DE69534235T2

DE69534235T2 - Cytokin lerk-7

Info

Publication number: DE69534235T2
Application number: DE69534235T
Authority: DE
Inventors: Douglas P. Cerretti
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1994-12-06
Filing date: 1995-12-05
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2015-12-06
Also published as: AU710160B2; EP0871702B1; EP0871702A4; NZ301067A; DE69534235D1; JPH10512440A; CA2206488A1; NO972455D0; DK0871702T3; AU4639396A; FI972390A0; PT871702E; WO1996017925A1; ATE296348T1; NO972455L; EP0871702A1; ES2240981T3; MX9704173A; FI972390A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Proteine, die als die Rezeptor-Tyrosin-Kinasen bekannt sind, weisen eine intrinsische Kinase-Aktivität auf, die bei einer Ligandenbindung aktiviert wird. Diese Klasse von Proteinen zeichnet sich durch konservierte strukturelle Motive innerhalb der katalytischen Domänen aus (Hanks et. al.: Science, 242: 42, 1988) und kann auf Grund der strukturellen Merkmale der Bereiche vom N-Terminus bis zur katalytischen Domäne in Familien unterteilt werden.
Die eph-Familie der Rezeptoren, die nach dem ersten isolierten Element benannt wurde (Hirai et. al.: Science 238: 1717, 1987), ist die größte Unterfamilie der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen. Unter den Mitgliedern dieser Familie sind Huhn-cek4 (Sajjadi et. al.: New Biol. 3: 769, 1991) und -cek5 (Pasquale, E. B.: Cell Regulation 2: 523, 1991); Maus-mek4 (Sajjadi et. al.: supra), -bsk (Zhou et. al.: J. Neurosci. Res., 37: 129, 1994), -nuk (Henkemeyer et. al.: Oncogene 9: 1001, 1994), und -sek (Gilardi-Hebenstreit et. al.: Oncogene 7: 2499, 1992); Ratten-elk (Letwin et. al.: Oncogene 3: 621, 1988; Lhotak et. al.: Mol. Cell. Biol. 11: 2496, 1991), -eek (Chan et. al: Oncogene 6: 1057, 1991), -ehk-1 und -ehk-2 (Maisonpierre et. al.: Oncogene 8: 3277, 1993); und menschliches hek (Boyd et. al.: J. Biol. Chem., 267: 3262, 1992; Wicks et. al.: PNAS USA, 89: 1611, 1992), hek2 (Bohme et. al.: Oncogene 8: 2857, 1993), eck (Lindberg et. al.: Mol. Cell. Biol., 10: 6316, 1990) und erk (Chan et. al.: supra).
Die Proteine diese Unterfamilie sind nicht nur in ihren Zytoplasmadomänen verwandt, sondern auch in ihren extrazellulären Domänen, die zu 41 bis 68% identisch sind. Interessanterweise sind die Gewebeverteilungen dieser verschiedenen Rezeptoren unterschiedlich. Beispielsweise ist berichtet worden, dass eine Expression von elk-mRNA auf Hoden und Hirn beschränkt ist (Lhotak et. al.: supra), wohingegen eck nicht nur in eben diesen beiden Geweben, sondern auch in Lunge, Darm, Niere, Milz, Eierstock und Haut angetroffen wird. Da die meisten der eph-verwandten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen hauptsächlich im Gehirn exprimiert werden, ist die These vertreten worden, dass diese Rezeptoren und ihre Liganden am Wachstum, an der Differenzierung und am Überleben von Neuronen beteiligt sein könnten.
Das hek (hek: Human eph/elk-like Kinase (engl.)) genannte Zelloberflächen-Glycoprotein wurde von Boyd et. al. (J. Biol. Chem., 267: 3262, 1992) gereinigt. Es wurde ein mit hek immunreaktiver monoklonaler Antikörper benutzt, um die hek-Expression an einer Anzahl menschlicher Zelltypen zu untersuchen (Boyd et. al.: supra). Ein hek-Antigen wurde bei der menschlichen Prä-B-Leukämiezelllinie LK63 (die Zelllinie wurde als das Immungen benutzt, gegen welches sich der Antikörper bildete) und der menschlichen 7-Zellen-Leukämiezelllinie JM festgestellt. Die Raji-B-Lymphom-Zelllinie zeigte eine schwache hek-Antigen-Expression, und die übrigen Zelllinien, die getestet wurden (sowohl normale als auch Tumor-Zelllinien, unter denen hämopoetische Zelllinien einschließlich Prä-B- und T-Zelllinien waren), waren durchweg negativ. Von den normalen und Tumorgewebe-Biopsieproben, die ebenfalls hinsichtlich einer hek-Antigen-Expression getestet wurden, war keine von normalem Gewebe positiv, und nur ein sehr geringer Teil der hämopoetischen Tumore war positiv.
Die Expression von hek-Transkripts sowohl in den oben beschriebenen LK63- und JM-Zelllinien als auch in der menschlichen T-Zellen-Leukämie-Zelllinie HSB-2 ist durch Northern Blot-Analyse (Wicks et. al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1611, 1992) nachgewiesen worden. Nucleotide und Aminosäuresequenzen für einen isolierten hek-cDNA-Klon sind ebenfalls in Wicks et. al.: supra, dargestellt.
Ein partieller Klon des elk genannten Zelloberflächenproteins wurde zuerst in einer Rattenhirn-cDNA-Expressionsbank entdeckt, die nach Proteinen durchsucht wurde, die eine Tyrosin-Kinase-Aktivität zum Ausdruck bringen (Letwin et. al.: Oncogene 3: 621, 1998). Später wurde eine zusammengesetzte Sequenz, die sich über die gesamte elk codierende Region spannt, von partiellen Klonen gewonnen, die aus einer Rattenhirn-cDNA-Bank und einer Rattenkleinhirn-Bank unter Verwendung des partiellen Klons als Sonde isoliert wurden (Lhotak et. al.: Mol. Cell Biol. 11: 2496, 1991).
Diese Liganden, die für die Rezeptor-Tyrosin-Kinasen identifiziert worden sind, stellen eine gemischte Gruppe von Proteinen dar, die das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben der Zellen, die die Rezeptoren exprimieren, beeinflussen. Auf Grund der Übereinstimmung der Rezeptoren innerhalb der eph-Familie kann ein bestimmter Ligand für einen spezifischen Rezeptor auch andere Rezeptoren binden. Es sind Liganden für hek und elk isoliert worden, die weiter unten ausführlicher erörtert sind.
Eine Identifizierung weiterer Liganden für hek und elk, die es geben könnte, würde sich als nützlich für die Erforschung der Natur zellulärer Vorgänge erweisen, die durch Signalisierung durch diese Rezeptoren reguliert werden. Wenn eine Verstärkung oder Inhibierung eines bestimmten biologischen Signals, das durch diese Rezeptoren übermittelt wird, gewünscht ist, ist es vorteilhaft, jedes der Proteine, das bei der Übertragung eines solchen Signals eine Rolle spielen könnte, zu identifizieren. Ferner ist bekannt, dass sich bestimmte Proteine, einschließlich des Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist-Proteins (Eisenberg et. al.: Nature 343: 341, 1990; Hannum et. al.: Nature 343: 336, 1990; und Carter et. al.: Nature 344: 633, 1990), an Rezeptoren binden können, ohne eine Signalübertragung in die Wege zu leiten. Eine Identifizierung weiterer Proteine, die hek oder elk binden, ist auch wünschenswert, um zu bestimmen, ob diese Proteine als Antagonisten wirksam werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein neuartiges Cytokin gerichtet, das Lerk-7 genannt wurde. Hierbei werden gereinigte Lerk-7-Proteine zusammen mit isolierten DNAs, die Lerk-7 codieren, Expressionsvektoren, die die Lerk-7-DNA aufweisen, und mit den Expressionsvektoren transformierte Wirtszellen bereitgestellt. Verfahren zur Herstellung von Lerk-7 schließen ein Kultivieren solcher transformierter Wirtszellen unter Bedingungen, die eine Expression von Lerk-7 begünstigen, ein.
Die Lerk-7-Polypeptide binden an Zelloberflächenrezeptoren, die, wie weiter oben beschrieben wurde, als hek, elk und eck bekannt sind. Außerdem schließt die Erfindung Antikörper ein, die in spezifischer Weise Lerk-7-Polypeptide binden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Hier wird ein neuartiges Cytokin mit der Bezeichnung Lerk-7 bereitgestellt. Dieses Cytokin bindet sich an die als elk, hek und eck bekannten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen.
Die vorliegende Erfindung schließt DNA, die Lerk-7 codiert, Expressionsvektoren, die die Lerk-7-DNA enthalten, und mit den Expressionsvektoren transformierte Wirtszellen ein. Ein Verfahren zur Herstellung von Lerk-7-Polypeptiden weist ein Kultivieren der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die zu einer Expression von Lerk-7 führen, und ein Wiedergewinnen des exprimierten Lerk-7 auf. Es sind gereinigte Lerk-7-Polypeptide sowohl in löslicher als auch in membrangebundener Form geoffenbart.
Lerk-7-Polypeptide oder immunogene Fragmente davon können als Immungene verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die eine Immunreaktion damit eingehen. In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
Eine cDNA, die menschliches Lerk-7 codiert, ist, wie im Beispiel 1 beschrieben, aus einer menschlichen fötalen Hirn-cDNA-Bank isoliert worden. Die Nucleotidsequenz der codierenden Region dieser Lerk-7-cDNA ist in SEQ ID NO: 4 dargestellt, und die dadurch codierte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt. Dieses Lerk-7-Protein weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –20 bis –1 der SEQ ID NO: 5), eine extrazelluläre rezeptorbindende Domäne (Aminosäuren 1 bis 133), eine Abstandsregion (Aminosäuren 134 bis 183) und einen C-terminalen Abschnitt aus hydrophoben Resten (Aminosäuren 194–208) auf.
Es wird vorhergesagt, dass Lerk-7 über eine Glykosylphosphatidylinosotol-(GPI-)Bindung an der Zelloberfläche verankert wird. GPI-Membrananker, einschließlich ihres chemischen Aufbaus und ihrer Verfahren sind in Ferguson, M. und A. Williams: Ann. Rev. Biochem. 57: 285, 1988, beschrieben. Wenn sie anfangs exprimiert werden, weisen bestimmte Proteine eine C-terminale hydrophobe Domäne auf, die Signale für eine GPI-Verankerung enthält. Eine Spaltstelle befindet sich stromaufwärts, oftmals ungefähr 10 bis 12 Aminosäuren von dem N-Terminus der hydrophoben Domäne entfernt. Eine posttranslationale Bearbeitung umfasst ein Spalten des Proteins an dieser Spaltstelle. Ein GPI-Anker heftet sich an die frisch freigelegte C-terminale Aminosäure des bearbeiteten reifen Proteins an. Wenn Lerk-7-Proteine in Zellen exprimiert werden, die GPI-Verankerungsignale erkennen, stellt folglich die volle Länge der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 eine Vorläuferform des Proteins dar.
Die vorhergesagte GPI-Anheftungsstelle in dem Lerk-7-Protein ist der Asparagin-Rest an der Position 183. Nach der Spaltung des Proteins (während der posttranslationalen Bearbeitung) wird dieser Asparagin-Rest der C-Terminus des bearbeiteten Proteins. Ein GPI-Abschnitt heftet sich an diesen Asparagin-Rest. Diese Vorhersage der wahrscheinlichen Spaltstelle beruht auf Konsensus- Sequenzen, die in anderen GPI-verankerten Proteinen gefunden wurden. Es ist möglich, dass eine Spaltung anderswo stromaufwärts der hydrophoben Region stattfindet.
Die vorliegende Erfindung stellt sowohl zellmembrangebundene als auch lösliche (sezernierte) Formen von Lerk-7 bereit. Lösliche Lerk-7-Polypeptide enthalten die rezeptorbindende Domäne eines natürlichen Lerk-7, es fehlt ihnen jedoch das GPI-Signal, das ein Zurückhalten des Polypeptids an einer Zellmembran zur Folge haben würde. Die durch die Erfindung erfaßten löslichen Lerk-7-Polypeptide behalten die Fähigkeit, den hek- oder den elk-Rezeptor zu binden, bei. Lösliches Lerk-7 kann außerdem die Abstandsregion oder einen Teil der hydrophoben Domäne enthalten, vorausgesetzt, dass lösliche Lerk-7-Protein kann sezerniert werden.
Lösliches Lerk-7 kann durch Abtrennen intakter Zellen, die ein Lerk-7-Polypeptid exprimieren, von dem Kulturmedium, z.B. durch Zentrifugieren, und Prüfen des Mediums (Supernatant) auf das Vorhandensein des gewünschten Proteins identifiziert (und von seinen unlöslichen membrangebundenen Gegenstücken unterschieden) werden. Das Vorhandensein von Lerk-7 in dem Medium zeigt an, dass das Protein von den Zellen sezerniert worden ist und folglich eine lösliche Form des gewünschten Proteins ist.
Lösliche Formen von Lerk-7 besitzen gewisse Vorteile gegenüber der membrangebundenen Form des Proteins. Die Reinigung des Proteins von rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Proteine von den Zellen sezerniert werden. Ferner sind lösliche Proteine für bestimmte Anwendungen, z.B. für eine intravenöse Verabreichung, im Allgemeinen besser geeignet.
Lösliche Lerk-7-Proteine sind am C-Terminus beschnitten. Vom Weglassen der hydrophoben Domäne wird angenommen, daß dies ausreicht, um eine GPI-Verankerung des Proteins an der Zellmembran zu verhindern, obwohl das Protein weiter beschnitten werden kann, um die Aminosäure, welche die GPI-Anheftungsstelle bildet, zu entfernen. Beispiele für lösliche menschliche Lerk-7-Polypeptide schließen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Polypeptide ein, die am C-Terminus so beschnitten sind, dass die C-terminale Aminosäure eine derjenigen ist, die zwischen den Resten an den Positionen 133 und 193 der SEQ ID NO: 5 oder einschließlich dieser Positionen enthalten ist.
In besonderen Ausführungsformen schließen lösliche Lerk-7-Polypeptide jene ein, die die Aminosäuren 1–133, 1–182, 1–185 oder 1–193 der SEQ ID NO: 5 aufweisen. Um eine Ausführungsform zu veranschaulichen wurde ein Expressionsvektor hergestellt, der ein rekombinantes Fusionsprotein codiert, das die Aminosäuren –20 bis 185 der SEQ ID NO: 5, gefolgt von einem Peptid, das durch eine Vektor-Mehrfachklonierungsstellensequenz codiert ist, gefolgt von einem Fc-Region-Polypeptid (von einem Antikörper gewonnen) aufweist. Dieses Fusionsprotein wurde von den Wirtszellen, in denen es exprimiert wurde, sezerniert und zeigte eine biologische Aktivität, wie durch die Bindung an eck deutlich wurde. In einer weiteren Alternative ist das lösliche Polypeptid ein Fragment der Lerk-7-Rezeptorbindungsdomäne, welche die Fähigkeit beibehält, elk oder hek zu binden.
