MXPA03010772A - Polipeptidos similares a atractina/caoba, polinucleotidos, anticuerpos y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente exposicion proporciona polipeptidos similares a atractina/caoba y fragmentos de los mismos, polinucleotidos que codifican tales polipeptidos y fragmentos, procesos para la produccion de formas recombinantes de tales polipeptidos, anticuerpos generados contra estos polipeptidos o fragmentos, y ensayos y metodos que emplean estos polipeptidos, anticuerpos y polinucleotidos.

Description

POÜPÉPTIDOS SIMILARES A ATRACTI A/CAOBA, POLINUCLEÓTIDOS, ANTICUERPOS Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C. §1 19 para la Solicitud Provisional Estadounidense Serie Número 60/293,608, presentada el 25 de Mayo del 2001 y para la Solicitud Provisional Estadounidense Serie Número 60/324,626, presentada el 24 de Septiembre del 2001 , las exposiciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se dirige a novedosos polipéptidos similares a atractina/caoba y fragmentos de los mismos, polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, procesos para la producción de formas recombinantes de tales polipéptidos, anticuerpos generados contra estos polipéptidos o fragmentos y ensayos y métodos que emplean estos polipéptidos, anticuerpos y polinucleótidos.

ANTECEDENTES La atractina (PDT-L) es una glicoproteína humana que pertenece a una familia de proteínas llamada la familia CUB de adhesión celular y proteínas guía. La atractina normalmente se segrega por linfocitos T, humanos, activados, y modula las interacciones celulares inmunes.

La atractina es una proteína de 1 198 amino ácidos que contiene cuatro dominios similares a EGF junto con otros dominios. Las proteínas con dominios similares a EGF típicamente desempeñan un papel un la señalización extracelular o la guía celular. Por ejemplo, la atractina de suero purificado y la atractina recombinante mejoran la respuesta proliferátiva de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) para anular antígenos tales como toxoide de tétanos (Duke-Cohan eí al. , Proc. Nat. Acad. Sci. , 95: 1 1336-41 , 1998). La atractina origina la difusión de monocitos adherentes a los cuales se unen linfocitos (Duke-Cohan eí al. , supra). Estas células adherentes se vuelven focos para el agrupamiento de linfocitos T y se considera que la atractina se encuentra involucrada en la mediación de las interacciones entre células T y macrófagos, influenciando el enlace entre las células, la presentación de antígenos o mediante modificación proteolítica. Además, la atractina también se ha identificado por relacionarse con la proteína de caoba murina con una conexión para controlar la pigmentación y metabolismo de energía (Tang eí al. , Proc. Nat. Acad. Sci., 97(1 1 ): 6025-30, 2000). La caoba es una proteína murina que es un ortólogo de la atractina humana (Gunn et al. , Nature, 398: 152, 1999). La caoba murina es una proteína de transmembrana de 1428 amino ácidos, la cual contiene un solo dominio de transmembrana. El dominio extracelular de la caoba murina tiene homología con la atractina. La caoba murina también ha demostrado estar involucrada en la supresión de la obesidad (Nagle eí al. , Nature, 398: 148-152, 1999; ver también la Patente de E. U. 6,274,339, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un polipéptido substancialmente puro que comprende una secuencia amino ácida que tiene al menos 80%, 90% o 100% de identidad con una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19. Además, la invención proporciona un polipéptidos substancialmente puro que comprende una secuencia amino ácida que tiene al menos 80%, 90% o 100% de identidad con una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 61 a 1379 de la SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona fragmentos bioactivos de la SEQ ID NO: 2 que comprenden una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 del amino ácido 1 a 61 , 61 a 1230, 61 a 1379, 1231 a 1252 o 1252 a 1379. La invención proporciona además un polipéptido substancialmente puro que comprende una secuencia amino ácida que tiene al menos 80%, 90% o 100% de identidad con una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 61 a 1230 de la SEQ ID NO: 2. La invención proporciona un polipéptido substancialmente puro que tiene una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 desde el amino ácido 61 hasta el amino ácido 1230 operablemente enlazados a una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 1252 a 1379 de la SEQ ID NO: 2. La invención también proporciona un polipéptido de fusión que comprende un primer polipéptido que comprende una secuencia amino ácida según se establece desde aproximadamente el amino ácido 61 a 1230 de la SEQ ID NO: 2 operablemente enlazada a un segundo polipéptido. En un aspecto, el segundo polipéptido es un polipéptido de Fe. En otro aspecto, el segundo polipéptido es un polipéptido de cierre de leucina. En todavía otro aspecto, el segundo polipéptido tiene una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19, incluyendo fragmentos bioactivos del mismo. En todavía un aspecto adicional, un polipéptido de enlace separa al primer polipéptido y al segundo polipéptido y enlaza operablemente al primer y segundo polipéptidos. La invención proporciona además un polinucleótido aislado que codifica los polipéptidos de la invención. En una modalidad, el polinucleótido aislado comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 o 18; SEQ ID NO: 1 o 18, en donde T también puede ser U; secuencias complementarias a SEQ ID NO: 1 o 18; y fragmentos de a), b) o c) que son de al menos 20 bases de longitud y que se hibridizarán bajo condiciones altamente estrictas a moderadas hacia un ácido nucléico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19. En todavía una modalidad adicional, el polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 desde aproximadamente el nucleótido 181 a 4137; SEQ ID NO: 1 desde aproximadamente el nucleótido 181 a 3690; secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 desde aproximadamente el nucleótido 181 a 4137; secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 desde aproximadamente el nucleotido 181 a 3690; y cualquiera de a), b), c) o d), en donde T también puede ser U. La invención proporciona además un polinucleotido aislado que codifica un polipéptido de fusión de la invención. La invención proporciona un vector que comprende un polinucleotido de la invención. En una modalidad, el vector es una plásmida o vector viral. La invención también proporciona una célula huésped que comprende un vector de la invención. La invención proporciona además una célula huésped recombinante que comprende un polinucleotido de la invención bajo el control de una secuencia reguladora heteróloga. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica. La invención proporciona además un método para la producción de un polipéptido que comprende el cultivo de una célula huésped o célula huésped recombinante de la invención bajo condiciones que promueven la expresión de un polipéptido de la invención. En otro aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido en donde el polipéptido se produce mediante cultivo de una célula huésped de la invención bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido. La invención también proporciona un anticuerpo purificado que se enlaza específicamente a un polipéptido de la invención. En un aspecto, el anticuerpo es monoclonal. En otro aspecto, el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado. La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención o un polipéptido que comprende una secuencia amino ácida seleccionada a partir del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2 desde el amino ácido. 61 a 1379; y la SEQ ID NO: 2 desde el amino ácido 61 a 1230, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico. En otro aspecto, la invención proporciona un método para la identificación de un agente que modula la expresión de un polinucleótido que comprende una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 18, que comprende contactar una muestra que contiene el polinucleótido con un agente de prueba y medir la expresión del polinucleótido en comparación con un control, en donde un cambio de expresión comparado con el control es indicativo de un agente que modula la expresión del polinucleótido. El agente puede ser un polipéptido, un péptido, un peptidomimético, un ácido nucléico y una pequeña molécula. También se proporciona por la invención un método para la identificación de un agente que modula la actividad de un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 o 19, SEQ ID NO: 2 desde aproximadamente 61 a 1379, SEQ ID NO: 2 desde aproximadamente 61 a 1230, comprendiendo el contacto de una muestra que contiene el polipéptido con un agente de prueba y ia medición de la actividad del polipéptido en comparación con un control, en donde un cambio de actividad en comparación con el control es indicativo de un agente que modula la actividad del polipéptido. La invención proporciona además un método para el tratamiento de desorden o enfermedad asociada con HAM, que comprende contactar un sujeto con un polipéptido HAM, polinucleótido HAM, o un anticuerpo hacia un polipéptido HAM en una cantidad efectiva para tratar el desorden o enfermedad asociada con HAM. El desorden asociado con HAM se selecciona a partir del grupo que consiste en un desorden reumatológico, un desorden de trasplante de médula ósea u órgano sólido, un desorden de injerto contra huésped, un desorden inflamatorio, un desorden autoinmune, un desorden neurológico, un desorden de mielinación, un desorden proliferativo celular, una infección, un desorden cardiovascular, un desorden hematológico, un desorden de hígado, desórdenes metabólicos, desórdenes de peso y un desorden óseo. En un aspecto, el polipéptido de HAM tiene una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19 o un fragmento bioactivo del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 A-D muestra una secuencia de cADN y una secuencia polipéptida correspondiente de la invención. Las flechas ilustran las cargas de inicio utilizadas para amplificar diversos fragmentos de la secuencia codificadora. La Figura 2A-C muestra una alineación del homólogo humano de la Atractina/Caoba (HAM), atractina humana y secuencias de caoba murina. La Figura 3A-B muestra los dominios putativos de un polipéptido HAM de la invención. La Figura 4A-B muestra una alineación de un polipéptido HAM humano de la SEQ ID NO: 2 con la de un polipéptido HAM murino de la SEQ ID NO: 19. La Figura 5A-D muestra la secuencia nucleótida (SEQ ID NO: 18) que codifica la secuencia polipéptida de la SEQ ID NO: 19.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona por primera vez polipéptidos novedosos que tienen homología con proteínas de atractina y caoba llamadas aquí "HAM" por Homólogo de Atractina y Caoba (por sus iniciales en inglés). También se proporcionan polinucleótidos que codifican los polipéptidos HAM novedosos, así como también los métodos de uso de los polinucleótidos y polipéptidos. Las moléculas de atractina modulan la interacción entre células T y macrófagos y monocitos, permitiendo una presentación antígena más rápida y/o más eficaz. La asociación de los tres tipos de célula no es ni simultánea ni aleatoria. Más bien las células de presentación de antígeno se agrupan primero con las células T auxiliares y este grupo actúa como un foco para el reconocimiento de células efectoras. En ausencia de antígenos, no ocurre proliferación alguna en grupos inducidos por atractina-1 soluble de monocitos y células T, pero si presenta un antígeno de anulación tal como toxoide de tétanos; la agrupación de las células maximiza la respuesta potencial al antígeno. La atractina puede regular la actividad de citosina local, ya sea influenciando el enlace y presentación o mediante modificación proteolítica. La atractina-1 soluble ha demostrado recientemente disociar un dipéptido de terminal N que convierte RANTES 1 -68 de longitud completa (que consisten en residuos amino ácidos 1 -68), un quimioatractor de monocitos potente, en RANTES 3-68, un inhibidor igualmente potente de quimiotaxis de monocitos. También se ha encontrado que la atractina-1 soluble se enlaza a macrógafos y monocitos. Es posible que sea a través de este enlace que la atraótina, en cualquiera de sus formas, puede regular ala actividad de macrófagos y monocitos. Por ejemplo, mediante la proporción de señales necesarias para la inducción de difusión y la posterior agrupación de células T mejoradas. De manera alternativa, la molécula podría complementar el enlace de otra molécula hacia un receptor sobre macrófagos/monocitos. Además, la molécula podría formar un puente entre células T y macrófagos/monocitos. Ya que la atractina-1 y —2 de membrana tiene un dominio citoplásmico, es probable que el enlace de un ligando putativo a una región extracelular de la atractina de membrana de cómo resultado la señalización a la célula T. Sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita por un mecanismo de acción en particular. En base a su homología con las atractinas, se predice que las moléculas HAM de la invención tienen actividad biológica similar a las atractinas y se predice por lo tanto que juegan un papel en la inflamación y respuestas inflamatorias. Otras actividades biológicas para las moléculas HAM incluyen metabolismo de energía y pigmentación, cuya actividad se basa en la homología de HAM's con la proteína de, caoba y el papel de la caoba en la regulación de la obesidad (Nagle et al. , Nature, 398: 148-152, 1 999). Una correlación de los dos tipos de actividades (por ejemplo, inflamatoria y obesidad) se ha demostrado por mayores conteos de células blancas sanguíneas en niños obesos (Visser et al., supra) que son más probables debido a las citocinas inducidas por la activación celular inflamatoria así como también los tipos de células adicionales que incluyen preadipocitos. Los preadipocitos exhiben características funcionales de macrófagos, tales como fagocitosis y actividad anti-microbiana, que sugieren que las células preadiposas podrían desempeñar un papel en el proceso inflamatorio o respuesta inmune (Cousin eí al. , J. Cell Physiol. , 1 86: 380-6, 2001 ). Podrían encontrarse características funcionales similares en el producto genético ob, Leptina, un péptido derivado de adiposito con niveles de circulación proporcionales a la masa grasa corporal. Los niveles de leptina en suero se correlacionan con adiposidad y se incrementan cuando mucho 3-4 veces en humanos obesos. Los niveles se disminuyen mediante ayuno y se incrementan por inflamación. La leptina es una molécula pleitrópica que regula la ingesta de alimentos, las funciones metabólicas y endocrinas y tiene un papel regulador en la inmunidad, inflamación y hematopoyesis (Fantuzzi y Faggioni, J. Leukoc. Biol., 68(4): 437-46, 2000). Además de su papel como una señal de saciedad, la leptina también es pro-inflamatoria: los receptores de leptina pertenecen a la familia de clase I de los receptores de citosina y se ha demostrado en una variedad de células hematopoiéticas, incluyendo macrófagos y células T, en las cuales la leptina promueve la liberación de citocinas inflamatorias. Por lo tanto, existe un enlace entre inflamación y obesidad (Visser et al. , Pediatrics, 107(1 ): E13, 2001 ). El papel de la leptina en el metabolismo de la energía y la inflamación es predictivo del papel de HAM. De acuerdo con lo anterior, HA puede jugar un papel en la obesidad, respuestas inflamatorias, inflamación, metabolismo, pigmentación y desórdenes neurológicos (por ejemplo, desórdenes relacionados con la mielinación). Los polipéptidos HAM, polinucleótidos y anticuerpos proporcionados en la presente encuentran uso en el tratamiento de enfermedad inflamatoria, obesidad, metabolismo de energía, apetito y la modulación de respuestas inflamatorias. La invención proporciona polipéptidos referidos en la presente como "polipéptidos HAM". Según se utiliza en la presente, un "polipéptido HAM" de la invención significa un polipéptido que contiene o comprende una secuencia amino ácida según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19; teniendo los polipéptidos una homología substancial o identidad substancial respecto a la secuencia establecida en la SEQ ID NO: 2 o 19; fragmentos de la secuencia anterior (por ejemplo, fragmentos bioactivos); y variantes conservadoras de lo anterior. Los polipéptidos HAM han demostrado tener homología con atractina y polipéptidos de caoba y, por lo tanto, tienen la función predicha y actividad biológica similar a la atractina y polipéptidos de caoba. Según se utiliza en la presente, "polipéptido" significa cualquier cadena de amino ácidos (incluyendo amino ácidos L o D), sin tomar en cuenta la longitud o modificación post-traslacional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación), e incluyen proteínas naturales, sintéticas o polipéptidos recombinantes y fragmentos, así como también una molécula recombinante que consiste en un híbrido con una primer porción, por ejemplo, que tiene todo o parte de una secuencia amino ácida de polipéptido HAM y una segunda porción que comprende todo o parte de un polipéptido de interés. Típicamente, el polipéptido HAM es substancialmente puro de otros componentes de los cuales se presenta normalmente en la naturaleza. El término "substancialmente puro" o "purificado" cuando se refiere a un polipéptido, significa un polipéptido que se encuentra al menos 30% libre de las proteínas y moléculas orgánicas naturalmente ocurrentes con las cuales se asocia naturalmente. Preferentemente, el polipéptido substancialmente puro de la invención se encuentra al menos 35-50%, preferentemente 60-70%, más preferentemente 75%, más preferentemente al menos 90%, y más preferentemente al menos 99% en peso purificado de otras moléculas orgánicas naturalmente ocurrentes. Un polipéptido substancialmente puro de la invención puede obtenerse, por ejemplo, mediante extracción de una fuente natural, mediante expresión de un polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido, o mediante sintetización química del polipéptido. La pureza puede medirse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, cromatografía de columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis de HPLC. En general, un polipéptido recombinante o fragmento puede aislarse de una célula , huésped si no se segrega, o del medio o sobrenadante si es soluble y sé segrega, seguido por una o más vueltas de concentración, desalación, intercambio iónico, interacción hidrofóbica, purificación por afinidád o cromatografía por exclusión de tamaño. Si se desea, el medio de cultivo puede concentrarse primero mediante el uso de un filtro de concentración de proteínas comerciaimente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Peilicon. Después de la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. De manera alternativa, una resina de intercambio aniónico puede emplear, por ejemplo, una matriz o substrato que tiene grupos de dietilaminoetilo (DEAE) pendientes. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en purificación de proteínas. De manera alternativa, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico, incluyendo diversas matrices no solubles que comprenden sulfopropilo o g rupos de carboximétilo. Además, puede emplearse una etapa de cromatoenfoque o, alternativamente, una etapa de cromatografía por interacción hidrofóbica. Las matrices adecuadas pueden ser fenilo o elementos de octilo enlazados a resinas. Además, puede emplearse cromatografía de afinidad con una matriz, la cual enlaza selectivamente la proteína recombinante. Los ejemplos de tales resinas empleadas son columnas de lectina, columnas de tintura y columnas de quelación de metales. Finalmente, una o más etapas de cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrofóbicos, (por ejemplo, gel de sílice o resina de polímero que tienen grupos de metilo, octilo, octildecilo u otros alifáticos, pendientes) pueden emplearse para purificar de manera adicional los polipéptidos. Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, con muy conocidas y pueden emplearse para proporcionar un polipéptido substancialmente purificado de la invención.

