DE69826649T2

DE69826649T2 - Mit der zellteilungsfurche assoziierte tyrosinphosphorylierte proteine (pstpips)

Info

Publication number: DE69826649T2
Application number: DE69826649T
Authority: DE
Inventors: A. Laurence LASKY; J. Donald DOWBENKO
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2018-01-31
Also published as: DE69826649D1; EP0980426B1; IL130953A; ATE278016T1; ZA98651B; CA2277983A1; EP0980426A1; CA2277983C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine, die mit Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ wechselwirken und durch diese dephosphoryliert werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung PSTPIP-Polypeptide, die mit dem Protein-Tyrosin-Phosphataseenzym PTP-HSCF wechselwirken und die mit der Polymerisation von Actinmonomeren assoziiert sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von Tyrosinresten in eukaryotischen Proteinen äußerst wichtige Funktionen bei der Regulierung zahlreicher eukaryotischer zellulärer Vorgänge übernimmt (Fantl et al., Annu. Rev. Biochem. 62, 453–481 (1993), und Hunter, 1001 Protein Kinases Redux Toward 2000 5, 367–376 (1994)). Während zahlreiche Informationen hinsichtlich der Funktionen der Proteintyrosinkinasen gesammelt wurden, ist hinsichtlich der physiologischen Rolle von Protein-Tyrosin-Phosphatasen (PTP) viel weniger bekannt, die die Enzyme sind, welche Phosphat aus Tyrosinresten in Proteinen entfernen. Während etwa 50 PTP bisher bereits beschrieben wurden, beginnt man erst, die Funktionen von nur wenigen zu verstehen (Tonks, Semin. Cell Biol. 4, 373–453 (1993), und Dixon, Recent Prog. Horm. Res. 51, 405–414 (1996)). Im Allgemeinen scheint es jedoch, dass die Aufgabe zahlreicher PTP die Modulation der positiven oder negativen Signale, die von unterschiedlichen Proteintyrosinkinasen induziert werden, ist. Daher ist es wahrscheinlich, dass PTP eine entscheidende Rolle in zahlreichen und unterschiedlichen zellulären Vorgängen spielen.
Die PEST-Familie von PTP ist eine Gruppe von Phosphataseenzymen. Die vier bekannten Beispiele dieser Enzyme, PTP-PEST [Yang et al., J. Biol. Chem. 268(23), 17.650 (1993)], PTP-PEP [Matthews et al., Mol. Cell. Biol. 12(5), 2.396–2.405 (1992)], PTP-HSCF [Cheng et al. Blood 88(4), 1.156–1.167 (1996); USSN 08/620.526, eingereicht am 22. März 1996]; auch als PTP-K1 bekannt [Huang et al., Oncogene 13, 1.567–1.573 (1996)], PTP20 [Aoki et al., J. Biol. Chem. 271(46), 29.422–29.426 (1996)] oder FLP1 [Dosil et al., Blood 88(12), 4.510–4.525 (1996)] und PTP-BDP1 (Kim et al., Oncogene 13, 2.275–2.279 (1996)], enthalten alle eine N-terminale Phosphatasedomäne, auf die eine Region mit variabler Größe, die reich an Prolin-, Serin- und Threoninresten ist, folgt, die jedoch keine eindeutige Homologie zu anderen Proteinen aufweist. Die PEST-Familie von PTP enthält auch eine hoch konservierte, 20 Aminosäuren lange, an Prolinen reiche Region am C-Terminus der Proteine, von denen angenommen wird, dass sie in Protein-Protein-Wechselwirkungen eingebunden sind. Hinsichtlich der Zelltypexpression wird PTP-PEST allgegenwärtig exprimiert (Yang et al. (1993), s.o.), PTP-PEP wird in Lymphoidzellen exprimiert (Matthews et al. (1992), s.o.), PTP-HSCF wird in hämopoetischen Stamm/Vorläufer-Zellen und dem fötalem Thymus (Cheng et al. (1996), s.o., und Dosil et al. (1996), s.o.) sowie in einer Teilmenge erwachsener Gewebe, umfassend Knochenmark (Huang et al. (1996), s.o.), exprimiert, und PTP-BDP1 wird in geringen Konzentrationen im Hirn sowie in anderen erwachsenen Geweben exprimiert (Kim et al. (1996), s.o.).
Einsicht in die physiologischen Funktionen von PEST-PTP kann durch eine Untersuchung der Proteine, die mit diesen Enzymen wechselwirken, eine Untersuchung der Auswirkungen von Überexpression der Proteine bei zellulärer Differenzierung und der möglichen Regulationsmodi der Moleküle gewonnen werden. Die Transfektion dominanter negativer Formen von PTP-PEST in COS-Zellen resultiert in einem endogenen, hyperphosphorylierten Protein, das als p130^CAS identifiziert wurde, ein zytoplasmatisches Molekül vom Docking/Adaptor-Typ, das eine SH3-Domäne sowie mehrere potentielle Tyrosin-phosphorylierte SH2-Bindungsstellen enthält (Garton et al., Mol. Cell. Biol. 16(11), 6.408–6.418 (1996)). Die Funktion von p130^CAS ist nicht vollständig bekannt, doch es scheint, dass es mit fokalen Adhäsionen assoziiert ist und durch das p125^FAK- (Petch et al., J. Cell. Sci 108, 1.371–1.379 (1995)) und RAFTK- (Astier et al., J. Biol. Chem. 272(1), 228–232 (1997)) Tyrosinkinasen phosphoryliert ist, was darauf schließen lässt, dass es bei Integrin-vermittelter Signaltransduktion eine Rolle spielen kann. Da dominante nega tive PTP-PEST Dephosphorylierung von p130^CAS hemmt, ist es wahrscheinlich, dass dieses Phosphoprotein ein Substrat für dieses PTP ist.
Interessanterweise wurde erst kürzlich auch gezeigt, dass die PTB-Domäne des zytoplasmatischen Adaptorproteins SHC mit einer nicht-phosphorylierten PTB-verwandten Bindungsstelle in der C-terminalen Region PTP-PEST wechselwirkt (Charest et al., J. Biol. Chem. 271(14), 8.424–8.429 (1996)). Darüber hinaus zeigten jüngste Daten, dass Csk, eine zytoplasmatische Tyrosinkinase, die Kinasen der Src-Familie durch Phosphorylierung ihrer C-terminalen Hemmtyrosine deaktiviert, mit dem PEP-PTP über eine Wechselwirkung zwischen der Csk-SH3-Domäne und einer der vier an Prolin reichen, potentiellen SH3-Bindungsstellen in der C-terminalen Region des Enzyms assoziiert (Cloutier et al., EMBO J. 15(18), 4.909–4.918 (1996)). Zusammen lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass die biologischen Aktivitäten von PTP-PEST und PTP-PEP (sowie auch möglicherweise anderer PEST-PTP) über die Wechselwirkung mit maßgeblichen zytoplasmatischen Signalproteinen, die in die Informationsübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren eingebunden sind, vermittelt werden.
Es wird nun jedoch angenommen, dass PSTPIP-Proteine, die sich an Elemente der Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ binden und durch diese dephosphoryliert werden, hiervor noch nicht offenbart wurden. Daher ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, PSTPIP-Polypeptide bereitzustellen, die sich an Elemente der Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ binden und durch diese dephosphoryliert werden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Nucleinsäure bereitzustellen, die für die PSTPIP-Polypeptide kodieren, sodass diese Polypeptide mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden können.
Diese und weitere Ziele werden durchschnittlichen Fachleuten nach Lektüre der gesamten Spezifikation verständlich sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Ziele werden in einem Aspekt durch Bereitstellen isolierter PSTPIP-Polypeptide, ausgewählt aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe, erreicht:

(i) einem Polypeptid, das die in 1A gezeigte Aminosäuresequenz des PSTPIP-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 1) umfasst; und
(ii) einem Polypeptid mit zumindest 65% Sequenzhomologie mit der PSTPIP-Aminosäuresequenz aus 1A (Seq.-ID Nr. 1);

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Antagonisten der zuvor beschriebenen PSTPIP-Polypeptide bereit.
In wiederum anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäuresequenzen, die für die zuvor beschriebenen PSTPIP-Polypeptide kodieren, Vektoren, die diese Nucleinsäuresequenzen umfassen, die operabel mit Kontrollsequenzen verbunden sind, die von mit diesen Vektoren transformierten Wirtszellen erkannt werden, und Wirtszellen, die die zuvor beschriebenen Nucleinsäuresequenzen umfassen, bereit.
In wiederum anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die in der Lage sind, sich an die zuvor beschriebenen PSTPIP-Polypeptide und Hybridomzelllinien zu binden, die solche Antikörper produzieren. In einer Ausführungsform sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der zuvor beschriebenen PSTPIP-Polypeptide bereit, die das Transformieren einer Wirtszelle mit für das Polypeptid kodierender Nucleinsäure, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur umfasst.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induktion der Polymerisation von Actinmonomeren in einer eukaryotischen Zelle bereit, umfassend das Einführen des zuvor beschriebenen PSTPIP-Polypeptides in die Zelle.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Test zur Identifikation von Antagonisten und Agonisten der zuvor beschriebenen PSTPIP-Polypeptide bereit, umfassend das Kontaktieren des PSTPIP-Polypeptids mit einem vermutlichen Antagonisten oder Agonisten und das Überwachen der Fähigkeit des Polypeptids, die Polymerisation von Actinmonomeren zu induzieren.
In wiederum einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Test zur Identifikation eines Polypeptids, das in der Lage ist, mit einem PST-Phosphatasewechselwirkenden Protein (PSTPIP) wechselzuwirken, umfassend

(a) das Exprimieren von Nucleinsäuremolekülen, die für ein Polypeptid kodieren, das eine Fusion einer nativen PSTPIP-Sequenz oder eines Fragments davon mit einer DNA-bindenden Domäne eines Transkriptionsaktivators und eine Fusion eines vermutlichen Polypeptids mit der Aktivierungsdomäne eines Transkriptionsaktivators in einer einzelnen Wirtszelle, die ein Reportergen trägt, umfasst, und
(b) das Überwachen der Assoziierung des vermutlichen Polypeptids mit der nativen PSTPIP-Sequenz oder einem Fragment davon mittels Detektion eines Signals des von obigem Reportergen kodierten Moleküls.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiters einen Test zur Identifikation von Peptiden, die in der Lage sind, die Wechselwirkung eines nativen PST-Phosphatase-wechselwirkenden Proteins (PSTPIP) und einer hämopoetischen nativen Protein-Tyrosin- Phosphatase-Stammzellenfraktion (PTP-HSCF) zu hemmen, umfassend das Kontaktieren dieses PSTPIP und einer PTP-HSCF oder Fragmenten davon mit einem vermutlichen Peptid und die Detektion der Fähigkeit des PTPPIP und der PTP-HSCF oder Fragmente davon, miteinander wechselzuwirken.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1A–1C. Proteinsequenzen und mutmaßliche Domänenstrukturen von PSTPIP. A. Dargestellt wird ein Vergleich der Proteinsequenzen von Mäuse-PSTPIP (PSTPIP) (Seq.-ID Nr. 1) und S. pombe cdc 15 (cdc 15) (Seq.-ID. Nr. 26). Die Sternchen bezeichnen die konservierten Tyrosinreste und das "+" zeigt die konservierte potentielle SH3-Bindungsstelle. Die vorausgesagten Doppelwendel- und die SH3-Domänen sind überstrichen. B. Sequenzvergleiche der SH3-Domänen von PSTPIP (pstpip.sh3) (Seq.-ID Nr. 3) und mehrerer unterschiedlicher Proteine, von denen bekannt ist, dass sie mit dem Zytoskelett, umfassend die schwere Myosinkette (myosin.sh3) (Seq.-ID Nr. 4), Spectrin (spectrin.sh3) (Seq.-ID Nr. 5), Fodrin (fodrin.sh3) (Seq.-ID Nr. 5), hämopoetisches spezifisches Protein 1 (hsp.sh3) (Seq.-ID Nr. 6) und Cortactin (cortactin.sh3) (Seq.-ID Nr. 7), wechselwirken. C. Domänenstruktur von PSTPIP und cdc15p. Dargestellt werden die vorausgesagten Doppelwendel-Regionen, die Regionen enthalten, die reich an basischen und sauren Resten (+-+) sind, die konservierten Tyrosinreste (*), die konservierten potentiellen SH3-Bindungsstellen (✝) und die konservierten SH3-Domänen. Auch gezeigt wird die große Region im S.-pombe-Protein, die prognostizierte PEST-Abbausignale enthält und im Säugetier-Homolog fehlt.
Die 2A–2B. Northern-Blot-Analyse der Expression von PSTPIP-Transkript. A. Expression von PSTPIP und Actin in Herz (Bahn a), Hirn (Bahn b), Milz (Bahn c), Lunge (Bahn d), Leber (Bahn e), Muskel (Bahn f), Niere (Bahn g) und Hoden (Bahn h). B. Expression von PSTPIP und Actin in 7 Tage alten Mäuseembryonen (Bahn a), 11 Tage alten Mäuseembryonen (Bahn b), 15 Tage alten Mäuseembryonen (Bahn c) und 17 Tage alten Mäuseembryonen (Bahn d).
3. Wechselwirkung zwischen PTP-HSCF und GST-PSTPIP. Gezeigt werden Niederschläge von in-vitro-transkribierter und -translatierter PTP-HSCF-Phosphatase mit GAST-p85 (Bahn a), GST allein (Bahn b), GST-Src (Bahn c), GST-Grb-2 (Bahn d), GST-PSTPIP (Bahn e), GST-Abl (Bahn f), GST-PLC (Bahn g), polyklonaler Anti-PTP-HSCF-Antikörper (Bahn h) und GST-Spectrin (Bahn i).
Die 4A–4D. Abbildung der PSTPIP-Wechselwirkungsstelle an PTP-HSCF. A. Gezeigt werden PTP-HSCF-Konstrukte, die C-terminale Volllängen-Homologie (CTH) und PST-reiche Domänendeletionen enthalten, die zur In-vitro-Transkription und -Translation eingesetzt werden. B. Ausfällung von in-vitro-transkribierten und -translatierten Formen von PTP-HSCF mit polyklonalen GST-PSTPIP- oder Anti-PTP-HSCF-Antikörpern. Die Bahnen sind wie folgt zugeordnet: Volllängen-PTP-HSCF mit Anti-PTP-HSCF (Bahn a), Volllängen-PTP-HSCF mit BST-PSTPIP (Bahn b), PST-reiches + CTH-deletiertes PTP-HSCF mit Anti-PTP-HSCF (Bahn c), PST-reiches-CTH-deletiertes PTP-HSCF mit GST-PSTPIP (Bahn d), PST-reiches-CTH-deletiertes PTP-HSCF mit GST-Spectrin (Bahn e), CTH-deletiertes PTP-HSCF mit GST-Spectrin (Bahn f), CTH-deletiertes PTP-HSCF mit GST-PSTPIP (Bahn g), CTH-deletiertes PTP-HSCF mit Anti-PTP-HSCF (Bahn h), Volllängen PTP-HSCF mit Anti-PTP-HSCF (Bahn i). C. Ausfällung von in-vitro-transkribiertem und -translatiertem PSTPIP mit polyklonalem Anti-PSTPIP-Antikörper (Bahn a), 10 μg von GST-PST-reichem + CTH-PTP-HSCF (ein GST-Konstrukt, das die PST-reichen und CTH-Domänen der Phosphatase enthält) (Bahn b), 5 μg von GST-PST-reichem + CTH-PTP-HSCF (Bahn c), 2 μm von GST-PST-reichem + CTH-PTP-HSCF (Bahn d) oder 1 μg von GST-PST-reichem-CTH-PTP-HSCF (Bahn e). D. Ausfällung von in-vitro-transkribierten und -translatierten PSTPIP mit GEST-PST-reichem + CTH-PTP-HSCF in Gegenwart von steigenden Mengen an Prolin-reichen Peptiden, abgeleitet von den C-terminalen Homologieregionen von PTP-HSCF, -PEST und -PEP, oder an einem Prolin-reichen Kontrollpeptid von PTP-HSCF.
Die 5A–5B. Abbildung der PTP-HSCF-Wechselwirkungsstelle an PSTPIP. A. Gezeigt werden GST-Fusionen, die die Volllängen-, Doppelwendel- und SH3- Domänen von PSTPIP enthalten. B. Ausfällung von Volllängen-PTP-HSCF mit GST-Volllängen-PSTPIP (Bahn a), Anti-Hämagglutinin (gegen eine Hämagglutinin-Epitopenmarkierung am N-Terminus der PTP-HSCF gerichtet) (Bahn b), GST-Grb2 (Bahn c), GST-Spectrin (Bahn d), GST-Volllängen-PSTPIP (Bahn e), GST-SH3-PSTPIP (Bahn f) und GST-Doppelwendel-PSTPIP (Bahn g).
Die 6A–6F. In-vivo-Tyrosin-Phosphorylierung von PSTPIP. A. Dargestellt ist die Immunfällung von endogenem PSTPIP aus Baf3-Zellen mit polyklonalem Anti-PSTPIP-Antikörper in Gegenwart und Abwesenheit des PTP-Inhibitors Pervanadat. Ausfällungen wurden entweder mit Anti-PSTPIP- (αPSTPIP-) oder Anti-Phosphotyrosin- (αPTyr-) Antikörpern geblottet. Es gilt anzumerken, dass das Protein in Abwesenheit von Pervanadat diffuser ist und einen geringeren Phosphotyrosin-Gehalt als das Protein in Gegenwart des Inhibitors aufweist. B. Gezeigt werden Immunfällungen, die durch die angegebenen Antikörper an transfizierten Zellen, wie dargestellt, durchgeführt werden. C. Immunfällung von PSTPIP mit Anti-FLAG-Antikörpern (α-FLAG), die gegen ein C-terminales PSTPIP-FLAG-Epitop gerichtet sind, und Blotten mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (α-P-Tyr). D. Immunfällung von PSTPIP mit Anti-FLAG-Antikörper (α-FLAG) und Blotten mit Anti-FLAG (α-FLAG). Die Abwesenheit sichtbaren Proteins in den Bahnen, die das Tyrosin-phosphorylierte PSTPIP enthalten, kann auf die Phosphorylierung des Tyrosins im FLAG-Epitop zurückzuführen sein. Die Proteine sind jedoch im Anti-Phosphotyrosin-Blot gut sichtbar. E. Immunfällung von PTP-HSCF mit Anti-HA-Antikörper (α-HA), die gegen ein N-terminales Hämagglutinin-Epitop gerichtet sind, und Blotten mit demselben Antikörper. F. Gezeigt werden Copräzipitations-Experimente, die demonstrieren, dass Fällen von PSTPIP (Anti-FLAG-markiert) PTP-HSCF (Anti-HA-markiert) und Fällen von PTP-HSCF (Anti-HA-markiert) PSTPIP (Anti-FLAG-markiert) ergibt.
7. Lokalisierung von endogenem PSTPIP in 3T3-Zellen. Gezeigt werden konfokale Bilder von zwei verschiedenen Gruppen von 3T3-Zellen bei verschiedenen Brennebenen, die mit Anti-PSTPIP-Antikörper (Cy3) und Phalloidin-FITC gefärbt sind (Tafeln a–d). Co-Lokalisierungsstellen erscheinen gelb und sind das kortikale Actin (cortical actin, c.a.), Lamellipodien (lam.) und die Spannungsfasern (s.f.). Tafeln e–g zeigen eine geringere Vergrößerungs- und zwei größere Vergrößerungsansichten von Interphasezellen und Zellen, die Zytokinese erfahren, angefärbt mit denselben Reagenzien. Die Interphasezellen weisen eine Co-Lokalisierung v.a. in der kortikalen Actin- (c.a.-) Region in dieser Brennebene auf, während die Zellen, die Zytokinese erfahren, Co-Lokalisierung v.a. an der Teilungsfurche (cleavage furrow, c.f.), die in beiden Brennebenen dargestellt sind, aufweisen. Die Balken zeigen die Größen in μm.
8. Expression von PSTPIP in transfizierten 3T3-Zellen. Tafel a zeigt eine Gruppe von 3T3-Zellen, die mit einem Expressionsplasmid transfiziert sind, das eine C-terminale FLAG-Version von PSTPIP unter der Kontrolle des Zytomegalie-Virus-Promotors enthält. Zellen werden mit Anti-FLAG (Cy3) und Phalloidin-FITC gefärbt. PSTPIP co-lokalisiert mit Actin in der kortikalen Region (c.a.), den Spannungsfasern (s.f.) und Lamellipodien (lam.). Die Tafeln b und c stellen zwei Zellen mit abnormaler Morphologie dar, die PSTPIP exprimieren. Es gilt anzumerken, dass diese Filopodien-Strukturen länger als 100 μm sind. Tafel c stellt auch dar, dass diese Zellen eine unterschiedliche Morphologie gegenüber normal ausgestreckten 3T3-Zellen aufweisen.
9. N-Terminale Trunkierungen resultieren in einem Verlust von PST-PIP-Bindung an PTP-HSCF. Volllängen-PST-PIP (Spencer et al., J. Cell. Biol. 138(4), 845–860 (1997)) und Formen, die keine 25- (delta 25-), 50- (delta 50-) und 75- (delta 75-) Aminosäuren ausgehend vom N-Terminus aufwiesen, wurden in vitro transkribiert und translatiert. Die obere Tafel stellt Immunfällung der Proteine mit einem gegen ein C-terminales PST-PIP-FLAG-Epitop gerichteten Antikörper dar. Die untere Tafel stellt dieselben Proteine dar, die mit einem GST-Fusionsprotein ausgefällt wurden, das die 149 C-terminalen Aminosäuren von PTP-HSCF enthält (Cheng et al., Oncogene 13, 2.275–2.279 (1996)), einschließlich der C-terminalen Prolin-reichen Bindungsstelle.
10. Konfokale Laser-Scan-Mikroskopie verschiedener Formen von PST-PIP, exprimiert in Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen). CHO-Zellen wurden mit Plasmiden, die unterschiedliche Formen von PST-PIP exprimieren, transfiziert, und die Zellen wurden in weiterer Folge mit einem Rhodamin-konjugierten, monoklonalen Antikörper gefärbt, der gegen ein C-terminates PST-PIP-FLAG-Epitop gerichtet war. Zellen wurden mit FITC-konjugiertem Phalloidin gegengefärbt, um F-Actin aufzuhellen. A. Wildtyp- (Volllängen-) PST-PIP, B. PST-PIP ohne die 25 N-terminalen Aminosäuren, C. PST-PIP ohne die 50 N-terminalen Aminosäuren, D. PST-PIP ohne die 75 N-terminalen Aminosäuren, E. PST-PIP mit einer Alaninersatzmutation bei Tryptophan 232.
11. W₂₃₂A in PST-PIP unterbindet die PTP-HSCF-Wechselwirkung in vitro. Wildtyp und Mutanten-Formen von PST-PIP wurden in vitro transkribiert und translatiert. Die obere Tafel stellt Immunfällung der Proteine mit einem Antikörper dar, der gegen ein C-terminates PST-PIP-FLAG-Epitop gerichtet ist. Die untere Tafel zeigt dieselben Proteine, die mit einem GST-Fusionsprotein ausgefällt werden, das die 149 C-terminalen Aminosäuren von PTP-HSCF enthält, einschließlich der C-terminalen Prolin-reichen Bindungsstelle. Die W₂₃₂A-Mutation unterbindet die Wechselwirkung zwischen PST-PIP und PTP-HSCF, während die anderen Mutationen, die aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu jenen, die in WW-Typ-Domänen (Chen et al., J. Biol. Chem. 272(27), 17.070–17.077 (1997) gefunden wurden, ausgewählt wurden, nur geringe Auswirkung auf die Bindungseigenschaften zeigen.
12. In-vivo-Analyse von Wechselwirkungen der W₂₃₂A-Mutante von PST-PIP mit Wildtypformen und dominanten negativen ("Substrat-fangenden") Formen von PTP-HSCF. COS-Zelltransfektionen wurden mit Plasmiden durchgeführt, die für die an der Fig. oben angegebenen Proteine kodieren. Zelllysate wurden mit Anti-FLAG-Antikörper (spezifisch für PST-PIP) oder Anti-HA-Antikörper (spezifisch für PTP-HSCF) immungefällt. Die resultierenden Präzipitate wurden an SDS-Polyacrylamidgelen gelöst und mit Anti-FLAG-Antikörper (um PST-PIP nachzuweisen), Anti-HA-Antikörper (um PTP-HSCF nachzuweisen) und Anti-pY (Anti-Phosphotyrosin-Anti körper) sondiert, um diesen modifizierten Rest an diesen Proteinen nachzuweisen. Es gilt anzumerken, dass die W₂₃₂A-Mutante von PST-PIP weder mit PTP-HSCF mitgefällt noch durch die dominante negative (C-S)-Form von PTP-HSCF "substratgefangen" wird (wie durch Hyperphosphorylierung bestimmt), während die Wildtypform des Proteins (PST-PIP wt) in einem Komplex mit ausgefälltem PTP-HSCF gefunden und durch dominante negative (C-S)-PTP-HSCF hyperphosphoryliert ("substratgefangen") wird (Jia et al., Science 268(5.218), 1.754–1.758 (1995); Garton et al., Mol. Cell. Biol. 16(11), 6.408–6.418 (1996); Flint et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(5), 1.680–1.685 (1997); Spencer et al. (1997), s.o.).
13. Alanin-Scan-Mutagenese von C-terminal abgeleitetem PTP-HSCF-Peptid. Vom C-Terminus von PTP-HSCF abgeleitete Peptide mit Alaninen an jeder der angegebenen Positionen wurden auf ihre Fähigkeit analysiert, die Wechselwirkung zwischen in-vitro-transkribierten und -translatierten PST-PIP und dem GST-PTP-HSCF-Fusionsprotein zu hemmen. Das Hemmen der Wechselwirkung führt zu einem Bindungsverlust zur GST-Fusion und zu einem fehlenden Signal am Gel, während Peptide mit niedrigerer Hemmaktivität kaum kompetitiv sind und Bindung ermöglichen. Auch dargestellt ist die Sequenz dieser C-terminalen Region im Peptid, die für diese Analyse eingesetzt wurde, PTP-HSCF (Cheng et al. (1996), s.o.) sowie PTP-PEST (Garton und Tonks, EMBO J. 13(16), 3.763–3.771 (1994)) und PTP-PEP (Matthews et al. (1992), s.o.).
14. In-vitro- und In-vivo-Analyse von Mutationen des C-Terminus von PTP-HSCF. A/1. PTP-HSCF-Konstrukte, die Alaninsubstitutionen an den angegebenen Positionen aufweisen, wurden in vitro transkribiert und translatiert, und die resultierenden mutierten Proteine wurden entweder mit 1 (oberste Tafel) oder mit 10 (zweite Tafel) μg/ml GST-PTP-PIP ausgefällt. Die dritte Tafel zeigt Immunfällungen der in-vitro-transkribierten und -translatierten PTP-HSCF-Mutanten mit einem monoklonalen Antikörper, der gegen eine N-terminale HA-Markierung gerichtet war, um sicherzustellen, dass all die Mutanten produziert wurden. Mehrfache Banden, die mit dem GST-PST-PIP-Fusionsprotein ausgefällt wurden, sind augenscheinlich C- terminale proteolysierte Produkte des PTP. Auch gezeigt werden GST-PST-PIP-Fällungen (10 μg/ml), die an einer doppelten Mutante von PTP-HSCF (R + W) durchgeführt wurden, wobei die beide Resten R₄₄₄ und W₄₅₀ zu Alanin mutiert waren (unterste Tafel, 14 A/2). B. COS-Zellen wurden in einem 10:1-Verhältnis von Plasmiden, die für Hämagglutinin- (HA-) markierte PTP-HSCF mit den dargestellten Alaninsubstitutionen oder eine Mutante von PTP-HSCF, der die 24 C-terminalen Aminosäuren deletiert wurden (PTP-HSCF_D24), kodierten, bzw. Wildtyp-PST-PIP mit einer C-terminalen FLAG-Epitop-Markierung cotransfiziert. Transfizierte Zelllysate wurden mit monoklonalen Anti-HA-Antikörpern immungefällt, und die Präzipitate wurden mit polyklonalem Anti-PST-PIP-Antikörper geblottet, um die relativen Mengen von PST-PIP, die entweder mit Wildtyp- oder unterschiedlichen Mutantenformen von PTP-HSCF komplexiert war, nachzuweisen. Lysate wurden auch mit Anti-HA-Antikörper immungefällt und mit demselben Antikörper geblottet, um gleichmäßige Expression von PTP-HSCF sicherzustellen. Gleichmäßige Expression von PSTPIP wurde durch Immunfällungslysate mit monoklonalem Anti-FLAG-Antikörper und Blotting mit polyklonalem Anti-PST-PIP-Antikörper bestimmt. Es wird auf den völligen Verlust der Copräzipitation sowohl bei PTP-HSCF_D24 als auch PTP-HSCF_444+450-Mutanten hingewiesen.
15. W_232A-PST-PIP wird in Gegenwart von v-Src effizienter Tyrosin-phosphoryliert. Äquivalente Mengen an Plasmiden, die entweder für den Wildtyp oder die W_232A-Mutante von PST-PIP kodieren, wurden in COS-Zellen in Gegenwart von ansteigenden Mengen an einem Plasmid, das für die v-Src-Tyrosin-Kinase kodiert, transfiziert. PST-PIP wurde mit Anti-FLAG-Antikörper immungefällt und entweder mit einem polyklonalen Antikörper, der gegen PST-PIP gerichtet war (obere Tafel), oder einem Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (untere Tafel) geblottet. Densitometrische Analyse der oberen Tafel zeigte ~ 10–15% Unterschiede bei den erhaltenen Signalen zwischen der Wildtypform oder der W_232A-Mutantenform von PST-PIP, während Densitometrie der unteren Tafel, je nach der Dosis des zugesetzten v-Src-Plasmids, 2- bis 3fach höhere Konzentrationen von Phosphotyrosin in der Mutantenform des Proteins aufwies (Daten nicht dargestellt).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Definitionen
Die Ausdrücke "PSTPIP-Polypeptid", "PSTPIP", "PST-Phosphatase-wechselwirkendes Protein" und "PTP-HSCF-wechselwirkendes Protein" werden als Synonyme verwendet und beziehen sich auf ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz des PSTPIP-Polypeptids, gezeigt in 1A, (Seq.-ID Nr. 1) oder ein weiteres Säugetierhomolog davon umfasst. Die oben genannten Bezeichnungen sollen auch funktionelle Polypeptide einschließen, die durch Nucleinsäure kodiert werden, die unter stringenten Bedingungen an Nucleinsäure hybridisiert, die für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz des PSTPIP-Polypeptids, gezeigt in 1A (Seq.-ID Nr. 2), oder ein weiteres Säugetierhomolog davon sowie funktionelle Derivate jedes beliebigen der oben genannten Polypeptide umfasst.
Unter "weitere Säugetierhomologe" oder grammatikalischen Entsprechungen davon wird ein PSTPIP-Polypeptid einer Säugetierspezies außer der Spezies der Mäuse verstanden, das hinsichtlich seiner Funktionalität dem in 1A (Seq.-ID Nr. 1) gezeigten PSTPIP-Polypeptid ähnlich ist. Solche PSTPIP-Homologe können in solchen Säugetieren wie beispielsweise Menschen, Kaninchen, Ratten, Schweinen, nicht zur menschlichen Rasse gehörige Primaten, Pferden und Schafen identifiziert werden. Das Screenen von cDNA-Bibliotheken, die von diesen Säugetieren gewonnen wurden, mit einer Sonde, die von der Nucleinsäure abgeleitet ist, die für das in 1A gezeigte Mäuse-PSTPIP-Polypeptid (Seq.-ID Nr. 2) kodiert, ermöglicht die Identifikation solcher Homologe wie des menschlichen Homologs (Seq.-ID Nr. 28 u. 29).
Die Bezeichnung "natives PSTPIP-Polypeptid" in diesem Zusammenhang bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes PSTPIP-Polypeptid mit den beschriebenen Eigenschaften jeder beliebigen menschlichen oder nicht zur menschlichen Rasse gehörigen Tierspezies mit dem oder ohne das Startermethionin, unabhängig davon, ob es von der nativen Quelle gereinigt, synthetisiert, durch DNA-Rekombinationsverfahren oder durch eine Kombination dieser und/oder anderer Verfahren hergestellt wurde. Natives PSTPIP-Polypeptid umfasst spezifisch das native Mäuse-PSTPIP-Protein, gezeigt in 1A (Seq.-ID Nr. 1), und das native menschliche PST-PIP-Protein (Seq.-ID Nr. 29).
Ein "funktionelles Derivat" eines Polypeptids ist eine Verbindung, die eine mit dem nativen Polypeptid gemeinsame qualitative biologische Aktivität aufweist. So ist ein funktionelles Derivat eines nativen PSTPIP-Polypeptids eine Verbindung, die eine qualitative biologische Aktivität gemeinsam mit einem nativen PSTPIP-Polypeptid aufweist, beispielsweise ist es in der Lage, sich an ein Mitglied der Protein-Tyrosin-Phosphatase-Familie vom PEST-Typ zu binden und/oder durch ein Mitglied der Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ dephosphoryliert zu werden, wenn es zumindest einen pliosphorylierten Tyrosin-Rest aufweist und/oder mit Actin assoziiert. "Funktionelle Derivate" umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Fragmente von nativen Polypeptiden von jeder beliebigen Tierspezies (einschließlich Menschen), Derivate von nativen (menschlichen und nicht menschlichen) Polypeptiden und deren Fragmenten, Glykosylierungsvarianten eines nativen Polypeptids und Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga nativer Polypeptide, mit der Maßgabe, dass sie eine mit dem entsprechenden nativen Polypeptid gemeinsame biologische Aktivität aufweisen. "Fragmente" umfassen Regionen innerhalb der Sequenz eines reifen nativen Polypeptids. Die Bezeichnung "Derivat" wird eingesetzt, um Varianten von Aminosäuresequenzen (Insertions-, Deletions- und Substitutionsvarianten) und kovalente Modifikationen eines nativen Polypeptids zu definieren. "Nicht-Peptid-Analoga" sind organische Verbindungen, die im Wesentlichen dieselbe Oberfläche wie Peptidanaloga der nativen Polypeptide aufweisen. Somit sind die Nicht-Peptid-Analoga des nativen PSTPIP-Polypeptids der vorliegenden Erfindung organische Verbindungen, die im Wesentlichen dieselbe Oberfläche wie Peptidanaloga des nativen PSTPIP aufweisen. Solche Verbindungen wechselwirken mit anderen Molekülen auf ähnliche Weise wie die Peptidanaloga und ahmen eine biologische Aktivität eines nativen PSTPIP der vorliegenden Erfindung nach. Die funktionellen Polypeptidderivate des nativen PSTPIP der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise zumindest etwa 65%, noch bevorzugter zumindest etwa 75%, insbesondere bevorzugt zumindest etwa 85% und am meisten bevorzugt zumindest etwa 95%, gesamte Sequenzhomologie mit der in 1A (Seq.-ID Nr. 1) dargestellten PSTPIP-Aminosäuresequenz auf und behalten im Wesentlichen die Fähigkeit bei, sich an ein Mitglied der Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ zu binden.
Der Begriff der "biologische Aktivität" im Zusammenhang mit der Definition funktioneller Derivate ist definiert als der Besitz zumindest einer physiologischen Funktion, die qualitativ mit einem nativen Polypeptid gemein ist. Die funktionellen Derivate des nativen PSTPIP der vorliegenden Erfindung haben ihre qualitative Fähigkeit gemein, sich an ein Mitglied der Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ zu binden.
Als "Protein-Tyrosin-Phosphatase vom PEST-Typ" wird ein Protein-Tyrosin-Phosphatase-Enzym bezeichnet, das eine nicht-katalytische Domäne besitzt, die eine variable Region reich an Prolin-, Serin- und Threonin-Resten und ein C-terminates 20-Aminosäure-Segment umfasst, das reich an Prolin-Resten ist und zumindest eine potentielle SH3-Bindungsdomäne definiert [Pawson, Nature 373, 573–580 (1995)]. Die Protein-Tyrosin-Phosphatase-Familie vom PEST-Typ umfasst die Protein-Tyrosin-Phosphatasen PTP-PEST [Yang et al. (1993), s.o.], PTP-PEP [Matthews et al. (1992), s.o.], PTP-HSCF [Cheng et al. (1996), s.o.], auch bekannt als PTP-K1 [Huang et al. (1996), s.o.], PTP20 [Aoki et al. (1996), s.o.] oder FLP1 [Dosil et al. (1996), s.o.] und PTP-BDP1 [Kim et al. (1996), s.o.].
Die Bezeichnung "Agonist" wird verwendet, um auf Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga der nativen PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper zu verweisen, die native PSTPIP binden, mit der Maßgabe, dass sie zumindest eine biologische Aktivität eines nativen PSTPIP beibehalten. Vorzugsweise behalten die Agonisten der vorliegenden Erfindung die qualitative Fähigkeit bei, sich an ein Mitglied der Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ zu binden und/oder die Polymerisation von Actinmonomeren zu induzieren.
Die Bezeichnung "Antagonist" wird verwendet, um auf ein Molekül Bezug zu nehmen, das eine biologische Aktivität eines nativen PSTPIP-Polypeptids der vorliegenden Erfindung hemmt. Vorzugsweise hemmen die Antagonisten dadurch die Fähigkeit des PSTPIP-Polypeptids der vorliegenden Erfindung, sich an Mitglieder der Protein-Tyrosin-Phosphatase-Enzyme vom PEST-Typ zu binden. Auch wird bevorzugt, dass Antagonisten die Fähigkeit des PSTPIP-Polypeptids hemmen, die Polymerisation von Actinmonomeren zu induzieren.
Vermutliche Agonisten und Antagonisten können eine Vielzahl verschiedener Verbindungen einschließlich Peptiden, Proteinen, organischen Molekülen und dergleichen umfassen. Beispielsweise ist in dem Fachgebiet der Erfindung die Herstellung kombinatorischer Oligopeptid-Bibliotheken und das Screenen dieser Bibliotheken auf Mitglieder, die sich entweder an das PSTPIP-Polypeptid binden oder die Bindung eines PSTPIP-Polypeptids an ein Mitglied der Protein-Tyrosin-Phosphatasen vom PEST-Typ stören, bekannt.
"Identität" oder "Homologie" hinsichtlich eines nativen Polypeptids und seines funktionellen Derivats sind hierin als der Prozentsatz an Aminosäure-Resten in der vermutlichen Sequenz definiert, die mit den Resten eines entsprechenden nativen Polypeptids ident sind, nachdem die Sequenzen angeglichen und, sofern erforderlich, Lücken eingefügt wurden, um den maximalen Prozentsatz an Homologie zu erreichen, wobei keinerlei konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität betrachtet werden. Weder N- noch C-terminale Verlängerungen noch Insertionen sollten als Reduktion von Identität oder Homologie aufgefasst werden. Methoden und Computerprogramme zur Angleichung sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Üblicherweise beziehen sich die Bezeichnungen "Aminosäure" und "Aminosäuren" auf alle natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. In manchen Ausführungsformen können jedoch D-Aminosäuren in den Polypeptiden oder Peptiden der vorliegenden Erfindung vorhanden sein, um die Konformationseinschränkung zu erleichtern. Um beispielsweise die Bildung von Disulfidbindungen und deren Stabilität zu erleichtern, kann ein D-Aminosäure-Cystein an einem oder beiden Enden eines funktionellen Peptid-Derivats oder Peptidantagonisten des nativen PSTPIP-Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Die Aminosäuren werden entweder mit einem oder mit drei Buchstaben bezeichnet:
Diese Aminosäuren können gemäß der chemischen Zusammensetzung und den Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie sind weit gefasst in zwei Gruppen, in geladene und ungeladene Aminosäuren, eingeteilt. Jede dieser Gruppen wird in Untergruppen unterteilt, um die Aminosäuren genauer zu klassifizieren:
I. Geladene Aminosäuren

Saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure
Basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin

II. Ungeladene Aminosäuren

Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin
Unpolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin
Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

Die Bezeichnung "Aminosäuresequenz-Variante" bezieht sich auf Moleküle mit einigen Unterschieden in ihren Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer nativen Aminosäuresequenz.
Substitutionsvarianten sind jene, die zumindest einen Aminosäurerest in einer nativen Sequenz entfernt und eine andere Aminosäure anstelle dieses Rests an derselben Position eingefügt haben. Die Substitionen können einfach sein, wobei nur eine Aminosäure im Molekül substituiert wurde, oder sie können vielfach sein, wobei zwei oder mehr Aminosäuren in einem Molekül substituiert wurden.
Insertionsvarianten sind jene, die eine oder mehrere Aminosäuren unmittelbar neben einer Aminosäure an einer bestimmten Position in einer nativen Sequenz eingefügt haben. Unmittelbar neben einer Aminosäure bedeutet, dass die Aminosäure entweder mit der α-Carboxyl- oder α-Amino-funktionellen Gruppe der Aminosäure verbunden ist.
Deletionsvarianten sind jene, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren in der nativen Aminosäuresequenz entfernt wurden. Üblicherweise sind bei Deletionsvarianten eine oder zwei Aminosäuren in einer bestimmten Region des Moleküls deletiert.
"Antikörper (Ab)" und "Immunglobuline (Ig)" sind Glykoproteine mit denselben strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität für ein spezifisches Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch Antikörper-ähnliche Moleküle, die keine Antigen-Spezifität aufweisen. Polypeptide der zweiten Art werden beispielsweise zu geringen Konzentrationen durch das Lymphsystem und zu höheren Konzentrationen durch Myelome produziert.
Native Antikörper und Immunglobuline sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine mit etwa 150.000 Dalton, zusammengesetzt aus zwei identen Leicht- (L-) Ketten und zwei identen Schwer-(H-)Ketten. Jede Leichtkette ist über eine kova lente Disulfidbindung an eine Schwerkette gebunden, während die Anzahl der Disulfidbindungen zwischen den Schwerketten unterschiedlicher Immunglobulin-Isotypen variiert. Jede Schwer- und Leichtkette hat auch Intra-Ketten-Disulfidbrücken in regelmäßigen Abständen. Jede Schwerkette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H) auf, der mehrere konstante Domänen folgen. Jede Leichtkette weist eine variable Domäne (V_L) an einem und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf: die konstante Domäne der Leichtkette ist mit der ersten konstanten Domäne der Schwerkette angeglichen, und die variable Domäne der Leichtkette ist mit der variablen Domäne der Schwerkette angeglichen. Insbesondere von Aminosäure-Resten wird angenommen, dass sie eine Grenzfläche zwischen den variablen Domänen der Leicht- und der Schwerkette bilden (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651–663 (1985), und Novotny und Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4.592–4.596 (1985)).
Die Bezeichnung "variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass sich bestimmte Abschnitte der variablen Domänen stark in Sequenzen unter Antikörpern unterscheiden, und werden beim Binden und der Spezifität jedes bestimmten Antikörpers für sein bestimmtes Antigen eingesetzt. Die Variabilität ist jedoch nicht gleichmäßig über die variablen Domänen der Antikörper verteilt. Sie ist in drei Segmenten, die als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) oder hypervariable Regionen bezeichnet werden, in den variablen Domänen sowohl der Leicht- als auch der Schwerkette konzentriert vorhanden. Die stärker konservierten Abschnitte variabler Domänen werden als Gerüst (FR, framework) bezeichnet. Die variablen Domänen nativer Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die durchwegs eine β-Faltblatt-Konfiguration annehmen und durch drei CDR verbunden sind, die Schleifen bilden, welche die β-Faltblatt-Struktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDR in jeder Kette werden durch die FR-Regionen sehr eng zusammengehalten und tragen, zusammen mit den CDR der anderen Kette, zur Bildung der Antigen-Bindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt in die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen eingebunden, weisen jedoch unterschiedliche Effektor-Funktionen auf, wie beispielsweise Beteiligung des Antikörpers an Antikörperabhängiger Zelltoxizität.
Papainverbau von Antikörpern produziert zwei idente Antigen-Bindungsfragmente, die Fab-Fragmente genannt werden, wobei jedes eine einzelne Antigen-Bindungsstelle aufweist, und ein Rest-"Fc"-Fragment, dessen Name seine Fähigkeit widerspiegelt, rasch zu kristallisieren. Pepsin-Behandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-Kombinationsstellen aufweist und immer noch in der Lage ist, das Antigen zu vernetzen.
"Fv" ist das minimale Antikörper-Fragment, das eine komplette Antigen-Erkennungs- und -Bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Domäne einer Schwer- und einer Leichtkette in enger, nicht kovalenter Assoziation. In dieser Konfiguration wechselwirken die drei CDR jeder variablen Domäne, um eine Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs CDR dem Antikörper Bindungsspezifität. Auch eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei für ein Antigen spezifische CDR umfasst) ist jedoch in der Lage, Antigene zu erkennen und zu binden, obwohl dies mit einer geringeren Affinität als im Falle einer vollständigen Bindungsstelle geschieht.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch den Zusatz einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der CH1-Domäne der Schwerkette, die ein oder mehrere Cysteine aus der Antikörper-Gelenkregion umfasst. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in denen der/die Cystein-Reste) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe trägt/tragen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Fab'-Fragment-Paare produziert, die Gelenkcysteine zwischen sich aufwiesen. Es sind auch andere Arten der chemischen Verbindung von Antikörperfragmenten bekannt.
Die Leichtketten von Antikörpern (Immunglobulinen) jeglicher Wirbeltierspezies können einem von zwei eindeutig unterschiedlichen Typen zugeordnet werden, die Kappa (κ) und Lambda (λ) genannt werden und auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen beruhen.
Je nach der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten werden Immunglobuline zwei verschiedenen Klassen zugeteilt. Es gibt fünf Hauptklassen für Immunglobuline: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiter in Unterklassen (Isotypen) eingeteilt werden, z.B. IgG-1, IgG-2, IgG-3 und IgG-4; IgA-1 und IgA-2. Die konstanten Domänen der Schwerketten, die den unterschiedlichen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden α, delta, epsilon, γ bzw. μ genannt. Die Untereinheitenstrukturen und dreidimensionale Konfigurationen verschiedener Klassen von Immunglobulinen sind bekannt.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinne eingesetzt und bezieht sich spezifisch auf einzelne, monoklonale Antikörper (umfassend Agonist- und Antagonist-Antikörper), Antikörperzusammensetzungen mit polyepitoper Spezifität sowie Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv), sofern sie die erwünschte biologische Aktivität aufweisen.
Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population aus im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper der Population ident sind, mit der Ausnahme, dass mögliche natürlich auftretende Mutationen in geringem Ausmaß vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper weisen eine hohe Spezifität auf und sind gegen eine einzelne Antigen-Stelle gerichtet. Weiters ist, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise unterschiedliche Antikörper einschließen, die gegen unterschiedliche Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante am Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität weisen die monoklonalen Antikörper den Vorteil auf, dass sie durch die Hybridomkulturen synthetisiert werden, und zwar unkontaminiert durch andere Immunglobuline. Das Attribut "monoklonal" beschreibt die Eigenschaft des Antikörpers, dass er von einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wird, und ist nicht so aufzufassen ist, dass die Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren notwendig wäre. Beispielsweise können monoklonale Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, durch das Hybridomverfahren, das von Kohler & Milstein (Nature, 256–495 (1975)) zum ersten Mal beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren erzeugt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567 von Cabilly et al.).
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen besonders "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Abschnitt der Schwer- und/oder der Leichtkette ident mit oder homolog zu den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer bestimmten Spezies abgeleitet sind oder zu einer bestimmten Antikörper-Klasse oder -Unterklasse gehören, während der Rest der Kette(n) ident mit oder homolog zu den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer anderen Antikörper-Klasse oder -Unterklasse gehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, sofern sie die erwünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567 von Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6.851–6.855 (1984)).
"Humanisierte" Formen nicht menschlicher (z.B. Mäuse-) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die Minimalsequenzen enthalten, die von nicht menschlichen Immunglobulinen abgeleitet sind. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipientenantikörper), in denen Reste einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste einer CDR einer nicht menschlichen Spezies (Spender-Antikörper) wie von Mäusen, Ratten oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht menschliche Reste ersetzt. Weiters können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen vorhanden sind. Diese Modifikationen werden durchgeführt, um die Antikörperleistung weiterhin zu verbessern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alles von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensus-Sequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im besten Fall auch zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise eines menschlichen Immunglobulins. Für weitere Details siehe: Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); EP-B-239.400 , veröffentlicht am 30. September 1987; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992); und EP-B-451.216 , veröffentlicht am 24. Jänner 1996.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" als Synonyme eingesetzt, und alle solche Bezeichnungen umfassen Nachkommenschaft. Es versteht sich auch, dass jegliche Nachkommenschaft hinsichtlich des DNA-Gehalts aufgrund von beabsichtigten oder unbeabsichtigten Modifikationen nicht genau ident sein kann. Mutierte Nachkommenschaft, die dieselbe Funktion oder biologische Eigenschaft aufweist, wie sie für die ursprünglich transformierte Zelle nachgewiesen wurde, ist eingeschlossen.
Die Bezeichnungen "replizierbarer Expressionsvektor" und "Expressionsvektor" beziehen sich auf einen Teil von üblicherweise doppelsträngiger DNA, der in sich einen Teil fremder DNA aufgenommen haben kann. Fremde DNA ist als heterologe DNA definiert, die in der Wirtszelle nicht natürlich vorkommt. Der Vektor wird eingesetzt, um die fremde oder heterologe DNA in eine geeignete Wirtszelle zu transportieren. Befindet er sich erst einmal in der Wirtszelle, so kann sich der Vektor unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA replizieren, wodurch einige Kopien des Vektors und seine eingefügte (fremde) DNA erzeugt werden können. Weiters enthält der Vektor die notwendigen Elemente, die das Translatieren der fremden DNA in ein Polypeptid ermöglichen. Viele Moleküle des durch die fremde DNA kodierten Polypeptids können so rasch synthetisiert werden.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen Kodierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten geeignet sind, umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosom-Bindungsstelle und möglicherweise andere Sequenzen, von denen bis heute nicht allzu viel bekannt ist. Eukaryotische Zellen sind dafür bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Verstärker einsetzen.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader ist operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn es als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Verstärker ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn sie die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosom-Bindungsstelle ist operabel an eine Kodierungssequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Falle eines Sekretionsleaders, zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Verstärker müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Bindung erfolgt über Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Sind solche Stellen nicht vorhanden, so werden synthetische Oligonucleotid-Adaptoren oder -Linker gemäß der herkömmlichen Praxis eingesetzt.
"Immunoadhäsine" oder "PSTPIP-Immunglobulin-Chimären" sind chimäre, Antikörperähnliche Moleküle, die die funktionelle(n) Domäne(n) eines Bindungsproteins (üblicherweise ein Rezeptor, ein Zelladhäsions-Molekül oder ein Ligand) mit einer Immunglobulinsequenz kombinieren. Das häufigste Beispiel dieses Fusionsprotein- Typs kombiniert die Gelenks- und Fc-Regionen eines Immunglobulins (Ig) mit Domänen eines Proteins, das einen spezifischen Liganden erkennt und sich an ihn bindet. Dieser Molekültyp wird als "Immunoadhäsin" bezeichnet, da er "Immun-" und "Adhäsions" Funktionen kombiniert; andere häufig eingesetzt Namen sind "Ig-Chimäre", "Ig-" oder "Fc-Fusionsprotein" oder "Rezeptor-Globulin".
"Oligonucleotide" sind einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide von kurzer Länge, die mittels bekannter Verfahren, wie z.B. Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramiditchemie, unter Einsatz von Festphasenverfahren, wie sie in dem am 4. Mai 1988 veröffentlichten EP 266.032 beschrieben werden, oder über Desoxynucleosid-H-Phosphonat-Zwischenprodukte, wie sie von Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5.399 (1986), beschrieben werden, chemisch synthetisiert werden. Anschließend werden sie auf Polyacrylamidgelen gereinigt.
Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter "stringenten Bedingungen", was bedeutet, dass (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperaturen zum Waschen eingesetzt werden, beispielsweise 0,015 Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 Natriumdodecylsulfat bei 50°C, oder dass (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel wie Formamid eingesetzt wird, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 nM Natriumphosphatpuffer bei einem pH von 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C. Ein anderes Beispiel ist der Einsatz von 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6/8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C, wobei Waschschritte bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS erfolgen. Wiederum ein anderes Beispiel ist Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers aus 10% Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem Waschschritt unter hochstringenten Bedingungen mit 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55°C.
"Transformation" bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration, sodass die DNA replikabel ist. Je nach der eingesetzten Wirtszelle erfolgt die Transformation unter Einsatz von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Einsatz von Calciumchlorid, wie sie von Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2.110 (1972), und Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 154 (1970), beschrieben wird, wird im Allgemeinen für prokaryotische Zellen und andere Zellen, die wesentliche Zellwandbarrieren aufweisen, verwendet. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte bezüglich Transformationen von Säugetierzellwirtssystemen wurden von Axel im US-Patent Nr. 4.399.216, ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3.829 (1979), durchgeführt. Andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, wie beispielsweise durch Kerninjektion, Elektroporation oder durch Protoplastenfusion, können jedoch auch eingesetzt werden.
"Gewinnung" und "Isolation" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsverdau bedeutet das Trennen des Verdaus an Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, die Identifikation des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität gegenüber den Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, das Entfernen des Gelabschnitts, der das erwünschte Fragment enthält, und das Trennen des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist im Allgemeinen bekannt. Siehe beispielsweise Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6.103–6.114 (1981), und Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4.057 (1980).
"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren zur Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (Maniatis et al. (1982), s.o.). Sofern nicht anders vorgegeben, kann die Ligation unter Einsatz bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten von T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 mg von etwa äquimolaren Mengen der DNA-Fragmente, die es zu ligieren gilt, durchgeführt werden.
"Herstellung" von DNA von Transformanten bedeutet das Isolieren von Plasmid-DNA aus mikrobiellen Kulturen. Sofern nicht anders vorgegeben, kann das Alkali/SDS-Verfahren nach Maniatis et al. (1982), s.o., eingesetzt werden.
B. Herstellung von PSTPIP-Polypeptiden durch DNA-Rekombinationsverfahren
1. Identifikation und Isolation von für PSTPIP kodierender Nucleinsäure
Nucleinsäuren, die für die nativen PSTPIP-Proteine der vorliegenden Erfindung kodieren, können von cDNA oder genomischen Bibliotheken isoliert werden. Eine geeignete cDNA-Bibliothek kann beispielsweise durch Erhalten polyadenylierter mRNA aus Zellen, die dafür bekannt sind, das erwünschte PSTPIP-Protein zu exprimieren (z.B. Baf3, erhältlich über die American Type Culture Collection) und durch Verwendung der mRNA als eine Matrize, um doppelsträngige cDNA zu synthetisieren, konstruiert werden. mRNA, die für das native PSTPIP der vorliegenden Erfindung kodiert, wird beispielsweise in Geweben exprimiert, die von erwachsener Lunge und Milz sowie von sehr jungen 7-Tage-Mäuseembryonen abgeleitet werden. Das Gen, das für das neue PSTPIP-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, kann auch aus einer genomischen Bibliothek, wie einer menschlichen Genom-Cosmid-Bibliothek oder einer von Mäusen abgeleiteten Embryonenzell-(ES-)Genom-Bibliothek, erhalten werden.
Bibliotheken, entweder cDNA- oder genomische Bibliotheken, werden mit Sonden gescreent, die dafür bestimmt sind, das betreffende Gen oder das von dem Gen kodierte Protein zu identifizieren. Für cDNA-Expressionsbibliotheken umfassen geeignete Sonden monoklonale und polyklonale Antikörper, die ein PSTPIP-Polypeptid erkennen und spezifisch an dieses Polypeptid binden. Für cDNA-Bibliotheken umfassen geeignete Sonden sorgfältig ausgewählte Oligonucleotidsonden (üblicher weise mit einer Länge von 20–80 Basen), die für bekannte oder mutmaßliche Abschnitte eines PSTPIP-Polypeptids derselben oder unterschiedlicher Spezies kodieren, und/oder komplementäre oder homologe cDNA oder Fragmente davon, die für dasselbe oder ein ähnliches Gen kodieren. Geeignete Sonden zum Screenen genomischer DNA-Bibliotheken umfassen ohne Einschränkung Oligonucleotide, cDNA oder Fragmente davon, die für dasselbe oder ein ähnliches Gen kodieren, und/oder homologe genomische DNA oder Fragmente davon. Das Screenen der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann mittels Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie in den Kapiteln 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), beschrieben sind.
Wird DNA, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, unter Einsatz sorgfältig ausgewählter Oligonucleotidsequenzen isoliert, um cDNA-Bibliotheken von verschiedenen Geweben zu screenen, so sollten die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend verwechslungsfrei sein, dass falsche Positive minimiert werden können. Die tatsächliche(n) Nucleotidsequenz(en) ist/sind üblicherweise auf Regionen basierend geschaffen, die die geringste Codonredundanz aufweisen. Die Oligonucleotide können an einer oder mehreren Positionen degeneriert sein. Die Verwendung degenerierter Oligonucleotide ist von besonderer Bedeutung, wenn eine Bibliothek einer Spezies gescreent wird, in der bevorzugter Codon-Einsatz nicht bekannt ist.
Das Oligonucleotid muss so markiert sein, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren ist der Einsatz von ATP (z.B. γ³²P) und Polynucleotid-Kinase, um das 5'-Ende des Oligonucleotids radioaktiv zu markieren. Es können jedoch auch andere Verfahren eingesetzt werden, um das Oligonucleotid zu markieren, umfassend Biotinylierung oder Enzymmarkierung, jedoch nicht darauf beschränkt.
cDNA, die für PSTPIP-Polypeptide kodieren, können auch mittels anderer bekannter Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie identifiziert und isoliert werden, beispielsweise durch direkte Expressionsklonierung oder unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), wie im US-Patent Nr. 4.683.195, ausgegeben am 28. Juli 1987, in Abschnitt 14 von Sambrook et al., s.o., oder in Kapitel 15 aus Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1991), beschrieben wird.
Wurde die für ein PSTPIP-Polypeptid kodierende cDNA einer Spezies erst einmal isoliert, können auch cDNA von anderen Spezies durch Spezies-kreuzende Hybridisierung erhalten werden. Gemäß diesem Ansatz werden menschliche oder andere Säugetier-cDNA- oder genomische Bibliotheken mittels markierter Oligonucleotid-Sequenzen sondiert, die aus bekannten PSTPIP-Sequenzen (wie Mäuse-PSTPIP) unter Berücksichtigung bekannter Kriterien ausgewählt werden, u.a. dass die Sequenz ausreichend lange und verwechslungsfrei sein sollte, sodass falsche Positive minimiert werden. Typischerweise ist ein ³²P-markiertes Oligonucleotid mit etwa 30 bis 50 Basen ausreichend, insbesondere wenn das Oligonucleotid ein oder mehrere Codons für Methionin oder Tryptophan enthält. Isolierte Nucleinsäure ist DNA, die identifiziert und von Kontaminanten-Nucleinsäure, die für andere Polypeptide der Nucleinsäurenquelle kodiert, getrennt ist. Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter zuvor definierten "stringenten Bedingungen".
Ist die Sequenz einmal bekannt, kann das für ein bestimmtes PSTPIP-Polypeptid kodierendes Gen auch mittels chemischer Synthese nach einem der Verfahren erhalten werden, die in Engels und Uhlmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989), beschrieben sind. Diese Verfahren umfassen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren, PCR und andere Autoprimer-Verfahren sowie Oligonucleotid-Synthesen auf festen Trägern.
2. Klonieren und Exprimieren von für PSTPIP kodierender Nucleinsäure
Ist die für PSTPIP kodierende Nucleinsäure einmal erhältlich, wird sie im Allgemeinen in einen replizierbaren Expressionsvektor für weiters Klonieren (Amplifizieren der DNA) oder zur Expression ligiert.
Expressions- und Klonierungsvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und enthaften eine Nucleinsäuresequenz, die den Vektor in die Lage versetzt, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Die Auswahl des geeigneten Vektors hängt 1) davon ab, ob er für DNA-Amplifikation oder DNA-Expression eingesetzt wird, hängt 2) von der Größe der DNA ab, die in den Vektor eingeführt werden soll, und 3) von der Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert werden soll, ab. Jeder Vektor enthält je nach seiner Funktion (Amplifikation oder Expression von DNA) und je nach Wirtszelle, mit der er kompatibel ist, verschiedene Komponenten. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen eine oder mehr der folgenden Komponenten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markierungsgene, ein Verstärkerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Zum Aufbau geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der zuvor genannten Komponenten, die erwünschten Kodierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, werden Standardligationsverfahren eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der erwünschten Form wieder ligiert, um das erforderliche Plasmid zu erzeugen. Zur Analyse, um korrekte Sequenzen in konstruierten Plasmiden zu bestätigen, werden die Ligationsgemische üblicherweise eingesetzt, um E.-coli-Zellen, z.B. E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz, wo geeignet, ausgewählt. Plasmide der Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonuclease-Verdau analysiert und/oder durch das von Messing et al., Nucleic Acid Res. 9, 309 (1981), oder durch das von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), beschriebene Verfahren sequenziert.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer Vielzahl prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen exprimiert sein. Geeignete Prokaryoten umfassen gram-negative oder gram-positive Organismen, beispielsweise E. coli oder Bacilli. Ein bevorzugter Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), wobei andere gram-negative oder gram-positive Prokaryoten wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325), Pseudomonas-Spezies oder Serratia Marcesans auch geeignet sind.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie Fadenpilze oder Hefe geeignete Wirte für hierin erläuterte Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder herkömmliche Bäckerhefe ist der üblichste unter niedrigen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Dennoch sind zahlreiche andere Genera, Spezies und Stämme üblicherweise erhältlich und hierin nützlich, wie z.B. S. pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981)); Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)); Yarrowia ( EP 402.226 ), Pichia pastoris ( EP 183.070 ), Trichoderma reesia ( EP 244.234 ), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5.259–5.263 (1979)) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 1.470–1.474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen können auch von multizellulären Organismen abgeleitet sein. Solche Wirtszellen sind zum komplexen Processing und zu komplexen Glykosylierungsaktivitäten in der Lage. Im Prinzip kann mit jeglicher höheren eukaryotischen Zellkultur gearbeitet werden, unabhängig davon, ob sie von Vertebraten- oder Invertebratenkulturen abstammen, wobei Zellen von Säugetieren wie Menschen bevorzugt sind. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und -Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie Wirtszellen von Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori wurden identifiziert. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow, J. K., et al. (Hrsg.), Bd. 8 (Plenum Publishing (1986)), 277–279; und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Eine Vielzahl solcher viralen Stämme sind öffentlich erhältlich, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV, und solche Viren können als das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, eingesetzt werden.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffeln, Sojabohnen, Petunien, Tomaten und Tabak können als Wirtszellen eingesetzt werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, die davor manipuliert wurde, um die PSTPIP-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für ein PSTPIP-Polypeptid kodierende DNA auf den Pflanzenzellwirt übertragen, sodass er transfiziert ist, und exprimiert unter geeigneten Bedingungen die PSTPIP-DNA. Zusätzlich dazu sind Regulator- und Signalsequenzen, die mit den Pflanzenzellen kompatibel sind, wie z.B. der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenlyierungs-Signalsequenzen, erhältlich. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Weiters sind DNA-Segmente, die von der Stromauf-Region des T-DNA-780-Gens isoliert sind, in der Lage, Transkriptionsniveaus von Pflanzen-exprimierbaren Genen in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu erhöhen. Siehe EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Das größte Interesse bestand jedoch an Wirbeltierzellen, und die Fortpflanzung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist an sich gut bekannt. Siehe Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson Hrsg. (1973). Beispiele für zweckdienliche Säugetier-Wirtszelllinien sind: Affenniere-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1.651); menschliche Embryonalnierenzelllinie (293 oder 293-Zellen in Suspensionskultur zum Wachstum subkloniert (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977))), Baby-Hamsternierenzellen 9BHK (ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR [CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4,216 (1980)]; Mäuse-Sertolizellen [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)]; Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1.587); Zellen des menschlichen Zervix-Karzinoms (HELA, ATCC CCL 2), Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1.442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8.065); Mäusebrusttumor (MMT 060.562, ATCC CCL51); TRI-Zellen [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44.068 (1982)]; MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatom-Zelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind menschliche Embryonalniere-293-Zellen und Chinahamster-Eierstockzellen.
Besonders nützlich in der praktischen Umsetzung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression in Säugetierzellen von für ein PSTPIP-Polypeptid kodierender DNA sorgen. Im Allgemeinen involviert vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, sich in Wirtszellen effizient zu vermehren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors sammelt und dadurch hohe Konzentrationen an erwünschtem Polypeptid, das durch den Expressionsvektor kodiert ist, synthetisiert. Vorübergehende Systeme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen einfache positive Identifikation von Polypeptiden, die durch klonierte DNA kodiert sind, sowie rasches Screenen solcher Polypeptide auf erwünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. So sind vorübergehende Expressionssysteme für den Zweck des Identifizierens von Analoga und Varianten eines PSTPIP-Polypeptids im Rahmen dieser Erfindung besonders nützlich.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die für die Adaptation an die Synthese der PSTPIP-Polypeptide in rekombinanten Wirbeltierzellkulturen geeignet sind, werden in Getting et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantel et al., Nature 281, 40–46 (1979); Levinson et al., EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben. Besonders nützliche Plasmide für Säugetierzellkulturexpression der PSTPIP-Polypeptide sind pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91108.291).
Andere Klonierungs- und Expressionsvektoren, die für die Expression der PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl an Wirtszellen geeignet sind, werden beispielsweise in der EP 457.758 , veröffentlicht am 27. November 1991, beschrieben. Eine große Auswahl an Expressionsvektoren sind heutzutage im Handel erhältlich. Ein Beispiel für einen im Handel erhältlichen Hefe-Expressionsvektor ist pPIC.9 (Invitrogen), während ein im Handel erhältlicher Expressionsvektor, der zur Transformation von E.-coli-Zellen geeignet ist, PET15b (Novagen) ist.
C. Kultivieren der Wirtszellen.
Prokaryotische Zellen, die eingesetzt werden, um die PSTPIP-Polypeptide dieser Erfindung zu produzieren, werden in geeigneten Medien, wie sie im Allgemeinen in Sambrook et al., s.o., beschrieben sind, kultiviert.
Säugetierzellen können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1.640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) sind für das Kultivieren von Wirtszellen geeignet. Weiters kann jedes der in Ham und Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979); Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); US 4.767.704 ; 4.657.866; 4.927.762; oder 4,560.655; WO 90/03.430; WO 87/00.195 oder US-Pat. Re. 30.985 beschriebenen Medien als Nährmedium für die Wirtszellen eingesetzt werden. Jedes dieser Medien kann, sofern erforderlich, mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin^TM-Arzneimittel), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden) und Glukose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Jede andere erforderliche Ergänzung kann auch in geeigneten Konzentrationen eingebunden werden, die Fachleuten bekannt sind. Als Kultivierungsbedingungen wie Temperatur, pH und dergleichen sind jene geeignet, die zuvor je nachdem für die zum Klonieren oder Exprimieren ausgewählten Wirtszellen eingesetzt wurden und die dem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind.
Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in In-vitro-Kulturen sowie Zellen, die innerhalb eines Wirtstieres oder einer Wirtspflanze enthalten sind.
Weiters wird angenommen, dass die PSTPIP-Polypeptide dieser Erfindung durch homologe Rekombination oder mittels Rekombinationsproduktionsverfahren unter Einsatz von Kontrollelementen produziert werden, die in Zellen eingeführt werden, die bereits die für das bestimmte PSTPIP-Polypeptid kodierende DNA enthalten.
D. Nachweisen von Genamplifikation/-expression
Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5.201–5.205 (1980)], Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Einsatz einer passend markierten Sonde, beruhend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, direkt gemessen werden. Verschiedene Markierungen, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P, können eingesetzt werden. Es können jedoch auch andere Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise der Einsatz von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als eine Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die durch zahlreiche Markierungen wie Radionuklide, fluoreszierende Substanzen, Enzyme oder dergleichen markiert werden können. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Doppelstränge, umfassend DNA-Doppelstränge, RNA-Doppelstränge und DNA-RNA-Hybriddoppelstränge oder DNA-Proteindoppelstränge erkennen können. Die Antikörper können wiederum markiert werden, und der Test kann dort durchgeführt werden, wo der Doppelstrang an die Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung von Doppelsträngen auf der Oberfläche die Gegenwart von Antikörperbindung an den Doppelstrang nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie immunhistochemisches Färben von Gewebeschnitten und Tests von Zellkulturen oder Körperflüssigkeiten, gemessen werden, um die Expression vom Genprodukt direkt zu quantifizieren. Mittels immunhistochemischer Färbungsverfahren wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydrieren und Fixieren, gefolgt von einer Umsetzung mit markierten, für das gebundene Genprodukt spezifischen Antikörpern, wobei die Markierungen, wie z.B. enzymatische Markierungen, fluoreszierende Markierungen, lumineszierende Markierungen und dergleichen, üblicherweise visuell nachweisbar sind. Ein besonders empfindliches Färbungsverfahren, das zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird von Hse et al., Am. J. Clin. Pharm. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
Für immonhistochemisches Färben und/oder für das Testen von Probenflüssigkeiten nützliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem Tier hergestellt werden. Günstigerweise können die Antikörper gegen ein natives PSTPIP-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid, das auf der hierin bereitgestellten und nachstehend beschriebenen DNA-Sequenz basiert, hergestellt werden.
E. Aminosäuresequenzvarianten von nativen PSTPIP-Polypeptiden
Aminosäuresequenzvarianten von nativen PSTPIP-Polypeptiden werden mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren durch Einführen geeigneter Nucleotidveränderungen in eine PSTPIP-DNA oder durch In-vitro-Synthese des erwünschten Polypeptids hergestellt. Es gibt zwei grundlegende Variablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: die Platzierung der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation. Außer bei natürlich vorkommenden Allelen, die die Manipulation der für das PSTPIP kodierenden DNA-Sequenz nicht erfordern, werden die Aminosäuresequenzvarianten von PSTPIP-Polypeptiden vorzugsweise durch Mutation der DNA konstruiert, um entweder ein Alle) oder eine Aminosäuresequenzvariante zu erhalten, die in der Natur nicht vorkommt.
Eine Mutationsgruppe wird innerhalb der N-terminalen Doppelwendel-Region der Polypeptide der vorliegenden Erfindung geschaffen. Nicht konservative Substitutionen innerhalb dieser Region können zu PSTPIP-Varianten führen, die ihre Fähigkeit verlieren, sich an PTP-HSCF (oder jedes andere PEST-PTP) zu binden und/oder dadurch dephosphoryliert zu werden. PSTPIP-Varianten, die mutiert wurden, um ihre Fähigkeit, mit Actin zu assoziieren, zu verändern, sind beispielsweise als Induktoren für oder Inhibitoren von Zytokinese nützlich.
In der Mäuse-PSTPIP-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) ist die Doppelwendel-Domäne als eine definiert, die sich etwa von Aminosäureposition 30 bis etwa Aminosäureposition 261 erstreckt (siehe 1A). In einem weiteren Sinn jedoch kann die Doppelwendel-Domäne so betrachtet werden, dass sie am N-Terminus des PSTPIP-Proteins beginnt. Die Mutationsanalyse zeigte, dass die sechs Cysteinreste, die innerhalb dieser Region vorhanden waren, für die korrekte Faltung und das Funktionieren von PSTPIP nicht entscheidend sind. Unerwarteterweise wurde gefunden, dass der Tryptophan- (W-) Rest an Aminosäurenposition 232 der Mäuse-Sequenz für die Bindung von PTP-HSCF entscheidend ist. Mutation dieses Tryptophanrests zu Alanin führte zu einem völligen Bindungsverlust. Demgemäß muss das Tryptophan an Position 232 beibehalten werden, um biologische Aktivität beizubehalten, wobei Substitution durch andere aromatische Aminosäuren, z.B. Tyrosin und Phenylalanin, zu Varianten führen könnte, die ihre Fähigkeit, PTP-HSCF in gewissem Maße zu binden, beibehalten. Wenn Varianten, die PTP-HSCF nicht binden, andererseits erforderlich sind, sind die Tryptophanreste an Position 232 der Mäusesequenz und entsprechende Reste in den PSTPIP-Proteinen von anderen Säugetierspezies, umfassend Menschen, ein primäres Substitutionsziel.
Während der Tryptophanrest an Position 232 von Seq.-ID Nr. 1 eine maßgebliche Rolle beim Binden von PTP-HSCF spielt, sind das Tryptophan an Position 205, das Phenylalanin an Position 321 und Leucin an Position 224 nicht maßgeblich und können leicht mutiert werden.
Alternativ oder zusätzlich dazu können Aminosäureveränderungen an Stellen durchgeführt werden, die bei PSTPIP-Proteinen von unterschiedlichen Spezies oder in hochkonservierten Regionen je nach beabsichtigtem Zweck unterschiedlich sind. Stellen an solchen Orten werden typischerweise in Serie modifiziert, z.B. durch (1) zuerst Substituieren mit ausgewählten konservativen Komponenten und anschließend mit einer stärker radikalen Auswahl, je nach erhaltenem Ergebnis, (2) Deletieren des Zielrests oder der -reste oder (3) durch Einführen von Resten derselben oder einer anderen Klasse angrenzend an die ausgewählte Stelle, oder eine Kombination aus 1–3. Ein hilfreiches Verfahren wird "Alanin-Scanning" genannt (Cunningham und Wells, Science 244, 1.081–1.085 (1989)).
Natürlich vorkommende Aminosäuren werden in Gruppen eingeteilt, die auf gemeinsamen Seitenketteneigenschaften basieren:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophob: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Konservative Substitutionen umfassen das Austauschen eines Mitglieds innerhalb einer Gruppe gegen ein anderes Mitglied derselben Gruppe, wobei nicht konservative Substitutionen das Austauschen eines Mitglieds einer dieser Klassen gegen ein anderes erfordern. Wesentliche Veränderungen hinsichtlich der Funktion oder der immunologischen Identität erfolgen durch Auswählen von Substitutionen, die weniger konservativ sind, d.h. die sich stärker hinsichtlich ihrer Auswirkung auf das Aufrechterhalten (a) der Struktur einer Polypeptidhauptkette im Substitutionsbereich, beispielsweise als eine Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) auf die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) dem Volumen der Seitenketten unterscheiden. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen der Eigenschaften der neuen nativen PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung produzieren, sind jene, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, einen hydrophoben Rest, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert oder durch diesen substituiert wird; (b) ein Cystein oder Prolin einen anderen Rest substituiert oder durch diesen substituiert wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, einen elektronegativen Rest, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert oder durch diesen substituiert wird; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, einen Rest ohne Seitenkette, z.B. Glycin, substituiert oder durch diesen substituiert wird.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, bevorzugter von etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend.
Die in den Beispielen offenbarten Ergebnisse zeigen, dass der N-Terminus von PSTPIP für die Bildung eines korrekt gefalteten Proteins, das in der Lage ist, PTP-HSCF zu binden, notwendig ist. Demgemäß sollte sich jegliche N-terminale Deletion nicht über etwa die Aminosäure 25 der Mäuse-PSTPIP-Sequenz oder der entsprechenden Aminosäure in menschlichen oder anderen Säugetiersequenzen erstrecken, wenn strukturelle Integrität und biologische Aktivität beibehalten werden sollen. Die Gegenwart des C-terminalen Abschnitts der PSTPIP-Proteine ist weniger entscheidend. Die Doppelwendel-Domäne ist für angemessenes Falten des Proteins ausreichend, wie Daten belegten, die zeigen, dass Transfektion der Doppelwendel-Domäne von PSTPIP zur Co-Lokalisierung des Proteins mit dem kortikalen Actin-Zytoskelett und den Lamellipodien führen, ein Vorgang, der vermutlich ein korrekt gefaltetes Protein erfordert. Wie zuvor angemerkt und wie in 1A dargestellt ist, ist in der Mäuse-PSTPIP-Sequenz (Seq.-ID Nr. 1) die Doppelwendel-Domäne so definiert, dass sie sich etwa von Aminosäureposition 30 bis etwa Aminosäureposition 261 erstreckt. Ähnliche Domänen können in PSTPIP von Säugetierspezies, z.B. Menschen, einfach identifiziert werden.
Aminosäureinsertionen umfassen Amino- und/oder Carboxy-terminale Fusionen, die eine Länge im Bereich von einem Rest bis zu Polypeptiden mit einhundert oder mehr Resten aufweisen, sowie Intrasequenz-Insertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäureresten. Intrasequenz-Insertionen (d.h. Insertionen innerhalb der PSTPIP-Protein-Aminosäuresequenz) können im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten liegen, bevorzugter von 1 bis 5 Resten, noch bevorzugter von 1 bis 3 Resten. Beispiele für terminate Insertionen umfassen die PSTPIP-Polypeptide mit einem N-terminalen Methionylrest, ein Artefakt seiner direkten Expression in rekombinanter Bakterien-Zellkultur, und Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz mit dem N-Terminus des PSTPIP-Moleküls, um die Sekretion des reifen PSTPIP aus rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Solche Signalsequenzen werden im Allgemeinen von der erwünschten Wirtszellenspezies erhalten und sind somit dazu homolog. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. coli, Alpha-Faktor für Hefe und virale Signale wie Herpes-gD für Säugetierzellen.
Andere Insertionsvarianten der nativen PSTPIP-Moleküle umfassen die Fusion des N- oder C-Terminus des PSTPIP-Moleküls mit immunogenen Polypeptiden wie z.B. bakteriellen Polypeptiden wie Beta-Lactamase oder einem durch den E.-coli-trp-Locus kodierten Enzym oder Hefeprotein und C-terminate Fusionen mit Proteinen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, wie z.B. Immunglobulinregionen (vorzugsweise konstante Immunglobulinregionen), Albumin oder Ferritin, wie in der WO 89/02.922, veröffentlicht am 6. April 1989, beschrieben wird.
Weitere Insertionsvarianten sind immunologisch aktive Derivate der neuen PSTPIP-Polypeptide, die das PSTPIP-Polypeptid und ein Polypeptid umfassen, das ein Epitop eines immunologisch kompetenten, fremden Polypeptids enthält, d.h. ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine Immunreaktion im Tier hervorzurufen, dem die Fusion verabreicht werden soll, oder das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, der gegen ein fremdes Polypeptid gebildet wurde. Typische Beispiele für solche immunologisch kompetenten Polypeptide sind Allergene, Autoimmunepitope oder andere potente Immunogene oder Antigene, die durch bereits bestehende Antikörper im Fusionsrezipienten erkannt werden, umfassend bakterielle Polypeptide wie trpLE, β-Galactosidase, virale Polypeptide wie Herpes-gD-Protein und dergleichen.
Immunogene Fusionen werden durch In-vitro-Vernetzen oder durch rekombinante Zellkultur, die mit für ein immunogenes Polypeptid kodierender DNA transformiert wird, hergestellt. Vorzugsweise ist die immunogene Fusion eine, in der die immunogene Sequenz mit einem neuen PSTPIP-Molekül oder einem Fragment davon über (eine) Peptidbindung(en) gebunden wird oder darin eingefügt wird. Diese Produkte bestehen daher aus einer linearen Polypeptidkette, die das PSTPIP-Epitop und zumindest ein Epitop, das für das PSTPIP-Polypeptid fremd ist, enthält. Selbstverständlich umfasst der Schutzumfang der Erfindung auch das Einführen der Epitope an irgendeiner Stelle innerhalb eines PSTPIP-Moleküls der vorliegenden Erfindung oder eines Fragmentes davon. Diese immunogenen Insertionen sind besonders nützlich, wenn sie in pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanzen formuliert und einer Versuchsperson verabreicht werden, um Antikörper gegen das PSTPIP-Molekül zu bilden, die wiederum nützlich zur Diagnose, Gewebetypisierung oder Reinigung der neuen PSTPIP-Polypeptide durch an sich bekannte Immunoaffinitätsverfahren sind. Alternativ dazu werden zur Reinigung der PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung Bindungspartner für das fremde Fusionspolypeptid, z.B. Antikörper, Rezeptoren oder Liganden, eingesetzt, um die Fusion aus unreinen Beimischungen zu adsorbieren, wonach die Fusion eluiert wird und, sofern erwünscht, das neue PSTPIP aus der Fusion, z.B. durch enzymatische Spaltung, gewonnen wird.
Nachdem die erwünschte(n) Mutation(en) identifiziert wurde(n), kann das für eine PSTPIP-Variante kodierende Gen beispielsweise mittels chemischer Synthese unter Einsatz bekannter Techniken erhalten werden. Noch bevorzugter wird DNA, die für eine PSTPIP-Aminosäuresequenzvariante kodiert, durch ortsgerichtete Mutagenese der DNA, die für eine bereits vorher hergestellte Variante oder eine Nicht-Varianten-Version der PSTPIP kodiert, hergestellt. Ortsgerichtete (ortsspezifische) Mutagenese ermöglicht die Produktion von PSTPIP-Varianten über den Einsatz spezifischer Oligonucleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation kodieren, sowie ausreichender angrenzender Nucleotide, um eine Primersequenz mit ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um einen stabilen Doppelstrang an beiden Seiten der durchkreuzten Deletionsstelle zu bilden. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste an beiden Seiten der Berührungsstelle der Sequenz geändert sind. Im Allgemeinen sind die Verfahren zur ortsspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden beispielhaft in Veröffentlichungen wie Edelman et al., DNA 2, 183 (1983), dargestellt. Wie bekannt ist, wird bei dem ortsspezifischen Mutageneseverfahren typischerweise ein Phagen-Vektor eingesetzt, der sowohl in der einzelsträngigen als auch in der doppelsträngigen Form existiert. Typische Vektoren, die für ortsspezifische Mutagenese nützlich sind, umfassen Vektoren wie den M13-Phagen, beispielsweise von Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981), offenbart. Dieser und andere Phagenvektoren sind im Handel erhältlich, und deren Einsatz ist Fachleuten bekannt. Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zur Konstruktion von Oligodesoxyribonucleotid-gerichteten, ortsspezifischen Mutationen in DNA-Fragmenten mittels M13-abgeleiteten Vektoren wurde von Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10, 6.487–6.500 (1982), veröffentlicht. Auch Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)), können eingesetzt werden, um einzelsträngige DNA zu erhalten. Alternativ dazu werden Nucleotidsubstitutionen durch In-vitro-Synthetisieren des geeigneten DNA-Fragments und durch Amplifizieren dieses Fragments mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter PCR-Verfahren eingeführt.
Das PCR-Verfahren kann auch zur Schaffung von Aminosäuresequenzvarianten eines PSTPIP-Polypeptids eingesetzt werden. In einem spezifischen Beispiel von PCR-Mutagenese wird Matrizen-Plasmid-DNA (1 μg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die eine einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region aufweist. Von diesem Material werden 100 ng einem PCR-Gemisch, das PCR-Puffer enthält, der die vier Desoxynucleotidtriphosphate umfasst und in den GENEAMP^R-Sets (erhalten von Perkin-Eimer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville, CA) eingebunden ist, und 25 pmol von jedem Oligonucleotid-Primer zu einem Endvolumen von 50 μl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Die Reaktion wird 5 Minuten lang bei 100°C denaturiert und kurz auf Eis gelegt, wonach 1 μl Thermus aquaticus-(Taq-)DNA-Polymerase (5 Einheiten/μl) (erworben bei Perkin-Eimer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville, CA) unter der Mineralölschicht zugesetzt werden. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen DNA-Thermal-Cycler (gekaut bei Perkin-Eimer Cetus) eingeführt, der wie folgt programmiert ist:
2 min, 55°C
30 s, 72°C, anschließend 19 Zyklen mit den folgenden Einstellungen:
30 s, 94°C
30 s, 55°C und
30 s, 72°C.
Am Ende des Programms wird die Reaktionsphiole aus dem Thermozykler entfernt und die wässrige Phase in eine neue Phiole übertragen, mit Phenol/Chloroform (50:50 im Volumen) extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, und die DNA wird mittels Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird anschließend geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Varianten, Kassettenmutagenese, basiert auf dem von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), beschriebenen Verfahren.
Darüber hinaus kann das so genannte Phagemid-Display-Verfahren zweckdienlich zur Herstellung von Aminosäuresequenzvarianten nativer oder varianter PSTPIP-Polypeptide oder derer Fragmenten sein. Dieses Verfahren umfasst (a) das Konstruieren eines replizierbaren Expressionsvektors, der ein erstes Gen, das für einen zu mutierenden Rezeptor kodiert, ein zweites Gen, das für zumindest einen Abschnitt eines natürlichen oder Wildtyp-Phagenhüllproteins kodiert, worin erstes und zweites Gen heterolog sind, und ein Transkriptions-regulierendes Element umfasst, das mit dem ersten und zweiten Gen operabel verbunden ist, wodurch eine Genfusion gebildet wird, die für ein Fusionsprotein kodiert; (b) das Mutieren des Vektors an einem oder mehreren ausgewählten Stellen innerhalb des ersten Gens, wodurch eine Familie verwandter Plasmide gebildet wird; (c) das Transformieren geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden; (d) das Infizieren der transformierten Wirtszellen mit einem Helfer-Phagen, der ein Gen aufweist, das für das Phagenhüllprotein kodiert; (e) das Kultivieren der transformierten infizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die zur Bildung rekombinanter Phagemid-Teilchen, die zumindest einen Abschnitt des Plasmids enthalten und zur Transformation des Wirts in der Lage sind, geeignet sind, wobei die Bedingungen so eingestellt werden, dass nicht mehr als eine geringe Menge der Phagemid-Teilchen mehr als eine Kopie des Fusionsproteins an der Teilchenoberfläche aufweist; (f) das Kontaktieren der Phagemidteilchen mit einem geeigneten Antigen, sodass sich zumindest ein Teil der Phagemidteilchen an das Antigen bindet; und (g) das Trennen der Phagemidteilchen, die sich binden, von jenen, die sich nicht binden. Schritte (d) bis (g) können einmal oder mehrere Male wiederholt werden. Vorzugsweise steht bei diesem Verfahren das Plasmid unter strenger Kontrolle des Transkriptions-Regulationselements, und die Kultivierungsbedingungen sind so eingestellt, dass die Menge oder Anzahl von Phagemid-Teilchen, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins an der Teilchenoberfläche aufweisen, unter etwa 1% liegt. Auch liegt die Menge der Phagemid-Teilchen, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins aufweisen, unter 10% der Menge der Phagemid-Teilchen, die eine einzelne Kopie des Fusionsproteins aufweisen. Am meisten bevorzugt liegt die Menge unter 20%. Typischerweise enthält in diesem Verfahren der Expressionsvektor weiters eine Sekretionssignalsequenz, die mit der für jede Untereinheit des Polypeptids kodierenden DNA fusioniert ist, und das Transkriptionsregulationselement ist ein Promotorsystem. Bevorzugte Promotorsysteme werden aus lacZ-, λ_PL-, tac-, T7-Polymerase-, Tryptophan- und Alkalische-Phosphatase-Promotoren sowie Kombinationen davon ausgewählt. Auch wird bei dem Verfahren üblicherweise ein Helfer-Phage eingesetzt, der aus M13K07, M13R408, M13-VCS und Phi X 174 ausgewählt ist. Der bevorzugte Helfer-Phage ist M13K07, und das bevorzugte Hüllprotein ist das M13-Phagengen-III-Hüllprotein. Der bevorzugte Wirt ist E. coli und Protease-arme Stämme von E. coli.
Da es oft schwer ist, die Eigenschaften einer PSTPIP-Variante im Vorhinein zu bestimmen, wird verstanden werden, dass gewisses Screening erforderlich ist, um die optimale Variante auszuwählen.
Weitere Details für die zuvor beschriebenen und ähnliche Mutagenese-Verfahren können in allgemeinen Lehrbüchern gefunden werden, wie beispielsweise in Sambrook et al., s.o., und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), s.o.
F. Glykosylierungsvarianten
Glykosylierungsvarianten sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung enthalten. Sie umfassen Varianten, die überhaupt keine Glykosylierung aufweisen (unglykosylierte Varianten), Varianten, die zumindest soviel oder weniger glykosylierte Stellen als die native Form aufweisen (deglykosylierte Varianten), sowie Varianten, in denen die Glykosylierung verändert wurde. Eingebunden sind deglykosylierte und unglykosylierte Aminosäuresequenzvarianten, deglykosylierte und unglykosylierte native PSTPIP und andere Glykosylierungsvarianten. Beispielsweise kann Substitutions- oder Deletionsmutagenese eingesetzt werden, um die N- oder O-verbundenen Glykosylierungsstellen in einem nativen oder varianten PSTPIP-Molekül der vorliegenden Erfindung zu entfernen, z.B. kann der Asparaginrest deletiert werden oder durch anderen basischen Rests wie Lysin oder Histidin substituiert werden. Alternativ dazu können flankierende Reste, die die Glykosylierungsstelle bilden, substituiert oder deletiert werden, wobei die Asparaginreste unverändert bleiben, um Glykosylierung durch Entfernen der Glykosylierungs-Erkennungsstelle zu vermeiden.
Darüber hinaus können unglykosylierte PSTPIP-Polypeptide, die die Glykosylierungsstellen eines nativen Moleküls aufweisen, in rekombinanter prokaryotischer Zellkultur hergestellt werden, da Prokaryoten nicht in der Lage sind, Glykosylierung in Polypeptide einzuleiten.
Glykosylierungsvarianten können durch die Auswahl geeigneter Wirtszellen oder durch In-vitro-Verfahren hergestellt werden. Hefe- und Insektenzellen beispielsweise leiten Glykosylierung ein, die sich signifikant von jener in Säugetiersystemen unterscheidet. Dem ähnlich werden Säugetierzellen, die eine unterschiedliche Spezies (z.B. Hamster, Maus, Schwein, Rind oder Schaf) oder Gewebsursprung (z.B. Lungen-, Leber-, Lymphoid-, Mesenchym- oder Epidermisursprung) als die Quelle des PSTPIP-Polypeptids aufweisen, routinemäßig auf ihre Fähigkeit, unterschiedliche Glykosylierung einzuleiten, gescreent, wie sie beispielsweise durch erhöhte Mannosekonzentrationen oder Varianten-Verhältnisse an Mannose, Fucose, Sialinsäure und anderen Zuckern, die typischerweise in Säugetier-Glykoproteinen gefunden werden, gekennzeichnet sind. In-vitro-Verarbeitung von PSTPIP erfolgt typischerweise durch enzymatische Hydrolyse, z.B. Neuraminidase-Verdauung.
G. Kovalente Modifikationen von PSTPIP-Polypeptiden
Kovalente Modifikationen von PSTPIP-Polypeptiden sind im Schutzumfang hierin eingeschlossen. Solche Modifikationen werden üblicherweise durch Umsetzen gerichteter Aminosäuresequenzen der PSTPIP-Polypeptide mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, sich mit ausgewählten Stellen oder terminalen Resten umzusetzen, oder durch Nutzbarmachen von Mechanismen posttranslationaler Modifikationen, die in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen zu Tage treten, eingefügt. Die resultierenden kovalenten Derivate sind in Programmen nützlich, die darauf abzielen, für biologische Aktivität, für Immuntests des PSTPIP oder für die Herstellung von Anti-PSTPIP-Antikörper zur Immunoaffinitätsreinigung der Rekombinanten wichtige Reste zu identifizieren. Beispielsweise würde die völlige Inaktivierung der biologischen Aktivität des Proteins nach Umsetzung mit Ninhydrin darauf schließen lassen, dass zumindest ein Arginyl- oder Lysylrest für seine Aktivität maßgeblich ist, wonach die einzelnen Reste, die unter den ausgewählten Bedingungen modifiziert wurden, mittels Isolation eines Peptidfragments, das den modifizierten Aminosäurerest enthält, identifiziert werden. Solche Modifikationen liegen im Bereich des Gebiets der Erfindung und werden ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt.
Cysteinylreste werden normalerweise mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu ergeben.
Cysteinylreste werden auch durch Umsetzungen mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat bei einem pH von 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. para-Bromphenacylbromid ist auch zweckdienlich: die Umsetzung erfolgt vorzugsweise in 0,1 M Natriumkakodylat bei pH 6,0.
Lysinyl- und Amino-terminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-hältigen Resten umfassen Imidoester wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Umsetzung mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin zählen. Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass aufgrund des hohen pK_a der funktionellen Guanidingruppe die Umsetzung unter alkalischen Bedingungen erfolgt. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie der Arginin-Epsilon-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann erzeugt werden, und zwar mit besonderem Gewicht auf dem Einführen von Spektralmarkierungen in die Tyrosylreste durch Umsetzen mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Üblicherweise werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan eingesetzt, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Einsatz von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung bei Radioimmuntests herzustellen.
Carboxyseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid modifiziert. Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste zu Asparaginyl- und Glutaminylresten durch Umsetzung mit Ammoniumionen umgewandelt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Jede Form dieser Reste sind im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen.
Andere Modifikationen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxygruppen von Seryl-, Threonyl- oder Tyrosylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Hisitidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 [1983]), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebiger C-terminaler Carboxygruppe. Die Moleküle können weiters kovalent an nicht proteinische Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Art gebunden sein, wie sie in den US-Patenten 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 erläutert wird.
Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist nützlich zur Herstellung intramolekularer Aggregate der PSTPIP-Polypeptide mit Polypeptiden sowie zum Vernetzen des PSTPIP-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrize oder Oberfläche zum Einsatz in Tests oder bei Affinitätsreinigung. Weiters wird eine Untersuchung von Zwischenkettenvernetzungsstellen direkte Information über Konformationsstrukturen liefern. Herkömmlich eingesetzte Vernetzer umfassen 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionelle Imidoester und bifunktionelle Maleinimide. Derivatisieiungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Vernetzungsstellen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ dazu werden reaktive, wasserunlösliche Matrizen wie Cyanbromid-aktivierte Kohlenwasserstoffe und die Systeme reaktiver Substrate, wie sie in den US-Patenten Nr. 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; und 4.330.440 beschrieben sind, zur Proteinimmobilisierung und -vernetzung eingesetzt.
Bestimmte posttranslationale Modifikationen sind das Ergebnis der Wirkung rekombinanter Wirtszellen am exprimierten Polypeptid. Glutaminyl- und Aspariginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten posttranslational desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Jede Form dieser Reste ist im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen.
Andere Derivate umfassen die neuen Peptide dieser Erfindung, die kovalent an ein nicht proteinisches Polymer gebunden sind. Das nicht proteinische Polymer ist üblicherweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das sonst nicht in der Natur gefunden wird. Dennoch sind auch Polymere, die in der Natur vorkommen und durch rekombinante oder In-vitro-Verfahren produziert werden, nützlich, wie es auch Polymere sind, die aus natürlichen Quellen isoliert sind. Hydrophile Polyvinylpolymere sind im Schutzumfang dieser Erfindung eingeschlossen, z.B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders nützlich sind Polyvinylalkylenether wie Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol.
Die PSTPIP-Polypeptide können an verschiedene nicht proteinische Polymere, wie z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die Weise gebunden sein, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 erläutert wird.
Die PSTPIP-Polypeptide können in Mikrokapseln eingeschlossen sein, die beispielsweise durch Koazervationsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation in kolloidalen, Arzneimittel freisetzenden Systemen (z.B. Liposome, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen hergestellt werden. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, Oslo, A. (Hrsg.), offenbart.
Weitere Derivate der PSTPIP-Polypeptide hierin sind die so genannten "Immunoadhäsine". Bis heute wurden auf dem Gebiet der Erfindung mehr als fünfzig Immunoadhäsine berichtet. Immunoadhäsine, die in der Literatur berichtet wurden, umfassen beispielsweise Fusionen des T-Zellenrezeptors (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2.936–2.940 [1987]); von CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 [1989]; Traunecker et al., Nature 339, 68–70 [1989]; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 [1990]; Byrn et al., Nature 344, 667–670 [1990]); L-Selectin (Homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell. Biol 110, 2.221–2.229 [1990]; Watson et al., Nature 349, 164–167 [1991]); E-Selectin [Mulligan et al., J. Immunol. 151, 6.410– 17 [1993]; Jacob et al., Biochemistry 34, 1.210–1.217 [1995]); P-Selectin (Mulligan et al., s.o.; Hollenbaugh et al., Biochemistry 34, 5.678–84 [1995]); ICAM-1 (Stauton et al., J. Exp. Med. 176, 1.471–1.476 [1992]; Martin et al., J. Virol. 67, 3.561–68 [1993]; Roep et al., Lancet 343, 1.590–93 [1994)); ICAM-2 (Damle et al., J. Immunol. 148, 665–71 [1992]); ICAM-3 (Holness et al., J. Biol. Chem. 270, 877–84 [1995]); LFA-3 (Kanner et al., J. Immunol. 148, 223–229 [1992]); L1-Glykoprotein (Doherty et al., Neuron 14, 57–66 [1995]); TNF-R1 (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10.535–539 [1991]; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21, 2.883–86 [1991]; Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1.483–1.489 [1991]); TNF-R2 (Zack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2.335–39 (1993]; Wooley et al., J. Immunol. 151, 6.602–07 [1993]); CD44 [Aruffo et al., Cell 61, 1.303.1.313 (1990)]; CD28 und B7 [Linsley et al., J. Exp. Med. 173; 721–730 (1991)]; CTLA-4 [Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)]; CD22 [Stamenkovic et al., Cell 66, 1.133–1.144 (1991)]; NP-Rezeptoren [Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23.060–23.067 (1991)]; IgE-Rezeptor α [Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstract 1.448 (1991)]; HGF-Rezeptor [Mark, M.R., et al., J. Biol. Chem. (1992), eingereicht); IFN-γR-α- und -β-Ketten [Masters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5.401–05 [1995]); trk-A, -B und -C (Shelton et al., J. Neurosci. 15, 477–91 [1995]); IL-2 (Landolfi, J. Immunol. 146, 915–19 [1991]); IL-10 (Zheng et al., J. Immunol. 154, 5.590–5.600 [1995]).
Das einfachste und direkteste Immunoadhäsindesign kombiniert die Bindungsregionen) des "Adhäsin"-Proteins mit den Gelenk- und Fc-Regionen einer Immunglobulin-Schwerkette. Üblicherweise wird bei der Herstellung der PSTPIP-Immunglobulinchimären der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure, die für das erwünschte PSTPIP-Polypeptid kodiert, C-terminal mit Nucleinsäure, die für den N-Terminus einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz kodiert, fusioniert, wobei auch N-terminale Fusionen möglich sind. Typischerweise behält bei solchen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest funktionell aktive Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen erfolgen auch an den C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zu CH1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette. Die präzise Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist nicht maßgeblich; bestimme Stellen sind bekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften der PSTPIP-Immunglobulinchimären zu optimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sequenz eines nativen, natürlichen PSTPIP-Polypeptids oder einer Variante oder eines Fragments davon an den N-Terminus des C-terminalen Abschnitts eines Antikörpers (insbesondere die Fc-Domäne), der die Effektorfunktionen eines Immunglobulins, z.B. IgG-1, enthält, fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Region der Schwerkette an die PSTPIP-Sequenz zu fusionieren. Noch bevorzugter jedoch wird eine Sequenz zur Fusion eingesetzt, die in der Gelenkregion gerade stramauf von der Papain-Spaltungsstelle (die IgG Fc chemisch definiert; Rest 216, wobei der erste Rest der konstanten Region der Schwerkette 114 ist [Kabat et al., s.o.], oder analoge Stellen anderer Immunglobuline) beginnt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die PSTPIP-Sequenz (volle Länge oder Fragment oder Variante) an die Gelenkregion und CH2 und CH3 oder CH1-, Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen einer IgG-1-, IgG-2- oder IgG-3-Schwerkette fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist nicht maßgeblich, und die optimale Stelle kann mittels Routineexperimenten ermittelt werden.
In einigen Ausführungsformen sind die PSTPIP-Immunglobulinchimären als Multimere, und besonders als Homo-Dimer oder -Tetramere, zusammengesetzt (WO 91/08.298). Im Allgemeinen weisen diese zusammengesetzten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen auf. Eine grundlegende Vierketten-Struktureinheit ist die Form, in der IgG, IgD und IgE existieren. Eine Vierereinheit ist in den hochmolekularen Immunglobulinen wiederholt; IgM existiert im Allgemeinen als ein Pentamer mit vier Grundeinheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gegebenenfalls IgG-Globulin können auch in multimerer Form in Serum vorliegen. Im Fall von Multimeren kann jede Vierer-Einheit dieselbe oder unterschiedlich sein.
Verschiedene beispielhafte, zusammengesetzte PSTPIP-Immunglobulinchimären, die in den Schutzumfang der Erfindung fallen, sind nachstehend schematisch als Diagramm dargestellt:

(a) AC_L-AC_L;
(b) AC_H-[AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, or V_LC_L-AC_H];
(c) AC_L-AC_H-[AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H, or V_LC_L-V_HC_H];
(d) AC_L-V_HC_H-[AC_H, or AC_L-V_HC_H, or V_LC_L-AC_H];
(e) V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H, or V_LC_L-AC_H]; und
(f) [A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H]₂.

_L

_H

_L

_H

Um Prägnanz zu wahren, zeigen die obigen Strukturen nur zentrale Eigenschaften: sie geben weder eine Verbindung (J) oder andere Domänen des Immunglobulins an, nach werden Disulfidbindungen gezeigt. Wo solche Domänen jedoch für Bindungsaktivität erforderlich sind, sollten sie so konstruiert werden, als ob sie an den gewöhnlichen Stellen, die sie in den Immunglobulinmolekülen einnehmen, vorhanden wären.
Alternativ dazu können die PSTPIP-Aminosäuresequenzen zwischen Immunglobulin-Schwerketten- und Leichketten-Sequenzen so eingefügt werden, dass ein Immunglobulin erhalten wird, das eine chimäre Schwerkette umfasst. In dieser Ausführungsform werden die PSTPIP-Polypeptidsequenzen an das 3'-Ende einer Immunglobulin-Schwerkette in jedem Arm eines Immunglobulins fusioniert, und dies entweder zwischen dem Gelenk und der CH2-Domäne oder zwischen der CH2- und der CH3-Domäne. Ähnliche Konstrukte wurden von Hoogenboom, H. R., et al., MoI-Immunol. 28, 1.027–1.037 (1991), erläutert.
Obwohl die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in den Immunoadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulin-Leichtkette entweder kovalent mit einem PSTPIP-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionspolypeptid assoziiert oder direkt an das PSTPIP-Polypeptid fusioniert sein. Im ersten Fall wird die DNA, die für eine Immunglobulin-Leichtkette kodiert, typischerweise mit der DNA, die für das PSTPIP-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionspolypeptid kodiert, co-exprimiert. Bei der Sekretion werden die hybride Schwerkette und die Leichtkette kovalent assoziiert, um eine Immunglobulin-ähnliche Struktur zu schaffen, die zwei Disulfid-gebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Geeignete Verfahren zur Herstellung solcher Strukturen sind beispielsweise im US-Patent Nr. 4.816.567, ausgegeben am 28. März 1989, offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Immunglobulinsequenzen, die zur Konstruktion der Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, von einer konstanten Domäne der Schwerkette von IgG-Immunglobulin. Für menschliche Immunoadhähsine ist der Einsatz von menschlichen IgG-1- und IgG-3-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein zentraler Vorteil des Einsatzes von IgG-1 ist, dass IgG-1-Immunoadhäsine wirksam an immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert die Reinigung von IgG-3 Protein G, ein bedeutend weniger vielseitiges Medium. Dennoch sollten auch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen bei der Auswahl des Ig-Fusionspartners für eine bestimmte Immunoadhäsinkonstruktion in Erwägung gezogen werden. Beispielsweise ist das IgG-3-Gelenk länger und flexibler, sodass es längere "Adhäsin"-Domänen aufnehmen kann, die sich eventuell nicht richtig falten oder nicht korrekt funktionieren, wenn sie an IgG-1 fusioniert werden. Während IgG-Immunoadhäsine typischerweise ein- oder zweiwertig sind, können andere Ig-Subtypen wie IgA und IgM dimere bzw. pentamere Strukturen der grundlegenden Ig-Homodimereinheit entstehen lassen. Multimere Immunoadhäsine sind insofern von Vorteil, da sie ihre jeweiligen Targets mit größerer Avidität binden können als ihre IgG-basierten Gegenstücke. Berichtete Beispiele solcher Strukturen sind CD4-IgM (Traunecker et al., s.o.); ICAM-IgM (Martin et al., J. Virol. 67, 3.561–68 [1993]); und CD2-IgM (Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177, 1.439–50 [1993]).
Für PSTPIP-Ig-Immunoadhäsine, die für In-vivo-Anwendungen entworfen sind, sind die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die durch die Fc-Region spezifiziert sind, ebenfalls wichtig. Obwohl IgG-1, IgG-2 und IgG-4 In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen haben, sind ihre relativen Leistungsfähigkeiten beim Aktivieren des Komplementsystems unterschiedlich. IgG-4 aktiviert das Komplement nicht, und IgG-2 ist hinsichtlich der Komplementaktivierung signifikant schwächer als IgG-1. Darüber hinaus bindet sich IgG-2, anders als IgG-1, nicht an Fc-Rezeptoren an einkernigen Zellen oder Neutrophile. Während IgG-3 hinsichtlich der Komplementaktivierung optimal ist, beläuft sich seine In-vivo-Halbwertszeit auf etwa ein Drittel jener der anderen IgG-Isotypen. Ein anderer wichtiger Punkt, der bei Immunoadhäsinen, die als Therapeutika für Menschen eingesetzt werden sollen, in Erwägung gezogen werden muss, ist die Anzahl allotypischer Varianten des bestimmten Isotyps. Im Allgemeinen werden IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. Beispielsweise hat IgG-1 nur vier serologisch definierte allotypische Stellen, von denen zwei (G1m und 2) in der Fc-Region angeordnet sind und eine dieser Stellen G1m1 nicht immunogen ist. Dahingegen gibt es 12 serologisch definierte Allotypen in IgG-3, von denen sich alle in der Fc-Region befinden; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen Allotyp auf, der nicht immunogen ist. Somit ist die potentielle Immunogenität eines γ3-Immunoadhäsins größer als die eines γ1-Immunoadhäsins.
PSTPIP-Immunoadhäsine werden im besten Fall durch Fusionieren der cDNA-Sequenz, die für den PSTPIP-Abschnitt kodiert, im Raster an eine Ig-cDNA-Sequenz konstruiert. Dennoch kann auch die Fusion an genomische Ig-Fragmente eingesetzt werden (siehe z.B. Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2.936–2.940 [1987]; Aruffo et al., Cell 61, 1.303–1.313 [1990]; Stamenkovic et al., Cell 66, 1.133– 1.144 [1991]). Der letztgenannte Fusionstyp erfordert die Gegenwart von Ig-Regulatorsequenzen zur Expression. cDNA, die für konstante Regionen der IgG-Schwerkette kodieren, können basierend auf veröffentlichter Sequenz von cDNA-Bibliotheken, die aus Milz- oder peripheren Blutlymphozyten abgeleitet sind, durch Verfahren der Hybridisierung oder der Polymerasekettenreaktion (PCR) isoliert werden.
H. Herstellung von Anti-PSTPIP-Antikörpern
(i) Polyklonale Antikörper
Polyklonale Antikörper gegen ein PSTPIP-Molekül werden im Allgemeinen in Tieren durch vielfache subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des PSTPIP und eines Adjuvans gebildet. Es kann nützlich sein, das PSTPIP oder ein Fragment, das die Zielaminosäuresequenz enthält, mit einem Protein zu konjugieren, das in den zu immunisierenden Spezies immunogen wirkt, z.B. Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsin-Hemmer, unter Einsatz eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C-NR, worin R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg oder 1 μg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina komplettem Freundschen Adjuvans und intradermales Injizieren der Lösung an mehreren Stellen immunisiert. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Konjugat in komplettem Freundschem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Anti-PSTPIP-Antikörper-Titer getestet. Die Tiere werden bis zur Titersättigung geboostet. Vorzugsweise werden die Tiere mit dem Konjugat desselben PSTPIP-Polypeptids geboostet, das jedoch an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes vernetzendes Reagens konjugiert ist. Konjugate können auch in rekombinanten Zellkulturen als Proteinfusionen erzeugt werden. Auch werden Aggregationsmittel wie Alaun eingesetzt, um die Immunreaktion zu verstärken.
(ii) Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population aus im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d.h. dass die einzelnen Antikörper, die die Population umfassen, ident sind, mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. So gibt das Attribut "monoklonal" die Eigenschaft des Antikörpers an, dass er kein Gemisch aus unterschiedlichen Antikörpern ist.
Beispielsweise können die monoklonalen Anti-PSTPIP-Antikörper der vorliegenden Erfindung unter Einsatz des Hybridomverfahrens erzeugt werden, das zum ersten Mal von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder sie können mittels DNA-Rekombinationsverfahren erzeugt werden [Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567].
Im Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier wie ein Hamster wie zuvor beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren oder fähig sind, diese Antikörper zu produzieren, die sich wiederum an das zur Immunisierung eingesetzte Protein spezifisch binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden dann mit Myelomzellen unter Einsatz eines geeigneten Fusionsmittels wie Polyethylenglykol fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103 (Academic Press, 1986)].
Die so hergestellten Hybridomzellen wurden gesät und in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder das Überleben der nicht fusionierten, elterlichen Myelomzellen hemmt. Weisen beispielsweise die elterlichen Myelomzellen die Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) nicht auf, so umfasst das Nährmedium der Hybridomen typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbindet.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die wirksam fusionieren, stabile hochgradige Expression von Antikörper durch die ausgewählten, Antikörper-produzierenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium wie HAT-Medium empfindlich sind. Unter diesen sind bevorzugte Myelomzelllinien Mäuse-Myelomlinien, wie z.B. jene, die von MOPC-21- und MPC-11-Mäusetumoren, erhältlich bei Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, abgeleitet sind, und SP-2-Zellen, die bei American Type Culture- Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Mäuse-Menschen-Heteromyelomzelllinien wurden auch für die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133, 3.001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
Ein Nährmedium, in dem Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf Produktion monoklonaler Antikörper, die gegen ein PSTPIP-Polypeptid gerichtet sind, getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler, durch Hybridomzellen produzierter Antikörper durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie einen Radioimmuntest (RIA) oder einen Enzym-gebundenen Immunabsorptionstest (ELISA), bestimmt. Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson & Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem Hybridomzellen identifiziert wurden, die Antikörper der erwünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzver dünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–104 (Academic Press, 1986). Geeignete Nährmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RPMI-1640-Medium. Weiters können Hybridomzellen in vivo als Ascites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden vom Nährmedium, den Ascites-Fluiden oder dem Serum durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gel-Elektrophorese, Dialyse oder Affinitäts-Chromatographie, geeignet getrennt.
DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, wird leicht isoliert und mittels herkömmlicher Verfahren sequenziert (z.B. durch Einsatz von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten von Mäuse-Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle solcher DNA. Wurde die DNA erst einmal isoliert, kann sie in Expressionsvektoren angeordnet werden, die anschließend in Wirtszellen wie Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) oder Myelomzellen transfiziert werden, die anderenfalls kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Die DNA kann beispielsweise auch durch Substituieren der homologen Mäusesequenzen durch die für menschliche konstante Domänen von Schwer- und Leichtketten kodierende Sequenz, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6.851 (1984), oder durch kovalentes Binden eines Teils der oder der gesamten für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kodierenden Sequenz an die für das Immunglobulin kodierende Sequenz modifiziert werden. Auf dieselbe Weise werden "chimäre" oder "hybride" Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines hierin umfassten, monoklonalen Anti-PSTPIP-Antikörpers aufweisen.
Typischerweise substituieren eines Antikörpers der Erfindung solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide, oder die variablen Domänen einer Antigen-kombinierenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung substituieren die konstanten Domänen, um einen chimären, zweiwertigen Antikörper zu schaffen, der eine Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein PSTPIP-Polypeptid und eine andere Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro unter Verwendung auf dem Gebiet der synthetischen Proteinchemie bekannter Verfahren hergestellt werden, umfassend jene, die Vernetzer einbinden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Einsatz einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für zu diesem Zweck geeignete Reagenzien umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Für diagnostische Anwendungen werden die Antikörper der Erfindung typischerweise mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Die nachweisbare Markierung kann eine sein, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop wie ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie Fluorescein-Isothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; Biotin oder ein Enzym, wie Alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichpenoxidase, sein.
Jedes auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zum getrennten Konjugieren des Antikörpers mit der nachweisbaren Gruppierung kann eingesetzt werden, umfassend jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1.014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981), und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren, wie z.B. kompetitive Bindungstests, direkte und indirekte Sandwich-Tests und Immunfällungstests, eingesetzt werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158 (CRC Press, Inc. 1987).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards (der ein PSTPIP-Polypeptid oder ein immunologisch reaktiver Abschnitt davon sein kann), mit dem Testprobenanalyt (PSTPIP) für die Bindung mit einer begrenzten Anzahl an Antikörper zu konkurrieren. Die Menge an PSTPIP-Polypeptid in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an die Antikörper gebunden wird. Um das Bestimmen der Menge des Standards, der gebunden wird, zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Kompetition unlöslich gemacht, sodass der Standard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, angemessen vom Standard und Analyt getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
Sandwichtests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder der beiden in der Lage ist, an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein Epitop des nachzuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest wird der Testprobenanalyt an einen ersten Antikörper gebunden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, und hiernach bindet sich ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch ein unlöslicher, dreiteiliger Komplex gebildet wird. David & Greene, US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkter Sandwichtest) oder kann mittels eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist, gemessen werden (indirekter Sandwichtest). Eine Art des Sandwichtests ist beispielsweise ein ELISA-Test, bei dem die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist.
(iii) Humanisierte Antikörper
Verfahren zum Humanisieren von nicht menschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die ihm aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht menschlich ist. Diese nicht menschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise von einer variablen "Import"-Domäne bezogen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren nach Winter und Mitarbeitern [Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1.534–1536 (1988)] durch Substituieren von Nagetier-CDR oder -CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, s.o.), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz einer nicht menschlichen Spezies substituiert wurde. In der praktischen Umsetzung sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste analoger Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert wurden.
Es ist wichtig, dass Antikörper unter Beibehaltung hoher Affinität zum Antigen und anderer günstiger biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dies zu erreichen, werden humanisierte Antikörper gemäß einem bevorzugten Verfahren mittels eines Analyseverfahrens für elterliche Sequenzen und unterschiedliche konzeptuelle humanisierte Produkte unter Einsatz von dreidimensionalen Modellen elterlicher und humanisierter Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle sind allgemein erhältlich und sind Fachleuten vertraut. Es gibt Computerprogramme, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter, vermutlicher immunglobulinsequenzen illustrieren und darstellen. Die Betrachtung dieser Darstellungen ermöglicht eine Analyse der möglichen Rolle der Reste für die Funktion der vermutlichen Immunglobulin-Sequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des vermutlichen Immunglobulins beeinflussen, sich an sein Antigen zu binden. So können FR-Reste von Consensus- und Importsequenz so ausgewählt und kombiniert werden, dass die erwünschte Antikörpereigenschaft wie erhöhte Affinität zu Zielantigen(en) erlangt wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und wesentlich beim Beeinflussen der Antigenbindung involviert. Für weitere Details siehe die US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/934.373, eingereicht am 21. August 1992, die eine Continuation-in-Part der Anmeldung mit der Seriennummer 07/715.272, eingereicht am 14. Juni 1991, ist.
Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu produzieren, die in der Lage sind, im Laufe der Immunisierung ein gesamtes Repertoire an menschlichen Antikörpern in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Gens der der Schwerkette des Antikörpers angrenzenden Region (J_H) in chimären und Keimbahn-mutierten Mäusen zu völliger Hemmung endogener Antikörperproduktion führt. Die Übertragung der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solche Keimbahn-mutierten Mäuse führt zur Produktion menschlicher Antikörper bei Antigen-Herausforderung. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2.551–255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993).
(iv) Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei unterschiedliche Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für ein PSTPIP-Polypeptid, die andere ist für jedes beliebige andere Antigen. Verfahren zur Herstellung spezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Üblicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, worin die zwei Schwerketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der Zufallsverteilung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung der korrekten Moleküle, die üblicherweise mittels Verfahrensschritten der Affinitätschromatographie erfolgt, ist eher mühevoll, und die Produktausbeute ist gering. Ähnliche Verfahren sind in der PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO93/08.829 (veröffentlicht am 13. Mai 1993) und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz werden variable Domänen von Antikörpern mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-kombinierende Stellen) an Immunglobulin-Konstant-Domänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Domäne der Schwerkette des Immunglobulins, die zumindest einen Teil des Gelenks umfasst, und einer zweiten und dritten konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette (CH2 und CH3). Vorzugsweise ist die erste konstante Region der Schwerkette (CH1), die die Stelle enthält, die für die Bindung der Leichtkette erforderlich ist, zumindest in einer der Fusionen vorhanden. DNA, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen und, sofern erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren eingeführt und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Dies bringt große Flexibilität beim Einstellen der jeweiligen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, wenn ungleiche Verhältnisse der drei in der Konstruktion eingesetzten Polypeptidketten für optimale Ausbeute sorgen. Es ist jedoch möglich, die für zwei oder alle drei Polypeptidketten kodierenden Sequenzen in einen Expressionsvektor einzuführen, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu höherer Ausbeute führt oder wenn die Verhältnisse keine besondere Bedeutung haben. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes sind die bispezifischen Antikörper aus einer hybriden Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem hybriden Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (die eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) im anderen Arm zusammengesetzt. Es wurde herausgefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der erwünschten bispezifischen Verbindung von nicht erwünschten Immunglobulinketten-Kombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für eine leichte Trennungsmöglichkeit sorgt. Dieser Ansatz ist in der PCT-Anmeldung WO 94/04.690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart.
Für weitere Details hinsichtlich der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
(v) Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper sind auch innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung eingebunden. Heterokonjugierte Antikörper sind aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern zusammengesetzt. Solche Antikörper wurden beispielsweise für Zielimmunsystemzellen für unerwünschte Zellen (US-Patent Nr. 4.676.980) und zur Behandlung von HIV-Infektionen (PCT-Anmeldung Veröffentlichungs-Nr. WO 91/00.360 und WO 92/200.373; EP 03.089 ) vorgeschlagen. Heterokonjugierte Antikörper können mittels jedes geeigneten Vernetzungsverfahrens erzeugt werden. Geeignete Vernetzer sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 neben mehreren Vernetzungsverfahren offenbart.
I. Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga von PSTPIP-Polypeptiden
Peptidanaloga der PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden auf Grundlage der dreidimensionalen Struktur der nativen Polypeptide modelliert. Peptide können mittels bekannter Verfahren, wie z.B. den Festphasen-Syntheseverfahren, die ursprünglich von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 15, 2.149–2.154 (1963), beschrieben wurden, synthetisiert werden. Andere Peptid-Syntheseverfahren sind beispielsweise in Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. Ausgabe (1976), sowie in anderen Nachschlagewerken, die Fachleuten leicht zugänglich sind, beschrieben. Eine Zusammenfassung von Peptid-Syntheseverfahren kann in Stuart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984), gefunden werden. Peptide können auch durch DNA-Rekombinationstechnologie unter Einsatz einer DNA-Sequenz, die für das erwünschte Peptid kodiert, hergestellt werden.
Neben den Peptidanaloga befasst sich die vorliegende Erfindung auch mit Nicht-Peptid-Verbindungen (z.B. organischen Verbindungen), die im Wesentlichen dieselbe Oberfläche wie die Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung aufweisen und daher mit anderen Molekülen auf ähnliche Weise wechselwirken.
J. Verwendung der PSTPIP-Polypeptide
Die PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind für zahlreiche Zwecke nützlich. Beispielsweise ist das in 1A gezeigte PSTPIP-Polypeptid zur Identifikation und Isolation eines PSTPIP-Homologs in einer anderen Säugetierspezies nützlich. Native PSTPIP-Polypeptide und deren funktionelle Äquivalente sind auch für Screeningtests nützlich, um Antagonisten oder Agonisten des nativen PSTPIP-Polypeptids zu identifizieren. Solche Tests können die Form eines jeden beliebigen, herkömmlichen Zelltyp- oder biochemischen Bindungstests annehmen und können in zahlreichen unterschiedlichen Testformaten, die Fachleuten bekannt sind, durchgeführt werden.
Die PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung, wie hierin gezeigt wird, sind in die Polymerisation von Actinmonomeren in eukaryotischen Zellen eingebunden. Als solche sind die PSTPIP-Polypeptide in zahlreichen Fällen nützlich, in denen Fachleute wünschen, die Polymerisation von Actinmonomeren zu induzieren.
Die PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung und die Nucleinsäuren, die für sie kodieren, sind auch als molekulare Marker für Gewebe nützlich, in denen sie spezifisch exprimiert werden. Als solche sind die PSTPIP-Polypeptide und Nucleinsäuren, die für sie kodieren, zur Gewebetypisierung spezifischer Säugetiergewebe nützlich.
Die PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind auch als Proteinmolekulargewichtsmarker an Proteingelen nützlich.
