DE69735716T2

DE69735716T2 - Kappa/mu ähnliche proteintyrosinphosphatase, proteintyrosinphosphatase lambda

Info

Publication number: DE69735716T2
Application number: DE69735716T
Authority: DE
Inventors: Jill Burlingame CHENG; A. Laurence Sausalito LASKY
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2017-05-23
Also published as: DE69735716D1; US5928887A; US5814507A; WO1997044458A1; PT912733E; JPH11511033A; DK0912733T3; JP3587857B2; ATE323764T1; US5976852A; AU722949B2; CA2253431A1; IL127108A0; EP0912733A1; ES2263177T3; ZA974526B; US6083748A; AU3217197A; EP0912733B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese vorliegende Erfindung betrifft neue Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-Polypeptide. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase, die hierin als PTP λ bezeichnet wird.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Außerordentlich viele zelluläre Prozesse werden durch die Tyrosinphosphorylierung zahlreicher verschiedener Proteine reguliert. Tyrosinphosphorylierung wird durch äußerst viele rezeptorähnliche Moleküle sowie durch zahlreiche intrazelluläre Enzyme induziert. Die Wirkungen von Tyrosinphosphorylierung sind zahlreich, und sie modulieren einen breiten Bereich an Entwicklungs- und anderen zellulären Vorgängen. Natürlich wird die Bedeutung von Tyrosinphosphorylierung durch den Bedarf an Mechanismen unterstrichen, die die Niveaus dieser Ereignisse sorgfältig regulieren. Somit weisen Proteintyrosinkinasen positive Mediatoren von Tyrosinphosphorylierung auf, während Proteintyrosinphosphatasen (PTPs) die Entfernung von Phosphat von Tyrosin induzieren. Das Gleichgewicht der Niveaus von Tyrosinphosphat wird somit durch die relativen Aktivitäten dieser zwei Typen an Enzymen vermittelt. Es ist daher verständlich, dass die Mechanismen, die Zellfunktion über Tyrosinphosphorylierung regulieren, spezifische Proteine benötigen, die sowohl die Hinaufregulierung als auch die Herabregulierung der Konzentrationen dieser modifizierten Aminosäure vermitteln.
PTPs stellen eine wachsende Familie von Enzymen dar, die sowohl in Rezeptor- als auch in Nicht-Rezeptor-Formen zu finden sind (Tonks, Semin. Cell. Biol. 4, 373–453 (1993); Walton et al., Ann. Rev. Biochem. 62, 101–120 (1993), und Sun et al., Trends Biochem. Sci. 19(11), 480–485 (1994)). Nicht-Rezeptor-PTPs sind äußerst verschiedenartig, und sie enthalten zusätzlich zu der enzymatisch aktiven PTP-Domäne zahlreiche Motive, die dazu dienen, die Region der Zelle, die durch diese Proteine besetzt ist, sowie die Substratspezifität dieser Enzyme zu regulieren. Die Rezeptor-PTPs sind auch eine stark unterschiedliche Gruppe, deren gemeinsames Merkmal der Einschluss einer Transmembrandomäne ist, die sie gegenüber der Plasmamembran der Zelle aussetzt. Erst jüngst wurden die Rezeptor-PTPs basierend auf ihrem Domäneninhalt in 8 Typen unterteilt (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 7(5), 650–657 (1995)). Diese Subtypen enthalten alle eine oder zwei PTPase-Domänen an ihren zytoplasmatischen Seiten, mit zahlreichen verschiedenen extrazellulären Motiven, einschließlich stark O-glykosylierter, Mucin-ähnlicher Domänen (beispielsweise CD45), Chondroitinsulfatdomänen (beispielsweise PTP γ) und kurzer, hoch glykosylierter Segmente (beispielsweise PTP α). Die größte Familie von PTPs ist die Familie, die verschiedene Motive enthält, die jenen ähnlich sind, die in Adhäsionsmolekülen zu finden sind. Diese Motive umfassen Immuglobulin-ähnliche (IgG-) Domänen und Fibronectin-Typ-III- (FnIII-) Regionen, die jenen ähnlich sind, die in Zelladhäsionsmolekülen wie ICAM, N-CAM und Ng-CAM zu finden sind (Rao et al., J. Cell. Biol. 118, 937–949 (1992)). Weiters enthält eine Untergruppe dieser Adhäsions-ähnlichen PTPs, einschließlich der PTPs κ und μ, eine dritte Domäne, die als MAM- (für Meprin/A5/PTP μ) Motiv bezeichnet wird (Beckman et al., Trends Biochem. Sci. 18, 40–41 (1993)). Für das MAM-Motiv wurde bereits gezeigt, dass es in Zell-Zell-Erkennung in Neuronen eingebunden ist (Jiang et al., J. Biol. Chem. 267, 9185–9193 (1992), Takagi et al., Neuron 7, 295–307 (1991), und Hirata et al., Neurosci. Res. 17, 159–169 (1993)). Interessanterweise lassen jüngste Daten darauf schließen, dass drei dieser Adhäsions-ähnlichen PTPs in neuronale Bahnung im Laufe der Drosophila-Entwicklung eingebunden zu sein scheinen (Desai et al., Cell 84, 599–609 (1996), und Kreuger et al., Cell 84, 611–622 (1996)). Zusammen stimmen diese strukturellen Daten mit der Vermutung überein, dass Rezeptor-PTPs eine mannigfaltige Familie enzymatisch aktiver Proteine umfassen, die zahlreiche interessante Zelloberflächenmotive enthalten, die möglicherweise in die Wahrnehmung der extrazellulären Umgebung eingebunden sind.