Wenn sie anfangs in einer Wirtszelle exprimiert werden, weisen die löslichen Lerk-7-Polypeptide vorteilhaft das natürliche Signalpeptid oder eines der weiter unten beschriebenen nicht übereinstimmenden Signalpeptide, das in den verwendeten Wirtszellen funktionsfähig ist, auf. Die vorliegende Erfindung schließt isolierte DNA-Sequenzen, die lösliche Lerk-7-Proteine codieren, ein.
Lerk-7-Fragmente, die lösliche Polypeptide umfassen, können mit irgendeinem einer Anzahl herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Eine DNA-Sequenz, die ein gestutztes Lerk-7 codiert, kann unter Anwendung bekannter Verfahren chemisch synthetisiert werden. Außerdem können DNA-Fragmente durch Restriktionsendonuclease-Aufschließung einer klonierten DNA-Sequenz voller Länge produziert und durch Elektrophorese auf Agarosegelen isoliert werden. Es können Oligonucleotide verwendet werden, die den 5'- oder den 3'-Terminus eines DNA-Fragments an einer gewünschten Stelle rekonstruieren. Es können Restriktionsendonuclease-Spaltstellen enthaltende Linker benutzt werden, um das gewünschte DNA-Fragment in einen Expressionsvektor einzufügen. Es kann auch das wohl bekannte Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) benutzt werden, um ein DNA-Fragment, das ein bestimmtes Proteinfragment codiert, zu amplifizieren. Bei der Polymerase-Kettenreaktion werden Primer benutzt, die die gewünschten Termini des DNA-Fragments definieren. Als eine weitere Alternative können bekannte Mutagenese-Verfahren benutzt werden, um an einer gewünschten Stelle, d.h. unmittelbar hinter dem Codon für die letzte Aminosäure der rezeptorbindenden Domäne, ein Stoppcodon einzufügen.
Es sind weitere Proteine entdeckt worden, die sich sowohl an hek als auch an elk binden; diese sind Lerk-1 bis Lerk-6 (Liganden der EPH-Related Kinases) genannt worden. Lerk-2 und Lerk-5 sind Transmembranproteine vom Typ 1, während Lerk-1, -3, -4 und -6 mittels GPI-Bindung an der Zellmembran verankert sind. Der Prozentsatz der Identität der Aminosäuresequenzen dieser sechs Proteine reicht von 30 bis 59%, wobei die Proteine jeweils vier konservierte Cystein-Reste aufweisen.
Holzmann et. al. (Mol. Cell. Biol. 10: 5830, 1990) berichtete die Klonierung von cDNA für ein B61 genanntes Protein. Später wurde entdeckt, dass B61 in der Lage war, an elk und hek zu binden, und dem Protein B61 wurde die alternative Bezeichnung Lerk-1 gegeben (Beckmann et al.: EMBO J. 13: 3757, 1994). Von B61 ist außerdem berichtet worden, daß es ein Ligand für die oben beschriebene Rezeptor-Tyrosin-Kinase, bekannt als eck, ist (Bartley et. al.: Nature 368: 558, 1994).
Lerk-2, auch als elk-Ligand bekannt, ist in der PCT-Anmeldung WO 94/11 384 beschrieben. Sowohl Lerk-3 als auch Lerk-4 sind in dem US-Patent 5,516,658 beschrieben. Lerk-5 ist in dem US-Patent 6,303,769 beschrieben.
Lerk-6-DNA und -Proteine sind in dem US-Patent 5,919,905 beschrieben. Ein als λ13 bezeichneter Maus-Lerk-6-cDNA-Klon wurde von einer 11,5-Tage-embryonalen Maus-cDNA-Bank isoliert. Eine im Wesentlichen vollständige DNA-Sequenz der codierenden Region der cDNA des Klons λ13 und die dadurch codierte Aminosäuresequenz sind hier in SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 gezeigt. Der offene Leserahmen innerhalb dieser Sequenz codiert ein Protein aus 184 Aminosäuren. Es wird die Meinung vertreten, dass sich die erste Aminosäure der SEQ ID NO: 2 (Ala) an oder sehr nahe dem natürlichen N-Terminus befindet. Ein die DNA des λ13-Klons (die Lerk-6-cDNA in λgt10) enthaltendes Zell-Lysat wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, am 15. Juli 1994 mit der zugeteilten Hinterlegungsnummer ATCC 75829 hinterlegt.
Die menschliche Lerk-7-cDNA der vorliegenden Erfindung wurde bei einem Versuch, cDNA zu isolieren, die das menschliche Homolog von Maus-Lerk-6 codiert, entdeckt. Ein Maus-Lerk-6-DNA-Fragment wurde als Sonde benutzt, um bei einem Versuch, menschliches Lerk-6 zu klonieren, eine menschliche cDNA-Bank zu durchsuchen. Überraschenderweise codierte ein isolierter cDNA-Klon ein neuartiges Protein, das Lerk-7 der vorliegenden Erfindung.
Die prozentuale Identität der menschlichen Lerk-7-Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 mit der Aminosäuresequenz voller Länge verschiedener anderer Proteine ist wie folgt, wobei "h" für human, "m" für Maus und "r" für Ratte steht:

h Lerk-1 45,771

h Lerk-2 27,602

r Lerk-2 25,676

m Lerk-2 26,126

h Lerk-3 42,342

h Lerk-4 42,000

h Lerk-5 25,792

m Lerk-5 25,114

m Lerk-6 55,330
So wie der Ausdruck "Lerk-7" hier benutzt wird, bezeichnet er eine Gattung von Polypeptiden, die im Wesentlichen mit dem im Beispiel 1 beschriebenen menschlichen Lerk-7-Protein übereinstimmen. Die Polypeptide weisen vorzugsweise eine Aminosäuresequenz auf, die zu wenigstens 80% und stärker bevorzugt zu wenigstens 90% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 identisch ist, wie weiter unten näher beschrieben wird. Die Lerk-7-Polypeptide sind in der Lage, an die oben beschriebenen Rezeptoren, die mit hek und elk bezeichnet sind, zu binden. Bestimmte Anwendungen von Lerk-7 ergeben sich aus dieser Fähigkeit, an elk oder hek zu binden, wie weiter unten ausführlich beschrieben ist.
Außerdem bindet Lerk-7 an den eck (für: Epithelial Cell Kinase (engl.)) genannten Rezeptor, was in Lindberg und Hunter: Mol. Cell. Biol. 10: 6316, 1990, beschrieben ist. eck wird in Zelllinien epithelialen Ursprungs und in Geweben, die einen wesentlichen Anteil an Epithelzellen enthalten, vorherrschend exprimiert (Lindberg und Hunter: supra). Zellen, die eck exprimieren, schließen sowohl normale Zelltypen als auch Krebszelltypen ein (Lindberg and Hunter: supra). Weitere Anwendungen des Lerk-7 ergeben sich aus seiner Fähigkeit, eck zu binden, wie weiter unten beschrieben ist.
Es werden hier menschliche Lerk-7-Nucleinsäuren und -Proteine bereitgestellt. Außerdem fallen in den Rahmen der vorliegenden Erfindung Lerk-7-Nucleinsäuren und -Proteine, die von anderen Säugetierarten abstammen, die, ohne darauf beschränkt zu sein, Maus, Rind, Schwein, Pferd oder verschiedene Primatenspezies einschließen.
Die hier bereitgestellten Lerk-7-Polypeptide schließen Varianten natürlicher Lerk-7-Polypeptide, die eine biologische Aktivität eines natürlichen Lerk-7 beibehalten, ein. So, wie der Ausdruck "Lerk-7-Varianten" hier benutzt wird, bezeichnet er Polypeptide, die im Wesentlichen mit dem natürlichen Lerk-7 übereinstimmen, aber eine Aminosäuresequenz aufweisen, die wegen einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von jener eines natürlichen Lerk-7 verschieden ist. Ebenso schließen die Lerk-7 codierenden DNAs der vorliegenden Erfindung Varianten ein, die wegen einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von einer natürlichen Lerk-7-DNA-Sequenz abweichen, jedoch ein biologisch aktives Lerk-7-Polypeptid codieren. Wenn sich der Ausdruck "biologisch aktiv" auf Lerk-7 bezieht, gibt er an, dass das Lerk-7 fähig ist, an hek oder elk zu binden.
Die DNA- oder Aminosäurensequenz-Varianten sind vorzugsweise wenigstens zu 80% mit einer natürlichen Lerk-7-Sequenz identisch, am stärksten bevorzugt wenigstens zu 90% identisch. Der Prozentsatz der Identität kann beispielsweise durch Vergleichen der Sequenzinformationen mit dem GAP-Computerprogramm, Version 6.0, beschrieben von Devereux et. al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984), erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG), bestimmt werden. Die bevorzugten Parametervoreinstellungen für das GAP-Programm umfassen: (1) eine monadische Vergleichsmatrix (einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nichtidentitäten enthaltend) für Nucleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff (Hg.), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, S. 353–358, 1979, beschrieben; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche Strafe von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Strafe für Endlücken.
Varianten der Lerk-7-Polypeptide schließen folglich Lerk-7-Fragmente ein, die weiterhin fähig sind, an hek oder elk zu binden. Beispiele für beschnittene Lerk-7-Polypeptide im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind lösliche (sezernierte) Polypeptide.
Weitere Ausführungsformen von Aminosäuresequenzvarianten sind jene, die konservative Substitutionen aufweisen, was bedeutet, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Rest ersetzt ist, der ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Substitutionen schließen einen Austausch eines aliphatischen Rests gegen einen anderen, wie etwa Ile, Val, Leu oder Ala gegeneinander, oder einen Austausch eines polaren Rests gegen einen anderen, wie etwa zwischen Lys und Arg, Glu und Asp oder Gln und Asn ein. Weitere derartige konservative Substitutionen, beispielsweise ein Austausch ganzer Regionen mit ähnlichen hydrophoben Eigenschaften, sind wohl bekannt. Ein Aminosäuresubstitutionen aufweisendes Lerk-7 wird hier als konservativ substituiert angesehen, wenn das resultierende, nicht natürliche Polypeptid eine gewünschte biologische Aktivität des natürlichen Lerk-7 beibehält.
Die Erfindung schließt ferner Lerk-7-Polypeptide mit oder ohne Glykosylierung des zugeordneten natürlichen Musters ein. In Hefe- oder Säuger-Expressionssystemen (z.B. COS-7-Zellen) exprimiertes Lerk-7 kann, je nach Wahl des Expressionssystems, in Bezug auf Molekülgewicht und Glycosylierungsmuster einem natürlichen Lerk-7-Polypeptid ähnlich sein oder von diesem wesentlich verschieden sein. Eine Expression von Lerk-7-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen wie etwa E. coli liefert nicht glycosylierte Moleküle.
Die N-Glycosylierungsstellen in der extrazellulären Domäne des Lerk-7 können so modifiziert sein, dass eine Glycosylierung ausgeschlossen ist, wodurch analog in Säuger- und Hefe-Expressionssystemen die Expression eines homogeneren, reduzierten Kohlenhydrats möglich ist. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden zeichnen sich durch ein Aminosäurentriplett Asn-X-Y aus, wobei X irgendeine Aminosäure außer Pro ist und Y Ser oder Thr ist. Das menschliche Lerk-7-Protein der SEQ ID NO: 5 weist ein solches Triplett auf, nämlich an den Aminosäuren 17–19 der SEQ ID NO: 5. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen an der Nucleotidsequenz, die diese Tripletts codieren, werden die Verhinderung einer Anlagerung von Kohlenhydratresten an die Asn-Seitenkette zur Folge haben. Eine Veränderung eines einzigen Nucleotids, die beispielsweise so gewählt ist, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, reicht aus, um einen N-Glycosylierungsort zu inaktivieren. Bekannte Verfahren zur Inaktivierung von N-Glycosylierungsorten schließen jene ein, die in dem US-Patent 5,071,972 und in EP 276 846 beschrieben sind.
In einem weiteren Beispiel für Varianten können Sequenzen, die Cys-Reste codieren, die für die biologische Aktivität nicht unbedingt erforderlich sind, so verändert sein, dass dies zur Folge hat, dass die Cys-Reste entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt sind, um die Bildung von fehlerhaften innermolekularen Disulfidbrücken bei der Renaturierung zu vermeiden. Cystein-Reste, die den vier Cysteinen entsprechen, die von den Lerk-Proteinen beibehalten werden, sind an den Positionen 42, 70, 82 und 131 der SEQ ID No: 5 zu finden. Um die biologische Aktivität des natürlichen Proteins zu bewahren, sollten diese vier Cysteine unverändert bleiben.
Weitere Varianten sind durch Modifizieren benachbarter zweiwertiger Aminosäurereste hergestellt worden, um die Expression in Hefesystemen, in denen eine KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist, zu verstärken. EP 212 914 offenbart die Anwendung einer ortsspezifischen Mutagenese, um die KEX2-Protease-Processing-Stellen in einem Protein zu inaktivieren. Die KEX2-Protease-Processing-Stellen werden durch Deletieren, Addieren oder Substituieren von Resten inaktiviert, um Arg-Arg-, Arg-Lys-, und Lys-Arg-Paare so zu verändern, dass das Auftreten dieser benachbarten Basenreste beseitigt wird. Lys-Lys-Paarungen sind zu einer KEX2-Spaltung weit weniger fähig, und eine Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg in Lys-Lys stellt eine konservative und bevorzugte Methode zur Inaktivierung von KEX2-Stellen dar. Das menschliche Lerk-7 enthält zwei KEX2-Proteasen-Processing-Stellen, nämlich bei den Aminosäuren 78–79 und 128–129 der SEQ ID NO: 5.
Natürlich vorkommende Lerk-7-Varianten oder -Allele sind ebenfalls durch die Erfindung miterfaßt. Beispiele für solche Varianten sind Proteine, die aus alternativen mRNA-Spleißereignissen oder aus einer proteolytischen Spaltung des Lerk-7-Proteins resultieren, wobei die Fähigkeit, an elk oder hek zu binden, erhalten bleibt. Ein alternatives Spleißen von mRNA kann ein beschnittenes, jedoch biologisch aktives Lerk-7-Protein liefern, wie beispielsweise eine natürlich vorkommende lösliche Form des Proteins. Variationen, die der Proteolyse zuzuschreiben sind, schließen beispielsweise bei einer Expression in verschiedenen Typen von Wirtszellen auf Grund des proteolytischen Abbaus einer oder mehrerer der terminalen Aminosäuren von dem Lerk-7-Protein (im Allgemeinen etwa 1 bis 3 terminale Aminosäuren) Unterschiede bei dem N-Terminus oder dem C-Terminus ein.
