DE69833670T2

DE69833670T2 - Homologe des tie-rezeptortyrosinekinase liganden

Info

Publication number: DE69833670T2
Application number: DE69833670T
Authority: DE
Inventors: Sherman Alameda FONG; Napoleone San Francisco FERRARA; Audrey San Francisco Goddard; J. Paul Burlingame GODOWSKI; L. Austin Belmont GURNEY; Kenneth San Francisco HILLAN; Mickey P. Half Moon Bay WILLIAMS
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-14
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2018-09-15
Also published as: KR20040097229A; DE69840966D1; CY1105248T1; AU9388198A; CA2304810C; US6074873A; JP3668795B2; DE69834852D1; EP1482041A1; KR100467186B1; US6030831A; PT1015586E; DK1482041T3; ZA988392B; JP2005176848A; DE69834852T2; DK1482040T3; EP1015586A2; US6348351B1; IL187847A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für neue TIE-Liganden-Homologe kodieren, von derartigen Nucleinsäuremolekülen kodierte TIE-Liganden-Homolog-Proteine sowie Verfahren und Mittel zur Herstellung und Verwendung derartiger Nucleinsäure- und Proteinmoleküle sowie Antikörper, welche die offenbarten TIE-Liganden-Homologe binden.
Stand der Technik
Die Abkürzungen „TIE" oder „tie" sind Akronyme, die für „Tyrosinkinase, die Ig- und EGF-Homologiedomänen enthält" stehen, und wurden kreiert, um eine neue Familie von Rezeptortyrosinkinasen zu bezeichnen, die fast ausschließlich in Gefäßendothelzellen und frühen hämopoetischen Zellen exprimiert werden und durch die Gegenwart einer EGF-ähnlichen Domäne und extrazellulärer Faltungseinheiten gekennzeichnet sind, die von Intraketten-Disulfidbindungen stabilisiert sind, die allgemein als „Immunglobulin- (IG-) ähnliche" Faltungen bezeichnet werden. Ein zu Tyrosinkinase homologes cDNA-Fragment aus menschlichen Leukämiezellen (tie) wurde von Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8913-8917 (1990), beschrieben. Die mRNA dieses menschlichen „tie"-Rezeptors ist in allen menschlichen fötalen und embryonalen Geweben der Maus nachgewiesen worden, und es ist beschrieben worden, dass sie in den Kardial- und Gefäßendothelzellen lokalisiert ist. Korhonen et al., Blood 80, 2548-2555 (1992); PCT-Anmeldung, Veröffentlichungsnummer WO 93/14124 (veröffentlicht am 22. Juli 1993). Das Rattenhomolog von tie, das als „tie-1" bezeichnet wird, wurde von Maisonpierre et al., Oncogene 8, 1631-1637 (1993), identifiziert. Ein weiterer als „tie-2" bezeichneter tie-Rezeptor wurde ursprünglich in Ratten identifiziert (Dumont et al., Oncogene 8, 1293-1301 (1993)), während das als „ork" bezeichnete menschliche Homolog von tie-2 im US-Patent Nr. 5.447.860 (Ziegler) beschrieben wurde. Das Maus-Homolog von tie-2 wurde ursprünglich als „tek" bezeichnet. Die Klonierung eines Maus-tie-2-Rezeptors aus einer Hirnkapillaren-cDNA-Bibliothek ist in der PCT- Anmeldung Nr. WO 95/13387 (veröffentlicht am 18. Mai 1995) offenbart. Von den TIE-Rezeptoren wird angenommen, dass sie aktiv an der Angiogenese beteiligt sind und außerdem eine Rolle bei der Hämopoese spielen.
Die Expressionsklonierung menschlicher TIE-2-Liganden ist in der PCT-Anmeldung Nr. WO 96/11269 (veröffentlicht am 18. April 1996) und im US-Patent Nr. 5.521.073 (veröffentlicht am 28. Mai 1996) beschrieben worden. Ein als λgt10 bezeichneter Vektor, der für einen als „htie-2-Ligand 1" bezeichneten TIE-2-Liganden kodiert, ist unter der ATCC-Zugangsnummer 75928 hinterlegt worden. Ein für einen weiteren als „htie-2 2" oder „hTL2" bezeichneten TIE-2-Liganden kodierendes Plasmid ist unter der ATCC-Zugangsnummer 75928 erhältlich. Dieser zweite Ligand ist als Antagonist des TIE-2-Rezeptors beschrieben worden. Die Identifizierung sekretierter menschlicher und Maus-Liganden für den TIE-2-Rezeptor ist von Davis et al., Cell 87, 1161-1169 (1996), beschrieben worden. Der menschliche Ligand, der als „Angiopoietin-1" bezeichnet wurde, um seine Rolle bei der Angiogenese und möglichen Aktivität während der Hämopoese widerzuspiegeln, ist derselbe Ligand wie der in WO 96/11269 wechselnd als „htie-2 1" oder „hTL-1" bezeichnete Ligand. Angiopoietin-1 ist später dahingehend beschrieben worden, dass es eine von VEGF verschiedene Rolle spielt (Suri et al., Cell 87, 1171-1180 (1996)). Da TIE-2 offenbar während der pathologischen Angiogenese als Voraussetzung für Tumorwachstum upreguliert wird (Kaipainen et al., Cancer Res. 54, 6571-6577 (1994)), ist vorgeschlagen worden, dass Angiopoietin-1 außerdem zum spezifischen Abzielen auf die Tumor-Gefäßversorgung zweckdienlich ist (Davis et al., s.o.).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue menschliche TIE-Liganden-Homologe mit starken Wirkungen auf das Gefäßsystem. Die Erfindung stellt außerdem für derartige Liganden-Homologe kodierende, isolierte Nucleinsäuremoleküle und derartige Nucleinsäuremoleküle enthaltende Vektoren bereit. Die Erfindung betrifft außerdem mit derartiger Nucleinsäure transformierte Wirtszellen, um die neuen TIE-Liganden- Homologe zu produzieren. Die neuen Liganden-Homologe können Agonisten oder Antagonisten von TIE-Rezeptoren sein, die bekannt sind oder hiernach entdeckt werden. Ihre therapeutische oder diagnostische Verwendung, einschließlich der Abgabe anderer therapeutischer oder diagnostischer Mitten an Zellen, welche die betreffenden TIE-Rezeptoren exprimieren, liegt ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper bereit, die spezifisch an die TIE-Liganden-Homologe hierin binden, sowie derartige Antikörper zur Verwendung in der Diagnostik oder bei einer medizinischen Behandlung.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Zusammensetzungen, welche die neuen Liganden-Homologe oder diese Liganden-Homologe bindenden Antikörper enthalten.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Konjugate der neuen TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung mit anderen therapeutischen oder zytotoxischen Mitteln und Zusammensetzungen, die derartige Konjugate umfassen. Es ist beschrieben worden, dass der TIE-2-Rezeptor während der für das Tumorwachstum erforderlichen pathologischen Angiogenese upreguliert wird; andere TIE-Rezeptoren könnten ähnliche Eigenschaften aufweisen. Demgemäß könnten die Konjugate der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung als zytotoxische Mittel oder andere Antitumormittel zweckdienlich sein, um spezifisch auf das Tumorgefäßsystem abzuzielen.
Ein Verfahren zur Identifizierung einer einen TIE-Rezeptor exprimierenden Zelle könnte das Kontaktieren einer Zelle mit einem nachweisbar markierten TIE-Liganden oder Homolog der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Bindung eines derartigen TIE-Liganden-Homologs an den TIE-Rezeptor ermöglichen, sowie die Feststellung einer eventuell erfolgten Bindung umfassen.
Ein Verfahren zur Messung der Menge an TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden Erfindung in einer biologischen Probe kann das Kontaktieren der biologischen Probe mit zumindest einem Antikörper umfassen, der spezifisch an das TIE-Liganden-Homolog bindet, sowie das Messen der Menge des gebildeten TIE-Liganden-Homolog-Antikörper-Komplexes.
Ein Screeningverfahren zur Identifizierung von Polypeptid- oder Kleinmolekül-Agonisten eines TIE-Rezeptors kann auf deren Fähigkeit beruhen, mit einem nativen oder Varianten-TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden Erfindung um die Bindung an einen entsprechenden TIE-Rezeptor zu konkurrieren.
Die Förderung oder Hemmung der Gefäßneubildung bei einem Patienten kann auf der Verabreichung einer wirksamen Menge eines TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel basieren.
Ein Verfahren zur Förderung der Knochenentwicklung und/oder -reifung und/oder des Knochenwachstums bei einem Patienten kann das Verabreichen einer wirksamen Menge eines TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel an den Patienten umfassen.
Ein Verfahren der Förderung von Muskelwachstum und -entwicklung kann das Verabreichen einer wirksamen Menge eines TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel an einen Patienten umfassen, der dies benötigt.
Ein Verfahren der Hemmung des Endothelzellenwachstums und/oder zur Auslösung der Apoptose von Endothelzellen kann das Verabreichen einer wirksamen Menge eines TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung umfassen. Ein Verfahren zur Entzündungshemmung könnte das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Antagonisten eines TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung, wie z.B. eines Antikörpers gegen ein TIE-Liganden-Homolog, umfassen.
Die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung können für sich alleine oder in Kombination miteinander und/oder mit anderen therapeutischen oder diagnostischen Mitteln, einschließlich Elementen der VEGF-Familie, verabreicht werden. Kombinationstherapien könnten zu neuen Ansätzen zur Förderung oder Hemmung von Gefäßneubildung, Muskel- und/oder Knochenwachstum, Entwicklung oder Differenzierung oder zur Behandlung von Konditionen führen, die mit unerwünschtem Endothelzellenwachstum verbunden sind, z.B. Tumorbehandlung.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine grafische Darstellung der Beziehung der Liganden-Homologe NL2, NL3 und FLS139 zu den beiden bekannten Liganden-Homologen des TIE2-Rezeptors (h-TIE2L1 und h-TIE2L2) und zu anderen TIE-Liganden-Homologen, die in der am 19. September 1997 eingereichten Anmeldung mit der Seriennummer 08/933.821 offenbart sind.
2 ist die Nucleotidsequenz des TIE-Liganden NL2 (Seq.-ID Nr. 1) (DNA 22780).
3 ist die Aminosäuresequenz des TIE-Liganden NL2 (Seq.-ID Nr. 2).
4 ist die Nucleotidsequenz des TIE-Liganden NL3 (Seq.-ID Nr. 3) (DNA 33457).
5 ist die Aminosäuresequenz des TIE-Liganden NL3 (Seq.-ID Nr. 4).
6 ist die Nucleotidsequenz des TIE-Liganden FLS139 (Seq.-ID Nr. 5) (DNA 16451).
7 ist die Aminosäuresequenz des TIE-Liganden FLS139, anschließend NL6 genannt (Seq.-ID Nr. 6).
8. Northern-Blot, der die Expression der mRNA des TIE-Liganden-Homologs NL2 in verschiedenen Geweben zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
A. TIE-Liganden-Homologe und die dafür kodierenden Nucleinsäuremoleküle
Die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung umfassen die als NL2 (Seq.-ID Nr. 2) bezeichneten nativen menschlichen Liganden-Homologe. Hierin offenbartes natives NL2 weist 27 % Aminosäuresequenzidentität mit hTL-1 (TIE2L1) und etwa 24 % Aminosäuresequenzidentität mit hTL-2 (TIE2L2) auf. Die nativen TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen sie in ihrer natürlichen Umgebung assoziiert sind. Diese Definition wird in keiner Weise durch das/die Verfahren eingeschränkt, mit dem/denen die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung erlangt wird/werden, und umfasst alle anderweitig in der Definition enthaltenen Homologe, ob sie aus natürlichen Quellen gereinigt, durch DNA-Rekombinationsverfahren erlangt, synthetisiert oder mittels einer beliebigen Kombination dieser und/oder anderer Techniken hergestellt worden sind. Die Aminosäuresequenzvarianten der nativen TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sollen zumindest 90 %, vorzugsweise zumindest 95 %, bevorzugter zumindest 98 %, insbesondere bevorzugt zumindest 99 %, Sequenzidentität mit einem nativen menschlichen TIE-Liganden-Homolog voller Länge der vorliegenden Erfindung oder mit der Fibrinogenähnlichen Domäne eines nativen menschlichen TIE-Homolog-Liganden der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Der Ausdruck „Fibrinogen-Domäne" oder „Fibrinogen-ähnliche Domäne" bezieht sich auf die Aminosäuren von der ungefähren Position 278 bis zur ungefähren Position 498 in der bekannten hTL-1-Aminosäuresequenz; Aminosäuren von der ungefähren Position 276 bis zur ungefähren Position 496 in der bekannten hTL-2-Aminosäuresequenz; Aminosäuren von der ungefähren Position 180 bis zur ungefähren Position 453 in der Aminosäuresequenz von NL2, und auf homologe Domänen in anderen TIE-Liganden-Homologen. Die Fibrinogen-ähnliche Domäne von NL2 ist zu etwa 37-38 % identisch mit der von hTL-1 (TIE2L1) und hTL-2 (TIE2L2).
Der Ausdruck „Nucleinsäuremolekül" umfasst RNA-, DNA- und cDNA-Moleküle. Es versteht sich, dass als Folge der Degeneriertheit des genetischen Codes eine Vielzahl an Nucleotidsequenzen produziert werden kann, die für einen gegebenen TIE-Liganden kodieren. Die vorliegende Erfindung umfasst ausdrücklich jegliche mögliche Variation von Nucleotidsequenzen, die für die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung kodiert, und zwar auf Basis aller möglichen Codon-Auswahlmöglichkeiten. Obgleich Nucleinsäuremoleküle, die für die TIE-Liganden-Homologe hierin kodieren, vorzugsweise fähig sind, unter stringenten Bedingungen an ein natürlich vorkommendes TIE-Liganden-Homolog-Gen zu hybridisieren, kann es vorteilhaft sein, für TIE-Liganden-Homologe kodierende Nucleotidsequenzen herzustellen, die eine wesentlich andersartige Codonverwendung besitzen. Beispielsweise können Codons so gewählt werden, dass die Rate, mit der die Expression des Polypeptids in einer bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle auftritt, im Einklang mit der Frequenz erhöht wird, mit der der Wirt ein bestimmtes Codon einsetzt. Außerdem können RNA-Transkripte mit verbesserten Eigenschaften, z.B. verbesserter Halbwertszeit, durch geeignete Wahl der für ein vorgegebenes TIE-Liganden-Homolog kodierenden Nucleotidsequenzen hergestellt werden.
Die „Sequenzidentität" wird ermittelt, indem zwei zu vergleichende Sequenzen nach dem Clustal-Verfahren der Vielfachsequenzangleichung angeglichen werden (Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 5, 151-153 (1989), und Higgins et al., Gene 73, 237-244 (1988)), das in der Version 1.6 der Lasergene-Bio-Berechnungssoftware (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) oder in einer beliebigen aktualisierten oder gleichwertigen Version dieser Software enthalten ist.
Die „Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen kann vom gewöhnlichen Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung leicht ermittelt werden und ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen zur richtigen Anellierung, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen benötigen. Die Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit denaturierter DNA ab, bei Anwesenheit komplementärer Stränge in einem Milieu unter ihrer Schmelztemperatur zu reassoziieren. Je höher der Grad an gewünschter Homologie zwischen Sonde und hybridisierbarer Sequenz, desto höher die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Ergebnis folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen, die Reaktionsbedingungen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für weitere Einzelheiten und Beschreibungen der Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
Die hierin definierten „stringenten Bedingungen" oder „hochstringenten Bedingungen" können als jene gekennzeichnet sein, die Folgendes einsetzen: (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperaturen zum Waschen, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) ein Denaturierungsmittel während der Hybridisierung, wie z.B. Formamid, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C mit Waschungen bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem hochstringenten Waschvorgang, der aus 0,1 × SSC besteht, das EDTA enthält, bei 55 °C.
„Mäßig stringente Bedingungen" können als jene gekennzeichnet sein, wie sie von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press (1989), beschrieben werden, und umfassen die Verwendung von Waschlösungs- und Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und -SDS), die weniger stringent als die oben beschriebenen sind. Ein Beispiel für mäßig stringente Bedingungen ist die Inkubation über Nacht bei 37 °C in einer Lösung, die Folgendes umfasst: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte, gescherte Lachsspermien-DNA, gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37-50 °C. Der Fachmann wird erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. je nach Anforderungen einzustellen sind, um Faktoren, wie z.B. Sondenlänge und dergleichen, Rechnung zu tragen.