Nucleinsäuren, die für die PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, sind auch zur Herstellung von PSTPIP-Polypeptiden mittels Rekombinationsverfahren, die hierin erläutert werden, und zum Bereitstellen von Hybridisierungssonden zum Suchen nach cDNA- und genomischen Bibliotheken für die kodierende Sequenz anderer PSTPIP-Polypeptidanaloga in anderen Spezies nützlich.
Antagonisten der PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind nützlich, um zumindest eine biologische Aktivität der Polypeptide zu hemmen.
Weitere Details der Erfindung werden in den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen erläutert.
Die PSTPIP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch in In-vitro-Tests zusammen mit PTP-HSCF eingesetzt werden, um Inhibitoren der PTP-PSTPIP-Wechselwirkung zu identifizieren. Solche Inhibitoren können beispielsweise Polypeptide, Peptide oder kleine (organische) Moleküle sein, die die PTP-PSTPIP-Wechselwirkung durch Binden an PSTPIP und/oder PTP-HSCF hemmen. Ähnliche Tests können eingesetzt werden, um enzymatische Inhibitoren von Dephosphorylierung der Phosphatase zu finden. Solche Inhibitoren können als chemotherapeutische Mittel nützlich sein, die in der Lage sind, die Zellteilung von Tumorzellen zu stoppen oder zu hemmen.
Mutanten (Aminosäuresequenzvarianten) nativer PSTPIP-Polypeptide können in vivo in transfizierten rekombinanten Zellen eingesetzt werden, um andere Komponenten der Zellteilungsvorgänge zu identifizieren. Darüber hinaus können PSTPIP-Regionen in vivo im Hefe-Zwei-Hybrid-System oder in jeder beliebigen, funktionell ähnlichen Testanordnung eingesetzt werden, um andere wechselwirkende Proteine, die möglicherweise in den Vorgang der Zellteilung eingebunden sind, zu identifizieren.
Antikörper, die PSTPIP spezifisch binden, können beispielsweise eingesetzt werden, um sich rasch teilende Zellen zu identifizieren, die wiederum zur Abbildung von Tumoren eingesetzt werden, die aus solchen sich rasch teilenden Zellen bestehen.
Nucleinsäure, die für native PSTPIP-Moleküle kodiert, kann eingesetzt werden, um homologe Gene, die in Tumorzellen spezifisch exprimiert werden, zu isolieren, die eventuell spezifischere Ziele zur Tumortherapie bereitstellen können.
K. Materialien und Verfahren
1. Zwei-Hybrid-Screeningtests
Der Hefe-Zwei-Hybrid-Screeningtest wurde im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt (Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9.578–9.582 (1991), und Bartel et al., Methods Enzymol. 254, 241–263 (1995)). Eine Mutante der aktiven Stelle von C₂₂₁-S von PTP-HSCF (Cheng et al. (1996), s.o.) wurde im Raster mit der Gal4-Bindungsdomäne im Plasmid pPC97 kloniert. Eine Bibliothek von 6 × 10⁶ individuellen Klonen wurde von Baf3-Lymphvorläuferzellen im Gal4-Aktivierungsdomänen-Plasmid pPC86 unter Einsatz von Standardverfahren produziert. Hefe wurde mit beiden Plasmiden transformiert und wurde an Histidin-Minus-Platten 3 Tage lang bei 30°C inkubiert. Kolonien, die unter diesen Bedingungen wuchsen, wurden neuerlich auf Histidin-Minus-Platten ausgestrichen und wurden auf β-Galactosidaseaktivität getestet (Bartel et al. (1995), s.o.). Kolonien, die unterschiedliche Niveaus an β-Galactosidaseaktivität aufwiesen, wurden isoliert, und die cDNA-Inserte in den pPC86-Vektor wurden mittels PCR isoliert und mittels Standardverfahren sequenziert. Für PSTPIP kodierende Klone wurden auf Abhängigkeit von der PTP-Wechselwirkung durch Transfektion in Zellen mit der oder ohne die ursprüngliche, pPC97-Plasmid enthaltende PTP-HSCF und durch anschließende Analyse auf Wachstum auf Histidin-Minus-Platten und β-Galactosidaseaktivität getestet.
2. Kartierung von Wechselwirkungsdomänen
Um eine cDNA zu erhalten, die für das Volllängen-PSTPIP kodiert, das mit dem FLAG-Epitop (DYKDDDDK) (Seq.-ID Nr. 8) am C-Terminus markiert ist, wurde PCR unter Einsatz von Primern 48.BAMHI.F (CGCGGATCCACCATGATGGCCCAGCTGCAGTTC) (Seq.-ID Nr. 9) und 48.SALFLAG.R (GTACGCGTCGACTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGAGCTT) (Seq.-ID Nr. 10) durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit BamHI und Sal I verdaut und in die BamHI- und Sal-I-Stellen von pRK.tkneo, einem Expressionsplasmid, das den Zytomegalie-Viruspromotor enthält, subkloniert, wodurch Plasmid pRK.PIP.FLAG.C geschaffen wurde. Die PTP-HSCF-Deletionsmutanten wurden aus einem Konstrukt abgeleitet, das das Influenza-Hämagglutinin-Epitop an seinem N-Terminus enthielt, und wurde wie folgt erzeugt: PCR wurde an PRK.HSCF unter Einsatz von Primern prkr (TGCCTTTCTCTCCACAGG) (Seq.-ID Nr. 11) und 38.spe.mid.R (CTCCTTGAGGTTCTACTAGTGGGGG CTGGTGTCCTG) (Seq.-ID Nr. 12) durchgeführt. Das resultierende PCR-Fragment, das für die Phosphatasedomäne (Aminosäuren 1–312) kodiert, mit Cla I und Spe I verdaut und in pRK.tk.neo, verdaut mit Cla I und XBa I, subkloniert, was in einer Plasmid-Domäne pRK.hscf.ptp resultierte. Dem ähnlich wurde PCR unter Einsatz von Primern prkr und 39.spe endR (GCGGCCGCACTAGTATCCAGTCTG TGCTCCATCTGTTAC) (Seq.-ID Nr. 13) durchgeführt, und das resultierende Fragment, das für Aminosäuren 1–439 von hscf kodiert, wurde mit Cla I und Spe I verdaut und in die Cla-I- und Xba-I-Stellen von pRKtkneo subkloniert. GST-Fusionsproteine wurden im Wesentlichen gemäß dem Hersteller (Pharmacia Biotech) in DH5-Alpha-Bakterienzellen hergestellt. Ein Sal I → Not I-Fragment, das die Volllängen-cDNA für PSTPIP (Aminosäuren 2–415) enthält, wurde in pGEX-4T-2 (Pharmacia), gespalten an den Sal-I- und Not-I-Stellen, subkloniert.
Um ein DNA-Fragment zu erhalten, das für die Doppelwendel-Domäne von PSTPIP kodiert, wurde PCR unter Einsatz von Primern PC86F (GCGTTTGGAATCA CTAC) (Seq.-ID Nr. 14) und pip48.1706R (TTATAGTTTAGCGGCCGCTCACCGGTAGTCCTGGGCTGATG) (Seq.-ID Nr. 15) durchgeführt. Das PCR-Fragment wurde mit Sal I und Not I verdaut und folglich in die Sal-1- und Not-l-Stellen von pGEX-4T-2 kloniert.
Um ein cDNA-Fragment zu erhalten, das für die SH3-Domäne von PSTPIP kodiert, wurde PCR unter Einsatz von Primern pip48.1673.F (GTACGCGTCGACC GCACTCTACGACTACACTGCACAG) (Seq.-ID Nr. 16) und PC86R (CTCTGGCGAAGAAGTCC) (Seq.-ID Nr. 17) durchgeführt, und das resultierende Produkt wurde mit Sal I und Not I verdaut und in die Sal-I- und Not-I-Stellen von pGEX-4T-2 subkloniert. Um ein cDNA-Fragment zu erhalten, das für das PST (und C-terminale Homologie) von PTP-HSCF (Aminosäuren 304–453) kodiert, wurde PCR unter Einsatz von Primern PST38-R1 (GATCGAATTCCCAGAACCTCAA GGAGAACTGC) (Seq.-ID Nr. 18) und PST38-XHOI (GATCCTCGAGTTACACCCGTGTCCACTCTGCTGGAGGA) (Seq.-ID Nr. 19) durchgeführt. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und in EcoRI- und Sal-Stellen von pGEX-4T-2 subkloniert. Proteinbestimmungen wurden gemäß dem Couprus-Test mit einem Set von Geno Technology (St. Louis) durchgeführt.
Das Binden erfolgte gemäß dem Verfahren nach Wong und Johnson (Wong et al., J. Biol. Chem. 271 (35), 20.981–20.984 (1996)). Kurz beschrieben wurde 1 μg Plasmid mit entweder dem PSTPIP-Protein oder PTP-HSCF unter der Kontrolle des Sp6-Promotors unter Einsatz des Promega-TnT-Kaninchen-Reticulozyten-System in vitro transkribiert/translatiert. Proben wurden in 50 mM HEPES, pH 7,2, 1% Triton X 100, 10% Glycerin, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA und jeweils 2 μg/ml von Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin und PMSF verdünnt. Proben wurden mit Harz 1 Stunde lang vorgereinigt, und 1 μg GST-Fusionspratein wurde zusammen mit 30 μl GSH-Sepharose zugesetzt, die davor in 3% BSA eine Stunde lang blockiert worden war. Dies wurde 1 Stunde lang bei 4°C umgesetzt, und anschließend wurde das Harz vor der SDS-Gel-Elektrophorese sechsmal in HEPES/Triton-Bindungspuffer gewaschen.
Die Peptide wurden an einem automatisierten Milligen 9050 Peptid-Synthesizer unter Einsatz herkömmlicher Festphasenchemie mit FMOC-geschützten Aminosäuren an einem p-Alkoxybenzylalkoholharz synthetisiert. Getrocknete Peptide wurden neuerlich im HEPES/Triton-Bindungspuffer bei einer Konzentration von 10 mg/ml suspendiert. Peptidhemmung wurde durch Zusatz des Peptids zuerst zum In-vitro-Transfationsprodukt und anschließend zur GST-Fusion durchgeführt gefolgt von GSH-Sepharose. Die Verfahrensschritte des Bindens/Waschens wurden wie zuvor durchgeführt. Die synthetisierten Peptide und die PTP, die davon abgeleitet wurden, waren:
PXXP-HSCF: ₄₃₂GFNLRIGRPKGPRDPPAEWT₄₅₁(PTP-HSCF) (Seq.-ID Nr. 20),
PXXP-PEP: ₇₈₂GFGNRFSKPKGPRNPPSAW₈₀₀(PTP-PEP) (Seq.-ID Nr. 21),
PXXP-PEST: ₇₆₁GFGNRCGKPKGPRDPPSEWT₇₈₀(PTP-PEST) (Seq.-ID Nr. 22),
PXXP-CONTROL: ₃₃₄GGVLRSISVPAPPTLPMADT₃₅₃(PTP-HSCF) (Seq.-ID Nr. 23).
3. Analyse von Tyrosinphosphorylierung
Baf3-Zellen wurden in 1% Triton, 50 mM HEPES, 10% Glycerin und 5 mM EDTA, das 1 μg/ml Aprotinin, PMSF, Leupeptin und Pepstatin enthielt, mit 1 mM Natriumvanadat und 10 mM Iodessigsäure lysiert. Vor der Lyse wurden die Zellen mit 0,1 mM Pervanadat 4 Stunden lang behandelt. Immunfällungen wurden im Vanadathältigen Lysepuffer unter Einsatz von 1 μg/ml polyklonalen Anti-PSTPIP-Antikörper und 400 μg Lysatprotein bei 4°C über Nacht durchgeführt. Western-Blots wurden unter Einsatz von 1 μg/ml Affinitäts-gereinigtem Anti-PSTPIP oder 1:5.000-Verdünnung von im Handel erhältlichem monoklonalem 4G10-Anti-Phosphotyrosin (Upstate Biotech) durchgeführt. Signale wurden durch HRPO-ECL-Reagenzien nachgewiesen (Pierce). Die C₂₂₁-S-Mutante war wie zuvor beschrieben (Cheng et al. (1996), s.o.). Die PTP-HSCF-D₁₉₇-A-Mutante wurde unter Einsatz von PCR erzeugt. Mutagenese-Primer D197A.F (GTATATGTCCTGGCCAGCCCATGGGGTTCCCAGCAG) (Seq.-ID Nr. 24), der dem Nucleotid 591 entspricht, und Primer D197A.R (GCAGGTCGACTCTAGATTACACCCGTGTCCACTCTG) (Seq.-ID Nr. 25), der dem Stopcodon entspricht, wurden in PCR eingesetzt, um ein Fragment zu erzeugen, das mit MscI und XbaI geschnitten werden konnte. pRK.HA.38 WT, ein Plasmid, das für das Wildtypenzym unter der Kontrolle des Zytomegalie-Viruspromotors kodiert (Cheng et al. (1996), s.o.), wurde mit ClaI und MscI verdaut, und das resultierende 600-bp-Fragment wurde mit dem MscI-XbaI-PCR-Fragment in den ClaI- und XbaI-Stellen von pRK.tkneo ligiert. Ein Plasmid, das für das V-src-Onkogen unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors kodiert, wurde von Dr. Art Levinson (CEO-Genentech., Inc.) freundlicherweise zur Verfügung gestellt. NIH-3T3-Zellen und COS-7-Zellen wurden in DMEM mit hohem Glucose-Gehalt, ergänzt mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES, pH 7,2, und Pen-Strep, kultiviert.
COS-7-Zellen wurden durch Elektroporation transfiziert. Kurz beschrieben wurden 1,5 × 10⁶ COS-7-Zellen mit 24 μg Gesamt-DNA in PBS gemischt und bei 960 μF, 0,22 Volt Elektroporation unterzogen (Bio-Rad Gene Pulsar). Nach der Elektroporation wurden Zellen in 10-cm-Schalen geimpft und drei Tage lang inkubiert. Die 10-cm-Schalen transfizierter COS-Zellen wurden zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 1 ml M-RIPA (50 mM Tris 7.4, 1% NP40, 0,25% DOC, 150 mM NaCl, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM NaF plus Complete^TM Protease Inhibitors (Boehringer Mannheim)) lysiert. Die Lysate wurden 15 Minuten lang mit 100 μl UltraLink Immobilized Protein A/G (Pierce) bei 4°C inkubiert, gefolgt von 5-minütiger Zentrifugation. Überstände wurden gesammelt und bei –70°C gelagert oder direkt immungefällt. 5 μg von M2 oder 12CA5 wurden 500 μl Lysat zugesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Ultralink-Protein A/G wurde zugesetzt, und die Inkubation wurde bei 4°C 2 Stunden lang fortgesetzt. Die Immunkomplexe wurden dreimal mit M-RIPA gewaschen. Die Proteine wurden SDS-PAGE unterzogen und zur Nitrocellulose in 1X Transfer Buffer (Novex) übertragen. Immunoblots wurden über Nacht bei 4°C in 3% Milch/PBS blockiert. Um Flag-markiertes PIP nachzuweisen, wurden Blots mit 10 μg/ml Bio-M2 (Biotinylierter monoklonaler Anti-FLAG-Antikörper, KODAK) inkubiert, wonach Inkubation in 10 μg/ml Streptavidin-HRP (UBI) erfolgte. Um HA-markierte PTPhscf nachzuweisen, wurden Blots in Anti-(HA)-Peroxidase (Boehringer Mannheim) gemäß den Anleitungen der Hersteller inkubiert. Um Phos photyrosin nachzuweisen, wurden Blots in HRP-konjugierten 4G10 (monoklonales Anti-Phosphotyrosin, UBI) gemäß den Anleitungen der Hersteller inkubiert.
4. Konfokale Mikroskopie von endogenem und translatiertem PSTPIP
Polyklonale Kaninchen-Antikörper wurden gegen ein GST-PSTPIP-Fusionsprotein produziert. Das komplette PSTPIP-GST-Fusionsprotein wurde an GSH-Sepharose gereinigt und intramuskulär an 2 Stellen mit 200 μg Fusionsprotein und subkutan an zahlreichen Stellen mit einer Gesamtmenge von 300 μg PSTPIP-GST-Fusionsprotein in Komplettem Freundschem Adjuvans injiziert. Die Kaninchen wurde alle drei Wochen mit 100 μg Fusionsprotein in Inkomplettem Freundschem Adjuvans geboostet. 15 ml Kaninchenseren wurden mit 0,5 mg PSTPIP-GST-GSH-Sepharose 3 Stunden lang bei 4°C unter leichtem Rotieren umgesetzt. Das Harz wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit 10 Säulenvolumina von PBS gewaschen. Immunglobulin wurde aus der Affinitätsmatrix mit 100 mM Essigsäure, 500 mM NaCl ausgewaschen, mit NaOH neutralisiert und anschließend über Nacht mit PBS dialysiert. NIH-3T3-Zellen wurden mit 100.000 Zellen pro Kammerobjektträger ("chamber slide") geimpft und über Nacht anhaften gelassen. Die Zellen wurden unter Einsatz von Lipofectamin (2 μg pRK.PIP.FLAG.C/12 μl Lipofectamin in 0,8 ml OPTI-MEM) 5 Stunden lang transfiziert. Die DNA/Lipofectamin-Lösung wurde entfernt und frisches, das Medium enthaltende Serum zugesetzt. 48 Stunden nach Beginn der Transfektion wurden die Zellen in 4% Formaldehyd in PHEM 6,1 (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA und 2 mM MgCl₂) 20 Minuten lang fixiert und anschließend 10 Minuten lang in 0,2% Triton X-100, 300 mM Saccharose in PHEM 6,9 permeabilisiert. Die Zellen wurden zweimal in PHEM 6,9 gewaschen und dann mit 10% FBS/PHEM 6,9 1 Stunde lang inkubiert, um nicht spezifische Bindungen des Antikörpers zu blockieren. Die Zellen wurden 1 Stunde lang in 2% BSA/PHEM 6,9, das 10 μg/ml M2 (KODAK, monoklonaler Anti-FLAG-Antikörper) oder 10 μg/ml 12CA5 (Boehringer Mannheim, monoklonaler Anti-HA-Antikörper) als eine irrelevante Antikörperkontrolle enthielt, inkubiert. Nachdem die Zellen zweimal mit 2% BSA/PHEM 6,9 gewaschen worden waren, wurden sie 30 Minuten lang mit einer 1:2000-Verdünnung von Cy3-konjugiertem AfinniPure Schaf-Anti-Maus-IgG und einer 1:200-Verdünnung von Fluorescein-Phalloidin (Molecular Probes) in 2% BSA/PHEM 6,9 inkubiert. Die Zellen wurden in 2% BSA/PHEM 6,9 gewaschen und in Vectashield Mounting Medium mit DAPI angeordnet. NIH3T3-Zellen wurden mit 200.000 Zellen pro Kammerobjektträger geimpft und über Nacht anhaften gelassen. Die Zellen wurden mit 0,4 μg/ml Kaninchen-Anti-PIP oder 0,4 μg/ml Kaninchen-IgG gefärbt und mit Cy3-konjugiertem Ziege-Anti-Kaninchen nachgewiesen. Weiters wurden Zellen mit einer 1:200-Verdünnung von Fluorescein-Phalloidin co-gefärbt.
L. Beispiele
BEISPIEL 1 – Identifikation eines PTP-HSCF-Bindungsproteins
Um potentielle Substrate für PTP-HSCF zu identifizieren (Cheng et al. (1996), s.o.), wurde ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screeningtest unter Einsatz einer katalytisch inaktiven Form des Enzyms als Köder und einer Bibliothek, die von hämopoetischen Mäuse-Baf3-Vorläuferzellen abgeleitet ist, ein Zelltyp, für den zuvor gezeigt wurde, dass er hohe Konzentrationen dieser Phosphatase exprimiert (Cheng et al. (1996), s.o.), durchgeführt. Dies führte zur Isolation von etwa 70 Hefeklonen, die in Abwesenheit von Histidin wuchsen und die unterschiedliche Konzentrationen an β-Galactosidase exprimierten. Eine Sequenzanalyse der Klone zeigte, dass etwa 40% für verwandte Sequenzen mit leicht unterschiedlichen 5'-Fusionen mit der GaI4-DNA-Bindungsdomäne kodierten. Die Sequenzen der Restsubstanz der Klone ließen darauf schließen, dass sie leicht zu künstlichen Wechselwirkungen neigen. Die Analyse von Histidinwachstum und β-Galactosidaseexpression aller Zwei-Hybrid-Klone, die diese verwandten Sequenzen enthielten, legte eine absolute Abhängigkeit von der Einbindung des Phosphatase-Köderkonstrukts in denselben Zellen offen (Daten nicht dargestellt). Der längste Zwei-Hybrid-Klon wurde eingesetzt, um eine Volllängen-cDNA von der ursprünglichen Baf3-Zwei-Hybrid-Bibliothek zu isolieren.
1A veranschaulicht, dass das Protein, das mit PTP-HSCF wechselwirkt, ein neues Molekül mit 415 Resten (vorausgesagtes Molekulargewicht: ~ 47.590 D) (Seq.-ID Nr. 1) ist, das signifikante Sequenzhomologie zum S.-pombe-Zellzyklusprotein, CDC15p (Seq.-ID Nr. 26), einem Zytoskelett-Wechselwirkungsprotein, das in die Organisation des Actinrings an der Teilungsfurche während Zytokinese eingebunden ist (Fankhauser, Cell 82, 435–444 (1995)), aufweist. Diese Homologie (~ 26% Sequenzähnlichkeit) erstreckt sich über die gesamte Länge beider Moleküle, mit Ausnahme einer großen Insertion von etwa 500 Resten im Hefemolekül, das im Säugetierprotein nicht gefunden wird, und das Hefeprotein ist jenes mit der höchsten Homologie in der Proteinsequenzdatenbank.
Zahlreiche Eigenschaften sind in diesen zwei Proteinen konserviert. Beispielsweise haben beide eine SH3-Domäne an ihren Carboxy-Termini (Feng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 12.408–12.415 (1995), und Pawson (1995), s.o.), und die Säugetier-SH3-Domäne scheint mit jenen homolog zu sein, die in zahlreichen bekannten Zytoskelettregulatorproteinen, umfassend Schwerkette von Myosin, Spectrin, Fodrin, hämopoetisches spezifisches Protein 1 (HS1) und das p80/85-src-Substrat, Cortactin (1B), gefunden wurden. Weiters enthalten sowohl die Säugetierproteine als auch die Hefeproteine (Frankhauser (1995), s.o.) eine potentielle Doppelwendel-Domäne an ihren N-Termini, was sowohl aufgrund der Sequenzhomologie als auch aufgrund einer Analyse der Säugetiersequenzen unter Einsatz des Prostruct-Programms (1C) vorhergesagt wird. Innerhalb dieser Doppelwendel-Domänen liegt eine Region mit einem außergewöhnlichen Gehalt an sauren und basischen Resten (Positionen 99–180 des Säugetierproteins). Da das Säugetierprotein auf der Grundlage einer Wechselwirkung mit einer Tyrosinphosphatase isoliert wurde, ist es möglich, dass das Protein Tyrosin-phosphoryliert ist (siehe unten), und eine Untersuchung der Säugetier- und Hefesequenzen zeigte 5 konservierte Tyrosinreste (Positionen 53, 191, 287, 367 und 369 des Säugetierproteins). Schließlich zeigte eine Untersuchung der Proteine für Prolin-reiche Regionen, die als SH3-Bindungsstellen (PXXP) (Seq.-ID Nr. 27) fungieren könnten, zwei solcher konservierter Stellen in diesen Proteinen (beginnend an Position 278 und 323 des Säugetierproteins) (Feng et al. (1995), s.o., und Pawson (1995), s.o.). p80/85-Cortactin (Wu et al., Mol. Cell. Biol. 11, 5.113–5.124 (1991)) und HS1 (Kitamura et al., Nuc. Acids Res. 17, 9.367–9.379 (1989)) sind zwei andere Säugetierproteine, die wiederholte Doppelwendel- und SH3-Domänen enthalten und die eine weiter entfernte Beziehung zu den PTP-HSCF-wechselwirkenden Proteinen aufweisen, obwohl diese zwei Proteine homologe 37-Aminosäurewiederholungen in ihren Doppelwendel-Regionen aufweisen, die scheinbar in PTP-wechselwirkenden Proteinen nicht vorhanden sind. Da die Säugetiersequenz, basierend auf ihrer Fähigkeit, mit der PEST-Phosphatase PTP-HSCF wechselzuwirken, isoliert wurde, wurde sie als PSTPIP (PST Phosphatase Interacting Protein) bezeichnet.
Northern-Blot-Analyse der Expression von PSTPIP während der Embryogenese und in erwachsenen Geweben wird in 2 veranschaulicht. Interessanterweise ist das Protein im 7 Tage alten Embryo im Vergleich zu späteren Stadien bereits höher exprimiert, und es scheint, dass es im 11 Tage alten Embryo signifikant hinunterreguliert wird (2B). Das Protein wird auf relativen hohen Niveaus in der erwachsenen Lunge und Milz und auf niedrigeren Niveaus in Testikeln, Muskeln, Niere, Hirn und Herz exprimiert (2A). Das wechselwirkende Protein weist jedoch weitaus niedrigere Niveaus als Actin auf, da die Actin-Blots 4 Stunden lang exponiert wurden, während die PSTPIP-Blots eine Woche lang exponiert wurden. Hierbei zeigten die Erfinder und andere, dass PTP-HSCF auch in nachweisbaren Konzentrationen in erwachsenen Lungen und Nieren exprimiert wird (Cheng et al. (1996), s.o., und Huang et al. (1996), s.o.).
BEISPIEL 2 – Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen PTP-HSCF und PSTPIP
Um die Regionen zu charakterisieren, die in die Bindung zwischen PTP-HSCF und PSTPIP eingebunden sind, wurde ein rascher und direkter In-vitro-Bindungstest durchgeführt. In diesem Text wurden verschiedene GST-Fusionen entweder der Phosphatase oder des wechselwirkenden Proteins eingesetzt, um In-vitro-Transla tionsprodukte der zugehörigen bindenden Proteine auszufällen. 3 veranschaulicht, dass das Ausfällen von in-vitro-translatierter PTP-HSCF durch GST-Fusionsproteine, die verschiedene SH3-Domänen sowie Volllängen-PSTPIP enthalten, ein hohes Maß an Spezifität in der Wechselwirkung zwischen dem GST-PSTPIP und der Phosphatase offenbarte. 3 veranschaulicht außerdem, dass bei dieser Konzentration an GST-Fusionsprotein (~ 1 μg/ml oder ~ 1,5 μM) das PSTPIP-Fusionsprotein beim Ausfällen der Phosphatase effizienter zu sein schien als ein polyklonaler Antikörper, der gegen das Enzym gerichtet war, oder ein monoklonaler Antikörper, der gegen eine Hämagglutinin-Markierung am PTP-N-Terminus gerichtet war (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis stimmt mit einer relativ hohen Affinitätswechselwirkung zwischen dem GST-PSTPIP und der in-vitro-translatierten PTP-HSCF überein (siehe unten).
Die Region von PTP-HSCF, die mit PSTPIP wechselwirkt, wurde durch Produktion von Deletionsmutanten des Enzyms identifiziert, das entweder die C-terminate 20-Aminosäure-Domäne nicht enthält, die in allen der PEST-PTP hoch konserviert ist (Yang et al. (1993), s.o., Matthews et al. (1992), s.o., Cheng et al. (1996), s.o., Huang et al. (1996), s.o., Aoki et al. (1996), s.o., Dosil et al. (1996), s.o., und Kim et al., (1996) s.o.), oder sowohl diese Domäne als auch die längere Prolin-, Serin- und Threonin-reiche Region, die C-terminal zur katalytischen Domäne ist, nicht enthält (4A). Die 4B–C zeigen, dass Deletion der C-terminalen 20-Aminosäure-Homologie-Domäne von PTP-HSCF die Wechselwirkung zwischen PTP-HSCF und PSTPIP völlig aufhebt. Da diese Region in allen PEST-PTP konserviert ist, ist es möglich, dass sowohl PTP-PEST (Yang et al. (1993), s.o.) als auch PTP-PEP (Matthews et al. (1992), s.o.) mit PSTPIP wechselwirken. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, und auch, um zu untersuchen, ob die C-terminale 20-Aminosäuren-Region für diese Wechselwirkung ausreichend ist, wurden 20 Reste lange Peptide, abgeleitet von der homologen C-terminalen Domäne von drei PEST-PTP, eingesetzt, um mit der Wechselwirkung zwischen PTP-HSCF und PSTPIP zu konkurrieren (4D). In dieser Form des Tests wurde eine GST-Fusion, abgeleitet von den PST-reichen und C-terminalen Homologieregionen der Phosphatase, eingesetzt, um in- vitro-translatiertes PSTPIP in Gegenwart von unterschiedlichen Peptidmengen auszufällen. 4D veranschaulicht, dass alle drei Peptide die Wechselwirkung bei Konzentrationen auf einem niedrigen Niveau wie ~ 800 nM wirksam blockieren, während ein Kontrollpeptid, abgeleitet von einer anderen Prolin-reichen Region von PTP-HSCF, völlig unfähig ist, die Wechselwirkung zu blockieren. Diese Daten lassen darauf schließen, dass diese kleine, Prolin-reiche Region der PEST-PTP ausreichend ist, um die hohe Affinitätswechselwirkung zwischen der Phosphatase und PSTPIP zu vermitteln, und sie weisen weiters auf die Möglichkeit hin, dass alle dieser PTP mit PSTPIP über die C-terminale Homologiedomäne wechselwirken können.
Um die Region von PSTPIP zu untersuchen, die mit der C-terminalen Homologieregion wechselwirkt, wurden GST-Fusionen, die entweder die SH3-Domäne oder die Doppelwendel-Domäne des wechselwirkenden Proteins enthalten, eingesetzt, um in-vitro-translatierte PTP-HSCF immunzufällen. Die C-terminale Homologieregion, die mit PSTPIP wechselwirkt, enthält zwei sich überlappende Consensus-SH3- (PXXP) (Seq.-ID Nr. 27) Bindungsstellen, die mit der Möglichkeit vereinbar sind, dass die Phosphatase-PSTPIP-Wechselwirkung ein SH3-Typ-Bindungsereignis war (Pawson (1995), s.o., und Feng et al. (1995), s.o.). Die Affinität der Wechselwirkung, die im Peptidexperiment gemessen wurde, war signifikant höher als zahlreiche der davor ermittelten Affinitäten für SH3-Domänen-PXXP- (Seq.-ID Nr. 27) Wechselwirkungen (Feng et al. (1995), s.o.), und wie 5 veranschaulicht, wurde die Wechselwirkung zwischen diesen Proteinen erstaunlicherweise durch die Doppelwendel-Domäne und nicht durch die SH3-Region vermittelt. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Ergebnissen von den Zwei-Hybrid-Klonen, von denen alle an einer Stelle sehr nahe am N-Terminus der Doppelwendel-Domäne ansetzten, was darauf schließen lässt, dass die PSTPIP-Stelle, die mit der C-terminalen, Prolin-reichen Domäne wechselwirkt, den N-Terminus umfasst. So definieren diese Daten eine neue Wechselwirkung mit anscheinend hoher Affinität zwischen der C-terminalen, Prolin-reichen Domäne von PTP-HSCF und der Doppelwendel-Region von PSTPIP.
