 얻어진 mRNA의 노턴블롯과 SOCS1, SOCS2, SOCS3 및 CIScDNA (도 11B)로 라벨을 붙인 조각들을 혼합하였다. IL-6를 주사한 간에서 4개의 모든 SOCS의 발현은 증가되었으나, 그 유도 반응속도는 각각 다르게 나타났다. 즉, 간에서 SOCS1 및 SOCS3의 발현은 일시적으로 나타났고, IL-6의 주사후 20분이 경과한 후에 mRNA가 검출되었으며, SOCS 발현은 4시간내에 그리고 SOCS3 발현은 8시간 내에 기본수준까지 감소하였다. 간에서의 SOCS2 및 CIS mRNA의 유도반응속도는 SOCS1의 초기 유도반응속도와 유사하지만 적어도 24시간동안은 그보다 빠른 반응속도를 유지하였다. 다른 장기 특히 폐 및 비장에서도 SOCS 유전자 mRNA에서의 유도현상과 유사한 유도현상이 관찰되었다. 이와 대조적으로 M1 세포에서는 IL-6에 의해 SOCS1 및 CIS mRNA는 유도되었으나 SOCS2 및 SOCS3 발현은 검출되지 않았다. 이와 같은 결과는 동일 사이토킨에 대한 반응시 SOCS 유전자군(family)의 발현에 있어서 세포타입에 따른 특수한 차이가 있음을 강조하는 것이다.

다양한 SOCS 유전자군의 전사(轉寫)를 유도할 수 있는 사이토킨류의 스펙트럼을 조사하기 위하여 골수세포를 일군의 사이토킨류로 자극한 후, mRNA을 추출하고, cDNA을 합성하였다. 다음에, PCR을 이용하여 SOCS1, SOCS2, SOCS3 및 CIS (도 11C)의 발현을 조사하였는데, 자극이 없는 상태에서는 SOCS 유전자는 거의 또는 전혀 검출되지 않았고, 여러 가지 사이토킨류로 자극한 골수세포는 하나이상의 SOCS 유전자군에 대해 mRNA를 조절할 수 있는 것으로 나타났다. 예로써, IFNγ는 4개의 SOCS 유전자 모두에 대해 발현을 유도하는데 비해, 에레트로포이틴 (erythropoietin), 그래뉼로사이트 콜로니 자극인자(granulocyte colony-stimuiating factor), 그래뉼로사이트-매크로퍼지 콜로니 자극인자 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor) 및 인터류킨-3(interleukin-3)은 SOCS2, SOCS3 및 CIS의 발현을 유도하였다. 흥미롭게도 타입I 사이토킨 수용체 분류의 범주에 들지 않는 수용체 역할을 하는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor alpha), 매크로퍼지(macrophage), 콜로니 자극인자 및 인터류킨-1(interleukin-l)도 또한 SOCS3 및 CIS 발현을 유도하였는데, 이는 SOCS 단백질이 신호 전달(signal transduction)의 조절시 광범위한 역할을 함을 암시하는 것이다.

SOCS 구조발현은 M1세포가 다양한 사이토킨류에 대해 반응하는 것을 억제하므로 발명자들은 IL-6 신호 전달에서 중요한 역할을 하는 세포의 표면 수용체 성분 gp130의 포스포릴레이션(phosphorylation) 및 전사인자 STAT3이 영향을 받는지의 여부를 조사하였다. M1 모세포계 및 M1.mpl 모세포계 그리고 SOCS1을 발현하는 대조군에서 비교하였다. 예상대로, gp130은 양 모세포계에서 IL-6에 반응하여 신속하게 포스포릴레이션되었으나, SOCS1(도 12A)를 발현하는 세포계에서는 이것이 감소되었다.

마찬가지로, STAT3 인산화는 SOCS1을 발현하는 그 세포주에서 IL-6에 반응하여 감소되었다. (도12A) STAT3 인산화 감소와 일치되게, 일렉트로포레틱 이동 전이검출(electrophoretic mobility shift assay)에 의해 결정 특정 STAT/DNA 결합 복합체(binding complexes)의 활성화 또한 감소되었다. 현저하게, IL-6로 자극된 M1세포 내에 유도된 주요 STAT 복합체인 SIF-A(STAT3를 포함하는) 및 SIF-B(STAT1/STAT3 헤테로다이머(heterodimer))의 형성이 없었다.(도 12B) 비슷하게, SOCS1의 항상적 발현(constitutive expression)은 또한 SIF-C(STAT1 호모다이머(homodimer); 도12B)의 IFNγ-자극 형성을 저해하였다. 이러한 실험은 SOCS1이 JAK 키네이즈(kinases)의 레벨에서 수용체의 신호 전달 업스트림(upstream)과 STAT 인산화를 저해한다는 제안과 일치되는 것이다.

신호 전달 및 궁극적으로 사이토킨에 대한 생물학적 반응을 저해시키는 SOCS1의 능력은, SH2-포함 포스파타제(phosphatase) SHP-1 [IhLE et al, 1994; Yi et al, 1993]과 같이, SOCS 단백질이 신호 전달 프로세스를 억제하는 것에 의해 다양한 범위의 세포외 자극(extracellular stimuli)에 대한 세포 반응의 강도 및/또는 기간을 조정하는 데에 중심적인 역할을 할 수 있다는 것을 제안한다. 여기서제공되는 증거는, SOCS 패밀 리가 사이토킨 신호 전달에 대한 전통적인 네가티브 피드백 루프 내에서 작용한다는 것을 가리킨다. OSM과 같은 다른 유전자들 처럼, SOCS 단백질을 암호하는 유전자의 발현은 STATs의 활성화를 통해서 사이토킨에 의해 유도된다. 한번 발현되면, SOCS 단백질이 JAKs의 활성을 저해시키고, 따라서 수용체 및 STATs의 인산화를 감소시키고, 그것에 의해 신호 전달 및 어떤 계속되는 생물학적 반응을 억제할 것으로 예상된다. 중요하게는, STAT 활성화의 저해가 SOCS유전자 발현을 오래동안 감소시켜 세포가 사이토킨에 대한 반응성을 회복하도록 할 것이다.