Der Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein chimäres Polypeptid, das ein an ein „Marker-Polypeptid" fusioniertes TIE-Liganden-Homolog umfasst. Das Marker-Polypeptid weist eine ausreichende Anzahl an Resten auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, sodass es die Aktivität des Polypeptids, an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Marker-Polypeptid ist vorzugsweise außerdem ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste) auf.
Die Ausdrücke „biologische Aktivität" und „biologisch aktiv" in Bezug auf ein TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, an einen nativen Rezeptor eines bekannten oder hiernach entdeckten TIE-Liganden (hiernach als „TIE-Rezeptor" genannt), z.B. einen nativen TIE-2-Rezeptor, spezifisch zu binden oder durch ihn zu signalisieren oder die Fähigkeit eines nativen TIE-Rezeptors (z.B. TIE-2) zu blockieren, an der Signaltransduktion teilzunehmen. Folglich umfassen die (nativen oder Varianten-) TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung Agonisten und Antagonisten eines nativen TIE-, z.B. TIE-2-, Rezeptors. Bevorzugte biologische Aktivitäten der TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung umfassen die Fähigkeit, die Gefäßbildung auszulösen oder zu hemmen. Die Fähigkeit, die Gefäßbildung auszulösen, ist zur Behandlung biologischer Konditionen und Krankheiten zweckdienlich, wo die Gefäßbildung wünschenswert ist, wie z.B. bei Wundheilung, Ischämie und Diabetes. Andererseits kann die Fähigkeit, die Gefäßbildung zu hemmen oder zu blockieren, bei der Unterbindung oder Abschwächung von Tumorwachstum zweckdienlich sein. Eine weitere bevorzugte biologische Aktivität ist die Fähigkeit, Knochenentwicklung, -reifung oder -wachstum zu beeinflussen. Noch eine weitere bevorzugte biologische Aktivität ist die Fähigkeit, das Endothelzellenwachstum zu hemmen und/oder Apoptose auszulösen.
Der Ausdruck „zytotoxisches Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Substanz, die die Funktion von Zellen hemmt oder verhindert und die die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der Ausdruck umfasst radioaktive Isotope (z.B. I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ und Re¹⁸⁶), chemotherapeutische Mittel und Toxine wie z.B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder deren Fragmente.
Ein „chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die bei der Behandlung von Krebs zweckdienlich ist. Beispiele chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiopeta, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitacel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rnace), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposide, Ifosfamide, Mitomycin C, Mitoxantrone, Vincristin, Vinorelbin, Carbplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte Stickstoff-Losts. Ebenfalls in dieser Definition umfasst sind hormonelle Mittel, die dahingehend wirken, dass sie die Hormonwirkung an Tumoren regulieren oder hemmen, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
Ein „wachstumshemmendes Mittel" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung, die das Wachstum einer Zelle, insbesondere Krebszelle, die irgendeines der hierin identifizierten Gene überexprimiert, entweder in vitro oder in vivo hemmt. Demnach ist das wachstumshemmende Mittel eines, das den prozentuellen Anteil der Zellen, die derartige Gene in der S-Phase überexprimieren, signifikant vermindert. Beispiele wachstumshemmender Mittel umfassen Mittel, die die Zellzyklusprogression (an einer Stelle, die nicht die S-Phase ist) blockieren, wie z.B. Mittel, die die G1-Arretierung und M-Phasen-Arretierung auslösen. Klassische M-Phasen-Blocker umfassen Vincas- (Vincristin- und Vinblastin-), Taxol- und Topo-II-Inhibitoren, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, die G1 arretieren, greifen auch auf die S-Phasen-Arretierung über, beispielsweise DNA-alkylierende Mittel, wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin, Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Informationen finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel (Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, Oncogens, and antineoplastic drugs" von Murakami et al., WB Saudners, Philadelphia (1995), insbesondere S. 13.
„Doxorubicin" ist ein Anthracyclin-Antibiotikum. Der vollständige chemische Name von Doxorubicin ist (8S-cis)-10-[(3-Amino-2,3,6-tridesoxy-α-L-lyxohexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacendion.
Der Ausdruck „Cytokin" ist ein allgemeiner Ausdruck für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf eine andere Zelle als intrazelluläre Vermittler wirken. Beispiele derartiger Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Unter den Cytokinen umfasst sind Wachstumshormon, wie z.B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin; Glykoproteinhormone, wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH), thyroidstimulierendes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH); Leberwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalaktogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; Müller-Inhibierungs- Substanz; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B. NGF-β; Blutplättchenwachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β; Insulinähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSFs), wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie z.B. IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; ein Tumornekrosefaktor, wie z.B. TNF-α oder TNF-β; und andere Polypeptidfaktoren, einschließlich LIF und kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Cytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Entsprechungen der Cytokine nativer Sequenz.
„Gefäßendothelwachstumsfaktor"/„Gefäßpermeabilitätsfaktor" (VEGF/VPF) ist ein endothelzellenspezifisches Mitogen, von dem kürzlich gezeigt worden ist, dass es durch Hypoxie stimuliert wird und für die Tumorangiogenese erforderlich ist (Senger et al., Cancer 46, 5629-5632 (1986); Kim et al., Nature 362, 841-844 (1993); Schweiki et al., Nature 359, 843-845 (1992); Plate et al., Nature 359, 845-848 (1992)). Es ist ein dimeres, Disulfid-verbundenes Glykoprotein von 34-43 kDa (wobei die vorwiegenden Spezies etwa 45 kDA aufweisen), das von einer Vielzahl von Tumorzellen und normalen Zellen synthetisiert und sekretiert wird. Außerdem ist von kultivierten menschlichen Retinazellen wie z.B. Pigmentepithelzellen und Perizyten gezeigt worden, dass sie VEGF sekretieren und die VEGF-Genexpression als Reaktion auf Hypoxie steigern (Adamis et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 631-638 (1993); Plouet et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 900 (1992); Adamis et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 1440 (1993); Ariello et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 1868 (1994); Simorre-pinatel et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 35, 3393-3400 (1994)). Im Gegensatz dazu ist der VEGF-Spiegel in normalen Geweben relativ niedrig. Daher scheint VEGF eine Hauptrolle bei vielen pathologischen Zuständen und Vorgängen zu spielen, die mit der Gefäßneubildung in Zusammenhang stehen. Die Regulation der VEGF-Expression in durch die verschiedenen oben beschriebenen Konditionen beeinträchtigten Geweben könnte daher der Schlüssel bei mit Hypoxie in Zusammenhang stehenden Behandlungs- oder Präventivtherapien sein.
Der Ausdruck „Agonist" wird verwendet, um auf Peptid- oder Nicht-Peptid-Analoga der nativen TIE-Liganden-Homologen der vorliegenden Erfindung unter der Voraussetzung zu verweisen, dass sie die Fähigkeit aufweisen, über einen nativen TIE-Rezeptor (z.B. TIE-2) zu signalisieren. Mit anderen Worten wird der Ausdruck „Agonist" im Zusammenhang mit der biologischen Rolle des TIE-Rezeptors definiert und nicht in Bezug auf die biologische Rolle eines nativen TIE-Liganden-Homologs, das wie vorher erwähnt ein Agonist oder Antagonist der biologischen TIE-Rezeptorfunktion sein kann. Bevorzugte Agonisten besitzen die bevorzugten biologischen Aktivitäten der oben aufgezählten TIE-Homologe und umfassen Förderer der Gefäßbildung, das sind Moleküle, die eine Rolle bei Knochenbildung, Reifung oder Wachstum spielen, und Förderer von Muskelwachstum und/oder -entwicklung.
Der Ausdruck „Antagonist" wird verwendet, um sich auf Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga der nativen TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper zu beziehen, die derartige TIE-Liganden-Homologe spezifisch binden, und zwar unter der Voraussetzung, dass sie die Fähigkeit aufweisen, die biologische Funktion eines nativen TIE-Rezeptors (z.B. TIE-2) zu hemmen. Abermals ist der Ausdruck „Antagonist" im Zusammenhang mit der biologischen Rolle des TIE-Rezeptors und in Bezug auf die biologische Aktivität eines nativen TIE-Liganden-Homologs definiert, das entweder ein Agonist oder Antagonist der biologischen TIE-Rezeptorfunktion sein kann. Bevorzugte Antagonisten sind Hemmstoffe von Gefäßbildung oder pathologischer Knochen- oder Muskelentwicklung oder Wachstum.
„Tumor" bezieht sich bei Verwendung hierin auf jegliche(s) neoplastische(n) Zellwachstum oder Vermehrung, ob bös- oder gutartig, sowie auf alle präkanzerösen und kanzerösen Zellen und Gewebe.
Die Ausdrücke „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren, der durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele von Krebs umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom und Leukämie. Speziellere Beispiele derartiger Krebsformen umfassen Brustkrebs, Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Magen-Darm-Krebs, Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs, Blasenkrebs, Hepatom, kolorektales Karzinom, Endometriumkarzinom, Speicheldrüsenkarzinom, Nierenkrebs, Leberkrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkrebs, Leberkarzinom und verschiedene Arten von Kopf- und Nackenkrebs.
„Behandlung" ist ein Eingriff, der mit der Absicht vorgenommen wird, die Entwicklung oder Veränderung der Pathologie einer Störung zu verhindern. Demgemäß bezieht sich „Behandlung" auf therapeutische Behandlung sowie prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die die Störung bereits aufweisen, sowie jene, bei denen die Störung verhindert werden soll. Bei der Tumor- (z.B. Krebs-) Behandlung kann ein therapeutisches Mittel die Pathologie von Tumorzellen direkt vermindern oder die Tumorzellen für die Behandlung mit anderen therapeutischen Mitteln, z.B. Bestrahlung und/oder Chemotherapie, empfänglicher machen.
Die „Pathologie" von Krebs umfasst alle Phänomene, die die Gesundheit des Patienten beeinträchtigen. Dies umfasst ohne Einschränkung abnormales oder unkontrollierbares Zellwachstum, Metastase, Störung der normalen Funktion benachbarter Zellen, Freisetzung von Cytokinen oder anderen Sekretionsprodukten in abnormalen Ausmaßen, Unterdrückung oder Verschlimmerung entzündlicher oder immunologischer Reaktionen usw.
„Säugetier" bezieht sich zum Zwecke der Erfindung auf jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere sowie Zoo- und Sporttiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren Mitteln umfasst die simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
Der Ausdruck „funktionelles Derivat" wird verwendet, um biologisch aktive Aminosäuresequenzvarianten der nativen TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sowie kovalente Modifizierungen zu definieren, einschließlich Derivate, die durch Reaktion mit organischen Derivatisierungsmitteln erlangt werden, posttranslationelle Modifizierungen, Derivate mit nicht-proteinartigen Polymeren und Immunoadhäsine.
Unter dem Ausdruck „isoliert" werden bei Verwendung zur Beschreibung der verschiedenen hierin beschriebenen Polypeptide Polypeptide verstanden, die von/aus einer Komponente ihrer natürlichen Umgebung identifiziert, abgetrennt und/oder gewonnen worden sind. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die typischerweise die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen für das Polypeptid stören, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht-proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) bis zu einem Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz mittels Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenators zu erlangen, oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Ein isoliertes Polypeptid umfasst ein Polypeptid in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des TIE-Liganden fehlen wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das aus/von zumindest einem verunreinigendem Nucleinsäuremolekül identifiziert und abgetrennt ist, mit dem es üblicherweise in der natürlichen Quelle der Nucleinsäuremoleküle assoziiert ist. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül liegt in anderer Form als der Form oder in dem Milieu vor, in der/dem es sich in der Natur findet. Isolierte Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher von dem Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert. Jedoch umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die für gewöhnlich einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung exprimieren, wo beispielsweise das Nucleinsäuremolekül sich an einer chromosomalen Stelle befindet, die sich von der natürlicher Zellen unterscheidet.
Der Ausdruck „Aminosäuresequenzvariante" bezieht sich auf Moleküle mit einigen Unterschieden hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer nativen Aminosäuresequenz.
Substitutionsvarianten sind jene, bei denen zumindest ein Aminosäurerest in einer nativen Sequenz entfernt und an ihrer Stelle durch eine andere Aminosäure an derselben Position ersetzt worden ist. Die Substitutionen können einzeln sein, wo nur eine Aminosäure im Molekül ersetzt worden ist, oder sie können mehrfach sein, wo zwei oder mehr Aminosäuren im selben Molekül ersetzt worden sind.
Insertionsvarianten sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in unmittelbarer Nachbarschaft zu einer Aminosäure an einer bestimmten Position in einer nativen Sequenz insertiert worden sind. Unmittelbar benachbart zu einer Aminosäure bedeutet, dass es sich um eine Bindung entweder an die funktionelle α-Carboxy- oder α-Aminogruppe der Aminosäure handelt.
Deletionsvarianten sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in der nativen Aminosäuresequenz entfernt worden sind. Für gewöhnlich werden bei Deletionsvarianten eine oder mehrere Aminosäuren in einer bestimmten Region des Moleküls entfernt sein. Deletionsvarianten umfassen jene mit C- und/oder N-terminalen Deletionen (Trunkierungen) sowie Varianten mit internen Deletionen einer oder mehrerer Aminosäuren. Die bevorzugten Deletionsvarianten der vorliegenden Erfindung umfassen Deletionen außerhalb der Fibrinogen-ähnlichen Domäne eines nativen TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung.
Die Aminosäuresequenzvarianten können verschiedene Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen, -insertionen und/oder -deletionen enthalten, um Moleküle mit optimalen Eigenschaften herzustellen.
Die Aminosäuren können nach der chemischen Zusammensetzung und den Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen, geladene und ungeladene, eingeteilt. Jede dieser Gruppen wird in Untergruppen unterteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren.

I. Geladene Aminosäuren Saure Aminosäuren: Asparaginsäure, Glutaminsäure Basische Aminosäuren: Lysin, Arginin, Histidin
II. Ungeladene Aminosäuren Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin Unpolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

Konservative Substitutionen umfassen das Austauschen eines Elements innerhalb einer Gruppe gegen ein anderes Element derselben Gruppe, wogegen nicht-konservative Substitutionen das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen gegen eine andere bedingen. Von Varianten, die durch nicht-konservative Substitutionen erlangt wurden, wird erwartet, dass sie in signifikanten Veränderungen der biologischen Eigenschaften/Funktion der erlangten Variante resultieren.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, bevorzugter etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend. Deletionen können in Regionen eingeführt werden, die nicht direkt an der Wechselwirkung mit einem nativen TIE-Rezeptor beteiligt sind. Deletionen werden vorzugsweise außerhalb der Fibrinogen-ähnlichen Regionen am C-Terminus des TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung durchgeführt.
Aminosäureinsertionen umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen im Längenbereich von einem Rest bis zu Polypeptiden, die hundert oder mehr Reste enthalten, sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Intrasequenzinsertionen (d.h. Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz des TIE-Liganden-Homologs) können im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 10 Resten, bevorzugter 1 bis 5 Resten, bevorzugter 1 bis 3 Resten, liegen. Beispiele terminaler Insertionen umfassen die TIE-Liganden-Homologe mit einem N-terminalen Methionylrest, einem Artefakt seiner direkten Expression in bakterieller rekombinanter Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus des TIE-Liganden-Homolog-Moleküls, um die Sekretion des reifen TIE-Liganden-Homologs aus rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Derartige Signalsequenzen werden im Allgemeinen aus der vorgesehenen Wirtszellspezies gewonnen und sind daher zu diesen homolog. Geeignete Sequenzen umfassen beispielsweise STII oder Ipp für E. coli, Alphafaktor für Hefe und Virussequenzen, wie z.B. Herpes-gD, für Säugetierzellen.
Andere Insertionsvarianten des nativen TIE-Liganden-Moleküls umfassen die Fusion des N- oder C-Terminus des TIE-Liganden-Homolog-Moleküls an immunogene Polypeptide, z.B. bakterielle Polypeptide, wie z.B. Beta-Lactamase oder ein vom trp-Locus aus E. coli kodiertes Enzym, oder Hefeprotein, und C-terminale Fusionen mit Proteinen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, wie z.B. Immunglobulinregionen (vorzugsweise konstante Immunglobulinregionen), Albumin oder Ferritin, wie beschrieben in der am 6. April 1989 veröffentlichten WO 89/02922.
Da es oft schwierig ist, im Voraus die Eigenschaften eines Varianten-TIE-Liganden-Homologs vorherzusehen, ist einzusehen, dass ein gewisses Maß an Screening notwendig sein wird, um die optimale Variante auszuwählen.
