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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nucleinsäuremoleküle, die
für neue
TIE-Liganden-Homologe
kodieren, von derartigen Nucleinsäuremolekülen kodierte TIE-Liganden-Homolog-Proteine
sowie Verfahren und Mittel zur Herstellung und Verwendung derartiger
Nucleinsäure-
und Proteinmoleküle
sowie Antikörper,
welche die offenbarten TIE-Liganden-Homologe binden.
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Stand der
Technik
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Die
Abkürzungen „TIE" oder „tie" sind Akronyme, die
für „Tyrosinkinase,
die Ig- und EGF-Homologiedomänen
enthält" stehen, und wurden
kreiert, um eine neue Familie von Rezeptortyrosinkinasen zu bezeichnen,
die fast ausschließlich
in Gefäßendothelzellen
und frühen
hämopoetischen
Zellen exprimiert werden und durch die Gegenwart einer EGF-ähnlichen
Domäne
und extrazellulärer
Faltungseinheiten gekennzeichnet sind, die von Intraketten-Disulfidbindungen
stabilisiert sind, die allgemein als „Immunglobulin-(IG-) ähnliche" Faltungen bezeichnet
werden. Ein zu Tyrosinkinase homologes cDNA-Fragment aus menschlichen
Leukämiezellen
(tie) wurde von Partanen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
8913–8917
(1990), beschrieben. Die mRNA dieses menschlichen „tie"-Rezeptors ist in
allen menschlichen fötalen
und embryonalen Geweben der Maus nachgewiesen worden, und es ist
beschrieben worden, dass sie in den Kardial- und Gefäßendothelzellen
lokalisiert ist. Korhonen et al., Blood 80, 2548–2555 (1992); PCT-Anmeldung,
Veröffentlichungsnummer WO
93/14124 (veröffentlicht
am 22. Juli 1993). Das Rattenhomolog von tie, das als „tie-1" bezeichnet wird, wurde
von Maisonpierre et al., Oncogene 8, 1631–1637 (1993), identifiziert.
Ein weiterer als „tie-2" bezeichneter tie-Rezeptor
wurde ursprünglich
in Ratten identifiziert (Dumont et al., Oncogene 8, 1293–1301 (1993)), während das
als „ork" bezeichnete menschliche
Homolog von tie-2 im US-Patent Nr. 5.447.860 (Ziegler) beschrieben
wurde. Das Maus-Homolog von tie-2 wurde ursprünglich als „tek" bezeichnet. Die Klonierung eines Maus-tie-2-Rezeptors
aus einer Hirnkapillaren-cDNA-Bibliothek
ist in der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/13387 (veröffentlicht am 18. Mai 1995)
offenbart. Von den TIE-Rezeptoren wird angenommen, dass sie aktiv
an der Angiogenese beteiligt sind und außerdem eine Rolle bei der Hämopoese
spielen.
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Die
Expressionsklonierung menschlicher TIE-2-Liganden ist in der PCT-Anmeldung
Nr. WO 96/11269 (veröffentlicht
am 18. April 1996) und im US-Patent Nr. 5.521.073 (veröffentlicht
am 28. Mai 1996) beschrieben worden. Ein als λgt10 bezeichneter Vektor, der
für einen
als „htie-2-Ligand
1" bezeichneten
TIE-2-Liganden kodiert, ist unter der ATCC-Zugangsnummer 75928 hinterlegt
worden. Ein für
einen weiteren als „htie-2
2" oder „hTL2" bezeichneten TIE-2-Liganden
kodierendes Plasmid ist unter der ATCC-Zugangsnummer 75928 erhältlich.
Dieser zweite Ligand ist als Antagonist des TAI-2-Rezeptors beschrieben
worden. Die Identifizierung sekretierter menschlicher und Maus-Liganden
für den
TIE-2-Rezeptor ist von Davis et al., Cell 87, 1161–1169 (1996),
beschrieben worden. Der menschliche Ligand, der als „Angiopoietin-1" bezeichnet wurde,
um seine Rolle bei der Angiogenese und möglichen Aktivität während der
Hämopoese
widerzuspiegeln, ist derselbe Ligand wie der in WO 96/11269 wechselnd
als „htie-2
1" oder „hTL-1" bezeichnete Ligand.
Angiopoietin-1 ist später
dahingehend beschrieben worden, dass es eine von VEGF verschiedene
Rolle spielt (Suri et al., Cell 87, 1171–1180 (1996)). Da TIE-2 offenbar
während
der pathologischen Angiogenese als Voraussetzung für Tumorwachstum
upreguliert wird (Kaipainen et al., Cancer Res. 54, 6571–6577 (1994)),
ist vorgeschlagen worden, dass Angiopoietin-1 außerdem zum spezifischen Abzielen
auf die Tumor-Gefäßversorgung
zweckdienlich ist (Davis et al., s.o.).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue menschliche TIE-Liganden-Homologe
mit starken Wirkungen auf das Gefäßsystem. Die Erfindung stellt
außerdem
für derartige
Liganden-Homologe kodierende, isolierte Nucleinsäuremoleküle und derartige Nucleinsäuremoleküle enthaltende
Vektoren bereit. Die Erfindung betrifft außerdem mit derartiger Nucleinsäure transformierte
Wirtszellen, um die neuen TIE-Liganden-Homologe zu produzieren. Die neuen Liganden-Homologe
können
Agonisten oder Antagonisten von TIE-Rezeptoren sein, die bekannt
sind oder hiernach entdeckt werden. Ihre therapeutische oder diagnostische
Verwendung, einschließlich
der Abgabe anderer therapeutischer oder diagnostischer Mitten an
Zellen, welche die betreffenden TIE-Rezeptoren exprimieren, liegt
ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
Antikörper
bereit, die spezifisch an die TIE-Liganden-Homologe hierin binden,
sowie die Verwendung derartiger Antikörper zur Verwendung in einer
medizinischen Behandlung.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Zusammensetzungen,
welche die neuen Liganden-Homologe oder diese Liganden-Homologe
spezifisch bindenden Antikörper
umfassen.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Konjugate der neuen
TIE-Liganden-Homologe
der vorliegenden Erfindung mit anderen therapeutischen oder zytotoxischen
Mitteln und Zusammensetzungen, die derartige Konjugate umfassen.
Es ist beschrieben worden, dass der TIE-2-Rezeptor während der
für das
Tumorwachstum erforderlichen pathologischen Angiogenese upreguliert
wird; andere TIE-Rezeptoren könnten ähnliche
Eigenschaften aufweisen. Demgemäß könnten die
Konjugate der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung als
zytotoxische Mittel oder andere Antitumormittel zweckdienlich sein,
um spezifisch auf das Tumorgefäßsystem
abzuzielen.
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Ein
Verfahren zur Identifizierung einer einen TIE-Rezeptor exprimierenden
Zelle könnte
das Kontaktieren einer Zelle mit einem nachweisbar markierten TIE-Liganden-Homolog
der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die die Bindung eines
derartigen TIE-Liganden-Homologs an den TIE-Rezeptor ermöglichen, sowie
die Feststellung einer eventuell erfolgten Bindung umfassen.
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Ein
Verfahren zur Messung der Menge an TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden
Erfindung in einer biologischen Probe kann das Kontaktieren der
biologischen Probe mit zumindest einem Antikörper umfassen, der spezifisch
an das TIE-Liganden- Homolog
bindet, sowie das Messen der Menge des gebildeten TIE-Liganden-Homolog-Antikörper-Komplexes.
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Ein
Screeningverfahren zur Identifizierung von Polypeptid- oder Kleinmolekül-Agonisten oder -Antagonisten
eines TIE-Rezeptors kann auf deren Fähigkeit beruhen, mit einem
nativen oder Varianten-TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden Erfindung
um die Bindung an einen entsprechenden TIE-Rezeptor zu konkurrieren.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines
TIE-Liganden-Homologs
der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments
zur Inhibierung von Tumorwachstum.
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Apoptose
von Endothelzellen kann durch Verabreichen einer wirksamen Menge
eines TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung induziert
werden.
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Die
TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung können für sich alleine
oder in Kombination miteinander und/oder mit anderen therapeutischen
oder diagnostischen Mitteln, einschließlich Elementen der VEGF-Familie,
verabreicht werden. Kombinationstherapien könnten zu neuen Ansätzen zur
Behandlung von Leiden führen,
die mit unerwünschtem
Endothelzellenwachstum verbunden sind, z.B. zur Tumorbehandlung.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine grafische Darstellung der Beziehung der Liganden-Homologe NL2,
NL3 und FLS139 zu den beiden bekannten Liganden-Homologen des TIE2-Rezeptors (h-TIE2L1
und h-TIE2L2) und zu anderen TIE-Liganden-Homologen, die in der
am 19. September 1997 eingereichten Anmeldung mit der Seriennummer 08/933.821
offenbart sind.
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2 ist die Nucleotidsequenz des TIE-Liganden
NL2 (Seq.-ID Nr. 1) (DNA 22780).
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3 ist die Aminosäuresequenz des TIE-Liganden
NL2 (Seq.-ID Nr. 2).
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4 ist
die Nucleotidsequenz des TIE-Liganden NL3 (Seq.-ID Nr. 3) (DNA 33457).
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5 ist
die Aminosäuresequenz
des TIE-Liganden NL3 (Seq.-ID Nr. 4).
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6 ist die Nucleotidsequenz des TIE-Liganden
FLS139 (Seq.-ID Nr. 5) (DNA 16451).
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7 ist die Aminosäuresequenz des TIE-Liganden
FLS139 (Seq.-ID Nr. 6).
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9.
Northern-Blot, der die Expression der mRNAs des TIE-Liganden-Homologs
NL3 in verschiedenen Geweben zeigt.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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A. TIE-Liganden-Homologe
und die dafür
kodierenden Nucleinsäuremoleküle
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Die
TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung umfassen das als
NL3 (Seq.-ID Nr. 4) bezeichnete native menschliche Liganden-Homolog
und seine Homologe in anderen, nicht-menschlichen Säugetierspezies,
umfassend, jedoch nicht beschränkt
auf, höhere
Säuger
wie Affe; Nagetiere wie Mäuse,
Ratten, Hamster; Porcine; Equine; Bovine; natürlich auftretende Allel- und
Spleißvarianten.
Die hierin offenbarte Aminosäuresequenz
von nativem NL3 weist etwa 30 % Identität mit jener von hTL-1 und etwa
29 % Identität
mit jener von hTL-2 auf. Die nativen TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden
Erfindung sind im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen
sie in ihrer natürlichen
Umgebung assoziiert sind. Diese Definition wird in keiner Weise
durch das/die Verfahren eingeschränkt, mit dem/denen die TIE-Liganden-Homologe
der vorliegenden Erfindung erlangt wird/werden, und umfasst alle
anderweitig in der Definition enthaltenen Homologe, ob sie aus natürlichen
Quellen gereinigt, durch DNA-Rekombinationsverfahren erlangt, synthetisiert
oder mittels einer beliebigen Kombination dieser und/oder anderer
Techniken hergestellt worden sind. Die Aminosäuresequenzvarianten der nativen
TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sollen zumindest
90 %, vorzugsweise zumindest 95 %, bevorzugter zumindest 98 %, insbesondere
bevorzugt zumindest 99 %, Sequenzidentität mit einem nativen menschlichen
TIE-Liganden-Homolog voller Länge
der vorliegenden Erfindung oder mit der Fibrinogen-ähnlichen
Domäne
eines nativen menschlichen TIE-Homolog-Liganden der vorliegenden
Erfindung aufweisen.
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Der
Ausdruck „Fibrinogen-Domäne" oder „Fibrinogen-ähnliche
Domäne" bezieht sich auf
die Aminosäuren
von der ungefähren
Position 278 bis zur ungefähren
Position 498 in der bekannten hTL-1-Aminosäuresequenz; Aminosäuren von
der ungefähren
Position 276 bis zur ungefähren
Position 496 in der bekannten hTL-2-Aminosäuresequenz; Aminosäuren von
der ungefähren
Position 77 bis zur ungefähren
Position 288 in der Aminosäuresequenz
von NL3, und auf homologe Domänen
in anderen TIE-Liganden-Homologen. Die NL3-Fibrinogen-Domäne ist zu
etwa 37 identisch mit den Fibrinogen-ähnlichen Domänen von
hTL-1 und hTL-2.
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Der
Ausdruck „Nucleinsäuremolekül" umfasst RNA-, DNA-
und cDNA-Moleküle.
Es versteht sich, dass als Folge der Degeneriertheit des genetischen
Codes eine Vielzahl an Nucleotidsequenzen produziert werden kann,
die für
einen gegebenen TIE-Liganden
kodieren. Die vorliegende Erfindung umfasst ausdrücklich jegliche
mögliche
Variation von Nucleotidsequenzen, die für die TIE-Liganden-Homologe
der vorliegenden Erfindung kodiert, und zwar auf Basis aller möglichen
Codon-Auswahlmöglichkeiten.
Obgleich Nucleinsäuremoleküle, die
für die
TIE-Liganden-Homologe
hierin kodieren, vorzugsweise fähig
sind, unter stringenten Bedingungen an ein natürlich vorkommendes TIE-Liganden-Homolog-Gen
zu hybridisieren, kann es vorteilhaft sein, für TIE-Liganden-Homologe kodierende
Nucleotidsequenzen herzustellen, die eine wesentlich andersartige
Codonverwendung besitzen. Beispielsweise können Codons so gewählt werden,
dass die Rate, mit der die Expression des Polypeptids in einer bestimmten
prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle auftritt, im Einklang
mit der Frequenz erhöht
wird, mit der der Wirt ein bestimmtes Codon einsetzt. Außerdem können RNA-Transkripte
mit verbesserten Eigenschaften, z.B. verbesserter Halbwertszeit,
durch geeignete Wahl der für
ein vorgegebenes TIE-Liganden-Homolog
kodierenden Nucleotidsequenzen hergestellt werden.
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Die „Sequenzidentität" wird ermittelt,
indem zwei zu vergleichende Sequenzen nach dem Clustal-Verfahren
der Vielfachsequenzangleichung angeglichen werden (Higgins et al.,
Comput. Appl. Biosci. 5, 151–153 (1989),
und Higgins et al., Gene 73, 237–244 (1988)), das in der Version
1.6 der Lasergene-Bio-Berechnungssoftware (DNASTAR, Inc., Madison,
Wisconsin) oder in einer beliebigen aktualisierten oder gleichwertigen
Version dieser Software enthalten ist.
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Die „Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen
kann vom gewöhnlichen
Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung leicht ermittelt werden und
ist im Allgemeinen eine empirische Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur
und Salzkonzentration abhängt.
Im Allgemeinen erfordern längere
Sonden höhere
Temperaturen zur richtigen Anellierung, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen
benötigen.
Die Hybridisierung hängt
im Allgemeinen von der Fähigkeit
denaturierter DNA ab, bei Anwesenheit komplementärer Stränge in einem Milieu unter ihrer
Schmelztemperatur zu reassoziieren. Je höher der Grad an gewünschter
Homologie zwischen Sonde und hybridisierbarer Sequenz, desto höher die
relative Temperatur, die verwendet werden kann. Als Ergebnis folgt,
dass höhere
relative Temperaturen dazu neigen, die Reaktionsbedingungen stringenter
zu machen, während
niedrigere Temperaturen dies weniger tun. Für weitere Einzelheiten und
Beschreibungen der Stringenz von Hybridisierungsreaktionen siehe
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience
Publishers (1995).
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Die
hierin definierten „stringenten
Bedingungen" oder „hochstringenten
Bedingungen" können als
jene gekennzeichnet sein, die Folgendes einsetzen: (1) niedrige
Ionenstärke
und hohe Temperaturen zum Waschen, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015
M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) ein
Denaturierungsmittel während
der Hybridisierung, wie z.B. Formamid, beispielsweise 50 Vol.-%
Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50
mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75
mM Natriumcitrat bei 42 °C;
oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC
(0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH
6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte
Lachsspermien-DNA (50 μg/ml),
0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C mit Waschungen bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat)
und 50 % Formamid bei 55 °C,
gefolgt von einem hochstringenten Waschvorgang, der aus 0,1 × SSC besteht,
das EDTA enthält,
bei 55 °C.
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„Mäßig stringente
Bedingungen" können als
jene gekennzeichnet sein, wie sie von Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Press
(1989), beschrieben werden, und umfassen die Verwendung von Waschlösungs- und
Hybridisierungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ionenstärke und
%-SDS), die weniger stringent als die oben beschriebenen sind. Ein
Beispiel für
mäßig stringente Bedingungen
ist die Inkubation über
Nacht bei 37 °C
in einer Lösung,
die Folgendes umfasst: 20 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat),
50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 %
Dextransulfat und 20 mg/ml denaturierte, gescherte Lachsspermien-DNA,
gefolgt vom Waschen der Filter in 1 × SSC bei etwa 37–50 °C. Der Fachmann
wird erkennen, wie Temperatur, Ionenstärke usw. je nach Anforderungen
einzustellen sind, um Faktoren, wie z.B. Sondenlänge und dergleichen, Rechnung
zu tragen.
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Der
Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei
Verwendung hierin auf ein chimäres
Polypeptid, das ein an ein „Marker-Polypeptid" fusioniertes TIE-Liganden-Homolog
umfasst. Das Marker-Polypeptid weist eine ausreichende Anzahl an
Resten auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt
werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, sodass es die Aktivität des Polypeptids,
an das es fusioniert ist, nicht stört. Das Marker-Polypeptid ist
vorzugsweise außerdem
ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper im Wesentlichen nicht
mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Marker-Polypeptide
weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise
zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste
(vorzugsweise zwischen etwa 10 und 20 Aminosäurereste) auf.
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Die
Ausdrücke „biologische
Aktivität" und „biologisch
aktiv" in Bezug
auf ein TIE-Liganden-Homolog der
vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, an einen
nativen Rezeptor eines bekannten oder hiernach entdeckten TIE-Liganden (hiernach
als „TIE-Rezeptor" genannt), z.B. einen
nativen TIE-2-Rezeptor, spezifisch zu binden oder durch ihn zu signalisieren
oder die Fähigkeit
eines nativen TIE-Rezeptors (z.B. TIE-2) zu blockieren, an der Signaltransduktion
teilzunehmen. Folglich umfassen die (nativen oder Varianten-) TIE-Liganden
der vorliegenden Erfindung Agonisten und Antagonisten eines nativen
TIE-, z.B. TIE-2-, Rezeptors. Bevorzugte biologische Aktivitäten der
TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung umfassen die Fähigkeit,
die Gefäßbildung
auszulösen
oder zu hemmen. Die Fähigkeit,
die Gefäßbildung
auszulösen,
ist zur Behandlung biologischer Konditionen und Krankheiten zweckdienlich,
wo die Gefäßbildung
wünschenswert
ist, wie z.B. bei Wundheilung, Ischämie und Diabetes. Andererseits
kann die Fähigkeit,
die Gefäßbildung
zu hemmen oder zu blockieren, bei der Unterbindung oder Abschwächung von
Tumorwachstum zweckdienlich sein. Eine weitere bevorzugte biologische
Aktivität
ist die Fähigkeit,
Knochenentwicklung, -reifung oder -wachstum zu beeinflussen. Noch
eine weitere bevorzugte biologische Aktivität ist die Fähigkeit, das Endothelzellenwachstum
zu hemmen und/oder Apoptose auszulösen.
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Der
Ausdruck „zytotoxisches
Mittel" bezieht
sich bei Verwendung hierin auf eine Substanz, die die Funktion von
Zellen hemmt oder verhindert und die die Zerstörung von Zellen bewirkt. Der
Ausdruck umfasst radioaktive Isotope (z.B. I131,
I125, Y90 und Re186), chemotherapeutische Mittel und Toxine
wie z.B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen
oder tierischen Ursprungs oder deren Fragmente.
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Ein „chemotherapeutisches
Mittel" ist eine
chemische Verbindung, die bei der Behandlung von Krebs zweckdienlich
ist. Beispiele chemotherapeutischer Mittel umfassen Adriamycin,
Doxorubicin, Epirubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid („Ara-C"), Cyclophosphamid,
Thiopeta, Busulfan, Cytoxin, Taxoide, z.B. Paclitacel (Taxol, Bristol-Myers
Squibb Oncology, Princeton, NJ) und Doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc
Rorer, Antony, Rnace), Toxotere, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan,
Vinblastin, Ble omycin, Etoposide, Ifosfamide, Mitomycin C, Mitoxantrone,
Vincristin, Vinorelbin, Carbplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin,
Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe US-Patent
Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte Stickstoff-Losts.
Ebenfalls in dieser Definition umfasst sind hormonelle Mittel, die
dahingehend wirken, dass sie die Hormonwirkung an Tumoren regulieren
oder hemmen, wie z.B. Tamoxifen und Onapriston.