BEISPIEL 3 – PSTPIP ist ein Substrat zur PTP-HSCF-Phosphatase-Aktivität
Die Assoziation zwischen PTP-HSCF und PSTPIP lässt darauf schließen, dass das wechselwirkende Protein ein Substrat für die Phosphatase sein könnte. Darüber hinaus war die Konservierung einer Anzahl an Tyrosinen zwischen PSTPIP und dem stark phosphoryliertem CDC15-Protein auch vereinbar mit der Möglichkeit, dass das wechselwirkende Protein Tyrosin-phosphoryliert war. Wie 6 zeigt ist endogenes PSTPIP tatsächlich in Baf3-Zellen Tyrosin-phosphoryliert, und diese Phosphorylierung wurde durch den Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor Vanadat signifikant verstärkt, was mit der Annahme vereinbar ist, dass das Protein in vivo durch ein PTP-Enzym dephosphoryliert wird (Dixon, Ann. NY Acad. Sci. 766, 18–22 (1995)).
Eine potentielle Tyrosinkinase, die PSTPIP möglicherweise in vivo phosphorylieren könnte, ist src. Bisherige Daten legten nahe, dass die V-src-Tyrosinkinase mit dem Zytoskelett assoziiert ist, Zytoskelettelemente moduliert, was in grundlegenden morphologischen Veränderungen resultiert (Cooper et al., Cell 73, 1.051–1.054 (1993), Kaplan et al., EMBO J. 13, 4.745–4.756 (1994), und Thomas et al., Nature 376, 267–271 (1995)), und die Tyrosinphosphorylierung von p80/85-Cortactin vermittelt (Wu et al. (1991), s.o., Okamura et al., J. Biol. Chem. 270 (44), 26.613–26.618 (1995), Vuori et al., J. Biol. Chem. 270(38), 22.259–22.262 (1995), und Dehio et al., EMBO J. 14, 2.741–2.782 (1995)), einem SH3, Doppelwendel enthaltenden, Actin bindenden Protein, das eine strukturelle Ähnlichkeit zu PSTPIP in sich trägt. Darüber hinaus ist HS1, ein anderes SH3 enthaltendes Protein, das strukturell auch PSTPIP ähnlich ist, durch verschiedene SRC-Familie-Kinasen Tyrosin-phosphoryliert (Yamanashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3.631–3.635 (1993), Nada et al, Oncogene 9, 3.571–3.578 (1994), Takemoto et al., EMBO J. 14, 3.403–3.414 (1995), und Takemoto et al., Int. Immunol. 8(11), 1.699–1.705 (1996)). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass V-src, eine konstitutiv aktive Form des Enzyms, möglicherweise die Tyrosinphosphorylierung von PSTPIP vermitteln könnte, was eine Analyse der möglichen Substratswechselwirkung zwischen dem wechselwirkenden Protein und PTP-HSCF ermöglicht. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde PSTPIP in COS-Zellen zusammen mit der V-src-Tyrosinkinase und entweder Wildtyp- oder dominanter negativer Formen von PTP-HSCF transfiziert. Dominante negative Phosphatasen wurden durch Mutieren entweder des Cysteins der aktiven Stelle zu einem Serin (C₂₂₉-S), das die Fähigkeit des Enzyms unterbindet, ein kovalentes Übergangszwischenprodukt, in dem das Phosphat an das Tyrosin gebunden ist, zu bilden, oder durch Mutation einer maßgeblichen Aspartat-Wirkungsstelle zu Alanin (D₁₉₇-A), das das katalytische Entfernen des Phosphats hemmt, produziert (Dixon (1995), s.o., Jia et al., Science 268(5.218), 1.754–1.758 (1995), und Garton et al. (1996), s.o.). In beiden Fällen binden sich diese Mutanten eng an das Substrat, dephosphorylieren es jedoch nicht, was dazu führt, dass das Substrat hyperphosphoryliert wird. Dieses Verfahren wurde bisher eingesetzt, um Substrate für eine Vielzahl verschiedener PTP zu charakterisieren, umfassend PTP-PEST (Garton (1996), s.o.) und PTP-SHP-2 (Herbst et al., Cell 85, 899–909 (1996)), und es zeigte, dass diese mutierten Enzyme in vivo äußerste Substratspezifität aufweisen.
Wie aus den 6B–F ersichtlich ist, ist PSTPIP als Reaktion auf V-src-Cotransfektion Tyrosin-phosphoryliert. Transfektion von PTP-HSCF vom Wildtyp in PSTPIP und V-src exprimierende Zellen führte zu einem erniedrigten Niveau an Tyrosinphosphat am wechselwirkenden Protein, was mit dem In-vivo-Entfernen des Phosphats aus PSTPIP-Tyrosinen durch das Phosphatase-Enzym übereinstimmt, ein Ergebnis, das erwartet werden würde, wenn das wechselwirkende Protein ein Substrat für das Enzym wäre. Noch überzeugender zeigen die 6B–F auch, dass Cotransfektion jeder dominanten negativen Form von PTP-HSCF in PSTPIP und V-src transfizierte Zellen zu einem extremen Anstieg der Konzentrationen von Tyrosinphosphat am wechselwirkenden Protein führte. Anscheinend war die D₁₉₇-A-Mutation ein geringfügig wirksameres dominantes negatives Protein als die C₂₂₉-S-Mutante, ein Ergebnis, das mit den Resultaten übereinstimmt, die unter Einsatz von dominanten negativen Formen von PTP-PEST, die mit einem seiner Substrate, _P130^CAS, wechselwirkten, erhalten wurden (Garton (1996), s.o.).
Diese Ergebnisse lassen, zusätzlich zu den Studien zur In-vitro-Bindung, auf eine direkte physikalische Wechselwirkung zwischen PSTPIP und PTP-HSCF schließen, und die 6B–F veranschaulichen auch die physikalische In-vivo-Assoziation dieser Proteine durch Darstellung der Mitfällung von entweder PSTPIP oder PTP-HSCF durch Antikörper zu Epitop-Markierungen an den zugehörigen Bindungsproteinen. Diese Daten sind somit mit der Schlussfolgerung vereinbar, dass PSTPIP mit PTP-HSCF in vivo wechselwirkt und dass diese Wechselwirkung es ermöglicht, dass die Phosphatase Tyrosinreste, die durch die V-src-Kinase modifiziert sind, dephosphoryliert. Da Tyrosin-phosphoryliertes PSTPIP nur in Zellen beobachtet wurde, die mit V-src transfiziert waren, legen diese Daten weiters auch nahe, dass COS-Zellen in der zellulären Kinase, die PSTPIP Tyrosin-phosphoryliert, fehlen oder dass die extreme Überexpression des Proteins in diesen Zellen den endogenen Tyrosinphosphorylierungsmechanismus unterdrückte.
BEISPIEL 4 – Subzelluläre Lokalisierung von PSTPIP
S. pombe CDC15p ist mit dem kortikalen Actin-Zytoskelett assoziiert, bis es in eine Region über dem postmitotischen Kern wandert und die Bildung der Actin-reichen Teilungsfurche auslöst (Fankhauser (1995), s.o.). Das Protein bleibt bis zum Abschluss der Zellteilung mit der Teilungsfurche assoziiert, wenn es dann zurück in die Region der Zelle wandert, die kortikales Actin enthält. Um die subzelluläre Lokalisierung von endogenem PSTPIP zu analysieren, wurden 3T3-Zellen mit einem Affinitäts-gereinigten, polyklonalen Antikörper, der gegen eine GST-Fusion des Proteins gerichtet ist, gefärbt und unter Einsatz von konfokaler Mikroskopie sichtbar gemacht. 7 veranschaulicht, dass das wechselwirkende Protein an mehreren Actin-hältigen Stellen in der Zelle colokalisiert ist. Ein großer Anteil des Proteins scheint mit dem kortikalen Actin-Zytoskelett an der intrazellulären Seite der Plasmamembran assoziiert zu sein. Das Protein colokalisiert anscheinend auch mit den Actin-Spannungsfasern sowie in Lamellipodien-Regionen der Actin enthaltenden Zelle.
Weiters zeigte die Transfektion von PSTPIP in CHO-Zellen Expression an Stellen fokalen Kontakts (Daten nicht dargestellt). Diese Ergebnisse sind im Gegensatz zum PSTPIP-verwandten Protein p80/85-Cortactin, das Lokalisierung am kortikalen Actin und an den Enden der Spannungsfasern aufweist, jedoch nicht an den Fasern selbst (Wu et al. (1991), s.o.). Wie es auch bei S. pombe CDC15p der Fall ist (Fankhauser (1995), s.o.) lassen diese Daten darauf schließen, dass PSTPIP während der nicht zytokinetischen Phasen des Zellzyklus mit Zytoskelett-Actin assoziiert ist.
Es ist wichtig, dass die Untersuchung von Zellen, die Zytokinese erfahren, zeigen, dass endogenes PSTPIP vorwiegend mit der Teilungsfurche assoziiert ist (Fishkind et al., Current Opinion in Cell Biology 7, 23–31 (1995), und Fankhauser (1995), s.o.). Wie 7 zeigt, co-lokalisieren sowohl PSTPIP als auch der Actinring zu dieser Region der teilenden Zellen. 7 veranschaulicht auch, dass das PSTPIP in der Teilungsfurche vorwiegend mit dem Membran-gebundenen F-Actin assoziiert ist, das wirkt, um die Teilungsfurche zusammenzuziehen (Fishkind (1995), s.o.), und Untersuchungen von Abschnitten, die senkrecht auf die Teilungsfurche stehen, unterstützen dies, da sie Doughnut-förmige Strukturen aufweisen, die PSTPIP und Actin, an die zusammenziehende Plasmamembran der Teilungsfurche gebunden, enthalten (Daten nicht dargestellt). Aus 7 geht auch hervor, dass ein großer Anteil an kortikal assoziiertem Actin und PSTPIP während der Zytokinese zur Teilungsfurche hin wandern, ein Resultat, das jenem äußerst ähnlich ist, das für Hefe CDC15p und Actin beobachtet wurde (Fankhauser (1995), s.o.). Diese Daten zur subzellulären Lokalisierung stehen somit im Einklang mit der Schlussfolgerung, dass PSTPIP ein Actin bindendes Protein ist, das möglicherweise in die Regulierung der Teilungsfurche eingebunden ist.
BEISPIEL 5 – Filopodieninduktion durch überexprimiertes PSTPIP
Eine Rolle, die PSTPIP möglicherweise an der Teilungsfurche spielt, ist die Reorganisation von polymerisiertem Actin (Cao et al., J. Cell Biol. 111, 1.905–1.911 (1990a), Cao et al., J. Cell Biol. 110, 1.089–1.095 (1990b), Fishkind et al., J. Cell Biol. 123(4), 837–848 (1993), und Fishkind (1995), s.o.). Um die mögliche Funktion von PSTPIP in Actinanordnungen zu untersuchen, wurden 3T3-Zellen mit einer Epitop-markierten Version des Proteins unter der Kontrolle eines starken Zytomegalie-Virus-Promotors transfiziert, und die transfizierten Zellen wurden folglich auf Expression von transfiziertem PSTPIP sowie F-Actin untersucht. Wie in 8 ersichtlich ist, zeigten 3T3-Zellen mit normaler Morphologie, die transfiziertes PSTPIP exprimierten, Co-Lokalisierung des Proteins an der kortikalen Oberfläche mit F-Actin sowie in Lamellipodien-Strukturen und den F-Actin-Spannungsfasern, was im Einklang mit jenen Daten steht, die mittels Untersuchungen endogener PSTPIP-Lokalisierung erhalten wurden (siehe 7). 8 zeigt auch, dass die Überexpression des Proteins oft eine bedeutende morphologische Veränderung in einem hohen Anteil an Zellen, die dieses Protein exprimierten, induzierte. Diese Zellen enthielten verlängerte Filopodien-artige Strukturen, die mit polymerisiertem Actin gefüllt waren. In zahlreichen Fällen wiesen die Strukturen eine Länge von bis zu 150 μm auf, und häufig hatten sie eine knopfartige Morphologie. Weiters enthielt die Mehrzahl der Zellen eine einzelne verlängerte Filopodien-Struktur. Es scheint, dass diese Struktur möglicherweise in Abwesenheit signifikanten Zellwachstums oder Plasmamembransynthese produziert wurde, da die Gesamtgröße des Zellkörpers anscheinend parallel zur Verlängerung der Filopodien-Struktur äußerst stark zurückging. Dieser Zellmorphologietyp wurde nie im Rahmen der Transfektion des grün fluoreszierenden Proteins beobachtet (Daten nicht dargestellt), und 8 zeigt, dass er sich von der Morphologie normal verlängerter, nicht transfizierter Zellen stark unterscheidet. Zusammengefasst lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass die unregulierte Expression von PSTPIP in vivo zur Induktion verlängerter, Filopodien-artiger Strukturen führt, die mit der Möglichkeit übereinstimmt, dass das Protein eine ungeeignete Polymerisation des kortikalen Zytoskeletts hervorrufen könnte.
BEISPIEL 6 – N-terminale Deletionen bei PSTPIP
Materialien und Verfahren
Deletionsmutagenese
Deletionen in den PST-PIP-Molekülen wurden sowohl vom Amino-Terminus als auch vom Carboxy-Terminus ausgehend erzeugt. Die Deletionen wurden von pfu-PCR-Fragmenten konstruiert, die zurück in den ursprünglichen PST-PIP-Expressionsvektor ligiert waren (Spencer et al. (1997), s.o.). Die PCR-Primer der N-terminalen Deletion waren (alle 5' bis 3'):
Die Primer der C-terminalen Deletionen waren:
Der Primer der N-Spirale 1 wurde als der gemeinsame 5'-PCR-Primer für die C-terminalen Deletionen eingesetzt.
In-vitro- und In-vivo-Analyse von PSTPIP- und PTP-HSCF-Wechselwirkungen
In-vitro-Bindungsanalysen zwischen verschiedenen PTP-HSCF- und PST-PIP-Konstrukten wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Spencer et al. (1997), s.o.). Kurz zusammengefasst wurden Plasmide unter Einsatz des TnT-Kaninchen-Reticulozyten-Lysatsystems (Promega) in vitro transkribiert und -translatiert. Proben wurden in 50 mM HEPES, pH 7,2, 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 100 mM NaCl und jeweils 2 μg/ml von Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin und PMSF (Lysepuffer) verdünnt. Die Proben wurden dann mit GST-Fusionsproteinen bei verschiedenen Konzentrationen umgesetzt, und die gebundenen Proteine wurden unter Einsatz von Glutathion-Sepharose-Kügelchen zentrifugiert und auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Durch Inkubieren der GST-Fusionsprotein-Bindungsreaktionen in Gegenwart von 10 μg/ml der nachstehend genannten Peptide wurden Inhibitionsstudien zu C-terminal-abgeleiteten Peptiden durchgeführt. Peptide wurden durch FMOC-geschützte Aminosäuren, wie zuvor beschrieben, hergestellt (Spencer et al. (1997), s.o.). In-vivo-Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Formen von PTP-HSCF und PST-PIP wurden auch wie zuvor beschrieben durchgeführt (Spencer et al., (1997), s.o.). Kurz zusammengefasst wurden COS-Zellen mit verschiedenen Konstrukten transfiziert, und nach 48 Stunden wurden Lysate hergestellt und mit Antikörpern zu entweder dem FLAG-Epitop, das am C-Terminus von PSTPIP enthalten ist, oder dem HA-Epitop, das am N-Terminus von PTP-HSCF enthalten ist, immungefällt. Die resultierenden Blots wurden mit Anti-FLAG sondiert, um PSTPIP nachzuweisen, mit Anti-HA, um PTP-HSCF nachzuweisen, oder mit Anti-Phosphotyrosin, um Konzentrationen dieser modifizierten Aminosäure in jedem Protein nachzuweisen.
Konfokale Mikroskopie transfizierter Zellen
Konfokale Mikroskopie wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Spencer et al. (1997), s.o.). Kurz beschrieben wurden CHO-Zellen unter Einsatz von Lipofectamin und der angegebenen Plasmide in Kammerobjektträgern transfiziert. 48 Stunden später wurden die Zellen in Formaldehyd fixiert und mit einem Anti-FLAG-Epitopspezifischen Antikörper (Kodak) und Fluorescein-Phalloidin (Molecular Probes) gefärbt. Anti-Flag-gefärbte Zellen wurden gewaschen und mit Cy3-konjugierten Schaf-Anti-Maus-IgG gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden unter Einsatz eines Molecular Dynamics Confocal Microscope (2001) beobachtet und mit ImageSpace-Software (Molecular Dynamis) analysiert.
Ergebnisse
PST-PIP war ursprünglich als ein Bindungspartner von PEST-Typ-PTP, PTP-HSCF, in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System isoliert. Interessanterweise begannen alle isolierte Klone in diesem Verfahren innerhalb der 10–15 Aminosäuren des N-Terminus von PST-PIP, was mit der Annahme übereinstimmte, dass der N-Terminus für das Binden an PTP-HSCF maßgeblich war. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden Deletionen von 25 (Delta 25), 50 (Delta 50) und 75 (Delta 75) Aminosäuren des N-Terminus der PST-PIP-Doppelwendel-Domäne geschaffen. Diese Deletionsmutanten wurden durch In-vitro-Transkriptionl-Translation produziert, und sie wurden auf Bindung an ein GST-Fusionsprotein, das die 149 C-terminalen Aminosäuren von PTP-HSCF enthält, umfassend die Prolin-reiche PST-PIP-Bindungsstelle (GST-PTP-HSCF), untersucht. Wie 9 veranschaulicht, waren die Volllängen- und Delta-25- Formen von PST-PIP in der Lage, mit dem GST-PTP-HSCF-Fusionsprotein wechselzuwirken, während die Delta-50- und Delta-75-Formen dies nicht waren. Diese fehlende Bindung könnte eventuell auf eine Deletion der tatsächlichen Bindungsstelle oder auf eine Fehlfaltung des Proteins zurückzuführen gewesen sein. Transfektion entweder der Volllängen- (10) oder der Doppelwendel-Domäne von PST-PIP resultiert in Co-Lokalisierung der Proteine mit dem kortikalen Actin-Zytoskelett und den Lamellipodien, ein Ereignis, das wahrscheinlich ein korrekt gefaltetes Protein erfordert. So kann die Analyse der zellulären Lokalisierung mutierter Formen von PST-PIP als ein Test auf korrekte Faltung des Proteins eingesetzt werden. 10 zeigt, dass sowohl die Wildtyp- als auch die Delta-25-Formen von PST-PIP vorwiegend mit dem kortikalen Actin-Zytoskelett co-lokalisiert sind, während die Delta-50- und Delta-75-Formen des Proteins große Aggregate innerhalb des Zytoplasmas bildete und keine kortikale Lokalisierung aufwies, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass diese Deletionsmutanten nicht korrekt gefaltet waren. Diese Daten sind mit den Ergebnissen des ursprünglichen Zwei-Hybrid-Tests stimmig, und sie lassen darauf schließen, dass der N-Terminus von PST-PIP für die Bildung eines korrekt gefalteten Proteins, das in der Lage ist, sich an PTP-HSCF zu binden, erforderlich ist.
Diskussion
Die Modulierung der Tyrosin-Phosphorylierung einer Vielzahl an zellulären Proteinen durch Proteintyrosinphosphatasen stellt einen maßgeblichen Aspekt für zelluläre Regulierung dar (Neel und Tonks, Opin. Cell Biol. 9(2), 193–204 (1997)). Zahlreiche dieser enzymatischen Dephosphorylierungen werden durch die Erkennung von Phosphotyrosinresten durch Domänen vom SH2-Typ sowie durch direkte Erkennung der Substrate durch die katalytischen Domänen der Enzyme vermittelt (Garton et al. (1996), s.o., Saxton et al., EMBO J. 16(9), 2.352–2.364 (1997)). Hier beschreiben die Erfinder nun einen neuen Mechanismus zur Regulierung von Tyrosinphosphorylierung, der das Erkennen eines Prolin-reichen Motivs am C-Terminus des PTP durch eine Tryptophan-hältige Stelle im Zytoskellet-assoziierten Protein umfasst, wobei dieses Protein PST-PIP ist, das sich von den zuvor beschriebenen poly-Prolinbindenden Molekülen vom SH3- und WW-Typ unterscheidet. Da diese Protein-Protein-Wechselwirkung scheinbar für die Dephosphorylierung von PST-PIP-Phosphotyrosinen erforderlich ist (Spencer et al. (1997), s.o.), kann dies ein potentiell wichtiger, neuer Mechanismus zur Regulierung des Zytoskeletts sein.
Die Mechanismen, die sowohl von SH3- als auch von WW-Domänen bei der Erkennung von Prolin-reichen Helices eingesetzt werden, wurden durch Struktur-Funktions-Analysen unter Einsatz von Röntgenkristallographie, durch NMR und ortsgerichtete Mutagenese aufgeklärt. Die SH3-Domäne besteht aus einem hochstrukturierten, 60 Aminosäuren langen Molekül, das sich anscheinend korrekt faltet, wenn es in Abwesenheit anderer Proteindomänen exprimiert wird, und dieses kurze Motiv ist in der Lage, Prolin-reiche Peptide mit relativ hoher Affinität zu binden (Terasawa et al., Nat. Struc. Biol. 1, 891–897 (1994); Wittekind et al., J. Mol. Biol. 267(4), 933–952; Feng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 12.408–12.415 (1995)). Die WW-Domäne ist auch ein relativ kleines (~ 38 Aminosäuren), hochstrukturiertes Motiv, das in der Lage ist, ein aktives Protein zu bilden, wenn sie in Abwesenheit anderer Moleküle exprimiert wird (Macias et al., Nature 382, 646–649 (1996)). Dies steht im Gegensatz zur poly-Prolin-Erkennungssequenz, die in PST-PIP gefunden wurde. Hier führte die Deletion der 50 N-Terminalen Aminosäuren des Proteins zu einem offensichtlich fehlgefalteten Molekül, das sich nicht an die C-terminate, Prolinreiche Domäne von PTP-HSCF band. Diese Daten stimmen mit der Möglichkeit überein, dass dieser Typ einer poly-Prolin-Erkennungsdomäne eine höhere Komplexität an Wechselwirkungen erfordern könnte als SH3- oder WW-Moleküle.
BEISPIEL 7 – Mutationsanalyse von PSTPIP
Materialien und Verfahren
Mutagenese
Die Mutagenese von PST-PIP wurde unter Einsatz des Dut/Ung-Verfahrens (BioRad Laboratories, Richmond, CA) durchgeführt. Die Mutageneseprimer waren dafür bestimmt, 3 benachbarte Aminosäuren zu Alanin zu ändern. Mutationen wurden mit einem Abstand von etwa 12 Aminosäuren angeordnet, wobei neue Restriktionsstellen zur Identifikation von mutierten Klonen eingebaut wurden. Primer-Annealing wurde bei 70°C 10 Minuten lang, bei 37°C 10 Minuten lang, bei Raumtemperatur 5 Minuten lang und dann auf Eis vor der T7-DNA-Polymeraseaddition durchgeführt. Die zur PST-PIP-Alanin-Scan-Mutagenese eingesetzten Primer waren (alle 5' → 3'):
Cysteine innerhalb der Region von PTP-HSCF-Bindungsdomänen von PST-PIP wurden unter Verwendung der folgenden Primer (alle 5' → 3') auch zu Alanin mutiert:
In-vitro- und In-vivo-Analyse von PSTPIP- und PTP-HSCF-Wechselwirkungen und konfokale Mikroskopie transfizierter Zellen wurden wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
Analyse von v-Src-vermittelter PST-PIP-Tyrosinphosphorylierung
COS-Zellen wurden mit einer konstanten Menge an Wildtyp- oder W₂₃₂A-Mutante von PST-PIP transfiziert und mit ansteigenden Mengen eines Plasmids cotransfiziert, das für die v-Src-Tyrosinkinase kodiert (Spencer et al. (1997), s.o.). Plasmidkonzentrationen wurden mit einem leeren Vektor, der den CMV-Promotor enthielt, ausgeglichen. Nach 48 Stunden wurden Lysate hergestellt und mit monoklonalen Anti-FLAG-Antikörpern immungefällt. Die Präzipitate wurden auf SDS-Polyacrylamidgele laufen gelassen, geblottet und entweder mit Anti-FLAG-Antikörper oder Anti-Phosphotyrosin-Antikörper wie zuvor beschrieben sondiert (Spencer et al. (1997), s.o.). Gebundene Antikörper wurden mittels verstärkter chemilumineszierender Reagenzien sichtbar gemacht.
Ergebnisse
Um die Bindungsstelle innerhalb der PST-PIP-Doppelwendel-Domäne genauer zu definieren, wurde eine Sammlung von Cluster- und Punktmutationen innerhalb dieser Domäne produziert. Vorläufige Deletionskartierung wies darauf hin, dass die Bindung von PTP-HSCF mit einer Form von PST-PIP erreicht werden könnte, das Aminosäuren 1–264 der Doppelwendel-Domäne enthielt, und so wurde die Mutagenese auf diese Region des Proteins eingeschränkt. Da Proteinfaltung für das Binden von PTP-HSCF anscheinend maßgeblich war (9 und 10), wurden alle 6 Cysteinreste innerhalb dieses Proteinteils zu Serinen mutiert, und die resultierenden Mutanten wurden auf Wechselwirkung mit dem PTP-HSCF-GST-Fusionsprotein getestet. Das Entfernen einzelner Cysteinreste schien die Bindung dieser zwei Proteine nicht zu beeinflussen, was darauf schließen ließ, dass sich das Protein in Abwesenheit einzelner Cysteine angemessen falten und funktionieren konnte (Daten nicht dargestellt). Weitere Mutationsanalyse von PST-PIP wurde somit durchgeführt, um eine Region oder Regionen zu identifizieren, die möglicherweise direkt in die PTP-HSCF-Bindung eingebunden war(en). Angehäufte Alaninsubstitutionen wurden in Abständen von etwa 12 Aminosäuren über die gesamte PST-PIP-Doppelwendel-Domäne produziert, und jede Mutante wurde anschließend auf Bindung an das PTP-HSCF-GST-Fusionsprotein getestet. Mutation von Restclustern L26QR, D38VE, E50ER, R62K, R73TS, N86VG, R99EE, E110RQ, I122MD, L133YK, D145QK, E159RV, Q169VE, E184S und R194QN jeweils zu Alanin führte entweder zu keiner oder nur geringfügiger Veränderung der Bindungsaktivität dieser zwei Proteine in vitro (Daten nicht dargestellt). In den obigen Bezeichnungen identifiziert die tiefgestellte Zahl, die auf den Einbuchstaben-Aminosäurecode folgt, die Aminosäureposition in Seq.-ID Nr. 1, wo die Alaninsubstitution beginnt, während die folgenden Einbuchstaben-Aminosäurecodes die anderen, kongruenten Aminosäuren bezeichnen, die in jedem einzelnen Cluster durch Alanin ersetzt wurden. 11 zeigt, dass die Mutation des Tryptophanrests an Position 232 von PST-PIP zu Alanin zu einem gänzlichen Verlust der Bindung an das PTP-HSCF GST-Fusionsprotein in vitro führte. Weiters zeigt 12, dass Cotransfektion von Wildtyp-PST-PIP zusammen mit PTP-HSCF in COS-Zellen zur In-vivo-Assoziierung der Proteine führte, wie zuvor beschrieben wurde (Spencer et al. (1997), s.o.), während Cotransfektion der W₂₃₂A-Mutante von PST-PIP zu einem gänzlichen Fehlen von In-vivo-Assoziierung führte, was mit den Studien bezüglich In-vitro-Bindung übereinstimmt. Wie erwartet könnte diese mutierte, nicht bindende Form von PST-PIP durch eine dominante negative Cys-Ser-Mutante von PTP-HSCF (12) nicht länger "substratgefangen" sein (Jia et al. (1995), s.o.; Garton et al. (1996), s.o.; Flint et al. (1997), s.o.; Spencer et al. (1997), s.o.), obwohl es eindeutig in Gegenwart von v-Src (4) oder Pervanadat (Daten nicht dargestellt) Tyrosin-phosphoryliert sein könnte. Während das Wildtyp-PST-PIP in Gegenwart eines dominanten negativen, substratfangenden Form von PTP-HSCF (PTP-HSCF C-S) verstärkte Tyrosin-Phosphorylierung zeigte (Jia et al. (1995), s.o., Garton et al. (1996), s.o., Flint et al. (1997), s.o., Spencer et al. (1997), s.o.), war die W₂₃₂A-Mutante von PST-PIP war in Gegenwart dieser Mutantenform des Enzyms nicht hyperphosphoryliert (12). Da vorangehende Resultate annehmen ließen, dass Tryptophan, aromatische und hydrophobe Reste in die Erkennung von Prolin-reichen Domänen eingebunden waren, sofern sie im Zusammenhang mit anderen Resten in WW-Typ-Domänen angemessen beabstandet waren (Macias et al. (1996), s.o., Chen et al. (1997), s.o.), untersuchten die Erfinder die PST-PIP-Sequenz auf diese Reste nahe W₂₃₂. Diese Untersuchung zeigte auf, dass W₂₃₂ 27 Aminosäuren sind, die C-terminal zu einem anderen Tryptophan an Position 205 liegen. Weiters scheinen auch ein Phenylalanin- (F₂₂₁) und Leucin- (L₂₂₄) Rest nahe dem W₂₃₂-Rest mit einem Abstand auf, der an das WW-Motiv erinnert (Andre et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 205(2), 1.201–1.205 (1994)). Wurden diese Reste jedoch zu Alanin mutiert, so wurde keine Auswirkung auf die PTP-HSCF-Bindung in vitro festgestellt (11). Während die Nebeneinanderstellung dieser zwei Tryptophanreste, zusammen mit der Einbindung von W₂₃₂ in die Erkennung des PTP-HSCF-Prolin-reichen Motivs, an das WW-Modul erinnert, so zeigt ein Vergleich der Region, die diese nahe beieinander liegenden Tryptophane enthält, mit der Consensus-Sequenz, die für die WW-Typ-Domänen beschrieben wurden (Andre et al. (1994), s.o.), dass der Großteil der konservierten Reste innerhalb des WW-Moduls in dieser Region von PST-PIP nicht aufzufinden sind (Daten nicht dargestellt). Weiters ist der Abstand der zwei Tryptophanreste in PST-PIP etwas länger als jener, der bei typischen WW-Typ-Motiven zu finden ist (27 Aminosäuren bei PST-PIP gegenüber ~ 22 Aminosäuren bei Consensus-WW-Domänen). Um sicherzustellen, dass Mutation die des maßgeblichen Tryptophans nicht zu einer umfassenden Auswirkung auf die Proteinfaltung führte, wie bei den Delta-50- und -75-Deletionsmutanten beobachtet wurde (10), wurde schließlich die W₂₃₂A-Mutante in CHO-Zellen transfiziert und mittels konfokaler Mikroskopie analysiert. Wie 10 zeigt, scheint dieses mutierte Protein mit dem kortikalen Actin-Zytoskelett auf eine Weise zu co-lokalisieren, die sich vom Wildtyp-Protein nicht unterscheiden lässt, was mit der Annahme übreinstimmt, dass die W₂₃₂A-Mutante in vivo korrekt gefaltet war. Diese Daten weisen so darauf hin, dass der Tryptophanrest 232 direkt in die Wechselwirkung zwischen PST-PIP und PTP-HSCF eingebunden sein kann. Da W₂₃₂ nicht in ein typisches WW-Modul eingebettet zu sein scheint (Andre et al. (1994), s.o.), lassen sie weiters darauf schließen, dass diese Region einen neuen Typ eines Protein-Protein-Erkennungsmotivs definiert.