실시예 17

데이터베이스 서치

발현된 서열 태그(Expressed Sequence Tags; ESTs)의 주요한 데이터베이스 및 인간 발현 서열 태그의 TIGR 데이터베이스를 포함하는 NCBI 유전자 서열 데이터베이스 (Genbank)가, TFASTA 및 MOTIF/PATTERN 알고리즘 [Pearson, 1990; Cockwell and Giles, 1989]를 이용하여, 보존(consensus) SOCS 박스 서열과 유사성을 갖는 서열들을 찾기 위해 서치되었다. 소프트웨어 팩키지 SRS [Etzold et al, 1996]을 사용하여, SOCS 박스와 유사성을 나타내는 ESTs (및 cDNAs의 다른 말단의 시퀀싱으로부터 유래된 그들의 파트너들)과가 회수되었고, Autoassembler(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 콘티그(contigs)열로 어셈블되었다. 그후 중첩된(overlapping) ESTs로부터 유래된 보존 뉴클레오티드 서열은 BLASTN[Altschul et al, 1990]을 사용하여 다양한 데이터베이스를 서치하는데에 이용되었다. 다시, 포지티브 ESTs가 회수되었고, 상기 콘티그(contig)에 부가되었다. 이러한 과정이 추가적인 ESTs가 발견되지 않을 때까지 반복되었다. 그 후 마지막보존 뉴클레오티 서열이 시퀀스 네비게이터(Sequence Navigator;Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 번역되었다.

새로운 SOCS 단백질을 암호화하는 ESTs는 다음과 같다.

인간 SOCS4 (EST81149, EST180909, EST182619, ya99H09, ye70co4, yh53c09, yh77gl1, yh87h05, yi45h07, yj04e06, yq12h06, yq56a06, yq60e02, yq92g03, yq97h06, yr90f01, yt69c03, yv30a08, yv55f07, yv57h09, yv87h02, yv98el1, yw68dl0, yw82a03, yx08a07, yx72h06, yx76b09, yy37h08, yy66b02, za81f08, zb18f07, zc06e08, zd14g06, zd51h12, zd52b09, ze25gl1, ze69f02, zf54f03, zh96e07, zv66h12, zs83a08 and zs83g08). 마우스 SOCS-4 (mc65f04, mf42e06, mp10c10, mr81g09, and mt19h12). 인간 SOCS-5 (EST15Bl03, EST15Bl05, EST27530 and zf50f01). 마우스 SOCS-5 (mc55a01, mh98f09, my26h12 and ve24e06). 인간 SOCS-6(yf61e08, yf93a09, yg05f12, yg41f04, yg45c02, yh1lfl0, yh13b05, zc35a12, ze02h08, zl09a03, zl69el0, zn39d08 and zo39e06). 마우스 SOCS-6(mc04c05, md48a03, mf31d03, mh26b07, mh78el1, mh88h09, mh94h07, mi27h04 and mj29c05, mp66g04, mw75g03, va53b05, vb34h02, vc55d07, vc59e05, vc67d03, vc68d10, vc97h01, vc99c08, vd07h03, vd08c01, vd09b12, vd19b02, vd29a04 and vd46d06). 인간 SOCS-7 (STS WI30171, EST00939, EST12913, yc29b05, yp49f10, zt10f03 and zx73g04). 마우스 SOCS-7 (mj39a0l and vi52h07). 마우스 SOCS-8 (mj6eO9 and vj27a029). 인간 SOCS-9 (CSRL-82f2-u, EST114054, yy06b07, yy06g06, zr40c09, zr72h01, yx92c08, yx93b08 and hfe0662). 마우스 SOCS-9 (me65d05). 인간 SOCS-10 (aa48h10, zp35h01, zp97h12, zq08h01, zr34gO5, EST73000 and HSDHEI005). 마우스 SOCS-10 (mb14d12, mb40fO6, mg89b11, mq89e12, mp03g12 and vh53c11). 인간 SOCS-11 (zt24h06 and zr43b02). 인간 SOCS-13 (EST59161). 마우스 SOCS-13 (ma39a09, me60c05, mi78g05, mk10c11, mo48g12, mp94a01, vb57c07 and vh07c11). 인간 SOCS-14 (mi75e03, vd29h11 and vd53g07).

실시예 18

cDNA 클로닝

중첩된 EST로부터 유래한 보존 서열에 기하여 SOCS 가족(familiy)의 다양한 구성원에 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 디자인하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 라벨링하여 시판되는 게놈 라이브러리와 λ 파아지에 클론된 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용하였다. 마우스 SOCS4와 마우스 SOCS5 및 마우스 SOCS6의 전체 암호영역을 포괄하는 게놈 및/또는 cDNA 클론을 분리하였다. SOCS15 전체 유전자는 인간 12p13BAC(Genbank Accession Number HSU47924)와 마우스 염색체 6 BAC(Genbank Accession Number AC002393)상에 위치한다. 마우스 SOCS7, SOCS9, SOCS10, SOCS11, SOCS12, SOCS13 및 SOCS14의 부분 cDNA도 역시 분리되었다.

실시예 19

노던 블럿(Northern blot)과 rtPCR

노던 블럿(Northern blot)을 상기와 같이 실시했다. 하이브리디제이션 프로브 원(sources)은 다음과 같다.

i ) 마우스 SOCS1 cDNA의 전체 암호영역

ii) SH2 영역 업스트림의 SOCS 5 암호영역으로부터 유래한 1059 bp PCR 산물

iii) 마우스 SOCS 6 cDNA의 전체 암호영역

iv) 부분 SOCS 7 cDNA의 암호영역으로부터 유래한 790 bp PCR 산물

v) 치킨 글리세르알데하이드 3-인산 디하이드로게네이즈(GAPDH) cDNA의 1200 bp Pst I 절편

실시예 20

SOCS 패밀리의 추가 구성원

SOCS1, SOCS2 및 SOCS3은 실시예 1∼16에서 설명한 SOCS 단백질 패밀리의 구성원들이다. 그 각각은 SOCS 박스로 명명된 중앙의 SH2 영역과 C-말단 보존 모티프(motif)를 포함한다. 이 단백질 패밀리에 포함되는 추가적인 구성원을 분리하기 위해, SOCS 박스에서 보존된 잔기에 해당하는 아미노산 서열로 다양한 DNA 데이터베이스를 검색했다. 이 검색 결과 SOCS 단백질 패밀리에 속하는 12개 구성원을 암호하는 인간 및 마우스 EST가 존재하는 것이 밝혀졌다(도 13 참조). 이 서열 정보을 이용하여 SOCS4, SOCS5, SOCS6, SOCS7, SOCS8, SOCS9, SOCS10, SOCS11, SOCS12, SOCS13, SOCS14 및 SOCS15를 암호하는 cDNA를 분리하였다.