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Ein „wachstumshemmendes
Mittel" bezieht
sich bei Verwendung hierin auf eine Verbindung oder Zusammensetzung,
die das Wachstum einer Zelle, insbesondere Krebszelle, die irgendeines
der hierin identifizierten Gene überexprimiert,
entweder in vitro oder in vivo hemmt. Demnach ist das wachstumshemmende Mittel
eines, das den prozentuellen Anteil der Zellen, die derartige Gene
in der S-Phase überexprimieren,
signifikant vermindert. Beispiele wachstumshemmender Mittel umfassen
Mittel, die die Zellzyklusprogression (an einer Stelle, die nicht
die S-Phase ist) blockieren, wie z.B. Mittel, die die G1-Arretierung
und M-Phasen-Arretierung auslösen.
Klassische M-Phasen-Blocker umfassen Vincas-(Vincristin- und Vinblastin-),
Taxol- und Topo-II-Inhibitoren, wie z.B. Doxorubicin, Epirubicin,
Daunorubicin, Etoposid und Bleomycin. Jene Mittel, die G1 arretieren,
greifen auch auf die S-Phasen-Arretierung über, beispielsweise DNA-alkylierende
Mittel, wie z.B. Tamoxifen, Prednison, Dacarbazin, Mechlorethamin,
Cisplatin, Methotrexat, 5-Fluoruracil und Ara-C. Weitere Informationen
finden sich in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn und Israel
(Hrsg.), Kapitel 1, mit dem Titel „Cell cycle regulation, Oncogens,
and antineoplastic drugs" von
Murakami et al., WB Saudners, Philadelphia (1995), insbesondere
S. 13.
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„Doxorubicin" ist ein Anthracyclin-Antibiotikum.
Der vollständige
chemische Name von Doxorubicin ist (8S-cis)-10-[(3-Amino-2,3,6-tridesoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacendion.
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Der
Ausdruck „Cytokin" ist ein allgemeiner
Ausdruck für
Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden, die auf
eine andere Zelle als interzelluläre Vermittler wirken. Beispiele
derartiger Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone.
Unter den Cytokinen umfasst sind Wachstumshormon, wie z.B. menschliches
Wachstumshormon, menschliches N-Methionyl-Wachstumshormon und Rinderwachstumshormon;
Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin; Relaxin; Prorelaxin;
Glykoproteinhormone, wie z.B. follikelstimulierendes Hormon (FSH),
thyroidstimulierendes Hormon (TSH) und luteinisierendes Hormon (LH);
Leberwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolactin; Plazentalaktogen;
Tumornekrosefaktor-α und
-β; Müller-Inhibierungs-Substanz;
Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor;
Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren, wie z.B.
NGF-β; Blutplättchenwachstumsfaktor;
transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs), wie z.B. TGF-α und TGF-β; Insulinähnlicher
Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduktive
Faktoren; Interferone, wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren
(CSFs), wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF
(GM-CSF); und Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs), wie
z.B. IL-1, IL-1α, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; ein Tumornekrosefaktor, wie
z.B. TNF-α oder
TNF-β; und andere
Polypeptidfaktoren, einschließlich
LIF und kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet, umfasst der Ausdruck Cytokin
Proteine aus natürlichen
Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive
Entsprechungen der Cytokine nativer Sequenz.
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„Gefäßendothelwachstumsfaktor"/„Gefäßpermeabilitätsfaktor" (VEGF/VPF) ist ein
endothelzellenspezifisches Mitogen, von dem kürzlich gezeigt worden ist,
dass es durch Hypoxie stimuliert wird und für die Tumorangiogenese erforderlich
ist (Senger et al., Cancer 46, 5629–5632 (1986); Kim et al., Nature
362, 841–844 (1993);
Schweiki et al., Nature 359, 843–845 (1992); Plate et al.,
Nature 359, 845–848
(1992)). Es ist ein dimeres, Disulfid-verbundenes Glykoprotein von
34–43
kDa (wobei die vorwiegenden Spezies etwa 45 kDA aufweisen), das
von einer Vielzahl von Tumorzellen und normalen Zellen synthetisiert
und sekretiert wird. Außerdem
ist von kultivierten menschlichen Retinazellen wie z.B. Pigmentepithelzellen
und Perizyten gezeigt worden, dass sie VEGF sekretieren und die
VEGF-Genexpression als Reaktion auf Hypoxie steigern (Adamis et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 631–638 (1993); Plouet et al.,
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 900 (1992); Adamis et al., In vest.
Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 1440 (1993); Ariello et al., Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. 35, 1868 (1994); Simorre-pinatel et al., Invest. Ophthalmol.
Vis. Sci. 35, 3393–3400
(1994)). Im Gegensatz dazu ist der VEGF-Spiegel in normalen Geweben
relativ niedrig. Daher scheint VEGF eine Hauptrolle bei vielen pathologischen
Zuständen
und Vorgängen
zu spielen, die mit der Gefäßneubildung
in Zusammenhang stehen. Die Regulation der VEGF-Expression in durch
die verschiedenen oben beschriebenen Konditionen beeinträchtigten
Geweben könnte
daher der Schlüssel
bei mit Hypoxie in Zusammenhang stehenden Behandlungs- oder Präventivtherapien
sein.
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Der
Ausdruck „Agonist" wird verwendet,
um auf Peptid- oder Nicht-Peptid-Analoga der nativen TIE-Liganden-Homologen
der vorliegenden Erfindung unter der Voraussetzung zu verweisen,
dass sie die Fähigkeit aufweisen, über einen
nativen TIE-Rezeptor
(z.B. TIE-2) zu signalisieren. Mit anderen Worten wird der Ausdruck „Agonist" im Zusammenhang
mit der biologischen Rolle des TIE-Rezeptors definiert und nicht
in Bezug auf die biologische Rolle eines nativen TIE-Liganden-Homologs,
das wie vorher erwähnt
ein Agonist oder Antagonist der biologischen TIE-Rezeptorfunktion
sein kann. Bevorzugte Agonisten besitzen die bevorzugten biologischen
Aktivitäten
der oben aufgezählten
TIE-Homologe und umfassen Förderer
der Gefäßbildung,
das sind Moleküle,
die eine Rolle bei Knochenbildung, Reifung oder Wachstum spielen,
und Förderer
von Muskelwachstum und/oder -entwicklung.
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Der
Ausdruck „Antagonist" wird verwendet,
um sich auf Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga der nativen TIE-Liganden-Homologe
der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper zu beziehen, die derartige
TIE-Liganden-Homologe spezifisch binden, und zwar unter der Voraussetzung,
dass sie die Fähigkeit
aufweisen, die biologische Funktion eines nativen TIE-Rezeptors
(z.B. TIE-2) zu hemmen. Abermals ist der Ausdruck „Antagonist" im Zusammenhang
mit der biologischen Rolle des TIE-Rezeptors und in Bezug auf die biologische
Aktivität
eines nativen TIE-Liganden-Homologs
definiert, das entweder ein Agonist oder Antagonist der biologischen
TIE-Rezeptorfunktion
sein kann. Bevorzugte Antagonisten sind Hemmstoffe von Gefäßbildung
oder pathologischer Knochen- oder Muskelentwicklung oder Wachstum.
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„Tumor" bezieht sich bei
Verwendung hierin auf jegliche(s) neoplastische(n) Zellwachstum
oder Vermehrung, ob bös-
oder gutartig, sowie auf alle präkanzerösen und
kanzerösen
Zellen und Gewebe.
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Die
Ausdrücke „Krebs" und „kanzerös" beziehen sich auf
oder beschreiben den physiologischen Zustand in Säugetieren,
der durch unreguliertes Zellwachstum gekennzeichnet ist. Beispiele
von Krebs umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Karzinom, Lymphom,
Blastom, Sarkom und Leukämie.
Speziellere Beispiele derartiger Krebsformen umfassen Brustkrebs,
Prostatakrebs, Dickdarmkrebs, Plattenepithelkarzinom, kleinzelliges
Lungenkarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Magen-Darm-Krebs,
Pankreaskrebs, Glioblastom, Zervixkrebs, Eierstockkrebs, Leberkrebs,
Blasenkrebs, Hepatom, kolorektales Karzinom, Endometriumkarzinom,
Speicheldrüsenkarzinom,
Nierenkrebs, Leberkrebs, Vulvakrebs, Schilddrüsenkrebs, Leberkarzinom und
verschiedene Arten von Kopf- und Nackenkrebs.
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„Behandlung" ist ein Eingriff,
der mit der Absicht vorgenommen wird, die Entwicklung oder Veränderung
der Pathologie einer Störung
zu verhindern. Demgemäß bezieht
sich „Behandlung" auf therapeutische Behandlung
sowie prophylaktische oder präventive
Maßnahmen.
Jene, die einer Behandlung bedürfen,
umfassen jene, die die Störung
bereits aufweisen, sowie jene, bei denen die Störung verhindert werden soll.
Bei der Tumor-(z.B. Krebs-) Behandlung kann ein therapeutisches
Mittel die Pathologie von Tumorzellen direkt vermindern oder die
Tumorzellen für
die Behandlung mit anderen therapeutischen Mitteln, z.B. Bestrahlung und/oder
Chemotherapie, empfänglicher
machen.
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Die „Pathologie" von Krebs umfasst
alle Phänomene,
die die Gesundheit des Patienten beeinträchtigen. Dies umfasst ohne
Einschränkung
abnormales oder unkontrollierbares Zellwachstum, Metastase, Störung der
normalen Funktion benachbarter Zellen, Freisetzung von Cytokinen
oder anderen Sekretionsprodukten in abnormalen Ausmaßen, Unterdrückung oder
Verschlimmerung entzündlicher
oder immunologischer Reaktionen usw.
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„Säugetier" bezieht sich zum
Zwecke der Erfindung auf jedes Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen,
Haus- und Nutztiere sowie Zoo- und Sporttiere, wie z.B. Hunde, Pferde,
Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier der Mensch.
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Verabreichung „in Kombination
mit" einem oder
mehreren weiteren Mitteln umfasst die simultane (gleichzeitige)
und aufeinander folgende Verabreichung in beliebiger Reihenfolge.
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Der
Ausdruck „funktionelles
Derivat" wird verwendet,
um biologisch aktive Aminosäuresequenzvarianten
der nativen TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sowie
kovalente Modifizierungen zu definieren, einschließlich Derivate,
die durch Reaktion mit organischen Derivatisierungsmitteln erlangt
werden, posttranslationelle Modifizierungen, Derivate mit nicht-proteinartigen
Polymeren und Immunoadhäsine.
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Unter
dem Ausdruck „isoliert" werden bei Verwendung
zur Beschreibung der verschiedenen hierin beschriebenen Polypeptide
Polypeptide verstanden, die von/aus einer Komponente ihrer natürlichen
Umgebung identifiziert, abgetrennt und/oder gewonnen worden sind.
Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien,
die typischerweise die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen
für das
Polypeptid stören,
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht-proteinartige
Gelöststoffe
umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen
wird das Polypeptid gereinigt, und zwar (1) bis zu einem Ausmaß, das ausreicht,
um zumindest 15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz
mittels Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenators zu erlangen, oder
(2) bis zur Homogenität
mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen
unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silberfärbung. Ein
isoliertes Polypeptid umfasst ein Polypeptid in situ in rekombinanten
Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des TIE-Liganden
fehlen wird. Für
gewöhnlich
wird jedoch ein isoliertes Polypeptid durch zumindest einen Reinigungsschritt
hergestellt.
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Ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül ist ein
Nucleinsäuremolekül, das aus/von
zumindest einem verunreinigendem Nucleinsäuremolekül identifiziert und abgetrennt
ist, mit dem es üblicherweise
in der natürlichen
Quelle der Nucleinsäuremoleküle assoziiert
ist. Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül liegt
in anderer Form als der Form oder in dem Milieu vor, in der/dem
es sich in der Natur findet. Isolierte Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher
von dem Nucleinsäuremolekül, wie es
in natürlichen
Zellen existiert. Jedoch umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül Nucleinsäuremoleküle, die
in Zellen enthalten sind, die für
gewöhnlich
einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung exprimieren, wo beispielsweise
das Nucleinsäuremolekül sich an
einer chromosomalen Stelle befindet, die sich von der natürlicher
Zellen unterscheidet.
-
Der
Ausdruck „Aminosäuresequenzvariante" bezieht sich auf
Moleküle
mit einigen Unterschieden hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenzen
im Vergleich zu einer nativen Aminosäuresequenz.
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Substitutionsvarianten
sind jene, bei denen zumindest ein Aminosäurerest in einer nativen Sequenz entfernt
und an ihrer Stelle durch eine andere Aminosäure an derselben Position ersetzt
worden ist. Die Substitutionen können
einzeln sein, wo nur eine Aminosäure
im Molekül
ersetzt worden ist, oder sie können
mehrfach sein, wo zwei oder mehr Aminosäuren im selben Molekül ersetzt
worden sind.
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Insertionsvarianten
sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in unmittelbarer Nachbarschaft
zu einer Aminosäure
an einer bestimmten Position in einer nativen Sequenz insertiert
worden sind. Unmittelbar benachbart zu einer Aminosäure bedeutet,
dass es sich um eine Bindung entweder an die funktionelle α-Carboxy-
oder α-Aminogruppe
der Aminosäure
handelt.
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Deletionsvarianten
sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in der nativen Aminosäuresequenz
entfernt worden sind. Für
gewöhnlich
werden bei Deletionsvarianten eine oder mehrere Aminosäuren in
einer bestimmten Region des Moleküls entfernt sein. Deletionsvarianten
umfassen jene mit C- und/oder N-terminalen Deletionen (Trunkierungen)
sowie Varianten mit internen Deletionen einer oder meh rerer Aminosäuren. Die
bevorzugten Deletionsvarianten der vorliegenden Erfindung umfassen
Deletionen außerhalb
der Fibrinogen-ähnlichen
Domäne
eines nativen TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden Erfindung.
-
Die
Aminosäuresequenzvarianten
können
verschiedene Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen, -insertionen
und/oder -deletionen enthalten, um Moleküle mit optimalen Eigenschaften
herzustellen.
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Die
Aminosäuren
können
nach der chemischen Zusammensetzung und den Eigenschaften ihrer
Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen,
geladene und ungeladene, eingeteilt. Jede dieser Gruppen wird in
Untergruppen unterteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren.
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I. Geladene Aminosäuren
-
- Saure Aminosäuren:
Asparaginsäure,
Glutaminsäure
- Basische Aminosäuren:
Lysin, Arginin, Histidin
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II. Ungeladene Aminosäuren
-
- Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
- Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin
- Unpolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin
- Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
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Konservative
Substitutionen umfassen das Austauschen eines Elements innerhalb
einer Gruppe gegen ein anderes Element derselben Gruppe, wogegen
nicht-konservative
Substitutionen das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen
gegen eine andere bedingen. Von Varianten, die durch nicht-konservative Substitutionen
erlangt wurden, wird erwartet, dass sie in signifikanten Veränderungen
der biologischen Eigenschaften/Funktion der erlangten Variante resultieren.
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Aminosäuresequenzdeletionen
liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, bevorzugter
etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhän gend. Deletionen
können
in Regionen eingeführt
werden, die nicht direkt an der Wechselwirkung mit einem nativen
TIE-Rezeptor beteiligt sind. Deletionen werden vorzugsweise außerhalb
der Fibrinogen-ähnlichen
Regionen am C-Terminus des TIE-Liganden-Homologs der vorliegenden
Erfindung durchgeführt.
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Aminosäureinsertionen
umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen im Längenbereich
von einem Rest bis zu Polypeptiden, die hundert oder mehr Reste
enthalten, sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer
Aminosäurereste.
Intrasequenzinsertionen (d.h. Insertionen innerhalb der Aminosäuresequenz
des TIE-Liganden-Homologs)
können
im Allgemeinen im Bereich von 1 bis 10 Resten, bevorzugter 1 bis
5 Resten, bevorzugter 1 bis 3 Resten, liegen. Beispiele terminaler
Insertionen umfassen die TIE-Liganden-Homologe mit einem N-terminalen
Methionylrest, einem Artefakt seiner direkten Expression in bakterieller rekombinanter
Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz
an den N-Terminus des TIE-Liganden-Homolog-Moleküls, um die Sekretion des reifen
TIE-Liganden-Homologs
aus rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Derartige Signalsequenzen
werden im Allgemeinen aus der vorgesehenen Wirtszellspezies gewonnen
und sind daher zu diesen homolog. Geeignete Sequenzen umfassen beispielsweise
STII oder Ipp für
E. coli, Alphafaktor für
Hefe und Virussequenzen, wie z.B. Herpes-gD, für Säugetierzellen.
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Andere
Insertionsvarianten des nativen TIE-Liganden-Moleküls umfassen
die Fusion des N- oder C-Terminus des TIE-Liganden-Homolog-Moleküls an immunogene
Polypeptide, z.B. bakterielle Polypeptide, wie z.B. Beta-Lactamase
oder ein vom trp-Locus
aus E. coli kodiertes Enzym, oder Hefeprotein, und C-terminate Fusionen
mit Proteinen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, wie z.B.
Immunglobulinregionen (vorzugsweise konstante Immunglobulinregionen),
Albumin oder Ferritin, wie beschrieben in der am 6. April 1989 veröffentlichten
WO 89/02922.
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Da
es oft schwierig ist, im Voraus die Eigenschaften eines Varianten-TIE-Liganden-Homologs vorherzusehen,
ist einzusehen, dass ein gewisses Maß an Screening notwendig sein
wird, um die optimale Variante auszuwählen.
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Aminosäuresequenzvarianten
von nativen TIE-Liganden-Homologen der vorliegenden Erfindung werden
mittels Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung
bekannt sind, indem geeignete Nucleinsäureänderungen in eine native TIE-Liganden-Homolog-DNA
oder in eine Variante davon eingeführt werden oder indem das gewünschte Polypeptid
in vitro synthetisiert wird. Es gibt zwei Hauptvariablen bei der
Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten:
den Ort der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation.
Mit Ausnahme natürlich
vorkommender Allele, die keine Manipulation der für das TIE-Liganden-Homolog
kodierenden DNA-Sequenz erfordern, werden die Aminosäuresequenzvarianten
der TIE-Liganden-Homologe vorzugsweise durch Mutieren der DNA konstruiert,
um entweder zu einem Allel oder zu einer Aminosäuresequenzvariante zu gelangen,
die in der Natur nicht vorkommt.
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Eine
Gruppe von Mutationen wird in der Domäne oder in den Domänen der
TIE-Liganden-Homologe der
vorliegenden Erfindung erzeugt, die dadurch gekennzeichnet ist,
dass sie an der Wechselwirkung mit einem TIE-Rezeptor, z.B. TIE-1
oder TIE-2, oder einem noch zu entdeckendem Rezeptor beteiligt ist.
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Alternativ
oder zusätzlich
dazu können
Aminosäureveränderungen
an Stellen vorgenommen werden, die sich in TIE-Liganden-Homologen
aus verschiedenen Spezies unterscheiden, oder in höchst konservierten Regionen,
und zwar in Abhängigkeit
vom zu erreichenden Ziel.
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Stellen
an solchen Orten werden typischerweise hintereinander modifiziert,
z.B. (1) indem zuerst durch konservative Auswahl ersetzt wird und
dann durch drastischere in Abhängigkeit
von erhaltenen Resultat, durch (2) Deletieren des/der Zielreste/s
oder (3) Insertieren von Resten derselben oder einer anderen Klasse
in Nachbarschaft zur gefundenen Stelle oder Kombinationen der Möglichkeiten
(1) bis (3).
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Eine
der hilfreichen Techniken wird „Alanin-Scanning" genannt (Cunningham
und Wells, Science 244, 1081–1085
(1989)). Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert
und durch Alanin oder Polyalanin ersetzt. Jene Domänen, die
eine funktionelle Empfindlichkeit gegen die Alanin-Substitutionen
zeigen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Substituenten
an den oder anstelle der Alanin-Substitutionsstellen eingeführt werden.
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Nach
der Identifizierung der gewünschten
Mutation(en) kann das für
eine Aminosäuresequenzvariante eines
TIE-Ligänden-Homologs
kodierende Gen beispielsweise durch chemische Synthese wie oben
beschrieben erlangt werden.
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Bevorzugter
wird für
eine TIE-Liganden-Homolog-Aminosäuresequenzvariante
kodierende DNA durch ortsgerichtete Mutagenese von DNA hergestellt,
die für
eine früher
hergestellte Version der Variante oder Nicht-Variante des Liganden
kodiert. Die ortsgerichtete (ortsspezifische) Mutagenese ermöglicht die
Herstellung von Ligandenvarianten über die Verwendung spezifischer
Oligonucleotidsequenzen, die für
die DNA-Sequenz
der gewünschten
Mutation sowie für
eine ausreichende Anzahl benachbarter Nucleotide kodieren, um eine
Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen,
um eine stabile Doppelhelix an beiden Seiten der durchlaufenen Deletionsverbindungsstelle
auszubilden. Typischerweise ist ein Primer einer Länge von
etwa 20 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei sich 5 bis 10 Reste
an beiden Seiten der Verbindungsstelle der veränderten Sequenz befinden. Im
Allgemeinen sind die Techniken der ortsspezifischen Mutagenese auf
dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und werden in Veröffentlichungen,
wie z.B. Edelman et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Wie einzusehen
ist, setzt die ortsgerichtete Mutagenese typischerweise einen Phagenvektor
ein, der in einzelsträngiger
sowie doppelsträngiger
Form existiert. Typische, für
die ortsgerichtete Mutagenese geeignete Vektoren umfassen Vektoren,
wie z.B. den M13-Phagen, der von Messing et al., Third Cleveland
Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.),
Elsevier, Amsterdam (1981), offenbart wird. Dieser und andere Phagenvektoren
sind im Handel erhältlich,
und ihre Verwendung ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung
wohlbekannt. Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zur Konstruktion
von Oligodesoxynucleotid-gerichteter, ortspezifischer Mutagenese
in DNA-Fragmenten
unter Verwendung von M13-hergeleiteten Vektoren wurde von M.J. Zoller
und M. Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487–6500 (1982), veröffentlicht.