PTPs κ und μ sind die Rezeptoren, die am besten als Adhäsionsmoleküle charakterisiert sind (Brady-Kalnay et al., s.o.; Jiang et al., Mol. Cell. Biol. 13, 2942–2951 (1993), und Gebbink et al., Febs. Lett. 290(1–2), 123–130 (1991)). Für beide dieser PTPs wurde gezeigt, dass sie homotypische Adhäsion vermitteln. Somit zeigten zahlreiche verschiedene Tests, einschließlich zell- als auch molekülbasierte Tests, dass sich die extrazelluläre Domäne dieser Enzyme mit hoher Spezifität auf homophile Weise binden kann (Brady-Kalnay et al., J. Cell. Biol. 268, 961–972 (1993), Gebbink et al., J. Biol. Chem. 268, 16101–16104 (1993), und Sap et al., Mol. Cell. Biol. 14, 1–9 (1994)). Interessanterweise zeigten Mischversuche, dass sich diese eng verwandten PTPs nicht auf heterophile Weise aneinander binden, was darauf schließen lässt, dass die extrazelluläre Domäne andere Zellen erkennen sollte, die identische Rezeptoren spezifisch exprimieren, eine Situation, die stark an das homotypische Cadherin-Adhäsionssystem erinnert (Kemler et al., Trends Genet. 9, 317–321 (1993)). Während umstritten bleibt, welche extrazellulären Domänen für diese homotypische Bindung erforderlich sind, scheint es wahrscheinlich, dass sowohl das MAM-Motiv als auch die IgG-Region in homophile Wechselwirkungen eingebunden sind (Brady-Kalnay et al., J. Biol. Chem. 269, 28472–28477 (1994), und Zondag et al., J. Biol. Chem. 270(24), 14247–14250 (1995)). Während diese Daten darauf schließen lassen, dass diese homophilen Adhäsionsenzyme in die Erkennung anderer Zellen, die ähnliche Typen an Rezeptoren exprimieren, eingebunden sind, schlugen andere Daten vor, dass dieses Erkennungsereignis eine Rolle in der Bindung solcher Zellen aneinander spielen können. So zeigten Tonks und Mitarbeiter erst kürzlich, dass sich die Rezeptor-PTP μ spezifisch mit dem Catenin/Cadherin-Komplex homotypischer Zelladhäsionsmoleküle assoziiert (Brady-Kalnay et al., J. Cell. Biol. 130(4), 977–984 (1995)). Sie zeigten auch, dass Behandlung von Zellen mit dem PTP-Inhibitor Pervanadat zur Hinaufregulierung von Tyrosinphosphorylierung von Cadherinen und Cateninen führte, ein Resultat, das auf eine Rolle für eine PTP, möglicherweise PTP μ, bei der Aufrechterhaltung des Cadherin/Catenin-Komplexes in einem unterphosphorylierten Zustand schließen lässt. Interessanterweise wiesen frühere Arbeiten darauf hin, dass das Niveau von Tyrosinphosphorylierung dieses Komplexes mit der adhäsiven Kapazität der Cadherine korrelierte (Beherns et al., J. Cell. Biol. 120, 757–766 (1993)), ein Resultat, das mit der Hypothese übereinstimmt, dass die Adhäsion zwischen Zellen, die durch die Cadherine vermittelt wird, durch ihre Tyrosinphosphorylierungsniveaus, wie sie durch homotypische Wechselwirkungen zwischen Rezeptor-PTPs wie κ und μ bestimmt werden, reguliert wird.
Die Erkenntnis, dass PTPs κ und μ homotypische Adhäsion vermittelten, zusammen mit der in gewisser Weise eingeschränkten Gewebeverteilung dieser PTPs (Jiang et al., s.o. (1993), und Gebbink et al., s.o. (1991)), ließ darauf schließen, dass zusätzliche Elemente dieser Familie adhäsiver Enzyme bestehen könnten. Hierin berichten die Erfinder vom Klonieren und von der Charakterisierung des dritten Elements dieser Rezeptor-PTP-Familie, bezeichnet als PTP λ. Das PTP-λ-Polypeptid, über das hierin berichtet wird, enthält strukturelle Motive, die jenen sehr ähnlich sind, die in PTP κ und μ zu finden sind. Darüber hinaus zeigt dieser neue PTP-λ-Rezeptor eine Gewebeverteilung, die von jener abweicht, die bereits vorher für die anderen Elemente der Familie beschrieben wurde.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder analysierten zahlreiche PTPs aus einer primitiven murinen hämatopoetischen Zellpopulation unter Verwendung von Consensus-PCR. Aus dieser Population wurde ein neues Rezeptorprotein-Tyrosinphosphorylase-Polypeptid kloniert, das mit den Rezeptor-PTPs κ und μ verwandt ist. Die Erfinder bezeichneten diese neue Proteintyrosinphosphorylase als "PTP λ". Anders als andere bekannte Rezeptor-PTP-Polypeptide wird PTP λ vorwiegend in Gehirn-, Lungen- und Nierengeweben von erwachsenen Säugetieren exprimiert, wobei jedoch Expression in Lebergewebe von erwachsenen Säugetieren überwiegend fehlt.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-Polypeptid (PTP) λ, wie es in Anspruch 1 definiert ist.
Ein PTP-Polypeptid kann (1) vorwiegend in Gehirn-, Lungen- und Nierengewebe von erwachsenen Säugetieren exprimiert werden; und (2) in Lebergewebe von erwachsenen Säugetieren überwiegend nicht exprimiert werden, wobei das Polypeptid in der Lage ist, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren.
Derivate dieser neuen PTP-Polypeptide können im Wesentlichen die Fähigkeit beibehalten, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren.
Eine bevorzugte Gruppe von PTP-Polypeptiden umfasst ein Polypeptid, das die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) umfasst; ein weiteres Säugetier-Homolog der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz und ein Derivat von jedem beliebigen der oben genannten Polypeptide, das die Fähigkeit, Tyrosinreste zu dephosphorylieren, im Wesentlichen beibehält.
Isolierte Nucleinsäuremoleküle können für die neuen, hierin offenbarten PTP-Polypeptide kodieren.
Vektoren können Nucleinsäure umfassen, die für die neuen PTP-Polypeptide hierin kodiert, operabel an Steuersequenzen gebunden, die durch eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden, sowie an Zellen, die mit solchen Vektoren transformiert sind.
Antikörper können zu spezifischer Bindung an die neuen PTP-Polypeptide dieser Erfindung und an Hybridomzelllinien, die solche Antikörper produzieren, in der Lage sein. Die Antikörper können Agonisten-Antikörper sein, die die Fähigkeit der neuen PTP-Polypeptide stimulieren, Tyrosine zu dephosphorylieren, oder Antagonisten-Antikörper, die diese Aktivität blockieren.
Verfahren zur Produktion der PTP-Polypeptide können das Transformieren einer Wirtszelle mit Nucleinsäure, die für das Polypeptid kodiert, das Kultivieren der transformierten Zelle und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur umfassen.
Ein Test zur Identifikation eines Antagonisten oder eines Agonisten eines neuen PTP-Polypeptids der vorliegenden Erfindung kann das Kontaktieren einer Phosphatasedomäne des PTP-Polypeptids mit einem Kandidaten-Antagonisten oder -Agonisten und das Beobachten der Fähigkeit der Phosphatasedomäne, Tyrosinreste zu dephosphorylieren, umfassen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A–1D. Die cDNA und abgeleitete Proteinsequenz von PTP λ. Veranschaulicht ist die cDNA (Seq.-ID Nr. 1) und die abgeleitete Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 2) des PTP-λ-Klons voller Länge, der zu einem kleinen PCR-Fragment homolog ist, das aus hämatopoetischen Vorläuferzellen unter Verwendung von Consensus-PTP-Primern abgeleitet wurde. Die Aminosäuren sind durch ihre Standard-Einbuchstabenbezeichnungen dargestellt.
2A–2B. Homologie zwischen PTP λ, PTP κ und PTP μ. Veranschaulicht als Reste in Kästchen sind die Aminosäurehomologien zwischen PTP-λ- (ptplambda) (Seq.-ID Nr. 2), PTP-κ- (ptpkappa) (Seq.-ID Nr. 3) und PTP-μ- (ptpmu) (Seq.-ID Nr. 4) Polypeptiden. Die Aminosäuren sind durch ihre Standard-Einbuchstabenbezeichnungen dargestellt. Über den Aminosäuresequenzen sind auch die Domänen gezeigt, die bereits vorher aus PTP κ und PTP μ vorhergesagt wurden. Diese Domänen umfassen die Signalsequenz- (SS), die MAM- (mePrin, A5, PTP μ), Immunglobulinähnliche (IgG) und Fibronectin-Typ-III-ähnliche Domäne (FnIII), Transmembrandomäne (TMD), Cadherin-ähnliche Domäne (Cadherin) und Doppelphosphatasedomänen (PTPase I und PTPase II).