EST와 cDNA로부터 유래한 콘티그(Contig)를 추가 분석한 졀과, SOCS 단백질은 SOCS 박스의 유추된 N-말단 구조에 따라 3그룹으로 배치할 수 있었다. 3그룹은,

i ) SH2 영역이 있는 그룹

ii) WD-40 반복배열이 있는 그룹 및

iii) 안크린(ankyrin) 반복배열이 있는 그룹이다.

실시예 21

SH2 영역이 있는 SOCS 단백질

SH2 영역을 가진 8개의 SOCS 단백질의 정체가 밝혀졌다. 여기에는 SOCS1, SOCS2과 SOCS3, SOCS5, SOCS9, SOCS11 및 SOCS14가 포함되어 있다(도 13 참조). 전체 길이의 cDNA는 마우스 SOCS5, SOCS14와 SOCS9 및 SOCS14를 암호하는 부분 클론으로부터 분리되었다.

1차 아미노산 서열과 게놈구조를 분석한 결과, 이들 단백질의 쌍들(pairs)이 (SOCS1과 SOCS3, SOCS2와 CIS, SOCS5 및 SOCS14, 글리고 SOCS9와 SOCS11) 매우 밀접하게 관련되어 있음을 시사하고 있다(도 13 참조). 게다가, SOCS5와 SOCS14의 SH2 영역은 거의 동일하며(도 13B 참조), CIS, SOCS1 및 SOCS2와는 달리, SOCS5와 SOCS14는, 비록 덜 보존되어 있지만, SH2 영역에 앞서는 광범위한 N-말단 부위를 갖고 있다(도 13A 참조).

실시예 22

WD-40 반복배열이 있는 SOCS 단백질

WD-40 반복배열을 포함하는 4개의 SOCS 단백질이 확인됐다. SH2 영역이 있는 SOCS 단백질과 마찬가지로 이들 단백질의 쌍들(pairs)은 매우 밀접하게 관련되어 있는 것으로 보인다. 마우스 SOCS4와 SOCS6의 전체 길이의 cDNA가 분리되었고, SOCS 박스의 8개 WD-40 반복 N-말단을 가지는 단백질을 암호하는 것으로 보이고(도13 참조), SOCS4 및 SOCS 6은 65%의 아미노산 상사도를 가진다. SOCS15는 인간 염색체 12p13 및 마우스 염색체 6(Ansari-Larietal, 1997)의 syntenic region의 BAC를 시퀀싱한 결과, 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로 확인됐다.

인간과 침판지 및 마우스에 있어서 SOCS15는 삼탄당 인산 아이소머레이스(triose phosphate isomerase: TPI)의 3' 말단에 있는 수백개의 염기쌍내의 2개의 코딩 엑손을 가진 유전자에 의해 암호되나 TPI(9)의 반대편 가닥은 암호하지 못한다.

C-말단 SOCS 박스에 더하여 SOCS15 단백질은 4개의 WD-40 반복배열을 함유하고 있다. 재미있는 것은, EST 데이터베이스 안에 SOCS15와 관련 있는 일련의 선충, 곤충 및 물고기가 들어있다. SOCS15는 SOCS13과 매우 관련이 있는 것으로 보인다.

실시예 23

안크린 반복배열이 있는 SOCS 단백질

안크린 반복배열이 있는 3개의 SOCS 단백질이 확인됐다. 마우스 SOCS7, SOCS10 및 SOCS12의 부분 cDNA를 분석한 결과, 다수의 안크린 반복배열이 존재하는 것이 확인됐다.

실시예 24

SOCS 단백질의 발현 양상

SOCS 단백질의 각 클래스에 있는 대표적인 구성원들-SH2 영역 그룹의 SOCS1과 SOCS5, WD-40 반복 그룹의 SOCS6 및 안크린 반복 그룹의 SOCS7로부터 mRNA 발현이 조사되었다.

위에서 보여 준 바와 같이, SOCS1 mRNA는 흉선에서 다량 발견됐으나 다른 성인조직에서는 그 양이 적었다.

SOCS1 유전자의 전사는 사이토킨에 의해 유도되기 때문에, 발명자들은 SOCS5, SOCS6 및 SOCS7 mRNA의 수치가 사이토키 자극에 의해서 증가되는지 여부를 확인하려고 시도했다. IL-6를 주사한 마우스의 간에서는 20분후에 SOCS1 mRNA가 검출되고 2시간 안에 원래수치로 준다. 이와는 대조적으로 SOCS5 mRNA 발현 양상(kinetics)은 전혀 달라, IL-6 주사 후 12∼24시간 사이에서만 검출된다. SOCS6 mRNA는 항상적으로 발현되는 반면 SOCS7 mRNA는 IL-6 주사 전이나 IL-6 주사 후 어느 순간에도 검출되지 않았다.

실시예 25

SOCS4

마우스 및 인간 SOCS4는 SOCS 박스 보존서열(box consensus)을 사용하여 EST데이터베이스(databases)를 검색함으로써 확인한다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS4 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 4.1 및 4.2). 마우스 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라 λ-박테리오파지로 클론된 마우스 흉선 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS4를 암호화하는 2개의 cDNAs를 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 ESTs를 오버랩하여 도시하였다. 이들 cDNAs는 5' 비번역부위, 전체 마우스 SOCS4의 코딩 부위 및 5' 비번역부위를 포함한다. 서열의 분석으로 그의 C-말단에서 SOCS 박스를 암호화하고 SOCS Box 이전에 일련의 8WD-40의 반복배열을 확인한다. 실험적으로 결정된 마우스 SOCS4 cDNA 서열에 대한 인간 SOCS4 (h4.l and h4.2)의 2개의 서열 콘티그의 관계는 도 17에 도시되어 있다. 2개의 인간 콘티그의 뉴클레오티드 서열은 도 18에 열거되어 있다.

서열번호 13 및 14는 뮤린 SOCS4의 뉴클레오티드 서열과 대응하는 아미노산서열을 나타낸다, 서열 번호 15 및 16은 각각 SOCS4 cDNA 인간 콘티그 h4.l 및 h4.2이다.