También es posible utilizar una columna de afinidad que comprende una proteína de enlace a polipéptido, tal como un anticuerpo monoclonal generado contra un polipéptido de la invención, para purificar por afinidad polipéptidos expresados. Estos polipéptidos pueden retirarse de una columna por afinidad mediante el uso de técnicas convencionales, por ejemplo, en un regulador de elusión elevado en sales y después dializarse hacia un regulador de sal inferior para utilizarse o mediante cambio de pH u otros componentes que dependen de la matriz de afinidad utilizada, o retirarse competitivamente mediante el uso del substrato naturalmente ocurrente del elemento de afinidad, tal como un polipéptido derivado de la invención. De acuerdo con lo anterior, las proteínas de enlace a polipéptido, tales como anticuerpos de anti-polipéptido u otras proteínas que pueden interactuar con un polipéptido de la invención, pueden enlazarse a un soporte de fase sólida, tal como una matriz de cromatografía . de columna o un substrato similar adecuado para identificación, separación o purificación de células que expresan polipéptidos de la invención sobre su superficie. La adherencia de proteínas de enlace a polipéptidos de la invención a una superficie de contacto de fase sólida puede llevarse a cabo mediante cualquier medio, por ejemplo, microesferas magnéticas pueden cubrirse con estas proteínas de enlace a polipéptido y ayudar en el recipiente de incubación a través de un campo magnético. Las suspensiones de mezclas celulares se contactan con la fase sólida que tiene tales proteínas de enlace a polipéptido sobre la misma. Las células que tienen polipéptidos de la invención sobre su superficie se enlazan a la proteína de enlace a polipéptido fija y las células no unidas se separan entonces por enjuague. Este método de enlace por afinidad es útil para purificación, selección o separación de tales células que expresan polipéptido de la solución. Las células pueden liberarse, por ejemplo, mediante el uso de una enzima preferentemente no tóxica que disocia al socio de enlace de la superfiGie celular, o mediante la realización de tal liberación mediante modificación de la composición del regulador. Alternativamente, mezclas de células que se sospecha contienen células que expresan polipéptido HAM de la invención pueden incubarse con una proteína de enlace a polipéptido biotinilado, tal como un anticuerpo de anti-HAM. Normalmente ocurre suficiente enlace dentro de aproximadamente una hora, después de lo cual la mezcla se pasa entonces a través de una columna empaquetada con perlas cubiertas de avidina, a la cual se unirá el elemento de biotina con afinidad elevada (ver Berenson, ef al. , J. Cell Biochem. , 10D: 239, 1986). Las células no unidas se enjuagan libres de la columna, y las células unidas se levigan de acuerdo a métodos convencionales. Este método puede utilizarse para aislar células que expresan polipéptidos HAM unidos a membrana. Cuando se purifican polipéptidos, el grado deseado de pureza dependerá del uso propuesto del polipéptido. Un grado de pureza relativamente elevado se desea cuando el polipéptido se administrará in vivo, por ejemplo. En tal caso, los polipéptidos típicamente se purifican de tal manera que no detecte banda alguna correspondiente a otras proteínas mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Un experto en ia materia entenderá que pueden visualizarse múltiples bandas correspondientes al polipéptido mediante SDS-PAGE, debido a glicosilación diferencial, procesamiento post-traslacional diferencial y lo similar. Más preferentemente, el polipéptidp de la invención se purifica hasta la homogeneidad substancial, ségún se indica por una sola banda de proteína después de análisis por SDS-PAGE. La banda puede visualizarse mediante teñido de plata, teñido de azul Coomassie o (si la proteína se radioetiqueta) mediante autoradiografía. Pueden discernirse varias regiones distintas dentro de un polipéptido HAM humano de la invención. Una secuencia guía, también llamada un péptido de señal, se presenta en estos polipéptidos. Por ejemplo, se predice que una secuencia guía presente en el polipéptido de longitud completa de la invención incluye amino ácidos 1 -60 de la SEQ ID NO; 2. El sitio de disociación del péptido de señal para HAM se predijo mediante el uso de un algoritmo de computadora. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que el sitio de disociación de la secuencia de señal puede variar dependiendo de varios factores que incluyen el organismo en el cual se expresa el polipéptido. De acuerdo con lo anterior, el término N de una forma madura de un polipéptido HAM de la invención puede variar de aproximadamente 2 a 5 amino ácidos. Por lo tanto, una forma madura del polipéptido HAM que comprende la SEQ ID NO: 2 puede incluir en sus amino ácidos de término N 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 o 65 de ia SEQ ID NO: 2. De acuerdo con lo anterior, una forma madura puede incluir amino ácidos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 o 65 de la SEQ ID NO: 2 hasta aproximadamente el amino ácido 1379 (o, en el caso de un polipéptido soluble, hasta el amino ácido 1230) de la S EQ ID NO: 2. Las regiones extracelulares del polipéptido HAM de la SEQ ID NO: 2 se localizan desde aproximadamente los amino ácidos 61 a 1230 de la SEQ ID NO: 2. Los dominios similares a EGF, dominio CUB, Lectina de tipo C o dominio de reconocimiento de carbohidratos (dominio CLECT), motivo KELCH y asignaciones de dominio similar a EGF de Laminina, así como también aquellos para la transmembrana y dominios citoplásmicos se basan en algoritmos computarizados y en reportes previos (Gunn et al. , Nature 398: 152-157, 1 999). Por ejemplo, la región extracelular de HAM humano contiene putativamente tres dominios similares a EGF, un dominio CUB, un motivo KELCH , un dominio de reconocimiento de carbohidratos o Lectina tipo C, un motivo de enlace a ligando putativo de la cadena común de gama citosina, y un dominio similar a EGF de Laminina localizado en aproximadamente los amino ácidos 63-90, 21 1 -244, 261 -280, 93-208, 581 -612, 749, 873, 670-686 y 1 014-1055 de la SEQ ID NO: 2, respectivamente (ver Figura 3). La región de transmembrana para los polipéptidos HAM se localiza en aproximadamente los amino ácidos 1 231 a 1251 de la SEQ ID NO: 2. Las regiones intracelulares se localizan en aproximadamente los amino ácidos 1252 a 1379 de la SEQ ID NO: 2. Las figuras 2 y 3 muestran los dominios relativos y residuos de cisteína conservados de HAM indicativos de un polipéptido de atractina o caoba. Utilizando la alineación proporcionada en la Figura 4A-B, pueden determinarse los dominios putativos del polipéptido HAM murino (SEQ ID NO: 19) en base a los dominios correspondientes en el polipéptido HAM humano (SEQ ID NO: 2). Los dominios relativos del polipéptido HAM murino (SEQ ID NO: 1 9) y los fragmentos polinucleótidos correspondientes que codifican tales dominios (por ejemplo, fragmentos de la SEQ ID NO: 1 8) se abarcan específicamente por la presente invención . De acuerdo con lo anterior, pueden discernirse varias regiones distintas dentro de un polipéptido HAM murino de la invención . Una secuencia guía, también llamada un péptido de señal, se presenta en estos polipéptidos. Por ejemplo, una secuencia guía presente en el polipéptido de longitud completa de la invención se predice que incluye amino ácidos 1 -59 de la SEQ ID NO: 1 9. El sitio de disociación de péptido de señal para HAM murino se predijo mediante el uso de un algoritmo de computadora y alineación con HAM humano. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que el sitio de disociación de la secuencia de señal puede variar dependiendo de varios factores, incluyendo el organismo en el cual se expresa el polipéptido. De acuerdo con lo anterior, el término N de una forma madura de un polipéptido HAM murino de la invención puede variar en aproximadamente 2 hasta 5 amino ácidos. Por lo tanto, una forma madura de un polipéptido HAM murino que comprende la SEQ ID NO: 19 puede incluir en su término N los amino ácidos 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, o 64 de la SEQ ID NO: 1 9. De acuerdo con lo anterior, una forma madura puede incluir el amino ácido 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, o 64 hasta aproximadamente el amino ácido 1 376 (o, en el caso de un polipéptido soluble, hasta el amino ácido 1230) de la SEQ ID NO: 2. Las regiones extracelulares de un polipéptido HAM murino de la SEQ ID NO: 1 9 se localizan desde aproximadamente los amino ácidos 60 a 1227 de la SEQ ID NO: 19. Los dominios similares a EGF, el dominio CUB, el dominio de reconocimiento de carbohidratos o Lectina tipo C (dominio CLECT), motivo KELCH y asignaciones de dominio similar a EGF de Laminina, así como también aquellos para la transmembrana y dominios citoplásmicos se basan en algoritmos de computadora, alineaciones con HAM humano (SEQ ID NO: 2) y en reportes previos (Gunn ef al. , Nature 398: 152-157, 1999). Por ejemplo, la región extracelular de HAM murino putativamente contiene tres dominios similares a EGF, un dominio CUB, un motivo KELCH, un dominio de reconocimiento de carbohidratos o Lectina tipo C, un motivo de enlace a ligando putativo de la cadena común de gama citosina y un dominio similar a EGF de Laminina localizados en aproximadamente los amino ácidos 62-89, 210-243, 260-277, 92-207, 578-609, 746-870, 667-683 y 101 1 -1052 de la SEQ ID NO: 19, respectivamente. La región de transmembrana para un polipéptido HAM murino se localiza en aproximadamente los amino ácidos 1249 a 1376 de la SEQ ID NO: 19. La invención proporciona formas tanto de maduras como de longitud completa de polipéptidos HAM. Los polipéptidos de longitud completa son aquellos que tienen la secuencia amino ácida primaria completa del polipéptido como se tradujo inicialmente. Las secuencias amino ácidas de polipéptidos de longitud completa pueden obtenerse, por ejemplo, medíante traslación de la estructura de lectura abierta completa ("ORF") de una molécula de cADN. Pueden codificarse varios polipéptidos de longitud completa mediante un solo sitio genético si se producen múltiples formas de mARN a partir de ese sitio mediante división alternativa o mediante el uso de múltiples sitios de inicio de traslación. Un ejemplo de un polipéptldo HAM de longitud completa de la invención comprende el amino ácido 1 al amino ácido 1379 de la SEQ ID NO: 2 y 1 a 1376 de la SEQ ID NO: 1 9. Tal polipéptido de longitud completa se contempla que incluye, por ejemplo, el péptido de señal que comprende amino ácidos 1 hasta aproximadamente amino ácido 60 de la SEQ ID NO: 2 y amino ácidos 1 hasta aproximadamente amino ácido 59 de la SEQ ID NO: 19, respectivamente. La "forma madura" de un polipéptido se refiere a un polipéptido que ha experimentado etapas de procesamiento post-traslacionales, si es que existen, tales como, por ejemplo, disociación de la secuencia de señal o disociación proteolítica para retirar un predominio. Las formas maduras múltiples de un polipéptido de longitud completa en particular pueden producirse, por ejemplo, mediante disociación imprecisa de la secuencia de señal o mediante regulación diferencial de proteasas que disocian al polipéptido. La(s) forma(s) madura(s) de tal polipéptido puede(n) obtenerse mediante expresión, en una célula mamífera adecuada u otra célula huésped, de un polinucleótido que codifica al polipéptido de longitud completa. La secuencia de la forma madura del polipéptido también puede ser determinable a partir de la secuencia amino ácida de la forma de longitud completa, a través de la identificación de secuencias de señal o sitios de disociación de proteasa (por ejemplo, un sitio de disociación de proteasa se predice entre los residuos Ser-Lys en las posiciones 60 y 61 de la SEQ ID NO: 2). Un ejemplo de una forma madura de un polipéptido HAM de la invención comprende una secuencia según se establece a partir de aproximadamente el amino ácido 61 hasta el amino ácido 1379 de la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos HAM de la invención también incluyen polipéptidos que resultan de los eventos de procesamiento post-transcripcional o post-traslacional tales como procesamiento alterno de mARN, los cuales pueden producir un poiipéptido trunco pero biológicamente activo, por ejemplo, una forma soluble naturalmente ocurrente del poiipéptido. También se abarcan dentro de la invención las variaciones atribuibles a proteolisis tales como las diferencias en los términos N o C después de la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido al retiro proteolítico de uno o más amino ácidos terminales del poiipéptido (generalmente desde 1 -5 amino ácidos terminales). En otra modalidad, la invención proporciona fragmentos bioactívos de un poiipéptido HAM. Por "fragmento bioactivo" se entiende un fragmento de la SEQ ID NO: 2 o 1 9 que tiene una actividad biológica asociada con una atractina y/o poiipéptido de caoba y/o una actividad biológica asopiada con una forma madura o de longitud completa de un poiipéptido HAM de la invención. Un fragmento bioactivo puede tener una o más de las siguientes actividades biológicas incluyendo, por ejemplo, inducción de monocitos y activación de macrófagos, promoción de la secreción y/o expresión de citocinas pro-inflamatorias (por ejemplo, lL-6), modulación de actividad metabólica, modulación de ganancia/pérdida de peso, y modulación del apetito y consumo de energía. Los ejemplos de fragmentos bioactivos de unas moléculas polipéptidas HAM incluyen aquellos que tienen una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 que comprende aproximadamente el amino ácido 61 a 1230 o según se establece en la SEQ ID NO: 19 que comprende aproximadamente el amino ácido 60 a 1227 y fragmentos de cualquiera de los anteriores. Tales fragmentos bioactivos representan moléculas solubles potenciales que carecen del dominio de transmembrana predicho (por ejemplo, el dominio que inicia en aproximadamente el amino ácido 1231 hasta el amino ácido 1251 de la SEQ ID NO: 2). El fragmento bioactivo de polipéptidos HAM es capaz de ínteractuar, por ejemplo, con un cognado de polipéptido HAM o con un anticuerpo desarrollado contra un polipéptido HAM de la SEQ ID NO: 2 o 1 9. Los métodos para determinar si un polipéptido HAM o fragmento bioactivo de un polipéptido HAM de la invención tiene una actividad deseada puede llevarse a cabo mediante ensayo del polipéptido por cualquiera de los métodos abajo descritos. De acuerdo con lo anterior, los polipéptidos de la invención pueden enlazarse a membrana o pueden segregarse y ser así solubles. Los polipéptidos solubles son capaces de segregarse a partir de células en las cuales se expresan. En general, los polipéptidos solubles pueden identificarse (y distinguirse de las contra-partes unidas a membrana, no solubles) mediante separación de células intactas que expresan el polipéptido deseado del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, y ensayando el medio (sobrenadante) respecto a la presencia del polipéptido deseado o mediante contacto de medio libre de células obtenido del cultivo con un anticuerpo específico para HAM. La presencia de polipéptido en el medio indica que el polipéptido se segregó a partir de células y por lo tanto es una forma soluble del polipéptido.