3. Vergleich der Domänenstrukturen von PTP λ, PTP κ und PTP μ. Veranschaulicht werden die prozentuellen Aminosäurehomologien zwischen den verschiedenen Domänen der PTP-λ-, PTP-κ- und PTP-μ-Polypeptide. Diese Domänen umfassen die Signalsequenz- (SS), MAM- (mePrin, A5, PTP μ), Immunglobulin-ähnliche (IgG) und Fibronectin-Typ-III-ähnliche Domäne (FnIII), Transmembrandomäne (TMD), Cadherin-ähnliche Domäne (Cadherin) und Doppelphosphatasedomänen (PTPase I und PTPase II).
4. Tyrosinphosphataseaktivität von PTP-λ-Immunpräzipitaten aus PC-12-Zellen. Lysate von PC-12-Zellen wurden entweder mit Prä-Immunantikörper (Preimmune) oder Antikörper, der gegen die zytoplasmatische Domäne des PTP-λ- Polypeptids gerichtet ist (AntiPTP λ), immungefällt. Die Immunpräzipitate wurden mit zwei verschiedenen immobilisierten tyrosinphosphorylierten Peptiden (PPS1 und PPS2) unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Tyrosinphosphatase-Testsets inkubiert. Immunausfällung erfolgte entweder in Abwesenheit oder Gegenwart des Tyrosinphosphataseinhibitors Vanadat. Tyrosinphosphataseaktivität wurde durch Untersuchen der restlichen Bindung eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers an das immobilisierte Peptid bestimmt, wobei eine reduzierte OD₄₀₅ mit Tyrosinphosphataseaktivität korrelierte.
5. Northern-Blot-Analyse von PTP-λ-Expression. Im Handel erhältliche Northern-Blots wurden mit einem ³²P-markierten Fragment von PTP λ unter Verwendung von Standard-Hybridisierungsbedingungen sondiert. Der Blot links veranschaulicht das PTP-λ-Transkript in RNA, gewonnen aus murinen Embryonen am in der Figur angegebenen Entwicklungstag gewonnen. Der Blot rechts veranschaulicht eine Analyse des PTP-λ-Transkripts in RNA aus a. Herz, b. Gehirn, c. Milz, d. Lunge, e. Leber, f. Skelettmuskel, g. Niere und h. Hoden.
6. PTP-λ-mRNA-Expression im E15.5-Rattenembryo. Emulsions-Autoradiographen aus einem sagittalen Embryoschnitt (A) und größere Vergrößerungen von embryonalem Mesenzephalon (C), Rückenmark (D), Niere (F) und Lunge, hybridisiert mit einer ³³P-UTP-markierten PTP-λ-Antisensesonde, sind gezeigt. Den Dunkelfeld-Autoradiographen sind die entsprechenden Hellfeldbilder von sagittalem Embryoschnitt (B), Niere (G) und Lunge (I) gegenübergestellt. Hybridisierung unter Verwendung einer PTP-λ-Sense-Strang-Kontrollsonde ist in einem embryonalen E15.5-Rückenmarkschnitt (E) gezeigt. (A, B, C, D, E) Balken = 1,0 mm; (F, G, H, I) Balken = 0,2 mm.
7. PTP-λ-mRNA-Expression in P1 und erwachsenem Rattengehirn. Emulsions-Autoradiographen von Koronalschnitten von P1-Rattengehirn (A, B, C) und erwachsenem Ratengehirn (D, E), hybridisiert mit einer ³³P-UTP-markierten PTP-λ-Antisense-Sonde, sind gezeigt. Koronalschnitte des P1-Gehirns sind von der Höhe des Septums (A), Hippocampus (B) und der Substantia nigra (C). Bezüglich des erwachsenen Tiers sind die koronalen Gehirngewebeschnitte auf Höhe des Septums (D) und des Hippocampus und der Substantia nigra (E). Hybridisierung unter Verwendung einer PTP-λ-Sense-Strang-Kontrollsonde ist in einem erwachsenen Koronalschnitt auf Höhe der Substantia nigra (F) gezeigt. (A, B, C) Balken = 1,0 mm; (D, E, F) Balken = 1,0 mm.
8. Expression von PTP λ in PC-12-Zellen. Veranschaulicht ist das PTP-λ-Transkript, beobachtet über die am oberen Rand der Figur angegebenen Tage hinweg in RNA von PC-12-Zellen, die entweder unbehandelt (-) oder mit 10 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) behandelt (+) waren. Der untere Blot zeigt das β-Actinsignal, das aus jeder der RNAs erhalten wurde.
9. Immunfluoreszenzanalyse von PTP-λ-Expression in PC-12-Zellen. PC-12-Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen oder mit 10 ng/ml Nervenwachstumsfaktor (NGF) 7 Tage lang behandelt, um Neuritenbildung zu induzieren. Am Ende dieses Zeitraums wurden die Zellen permeabilisiert und entweder mit Prä-Immunserum oder mit Antikörpern, die gegen die intrazelluläre Domäne von PTP λ gerichtet waren, gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen und mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Tafel A zeigt die Resultate ohne NGF und mit Prä-Immunserum. Tafel B zeigt die Resultate ohne NGF und mit Anti-PTP-λ-Serum. Tafel C zeigt die Resultate mit NGF und Anti-PTP-λ-Serum. Tafel D zeigt die Resultate, die mit NGF und Anti-PTP-λ-Serum erhalten wurden, in einer Vergrößerung mit größerem Maßstab als in Tafel C. Die Pfeile zeigen positiv gefärbte, verlängerte Neuriten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
A. Definitionen
Die Phrasen "Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase λ", "Proteintyrosinphosphatase λ" und "PTP λ" werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein natives, membrangebundenes Proteintyrosinphosphatase-Polypeptid, das (1) vorwiegend in Gehirn-, Lungen- und Nierengewebe von erwachsenen Säugetieren exprimiert werden; und (2) in Lebergewebe von erwachsenen Säugetieren überwiegend nicht exprimiert wird, worin das Polypeptid in der Lage ist, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren. Die obigen Bezeichnungen sollen auch funktionelle Derivate solcher nativen Tyrosinphosphatasen umfassen.
Die Bezeichnung "native Tyrosinphosphatase" in diesem Zusammenhang bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes Tyrosinphosphatasepolypeptid mit den erwünschten Eigenschaften aus jeder beliebigen menschlichen Spezies und nicht-menschlichen Tierspezies, mit oder ohne initiierendem/s Methionin, unabhängig davon, ob aus der nativen Quelle gereinigt, synthetisiert, durch DNA-Rekombinationsverfahren oder durch jegliche Kombination dieser und/oder anderer Verfahren hergestellt. Native PTP λ umfasst insbesondere das native murine PTP-λ-Protein, das in 1 (Seq.-ID Nr. 2) gezeigt ist.