Außerdem
können
Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten
(Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)), eingesetzt werden,
um einzelsträngige
DNA zu erhalten. Alternativ dazu werden Nucleotidsubstitutionen
durch Synthetisieren des geeigneten DNA-Fragments in vitro und dessen
Amplifikation durch auf dem Gebiet bekannte PCR-Verfahren eingeführt.
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Im
Allgemeinen wird die ortsspezifische Mutagenese hiermit durchgeführt, indem
zunächst
ein einzelsträngiger
Vektor erlangt wird, der in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz umfasst,
die für
das maßgebliche Protein
kodiert. Ein die gewünschte
mutierte Sequenz tragender Primer wird im Allgemeinen synthetisch
hergestellt, beispielsweise mit dem Verfahren von Crea et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Dieser Primer wird dann mit
dem die einzelsträngige
Proteinsequenz enthaltenden Vektor anelliert und DNA-polymerisierenden
Enzymen, wie z.B. Polymerase-I-Klenow-Fragment
aus E. coli, ausgesetzt, um die Synthese des die Mutation tragenden
Strangs zu vervollständigen.
Demnach wird eine Doppelhelix gebildet, worin einer der Stränge für die ursprüngliche,
nicht mutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die gewünschte Mutation trägt. Dieser
Heteroduplex-Vektor wird dann verwendet, um geeignete Wirtszellen,
wie z.B. JP101-Zellen, zu transformieren, und es werden Klone selektiert,
die rekombinante Vektoren umfassen, die die mutierte Sequenzanordnung
enthalten. Danach kann die mutierte Region entfernt und in einen
geeigneten Expressionsvektor zur Proteinproduktion platziert werden.
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Die
PCR-Technik kann außerdem
bei der Erzeugung von Aminosäuresequenzvarianten
eines TIE-Liganden verwendet werden. Wenn kleine Mengen Templat-DNA
als Anfangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer
verwendet werden, die sich in der Sequenz von der entsprechenden
Region in einer Templat-DNA leicht unterscheiden, um relativ große Mengen
eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, das sich von der Templatsequenz
nur an denjenigen Positionen unterscheidet, wo sich die Primer vom
Templat unterscheiden. Zur Einführung
einer Mutation in eine Plasmid-DNA ist einer der Primer so konstruiert,
dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die
Sequenz des anderen Primers muss mit einem Sequenzabschnitt des
entgegengesetzten Strangs des Plasmids identisch sein, jedoch kann
sich diese Sequenz irgendwo entlang der Plasmid-DNA befinden.
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Es
ist jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers
innerhalb von 200 Nucleotiden von der des ersten befindet, sodass
das Ende der gesamten von den Primern begrenzten, amplifizierten DNA-Region
leicht sequenziert werden kann. Die PCR-Amplifikation unter Verwendung
eines Primerpaars wie des gerade beschriebenen resultiert in einer
Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der vom
Primer festgelegten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen
unterscheiden, da das Templatkopieren etwas fehleranfällig ist.
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Wenn
das Verhältnis
von Templat zu Produktmaterial extrem niedrig ist, beinhaltet die überwiegende Mehrheit
von DNA-Fragmentprodukten die gewünschte(n) Mutation(en). Dieses
Produktmaterial wird verwendet, um die entsprechende Region, die
als PCR-Templat diente, im Plasmid mittels standardmäßiger DNA-Technologie
zu ersetzen. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig
entweder unter Verwendung eines mutierten zweiten Primers oder mittels
Durchführung
einer zweiten PCR mit anderen mutierten Primern und gleichzeitiges
Ligieren der beiden resultierenden PCR-Fragmente an das Vektorfragment
in einer drei- (oder mehr-) teiligen Ligation eingeführt werden.
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In
einem speziellen Beispiel der PCR-Mutagenese wird Templat-Plasmid-DNA
(1 μg) durch
Verdauen mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die eine
einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb
der zu amplifizierenden Region aufweist. Von diesem Material werden
100 ng zu einem PCR-Gemisch zugegeben, das PCR-Puffer enthält, der
die vier Desoxyribonucleotidtriphosphate enthält und in den GeneAmp®-Sets
enthalten ist (erworben von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, und
Emeryville, CA), sowie 25 pmol jedes Oligonucleotidprimers in einem
Endvolumen von 50 μl.
Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl
Mineralöl überschichtet.
Die Reaktion wird für
5 Minuten bei 100 °C
denaturiert, kurz auf Eis gegeben, worauf 1 μl Thermus-aquaticus-(Taq-) DNA-Polymerase
(5 Units/l, erworben von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville,
CA) unter die Mineralölschicht
zugegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen wie folgt programmierten
DNA-Thermocycler
(erworben von Perkin-Elmer Cetus) eingesetzt:
2 Minuten 55 °C
30
Sekunden 72 °C,
dann 19 Zyklen der Folgenden:
30 Sekunden 94 °C
30
Sekunden 55 °C
und
30 Sekunden 72 °C
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Am
Ende des Programms wird das Reaktionsfläschchen aus dem Thermocycler
entfernt und die wässrige
Phase in ein neues Fläschchen überführt, mit
Phenol/Chloroform (50:50 volumenmäßig) extrahiert und mittels
Ethanol präzipitiert,
worauf die DNA mittels Standardverfahren gewonnen wird. Dieses Material
wird anschließend
geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
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Ein
weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassettenmutagenese,
basiert auf der von Wells et al. (Gene 34, 315 (1985)) beschriebenen
Technik. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder der Vektor),
das die zu mutierende TIE-Liganden-Homolog-DNA
enthält.
Das/die Codon(s) im zu mutierenden TIE-Liganden-Homolog wird/werden identifiziert. Es
muss sich eine einzigartige Restriktionsendonucleasestelle an beiden
Seiten der identifizierten Mutationsstelle(n) befinden. Falls derartige
Stellen nicht vorhanden sind, können
sie unter Anwendung des oben beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten
Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an geeigneten Stellen
in die für
das TIE-Liganden-Homolog kodierende DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen
in das Plasmid eingeführt
worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um
es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das
für die
Sequenz der DNA zwischen der Restriktionsstelle kodiert, jedoch
die gewünschte(n)
Mutation(en) enthält,
wird mittels Standardverfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden
getrennt synthetisiert und dann unter Anwendung von Standardtechniken
miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als
Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konstruiert, dass sie
3'- und 5'-Enden aufweist,
die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, sodass
sie direkt in das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die
mutierte TIE-Liganden-Homolog-DNA-Sequenz.
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Außerdem kann
das so genannte Phagemid-Display-Verfahren bei der Herstellung von
Aminosäuresequenzvarianten
von nativen TIE-Liganden-Homologen und deren Varianten zweckdienlich
sein. Dieses Verfahren umfasst (a) das Konstruieren eines replizierbaren
Expressionsvektors, umfassend ein für einen zu mutierenden Rezeptor
kodierendes erstes Gen, ein für
zümindest
einen Abschnitt eines natürlichen
Phagen-Hüllproteins
oder Phagen-Hüllproteins
der Wildform kodierendes Gen, worin das erste und zweite Gen heterolog sind,
und ein Transkriptionsregulationselement, das operabel an das erste
und zweite Gen gebunden ist, wodurch eine für ein Fusionsprotein kodierende
Genfusion ausgebildet wird; (b) das Mutieren des Vektors an einer
oder mehreren ausgewählten
Positionen im ersten Gen, wodurch eine Familie verwandter Plasmide
gebildet wird; (c) das Transformieren geeigneter Wirtszellen mit
den Plasmiden; (d) das Infizieren der transformierten Zellen mit
einem Helferphagen, der ein Gen aufweist, das für das Hüllprotein kodiert; (e) das
Kultivieren der transformierten Wirtszellen unter Bedingungen, die
zur Bildung rekombinanter Phagemid-Teilchen geeignet sind, die zumindest
einen Abschnitt des Plasmids enthalten und zur Transformation des
Wirts fähig
sind, wobei die Bedingungen so eingestellt werden, dass nicht mehr
als eine geringfügige
Menge von Phagemid-Teilchen mehr als eine Kopie des Fusionsproteins
an der Oberfläche
des Teilchens präsentiert;
(f) das Kontaktieren der Phagemid-Teilchen mit einem geeigneten
Antigen, sodass zumindest ein Teil der Phagemid-Teilchen an das
Antigen bindet; und (g) das Trennen der bindenden Phagemid-Teilchen
von jenen, die nicht binden. Schritte (d) bis (g) können einmal
oder mehrere Male wiederholt werden. Vorzugsweise steht das Plasmid
bei diesem Verfahren unter strenger Kontrolle des Transkriptionsregulationselements,
und die Kultivierungsbedingungen werden so eingestellt, dass die
Menge oder Anzahl von Phagemid-Teilchen, die mehr als eine Kopie
des Fusionsproteine an der Oberfläche des Teilchens präsentieren,
weniger als etwa 1 % beträgt.
Ebenso bevorzugt beträgt
die Menge an Phagemid-Teilchen, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins
präsentieren,
weniger als 10 % der Phagemid-Teilchen, die eine einzige Kopie des
Fusionsproteins präsentieren.
Insbesondere bevorzugt beträgt
die Menge weniger als 20 %. Typischerweise wird bei diesem Verfahren
der Expressionsvektor außerdem
eine Sekretionssignalsequenz enthalten, die an die für jede Untereinheit des
Polypeptids kodierende DNA fusioniert ist, und das Regulationsele ment
wird ein Promotorsystem sein. Bevorzugte Promotorsysteme werden
aus lac Z-, λPL-, tac-, T7-Polymerase-, Tryptophan- und
Alkalische-Phosphatase-Promotoren und Kombinationen davon gewählt sein.
Außerdem
wird das Verfahren normalerweise einen Helferphagen einsetzen, der
aus M13K07, M13R408, M13-VCS und Phi X 174 ausgewählt ist.
Der bevorzugte Helferphage ist M13K07 und das bevorzugte Hüllprotein
ist das M13-Phagen-Gen-III-Hüllprotein.
Der bevorzugte Wirt ist E. coli und Proteinase-defekte Stämme von
E. coli.
-
Weitere
Einzelheiten der vorhergehenden und ähnlichen Mutagenesetechniken
finden sich in allgemeinen Lehrbüchern,
wie z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und Current
Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), Wiley-Interscience
(1991).
-
„Immunoadhäsine" sind Hybride, die
herkömmlicherweise
aus einer Rezeptorsequenz konstruiert werden, die an eine geeignete
Immunglobulin-Konstantdomänensequenz
gebunden ist (Immunoadhäsine).
Derartige Strukturen sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt.
In der Literatur beschriebene Immunoadhäsine umfassen Fusionen des
T-Zellen-Rezeptors* (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84, 2936–2940 (1987));
CD4* (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et
al., Nature 339, 68–70
(1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990);
Byrn et al., Nature 344, 667–670
(1990)); L-Selectin (homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell Biol.
110, 2221–2229
(1990); Watson et al., Nature 349, 164–167 (1991)); CD44* (Aruffo
et al., Cell 61, 1303–1313
(1990)); CD28* und B7* (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991));
CTLA-4* (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22* (Stamenkovic
et al., Cell 66, 1133–1144
(1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88, 10535–10539
(1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2882–2886 (1991);
Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren
(Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); IgE-Rezeptor-α-Kette* (Ridgway
und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstr. 1448 (1991)); HGF-Rezeptor
(M.R. Mark et al., J. Biol. Chem. (1992), eingereicht), wobei das
Sternchen (*) darauf hinweist, dass der Rezeptor ein Element der
Immunglobulin-Überfamilie
ist.
-
Liganden-Immunoglobulin-Hybride
sind ebenfalls bekannt und werden beispielsweise in den US-Patenten
Nr. 5.304.640 (für
L-Selectin-Liganden); 5.316.921 und 5.328.837 (für HGF-Varianten) offenbart.
Diese Hybride können
auf ähnliche
Weise wie die Konstruktion von Rezeptor-Immunglobulin-Hybriden hergestellt werden.
-
Kovalente
Modifizierungen der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung
sind im Schutzumfang hierin enthalten. Derartige Modifizierungen
werden herkömmlicherweise
eingeführt,
indem die Ziel-Aminosäurereste
des TIE-Liganden mit einem organischen Derivatisierungsmittel zur
Reaktion gebracht werden, das fähig
ist, mit gewählten
Stellen oder terminalen Resten zu reagieren, oder mittels Nutzbarkeits-Mechanismen der posttranslationellen
Modifizierungen, die in gewählten
rekombinanten Wirtszellen funktionstüchtig sind. Die resultierenden
kovalenten Derivate sind für
Programme, die auf die Identifizierung von Resten abzielen, die
für biologische
Aktivität
von Bedeutung sind, für
Immuntests oder zur Herstellung von Anti-TIE-Liganden-Antikörpern für die Immunoaffinitätsreinigung
der Rekombinanten zweckdienlich. Beispielsweise weist die vollständige Inaktivierung
der biologischen Aktivität
des Proteins nach Reaktion mit Ninhydrin darauf hin, dass zumindest
ein Arginyl- oder
Lysylrest für
seine Aktivität
entscheidend ist, worauf die einzelnen Reste, die unter den gewählten Bedingungen
modifiziert wurden, durch Isolierung eines Peptidfragments identifiziert
werden, das den modifizierten Aminosäurerest enthält. Derartige
Modifizierungen sind dem gewöhnlichen
Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und können ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt werden.
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Cysteinylreste
werden am häufigsten
mit α-Haloacetaten
(und entsprechenden Aminen), wie z.B. Chloressigsäure oder
Chloracetamid, zur Reaktion gebracht, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate
zu liefern. Cysteinylreste werden außerdem durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat,
N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2- pyridyldisulfid,
p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol
derivatisiert.
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Histidylreste
werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5–7,0 derivatisiert,
da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist.
para-Bromphenacylbromid
ist ebenfalls zweckdienlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1
M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
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Lysinyl-
und aminoterminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden
zur Reaktion gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat
die Wirkung der Ladungsumkehr von Lysinylresten. Andere geeignete
Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen
Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal;
Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff;
2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
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Arginylreste
werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen
Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal-2,3-butandion, 1,2-Cyclohexandion
und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert,
dass die Reaktion aufgrund des hohen pKa der
funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird.
Darüber
hinaus können
diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie der Arginin-Epsilon-Aminogruppe
reagieren.
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Die
spezifische Modifizierung von Tyrosylresten kann durch Reaktion
mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan durchgeführt werden,
wobei besonderes Interesse an der Einführung spektraler Marker in
Tyrosinylreste besteht. Am häufigsten
werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyl-Tyrosylspezies
bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung
von 125I oder 131I
iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung beim Radioimmuntest
herzustellen.
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Carboxylseitenketten
(Aspartyl und Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R'), wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid
oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid, selektiv
modifiziert. Darüber
hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen
zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgesetzt.
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Glutaminyl-
und Asparaginylreste werden häufig
zu den entsprechenden Glutamyl- und
Aspartylresten deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter
schwach sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste
liegen im Schutzumfang dieser Erfindung.
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Andere
Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin,
Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Threonyl- oder
Tyrosylresten, Methylierung der α-Aminogruppen
von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins:
Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman &Co., San Francisco,
S. 79–86
(1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung
jeglicher C-terminalen Carboxylgruppe. Die Moleküle können außerdem kovalent an nicht-proteinartige
Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene,
gebunden werden, und zwar in der Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835;
4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt
ist.
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Die
Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zur Herstellung
intramolekularer Aggregate des TIE-Liganden mit Polypeptiden sowie
zur Vernetzung des TIE-Liganden-Polypeptids
an eine wasserlösliche Trägermatrix
oder Oberfläche
zur Verwendung in Tests oder bei der Affinitätsreinigung zweckdienlich.
Außerdem
liefert die Untersuchung von Interketten-Vernetzungen direkte Informationen über die
Konformationsstruktur. Im Allgemeinen verwendete Vernetzungsmittel
umfassen 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan,
Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionelle Imidoester
und bifunktionelle Maleinimide. Derivatisierungsmittel, wie z.B.
Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, liefern photoaktivierbare
Zwischenprodukte, die fähig
sind, in Gegenwart von Licht Vernetzungen auszubilden. Alterna tiv
dazu werden wasserunlösliche Matrices
wie z.B. Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die in den US-Patenten
Nr. 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537;
4.055.635; und 4.330.440 beschriebenen Systeme reaktiver Substrate
für die
Proteinimmobilisierung und Vernetzung eingesetzt.
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Bestimmte
posttranslationelle Modifizierungen sind das Resultat der Wirkung
rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl-
und Asparaginylreste werden häufig
posttranslationell zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten
deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren
Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste liegen im Schutzumfang
dieser Erfindung.
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Andere
posttranslationelle Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung
von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-,
Threonyl- oder Tyrosylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin-
und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)).
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Andere
Derivate umfassen die kovalent an ein nicht-proteinartiges Polymer
gebundenen neuen Peptide dieser Erfindung. Das nicht-proteinartige
Polymer ist für
gewöhnlich
ein hydrophiles synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das in
der Natur ansonsten nicht vorkommt. Jedoch sind Polymere zweckdienlich,
die in der Natur vorkommen und durch rekombinante oder In-vitro-Verfahren
hergestellt werden, so wie es auch aus der Natur isolierte Formen
sind. Hydrophile Polyvinylpolymere liegen im Schutzumfang dieser
Erfindung, z.B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Insbesondere
zweckdienlich sind Polyvinylalkylenether, wie z.B. Polyethylenglykol
und Polypropylenglykol.
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Die
TIE-Liganden-Homologe können
an verschiedene nicht-proteinartige Polymere, wie z.B. Polyethylenglykol
(PEG), Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf eine Weise gebunden
werden, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 offenbart ist. Von diesen Varianten wird
wie von den Immunoadhäsinen
der vorliegenden Erfindung erwartet, dass sie längere Halbwertzeiten als die
entsprechenden nativen TIE-Liganden-Homologe aufweisen.
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Die
TIE-Liganden-Homologe können
in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Coazervationstechniken
oder mittels Grenzflächenpolymerisation
hergestellt werden, in kolloidale Medikamentabgabesysteme (z.B.
Liposomen, Albuminmikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen
eingeschlossen werden. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980), offenbart.
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Der
Ausdruck „nativer
TIE-Rezeptor" wird
hierin verwendet, um sich auf einen TIE-Rezeptor jeglicher Tierspezies zu beziehen,
die bekannt ist oder hiernach entdeckt wird, einschließlich, jedoch
nicht eingeschränkt
auf, Menschen, andere höhere
Primaten, z.B. Affen, und Nagetiere, z.B. Ratten und Mäuse. Die
Definition umfasst ausdrücklich
den TIE-2-Rezeptor, der beispielsweise in der PCT-Anmeldung Nr.
WO 95/13387 (veröffentlicht
am 18. Mai 1995) offenbart ist, und die in der PCT-Anmeldung WO 93/14124
(veröffentlicht
am 22. Juli 1993) „TIE" genannte Endothelzellenrezeptor-Tyrosinkinase
und ist vorzugsweise TIE-2.
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B. Anti-TIE-Liganden-Homolog-Antikörper
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst Antikörper, die die TIE-Liganden-Homologe
spezifisch binden. Die Antikörper
können
monoklonal oder polyklonal sein und umfassen ohne Einschränkung reife
Antikörper,
Antikörperfragmente
(z.B. Fab, F(ab')2, Fv usw.), Einzelkettenantikörper und
verschiedene Kettenkombinationen.
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Der
Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten
Sinne verwendet und umfasst im Speziellen einzelne monoklonale Antikörper, die
einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung spezifisch binden,
sowie Antikörperzusammensetzungen
mit polyepitopischer Spezifität.
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Der
Ausdruck „monoklonaler
Antikörper" bezieht sich bei
Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population
von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h.
dass die die Population umfassenden einzelnen Antikörper mit
der Ausnahme von natürlich
vorkommenden Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein
können,
identisch sind. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten
sich gegen einen einzige Antigenstelle. Darüber hinaus richtet sich jeder
monoklonale Antikörper im
Gegensatz zu herkömmlichen
(polyklonalen) Antikörperpräparaten,
die typischerweise verschiedene, gegen verschiedene Determinanten
(Epitope) gerichtete Antikörper
umfassen, gegen eine einzige Determinante am Antigen.