Anhand der vorangehenden Diskussion des Signalpeptids und verschiedener Domänen des Lerk-7-Proteins wird der Fachmann erkennen, dass die oben beschriebenen Grenzen solcher Regionen des Proteins genähert sind. Beispielsweise kann, obwohl Computerprogramme zur Verfügung stehen, die die Spaltstelle eines Signalpeptids vorhersagen, die Spaltung an Stellen auftreten, die von diesen vorhergesagten verschieden sind. Ferner ist zu erkennen, dass infolge der Spaltung des Signalpeptids an mehr als einer Stelle ein Proteinpräparat ein Gemisch aus Proteinmolekülen mit unterschiedlichen N-terminalen Aminosäuren aufweisen kann. Außerdem kann die posttranslationale Weiterverarbeitung entsprechend dem bestimmten Expressionssystem, das benutzt wurde, verschieden sein. Folglich kann die N- oder C-terminale Aminosäure eines rekombinanten Proteins beispielsweise je nach dem Typ der Wirtszellen, in denen das Protein exprimiert wurde, verschieden sein.
Varianten und Derivate natürlicher Lerk-7-Proteine können durch Mutation der Nucleotidsequenzen, die natürliche Lerk-7-Polypeptide codieren, hergestellt werden. Mutationen können durch Synthetisieren von Oligonucleotiden, die eine Mutantensequenz flankiert von Restriktionsorten, die eine Ligation mit Fragmenten der natürlichen Sequenz ermöglichen, enthalten, an bestimmten Orten eingebracht werden. Nach der Ligation codiert die resultierende, wiederhergestellte Sequenz ein Analogon mit der gewünschten Aminosäure-Insertion, -Substitution oder -Deletion. Alternativ können auf Oligonucleotide gerichtete, ortspezifische Mutageneseverfahren benutzt werden, um eine gewünschte Mutation einzubringen. Verfahren, um derartige Veränderungen vorzunehmen, schließen jene ein, die von Walder u.a. (Gene 42: 133, 1986); Bauer u.a. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith u.a. (Generic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press., 1981); Kunkel (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985): Kunkel u.a. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); und in den US-Patenten Nr. 4,518,584 und 4,737,462 geoffenbart worden sind.
Lerk-7 kann so abgewandelt werden, dass durch Bilden kovalenter oder aggregativer konjugierter Verbindungen mit anderen chemischen Komponenten, wie etwa Glycosyl-Gruppen, Lipiden, Phosphat, Acetyl-Gruppen und dergleichen Lerk-7-Derivate geschaffen werden. Kovalente Derivate von Lerk-7 können durch Binden der chemischen Komponenten an funktionelle Gruppen an Lerk-7-Aminosäureseitenketten oder an den N-Terminus oder den C-Terminus eines Lerk-7-Polypeptids oder die extrazellulären Domäne davon hergestellt werden. Weitere Lerk-7-Derivate, die in den Rahmen dieser Erfindung fallen, schließen kovalente oder aggregative konjugierte Verbindungen von Lerk-7-Polypeptiden mit anderen Proteinen oder Polypeptiden, wie etwa durch Synthese in einer rekombinanten Kultur, als N-terminale oder C-terminale Fusionen ein.
Lerk-7-Polypeptidfusionen können Peptide aufweisen, die hinzugefügt worden sind, um das Reinigen und Identifizieren von Lerk-7 zu erleichtern. Derartige Peptide schließen beispielsweise poly-His oder die in dem US-Patent Nr. 5 011 912 und in Hopp et. al.: Bio/Technology 6: 1204, 1988, beschriebenen Antigenerkennungspeptide ein. Ein solches Peptid ist das Flag^®-Peptid, Asp- Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, das stark antigen ist und mit einem Epitop ausgestattet ist, das mittels eines spezifischen monoklonalen Antikörpers reversibel gebunden ist, wodurch eine schnelle Prüfung und eine einfache Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht wird. Ein Maus-Hybridom mit der Bezeichnung 4E11 erzeugt einen monoklonalen Antikörper, der das Flag^®-Peptid bei Vorhandensein bestimmter zweiwertiger Metall-Kationen bindet, wie in dem US-Patent 5,011,912 beschrieben ist. Die 4E11-Hybridom-Zelllinie ist bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer HB 9259 hinterlegt worden. Monoklonale Antikörper, die das Flag^®-Peptid binden, sind von Eastman Kodak Co., Scientific Imaging Systems Division, New Haven, Connecticut erhältlich.
Wegen der bekannten Degeneration des genetischen Codes, bei welcher mehr als ein Codon dieselbe Aminosäure codieren kann, ist es möglich, dass eine DNA-Sequenz von jener, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist, abweicht und immer noch ein Lerk-7-Protein codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 aufweist. Derart unterschiedliche DNA-Sequenzen können die Folge stiller Mutationen (die z.B. während der PCR-Amplifikation auftreten) oder das Ergebnis einer absichtlich herbeigeführten Mutagenese einer natürlichen Sequenz sein. Die vorliegende Erfindung stellt folglich isolierte DNA-Sequenzen bereit, die aus natürlichen Lerk-7-DNA-Sequenzen (z.B. cDNA, welche die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Nucleotidsequenz aufweist) und DNA, die als Folge des genetischen Codes für eine natürliche Lerk-7-DNA-Sequenz degeneriert ist, ausgewählt sind.
Lerk-7-Varianten mit der Fähigkeit, hek oder elk zu binden, können durch jeden geeigneten Test identifiziert werden. Die biologische Aktivität einer Lerk-7-Variante kann beispielsweise bestimmt werden, indem die Fähigkeit der Variante, mit einem natürlichen Lerk-7 um die Bindung an hek oder elk zu konkurrieren, geprüft wird (kompetitiver Bindungsassay).
Kompetitive Bindungsassays können unter Befolgung der herkömmlichen Verfahrensweise durchgeführt werden. Reagenzien, die in kompetitiven Bindungsassays eingesetzt werden können, schließen radioaktiv markiertes, lösliches Lerk-7 und intakte hek/elk-exprimierende Zellen ein. Beispielsweise kann radioaktiv markiertes natürliches Lerk-7 eingesetzt werden, das mit einer Lerk-7-Variante um die Bindung an zelloberflächengebundenes hek oder elk konkurriert. Anstelle von intakten Zellen könnte man ein lösliches hek/Fc- oder elk/Fc-Fusionsprotein, das an eine feste Phase gebunden ist, durch die Interaktion von Protein A oder Protein B mit dem Fe-Anteil ersetzen. Protein A und Protein G enthaltende Chromatographiesäulen schließen jene ein, die von Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, erhältlich sind. Ein weiterer Typ kompetitiver Bindungsassays verwendet radioaktiv markiertes, lösliches hek oder elk, wie etwa ein lösliches hek/Fc- oder elk/Fc-Fusionsprotein, und intakte Zellen, die Lerk-7 exprimieren. Qualitative Ergebnisse können mittels kompetitiver autoradiographischer Bindungsassays erzielt werden. Oder es können Scatchard-Plots benutzt werden, um quantitative Ergebnisse hervorzubringen.
Die biologische Aktivität eines natürlichen Lerk-7-Proteins oder eines Fragments davon, das in einem bestimmten Expressionssystem exprimiert wurde, kann mit kompetitiven Bindungsassays bestätigt werden. Beispielsweise kann das Lerk-7 auf die Fähigkeit, mit einem der anderen Lerk-Proteine (z.B. Lerk-6) um die Bindung an elk oder hek zu konkurrieren, geprüft werden.
Außerdem bindet Lerk-7 an den als eck bekannten Rezeptor (Lindberg and Hunter: Mol. Cell. Biol. 10: 6316, 1990). Es ist möglich, dass das Lerk-7 der vorliegenden Erfindung an weitere Rezeptoren der eph-Familie binden wird (siehe den Abschnitt zum Hintergrund der Erfindung). Eine solche Bindung kann mit einem geeigneten Assay, der zu jenen, die weiter oben und in den Beispielen 4 und 7 beschrieben sind, analog ist, analysiert werden.
Anwendungen des Lerk-7, die sich aus der Fähigkeit, an elk, hek und eck zu binden, ergeben, schließen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Folgendes ein. Lerk-7 findet Anwendung als Proteinreinigungsreagens. Lerk-7-Polypeptide können an ein festes Trägermaterial angelagert und verwendet werden, um hek-, elk- oder eck-Proteine mittels Affinitätschromatographie zu reinigen. In bestimmten Ausführungsformen sind Lerk-7-Fragmente oder -Fusionsproteine (z.B. Lerk-7/Fc-Fusionen), die die Rezeptor-Bindungsdomäne des Lerk-7 enthalten, an dem festen Träger angelagert. Lerk-7-Polypeptide können mittels herkömmlicher Verfahren an ein festes Trägermaterial angelagert werden. Beispielsweise sind Chromatographiesäulen erhältlich (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ), die funktionelle Gruppen enthalten, die mit funktionellen Gruppen an Aminosäure-Seitenketten von Proteinen reagieren werden. Lerk-7/Fc-Fusionsproteine können durch Interaktion mit der Fc-Komponente an Chromatographiesäulen, die Protein A oder Protein B enthalten, angelagert werden.
Außerdem finden Lerk-7-Proteine bei der Reinigung von Zellen Anwendung, die hek, elk oder eck an der Zelloberfläche exprimieren. Das Lerk-7 (oder Fragmente oder Fusionen davon) ist (sind) an eine feste Phase wie etwa eine säulenchromatographische Matrix oder ein ähnliches geeignetes Substrat gebunden. Beispielsweise können magnetische Mikrokügelchen mit Lerk-7 beschichtet und in einem Inkubationsgefäß in einem Magnetfeld gehalten werden. Suspensionen aus Zellgemischen, die hek/elk/eck-exprimierende Zellen enthalten, werden mit der festen Phase, auf der sich Lerk-7 befindet, in Kontakt gebracht. Zellen, die hek oder elk oder eck an der Zelloberfläche exprimieren, binden an das fixierte Lerk-7, und ungebundene Zellen werden dann ausgewaschen. Dieses Affinitätsbindungsverfahren ist zweckmäßig für ein Reinigen oder Identifizieren solcher hek/elk/eck-exprimierender Zellen.
Fachleuten sind Verfahren zum Freisetzen eindeutig ausgewählter Zellen aus der Festphase bekannt, die beispielsweise die Anwendung von Enzymen beinhalten. Geeignete Enzyme sind nicht toxisch und unschädlich für die Zellen und vorzugsweise auf die Spaltung der hek- oder elk- oder eck-Proteine gerichtet, wodurch die resultierende Zellsuspension von "fremdem" Lerk-7-Material befreit wird.
Die Zellpopulation, die gereinigt wurde, vor allem wenn sie aus fötalem Gewebe gewonnen ist, kann dann benutzt werden, um reife (adulte) Gewebe wiederzubesiedeln. Beispielsweise können Nervenzellen, die elk exprimieren, mittels der vorhergehenden Prozedur isoliert und dann einem Säuger, der an einer neurodegenerativen Erkrankung leidet, verabreicht werden.
Alternativ können Zellgemische, von denen vermutet wird, dass sie hek/elk⁺-Zellen enthalten, zuerst mit biotinyliertem Lerk-7 inkubiert werden. Die Inkubationsdauern umfassen typisch wenigstens eine Stunde, um eine ausreichende Bindung an helk/elk sicherzustellen. Das resultierende Gemisch wird dann durch eine mit avidinbeschichteten Perlen bepackte Säule laufen gelassen, wobei die starke Affinität des Biotins in Bezug auf Avidin für die Bindung der Zelle an die Perlen sorgt. Die Verwendung von avidinbeschichteten Perlen ist Fachleuten bekannt, siehe Berenson u.a.: J. Cell. Biochem., 10D: 239 (1986). Das Auswaschen ungebundenen Materials und das Lösen der gebundenen Zellen erfolgen mit herkömmlichen Verfahren.
Lerk-7 kann folglich zur Abtrennung oder Reinigung der oben beschriebenen Zelltypen, die hek oder elk exprimieren, benutzt werden. Außerdem findet Lerk-7 bei der Identifizierung weiterer Zelltypen, die hek oder elk an der Zelloberfläche exprimieren, Anwendung. Lerk-7 kann mit einer nachweisbaren Komponente, wie etwa einem radioaktiven Nuklid, konjugiert werden, um hek/elk-exprimierende Zellen nachzuweisen. Beispielsweise kann ein radioaktives Markieren mit ¹²⁵I mittels irgendeiner der verschiedenen üblichen Verfahrensweisen durchgeführt werden, die zu einem funktionsfähigen ¹²⁵I-Lerk-7-Molekül führt, das für eine hochspezifische Aktivität markiert ist. Es kann eine andere nachweisbare Komponente, wie etwa ein Enzym, das eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysieren kann, Biotin oder Avidin verwendet werden. Zellen die hinsichtlich einer hek/elk-Expression getestet werden sollen, können mit markiertem Lerk-7 zusammengebracht werden. Nach einem Inkubieren wird das ungebundene markierte Lerk-7 entfernt, und es wird das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der nachweisbaren Komponente an den Zellen bestimmt.
Außerdem können Lerk-7-Proteine benutzt werden, um die biologische Aktivität von elk- oder hek-Proteinen als Bindungsaffinität gegenüber Lerk-7 zu messen. Lerl-7-Proteine finden folglich Anwendung als Reagenzien, die von jenen benutzt werden können, die Untersuchungen zur "Qualitätssicherung" durchführen, z.B. um die Lagerfähigkeit und Stabilität von elk- oder hek-Protein unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. In weiteren Beispielen wird Lerk-7 benutzt, um festzustellen, ob nach einer Modifikation eines elk- oder hek-Proteins (z.B. durch chemische Modifikation, Stutzen, Mutation usw.) die biologische Aktivität erhalten geblieben ist. Die biologische Aktivität eines elk- oder hek-Proteins kann folglich festgestellt werden, bevor es beispielsweise bei einer wissenschaftlichen Untersuchung oder möglicherweise in der Klinik eingesetzt wird.
Zur Veranschaulichung: Lerk-7 wird bei einer Bindungsaffinitätsuntersuchung benutzt, um die biologische Aktivität eines elk-Proteins zu messen, das bei verschiedenen Temperaturen aufbewahrt wurde oder das in verschiedenen Zelltypen produziert wurde. Die Bindungsaffinität des modifizierten elk-Proteins gegenüber Lerk-7 wird mit jener eines nicht modifizierten elk-Proteins verglichen, um jede negative Auswirkung der Modifikationen auf die biologische Aktivität des elk festzustellen. Genauso kann die biologische Aktivität eines hek-Proteins mit Lerk-7 geprüft werden.