Aminosäuresequenzvarianten von nativen TIE-Liganden-Homologen der vorliegenden Erfindung werden mittels Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, indem geeignete Nucleinsäureänderungen in eine native TIE-Liganden-Homolog-DNA oder in eine Variante davon eingeführt werden oder indem das gewünschte Polypeptid in vitro synthetisiert wird. Es gibt zwei Hauptvariablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: den Ort der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation. Mit Ausnahme natürlich vorkommender Allele, die keine Manipulation der für das TIE-Liganden-Homolog kodierenden DNA-Sequenz erfordern, werden die Aminosäuresequenzvarianten der TIE-Liganden-Homologe vorzugsweise durch Mutieren der DNA konstruiert, um entweder zu einem Allel oder zu einer Aminosäuresequenzvariante zu gelangen, die in der Natur nicht vorkommt.
Eine Gruppe von Mutationen wird in der Domäne oder in den Domänen der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung erzeugt, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie an der Wechselwirkung mit einem TIE-Rezeptor, z.B. TIE-1 oder TIE-2, oder einem noch zu entdeckendem Rezeptor beteiligt ist.
Alternativ oder zusätzlich dazu können Aminosäureveränderungen an Stellen vorgenommen werden, die sich in TIE-Liganden-Homologen aus verschiedenen Spezies unterscheiden, oder in höchst konservierten Regionen, und zwar in Abhängigkeit vom zu erreichenden Ziel.
Stellen an solchen Orten werden typischerweise hintereinander modifiziert, z.B. (1) indem zuerst durch konservative Auswahl ersetzt wird und dann durch drastischere in Abhängigkeit von erhaltenen Resultat, durch (2) Deletieren des/der Zielreste/s oder (3) Insertieren von Resten derselben oder einer anderen Klasse in Nachbarschaft zur gefundenen Stelle oder Kombinationen der Möglichkeiten (1) bis (3).
Eine der hilfreichen Techniken wird „Alanin-Scanning" genannt (Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989)). Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert und durch Alanin oder Polyalanin ersetzt. Jene Domänen, die eine funktionelle Empfindlichkeit gegen die Alanin-Substitutionen zeigen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Substituenten an den oder anstelle der Alanin-Substitutionsstellen eingeführt werden.
Nach der Identifizierung der gewünschten Mutation(en) kann das für eine Aminosäuresequenzvariante eines TIE-Liganden-Homologs kodierende Gen beispielsweise durch chemische Synthese wie oben beschrieben erlangt werden.
Bevorzugter wird für eine TIE-Liganden-Homolog-Aminosäuresequenzvarianie kodierende DNA durch ortsgerichtete Mutagenese von DNA hergestellt, die für eine früher hergestellte Version der Variante oder Nicht-Variante des Liganden kodiert. Die ortsgerichtete (ortsspezifische) Mutagenese ermöglicht die Herstellung von Ligandenvarianten über die Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation sowie für eine ausreichende Anzahl benachbarter Nucleotide kodieren, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um eine stabile Doppelhelix an beiden Seiten der durchlaufenen Deletionsverbindungsstelle auszubilden. Typischerweise ist ein Primer einer Länge von etwa 20 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei sich 5 bis 10 Reste an beiden Seiten der Verbindungsstelle der veränderten Sequenz befinden. Im Allgemeinen sind die Techniken der ortsspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und werden in Veröffentlichungen, wie z.B. Edelman et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Wie einzusehen ist, setzt die ortsgerichtete Mutagenese typischerweise einen Phagenvektor ein, der in einzelsträngiger sowie doppelsträngiger Form existiert. Typische, für die ortsgerichtete Mutagenese geeignete Vektoren umfassen Vektoren, wie z.B. den M13-Phagen, der von Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981), offenbart wird. Dieser und andere Phagenvektoren sind im Handel erhältlich, und ihre Verwendung ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zur Konstruktion von Oligodesoxynucleotidgerichteter, ortspezifischer Mutagenese in DNA-Fragmenten unter Verwendung von M13-hergeleiteten Vektoren wurde von M.J. Zoller und M. Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500 (1982), veröffentlicht. Außerdem können Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)), eingesetzt werden, um einzelsträngige DNA zu erhalten. Alternativ dazu werden Nucleotidsubstitutionen durch Synthetisieren des geeigneten DNA-Fragments in vitro und dessen Amplifikation durch auf dem Gebiet bekannte PCR-Verfahren eingeführt.
Im Allgemeinen wird die ortsspezifische Mutagenese hiermit durchgeführt, indem zunächst ein einzelsträngiger Vektor erlangt wird, der in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz umfasst, die für das maßgebliche Protein kodiert. Ein die gewünschte mutierte Sequenz tragender Primer wird im Allgemeinen synthetisch hergestellt, beispielsweise mit dem Verfahren von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Dieser Primer wird dann mit dem die einzelsträngige Proteinsequenz enthaltenden Vektor anelliert und DNA-polymerisierenden Enzymen, wie z.B. Polymerase-I-Klenow-Fragment aus E. coli, ausgesetzt, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs zu vervollständigen. Demnach wird eine Doppelhelix gebildet, worin einer der Stränge für die ursprüngliche, nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Wirtszellen, wie z.B. JP101-Zellen, zu transformieren, und es werden Klone selektiert, die rekombinante Vektoren umfassen, die die mutierte Sequenzanordnung enthalten. Danach kann die mutierte Region entfernt und in einen geeigneten Expressionsvektor zur Proteinproduktion platziert werden.
Die PCR-Technik kann außerdem bei der Erzeugung von Aminosäuresequenzvarianten eines TIE-Liganden verwendet werden. Wenn kleine Mengen Templat-DNA als Anfangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer verwendet werden, die sich in der Sequenz von der entsprechenden Region in einer Templat-DNA leicht unterscheiden, um relativ große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, das sich von der Templatsequenz nur an denjenigen Positionen unterscheidet, wo sich die Primer vom Templat unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA ist einer der Primer so konstruiert, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muss mit einem Sequenzabschnitt des entgegengesetzten Strangs des Plasmids identisch sein, jedoch kann sich diese Sequenz irgendwo entlang der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden von der des ersten befindet, sodass das Ende der gesamten von den Primern begrenzten, amplifizierten DNA-Region leicht sequenziert werden kann. Die PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars wie des gerade beschriebenen resultiert in einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der vom Primer festgelegten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheiden, da das Templatkopieren etwas fehleranfällig ist.
Wenn das Verhältnis von Templat zu Produktmaterial extrem niedrig ist, beinhaltet die überwiegende Mehrheit von DNA-Fragmentprodukten die gewünschte(n) Mutation(en). Dieses Produktmaterial wird verwendet, um die entsprechende Region, die als PCR-Templat diente, im Plasmid mittels standardmäßiger DNA-Technologie zu ersetzen. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig entweder unter Verwendung eines mutierten zweiten Primers oder mittels Durchführung einer zweiten PCR mit anderen mutierten Primern und gleichzeitiges Ligieren der beiden resultierenden PCR-Fragmente an das Vektorfragment in einer drei- (oder mehr-) teiligen Ligation eingeführt werden.
In einem speziellen Beispiel der PCR-Mutagenese wird Templat-Plasmid-DNA (1 μg) durch Verdauen mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die eine einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region aufweist. Von diesem Material werden 100 ng zu einem PCR-Gemisch zugegeben, das PCR-Puffer enthält, der die vier Desoxyribonucleotidtriphosphate enthält und in den GeneAmp^®-Sets enthalten ist (erworben von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville, CA), sowie 25 pmol jedes Oligonucleotidprimers in einem Endvolumen von 50 μl. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Die Reaktion wird für 5 Minuten bei 100 °C denaturiert, kurz auf Eis gegeben, worauf 1 μl Thermus-aquaticus- (Taq-) DNA-Polymerase (5 Units/I, erworben von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville, CA) unter die Mineralölschicht zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen wie folgt programmierten DNA-Thermocycler (erworben von Perkin-Elmer Cetus) eingesetzt:

2 Minuten 55 °C
30 Sekunden 72 °C, dann 19 Zyklen der Folgenden:
30 Sekunden 94 °C
30 Sekunden 55 °C und
30 Sekunden 72 °C

Am Ende des Programms wird das Reaktionsfläschchen aus dem Thermocycler entfernt und die wässrige Phase in ein neues Fläschchen überführt, mit Phenol/Chloroform (50:50 volumenmäßig) extrahiert und mittels Ethanol präzipitiert, worauf die DNA mittels Standardverfahren gewonnen wird. Dieses Material wird anschließend geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassettenmutagenese, basiert auf der von Wells et al. (Gene 34, 315 (1985)) beschriebenen Technik. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder der Vektor), das die zu mutierende TIE-Liganden-Homolog-DNA enthält. Das/die Codon(s) im zu mutierenden TIE-Liganden-Homolog wird/werden identifiziert. Es muss sich eine einzigartige Restriktionsendonucleasestelle an beiden Seiten der identifizierten Mutationsstelle(n) befinden. Falls derartige Stellen nicht vorhanden sind, können sie unter Anwendung des oben beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an geeigneten Stellen in die für das TIE-Liganden-Homolog kodierende DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen der Restriktionsstelle kodiert, jedoch die gewünschte(n) Mutation(en) enthält, wird mittels Standardverfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden getrennt synthetisiert und dann unter Anwendung von Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konstruiert, dass sie 3'- und 5'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, sodass sie direkt in das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte TIE-Liganden-Homolog-DNA-Sequenz.
Außerdem kann das so genannte Phagemid-Display-Verfahren bei der Herstellung von Aminosäuresequenzvarianten von nativen TIE-Liganden-Homologen und deren Varianten zweckdienlich sein. Dieses Verfahren umfasst (a) das Konstruieren eines replizierbaren Expressionsvektors, umfassend ein für einen zu mutierenden Rezeptor kodierendes erstes Gen, ein für zumindest einen Abschnitt eines natürlichen Phagen-Hüllproteins oder Phagen-Hüllproteins der Wildform kodierendes Gen, worin das erste und zweite Gen heterolog sind, und ein Transkriptionsregulationselement, das operabel an das erste und zweite Gen gebunden ist, wodurch eine für ein Fusionsprotein kodierende Genfusion ausgebildet wird; (b) das Mutieren des Vektors an einer oder mehreren ausgewählten Positionen im ersten Gen, wodurch eine Familie verwandter Plasmide gebildet wird; (c) das Transformieren geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden; (d) das Infizieren der transformierten Zellen mit einem Helferphagen, der ein Gen aufweist, das für das Hüllprotein kodiert; (e) das Kultivieren der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Bildung rekombinanter Phagemid-Teilchen geeignet sind, die zumindest einen Abschnitt des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts fähig sind, wobei die Bedingungen so eingestellt werden, dass nicht mehr als eine geringfügige Menge von Phagemid-Teilchen mehr als eine Kopie des Fusionsproteins an der Oberfläche des Teilchens präsentiert; (f) das Kontaktieren der Phagemid-Teilchen mit einem geeigneten Antigen, sodass zumindest ein Teil der Phagemid-Teilchen an das Antigen bindet; und (g) das Trennen der bindenden Phagemid-Teilchen von jenen, die nicht binden. Schritte (d) bis (g) können einmal oder mehrere Male wiederholt werden. Vorzugsweise steht das Plasmid bei diesem Verfahren unter strenger Kontrolle des Transkriptionsregulationselements, und die Kultivierungsbedingungen werden so eingestellt, dass die Menge oder Anzahl von Phagemid-Teilchen, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteine an der Oberfläche des Teilchens präsentieren, weniger als etwa 1 % beträgt. Ebenso bevorzugt beträgt die Menge an Phagemid-Teilchen, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins präsentieren, weniger als 10 % der Phagemid-Teilchen, die eine einzige Kopie des Fusionsproteins präsentieren. Insbesondere bevorzugt beträgt die Menge weniger als 20 %. Typischerweise wird bei diesem Verfahren der Expressionsvektor außerdem eine Sekretionssignalsequenz enthalten, die an die für jede Untereinheit des Polypeptids kodierende DNA fusioniert ist, und das Regulationselement wird ein Promotorsystem sein. Bevorzugte Promotorsysteme werden aus lac Z-, λ_PL-, tac-, T7-Polymerase-, Tryptophan- und Alkalische-Phosphatase-Promotoren und Kombinationen davon gewählt sein. Außerdem wird das Verfahren normalerweise einen Helferphagen einsetzen, der aus M13K07, M13R408, M13-VCS und Phi X 174 ausgewählt ist. Der bevorzugte Helferphage ist M13K07 und das bevorzugte Hüllprotein ist das M13-Phagen-Gen-III-Hüllprotein. Der bevorzugte Wirt ist E. coli und Proteinase-defekte Stämme von E. coli.
Weitere Einzelheiten der vorhergehenden und ähnlichen Mutagenesetechniken finden sich in allgemeinen Lehrbüchern, wie z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), Wiley-Interscience (1991).
„Immunoadhäsine" sind Hybride, die herkömmlicherweise aus einer Rezeptorsequenz konstruiert werden, die an eine geeignete Immunglobulin- Konstantdomänensequenz gebunden ist (Immunoadhäsine). Derartige Strukturen sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. In der Literatur beschriebene Immunoadhäsine umfassen Fusionen des T-Zellen-Rezeptors^* (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936-2940 (1987)); CD4^* (Capon et al., Nature 337, 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347-353 (1990); Byrn et al., Nature 344, 667-670 (1990)); L-Selectin (homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell Biol. 110, 2221-2229 (1990); Watson et al., Nature 349, 164-167 (1991)); CD44^* (Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990)); CD28^* und B7^* (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991)); CTLA-4^* (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)); CD22^* (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133-1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2882-2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483-1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)); IgE-Rezeptor-α-Kette^* (Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstr. 1448 (1991)); HGF-Rezeptor (M.R. Mark et al., J. Biol. Chem. (1992), eingereicht), wobei das Sternchen (*) darauf hinweist, dass der Rezeptor ein Element der Immunglobulin-Überfamilie ist.
Liganden-Immunoglobulin-Hybride sind ebenfalls bekannt und werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5.304.640 (für L-Selectin-Liganden); 5.316.921 und 5.328.837 (für HGF-Varianten) offenbart. Diese Hybride können auf ähnliche Weise wie die Konstruktion von Rezeptor-Immunglobulin-Hybriden hergestellt werden.
Kovalente Modifizierungen der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sind im Schutzumfang hierin enthalten. Derartige Modifizierungen werden herkömmlicherweise eingeführt, indem die Ziel-Aminosäurereste des TIE-Liganden mit einem organischen Derivatisierungsmittel zur Reaktion gebracht werden, das fähig ist, mit gewählten Stellen oder terminalen Resten zu reagieren, oder mittels Nutzbarkeits-Mechanismen der posttranslationellen Modifizierungen, die in gewählten rekombinanten Wirtszellen funktionstüchtig sind. Die resultierenden kovalenten Derivate sind für Programme, die auf die Identifizierung von Resten abzielen, die für biologische Aktivität von Bedeutung sind, für Immuntests oder zur Herstellung von Anti-TIE-Liganden-Antikörpern für die Immunoaffinitätsreinigung der Rekombinanten zweckdienlich. Beispielsweise weist die vollständige Inaktivierung der biologischen Aktivität des Proteins nach Reaktion mit Ninhydrin darauf hin, dass zumindest ein Arginyl- oder Lysylrest für seine Aktivität entscheidend ist, worauf die einzelnen Reste, die unter den gewählten Bedingungen modifiziert wurden, durch Isolierung eines Peptidfragments identifiziert werden, das den modifizierten Aminosäurerest enthält. Derartige Modifizierungen sind dem gewöhnlichen Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden.
Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen), wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, zur Reaktion gebracht, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu liefern. Cysteinylreste werden außerdem durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. para-Bromphenacylbromid ist ebenfalls zweckdienlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Ladungsumkehr von Lysinylresten. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal-2,3-butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pK_a der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie der Arginin-Epsilon-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosylresten kann durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan durchgeführt werden, wobei besonderes Interesse an der Einführung spektraler Marker in Tyrosinylreste besteht. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyl-Tyrosylspezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung beim Radioimmuntest herzustellen.