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Die
monoklonalen Antikörper
hierin umfassen Hybrid- und rekombinante Antikörper, die durch Spleißen einer
variablen (einschließlich
hypervariablen) Domäne
eines Anti-TIE-Liganden-Homolog-Antikörpers mit einer konstanten
Domäne
(z.B. „humanisierte" Antikörper) oder
einer Leichtkette mit einer Schwerkette oder einer Kette aus einer
Spezies mit einer Kette aus einer anderen Spezies erlangt werden,
oder Fusionen mit heterologen Proteinen ungeachtet der Ursprungsspezies
oder Immunglobulinklassen- oder -unterklassenzuordnung, sowie Antikörperfragmente
(z.B. Fab, F(ab')2 und Fv), solange sie die gewünschte biologische
Aktivität
zeigen. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567 und Mage et al., in:
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, S. 79–97, Marcel
Dekker, Inc., New York (1987).
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Daher
kennzeichnet der Modifikator „monoklonal" den Antikörper derart,
dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt
wurde, und er ist nicht dahingehend auszulegen, dass er die Produktion
des Antikörpers
durch irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden
Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper mit dem erstmals von Kohler und
Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahren oder durch
DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, wie sie im US-Patent
Nr. 4.816.567 beschrieben sind. Die „monoklonalen Antikörper" können außerdem aus
Phagenbibliotheken isoliert werden, die unter Verwendung der in
McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen
Techniken aus Phagenbibliotheken erzeugt wurden.
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„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher
Antikörper
(z.B. Maus-Antikörper)
sind spezifische chimäre
Immunglobuline, Immunglobulinketten oder deren Fragmente (wie z.B.
Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder
andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine von nicht-menschlichem
Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Größtenteils
sind humanisierte Antikörper
menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), bei
denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR)
des Empfängers
durch Reste einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie
z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt
sind. In manchen Fällen
werden Fv-Gerüstregion-(FR-)
Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche
Reste ersetzt. Darüber
hinaus kann der humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich
weder im Empfängerantikörper, noch
in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifizierungen
werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter
zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte
Antikörper
im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei
Domänen umfassen,
in denen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen denen eines
nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen
alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz
sind. Der humanisierte Antikörper
wird im Optimalfall außerdem
zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion oder
Domäne
(Fc), typischerweise jene eines menschlichen Immunglobulins, umfassen.
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Polyklonale
Antikörper
gegen ein TIE-Liganden-Homolog der vorliegenden Erfindung werden
im Allgemeinen in Tieren hergestellt, indem der TIE-Ligand und ein
Adjuvans mehrfach subkutan (sc) oder intraperitoneal (ip) injiziert
werden. Es kann zweckdienlich sein, den TIE-Liganden oder ein die
Ziel-Aminosäuresequenz
enthaltendes Fragment an ein Protein zu konjugieren, das in der
zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin,
Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor,
und zwar unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden
Reagens, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste),
N-Hydroxysuccinimid (über
Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder
R1N=C=NR, wobei R und R1 unterschiedliche
Alkylgruppen sind.
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Tiere
werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert,
indem 1 mg oder 1 μg Konjugat
(für Kaninchen
bzw. Mäuse)
mit drei Volumenanteilen Freundschem kompletten Adjuvans kombiniert und
die Lösung
intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später werden
die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Konjugatmenge in Freundschem
kompletten Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen
geboostet. 7 bis 14 Tage später
wird den Tieren Blut entnommen und das Serum auf Anti-TIE-Liganden-Titer
getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer sein Plateau
erreicht hat. Vorzugsweise werden die Tiere mit dem Konjugat desselben
TIE-Liganden geboostet, das jedoch ein anderes Protein und/oder über ein
anderes Vernetzungsreagens konjugiert ist. Konjugate können außerdem in
rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden.
Außerdem
können
Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, verwendet werden, um die Immunantwort
zu verstärken.
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Monoklonale
Antikörper
werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt,
d.h. dass die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper identisch
sind mit der Ausnahme möglicher
natürlich
auftretender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Daher
kennzeichnet der Modifikator „monoklonal" den Antikörper als
einen, der nicht ein Gemisch aus unterschiedlichen Antikörpern ist.
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Beispielsweise
können
die monoklonalen Anti-TIE-Liganden-Homolog-Antikörper der Erfindung durch Anwendung
des erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen
Verfahrens oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (Cabilly et al.,
US-Patent Nr. 4.816.567) hergestellt werden.
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Beim
Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier,
wie z.B. ein Hamster, wie hierin oben beschrieben immunisiert, um
Lymphozyten anzuregen, die Antikörper
produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an
das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu
können
Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden
dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels,
wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle auszubilden
(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S.59–103, Academic
Press (1986)).
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Die
so hergestellten Hybridomzellen werden in ein geeignetes Medium
geimpft und darin gezüchtet, wobei
das Medium vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die
das Wachstum oder Überleben unfusionierter
elterlicher Myelomzellen hemmt. Wenn beispielsweise den elterlichen
Myelomzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT
oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise
Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) umfassen, wobei diese Substanzen
das Wachstum HGPRT-defekter Zellen verhindern.
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Bevorzugte
Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile
hohe Antikörperexpression durch
die gewählten
antikörperproduzierenden
Zellen unterstützen
und gegen ein Medium, wie z.B. das HAT-Medium, empfindlich sind.
Unter diesen bevorzugten Myelomzelllinien sind Maus-Myelomlinien,
wie z.B. jene, die sich von MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren herleiten
und vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California,
USA, erhältlich
sind, sowie SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, USA, erhältlich
sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien
sind ebenfalls zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper beschrieben
worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal
Antibody Production Techniques and Applications, S. 51–63, Marcel
Dekker, Inc., New York (1987)).
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Das
Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen wachsen, wird auf Produktion
von gegen das TIE-Liganden-Homolog gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet.
Vor zugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen, durch Hybridomzellen
produzierten Antikörpern
mittels Immunopräzipitation
oder durch einen In-vitro-Bindungstest,
wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunosorbentassay
(ELISA), ermittelt.
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Die
Bindungsaffinität
des monoklonalen Antikörpers
kann beispielsweise mittels Scatchard-Analyse von Munson und Pollard,
Anal. Biochem. 107, 220 (1980), ermittelt werden.
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Nachdem
Hybridomzellen identifiziert worden sind, die Antikörper der
gewünschten
Spezifität,
Affinität und/oder
Aktivität
produzieren, können
die Klone mittels Grenzverdünnungsverfahren
subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, S. 59–104, Academic Press (1986).
Geeignete Kulturmedien zu diesem Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RMPI-1640-Medium.
Außerdem
können
die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumoren in einem Tier gezüchtet werden.
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Die
von den Subklonen produzierten monoklonalen Antikörper werden
in geeigneter Weise durch herkömmliche
Immunglobulinreinigungsverfahren vom Kulturmedium, von der Aszitesflüssigkeit
oder vom Serum abgetrennt, wie z.B. durch Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie,
Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie.
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Die
für die
monoklonalen Antikörper
der Erfindung kodierende DNA kann unter Anwendung herkömmlicher
Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind,
spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten
Ketten von Mausantikörpern
kodieren) leicht isoliert und sequenziert werden. Die Hybridomzellen
der Erfindung dienen dann als bevorzugte Quelle derartiger DNA.
Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren
eingesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Simian-COS-Zellen,
Chinahamster-Eierstock- (CHO-)
Zellen oder Myelomzellen, transfiziert werden, die ansonsten kein
Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in
den rekombi nanten Wirtszellen zu erlangen. Die DNA kann außerdem modifiziert
werden, beispielsweise durch Ersetzen der kodierenden Sequenz für menschliche
Schwer- und Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Maussequenzen
(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder
durch kovalentes Binden der gesamten oder eines Teils der kodierenden
Sequenz für
ein Nicht-Immunglobulinprotein an die für Immunglobulin kodierende
Sequenz. Auf diese Weise werden „chimäre" Antikörper oder „Hybrid"-Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines
monoklonalen Anti-TIE-Liganden-Antikörpers dieser Erfindung aufweisen.
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Typischerweise
werden die konstanten Domänen
eines Antikörpers
durch derartige Nicht-Immunglobulin-Polypeptide ersetzt, oder es
werden die variablen Domänen
einer der Antigen-kombinierenden Stellen eines Antikörpers der
Erfindung durch sie ersetzt, um einen chimären bivalenten Antikörper zu
erzeugen, der eine Antigen-kombinierende
Stelle mit Spezifität
für einen
TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung und eine weitere Antigen-kombinierende
Stelle mit Spezifität
für ein
anderes Antigen umfasst.
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Chimäre oder
hybride Antikörper
können
auch in vitro hergestellt werden, wobei bekannte Verfahren der synthetischen
Proteinchemie verwendet werden, einschließlich jene, die Vernetzungsmittel
umfassen. Beispielsweise können
Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder
durch Ausbildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele
geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolat und
Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
-
Für Diagnoseanwendungen
werden die Antikörper
der Erfindung typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung
markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung kann eine beliebige
sein, die fähig
ist, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu liefern.
Beispielsweise ist die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop,
wie z.B. 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I, eine fluoreszierende oder chemilumineszente
Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin;
Biotin; radioaktive Isotopenmarker, wie z.B. 125I, 32P, 14C oder 3H, oder ein Enzym, wie z.B. Alkalische Phosphatase,
Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase.
-
Es
kann jedes auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zur gesonderten
Konjugation des Antikörpers
mit der nachweisbaren Gruppierung eingesetzt werden, einschließlich jener
Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David
et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth.
40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407
(1982), beschrieben werden.
-
Die
Antikörper
der vorliegenden Erfindung können
in jedem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie z.B. in
kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests
und Immunopräzipitationstests.
Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, S. 147–158, CRC
Press, Inc. (1987).
-
Kompetitive
Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit
eines markierten Standards (der ein TIE-Liganden-Homolog oder ein
immunologisch reaktiver Abschnitt davon sein kann), mit dem Analyten
der Testprobe (TIE-Ligand) um die Bindung mit einer begrenzten Antikörpermenge
zu konkurrieren. Die Menge TIE-Liganden-Homolog in der Testprobe
ist umgekehrt proportional zur Menge Standard, die an die Antikörper bindet. Um
die Bestimmung der Menge des gebundenen Standards zu erleichtern,
werden die Antikörper
im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion solubilisiert,
sodass Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, bequem
vom ungebunden gebliebenen Standard und Analyt getrennt werden können.
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Sandwichtests
umfassen die Verwendung zweier Antikörper, wobei beide fähig sind,
an ein(en) anderen/s immunogenen/s Abschnitt oder Epitop des nachzuweisenden
Proteins zu binden. In einem Sandwichtest wird der Testprobenanalyt
von einem ersten Antikörper
gebunden, der an einem festen Träger
gebunden ist, worauf ein zweiter Antikörper an den Analyten bindet,
wodurch ein unlöslicher
dreiteiliger Komplex gebildet wird. David und Greene, US-Patent
Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper
kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkte
Sandwichtests) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen
werden, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist (indirekter
Sandwichtest). Beispielsweise ist ein ELISA-Test einer der Typen
von Sandwichtests, wobei in diesem Fall die nachweisbare Gruppierung
ein Enzym ist.
-
Verfahren
zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen
oder mehrere Aminosäurereste
auf, die in ihn aus einer nicht-menschlichen Quelle eingeführt worden
sind. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet,
die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne
entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem
Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321,
522–525
(1986): Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al.,
Science 239, 1534–1536
(1988)) durchgeführt
werden, indem die Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch
die entsprechenden Nager-CDRs oder CDR-Sequenzen ersetzt werden.
Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly,
s.o.), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche
variable Domäne
durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies
ersetzt worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise
menschliche Antikörper,
in denen einige CDR-Reste und möglicherweise
einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern ersetzt
sind.
-
Es
ist wichtig, dass Antikörper
mit Erhaltung hoher Affinität
für das
Antigen und anderen vorteilhaften biologischen Eigenschaften humanisiert
werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper nach
einem bevorzugten Verfahren durch einen Prozess der Analyse der
elterlichen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter
Produkte unter Verwendung dreidimensionaler Modelle der elterlichen
und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle
sind allgemein verfügbar
und dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung geläufig. Es
sind Computerprogramme verfügbar,
die mögliche dreidimensionale
Konformationsstrukturen gewählter
Kandidat-Immunglobulinsequenzen illustrieren und darstellen. Die
Prüfung
dieser Darstellungen ermöglicht
die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktion
der Kandidat-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten,
die die Fähigkeit
des Kandidat-Immunglobulins beeinflussen, an sein Antigen zu binden.
Auf diese Weise können
FR-Reste gewählt
und aus der Konsensus- und Import-Sequenz kombiniert werden, sodass
die gewünschte
Antikörpereigenschaft, wie
z.B. erhöhte
Affinität
für das/die
Ziel-Antigen(e), erzielt wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste
direkt und sehr wesentlich an der Beeinflussung der Antigenbindung
beteiligt.
-
Alternativ
dazu ist es nunmehr möglich,
transgene Tiere (z.B. Mäuse)
zu produzieren, die fähig
sind, bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher
Antikörper
in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren.
Es ist beispielsweise beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des
Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-(JH-) Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen in der
vollständigen
Hemmung endogener Antikörperproduktion
resultiert. Die Übertragung
der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in derartige
keimbahnmutierte Mäuse
resultiert für
gewöhnlich
in der Produktion menschlicher Antikörper bei Antigenexposition.
Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993);
Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993).
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Bispezifische
Antikörper
sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die
Bindungsspezifitäten
für zumindest
zwei verschiedene Antigene aufweisen. In vorliegenden Fall ist eine
der Bindungsspezifitäten
für einen
bestimmten TIE-Liganden, die andere ist für ein beliebiges anderes Antigen
und vorzugsweise für
einen anderen Liganden. Beispielsweise liegen bispezifische Antikörper, die
zwei verschiedene TIE-Liganden-Homologe spezifisch binden, im Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung.
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Verfahren
zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt.
-
Herkömmlicherweise
basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf
der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren,
wobei die beiden Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen
(Millstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der
zufälligen
Auswahl der Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren
diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch
aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von
denen nur einer die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die
Reinigung des korrekten Mole küls,
die für
gewöhnlich
mittels affinitätschromatischer
Schritte durchgeführt
wird, ist ziemlich mühsam,
und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren werden in der
PCT-Anmeldung Nr. WO 93/08829 (veröffentlicht am 13. Mai 1993)
und in Traunecker et al., EMBO 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
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Gemäß einem
anderen und bevorzugteren Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit
den gewünschten
Bindungsspezifitäten
(Antikörper-Antigen-kombinierenden
Stellen) an Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen fusioniert.
Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne und umfasst
zumindest einen Abschnitt des Gelenks und die zweite und dritte
konstante Region einer Immunglobulin-Schwerkette (CH2 und CH3).
Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1),
die die zur Leichtkettenbindung notwendige Stelle enthält, in zumindest
einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen
und, falls erwünscht,
für die
Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in gesonderte Expressionsvektoren
insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert.
Dies sorgt für
eine höhere
Flexibilität
bei der Einstellung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente
in Ausführungsformen,
bei denen ungleiche Verhältnisse
der drei bei der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten die optimalen
Ausbeuten bereitstellen. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen
für zwei
oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren,
wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten im gleichen
Verhältnis
in hohen Ausbeuten resultiert oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen
Relevanz sind. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes
sind die bispezifischen Antikörper
aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette
mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar
im anderen Arm (der eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) zusammengesetzt.
Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung
der gewünschten
bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen
erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in
nur einer Hälfte
des bispezifischen Moleküls
für eine
einfache Art und Weise der Trennung sorgt.
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Für weitere
Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh
et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
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Der
Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf
kleine Antikörperfragmente
mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable
Schwerkettendomäne
(V
H) aufweisen, die mit einer variablen
Leichtkettendomäne
(V
L) in derselben Polypeptidkette (V
H-V
L) verbunden ist.
Durch Verwenden eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen
den beiden Domänen
an derselben Kette zu erlauben, sind die Domänen gezwungen, sich mit den
komplementären
Domänen
einer anderen Ketten zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen zu
erzeugen. Diabodies werden beispielsweise in
EP 404.097 ; WO 93/11161; und Hollinger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), vollständiger beschrieben.
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Ein „isolierter" Antikörper ist ähnlich wie
die hierin oben bereitgestellte Definition für isolierte Polypeptide definiert.
Im Speziellen ist ein isolierter Antikörper einer, der identifiziert
und getrennt und/oder aus einer Komponente seiner natürlichen
Umgebung gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner
natürlichen
Umgebung sind Materialien, die die diagnostischen und therapeutischen
Verwendungen für
den Antikörper
stören
würden,
und können
Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht-proteinartige
Gelöststoffe
umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen
wird der Antikörper
gereinigt, und zwar (1) auf ein mittels Lowry-Verfahren ermitteltes
Ausmaß von
mehr als 95 Gew.-% Antikörper
und insbesondere auf ein Ausmaß von
mehr als 99 Gew.-%, (2) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest
15 Reste N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz durch Verwendung
eines Spinning-Cup-Sequenators zu erlangen, oder (3) bis zur Homogenität mittels
SDS-PAGE unter reduzierenden
oder nicht reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau
oder vorzugsweise Silberfärbung.
Ein isolierter Antikörper
umfasst den Antikörper
in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der
natürlichen
Umgebung des Antikörpers
nicht vorhanden sein wird. Für
gewöhnlich
wird ein isolierter Antikörper
jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
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Das
Wort „Marker" bezieht sich bei
Verwendung hierin auf eine nachweisbare Verbindung oder Zusammensetzung,
die direkt oder indirekt an den Antikörper gebunden ist, sodass ein „markierter" Antikörper erzeugt
wird. Der Marker kann selbst nachweisbar sein (z.B. Radioisotopmarker
oder Fluoreszenzmarker) oder im Falle eines Enzymmarkers chemische
Veränderungen
einer Substratverbindung oder Zusammensetzung katalysieren, die
nachweisbar sind.
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Unter „Festphase" wird eine nicht-wässrige Matrix
verstanden, an die der Antikörper
der vorliegenden Erfindung anhaften kann. Beispiele von hierein
vorgesehenen Festphasen umfassen jene, die teilweise oder völlig aus
Glas gebildet werden (Controlled-pore-Glas), Polysaccharide (z.B.
Agarose), Polyacrylamide, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikone.
In gewissen Ausführungsformen
kann die Festphase in Abhängigkeit
vom Zusammenhang den Well einer Testplatte umfassen; in anderen
ist sie eine Reinigungssäule
(z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Dieser
Ausdruck umfasst außerdem
eine diskontinuierliche Festphase getrennter Teilchen, wie z.B.
jene, die im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben ist.
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Ein „Liposom" ist ein kleines
Vesikel, das aus verschiedenen Arten von Lipiden, Phospholipiden und/oder
Tensiden zusammengesetzt ist, das zur Abgabe eines Medikaments (wie
z.B. der hierin offenbarten Anti-ErbB2-Antikörper und gegebenenfalls eines
chemotherapeutischen Mittels) zweckdienlich ist. Die Komponenten
des Liposoms sind üblicherweise
als Doppelschicht ähnlich
der Lipidanordnung biologischer Membranen angeordnet.
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Heterokonjugat-Antikörper liegen
ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper sind
beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen
(US-Patent Nr. 4.676.980) und zur Behandlung der HIV-Infektion (PCT-Anmeldungen
Nr. WO 91/00360 und WO 92/200373;
EP
03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Verwendung eines
beliebigen zweckmäßigen Vernetzungsverfahrens
hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet
der Erfindung wohlbekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam
mit einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
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„Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente
umfassen die VH- und VL-Domänen von
Antikörpern,
worin diese Domänen
in einer einzigen Polypeptidkette vorliegen. Vorzugsweise umfasst
das Fv-Polypeptid außerdem
einen Polypeptidlinker zwischen den VH-
und VL-Domänen, der es dem sFv ermöglicht,
die gewünschte
Struktur zur Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick bezüglich sFv
siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd.
113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New. York, S.
269–315
(1994).
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C. Klonierung und Expression
der TIE-Liganden-Homologe
-
Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" wechselseitig verwendet,
und alle derartigen Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft.
Es versteht sich außerdem,
dass aufgrund beabsichtigter oder unabsichtlicher Mutationen nicht
die gesamte Nachkommenschaft hinsichtlich des DNA-Gehalts genau
identisch sein muss. Mutierte Nachkommen, die dieselbe Funktion
oder biologische Eigenschaft aufweisen, auf die in der ursprünglich transformierten
Zelle gescreent worden ist, sind mit umfasst.