En una modalidad, los polipéptidos solubles (por ejemplo, un fragmento bioactivo de un polipéptido HAM) comprenden todo o parte del dominio extracelular, pero carecen del dominio de transmembrana que originaría la retención del polipéptido en una membrana celular. En algunas modalidades, el polipéptido soluble carece de un dominio de transmembrana además de uno o más dominios adicionales que incluyen, por ejemplo, la secuencia de señal o dominio citoplásmico. Un polipéptido soluble de acuerdo a la invención puede incluir el dominio citoplásmico o una porción del mismo, mientras que el polipéptido se segrega a partir de la célula en la cual se produce. En general, el uso de formas solubles es ventajoso para ciertas aplicaciones. La purificación de los polipéptidos a partir de células huésped recombinantes se facilita, ya que los polipéptidos solubles se segregan a partir de Células. Además, los polipéptidos solubles generalmente son más adecuados para administración intravenosa. La invención también proporciona polipéptidos y fragmentos del dominio extracelular que retienen la capacidad de modular respuestas inmunes, ganancia/pérdida de peso de la actividad sistémica inmune, y/o metabolismo de energía. Tal fragmento puede ser un polipéptido soluble, como se describe arriba. También se proporcionan en la presente fragmentos de polipéptido que comprenden al menos 25, o al menos 30 amino ácidos contiguos de una secuencia según se establece en la SEQ ID NO. 2 o 19. Los fragmentos derivados del dominio citoplásmico encuentran uso en estudios de transducción de señales y en la regulación de procesos celulares asociados con la transducción de señales biológicas, tales como señales inhibidoras y en la identificación de pequeños imitadores de molécula o inhibidores de interacción de receptor con moléculas de señalización. Los fragmentos polipéptidos que comprenden al menos aproximadamente 8 a 1 1 , o más preferentemente 10 a 30 amino ácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 o 19 también pueden emplearse como inmunogenes para la generación de anticuerpos, así como también como polipéptidos mayores. Las variantes naturalmente ocurrentes y variantes derivadas de los polipéptidos y fragmentos expuestos se proporcionan en la presente. Las variantes pueden exhibir secuencias amino ácidas que son al menos 80% idénticas a los polipéptidos y fragmentos expuestos. También se proporcionan polipéptidos o fragmentos que comprenden una secuencia amino ácida que es al menos 85% idéntica, al menos 90% idéntica, al menos 95% idéntica, al menos 98% idéntica, al menos 99% idéntica, o al menos 99.9% idéntica a las secuencias amino ácidas expuestas en la presente. La identidad porcentual puede determinarse mediante inspección visual y cálculo matemático. De manera alternativa, la identidad porcentual de dos secuencias de proteína puede determinarse mediante comparación de información de secuencia mediante el uso de un programa de computadora, tal como el programa GAP, en base al algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Bio. 48: 443, 1970) y disponible en la Universidad de Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por omisión preferidos para el programa GAP incluyen (1 ) una matriz de puntuación, blosum62, según se describe por Henikoff y Henikoff (Proc. Nati. Acad. Sel. USA 89: 10915, 1992); (2) un peso de intervalo de 12; (3) un peso de longitud de intervalo de 4; y (4) ninguna penalidad para los intervalos de extremo. Pueden implementarse parámetros de comparación similares mediante el uso de otros programas de computadora tales como, por ejemplo, BESTFIT, FASTA, TFASTA (ver, por ejemplo, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. adison, Wis.) o PILEUP (una simplificacipon del método de alineación progresiva de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35: 351 -360 (1987)). Las variantes de la invención incluyen, por ejemplo, aquellas que resultan de los eventos alternos de división de mARN o de disociación proteolítíca. La división alterna de mARN puede producir, por ejemplo, una proteína trunca pero biológicamente activa, tal como una forma soluble, naturalmente ocurrente, de la proteína. Las variaciones atribuibles a proteolisis incluyen, por ejemplo, las diferencias en los términos N o C después de la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido al retiro proteolítico de uno o más amino ácidos terminales de la proteína (generalmente desde 1 -5 amino ácidos terminales). También se contemplan en la presente las proteínas en las cuales las diferencias en a secuencia amino ácida son atribuibles a polimorfismo genético (variación alélica entre individuos que producen la proteína). Las variantes adicionales dentro del alcance de la invención incluyen polipéptidos que pueden modificarse para crear derivados de los mimos mediante la formación de conjugados covalentes o agregados con otros elementos químicos, tales como grupos de glicosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y lo similar. Los derivados covalentes pueden prepararse mediante enlace de los elementos químicos a grupos funcionales en cadenas laterales amino ácidas o en el término N o término C de un polipéptido. Los conjugados que comprenden agentes terapéuticos o de diagnóstico (detectables) anexos a los mismos se contemplan en la presente, como se discute con mayor detalle a continuación. Otros derivados incluyen conjugados covalentemente enlazados o agregados de los polipéptidos con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante síntesis en cultivo recombinante como fusiones de terminal N o de terminal C. Los ejemplos de polipéptidos de fusión se discuten abajo en conexión con oligómeros. Además, los polipéptidos de fusión pueden comprender péptidos agregados para facilitar la purificación e identificación . Tales péptidos incluyen , por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la Patente de E. U. No. 5,01 1 ,912 y en Hopp ef al., Bio/Technology 6: 1204, 1 988. Uno de tales péptidos es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (SEQ ID NO: 3), el cual es altamente antigénico y proporciona un epítope reversiblemente enlazado por un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo un rápido ensayo y fácil purificación de la proteína recombinante expresada. Un hibridoma murino designado 4E1 1 produce un anticuerpo monoclonal que se enlaza al péptido FLAG® en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes, como se describe en la Patente de E.U . 5,01 1 ,912, incorporada en la presente para referencia. La línea celular de hibridoma 4E1 1 se ha depositado con la Colección de Cultivos Tipo Americano bajo el número de acceso H B 9259. Los anticuerpos monoclonales que se enlazan al péptido FLAG® se encuentran disponibles en Eastman Kodak Co. , Scientific Imaging Systems División, New Haven, Connecticut. Entre los polipéptidos variantes proporcionados en la presente se encuentran las variantes de polipéptidos HAM nativos que retienen las propiedades de enlace nativas o la actividad biológica de un polipéptido HAM maduro de la SEQ ID NO: 2 o 1 9 o el equivalente substancial de los mismos. Por ejemplo, una variante incluye una molécula que enlaza su socio de enlace con esencialmente la misma afinidad de enlace que la forma nativa. La afinidad de enlace puede medirse mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, como se describe en la Patente de E.U. No. 5,512,457 y según se establece a continuación. Las variantes incluyen polipéptidos que son substancialmente homólogos a la forma nativa, pero que tienen una secuencia amino ácida diferente de la forma nativa debido a una o más omisiones, inserciones o substituciones. Las modalidades particulares incluyen, pero sin limitarse, polipéptidos que comprenden desde una hasta diez omisiones, inserciones o substituciones de residuos amino ácidos, cuando se comparan con una secuencia nativa. Un amino ácido dado puede reemplazarse, por ejemplo, por un residuo que tiene características fisioquímicas similares. Los ejemplos de tales substituciones conservadoras incluyen la substitución de un residuo alifático por otro tal como lie, Val, Leu, o Ala por otro; la substituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg, Glu y Asp o Gln y Asn; o substituciones de un residuo aromático por otro, tal como Phe, Trp, o Tyr por otro. Otras substituciones conservadoras, por ejemplo, que involucran substituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares, son muy conocidas. También se incluye la sustitución de amino ácidos L por amino ácidos D. La presencia de amino ácidos D proporciona resistencia a proteasas e incrementa la estabilidad de un polipéptido o fragmento del mismo. Las substituciones amino ácidas y otras alteraciones (omisiones, inserciones y lo similar) a un polipéptido HAM de la invención se predice es más probable que alteren o interrumpan las actividades polipéptidas HAM si dan como resultado cambios a los residuos conservados, indicados por el "consenso", indicado en la Figura 2 A-C. Por el contrario, si se hace un cambio a un polipéptido HAM que da como resultado la substitución de uno o más residuos de secuencia de consenso de la Figura 2 para el residuo polipéptido HAM en esa posición conservada, es menos probable que tal alteración afecte la función polipéptida HAM. En un aspecto, la invención proporciona polipéptidos HAM que tienen desde 1 -10 substituciones, inserciones y/u omisiones amino ácidas. De manera similar, los polinucleótidos de la invención incluyen variantes que difieren de un polinucleótido HAM nativo debido a una o más omisiones, inserciones o substituciones, pero que codifican un polipéptido biológicamente activo. Además, las "variantes modificadas de manera conservadora" aplican tanto a polipéptidos como a polinucleótidos. Con respecto a un polinucleótido en particular, las variantes modificadas de manera conservadora se refieren a codones en el polinucleótido que codifican amino ácidos idénticos o esencialmente idénticos. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de polinucleótidos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos la alanina amino ácida. Por lo tanto, én cualquier posición donde se especifique una alanina por un codón, el codón pueden alterarse hacia cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones modificadas de manera conservadora. Cada secuencia poliriucleótida en la presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación discreta del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un polinucleótido (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con lo anterior, cada variación discreta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido se encuentra implícita en cada secuencia descrita. La invención incluye además polipéptidos de la invención con o sin glicosilación de patrón nativo asociada. Los polipéptidos expresados en levadura o sistemas de expresión mamíferos (por ejemplo, células COS-1 o COS-7) pueden ser similares a o significativamente diferentes de un polipéptido nativo en peso molecular y patrón de glicosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de cualquiera de los polipéptidos de la invención en sistemas de expresión bacterianos, tales como E. coli, proporciona formas no glicosiladas de los polipéptidos. Además, una preparación dada puede incluir múltiples especies diferencialmente glicosiladas de la proteína. Los grupos glicosilo pueden retirarse a través de métodos convencionales, en particular aquellos que utilizan glicopeptidasa. En general, los polipéptidos glicosilados de la invención pueden tener sus elementos de carbohidratos retirados al incubarse con un exceso molar de glicopeptidasa (Boehringer annheim). Los sitios de N-glicosilación en polipéptidos eucarióticos se caracterizan por un triplete amino ácido Asn-X-Y, en donde X es cualquier amino ácido excepto Pro e Y es Ser o Thr. Los polipéptidos HA de la invención tienen varios sitios de glicosilación putativos. Por ejemplo, el residuo de Asn en una o más de las siguientes posiciones es un sitio de glicosilación potencial: 76N, 174N, 198N, 214N, 272N, 326N, 380N, 542N, 590N, 697N, 704N, 763N, 778N, 817N, 831 N, 842N, 898N, 942N, 1033N, 1 149N, 1 157N, 1201 N y 1210N de la SEQ ID NO: 2. HAM murino también tiene sitios de glicosilación putativa en 75N, 173N, 197N, 213N, 271 N, 323N, 378N, 539N, 587N, 694N, 701 N, 760N, 775N, 814N, 828N, 839N, 895N, 939N, 1030N, 1 146N, 1 154N, 1 198N y 1207N de la SEQ ID NO: 19. Los sitios de N-glicosilación en el dominio extracelular polipéptido pueden modificarse para evitar la glicosilación, permitiendo la expresión de un análogo de carbohidrato reducido en sistemas de expresión mamíferos y de levadura. De acuerdo con lo anterior, las modificaciones (por ejemplo, tratamiento con una glicopeptidasa) o substituciones u omisiones de estos residuos pueden modular la actividad de un polipéptido HAM maduro de la invención. De manera correspondiente, se abarcan por la invención las construcciones polinucleótidas similares que codifican diversas adiciones o substituciones de residuos o secuencias amino acidas, u omisiones de residuos o secuencias terminales o internos. Las substituciones, adiciones u omisiones adecuadas a la secuencia nucleótida que codifica estos tripletes (por ejemplo, Asn-X-Y) darán como resultado la prevención de la sujeción de residuos carbohidratos en la cadena lateral Asn. La alteración de un solo nucleótido, seleccionado a fin de que Asn se reemplace por un amino ácido diferente, por ejemplo, es suficiente para inactivar un sitio de N-glicosilación. Alternativamente, un Ser o Thr en el triplete puede reemplazarse con otro amino ácido, tal como Ala. Los procedimientos conocidos para inactivar sitios de N-glicosilación en proteínas incluyen aquellos descritos en la Patente de E.U. 5,071 ,972 y ia EP 276,846. Un experto en la materia puede identificar los codones correspondientes a los residuos Asn para HAM según se describe arriba, así como también los residuos Ser y Thr del triplete Asn-X-Y. En otro ejemplo de variantes, las secuencias que codifican residuos Cys que no son esenciales para la actividad biológica pueden alterarse para originar que los residuos Cys se omitan o reemplacen con otros amino ácidos, previniendo la formación de puentes de disulfuro intramoleculares, incorrectos, después del doblez o renaturalización. Varios de los residuos Cys conservados, putativos, de un polipéptido HAM de la invención se identifican en la alineación proporcionada en la Figura 2 y en la Figura 4. Se preparan otras variantes mediante modificación de residuos amino ácidos dibásicos, adyacentes, para mejorar la expresión en sistemas de levadura en los cuales se presenta actividad de proteasa KEX2. La EP 212,914 expone el uso de mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de proteasa KEX2 en una proteína. Los sitios de procesamiento de proteasa se inactivan por omisión, adición o s ubstitución de residuos para alterar pares Arg-Arg, Arg-Lys, y Lys-Arg a fin de eliminar la ocurrencia de estos residuos básicos adyacentes. Los pares Lys-Lys son considerablemente menos susceptibles a disociación de K EX2 y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg a Lys-Lys representa un enfoque conservador y preferido para inactivar sitios KEX2. Oligomeros Se abarcan por la invención los oligómeros y polipéptidos de fusión, que comprenden un polipéptido HAM o un fragmento bioactivo del mismo enlazado a un polipéptido de interés. En una modalidad preferida, el socio de fusión se enlaza al término C del polipéptido HAM o un fr agmento bioactivo del mismo. Tales oligómeros pueden encontrarse en la forma de multímeros enlazados de manera covalente o enlazados de manera no covalente, incluyendo dimeros, trímeros u oligómeros mayores. C omo se observó arriba, los polipéptidos preferidos son solubles y por lo tanto estos oligómeros típicamente comprenden polipéptidos solubles. En un aspecto de la invención, los oligómeros mantienen la habilidad de enlace de los componentes polipéptidos y proporcionar para lo mismo s itios de enlace bivalentes, trivalentes y lo similar. Una modalidad de la invención se dirige a oligómeros que C Dmprenden múltiples polipéptidos unidos a través de interacciones C Dva lentes o no covalentes entre elementos péptidos fusionados a los polipéptidos. Tales elementos péptidos pueden ser enlazadores péptidos (separadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Los ejemplos de péptidos enlazadores incluyen -Gly-Gly--, GGGGS (SEQ ID NO: 4) (GGGGS)n (SEQ ID NO: 5), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO: 6), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 7), GSTSGSG SSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 8), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 9) o EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO: 10). Los elementos de enlace se describen, por ejemplo, en Huston, J. S. , et al. , PNAS 85: 5879-5883 (1988), Whitlow, . , et al. , Diseño de Proteínas 6: 989-995 (1993), y Newton, D.L. , et al., Biochemistry 35: 545-553 (1996). Otros enlazadores péptidos adecuados son aquellos descritos en las Patentes de E.U. 4,751 , 180 y 4,935,233, las cuales se incorporan en la presente para referencia. Un polinucleótido que codifica un enlazador péptido deseado puede insertarse entre, y en la misma estructura de lectura que, un polinucleótido que codifica un polipéptido HAM o fragmento bioactivo de la invención, mediante el uso de cualquier técnica convencional adecuada. En modalidades particulares, un polipéptido de fusión comprenden desde dos hasta cuatro fragmentos bioactivos de un polipéptido HAM (por ejemplo, un fragmento soluble), separado por enlazadores péptidos. En una modalidad, la invención proporciona un polipéptido de fusión que tiene un dominio polipéptido Fe y un polipéptido HAM o fragmento bioactivo (por ejemplo, un fragmento según se establece en la SEQ ID NO: 2 desde aproximadamente el amino ácido 61 hasta 1230). Los cierres de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de los polipéptidos anexos a los mismos, según se describe con mayor detalle a continuación. Como una alternativa, un oligómero o polipéptido de fusión se prepara mediante el uso de polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Se ha descrito la preparación de polipéptidos de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fe), por ejemplo, por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991 ); Byrn et al. {Nature 344: 677, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construcción de Proteínas de Fusión de Inmunoglobulina", en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 -10.19.1 1 , 1992). Una modalidad de la presente invención se dirige a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas por fusión de un polipéptido HA o fragmento bioactivo de la invención para un polipéptido Fe derivado de un anticuerpo. Una fusión genética que codifica un polipéptido HAM/ proteína de fusión Fe se inserta en un vector de expresión adecuado. El polipéptido HA /proteínas de fusión Fe en células huésped transformadas con el Vector de expresión recombinante, transformadas con el vector de expresión recombinante y se dejan ensamblar mucho más como moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces de disulfuro entre elementos Fe para producir moléculas divaientes. Un polipéptido de Fe incluye formas de muteína y nativas de polipéptidos hechos de la región Fe de un anticuerpo que comprende cualquiera o todos los dominios CH de la región Fe. También se incluyen las formas truncas de tales polipéptidos que contienen la región de articulación que promueve la dimerización. Los polipéptidos preferidos comprenden un polipéptido de Fe derivado de un anticuerpo lgG 1 humano. Los polipéptidos Fe preferentemente se enlazan a los términos COOH de un polipéptido HA o fragmento bioactivo de la invención. Un polipéptido Fe adecuado, descrito en la solicitud de PCT WO 93/10151 (incorporada en la presente para referencia) es un polipéptido de una sola cadena que se extiende desde la región de articulación de terminal N hasta el término nativo C de la región Fe de un anticuerpo lgG1 humano. Otro polipéptido de Fe útil es la muteína Fe descrita en la Patente de E.U. 5,457,035 y en Barum et al. , (EMBO J. 1 3: 3992-4001 , 1 994) incorporada en la presente para referencia. La secuencia amino ácida de esta muteína es idéntica a la de la secuencia nativa Fe presentada en WO 93/10151 , excepto que el amino ácido 1 9 ha cambiado de Leu a Ala, el amino ácido 20 ha cambiado de Leu a Glu, y el amino ácido 22 ha cambiado de Gly a Ala. La muteína exhibe afinidad reducida para receptores Fe. Las proteínas de fusión arriba descritas que comprenden elementos Fe (y oligómeros formados a partir de los mismos) ofrecen la ventaja de fácil purificación mediante cromatografía por afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G. En otras modalidades, los polipéptidos de la invención pueden sustituirse por la porción variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo. Si las proteínas de fusión se elaboran con cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, es posible, por ejemplo, formar un oligómero con tantas como cuatro regiones extracelulares HAM.

Otro método para preparar los oligómeros de la invención involucra el uso de un cierre de leucina. Los dominios de cierre de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las cuales se encuentran. Los cierres de leucina se identificaron originalmente en varias proteínas de enlace a ADN (Landschulz et al. , Science 240: 1759, 1 988) y desde entonces se han encontrado en una variedad de diferentes proteínas. Entre los cierres de leucina conocidos se encuentran los péptidos naturalmente ocurrentes y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. El dominio de cierre (también referido en la presente como un dominio de oligomerización o formador de oligómeros) comprende una repetición héptada repetitiva, con frecuencia con cuatro o cinco residuos de leucina intercalados con otros amino ácidos. Los ejemplos de dominios de cierre son aquellos encontrados en el factor de transcripción de levadura GCN4 y una proteína de enlace a ADN termoestable encontrada en hígado de rata (C/EBP; Landschulz et al., Science 243: 1681 , 1989). Dos proteínas transformadoras nucleares, fos y jun, también exhiben dominios de cierre y así mismo el producto genético del proto-oncogen murino, c-myc (Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988). Los productos de los oncogenes nucleares fos y jun comprenden dominios de cierre que preferentemente forman un heterodímero (O'Shea et al., Science 245: 646, 1989, Turner y Tjian, Science 243: 1689, 1 989). Las proteínas fusogénicas de varios virus diferentes, incluyendo paramixovirus, coronavirus, virus de cisticercosis y muchos retrovirus, también poseen dominios de cierre (Buckland y Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991 ; Delwart y osialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990). Los dominios de cierre en estas proteínas virales fusogénicas se encuentran cerca de la región de transmembrana de las proteínas; se ha sugerido que los dominios de cierre podrían contribuir a la estructura oligomérica de las proteínas fusogénicas. La oligomerización de proteínas virales fusogénicas se involucra en la formación de poros de fusión (Spruce et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 88: 3523, 1991 ). Los dominios de cierre también se ha reportado que desempeñan un papel en la oligomerización de factores de transcripción de termo-choque (Rabindran et al., Science 259: 230, 1993). Los dominios de cierre se doblan como bobinas cortas enrolladas en paralelo (O'Shea et al., Science 254: 539, 1991 ). La arquitectura general de la bobina enrollada en paralelo se ha caracterizado, con un empaquetamiento de "salientes en orificios" según se propuso por Crick en 1953 (Acta Crystallogr. 6:689). El dímero formado por un dominio de cierre se estabiliza por la repetición héptada, designada (ab dfg)n de acuerdo a la notación de McLachlan y Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293, 1975), en la cual los résidüos a y d son residuos generalmente hidrofóbicos, siendo d una leucina, la cual se alinea sobre la misma superficie de un hélice. Los residuos cargados de manera opuesta comúnmente ocurren en posiciones g y e. Por lo tanto, en una bobina enrollada en paralelo formada a partir de dos dominios de cierre helicoidales, las "salientes" formadas por las cadenas laterales hidrofóbicas del primer hélice se empacan en los "orificios" formados entre las cadenas laterales del segundo hélice.