실시예 26

SOCS5

마우스 및 인간 SOCS5는 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스 (databases)를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS5 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 5.1 및 5.2). 마우스 및 인간 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라, 마우스 흉선 cDNA 라이브러리, 마우스 게놈 DNA 및 λ-박테리오파지로 클론된 인간 흉선 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS5를 암호화하는 단일 게놈 DNA 클론(57-2) 및 (5-3-2) cDNA를 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 ESTs를 오버랩하여 도시하였다. 마우스 SOCS5의 5' 및 3' 비번역 부위에 더하여, 완전 코드화 부위는 단일 엑손(single axon)에 대하여 암호화되도록 출현한다(도 19 참조). 서열의 분석(도 20 참조)으로, SOCS5 게놈 및 cDNA 클론이 SH2 영역에 더하여 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 확인한다(도 19 및 20B). cDNA 클론 5-94-2의 분석으로 유래된 인간 SOCS5 콘티그 (h5.1 도 21) 및 인간 SOCS5 ESTs (표 5.2)와 마우스 SOCS5 DNA 서열과의 관계는 도 19에 도시되어 있다. 뮤린 SOCS5의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 17 및 18에 각각 도시되어 있다. 인간 SOCS5 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 19로 도시되어 있다.

실시예 27

SOCS6

마우스 및 인간 SOCS6은 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스 (databases)를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS6 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 6.1 및 6.2). 마우스 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라 마우스 흉선 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS6를 암호화하는 8개의 cDNA 클론 (6-1A, 6-2A, 6-5B, 6-4N, 6- 18, 6-29, 6-3N, 6-5N) cDNA 클론을 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 ESTs를 오버랩하여 도시하였다(도 22 및 도 23A). 서열의 분석(도 23 참조)으로, 마우스 SOCS6 cDNA 클론이 8개의 WD-40 반복배열에 더하여 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 확인한다. 인간 SOCS-6 ESTs (h6.2)의 분석으로 유래된 인간 SOCS-6 콘티그(h6.1 및 h6.2 도 24)와 마우스 SOCS6 DNA 서열과의 관계는 도 22에 도시되어 있다. 뮤린 SOCS6의 뉴클레오티드 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 20 및 21에 각각 도시되어 있다. SOCS6 인간 콘티그 h6.1 및 h6.2는 서열 번호 22 및 23으로 각각 도시되어 있다.

실시예 28

SOCS7

마우스 및 인간 SOCS7은 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS-7 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 7.1 및 7.2). 마우스 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라 마우스 흉선 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS7을 암호화하는 하나의 cDNA 클론 (74-10A-11) cDNA를 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 ESTs를 오버랩하여 도시하였다. 서열의 분석(도 26 참조)으로, 마우스 SOCS7 클론이 안키린(ankyrin) 반복배열에 더하여, 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 확인한다(도 25 참조). 인간 SOCS7 ESTs (표 7.2)의 분석으로 유래된 인간 SOCS7 콘티그(h7.1 및 h7.2, 도 27)와 마우스 SOCS7 DNA 서열과의 관계는 도 25에 도시되어 있다. 뮤린 SOCS7의 뉴클레오티드 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 24 및 25에 각각 도시되어 있다. SOCS7 인간 콘티그 h7.1 및 h7.2의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 26 및 27로 각각 도시되어 있다.

실시예 29

SOCS8

SOCS8 cDNAs로부터 유래된 ESTs는 이하의 표 8.1에 나타나 있다. SOCS 패밀리(family)의 구성원 이외의 것에 관해서 설명한 바와 같이, 마우스 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 사용하여 마우스 SOCS8에 대한 cDNAs를 분리시키는 것이 가능하다. ESTs와 SOCS8의 소정의 코딩 부위와의 관계는 도 28에 도시되어 있다. 도 29A에 도시된 ESTs로부터 얻어진 뉴클레오티드 서열과, SOCS8의 일부의 아미노산 서열은 도 29B에 도시되어 있다. 뮤린 SOCS8의 뉴클레오티드 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 28 및 29에 각각 도시되어 있다.

실시예 30

SOCS9

마우스 및 인간 SOCS-9는 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS9 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 9.1 및 9.2). 마우스 SOCS9 EST(표 9.1)의 분석으로 유래된 마우스 SOCS9 콘티그(m9.1 도 9.2)와 인간 SOCS9 ESTs (h9.2)의 분석으로 유래된 인간 SOCS-9 DNA 콘티그(h9.1 도 32)의 관계는 도 31에 도시되어 있다. 서열의 분석(도 32 참조)으로, 마우스 SOCS7 클론이 SH2 반복배열에 더하여, 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 나타낸다(도 30 참조). 뮤린(muring) SOCS9 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 30으로 도시되어 있다. 인간 SOCS9 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 31로 도시되어 있다.

실시예 31

SOCS10

마우스 및 인간 SOCS10은 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS10 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 10.1 및 10.2). 마우스 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라 마우스 흉선 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS10을 암호화하는 4개의 cDNA 클론 (10-9, 10-12, 10-23 and l0-24)을 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 및 인간 ESTs를 오버랩하여 도시하였다(도 33 및 도 34). 서열의 분석(도 34 참조)으로, 마우스 SOCS10 cDNA 클론이 전체 길이는 아니지만, 몇몇의 안키린(ankyrin) 반복배열에 더하여, 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 확인한다(도 33 참조). 인간 SOCS10 EST(표 10.2)의 분석으로 유래된 마우스 SOCS10 콘티그(hl0.1 및 h10.2 도 35)와 마우스 SOCS10 DNA 서열과의 관계는 도 33에 도시되어 있다. 마우스 cDNA 및 ESTs와 인간 ESTs를 비교해 보면, 마우스의 3' 비번역된 부위와 인간 SOCS10이 상당히 다름을 시사한다. 뮤린 SOCS10의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 32로 도시되고, SOCS10 인간 콘티그 h10.1 및 h10.2의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 33 및 34로 각각 도시되어 있다.

실시예 32

SOCS11

인간 SOCS11은 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 인간 SOCS11 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 11.1 및 11.2). EST(표 11.2)의 분석으로 유래된 마우스 SOCS11 콘티그(h11.1 도 36A 및 B)와 소정의 암호화된 단백질과의 관계는 도 37에 도시되어 있다. 서열의 분석으로, 인간 SOCS11 cDNA가 SH2 영역에 더하여, 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 나타낸다(도 37 및 도 36B 참조). 인간SOCS11의 뉴클레오티드 서열과 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 30과 36으로 각각 도시되어 있다.

실시예 33

SOCS12

마우스 및 인간 SOCS-12는 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS12 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 12.1 및 12.2). 마우스 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라 마우스 흉선 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS12를 암호화하는 4개의 cDNA 클론 (10-9, 10-12, 10-23 및 10-24)을 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 및 인간 ESTs를 오버랩하여 도시하였다(도 38 및 도 39). 서열의 분석(도 39 및 도 40 참조)으로, SOCS12 cDNA 클론이 몇몇의 안키린 반복배열에 더하여, 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 확인한다(도 38 참조). 인간 SOCS10 EST(표 10.2)의 분석으로 유래된 마우스 SOCS12 콘티그(h12.1 및 h12.2 도 40)와 마우스 SOCS12 DNA 서열과의 관계는 도 38에 도시되어 있다. 마우스 cDNA 및 ESTs와 인간 ESTs를 비교해보면, 마우스의 3' 비번역된 부위와 인간 SOCS12가 상당히 다름을 시사한다. SOCS12의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 37로 도시되어 있다. 인간 SOCS12 콘티그 h12.1 및 h12.2의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 38 및 39로 각각 도시되어 있다.