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Die
Ausdrücke „replizierbarer
Expressionsvektor" und „Expressionsvektor" beziehen sich auf
ein üblicherweise
doppelsträngiges
DNA-Stück,
in das ein Stück
Fremd-DNA insertiert sein kann. Fremd-DNA ist als heterologe DNA
definiert, die DNA ist, die in der Wirtszelle nicht vorkommt. Der
Vektor wird verwendet, um die fremde oder heterologe DNA in eine
geeignete Wirtszelle zu transportieren. Wenn er einmal in der Wirtszelle ist,
kann der Vektor sich unabhängig
von der chromosomalen Wirts-DNA replizieren, und es können mehrere Kopien
des Vektors und seiner insertierten (fremden) DNA erzeugt werden.
Außerdem
enthält
der Vektor die notwendigen Elemente, die die Translation der fremden
DNA in ein Polypeptid ermöglichen.
Viele Moleküle
des von der Fremd-DNA kodierten Polpeptids können folglich schnell synthetisiert
werden.
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Expressions-
und Klonierungsvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt
und enthalten eine Nucleinsäuresequenz,
die es dem Vektor ermöglicht,
in einer oder mehren gewählten
Wirtszellen zu replizieren. Die Wahl des geeigneten Vektors hängt von
Folgendem ab: 1) ob er zur DNA-Amplifikation oder zur DNA-Expression zu verwenden
ist; 2) der Größe der in
den Vektor zu insertierenden DNA und 3) der mit dem Vektor zu transformierenden
Wirtszelle. Jeder Vektor enthält
verschiedene Komponenten in Abhängigkeit
von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA)
und dem Wirt, für
den er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen,
sind jedoch nicht eingeschränkt
auf, eine oder mehrere der Folgenden: eine Signalsequenz, einen
Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement,
einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
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(i) Signalsequenzkomponente
-
Im
Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein,
oder sie kann ein Teil des TIE-Liganden-Moleküls sein, das in den Vektor
insertiert wird. Falls die Signalsequenz heterolog ist, sollte sie so
gewählt
sein, dass sie von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h.
von einer Signalpeptidase gespalten) wird.
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Für prokaryotische
Wirtszellen geeignete heterologe Signalsequenzen sind vorzugsweise
prokaryotische Signalsequenzen, wie z.B. die α-Amylase-, ompA-, ompC-, ompE-,
ompF-, Alkalische-Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabile
Enterotoxin-II-Leader. Für
die Hefesekretion können
beispielsweise die Hefe-Invertase-, Amylase-, Alpha-Faktor- oder
Saure-Phosphatase-Leader verwendet werden. Bei der Säugetierzellexpression
sind Säugetier-Signalsequenzen
am zweckdienlichsten. Die aufgezählten
Signalsequenzen dienen ausschließlich der Illustration und
schränken
den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise ein.
-
(ii) Replikationsstartpunktkomponente
-
Expressions-
sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz,
die es dem Vektor ermöglicht,
in einer oder mehreren gewählten
Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren
eine, die es dem Vektor ermöglicht,
sich unabhängig
von den Wirtschromosomen zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkte
oder autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sich für eine Vielzahl
von Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt
aus dem wohlbekannten Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen
Bakterien geeignet, der 2μ-Plasmid-Startpunkt für Hefe und
verschiedene Virusstartpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder
BPV) sind für
Klonierungsvektoren in Säugetierzellen
zweckdienlich. Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. dass
sie zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig sind,
jedoch zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden
können.
Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert, worauf derselbe
Vektor in Hefe oder Säugetierzellen
zur Expression transfiziert wird, obwohl er nicht fähig ist,
sich unabhängig
vom Chromosom des Wirts zu replizieren.
-
DNA
wird außerdem
durch Insertion in das Wirtsgenom kloniert. Dies kann leicht unter
Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirt erzielt werden, beispielsweise
indem in den Vektor eine DNA-Sequenz aufgenommen wird, die zu einer
in genomischer Bacillus-DNA vorkommenden Sequenz komplementär ist. Die Transfektion
von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in der homologen Rekombination
mit dem Genom und der Insertion der für das gewünschte heterologe Polypeptid
kodierenden DNA. Jedoch ist die Gewinnung genomischer DNA komplexer
als die eines exogen replizierten Vektors, da ein Restriktionsenzymverdau
notwendig ist, um das kodierte Polypeptidmolekül herauszuschneiden.
-
(iii) Selektionsgenkomponente
-
Expressions-
und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das
auch Selektionsmarker genannt wird. Dies ist ein Gen, das für ein Protein
kodiert, das zum Überleben
oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendig
ist. Die Gegenwart dieses Gens gewährleistet, dass jegliche Wirtszelle,
die diesen Vektor deletiert, hinsichtlich Wachstum oder Reproduktion
gegenüber
transformierten Wirten nicht im Vorteil ist. Typische Selektionsgene
kodieren für
Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine
verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin,
(b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe
bereitstellen, die aus komplexen Nährmedien nicht verfügbar sind,
z.B. das für
D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
-
Eines
der Beispiele eines Selektionsschemas setzt ein Medikament ein,
um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene
Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert
sind, exprimieren ein Protein, das Medikamentresistenz verleiht,
und überleben
folglich das Selektionsregime. Beispiele einer derartigen dominanten
Selektion verwenden die Medikamente Neomycin (Southern et al., J.
Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science
209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sudgen et al., Mol. Cel. Biol.
5, 410–413
(1985)). Die oben aufgezählten
drei Beispiele setzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle
ein, um Resistenz gegen das geeignete Medikament G418 oder Neomycin
(Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure)
bzw. Hygromycin zu verleihen.
-
Andere
Beispiele geeigneter Selektionsmarker für Säugetierzellen sind Dihydrofolatreduktase
(DHFR) oder Thymidinkinase. Derartige Marker ermöglichen die Identifizierung
von Zellen, die zur Aufnahme der gewünschten Nucleinsäure kompetent
waren. Die Säugetierzellen-Transformanten
werden unter Selektionsdruck gestellt, gegen den nur die Transformanten
aufgrund der Aufnahme des Markers zum Überleben einzigartig adaptiert
sind. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten
unter Bedingungen ausgeübt, bei
denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium sukzessiv
verändert
wird, wodurch sowohl das Selektionsgen, als auch die für das gewünschte Polypeptid
kodierende DNA amplifiziert wird. Die Amplifikation ist ein Prozess,
durch den Gene, deren Bedarf für
die Produktion eines für
das Wachstum entscheidenden Proteins höher ist, im Chromosom aufeinander
folgender Generationen rekombinanter Zellen tandemwiederholt werden.
Es werden erhöhte
Mengen des gewünschten
Polypeptids aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
-
Beispielsweise
werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zunächst durch
Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert,
dem Hypoxanthin, Glycin und Thymidin fehlt. Eine geeignete Wirtszelle
in diesem Fall ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekte Chinahamster-Eierstock-(CHO-) Zeillinie,
die wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216
(1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Eine besonders
zweckdienliche DHFR ist eine mutierte DHFR, die gegen MTX höchst resistent
ist (
EP 117.060 ). Dieses
Selektionsmittel kann mit jeglichem ansonsten geeigneten Wirt, z.B.
ATCC-Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Gegenwart endogener DHFR verwendet
werden. Die für
DHFR bzw. das gewünschte
Polypeptid kodierende DNA wird dann durch Exposition mit einem Mittel
(Methotrexat oder MTX) amplifiziert, das DHFR inaktiviert. Man gewährleistet,
dass die Zelle mehr DHFR benötigt
(und somit die gesamte exogene DNA amplifiziert), indem nur Zellen
selektiert werden, die in aufeinander folgenden Umläufen immer
höher werdender
MTX-Konzentration wachsen können.
Alternativ dazu können
Wirte, die mit Genen cotransformiert sind, die für das gewünschte Polypeptid, DHFR der
Wildform und einen weiteren Selektionsmarker, wie z.B. das neo-Gen,
kodieren, unter Verwendung eines Selektionsmittels für das Selektionsgen,
wie z.B. G418, identifiziert und dann unter Verwendung von Methotrexat
in einem Wirt der Wildform, der endogene DHFR enthält, selektiert
und amplifiziert werden (siehe auch US-Patent Nr. 4.965.199).
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Ein
geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid
YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979);
Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene
10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen
mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum in Tryptophan
fehlt, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die
Gegenwart der trp1-Läsion
im Hefe-Wirtszellgenom
stellt dann ein wirksames Milieu zum Nachweis der Transformation
durch Wachstum in Anwesenheit von Tryptophan bereit. Gleichermaßen werden Leu2-defekte
Hefestämme
(ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide
komplementiert.
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(iv) Promotorkomponente
-
Expressionsvektoren
sollten im Gegensatz zu Klonierungsvektoren einen Promotor enthalten,
der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die für das gewünschte Polypeptid
kodierende Nucleinsäure gebunden
ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die sich stromauf
vom Startcodon eines Strukturgens (im Allgemeinen innerhalb von
etwa 100 bis 1.000 bp) befinden, die die Transkription und Translation
von Nucleinsäure
unter ihrer Kontrolle kontrollieren. Sie gliedern sich typischerweise
in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren
sind Promotoren, die erhöhte
Transkriptionsniveaus aus DNA unter ihrer Kontrolle auslösen, und
zwar als Reaktion auf eine gewisse Änderung der Kulturbedingungen,
z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder eine Temperaturänderung.
Derzeit ist eine große
Anzahl von Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielzahl möglicher
Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an
die für
das gewünschte
Polypeptid kodierende DNA gebunden, indem sie durch Restriktionsenzymverdau
aus ihrem ursprünglichen
Gen entfernt werden, gefolgt von der Insertion 5' des Startcodons für das zu exprimierende Polypeptid.
Das heißt
nicht, dass der genomische Promotor für einen TIE-Liganden unbrauchbar
ist. Jedoch resultieren heterologe Promotoren im Allgemeinen in
höherer
Transkription und höheren
Ausbeuten an exprimierten TIE-Liganden-Homologen im Vergleich zu
den nativen TIE-Liganden-Promotoren.
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Zur
Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen
die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme
(Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature
281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)
Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) und EPO-Anmeldung
mit der Veröffentlichungsnummer
36.776) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (H. de Boer
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983)). Jedoch sind andere
bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nuclein säuresequenzen
sind veröffentlicht
worden, wodurch es dem geübten
Fachmann ermöglicht
wird, sie operabel an für
einen TIE-Liganden kodierende DNA zu ligieren (Siebenlist et al., Cell
20, 269 (1980)), und zwar unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren,
um jegliche erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen.
Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem eine operabel
an die für
einen TIE-Liganden kodierende DNA gebundene Shine-Dalgarno-(S.D.-)
Sequenz enthalten.
-
Geeignete
Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren
für 3-Phosphoglyceratkinase
(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische
Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1978); und Holland,
Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase,
Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase,
3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase,
Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
-
Andere
Hefe-Promotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen
Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription
sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom
C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus in Zusammenhang
stehende Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase
und Enzyme, die für
Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete
Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind
in R. Hitzeman et al.,
EP
73.657 A , weiterführend
beschrieben. Hefe-Enhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefe-Promotoren verwendet.
-
Promotorsequenzen
sind für
Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche
Region auf, die ungefähr
25 bis 30 Basen stromauf derjenigen Stelle lokalisiert ist, wo die
Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70
bis 80 Basen stromauf des Transkriptionsstarts vieler Gene befindet,
ist eine CXCAAT-Region, wobei X jegliches Nucleotid sein kann. Am
3'-Ende der meisten
eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal
zur Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein könnte. Alle
diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in Säugetier-Expressionsvektoren
insertiert.
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Die
TIE-Liganden-Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen kann durch
Promotoren gesteuert werden, die aus den Genomen von Viren, wie
z.B. aus Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus
(
UK 2.211.504 , veröffentlicht
am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus,
Vogel-Sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus
und insbesondere Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren,
z.B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, aus Hitzeschockpromotoren
und aus dem normalerweise mit der TIE-Liganden-Sequenz assoziierten
Promotor unter der Voraussetzung erlangt werden, dass derartige
Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
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Die
frühen
und späten
Promotoren des SV40-Virus können
bequem als SV40-Restriktionsfragment
erlangt werden, das außerdem
den SV40-Virus-Replikationsstartpunkt enthält (Fiers et al., Nature 273,
113 (1978), Mulligan und Berg, Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981)). Der unmittelbar
frühe Promotor
des menschlichen Cytomegalovirus wird bequem als HindIII-E-Restriktionsfragment
erlangt (Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982)). Ein System zur
DNA-Expression in Säugetierwirten
unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent
Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifizierung dieses Systems wird
im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al.,
Nature 295, 503–508
(1982), über
die Expression von für
menschliches Immuninterferon kodierender cDNA in Affen; Reyes et
al., Nature 297, 598–601
(1982), über
die Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA
in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinasepromotors
aus Herpes-Simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79 5166–5170
(1982), über
die Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Maus-
und Kaninchen-Zellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
79, 6777–6781
(1982), über
die Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen,
Hühnerembryo-Fibroblasten,
Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-HIN-3T3-Zellen
unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung aus Rous-Sarcomavirus
als Promotor.
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(v) Enhancerelementkomponente
-
Die
Transkription einer für
die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung kodierenden
DNA durch höhere
Eukaryoten wird häufig
durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert.
Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente
einer Länge
von üblicherweise
etwa 10 bis 300 bp, die an einem Promotor wirken, um dessen Transkription
zu steigern. Enhancer sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig und
wurden 5' (Laimins
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lasky et al., Mol.
Cel. Biol. 3, 1108 (1983)) der Transkriptionseinheit, in einem Intron
(Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie in der kodierenden Sequenz
selbst gefunden (Osborne et al., Mol. Cel. Biol. 4, 1293 (1984)).
Es sind viele Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin,
Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin).
Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus eukaryotischer
Zellen verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite
des Replikationsstartpunkts (bp 100–270), den frühen Promotor-Enhancer aus Cytomegalovirus,
den Polyoma-Enhancer an der späten
Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe
auch Yaniv, Nature 297, 17–18
(1982), über
Enhancerelemente zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der
Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' der TIE-Liganden-DNA in den Vektor
gespleißt
werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
-
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
-
In
eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere,
Mensch oder kernhaltige Zellen aus anderen vielzelligen Organismen)
verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten,
die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der
mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind im Allgemeinen aus
den 5'- und gelegentlich
3'-untranslatierten
Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese
Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente
im untranslatierten Abschnitt der für den TIE-Liganden kodierenden
mRNA transkribiert werden. Die 3'-untranslatierten
Regionen umfassen außerdem
Transkriptionsterminationsstellen.
-
Die
Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben
aufgezählten
Komponenten, die gewünschten
kodierenden und steuernden Sequenzen enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken
ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente
werden gespalten, maßgeschneidert
und in der gewünschten Form
neu ligiert, um die benötigten
Plasmide zu erzeugen.
-
Zur
Analyse zur Bestätigung
der korrekten Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische
verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446), zu transformieren,
und erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls mittels Ampicillin-
oder Tetracyclinresistenz selektiert. Es werden Plasmide aus den
Transformanten hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau
analysiert und/oder mittels Verfahren von Messing et al., Nucleic
Acids Res. 9, 309 (1981), oder mittels Verfahren von Maxam et al.,
Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
-
Bei
der praktischen Durchführung
dieser Erfindung besonders zweckdienlich sind Expressionsvektoren,
die für
eine vorübergehende
Expression der für
einen TIE-Liganden
kodierenden DNA in Säugetierzellen sorgen.
Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende
Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist,
sich in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle
zahlreiche Kopien des Expressionsvektors anreichert und dann hohe
Mengen eines gewünschten,
vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert. Vorübergehende
Systeme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle
umfassen, ermöglichen
die bequeme positive Identifizierung von Polypeptiden, die durch
klonierte DNAs kodiert werden, sowie das rasche Screening derartiger
Polypeptide auf gewünschte
biologische oder physiologische Eigenschaften. Daher sind vorübergehen de
Expressionssysteme in der Erfindung zum Zwecke der Identifizierung
von Analoga und Varianten eines TIE-Liganden besonders zweckdienlich.
-
Andere
Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung der Synthese
der TIE-Polypeptide in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet
sind, werden beschrieben in Getting et al., Nature 293, 620–625 (1981);
Mantel et al., Nature 281, 40–46
(1979); Levinson et al.;
EP 117.060 und
EP 117.058 . Ein besonders brauchbares
Plasmid zur Säugetierzellkulturexpression
der TIE-Liganden-Polypeptide ist pRK5 (
EP
307.247 ) zusammen mit seinen Derivaten, wie z.B. pRK5D,
das eine sp6-Transkriptionsinitiationsstelle,
gefolgt von einer den Xho/NotII-cDNA-Klonierungsstellen vorausgehenden
SfiI-Restriktionsenzymstelle aufweist, sowie pRK5B, einem Vorläufer von
pRK5D, das die SfiI-Stelle nicht enthält; siehe Holmes et al., Science
253, 1278–1280
(1991).
-
(vii) Konstruktion und
Analyse von Vektoren
-
Die
Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben
aufgezählten
Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein.
Isolierte DNA-Fragmente
werden gespalten, maßgeschneidert
und in der gewünschten
Form zur Erzeugung des benötigten
Plasmids neu ligiert.
-
Zur
Analyse zur Bestätigung
der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die
Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446),
zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls
mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert. Plasmide
aus den Transformanten werden hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau
analysiert und/oder mittels Verfahren von Messing et al., Nucleic
Acids Res. 9, 309 (1981), oder mittels Verfahren von Maxam et al.,
Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
-
(viii) Vorübergehende
Expressionsvektoren
-
Besonders
zweckdienlich bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung sind
Expressionsvektoren, die für
die vorübergehenden
Expression von für
einen TIE-Liganden
kodierender DNA in Säugetierzellen sorgt.
Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende
Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist,
sich in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle
zahlreiche Kopien des Expressionsvektors anreichert und dann hohe
Mengen eines vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert.
Sambrook et al., s.o., S. 16.17–16.22.
Vorübergehende
Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine
Wirtszelle umfassen, ermöglichen
das bequeme positive Screening derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische
oder physiologische Eigenschaften. Daher sind vorübergehende
Expressionssysteme in der Erfindung insbesondere zum Zwecke der
Identifizierung von Analoga und Varianten nativer TIE-Liganden-Homologe
mit der erforderlichen biologischen Aktivität zweckdienlich.
-
(ix) Geeignete beispielhafte
Vertebratenzellvektoren
-
Andere
Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung der Synthese
eines TIE-Liganden (einschließlich
funktioneller Abkömmlinge
nativer Proteine) in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind,
werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al.,
Nature 281, 40–46
(1979); Levinson et al.;
EP 117.060 ;
und
EP 117.058 beschrieben.
Ein besonders brauchbares Plasmid zur Säugetierzellkulturexpression
eines TIE-Liganden ist pRK5 (
EP 307.247 )
oder pSV16B (PCT-Anmeldung
Nr. WO 91/08291).
-
Geeignete
Wirtszellen zur Klonierung oder Expression der Vektoren hierin sind
die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen.
Geeignete Prokaryoten umfassen gram-negative oder gram-positive
Organismen, beispielsweise E. coli oder Bacilli. Ein bevorzugter
Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obgleich andere gram-negative
oder gram-positive Prokaryoten, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776
(ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325), Pseudomonas-Spezies
oder Serratia marcesans, geeignet sind.
-
Zusätzlich zu
Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z.B. filamentöse Pilze
oder Hefe, geeignete Wirte für
die Vektoren hierin. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche
Bäckerhefe
ist der am häufigsten
verwendete unter den niedrigeren eukaryotischen Wirtsmikroorganismen.
Jedoch ist eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämme allgemein
verfügbar
und hierin zweckdienlich, wie z.B. S. pombe (Beach und Nurse, Nature
290, 140 (1981)), Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol.
737 (1983)), Yarrowia (
EP 402.226 );
Pichia pastoris (
EP 183.070 ),
Trichoderma reesia (
EP 244.234 ),
Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979));
und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 112, 284–289
(1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger
(Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)).
-
Geeignete
Wirtszellen können
sich auch von vielzelligen Organismen herleiten. Derartige Wirtszellen sind
zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im
Prinzip ist jegliche eukaryotische Zellkultur, ob Vertebraten- oder
Invertebratenzellkultur, verwendbar, obgleich Zellen aus Säugetieren,
wie z.B. Menschen, bevorzugt sind. Beispiele von Invertebratenzellen
umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirusstämme und
Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen aus Wirten,
wie z.B. Wirtszellen aus Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti
(Stechmücke),
Aedes albopictus (Stechmücke),
Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, sind identifiziert
worden. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988);
Miller et al., in: Genetic Engineering, J.K. Setlow et al. (Hrsg.),
Bd. 8, Plenum Publishing, S 277–279
(1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Vielfalt
derartiger Virusstämme
ist öffentlich
zugänglich,
z.B. die L-1-Variante von Autographa-californica-NPV, und derartige
Viren können
als Virus hierin gemäß der vorliegenden
Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen,
verwendet werden.
-
Im
Allgemeinen werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten
Stämmen
des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das vorher
so manipuliert worden ist, um die TIE-Liganden-DNA zu enthalten.