Los residuos en la posición d (con frecuencia leucina) contribuyen a grandes energías de estabilización hidrofóbica y son importantes en la formación de oligómeros (Krystek eí al., Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991 ). Lovejoy eí al. (Science 259: 1288, 1 993) reportó la síntesis de un bulto a-helicoidal de triple filamento en el cual las hélices corren arriba-arriba-abajo. Sus estudios confirmaron que la energía de estabilización hidrofóbica proporciona la principal fuerza motriz para la formación de bobinas enrolladas a partir de monómeros helicoidales. Estos estudios también indican que las interacciones electroestáticas contribuyen a la estequiometría y geometría de bobinas enrolladas. La discusión adicional de la estructura de cierres de leucina se encuentra en Harbury eí al. (Science 262: 1401 , Noviembre 26 de 1993). Los ejemplos de dominios de cierre de leucina adecuados para la producción de proteínas oligoméricas solubles incluyen el cierre de leucina descrito en la solicitud de PCT WO 94/10308 y el cierre de leucina derivado de proteína D surfactante de pulmón (SPD) descrita en Hoppe eí al. (FEBS Letters 344: 191 , 1994), incorporada en la presente para referencia. El uso de un cierre de leucina modificado que permite la trimerizacion estable de una proteína heteróloga fusionada al mismo se describe en Fanslow eí al. (Semin. Immunol. 6: 267-278, 1994). Las proteínas dé fusión recombinantes que comprenden un fragmento bioactivo de la invención (por ejemplo, un fragmento soluble) fusionadas a un péptido de cierre de leucina se expresan en células huésped adecuadas y el oligómero soluble que forma se recupera a partir del sobrenadante de cultivo.

Ciertos elementos de cierre de leucina forman trímeros. Un ejemplo es un cierre de leucina derivado de proteína D surfactante de pulmón (SPD) arriba anotada, según se describe en Hoppe et al. y en la Patente de E.U . 5,716,805, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. Este péptido de cierre de leucina derivado de SPD de pulmón comprende la secuencia amino ácida: Pro-Asp-Val-Ala-Ser-Leu-Arg-GIn-Gln-Val-Glu-Ala-Leu-Gln-Gly-Gln-Val-Gln-His-Leu-Gln-Ala-Ala-Phe-Ser-Gln-Tyr (SEQ I D NO: 1 1 ). Otro ejemplo de un cierre de leucina que promueve la trimerización es un péptido que comprende la secuencia amino ácida Arg-Met-Lys-GIn-lle-Glu-Asp-Lys-lle-Glu-Glu-lle-Leu-Ser-Lys-lle-Tyr-His-lle-Glu-Asn-Glu-lle-Lys-Lys-Leu-lle-Gly-Glu-Arg (SEQ ID NO: 12), según se describe en la Patente de E.U. 5,716,805. En una modalidad alternativa, se agrega un residuo de Asp de terminal N; en otra, el péptido carece del residuo Arg de terminal N. Los fragmentos de los péptidos de cierre anteriores que retienen la propiedad de promover la oligomerización también pueden emplearse. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero sin limitarse, péptidos que carecen de uno o dos de los residuos de terminal N o de terminal C presentados en las secuencias amino ácidas anteriores. Los cierres de leucina pueden derivarse de péptidos de cierre de leucina naturalmente ocurrentes, por ejemplo, a través de substitución(es) conservadora(s) en la secuencia amino ácida nativa, en donde se retiene la habilidad del péptido para promover la oligomerización. En modalidades particulares, los residuos de leucina en un elemento de cierre de leucina se reemplazan por residuos de isoleucina. Tales péptidos que comprenden isoleucina pueden referirse como cierres de isoleucina , pero se abarcan por el término "cierres de leucina", según se emplea en la presente. Anticuerpos Los polipéptidos, fragmentos (por ejemplo, fragmentos solubles o bioactivos), variantes, proteínas de fusión y lo similar, según se establece arriba, pueden emplearse como "inmunogenes" en la producción de anticuerpos inmunoreactivos con los mismos. Más específicamente, los polipéptidos, fragmentos, variantes, proteínas de fusión y lo similar, contienen determinantes antigénicas o epítopes que producen la formación de anticuerpos. Las determinantes o epítopes antigénicas adecuadas pueden ser ya sea lineales o conformacionales (discontinuos). Los epítopes lineales se componen de una serie lineal de amino ácidos enlazados entre sí mediante enlaces covalentes, mientras que los epítopes conformacionales o discontinuos se componen de secciones amino ácidas de diferentes regiones de la cadena polipéptida que se conducen en proximidad después del doblez de la proteína (C.A. Janeway, Jr. Y P. Travers, Immuno Biology 3: 9 (Garland Publishing Inc. , 2nd. Ed. 1 996)). Debido a que las proteínas dobladas tienen superficies complejas, el número de epítopes disponibles es bastante numeroso; sin embargo, debido a la conformación de la proteína y las articulaciones estéricas, el número de anticuerpos que realmente se enlaza a los epítopes es inferior al número de epítopes disponibles (C. A. Janeway, Jr. Y P. Travers, Immuno Biology 2: 14 (Garland Publishing Inc. , 2nd. Ed. 1996)). Los epítopes pueden identificarse por cualquier número de métodos conocidos en la materia. Los epítopes derivados de los polipéptidos expuestos son útiles para elevar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, y pueden utilizarse como reactivos de búsqueda en ensayos y para purificar anticuerpos de enlace específicos a partir de substancias tales como suero policlonal o sobrenadantes de hibridomas cultivados. Tales epítopes o variantes de los mismos pueden producirse mediante el uso de técnicas muy conocidas en la materia, tales como síntesis de fase sólida, disociación química o enzimática de un polipéptido, o mediante el uso de tecnología de ADN recombinante. Los anticuerpos policlonales y monoclonales producidos por los polipéptidos expuestos, ya sea que los epítopes se hayan aislado o permanezcan como parte de los polipéptidos, pueden prepararse mediante técnicas convencionales. Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biológica! Analysis, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1 988). Las líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales específicos para los polipéptidos de la invención también se contemplan en la presente y pueden producirse e identificarse mediante técnicas convencionales. Un método para la producción de tal línea celular de hibridoma comprende la inmunización de un animal con un polipéptido; recolectando células de bazo del animal inmunizado; fusionando dichas células de bazo con una línea celular de mieloma, generando así células de hibridoma; e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que enlaza el polipéptido. Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse mediante técnicas convencionales. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas y ofrecen la ventaja de inmunogenicidad reducida cuando los anticuerpos se administran a humanos, tal como para propósitos terapéuticos. En una modalidad, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o solo el sitio de enlace antígeno del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. De manera alternativa, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de enlace a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece de sitio de enlace a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales quiméricos y diseñados incluyen aquellos descritos en Riechmann et al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et al. (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7: 934, 1 989) y Winter y Harris (TIPS 14: 139, Mayo 1993). Los procedimientos para generar anticuerpos transgénicamente pueden encontrarse en GB 2,272,440, las Patentes de E. U . Nos. 5,569,825 y 5,545,806 y las patentes relacionadas que reclama prioridad de lo mismo, todas cuales se incorporan en la presente para referencia. Los procedimientos para generar anticuerpos transgénicamente pueden encontrarse en GB 2,272,440, las Patentes de E.U. Nos. 5,569,825 y 5,545,806 y patentes relacionadas que reclama prioridad de lo mismo, todas cuales se incorporan en la presente para referencia. Preferentemente, para uso en humanos, los anticuerpos son humanos: las técnicas para la creación de tales anticuerpos humanos también se conocen y los ratones transgénicos útiles para la creación de tales anticuerpos se .encuentran comercialmente disponibles en, por ejemplo, Medarex Inc. (Princeton, NJ) y Abgenix Inc. (Fremont, CA). Los fragmentos de enlace antígeno de los anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales, también se abarcan por la presente invención. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero sin limitarse, scFv, Fab y fragmentos F(ab')2- Los fragmentos de anticuerpos y derivados producidos por técnicas de diseño genético también se proporcionan. Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en ensayos para detectar la presencia de los polipéptidos o fragmentos de la invención, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos también pueden emplearse en la purificación de polipéptidos o fragmentos de la invención mediante cromatografía por inmunoafinidad. Aquellos anticuerpos que bloquean el enlace de los polipéptidos de la invención a sus socios de enlace pueden utilizarse para inhibir una actividad biológica que resulta de tal enlace. Tales anticuerpos de bloqueo pueden identificarse mediante el uso de cualquier procedimiento de ensayo adecuado, tal como mediante la examinación de anticuerpos para la habilidad de inhibir el enlace de un polipéptido HAM o fragmento bioactivo del mismo a ciertas células que expresan los socios de enlace de tal polipéptido o fragmento. De manera alternativa, los anticuerpos de bloqueo pueden identificarse en ensayos para la habilidad de inhibir un efecto biológico que resulta del enlace de los polipéptidos de la invención a células objetivo. Los anticuerpos pueden ensayarse respecto a la habilidad para inhibir actividades celulares mediadas por polipéptido HA , por ejemplo. Tales anticuerpos pueden emplearse en procedimiento in vitro o administrarse in vivo para inhibir una actividad biológica mediada por el polipéptido al cual se enlaza el anticuerpo. Los desórdenes originados o exacerbados (directa o indirectamente) por la interacción de los polipéptidos de la invención con receptor de superficie celular (socio de enlace) pueden tratarse así. Un método terapéutico involucra ia administración in vivo de un anticuerpo de bloqueo a un mamífero en una cantidad eficaz para la inhibición de una actividad biológica mediada por polipéptido HAM. Los anticuerpos monoclonales se prefieren generalmente para utilizarse en tales métodos terapéuticos. En una modalidad , un fragmento de anticuerpo de enlace a antígeno se emplea. Además, las etiquetas terapéuticas o de, diagnóstico pueden conjugarse con los anticuerpos de la invención, dirigiéndose así las células terapéuticas o de diagnóstico a los anticuerpos de la invención , dirigiendo así lo terapéutico o diagnóstico a células que expresan un polipéptido HAM. Los anticuerpos pueden seleccionarse por sus propiedades agonísticas (es decir, imitadoras de HAM). Un anticuerpo agonístico incluye anticuerpos que se enlazan a HAM y activan HAM (por ejemplo, mediante degradación de la molécula HAM). Tales anticuerpos, después del enlace al cognado de HAM sobre una superficie celular, inducen efectos biológicos (por ejemplo, transducción de señales biológicas) similares a los efectos biológicos inducidos cuando un polipéptido HAM se enlaza a ligandos de superficie celular. Se proporcionan en la presente las composiciones que comprenden un anticuerpo que se dirige contra un polipéptido HAM o fragmento del mismo y un diluyente, excipiente o vehículo fisiológicamente aceptable. Los componentes adecuados de tales composiciones son según se describen aquí y son similares a aquellos descritos para composiciones que contienen un polipéptido HAM o fragmento del mismo. También se proporcionan en la presente conjugados que comprenden un agente detectable (por ejemplo, de diagnóstico) o terapéutico, anexo al anticuerpo. Los conjugados encuentran uso en procedimientos in vitro o ¡n vivo. polinucleótidos La invención también proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos HAM y fragmentos bioactivos de los mismos. El término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o formas modificadas de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de un solo y de doble filamento de ADN o ARN. El ADN incluye, por ejemplo, cADN, ADN genómico (por ejemplo, una secuencia que contiene intrones y exones), ADN químicamente sintetizado, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de los mismos. Los polinucleótidos de la invención incluyen genes de longitud completa y moléculas de cADN así como también una combinación de fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos de la invención se derivan preferentemente de fuentes humanas, pero la invención incluye aquellos derivados de especies no humanas también. Por "polinucleótido aislado" se entiende un polinucleótido que no es inmediatamente contiguo con ambas secuencias codificadoras con las cuales es inmediatamente contiguo (uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3') en el genoma naturalmente ocurrente del organismo del cual se deriva. Por consig uiente, el término incluye, por ejemplo, una molécula polinucleótida recombinante que se incorpora en un vector, por ejemplo, un vector de expresión; en una plásmida o virus de reproducción autónoma; o en el ADN genómico de un procariote o eucariote, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, una cADN) independiente de otras secuencias. Un polinucleótido de la invención comprende (1 ) una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 18; (2) secuencias complementarias a una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 18; (3) fragmentos de la SEQ ID NO: 1 o 18 o sus complementos que hibridizan específicamente al polinucleótido de (1 ) o (2) bajo condiciones altamente estrictas a moderadas, en donde los fragmentos son de aproximadamenté 50 hasta 1 00 bases consecutivas de longitud, 200 hasta 300 bases consecutivas de longitud, o 500 hasta 1000 bases consecutivas de longitud o mayores; y (4) secuencias de (1 ), (2) o (3) en donde T también puede ser U (por ejemplo, secuencias de ARN). También se abarcan por la invención los homólogos de un polinucleótido de la invención. Estos homólogos pueden identificarse de varias maneras, incluyendo el aislamiento de moléculas genómicas o de cADN provenientes de una fuente adecuada o búsquedas por computadora de bases de datos de secuencias disponibles. Los oligonucleótidos o polinucleótidos correspondientes a las secuencias amino ácidas descritas en la presente pueden utilizarse como sondas o cargas de inicio para el aislamiento de homólogos polinucleótidos o como secuencias de consulta para búsquedas en base de datos. Las secuencias oligonucleótidas degeneradas pueden obtenerse por "traslación posterior" de las secuencias amino ácidas (por ejemplo, una secuencia de SEQ ID NO: 2 o 19). El procedimiento de reacción en cadena de polimerasa (PCR) puede emplearse para aislar y amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido HAM. Los fragmentos de los polinucleótidos de la invención son útiles como sondas y cargas de inicio para identificar o amplificar la secuencia relacionada u obtener secuencias de longitud completa de un polinucleótido HAM de la invención. Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, a fin de facilitar la inserción de la combinación amplificada de fragmentos de ADN en un vector de expresión. Las técnicas de PCR se describen en Saiki eí al. , Science 239: 487 (1988); Metodología de ADN Recombinante, Wu eí al. , eds. , Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 1 89-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. , Academic Press, Inc. (1990).

La invención también incluye polinucleótidos y oligonucleótidos que se hibridizan bajo condiciones de escasez reducida, más preferentemente condiciones de escasez moderada y más preferentemente condiciones altamente estrictas, a polinucleótidos que codifican polipéptidos HAM descritos en la presente. Los parámetros básicos que afectan la elección de condiciones de hibridizacion y guía para prever condiciones adecuadas se establecen por Sambrook, J.E. F. Fritsch y T. aniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 1 1 ; y Protocolos Actuales en Biología Molecular, 1995, F.M. Ausubel et al. , eds. , John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.1 0 y 6.3-6.4, incorporados en la presente para referencia) y pueden determinarse fácilmente por aquellos que tienen experiencia ordinaria en la materia en base, por ejemplo, a la longitud y/o composición base del ácido nucleico. Una manera de lograr condiciones moderadamente estrictas involucra el uso de una solución de pre-enjuague que contiene 5 x SSC, 0.5% de SDS, 1 .0 mM de EDTA (pH 8.0), regulador de hibridizacion de aproximadamente 50% de formamida, 6 x SSC y una temperatura de hibridizacion de aproximadamente 55°C /u otras soluciones de hibridizacion similares, tales como una que contiene aproximadamente 50% de formamida, con una temperatura de hibridizacion de aproximadamente 42 °C) y condiciones de enjuagado de aproximadamente 60°C, en 0.5 x SSC, 0.1 % de SDS. Generalmente, las condiciones altamente estrictas se definen como condiciones de hibridizacion como arriba, pero con enjuague a aproximadamente 68°C, 0.2 x SSC, 0.1 % SDS, SSPE (I xSSPE es 0.15 M de NaCI, 1 0 mM de NaH2P04 y 1 .25 mM de EDTA, pH 7.4) pueden sustituirse por SSC (1 xSSC es 0.15 M de NaCI y 1 5 mM de citrato de sodio) en la hibridizacion y reguladores de enjuague; los enjuagues se llevan a cabo durante 15 minutos después de que se completa la hibridizacion. Debe entenderse que la temperatura de enjuague y la concentración de sales de enjuague puede ajustarse según sea necesario para lograr un grado deseado de escasez mediante la aplicación de los principios básicos que dirigen las reacciones de hibridizacion y la doble estabilidad, como se conoce por aquellos expertos en la materia y según se describe más abajo (ver, por ejemplo, Sambrook et al. , 1989). Cuando se hibridiza un ácido nucleico hacia un polinucieótido objetivo de secuencia desconocida, se supone que la longitud híbrida seá la del ácido nucleico de hibridizacion. Cuando los ácidos nucleicos de secuencia conocida se hibridizan, la longitud híbrida puede determinarse por alineación de las secuencias de los ácidos nucleicos y la identificación de la región o regiones de complementaridad de secuencia óptima. La temperatura de hibridizacion para híbridos anticipados que deben ser de menos de 50 pares base de longitud , debe encontrarse a de menos de 50 pares base de longitud debe encontrarse a 5 hasta 10°C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para los híbridos de menos de 18 pares de longitud, Tm (°C) = 2(# de bases A+T) + 4(# de bases G+C). Para los híbridos de más de 18 pared de longitud, Tm (°C) = 81.5 + 16.6(log 10[Na+]) + 0.41 (%G+C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el regulador de hibridizacion ([Na+] para 1 xSSC = 0.165M).