Zuvor zeigten die Erfinder, dass PST-PIP Tyrosin-phosphoryliert war, sofern es mit v-Src-Tyrosinkinase cotransfiziert wurde (Spencer et al. (1997), s.o.). Darüber hinaus zeigten die Erfinder, dass dieses Tyrosin-phosphoryliertes PST-PIP ein Substrat zur Dephosphorylierung oder zum "Substratseinfangen" durch Wildtyp- bzw. dominante negative PTP-HSCF war und dass die erforderliche, Substrat einfangende Aktivität eine Wechselwirkung zwischen den zwei Proteinen war, die durch die C-terminale, Prolin-reiche Region des PTP vermittelt wird (Spencer et al. (1997), s.o.). Die Erfinder zeigten auch auf, dass (eine) endogene Tyrosinkinase(n) in der Lage war(en), Tyrosine innerhalb von PST-PIP sowohl in BaF3- als auch transfizierten COS-Zellen zu phosphorylieren, und dass endogene Tyrosinphosphatase(n) in der Lage war(en), diese Tyrosinreste zu dephosphorylieren. Weiters lassen erste, in 12 dargestellte Hinweise darauf schließen, dass die W₂₃₂A-Mutante effizienter phosphoryliert ist als das Wildtyp-PST-PIP in Gegenwart von v-Src. Um die Rolle des W₂₃₂-Rests in v-Src-induzierter Tyrosinphosphorylierung umfassender zu untersuchen, transfizierten die Erfinder konstante Mengen der Wildtyp- und W₂₃₂A-Mutantenformen von PST-PIP zusammen mit ansteigenden Mengen des v-Src-Expressionsplasmids in COS-Zellen und analysierten anschließend die Phosphotyrosin-Konzentrationen in immungefälltem PST-PIP. 15 zeigt, dass die W₂₃₂A-Mutantenform von PSTPIP, der es an Bindung zu PTP-HSCF mangelte, in Gegenwart von v-Src in vivo signifikant effizienter Tyrosin-phosphoryliert war als das PTP-bindende Wildtyp-Protein, was die anfänglichen, in 12 dargestellten Daten bestätigte. Diese Daten stimmen mit der Hypothese überein, dass PST-PIP dazu neigt, mit einem endogenen PTP vom PEST-Typ in COS-Zellen wechselzuwirken und dadurch dephosphoryliert zu werden, und der Verlust dieser Wechselwirkung, wie bei der W₂₃₂A-Mutante beobachtet wurde, führt in Gegenwart von v-Src zu verstärkter Tyrosinphosphorylierung des Proteins.
Diskussion
Die Bedeutung der Gesamtstruktur für die Ligandenerkennung durch die WW-Domäne wird durch Mutation des Prolins verstärkt, das C-terminal zum maßgeblichen Tryptophan-Erkennungsrest ist (Chen et al. (1997), s.o.). Die Mutation dieses Rests, der in allen WW-Motiven konserviert ist, zu Alanin führt zu einem inaktiven WW-Modul, wahrscheinlich aufgrund einer Störung der Faltung der Domäne. Die PST-PIP-poly-Prolin-Erkennungssequenz weist dieses hochkonservierte Prolin nicht auf (Spencer et al. (1997), s.o.), was mit der Möglichkeit übereinstimmt, dass andere Reste in dem Protein in die Bildung der Ligandenbindungsstelle eingebunden sein können. Von möglicher Bedeutung ist die Entdeckung, dass die Region, die die Poly-Prolin-Erkennungssequenz in PST-PIP enthält, eine Domäne ist, für die vorhergesagt wurde, dass sie eine Doppelwendel [31] bildet, und erste Daten lassen darauf schließen, dass dieser Bereich von PST-PIP Dimerisation vermittelt, eine für Doppelwendel enthaltendes Protein typische Eigenschaft. Dies, zusammen mit den Ergebnissen der Studien bezüglich N-terminaler Deletion, die in Beispiel 6 diskutiert wurden, lässt darauf schließen, dass die Gesamtfaltung dieser relativ ausgedehnten Domäne für die Bildung einer korrekt strukturierten Poly-Prolin-Erkennungsstelle maßgeblich sein könnte.
Während diese Ergebnisse darauf hinweisen, dass sich die PST-PIP-Poly-Prolin-Erkennungsdomäne in funktioneller und struktureller Hinsicht von den SH3- und WW-Modulen unterscheidet, ist eine interessante Verbindung zwischen diesen Bindungsmotiven die Inklusion eines entscheidenden Tryptophanrests in allen drei Domänen. Sowohl in SH3- als auch in WW-Motiven sind diese Tryptophane in allen Modulen konserviert, die bisher identifiziert werden konnten. Sowohl bei SH3- (Feng et al., Science 266, 1.241–1.247 (1994)) als auch bei WW- (Chen et al. (1997), s.o.) Motiven scheint das Tryptophan für die Wechselwirkung mit dem Prolin-reichen Peptid maßgeblich zu sein, da Mutation dieses Rests zu verminderter Bindung führt. Interessanterweise ist dies auch bei der Prolin-reichen PST-PIP-Erkennungsstelle der Fall, was mit der Möglichkeit im Einklang steht, dass Tryptophanreste zur Erkennung von poly-Prolin-reichen Domänen auf einzigartige Weise geeignet sind. Strukturelle Daten von SH3- und WW-Domänen bestätigen diese Hypothese. Im Fall der SH3-Domäne ist der konservierte Tryptophanrest in der Bindungstasche zu finden, und dieser Rest scheint durch Stapeln mit spiralförmig ausgerichteten Prolinen im Prolin-reichen Liganden wechselzuwirken (Feng et al. (1994), s.o.; Terasawa et al. (1994), s.o., Wittekind et al. (1997), s.o.). NMR-Analyse der WW-Domäne vom yes-Kinase-assoziierten Protein (YAP) (Sudol et al., J. Biol. Chem. 270(24), 14.733–14.741 (1995)) zeigt gleichfalls eine Wechselwirkung zwischen dem konservierten Tryptophanrest und Prolinen in der Prolin-Helix, die durch dieses Protein erkannt wird, obwohl es auch möglich ist, dass dieses konservierte Tryptophan in die Struktur der Bindungstasche eingebunden ist (Macias et al. (1996), s.o.; Chen et al. (1997), s.o.). Die Tatsache, dass Mutation eines einzelnen Tryptophans in der Doppelwendel-Region von PSTPIP sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Bindung an die Phosphatase unterbindet, steht im Einklang mit der Hypothese, dass dieser Tryptophanrest mit potentiell spiralförmig ausgerichteten Prolinen im C-Terminus der PEST-PTP ähnlich wechselwirken kann. Alternativ dazu ist es möglich, dass ein Umsetzen dieses hydrophoben Rests zu einem Alanin zu einer Fehlfaltung des Proteins führt. Dennoch ist es wahrscheinlich, sofern das mutierte W₂₃₂A-Protein nicht korrekt gefaltet ist, dass dies nur eine lokalisierte Störung ist, da das Protein noch immer in der Lage ist, mit dem Zytoskelett zu assoziieren, und in Gegenwart von transfiziertem v-Src oder des PTP-Inhibitors, Pervanadat, Tyrosin-phosphoryliert ist. Interessanterweise scheint das Tryptophan, das N-terminal zum maßgeblichen Tryptophan, das in die Bindung von PST-PIP an PTP-HSCF eingebunden ist, angeordnet ist, zur Ligandenerkennung nicht erforderlich zu sein, ein ähnliches Ergebnis wie jenes, das für das N-terminale Tryptophan der WW-Domäne in YAP gefunden wurde (Chen et al. (1997), s.o.). Während scheinbar zahlreiche andere Reste, insbesondere mit hydrophoben und aromatischen Seitenketten, in die Erkennung des Prolin-reichen Liganden sowohl in SH3- [10][8][9] und WW- (Macias et al. (1996), s.o.; Chen et al. (1997), s.o.) Domänen eingebunden sind, hat letztlich die Mutation zweier solcher Reste in PST-PIP (F₂₂₁ und L₂₂₄) keine signifikante Auswirkung auf die Bindung, was mit der Annahme übereinstimmt, dass sich die Poly-Prolin-Erkennungsdomäne von PST-PIP vom WW-Modul unterscheidet.
Die mögliche Bedeutung von W₂₃₂ in der Funktion von PST-PIP wird durch die Entdeckung unterstrichen, dass Expression der W₂₃₂A-Mutante in COS-Zellen zusammen mit der v-Src-Tyrosinkinase zu einer verstärkten Tyrosinphosphorylierung des Zytoskelett-assoziierten Proteins führt. Diese Daten stimmen mit der Hypothese überein, dass PST-PIP mit endogenen PTP in vivo wechselwirkt, und diese Wechselwirkung vermittelt das Entfernen von Phosphaten von Tyrosinresten. Weiters lassen diese Ergebnisse darauf schließen, da diese Mutation die Bindung von PTP-HSCF vom PEST-Typ über die C-terminale, Prolin-reiche Domäne blockiert, dass es möglich ist, dass PST-PIP mit einer oder mehreren endogenen Tyrosinphosphatasen vom PEST-Typ in COS-Zellen wechselwirkt. Die Frage bleibt jedoch aufrecht, warum die W₂₃₂A-Mutante in Abwesenheit von v-Src nicht wesentlich Tyrosin-phosphoryliert ist, da es wahrscheinlich ist, dass das Protein nicht in der Lage ist, endogene PTP vom PEST-Typ wirksam zu binden. Während eingewendet werden könnte, dass die geeignete Tyrosinkinase in COS-Zellen nicht vorhanden ist, zeigten die Erfinder bereits im Vorfeld, dass das Protein in Gegenwart von Vanadat, sowohl in seinem endogenen Zustand in BaF3-Zellen als auch, wenn es in COS-Zellen transfiziert wird (Spencer et al. (1997), s.o.), Tyrosin-phosphoryliert wird. Eine wahrscheinliche Erklärung für diese Daten ist, dass die Kinase, die PST-PIP phosphoryliert, ein Aktivierungsereignis wie Tyrosinphosphorylierung benötigt, um diese Modifikation zu vermitteln. So würde für v-Src, das eine grundlegend aktivierte Tyrosinkinase [33] ist, vorhergesagt werden, dass es die Tyrosinphosphorylierung der W₂₃₂A-Mutante in Abwesenheit von Vanadat vermittelt. Weiters lassen die Daten darauf schließen, dass Vanadat (eine) endogene Tyrosinkinase(n) aktivieren muss, wahrscheinlich durch Hemmen einer endogenen Tyrosinphosphatase (Jia et al. (1995), s.o.)), die in weiterer Folge die Tyrosinphosphorylierung von PST-PIP vermittelt.
BEISPIEL 8 – Mutationsanalyse von PTP-HSCF
Materialien und Verfahren
Mutagenese
Eincodon-Mutagenese zu Alanin wurde im Carboxy-Terminus von PTP-HSCF gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren und unter Verwendung der folgenden Primer (alle 5' → 3') durchgeführt:
Die R₄₄ + W₄₅₀-Doppelmutante wurde mittels des HSCF-W₄₅₀-Primers an einer Einzelstrang-Matrix der R₄₄₄-Mutantenphosphatase erzeugt. Die Mutanten wurden alle durch DNA-Sequenzieren bestätigt.
Die anderen Verfahren wurden wie in den obigen Beispielen beschrieben durchgeführt.
Ergebnisse
Um die Reste innerhalb der C-terminalen 20-Aminosäurenregion von PTP-HSCF, die für die PST-PIP-Bindung maßgeblich waren, zu analysieren, wurden 20-Aminosäure peptide, die Alanine getrennt an jeder Position eingebunden hatten, auf Blockieren der Wechselwirkung in vitro getestet. Zuvor zeigten die Erfinder bereits, dass ein 20-Aminosäuren-Peptid, abgeleitet von dieser Region der drei unterschiedlichen PTP vom PEST-Typ (Yang et al., J. Biol. Chem. 268(23), 17.650 (1993); Matthews et al. (1992), s.o.; Cheng et al. (1996), s.o.), in der Lage war, die Bindung einer in-vitrotranslatierten Form von PST-PIP an eine GST-Fusion von PTP-HSCF, die 149 C-terminale Aminosäuren enthält, umfassend die C-terminale, Prolin-reiche Bindungsstelle (GST-PTP-HSCF) (Spencer et al. (1997), s.o.), wirksam zu blockieren. 13 zeigt, dass Alaninersetzung von R₄₃₆, P₄₄₀, G₄₄₂, P₄₄₃, R₄₄₄, P₄₄₇ und W₄₅₀ jeweils in einem Peptid, das vom C-Terminus von PTP-HSCF abgeleitet war, zu einer verminderten Bindungshemmung durch die mutierten Peptide führte, während Alaninersetzung an anderen Stellen innerhalb des Peptids wenig oder gar keinen Einfluss auf die Fähigkeit dieser Peptide hatte, die Wechselwirkung in vitro zu blockieren. Wichtig ist anzumerken, dass diese Reste in allen C-Termini von PTP vom PEST-Typ konserviert sind (Yang et al. (1993), s.o.; Matthews et al. (1992), s.o.; Cheng et al. (1996), s.o.; Kim et al., Oncogene 13, 2.275–2.279 (1996)), was die früheren Daten (Spencer et al. (1997), s.o.) bestätigt, die zeigten, dass Peptide, die von anderen Mitgliedern dieser Phosphatase-Familie abgeleitet sind, alle diese Wechselwirkung wirksam blockierten (13). Um die Peptidmutationsanalyse zu bestätigen, wurde jeder Rest, für den bekannt war, dass er für PST-PIP-Bindung in der C-terminalen PTP-HSCF-Region maßgeblich ist, im Zusammenhang mit dem ganzen Protein zu Alanin mutiert, und die Fähigkeit jeder Mutanten-PTP, PST-PIP zu binden, wurde in vitro und in vivo analysiert. 14 zeigt, dass Mutanten der Phosphatase, die Alanine enthält, an allen der durch die Peptidkartierungsstudie vorhergesagten Positionen außer einer (P₄₄₃, 13) hinsichtlich des Bindens an GST-PST-PIP in den In-vitro-Bindungstests im Wesentlichen defizient waren, obwohl um das Zehnfache erhöhte Mengen an GST-PST-PIP mit den mutierten PTP-HSCF-Proteinen wechselwirken konnten, was auf einen nur teilweisen Verlust der Bindung schließen lässt. Weiters führte die Produktion einer doppelten Mutation in zwei der maßgeblichen Reste in dieser Region von PTP-HSCF (R₄₄₄ und W₄₅₀) zu einer stärkeren Hemmwirkung beim Binden an PST-PIP (14). In-vivo-Analyse dieser Punktmutanten zeigte bei den einzelnen Mutanten von PTP-HSCF nur eine bescheidene Wirkung auf die Bindung, was mit den In-vitro-Daten vereinbar ist, die annehmen lassen, dass ausreichend hohe Konzentrationen an PSTPIP mit den mutierten Proteinen wechselwirken könnten. Dennoch, wie auch in den In-vitro-Experimenten beobachtet wurde, wies die doppelt mutierte Form von PTP-HSCF (R₄₄₄ + W₄₅₀) eine ebenso bescheidene Wechselwirkung in vivo mit PST-PIP auf wie die Mutante, der die gesamte C-terminale, Prolin-reiche Domäne (PTP-HSCF D24) fehlte (Spencer et al. (1997), s.o.). Diese Daten bestätigen die Bedeutung dieser Reste für die Bindungswechselwirkung und weisen darauf hin, dass ein großer Anteil der C-terminalen Region von PTP-HSCF für höchste Affinitätsbindung an PST-PIP erforderlich sein kann.
Diskussion
Die Mutationsanalyse der Prolin-reichen Domäne von PTP-HSCF stimmt mit der Annahme überein, dass die PST-PIP-Bindungsstelle ein neues Poly-Prolin-Erkennungsmodul ist. Diese Daten zeigten, dass sich die Bindungsstelle in der Phosphatase scheinbar über eine Länge von etwa 15 Aminosäuren, von R₄₃₆ bis W₄₅₀, erstreckt. Dies steht im Gegensatz zu Strukturstudien an SH3- und WW-Domänen-Erkennungsstellen, in denen Mutagenese, Röntgenkristallographie und NMR-Analysen gezeigt haben, dass Spannen von 10–12 (Feng et al. (1994), s.o.; Terasawa et al. (1994), s.o.; Wittekind et al. (1997), s.o.) bzw. 6 (Macias et al. (1996), s.o.; Chen et al. (1997), s.o.) Resten für die höchste Affinitätswechselwirkung erforderlich sind. Während die PST-PIP-Poly-Prolin-Erkennungsdomäne, dadurch, dass es zwei relativ knapp beabstandete Tryptophane enthält, sehr stark wie das WW-Modul wirkt, wurde für die durch das WW-Motiv erkannten Liganden herausgefunden, dass sie die allgemeine Struktur XPPXY aufweist, wobei Proline und Tyrosin entscheidende Erkennungsfunktionen ausführen (Chen et al. (1995), s.o.; Einbond et al., FEBS Letts. 384, 1–8 (1996); Macias et al. (1996), s.o.; Pirozzi et al., J. Biol. Chem. 272(23), 14.611–14.616 (1997)). Die PTP-HSCF-Poly-Prolin-Region enthält zwei benachbarte Prolinreste, von denen einer, wie herausgefunden wurde, in die Bindung eingebunden ist, es gibt jedoch keinen Tyrosinrest, der C-terminal zum zweiten Prolin ist. Während diese Ergebnisse darauf schließen lassen, dass sich die Erkennung der PTP-HSCF-Poly-Prolin-Domäne durch PST-PIP sehr stark von den Mechanismen unterscheidet, die von SH3- und WW-Modulen eingesetzt werden, wurde eine erstaunliche Ähnlichkeit hinsichtlich der Einbindung von knapp beabstandeten Prolinresten herausgefunden. Ähnliche Anforderungen wurden für die Proline an SH3-Erkennungsstellen erfasst (Feng et al. (1994), s.o.), während Mutation dieser Reste an WW-Erkennungsstellen, die jedoch nicht quantitativ gemessen wurde, auch eine Auswirkung auf die Bindung zeigte (Chen et al. (1997), s.o.). Wiederum erklärt die Strukturanalyse von SH3- und WW-Modulen, die an ihre zugehörigen Liganden gebunden sind, die Rolle dieser Proline beim Binden. Bei beiden dieser Motive nimmt der Ligand eine poly-Prolin-spiralförmige Konformation vom Typ II an, die Wechselwirkungen zwischen Resten innerhalb der spiralförmigen Region und konservierten Seitenketten innerhalb der Erkennungsmodule ermöglicht (Feng et al. (1994), s.o., Feng et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA 92, 12.408–12.415 (1995)). Da die Mutation der Proline in der C-terminalen PST-PIP-Region eine Auswirkung auf die Bindung hatte, ist es wahrscheinlich, dass diese Region auch eine Prolin-Helix vom Typ II bildet, die die relevanten Seitenketten in der passenden Konformation anordnet. Weiters und im Gegensatz zu den SH3- und WW-Erkennungsmotiven scheint das Glycin, das innerhalb dieser Region enthalten ist, in die Bindung an PST-PIP eingebunden zu sein. Da Glycinreste auch Vermittler von Peptidstrukturen sind, ist es möglich, dass dieser Rest dazu dienen kann, diese kleine Region in eine geeignete Konformation zu falten, und es könnte diese hohe Konzentration an Struktur-induzierenden Resten sein, die es ermöglichen, dass dieses kleine Peptid sich so wirksam an PST-PIP bindet (Spencer et al. (1997), s.o.). Bezeichnenderweise zeigten Mutagenesestudien auch die Bedeutung von Nicht-Prolin-Resten in der Bindung von SH3- und WW-Motiven an Poly-Prolin-Liganden. Im Fall der WW-Domäne ist der konservierte Tyrosinrest des Liganden wichtig für die Wechselwirkung und stellt einen direkten Kontakt mit dem Bindungsmodul her (Macias et al. (1996), s.o.), während Aminosäuren in den N- oder C-terminalen Regionen der SH3-Erkennungsstelle die Ausrichtung und Affinität der Bindung der Peptidliganden bestimmen können (Feng et al. (1995), s.o.). Da Mutation der Arginine, die innerhalb des PTP-HSCF-C-Terminus enthalten waren, eine Auswirkung auf die Bindung hatten, ist es möglich, dass elektrostatische Wechselwirkungen in das Bindungsereignis eingebunden sind, wie für SH3-Erkennungsmodule beobachtet wurde (Feng et al. (1995), s.o.). Die Bedeutung von C-terminalem Tryptophan lässt auf mögliche hydrophobe Stapelungswechselwirkungen schließen, eventuell mit dem wichtigen Tryptophanrest in PST-PIP. Da diese in den Bindungsprozess eingebundenen Reste hoch konserviert sind (Cheng et al. (1996), s.o.), sind letztlich diese Daten mit vorherigen Studien völlig übereinstimmend, die zeigten, dass C-terminale, Prolin-reiche Peptide, abgeleitet von den C-Termini der verwandten PTP-Arten PEST, PEP (Spencer et al. (1997), s.o.) und BDP-1, die Wechselwirkung zwischen PTP-HSCF und PST-PIP wirksam blockieren.
M. Zusammenfassung
Die Erfinder isolierten ein neues Mitglied der Actin-bindenden Protein-Familie, PSTPIP, das sich über eine Wechselwirkung zwischen der Prolin-reichen, C-terminalen Homologiedomäne des PTP und der Doppelwendel-Domäne des wechselwirkenden Proteins an die PEST-Tyrosinphosphatase bindet. Wie zahlreiche andere Proteine, die mit dem Zytoskelett assoziiert sind, ist PSTPIP in V-src-transfizierten Zellen Tyrosin-phosphoryliert, und zumindest eine Teilmenge dieser phosphorylierten Reste scheinen Substrate für die katalytische Stelle des gebundenen PTP-HSCF zu sein. PSTPIP ist am kortikalen Zytoskelett sowie in Lamellipodien und an Spannungsfasern lokalisiert, und es scheint im Laufe der Zytokinese zur Actin-reichen Teilungsfurche zu wandern. Überexpression des Proteins in 3T3-Zellen umfasst lange Filopodien-Strukturen, was mit der Rolle von PSTPIP in der Reorganisation des Zytoskeletts übereinstimmt. Diese Daten zeigen, dass PSTPIP ein Zytoskelett-bindendes Protein ist, dessen physiologische Funktion teilweise durch den Grad seiner Tyrosinphosphorylierung reguliert ist.
Die Analyse der Proteindatenbanken für Sequenzen mit Homologie zu PSTPIP lässt auf potentielle Funktionen dieses neuen Proteins schließen. Der Großteil der Sequenzen mit signifikanter Homologie zu PSTPIP sind Mitglieder der Actin-bindenden Proteinfamilie, und aus den hierin erwähnten, konfokalen Studien geht eindeutig hervor, dass PSTPIP mit Actin wechselwirkt. Während zahlreiche andere Actin-bindende Proteine, umfassend Myosin, Fodrin und Spektrin, Homologie zu PSTPIP zeigen, liegt der Großteil dieser Homologien innerhalb der SH3-Domäne, wobei in anderen Regionen der Proteine nur wenige oder gar keine Homologien gefunden werden. Dies gilt auch für ein anderes Protein, das sich an das Actin-Zytoskelett auf ähnliche, jedoch nicht identische Weise bindet, für p80/85-Cortactin (Wu et al. (1991), s.o.), obwohl es hier schwache Homologie in einer kleinen Region der Doppelwendel-Domäne sowie der SH3-Region gibt. Dies steht im Gegensatz zum Protein mit dem höchsten Homologiegrad, der Hefe S. pombe cdc15p, die signifikante Sequenzkonservierung sowohl in der SH3- als auch in der Doppelwendel-Domäne aufweist (Fankhauser et al. (1995), s.o.). Cdc 15p ist ein hoch phosphoryliertes Protein, das zur Bildung des Actinrings an der Teilungsfurche der postmitotischen Zelle absolut erforderlich ist, und Mutationen in diesem Protein führen zur Unfähigkeit, den Actinring über dem postmitotischen Kern zusammenzufügen, was wiederum zu vielkernigen Zellen führt. Wie bei PSTPIP wird cdc 15p am kortikalen Actin-Zytoskelett bis zur Anaphase lokalisiert, wenn es über den postmitotischen Kern wandert und wahrscheinlich die Reorganisation des Zytoskeletts zur Spaltebene vermittelt (Fankhauser et al. (1995), s.o.; Chang et al., Cell 84, 191–194 (1996), und Simanis, Sem. in Cell Biol. 6, 79–87 (1995)). Während es den genauen Zeitpunkt für die PSTPIP-Migration zur Teilungsfurche noch zu bestimmen gilt, ist seine beeindruckende Co-Lokalisierung mit dem Actinring an dieser Stelle während der Zytokinese analog dazu, was für cdc 15p beobachtet wurde (Fankhauser et al. (1995), s.o.). Darüber hinaus wird das cdc 15p bis zum Beginn der Anaphase und der Bildung des zytokinetischen F-Actin-Teilungsrings hyperphosphoryliert, wo es dann signifikant dephosphoryliert wird. Interessanterweise gewinnt das Hefeprotein seinen hohen Phosphorylierungs-Grad beim Abschluss der Zellteilung wieder, was darauf schließen lässt, dass Phosphorylierung seine Assoziierung mit der Teilungs furche reguliert. Wenn auch der Phosphorylierungs-Typ für cdc 15p bisher noch nicht analysiert wurde, lässt dies darauf schließen, dass Tyrosin- und/oder Serin-Threonin-Phosphatasen in die Regulierung der Funktion von cdc 15p eingebunden sein müssen, und liefert einen Mechanismus, in dem die Bindung und katalytische Aktivität eines PTP wie PTP-HSCF als Zytokinesekontrolle fungieren kann. Wenn auch der genaue Zeitpunkt von Tyrosinphosphorylierung von PSTPIP während des Zellzyklus noch nicht bestimmt wurde, lassen wiederum die exakte Konservierung von 5 Tyrosinresten zwischen PSTPIP und cdc 15p sowie die Vanadat-empfindliche Tyrosinphosphorylierung von endogenem PTP-wechselwirkendem Protein in Baf3-Zellen darauf schließen, dass sie Phosphotyrosin-Konzentrationen während des Zellzyklus modulieren können. So weisen die Sequenz, die zelluläre Lokalisierung und Phosphorylierung von PSTPIP und cdc15 darauf hin, dass das Säugetierprotein ein potentielles Homolog von cdc 15p ist.
Es wurde im Vorfeld der Erfindung gezeigt, dass Phosphorylierung, insbesondere von Serin- und Threoninresten, eine wichtige Rolle bei Regulationsereignissen bei Zytokinese und Reorganisation des Zytoskeletts spielt (Yamakita et al., J. Cell Biol. 124, 129–137 (1994), Egelhoff et al., Cell 75, 363–371 (1993), und Fishkind et al. (1995), s.o.). Bis heute wurde jedoch die Möglichkeit, dass Tyrosinphosphorylierung eine Rolle in diesen Funktionen spielen könnte, unvollständig untersucht. Die in dieser Ausführung angeführten Daten zeigen, dass die Regulierung von Tyrosinphosphorylierung an PSTPIP durch PTP-HSCF in Aspekten der Zytoskelettkontrolle, möglicherweise Zytokinese umfassend, eine gewisse Rolle spielen kann. Während die möglichen Kinasen, die in solche Phosphorylierung eingebunden sind, zahlreich sind, lassen die hierin und auch anderswo beschriebenen Informationen darauf schließen, dass ein Mitglied der Src-Familie von Tyrosinkinasen in die Phosphorylierung dieses wechselwirkenden Proteins entweder durch direkte oder durch indirekte Mechanismen eingebunden sein kann. Zwei andere PSTPIP-verwandte Proteine, p80/85-Cortactin und das HS1-Protein, sind beide dafür bekannt, dass sie in V-src-transformierten Zellen Tyrosin-phosphoryliert sind, und Cortactin ist dafür bekannt, mit dem Zytoskelett auf eine ähnliche Weise wie PSTPIP wechselzuwirken (Wu et al. (1991), s.o.). Weiters ist eine Vielzahl anderer Proteine, die in das Zytoskelett eingebunden sind, in V-src-transformierten Zellen ebenfalls Tyrosinphosphoryliert (Schaller et al., Prog. Nuc. Acid Res. and Mol. Biol. 44, 205–227 (1993)). Interessanterweise wird auch die Tyrosinphosphorylierung von Cortactin in Zellen enorm verstärkt, die von Mäusen isoliert wurden, denen die Csk-Kinase fehlte (Thomas et al. (1995), s.o.), eine Tyrosinkinase, die das C-terminale Hemmtyrosin an C-src phosphoryliert, was darauf schließen lässt, dass Cortactin entweder ein direktes oder ein indirektes C-src-Substrat in vivo ist. Weiters wurde gezeigt, dass sich HS1 an die SH3- und SH2-Domänen von Src in vitro binden kann und dass es auch, sowohl in vitro als auch in vivo, durch diese Kinase Tyrosin-phosphoryliert wird (Takemoto et al. (1996), s.o.). Obwohl es mit Cortactin und HS1 nur entfernt verwandt ist, kann daher die Tyrosinphosphorylierung von PSTPIP durch V-src in transfizierten Zellen von physiologischer Bedeutung sein.