Während
der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die
für einen
TIE-Liganden kodierende DNA auf den Pflanzenzellenwirt so übertragen,
dass er transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die TIE-Liganden-DNA
exprimiert. Außerdem
sind mit den Pflanzenzellen kompatible Regulations- und Signalsequenzen
verfügbar,
wie z.B. der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssequenzen. Depicker
et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem sind aus der Stromaufregion
des T-DNA-780-Gens isolierte
DNA-Segmente fähig,
die Transkriptionsstärken
pflanzenexprimierbarer Gene in rekombinante DNA enthaltenden Pflanzengeweben
zu aktivieren oder zu steigern. Siehe
EP
321.196 , veröffentlicht
am 21. Juni 1989.
-
Jedoch
bestand das größte Interesse
an Vertebratenzellen, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in
Kultur (Gewebekultur) ist an sich wohlbekannt. Siehe Tissue Culture,
Kruse und Patterson (Hrsg.), Academic Press (1973). Beispiele geeigneter
Säugetierwirtszelllinien
sind die durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7,
ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenzelllinie (293-Zellen oder zum
Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et
al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen 9BHK
(ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR
(CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980));
Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980));
Affen-Nierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatzen-Nierenzellen
(VERO-76, ATCC CRL-1587); Menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA,
ATCC CCL 2); Hunde-Nierenzellen
(MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen
(BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL
75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor
(MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y.
Acad. Sci. 383, 44068 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und menschliche
Hepatomzelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind menschliche
Urnieren-293- und Chinahamster-Eierstockzellen.
-
Insbesondere
bevorzugte Wirtszellen zum Zwecke der vorliegenden Erfindung sind
Vertebratenzellen, die die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden
Erfindung produzieren.
-
Wirtszellen
werden transformiert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen
Expressions- oder Klonierungsvektoren transformiert und in herkömmlichen
Nährmedien
kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren
oder Selektion von amplifizierte Gene enthaltenden Transformanten
modifiziert sind.
-
Zur
Produktion der TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung
verwendete Prokaryotenzellen werden wie in Sambrook et al., s.o.,
beschrieben in geeigneten Medien kultiviert.
-
Säugetierzellen
können
in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche
Medien, wie z.B. Ham's
F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma)
und Dulbecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM,
Sigma), sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann
ein beliebiges der in Ham und Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979),
Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980),
US 4.767.704 ; 4.657.866; 4.927.762;
oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195 oder US-Patent Nr. 30.985
beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet
werden. Jegliches dieser Medien kann wie erforderlich mit Hormonen
und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin
oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid,
Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie. z.B. HEPES), Nucleosiden
(wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamycin
TM-Medikament), Spurenelementen (definiert
als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen
im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer gleichwertigen
Energiequelle ergänzt
sein. Beliebige andere notwendige Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten
Konzentrationen enthalten sein, die dem geübten Fachmann auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt sind. Die geeigneten Kulturbedingungen, wie
z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind gegebenenfalls jene, die für die zur
Klonierung oder Expression gewählten
Wirtszellen vorher verwendet wurden, und sind dem gewöhnlichen
Fachmann offensichtlich.
-
Die
in dieser Offenbarung genannten Wirtszellen umfassen Zellen in vivo
sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier oder einer Pflanze befinden.
-
Es
ist außerdem
beabsichtigt, die TIE-Liganden-Homologe dieser Erfindung durch rekombinante
Rekombination oder mit rekombinanten Produktionsverfahren unter
Einsatz von Kontrollelementen zu produzieren, die in Zellen eingeführt werden,
die bereits die für
den jeweiligen TIE-Liganden kodierende DNA enthalten.
-
Eine
Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt
gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting,
Northern-Blotting zur Quantifizierung der mRNA-Transkription (Thomas,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting
(DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer
geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten
Sequenzen. Es können
verschiedene Marker eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere 32P. Jedoch können auch andere Techniken
eingesetzt werden, wie z.B. die Verwendung von Biotin-modifizierten
Nucleotiden zur Einführung
in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin
oder Antikörper, die
mit einer breiten Vielfalt von Markern, wie z.B. Radionukliden,
Fluoreszierern, Enzymen oder dergleichen markiert sein können. Alternativ
dazu können
Antikörper
eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe,
RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe,
erkennen können.
Die Antikörper
können
wiederum markiert sein, und der Test kann ausgeführt werden, wo der Duplex an
der Oberfläche
gebunden ist, sodass bei der Duplexbildung an der Oberfläche die
Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper detektiert werden kann.
-
Eine
Genexpression kann alternativ dazu mittels immunologischen Verfahren
gemessen werden, beispielsweise durch immunhistochemische Färbung von
Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten,
um die Genproduktex pression direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen
Färbetechniken
wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Entwässerung
und Fixierung, gefolgt von der Reaktion mit markierten Antikörpern, die
für das
gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Marker üblicherweise
visuell nachweisbar sind, wie z.B. enzymatische Marker, fluoreszierende
Marker, lumineszierende Marker und dergleichen. Eine besonders empfindliche
Färbetechnik,
die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird
von Hse et al., Am. J. Clin. Pharm. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
-
Für immunhistochemische
Färbung
und/oder das Testen von Probenflüssigkeiten
zweckdienliche Antikörper
können
entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Tier hergestellt
werden. In geeigneter Weise können
Antikörper
gegen ein natives TIE-Liganden-Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder
gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten
DNA-Sequenz wie hierin weiter unten beschrieben hergestellt werden.
-
Das
TIE-Liganden-Homolog kann in Wirtszellen in Form von Einschlusskörperchen
produziert oder in den periplasmatischen Raum oder in das Kulturmedium
sekretiert werden und wird typischerweise aus Wirtszelllysaten gewonnen.
Die rekombinanten Ligandenhomologe können mittels jeglicher Technik
gereinigt werden, die die anschließende Bildung eines stabilen
Proteins ermöglicht.
-
Wenn
das TIE-Liganden-Homolog in einer rekombinanten Zelle exprimiert
wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist es vollständig frei
von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist
es notwendig, das TIE-Liganden-Homolog von rekombinanten Zellproteinen
oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die bezüglich des
Liganden im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt wird das
Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu
entfernen. Die Membran- und löslichen
Proteinfraktionen werden dann getrennt. Das TIE-Liganden-Homolog
kann dann aus der löslichen
Proteinfraktion gereinigt werden. Die folgenden Verfahren sind beispielgebend
für geeignete
Reinigungsverfahren: Fraktionierung an Immunoaffinitäts- oder
Ionentauschersäulen;
Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC;
Chromatographie an Kieselgel oder an einem Kationentauscherharz,
wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammonsulfatpräzipitation;
Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75;
und Protein-A-Sepharose-Säulen,
um Verunreinigungen, wie z.B. IgG, zu entfernen.
-
Funktionelle
Derivate der TIE-Liganden-Homologe, bei denen Reste deletiert, insertiert
und/oder substituiert worden sind, werden in derselben Weise wie
die nativen Liganden gereinigt, wobei jegliche wesentlichen, durch
die Abänderungen
veranlassten Veränderungen
der Eigenschaften berücksichtigt
werden. Beispielsweise erleichtert die Fusion des TIE-Liganden-Homologs
mit einem anderen Protein oder Polypeptid, z.B. einem bakteriellen
oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Antikörper gegen das Antigen enthaltende Immunoaffinitätssäule kann
verwendet werden, um die Fusion zu absorbieren. Immunoaffinitätssäulen, wie z.B.
eine polyklonale Kaninchen-Anti-TIE-Liganden-Homolog-Säule, kann
eingesetzt werden, um TIE-Liganden-Homolog-Varianten durch Binden an zumindest
ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren. Ein Proteaseinhibitor,
wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kann auch zweckdienlich
sein, um den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen,
und es können
Antibiotika mit enthalten sein, um das Wachstum von hinzukommenden
Kontaminanten zu verhindern. Die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden
Erfindung werden in geeigneter Weise mittels Affinitätschromatographie
auf Basis ihrer Fähigkeit
gereinigt, an einen TIE-Rezeptor, z.B. TIE-2, zu binden.
-
Ein
Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass für native
TIE-Liganden-Homologe
geeignete Reinigungsverfahren Modifizierungen erfordern können, um Änderungen
des Charakters eines nativen TIE-Liganden-Homologs oder seiner Varianten
bei Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen.
-
D. Verwendung der TIE-Liganden-Homologe,
Nucleinsäuremoleküle und Antikörper
-
Es
wird erwartet, dass die TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung
für die
Begünstigung des Überlebens
und/oder Wachstums und/oder der Differenzierung von TIE-Rezeptor-exprimierenden
Zellen in Zellkultur zweckdienlich sind.
-
Die
TIE-Liganden-Homologe können
zusätzlich
verwendet werden, um Zellen zu identifizieren, die native TIE-Rezeptoren
exprimieren. Zu diesem Zweck wird ein nachweisbar markierter Ligand
mit einer Zielzelle unter Bedingungen kontaktiert, die seine Bindung
an seine Rezeptoren (TIE-Rezeptor) ermöglichen, wobei die Bindung überprüft wird.
-
Die
TIE-Liganden-Homologe hierin können
außerdem
verwendet werden, um Moleküle
zu identifizieren, die eine biologische Aktivität eines TIE-Liganden-Homolog
aufweisen, beispielsweise durch Exponieren einer ein TIE-Liganden-Homolog
der Erfindung exprimierenden Zelle mit einem Testmolekül und Nachweisen der
spezifischen Bindung des Testmoleküls an einen TIE-Rezeptor entweder
durch direkten Nachweis oder auf Basis sekundärer biologischer Wirkungen.
Dieser Ansatz ist insbesondere zur Identifizierung neuer Mitglieder der
TIE-Liganden-Familie oder zum Screening von Peptidbibliotheken oder
Nicht-Peptid-Bibliotheken kleiner Moleküle geeignet.
-
Die
hierin offenbarten TIE-Liganden-Homologe sind außerdem in Screeningtests nützlich,
die konstruiert sind, um Agonisten oder Antagonisten eines nativen
TIE-Rezeptors zu
identifizieren, die eine bedeutende Rolle bei Knochenentwicklung,
-reifung und -wachstum oder bei Muskelwachstum oder -entwicklung
spielen und/oder Angiogenese fördern
oder hemmen. Beispielsweise können
Antagonisten eines TIE-Rezeptors auf Basis ihrer Fähigkeit
identifiziert werden, die Bindung eines TIE-Liganden-Homologs der
vorliegenden Erfindung an einen nativen TIE-Rezeptor zu blockieren,
die beispielsweise unter Anwendung der BIAcore-Biosensortechnologie
(BIAcore; Pharmacia Biosensor, Midscataway, NJ) oder durch Überprüfung ihrer
Fähigkeit
gemessen werden kann, die biologische Reaktion zu blockieren, die durch
ein aktives TIE-Liganden-Homolog dieser Erfindung verursacht wird.
Biologische Reaktionen, die überprüft werden
können,
umfassen beispielsweise die Phosphorylierung des TIE-Rezeptors oder
von Stromab-Komponenten des TIE-Signalübertragungswegs
oder Überleben,
Wachstum oder Differenzierung von Zellen, die den TIE-Rezeptor exprimieren.
Auf Zellen basierende Tests unter Einsatz von den TIE-Rezeptor normalerweise
nicht exprimierenden Zellen, die konstruiert sind, um diesen Rezeptor
zu exprimieren oder um den TIE-Rezeptor und ein TIE-Liganden-Homolog der
vorliegenden Erfindung zusammen zu exprimieren, sind zur Verwendung
besonders geeignet.
-
In
einer speziellen Ausführungsform
können
kleine Agonisten- und Antagonistenmoleküle eines nativen TIE-Rezeptors
auf Basis ihrer Fähigkeit
identifiziert werden, die TIE-Ligand/TIE-Rezeptor-Wechselwirkung zu
stören.
Es bestehen zahlreiche Möglichkeiten
der Messung der spezifischen Bindung eines Testmoleküls an einen
TIE-Rezeptor, einschließlich, jedoch
nicht eingeschränkt
auf, den Nachweis oder die Messung der Menge eines Testmoleküls, die
an der Oberfläche
intakter, den TIE-Rezeptor
exprimierender Zellen gebunden, mit dem TIE-Rezeptor in Zelllysaten
vernetzt oder an den TIE-Rezeptor in vitro gebunden ist.
-
Nachweisbar
markierte TIE-Liganden-Homologe umfassen beispielsweise TIE-Liganden-Homologe, die
kovalent oder nicht kovalent an radioaktive Substanzen, z.B. 125I, eine fluoreszierende Substanz, eine
Substanz mit Enzymaktivität
(vorzugsweise für
kolorimetrischen Nachweis geeignet) oder eine Substanz gebunden
sind, die von einem (nachweisbar markierten) Antikörpermolekül erkannt
werden kann.
-
Die
Tests können
auf ähnliche
Weise durchgeführt
werden, wie sie in der am 18. April 1996 veröffentlichten PCT-Anmeldung
WO 96/11269 beschrieben ist.
-
Die
TIE-Liganden-Homologe der vorliegenden Erfindung sind außerdem zur
Reinigung von TIE-Rezeptoren zweckdienlich, gegebenenfalls in Form
von Immunoadhäsinen,
bei denen der TIE-Ligand oder der TIE-Rezeptor-bindende Abschnitt
davon an eine konstante Immunglobulin-Schwer- oder -Leichtkettenregion fusioniert
ist.
-
Außerdem können die
neuen TIE-Liganden-Homologe hierin zur Hemmung von Tumorwachstum zweckdienlich
sein.
-
Die
Nucleinsäuremoleküle der vorliegenden
Erfindung sind zum Nachweis der Expression der TIE-Liganden-Homologe
in Zellen oder Gewebeschnitten zweckdienlich. Zellen oder Gewebeschnitte
können
mit einem nachweisbar markierten, für einen TIE-Liganden der vorliegenden
Erfindung kodierenden Nucleinsäuremolekül unter
Hybridisierungsbedingungen kontaktiert und die Gegenwart von an
das Nucleinsäuremolekül hybridisierter
mRNA ermittelt werden, wodurch die Expression des TIE-Liganden nachgewiesen
wird.
-
Antikörper der
vorliegenden Erfindung können
beispielsweise in Immuntests verwendet werden, um die Mengen eines
TIE-Liganden in einer biologischen Probe zu messen. Die biologische
Probe wird mit einem Antikörper
oder Antikörpergemisch
kontaktiert, der/das einen TIE-Liganden der vorliegenden Erfindung
spezifisch bindet, und es wird die Menge des Komplexes gemessen,
der sich mit einem in der Testprobe vorhandenen Liganden bildet.
-
Antikörper gegen
die TIE-Liganden-Homologe hierin können außerdem zur Abgabe von zytotoxischen Molekülen wie
z.B. Radioisotopen oder Toxinen oder therapeutischen Mitteln an
Zellen verwendet werden, die einen entsprechenden TIE-Rezeptor exprimieren.
Die therapeutischen Mittel können
beispielsweise andere TIE-Liganden-Homologe, einschließlich der TIE-2-Ligand, Elemente
der Gefäßendothelwachstumsfaktor-(VEGF-)
Familie oder bekannte Antitumormittel und Mittel sein, die bekanntermaßen mit
Muskelwachstum und -entwicklung oder Knochenentwicklung, -reifung
oder -wachstum in Zusammenhang stehen.
-
Zur
therapeutischen Verwendung werden die TIE-Liganden-Homologe oder
Anti-TIE-Liganden-Antikörper der
vorliegenden Erfindung als therapeutische Zusammensetzung formuliert,
die den/die aktiven Bestandteil(e) in Beimischung mit einem pharmakologisch
annehmbaren Vehikel umfasst, das für systemische oder topische
Anwendung geeignet ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der
vorliegenden Erfindung werden zur Lagerung hergestellt, indem der
aktive Bestandteil mit dem gewünschten
Reinheitsgrad gegebenenfalls mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten
oder Stabilisatoren (Remington's
Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1980)) in Form
von lyophilisierten Formulierungen oder wässrigen Lösungen vermischt wird. Annehmbare
Träger,
Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen
und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B.
Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare
(weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin,
Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon,
Aminosäuren,
wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide,
Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder
Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B.
Mannit und Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder
nichtionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder PEG.
-
Die
aktiven Bestandteile können
auch in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken
oder Grenzflächenpolymerisation
hergestellt wurden, beispielsweise Hydroxymethylcellulose- bzw.
Gelatine-Mikrokapseln und Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln,
in kolloidalen Medikamentabgabesystemen (beispielsweise Liposomen,
Albumin-Mikrokügelchen,
Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen
eingeschlossen sein. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical
Sciences, s.o., offenbart.
-
Die
zur In-vivo-Verabreichung verwendeten Formulierungen müssen steril
sein. Dies kann leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen
vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erzielt werden.
-
Therapeutische
Zusammensetzungen hierin werden im Allgemeinen in einen Behälter mit
steriler Einfüllöffnung gegeben,
beispielsweise in einen Beutel für
intravenöse
Lösungen
oder in ein Fläschchen
mit einem von einer Subkutankanüle
durchstechbaren Stopfen.
-
Der
Verabreichungsweg steht im Einklang mit bekannten Verfahren, z.B.
Injektion oder Infusion über intravenöse, intraperitoneale,
intrazerebrale, intramuskuläre,
intraokuläre,
intraarterielle oder intraläsionale Wege,
topische Verabreichung oder Systeme mit nachhaltiger Freisetzung.
-
Geeignete
Beispiele von Präparaten
mit nachhaltiger Freisetzung (Retardpräparate) umfassen semipermeable
Polymermatrices in Form von Formteilchen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln.
Matrices mit nachhaltiger Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele,
Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919,
EP
58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-glutamat
(U. Sidman et al., Biopolymers 22(1), 547–556 (1983)), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)
(R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981),
und R. Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982)), Ethylenvinylacetat
(R. Langer et al., idem) oder Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure (
EP 133.988 A ). Zusammensetzungen
mit nachhaltiger Freisetzung umfassen auch Liposomen. Liposomen,
die ein im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthaltenes Molekül enthalten,
werden mittels Verfahren hergestellt, die an sich bekannt sind:
DE 3.218.121 A ;
Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985);
Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980);
EP 52322 A ;
EP 36676 A ;
EP 88046 A ;
EP 143949 A ;
EP 142641 A ; Japanische
Patentanmeldung 83-118008; US-Patente
Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und
EP 102.324 A . Für gewöhnlich sind die Liposomen vom
kleinen (etwa 200–800 Ångström) unilamellaren
Typ, bei dem der Lipidgehalt höher
als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der gewählte Anteil für die optimale
NT-4-Therapie eingestellt wird.
-
Eine
wirksame Menge eines therapeutisch einzusetzenden Moleküls der vorliegenden
Erfindung wird beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem
Verabreichungsweg und vom Leiden des Patienten abhängen. Demgemäß wird es
für den
Therapeuten notwendig sein, die Dosierung zu titrieren und die Verabreichung
je nach Bedarf zu modifizieren, um die optimale therapeutische Wirkung
zu erzielen. Eine typische tägliche
Dosis kann in Abhängigkeit
von den oben erwähnten
Faktoren im Bereich von etwa 1 μg/kg
bis zu 100 mg/kg oder mehr liegen. Typischerweise wird der Kliniker
ein Molekül
der vorliegenden Erfindung verabreichen, bis eine Dosis er reicht
ist, die für
die erforderliche biologische Wirkung sorgt. Der Fortschritt dieser
Therapie kann leicht durch herkömmliche
Tests überprüft werden.
-
Falls
es das therapeutische Ziel ist, Tumoren vorzubeugen oder Tumoren
zu behandeln, können
die Verbindungen hierin mit anderen Therapien kombiniert werden.
Beispielsweise kann der mit derartigen Antikrebsmitteln zu behandelnde
Patient auch eine Bestrahlungstherapie erhalten. Alternativ oder
zusätzlich
dazu kann dem Patienten ein chemotherapeutisches Mittel verabreicht
werden. Als Herstellungs- und Dosierungspläne für derartige chemotherapeutische
Mittel können
jene gemäß den Vorschriften
des Herstellers oder wie sie vom geübten Arzt empirisch ermittelt
wurden verwendet werden. Herstellungs- und Dosierungspläne für derartige
Chemotherapien sind auch in Chemotherapy Service, M.C. Perry (Hrsg.),
Williams & Wilkins,
Baltimore, MD (1992), beschrieben. Das chemotherapeutische Mittel
kann der Verabreichung des Antitumormittels vorangehen oder folgen
oder kann gleichzeitig damit verabreicht werden.
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Es
kann wünschenswert
sein, außerdem
Antikörper
gegen andere tumorassoziierte Antigene zu verabreichen, wie z.B.
Antikörper,
die an ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 oder Gefäßendothelfaktor (VEGF) binden. Alternativ
oder zusätzlich
dazu können
zwei oder mehr Antikörper,
die dasselbe oder zwei oder mehrere verschiedene hierin offenbarte
Antigene binden, dem Patienten zusammen verabreicht werden. Manchmal
kann es vorteilhaft sein, dem Patienten außerdem ein oder mehrere Cytokine
zu verabreichen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Antitumorverbindungen
hierin zusammen mit einem weiteren wachstumshemmenden Mittel verabreicht.