Carboxylseitenketten (Aspartyl und Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R'), wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid, selektiv modifiziert. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste liegen im Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Threonyl- oder Tyrosylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman &Co., San Francisco, S. 79-86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxylgruppe. Die Moleküle können außerdem kovalent an nicht-proteinartige Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, gebunden werden, und zwar in der Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zur Herstellung intramolekularer Aggregate des TIE-Liganden mit Polypeptiden sowie zur Vernetzung des TIE-Liganden-Polypeptids an eine wasserlösliche Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung in Tests oder bei der Affinitätsreinigung zweckdienlich. Außerdem liefert die Untersuchung von Interketten-Vernetzungen direkte Informationen über die Konformationsstruktur. Im Allgemeinen verwendete Vernetzungsmittel umfassen 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionelle Imidoester und bifunktionelle Maleinimide. Derivatisierungsmittel, wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die fähig sind, in Gegenwart von Licht Vernetzungen auszubilden. Alternativ dazu werden wasserunlösliche Matrices wie z.B. Bromcyanaktivierte Kohlenhydrate und die in den US-Patenten Nr. 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; und 4.330.440 beschriebenen Systeme reaktiver Substrate für die Proteinimmobilisierung und Vernetzung eingesetzt.
Bestimmte posttranslationelle Modifizierungen sind das Resultat der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslationell zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste liegen im Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere posttranslationelle Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Threonyl- oder Tyrosylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 (1983)).
Andere Derivate umfassen die kovalent an ein nicht-proteinartiges Polymer gebundenen neuen Peptide dieser Erfindung. Das nicht-proteinartige Polymer ist für gewöhnlich ein hydrophiles synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das in der Natur ansonsten nicht vorkommt. Jedoch sind Polymere zweckdienlich, die in der Natur vorkommen und durch rekombinante oder In-vitro-Verfahren hergestellt werden, so wie es auch aus der Natur isolierte Formen sind. Hydrophile Polyvinylpolymere liegen im Schutzumfang dieser Erfindung, z.B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Insbesondere zweckdienlich sind Polyvinylalkylenether, wie z.B. Polyethylenglykol und Polypropylenglykol.
Die TIE-Liganden-Homologe können an verschiedene nicht-proteinartige Polymere, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf eine Weise gebunden werden, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 offenbart ist. Von diesen Varianten wird wie von den Immunoadhäsinen der vorliegenden Erfindung erwartet, dass sie längere Halbwertzeiten als die entsprechenden nativen TIE-Liganden-Homologe aufweisen.
Die TIE-Liganden-Homologe können in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Coazervationstechniken oder mittels Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, in kolloidale Medikamentabgabesysteme (z.B. Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen werden. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
Der Ausdruck „nativer TIE-Rezeptor" wird hierin verwendet, um sich auf einen TIE-Rezeptor jeglicher Tierspezies zu beziehen, die bekannt ist oder hiernach entdeckt wird, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Menschen, andere höhere Primaten, z.B. Affen, und Nagetiere, z.B. Ratten und Mäuse. Die Definition umfasst ausdrücklich den TIE-2-Rezeptor, der beispielsweise in der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/13387 (veröffentlicht am 18. Mai 1995) offenbart ist, und die in der PCT-Anmeldung WO 93/14124 (veröffentlicht am 22. Juli 1993) „TIE" genannte Endothelzellenrezeptor-Tyrosinkinase und ist vorzugsweise TIE-2.
B. Anti-TIE-Liganden-Homolog-Antikörper
Die vorliegende Erfindung umfasst Antikörper, die die TIE-Liganden-Homologe spezifisch binden. Die Antikörper können monoklonal oder polyklonal sein und umfassen ohne Einschränkung reife Antikörper, Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')₂, F_v usw.), Einzelkettenantikörper und verschiedene Kettenkombinationen.
Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen einzelne monoklonale Antikörper, die einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung spezifisch binden, sowie Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h. dass die die Population umfassenden einzelnen Antikörper mit der Ausnahme von natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen einen einzige Antigenstelle. Darüber hinaus richtet sich jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene, gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper umfassen, gegen eine einzige Determinante am Antigen.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen Hybrid- und rekombinante Antikörper, die durch Spleißen einer variablen (einschließlich hypervariablen) Domäne eines Anti-TIE-Liganden-Homolog-Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z.B. „humanisierte" Antikörper) oder einer Leichtkette mit einer Schwerkette oder einer Kette aus einer Spezies mit einer Kette aus einer anderen Spezies erlangt werden, oder Fusionen mit heterologen Proteinen ungeachtet der Ursprungsspezies oder Immunglobulinklassen- oder -unterklassenzuordnung, sowie Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv), solange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567 und Mage et al., in: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York (1987).
Daher kennzeichnet der Modifikator „monoklonal" den Antikörper derart, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt wurde, und er ist nicht dahingehend auszulegen, dass er die Produktion des Antikörpers durch irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mit dem erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahren oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie sie im US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind. Die „monoklonalen Antikörper" können außerdem aus Phagenbibliotheken isoliert werden, die unter Verwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), beschriebenen Techniken aus Phagenbibliotheken erzeugt wurden.
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher Antikörper (z.B. Maus-Antikörper) sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder deren Fragmente (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine von nicht-menschlichem Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), bei denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregion- (FR-) Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus kann der humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifizierungen werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei Domänen umfassen, in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen denen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird im Optimalfall außerdem zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion oder Domäne (Fc), typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins, umfassen.
Polyklonale Antikörper gegen ein TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen in Tieren hergestellt, indem der TIE-Ligand und ein Adjuvans mehrfach subkutan (sc) oder intraperitoneal (ip) injiziert werden. Es kann zweckdienlich sein, den TIE-Liganden oder ein die Ziel-Aminosäuresequenz enthaltendes Fragment an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, und zwar unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Reagens, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, wobei R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg oder 1 μg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit drei Volumenanteilen Freundschem kompletten Adjuvans kombiniert und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Konjugatmenge in Freundschem kompletten Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut entnommen und das Serum auf Anti-TIE-Liganden-Titer getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer sein Plateau erreicht hat. Vorzugsweise werden die Tiere mit dem Konjugat desselben TIE-Liganden geboostet, das jedoch ein anderes Protein und/oder über ein anderes Vernetzungsreagens konjugiert ist. Konjugate können außerdem in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Außerdem können Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken.
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt, d.h. dass die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper identisch sind mit der Ausnahme möglicher natürlich auftretender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Daher kennzeichnet der Modifikator „monoklonal" den Antikörper als einen, der nicht ein Gemisch aus unterschiedlichen Antikörpern ist.
Beispielsweise können die monoklonalen Anti-TIE-Liganden-Homolog-Antikörper der Erfindung durch Anwendung des erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahrens oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567) hergestellt werden.
Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z.B. ein Hamster, wie hierin oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten anzuregen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle auszubilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S.59-103, Academic Press (1986)).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden in ein geeignetes Medium geimpft und darin gezüchtet, wobei das Medium vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben unfusionierter elterlicher Myelomzellen hemmt. Wenn beispielsweise den elterlichen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) umfassen, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defekter Zellen verhindern.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile hohe Antikörperexpression durch die gewählten antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und gegen ein Medium, wie z.B. das HAT-Medium, empfindlich sind. Unter diesen bevorzugten Myelomzelllinien sind Maus-Myelomlinien, wie z.B. jene, die sich von MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren herleiten und vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, erhältlich sind, sowie SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind ebenfalls zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen wachsen, wird auf Produktion von gegen das TIE-Liganden-Homolog gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen, durch Hybridomzellen produzierten Antikörpern mittels Immunopräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunosorbentassay (ELISA), ermittelt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mittels Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), ermittelt werden.
Nachdem Hybridomzellen identifiziert worden sind, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone mittels Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59-104, Academic Press (1986). Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RMPI-1640-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen produzierten monoklonalen Antikörper werden in geeigneter Weise durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren vom Kulturmedium, von der Aszitesflüssigkeit oder vom Serum abgetrennt, wie z.B. durch Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie.
Die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von Mausantikörpern kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen der Erfindung dienen dann als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren eingesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen, transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die DNA kann außerdem modifiziert werden, beispielsweise durch Ersetzen der kodierenden Sequenz für menschliche Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maussequenzen (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulinprotein an die für Immunglobulin kodierende Sequenz. Auf diese Weise werden „chimäre" Antikörper oder „Hybrid"-Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines monoklonalen Anti-TIE-Liganden-Antikörpers dieser Erfindung aufweisen.
Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers durch derartige Nicht-Immunglobulin-Polypeptide ersetzt, oder es werden die variablen Domänen einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers der Erfindung durch sie ersetzt, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen, der eine Antigenkombinierende Stelle mit Spezifität für einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung und eine weitere Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro hergestellt werden, wobei bekannte Verfahren der synthetischen Proteinchemie verwendet werden, einschließlich jene, die Vernetzungsmittel umfassen. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Ausbildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Für Diagnoseanwendungen werden die Antikörper der Erfindung typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung kann eine beliebige sein, die fähig ist, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu liefern. Beispielsweise ist die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszente Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; Biotin; radioaktive Isotopenmarker, wie z.B. ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C oder ³H, oder ein Enzym, wie z.B. Alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase.
Es kann jedes auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zur gesonderten Konjugation des Antikörpers mit der nachweisbaren Gruppierung eingesetzt werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie z.B. in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunopräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147-158, CRC Press, Inc. (1987).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards (der ein TIE-Liganden-Homolog oder ein immunologisch reaktiver Abschnitt davon sein kann), mit dem Analyten der Testprobe (TIE-Ligand) um die Bindung mit einer begrenzten Antikörpermenge zu konkurrieren. Die Menge TIE-Liganden-Homolog in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge Standard, die an die Antikörper bindet. Um die Bestimmung der Menge des gebundenen Standards zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion solubilisiert, sodass Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, bequem vom ungebunden gebliebenen Standard und Analyt getrennt werden können.
Sandwichtests umfassen die Verwendung zweier Antikörper, wobei beide fähig sind, an ein(en) anderen/s immunogenen/s Abschnitt oder Epitop des nachzuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger gebunden ist, worauf ein zweiter Antikörper an den Analyten bindet, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. David und Greene, US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkte Sandwichtests) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwichtest). Beispielsweise ist ein ELISA-Test einer der Typen von Sandwichtests, wobei in diesem Fall die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist.
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt worden sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986): Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)) durchgeführt werden, indem die Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch die entsprechenden Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen ersetzt werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, s.o.), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies ersetzt worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern ersetzt sind.
Es ist wichtig, dass Antikörper mit Erhaltung hoher Affinität für das Antigen und anderen vorteilhaften biologischen Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper nach einem bevorzugten Verfahren durch einen Prozess der Analyse der elterlichen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der elterlichen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung geläufig. Es sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen gewählter Kandidat-Immunglobulinsequenzen illustrieren und darstellen. Die Prüfung dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktion der Kandidat-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidat-Immunglobulins beeinflussen, an sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste gewählt und aus der Konsensus- und Import-Sequenz kombiniert werden, sodass die gewünschte Antikörpereigenschaft, wie z.B. erhöhte Affinität für das/die Ziel-Antigen(e), erzielt wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und sehr wesentlich an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt.
Alternativ dazu ist es nunmehr möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu produzieren, die fähig sind, bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Es ist beispielsweise beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion- (J_H-) Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen in der vollständigen Hemmung endogener Antikörperproduktion resultiert. Die Übertragung der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in derartige keimbahnmutierte Mäuse resultiert für gewöhnlich in der Produktion menschlicher Antikörper bei Antigenexposition. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993).
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. In vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für einen bestimmten TIE-Liganden, die andere ist für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für einen anderen Liganden. Beispielsweise liegen bispezifische Antikörper, die zwei verschiedene TIE-Liganden-Homologe spezifisch binden, im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Aufgrund der zufälligen Auswahl der Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur einer die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die für gewöhnlich mittels affinitätschromatischer Schritte durchgeführt wird, ist ziemlich mühsam, und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren werden in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/08829 (veröffentlicht am 13. Mai 1993) und in Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen und bevorzugteren Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigenkombinierenden Stellen) an Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne und umfasst zumindest einen Abschnitt des Gelenks und die zweite und dritte konstante Region einer Immunglobulin-Schwerkette (CH2 und CH3). Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), die die zur Leichtkettenbindung notwendige Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, falls erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Dies sorgt für eine höhere Flexibilität bei der Einstellung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, bei denen ungleiche Verhältnisse der drei bei der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten die optimalen Ausbeuten bereitstellen. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten im gleichen Verhältnis in hohen Ausbeuten resultiert oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Relevanz sind. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes sind die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar im anderen Arm (der eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) zusammengesetzt. Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für eine einfache Art und Weise der Trennung sorgt.
Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) aufweisen, die mit einer variablen Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) verbunden ist. Durch Verwenden eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu erlauben, sind die Domänen gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer anderen Ketten zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu erzeugen. Diabodies werden beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161; und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), vollständiger beschrieben.
Ein „isolierter" Antikörper ist ähnlich wie die hierin oben bereitgestellte Definition für isolierte Polypeptide definiert. Im Speziellen ist ein isolierter Antikörper einer, der identifiziert und getrennt und/oder aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die die diagnostischen und therapeutischen Verwendungen für den Antikörper stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht-proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird der Antikörper gereinigt, und zwar (1) auf ein mittels Lowry-Verfahren ermitteltes Ausmaß von mehr als 95 Gew.-% Antikörper und insbesondere auf ein Ausmaß von mehr als 99 Gew.-%, (2) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenators zu erlangen, oder (3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Ein isolierter Antikörper umfasst den Antikörper in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Antikörpers nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird ein isolierter Antikörper jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Das Wort „Marker" bezieht sich bei Verwendung hierin auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung, die direkt oder indirekt an den Antikörper gebunden ist, sodass ein „markierter" Antikörper erzeugt wird. Der Marker kann selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarker oder Fluoreszenzmarker) oder im Falle eines Enzymmarkers chemische Veränderungen einer Substratverbindung oder Zusammensetzung katalysieren, die nachweisbar sind.
Unter „Festphase" wird eine nicht-wässrige Matrix verstanden, an die der Antikörper der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele von hierein vorgesehenen Festphasen umfassen jene, die teilweise oder völlig aus Glas gebildet werden (Controlled-pore-Glas), Polysaccharide (z.B. Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikone. In gewissen Ausführungsformen kann die Festphase in Abhängigkeit vom Zusammenhang den Napf einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser Ausdruck umfasst außerdem eine diskontinuierliche Festphase getrennter Teilchen, wie z.B. jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben ist.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, das aus verschiedenen Arten von Lipiden, Phospholipiden und/oder Tensiden zusammengesetzt ist, das zur Abgabe eines Medikaments (wie z.B. der hierin offenbarten Anti-ErbB2-Antikörper und gegebenenfalls eines chemotherapeutischen Mittels) zweckdienlich ist. Die Komponenten des Liposoms sind üblicherweise als Doppelschicht ähnlich der Lipidanordnung biologischer Membranen angeordnet.
Heterokonjugat-Antikörper liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen (US-Patent Nr. 4.676.980) und zur Behandlung der HIV-Infektion (PCT-Anmeldungen Nr. WO 91/00360 und WO 92/200373; EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Verwendung eines beliebigen zweckmäßigen Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam mit einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
„Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Domänen von Antikörpern, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorliegen. Vorzugsweise umfasst das Fv-Polypeptid außerdem einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, der es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur zur Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick bezüglich sFv siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New. York, S. 269-315 (1994).
C. Klonierung und Expression der TIE-Liganden-Homologe
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" wechselseitig verwendet, und alle derartigen Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Es versteht sich außerdem, dass aufgrund beabsichtigter oder unabsichtlicher Mutationen nicht die gesamte Nachkommenschaft hinsichtlich des DNA-Gehalts genau identisch sein muss. Mutierte Nachkommen, die dieselbe Funktion oder biologische Eigenschaft aufweisen, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent worden ist, sind mit umfasst.
Die Ausdrücke „replizierbarer Expressionsvektor" und „Expressionsvektor" beziehen sich auf ein üblicherweise doppelsträngiges DNA-Stück, in das ein Stück Fremd-DNA insertiert sein kann. Fremd-DNA ist als heterologe DNA definiert, die DNA ist, die in der Wirtszelle nicht vorkommt. Der Vektor wird verwendet, um die fremde oder heterologe DNA in eine geeignete Wirtszelle zu transportieren. Wenn er einmal in der Wirtszelle ist, kann der Vektor sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA replizieren, und es können mehrere Kopien des Vektors und seiner insertierten (fremden) DNA erzeugt werden. Außerdem enthält der Vektor die notwendigen Elemente, die die Translation der fremden DNA in ein Polypeptid ermöglichen. Viele Moleküle des von der Fremd-DNA kodierten Polpeptids können folglich schnell synthetisiert werden.