Ein "funktionelles Derivat" eines Polypeptids ist eine Verbindung, die mit dem nativen Polypeptid eine gemeinsame qualitative biologische Aktivität aufweist. Somit ist ein funktionelles Derivat eines nativen PTP-λ-Polypeptids eine Verbindung, die eine gemeinsame qualitative biologische Aktivität mit einem nativen PTP-λ-Polypeptid aufweist, beispielsweise in der Lage ist, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren. "Funktionelle Derivate" umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Fragmente nativer Polypeptide aus jeglicher Tierspezies (einschließlich Menschen), Derivate von nativen (menschlichen und nicht-menschlichen) Polypeptiden und ihre Fragmenten, Glykosylierungsvarianten eines nativen Polypeptids und Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga von nativen Polypeptiden, vorausgesetzt, dass sie mit einem jeweiligen nativen Polypeptid eine gemeinsame biologische Aktivität aufweisen. "Fragmente" umfassen Regionen innerhalb der Sequenz eines reifen nativen Polypeptids. Die Bezeichnung "Derivat" wird verwendet, um Aminosäuresequenzvarianten und kovalente Modifikationen eines nativen Polypeptids zu definieren. "Nicht-Peptid-Analoga" sind organische Verbindungen, die im Wesentlichen die gleiche Oberfläche wie Pep tidanaloga der nativen Polypeptide aufweisen. Somit sind die Nicht-Peptid-Analoga der nativen PTP λ der vorliegenden Erfindung organische Verbindungen, die im Wesentlichen die gleiche Oberfläche wie Peptidanaloga der nativen PTP λ aufweisen. Solche Verbindungen wechselwirken mit anderen Molekülen auf eine ähnliche Weise wie Peptidanaloga und ahmen eine biologische Aktivität einer nativen PTP λ der vorliegenden Erfindung nach. Die funktionellen Polypeptidderivate der nativen PTP λ der vorliegenden Erfindung weisen zumindest 65 %, noch bevorzugter zumindest 75 %, noch bevorzugter zumindest 85 %, und am meisten bevorzugt zumindest 95 %, Gesamtsequenzidentität mit der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) auf und behalten die Fähigkeit, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren, im Wesentlichen bei.
Die Bezeichnung "biologische Aktivität" im Zusammenhang mit der Definition funktioneller Derivate ist definiert als die Eigenschaft, über zumindest eine adhäsive, regulative oder Effektorfunktion zu verfügen, die qualitativ gesehen auch ein natives Polypeptid (z.B. PTP λ) aufweist. Die funktionellen Derivate der nativen PTP λ der vorliegenden Erfindung weisen als gemeinsames Merkmal ihre qualitative Fähigkeit auf, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren. Vorzugsweise behalten die funktionellen Derivate der nativen PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung auf qualitativer Ebene zumindest eine der folgenden biologischen Eigenschaften der nativen Moleküle bei: Vermittlung von Zelladhäsion und Einbindung in neurale Bahnung.
Die Bezeichnungen "kovalente Modifikation" und "kovalente Derivate" werden synonym verwendet und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Modifikationen an einem nativen Polypeptids oder einem Fragment davon mit einem organischen proteinartigen oder nicht-proteinartigen derivatisierenden Mittel, Fusionen an heterologe Polypeptidsequenzen und posttranslationale Modifikationen. Kovalente Modifikationen werden üblicherweise durch Umsetzen von Target-Aminosäureresten mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit selektierten Stellen oder terminalen Resten zu reagieren, oder durch Nutzbarmachungsmechanismen posttranslationaler Modifikationen, die in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen funktionieren, eingeführt. Bestimmte posttranslationale Modifikationen sind das Resultat der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Andere posttranslationale Modifikationen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Tyrosin- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)). Kovalente Derivate/Modifikationen umfassen insbesondere Fusionsproteine, die native PTP-λ-Sequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen, und deren Aminosäuresequenzvarianten, wie Immunoadhäsine, und N-terminale Fusionen an heterologe Signalsequenzen.
"Vorwiegend exprimiert", "vorwiegende Expression" und grammatische Entsprechungen davon beschreiben ein Expressionsniveau einer Nucleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die unter Verwendung von Northern-Blot-Analyse unter stringenten Bedingungen leicht nachweisbar ist.
"Identität" oder "Homologie" in Bezug auf ein natives Polypeptid und sein funktionelles Derivat ist hierin definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz, die mit den Resten eines entsprechenden nativen Polypeptids, nach Abgleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern erforderlich, um die maximale prozentuelle Homologie zu erreichen, und ohne Berücksichtigung jeglicher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität, identisch sind. Weder N- oder C-terminate Verlängerungen noch Insertionen sollten als Verringerungsfaktoren für Identität oder Homologie gelten. Verfahren und Computerprogramme zum Abgleichen sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt.
Die Bezeichnung "Agonist" wird verwendet, um auf Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga der nativen PTP λ der vorliegenden Erfindung und auf Antikörper, die sich spezifisch an native PTP λ binden, vorausgesetzt, dass sie zumindest eine biologische Aktivität einer nativen PTP λ beibehalten, Bezug zu nehmen. Vorzugsweise behalten die Agonisten der vorliegenden Erfindung die qualitative Fähigkeit bei, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren.
Die Bezeichnung "Antagonist" wird verwendet, um auf ein Molekül Bezug zu nehmen, das eine biologische Aktivität einer nativen PTP λ der vorliegenden Erfindung inhibiert. Vorzugsweise inhibieren die Antagonisten hierin die Fähigkeit der PTP λ der vorliegenden Erfindung, Tyrosine zu dephosphorylieren. Bevorzugte Antagonisten blockieren durch PTP λ verursachte Tyrosindephosphorylierung im Wesentlichen vollständig.
Üblicherweise beziehen sich die Bezeichnungen "Aminosäure" und "Aminosäuren" auf alle natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren. In manchen Ausführungsformen können jedoch auch D-Aminosäuren in den Polypeptiden oder Peptiden der vorliegenden Erfindung vorhanden sein, um Konformationsrestriktion zu erleichtern. Um beispielsweise Disulfidbindungsbildung und -stabilität zu erleichtern, kann ein D-Aminosäurecystein an einem oder beiden Termini eines funktionellen Peptidderivats oder Peptidantagonisten der nativen PTP λ der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Die Aminosäuren werden entweder durch Einbuchstaben- oder durch Dreibuchstabenbezeichnungen identifiziert:
Diese Aminosäuren können gemäß der chemischen Zusammensetzung und Eigenschaften ihrer Seitenketten klassifiziert werden. Sie werden grob in zwei Gruppen, geladen und ungeladen, eingeteilt. Jede dieser Gruppen ist in Untergruppen eingeteilt, um die Aminosäuren exakter zu klassifizieren:
I. Geladene Aminosäuren

Saure Reste: Asparaginsäure, Glutaminsäure
Basische Reste: Lysin, Arginin, Histidin

II. Ungeladene Aminosäuren

Hydrophile Reste: Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin
Aliphatische Reste: Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin
Nichtpolare Reste: Cystein, Methionin, Prolin
Aromatische Reste: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan

Die Bezeichnung "Aminosäuresequenzvariante" bezieht sich auf Moleküle mit einigen Unterschieden in ihren Aminosäuresequenzen im Vergleich zu einer nativen Aminosäuresequenz.