실시예 34

SOCS13

마우스 및 인간 SOCS-13는 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS13 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 13.1 및 13.2). 마우스 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라 마우스 흉선 및 마우스 엠브리오 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS13을 암호화하는 3개의 cDNA 클론 (62-1, 62-6- 7 and 62- 14)을 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 및 인간 ESTs를 오버랩하여 도시하였다(도 41 및 도 42A). 서열의 분석(도 42 참조)으로, SOCS13 cDNA가 잠재적인 WD-40 반복배열에 더하여, 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 단백질을 암호화함을 확인한다(도 41 및 도 42B 참조). 인간 SOCS13 EST(표 13.2)의 분석으로 유래된 인간 SOCS13 콘티그(h13.1 및 h13.2 도 40)와 마우스 SOCS13 DNA 서열과의 관계는 도 41에 도시되어 있다. 뮤린 SOCS13의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 40 및 41로 각각 도시되어 있다. SOCS13 콘티그 h13.1의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 42로 도시되어 있다.

실시예 35

SOCS14

마우스 및 인간 SOCS-14는 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 EST 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스 및 인간 SOCS14 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 이하의 표로 되어있다(표 14.1 및 14.2). 마우스 및 인간 ESTs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 몇몇의 올리고뉴클레오티드을 디자인하였고, 종래 방법에 따라, 마우스 흉선 cDNA 라이브러리, 마우스 게놈 DNA 라이브러리 및λ-박테리오파지로 클론된 인간 흉선 cDNA 라이브러리를 스크린하는 데 사용되었다. 마우스 SOCS14를 암호화하는 단일 게놈 DNA 클론(57-2) 및 (5-3-2) cDNA를 분리시켰고, 그대로 서열화시켰고, 데이터베이스 내에서 식별된 마우스 ESTs를 오버랩하여 도시하였다(도 44 및 도 45A). 마우스 SOCS14의 5' 및 3' 비번역 부위에 더하여, 완전 코드화 부위는 단일 엑손(single axon)에 대하여 암호화되도록 출현한다. (도 44 참조). 서열의 분석으로, SOCS14 게놈 및 cDNA 클론이 SH2 영역에 더하여 그의 C-말단에서 SOCS 박스와 프로테인을 암호화함을 확인한다. cDNA 클론 5-94-2 및 인간 SOCS14 ESTs(표 14.2)의 분석으로 유래된 인간 SOCS14 콘티그(h14.1 및 h14.3)와 마우스 SOCS14 DNA 서열과의 관계는 도 44에 도시되어 있다.

뮤런 SOCS14의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 43 및 44로 각각 도시되어 있다.

실시예 36

SOCS15

마우스 및 인간 SOCS15는 SOCS 박스 보존서열을 사용하여 DNA 데이터베이스를 검색함으로써 확인하였다(도 13 참조). 마우스및 인간 SOCS15 cDNAs로부터 유래된 이들 ESTs는 마우스 및 인간 BAC가 전체 마우스 및 인간 SOCS-15 유전자를 함유하는 것으로, 이하의 표로 되어있다(표 15.1 및 15.2). ESTs와 BACs로부터 유래된 서열 정보를 이용하여, 전체 아미노산 서열을 나타낼 수 있고, 다른 SOCS 유전자에 대해 기술된 바와 같이, cDNA가 분리될 수 있도록 특수 올리고뉴클레오티드 프로브(1O)를 용이하게 디자인할 수 있다. 마우스 및 인간 BACs로부터 유래된, 소정의 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열의 관계와, 도 46에 도시된 ESTs와 BACs의관계는 도 47 및 도 48에 도시되어 있다. 뮤린 SOCS15의 뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 46 및 47로 각각 도시되어 있다. 인간 SOCS15의뉴클레오티드 서열 및 대응하는 아미노산 서열은 서열 번호 48 및 49로 각각 도시되어 있다.

실시예 37

SOCS과 JAK2 키나아제의 상호작용

본 예는 SOCS와 JAK2 키나아제 간의 상호작용을 예시하고 있다. 상호작용은 SOCS1, 2, 3 및 CIS의 SH2 영역을 통해 성립된다. 이 상호작용으로 SOCS1에 의한 JAK2 키나아제 활동이 억제되게 된다. 통상 JAK2와 SOCS1, 2, 3과 CIS의 상호작용은 도 50에 예시되어 있다.

이하의 방법이 채용된다.

면역침강법

코스(cos) 6 세포는 일렉트로포레이션에 의해 일시적으로 세포감염되고 48 시간 동안 배양된다. 이때, 세포들은 완전 프로테아제 억제제(뵈링거 만하임) 및 면역침강을 위해 보유된 상청액(supernatant)을 부가하여 용균 버버(50 mM Tris/HCL, pH 7.5, 150 mM NaCl 1% v/v Triton-X-100, l mM EDTA, l mM Naf, 1 mM Na₃VO₄) 내의 얼음 상에서 파쇄된 후, 4℃(14,000 x g, 10분)에서 원심분리된다. JAK2 단백질은 5㎕의 항-JAK2 항체(UBI)를 사용하여 면역침강된다. 항유전자-항체복합물은 단백질 에이-세파로제(A-Sepharose) (50% 현탁(slurry)된 30㎕)를 사용하여 회복된다.