Expressions- und Klonierungsvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Die Wahl des geeigneten Vektors hängt von Folgendem ab: 1) ob er zur DNA-Amplifikation oder zur DNA-Expression zu verwenden ist; 2) der Größe der in den Vektor zu insertierenden DNA und 3) der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten in Abhängigkeit von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und dem Wirt, für den er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
(i) Signalsequenzkomponente
Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil des TIE-Liganden-Moleküls sein, das in den Vektor insertiert wird. Falls die Signalsequenz heterolog ist, sollte sie so gewählt sein, dass sie von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h. von einer Signalpeptidase gespalten) wird.
Für prokaryotische Wirtszellen geeignete heterologe Signalsequenzen sind vorzugsweise prokaryotische Signalsequenzen, wie z.B. die α-Amylase-, ompA-, ompC-, ompE-, ompF-, Alkalische-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabile Enterotoxin-II-Leader. Für die Hefesekretion können beispielsweise die Hefe-Invertase-, Amylase-, Alpha-Faktor- oder Saure-Phosphatase-Leader verwendet werden. Bei der Säugetierzellexpression sind Säugetier-Signalsequenzen am zweckdienlichsten. Die aufgezählten Signalsequenzen dienen ausschließlich der Illustration und schränken den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise ein.
(ii) Replikationsstartpunktkomponente
Expressions- sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von den Wirtschromosomen zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sich für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem wohlbekannten Plasmid pBR322 ist für die meisten gram-negativen Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt für Hefe und verschiedene Virusstartpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen zweckdienlich. Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. dass sie zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig sind, jedoch zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden können. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert, worauf derselbe Vektor in Hefe oder Säugetierzellen zur Expression transfiziert wird, obwohl er nicht fähig ist, sich unabhängig vom Chromosom des Wirts zu replizieren.
DNA wird außerdem durch Insertion in das Wirtsgenom kloniert. Dies kann leicht unter Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirt erzielt werden, beispielsweise indem in den Vektor eine DNA-Sequenz aufgenommen wird, die zu einer in genomischer Bacillus-DNA vorkommenden Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in der homologen Rekombination mit dem Genom und der Insertion der für das gewünschte heterologe Polypeptid kodierenden DNA. Jedoch ist die Gewinnung genomischer DNA komplexer als die eines exogen replizierten Vektors, da ein Restriktionsenzymverdau notwendig ist, um das kodierte Polypeptidmolekül herauszuschneiden.
(iii) Selektionsgenkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch Selektionsmarker genannt wird. Dies ist ein Gen, das für ein Protein kodiert, das zum Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig ist. Die Gegenwart dieses Gens gewährleistet, dass jegliche Wirtszelle, die diesen Vektor deletiert, hinsichtlich Wachstum oder Reproduktion gegenüber transformierten Wirten nicht im Vorteil ist. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Nährmedien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
Eines der Beispiele eines Selektionsschemas setzt ein Medikament ein, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, exprimieren ein Protein, das Medikamentresistenz verleiht, und überleben folglich das Selektionsregime. Beispiele einer derartigen dominanten Selektion verwenden die Medikamente Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sudgen et al., Mol. Cel. Biol. 5, 410-413 (1985)). Die oben aufgezählten drei Beispiele setzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle ein, um Resistenz gegen das geeignete Medikament G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Andere Beispiele geeigneter Selektionsmarker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder Thymidinkinase. Derartige Marker ermöglichen die Identifizierung von Zellen, die zur Aufnahme der gewünschten Nucleinsäure kompetent waren. Die Säugetierzellen-Transformanten werden unter Selektionsdruck gestellt, gegen den nur die Transformanten aufgrund der Aufnahme des Markers zum Überleben einzigartig adaptiert sind. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen ausgeübt, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium sukzessiv verändert wird, wodurch sowohl das Selektionsgen, als auch die für das gewünschte Polypeptid kodierende DNA amplifiziert wird. Die Amplifikation ist ein Prozess, durch den Gene, deren Bedarf für die Produktion eines für das Wachstum entscheidenden Proteins höher ist, im Chromosom aufeinander folgender Generationen rekombinanter Zellen tandemwiederholt werden. Es werden erhöhte Mengen des gewünschten Polypeptids aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zunächst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt. Eine geeignete Wirtszelle in diesem Fall ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekte Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinie, die wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Eine besonders zweckdienliche DHFR ist eine mutierte DHFR, die gegen MTX höchst resistent ist ( EP 117.060 ). Dieses Selektionsmittel kann mit jeglichem ansonsten geeigneten Wirt, z.B. ATCC-Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Gegenwart endogener DHFR verwendet werden. Die für DHFR bzw. das gewünschte Polypeptid kodierende DNA wird dann durch Exposition mit einem Mittel (Methotrexat oder MTX) amplifiziert, das DHFR inaktiviert. Man gewährleistet, dass die Zelle mehr DHFR benötigt (und somit die gesamte exogene DNA amplifiziert), indem nur Zellen selektiert werden, die in aufeinander folgenden Umläufen immer höher werdender MTX-Konzentration wachsen können. Alternativ dazu können Wirte, die mit Genen cotransformiert sind, die für das gewünschte Polypeptid, DHFR der Wildform und einen weiteren Selektionsmarker, wie z.B. das neo-Gen, kodieren, unter Verwendung eines Selektionsmittels für das Selektionsgen, wie z.B. G418, identifiziert und dann unter Verwendung von Methotrexat in einem Wirt der Wildform, der endogene DHFR enthält, selektiert und amplifiziert werden (siehe auch US-Patent Nr. 4.965.199).
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan fehlt, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellgenom stellt dann ein wirksames Milieu zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Anwesenheit von Tryptophan bereit. Gleichermaßen werden Leu2-defekte Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide komplementiert.
(iv) Promotorkomponente
Expressionsvektoren sollten im Gegensatz zu Klonierungsvektoren einen Promotor enthalten, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die für das gewünschte Polypeptid kodierende Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die sich stromauf vom Startcodon eines Strukturgens (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1.000 bp) befinden, die die Transkription und Translation von Nucleinsäure unter ihrer Kontrolle kontrollieren. Sie gliedern sich typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Transkriptionsniveaus aus DNA unter ihrer Kontrolle auslösen, und zwar als Reaktion auf eine gewisse Änderung der Kulturbedingungen, z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder eine Temperaturänderung. Derzeit ist eine große Anzahl von Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielzahl möglicher Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an die für das gewünschte Polypeptid kodierende DNA gebunden, indem sie durch Restriktionsenzymverdau aus ihrem ursprünglichen Gen entfernt werden, gefolgt von der Insertion 5' des Startcodons für das zu exprimierende Polypeptid. Das heißt nicht, dass der genomische Promotor für einen TIE-Liganden unbrauchbar ist. Jedoch resultieren heterologe Promotoren im Allgemeinen in höherer Transkription und höheren Ausbeuten an exprimierten TIE-Liganden-Homologen im Vergleich zu den nativen TIE-Liganden-Promotoren.
Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) und EPO-Anmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 36.776) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)). Jedoch sind andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleinsäuresequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch es dem geübten Fachmann ermöglicht wird, sie operabel an für einen TIE-Liganden kodierende DNA zu ligieren (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), und zwar unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, um jegliche erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem eine operabel an die für einen TIE-Liganden kodierende DNA gebundene Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz enthalten.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1978); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefe-Promotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus in Zusammenhang stehende Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind in R. Hitzeman et al., EP 73.657A , weiterführend beschrieben. Hefe-Enhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefe-Promotoren verwendet.
Promotorsequenzen sind für Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die ungefähr 25 bis 30 Basen stromauf derjenigen Stelle lokalisiert ist, wo die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromauf des Transkriptionsstarts vieler Gene befindet, ist eine CXCAAT-Region, wobei X jegliches Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal zur Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein könnte. Alle diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in Säugetier-Expressionsvektoren insertiert.
Die TIE-Liganden-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen kann durch Promotoren gesteuert werden, die aus den Genomen von Viren, wie z.B. aus Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, aus Hitzeschockpromotoren und aus dem normalerweise mit der TIE-Liganden-Sequenz assoziierten Promotor unter der Voraussetzung erlangt werden, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus können bequem als SV40-Restriktionsfragment erlangt werden, das außerdem den SV40-Virus-Replikationsstartpunkt enthält (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978), Mulligan und Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981)). Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird bequem als HindIII-E-Restriktionsfragment erlangt (Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982)). Ein System zur DNA-Expression in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifizierung dieses Systems wird im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982), über die Expression von für menschliches Immuninterferon kodierender cDNA in Affen; Reyes et al., Nature 297, 598-601 (1982), über die Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinasepromotors aus Herpes-Simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 5166-5170 (1982), über die Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Maus- und Kaninchen-Zellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982), über die Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo-Fibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-HIN-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung aus Rous-Sarcomavirus als Promotor.
(v) Enhancerelementkomponente
Die Transkription einer für die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente einer Länge von üblicherweise etwa 10 bis 300 bp, die an einem Promotor wirken, um dessen Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lasky et al., Mol. Cel. Biol. 3, 1108 (1983)) der Transkriptionseinheit, in einem Intron (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie in der kodierenden Sequenz selbst gefunden (Osborne et al., Mol. Cel. Biol. 4, 1293 (1984)). Es sind viele Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus eukaryotischer Zellen verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100-270), den frühen Promotor-Enhancer aus Cytomegalovirus, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982), über Enhancerelemente zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' der TIE-Liganden-DNA in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Mensch oder kernhaltige Zellen aus anderen vielzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind im Allgemeinen aus den 5'- und gelegentlich 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für den TIE-Liganden kodierenden mRNA transkribiert werden. Die 3'-untranslatierten Regionen umfassen außerdem Transkriptionsterminationsstellen.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten, die gewünschten kodierenden und steuernden Sequenzen enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form neu ligiert, um die benötigten Plasmide zu erzeugen.
Zur Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446), zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert. Es werden Plasmide aus den Transformanten hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder mittels Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder mittels Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung besonders zweckdienlich sind Expressionsvektoren, die für eine vorübergehende Expression der für einen TIE-Liganden kodierenden DNA in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, sich in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors anreichert und dann hohe Mengen eines gewünschten, vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert. Vorübergehende Systeme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die bequeme positive Identifizierung von Polypeptiden, die durch klonierte DNAs kodiert werden, sowie das rasche Screening derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Daher sind vorübergehende Expressionssysteme in der Erfindung zum Zwecke der Identifizierung von Analoga und Varianten eines TIE-Liganden besonders zweckdienlich.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung der Synthese der TIE-Polypeptide in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden beschrieben in Getting et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantel et al., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117.060 und EP 117.058 . Ein besonders brauchbares Plasmid zur Säugetierzellkulturexpression der TIE-Liganden-Polypeptide ist pRK5 ( EP 307.247 ) zusammen mit seinen Derivaten, wie z.B. pRK5D, das eine sp6-Transkriptionsinitiationsstelle, gefolgt von einer den Xho/NotIIcDNA-Klonierungsstellen vorausgehenden SfiI-Restriktionsenzymstelle aufweist, sowie pRK5B, einem Vorläufer von pRK5D, das die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991).
(vii) Konstruktion und Analyse von Vektoren
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form zur Erzeugung des benötigten Plasmids neu ligiert.
Zur Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446), zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder mittels Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder mittels Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
(viii) Vorübergehende Expressionsvektoren
Besonders zweckdienlich bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehenden Expression von für einen TIE-Liganden kodierender DNA in Säugetierzellen sorgt. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, sich in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors anreichert und dann hohe Mengen eines vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert. Sambrook et al., s.o., S. 16.17-16.22. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen das bequeme positive Screening derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Daher sind vorübergehende Expressionssysteme in der Erfindung insbesondere zum Zwecke der Identifizierung von Analoga und Varianten nativer TIE-Liganden-Homologe mit der erforderlichen biologischen Aktivität zweckdienlich.
(ix) Geeignete beispielhafte Vertebratenzellvektoren
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung der Synthese eines TIE-Liganden (einschließlich funktioneller Abkömmlinge nativer Proteine) in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117.060 ; und EP 117.058 beschrieben. Ein besonders brauchbares Plasmid zur Säugetierzellkulturexpression eines TIE-Liganden ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/08291).
Geeignete Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der Vektoren hierin sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten umfassen gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise E. coli oder Bacilli. Ein bevorzugter Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obgleich andere gram-negative oder gram-positive Prokaryoten, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325), Pseudomonas-Spezies oder Serratia marcesans, geeignet sind.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z.B. filamentöse Pilze oder Hefe, geeignete Wirte für die Vektoren hierin. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete unter den niedrigeren eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Jedoch ist eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämme allgemein verfügbar und hierin zweckdienlich, wie z.B. S. pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981)), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)), Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ), Trichoderma reesia ( EP 244.234 ), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979)); und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen können sich auch von vielzelligen Organismen herleiten. Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jegliche eukaryotische Zellkultur, ob Vertebraten- oder Invertebratenzellkultur, verwendbar, obgleich Zellen aus Säugetieren, wie z.B. Menschen, bevorzugt sind. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirusstämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen aus Wirten, wie z.B. Wirtszellen aus Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, sind identifiziert worden. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, J.K. Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 8, Plenum Publishing, S 277-279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592-594 (1985). Eine Vielfalt derartiger Virusstämme ist öffentlich zugänglich, z.B. die L-1-Variante von Autographa-californica-NPV, und derartige Viren können als Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden.
Im Allgemeinen werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das vorher so manipuliert worden ist, um die TIE-Liganden-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für einen TIE-Liganden kodierende DNA auf den Pflanzenzellenwirt so übertragen, dass er transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die TIE-Liganden-DNA exprimiert. Außerdem sind mit den Pflanzenzellen kompatible Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, wie z.B. der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem sind aus der Stromaufregion des T-DNA-780-Gens isolierte DNA-Segmente fähig, die Transkriptionsstärken pflanzenexprimierbarer Gene in rekombinante DNA enthaltenden Pflanzengeweben zu aktivieren oder zu steigern. Siehe EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Jedoch bestand das größte Interesse an Vertebratenzellen, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ist an sich wohlbekannt. Siehe Tissue Culture, Kruse und Patterson (Hrsg.), Academic Press (1973). Beispiele geeigneter Säugetierwirtszelllinien sind die durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenzelllinie (293-Zellen oder zum Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen 9BHK (ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); Menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44068 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und menschliche Hepatomzelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind menschliche Urnieren-293- und Chinahamster-Eierstockzellen.
Insbesondere bevorzugte Wirtszellen zum Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Vertebratenzellen, die die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung produzieren.
Wirtszellen werden transformiert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren oder Selektion von amplifizierte Gene enthaltenden Transformanten modifiziert sind.
Zur Produktion der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung verwendete Prokaryotenzellen werden wie in Sambrook et al., s.o., beschrieben in geeigneten Medien kultiviert.
Säugetierzellen können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma), sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann ein beliebiges der in Ham und Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US 4.767.704 ; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195 oder US-Patent Nr. 30.985 beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jegliches dieser Medien kann wie erforderlich mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamycin^TM-Medikament), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer gleichwertigen Energiequelle ergänzt sein. Beliebige andere notwendige Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die dem geübten Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Die geeigneten Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind gegebenenfalls jene, die für die zur Klonierung oder Expression gewählten Wirtszellen vorher verwendet wurden, und sind dem gewöhnlichen Fachmann offensichtlich.
Die in dieser Offenbarung genannten Wirtszellen umfassen Zellen in vivo sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier oder einer Pflanze befinden.
Es ist außerdem beabsichtigt, die TIE-Liganden-Homologe dieser Erfindung durch rekombinante Rekombination oder mit rekombinanten Produktionsverfahren unter Einsatz von Kontrollelementen zu produzieren, die in Zellen eingeführt werden, die bereits die für den jeweiligen TIE-Liganden kodierende DNA enthalten.
Eine Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung der mRNA-Transkription (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Es können verschiedene Marker eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P. Jedoch können auch andere Techniken eingesetzt werden, wie z.B. die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer breiten Vielfalt von Markern, wie z.B. Radionukliden, Fluoreszierern, Enzymen oder dergleichen markiert sein können. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Test kann ausgeführt werden, wo der Duplex an der Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Duplexbildung an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper detektiert werden kann.
Eine Genexpression kann alternativ dazu mittels immunologischen Verfahren gemessen werden, beispielsweise durch immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, um die Genproduktexpression direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbetechniken wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Entwässerung und Fixierung, gefolgt von der Reaktion mit markierten Antikörpern, die für das gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Marker üblicherweise visuell nachweisbar sind, wie z.B. enzymatische Marker, fluoreszierende Marker, lumineszierende Marker und dergleichen. Eine besonders empfindliche Färbetechnik, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird von Hse et al., Am. J. Clin. Pharm. 75, 734-738 (1980), beschrieben.