Substitutionsvarianten sind jene, die zumindest einen Aminosäurerest in einer nativen Sequenz entfernt haben und eine andere Aminosäure an seiner Stelle an derselben Position insertiert aufweisen. Die Substitutionen können einfach sein, wobei nur eine Aminosäure im Molekül substituiert wurde, oder sie können vielfach sein, wobei zwei oder mehrere Aminosäuren im selben Molekül substituiert wurden.
Insertionsvarianten sind jene mit einer oder mehreren Aminosäuren, die unmittelbar neben einer Aminosäure an einer bestimmten Position in einer nativen Sequenz insertiert wurden. Unmittelbar neben einer Aminosäure bedeutet, dass sie entweder mit der α-Carboxy- oder der α-Amino-funktionellen Gruppe der Aminosäure verbunden ist.
Deletionsvarianten sind jene, die eine oder mehrere Aminosäuren in der nativen Aminosäuresequenz entfernt haben. Üblicherweise weisen Deletionsvarianten eine oder zwei deletierte Aminosäuren in einer bestimmten Region des Moleküls auf.
"Antikörper (Abs)" und "Immunglobuline (Igs)" sind Glykoproteine mit denselben strukturellen Eigenschaften. Während Antikörper Bindungsspezifität zu einem spezifischen Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper als auch andere Antikörper-ähnliche Moleküle, denen Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letztgenannten Art werden beispielsweise in geringen Konzentrationen vom Lymphsystem und in höheren Konzentrationen von Myelomen produziert.
Native Antikörper und Immunglobuline sind üblicherweise heterotetramere Glykoproteine mit etwa 150.000 Da, die sich aus zwei identischen leichten (L-) Ketten und zwei identischen schweren (H-) Ketten zusammensetzen. Jede leichte Kette ist über eine kovalente Disulfidbindung an eine schweren Kette gebunden, während die Anzahl an Disulfidbindungen zwischen den schweren Ketten verschiedener Immunglobulinisotypen variiert. Jede schwere und leichte Kette weist auch regelmäßig beabstandete Intraketten-Disulfidbrücken auf. Jede schwere Kette weist an einem Ende eine variable Domäne (V_H) auf, gefolgt von mehreren konstanten Domänen. Jede leichte Kette weist eine variable Domäne (V_L) an einem und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf; die konstante Domäne der leichten Kette ist mit der ersten konstanten Domäne der schweren Kette abgeglichen, und die variable Domäne der leichten Kette ist mit der variablen Domäne der schweren Kette abgeglichen. Es wird angenommen, dass besondere Aminosäurereste eine Grenzfläche zwischen den variablen Domänen der leichten und der schweren Kette bilden (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651–653 (1985); Novotny & Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592–4596 (1985)).
Die Bezeichnung "variabel" bezieht sich auf die Tatsache, dass sich unter den einzelnen Antikörpern bestimmte Abschnitte der variablen Domänen in ihrer Sequenz stark unterscheiden und zur Bindung und Spezifität von jedem bestimmten Antikörper zu seinem/für sein bestimmten/s Antigen verwendet werden. Die Variabilität ist jedoch über die variablen Domänen von Antikörpern nicht gleichmäßig verteilt. Sie ist in drei Segmenten, die als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) oder hypervariable Regionen bezeichnet werden, sowohl in den variablen Domänen der leichten Kette als auch jenen der schweren Kette konzentriert. Die stärker konservierten Abschnitte von variablen Domänen werden als Gerüst (FR) bezeichnet. Die variablen Domänen von nativen Schwer- und Leichtketten umfassen jeweils vier FR-Regionen, die fast durchwegs eine β-Faltblattkonfiguration annehmen, verbunden durch die drei CDRs, die Schleifen bilden, die die β-Faltblattstruktur verbinden und in manchen Fällen einen Teil davon bilden. Die CDRs in jeder Kette werden durch die FR-Regionen sehr eng zusammengehalten und tragen, mit den CDRs aus der anderen Kette, zur Bildung von Antigen-Bindungsstellen von Antikörpern bei (siehe E.A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Die konstanten Domänen sind nicht direkt in die Bindung eines Antikörpers an ein Antigen eingebunden, zeigen jedoch verschiedene Effektorfunktionen, wie Beteiligung des Antikörpers an Antikörper-abhängiger, zellulärer Toxizität.
Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt Fab-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigen-Bindungsstelle und einem verbleibenden "Fc"-Fragment, eine Bezeichnung, die die Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das zwei Antigen-kombinierende Stellen aufweist und dennoch zur Vernetzung von Antigen in der Lage ist.
"Fv" ist das minimale Antikörperfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und -bindungsstelle aufweist. Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Schwer- und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Assozia tion. In dieser Konfiguration erfolgt eine Wechselwirkung zwischen den drei CDRs jeder variablen Domäne zur Definition einer Antigen-Bindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers. Gemeinsam verleihen die sechs CDRs dem Antikörper Antigen-Bindungsspezifität. Jedoch weist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das nur drei CDRs umfasst, die für ein Antigen spezifisch sind) die Fähigkeit auf, Antigen zu erkennen und zu binden, dies jedoch bei einer geringeren Affinität als die gesamte Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält auch die konstante Domäne der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Addition einiger weniger Reste am Carboxy-Terminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', in dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweist/aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenks-Cysteine zwischen sich aufwiesen. Auch andere chemische Bindungen sind für Antikörperfragmente bekannt.
Die leichten Ketten von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeder beliebigen Wirbeltierspezies können einem oder zwei eindeutig unterscheidbaren Typen, genannt kappa (κ) und lambda (λ), basierend auf den Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen zugeordnet werden.
Je nach Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer schweren Ketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiters in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B.: IgG-1, IgG-2, IgG-3, und IgG-4; IgA-1 und IgA-2. Die konstanten Domänen der schweren Kette, die den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden als α, delta, epsilon, γ bzw. μ bezeichnet. Die Untereinheitstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen verschiedener Klassen von Immunglobulinen sind durchwegs bekannt.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt insbesondere beispielsweise einzelne monoklonale Antikörper (einschließlich Agonisten- und Antagonistenantikörper), Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität sowie Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv), solange sie die erwünschte biologische Aktivität aufweisen.
Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, identisch sind, unter Ausnahme möglicher, natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, da sie gegen eine einzige antigene Stelle gerichtet sind. Darüber hinaus ist, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante am Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität weisen die monoklonalen Antikörper darin einen Vorteil auf, dass sie durch die Hybridomkultur synthetisiert werden, unkontaminiert von anderen Immunglobulinen. Das Adjektiv "monoklonal" beschreibt die Eigenschaft des Antikörpers, aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern gewonnen worden zu sein, und ist nicht als ein Erfordernis zu verstehen, den Antikörper mittels eines bestimmten Verfahrens herzustellen. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, mittels des Hybridomverfahrens hergestellt werden, das als erstes von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder sie können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z.B. das US-Patent Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.)).