Preferentemente, cada tal ácido pucleico de hibridización tiene una longitud que es al menos 25% (más preferentemente al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70% y más preferentemente al menos 80%) de la longitud del ácido nucleico de la invención al cual hibridiza y tiene al menos 60% de identidad de secuencia (más preferentemente al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97.5% o al menos 99% y más preferentemente al menos 99.5%) con el polinucleótido de la invención al cual hibridiza. Otras modalidades de la invención incluyen polinucleótidos que tienen secuencias que codifican dominios discretos de un polipéptido HAM que tienen una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19. El análisis por computadora predice que el péptido de señal de los polipéptidos HAM es más probable que se disocie después del residuo 60 de la SEQ ID NO: 2 y después del residuo 59 de la SEQ ID NO: 19, aunque otros posibles sitios de disociación incluyen después de los amino ácidos 54, 55, 59, 172 o 173. Estos sitios de disociación predicen un polipéptido HAM maduro que comprende desde aproximadamente el amino ácido 55 hasta 1379, desde aproximadamente 56 hasta 1379, desde aproximadamente 60 hasta 1379, desde aproximadamente 61 hasta 1370 o desde aproximadamente 174 hasta 1379 de la SEQ ID NO: 2 y desde aproximadamente 55 hasta 1376, desde aproximadamente 56 hasta 1376, desde aproximadamente 60 hasta 1376, desde aproximadamente 61 hasta 1376 o desde aproximadamente 173 hasta 1376 de la SEQ ID NO: 19. Los dominios similares a EGF localizados, por ejemplo, en aproximadamente los amino ácidos 63-90, 21 1 -243, y 261 -280 de la SEQ ID NO: 2 es probable que se involucren en señalización extracelular o guía celular. Un dominio CUB, un motivo KELCH, un dominio de reconocimiento de carbohidratos o Lectina eje tipo C, un motivo de enlace a ligando putativo de la cadena común de gama citosina y un dominio similar a EGF de Laminina localizado en aproximadamente los amino ácidos 93-208, 581 -612, 749-873, 670-686 y 1014-1055 de la SEQ ID NO: 2, respectivamente (ver Figura 3). Una región de transmembrana se presenta en aproximadamente los amino ácidos 1231 a 1251 y un dominio citoplásmico en aproximadamente los amino ácidos 1252 a 1379 de la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, la invención proporciona polinucleótidos que codifican estos fragmentos de polipéptido discretos, así como también los fragmentos polipéptidos que comprenden cada dominio por separado o en diversas combinaciones. La invención proporciona polinucleótidos que comprenden desde aproximadamente el nucleótido 1 -162, desde aproximadamente 1 -1 77, desde aproximadamente 1 -180 o desde aproximadamente 1 -522 de la SEQ ID NO: 1 , lo cual codifica los péptidos de señal que residen en aproximadamente los amino ácidos 1 -54, 1 -55, 1 -59, 1 -60 o 1 -173 de la SEQ ID NO: 2, desde aproximadamente nucleótidos 163-4137, desde aproximadamente 166-4137, desde aproximadamente 178-4137, desde aproximadamente 181 -4137 o desde aproximadamente 523-4137 de la SEQ ID NO: 1 , que codifican polipéptidos HAM maduros que comprenden, respectivamente, amino ácidos 55-1379, 56-1379, 60-1379, 61 -1379 o 174-1379 de la SEQ ID NO: 2; nucleótidos 3691 -3753 de la SEQ ID NO: 1 , codificando una región de transmembrana que comprende amino ácidos 1231 -1251 de la SEQ ID NO: 2; nucleótidos 163-3690, 166-3690, 178- 3690, 181 -3690 o 523-3690 de la SEQ ID NO: 1 , codificando dominios extracelulares del polipéptido HAM que comprenden amino ácidos 55-1 230, 56-1 230, 60-1230, 61 -1230 o 1 74-1230, respectivamente, de la SEQ ID NO: 2; y nucleotidos 3754-4137 de la SEQ ID NO: 1 , codificando un dominio citoplásmico que comprende amino ácidos 1252-1 379 de la SEQ ID NO: 2. Además, la invención proporciona polinucleótidos que comprenden desde aproximadamente nucleotidos 1 -177 de la SEQ ID NO: 18, que codifican el péptido de señal que reside en aproximadamente los amino ácidos 1 -59 de la SEQ ID NO: 19; desde aproximadamente los nucleotidos 1 78-4128 de la SEQ ID NO: 18, que codifican un polipéptido HAM murino, maduro que comprende amino ácidos 60-1376 de la SEQ ID NO: 1 9; y desde aproximadamente los nucleotidos 178-3681 de la SEQ ID NO: 1 8, codificando un dominio extracelular de un polipéptido HAM murino que comprende amino ácidos 60-1227 de la SEQ ID NO: 1 9. Los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse en el desarrollo de tratamientos para cualquier desorden mediado (directa o indirectamente) por cantidades insuficientes, defectuosas de los genes correspondientes a los polinucleótidos de la invención. La exposición en la presente de las secuencias correspondientes a los polinucleótidos de la invención permite la detección de genes defectuosos y el reemplazo de los mismos con genes normales. Los genes defectuosos pueden detectarse en ensayos de diagnóstico in vitro y mediante comparación de las secuencias polinucleótidas expuestas en la presente con la de un gen derivado de un sujeto sospechoso de alojar un defecto en los genes.

La expresión, aislamiento y purificación de los polipéptidos y fragmentos de la invención pueden llevarse a cabo mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo la utilización de sistemas de expresión tales como aquellos conocidos en la materia así como también aquellos descritos en la presente. En una modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido HA de la invención. El polinucleótido de la invención (por ejemplo, un polinucleótido que comprenden una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 18) puede insertarse de manera operable en, por ejemplo, un vector de expresión comercialmente disponible mediante técnicas recombinantes conocidas en la materia. Típicamente, el polinucleótido se insertará corriente abajo (o 3') y se enlazará de manera operable a un control o secuencia reguladora. Según se utiliza en la presente, una "secuencia de control" o "secuencia reguladora" se utilizan de manera intercambiable para incluir un promotor, combinación de mejorador-promotor, u otra secuencia que efectúa las expresión o transcripción de la secuencia polinucleótida corriente abajo. Un promotor es un elemento regulador transcripcional compuesto de una región de una molécula de ADN típicamente dentro de 100 pares nucleotidos en frente de (corriente arriba) el punto en el cual se inicia la transcripción. Otro elemento regulador transcripcional es un mejorador, que proporciona especificidad en términos de tiempo, ubicación y nivel de expresión. A diferencia de un promotor, un mejorador puede funcionar cuando se localiza en distancias variables del sitio de transcripción, siempre y cuando se presente un promotor. Un mejorador también puede localizarse corriente abajo del sitio de inicio de transcripción . Otras secuencias reguladoras incluyen secuencia de término de transcripción, sitios de entrada de ribosoma internos (IRES) y lo similar. Típicamente, para conducir una secuencia codificadora bajo control de un promotor, es necesario colocar el sitio de inicio de transcripción de la estructura de lectura transcripcional del péptido o polipéptido entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos corriente abajo (3') del promotor. Tale elemento regulador incluye, pero sin limitarse, el gen inmediatamente anterior citomegalovirus hCMV, los promotores anteriores o posteriores del adenovirus SV40, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el operador principal y las regiones promotoras de fago A, las regiones de control de la proteína cubierta de fd, el promotor para quinasa de 3-fosfoglicerato, los promotores de fosfatasa ácida y los promotores de los factores de a-acoplamiento a levadura, por nombrar unos cuantos. Los vectores de expresión y métodos para su construcción se conocen por aquellos expertos en la materia (Ausubel et al. citados en la presente). Los Vectores adecuados incluyen plásmidas y vectores virales tales como virus de herpes, retrovirus, virus de aves canarias, adenovirus y virus adeno-asociados, entre otros y derivados de los mismos. Un polinuc.leótido y las secuencias reguladoras se "enlazan de manera operable" cuando se conectan de tal manera que se permite la expresión cuando la secuencia codificadora (por ejemplo, la secuencia codificadora HAM) del polinucleótido se enlaza, a las secuencias reguladoras, por ejemplo, dentro de un vector de expresión. Un origen de reproducción que otorga la habilidad de reproducirse en las células huésped deseadas, y un gen de selección (por ejemplo, kanr, ampr) mediante el cual se identifiquen los transformadores, se incorporan generalmente en el vector de expresión. Los vectores de expresión que comprenden un polinucleótido de la invención pueden utilizarse para preparar los polipéptidos o fragmentos de la invención codificados por el polinucleótido. Un método para la producción de polipéptidos comprende el cultivo de células huésped transformadas o transfectadas con un vector de expresión recombinante que codifica el polipéptido, bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido, recuperando después los polipéptidos expresados a partir de las células o del medio del cultivo en el cual se desarrolla la célula huésped. El procedimiento para purificar los polipéptidos expresados váriará de acuerdo con el tipo de células huésped empleadas y si el polipéptido se enlaza a membrana o es una forma soluble segregada del polipéptido. Además, una secuencia que codifica un péptido de señal adecuado (nativo o heterólogo) puede incorporarse en los vectores de expresión. Una secuencia de ADN para un péptido de señal puede fusionarse en una estructura a una secuencia polinucleótida de la invención a fin de que el polinucleótido se transcriba inicialmente y el mARN trasladado en una proteína de fusión que comprende el péptido de señal. Los péptidos de señal pueden emplearse para dirigir proteínas de transmembrana a la superficie celular o pueden utilizarse diferentes péptidos de señal que promuevan la secreción de una forma soluble de la proteína. En general, el péptido de señal se disocia durante la maduración de la proteína. Un polinucleótido que codifica una secuencia de ubicación, o secuencia de señal, puede liggrse o fusionarse en el término 5' de un polinucleótido que codifica un polipéptido HA de tal manera que el péptido de señal se localice en el extremo terminal amino de la fusión resultante de polinucleótido/polipéptido. En eucariotes, el péptido de señal funciona para transportar el polipéptido de fusión a través del retículo endoplásmico. La proteína secretora se transporta entonces a través del aparato de Golgi hacia vesículas secretoras y hacia el espacio extracelular o, preferentemente, el ambiente externo. Los péptidos de señal, que pueden utilizarse de acuerdo a la invención, incluyen pre-pro péptidos, que contienen un sitio de reconocimiento de enzima proteolítica. La secuencia de ubicación puede ser una secuencia de ubicación nuclear, una secuencia de ubicación de retículo endoplásmico, una secuencia de ubicación de peroxisoma, una secuencia de ubicación mitocondrial, o una proteína localizada. Las secuencias de ubicación pueden ser secuencias de dirección que se describen, por ejemplo, en "Direccionamiento de Proteínas", capítulo 35 de Stryer, L. Biochemistry (4th ed.), W. H. Freeman, 1995. Algunas secuencias de ubicación importantes incluyan aquellas que dirigen los núcleos (por ejemplo, KKKRK (SEQ ID NO: 13)), la mitocondria 8MLRTSSLFTRRVQPSLFRNILRLQST (SEQ ID NO: 14)), retículo endoplásmico (KDEL (SEQ ID NO: 15)), peroxisoma (SKF), prenilación o inserción en membrana de plasma (CAAX (SEQ ID NO: 16), CC, CXC o CCXX (SEQ ID NO: 17)), lado citoplásmico de membrana de plasma (fusión a SNAP-25) o el aparato de Golgi (fusión a furina). Otros ejemplos de péptidos de señal heterólogos que son funcionales en células huésped mamíferas incluyen la secuencia de señal para interleukin-7 (I L-7) descrito en la Patente de E. U. 4,965, 1 95; la secuencia de señal para el receptor de interIeukin-2 descrito en Cosman et a/. , Nature 312: 768 (1984); el péptido de señal receptor1 de interleukin-4 descrito en EP 367,566; el péptido de señal receptor de interleukin-1 tipo I descrito en la Patente de E. U . 4,968,607; y el péptido de señal receptor de interleukin-1 tipo II descrito en EP 460,846. El técnico experto también reconocerá que la(s) posición(es) en la(s) cual(es) se disocia el péptido de señal puede(n) diferir de lo predicho por el programa de computadora y puede(n) variar de acuerdo a tales factores como el tipo de células huésped empleadas en la expresión de un polipéptido recombinante. Una preparación de proteína puede incluir una mezcla de moléculas de proteína que tienen diferentes amino ácidos de terminal N, que resultan de la disociación del péptido de señal en más de un sitio. Las modalidades particulares de polipéptidos HA maduros proporcionados en la presente, que tienen una secuencia de señal nativa, incluyen, pero sin limitarse, polipéptidos en donde el amino ácido de término N es cualquier amino ácido entre 55 y 61 de la SEQ ID NO: 2. Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos incluyen procariotes (por ejemplo, E. coli), levadura, células de planta, y células eucarióticas de insectos o mayores. Más típicamente, se utilizan las células mamíferas o de levadura. Los vectores de expresión y clonación adecuados para utilizarse con bacterias, hongos, levadura y huéspedes celulares mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels et al. , Vectores de Clonación: Manual de Laboratorio, Elsevier, Nueva York, (1985). Los sistemas de traslación libres de células también podrían emplearse para producir polipéptidós mediante el uso de ARNs derivados de construcciones de ADN expuestas en la presente. Las células huésped procarióticas adecuadas para transformación pueden ser gram-negativas o gram-positivas e incluyen, por ejemplo, E.coli, Bacillus subtilis, Sálmonella typhimurium, y otras diversas especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula huésped procariótica, tal como E.coli, un polipéptido puede incluir un residuo de metionina (met) de terminal N para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariótica. La Met de terminal N puede disociarse del polipéptido recombinante expresado. Los vectores de expresión para utilizarse en células huésped procarióticas generalmente comprenden uno o más genes marcadores seleccionables, fenotlpicos, que pueden incluir, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que otorga resistencia antibiótica o que suministra un requisito autotrófico. Los vectores de expresión procarióticos útiles incluyen aquellos derivados de plásmidas comercialmente disponibles, tales como el vector de clonación pBR322 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, Wl, EUA). Un promotor adecuado y una secuencia polinucleótida que codifica el polipéptido deseado pueden insertarse en el vector. Las secuencias promotoras comúnmente utilizadas para vectores de expresión de célula huésped procariótica recombinantes, incluyen ß-lactamasa (penicilinasa), sistema promotor de lactosa (Chang eí al. , Nature 275: 615, 1978; y Goeddel eí al. , Nature 281 : 544, 1 979), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel eí al. , Nucí. Acids Res. 8: 4057, 1980) y promotor tac (Maniatis eí al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, primera ed., Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Un sistema de expresión de célulq huésped procariótica particularmente útil emplea un promotor fago ?PL· y una secuencia represora termolábil cl857ts. Los vectores plásmidos disponibles en American Type Culture Collection que incorporan derivados del promotor ???_ incluyen la plásmida pHUB2 (residente en la cepa JMB9 de E.coli, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E. coli RR1 , ATCC 53082). De manera alternativa, los polipéptidos pueden expresarse en células huésped de levadura, tal como a partir de genes de Saccharomyces (por ejemplo, S.cerevisiae). De manera alternativa, pueden emplearse Pichia, Kluyveromyces u otros géneros de levadura. Los vectores de levadura con frecuencia contendrán un origen de reproducción de secuencia desde una plásmida de levadura 2mu, una secuencia de reproducción autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas incluyen aquellas derivadas de los genes de quinasa de 3-fosfogIicerato o metalotioneína de levadura (Hitzeman et al. , J. Biol. Chem. 255: 2073, 1989) u otros genes que codifican enzimas glicolíticas (Hess eí al. , J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; y Holland eí al. , Biochem. 17: 4900, 1 978), tal como enolasa, deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato, hexoquinasa, decarboxilasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, isomerasa de fosfo-glucosa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para utilizarse en expresión de levadura se conocen en la materia (por ejemplo, ver en Hitzeman, EPA-73,657; Russell et al. , J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982; y Beier et al. , Nature 300:724, 1982). La secuencia guía de factor de levadura puede emplearse para dirigir la secreción del polipéptido y con frecuencia se inserta entre la secuencia promotora y la secuencia genética estructural (por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982 y Bitter et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 : 5330, 1984). Los protocolos de transformación de levadura se conocen por aquellos expertos en la materia, incluyendo un protocolo que involucra la selección de transformantes Trp+ en un medio que contiene base de nitrógeno de levadura , casamino ácidos, glucosa, 10 mg/ml de adenina y 20 mg/ml de uracilo (ver, por ejemplo, Hinnen et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 12929, 1 978). En otros protocolos, las células de levadura transformadas por vectores que contienen una secuencia promotora de ADH2 pueden desarrollarse en un medio "rico". Un ejemplo de un medio rico es uno que consiste en 1 % de extracto de levadura, 2% de peptona y 1 % de glucosa complementado con 80 mg/ml de adenina y 80 mg/ml de uracilo. La no represión del promotor de ADH2 ocurre cuando la glucosa se agota del medio. También pueden emplearse los cultivos celulares huéspedes de mamífero o insecto para expresar polipéptidos recombinantes, tal como los sistemas de baculovirus revisados por Luckow y Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988). Las líneas celulares establecidas de origen mamífero también pueden emplearse. Los ejemplos de líneas celulares huéspedes mamíferas incluyen la línea COS-7 de células de riñon de mono (ATCC CRL 1651 ) (Gluzman eí al. , Cell 23: 175, 1981 ), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células de HeLa, y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular de CV1 /EBNA derivada de la línea celular de riñon de mono verde Africano CV1 (ATCC CCL 70) según se describe por McMahan ef al. (E BO J . 10. 2821 , 1 991 ). Los métodos establecidos para la introducción de polinucleótidos en células mamíferas se han descrito (Kaufman, R. J . , Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69). Los protocolos adicionales que utilizan reactivos comercialmente disponibles, tales como reactivo lípido de Lipofectamina (Gibco/BRL) o reactivo lípido de Lipofectamina-Plus, pueden utilizarse para transfectar células (Felgner eí al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 741 3-7417, 1987). Además, la electroporación puede utilizarse para transfectar células mamíferas mediante el uso de procedimientos convencionales, tales como aquellos en Sambrook eí al., 1989. La selección de transformantes estables puede llevarse a cabo mediante el uso de métodos conocidos en la materia, tal como, por ejemplo, resistencia fármacos citotóxicos. Kaufman ef al. , Meth in Enzymology 185: 487-51 1 , 1 990, describe varios esquemas de selección, tal como resistencia a reductasa de dihidrofolato (DHFR). Una cepa huésped adecuada para la selección de DHFR es la cepa CHO DX-B1 1 , la cual es deficiente es DHFR (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1 980). Una plásmida que expresa el cADN de DHFR puede introducirse en la cepa DX-B1 1 y solamente las células que contienen la plásmida pueden crecer en el medio selectivo apropiado. Otros ejemplos de marcadores seleccionares incluyen genes que otorgan resistencia a antibióticos, tal como G41 8 e higromicina B, lo cual permite la selección de células que alojan el vector sobre la base de resistencia a estos agentes. Las secuencias de control transcripcional y traslacional para vectores de expresión de célula huésped mamífera pueden extirparse de genomas virales. Las secuencias promotoras comúnmente utilizadas y las secuencias mejoradoras se derivan de virus de polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias polinucleótidas derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor anterior y posterior, mejorador, divisor y sitios de poliadenilación, pueden utilizarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia genética estructural en una célula huésped mamífera. Los promotores virales anteriores y posteriores son particularmente útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente de un genoma viral como un fragmento, el cual también puede contener un origen viral de reproducción (Fiers et al. , Nature 273: 1 13, 1978; Kaufman, Meth. In Enzymology, 1990). También pueden utilizarse fragmentos SV40 menores o mayores, tomando en cuenta que se incluye la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el origen viral SV40 del sitio de reproducción . Las secuencias de control adicional demostraron mejorar la expresión de genes heterólogos de vectores de expresión mamíferos que incluyen tales elementos como el elemento de secuencia de aumento de expresión (EASE) derivado de células CHO (Morris eí al. , Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534 y Solicitud de PCT WO 97/25420 y la guía tripartita (TPL) y ARNs de gen VA de Adenovirus 2 (Gingeras eí al. , J. Biol. Chem. 257: 13475-13491 , 1982). Las secuencias del sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) de origen viral permiten que los mARNs dicistrónicos se trasladen de manera eficiente (Oh y Sarnow, Current Opinión in Genetics and Development 3: 295-300, 1993; Armes eí al. , Nucleic Acids Research 24: 2697-2700, 1 996). La expresión de un cADN heteró(ogo como parte de un mARN dicistrónico seguido por el gen para un marcador seleccionable (por ejemplo, DHFR) ha demostrado mejorar la transfectabilidad del huésped y la expresión de los polinucleótidos heterólogos Kaufman, Meth. In Enzymology, 1 990). Los vectores de expresión ejemplificativos que emplean mARNs dicistrónicos son pTR-DC/GFP descritos por Mosser eí al. , Biotechniques 22: 1 50-161 , 1 997 y p2A5l descrito por Morris eí al. , Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534. Un vector de expresión elevada útil, pCAVNOT se ha descrito por Mosley eí al. , Cell 59: 335-348, 1989. Otros vectores de expresión para utilizarse en células huésped mamíferas pueden construirse como se expone por Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Un sistema útil para la expresión estable de alto nivel de cADNs mamíferos en células epiteliales mamarias murinas C127 puede construirse substancialmente como se describe por Cosman et a/., (Mol. Immunol. 23: 935, 1986). Un vector de expresión elevada útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312: 768, 1984, se ha depositado como ATCC 39890. Los vectores de expresión mamífera útiles, adicionales, se describen en EP-A-0367566 y en WO 91 /1 8982, incorporadas en la presente para referencia. En todavía otra alternativa, los vectores pueden derivarse de retrovirus. Los vectores de expresión útiles adicionales, pFLAG® y pDC31 1 también pueden utilizarse. La tecnología FLAG® se centra en la fusión de un péptido marcador FLAG®, hidrofílico, de bajo peso molecular (1 kD), hacia el término N de una proteína recombinante expresada por los vectores de expresión pFLAG®. pDC31 1 es otro vector especializado que se utiliza para expresar proteínas en células CHO. pDC31 1 se caracteriza por una secuencia bicistrónica que contiene el gen de interés y un gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) con un sitio de enlace a ribosoma interno para traslación de DHFR, un elemento de secuencia de aumento de expresión (EASE), el promotor de CMV humano, una secuencia guía tripartita y un sitio de poliadenilación. Otros fragmentos útiles de los polinucleótidos expuestos incluyen oligonucleótidos de antidetección o detección que comprenden una secuencia polinucleótida de un solo filamento (ya sea ARN o ADN) capaz de enlazarse a secuencias objetivo de mARN (detección) o ADN (antidetección). Los oligonucleótidos de antidetección o de detección, de acuerdo a la presente invención, comprenden fragmentos del polinucleótido que tienen una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 18. Tal fragmento generalmente comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. La habilidad para derivar un oligonucleótido de antidetección o de detección, en base a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén (Cáncer Res. 48: 2659, 1988) y van der Krol ef al. (BioTechniques 6:958, 1988). El enlace de oligonucleótidos de antideteccióri o de detección a ácidos nucleicos objetivo da como resultado la formación de dobletes que bloquean o inhiben la expresión de proteínas mediante uno de varios medios, incluyendo degradación mejorada del mARN mediante ARNasa H, inhibición de división, término prematuro de transcripción o traslación o mediante otros medios. Los oligonucleótidos de antidetección pueden utilizarse así para bloquear la expresión de proteínas. Los oligonucleótidos de antidetección o de detección comprenden además oligonucleótidos que tienen estructuras modificadas de azúcar-fosfodiéster (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91 /06629) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen especificidad de secuencia para ser capaces de enlazarse a ácidos nucleicos objetivo. Otros ejemplos de oligonucleótidos de detección o antidetección incluyen aquellos oligonucleótidos que se enlazan de manera covalente a elementos orgánicos, tales como aquellos descritos en WO 90/10448, y otros elementos que incrementan la afinidad del oligonucleótido hacia un ácido nucleico objetivo, tal como poli-(L)-lisina. Además, los agentes intercalantes, tales como elipticina y los agentes de alquilación o complejos de metal pueden anexarse a oligonucleótidos de detección o antidetección a fin de modificar especificidades de enlace del oligonucleótido de antidetección o de detección para la secuencia nucleótida objetivo. Los oligonucleótidos de antidetección o de detección pueden introducirse en una célula que contiene el ácido nucleico objetivo mediante cualquier método de transferencia genética, incluyendo, por ejemplo, lipofección, transfección de cADN mediada por CaP04, electroporación, o mediante el uso de vectores de transferencia genética tales como virus Epstein-Barr o adenovirus. Los oligonucleótidos de detección o antidetección también pueden introducirse en una célula que contiene el ácido nucleico objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula de enlace a ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de enlace a ligando adecuadas incluyen, pero sin limitarse, receptores de superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas u otros ligandos que se enlazan a receptores de superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de enlace a ligando no interfiere substancialmente con la habilidad de la molécula de enlace a ligando para enlazarse a su molécula o recéptor correspondiente, ni bloquea la entrada del oligonucleótido de detección y antidetección ni su versión conjugada en la célula.