Für immunhistochemische Färbung und/oder das Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Tier hergestellt werden. In geeigneter Weise können Antikörper gegen ein natives TIE-Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenz wie hierin weiter unten beschrieben hergestellt werden.
Das TIE-Liganden-Homolog kann in Wirtszellen in Form von Einschlusskörperchen produziert oder in den periplasmatischen Raum oder in das Kulturmedium sekretiert werden und wird typischerweise aus Wirtszelllysaten gewonnen. Die rekombinanten Ligandenhomologe können mittels jeglicher Technik gereinigt werden, die die anschließende Bildung eines stabilen Proteins ermöglicht.
Wenn das TIE-Liganden-Homolog in einer rekombinanten Zelle exprimiert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist es vollständig frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist es notwendig, das TIE-Liganden-Homolog von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die bezüglich des Liganden im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. Die Membran- und löslichen Proteinfraktionen werden dann getrennt. Das TIE-Liganden-Homolog kann dann aus der löslichen Proteinfraktion gereinigt werden. Die folgenden Verfahren sind beispielgebend für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an Immunoaffinitäts- oder Ionentauschersäulen; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Kieselgel oder an einem Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammonsulfatpräzipitation; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; und Protein-A-Sepharose-Säulen, um Verunreinigungen, wie z.B. IgG, zu entfernen.
Funktionelle Derivate der TIE-Liganden-Homologe, bei denen Reste deletiert, insertiert und/oder substituiert worden sind, werden in derselben Weise wie die nativen Liganden gereinigt, wobei jegliche wesentlichen, durch die Abänderungen veranlassten Veränderungen der Eigenschaften berücksichtigt werden. Beispielsweise erleichtert die Fusion des TIE-Liganden-Homologs mit einem anderen Protein oder Polypeptid, z.B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Antikörper gegen das Antigen enthaltende Immunoaffinitätssäule kann verwendet werden, um die Fusion zu absorbieren. Immunoaffinitätssäulen, wie z.B. eine polyklonale Kaninchen-Anti-TIE-Liganden-Homolog-Säule, kann eingesetzt werden, um TIE-Liganden-Homolog-Varianten durch Binden an zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren. Ein Proteaseinhibitor, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kann auch zweckdienlich sein, um den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und es können Antibiotika mit enthalten sein, um das Wachstum von hinzukommenden Kontaminanten zu verhindern. Die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung werden in geeigneter Weise mittels Affinitätschromatographie auf Basis ihrer Fähigkeit gereinigt, an einen TIE-Rezeptor, z.B. TIE-2, zu binden.
Ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass für native TIE-Liganden-Homologe geeignete Reinigungsverfahren Modifizierungen erfordern können, um Änderungen des Charakters eines nativen TIE-Liganden-Homologs oder seiner Varianten bei Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen.
D. Verwendung der TIE-Liganden-Homologe, Nucleinsäuremoleküle und Antikörper
Es wird erwartet, dass die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung für die Begünstigung des Überlebens und/oder Wachstums und/oder der Differenzierung von TIE-Rezeptor-exprimierenden Zellen in Zellkultur zweckdienlich sind.
Die TIE-Liganden-Homologe können zusätzlich verwendet werden, um Zellen zu identifizieren, die native TIE-Rezeptoren exprimieren. Zu diesem Zweck wird ein nachweisbar markierter Ligand mit einer Zielzelle unter Bedingungen kontaktiert, die seine Bindung an seine Rezeptoren (TIE-Rezeptor) ermöglichen, wobei die Bindung überprüft wird.
Die TIE-Liganden-Homologe hierin können außerdem verwendet werden, um Moleküle zu identifizieren, die eine biologische Aktivität eines TIE-Liganden-Homolog aufweisen, beispielsweise durch Exponieren einer ein TIE-Liganden-Homolog der Erfindung exprimierenden Zelle mit einem Testmolekül und Nachweisen der spezifischen Bindung des Testmoleküls an einen TIE-Rezeptor entweder durch direkten Nachweis oder auf Basis sekundärer biologischer Wirkungen. Dieser Ansatz ist insbesondere zur Identifizierung neuer Mitglieder der TIE-Liganden-Familie oder zum Screening von Peptidbibliotheken oder Bibliotheken kleiner Moleküle geeignet.
Die hierin offenbarten TIE-Liganden-Homologe sind außerdem in Screeningtests nützlich, die konstruiert sind, um Agonisten oder Antagonisten eines nativen TIE-Rezeptors zu identifizieren, die eine bedeutende Rolle bei Knochenentwicklung, -reifung und -wachstum oder bei Muskelwachstum oder -entwicklung spielen und/oder Angiogenese fördern oder hemmen. Beispielsweise können Antagonisten eines TIE-Rezeptors auf Basis ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die Bindung eines TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung an einen nativen TIE-Rezeptor zu blockieren, die beispielsweise unter Anwendung der BIAcore-Biosensortechnologie (BIAcore; Pharmacia Biosensor, Midscataway, NJ) oder durch Überprüfung ihrer Fähigkeit gemessen werden kann, die biologische Reaktion zu blockieren, die durch ein aktives TIE-Liganden-Homolog dieser Erfindung verursacht wird. Biologische Reaktionen, die überprüft werden können, umfassen beispielsweise die Phosphorylierung des TIE-Rezeptors oder von Stromab-Komponenten des TIE-Signalübertragungswegs oder Überleben, Wachstum oder Differenzierung von Zellen, die den TIE-Rezeptor exprimieren. Auf Zellen basierende Tests unter Einsatz von den TIE-Rezeptor normalerweise nicht exprimierenden Zellen, die konstruiert sind, um diesen Rezeptor zu exprimieren oder um den TIE-Rezeptor und ein TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden Erfindung zusammen zu exprimieren, sind zur Verwendung besonders geeignet.
In einer speziellen Ausführungsform können kleine Agonisten- und Antagonistenmoleküle eines nativen TIE-Rezeptors auf Basis ihrer Fähigkeit identifiziert werden, die TIE-Ligand/TIE-Rezeptor-Wechselwirkung zu stören. Es bestehen zahlreiche Möglichkeiten der Messung der spezifischen Bindung eines Testmoleküls an einen TIE-Rezeptor, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, den Nachweis oder die Messung der Menge eines Testmoleküls, die an der Oberfläche intakter, den TIE-Rezeptor exprimierender Zellen gebunden, mit dem TIE-Rezeptor in Zelllysaten vernetzt oder an den TIE-Rezeptor in vitro gebunden ist.
Nachweisbar markierte TIE-Liganden-Homologe umfassen beispielsweise TIE-Liganden-Homologe, die kovalent oder nicht kovalent an radioaktive Substanzen, z.B. ¹²⁵I, eine fluoreszierende Substanz, eine Substanz mit Enzymaktivität (vorzugsweise für kolorimetrischen Nachweis geeignet) oder eine Substanz gebunden sind, die von einem (nachweisbar markierten) Antikörpermolekül erkannt werden kann.
Die Tests können auf ähnliche Weise durchgeführt werden, wie sie in der am 18. April 1996 veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 96/11269 beschrieben ist.
Die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sind außerdem zur Reinigung von TIE-Rezeptoren zweckdienlich, gegebenenfalls in Form von Immunoadhäsinen, bei denen der TIE-Ligand oder der TIE-Rezeptor-bindende Abschnitt davon an eine konstante Immunglobulin-Schwer- oder -Leichtkettenregion fusioniert ist.
Außerdem können die neuen TIE-Liganden-Homologe hierin verwendet werden, um die Gefäßneubildung zu fördern und können zur Hemmung von Tumorwachstum zweckdienlich sein.
Die Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung sind zum Nachweis der Expression der TIE-Liganden-Homologe in Zellen oder Gewebeschnitten zweckdienlich. Zellen oder Gewebeschnitte können mit einem nachweisbar markierten, für einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung kodierenden Nucleinsäuremolekül unter Hybridisierungsbedingungen kontaktiert und die Gegenwart von an das Nucleinsäuremolekül hybridisierter mRNA ermittelt werden, wodurch die Expression des TIE-Liganden nachgewiesen wird.
Antikörper der vorliegenden Erfindung können beispielsweise in Immuntests verwendet werden, um die Mengen eines TIE-Liganden in einer biologischen Probe zu messen. Die biologische Probe wird mit einem Antikörper oder Antikörpergemisch kontaktiert, der/das einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung spezifisch bindet, und es wird die Menge des Komplexes gemessen, der sich mit einem in der Testprobe vorhandenen Liganden bildet.
Antikörper gegen die TIE-Liganden-Homologe hierin können außerdem zur Abgabe von zytotoxischen Molekülen wie z.B. Radioisotopen oder Toxinen oder therapeutischen Mitteln an Zellen verwendet werden, die einen entsprechenden TIE-Rezeptor exprimieren. Die therapeutischen Mittel können beispielsweise andere TIE-Liganden-Homologe, einschließlich der TIE-2-Ligand, Elemente der Gefäßendothelwachstumsfaktor- (VEGF-) Familie oder bekannte Antitumormittel und Mittel sein, die bekanntermaßen mit Muskelwachstum und -entwicklung oder Knochenentwicklung, -reifung oder -wachstum in Zusammenhang stehen.
Zur therapeutischen Verwendung werden die TIE-Liganden-Homologe oder Anti-TIE-Liganden-Antikörper der vorliegenden Erfindung als therapeutische Zusammensetzung formuliert, die den/die aktiven Bestandteil(e) in Beimischung mit einem pharmakologisch annehmbaren Vehikel umfasst, das für systemische oder topische Anwendung geeignet ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden zur Lagerung hergestellt, indem der aktive Bestandteil mit dem gewünschten Reinheitsgrad gegebenenfalls mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen vermischt wird. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit und Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder PEG.
Die aktiven Bestandteile können auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt wurden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- bzw. Gelatine-Mikrokapseln und Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, in kolloidalen Medikamentabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o., offenbart.
Die zur In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen müssen steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erzielt werden.
Therapeutische Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter mit steriler Einfüllöffnung gegeben, beispielsweise in einen Beutel für intravenöse Lösungen oder in ein Fläschchen mit einem von einer Subkutankanüle durchstechbaren Stopfen.
Der Verabreichungsweg steht im Einklang mit bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion über intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokuläre, intraarterielle oder intraläsionale Wege, topische Verabreichung oder Systeme mit nachhaltiger Freisetzung.
Geeignete Beispiele von Präparaten mit nachhaltiger Freisetzung (Retardpräparate) umfassen semipermeable Polymermatrices in Form von Formteilchen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln. Matrices mit nachhaltiger Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele, Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-glutamat (U. Sidman et al., Biopolymers 22(1), 547-556 (1983)), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 (1981), und R. Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982)), Ethylenvinylacetat (R. Langer et al., idem) oder Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988A ). Zusammensetzungen mit nachhaltiger Freisetzung umfassen auch Liposomen. Liposomen, die ein im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthaltenes Molekül enthalten, werden mittels Verfahren hergestellt, die an sich bekannt sind: DE 3.218.121A ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030-4034 (1980); EP 52322A ; EP 36676A ; EP 88046A ; EP 143949A ; EP 142641A ; Japanische Patentanmeldung 83-118008; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324A . Für gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200-800 Ångström) unilamellaren Typ, bei dem der Lipidgehalt höher als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der gewählte Anteil für die optimale NT-4-Therapie eingestellt wird.
Eine wirksame Menge eines therapeutisch einzusetzenden Moleküls der vorliegenden Erfindung wird beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und vom Leiden des Patienten abhängen. Demgemäß wird es für den Therapeuten notwendig sein, die Dosierung zu titrieren und die Verabreichung je nach Bedarf zu modifizieren, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische tägliche Dosis kann in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren im Bereich von etwa 1 μg/kg bis zu 100 mg/kg oder mehr liegen. Typischerweise wird der Kliniker ein Molekül der vorliegenden Erfindung verabreichen, bis eine Dosis erreicht ist, die für die erforderliche biologische Wirkung sorgt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht durch herkömmliche Tests überprüft werden.
Falls es das therapeutische Ziel ist, Tumoren vorzubeugen oder Tumoren zu behandeln, können die Verbindungen hierin mit anderen Therapien kombiniert werden. Beispielsweise kann der mit derartigen Antikrebsmitteln zu behandelnde Patient auch eine Bestrahlungstherapie erhalten. Alternativ oder zusätzlich dazu kann dem Patienten ein chemotherapeutisches Mittel verabreicht werden. Als Herstellungs- und Dosierungspläne für derartige chemotherapeutische Mittel können jene gemäß den Vorschriften des Herstellers oder wie sie vom geübten Arzt empirisch ermittelt wurden verwendet werden. Herstellungs- und Dosierungspläne für derartige Chemotherapien sind auch in Chemotherapy Service, M.C. Perry (Hrsg.), Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992), beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel kann der Verabreichung des Antitumormittels vorangehen oder folgen oder kann gleichzeitig damit verabreicht werden.
Es kann wünschenswert sein, außerdem Antikörper gegen andere tumorassoziierte Antigene zu verabreichen, wie z.B. Antikörper, die an ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder Gefäßendothelfaktor (VEGF) binden. Alternativ oder zusätzlich dazu können zwei oder mehr Antikörper, die dasselbe oder zwei oder mehrere verschiedene hierin offenbarte Antigene binden, dem Patienten zusammen verabreicht werden. Manchmal kann es vorteilhaft sein, dem Patienten außerdem ein oder mehrere Cytokine zu verabreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antitumorverbindungen hierin zusammen mit einem weiteren wachstumshemmenden Mittel verabreicht.
Zur Prävention oder Behandlung einer Krankheit wird die geeignete Dosierung eines Antitumormittels, z.B. eines Antikörpers der Erfindung, von der wie oben definierten Art der zu behandelnden Krankheit, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob das Mittel zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von der vorausgehenden Therapie, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf das Mittel und vom Ermessen des behandelnden Arztes abhängen. Das Mittel wird dem Patienten in geeigneter Weise auf einmal oder über eine Reihe von Behandlungen hinweg verabreicht.
Weitere Einzelheiten der Erfindung werden aus den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen offensichtlich.
Beispiel 1
Identifizierung von NL2
NL2 wurde durch Screening der GenBank-Datenbank unter Verwendung des Computerprogramms BLAST identifiziert (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996)). Die NL2-Sequenz zeigt eine Homologie mit bekannten EST-Sequenzen T08223, AA122061 und M62290. Keine der bekannten Sequenzen ist als Sequenz voller Länge identifiziert oder als mit den TIE-Rezeptoren in Verbindung stehender Ligand beschrieben worden.
Nach seiner Identifizierung wurde NL2 aus einer Bibliothek der menschlichen fötalen Lunge kloniert, die aus von Clontech, Inc. (Palo Alto, CA, USA) bezogener mRNA nach den Anleitungen des Herstellers hergestellt wurde. Die Bibliothek wurde mittels Hybridisierung mit synthetischen Oligonucleotidsonden gescreent:
Für NL2:
NL2,5-1 ATGAGGTGGCCAAGCCTGCCCGAAGAAAGAGGC Seq.-ID NT. 7
NL2,3-1 CAACTGGCTGGGCCATCTCGGGCAGCCTCTTTCTTCGGG Seq.-ID Nr. 8
NL2,3-4 CCCAGCCAGAACTCGCCGTGGGGA Seq.-ID Nr. 9
auf Basis der in der GenBank-Datenbank gefundenen ESTs. cDNA-Sequenzen wurden vollständig sequenziert.
Die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von NL2 sind in 2 (Seq.-ID Nr. 1) bzw. 3 (Seq.-ID Nr. 2) dargestellt.
Ein Klon von NL2 (NL2-DNA 22780-1078) wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 18. September 1997 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 209284.
Beispiel 2
Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse und In-situ-Hybridisierung
Die Expression der NL2-mRNA in menschlichen Geweben wurde mittels Northern-Blot-Analyse untersucht. Menschliche mRNA-Blots wurden an eine ³²P-markierte DNA-Sonde auf Basis der cDNAs voller Länge hybridisiert; die Sonden wurden durch Verdauen und Reinigen der cDNA-Inserte erzeugt. „Human fetal RNA blot MTN" (Clontech) und „human adult RNA blot MTN-II" (Clontech) wurden mit den DNA-Sonden inkubiert. Die Blots wurden mit den Sonden in Hybridisierungspuffer (5 × SSPE; 2Denhardt-Lösung; 100 mg/ml denaturierte, gescherte Lachsspermien-DNA; 50 % Formamid; 2 % SDS) für 60 Stunden bei 42 °C inkubiert. Die Blots wurden mehrere Male in 2 × SCC, 0,05 % SDS für 1 Stunde bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einer Waschung für 30 Minuten in 0,1 × SSC; 0,1 % SDS bei 50 °C. Die Blots wurden nach Exposition über Nacht mittels Phosphorimager-Analyse (Fuji) entwickelt.