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen insbesondere "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Ketten mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer bestimmten Spezies abstammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -subklasse gehören, identisch oder zu diesen homolog sind, während der Rest der Kette(n) mit den entspre chenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -subklasse gehören, identisch oder zu diesen homolog sind, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die erwünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
"Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin abstammt. Im Großteil der Fälle sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donor-Antikörper) wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregionreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden vollzogen, um Antikörperleistung weiter zu verfeinern und optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer, vorzugsweise zwei, variablen Domäne(n), in der/denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im Optimalfall auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Nähere Details sind in Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); EP-B-239 400, veröffentlicht am 30 September 1987; Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992); und der EP-B-451 216, veröffentlicht am 24. Jänner 1996, zu finden.
Wie hierin verwendet, werden die Bezeichnungen "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" synonym verwendet, und alle diese Bezeichnungen beziehen Nachkommenschaft mit ein. Es gilt auch zu verstehen, dass die gesamte Nachkommenschaft aufgrund von beabsichtigen oder unbeabsichtigten Mutationen nicht exakt identisch bezüglich DNA-Gehalt sein kann. Mutierte Nachkommenschaft, die gewisse Funktionen oder biologische Aktivität, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurden, aufweisen, sind eingebunden.
Die Bezeichnungen "replizierbarer Expressionsvektor" und "Expressionsvektor" beziehen sich auf ein Stick von DNA, üblicherweise doppelsträngig, das ein in sich insertiertes Stück von Fremd-DNA aufweisen kann. Fremd-DNA ist definiert als heterologe DNA, worin die DNA in der Wirtszelle in der Natur nicht zu finden ist. Der Vektor wird verwendet, um die Fremd- oder heterologe DNA in eine geeignete Wirtszelle zu transportieren. Sobald er in der Wirtszelle angekommen ist, kann der Vektor unabhängig von der chromosomalen Wirt-DNA replizieren, und mehrere Kopien des Vektors und seiner insertierten (Fremd-) DNA können gebildet werden. Darüber hinaus enthält der Vektor die erforderlichen Elemente, die das Translatieren der Fremd-DNA in ein Polypeptid ermöglichen. Zahlreiche Moleküle des Polypeptids, für die die Fremd-DNA kodiert, können so rasch synthetisiert werden.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression von operabel gebundener Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten beispielsweise geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosombindungsstelle und möglicherweise noch andere Sequenzen, die bisher noch kaum erforscht wurden. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn es als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypep tids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend sind und in Lesephase stehen. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Sind solche Stellen nicht vorhanden, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
"Immunoadhäsine" oder "PTP-λ-Immunglobulinchimären" sind chimäre, Antikörperähnliche Moleküle, die die funktionelle(n) Domäne(n) eines Bindungsproteins (üblicherweise eines Rezeptors, eines Zelladhäsionsmoleküls oder eines Liganden) mit einer Immunglobulinsequenz kombinieren. Das häufigste Beispiel für diesen Typ von Fusionsprotein kombiniert die Gelenks- und Fc-Regionen eines Immunglobulins (Ig) mit Domänen eines Zelloberflächenrezeptors, der einen spezifischen Liganden erkennt. Dieser Typ von Molekül wird als "Immunoadhäsin" bezeichnet, da er "Immun"- und "Adhäsions"-Funktionen kombiniert; andere häufig verwendete Namen sind "Ig-Chimäre", "Ig-Fusionsprotein" oder "Fc-Fusionsprotein" oder auch "Rezeptorglobulin".
"Oligonucleotide" sind kurze, einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die mittels bekannter Verfahren (wie chemischer Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Verfahren, unter Verwendung von Festphasenverfahren wie jenen, die in der EP 266.032, veröffentlicht am 4. Mai 1988, beschrieben werden, oder über Desoxynucleosid-H-phosphonat-Zwischenprodukte, wie sie von Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986), beschrieben werden) chemisch synthetisiert werden. Sie werden anschließend an Polyacrylamidgelen gereinigt.
Hybridisierung erfolgt vorzugsweise unter "stringenten Bedingungen", was die Verwendung von (1) geringer Ionenstärke und hohen Temperaturen für das Waschen bedeutet, beispielsweise 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; oder die Verwendung von (2) einem denaturierenden Mittel während der Hybridisierung bedeutet, wie beispielsweise Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C. Ein anderes Beispiel ist die Verwendung von 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung, beschallter Lachssperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C, mit Waschschritten bei 42 °C in 0,2 × SSC und 0,1 % SDS. Wiederum ein anderes Beispiel ist Hybridisierung unter Verwendung eines Puffers in 10 % Dextransulfat, 2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem Waschschritt bei hoher Stringenz bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55 °C.
"Transformation" bezeichnet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodass die DNA replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. Je nach verwendeter Wirtszelle erfolgt Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung, die Calciumchlorid verwendet, wie von S.N. Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 (1972), und Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 154 (1970), beschrieben, wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen, die wesentliche Zellwandbarrieren aufweisen, verwendet. Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphatausfällverfahren von F. Graham und A. van der Eb, Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte zu Säugetierzellwirtsystem-Transformationen wurden von Axel im US-Patent Nr. 4.399.216, ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen zu Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von P. van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und C.L. Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, beispielsweise durch Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion, verwendet werden.
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten Fragments von DNA aus einem Restriktionsverdau bedeutet Trennung des Verdaus an Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, Identifikation des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität mit jener von Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, Entfernung des Gelschnitts, der das erwünschte Fragment enthält, und Trennung des Gels von DNA. Dieses Verfahren ist im Allgemeinen bekannt. Siehe beispielsweise R. Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103–6114 (1981), und D. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).
"Ligation" bezieht sich auf das Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., s.o., 146 (1982). Außer anders angegeben, kann Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 mg von etwa äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erfolgen.
"Herstellung" von DNA aus Transformanten bedeutet das Isolieren von Plasmid-DNA aus Mikrobenkultur. Außer anders angegeben, kann das Alkali/SDS-Verfahren von Maniatis et al., s.o., S. 90 (1982), verwendet werden.
B. Herstellung von PTP λ durch DNA-Rekombinations-Technologie
1. Identifikation und Isolierung von Nucleinsäure, die für PTP λ kodiert
Die nativen PTP-λ-Proteine der vorliegenden Erfindung können aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken isoliert werden. Eine geeignete cDNA-Bibliothek kann beispielsweise durch Gewinnen von polyadenylierter mRNA aus Zellen, die dafür bekannt sind, das erwünschte PTP-λ-Protein zu exprimieren, und Verwenden der mRNA als Matrix, um doppelsträngige cDNA zu synthetisieren, konstruiert werden. Geeignete Quellen für die mRNA sind murine primitive blutbildende Zellen und PC12-Zellen. mRNA, die für die native PTP λ der vorliegenden Erfindung kodiert, wird beispielsweise in Geweben exprimiert, die aus erwachsenem/r Gehirn, Lunge, Niere, Herz, Skelettmuskel und Hoden stammen. Das für das neue PTP-λ-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek, wie einer menschlichen genomischen Cosmid-Bibliothek, oder einer von Maus abstammenden, genomischen Embryonalzellen- (ES-) Bibliothek gewonnen werden.