Lerk-7-Polypeptide finden außerdem als Träger Anwendung, um Agenzien, die daran angelagert sind, an Zellen zu liefern, die den elk- oder hek-Zelloberflächenrezeptor aufweisen. Eine Expression eines hek-Antigens ist für bestimmte Leukämie-Zelllinien einschließlich der menschlichen T-Zellen-Leukämiezellline, die mit JM bezeichnet ist, und der menschlichen Pre-B-Zellen-Leukämiezelllinie, die mit LK63 bezeichnet ist, berichtet worden (Boyd et. al.: J. Biol. Chem. 267: 3262, 1992, und Wicks et. al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1611, 1992). Lerk-7-Proteine können folglich benutzt werden, um an diese Zellen (oder an andere Zelltypen, die nachweislich hek oder elk an der Zelloberfläche exprimieren) in in vitro- oder in in vivo-Verfahren diagnostische oder therapeutische Agenzien zu liefern.
Ein Beispiel für eine solche Anwendung ist, eine hek⁺-Leukämiezelllinie einer therapeutischen Agens/Lerk-7-Konjugat auszusetzen, um abzuschätzen, ob das Agens eine Zytotoxizität in Bezug auf die Leukämiezellen zeigt. In einem Assay, um die zytotoxische Wirkung der Agenzien auf die Leukämiezellen zu erfassen und zu vergleichen, kann eine Anzahl verschiedener therapeutischer Agenzien, die an Lerk-7 angelagert sind, enthalten sein. Es können Konjugate von Lerk-7 und diagnostischen Agenzien benutzt werden, um das Vorhandensein von hek⁺-Zellen in vitro oder in vivo nachzuweisen.
Diagnostische und therapeutische Agenzien, die an ein Lerk-7-Polypeptid angelagert werden können, schließen Arzneimittel, Toxine, Radionuklide, Chromophore, Enzyme, die eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysieren und dergleichen ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, wobei das bestimmte Agens entsprechend der beabsichtigten Anwendung gewählt ist. Beispiele für Arzneimittel schließen jene ein, die bei der Behandlung verschiedener Formen von Krebs eingesetzt werden, z.B. Chlormethin wie etwa L-Phenylalanin-Chlormethin oder Cyclophosphamid, interkalierende Agenzien wie etwa cis-Diaminodichloroplatin, Antimetabolite wie etwa 5-Fluorouracil, Vinca-Alkaloide wie etwa Vincristin und Antibiotika wie etwa Bleomycin, Doxorubicin, Daunorubicin und Derivate davon. Unter den Toxinen sind Ricin, Abrin, Diphterietoxin, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, ribosomale inaktivierende Proteine, Mycotoxine wie etwa Trichothecene und Derivate und Fragmente (z.B. Einzelkette) davon. Radionuklide, die sich für Diagnosezwecke eignen, schließen ¹²³I, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br ein, ohne hierauf beschränkt zu sein. Radionuklide, die sich für therapeutische Zwecke eignen, schließen ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu und ⁶⁷Cu ein, ohne hierauf beschränkt zu sein.
Derartige Agenzien können mittels eines geeigneten herkömmlichen Verfahrens an das Lerk-7 angelagert werden. Lerk-7, das ein Protein ist, weist funktionelle Gruppen an Aminosäureseitenketten auf, die mit funktionellen Gruppen an einem gewünschten Agens zur Reaktion gebracht können, um beispielsweise kovalente Bindungen auszubilden. Alternativ kann das Protein oder Agens in ein Derivat überführt werden, um eine gewünschte reaktive funktionelle Gruppe zu erzeugen oder zu binden. Die Derivatisierung kann mit dem Anlagern eines der bifunktionalen Kupplungsreagenzien einhergehen, die für ein Anlagern verschiedener Moleküle an Proteine zur Verfügung stehen (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Es ist eine Anzahl von Techniken zur radioaktiven Markierung von Proteinen bekannt. Beispielsweise können Radionuklidmetalle unter Verwendung eines geeigneten bifunktionalen Chelatbildners an Lerk-7 angelagert werden.
So werden Konjugate hergestellt, die Lerk-7 und ein geeignetes diagnostisches oder therapeutisches Agens aufweisen (vorzugsweise kovalent gebunden). Die Konjugate werden in einer Menge, die für die bestimmte Anwendung angebracht ist, verabreicht oder anderweitig eingesetzt.
Eine weitere Anwendung des Lerk-7 der vorliegenden Erfindung ist jene als Forschungswerkzeug, um die Rolle zu untersuchen, die Lerk-7 in Verbindung mit elk oder hek für das Wachstum oder die Differenzierung von Zellen, die den elk- oder hek-Rezeptor aufweisen, spielen kann. Außerdem können die Lerk-7-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in in vitro-Assays für den Nachweis von elk oder Lerk-7 oder deren gegenseitige Beeinflussung verwendet werden. Genauso findet Lerk-7 in Assays für hek oder die gegenseitige Beeinflussung von Lerk-7 und hek Anwendung. Es ist auf die Möglichkeit hingewiesen worden, dass hek bei der Tumorgenese eine Rolle spielen könnte (Boyd et. al.: supra). Das Lerk-7-Protein ist nützlich bei der Erforschung, welche Wirkung die Bindung von Lerk-7 an hek auf die Tumorgenese haben könnte.
Obwohl hier einige Anwendungen von Lerk-7 mit Bezug auf die Eigenschaft der elk-Bindung oder der hek-Bindung des Lerk-7 veranschaulicht worden sind, ist selbstverständlich, dass sich gleichartige Anwendungen aus der Fähigkeit des Lerk-7, an eck zu binden, ergeben. Beispiele für Krebszelltypen, die eck exprimieren, sind die menschliche Epitheliom-Zelllinie HeLa, eine menschliche Epidermis-Karzinomzellline mit der Bezeichnung A431 (Lindberg und Hunter: supra), Melanom-Zelllinien (Easty et. al.: Cancer Research 55: 2528, 1995) und die menschliche Colon-Adenokarzinom-Zelllinie HT29. Lerk-7 kann benutzt werden, um diagnostische oder therapeutische Agenzien an solche Zellen zu liefern, wie weiter oben in Bezug auf hek aufweisende Zellen diskutiert worden ist.
Lerk-7-Nucleinsäuren können benutzt werden, um Defekte des Lerk-7-Gens festzustellen, z.B. in einem in vitro-Test, der an DNA-Proben durchgeführt wird, die von einem Individuum stammen, das auf einen solchen Defekt untersucht werden soll. DNA der vorliegenden Erfindung kann benutzt werden, um z.B. in Gentherapieprozeduren defekte Lerk-7-Gene zu ersetzen.
Wie weiter oben diskutiert worden ist, wurden bei der Untersuchung verschiedener Rattengewebe auf elk-mRNA nur in Hirn und Hoden Transkripte festgestellt (Lhotak u.a.: supra). Ein Binden von Lerk-7 an elk an Nervengewebe kann eine das Nervengewebe schützende oder versorgende Wirkung haben.
Lerk-7 findet als Gewebekulturreagens Anwendung. Ein Lerk-7-Protein kann zu in vitro kultivierten Neuronen hinzugefügt werden, um die Vermehrungsfähigkeit zu verbessern oder um die Lebenszeit der kultivierten Neuronen zu verlängern, wodurch wissenschaftliche Untersuchungen und eine mögliche klinische Behandlung von Nervengewebe vereinfacht werden.
Es ist festgestellt worden, dass das oben beschriebene Lerk-2-Protein eine neurotrophe Wirkung auf Neuronen des Hippocampus hat und die Neuronen gegen eine glutamatvermittelte Erregungstoxizität schützt. Genauso kann Lerk-7 Eigenschaften des Schutzes oder der Versorgung von Nervengewebe zeigen. Lerk-7 kann folglich bei einem Verfahren zur Behandlung von Nervengewebserkrankungen Anwendung finden, wobei das Verfahren mit sich bringt, Lerk-7 mit dem Nervengewebe in Kontakt zu bringen. Solche Erkrankungen schließen Verletzungen oder neurologische Erkrankungen, die entweder chronisch oder akut sind, ein. Es wird hier die Verwendung von Lerk-7 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen oder Verletzungen von Nervengewebe in Betracht gezogen.
Es werden hier Zusammensetzungen bereitgestellt, die eine wirksame Menge eines Lerk-7-Polypeptids der vorliegenden Erfindung in Kombination mit weiteren Komponenten wie etwa einem geeigneten Verdünnungs-, Träger- oder Excipient aufweisen. Lerk-7 kann nach bekannten Verfahren, die verwendet werden, um pharmazeutisch anwendbare Zusammensetzungen herzustellen, formuliert werden. Lerk-7 kann in einer Beimischung, entweder als einziger Wirkstoff oder zusammen mit weiteren bekannten Wirkstoffen, mit für pharmazeutische Zwecke geeigneten Verdünnungsmitteln (z.B. Salzlösung, Tris-HCl, Acetat und Phosphatpufferlösungen), Konservierungsmitteln (z.B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgierungsmitteln, Lösungsvermittlern, Zusatzstoffen und/oder Trägermitteln kombiniert werden. Geeignete Trägermittel und ihre Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl. 1980, Mack Publishing Company, beschrieben.
Außerdem können derartige Zusammensetzungen Lerk-7 im Komplex mit Polyethylenglycol (PEG) Metallionen enthalten, oder in polymere Verbindungen wie etwa Polyessigsäure, Polyglycolsäure, Hydrogele, Dextran usw. eingebaut sein oder in Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, aus einer oder vielen Schichten zusammengesetzte Vesikel, leere Erythrozytenmembranen oder Sphäroplasten eingebaut sein. Derartige Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität, die in vivo-Freisetzungsrate und die in vivo-Eliminierungsrate des Lerk-7 beeinflussen, weshalb sie entsprechend der beabsichtigten Anwendung gewählt werden. Als eine Alternative ist Lerk-7 über GPI an ein Substrat gebunden, wobei das Substrat aus physiologisch verträglichem Material besteht, das eine chemische Zusammensetzung aufweist, die sich für ein Anlagern von Lerk-7 über GPI-Bindungen eignet. Das das Lerk-7 tragende Substrat kann durch einen chirurgischen Eingriff implantiert werden. Außerdem kann Lerk-7 mit Antikörpern gegen gewebespezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigene gepaart werden oder an Liganden gewebespezifischer Rezeptoren gekoppelt werden.
Derartige Zusammensetzungen können ein Lerk-7-Polypeptid in irgendeiner hier beschriebenen Form enthalten, etwa in Form von natürlich vorkommenden Proteinen, Varianten, Derivaten, biologisch aktiven Fragmenten oder Oligomeren. In einer Ausführungsform weist die Zusammensetzung ein lösliches Lerk-7-Polypeptid auf.
Lerk-7 kann auf jede geeignete Weise verabreicht werden, z.B. topisch, parenteral oder durch Inhalation. Der Ausdruck "parenteral" schließt Injektionen, z.B. über den subkutanen, intravenösen oder intramuskulären Weg ein, wobei auch örtlich genau festgelegte Injektionen, z.B. am Ort der Erkrankung oder Schädigung eingeschlossen sind. Eine anhaltende Freisetzung aus Implantaten wird ebenfalls in Erwägung gezogen. Geeignete Dosierungen und angestrebte Konzentrationen der in den Zusammensetzungen enthaltenen Arzneimittel können in Abhängigkeit von vielen Faktoren einschließlich der beabsichtigten Verwendung, des Körpergewichts und des Alters des Patienten sowie des Verabreichungsweges verschieden sein. Vorläufige Dosierungen können anhand von Tierversuchen bestimmt werden, und die Zuordnung der Dosierungen für eine Verabreichung an den Menschen kann entsprechend den im Fachgebiet allgemein anerkannten Methoden durchgeführt werden.
Oligomere Formen von Lerk-7
Die vorliegende Erfindung schließt Lerk-7-Polypeptide in Form von Oligomeren, wie etwa kovalent gebundene oder nicht kovalent gebundene Dimere, Trimere oder höhere Oligomere ein. Solche Oligomere können natürlich vorkommen oder mittels rekombinanter DNA-Technologie erzeugt sein. Oligomere können durch Disulfid-Bindungen, die sich zwischen Cystein-Resten an verschiedenen Lerk-7-Polypeptiden ausbilden, verkettet werden.
Oligomere der vorliegenden Erfindung schließen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, zwei bis vier Lerk-7-Polypeptide aufweisende Oligomere ein. In einer Ausführungsform sind die Lerk-7-Polypeptide löslich.
Als eine Alternative wird ein Lerk-7-Oligomer unter Verwendung von Polypeptiden hergestellt, die von Immunglobulinen abgeleitet sind. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die bestimmte heterologe Polypeptide aufweisen, die mit verschiedenen Abschnitten von Polypeptiden, die von Antikörpern abgleitet sind, (einschließlich der Fc-Domäne) verschmolzen werden, ist z.B. von Ashkenazi et. al. (PNAS USA 88: 10535, 1991), Byrn et. al. (Nature 344: 677, 1990) und Hollenbaugh et. al. (Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, 1992, S. 10.19.1–10.19.11) beschrieben worden und hierin durch die Bezugnahme aufgenommen. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf ein Lerk-7-Dimer gerichtet, das durch Fusionieren von Lerk-7 mit der Fc-Region eines Antikörpers (z.B. IgG1) in einer Art und Weise, die eine Bindung des Lerk-7 an die hek- oder elk-Ligandenbindungsdomäne nicht stört, gebildet wird.
Eine Genfusion, die das Lerk-7/Fc-Fusionsprotein codiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Lerk-7/Fc-Fusionsproteine werden in mit dem rekombinanten Expressionsvektor transformierten Wirtszellen exprimiert, und es wird ihnen ermöglicht, sich ganz wie Antikörper-Moleküle zusammenzufinden, woraufhin sich zwischen den Ketten der Fc-Polypeptide Disulfid-Bindungen ausbilden, die zu einem bivalenten Lerk-7 führen. Wenn Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch mit leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein Lerk-7-Oligomer mit nicht weniger als vier Lerk-7-Extrazellulärregionen zu bilden.