De manera alternativa, un oligonucleótido de detección o antidetección puede introducirse en una célula que contiene el ácido nucleico objetivo mediante la formación de un complejo lípido-oligonucleótido, como se describe en WO 90/10448. El complejo oligonucleótido-lípido de detección o antidétección se disocia preferentemente dentro de la célula por una lipasa endógena. Los polinucleotidos de la invención permiten la construcción de vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden un polinucleótido que codifica µ? polipéptido HAM de la invención o fragmento del mismos; las células huésped transfectadas o transformadas con los vectores; los métodos para la producción y purificación de poiipéptidos biológicamente activos y fragmentos bioactivos de los mismos; el uso de polinucleotidos u oligonucleótidos de los mismos como sondas para identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas de familia de atractina o caoba relacionados; el uso de los polinucleotidos u oligonucleótidos de los mismos para correlacionar la ubicación de los genes que codifican poiipéptidos HAM de la invención con regiones de cromosoma a fin de identificar genes asociados con tumores, desórdenes inmunes, síndromes u otras condiciones humanas; la administración de las proteínas expuestas o fragmentos de las mismas para el tratamiento de desórdenes caracterizados por una mutación en un gen que codifica un polipéptido HAM o mediante un exceso o una deficiencia de un polipéptido HAM; y el uso de oligonucleótidos de detección o antidetección de un solo filamento para inhibir la expresión de polinucleotidos que codifican un polipéptido HAM. Además, la invención proporciona el uso de los poiipéptidos expuestos y fragmentos solubles de los mismos como inhibidores competitivos del enlace de polipéptidos HAM nativos a sus ligandos, cognados o socios de enlace de contra-estructura; el uso de polipéptidos HAM y fragmentos de los mismos como marcadores de peso molecular únicos o como controles de fragmentación péptida así como también equipos que comprenden estos reactivos; el uso de polipéptidos HAM y fragmentos de los mismos para generar anticuerpos; y el uso de tales anticuerpos para purificar polipéptidos HAM; como reactivos de afinidad para la separación de células hematopoiéticas que expresan las proteínas, así como también el uso de anticuerpos en la modulación de la actividad biológica del polipéptido HAM. Para el tratamiento de humanos, típicamente se utilizan los polipéptidos HAM humanos, fragmentos y polinucleótidos que codifican lo anterior. Ensayos de Actividad Los polipéptidos purificados de la invención (incluyendo proteínas, polipéptidos, fragmentos, variantes, oligómeros y otras formas) pueden examinarse respecto a su habilidad para enlazarse a un socio de enlace HAM. Tales actividades pueden medirse en cualquier ensayo adecuado, tal como un enlace convencional o ensayo enzimático. Para ilustrar, en un ensayo de enlace típico el polipéptido puede etiquetarse con un reactivo detectable (por ejemplo, un radionúclido, cromóforo, enzima que cataliza una reacción colorimétrica o fluorométrica y lo similar), y después contactarse con células que expresan un socio de enlace HAM sobre su superficie. Las células se enjuagan para retirar el polipéptido etiquetado no enlazado y la presencia de una etiqueta enlazada a célula se determina por una técnica adecuada. Por ejemplo, un vector de expresión recombinante se construye conteniendo un polinucleótido que codifica un polipéptido HAM (o fragmento bioactivo del mismo) fusionado a una región Fe de acuerdo con métodos muy conocidos en la materia. Después de la expresión el polinucleótido codifica, por ejemplo, un polipéptido HAM soluble que comprende las porciones extracelulares del polipéptido HAM, o el dominio éxtracelular y un dominio citoplásmico con la región de transmembrana retirada. Por ejemplo, las células huéspedes se transfectan con el vector de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de la invención. Después del cultivo de las células transfectadas, el medio de cultivo que contiene un HAM u otro polipéptido soluble de la invención se recolecta de las células transfectadas y la cantidad del polipéptido se cuantifican mediante el uso de métodos estándares. Las células que expresan el socio de enlace a HAM sé cultivan y enjuagan con BM-NFDM, que es el medio de enlace (RPMI 1640 que contiene 25 mg/ml de albúmina de suero bovino, 2 mg/ml de azida de sodio, 20 mM Hepes pH 7.2, al cual se han agregado 50 mg/ml de lecha seca no grasa. Las células se incuban entonces con diversas concentraciones de, por ejemplo, una proteína de fusión Fc/polipéptido soluble hecha como se establece arriba. Las células se enjuagan e incuban con una concentración de saturación constante de un IgG antihumano de 125l-ratón en medio de enlace, con agitación suave durante 1 hora a 37°C. Después de enjuague extenso, las células se liberan a través de tripsinización.

El IgG anti-humano de ratón empleado arriba se dirige contra la región Fe de IgG humano y puede obtenerse de Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. El anticuerpo se radioyodura mediante el uso del método estándar de cloramina-T. El anticuerpo se enlazará a la porción Fe de cualquier polipéptido/proteína Fe que se ha enlazado a las células. En todos los ensayos, el enlace no específico de 25l-anticuerpo se ensaya en ausencia de la proteína de fusión Fc/Fc, así como también en presencia de la proteína de fusión Fe y un exceso molar de 200 veces el anticuerpo IgG anti-humano de ratón no etiquetado. El 125l-anticuerpo de enlace a célula se cuantifica en un contador Autogama Packard. Los cálculos de afinidad (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51 : 660, 1949) se generan en RS/1 (BBN Software, Boston, MA) que se ejecuta en una computadora Microvax. Para ilustrar, el substrato puede etiquetarse con un reactivo detectable (por ejemplo, un radionúclido, cromóforo y lo similar) y después se contacta con células o una muestra que contiene un polipéptido HAM o fragmento del mismo. El substrato etiquetado se enlaza típicamente a una placa de microtítulo o lo similar. Después de la incubación de los dos componentes la placa se enjuaga y la cantidad de etiqueta aún presente en la placa se cuantifica en comparación con una placa de control. Una reducción en la etiqueta en la placa es indicativa de actividad enzimática. Otro tipo de ensayo de enlace adecuado es un ensayo de enlace competitivo. Para ilustrar, la actividad biológica de una variante puede determinarse mediante ensayo de la habilidad de la variante para competir con las proteínas nativas en el enlace a su socio de enlace. Los ensayos de enlace competitivos pueden llevarse a cabo mediante metodología convencional. Los reactivos que pueden emplearse en ensayos de enlace competitivos incluyen un polipéptido HAM soluble rádioetiquetado o células intactas que expresan un polipéptido HAM (endógeno o recombinante) en la superficie celular. Por ejemplo, un fragmento bioactivo rádioetiquetado de un polipéptido HAM puede utilizarse para competir con una variante soluble para enlace a un socio de enlace de superficie celular. En lugar de células intactas, uno podría sustituir un fragmento bioactivo de un polipéptido HAM/proteína de fusión Fe enlazado a una fase sólida a través de la interacción de Proteína A o Proteína G (en la fase sólida) con el elemento Fe. Las columnas de cromatografía que contienen Proteína A y proteína G incluyen aquellas disponibles en Pharmacia Biotech, Inc. , Piscataway, NJ. Otro tipo de ensayo de enlace competitivo utiliza un fragmento bioactivo soluble, rádioetiquetado, de un péptido HAM, tal como un fragmento bioactivo soluble/proteína de fusión Fe y células intactas que expresan socios de enlace HAM. Los resultados cualitativos pueden obtenerse mediante ensayos de enlace de placa autoradiográfica competitivos, aunque pueden utilizarse gráficas Scatchard (Scatchard, Ann., N.Y. Acad. Sci 51 : 660, 1949) para generar resultados cuantitativos. Ensayos de Diagnóstico Los polinucleótidos y polipéptidos proporcionados en la presente son útiles como reactivos de diagnóstico en ensayos para detectar malfuncionamiento o genes HAM mutantes. Las muestras para diagnóstico pueden obtenerse de tejidos de un sujeto, por ejemplo, exudado de garganta, sangre, suero, orina, saliva, fluido cerebroespinal, heces, biopsia de tejido y así sucesivamente. Las muestras similares se toman de individuos normales (de personas que no sufren del desorden o mutación en cuestión) y estas muestras normales o estándares proporcionan una base de comparación. De manera alternativa, los reactivos purificados (por ejemplo, polinucleótidos HAM, polipéptidos y anticuerpos) pueden utilizarse como estándares para ensayos de diagnóstico. En algunas modalidades, los fragmentos de los polinucleótidos de la invención se utilizan como sondas para manchados Northern o Southern o como cargas de inicio de PCR para detectar formas mutadas de un polipéptido HAM codificado por el ácido nucleico objetivo. Las condiciones que pueden diagnosticarse incluyen aquellas caracterizadas por un exceso o deficiencia de un polipéptido HAM o que se caracterizan por una forma mutada de tal polipéptido. Tales condiciones incluyen, pero sin limitarse, la ausencia del polipéptido en una célula que requiere su expresión, actividad enzimática alterada, habilidad de señalización alterada, sobre-expresión o sub-expresión en una célula que bajo condiciones normales tiene tal actividad. Las condiciones particulares que pueden diagnosticarse mediante el uso de estos ensayos incluyen, pero sin limitarse: enfermedades reumatológicas (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis psoriática, espondiloartropatías seronegativas), condiciones inflamatorias, transplante de médula ósea u órgano sólido, enfermedad de injerto-contra-huésped, alergias (por ejemplo, asma, rinitis alérgica), desórdenes neurológicos (por ejemplo, Alzheimer, Parkinson, demencia, cáncer cerebral, parálisis de Bell, neuralgia post-herpética), desórdenes proliferativos celulares que incluyen neoplasmas o cáncer (por ejemplo, linfoma, célula B, célula T y leucemias celulares mieloides), infecciones (por ejemplo, bacteriana, parasítica, protozoaria e infecciones virales, incluyendo SIDA), toxicidad inducida por radiación o quimioterapia, caquexia, desórdenes cardiovasculares (por ejemplo, falla cardiaca congestiva, infarto al miocardio, daño por isquemia/reperfusión, arteritis, choque), desórdenes gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del bazo, enfermedad de Crohn, enfermedad celiaca), diabetes melitus, enfermedades de la piel (por ejemplo , psoriasis, escleroderma , dermatomiositis), desórdenes hematológicos (por ejemplo, síndromes mielodisplásicos, anemia aplástica de Fanconi o adquirida), choque séptico, enfermedades del hígado (por ejemplo, hepatitis viral o asociada al alcohol), desórdenes óseos (por ejemplo, osteoporosis, osteopetrosis). En algunas modalidades de la invención, la condición por diagnosticarse en un desorden hematoíógico y la muestra de tejido es sangre Q una biopsia de nodo linfático.