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Zur
Prävention
oder Behandlung einer Krankheit wird die geeignete Dosierung eines
Antitumormittels, z.B. eines Antikörpers der Erfindung, von der
wie oben definierten Art der zu behandelnden Krankheit, der Schwere
und dem Verlauf der Krankheit, davon, ob das Mittel zu präventiven
oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von der vorausgehenden
Therapie, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf
das Mittel und vom Ermessen des behandelnden Arztes abhängen. Das Mittel
wird dem Patienten in geeigneter Weise auf einmal oder über eine
Reihe von Behandlungen hinweg verabreicht.
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Beispiel 1
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Identifizierung von NL3
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NL3
wurde durch Screening der GenBank-Datenbank unter Verwendung des
Computerprogramms BLAST identifiziert (Altschul et al., Methods
in Enzymology 266, 460–480
(1996)). NL3 zeigt Homologie mit den bekannten EST-Sequenzen T57280
und T50719. Keine der bekannten Sequenzen ist als Sequenz voller
Länge identifiziert
oder als mit den TIE-Rezeptoren in Verbindung stehende Liganden
beschrieben worden.
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Nach
seiner Identifizierung wurde NL3 aus einer Bibliothek der menschlichen
fötalen
Lunge kloniert, die aus von Clontech, Inc., (Palo Alto, CA, USA)
bezogener mRNA, Katalog-Nr. 6528-1, nach den Anleitungen des Herstellers
hergestellt wurde. Die Bibliothek wurde mittels Hybridisierung mit
synthetischen Oligonucleotidsonden gescreent:
Für NL3:
NL3.5-1
TGGTTGGCAAAGGCAAGGTGGCTGACGATCCGG Seq.-ID Nr. 10
NL3.3-1 GTGGCCCTTATCTCTCCTGTACAGCTTCCGGATCGTCAGCCAC
Seq.-ID Nr. 11
NL3.3-2 TCCATTCCCACCTATGACGCTGACCCA Seq.-ID
Nr. 12
auf Basis der in der GenBank-Datenbank gefundenen ESTs.
cDNA-Sequenzen wurden vollständig
sequenziert.
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Die
Nucleotid- und Aminosäuresequenz
von NL3 sind in 4 (Seq.-ID Nr. 3) bzw. 5 (Seq.-ID
Nr. 4) dargestellt.
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Ein
Klon von NL3 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC),
12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, am 18. September
1997 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags hinterlegt und
erhielt die Hinterlegungsnummer ATCC 209283.
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Beispiel 2
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Ergebnisse der Northern-Blot-Analyse
und In-situ-Hybridisierung
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Die
Expression der NL3-mRNA in menschlichen Geweben wurde mittels Northern-Blot-Analyse untersucht.
Menschliche mRNA-Blots wurden an eine 32P-markierte
DNA-Sonde auf Basis der cDNAs voller Länge hybridisiert; die Sonden
wurden durch Verdauen und Reinigen der cDNA-Inserts erzeugt. „Human
fetal RNA blot MTN" (Clontech)
und „human
adult RNA blot MTN-II" (Clontech)
wurden mit den DNA-Sonden
inkubiert. Die Blots wurden mit den Sonden in Hybridisierungspuffer
(5 × SSPE;
2Denhardt-Lösung;
100 mg/ml denaturierte, gescherte Lachsspermien-DNA; 50 % Formamid;
2 % SDS) 60 Stunden lang bei 42 °C
inkubiert. Die Blots wurden mehrere Male in 2 × SCC, 0,05 % SDS 1 Stunde
lang bei Raumtemperatur gewaschen, gefolgt von einer Waschung für 30 Minuten
in 0,1 × SSC;
0,1 % SDS bei 50 °C.
Die Blots wurden nach Exposition über Nacht mittels Phosphorimager-Analyse
(Fuji) entwickelt.
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Wie
in 9 dargestellt, wurden NL3-mRNA-Transkripte nachgewiesen.
-
Das
Gewebeexpressionsmuster von NL3 wurde auch durch In-situ-Hybridisierung
(Beobachtung von Hybridisierung an zelluläre RNA) unter Verwendung einer
optimierten Arbeitsvorschrift, die PCR-gebildete, 33P-markierte
Ribosonde verwendet, bestimmt (Lu & Gillett, Cell Vision 1, 169–176 (1994)).
Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete menschliche fötale und
erwachsene Gewebe wurden in Schnitte aufgeteilt, entparaffiniert,
in Proteinase K (20 g/ml) 15 min lang bei 37 °C deproteinisiert und weiter
zur In-situ-Hybridisierung, wie von Lu & Gillett (1994) beschrieben, verarbeitet.
Eine [33-P]-UTP-markierte Antisense-Ribosonde
wurde aus einem PCR- Produkt
gebildet und bei 55 °C über Nacht
hybridisiert. Die Objektträger
wurden in Kodak-NTB2-Kernspuremulsion getaucht und 4 Wochen lang
entwickeln gelassen.
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33P-Ribosonde-Synthese
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6,0 μl (125 mCi) 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmol) wurden
schnell speed-vac-getrocknet. Zu jedem Röhrchen, das getrocknetes 33P-UTP enthielt, wurden die folgenden Bestandteile
zugesetzt:
2,0 μl
5 × Transkriptionspuffer
1,0 μl DTT (100
mM)
2,0 μl
NTP-Mischung (2,5 mM : 10 μ;
jeweils von 10 mM GTP, CTP & ATP
+ 10 μl
H2O)
1,0 μl UTP (50 μM)
1,0 μl Rnasin
1,0 μl DNA-Templat
(1 μg)
1,0 μl H2O
1,0 μl RNA-Polymerase (für PCR-Produkte
T3 = AS, T7 = S, üblicherweise)
-
Die
Röhrchen
wurden bei 37 °C
eine Stunde lang inkubiert. 1,0 μl
RQ1-DNase wurde zugesetzt, gefolgt von Inkubation bei 37 °C 15 min
lang. 90 μl
TE (10 mM Tris pH 7,6/1 mM EDTA pH 8,0) wurden zugesetzt, und das
Gemisch wurde auf DE81-Papier pipettiert. Die verbleibende Lösung wurde
in eine Microcon-50-Ultrafiltrationseinheit geladen und unter Verwendung
von Programm 10 (6 min) zentrifugiert. Die Filtrationseinheit wurde
in ein zweites Röhrchen
geleert, und dieses wurde unter Verwendung von Programm 2 (3 min)
zentrifugiert. Nach dem abschließenden Zentrifugieren zur Gewinnung
wurden 100 μl
TE zugesetzt. 1 μl
des Endprodukts wurde auf DE81-Papier
pipettiert und in 6 ml Biofluor II gezählt.
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Die
Sonde wurde auf einem TBE/Harnstoff-Gel laufen gelassen. 1–3 μl der Sonde
oder 5 μl
von RNA-Mrk-III wurden zu 3 μl
Ladepuffer zugesetzt. Nach 3-minütigem
Erhitzen auf einem 95-°C-Heizblock
wurde das Gel unmittelbar auf Eis gegeben. Die Gel-Wells wurden
durchgespült,
die Probe geladen und bei 180–250
Volt 45 min lang laufen gelassen. Das Gel wurde in Klarsichtfolie
gewickelt, und damit wurde ein XAR-Film mit einer Verstärkerfolie
in einem Tiefkühler
mit –70 °C von einer
Stunde lang bis über
Nacht entwickelt.
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33P-Hybridisierung
-
Vorbehandlung
tiefgefrorener Schnitte. Die Objektträger wurden aus dem Tiefkühler entfernt,
auf Aluminium-Schalen gegeben und bei Raumtemperatur 5 min lang
aufgetaut. Die Schalen wurden 5 min lang in einen 55-°C-Inkubator
gegeben, um Kondensation zu reduzieren. Die Objektträger wurden
10 min lang in 4 % Paraformaldehyd auf Eis im Abzug fixiert und
in 0,5 × SSC
5 min lang bei Raumtemperatur gewaschen (25 ml 20 × SSC +
975 ml SQ H2O). Nach 10-minütiger Deproteinisierung
in 0,5 μg/ml
Proteinase K bei 37 °C
(12,5 μl
von 10 mg/ml Stammlösung
in 250 ml vorgewärmtem
RNase-freiem RNase-Puffer) wurden die Schnitte 10 min lang bei Raumtemperatur
in 0,5 × SSC
gewaschen. Die Schnitte wurden in 70 %, 95 %, 100 % Ethanol, 2 min
jeweils, dehydratisiert.
-
Vorbehandlung
von in Paraffin eingebetteten Schnitten. Die Objektträger wurden
entparaffiniert, in SQ H2O gegeben und zweimal
in 2 × SSC
bei Raumtemperatur, 5 min jeweils, gewaschen. Die Schnitte wurden
in 20 μg/ml
Proteinase K (500 μl
von 10 mg/ml in 250 ml RNase-freiem RNase-Puffer, 37 °C, 15 min) – menschlicher
Embryo, oder in 8 × Proteinase
K (100 μl
in 250 ml RNase-Puffer, 37 °C,
30 min) – Formalingewebe, deproteinisiert.
Darauf folgendes Spülen
in 0,5 × SSC
und Dehydratisierung erfolgten wie oben beschrieben.
-
Vorhybridisierung.
Die Objektträger
wurden in einem Kunststoffbehälter,
der mit Box-Puffer-(4 × SSC, 50
% Formamid) gesättigtem
Filterpapier ausgekleidet war, ausgelegt. Das Gewebe wurde mit 50 μl Hybridisierungspuffer
(3,75 g Dextransulfat + 6 ml SQ H2O) bedeckt,
zentrifugiert und in der Mikrowelle 2 min lang bei gelockertem Deckel
erhitzt. Nach Abkühlen
auf Eis wurden 18,75 ml Formamid, 3,75 ml 20 × SSC und 9 ml SQ H2O zugesetzt, das Gewebe wurde ausführlich zentrifugiert
und bei 42 °C
1–4 h
lang inkubiert.
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Hybridisierung.
1,0 × 106 cpm Sonde und 1,0 μl tRNA (50 mg/ml Stammlösung) pro
Objektträger
wurden 3 min lang auf 95 °C
erhitzt. Die Objektträger
wurden auf Eis gekühlt,
und 48 μl
Hybridisierungspuffer wurden pro Objektträger zugesetzt. Nach dem Zentrifugieren
wurden 50 μl 33P-Mischung zu 50 μl Vorhybridisierungsprodukt
auf dem Objektträger
zugesetzt. Die Objektträger
wurden über
Nacht bei 55 °C
inkubiert.
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Waschschritte.
Waschen erfolgte 2 × 10
min lang mit 2 × SSC,
EDTA bei Raumtemperatur (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0,25 M EDTA,
Vf = 4 l), gefolgt von RNaseA-Behandlung bei 37 °C 30 min
lang (500 μl
von 10 mg/ml in 250 ml RNase-Puffer = 20 μg/ml). Die Objektträger wurden
2 × 10
min lang mit 2 × SSC,
EDTA bei Raumtemperatur gewaschen. Die stringenten Waschbedingungen
lauteten wie folgt: 2 h bei 55 °C,
0,1 × SSC, EDTA
(20 ml 20 × SSC
+ 16 ml EDTA, Vf = 4 l).
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Oligos:
-
- C-141F-NL3p1: 48mer GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC
AAG TTG TCC TCC
(Seq.-ID Nr. 16)
- C-141G-NL3p2: 47mer CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CGT
GGT CAG CGT
(Seq.-ID Nr. 17)
-
Die
untersuchten erwachsenen Gewebe waren: Leber, Niere, Nebenniere,
Herzmuskel, Aorta, Milz, Lymphknoten, Bauchspeicheldrüse, Lunge,
Haut, Großhirnrinde,
Hippocampus, Kleinhirn, Penis, Auge, Blase, Magen, Magenkarzinom,
Kolon, Kolonkarzinom und Chondrosarkom, Acetominophen-induzierte
Leberschädigung
und Leberzirrhose. Die untersuchten fötalen Gewebe waren: Plazenta,
Nabelschnur, Leber, Niere, Nebennieren, Schilddrüse, Lungen, Herz, große Blutgefäße, Speiseröhre, Magen,
Dünndarm,
Milz, Thymus, Bauchspeicheldrüse,
Gehirn, Auge, Rückenmark,
Körperwand,
Becken und untere Extremität.
Expression wurde nicht in jedem der normalen oder fötalen Gewebe
beobachtet. Expression wurde in sinusoidalen Leberzellen (wahrscheinlich
Endothelzellen) sowohl bei akuter (Acetaminopheninduzierter) als
auch chronischer Leberschädigung
(Zirrhose und neben kolorektalen Karzinommetastasen) nachgewiesen.
Diese Resultate weisen darauf hin, dass NL3 bei der Regulierung
von Leberregeneration eine Rolle spielen kann.
-
Die
Expression von NL1 wurde auch in einer ähnlichen Anordnung erwachsener
und fötaler
Gewebe untersucht, wobei jedoch unter den oben angegebenen Bedingungen
keine Expression beobachtet wurde.
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Beispiel 3
-
Expression von NL3 in
E. coli
-
Dieses
Beispiel illustriert die Herstellung einer unglykosylierten Form
der TIE-Liganden-Homologe
der vorliegenden Erfindung in E. coli. Die für einen NL-3-Liganden kodierende
DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 3) wird zunächst unter Verwendung ausgewählter PCR-Primer
amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen enthalten,
die den Restriktionsenzymstellen am gewählten Expressionsvektor entsprechen.
Es kann eine Vielzahl an Expressionsvektoren eingesetzt werden.
Der Vektor wird vorzugsweise für
ein Antibiotikaresistenzgen, einen Replikationsstartpunkt, einen
Promotor und eine Ribosombindungsstelle kodieren. Ein Beispiel für einen
geeigneten Vektor ist pBR322 (hergeleitet von E. coli; siehe Bolivar
et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz
enthält.
Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert.
Die PCR-amplifizierten Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert.
-
Das
Ligationsgemisch wird dann verwendet, um einen gewählten E.-coli-Stamm
unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren
zu transformieren. Transformanten werden aufgrund ihrer Fähigkeit
identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, worauf antibiotikaresistente
Kolonien selektiert werden. Plasmid-DNA kann isoliert und mittels
Restriktionsanalyse bestätigt
werden.
-
Selektierte
Klone können über Nacht
in Flüssigmedium,
wie z.B. mit Antibiotika ergänzter
IB-Bouillon, gezüchtet
werden. Die Übernachtkultur
kann anschließend
verwendet werden, um eine Kultur im größeren Maßstab zu inokulieren. Die Zellen
werden dann auf eine gewünschte
optische Dichte gezüchtet.
Es kann ein Induktor, wie z.B. IPTG, zugegeben werden.
-
Nach
dem Kultivieren der Zellen für
mehrere weitere Stunden können
die Zellen mittels Zentrifugation geerntet werden. Das durch die
Zentrifugation erhaltene Zellpellet kann unter Verwendung verschiedener,
auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel solubilisiert werden,
worauf das solubilisierte Protein unter Verwendung einer Metallchelatsäule unter
Bedingungen gereinigt werden kann, die eine feste Bindung des Proteins ermöglichen.
-
Beispiel 4
-
Expression von NL3 in
Säugetierzellen
-
Dieses
Beispiel illustriert die Herstellung einer glykosylierten Form des
NL3-Liganden-Homologs
durch rekombinante Expression in Säugetierzellen.
-
Der
Vektor pRK5 (siehe
EP 307.247 ,
veröffentlicht
am 15. März
1989) wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls wird
die NL3-DNA mit gewählten
Restriktionsenzymen in pRK5 ligiert, um die Insertion der NL3-DNA
unter Verwendung von Ligationsverfahren zu ermöglichen, wie sie z.B. in Sambrook
et al., s.o., beschrieben sind. Der resultierende Vektor wird pRK5-NL3
genannt.
-
In
einer der Ausführungsformen
können
die gewählten
Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573)
werden in Gewebekulturplatten in Medium wie z.B. mit Fötalkälberserum
und gegebenenfalls mit Nährstoffkomponenten
und/oder Antibiotika ergänztem
DMEM bis zur Konfluenz gezüchtet.
Etwa 10 μg
pRK5-NL3-DNA werden mit etwa 1 μg
der für
das VA-RNA-Gen kodierenden DNA (Thimmappaya et al., Cell 31, 543
(1982)) vermischt und in 500 μl
1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2 gelöst. Zu diesem
Gemisch werden tropfenweise 500 μl
50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO4 zugegeben,
und es wird die Ausbildung eines Präzipitats für 10 Minuten bei 25 °C ermöglicht.
Das Präzipitat
wird suspendiert, zu den 293-Zellen zugegeben und für etwa vier
Stunden bei 37 °C
absetzen gelassen. Das Kulturmedium wird abgesaugt, und es werden
2 ml 20 %iges Glycerin in PBS für
30 Sekunden zugegeben. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem
Medium gewaschen, worauf frisches Medium zugegeben wird und die
Zellen für
etwa 5 Tage inkubiert werden.
-
Ungefähr 24 Stunden
nach den Transfektionen wurde das Kulturmedium entfernt und durch
Kulturmedium (für
sich alleine) oder 200 μCi/ml 35S-Cystein und 200 μCi/ml 35S-Methionin
Kulturmedium ersetzt. Nach Inkubation für 12 Stunden wird das konditionierte
Medium gesammelt, an einem Zentrifugenfilter konzentriert und auf
ein 15 %iges SDS-Gel aufgegeben. Das verarbeitete Gel kann getrocknet
und für
eine gewählte
Zeitdauer einem Film exponiert werden, um die Gegenwart von NL3-Polypeptid
nachzuweisen. Die Kulturen, die transfizierte Zellen enthalten,
können
einer weiteren Inkubation (in serumfreiem Medium) unterzogen und
das Medium in gewählten
Biotests getestet werden.
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In
einer alternativen Technik kann NL3 unter Verwendung des von Somparyac
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 12, 7575 (1981), beschriebenen
Dextransulfatverfahrens vorübergehend
in 293-Zellen eingeführt werden.
293-Zellen werden in einer Spinner-Flasche auf maximale Dichte gezüchtet, und
es werden 700 μg pRK5-NL3-DNA
zugegeben. Die Zellen werden zunächst
mittels Zentrifugation aus der Spinner-Flasche konzentriert und
mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird auf dem Zellpellet
für vier
Stunden inkubiert. Die Zellen werden mit 20 % Glycerin für 90 Sekunden
behandelt, mit Gewebekulturmedium gewaschen und wieder in die Spinner-Flasche überführt, die
Gewebekulturmedium, 5 μg/ml
Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin
enthält.
Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert
und filtriert, um Zellen und Trümmer
zu entfernen. Die exprimiertes NL3 enthaltende Probe kann dann mit
einem beliebigen gewählten
Verfahren, wie z.B. Dialyse und/oder Säulenchromatographie, konzentriert
und gereinigt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann NL3 in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-NL3 kann unter
Verwendung bekannter Reagenzien, wie z.B. CaPO4 oder
DEAE-Dextran, in CHO-Zellen transfiziert werden. Wie oben beschrieben
können
die Zellkulturen inkubiert und das Medium durch Kulturmedium (für sich alleine)
oder Medium ersetzt werden, das einen Radiomarker, wie z.B. 35S-Methionin, enthält. Nach Ermittlung der Gegenwart
von NL3-Polypeptid kann das Kulturmedium durch serumfreies Medium
ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen für etwa 6
Tage inkubiert, worauf das konditionierte Medium geerntet wird.
Das exprimiertes NL3 enthaltende Medium kann dann mit einem beliebigen
gewählten
Verfahren konzentriert und gereinigt werden.
-
Epitop-markiertes
NL3 kann ebenfalls in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. NL3 kann
aus dem pRK5-Vektor heraus subkloniert werden. Das Subklon-Insert
kann einer PCR unterzogen werden, um In-frame mit einem gewählten Epitop-Marker,
wie z.B. einem Poly-His-Marker, in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu
fusionieren. Das Poly-His-markierte NL3-Insert kann dann in einen
SV40-angetriebenen Vektor subkloniert werden, der einen Selektionsmarker,
wie z.B. DHFR, zur Selektion stabiler Klone enthält. Schließlich können die CHO-Zellen (wie oben
beschrieben) mit dem SV40-angetriebenen Vektor transfiziert werden.
Es kann wie oben beschrieben eine Markierung durchgeführt werden,
um die Expression zu verifizieren. Das Kulturmedium, das das exprimierte
Poly-His-markierte FLS139, NL2 und NL3 enthält, kann dann mit einem beliebigen gewählten Verfahren,
wie z.B. mittels Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie,
konzentriert und gereinigt werden.