Wie in 8 dargestellt, wurden NL2-mRNA-Transkripte nachgewiesen.
Beispiel 3
Expression von NL2 in E. coli
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer unglykosylierten Form der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung in E. coli. Die für einen NL-2-Liganden kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) wird zunächst unter Verwendung ausgewählter Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten, die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen. Es kann eine Vielzahl an Expressionsvektoren eingesetzt werden. Der Vektor wird vorzugsweise für ein Antibiotikaresistenzgen, einen Replikationsstartpunkt, einen Promotor und eine Ribosombindungsstelle kodieren. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (hergeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert.
Das Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen gewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, worauf antibiotikaresistente Kolonien selektiert werden. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels Restriktionsanalyse bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in Flüssigmedium, wie z.B. mit Antibiotika ergänzter IB-Bouillon, gezüchtet werden, Die Übernachtkultur kann anschließend verwendet werden, um eine Kultur im größeren Maßstab zu inokulieren. Die Zellen werden dann auf eine gewünschte optische Dichte gezüchtet. Es kann ein Induktor, wie z.B. IPTG, zugegeben werden.
Nach dem Kultivieren der Zellen für mehrere weitere Stunden können die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das durch die Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden, worauf das solubilisierte Protein unter Verwendung einer Metallchelatsäule unter Bedingungen gereinigt werden kann, die eine feste Bindung des Proteins ermöglichen.
In der Tat wurde NL2 in E. coli unter Anwendung des folgenden Verfahrens in Poly-His-markierter Form exprimiert. Die für NL2 kodierende DNA wurde anfänglich unter Verwendung gewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer enthielten Restriktionsenzymstellen, die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen, und andere zweckdienliche Sequenzen, die für die effiziente und zuverlässige Translationsinitiation sorgen und die schnelle Reinigung an einer Metallchelatsäule und die proteolytische Entfernung mit Enterokinase ermöglichen. Die PCR-amplifizierte, Poly-His-markierte Sequenz wurde dann in einen Expressionsvektor ligiert, der verwendet wurde, um einen E.-coli-Wirt auf Basis von Stamm 52 (W3110 fuhA(tonA)Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq)) zu transformieren. Transformanten wurden zunächst in 50 mg/ml Carbenicillin enthaltendem LB bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet, bis eine O.D.600 von 3-5 erreicht war. Die Kulturen wurden dann 50- bis 100fach in CRAP-Medium (hergestellt durch Vermischen von 3,57 g (NH₄)₂SO₄, 0,71 g Natriumcitrat.2H₂O, 1,07 g KCl, 5,36 g Difco-Hefeextrakt, 5,36 g Sheffield-Hycase SF in 500 ml Wasser, sowie 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55 % (Gew./Vol.) Glucose und 7 mM MgSO₄) verdünnt und für ungefähr 20-30 Stunden bei 30 °C unter Schütteln gezüchtet. Es wurden Proben entnommen, um die Expression mittels SDS-PAGE-Analyse zu verifizieren, und der Hauptteil der Kultur wurde zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Zellpellets wurden bis zur Reinigung und Neufaltung eingefroren.
E.-coli-Paste aus 0,5- bis 1-Liter-Fermentationen (6-10 g Pellets) wurde in 10 Volumenanteilen (Gew./Vol.) Puffer (7 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 8) resuspendiert. Es wurden festes Natriumsulfit und Natriumtetrathionat zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,1 M bzw. 0,02 M zu erzielen, und die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C gerührt. Dieser Schritt resultiert in einem denaturierten Protein, bei dem alle Cysteinreste durch Sulfitolyse blockiert sind. Die Lösung wurde bei 40.000 U/mom in einer Beckman-Ultrazentrifuge für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 3-5 Volumenanteilen Metallchelatpuffer (6 M Guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) verdünnt und zur Klärung durch 0,22-μm-Filter filtriert. Der geklärte Extrakt wurde auf eine im Metallchelatpuffer äquilibrierte Qiagen-Ni-NTA-Metallchelatsäule von 5 ml aufgegeben. Die Säule wurde mit zusätzlichem, 50 mM Imidazol (Calbiochem, Utrol-Qualität) enthaltendem Puffer (pH 7,4) gewaschen. Das Protein wurde mit 250 mM Imidazol enthaltendem Puffer eluiert. Das gewünschte Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und bei 4 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde über seine Absorption bei 280 nm unter Verwendung des auf Basis seiner Aminosäuresequenz berechneten Extinktionskoeffizienten abgeschätzt.
Das Protein wurde neu gefaltet, indem die Probe langsam in frisch hergestelltem Neufaltungspuffer verdünnt wurde, der aus Folgendem bestand: 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M Harnstoff, 5 mM Cystein, 20 mM Glycin und 1 mM EDTA. Neufaltungsvolumina wurden so gewählt, dass die Proteinendkonzentration zwischen 50 und 100 Mikrogramm/ml lag. Die Neufaltungslösung wurde bei 4 °C für 12-36 Stunden leicht gerührt. Die Neufaltungsreaktion wurde durch Zugabe von TFA auf eine Endkonzentration von 0,4 % (pH ungefähr 3) gestoppt. Vor der weiteren Reinigung des Proteins wurde die Lösung durch ein 0,22-μm-Filter filtriert und mit Acetonitril auf eine Endkonzentration von 2-10 % versetzt. Das neugefaltete Protein wurde an einer Poros-R1/H-Umkehrphasensäule unter Verwendung eines Mobilphasenpuffers von 0,1 % TFA chromatographiert, wobei mit einem Acetonitril-Gradienten von 10 bis 80 % eluiert wurde. Aliquoten von Fraktionen mit Absorption bei 280 nm wurden an SDS-Polyacrylamidgelen analysiert, und Fraktionen, die homogen neugefaltetes Protein enthielten, wurden vereinigt. Im Allgemeinen werden die richtig gefalteten Spezies der meisten Proteine bei den niedrigsten Acetonitril-Konzentrationen eruiert, da diese Spezies die kompaktesten sind, wobei ihr hydrophobes Inneres von der Wechselwirkung mit dem Umkehrphasenharz abgeschirmt ist. Aggregierte Spezies werden üblicherweise bei höheren Acetonitril-Konzentrationen eluiert. Zusätzlich zur Trennung fehlgefalteter Proteinformen von der gewünschten Form entfernt der Umkehrphasenschritt auch Endotoxin aus den Proben.
Das gewünschte, gefaltete NL2-Protein enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril unter Verwendung eines leichten, gegen die Lösung gerichtete Stickstoffstroms entfernt. Die Proteine wurden in 20 mM Hepes, pH 6,8, mit 0,14 M Natriumchlorid und 4 % Mannit formuliert, mittels Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung von in Formulierungspuffer äquilibriertem G25 Superfine (Pharmacia) gereinigt und sterilfiltriert.
Beispiel 4
Expression von NL2 in Säugetierzellen
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer glykosylierten Form des NL2-Liganden-Homologs durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
Der Vektor pRK5 (siehe EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls wird die NL2-DNA mit gewählten Restriktionsenzymen in pRK ligiert, um die Insertion der NL2-DNA unter Verwendung von Ligationsverfahren zu ermöglichen, wie sie z.B. in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind. Der resultierende Vektor wird pRK5-NL2 genannt.
In einer der Ausführungsformen können die gewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. mit Fötalkälberserum und gegebenenfalls mit Nährstoffkomponenten und/oder Antibiotika ergänztem DMEM bis zur Konfluenz gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-NL2-DNA werden mit etwa 1 μg der für das VA-RNA-Gen kodierenden DNA (Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)) vermischt und in 500 μl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ gelöst. Zu diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugegeben, und es wird die Ausbildung eines Präzipitats für 10 Minuten bei 25 °C ermöglicht. Das Präzipitat wird suspendiert, zu den 293-Zellen zugegeben und für etwa vier Stunden bei 37 °C absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und es werden 2 ml 20%iges Glycerin in PBS für 30 Sekunden zugegeben. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, worauf frisches Medium zugegeben wird und die Zellen für etwa 5 Tage inkubiert werden.
Ungefähr 24 Stunden nach den Transfektionen wurde das Kulturmedium entfernt und durch Kulturmedium (für sich alleine) oder 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin enthaltendes Kulturmedium ersetzt. Nach Inkubation für 12 Stunden wird das konditionierte Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel aufgegeben. Das verarbeitete Gel kann getrocknet und für eine gewählte Zeitdauer einem Film exponiert werden, um die Gegenwart von NL2-Polypeptid nachzuweisen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten, können einer weiteren Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen und das Medium in gewählten Biotests getestet werden.
In einer alternativen Technik kann NL2 unter Verwendung des von Somparyac et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, 7575 (1981), beschriebenen Dextransulfatverfahrens vorübergehend in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden in einer Spinner-Flasche auf maximale Dichte gezüchtet, und es werden 700 μg pRK5-NL2-DNA zugegeben. Die Zellen werden zunächst mittels Zentrifugation aus der Spinner-Flasche konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird auf dem Zellpellet für vier Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin für 90 Sekunden behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Spinner-Flasche überführt, die Gewebekulturmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Trümmer zu entfernen. Die exprimiertes NL2 enthaltende Probe kann dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren, wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
In einer weiteren Ausführungsform kann NL2 in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-NL2 kann unter Verwendung bekannter Reagenzien, wie z.B. CaPO₄ oder DEAE-Dextran, in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben beschrieben können die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (für sich alleine) oder Medium ersetzt werden, das einen Radiomarker, wie z.B. ³⁵S-Methionin, enthält. Nach Ermittlung der Gegenwart von NL2-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen für etwa 6 Tage inkubiert, worauf das konditionierte Medium geerntet wird. Das exprimiertes NL2 enthaltende Medium kann dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
Epitop-markiertes NL2 kann ebenfalls in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. NL2 kann aus dem pRK5-Vektor heraus subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann einer PCR unterzogen werden, um In-frame mit einem gewählten Epitop-Marker, wie z.B. einem Poly-His-Marker, in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das Poly-His-markierte NL2-Insert kann dann in einen SV40-angetriebenen Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker, wie z.B. DHFR, zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie oben beschrieben) mit dem SV40-angetriebenen Vektor transfiziert werden. Es kann wie oben beschrieben eine Markierung durchgeführt werden, um die Expression zu verifizieren. Das Kulturmedium, das das exprimierte Poly-His-markierte NL2 enthält, kann dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren, wie z.B. mittels Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie, konzentriert und gereinigt werden.
Glykosylierte Formen von NL2 wurden in der Tat in CHO-Zellen als Poly-His-markierte Formen exprimiert. Nach PCR-Amplifikation wurde die NL2-DNA in einen CHO-Expressionsvektor unter Anwendung standardmäßiger Techniken subkloniert, die in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Abschnitt 3.16, John Wiley and Sons (1997), beschrieben sind. CHO-Expressionsvektoren werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse aufweisen, um das geeignete Shuttling von cDNAs zu ermöglichen. Der zur Expression von NL2 in CHO-Zellen verwendete Vektor entspricht dem in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24, 9, 1774-1779 (1996), beschriebenen und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um die Expression der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) anzutreiben. DHFR-Expression ermöglicht die Selektion auf stabile Erhaltung des Plasmids nach Transfektion.
Zwölf Mikrogramm für NL2 kodierende Plasmid-DNA wurden in ungefähr 10 Millionen CHO-Zellen unter Verwendung der im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien Superfect^® (Quiagen), Dosper^® oder Fugene^® (Böhringer-Mannheim) eingeführt. Die Zellen wurden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Ungefähr 3 × 10^-7 Zellen wurden für weiteres Wachstum und Produktion wie unten beschrieben in einer Ampulle eingefroren.
Die NL2-Plasmid-DNA enthaltende Ampulle wurde aufgetaut, indem sie in ein Wasserbad gestellt und mittels Vortexen gemischt wurde. Der Inhalt wurde in ein Zentrifugenröhrchen pipettiert, das 10 ml Medium enthielt, und bei 1.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in 10 ml Selektivmedium resuspendiert (0,2-μm-filtriertes PS20 mit 5 % 0,2-μm- diafiltriertem Fötalrinderserum). Die Zellen wurden dann in einen 90 ml Selektivmedium enthaltenden 100-ml-Spinner aliquotiert. Nach 1-2 Tagen wurden die Zellen in einen mit 150 ml Selektivwachstumsmedium befüllten 250-ml-Spinner überführt und bei 37 °C inkubiert. Nach weiteren 2-3 Tagen wurden jeweils ein 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Spinner mit 3 × 10⁵ Zellen/ml beimpft. Das Medium wurde durch Zentrifugation und Resuspension in Produktionsmedium gegen frisches Medium ausgetauscht. Es kann jegliches geeignete CHO-Medium eingesetzt werden, wie es z.B. im am 16. Juni 1992 erteilten US-Patent Nr. 5.122.469 beschrieben ist. Ein 3-Liter-Produktionsspinner wird mit 1,2 × 10⁶ Zellen/ml beimpft. Am Tag 0 wurden Zellzahl und pH ermittelt. Am Tag 1 wurden dem Spinner Proben entnommen und die Begasung mit filtrierter Luft begonnen. Am Tag 2 wurden dem Spinner Proben entnommen, die Temperatur auf 33 °C geändert und 20 ml einer Lösung aus 500 g/l Glucose und 0,6 ml 10%iger Antischaum (z.B. 35 Polydimethylsiloxan-Emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) zugegeben. Über die gesamte Produktion hinweg wurde der pH gegebenenfalls eingestellt, um ihn um 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen oder wenn die Lebensfähigkeit unter 70 % gesunken war, wurde die Zellkultur mittels Zentrifugation geerntet und durch ein 0,22-μm-Filter filtriert. Das Filtrat wurde bei 4 °C bis zum Aufgeben auf eine Reinigungssäule gelagert.
Die Poly-His-markierten Formen wurden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Quiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4 °C auf eine Ni-NTA-Säule von 5 ml gepumpt, die in 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem 20 mM Hepes-Puffer (pH 7,4) äquilibriert war. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das gereinigte Protein wurde anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia) in einen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit bei pH 6,8 enthaltenden Lagerungspuffer entsalzt und bei -80 °C gelagert.
Die Homogenität des gereinigten Proteins wurde mittels SDS-PAGE bestätigt und die N-terminale Aminosäuresequenzierung mittels Edman-Abbau durchgeführt.
Beispiel 5
Expression von NL2 in Hefe
Zuerst werden Expressionsvektoren für intrazelluläre Produktion oder Sekretion von NL2 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. Für NL2, ein gewähltes Signalpeptid und den Promotor kodierende DNA wird in geeignete Restriktionsenzymstellen im gewählten Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression von NL2 zu steuern. Zur Sekretion kann für NL2 kodierende DNA zusammen mit DNA in das gewählte Plasmid kloniert werden, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, die Hefe-Alphafaktor-Sekretionssignal/Leader-Sequenz und Linkersequenzen (falls benötigt) zur Expression von NL2 kodiert.
Hefezellen, wie z.B. Hefestamm AB110, können dann mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in gewählten Fermentationsmedien kultiviert werden. Die transformierten Hefeüberstände können mittels Präzipitation mit 10 Trichloressigsäure und Trennung mittels SDS-PAGE, gefolgt von Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff analysiert werden.
Rekombinantes NL2 kann anschließend isoliert und gereinigt werden, indem die Hefezellen aus dem Fermentationsmedium mittels Zentrifugation entfernt werden und das Medium dann unter Verwendung gewählter Kartuschenfilter konzentriert wird. Das NL2 enthaltende Konzentrat kann unter Verwendung gewählter Säulenchromatographieharze weiter gereinigt werden.
Beispiel 6
Expression von NL2 in Baculovirus-transfizierten Insektenzellen
Das folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von NL2 in Baculovirus-transfizierten Insektenzellen.