Bibliotheken, entweder cDNA- oder genomische Bibliotheken, werden dann mit Sonden gescreent, die dazu entworfen sind, das Gen von Interesse oder das davon kodierte Protein zu identifizieren. Für cDNA-Expressionsbibliotheken umfassen geeignete Sonden monoklonale und polyklonale Antikörper, die ein PTP-λ-Polypeptid erkennen und sich spezifisch daran binden. Für cDNA-Bibliotheken umfassen geeignete Sonden sorgfältig ausgewählte Oligonucleotidsonden (üblicherweise mit einer Länge von etwa 20–80 Basen), die für bekannte oder in Betracht gezogene Abschnitte eines PTP-λ-Polypeptids aus derselben oder einer anderen Spezies kodieren, und/oder komplementäre oder homologe cDNAs oder Fragmente davon, die für dasselbe oder ein ähnliches Gen kodieren. Geeignete Sonden zum Screenen von genomischen DNA-Bibliotheken umfassen, ohne Einschränkung, Oligonucleotide, cDNAs oder Fragmente davon, die für dasselbe oder ein ähnliches Gen kodieren, und/oder homologe genomische DNAs oder Fragmente davon. Das Screenen der cDNA- oder genomischen Bibliothek mit der ausgewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren, wie in den Kapiteln 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), durchgeführt werden.
Wird DNA, die für ein Enzym der vorliegenden Erfindung kodiert, unter Verwendung von sorgfältig ausgewählten Oligonucleotidsequenzen, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Geweben zu screenen, isoliert, so sollten die als Sonden ausgewählten Oligonucleotidsequenzen eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, um falsche Positive zu minimieren. Die tatsächliche(n) Nucleotidsequenz(en) wird/werden üblicherweise basierend auf Regionen, die die geringste Codonredundanz aufweisen, entworfen. Die Oligonucleotide können an einer oder mehreren Positionen degeneriert sein. Die Verwendung von degenerierten Oligonucleoti den ist von besonderer Bedeutung, wenn eine Bibliothek aus einer Spezies gescreent wird, in der präferenzielle Codonverwendung nicht bekannt ist.
Das Oligonucleotid muss so markiert sein, dass es bei Hybridisierung an DNA in der zu screenenden Bibliothek nachgewiesen werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren ist die Verwendung von ATP (z.B. γ³²P) und Polynucleotidkinase, um das 5'-Ende des Oligonucleotids radioaktiv zu markieren. Es können jedoch auch andere Verfahren verwendet werden, um das Oligonucleotid zu markieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Biotinylierung oder Enzymmarkierung.
cDNAs, die für PTP λ kodieren, können auch durch andere bekannte Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie, wie beispielsweise durch direktes Expressionsklonieren oder unter Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR), wie im US-Patent Nr. 4.683.195, ausgegeben am 28. Juli 1987, in Abschnitt 14 von Sambrook et al., s.o., oder in Kapitel 15 von Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1991), beschrieben, identifiziert und isoliert werden. Die Verwendung des PCR-Verfahrens zur Gewinnung von cDNA, die für murine PTP λ kodiert, wird auch in den Beispielen veranschaulicht.
Nachdem cDNA, die für ein PTP-λ-Enzym aus einer Spezies kodiert, isoliert wurde, können cDNAs aus anderen Spezies auch durch interspezifische Hybridisierung gewonnen werden. Gemäß diesem Ansatz werden menschliche oder andere Säugetier-cDNA- oder genomische Bibliotheken mittels markierter Oligonucleotidsequenzen, die aus bekannten PTP-λ-Sequenzen (wie muriner PTP λ) ausgewählt sind, gemäß bekannten Kriterien sondiert, zu denen gehört, dass die Sequenz eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein sollte, um falsche Positive zu minimieren. Typischerweise ist ein ³²P-markiertes Oligonucleotid mit etwa 30 bis 50 Basen ausreichend, insbesondere, wenn das Oligonucleotid ein oder mehrere Codons für Methionin oder Tryptophan enthält. Isolierte Nucleinsäure ist DNA, die identifiziert und von verunreinigender Nucleinsäure, die für andere Polypeptide aus der Quelle der Nucleinsäure kodiert, getrennt wurde. Hybridisierung wird vorzugsweise unter "stringenten Bedingungen", wie hierin zuvor bereits definiert, durchgeführt.
Sobald die Sequenz bekannt ist, kann das für ein bestimmtes PTP-λ-Polypeptid kodierende Gen auch durch chemische Synthese gemäß einem der in Engels & Uhlmann, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989), beschriebenen Verfahren gewonnen werden. Diese Verfahren umfassen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit-, und H-Phosphonatverfahren, PCR und andere Autoprimer-Verfahren und Oligonucleotidsynthesen an festen Trägern.
2. Klonieren und Expression von Nucleinsäure, die für PTP λ kodiert
Sobald die für PTP λ kodierende Nucleinsäure verfügbar ist, wird sie im Allgemeinen für weiteres Klonieren (Amplifikation der DNA) oder für Expression in einen replizierbaren Vektor ligiert.
Expressions- und Klonierungsvektoren sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die dem Vektor die Fähigkeit verleiht, in einer oder mehreren selektierten Wirtszellen zu replizieren. Die Selektion des geeigneten Vektors hängt 1) davon ab, ob er zur DNA-Amplifikation oder zur DNA-Expression verwendet wird, hängt 2) von der Größe der in den Vektor zu insertierenden DNA, und 3) von der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle ab. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten je nach seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und der Wirtszelle, für die er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere der folgenden Komponenten: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz. Zur Konstruktion von geeigneten Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgelisteten Komponenten, die erwünschten Kodier- und Kontrollsequenzen, umfassen, werden Standard-Ligationsverfahren eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der erwünschten Form neuerlich ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden. Für die Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische üblicherweise verwendet, um E.-coli-Zellen, z.B. E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446), zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz, sofern dies passend ist, selektiert. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder durch ein Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in zahlreichen verschiedenen prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen exprimiert werden. Geeignete Prokaryoten umfassen gramnegative oder grampositive Organismen, beispielsweise E. coli oder Bacilli. Ein bevorzugter Klonierwirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl auch andere gramnegative oder grampositive Prokaryoten, wie E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325), Pseudomonas-Spezies oder Serratia Marcesans, geeignet sind.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind hierin eukaryotische Mikroben wie Fadenpilze oder Hefe geeignete Wirte für Vektoren. Saccharomyces cerevisiae, oder gewöhnliche Bäckerhefe, ist der am häufigsten verwendete unter den nieder eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Es sind jedoch zahlreiche andere Gattungen, Spezies und Stämme gewöhnlich erhältlich und hierin nützlich, wie beispielsweise S. pombe (Beach & Nurse, Nature 290, 140 (1981)); Kluyveromyces lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983)); Yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.700), Trichoderma reesia (EP 244.234), Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); und Aspergillus-Wirte wie A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger (Kelly & Hynes, EMBO J. 4, 475–479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen können auch aus mehrzelligen Organismen abstammen. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten in der Lage. Im Prinzip kann jegliche höhere eukaryotische Zellkultur bearbeitet werden, unabhängig davon, ob aus einer Wirbeltier- oder Wirbellosen-Kultur, wobei jedoch Zellen aus Säugetieren wie Menschen bevorzugt sind. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirusstämme und Varianten sowie entsprechende permissive Insektenwirtszellen aus Wirten wie Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx-mori-Wirtszellen wurden bereits identifiziert. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, J.K. Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 8, Plenum Publishing, 277–279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Zahlreiche solche Virusstämme sind öffentlich erhältlich, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV, und solche Viren können als das Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffeln, Sojabohnen, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das bereits davor manipuliert wurde, um die PTP-λ-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für ein PTP-λ-Polypeptid kodierende DNA auf den Pflanzenzellwirt transferiert, sodass der transfiziert wird und, unter geeigneten Umständen, die PTP-λ-DNA exprimiert. Darüber hinaus sind Regulations- und Signalsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, verfügbar, wie beispielsweise der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Weiters sind DNA-Segmente, die aus der Stromauf-Region des T-DNA-780-Gens isoliert wurden, in der Lage, Transkriptionskonzentrationen von in Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinantem, DNA-hältigen Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu steigern. Siehe die EP 321.196, veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Das Interesse war nun aber bisher an Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist an sich bekannt. Siehe Tissue Culture, Academic Press, Kruse & Patterson (Hrsg.) (1973). Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenzelllinie (293 oder 293-Zellen, die zum Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen 9BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub & Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); canine Nierenzellen (MDCK, ATCC CCL34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44068 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomzelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind menschliche embryonale Nieren-293-Zellen und Chinahamster-Eierstockzellen.