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Glykosylierte
Formen von NL3 wurden in der Tat in CHO-Zellen als Poly-Hismarkierte
Formen exprimiert. Nach PCR-Amplifikation wurde die NL3-DNA in einen
CHO-Expressionsvektor unter Anwendung standardmäßiger Techniken subkloniert,
die in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Abschnitt 3.16,
John Wiley and Sons (1997), beschrieben sind. CHO-Expressionsvektoren
werden so konstruiert, dass sie kompatible Restriktionsstellen 5' und 3' der DNA von Interesse
aufweisen, um das geeignete Shuttling von cDNAs zu ermöglichen.
Der zur Expression von NL3 in CHO-Zellen verwendete Vektor entspricht
dem in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24, 9, 1774–1779 (1996),
beschriebenen und verwendet den frühen SV40-Promotor/Enhancer, um die Expression
der cDNA von Interesse und von Dihydrofolatreductase (DHFR) anzutreiben. DHFR-Expression
ermöglicht
die Selektion auf stabile Erhaltung des Plasmids nach Transfektion.
-
Zwölf Mikrogramm
für NL3
kodierende Plasmid-DNA wurden in ungefähr 10 Millionen CHO-Zellen
unter Verwendung der im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien
Superfect® (Quiagen),
Dosper® oder
Fugene® (Böhringer-Mannheim)
eingeführt.
Die Zellen wurden wie in Lucas et al., s.o., beschrieben gezüchtet. Ungefähr 3 × 10–7 Zellen
wurden für
weiteres Wachstum und Produktion wie unten beschrieben in einer
Ampulle eingefroren.
-
Die
NL3-Plasmid-DNA enthaltende Ampulle wurde aufgetaut, indem sie in
ein Wasserbad gestellt und mittels Vortexen gemischt wurde. Der
Inhalt wurde in ein Zentrifugenröhrchen
pipettiert, das 10 ml Medium enthielt, und bei 1.000 U/min für 5 Minuten
zentrifugiert. Der Überstand
wurde abgesaugt, und die Zellen wurden in 10 ml Selektivmedium resuspendiert
(0,2-μm-filtriertes
PS20 mit 5 % 0,2-μm-diafiltriertem
Fötalrinderserum). Die
Zellen wurden dann in einen 90 ml Selektivmedium enthaltenden 100-ml-Spinner
aliquotiert. Nach 1–2
Tagen wurden die Zellen in einen mit 150 ml Selektivwachstumsmedium
befüllten
250-ml-Spinner überführt und bei
37 °C inkubiert.
Nach weiteren 2–3
Tagen wurden jeweils ein 250-ml-, 500-ml- und 2.000-ml-Spinner mit 3 × 105 Zellen/ml beimpft. Das Medium wurde durch
Zentrifugation und Resuspension in Produktionsmedium gegen frisches
Medium ausgetauscht. Es kann jegliches geeignete CHO-Medium eingesetzt
werden, wie es z.B. im am 16. Juni 1992 erteilten US-Patent Nr.
5.122.469 beschrieben ist. Ein 3-Liter-Produktionsspinner wird mit 1,2 × 106 Zellen/ml beimpft. Am Tag 0 wurden Zellzahl
und pH ermittelt. Am Tag 1 wurden dem Spinner Proben entnommen und
die Begasung mit filtrierter Luft begonnen. Am Tag 2 wurden dem
Spinner Proben entnommen, die Temperatur auf 33 °C geändert und 20 ml einer Lösung aus
500 g/l Glucose und 0,6 ml 10 %iger Antischaum (z.B. 35 % Polydimethylsiloxan-Emulsion,
Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion) zugegeben. Über die
gesamte Produktion hinweg wurde der pH gegebenenfalls eingestellt,
um ihn um 7,2 zu halten. Nach 10 Tagen oder wenn die Lebensfähigkeit
unter 70 % gesunken war, wurde die Zellkultur mittels Zentrifugation geerntet
und durch ein 0,22-μm-Filter
filtriert. Das Filtrat wurde bei 4 °C bis zum Aufgeben auf eine
Reinigungssäule
gelagert.
-
Die
Poly-His-markierten Formen wurden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule (Quiagen)
gereinigt. Vor der Reinigung wurde dem konditionierten Medium Imidazol
auf eine Konzentration von 5 mM zugegeben. Das konditionierte Medium
wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4–5 ml/min bei 4 °C auf eine Ni-NTA-Säule von
5 ml gepumpt, die in 0,3 M NaCl und 5 mM Imidazol enthaltendem 20
mM Hepes-Puffer
(pH 7,4) äquilibriert
war. Nach der Beladung wurde die Säule mit zusätzlichem Äquilibrierungspuffer gewaschen und
das Protein mit 0,25 M Imidazol enthaltendem Äquilibrierungspuffer eluiert.
Das gereinigte Protein wurde anschließend mit einer 25-ml-G25-Superfine-Säule (Pharmacia)
in einen 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl und 4 % Mannit bei pH 6,8 enthaltenden
Lagerungspuffer entsalzt und bei –80 °C gelagert.
-
Die
Homogenität
des gereinigten Proteins wurde mittels SDS-PAGE bestätigt und
die N-terminale Aminosäuresequenzierung
mittels Edman-Abbau durchgeführt.
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Beispiel 5
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Expression von NL3 in
Hefe
-
Zuerst
werden Hefe-Expressionsvektoren für intrazelluläre Produktion
oder Sekretion von NL3 aus dem ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert.
Für NL3,
ein gewähltes
Signalpeptid und den Promotor kodierende DNA wird in geeignete Restriktionsenzymstellen
im gewählten
Plasmid insertiert, um die intrazelluläre Expression von NL3 zu steuern.
Zur Sekretion kann für
NL3 kodierende DNA zusammen mit DNA in das gewählte Plasmid kloniert werden,
die für
den ADH2/GAPDH-Promotor, die Hefe-Alphafaktor-Sekretionssignal/Leader-Sequenz
und Linkersequenzen (falls benötigt)
zur Expression von NL3 kodiert.
-
Hefezellen,
wie z.B. Hefestamm AB110, können
dann mit den oben beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert
und in gewählten
Fermentationsmedien kultiviert werden. Die transformierten Hefeüberstände können mittels
Präzipitation
mit 10 % Trichloressigsäure
und Trennung mittels SDS-PAGE, gefolgt von Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Farbstoff
analysiert werden.
-
Rekombinantes
NL3 kann anschließend
isoliert und gereinigt werden, indem die Hefezellen aus dem Fermentationsmedium
mittels Zentrifugation entfernt werden und das Medium dann unter
Verwendung gewählter
Kartuschenfilter konzentriert wird. Das NL3 enthaltende Konzentrat
kann unter Verwendung gewählter Säulenchromatographieharze
weiter gereinigt werden.
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Beispiel 6
-
Expression von NL3 in
Baculovirus-transfizierten Insektenzellen
-
Das
folgende Verfahren beschreibt die rekombinante Expression von NL3
in Baculovirus-transfizierten Insektenzellen.
-
Das
NL3 wird stromauf eines im Baculovirus-Expressionsvektor enthaltenen
Epitopmarkers fusioniert. Derartige Epitopmarker umfassen Poly-His-Marker
und Immunglobulin-Marker (wie z.B. Fc-Regionen von IgG). Es kann
eine Vielzahl von Plasmiden eingesetzt werden, einschließlich Plasmide,
die sich von im Handel erhältlichen
Plasmiden, wie z.B. pVL1393 (Novagen), herleiten. Zusammenfassend
wird NL3 oder der gewünschte
Abschnitt des NL3 (wie z.B. die für die extrazelluläre Domäne eines
Transmembranproteins kodierende Sequenz) mittels PCR mit Primern
amplifiziert, die zu den 5'-
und 3'-Regionen
komplementär
sind. Der 5'-Primer
kann flankierende (gewählte)
Restriktionsenzymstellen enthalten. Das Produkt wird dann mit diesen gewählten Restriktionsenzymen
verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
-
Rekombinantes
Baculovirus wird durch Cotransfizieren des obigen Plasmids und BaculoGoldTM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda-(„Sf9"-) Zellen (ATCC CRL
1711) unter Verwendung von Lipofectin (im Handel von GIBCO-BRL erhältlich)
erzeugt. Nach 4–5
Tagen Inkubation bei 28 °C
werden die freigesetzten Viren geerntet und für weitere Amplifikationen verwendet.
Virusinfektion und Proteinexpression werden wie von O'Reilley et al., Baculovirus
expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, Oxford
(1994), beschrieben durchgeführt.
-
Exprimiertes
Poly-His-markiertes NL3 kann dann beispielsweise mittels Ni2+-Chelat-Aftinitätschromatographie
wie folgt gereinigt werden: Es werden Extrakte aus rekombinanten,
virusinfizierten Sf9-Zellen wie von Rupert et al., Nature 362, 175–179 (1993),
beschrieben hergestellt. Zusammenfassend werden Sf9-Zellen gewaschen,
in Beschallungspuffer (25 mM Hepes, pH 7,9; 12,5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA; 10 % Glycerin; 0,1 % NP-40;
0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal für 20 Sekunden auf Eis beschallt.
Die beschallten Proben werden mittels Zentrifugation geklärt und der Überstand
wird 50fach in Beladungspuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10
% Glycerin, pH 7,8) verdünnt
und durch ein 0,45-μm-Filter
filtriert. Eine Ni2+-NTA-Agarosesäule (im Handel von Qiagen erhältlich)
wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser
gewaschen und mit 25 ml Beladungspuffer äquilibriert. Der filtrierte
Zellextrakt wird bei 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird
auf A280-Basislinie mit Beladungspuffer
gewaschen, wobei zu diesem Zeitpunkt die Fraktionensammlung gestartet
wird. Als Nächstes
wird die Säule
mit einem zweiten Waschpuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10 %
Glycerin, pH 6,0) gewaschen, was unspezifisch gebundenes Protein
entfernt. Nach erneutem Erreichen der A280-Basislinie
wird die Säule
mit einem Gradienten von 0 bis 500 mM Imidazol im zweiten Waschpuffer
entwickelt. Es werden Einmilliliterfraktionen gesammelt und mittels
SDS-PAGE und Silberfärbung
oder Western-Blot an Alkalische Phosphatase konjugiertem mit Ni2+-NTA (Qiagen) analysiert. Fraktionen, die
eluiertes, His10-markiertes NL3 enthalten,
werden vereinigt und gegen Beladungspuffer dialysiert.
-
Alternativ
dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten)
FLS139, NL2 und NL3 unter Anwendung bekannter chromatographischer
Techniken, einschließlich
beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
-
Beispiel 7
-
Herstellung von Antikörpern, die
NL3 binden
-
Dieses
Beispiel illustriert die Herstellung monoklonaler Antikörper, die
spezifisch NL3 binden können.
-
Techniken
zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind auf dem Gebiet der
Erfindung bekannt und sind beispielsweise in Goding, s.o., beschrieben.
Immunogene, die eingesetzt werden können, umfassen gereinigte Ligandenhomologe
der vorliegenden Erfindung, derartige Ligandenhomologe enthaltende
Fusionsproteine und Zellen, die rekombinante Ligandenhomologe an
der Zelloberfläche
exprimieren. Die Wahl des Immunogens kann vom geübten Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren
vorgenommen werden.
-
Mäuse, wie
z.B. Balb/c, werden mit dem in komplettem Freundschem Adjuvans emulgierten
Immunogen immunisiert und subkutan oder intraperitoneal in einer
Menge von 1–100
Mikrogramm injiziert. Alternativ dazu wird das Immunogen in MPL-TDM-Adjuvans (Ribi Immunochemicals
Research, Hamilton, MT) emulgiert und in die Hinterpfoten des Tiers
injiziert. Die immunisierten Mäuse
werden dann 10 bis 12 Tage später
mit zusätzlichem,
im gewählten
Adjuvans emulgiertem Immunogen geboostet. Danach können die
Mäuse außerdem für mehrere
Wochen mit zusätzlichen
Immunisierungsinjektionen geboostet werden. Serumproben können aus
den Mäusen
durch retroorbitale Blutung zum Testen in ELISA-Tests periodisch
erlangt werden, um die Antikörper
nachzuweisen.
-
Nachdem
ein geeigneter Antikörpertiter
nachgewiesen worden ist, können
die für
Antikörper „positiven" Tiere mit einer
letzten intravenösen
Injektion des gegebenen Liganden injiziert werden. Drei bis vier
Tage später
werden die Mäuse
getötet
und die Milzzellen gewonnen. Die Milzzellen werden dann mit einer
gewählten
Maus-Myelomzelllinie,
wie z.B. P3X63AgU.1, die von ATCC, Nr. CRL 1597, erhältlich ist,
fusioniert (unter Verwendung von 35 % Polyethylenglykol). Die Fusionen
erzeugen Hybridomzellen, die dann in 96-Well-Gewebekulturplatten
ausplattiert werden können,
die HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) enthalten,
um die Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelomhybriden
und Milzzellhybriden zu hemmen.
-
Die
Hybridomzellen werden in einem ELISA auf Reaktivität gegen
das Antigen gescreent. Die Ermittlung „positiver" Hybridomzellen, die die gewünschten
monoklonalen Antikörper
gegen die TIE-Liganden-Homologe hierin sekretieren, ist auf dem
Gebiet der Erfindung wohlbekannt.
-
Die
positiven Hybridomzellen können
intraperitoneal in syngenetische Balb/c-Mäuse injiziert werden, um Aszites
zu produzieren, die die monoklonalen Anti-TIE-Liganden-Antikörper enthalten.
Alternativ dazu können
die Hybridomzellen in Gewebekulturflaschen oder Rollerflaschen gezüchtet werden.
Die Reinigung der in den Aszites produzierten monoklonalen Antikörper kann
unter Verwendung von Ammonsulfatpräzipitation, gefolgt von Gelausschlusschromatographie
erzielt werden. Alternativ dazu kann die Affinitätschromatographie auf Basis
der Bindung von Antikörper
an Protein A oder Protein G eingesetzt werden.
-
Beispiel 8
-
Induktion
von Endothelzellenapoptose
-
Die
Fähigkeit
von NL3, Apoptose in Endothelzellen zu induzieren, wurde bei menschlichen
Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC, Cell Systems) unter Verwendung
eines 96-Well-Formats in mit 100 ng/ml VEGF ergänztem 0 %-Serummedium getestet.
(Da sich HUVEC-Zellen leicht von der Plattenoberfläche loslösen, müssen alle
Pipettierschritte so vorsichtig wie möglich durchgeführt werden.)
-
Das
Medium wurde abgesaugt und die Zellen einmal mit PBS gewaschen.
5 ml 1 × Trypsin
wurden zu den Zellen in einer T-175-Flasche zugegeben und die Zellen
stehen gelassen, bis sie von der Platte freigesetzt wurden (etwa
5–10 Minuten).
Die Trypsinisierung wurde durch Zugabe von 5 ml Wachstumsmedium
gestoppt. Die Zellen wurden bei 1.000 U/min 5 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert.
Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen wurden in 10 ml Medium
mit 10 % Serum komplementiertem Medium (Cell Systems), 1 × penn/strep resuspendiert.
-
Die
Zellen wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten (Amersham Life Science,
Cytostar-T-Szintillationsmikroplatte,
RPNQ160, steril, gewebekulturbehandelt, einzeln verpackt) in 10
% Serum (CSG-Medium, Cell Systems) in einer Dichte von 2 × 104 Zellen pro Well in einem Gesamtvolumen
von 100 μl
ausplattiert. Die NL5- und NL8-Polypeptide wurden in dreifacher
Ausführung
bei Verdünnungen
von 1 %, 0,33 % und 0,11 % zugesetzt. Wells ohne Zellen wurden als
Leerwert und Wells nur mit Zellen als Negativkontrolle verwendet.
Als Positivkontrollen wurden 1:3-Reihenverdünnungen von 50 μl einer 3x-Stammlösung von
Staurosporin verwendet. Die Fähigkeit
des NL5-Polypeptids,
Apoptose zu induzieren, wurde unter Verwendung von Annexin V, einem Element
der Calcium- und Phospholipid-Bindungsproteine, zum Nachweis von
Apoptose bestimmt.
-
0,2
ml Annexin-V-Biotin-Stammlösung
(100 μg/ml)
wurden in 4,6 ml 2 × Ga2+-Bindungspuffer
und 2,5 % BSA verdünnt
(1:25-Verdünnng).
50 μl der
verdünnten
Annexin-V-Biotin-Lösung
wurden jedem Well (außer den
Kontrollen) auf eine Endkonzentration von 1,0 μg/ml zugegeben. Die Proben wurden
10–15
Minuten lang mit Annexin-Biotin vor der direkten Zugabe von 35S-Streptavidin inkubiert. 35S-Streptavidin wurde
in 2 × Ca2+-Bindungspuffer, 2,5 % BSA verdünnt und
zu allen Wells in einer Endkonzentration von 3 × 104 cpm/Well zugegeben.
Die Platten wurden dann versiegelt, bei 1.000 U/min 15 Minuten lang
zentrifugiert und 2 Stunden lang auf einen Kreisschüttler gegeben.
Die Analyse wurde an einem "1450
Microbeta Trilux" (Wallac)
durchgeführt.
-
NL3
war in diesem Test positiv. Dieses Ergebnis bestätigt zusätzlich den potenziellen Nutzen
dieser und möglicher
verwandter Moleküle
in der Krebstherapie.
-
Materialhinterlegung
-
Wie
bereits zuvor erwähnt,
wurden die die folgenden Materialien bei der American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt:
-
Diese
Hinterlegung wurde unter den Vorschriften des Budapester Vertrages über die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester
Vertrag) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur
der Hinterlegung für
30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATCC
unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt
und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC,
was die ständige
und uneingeschränkte
Verfügbarkeit
der Nachkommenschaft der Kultur der Hinterlegung für die Öffentlichkeit
bei Erteilung des entsprechenden US-Patents oder bei Offenlegung
jeglicher US- oder ausländischen
Patentanmeldung gewährleistet,
was auch immer zuerst eintrifft, und die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft
für jemanden
vom US-Bevollmächtigten
für Patente
und Marken bestimmten gewährleistet,
der dazu gemäß 35 USC §122 und
den dazugehörigen
Regeln des Bevollmächtigten (einschließlich 37
CFR § 1.14
mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) ermächtigt ist.
-
Der
Abtretungsempfänger
der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Materialien,
falls eine Kultur der hinterlegten Materialien bei Kultivierung
unter geeigneten Bedingungen abstirbt, verloren geht oder zerstört werden
sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch andere derselben
ersetzt werden. Die Verfügbarkeit
der hinterlegten Materialien ist nicht als Erlaubnis auszulegen,
die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen
Regierung gemäß ihrer
Patentrechte gewährten
Rechte praktisch umzusetzen.
-
Die
vorliegende Patentschrift wird als ausreichend erachtet, einem Fachkundigen
auf dem Gebiet der Erfindung zu ermöglichen, die Erfindung in die
Praxis umzusetzen. Die vorliegende Erfindung wird durch das hinterlegte
Konstrukt in seinen Ansprüchen
nicht eingeschränkt,
da die hinterlegte Ausführungsform
als einzelne Illustration gewisser Aspekte der Erfindung gedacht
ist und jegliche funktionell gleichwertigen Konstrukte im Schutzumfang
der Erfindung liegen. Die Hinterlegung von Material hierin stellt
kein Zugeständnis
dar, dass die niedergeschriebene Beschreibung unzulänglich ist,
um die praktische Umsetzung irgendeines Aspekts der Erfindung, einschließlich der
besten Ausführungsart
davon, zu ermöglichen,
noch ist sie dahingehend auszulegen, dass sie den Schutzumfang der
Ansprüche
auf die speziellen Illustrationen einschränkt, die sie verkörpert. In
der Tat werden verschiedene Modifizierungen der Erfindung zusätzlich zu
jenen, die hierin dargestellt und beschrieben sind, dem Fachkundigen
auf dem Gebiet der Erfindung aus der vorhergehenden Beschreibung
offensichtlich und liegen im Schutzumfang der beigefügten Ansprüche. SEQUENZPROTOKOLL
![Figure 00840001](https://patentimages.storage.googleapis.com/ce/dc/fe/fcca28980a3bc4/00840001.png)
![Figure 00850001](https://patentimages.storage.googleapis.com/86/29/b2/d9eac5c51a13b5/00850001.png)
![Figure 00860001](https://patentimages.storage.googleapis.com/a5/60/74/fbf069dda32f5e/00860001.png)
![Figure 00870001](https://patentimages.storage.googleapis.com/34/78/46/5517494115f711/00870001.png)
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![Figure 00890001](https://patentimages.storage.googleapis.com/8d/e2/b6/a07a4e9564f85b/00890001.png)
![Figure 00900001](https://patentimages.storage.googleapis.com/6c/40/49/8f692f99776ba2/00900001.png)
![Figure 00910001](https://patentimages.storage.googleapis.com/1e/3b/a4/2b96ec5b8836ff/00910001.png)
![Figure 00920001](https://patentimages.storage.googleapis.com/ee/ec/cf/9d6dfd0eed4b6d/00920001.png)
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SEQUENZPROTOKOLL