Es werden hier Fusionsproteine bereitgestellt, die ein Lerk-7-Polypeptid aufweisen, das mit einem von einem Antikörper abgeleiteten Fc-Polypeptid verschmolzen ist. Außerdem werden sowohl die DNA, die derartige Fusionsproteine codiert, als auch Dimere, die zwei Fusionsproteine enthalten, die über Disulfid-Bindungen zwischen den Fc-Komponenten davon verbunden sind, bereitgestellt. So, wie der Ausdruck "Fc-Polypeptid" hier benutzt wird, schließt er natürliche und mutierte Formen von Polypeptiden, die von der Fc-Region eines Antikörpers abgleitet sind, ein. Gestutzte Formen derartiger Polypeptide, die die Gelenkregion enthalten, die eine Dimerisation begünstigt, sind ebenfalls eingeschlossen. Ein geeignetes Fc-Polypeptid, das in der PCT-Anmeldung WO 93/10 151 beschrieben ist, ist ein einkettiges Polypeptid, das sich von der N-terminalen Gelenkregion zu dem natürlichen C-Terminus erstreckt. Ein Mutein dieses Fc-Polypeptids ist im Beispiel 3 weiter unten beschrieben. Das Mutein zeigt eine geringere Affinität gegenüber Fc-Rezeptoren.
Ein Verfahren zur Herstellung von oligomerem Lerk-7 geht mit der Verwendung eines Leucinzippers einher. Leucinzipperdomänen sind Peptide, die eine Oligomerisierung der Proteine, in denen sie anzutreffen sind, begünstigen. Leucinzipper wurden ursprünglich in einigen DNA-Bindungsproteinen identifiziert (Landschulz et. al.: Science 240: 1759, 1988) und sind seitdem in einer Vielzahl von verschiedenen Proteinen gefunden worden. Unter den bekannten Leucinzippern sind natürlich vorkommende Peptide und Derivate davon, die dimerisieren oder trimerisieren. Beispiele für Leucinzipperdomänen, die für die Herstellung löslicher Oligomerproteine anwendbar sind, sind in der PCT-Anmeldung WO 94/10 308 beschrieben. In einer Ausführungsform werden rekombinante Fusionsproteine, die ein lösliches Lerk-7-Polypeptid aufweisen, das mit einem Peptid fusioniert ist, das in Lösung dimerisiert oder trimerisiert, in geeigneten Wirtszellen exprimiert. Aus dem Kulturmedium werden lösliche Lerk-7-Oligomere zurückgewonnen.
Alternativ ist das Oligomer ein Fusionsprotein, das mehrere Lerk-7-Polypeptide mit oder ohne Zwischenraum-Peptide zwischen den Lerk-7-Komponenten aufweist. Derartige Fusionsproteine werden mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt. In einer Ausführungsform enthält ein Fusionsprotein zwei oder mehr lösliche Lerk-7-Polypeptide, die durch Peptid-Linker voneinander getrennt sind.
Die Oligomere weisen die Besonderheit bivalenter, trivalenter usw. Bindungsstellen für elk oder hek auf. Ferner bieten die oben beschriebenen Fusionsproteine, die Fc-Komponenten (und daraus gebildete Oligomere) aufweisen, den Vorteil einer problemlosen Reinigung durch Affinitätschromatographie über Protein A- oder Protein G-Säulen.
Expressionssysteme
Geeignete Wirtszellen für eine Expression von Lerk-7-Polypeptiden schließen prokaryotische Zellen, Hefezellen oder höhere eukaryotische Zellen ein. Entsprechende Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit Bakterien-, Pilz-, Hefe- und Säugerwirtszellen sind beispielsweise in Pouwels u.a.: Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985), beschrieben. Zellfreie Translationssysteme könnten ebenfalls benutzt werden, um unter Verwendung von RNAs, die von hier offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind, Lerk-7-Polypeptide herzustellen.
Der Expressionsvektor kann DNA enthalten, die ein Signal- oder Leitpeptid codiert, das mit dem N-Terminus eines Lerk-7-Polypeptids fusioniert ist. Das Signal- oder Leitpeptid leitet eine co-translationale oder post-translationale Übertragung des Lerk-7 von seinem Syntheseort zu einem Ort innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand. Das Signal- oder Leitpeptid wird von dem reifen Lerk-7-Polypeptid abgespaltet. Die Wahl des Signal- oder Leitpeptids ist vom Wirtszellentyp, der verwendet werden soll, abhängig.
Für eine Transformation geeignete prokaryotische Wirtszellen schließen beispielsweise E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen Pseudomonas, Streptomyces and Staphylococcus ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle wie etwa E. coli kann ein Lerk-7-Polypeptid einen N-terminalen Methionin-Rest aufweisen, der die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle erleichtert. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten, rekombinanten Lerk-7-Polypeptid abgespaltet werden.
Lerk-7-Polypeptide können in Hefe-Wirtszellen, vorzugsweise von der Gattung Saccharomyces (z.B. S. cerevisiae), exprimiert werden. Es können auch andere Hefegattungen wie etwa Pichia, K. lactis oder Kluyveromyces verwendet werden. Hefevektoren können eine Replikationsstartsequenz von einem 2μ-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für eine Polyadenylierung, Sequenzen für den Transkriptionsterminator und ein wählbares Markierungsgen aufweisen.
Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen unter anderen Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et. al.: J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et. al.: J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et. al.: Biochem. 17: 4900, 1978) wie etwa Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase ein. Eine weitere Alternative ist der von Russell et. al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et. al. (Nature 300: 724, 1982) beschriebene glucosehemmende ADH2-Promotor. Weitere zur Verwendung bei der Hefeexpression geeignete Vektoren und Promotoren sind ferner in Hitzeman, EPA-73 657 oder in Fleer et. al.: Gene, 107: 285–195 (1991); und van den Berg et. al.: Bio/Technology, 8: 135–139 (1990) beschrieben. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefe als auch in E. coli replizierbar sind, können durch Einfügen von DNA-Sequenzen von pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r-Gen und Replikationsstartpunkt) in die oben beschriebenen Hefevektoren gebildet werden.
Es kann eine geeignete Leadersequenz (z.B. der α-Faktor-Leader von Saccharomyces) benutzt werden, welche die Absonderung des Lerk-7-Polypeptids von Hefezellen leitet. Die α-Faktor-Leader-Sequenz wird im Allgemeinen zwischen die Promotorsequenz und die Strukturgensequenz eingefügt, siehe z.B. Kurjan et. al.: Cell 30: 933, 1982; Bitter u.a.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984; das US-Patent 4,546,082 und EP 324 274 . Weitere Leadersequenzen, die geeignet sind, die Absonderung rekombinanter Polypeptide von Hefewirtszellen zu erleichtern, sind dem Fachmann bekannt. Eine Leadersequenz kann nahe ihres 3'-Endes so modifiziert sein, dass sie einen oder mehrere Restriktionsorte enthält. Dies wird die Fusion der Leadersequenz mit dem Strukturgen vereinfachen.
Dem Fachmann sind Methodenvorschriften für die Transformation von Hefen bekannt. Eine solche Methodenvorschrift ist von Hinnen et. al. in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978, beschrieben. Die Methodenvorschrift nach Hinnen u.a. wählt Trp⁺-Transformanten in einem selektiven Medium aus, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoffbase, 0,5% Caseinhydrolysat (casamino acid), 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Mit eine ADH2-Promotorsequenz enthaltenden Vektoren, transformierte Hefe-Wirtszellen können herangezogen werden, um die Expression in einem "reichen" Medium zu bewirken. Ein Beispiel für ein reiches Medium ist ein solches, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, angereichert mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil, besteht. Eine Derepression des ADH2-Promotors findet statt, wenn die Glucose in dem Medium erschöpft ist.
Außerdem könnten Säuger- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme benutzt werden, um rekombinante Lerk-7-Polypeptide zu exprimieren. Baculovirussysteme für die Produktion von heterologen Proteinen in Insektenzellen wurden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988) untersucht. Von Säugern stammende etablierte Zelllinien können ebenfalls benutzt werden. Beispiele für geeignete Säuger-Wirtszelllinien schließen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651; Gluzman et. al.: Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), HeLa-Zellen, die BHK-(ATCC CRL 10)Zelllinie und die CV1/EBNA-1-Zelllinie, die aus der AGMK-Zelllinie CV1 (ATCC CCL 70) gewonnen wurde, wie von McMahan et. al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben ist, ein.
Transkriptions- und Translationssteuerungssequenzen für Säugerwirtszellen-Expressionsvektoren können aus Virusgenomen ausgeschnitten werden. Gemeinhin benutzte Promotorsequenzen und Enhancersequenzen stammen vom Polyomavirus, Adenovirus 2, Simianvirus 40 (SV40) und von dem menschlichen Zytomegalievirus. DNA-Sequenzen, die aus dem Virusgenom SV40 gewonnen sind, beispielsweise SV40-Startpunkt, früher und später Promotor, Enhancer, Spalt- und Polyadenylationsstellen, können benutzt werden, um weitere genetische Elemente für eine Expression einer Strukturgensequenz in einer Säugerwirtszelle zu schaffen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders zweckmäßig, denn sie werden beide leicht als Fragment aus einem Virusgenom gewonnen, wobei das Fragment außerdem einen viralen Replikationsstartpunkt enthalten kann. (Fiers et. al.: Nature 273: 113, 1978). Es können auch kürzere oder längere SV40-Fragmente benutzt werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 Basenpaare umfassende Sequenz, die sich von der Stelle Hind III zu der Stelle Bgl I erstreckt, die sich in dem SV40-viralen Replikationsstartpunkt befindet, ist eingeschlossen.
Beispiele für Expressionsvektoren für die Verwendung in Säugerwirtszellen können wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Mol. 3: 280, 1983) offenbart konstruiert werden. Ein System, das für eine stabile starke Expression von Säuger-cDNAs in C127-Maus-Brustepithelzellen zweckmäßig ist, kann im Wesentlichen wie von Cosman et. al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben konstruiert werden. Ein zweckmäßiger starker Expressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et. al.: Nature 312: 768, 1984, ist als ATCC 39 890 hinterlegt worden. Weitere zweckmäßige Säuger- Expressionsvektoren sind in EP-A-0 367 566 und in WO 91/18 982 beschrieben. Die Vektoren können aus Retroviren gewonnen sein. Anstelle der natürlichen Signalsequenz kann eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, etwa die Signalsequenz für IL-7, die in dem US-Patent 4,965,195 beschrieben ist, die Signalsequenz für den IL-2-Rezeptor, die in Cosman et. al.: Nature 312: 768 (1984) beschrieben ist; das IL-4-Signalpeptid, das in EP 367 566 beschrieben ist, das IL-1-Rezeptorsignalpeptid vom Typ I, das in dem US-Patent 4,968,607 beschrieben ist, und das IL-1-Rezeptorsignalpeptid vom Typ II, das in EP 460 846 beschrieben ist.
Lerk-7-Protein
Lerk-7-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können mittels rekombinanter Expressionssysteme wie oben beschrieben hergestellt oder aus in der Natur vorkommenden Zellen gereinigt werden. Ein Verfahren zur Herstellung von Lerk-7 weist das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine Lerk-7 codierende DNA-Sequenz aufweist, unter Bedingungen, die ausreichen, um die Expression von Lerk-7 zu begünstigen, auf. Das Lerk-7 wird dann je nach verwendetem Expressionssystem aus dem Kulturmedium oder aus Zellextrakten wiedergewonnen. In einer Ausführungsform weist ein menschliches Lerk-7-Protein die Aminosäuresequenz des Proteins auf, das von Wirtszellen exprimiert wird, die mit einem Expressionsvektor transformiert worden sind, der die Lerk-7-cDNA enthält, die in dem Stamm ATCC 75959 anzutreffen ist.
Wie dem Fachmann bekannt ist, werden die Vorgehensweisen beim Reinigen eines rekombinanten Proteins entsprechend solcher Faktoren wie dem Typ der benutzten Wirtszellen, und in Abhängigkeit davon, ob das rekombinante Protein in das Kulturmedium sezerniert wird oder nicht, verschieden sein. Andere Betrachtungsweisen schließen die Typen der Kontaminanten, die zu entfernen sind und die entsprechend den bestimmten Wirtszellen, die benutzt werden, um das gewünschte Protein zu exprimieren, verschieden sein können, ein.
Beispielsweise kann, wenn Expressionssysteme benutzt werden, die das rekombinante Protein sezernieren, das Kulturmedium zuerst mit einem handelsüblichen Proteinkonzentrationsfilter, beispielsweise einer Amicon- oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit konzentriert werden. Nach dem Konzentrierungsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie etwa eine Gelfiltrationsmatrix aufgebracht werden. Alternativ kann ein Anionenaustauscherharz benutzt werden, beispielsweise eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl-(DEAE-)Gruppen. Die Matrices können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere Trägermaterialien sein, die üblicherweise zur Proteinreinigung benutzt werden. Alternativ kann ein Kationenaustauschschritt angewendet werden. Geeignete Kationenaustauscher enthalten verschiedene unlösliche Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethyl-Gruppen aufweisen. Sulfopropyl-Gruppen werden bevorzugt. Außerdem können ein oder mehrere Schritte einer Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC), die hydrophobe RP-HPLC-Medien (z.B. Kieselgel mit anhängenden Methylgruppen oder anderen aliphatischen Gruppen) benutzt, angewendet werden. Es können einige oder alle der bisher angeführten Reinigungsschritte in verschiedenen Kombinationen angewendet werden, um ein gereinigtes Lerk-7-Protein bereitzustellen.
Eine weitere Alternative ist eine Affinitätschromatographie, die eine Chromatographiematrix benutzt, die hek, elk oder einen mit Lerk-7 reagierenden Antikörper enthält. Die Lerk-7-Polypeptide können unter Anwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. Eluieren in einem hochkonzentrierten Salzpuffer) aus einer Affinitätssäule wiedergewonnen und dann für die Verwendung in einen niedrigkonzentrierten Salzpuffer dialysiert werden.
In einer Bakterienkultur produziertes rekombinantes Protein kann durch anfängliches Aufbrechen der Wirtszellen, Zentrifugieren, Extrahieren aus Zellpellets, wenn es sich um ein unlösliches Polypeptid handelt, oder aus dem Supernatant-Fluid, wenn es sich um ein lösliches Polypeptid handelt, gefolgt von einem oder mehreren Schritten des Konzentrierens, Aussalzens, Ionenaustausches, der Affinitätsreinigung oder der Ausschlusschromatographie isoliert werden. Schließlich kann die RP-HPLC für die Endreinigungsschritte benutzt werden. Mikrobenzellen können mit einem beliebigen geeigneten Verfahren aufgebrochen werden, einschließlich Gefrier-Auftau-Zyklen, Beschallung, mechanisches Aufbrechen oder die Verwendung von zellauflösenden Agenzien.