Das NL2 wird stromauf eines im Baculovirus-Expressionsvektor enthaltenen Epitopmarkers fusioniert. Derartige Epitopmarker umfassen Poly-His-Marker und Immunglobulin-Marker (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide, die sich von im Handel erhältlichen Plasmiden, wie z.B. pVL1393 (Novagen), herleiten. Zusammenfassend wird NL2 oder der gewünschte Abschnitt des NL2 (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Der 5'-Primer kann flankierende (gewählte) Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit diesen gewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Cotransfizieren des obigen Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- („Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach 4-5 Tagen Inkubation bei 28 °C werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet. Virusinfektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, Oxford (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes Poly-His-markiertes NL2 kann dann beispielsweise mittels Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie wie folgt gereinigt werden: Es werden Extrakte aus rekombinanten, virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175-179 (1993), beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 mM Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA; 10 Glycerin; 0,1 % NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal für 20 Sekunden auf Eis beschallt. Die beschallten Proben werden mittels Zentrifugation geklärt und der Überstand wird 50fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) verdünnt und durch ein 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel von Qiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird bei 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird auf A₂₈₀-Basislinie mit Beladungspuffer gewaschen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Fraktionensammlung gestartet wird. Als Nächstes wird die Säule mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 % Glycerin, pH 6,0) gewaschen, was unspezifisch gebundenes Protein entfernt. Nach erneutem Erreichen der A₂₈₀-Basislinie wird die Säule mit einem Gradienten von 0 bis 500 mM Imidazol im zweiten Waschpuffer entwickelt. Es werden Einmilliliterfraktionen gesammelt und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot an Alkalische Phosphatase konjugiertem mit Ni²⁺-NTA (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die eluiertes, His₁₀-markiertes FLS139, NL2 und NL3 enthalten, werden vereinigt und gegen Beladungspuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) NL2 unter Anwendung bekannter chromatographischer Techniken, einschließlich beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
NL2 wurde in Baculovirus-infizierten High5-Zellen in Poly-His-markierten Formen exprimiert. Während die Expression tatsächlich in einem Maßstab von 0,5 Litern durchgeführt wurde, kann sie für größere Präparationen (z.B. 8 Liter) leicht maßstabsvergrößert werden.
Nach der PCR-Amplifikation wurden die entsprechenden Sequenzen in einen Baculovirus-Expressionsvektor (pb.PH.His.c) subkloniert und der Vektor und Baculogold^®-Baculovirus-DNA (Pharmingen) in High5-Zellen unter Verwendung von Lipofectin (Gibco BRL) cotransfiziert. pb.PH.His ist eine Modifikation des im Handel erhältlichen Baculovirus-Expressionsvektors pVL1393 (Pharmingen) mit einer modifizierten Polylinkerregion, die His-Sequenzen enthält. Die Zellen wurden in mit 10 % FBS (Hyclone) ergänztem Hink's TNM-FH-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden für 5 Tage bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet und anschließend für die erste virale Amplifikation verwendet, indem Sf9-Zellen in mit 10 % FBS ergänztem Hink's TNM-FH-Medium bei einer ungefähren Infektionsmultiplizität (MOI) von 10 infiziert wurden. Die Zellen wurden für 3 Tage bei 28 °C inkubiert. Der Überstand wurde geerntet, und die Expression der NL2-Konstrukte im Baculovirus-Expressionsvektor wurde durch Chargenbindung von 1 ml Überstand an 25 ml Ni-NTA-Kügelchen (QIAGEN), gefolgt von SDS-PAGE-Analyse im Vergleich zu einer bekannten Konzentration von Proteinstandard mittels Coomassie-Blau-Färbung ermittelt.
Der erste virale Amplifikationsüberstand wurde verwendet, um eine Spinner-Kultur (500 ml) von in ESF-921-Medium (Expression Systems LLC) gezüchteten High5-Zellen bei einer ungefähren MOI von 0,1 zu infizieren. Die Zellen wurden für 3 Tage bei 28 °C gezüchtet. Der Überstand wurde geerntet und filtriert. Chargenbindung und SDS-PAGE-Analyse wurden gegebenenfalls wiederholt, bis die Expression der Spinner-Kultur bestätigt war.
Das konditionierte Medium der transfizierten Zellen (0,5 bis 3 Liter) wurde mittels Zentrifugation geerntet, um die Zellen zu entfernen, und durch 0,22-μm-Filter filtriert. Die Poly-His-markierten Konstrukte wurden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Qiagen) gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Die konditionierten Medien wurden bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4-5 ml/min bei 4 °C auf eine in 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem 20 mM Hepes-Puffer (pH 7,4) äquilibrierte Ni-NTA-Säule von 5 ml gepumpt. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert. Das hochgereinigte Protein wurde anschließend mit einer G25-Superfine-Säule (Pharmacia) von 25 ml in einen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit (pH 8,0) enthaltenden Lagerungspuffer entsalzt und bei -80 °C gelagert.
Die Homogenität des NL2-Proteins wurde mittels SDS-Polyacrylamid- (PEG-) Elektrophorese und N-terminaler Sequenzierung mittels Edman-Abbau verifiziert.
Beispiel 7
Herstellung von Antikörpern, die NL2 binden
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung monoklonaler Antikörper, die spezifisch NL2 binden können.
Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben. Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigte Ligandenhomologe der vorliegenden Erfindung, derartige Ligandenhomologe enthaltende Fusionsproteine und Zellen, die rekombinante Ligandenhomologe an der Zelloberfläche exprimieren. Die Wahl des Immunogens kann vom geübten Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren vorgenommen werden.
Mäuse, wie z.B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freundschem Adjuvans emulgierten Immunogen immunisiert und subkutan oder intraperitoneal in einer Menge von 1-100 Mikrogramm injiziert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemicals Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfoten des Tiers injiziert. Die immunisierten Mäuse werden dann 10 bis 12 Tage später mit zusätzlichem, im gewählten Adjuvans emulgiertem Immunogen geboostet. Danach können die Mäuse außerdem für mehrere Wochen mit zusätzlichen Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können aus den Mäusen durch retroorbitale Blutung zum Testen in ELISA-Tests periodisch erlangt werden, um die Antikörper nachzuweisen.
Nachdem ein geeigneter Antikörpertiter nachgewiesen worden ist, können die für Antikörper „positiven" Tiere mit einer letzten intravenösen Injektion des gegebenen Liganden injiziert werden. Drei bis vier Tage später werden die Mäuse getötet und die Milzzellen gewonnen. Die Milzzellen werden dann mit einer gewählten Maus-Myelomzelllinie, wie z.B. P3X63AgU.1, die von ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist, fusioniert (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol). Die Fusionen erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Napf-Gewebekulturplatten ausplattiert werden können, die HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthalten, um die Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen das Antigen gescreent. Die Ermittlung „positiver" Hybridomzellen, die die gewünschten monoklonalen Antikörper gegen die TIE-Liganden-Homologe hierin sekretieren, ist auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt.
Die positiven Hybridomzellen können intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites zu produzieren, die die monoklonalen Anti-TIE-Liganden-Antikörper enthalten. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollerflaschen gezüchtet werden. Die Reinigung der in den Aszites produzierten monoklonalen Antikörper kann unter Verwendung von Ammonsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelausschlusschromatographie erzielt werden. Alternativ dazu kann die Affinitätschromatographie auf Basis der Bindung von Antikörper an Protein A oder Protein G eingesetzt werden.
Beispiel 8
Hemmung der VEGF-stimulierten Endothelzellenproliferation
Rinder-Nebennierenrinden-Kapillarendothel- (ACE-) Zellen (aus Primärkultur, maximal 12-14 Passagen) wurden in 96-Napf-Mikrotiterplatten (Amersham Life Sciences) in einer Dichte von 500 Zellen/Napf pro 100 μl in Niedrigglucose-DMEM, 10 % Kälberserum, 2 mM Glutamin, 1 × pen/strept und Fungizon, ergänzt mit 3 ng/ml VEGF, ausplattiert. Kontrollen wurden in derselben Weise ausplattiert, enthielten jedoch kein VEGF. Testproben des NL2-Polypeptids wurden in einem Volumen von 100 μl für ein Endvolumen von 200 μl zugegeben. Die Zellen wurden für 6-7 Tage bei 37 °C inkubiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen 1 × mit PBS gewaschen. Ein Saure-Phosphatase-Reaktionsgemisch (100 μl, 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5, 0,1 % Triton-100, 10 mM p-Nitrophenylphosphat) wurde zugegeben. Nach Inkubation für 2 Stunden bei 37 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 μl 1 N NaOH gestoppt. Die OD wurde an einem Mikrotiterplattenlesegerät bei 405 nm gemessen. Die Kontrollen waren ohne Zellen, Zellen alleine, Zellen + FGF (5 ng/ml), Zellen + VEGF (3 ng/ml), Zellen + VEGF (3 ng/ml) + TGF-β (1 ng/ml) und Zellen + VEGF (3 ng/ml) + LIF (5 ng/ml). (Es ist bekannt, dass TGF-β bei einer Konzentration von 1 ng/ml 70-90 % der VEGF-stimulierten Zellproliferation blockiert.)
Die Ergebnisse wurden beurteilt durch Berechnung der prozentuellen Hemmung der VEGF- (3 ng/ml) stimulierten Zellproliferation, ermittelt durch Messen der Aktivität der Sauren Phosphatase bei OD 405 nm, (1) relativ zu Zellen ohne Stimulation und (2) relativ zur Referenz-TGF-β-Hemmung VEGF-stimulierter Aktivität. Die Resultate werden als positiv erachtet, wenn die Hemmung 30 % oder mehr beträgt. Die in unten stehender Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse lassen den Nutzen des NL2-Polypeptids bei der Krebstherapie und insbesondere bei der Hemmung der Tumorangiogenese erkennen. Die in der Tabelle 1 dargestellten Zahlenwerte (relative Hemmung) wurden ermittelt, indem die prozentuelle Hemmung der VEGF-stimulierten Proliferation durch die getesteten TIE-Liganden-Homologe relativ zu Zellen ohne Stimulation berechnet wurde und dann der Prozentwert durch die mittels TGF-β bei 2 ng/ml erlangte prozentuelle Hemmung dividiert wurde, die bekanntermaßen 70-90 % der VEGF-stimulierten Zellproliferation blockiert. Tabelle 1
Beispiel 9
Induktion von Endothelzellenapoptose
Die Fähigkeit von NL2, Apoptose in Endothelzellen zu induzieren, wurde bei menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC, Cell Systems) unter Verwendung eines 96-Napf-Formats in mit 100 ng/ml VEGF ergänztem 0%-Serummedium getestet. (Da sich HUVEC-Zellen leicht von der Plattenoberfläche loslösen, müssen alle Pipettierschritte so vorsichtig wie möglich durchgeführt werden.)
Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen einmal mit PBS gewaschen. 5 ml 1 × Trypsin wurden den Zellen in einer T-175-Flasche zugegeben und die Zellen stehen gelassen, bis sie von der Platte freigesetzt wurden (etwa 5-10 Minuten). Die Trypsinisierung wurde durch Zugabe von 5 ml Wachstumsmedium gestoppt. Die Zellen wurden bei 1.000 U/min für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen wurden in 10 ml Medium mit 10 % Serum komplementiertem Medium (Cell Systems), 1 × penn/strep resuspendiert.
Die Zellen wurden in 96-Napf-Mikrotiterplatten (Amersham Life Science, Cytostar-T-Szintillationsmikroplatte, RPNQ160, steril, gewebekulturbehandelt, einzeln verpackt) in 10 % Serum (CSG-Medium, Cell Systems) in einer Dichte von 2 × 10⁴ Zellen pro Napf in einem Gesamtvolumen von 100 μl ausplattiert. Näpfe ohne Zellen wurden als Leerwert und Näpfe nur mit Zellen als Negativkontrolle verwendet. Als Positivkontrollen wurden 1:3-Reihenverdünnungen von 50 μl einer 3x-Stammlösung von Staurosporin verwendet.
0,2 ml Annexin-V-Biotin-Stammlösung (100 μg/ml) wurden in 4,6 ml 2 × Ca²⁺-Bindungspuffer und 2,5 % BSA verdünnt (1:25-Verdünnng). 50 μl der verdünnten Annexin-V-Biotin-Lösung wurden jedem Napf (außer den Kontrollen) auf eine Endkonzentration von 1,0 μg/ml zugegeben. Die Proben wurden für 10-15 Minuten mit Annexin-Biotin vor der direkten Zugabe von ³⁵S-Streptavidin inkubiert. ³⁵S-Streptavidin wurde in 2 × Ca²⁺-Bindungspuffer, 2,5 % BSA verdünnt und allen Näpfen in einer Endkonzentration von 3 × 10⁴ cpm/Napf zugegeben. Die Platten wurden dann versiegelt, bei 1.000 U/min für 15 Minuten zentrifugiert und für 2 Stunden auf einen Kreisschüttler gegeben. Die Analyse wurde an einem 1450 Microbeta Trilux (Wallac) durchgeführt.
NL2 war in diesem Test positiv. Dieses Ergebnis bestätigt zusätzlich den potenziellen Nutzen dieses und möglicher verwandter Moleküle in der Krebstherapie.
Materialhinterlegung
Wie bereits zuvor erwähnt, wurden die die folgenden Materialien bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt:
Diese Hinterlegung wurde unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit bei Erteilung des entsprechenden US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer zuerst eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für jemanden vom US-Bevollmächtigten für Patente und Marken bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC §122 und den dazugehörigen Regeln des Bevollmächtigten (einschließlich 37 CFR § 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) ermächtigt ist.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien, falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch andere derselben ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.
Die vorliegende Patentschrift wird als ausreichend erachtet, einem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung zu ermöglichen, die Erfindung in die Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch das hinterlegte Konstrukt in seinen Ansprüchen nicht eingeschränkt, da die hinterlegte Ausführungsform als einzelne Illustration gewisser Aspekte der Erfindung gedacht ist und jegliche funktionell gleichwertigen Konstrukte im Schutzumfang der Erfindung liegen. Die Hinterlegung von Material hierin stellt kein Zugeständnis dar, dass die niedergeschriebene Beschreibung unzulänglich ist, um die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsart davon zu ermöglichen, noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der Ansprüche auf die speziellen Illustrationen einschränkt, die sie verkörpert. In der Tat werden verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin dargestellt und beschrieben sind, dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorhergehenden Beschreibung offensichtlich und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche.

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Polypeptid mit zumindest 90 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das kodierte Polypeptid zumindest 95 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2, worin das kodierte Polypeptid zumindest 98 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 3, worin das kodierte Polypeptid zumindest 99 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, worin das kodierte Polypeptid die Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, das die Kodierregion aus Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das die Fibrinogen-ähnliche Domäne aus Seq.-ID Nr. 1 umfasst.
Vektor, der ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 transformiert ist.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine prokaryotische Zelle ist.
Rekombinante Wirtszelle nach Anspruch 9, die eine eukaryotische Zelle ist.
Isoliertes Polypeptid, umfassend eine NL2-Aminosäuresequenz mit zumindest 90 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2).
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 12, umfassend eine NL2-Aminosäuresequenz mit zumindest 95 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2).
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 13, umfassend eine NL2-Aminosäuresequenz mit zumindest 98 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2).
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 14, umfassend eine NL2-Aminosäuresequenz mit zumindest 99 % Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2).
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 15, umfassend eine NL2-Aminosäuresequenz, die die Aminosäuresequenz von nativem menschlichem NL2-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) aufweist.
Antikörper, der sich spezifisch an die NL2-Aminosäuresequenz des Polypeptids nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bindet.
Antikörper nach Anspruch 17, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 18, der Reste von nicht-menschlicher komplementaritätsbestimmender Region (CDR) und Reste von menschlichem Gerüst (FR) aufweist.
Antikörper nach Anspruch 17, der markiert ist.
Zusammensetzung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 16 in Verbindung mit einem Träger.
Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 17 in Verbindung mit einem Träger.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, umfassend eine wachstumshemmende Menge von diesem Antikörper.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, weiters umfassend einen zweiten Antikörper oder ein zytotoxisches oder chemotherapeutisches Mittel.
Konjugat, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 16 oder einen Antikörper nach Anspruch 17, fusioniert an ein weiteres therapeutisches oder zytotoxisches Mittel.
Konjugat nach Anspruch 25, worin das weitere therapeutische Mittel ein Toxin, ein anderer TIE-Ligand oder ein Mitglied der Gefäßendothelwachstumsfaktoren(VEGF-) Familie ist.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 12 bis 16 oder Antikörper nach Anspruch 17 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 12 bis 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Inhibition von Vaskulogenese, Inhibition von En dothelzellenproliferation, Induktion von Endothelzellenapoptose oder Inhibition von Tumorwachstum.