Weiters zeigten bisherige Daten, dass C-src mit den fokalen Adhäsionen und Lamellipodien sowie anderen Actin-hältigen Stellen assoziiert, was mit der Möglichkeit übereinstimmt, dass es PSTPIP phosphorylieren könnte, das sich auch auf diese Regionen lokalisiert (Kaplan et al. (1994), s.o.). Schließlich ist V-src dafür bekannt, in transformierten Zellen Veränderungen im Zytoskelett hervorzurufen, und es wurde ganz eindeutig gezeigt, dass Cortactin, ein Actin-bindendes Protein, von den Enden der Spannungsfasern bis hin zu den Podosomen dieser Src-transformierten Zellen umgeordnet wird, was auf die Möglichkeit schließen lässt, dass Phosphorylierung solcher Actin-bindenden Proteine Änderungen in ihrer zellulären Lokalisierung vermitteln könnten (Wu et al. (1991), s.o.).
Die Verwendung dominanter negativer Formen von PTP wurde zuvor eingesetzt, um Substrate für mehrere Enzyme, vor allem für PTP-PEST (Garton et al. (1996), s.o.) und das Wendel-PTP (SH PTP-2) (Herbst et al. (1996), s.o.) zu identifizieren. Im Allgemeinen haben diese Studien gezeigt, dass diese dominanten negativen Mutanten die Tyrosinphosphorylierung einer erstaunlich begrenzten Anzahl an Substraten in vivo, im Gegensatz zu dem relativ vermischten Verhalten dieser Enzyme in vitro, verstärken. Die hierin präsentierte Darstellung, dass Co-Expression von zwei unterschiedlichen, dominanten negativen Formen von PTP-HSCF eine drastische Steigerung der V-src-induzierten PSTPIP-Tyrosinphosphorylierung vermittelt, ist somit mit mehreren Schlussfolgerungen übereinstimmend. Die erste davon ist, dass diese zwei Proteine in vivo eng miteinander wechselwirken, eventuell durch die Wechselwirkung zwischen der C-terminalen Homologiedomäne und der Doppelwendel-Region, die durch die In-vitro-Bindungsstudien bestimmt wurde, und die Co-Präzipitationsanalyse (6) unterstützt solch eine physikalische Wechselwirkung. Dies liefert noch ein weiteres Beispiel für den Einsatz einer nicht katalytischen Region durch ein PTP, um die katalytische Domäne sehr nahe an das Substrat zu bringen, wobei der in diesem Fall eingesetzte Bindungsmechanismus neu ist (Tonks (1993), s.o.). Die zweite Schlussfolgerung ist, dass es wahrscheinlich ist, dass Tyrosin-phosphoryliertes PSTPIP ein In-vivo-Substrat für das PTP-HSCF ist, und dies lässt darauf schließen, dass das durch Vanadat gehemmte Enzym im endogenen Phosphotyrosin-Experiment in Baf3-Zellen, wo sowohl PSTPIP als auch PTP-HSCF exprimiert werden, wahrscheinlich PTP-HSCF ist. Schließlich nehmen die Erfinder an, dass die mutierten Formen von PTP-HSCF denselben Grad an Substratspezifität in sich tragen, wie dies für andere dominante negative PTP herausgefunden wurde, und die V-src-Cotransfektion-Studien weisen weiters darauf hin, dass entweder Src oder ein verwandtes Familienmitglied eine Kinase sein kann, die in die Tyrosinphosphorylierung von PSTPIP in vivo in nicht transfizierten Zellen eingebunden ist.
Die Beschaffenheit der Bindung mit hoher Affinität zwischen der Prolin-reichen, C-terminalen Homologiedomäne und der Doppelwendel-Region erinnert an die vorangehende Beschreibung der Wechselwirkung zwischen SH3 und dem Prolinreichen Kern (Pawson (1995), s.o.). In diesem letztgenannten Fall induzieren Prolinhelices die Bildung von hochstrukturierten, kleinen Peptiddomänen, die sich mit relativ hoher Affinität und Spezifität an die Bindungstaschen der SH3-Domäne binden, und verschiedene Wechselwirkungen, Salzbrücken umfassend, vermitteln die Spezifität und Ausrichtung von Peptidbindungen (Feng. et al. (1995), s.o.). Die Analyse der Prolin-reichen, C-terminalen Homologiedomänen der drei PEST-PTP, die alle die PSTPIP-PTP-HSCF-Bindungswechselwirkung mit ähnlichen IC₅₀ zu hemmen scheinen, zeigt, dass sie eine Prolin-reiche Kernregion teilen, von der vorhergesagt werden würde, dass sie eine Prolin-Helix bildet, die jener ähnlich ist, die für SH3-Bindungsstellen gesehen wurden (Yang et al. (1993), s.o., Matthews et al. (1992), s.o., und Cheng et al. (1996), s.o.). Diese Region enthält zahlreiche geladene Reste, und es ist möglich, dass die potentielle spiralförmige Beschaffenheit dieser Domänpositionen diese Reste in einer für die Wechselwirkung mit einer Stelle innerhalb der Doppelwendel-Domäne geeigneten Bindungskonformation anordnet. Da von allen PEST-PTP angenommen wird, dass sie sich an PSTPIP über diese Prolin-reiche Region binden, ist es möglich, dass der Phosphotyrosingehalt vom wechselwirkenden Protein durch unterschiedliche PEST-PTP in unterschiedlichen Zelltypen moduliert wird. Hierbei ist es interessant anzumerken, dass das einzige hyperphosphorylierte Protein, das in COS-Zellen, die mit dominanten negativen (D-A)-PTP-PEST transfiziert waren, beobachtet wurde, p130^CAS war (Garton et al. (1996), s.o.). Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass, sofern PSTPIP in COS-Zellen exprimiert wird, es entweder nicht Tyrosin-phosphoryliert oder kein Substrat für dieses PTP in dieser Zelllinie ist. Über den Mechanismus, durch den PSTPIP von den kortikalen Actin-, Lamellipodien- und Spannungsfaserregionen in ruhenden Zellen zur zytokinetischen Teilungsfurche in sich teilenden Zellen wandert, kann nur gemutmaßt werden (Strome, Cell 72, 3–6 (1993)). Eine Möglichkeit ist, dass sich dieses Protein eng an Actin bindet, und wird das Actin an der Teilungsebene umgeordnet, so begleitet es das PSTPIP passiv (Cao et al. (1990a), s.o.; Cao et al. (1990b), s.o., und Fishkind (1993), s.o.). Experimente an Hefe, in der cdc 15p deletiert war, zeigten jedoch, dass kortikales Actin in Abwesenheit dieses Proteins nicht zur Teilungsebene wanderte, was darauf schließen lässt, dass cdc 15p aktiv zu dieser Stelle übergeht und die Anordnung des Actinrings vermittelt (Simanis (1995), s.o.). Diese Daten weisen somit darauf hin, dass, sofern PSTPIP ein Säugetierhomolog von cdc 15p ist, diese dominanten negativen Mutanten in diesem Protein die Anordnung von Actin an der Teilungsfurche aufheben sollten. Interessanterweise ist die Deletionsmutante von cdc 15p, der die SH3-Domäne fehlt, anscheinend nicht in der Lage, die cdc 15-Mutanten wiederzugewinnen, was auf eine maßgebliche Rolle dieser C-terminalen Domäne beim Anordnen des zytokinetischen Actinrings schließen lässt (Fankhauser et al. (1995), s.o.).
Auf einen möglichen Mechanismus, durch den PSTPIP funktioniert, lassen die Ergebnisse von Überexpressions-Studien an Mäuse-3T3-Zellen schließen. Die verlängerten Filopodienstrukturen in zahlreichen dieser transfizierten Zellen stimmen sich mit der Möglichkeit überein, dass die unregulierte Expression des Proteins eine ektopische und organisierte Anordnung der Actinfilamente vermittelt, was zu einer zellulären Protrusion führt, die PSTPIP und F-Actin enthält. In dieser Hinsicht stimmt die erstaunliche Konzentration an Lysinen in der vorhergesagten Doppelwendel-Domäne dieses Proteins mit zuvor beschriebenen Actin-Bindungsstellen überein (Vandekerckhove, Curr. Opin. Cell Biol. 2, 41–50 (1990), und Friederich et al., Cell 70, 81–92 (1992)). Interessanterweise enthielten zahlreiche der transfizierten Zellen eine einzelne, Filopodien-artige Struktur, was darauf schließen lässt, dass diese morphologische Eigenschaft rasch entwickelt wurde und so wahrscheinlich einen negativen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zelle hat. Die augenscheinlich kleine Größe zahlreicher dieser Zellen lässt darauf schließen, dass dieser Actin-hältige Stachel ohne Plasmamembransynthese gebildet wird, was auch mit einer raschen Bildung der Struktur stimmig ist. Die offensichtliche Heterogenität der Penetranz dieser morphologischen Einheit kann entweder auf den Expressionsgrad oder auf Unterschiede in post-translationalen Modifikationen der transfizierten Proteine zurückzuführen sein. So mag es scheinen, dass PSTPIP in der raschen Anordnung einer hochorganisierten, F-Actin-hältigen Struktur eine Rolle spielen kann.
BEISPIEL 9 – Expression von PSTPIP in E. coli
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung einer nicht glykosylierten Form von PSTPIP durch rekombinante Expression in E. coli.
Die für PSTPIP kodierende DNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) wird anfänglich mittels ausgewählter PCR-Primer amplifiziert. Die Primer sollten Restriktionsenzymstellen umfassen, die den Restriktionsenzymstellen am ausgewählten Expressionsvektor entsprechen. Es können zahlreiche Expressionsvektoren eingesetzt werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Vektor ist pBR322 (abgeleitet von E. coli; siehe Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)), der Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält. Der Vektor wird mit Restriktionsenzym verdaut und dephosphoryliert. Die PCR-amplifizierte Sequenzen werden dann in den Vektor ligiert. Der Vektor umfasst vorzugsweise Sequenzen, die für ein antibiotisches Resistenzgen kodieren, einen trp-Promotor, einen Polyhis-Leader (umfassend die ersten sechs STII-Codons, die Polyhis-Sequenz und die Enterokinase-Spaltungsstelle), die PSTPIP-kodierende Region, Lambda-Transkriptions-Terminator und ein argU-Gen.
Das Ligationsgemisch wird dann eingesetzt, um einen ausgewählten E.-coli-Stamm unter Verwendung der in Sambrook et al., s.o., beschriebenen Verfahren zu transformieren. Transformanten werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, auf LB-Platten zu wachsen, und anschließend werden Antibiotika-resistente Kolonien ausgewählt. Plasmid-DNA kann isoliert und durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzieren bestätigt werden.
Selektierte Klone können über Nacht in flüssigem Nährmedium wie LB-Lösung, ergänzt durch Antibiotika, gezüchtet werden. Die Übernacht-Kultur kann in weiterer Folge eingesetzt werden, um eine größere Kultur zu beimpfen. Die Zellen werden dann auf eine erwünschte optische Dichte gezüchtet, währenddessen der Expressionspromotor angeschaltet ist.
Nach dem Kultivieren der Zellen über mehrere weitere Stunden können die Zellen durch Zentrifugieren geerntet werden. Das durch Zentrifugieren erhaltene Zellpellet kann unter Einsatz verschiedener, auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Mittel löslich gemacht werden, und das löslich gemachte PSTPIP-Protein kann dann mittels einer Metallchelatsäule unter Bedingungen gereinigt werden, die eine enge Bindung des Proteins ermöglichen.
BEISPIEL 10 – Expression von PSTPIP in Säugetierzellen
Dieses Beispiel illustriert die Herstellung einer glykosylierten Form von PSTPIP durch Rekombinationsexpression in Säugetierzellen.
Der Vektor, pRK5 (siehe die EP 307.247 , veröffentlicht am 15. März 1989), wird als Expressionsvektor eingesetzt. Gegebenenfalls ist die PSTPIP-DNA in pRK5 mit ausgewählten Restriktionsenzymen ligiert, um die Insertion der PSTPIP-DNA mittels Ligationsverfahren, wie sie in Sambrook et al., s.o., beschrieben werden, zu ermöglichen. Der resultierende Vektor wird pRK5-PSTPIP genannt.
In einer Ausführungsform können die ausgewählten Wirtszellen 293-Zellen sein. Menschliche 293-Zellen (ATCC CCL 1573) werden bis zur Konfluenz auf Gewebskulturplatten in einem Medium wie DMEM, ergänzt mit fötalem Kälberserum und gegebenenfalls mit Nährkomponenten und/oder Antibiotika, gezüchtet. Etwa 10 μg pRK5-PSTPIP-DNA wird mit etwa 1 μg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert [Thimmappaya et al., Cell 31, 543 (1982)], vermischt und in 500 μl von 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl₂ gelöst. Diesem Gemisch werden tropfenweise 500 μl von 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaPO₄ zugesetzt, und ein Präzipitat wird 10 Minuten lang bei 25°C bilden gelassen. Das Präzipitat wird suspendiert, den 293-Zellen zugesetzt und vier Stunden lang bei 37°C absetzen gelassen. Das Nährmedium wird abgesaugt, und 2 ml von 20%igem Glycerin in PBS werden innerhalb von 30 Sekunden zugesetzt. Die 293-Zellen werden dann mit serumfreiem Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und die Zellen werden etwa 5 Tage lang inkubiert.
Etwa 24 Stunden nach den Transfektionen wird das Nährmedium entfernt und durch Nährmedium (alleine) oder Nährmedium mit 200 μCi/ml ³⁵S-Cystein und 200 μCi/ml ³⁵S-Methionin ersetzt. Nach 12 Stunden Inkubation wird das konditionierte Medium gesammelt, auf einem rotierenden Filter konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel gegeben. Das verarbeitete Gel kann getrocknet und für eine ausgewählte Zeitspanne einem Film ausgesetzt werden, um die Gegenwart von PSTPIP-Polypeptid zu zeigen. Die die transfizierten Zellen enthaltenden Kulturen können (in serumfreien Medium) weitere Inkubation erfahren, und das Medium wird in ausgewählten Biotests getestet.
Bei einem alternativen Verfahren kann PSTPIP unter Einsatz des Dextransulfatverfahrens, beschrieben von Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12, 7.575 (1981), vorübergehend in 293-Zellen eingeführt werden. 293-Zellen werden bis zur maximalen Dichte in einem Drehkolben gezüchtet, und 700 μg pRKS-PSTPIP-DNA werden zugesetzt. Die Zellen werden zuerst aus dem Drehkolben durch Zentrifugation konzentriert und mit PBS gewaschen. Das DNA-Dextran-Präzipitat wird am Zellpellet vier Stunden lang inkubiert. Die Zellen werden mit 20%igem Glycerin 90 Sekunden lang behandelt, mit Gewebsnährmedium gewaschen und wieder in den Drehkolben, der das Gewebsnährmedium, 5 μg/ml Rinderinsulin und 0,1 μg/ml Rindertransferrin enthält, eingeführt. Nach etwa vier Tagen wird das konditionierte Medium zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Die exprimiertes PSTPIP enthaltende Probe kann dann durch jedes beliebige, ausgewählte Verfahren wie Dialyse und/oder Säulenchromatographie konzentriert und gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann PSTPIP in CHO-Zellen exprimiert werden. Das pRK5-PSTPIP kann in CHO-Zellen mittels bekannter Reagenzien wie CaPO₄ oder DEAE-Dextran transfiziert werden. Wie zuvor beschrieben können die Zellkulturen inkubiert werden, und das Medium kann durch Nährmedium (alleine) oder Medium mit einer radioaktiven Markierung wie ³⁵S-Methionin ersetzt werden. Nach Bestimmen der Gegenwart von PSTPIP-Polypeptid kann das Nährmedium durch serumfreies Medium ersetzt werden. Vorzugsweise werden die Kulturen etwa 6 Tage lang inkubiert, und dann wird das konditionierte Medium geerntet. Das das exprimierte PSTPIP enthaltende Medium kann dann mittels jedes beliebig ausgewählten Verfahrens konzentriert und gereinigt werden.
Epitop-markiertes PSTPIP kann auch in Wirts-CHO-Zellen exprimiert werden. Das PSTPIP kann aus dem pRK5-Vektor heraus subkloniert werden. Das Subklon-Insert kann PCR unterzogen werden, um im Raster mit einer ausgewählten Epitopmarkierung wie einer Poly-His-Markierung in einen Baculovirus-Expressionsvektor zu fusionieren. Das poly-His-markierte PSTPIP-Insert kann dann in einen von SV40 angetriebenen Vektor, der einen Selektionsmarker wie DHFR zur Selektion stabiler Klone enthält, subkloniert werden. Schließlich können die CHO-Zellen mit dem von SV40 angetriebenen Vektor transfiziert werden (wie oben beschrieben). Markieren kann wie zuvor beschrieben durchgeführt werden, um Expression zu überprüfen. Das das poly-His-markierte PSTPIP enthaltende Nährmedium kann anschließend mittels jedes beliebig ausgewählten Verfahrens wie Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie konzentriert und gereinigt werden.
BEISPIEL 11 – Expression von PSTPIP in Hefe
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PSTPIP in Hefe.
Zuerst werden Hefe-Expressionsvektoren zur intrazellulären Produktion oder Sekretion von PSTPIP vom ADH2/GAPDH-Promotor konstruiert. DNA, die für PSTPIP, ein ausgewähltes Signalpeptid und den Promotor kodiert, wird in geeignete Restriktionsenzymstellen im ausgewählten Plasmid eingeführt, um intrazelluläre Expression von PSTPIP zu leiten. Zur Sekretion kann für PSTPIP kodierende DNA in das ausgewählte Plasmid gemeinsam mit DNA, die für den ADH2/GAPDH-Promotor, die Hefe-Alphafaktor-Sekretionssignal-/Leader-Sequenz und Linker-Sequenzen (sofern erforderlich) zur Expression von PSTPIP kodiert, kloniert werden.
Hefezellen wie Hefestamm AB110 können dann mit den zuvor beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in ausgewählten Fermentationsmedien kulti viert werden. Die transformierten Hefeüberstände können durch Ausfällung mit 10%iger Trichloressigsäure und Trennung durch SDS-PAGE, gefolgt von Färben der Gele mit Coomassie-Blau, analysiert werden.
Rekombinantes PSTPIP kann in Folge durch Entfernen der Hefezellen aus dem Fermentationsmedium durch Zentrifugieren und anschließendes Konzentrieren des Mediums unter Einsatz ausgewählter Patronenfilter isoliert und gereinigt werden. Das PSTPIP enthaltende Konzentrat kann weiters unter Einsatz von Säulenchromatographieharzen gereinigt werden.
BEISPIEL 12 – Expression von PSTPIP in Baculovirus
Das folgende Verfahren beschreibt rekombinante Expression von PSTPIP in Baculovirus.
Das PSTPIP wird stromauf einer Epitopmarkierung, die in einem Baculovirus-Expressionsvektor enthalten ist, fusioniert. Solche Epitopmarkierungen umfassen poly-His-Markierungen und Immunglobulinmarkierungen (wie Fc-Regionen von IgG). Zahlreiche Plasmide können eingesetzt werden, umfassend Plasmide, die von im Handel erhältlichen Plasmiden wie pVL1393 (Novagen) abgeleitet sind. Kurz zusammengefasst wird das PSTPIP oder der erwünschte Abschnitt des PSTPIP (wie die für die extrazelluläre Domäne eines Transmembranproteins kodierende Sequenz) durch PCR mit Primern amplifiziert, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind. Die 5'-Primer können flankierende (ausgewählte) Restriktionsenzymstellen inkorporieren. Das Produkt wird dann mit jenen ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den Expressionsvektor subkloniert.
Rekombinantes Baculovirus wird durch Cotransfizieren des obigen Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen) in Spodoptera-frugiperda- ("Sf9"-) Zellen (ATCC CRL 1711) unter Einsatz von Lipofectin (im Handel bei GIBCO-BRL erhältlich) erzeugt. Nach 4 bis 5 Tagen Inkubation bei 28°C werden die freigesetzten Viren geerntet und zu weiteren Amplifikationen eingesetzt. Virale Infektion und Proteinexpression werden wie in O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford, Oxford University Press (1994), beschrieben durchgeführt.
Exprimiertes, poly-His-markiertes PSTPIP kann dann beispielsweise durch Ni²⁺-Chelataffinitätschromatographie wie folgt gereinigt werden. Extrakte werden aus rekombinanten, virus-infizierten Sf9-Zellen, wie von Rupert et al, Nature 362, 175–179 (1993), beschrieben, hergestellt. Kurz beschrieben werden Sf9-Zellen gewaschen, in Beschallungspuffer (25 ml HEPES, pH 7,9; 12,5 mM MgCl₂; 0,1 mM EDTA; 10% Glycerin, 0,1% NP-40; 0,4 M KCl) resuspendiert und zweimal 20 Sekunden lang auf Eis beschallt. Die beschallten Produkte werden durch Zentrifugation geklärt, und der Überstand wird in Ladepuffer (50 mM Phosphat, 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 7,8) 50fach verdünnt und durch einen 0,45-μm-Filter filtriert. Eine Ni²⁺-NTA-Agarosesäule (im Handel bei Quiagen erhältlich) wird mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt, mit 25 ml Wasser gewaschen und mit 25 ml Ladepuffer äquilibriert. Der filtrierte Zellextrakt wird mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute auf die Säule geladen. Die Säule wird zur Basislinie A₂₈₀ mit Ladepuffer gewaschen, ein Punkt, an dem die Fraktionensammlung begonnen wird. Weiters wird die Säule mit einem sekundären Waschpuffer (50 mM Phosphat; 300 mM NaCl, 10% Glycerin, pH 6,0) gewaschen, der nicht spezifisch gebundenes Protein eluiert. Nachdem die A₂₈₀-Basislinie wieder erreicht wurde, wird die Säule mit einem 0- bis 500-mM-Imidazolgradienten im sekundären Waschpuffer entwickelt. 1-ml-Fraktionen werden gesammelt und durch SDS-PAGE und Silberfärbung oder Western-Blot mit Ni²⁺-NTA, konjugiert an alkalische Phosphatase (Quiagen), analysiert. Fraktionen, die das eluierte His₁₀-markierte PSTPIP enthalten, werden gesammelt und gegen Ladepuffer dialysiert.
Alternativ dazu kann die Reinigung des IgG-markierten (oder Fc-markierten) PSTPIP unter Einsatz bekannter Chromatographie-Verfahren, umfassend beispielsweise Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
N. Abschließende Bemerkungen:
Die obige Beschreibung erläutert spezifische Verfahren, die eingesetzt werden können, um die vorliegende Erfindung in die Praxis umzusetzen. Auch nach dieser detaillierten Beschreibung solcher spezifischen Verfahren wird Fachleuten bekannt sein, wie sie alternative und zuverlässige Verfahren gestalten können, um mit Hilfe der Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung dieselben Informationen zu erhalten. Sind die obigen Erläuterungen auch in Textform festgehalten, dürfen sie nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung betrachtet werden; der Umfang der vorliegenden Erfindung ist nur durch die rechtmäßige Auslegung der beiliegenden Ansprüche zu bestimmen. Alle hierin zitierten Dokumente sind hierin durch Verweis ausdrücklich aufgenommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes PSTPIP-Polypeptid, ausgewählt aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe: (i) einem Polypeptid, das die in 1A gezeigte Aminosäuresequenz des PSTPIP-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 1) umfasst; und (ii) einem Polypeptid mit zumindest 65% Sequenzhomologie mit der PSTPIP-Aminosäuresequenz aus 1A (Seq.-ID Nr. 1); mit der Maßgabe, dass die Polypeptide gemäß (i) und (ii) die Fähigkeit beibehalten, an zumindest einem Tyrosinrest durch eine hämopoetische Protein-Tyrosin-Phosphatase-Stammzellenfraktion (PTP-HSCF) dephosphoryliert zu werden.
PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1 mit zumindest 85% Sequenzhomologie mit der PSTPIP-Aminosäuresequenz aus 1A (Seq.-ID Nr. 1).
PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz des in 1A gezeigten PSTPIP-Polypeptids (Seq.-ID Nr. 1) umfasst.
PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1, das keine C-terminale SH3-Domäne aufweist.
PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1, das nicht phosphoryliert ist.
PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1, das an zumindest einem Tyrosinrest phosphoryliert ist.
PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1, das mit Actin assoziiert.
Isolierte Nucleinsäuresequenz, die für ein PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Vektor, umfassend eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 8, die operabel mit Kontrollsequenzen verbunden ist, die von einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, die eine Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 8 umfasst.
Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 9 umfasst.
Antikörper, der zur spezifischen Bindung an ein PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1 fähig ist.
Antikörper nach Anspruch 12, der detektierbar markiert ist.
Antikörper nach Anspruch 12, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Hybridomzelllinie, die einen Antikörper nach Anspruch 12 produziert.
Verfahren zur Herstellung eines PSTPIP-Polypeptids nach Anspruch 1, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit für das Polypeptid kodierender Nucleinsäure, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur.
In-vitro-Verfahren zur Induktion der Polymerisation von Actinmonomeren in einer eukaryotischen Zelle, umfassend das Einführen eines PSTPIP-Polypeptids nach Anspruch 1 in die Zelle.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 17, worin der Schritt des Einführens das Einführen eines Vektors nach Anspruch 10 in die Zelle umfasst.
Test zur Identifikation eines Antagonisten oder Agonisten für ein PSTPIP-Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend das Kontaktieren eines PSTPIP-Polypeptids nach Anspruch 1 mit einem vermutlichen Antagonisten oder Agonisten und das Überwachen der Fähigkeit des Polypeptids, die Polymerisation von Actinmonomeren zu induzieren.