웨스턴 블로팅(Western blotting)

면역침강은 환원 조건하에서 소듐 도데실 슐페이트(SDS) - 폴리아크릴아미드 유전자 일렉트로포레시스(PAGE)에 의해 분석된다. 단백질이 니트로세포룰로우즈로 전기이동적으로 전달된 후, 10% v/v의 스킨-밀크 내에서 밤새도록 블록되고, 항-포스포티로신(anti-phosphotyrosine) 항체(4Gl0) (15000, UBI ), 항-플래그 (anti-FLAG) 항체(1.6 ㎍/㎖), 또는 세척 버퍼(wash buffer)/17% v/v BSA에서 2시간 동안 희석된 항-JAK2 항체(12000, LBI) 중 어느 하나에 의해 배양(incubation)되기 이전에 PBS/0.1% v/v 트윈(Tween)-20 (시그마) (세척버퍼, wash buffer)에서 세척된다. 니트로세포룰로즈 블롯(Nitrocellulose blots)은 퍼옥시다제-컨쥬게이트(peroxidase-conjugated)된 쉽 항-래빗 면역글로부린(15000, 실레누스) 또는 세척 버퍼/1% v/v BSA에 희석된 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 쉽 항-마우스 면역글로부린(15000, 실레누스) 중 어느 하나로 주 항체를 검출한다. 블롯(Blots)이 세척되면, 제조자의 교시에 따라 증대된 화학발광(ECL) 시스템(아머샴, 영국)을 사용하여 항체 바인딩이 가시화된다.

시험관내 키나아제 검정(In-vitro kinase assay)

시험관 내 키나아제 검정은 고유의 JAK2 키나아제 촉매작용을 평가하도록 수행된다. JAK2 단백질은 상술한 바와 같이 면역침강되고, 키나아제 검정 버퍼(50 mM NaCl, 5 mM MgCl₂,5 mM MnCl2, 1 mM NaF,, l mM Na₃VO₄, 10 mM HEPES, pH 7.4)에서 2회 세척되며, 0.25 μCi/ml(γ-³P)-ATP (30분, 실내 온도)를 함유한 동일 용량의 키나아제 버퍼에서 현탁된다. 엑세스³²(Y-P)-ATP가 제거되고, 면역침강은 환원 조건하에서 SDS/PAGE에 의해 분석된다. 겔은 1 몰의 KOH(55℃, 2 시간)로 처리함으로써 마일드한 알카리성 가수분해가 되고, 그 결과 포스포세린(phosphoserine) 및 포스포트레오닌(phosphothreonine)이 제거되게 된다. 방사성 밴드는 포스포이미지 시스템(Molecular Dynamics, 서니베일, 캘리포니아, 미합중국)의 이미지퀀트 소프트웨어에 의해 가시화된다.

실시예 38

SOCS-1 녹아웃 구조의 마련과정

플라스미드 구조 다이아그램 및 녹아웃 구조는 도 51 내지 도 53에 도시되어 있다. 게놈 SOCS-1 클론 95-11-10은 SOCS-1 녹아웃 벡터에서 3' 가지으로서 사용되는 코딩 부위의 3.6Kb DNA 절편 3'을 얻기 위해, 제한 효소 BamH1 및 EcoR1로 절단된다. 이때, 이러한 절편의 가장자리가 블런트된다. 이어서, 이러한 절편은 다음의 벡터로 결찰된다.

pBgalpAloxNeo

그리고, pBgalpAloxNeoTK

여기서, 단일의 Xho1 지점에서 선형화되고, 이어서 블런트된다.

이러한 결찰은 다음의 벡터 형태로 된다.

pBgalpAloxNeo에서의 3'SOCS-l 가지(arm), 및

pBgalpAloxNeoTK에서의 3'SOCS-1 가지

SOCS-l 녹아웃 벡터의 5' 가지는 단지 5'의 SOCS-1 코딩 부위(SOCS-l, 엑손)의 게놈 SOCS-1 클론 95-11-10으로부터 2.5Kb PCR 생성물을 생성하도록 PCR을 사용함으로써 구성화된다.

이러한 생성물에 사용된 올리고(oligo's)는,

5' 올리고 (센스, sense) (2465)

AGCr AGA TCT GGA CCC TAC AAT GGC AGC [서열 번호 49]

3' 올리고 (안티센스, antisense) (2466)

AGCT AG ATC TGC CAT CCT ACT CGA GGG GCC AGC TGG [서열 번호 50]

이 PCR 생성물이 절단된 후, 제한 효소 BglⅡ를 이용하여, PCR 생성물에 Bgl Ⅱ 단부를 생성시킨다.

BglⅡ, 단부를 가지는 이러한 5' SOCS-1 PCR 생성물은 다음과 같이 결찰된다.

pBgalpAloxNeo에서의 3'SOCS- l 가지, 및

pBgalpAloxNeoTK에서의 3' SOCS-l 가지

이것은 다음의 벡터 형태로 된다.

pBgalpAloxNeo에서의 5'&3'SOCS-1 가지, 및

pBgalpAloxNeoTK 5'&3'SOCS-l 가지

이들은 최종의 SOCS-1 녹아웃 구조이다.

이들 양 구조는 전체적인 SOCS- 1 코딩 부위(SOCS-l, 엑손)가 결여되어, Bgal, B 글로빈(globin) polyA, PGK 프로모터 네오미신 및 PGK polyA 서열의 일부로 대치된다.

또, pBgalpMoxNeoTK 벡터에서의 5'&3'SOCS-l 가지에는 네어미신과 PGK 폴리A 서열 사이에 티미딘 키나아제 유전자 서열을 포함하였다.

벡터 pBgalpAloxNeo에서의 5'&3'SOCS-l 가지, 및

pBgalpAloxNeoTK에서의 5;&3'SOCS-l 가지

여기서, 단일의 제한 효소 Not1으로 인해 선형화된 후, 일렉트로포레이션에의해 발달되지 않은 스템 세포로 전이된다.

네오미신에 저항력이 있는 클론은, 정확하게 합성된 SOCS-l 표적화 서열을 함유하고 있는 지의 여부를 판단하도록, 서던블롯(southern blot)에 의해 선택되고 분석된다. 판단을 위해, 만일 정확한 합성이 일어난다면, 네오미신 억제 클론으로부터의 게놈 DNA은 제한 효소 EcoR1에 의해 절단된다. 이 절단된 DNA가 나일론 필터에서 블롯된 후, l.5Kb EcoR1/Hind III DNA에 의해 탐침되는 데, 녹아웃 구조에서 사용된 5' 가지 서열의 5'을 조장한다.

다음은 정확한 합성물을 위해 기대되는 밴드 크기이다.

와일드 형(Wild type) SOCS-1 형질(allele) 5.4Kb.

pBgalpAloxNeo에서의 5'&3'SOCS-1 가지의 SOCS-1 녹아웃 형질 8.2Kb

또는, pBgalpAloxNeoTK 전환형 cells에서의 5'&3'SOCS- l 가지의 11Kb

당해 기술에 숙련된 자가 기재된 발명이 상술한 바 이외의 변경과 변형을 가미할 수 있음이 인정된다. 그러나, 본 발명이 이러한 변경과 변형을 포함하고 있음은 물론이다. 또, 본 발명은 본 명세서에 언급되거나 나타난 모든 스텝. 특징, 구성 및 화합물을 개별적 또는 총괄적으로 포함하고, 또 임의의 2 이상의 상기 스텝이나 특징의 어떠한 조합도 포함하고 있다.