Um die Reinigung zu vereinfachen wird Lerk-7 vorzugsweise als sezerniertes Polypeptid in Hefewirtszellen exprimiert. Ein sezerniertes rekombinantes Polypeptid aus einer Hefewirtszellenfermentierung kann mit Verfahren gereinigt werden die jenen analog sind, die von Urdal et. al. (J. Chromatog. 296: 171, 1984) offenbart worden sind. Urdal et. al. beschreiben zwei nacheinander erfolgende Umkehrphasen-HPLC-Schritte für die Reinigung rekombinanten menschlichen IL-2 an einer präparativen HPLC-Säule.
Der angestrebte Reinheitsgrad hängt von der beabsichtigten Verwendung des Proteins ab. Beispielsweise wird ein verhältnismäßig hoher Reinheitsgrad angestrebt, wenn das Protein in vivo verabreicht werden soll. Vorteilhafterweise werden Lerk-7-Polypeptide so gereinigt, dass bei einer Analyse mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) keine Proteinbanden, die anderen Proteinen entsprechen, nachweisbar sind. Ein Fachmann auf dem relevanten Gebiet wird erkennen, dass auf Grund der unterschiedlichen Glycosylierung, der unterschiedlichen posttranslationalen Verarbeitung und dergleichen, wie oben diskutiert, mehrere Banden, die dem Lerk-7-Protein entsprechen, mittels SDS-PAGE sichtbar gemacht werden können. Ein Lerk-7-Proteinpräparat wird als gereinigt angesehen, solange keine Banden sichtbar gemacht werden, die anderen (von Lerk-7 verschiedenen) Proteinen entsprechen. Am meisten bevorzugt wird Lerk-7 bis zu einer wesentlichen Homogenität gereinigt, auf die eine einzige Proteinbande bei einer Analyse mittels SDS-PAGE schließen lässt.
Nucleinsäuren
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Lerk-7-Nucleinsäuren bereit. Derartige Nucleinsäuren schließen die menschliche Lerk-7-DNA der SEQ ID NO: 4 sowohl in Einzelstrang- und Doppelstrangform als auch das RNA-Komplement davon ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Lerk-7-DNA der vorliegenden Erfindung schließt beispielsweise cDNA, genomische DNA, chemisch synthetisierte DNA, mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifizierte DNA und Kombinationen davon ein. Genomische DNA kann mittels herkömmlicher Verfahren unter Verwendung der cDNA, die im Beispiel 1 isoliert wird, oder eines geeigneten Fragments davon als Sonde isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Fragmente der hier dargestellten Lerk-7-Nucleotidsequenzen bereit. Es ist erstrebenswert, dass derartige Fragmente wenigstens ungefähr 14, vorzugsweise wenigstens 17 aufeinander folgende Nucleotide der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Sequenz aufweisen. Es werden hier DNA- und RNA-Komplemente der Fragmente zusammen mit sowohl Einzelstrangformen als auch Doppelstrangformen der Lerk-7-DNA bereitgestellt.
Verwendet werden derartige Lerk-7-Nucleinsäurefragmente u.a. als Sonde oder als Primer. Derartige Sonden können in interspezifischen Hybridisierungsverfahren benutzt werden, um Lerk-7- DNA von weiteren Säugetierarten zu isolieren. Beispielsweise kann eine Sonde benutzt werden, die der extrazellulären Domäne eines Lerk-7 entspricht. Die Sonden finden außerdem bei der Feststellung des Vorhandenseins von Lerk-7-Nucleinsäuren in in vitro-Assays und in solchen Verfahren wie Northern und Southern Blots Anwendung. Es können Lerk-7 exprimierende Zelltypen identifiziert werden. Derartige Verfahren sind wohl bekannt, und der Fachmann kann je nach der beabsichtigten besonderen Anwendung eine Sonde geeigneter Länge wählen. Die Sonden können mittels herkömmlicher Techniken (z.B. mit ³²P) markiert werden.
Oligonucleotide, die Segmenten von Lerk-7-Nucleinsäuren entsprechen, finden als Primer in solchen Verfahren wie etwa der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Anwendung. Beispielsweise werden 5'- und 3'-Primer entsprechend den Termini einer gewünschten Lerk-7-Sequenz (z.B. eines Lerk-7-Fragments) benutzt, um diese Sequenz in einem herkömmlichen PCR-Verfahren zu isolieren und zu amplifizieren.
Weitere nützliche Fragmente der Lerk-7-Nucleinsäuren schließen antisense- oder sense-Oligonucleotide ein, die eine Einzelstrang-Nucleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die fähig ist, an die Ziel-Lerk-7-mRNA-(sense-)Sequenzen oder -Lerk-7-DNA-(antisense-)Sequenzen zu binden. Antisense- oder sense-Oligonucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung weisen ein Fragment der codierenden Region der Lerk-7-cDNA auf. Ein derartiges Fragment weist im Allgemeinen wenigstens ungefähr 14 Nucleotide auf, vorzugsweise ungefähr 14 bis ungefähr 30 Nucleotide. Die Möglichkeit, ein antisense- oder ein sense-Oligonucleotid auf der Grundlage einer cDNA-Sequenz, die ein bestimmtes Protein codiert, zu gewinnen, ist beispielsweise von Stein und Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) und van der Krol et. al. (BioTechniques 6: 958, 1988) beschrieben worden.
Ein Binden von antisense- oder sense-Oligonucleotiden an Ziel-Nucleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Doppelsträngen, welche die Transkription oder Translation der Zielsequenz durch eines von verschiedenen Mitteln, die eine verstärkte Degradation der Doppelstränge und eine vorzeitige Beendigung der Transkription oder Translation einschließen, oder durch andere Mittel blockieren. Die antisense-Oligonucleotide können folglich benutzt werden, um die Expression von Lerk-7-Proteinen zu blockieren. Ferner umfassen antisense- oder sense-Oligonucleotide Oligonucleotide mit modifiziertem Zucker-Phosphodiester-Hauptketten (oder mit anderen Zuckerverbindungen, wie etwa jenen, die in WO 91/06 629) beschrieben sind), wobei diese Zuckerverbindungen gegen endogene Nucleasen beständig sind. Solche Oligonucleotide mit beständigen Zuckerverbindungen sind in vivo stabil (d.h. fähig, einem enzymatischen Abbau zu widerstehen,), behalten aber die Sequenzspezifität, in der Lage zu sein, an Ziel-Nucleotidsequenzen zu binden.
Weitere Beispiele für sense- oder antisense-Oligonucleotide schließen jene Oligonucleotide ein, die kovalent an organische Komponenten gebunden sind, wie etwa jene, die in WO 90/10,448 beschrieben sind, und andere Komponenten, welche die Affinität der Oligonucleotide gegenüber einer Ziel-Nucleotidsequenz erhöhen, wie etwa Poly-L-Lysin. Ferner können auch interkalierende Agenzien wie etwa Ellipticin und alkylierende Agenzien oder Metallkomplexe an sense- oder antisense-Oligonucleotide angelagert werden, um die Bindungsspezifitäten der antisense- oder sense-Oligonucleotide gegenüber der Ziel-Nucleotidsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder sense-Oligonucleotide können mittels eines Gentransferverfahrens, einschließlich beispielsweise der CaPO₄-vermittelten DNA-Transfektion und der Elektroporation oder durch Benutzung von Gentransfervektoren wie etwa dem Epstein-Barr-Virus (EBV), in eine Zelle eingebracht werden, die die Ziel-Nucleotidsequenz enthält. In einem bevorzugten Verfahren wird ein antisense- oder sense-Oligonucleotid in einen geeigneten retroviralen Vektor eingefügt. Eine Zelle, die die Ziel-Nucleotidsequenz enthält, wird entweder in vivo oder ex vivo mit dem rekombinanten retroviralen Vektor zusammengebracht. Geeignete retrovirale Vektoren schließen jene ein, die von dem Maus-Retrovirus M-MuLV, N2 (ein von M-MuLV gewonnenes Virus) abstammen, oder die mit DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichneten Doppelkopievektoren (siehe WO 90/13641), ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Sense- oder antisense-Oligonucleotide können auch durch Bilden einer Zusammenlagerung mit einem ligandenbindenden Molekül in eine Zelle eingebracht werden, die die Ziel-Nucleotidsequenz enthält, wie in WO 91/04753 beschrieben ist. Geeignete ligandenbindende Moleküle schließen Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, weitere Cytokine oder weitere Liganden, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, ein, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. Vorzugsweise beeinflusst die Zusammenlagerung des ligandenbindenden Moleküls nicht wesentlich dessen Fähigkeit, an sein entsprechendes Molekül oder an seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder die Einbringung des sense- oder antisense-Oligonucleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Alternativ kann, wie in WO 90/10448 beschrieben ist, ein sense- oder ein antisense-Oligonucleotid durch Bilden eines Oligonucleotid-Lipid-Komplexes in eine Zelle eingebracht werden, die die Ziel-Nucleinsäuresequenz enthält. Der sense- oder antisense-Oligonucleotid-Lipid-Komplex wird vorzugsweise in der Zelle durch eine endogene Lipase aufgespaltet.
Antikörper
Es werden Antikörper bereitgestellt, die mit den hier offenbarten Lerk-7-Polypeptiden immunreaktiv sind. Solche Antikörper binden Lerk-7 dadurch spezifisch, dass sie über ihre Antigen-Bindungsstellen an Lerk-7 anbinden (im Gegensatz zu einer unspezifischen Bindung).
Polyklonale und monoklonale Antikörper können mittels herkömmlicher Techniken hergestellt werden, siehe beispielsweise Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et. al. (Hg.), Plenum Press, New York (1980), und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Land (Hg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Die Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit Lerk-7 immunreaktiv sind, ist im Beispiel 5 weiter unten genauer dargestellt.
Antigenbindende Fragmente derartiger Antikörper, die mit herkömmlichen Techniken hergestellt werden können, sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung eingeschlossen. Beispiele für solche Fragmente schließen Fab-, F(ab') und F(ab')₂-Fragmente ein, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. Außerdem werden durch gentechnische Verfahren hergestellte Antikörperfragmente und -derivate bereitgestellt.
Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen chimäre Antikörper, z.B. vermenschlichte Versionen von monoklonalen Maus-Antikörpern, ein. Solche vermenschlichten Antikörper können mittels bekannter Techniken hergestellt werden und bieten den Vorteil einer schwächeren Immunogenität, wenn sie an Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform weist ein vermenschlichter monoklonaler Antikörper die variable Region eines Maus-Antikörpers (oder genau die Antigen-Bindungsstelle davon) und eine konstante Region, die von einem menschlichen Antikörper stammt, auf. Alternativ kann ein vermenschlichtes Antikörperfragment die Antigen-Bindungsstelle eines monoklonalen Maus-Antikörpers und ein Fragment der variablen Region (wobei die Antigen-Bindungsstelle fehlt), das von einem menschlichen Antikörper stammt, aufweisen. Verfahren zur Herstellung von chimären und weiteren gentechnisch erlangten monoklonalen Antikörpern schließen jene ein, die von Riechmann et. al. (Nature 332: 323, 1988), Liu et. al. (PNAS 84: 3439, 1987), Larrick et. al. (Bio/Technology 7: 934, 1989), und Winter und Harns (TIPS 14: 139, Mai, 1993) beschrieben worden sind.
Verwendet werden die Antikörper u.a. in Assays, um das Vorhandensein von Lerk-7-Polypeptiden entweder in vitro oder in vivo festzustellen. Die Antikörper können auch zur Reinigung von Lerk-7-Proteinen mittels Immunoaffinitätschromatographie benutzt werden.
Die folgenden Beispiele sind vorgesehen, um besondere Ausführungsformen der Erfindung genauer darzustellen, wobei sie nicht als den Rahmen der vorliegenden Erfindung einschränkend aufzufassen sind.
BEISPIEL 1
Klonierung menschlicher Lerk-7-cDNA
Durch das nachfolgend angegebene Verfahren wurde cDNA isoliert, die ein menschliches Lerk-7 der vorliegenden Erfindung codiert. Zusammengefasst: Lerk-7-DNA wurde bei einem Screenen einer menschlichen, fötalen Hirn-cDNA-Bank mit einer Sonde, die aus Maus-cDNA mit der Bezeichnung Lerk-6 gewonnen war, identifiziert.
Lerk-6-DNA und -Proteine sind weiter oben und im US-Patent 5,919,905 beschrieben. Die DNA und die codierten Aminosäuresequenzen für eine Maus-Lerk-6-cDNA sind hier als SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 wiedergegeben.
Von Clonetech Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornien, wurde eine cDNA-Bank gekauft, die aus menschlicher fötaler Hirn-cDNA in dem Phagenvektor λgt10 bestand. Ein Fragment der Maus-Lerk-6-DNA wurde für eine Verwendung als Sonde mittels PCR isoliert. Das Lerk-6-DNA-Fragment enthielt die Nucleotide 11 bis 443 der SEQ ID No: 1. Ein bei der PCR benutzter Primer fügte eine T3-RNA-Polymerasebindungsstelle (CTTTAGTGAGGGTTAATCTATAG) (SEQ ID NO: 3) am 3'-Ende des amplifizierten Lerk-6-DNA-Fragments hinzu.
Die Sonde wurde unter Anwendung der Polypriming-Technik mit ³²P-dCTP markiert; anschließend wurde ihr ermöglicht, mit aus der Bank gewonnenen cDNA-Pools zu hybrisieren. Die Hybridisierung wurde bei 55°C über Nacht in 6 × SSC durchgeführt. Die Filter wurden dann bei 55°C über einen Zeitraum von ungefähr zwei Stunden auf 0,5 × SSC/0,1% SDS gewaschen. Die hybridisierenden Pools wurden bestimmt, und das Screenen wurde mit immer kleineren Pools unter den gleichen Bedingungen wiederholt. Nach dem dritten Screenen wurde ein einzelner hybridisierender Klon, Nr. 16, gereinigt.
Die DNA-Sequenz des Klons Nr. 16 wurde bestimmt. Überaschenderweise codierte der Klon ein neuartiges menschliches Protein, hier als Lerk-7 bezeichnet, statt das menschliche Homolog von Lerk-6 zu codieren. Die Nucleotidsequenz der codierenden Region der menschlichen Lerk-7-cDNA und die dadurch codierte Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 5 offenbart. Das menschliche Lerk-7-Protein der SEQ ID NO: 5 weist ein N-terminales Signalpeptid (Aminosäuren –20 bis –1), eine extrazelluläre Rezeptorbindungsdomäne (Aminosäuren 1 bis 133), eine Abstandsregion (Aminosäuren 134 bis 183) und eine C-terminale hydrophobe Region (Aminosäuren 194–208) auf.