Selección de Moduladores de Polipéptidos HAM y polinucleotidos Los polipéptidos HAM y polinucleotidos expuestos en la presente encuentran uso en la selección de ensayos para identificar agentes que modulan la expresión o actividad de los polinucleotidos o polipéptidos de la invención, respectivamente. Una vez identificados, los agentes que modulan la expresión o actividad de polinucleótidos HAM y polipéptidos, pueden administrarse por ejemplo para suprimir la expresión de HAM en condiciones caracterizadas por la sobreproducción de HAM u otras proteínas relacionadas con atractina o caoba, de manera similar, los agentes que estimulan la actividad biológica o expresión de un polipéptido HAM en células cultivadas o en sujetos pueden administrarse para estimular la actividad o expresión donde una condición de caracteriza por una deficiencia del activador endógeno normal de HAM. Los métodos para identificar un agente que modula la actividad o expresión de un polipéptido HAM pueden llevarse a cabo mediante el uso de las enseñanzas proporcionadas en la presente. Por ejemplo, para identificar un agente que modula la actividad del polipéptido HAM, un agente de prueba se contacta con una muestra que contiene un polipéptido HAM de la invención. La muestra se ensaya entonces para medir la actividad HAM y la actividad HAM en presencia del agente de prueba se compara con la actividad presente en una muestra estándar (es decir, un control) que no tiene el agente presente. Una muestra puede ser, por ejemplo, una muestra libre de células, una muestra que contiene células (por ejemplo, un cultivo celular), o una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de tejido obtenida o derivada de un sujeto). Una muestra estándar incluye, por ejemplo, la muestra anterior al contacto con el agente de prueba o una muestra que representa actividad normal. La actividad puede medirse mediante el uso de cualquiera de los métodos de ensayo identificados en la presente (por ejemplo, ensayos de enlace competitivos, ensayos enzimáticos y lo similar). Un cambio de actividad en comparación con una muestra de control o estándar es indicativo de un agente que modula la actividad (por ejemplo, la incrementa o disminuye). De manera similar, la invención proporciona un método para la identificación de un agente que modula la expresión de un poiipéptido HAM. Tales métodos incluyen, por ejemplo, el contacto de una muestra que comprende un polinucleótido de la invención con un agente de prueba y la medición de la expresión del polinucleótido en comparación con una muestra estándar o de control. El nivel de expresión puede determinarse mediante métodos conocidos en la materia, incluyendo detección de proteína (por ejemplo, mediante Western Blot), o mediante detección de la cantidad de mARN transcrito (por ejem plo, por PCR). Como arriba, la muestra puede ser una muestra celular, una muestra de tejido y lo similar. Un cambio de expresión en comparación con una muestra de control o estándar es indicativo de un agente que modula la expresión (por ejemplo, la incrementa o disminuye). Un agente de prueba puede incluir, por ejemplo, una proteína, un péptido, un peptidomimético, un anticuerpo, una molécula pequeña o un polinucleótido (por ejemplo, uno de antidetección o ribozima). Un ejemplo de un agente de prueba es un ligando que se enlaza específicamente con un poiipéptido HAM u otras moléculas capaces de formar heterómeros funcionales con un poiipéptido HAM. Las células utilizadas para estos ensayos de selección pueden incluir, por ejemplo, células que expresan naturalmente un poiipéptido HAM, tal como células glial, células T, células mieloides y otras células hematoppiéticas o cualquier tipo celular conveniente que se ha transformado o transfectado con un ácido nucleico heterologo que dirige la expresión de un polipéptido HAM. En otros ensayos, las células que expresan un fragmento bioactivo de un polipéptido HAM (por ejemplo, una forma soluble) pueden cultivarse con la molécula de prueba para determinar si la molécula tiene la capacidad de modular la cantidad de fragmento bioactivo producido por las células. La cantidad de fragmento bioactivo producido puede medirse mediante cualquier método adecuado, incluyendo el ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), el manchado de sangre que emplea un anticuerpo que enlaza el fragmento bioactivo o un ensayo de enlace de fase sólida. Métodos de Terapia Esta invención proporciona compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento de un sujeto, preferentemente un sujeto mamífero y más preferentemente un sujeto humano, que sufre de un desorden médico y, en particular, un desorden mediado por HAM. Tales desórdenes mediados por HAM incluyen condiciones originadas (directa o indirectamente) o exacerbadas por enlace entre un polipéptido HAM y un socio de enlace. Para propósitos de esta exposición, los términos "enfermedad", "padecimiento", "condición médica", "condición anormal" y lo similar se utilizan de manera intercambiable con el término "desorden médico". Los términos "tratar", "tratamiento" y "en tratamiento" utilizados en la presente incluyen tratamiento curativo, preventivo (por ejemplo, profiláctico) y paliativo o de atenuación. Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención pueden administrarse de manera terapéutica a un sujeto mamífero (por ejemplo, bovino, equino, felino, canino, porcino, primates), preferentemente un sujeto humano, que tiene un desorden que involucra un gen o polipéptido HAM defectuoso, que incluye un exceso o una deficiencia de tal polipéptido, o expresión de una forma muíante nociva del polipéptido. Tales desórdenes incluyen condiciones originadas (directa o indirectamente) o exacerbadas por formas tales de los polipéptidos. Cuando la administración se hace a un sujeto humano, las moléculas son preferentemente en base a una secuencia HAM humana (por ejemplo, una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 2). Para estos métodos terapéuticos, pueden emplearse los agentes que modulan la actividad o expresión de un polipéptido o polinucleótido HAM, respectivamente. Tales agentes de modulación se identifican por selección, tal como mediante empleo de los métodos de selección expuestos en la presente. Los anticuerpos que se enlazan específicamente con el polipéptido HAM o su ligando pueden modular la actividad biológica del polipéptido HAM. Los desórdenes y enfermedades tratables mediante los métodos y composiciones de la invención incluyen, pero sin limitarse: desórdenes reumatológicos (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis psoriática, espondiloartropatías seronegativas), trasplante de médula ósea u órgano sólido, reacción de injerto-contra-huésped, condiciones inflamatorias, desórdenes autoinmunes (por ejemplo, lupus sistémico eritematoso, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Sjogren), alergias (por ejemplo, asma, rinitis alérgica), desórdenes neurológicos (por ejemplo, Alzheimer, Parkinson, clemencia, cáncer cerebral, parálisis de Bell, neuralgia post-herpética), cánceres (por ejemplo, linfoma, célula B, célula T y leucemias celulares mieloides), infecciones (por ejemplo, bacteriana, parasítica, protozoaria e infecciones virales, incluyendo SIDA), toxicidad inducida por quimioterapia o radiación, caquexia, desórdenes cardiovasculares (por ejemplo, falla cardiaca congestiva, infarto al miocardio, daño por isquémia/reperfusión, arteritis, choque), diabetes melitus, enfermedades de la piel (por ejemplo, psoriasis, escleroderma, dermatomiositis), desórdenes hematológicos (por ejemplo, síndromes mielodisplásticos, anemia aplástica de Fanconi d adquirida), choque séptico, enfermedades del hígado (por ejemplo, hepatitis viral o asociada al alcohol), desórdenes óseos (por ejemplo, osteoporosis, osteopetrosis) y desórdenes relacionadds con el peso o metabolismo de energía, incluyendo obesidad. Para el tratamiento de cualquiera de los desórdenes anteriores, el agente terapéutico puede administrarse en una cantidad eficaz para reducir mesurablemente una o más señales o síntomas del desorden a tratarse. Además, tales desórdenes pueden tratarse mediante administración in vivo o ex vivo de un vector o liposoma que suministra una forma no defectuosa del gen disfuncional al tipo celular en el cual se presenta la disfunción. Las composiciones terapéuticas pueden comprender un polipéptido HAM substanciaimente purificado en cualquier forma descrita en la presente, tal como un polipéptido nativo, una variante, un derivado, un oligómero y un fragmento bioactivo. La composición puede comprender un polipéptido soluble o un oligómero que comprende un polipéptido HAM soluble. En otra modalidad, una composición comprende un anticuerpo dirigido contra ai menos un epítope de polipéptido HAM. En aún otra modalidad, un agente terapéutico se anexa al anticuerpo y el anticuerpo se utiliza para dirigir el agente terapéutico hacia una célula que expresa un polipéptido HAM. También se prevén terapias de combinación, en las cuales otro agente farmacológicamente activo se co-administra con un agente terapéutico de la presente invención. Otros agentes adecuados para coadministración incluyen, pero sin limitarse, citocinas, linfocinas, quimiocinas, agentes de quimioterapia, anti-infiamatorios, DMARDs, agentes anti-angiogénicos (por ejemplo, anticuerpos de anti-VEGF) o cualquier otro compuesto eficaz en el tratamiento de la enfermedad o desorden objetivo. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además otros componentes tales como díluyente, vehículo o excipiente fisiológicamente aceptables y se formulan de acuerdo con métodos conocidos. Pueden combinarse en mezcla, ya sea como el material activo único o con otros materiales activos conocidos, adecuados para una indicación dada, con diluyentes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina, Tris-HCl, acetato, y soluciones reguladas con fosfato), preservativos (por ejemplo, timerosal, alcohol de benzilo, parabenos), emulsificantes, solubilizadores, adyuvantes y/o vehículos. Las formulaciones adecuadas para composiciones farmacéuticas incluyen aquellas descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. , 1 980, Mack Publishing Company, Easton , PA. Además, tales composiciones pueden acomplejarse con glicol de polietileno (PEG), iones de metal, o incorporarse en compuestos poliméricos tales como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, dextrano y lo similar, o incorporarse en liposomas, microemulsiones, micelos, vesículas unilamelares o multila melares, espíritus de eritrocito o esferoblastos. Tales composiciones influenciarán el estado físico, solubilidad, estabilidad , velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclarado in vivo y así se seleccionan de acuerdo a la aplicación propuesta. Las composiciones de la invención pueden administrarse en cualquier manera adecuada, por ejemplo, de manera oral, tópica, parenteral o mediante inhalación. El término "parenteral" incluye inyección , por ejemplo, mediante rutas subcutánea, intravenosa o intramuscular, incluyendo también la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o daño. La liberación prolongada de implantes también se contempla. Las dosis adecuadas variarán, dependiendo de factores tales como la naturaleza del desorden a tratarse, el pesó corporal del sujeto, la edad y la condición general y ruta de administración . Las dosis preliminares pueden determinarse de acuerdo a pruebas animales, y la escalación de las dosis para administración en humanos se lleva a cabo de acuerdo con las prácticas aceptadas en la materia. La dosis, ruta de administración, frecuencia de administración y duración de un régimen eficaz de tratamiento variarán dependiendo de factores tales como la condición particular a tratarse, la severidad de la • . ' · . 81 - condición, la edad, peso y salud del sujeto y lo similar, y pueden ajustarse de acuerdo con lo anterior por el médico del paciente. En un método de tratamiento, el agente activo es un polipéptido y se administra mediante inyección una a tres veces a la semana a una dosis que varía desde 0.1 -100 mg/kg o más preferentemente a una dosis de 0.4-50 mg/kg. El tratamiento se continúa hasta que se determina una mejora en la condición del sujeto, lo cual en la mayoría de los casos requerirá de al menos dos hasta ocho semanas o más de tratamiento. Las dosis de mantenimiento pueden administrarse posteriormente y el tratamiento puede retomarse si reapareciera evidencia de la enfermedad. Los regímenes adecuados de otras rutas de administración pueden determinarse de acuerdo a métodos conocidos en la materia. De manera similar, los regímenes adecuados para la administración de anticuerpos, moléculas pequeñas, reactivos de terapia genética o de antidetección, pueden determinarse de acuerdo con métodos conocidos en la materia. Se incluyen dentro del alcance de la invención las composiciones farmacológicamente aceptables que comprenden los agentes terapéuticos descritos, incluyendo composiciones adecuadas para administración por cada una de las rutas descritas. Tales composiciones se formulan de acuerdo con prácticas estándares. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar aún más las modalidades particulares de la invención y no deben considerarse como limitantes al alcance de la presente invención.

EJEMPLOS EJ EMPLO 1 Identificación, Clonación y Ordenamiento en Secuencia de HAM Se utilizaron microinstalaciones de cADN de células dendríticas (DC) de ratón para identificar genes novedosos relacionados con DC. Las instalaciones de nylon de alta densidad se prepararon a partir de inserciones de una biblioteca de cADN preparada a partir de DCs de ratón CD1 1 c+, que se aislaron de los bazos de ratones tratados con Flt3L/en reposo y tratados con Flt3L/estimulados con SEB. Estas instalaciones se hibridizaron entonces con cADNs de primer filamento, etiquetados, de subconjuntos de DC de ratón derivados bajo varias condiciones de estimulación. Los genes diferencialmente expresados se identificaron por señales de instalación diferencial. Los cambios en los patrones de señal se identificaron y las clonas correspondientes se ordenaron por secuencia y se analizaron. Una clona identificada que contenía una secuencia que se sobre-reguló en CD8+/CD1 1 b bajo (ver Tabla inmediatamente a continuación), DC in vivo, se identificó por una búsqueda BLAST por relacionarse de manera más cercana con la Atractina, una proteína de membrana de tipo I con múltiples funciones biológicas, incluyendo actividad inmunoreguladora (promoción de difusión macrófaga acóplada a adhesión celular T; expresión defectuosa en Inmunodeficiencia Variable Combinada), mielinación (gen mutante en la rata Zitter) y metabolismo (gen mutante en el ratón Mahogany). Una búsqueda BLAST mediante el uso de la secuencia obtenida de la clona DC también identificó el acceso a Gen Bank CAC12966, un ORF predicho de genoma humano (GenBank AL355530) que pareció ser ortólogo a la secuencia DC de ratón y homólogo al término N de la Atractina. Los análisis BLAST adicionales identificaron un EST de cADN cerebral humano (GenBank AB011106) que mostraron homología con el extremo 3' de la Atractina. Ambos CAC12966 y AB011106 se incorporan en la presente para referencia. Secuencia sobre-regulada en CDS+/CD11b bajo GGAGCCGGGGGTCCGGGCCCGCTCGGGTGCCCCGCAGCCGGCCTCCCCGGTGCTGTGGAG E P G V R A R S G A P Q P A S P V L W R GGCTCGGCCGGCGGGCGGTGGGGGCGCCTCCTCCTGGCTGCTGCTGGACGGGAACAGCTG A R P A G G G G A S S W L L L D G N S W GCTGCTGTGCTATGGCTTCCTCTACCTGGCGCTCTATGCTCAGGTGTCCCAGTCCAAGCC L L C Y G F L Y L A L Y A Q V S Q S P CTGCGAGAGGACTGGCTCCTGCTTCTCCGGTCGCTGTGTCAACTCCACCTGCCTGTGCGA C E R T G S C F S G R C V N S T C L C D CCCGGGCTGGGTTGGGGACCAGTGCCAGCACTGCCAGGGCAGGTTCAAGTTAACAGAACC P G W V G D Q C Q H C Q G R F K L T E P TTCTGGATATTTAACAGATGGACCAATTAACTATAAATATAAAACAAAGTGTACATGGCT S G Y L T D G P I N Y K Y K T K C T W 'L AATTGAAGGCTATCCAAATGCAGTGCTAAGGTTAAGATTCAATCATTTTGCTACAGAATG I E G Y P N A V L R L R F N H F A T E C CAGCTGGGATCATATGTATGTTTÁTGATGGAGATTCTATATACGCACCTTTAGTAGCTGT S W D H M Y V Y D G D S I Y A P L V A V ACTTAGTGGCTTGATCGTTCCTGAAGTGAGGGGTAACGAGACCGTGCCTGAGGTGGTCAC L S G L I V P E V R G N E T V P E V V T GACGTCTGGCTACGCGCTGCTCCAC I I I I I CAGCGATGCTGCATATAACCTAACTGGCTT T S G Y A L L H F F S D A A Y N L T G F CAACAI I I I I I ATTCGATCAATTCCTGTCCTAACAACTGCTCTGGTCATGAAAGTGC N I F Y S I N S C P N N C S G H E S Un cADN de longitud completa se amplificó en seis segmentos, utilizando cargas de inicio de PCR en base a secuencia AL355530 y AB011106. La biblioteca de cADN de ovario humano se utilizó como un modelo para el PCR. Las flechas sobrepuestas en la secuencia mostrada en la Figura 1 ilustran esa posición de las cargas de inicio para cada fragmento.

Fragmento Tamaño Filamento Cargas de Inicio A 494 bp Detección: 5'-GGGGAAGATGGAGACTGG Antidetección: 5'-GTACAGCTATTAAAG GTGCATATATTGAATCTCC B 952 bp Detección : 5 -TTAACAGAACCTTCTGGATATTTAACAGATGGC Antidetección: 5 -CTGAATGTCCCTCCACAGCATACTGCTG C 837 bp Detección : 5'-GTTCTTGGACATGGTCAGCAGTATGCTGTG Antidetección : 5'-TTGTATTGGCAGTACAGCTGGCACAATCTG D 897 bp Detección : 5'-GCTGCTTCTGATGACAGATGTTACAGATATGC Antidetección : 5 -CACATCCAGGCTGTTCCAAACACTGTCCAC E 855 bp Detección : 5'-CCATATGGACAATGTCTAGAGTGGCAAACTGC Antidetección : 5'-GCTGACGTACACATAGAACGTAATGTTAGGATTGC F 650 bp Detección : 5'-CAATATCTGGGGAAGAGACTTCTATAGTTTCCAAG Antidetección : 5'-GGTTTCCATTTCTCAGACACAAGTTCCTTGACGTGT Varios fragmentos de PCR de cada amplificación se ligaron en un vector de clonación para ordenamiento por secuencia. El ordenamiento por secuencia se condujo mediante el uso de metodología estándar.

EJEMPLO 2 Análisis de Secuencia La estructura de lectura abierta (ORF) de HAM humano (SEQ ID NO: 1 ) se predice que se codificará en 29 exones. Se encontraron cuatro variantes alternativamente divididas, putativas, durante las amplificaciones de PCR, incluyendo una omisión del exón 7, omisión del exón 1 0, omisión del exón 19, y una omisión del exón 21 . Estas variantes/omisiones pueden ocurrir de manera individual o en combinación . Además, se identificaron diversas substituciones nucleótidas como sigue con relación a la SEQ ID NO: 1 : Un análisis de la secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19 identificó regiones distintas de los polipéptidos HAM de la invención. Una secuencia guía, también llamada un péptido de señal, se presenta en estos polipéptidos. Por ejemplo, la secuencia guía presente en el polipéptido HAM humano de longitud completa de la invención se predice que incluye amino ácidos 1 -60 de la SEQ ID NO: 2 y amino ácidos 1 -59 de la SEQ ID NO: 19. El sitio de disociación péptida de señal para HAM se predijo mediante el uso de un algoritmo de computadora. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que el sitio de disociación de la secuencia de señal pueden variar dependiendo de varios factores que incluyen el organismo en el cual se expresa el polipéptido. De acuerdo con lo anterior, el término N de una forma madura de un polipéptido HAM de la invención puede variar en aproximadamente 2 hasta 5 amino ácidos. Por lo tanto, una forma madura del polipéptido HAM humano de la invención puede incluir en su término N amino ácidos 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 o 65 de la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con lo anterior, un HAM humano de forma madura puede incluir el amino ácido 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 o 65 hasta aproximadamente el amino ácido 1379 (o, en el caso de un polipéptido soluble, hasta el amino ácido 1230) de la SEQ ID NO: 2. Las regiones extracelulares de los polipéptidos HAM humanos se localizan en aproximadamente los amino ácidos 61 a 1230 de la SEQ ID NO: 2. Los dominios similares a EGF, dominio CUB, dominio de reconocimiento de carbohidratos o Lectina tipo C (dominio CLECT), motivo KELCH y asignaciones de dominio similar a EGF de Laminina, así como también aquellas para los dominios de transmembrana y citoplásmicos, se basan en algoritmos de computadora y en reportes previos (Gunn et al. , Nature 398: 152-157, 1999). La región extracelular de HAM humano putativamente contiene tres dominios similares a EGF, un dominio CUB, un motivo KELCH, un dominio de reconocimiento de carbohidratos o Lectina tipo C, un motivo de enlace a ligando putativo de la cadena común de gama citosina y un dominio similar a EGF de Laminina localizado en aproximadamente los amino ácidos 63-90, 21 1 -243, 261 -280, 93-208, 581 -612, 749-873, 670-686 y 1014-1055 de la SEQ ID NO: 2, respectivamente (ver Figura 3). La región de transmembrana para los polipéptidos HAM humanos se localiza en aproximadamente los amino ácidos 1231 a 1251 de la SEQ ID NO: 2. Las regiones intracelulares se localizan en aproximadamente los amino ácidos 1252 a 1379 de la SEQ ID NO: 2. Además, las secuencias reconocidas arriba, la secuencia RXXHSAVXINGXMXIFGG, se encontró que se repie en la secuencia HAM humana de la invención (ver, por ejemplo, los aminoácidos 521 a 540 y 581 a 600 de la SEQ ID NO: 2). Una BLAST de esta secuencia repetida identificó un número de secuencias de atractina y caoba. De acuerdo con lo anterior, esta secuencia de repetición es un dominio conservado HAM putativo. La figura 3 muestra los dominios relativos y los residuos conservados de HAM indicativos de un polipéptido de atractina o caoba.