[표 4.1]

표 4.2

표 5.1

표 5.2

표6.1

표 6.2

표 7.1

표 7.2

표 8.1

표 9.1

표 9.2

표 10.1

표 10.2

표 11.1

표 12.1

표 12.2

표 13.1

표 13.2

표 14.1

표 15.1

표 15.2

참조문헌

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Claims

단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체(mimetic)를 암호화하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃에서 덜 엄격한 (low stringent) 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자에 있어서, 상기 단백질은 C 말단 부위에 SOCS 박스를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 추가로 단백질:분자 상호작용 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질:분자 상호작용 부위는 SOCS 박스의 N 말단부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 단백질:분자 상호작용 부위는 단백질:DNA 결합 부위 또는 단백질:단백질 결합 부위인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 상기 단백질:분자 상호작용 부위는 하나 이상의 SH2 영역, WD-40 반복배열 또는 안키린 반복배열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SOCS 박스는 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆[X_i]_nX₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃[X_j]_nX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

[X_i]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_i은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

[X_j]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_j은 임의의 아미노산잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)
제 6 항에 있어서, 상기 단백질은 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 7 항에 있어서, 상기 신호 전달은 사이토킨 또는 호르몬, 세균 또는 세균생성물, 기생자, 항원 또는 기타 이펙터(effector) 분자에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 8 항에 있어서, 상기 단백질은 사이토킨 매개 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 9 항에 있어서, 상기 신호 전달은 EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-12, IFNγ, TNFα,IL-1 및/또는 M-CSF의 어느 하나 이상의 사이토킨에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 10 항에 있어서, 상기 신호 전달은 하나 이상의 IL-6, LIF, OSM, IFNγ 및/또는 트롬보포이에틴(thrombopoietin)에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 11 항에 있어서, 상기 신호 전달은 IL-6에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 실질적으로 서열번호 : 4, 서열번호 6, 서열 번호 : 8, 서열 번호 : 10, 서열 번호 : 12, 서열 번호 : 14, 서열번호 : 18, 서열 번호 : 21, 서열 번호 : 25, 서열 번호 : 29, 서열 번호 : 36, 서열 번호 : 41, 서열 번호 : 44, 서열 번호 : 46 또는 서열 번호 : 48에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열, 또는 기재된 서열 중 전체 또는 일부 또는 42℃에서 덜 엄격한 조건하에 핵산을 하이브리디제이션하는 뉴클레오티드 서열과 약 15% 이상의 상사도(similarity)를 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 서열은 실질적으로 서열 번호 : 3, 서열 번호 : 5, 서열 번호 : 7, 서열 번호 : 9, 서열 번호 : 11, 서열 번호 : 13, 서열 번호 : 15, 서열 번호 : 16, 서열 번호 : 17, 서열 번호 : 20, 서열 번호 : 22, 서열 번호 : 23, 서열 번호 : 24, 서열 번호 : 26, 서열 번호 : 27, 서열 번호 : 28, 서열 번호 : 30, 서열 번호 : 31, 서열 번호 : 32, 서열 번호 : 33, 서열 번호 : 34, 서열 번호 : 35, 서열 번호 : 37, 서열 번호 : 38, 서열 번호 : 39, 서열번호 : 40, 서열 번호 : 42, 서열 번호 : 43, 서열 번호 : 45 또는 서열 번호 : 47에 나타낸 것이나, 또는 기재된 서열 중 전체 또는 일부 또는 기재된 서열을 42℃에서 덜 엄격한 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열과 15% 이상의 상사도를 갖는 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체 또는 의체를 암호화하는 서열에 상보적이거나 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 42℃에서 덜 엄격한 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산 분자에 있어서, 상기 단백질은

(i) SOCS 박스가 아미노산 서열,

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆[X_i]_nX₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃[X_j]_nX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

[X_i]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_i은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

[X_j]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_j은 임의의 아미노산잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)를 포함하는 C 말단 부위내에 SOCS 박스를 포함하고,

(ii) SOCS 박스의 N 말단 부위내에 하나 이상의 SH2 영역, WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열 또는 기타 단백질:분자 상호작용 영역을 포함하며,

(iii) 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
C 말단 부위에 SOCS 박스를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 단백질 또는 이의 유도체, 동족체 또는 의체.
제 16 항에 있어서, 상기 단백질은 단백질:분자 상호작용 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 17 항에 있어서, 상기 단백질:분자 상호작용 부위는 SOCS 박스의 N 말단부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 단백질:분자 상호작용 부위는 단백질:DNA 결합 부위 또는 단백질:단백질 결합 부위인 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 19 항에 있어서, 상기 단백질:분자 상호작용 부위는 하나 이상의 SH2 영역, WD-40 반복배열 또는 안키린 반복배열인 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SOCS 박스는 하기 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆[X_i]_nX₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃[X_j]_nX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

[X_i]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_i은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

[X_j]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_j은 임의의 아미노산잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)
제 21 항에 있어서, 상기 단백질은 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 22 항에 있어서, 상기 신호 전달은 사이토킨 또는 기타 내인성 분자, 호르몬, 세균 또는 세균 생성물, 기생자, 항원 또는 기타 이펙터(effector) 분자에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 23 항에 있어서, 상기 단백질은 사이토킨 매개 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 24 항에 있어서, 상기 신호 전달은 EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-12, IFNγ, TNFα, IL-1 및/또는 M-CSF의하나 이상의 사이토킨에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 25 항에 있어서, 상기 신호 전달은 하나 이상의 IL-6, LIF, OSM, IFNγ및/또는 트롬보포이에틴에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 26 항에 있어서, 상기 신호 전달은 IL-6에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 16 항에 있어서, 상기 단백질은 실질적으로 서열 번호 : 4, 서열 번호 : 6, 서열 번호 : 8, 서열 번호 : 10, 서열 번호 : 12, 서열 번호 : 14, 서열 번호 : 18, 서열 번호 : 21, 서열 번호 : 25, 서열 번호 : 29, 서열 번호 : 36, 서열 번호 : 41, 서열 번호 : 44, 서열 번호 : 46 또는 서열 번호 : 48에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열, 또는 기재된 서열 중 전체 또는 일부와 약 15% 이상의 상사도를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
제 16 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 서열은 실질적으로 서열 번호 : 3, 서열 번호 : 5, 서열 번호 : 7, 서열 번호 : 9, 서열 번호 : 11, 서열 번호 : 13, 서열 번호 : 15, 서열 번호 : 16, 서열 번호 : 17, 서열 번호 : 20, 서열 번호 : 22, 서열 번호 : 23, 서열 번호 : 24, 서열 번호 : 26, 서열 번호 : 27, 서열 번호 : 28, 서열 번호 : 30, 서열 번호 : 31, 서열 번호 : 32, 서열 번호 : 33, 서열 번호 : 34, 서열 번호 : 35, 서열 번호 : 37, 서열 번호 : 38, 서열 번호 : 39, 서열번호 : 40, 서열 번호 : 42, 서열 번호 : 43, 서열 번호 : 45 또는 서열 번호 : 47에 나타낸 것과 같은 뉴클레오티드 서열, 또는 기재된 서열 중 전체 또는 일부 또는 기재된 서열을 42℃에서 덜 엄격한 조건하에 하이브리디제이션할 수 있는 뉴클레오티드 서열과 15% 이상의 상사도를 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리 단백질.
( i ) 아미노산 서열,