Proben eines einen rekombinanten Phagenvektor (λgt10, der am Eco-RI-Restriktionsort des Vektors eingefügte menschliche Lerk-7-cDNA des Klons Nr. 16 enthält) enthaltenden Zell-Lysats wurden bei der American Type Culture Collection. Rockville, Maryland, hinterlegt. Die Proben wurden am 7. Dezember 1994 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags mit der zugeteilten Hinterlegungsnummer ATCC 75959 hinterlegt.
BEISPIEL 2
Herstellung eines löslichen elk:Fc-Fusionsproteins
Dieses Beispiel beschreibt die Bildung eines Expressionsvektors, der ein lösliches elk:Fc-Fusionsprotein codiert. Dieses Fusionsprotein kann in den hier beschriebenen Bindungsassays verwendet werden.
Eine DNA und eine codierte Aminosäuresequenz für Ratten-elk-cDNA ist in Lhotak u.a.: Mol. Cell. Biol. 11: 2496, 1991, dargestellt. Das Ratten-elk-Protein besitzt eine 538 Aminosäuren umfassende extrazelluläre Domäne, eine 25 Aminosäuren umfassende Transmembrandomäne und eine 419 Aminosäuren umfassende Zytoplasmadomäne.
Ein Ratten-elk-cDNA-Fragment wurde mit dem 5'-Terminus der cDNA, die den Fc-Abschnitt eines menschlichen IgG1-Antikörpers codiert, fusioniert. Aufwärts (in 5'-Richtung) der elk-codierenden Region wurde eine Asp 718-Restriktionsendonuclease-Spaltstelle eingefügt. Es wurde ein Asp 718-BglII-Fragment der Ratten-elk-cDNA (die gesamte extrazelluläre Domäne, die Transmembrenregion und kleinen Abschnitt der Zytoplasmadomäne aufweisend) isoliert.
DNA, die eine einzige Polypeptidkette codiert, die die Fc-Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers aufweist, wurde in die SpeI-Stelle von pBluescript SK^®, einem Klonierungsvektor, der von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien, bezogen werden kann, kloniert. Dieser Plasmidvektor ist in E. coli replizierbar und enthält ein Polylinkersegment, das 21 eindeutige Restriktionsorte enthält. Die Nucleotidsequenz der klonierten DNA ist zusammen mit der dadurch codierten Aminosäuresequenz des Fc-Polypeptids in der PCT-Anmeldung WO 93/10 151 beschrieben, wobei beide auch in SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 dargestellt sind. Es ist eine einzige BglII-Stelle eingebracht wurden, die die Codons für die Aminosäuren drei und vier des Fc-Polypeptids umfasst. Das codierte Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen Gelenkregion zu dem natürlichen C-Terminus, d.h. es handelt sich um eine Antikörper-Fc-Region von im Wesentlichen voller Länge.
Das oben beschriebene Asp718-BglII-elk-cDNA-Fragment wurde in der Weise in den Fc-cDNA enthaltenden pBluescript SK^®-Vektor kloniert, dass die elk-cDNA aufwärts der Fc-cDNA angeordnet wurde. Eine aus der resultierenden Genfusion gewonnene Einzelstrang-DNA wurde mit dem in Kunkel: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985, und Kunkel et. al.: Methods in Enzymol. 154: 367, 1987, beschriebenen Verfahren mutagenisiert, um die gesamte extrazelluläre Domäne des elk vollständig mit der Fc-Sequenz zu fusionieren. Die mutagenisierte DNA wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die richtigen Nucleotide entfernt worden waren (d.h. dass die Transmembranregion und ein Teil der Zytoplasmadomänen-DNA deletiert waren) und dass die elk-Sequenz und die Fc-Sequenz in demselben Leserrahmen waren.
Das elk:Fc-Fusionsprotein wird vorzugsweise in Säugerwirtszellen wie etwa CV1-EBNA- oder COS-7-Zellen synthetisiert. Die elk-Fc-Genfusion wurde ausgeschnitten und in einen Säuger-Expressionsvektor mit der Bezeichnung HAV-EO (Dower et. al.: J. Immunol. 142: 4314, 1989) eingefügt. Es wurden Säugerwirtszellen mit dem resultierenden rekombinanten Expressionsvektor transfiziert und kultiviert, um eine vorübergehende Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das durch das elk-Signalpeptid in das Kulturmedium sezerniert wurde. Das elk-Fc-Fusionsprotein wurde mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Protein-A-Sepharosesäule gereinigt.
BEISPIEL 3
Herstellung eines löslichen hek:Fc-Fusionsproteins
Dieses Beispiel beschreibt die Bildung eines Expressionsvektors, der ein lösliches hek:Fc-Fusionsprotein codiert. Dieses Fusionsprotein kann in den hier beschriebenen Bindungsassays verwendet werden.
Eine DNA und eine codierte Aminosäuresequenz für menschliche hek-cDNA ist dargestellt in Wicks et. al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1611, 1992, durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Dieses hek-Protein weist (vom N-Terminus zum C-Terminus) eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine Zytoplasmadomäne auf.
Zwei DNA-Fragmente, wovon eines ein N-terminales Fragment der extrazellulären Domäne von hek und das andere ein C-terminales Fragment der extrazellulären Domäne von hek codiert, wurden durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) isoliert, die unter üblichen Bedingungen durchgeführt wurden, wobei Oligonucleotid-Primer auf der Grundlage der von Wicks et. al. in supra veröffentlichten hek-Nucleotidsequenz benutzt wurden. Die Matrize für die PCR war cDNA, die aus mRNA hergestellt war, die aus einer menschlichen T-Zellen-Leukämie-Zelllinie mit der Bezeichnung CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) isoliert worden war.
Die das 5'-Ende der hek-DNA enthaltenden PCR-Produkte wurden mit SpeI und HindIII aufgeschlossen, um ein DNA-Fragment zu isolieren, das sich vom 5'-Terminus der reifen menschlichen hek-Sequenz (d.h. Fehlen der DNA, die die Signalsequenz codiert) bis zu einer in dem hek-Gen aufgefundenen HindIII-Stelle erstreckt. Die den 3'-Terminus der extrazellulären Domäne der hek-DNA enthaltenden PCR-Produkte wurden mit HindIII und ClaI aufgeschlossen, um ein Fragment zu isolieren, das sich von der inneren HindIII-Stelle bis zu einer ClaI-Stelle genau hinter dem 3'-Ende der die extrazelluläre Domäne von HEK codierenden Sequenz erstreckt. Die ClaI-Stelle ist in eine Mehrfachklonierungsstelle (mcs) genau hinter der extrazellulären Domäne eingefügt.
Es wurde DNA isoliert, die ein Mutein der Fc-Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers codiert. Diese Fc-Mutein-DNA und das dadurch codierte Polypeptid sind in dem US-Patent 5,457,035 mit dem Titel "Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40" beschrieben. Die Mutein-DNA wurde von einer natürlichen, ein Fc-Polypeptid codierenden DNA durch eine ortsgerichtete Mutagenese gewonnen, die im Wesentlichen wie von Deng und Nickoloff, Anal: Biochem. 200: 81 (1992) beschrieben durchgeführt wurde. Die Aminosäuresequenz des Fc-Muteinpolypeptids ist mit jener des in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschriebenen natürlichen Polypeptids identisch, nur dass die Aminosäure 19 aus Leu in Ala verändert worden ist, die Aminosäure 20 aus Leu in Glu verändert worden ist und die Aminosäure 22 aus Gly in Ala verändert worden ist. Dieses Mutein-Fc zeigt eine verminderte Affinität gegenüber Immunglobulinrezeptoren.
Ein die Fc-Mutein-DNA enthaltender rekombinanter Vektor wurde mit ClaI und NotI gespaltet, wodurch der Vektor in eine Polylinkerregion unmittelbar vor bzw. hinter dem Fc-Mutein-DNA-Insert gespaltet wurde. Das gewünschte Fc-Mutein codierende Fragment wurde isoliert.
Ein Säuger-Expressionsvektor, der mit SMAG4 bezeichnet ist, wurde mit SpeI und NotI gespaltet. Der SMAG4-Vektor weist eine ein Maus-Interleukin-7-Signalpeptid codierende Sequenz (im US-Patent 4,965,195 beschrieben), die in den starken Säuger-Expressionsvektor pDC201 eingefügt ist (beschrieben in Sims et. al.: Science 241: 585, 1988 und in der PCT-Anmeldung WO 89/03884) auf, die auch zu einer Replikation in E. coli fähig ist. SpeI spaltet den Vektor unmittelbar hinter der das IL-7-Signalpeptid codierenden Sequenz. NotI spaltet ungefähr 155 Basenpaare stromabwärts der SpeI-Stelle an einer Mehrfachklonierungsstelle des Vektors. Das große SpeI/NotI-Fragment, das die Vektorsequenzen für die das IL-7-Signalpeptid codierende DNA enthält, wurde isoliert.
Es wurde eine Vierwege Ligation durchgeführt, um die zwei hek-codierenden DNA-Fragmente und das oben beschriebene Fc-Mutein codierende DNA-Fragment in den mit SpeI/NotI gespalteten SMAG4-Expressionsvektor einzufügen. Zellen von E. coli wurden mit dem Ligationsgemisch transfiziert, und der gewünschte rekombinante Vektor wurde davon isoliert. Der isolierte Vektor codiert ein Fusionsprotein, das (vom N-Terminus zum C-Terminus) das Maus-IL-7-Signalpeptid, die extrazelluläre Domäne des hek, vier durch die eingefügten Mehrfachklonierungsstellen codierte Aminosäuren und das Fc-Mutein aufweist.
Der Expressionsvektor wurde dann mit Plasmid pSV3.NEO in CV1/EBNA-Zellen cotransfiziert. Die CV1/EBNA-Zelllinie (ATCC CRL 10478) wurde wie in McMahan et. al.: EMBO J., 10: 2821, 1991) beschrieben von einer Affennierenzellline gewonnen. Der Vektor pSV3.NEO exprimiert SV40 T-Antigen, das von den Wirtzellen nicht produziert wird. Der pSV3.NEO-Vektor ist pSV3 ähnlich (Mulligan und Berg: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072, 1981), enthält aber zusätzlich ein Neomycinresistenzgen. Die transformierten Zellen wurden kultiviert, um eine vorübergehende Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das über das Maus-IL-7-Signalpeptid in das Kulturmedium sezerniert wird.
BEISPIEL 4: Bindungsstudie
Die Bindung von Lerk-7 an elk oder hek kann durch Anwenden des folgenden Tests beurteilt werden. Es werden Zellen hergestellt, die Lerk-7 an der Zelloberfläche exprimieren. Lerk-7-DNA wird durch PCR amplifiziert. Die bei der PCR benutzten Primer sind so ausgewählt, dass sie die Enden der codierenden Region der Lerk-7-DNA definieren, wobei sie außerdem einen XhoI-Restriktionsstelle am 5'-Terminus und einen NotI-Ort am 3'-Terminus der amplifizierten DNA enthalten. Der 5'-Primer enthält außerdem eine Consensus-Kozak-Sequenz vor dem Startcodon.
Die Reaktionsprodukte werden mit XhoI und NotI aufgeschlossen und in einen mit SalI (das mit XhoI vereinbar ist) und NotI gespaltenen Expressionsvektor pDC410 eingefügt. pDC410, ein Säuger-Expressionsvektor, der sich auch in E. coli repliziert, ist pDC406 ähnlich (McMahan et. al.: EMBO J. 10: 2821, 1991). Die pDC410-Mehrfachklonierungsstelle (mcs) weicht von jener des pDC406 insofern ab, als sie zusätzliche Restriktionsstellen und drei Stoppcodons (eines in jedem Leserrahmen) enthält. Ein T7-Polymerase-Promotor abwärts der Mehrfachklonierungsstelle vereinfacht das Sequenzieren der in die Mehrfachklonierungsstelle eingefügten DNA. Außerdem wird der EBV-Replikationsstartpunkt durch DNA ersetzt, die das SV40-T-Antigen (von einem SV40-Promotor angetrieben) in pDC410 codiert.
Es werden CV1-EBNA-1-Zellen in 10 cm²-Schalen mit dem rekombinanten Expressionsvektor, der Lerk-7-DNA enthält, transfiziert. Die CV1/EBNA-1-Zellline (ATCC CRL 10478) exprimiert, von dem unmittelbar frühen CMV-Enhancer/Promotor angetrieben, radioaktiv markiertes EBV-Antigen-1. CV1/EBNA-1 ist von der African Green Monkey Nieren-Zelllinie CV1 (ATCC CCL 70) abgeleitet, wie von McMahan et. al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben ist.
Die transfizierten Zellen werden 24 Stunden lang kultiviert, und anschließend werden die Zellen jeder Schale auf eine 24 Mulden aufweisende Platte übertragen. Nach einem Kultivieren über weitere 48 Stunden wird durch das folgende Verfahren ein Bindungsassay durchgeführt. Die transfizierten Zellen (ungefähr 4 × 10⁴ Zellen/Mulde) werden mit BM-NFDM gewaschen, das ein Bindungsmedium ist (da RPMI 1640 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM HEPES pH 7,2 enthält), dem 50 mg/ml fettlose Trockenmilch zugesetzt worden sind. Die Zellen wurden dann mit verschiedenen Konzentration des elk:Fc-Fusionsproteins, das im Beispiel 2 hergestellt wurde, oder des hek:Fc-Fusionsproteins, das im Beispiel 3 hergestellt wurde, eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit einer konstanten Sättigungskonzentration eines ¹²⁵I-Anti-Human-IgG (Maus) in dem Bindungsmedium bei vorsichtigem Rühren eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach einem ausgedehnten Waschen wurden durch Trypsinierung Zellen freigesetzt.
Das oben verwendete Anti-Human-IgG (Maus), das sich gegen die Fc-Region von Human-IgG richtet, kann von Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, erworben werden. Der Antikörper ist unter Anwendung der üblichen Chloramin-T-Methode mit radioaktivem Iod markiert worden. Der Antikörper wird an den Fc-Abschnitt jedes elk:Fc- oder hek:Fc-Fusionsproteins, das an die Zellen gebunden ist, binden. Bei allen Assays wird eine unspezifische Bindung eines ¹²⁵I-Antikörpers sowohl in Abwesenheit von elk:Fc (oder hek:Fc) als auch bei Anwesenheit von elk:Fc (oder hek:Fc) und einem 200-fachen molaren Überschuss unmarkierter Anti-Human-IgG-Antikörper (Maus) getestet.
Die zellgebundenen ¹²⁵I-Antikörper werden auf einem Packard Autogamma-Zähler quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) erfolgen bei Ausführung von RS/1 (BBN Software, Boston, MA) auf einem Microvax-Computer.