EJEMPLO 3 Expresión en Tejido de HAM PCR para el homólogo de atractina utilizó las siguientes cargas de inicio que se designaron para amplificar un fragmento de aproximadamente 650 bp desde el extremo predicho 3' de la región codificadora. Las cargas de inicio se basaron en la región codificadora predicha dentro de la secuencia genómica y son idénticas a las secuencias encontradas en la secuencia AB01 1 1 06: Filamento de detección 5'CAATATCTGGGGAAGAGACTTCTATAGTTTCCAAG (SEQ ID NO: 20) Antidetección 5'GGTrTCCATTTCTCAGACACAAGTTCCTTGACGTGT (SEQ ID NO: 21) PCR mostró una señal positiva mediante el uso de estos primeros cADNs de filamento como modelos en: placenta, hígado, riñon, páncreas, bazo, testículos, nodo linfático, corazón, músculo esquelético, cerebro, ovario, intestino delgado, esófago, hígado fetal, cerebro fetal, pulmón fetal, bazo fetal, timo fetal, riñon fetal y músculo esquelético fetal. Ningún producto de PCR fue detectable en estómago, médula ósea, pulmón, colon, próstata, timo, leucocitos y piel. De acuerdo con lo anterior, HAM pueden utilizarse como un marcador específico de tejido.

EJEMPLO 4 Anticuerpos Monoclonales que se Unen a Polipéptidos HAM Los polipéptidos HAM substancialmente purificados o fragmentos de los mismos pueden utilizarse para generar anticuerpos monoclonales inmunoreactivos con los mismos, mediante el uso de técnicas convencionales tales como aquellas descritas en la patente de E.U. 4,41 1 ,993. En resumen, los ratones se inmunizaron con un inmunogen polipéptido HAM emulsificado en adyuvante completo de Freund y se inyectaron en cantidades que varían desde 10-100 µg de manera subcutánea o intraperitoneal. Diez o doce días después, los animales inmunizados recibieron un refuerzo con polipéptido HAM adicional o fragmento del mismo, emulsificado en adyuvante completo de Freund. Posteriormente, los ratones reciben refuerzos periódicamente en un esquema de inmunización semanal o dos veces a la semana. Las muestras de suero se toman periódicamente mediante sangrado retro-orbital o corte en la punta de la cola para examinar los anticuerpos HAM mediante ensayo de manchado sanguíneo, ELISA (Ensayo Inmunosorbente Enlazado a Enzima) o inhibición del enlace de un polipéptido HAM a un socio de enlace de polipéptido HAM. Después de la detección de un título de anticuerpo adecuado, a los animales positivos se les proporcionó una última inyección intravenosa e un polipéptido HAM o fragmento en solución salina. Tres a cuatro días más tarde, los animales se sacrificaron, se recolectaron células del hígado y las células de hígado se fusionaron con una línea celular de mieloma murino, por ejemplo, NS1 o preferentemente P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se colocan en múltiples placas de microtítulo en un medio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de célula de bazo. Las células de hibridoma se seleccionan por ELISA respecto a la reactividad contra un polipéptido HAM substancialmente puro mediante adaptaciones de las técnicas expuestas en Engvall et al. (Immunochem. 8: 871 , 1971 ) y en la Patente de E.U. 4,703,004. Una técnica de selección preferida es la técnica de captura de anticuerpos descrita en Beckmann et al. {J. Immunol. 144: 4212, 1990). Las células de hjbridoma positivas pueden inyectarse de manera intraperitoneal en ratones BALB/C singénicos a fin de producir ascitas que contienen concentraciones elevadas de anticuerpo monoclonal de polipéptido anti-HAM. De manera alternativa, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vitro en matraces o botellas giratorias mediante diversas técnicas. Los anticuerpos monoclonales producidos en ascitas de ratón pueden purificarse mediante precipitación por sulfato de amoniaco, seguido por cromatografía de exclusión por gel. De manera alternativa, la cromatografía por afinidad en base al enlace de anticuerpo a Polipéptido A o Polipéptido G también puede utilizarse, como puede utilizarse igualmente la cromatografía por afinidad en base al enlace a polipéptido HAM.

EJEMPLO 5 Representación Gráfica de Cromosomas La representación gráfica de cromosomas puede llevarse a cabo en , por ejemplo, uno de los dos siguientes métodos. El gen correspondiente a un polipéptido HAM se representa gráficamente mediante el uso de cargas de inicio de PCR específicas de HAM y un equipo de ADN PCRable Híbrido dé Célula Somática BIOS de BIOS Laboratories (New Haven, CT), siguiendo las instrucciones del fabricante. La representación gráfica más detallada se lleva a cabo mediante el uso de un Panel Híbrido de Radiación 4 Genebridge (Research Genetics, Huntsville, AL; descrito en Walter, MA ef al. , Nature Genetics 7: 22-28, 1 994). Los datos de este análisis se someten entonces electrónicamente al Representador Gráfico Híbrido de Radiación MIT (URL: http://www-genome.wi. mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper. pl) siguiendo las instrucciones contenidas en el mismo. Este análisis produce nombres de marcadores genéticos específicos que, cuando se someten electrónicamente al examinador NCBI Genemap (www-ncbi. nlm.nih.gov80/cgi-bin/enterez/hum_srch?chr=hum_chr. ing&guery), producen el intervalo de cromosoma específico.

De manera alternativa, el análisis de base de datos puede producir información sobre la ubicación de la secuencia polinucleótida que codifica el polipéptido HAM. El análisis de las colindancias genómicas humanas mediante el uso de la base de datos de genoma humano Celera identificó a la secuencia HAM localizada en el cromosoma humano 10q26.

EJEMPLO 6 Ensayo de Enlace Los polipéptidos HAM o fragmentos de los mismos se expresan por técnicas de ADN recombinantes, se purifican y examinan respecto a la habilidad para enlazarse con diversas células de las diversas alineaciones (por ejemplo, células hematopoiéticas). Los ensayos de enlace emplean polipéptidos HAM, incluyendo formas solubles de estos polipéptidos y oligómeros formados como se describe a continuación. Los oligómeros para ensayos se preparan como sigue. Las proteínas de fusión que comprenden un péptido de cierre de leucina fusionado al término COOH de un polipéptido HAM se construyen como se describe arriba. El péptido puede comprender una forma soluble de polipéptido HAM, tal como la región extracelular de un polipéptido HAM. Se prepara una construcción de expresión, esencialmente como se describe en Baum eí al. (EMBO J. 13: 3992-4001 , 1994). La construcción, en el vector de expresión pDC409, codifica una secuencia guía derivada del citomegalovirus humano, seguida por el elemento de cierre de leucina fusionado al término C de un polipéptido HAM soluble. De manera alternativa, una fusión genética que codifica un polipéptido HAM/ proteína > > ' > _ 92 . de fusión Fe se inserta en un vector de expresión adecuado. El polipéptido/proteínas de fusión Fe se expresan en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante y se permiten ensamblar por la formación de enlaces de disulfuro dé intercadena entre los elementos Fe, produciendo así moléculas diméricas. El Fc/polipéptido HAM o cierre de leucina/proteína de fusión de polipéptido HAM expresado se contacta con una célula que se sospecha expresa un socio de enlace a polipéptido HAM. En una modalidad, la actividad de la proteína de fusión se mide mediante la detección de un cambio en el metabolismo de energía o activación celular inmune a través de cualquiera de varios indicadores. En otra modalidad, la actividad de la proteína de fusión se mide mediante la detección de la habilidad de una célula que expresa un polipéptido HAM nativo para enlazarse a o interactuar con una célula que expresa un socio de enlace a polipéptido HAM en presencia y ausencia de la proteína de fusión. En todavía otra modalidad, la actividad de enlace de la construcción de fusión se omite mediante detección de enlace de la proteína de fusión a un cognado de polipéptido HAM mediante el uso, por ejemplo, de un anticuerpo anti-lgG etiquetado.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un polipéptido substancialmente purificado, caracterizado porque comprende un polipéptido HAM, en donde el polipéptido HAM es al menos 80% idéntico a una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19. 2. El polipéptido substancialmente purificado según la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido HAM es ai menos 90% idéntico a una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19. 3. El polipéptido substancialmente purificado según la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido HAM tiene una sepuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 19. 4. El polipéptido substancialmente purificado según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia comprende desde aproximadamente el amino ácido 61 hasta 1379 de la SEQ ID NO: 2 o desde aproximadamente el amino ácido 60 hasta 1376 de la SEQ ID NO: 19. 5. El polipéptido substancialmente purificado según la reivindicación 1 , caracterizado porque la secuencia comprende desde aproximádamente el amino ácido 61 hasta 1230 de la SEQ ID NO: 2 o fragmento de la misma, o desde aproximadamente el amino ácido 60 hasta 1227 de la SEQ ID NO: 19 o un fragmento de la misma. 6. Un polipéptido substancialmente purificado caracterizado porque comprende un polipéptido HAM, en donde el polipéptido HAM es al menos 80% idéntico a una secuencia según se establece a partir de aproximadamente el amino ácido 61 hasta 1230 de la SEQ ID NO: 2, o desde aproximadamente el amino ácido 60 hasta 1227 de la SEQ ID NO: 19 y en donde el polipéptido HAM tiene una actividad polipéptida de HAM. 7. El polipéptido substancialmente purificado según la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia es al menos 90% idéntica a una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 61 a 1230 de la SEQ ID NO: 2, o desde aproximadamente el amino ácido 60 a 1227 de la SEQ ID NO: 19. 8. Un polipéptido substancialmente puro caracterizado porque comprende una secuencia amino ácida según se establece desde aproximadamente el amino ácido 61 a 1230 de la SEQ ID NO: 2 o desde aproximadamente el amino ácido 60 a 1227 de la SEQ ID NO: 19. 9. Un polipéptido de fusión caracterizado porque comprende un primer polipéptido operablemente enlazado a un segundo polipéptido, en donde el primer polipéptido se selecciona partir del consistente en: (i) un polipéptido que tiene una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 61 hasta 1230 de la SEQ ID NO: 2; (ii) un polipéptido que tiene una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 60 hasta 1227 de la SEQ ID NO: 19; (iii) un polipéptido que tiene una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 61 hasta 1379 de la SEQ ID NO: 2; y (iv) un polipéptido que tiene una secuencia según se establece desde aproximadamente el amino ácido 60 hasta 1376 de la SEQ ID NO: 19. 1 0. El polipéptido de fusión según la reivindicación 9, caracterizado porque el segundo polipéptido es un polipéptido de Fe. 1 1 . El polipéptido de fusión según la reivindicación 9, caracterizado porque el segundo polipéptido es un polipéptido de cierre de leucina. 12. El polipéptido de fusión según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende un polipéptido enlazador que separa al primer polipéptido y al segundo polipéptido y se enlaza operablemente al primer y segundo polipéptido. 13. Un polinucleótido aislado que codifica al polipéptido según la reivindicación 1 , 6 o 9. 14. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: a) SEQ ID NO: 1 o 18; b) SEQ ID NO: 1 o 18, en donde T también puede ser U; y c) secuencias complementarias a la SEQ ID NO: 1 o 18. 15. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste en: a) la SEQ ID NO: 1 desde aproximadamehte el nucleotido 181 a 4137; b) la SEQ ID NO: 1 desde aproximadamente el nucleotido 181 a 3690; c) la SEQ ID NO: 18 desde aproximadamente el nucleotido 178 a 4128; d) la SEQ ID NO: 18 desde aproximadamente el nucleotido 178 a 3681 ; e) secuencias complementarias a a), b), c) y d); y f) cualquiera de a), b), c) o d) en donde T también puede ser U. 16. Un vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 14 o 15. 17. El vector según la reivindicación 16, caracterizado porque el vector es una plásmida. 18. El vector según la reivindicación 16, caracterizado porque el vector es un vector viral. 19. Una célula huésped que contiene el vector según la reivindicación 16. 20. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende un polinucleótido según la reivindicación 14 o 15 bajo el control de una secuencia reguladora heteróloga. 21 . La célula huésped según la reivindicación 20, caracterizada porque la célula es procariótica. 22. La célula huésped según la reivindicación 20, caracterizada porque la célula es eucariótica. 23. Un método para la producción de un polipéptido que comprende el cultivo de una célula huésped según la reivindicación 20, bajo la condición de promover la expresión del polipéptido. 24. Un polipéptido producido mediante cultivo de una célula huésped según la reivindicación 20, bajo condiciones que promueven la expresión del polipéptido. 25. Un anticuerpo purificado que se enlaza específicamente a un polipéptido que consiste en una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 18. 26. El anticuerpo según la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 27. El anticuerpo según la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano o humanizado. 28. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo según la reivindicación 25 o un polipéptido que comprende una secuencia amino ácida seleccionada a partir del grupo que consiste en: (a) la SEQ ID NO: 2 desde el amino ácido 61 hasta 1379; (b) la SEQ ID NO: 2 desde el amino ácido 61 hasta 1230; (c) la SEQ ID NO: 18 desde el amino ácido 60 hasta 1376; y (d) la SEQ ID NO: 18 desde el amino ácido 60 hasta 1227, y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutico. 29. Un método para la identificación de un agente que modula la expresión de un polinucleotido que comprende una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 18, caracterizado porque comprende contactar una muestra que contiene el polinucleotido con un agente de prueba y medir la expresión del polinucleotido en comparación con un control, en donde un cambio en la expresión en comparación con el control es indicativo de un agente que modula la expresión del polinucleotido. 30. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido, un péptido, un peptidomimético, un ácido nucleico y una molécula pequeña. 31 . El método según la reivindicación 29, caracterizado porque la muestra es una muestra biológica de un sujeto. 32. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque la muestra comprende células. 33. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque el cambio de expresión es un incremento en la expresión. 34. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque la medición es mediante PCR o Northern Blot. 35. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque la medición es mediante la detección de un polipéptido expresado por el polinucleótido. 36. Un método para la identificación de un agente que modula la actividad de un polipéptido que comprende una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 o 1 9, caracterizado porque comprende contactar una muestra que contiene el polipéptido con un agente de prueba y medir la actividad del polipéptido en comparación con un control, en donde un cambio de actividad en comparación con el control es indicativo de un agente que modula la actividad del polipéptido. 37. El método según la reivindicación 36, caracterizado porque el agente se selecciona a partir del grupo que consiste en un poíipéptido, un péptido, un peptidomimético, un ácido nucleico y una molécula pequeña. 38. El método según la reivindicación 36, caracterizado porque la muestra es una muestra biológica de un sujeto. 39. El método según la reivindicación 36, caracterizado porque la muestra comprende células. 40. El método según la reivindicación 36, caracterizado porque el cambio de actividad es un incrementó en la actividad. 41 . El método según la reivindicación 36, caracterizado porque la medición es mediante la cuantificación de la cantidad de poíipéptido en la muestra. 42. Un método para el tratamiento de un desorden o enfermedad asociada con HAM, caracterizado porque comprende contactar un sujeto con un poíipéptido HAM, un polinucíeotido HAM, o un anticuerpo que se une específicamente a un poíipéptido HAM en una cantidad eficaz para tratar el desorden o enfermedad asociada con HAM. 43. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el desorden asociado con HAM se selecciona a partir del grupo que consiste en un desorden reumatológico, un desorden de trasplante de médula ósea u órgano sólido, un desorden de injerto contra huésped, un desorden inflamatorio, un desorden autoinmune, un desorden neurológico, un desorden de mielinación, un desorden proliferativo celular, una infección, un desorden cardiovascular, un desorden hematológico, un desorden de hígado, un desorden metabólico, un desorden de peso y un desorden óseo. ' ' . * ' - 100 - 44. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el polipéptido HAM tiene una secuencia según se establecen en la SEQ ID NO: 2 o 19. 45. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el polipéptido HAM tiene una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 2 desde aproximadamente el amino ácido 61 hasta 1230, o según se establece en la SEQ ID NO: 1 9 desde aproximadamente el amino ácido 60 hasta 1227. 46. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el polinucleótido HAM tiene una secuencia según se establece en la SEQ ID NO: 1 o 18. 47. El método según la reivindicación 42, caracterizado porque el sujeto es un mamífero. RESUME N La presente exposición proporciona polipéptidos similares a atractina/caoba y fragmentos de los mismos, polinucleótidos que codifican tales polipéptidos y fragmentos, procesos para la producción de formas recombinantes de tales polipéptidos, anticuerpos generados contra estos polipéptidos o fragmentos, y ensayos y métodos que emplean estos polipéptidos, anticuerpos y polinucleótidos.