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆[X_i]_nX₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃[X_j]_nX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

[X_i]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_i은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

[X_j]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_j은 임의의 아미노산잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)를 포함하는 SOCS 박스를 C 말단 부위내에를 포함하고,

(ii) SOCS 박스의 N 말단 부위내에 하나 이상의 SH2 영역, WD-40 반복배열 및/또는 안키린 반복배열 또는 기타 단백질:분자 상호작용 영역을 포함하며,

(iii) 신호 전달을 조절하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 이의 유도체, 동족체, 유사체, 혹은 의체
세포내의 SOCS 단백질 레벨을 조절하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 SOCS 단백질 레벨을 조절하기에 충분한 조건하에 일정기간동안 SOCS 유전자 함유 세포를 유효량의 SOCS 유전자 발현 조절자 또는 SOCS 단백질 활성 조절자와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포내의 SOCS 단백질 레벨을 조절하는 방법.
신호 전달을 조절하기에 충분한 시간동안에 SOCS 유전자 함유 세포를 유효량의 SOCS 유전자 발현 조절자 또는 SOCS 단백질 활성 조절자와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 SOCS 함유 세포내의 신호 전달을 조절하는 방법.
하나 이상의 세포가 SOCS 유전자를 함유하는 세포간의 상호작용에 영향을 미치는 방법에 있어서, 상기 방법은 신호 전달을 조절하기에 충분한 시간동안 SOCS유전자 함유 세포를 유효량의 SOCS 유전자 발현 조절자 또는 SOCS 단백질 활성 조절자와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 세포간의 상호작용에 영향을 미치는 방법.
제 31 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호 전달은 사이토킨, 호르몬, 세균 또는 세균 생성물, 기생자, 항원 또는 기타 이펙터 분자에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 34 항에 있어서, 상기 사이토킨은 하나 이상의 EPO, TPO, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-2, IL-4, IL-7, IL-13, IL-6, LIF, IL-12, IFNγ, TNFα, IL-1 및/또는 M-CSF인 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서, 상기 사이토킨은 하나 이상의 IL-6, LIF, OSM, IFNγ 및/또는 트롬보포이에틴인 것을 특징으로 하는 방법.
제 36 항에 있어서, 상기 사이토킨은 IL-6인 것을 특징으로 하는 방법.
제 31 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SOCS 유전자는 하기 아미노산 서열을 포함하는 SOCS 박스를 갖는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆[X_i]_nX₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁X₂₂X₂₃[X_j]_nX₂₄X₂₅X₂₆X₂₇X₂₈

(상기 아미노산 서열에서,

X₁는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂는 임의의 아미노산 잔기이며,

X₃은 P, T 또는 S이고,

X₄는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₅는 임의의 아미노산이고,

X₆은 임의의 아미노산이며,

X₇은 L, I, V, M, A, F, Y 또는 W이고,

X₈은 C, T 또는 S이며,

X₉는 R, K 또는 H이고,

X₁₀은 임의의 아미노산이며,

X₁₁은 임의의 아미노산이고,

X₁₂는 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₁₃은 임의의 아미노산이고,

X₁₄는 임의의 아미노산이며,

X₁₅는 임의의 아미노산이고,

X₁₆은 L, I, V, M, A, P, G, C, T 또는 S이며,

[X_i]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_i은 임의의 아미노산 잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₁₇은 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₁₈은 임의의 아미노산이며,

X₁₉는 임의의 아미노산이고,

X₂₀은 L, I, V, M, A 또는 P이며,

X₂₁은 P이고,

X₂₂는 L, I, V, M, A, P 또는 G이며,

X₂₃은 P 또는 N이고,

[X_j]_n은 n이 1∼50인 n 개의 아미노산 서열이고, 서열 X_j은 임의의 아미노산잔기 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산을 포함하며,

X₂₄는 L, I, V, M, A 또는 P이고,

X₂₅는 임의의 아미노산이며,

X₂₆은 임의의 아미노산이고,

X₂₇은 Y 또는 F이며,

X₂₈은 L, I, V, M, A 또는 P이다.)
제 38 항에 있어서, 상기 SOCS 유전자는 서열 번호 : 3, 서열 번호 : 5, 서열 번호 : 7, 서열 번호 : 9, 서열 번호 : 11, 서열 번호 : 13, 서열 번호 : 15, 서열 번호 : 16, 서열 번호 : 17, 서열 번호 : 20, 서열 번호 : 22, 서열 번호 : 23, 서열 번호 : 24, 서열 번호 : 26, 서열 번호 : 27, 서열 번호 : 28, 서열 번호 : 30, 서열 번호 : 31, 서열 번호 : 32, 서열 번호 : 33, 서열 번호 : 34, 서열 번호 : 35, 서열 번호 : 37, 서열 번호 : 38, 서열 번호 : 39, 서열 번호 : 40, 서열번호 : 42, 서열 번호 : 43, 서열 번호 : 45 또는 서열 번호 : 47 중에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 상기 SOCS 유전자는 실질적으로 서열 번호 : 4, 서열 번호 : 6, 서열 번호 : 8, 서열 번호 : 10, 서열 번호 : 12, 서열 번호 : 14, 서열번호 : 18, 서열 번호 : 21, 서열 번호 : 25, 서열 번호 : 29, 서열 번호 : 36, 서열 번호 : 41, 서열 번호 : 44, 서열 번호 : 46 또는 서열 번호 : 48에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.