BEISPIEL 5
Monoklonale Antikörper, die Lerk-7 binden
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die Lerk-7 binden. Geeignete Immungene, die bei der Erzeugung solcher Antikörper benutzt werden können, schließen gereinigtes Lerk-7-Protein oder ein immunogenes Fragment davon, wie etwa die extrazelluläre Domäne, Lerk-7 enthaltende Fusionsproteine (z.B. ein lösliches Lerk-7/Fc-Fusionsprotein) oder Zellen, die Lerk-7 an der Zelloberfläche exprimieren, ein, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein.
Gereinigtes Lerk-7 kann benutzt werden, um unter Anwendung herkömmlicher Techniken, wie etwa jenen, die im US-Patent 4,411,993 beschrieben sind, monoklonale Antikörper zu erzeugen, die immunreaktiv damit sind. Kurz gesagt, es werden Mäuse mit dem Lerk-7-Immungen, das in komplettem Freud'schen Adjuvans emulgiert ist, immunisiert, wobei Mengen im Bereich von 10 bis 100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert werden. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem Lerk-7, das in inkomplettem Freud'schen Adjuvans emulgiert ist, re-immunisiert. Danach werden die Mäuse nach einem Wochen- bis Zweiwochen-Immunisierungsplan regelmäßig re-immunisiert. Durch retro-orbitales Bluten oder Entfernen der Schwanzspitze werden regelmäßig Serumproben genommen, um mittels Dot-Blot-Assay, ELISA (Enzymimmuntest) oder Inhibieren der hek- oder elk-Bindung auf Lerk-7-Antikörper zu testen.
Nach Feststellung eines entsprechenden Antikörper-Titers wird positiven Tieren eine letzte intravenöse Injektion von Lerk-7 in physiologischer Kochsalzlösung gegeben. Drei oder vier Tage später werden die Tiere geopfert, es werden Milzzellen geerntet, und die Milzzellen werden mit einer Maus-Myelom-Zelllinie, z.B. NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, die auf Mikrotiterplatten in einem selektivem HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) aufgebracht werden, um eine Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden mittels ELISA bei Anpassung der von Engvall et. al. in Immunochem. 8: 871, 1971 und in dem US-Patent 4,703,004 beschriebenen Verfahren auf eine Reaktivität mit gereinigtem Lerk-7 getestet. Ein bevorzugtes Screening-Verfahren ist die von Beckmann et. al. (J. Immunol. 144: 4212, 1990) beschriebene Antikörperfangtechnik. Positive Hybridomzellen können intraperitoneal in syngene BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Ascite zu erzeugen, die hohe Konzentrationen monoklonaler Anti-Lerk-7-Antikörpern enthalten. Alternativ können Hybridomzellen mittels verschiedener Verfahren in vitro in Kolben oder Rollerflaschen herangezogen werden. In Maus-Ascites erzeugte monoklonale Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von einer Gelpermeationschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch eine Affinitätschromatographie, die auf der Antikörperbindung an Protein A oder Protein G beruht, oder auch eine Affinitätschromatographie, die auf der Bindung an Lerk-7 beruht, angewendet werden.
BEISPIEL 6
Southern Blots
Am Human- und Mausgenom wurden Southern-Blots durchgeführt, um den Nachweis zu erbringen, dass menschliches Lerk-7 und Maus-Lerk-6 nicht übereinstimmend sind. Ein Sondieren der menschlichen DNA mit menschlichem Lerk-7 oder Maus-Lerk-6 hatte die folgenden Hybridisierungsbanden zum Ergebnis (in kbp): Lerk-7 [EcoR1 (12,5, 9, 6, 4, 2,5) und BamH1 (13 und 9)]; Lerk-6 [EcoR1 (5) und BamH1 (5,3)]. Ein Sondieren der Mausgenom-DNA führt zu folgenden Hybridisierungsbanden: Lerk-7 [EcoR1 (12,5, 6) und BamH1 (18, 6)]; Lerk-6 [EcoR1 (18) und BamH1 (2,7, 2,2)]. Da die Lerk-7 und Lerk-6-Hybridisierungsbanden nicht völlig gleich sind, definieren diese cDNAs einzigartige Gene.
BEISPIEL 7: Bindungsstudie
Die Bindungsaffinität von Lerk-7 gegenüber elk oder gegenüber hek wurde in dem folgenden Test bestimmt. cDNA, welche die volle Länge des Lerk-7-Polypeptids der SEQ ID NO: 5 codiert, wurde in SF CAV, einen Säuger-Expressionsvektor, der sich auch in E. coli repliziert, eingefügt. Der SF CAV-Vektor ist in der PCT-Anmeldung WO 93/19777 beschrieben.
CV1-EBNA-1-Zellen (im Beispiel 3 beschrieben) in 10 cm²-Schalen wurden mit dem Lerk-7-DNA enthaltenden rekombinanten Expressionsvektor transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden 24 Stunden lang kultiviert, und anschließend wurden die Zellen jeder Schale auf eine 24 Mulden aufweisende Platte übertragen. Nach einem Kultivieren über weitere 48 Stunden wurde durch das folgende Verfahren ein Bindungsassay durchgeführt. Die transfizierten Zellen (ungefähr 4 × 10⁴ Zellen/Mulde) wurden mit BM-NFDM gewaschen, das ein Bindungsmedium ist (RPMI 1640 enthält 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid und 20 mM HEPES pH 7,2), dem 50 mg/ml fettlose Trockenmilch zugesetzt worden sind. Die Zellen wurden dann mit verschiedenen Konzentrationen eines löslichen elk:Fc- oder hek:Fc-Fusionsproteins eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Das hek:Fc-Fusionsprotein wurde wie im Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Das elk:Fc-Fusionsprotein wurde durch Verfahren hergestellt, die jenen, die im Beispiel 2 beschrieben sind, analog sind, nur dass das natürliche Fc-Polypeptid durch das im Beispiel 3 beschriebene Mutein-Fc-Polypeptid ersetzt wurde.
Anschließend wurden die Zellen gewaschen und mit einer konstanten Sättigungskonzentration (20 ng/ml) von ¹²⁵I-Maus-Anti-Human-IgG in dem Bindungsmedium bei vorsichtigem Rühren eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Nach einem ausgedehnten Waschen wurden die Zellen durch Trypsinierung geerntet.
Das oben verwendete Maus-Anti-Human-IgG, das sich gegen die Fc-Region von Human-IgG richtet, kann von Jackson Immunoresearch Laboratories Inc., West Grove, PA, bezogen werden. Der Antikörper ist unter Anwendung der üblichen Chloramin-T-Methode mit radioaktivem Iod markiert worden. Der Antikörper wird an den Fc-Abschnitt jedes elk:Fc- oder hek:Fc-Fusionsproteins, das an die Zellen gebunden ist, binden. Bei allen Assays wurde eine unspezifische Bindung eines ¹²⁵I-Antikörpers sowohl in Abwesenheit von elk:Fc (oder hek:Fc) als auch bei Anwesenheit von elk:Fc (oder hek:Fc) und einem 200-fachen molaren Überschuss unmarkierter Maus-Anti-Human-IgG-Antikörper getestet.
Die zellgebundenen ¹²⁵I-Antikörper wurden auf einem Packard Autogamma-Zähler quantifiziert. Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949) erfolgten bei Ausführung von RS/1 (BBN Software, Boston, MA) auf einem Microvax-Computer. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
Die Bindung von elk:Fc an die Lerk-7 exprimierenden Zellen wurde als ein Zweiphasen-Muster beschrieben, mit Affinitätskonstanten (K_a), die als K_a1 = 1,06 × 10⁸ und K_a2 = 4,95 × 10⁷ berechnet wurden. Die Bindung von hek:Fc wies eine einzige Affinitätsklasse der Bindung (K_a = 5,0 × 10⁸) auf.
KURZBESCHREIBUNG DES SEQUENZPROTOKOLLS
SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 zeigen die DNA-Sequenz einer klonierten cDNA, die ein Lerk-6 genanntes Protein codiert, bzw. die dadurch codierte Aminosäuresequenz. Ein Fragment der DNA der SEQ ID NO: 1 wurde als Sonde benutzt, um die Lerk-7-DNA der vorliegenden Erfindung zu isolieren, wie im Beispiel 1 beschrieben ist.
SEQ ID NO: 3 zeigt die DNA-Sequenz einer T3-RNA-Polymerase-Bindungsstelle, die im Beispiel 1 beschrieben ist.
SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 zeigen die DNA-Sequenz einer klonierten menschlichen Lerk-7-cDNA bzw. die dadurch codierte Aminosäuresequenz. Das Isolieren dieser cDNA ist im Beispiel 1 beschrieben.
SEQ ID NO: 6 zeigt die Aminosäuresequenz des Flag^®Peptids.
SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 zeigen die DNA bzw. die codierten Aminosäuresequenzen einer klonierten cDNA, die die Fc-Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers codiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, die ein Lerk-7-Polypeptid codiert, das hek oder elk bindet, wobei das Lerk-7-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens zu 80% mit einer Sequenz identisch ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Resten von –20 bis 208 der SEQ ID NO: 5 und Resten von 1 bis 208 der SEQ ID NO: 5 besteht.
DNA nach Anspruch 1, wobei das Lerk-7-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens zu 90% mit einer Sequenz identisch ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Resten von –20 bis 208 der SEQ ID NO: 5 und Resten von 1 bis 208 der SEQ ID NO: 5 besteht.
DNA nach Anspruch 2, wobei das LERK-7-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Resten von –20 bis 208 der SEQ ID NO: 5 und Resten von 1 bis 208 der SEQ ID NO: 5 besteht.
DNA nach Anspruch 3, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Nucleotiden 1–687 der SEQ ID NO: 4 und Nucleotiden 61–687 der SEQ ID NO: 4 besteht.
Isolierte DNA, die ein lösliches Lerk-7-Polypeptid codiert, das hek oder elk bindet, wobei das Lerk-7-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens zu 80% mit einer Sequenz identisch ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Resten von –20 bis x der SEQ ID NO: 5 und Resten von 1 bis x der SEQ ID NO: 5 besteht, wobei x eine ganze Zahl zwischen einschließlich 133 und einschließlich 193 repräsentiert.
Isolierte DNA nach Anspruch 5, wobei das Lerk-7-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Resten von –20 bis x der SEQ ID NO: 5 und Resten von 1 bis x der SEQ ID NO: 5 besteht, wobei x eine ganze Zahl zwischen einschließlich 133 und einschließlich 193 repräsentiert.
DNA nach Anspruch 6, wobei das Lerk-7-Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Resten von –20 bis 133, –20 bis 182, –20 bis 193, 1 bis 133, 1 bis 182 und 1 bis 193 der SEQ ID NO: 5 besteht.
Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 aufweist.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 8 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Lerk-7-Polypeptids, das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 9 unter Bedingungen, die eine Expression des Lerk-7-Polypeptids begünstigen, und ein Gewinnen des Lerk-7-Polypeptids aufweist.
Gereinigtes Lerk-7-Polypeptid, das durch eine DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert ist.
Gereinigtes Lerk-7-Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens zu 80% mit der Sequenz der Aminosäurereste von 1 bis 208 der SEQ ID NO: 5 identisch ist.
Lerk-7-Polypeptid nach Anspruch 12, wobei die Sequenz die Aminosäurereste von 1 bis 208 der SEQ ID NO: 5 aufweist.
Gereinigtes, lösliches Lerk-7-Polypeptid, das hek oder elk bindet, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens zu 80% mit der Sequenz der Reste von 1 bis x der SEQ ID NO: 5 identisch ist, wobei x eine ganze Zahl zwischen einschließlich 133 und einschließlich 193 repräsentiert.
Lösliches Lerk-7-Polypeptid nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der Reste von 1 bis x der SEQ ID NO: 5 aufweist, wobei x eine ganze Zahl zwischen einschließlich 133 und einschließlich 193 repräsentiert.
Lösliches Lerk-7-Polypeptid nach Anspruch 15, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Resten von 1 bis 133, 1 bis 182 und 1 bis 193 der SEQ ID NO: 5 besteht.
Gereinigtes Lerk-7-Polypeptid, das ein Fragment des Lerk-7-Proteins der SEQ ID NO: 5 ist, wobei das Fragment hek oder elk bindet.
Gereinigtes Lerk-7-Polypeptid, gekennzeichnet durch eine N-terminale Aminosäuresequenz Gln-Asp-Pro-Gly-Ser-Lys-Ala-Val-Ala-Asp-Arg-Tyr-Ala-Val-Tyr-.
Gereinigtes Lerk-7-Protein, das die Aminosäuresequenz des von dem Lerk-7-cDNA-Insert des rekombinanten Vektors in ATCC 75 959 exprimierten Proteins aufweist.
Antikörper, der spezifisch ein Lerk-7-Polypeptid nach einem der Ansprüche 11 bis 19 oder ein Antigenbindungsfragment davon bindet.
Antikörper nach Anspruch 20, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 21, wobei der Antikörper spezifisch das Lerk-7-Polypeptid der SEQ ID NO: 5 bindet.
Fusionsprotein, das ein lösliches Lerk-7-Polypeptid und ein von einem Antikörper abgeleitetes Polypeptid aufweist, wobei das Lerk-7-Polypeptid ein lösliches Fragment des Lerk-7-Proteins der SEQ ID NO: 5 ist, wobei das Fragment fähig ist, elk oder hek zu binden.
Fusionsprotein nach Anspruch 23, wobei das von einem Antikörper abgeleitete Polypeptid ein Fc-Polypeptid ist.
Dimer, welches zwei Fusionsproteine nach Anspruch 24 aufweist.
Oligomer, das zwei bis vier lösliche Lerk-7-Polypeptide aufweist, wobei jedes der Polypeptide ein lösliches Fragment des Lerk-7-Proteins der SEQ ID NO: 5 ist, wobei das Fragment fähig ist, elk oder hek zu binden.
Zusammensetzung, die ein Lerk-7-Polypeptid oder -Oligomer nach einem der Ansprüche 11 bis 19, 25 oder 26 und ein für Pharmazeutika zugelassenes Verdünnungs-, Träger- oder Bindemittel aufweist.
Konjugat, das ein Lerk-7-Polypeptid oder -Oligomer nach einem der Ansprüche 11 bis 19, 25 oder 26 und ein Diagnostikum oder Therapeutikum aufweist.
Lerk-7-Polypeptid, -Oligomer, -Zusammensetzung oder -Konjugat nach einem der Ansprüche 11 bis 19, 25 bis 28 zur Verwendung in der Humanmedizin.
Verwendung eines Lerk-7-Polypeptids, -Oligomers oder einer Lerk-7-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 19 oder 25 bis 27 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung von Nervengewebe.
Verwendung eines Lerk-7-Polypeptids, -Oligomers oder einer Lerk-7-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 19 oder 25 bis 27 zur Auffindung oder Bindung eines Rezeptors, der Lerk-7 bindet.