Besonders nützlich bei der Durchführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression von DNA, die für ein PTP-λ-Polypeptid kodiert, in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, wirksam in einer Wirtszelle zu replizieren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und, daraufhin, hohe Konzentrationen an einem erwünschten Polypeptid, für das der Expressionsvektor kodiert, synthetisiert. Vorübergehende Systeme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die einfache positive Identifikation von Polypeptiden, für die Klon-DNAs kodieren, sowie das rasche Screenen solcher Polypeptide auf biologische oder physiologische Eigenschaften. Somit sind vorübergehende Expressionssysteme zum Zweck der Identifikation von Analoga und Varianten eines PTP-λ-Polypeptids im Rahmen der Erfindung besonders nützlich.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese der PTP-λ-Polypeptide in rekombinanter Wirbeltier-Zellkultur geeignet sind, werden in Getting et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantel et al., Nature 281, 40–46 (1979); Levinson et al.; EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben. Besonders nützliche Plasmide zur Säugetierzellkultur-Expression der PTP-λ-Polypeptide sind pRK5 (EP 307.247) oder pSVI6B (PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/08291).
Andere Klonier- und Expressionsvektoren, die zur Expression der PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung in zahlreichen verschiedenen Wirtszellen geeignet sind, werden beispielsweise in der EP 457.758, veröffentlicht am 27. November 1991, beschrieben. Zahlreiche verschiedene Expressionsvektoren sind zur Zeit im Handel erhältlich. Ein Beispiel für einen im Handel erhältlichen Hefe-Expressionsvektor ist pPIC.9 (Invitrogen), während ein im Handel erhältlicher Expressionsvektor, der zur Transformation von E.-coli-Zellen geeignet ist, PET15b (Novagen) ist.
C. Kultivieren der Wirtszellen
Prokaryotische Zellen, die verwendet werden, um die PTP-λ-Polypeptide dieser Erfindung zu produzieren, werden in geeigneten Medien, wie im Allgemeinen von Sambrook et al., s.o., beschrieben, kultiviert.
Säugetierzellen können in zahlreichen verschiedenen Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma) sind zum Kultivieren der Wirtszellen geeignet. Darüber hinaus kann jegliches der in Ham & Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979); Barnes & Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); in der US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195 oder im US-Patent Re. 30.985 beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jegliches dieser Medien kann je nach Bedarf mit Hormonen und/oder Wachstumsfaktoren (wie Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie dem Arzneimittel Gentamycin^TM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer gleichwertigen Energiequelle ergänzt sein. Jegliche anderen erforderlichen Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen, die Fachleuten bekannt sind, eingebunden sein. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH und dergleichen, sind geeigneterweise jene, die davor für die zur Klonierung oder Expression, je nachdem, selektierte Wirtszelle verwendet wurden, und sind für durchschnittliche Fachleute ersichtlich.
Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in In-vitro-Zellkultur sowie Zellen, die in einem Wirtstier oder einer Wirtspflanze vorhanden sind.
Weiters wird in Betracht gezogen, dass die PTP-λ-Polypeptide dieser Erfindung durch homologe Rekombination oder mittels rekombinanter Produktionsverfahren unter Verwendung von Kontrollelementen, die in Zellen eingeführt wurden, die bereits für das bestimmte PTP-λ-Polypeptid kodierende DNA enthalten, produziert werden können.
D. Detektion von Genamplifikation/expression
Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting oder Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen werden. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P. Es können jedoch auch andere Verfahren, wie beispielsweise der Einsatz von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid, verwendet werden. Das Biotin dient dann als eine Stelle zur Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit zahlreichen verschiedenen Markierungen, wie Radionucliden, Fluoreszenzmarkern, Enzymen oder dergleichen, markiert sein können. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Protein-Duplices, erkennen können. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wobei der Duplex an die Oberfläche gebunden wird, sodass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren, wie immunhistochemisches Färben von Gewebeschnitten und Tests an Zellkultur oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren, gemessen werden. Mittels immunhistochemischer Färbungsverfahren wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratation und Fixierung, gefolgt von einer Reaktion mit markierten Antikörpern, die für das gebundene Genprodukt spezifisch sind, worin die Markierungen üblicherweise per Sichtprüfung nachweisbar sind, wie z.B. enzymatische Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Lumineszenzmarkierungen und dergleichen. Ein besonders empfindliches Färbungsverfahren, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird von Hse et al., Am. J. Clin. Pharm. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
Antikörper, die zur immunhistochemischen Färbung und/oder zum Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem beliebigen Tier hergestellt werden. Praktischerweise können die Antikörper gegen ein natives PTP-λ-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid basierend auf der hierin bereitgestellten DNA-Sequenz, wie nachstehend noch näher beschrieben, hergestellt werden.
E. Aminosäuresequenzvarianten von nativen PTP-λ-Polypeptiden
Aminosäuresequenzvarianten von nativen PTP-λ-Polypeptiden werden mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, durch Einführen von geeigneten Nucleotidänderungen in eine PTP-λ-DNA oder durch In-vitro-Synthese des erwünschten Polypeptids hergestellt. Bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten gibt es zwei prinzipielle Variablen: die Position der Mutationsstelle und die Art der Mutation. Unter Ausnahme von natürlich vorkommenden Allelen, die die Manipulation der DNA-Sequenz, die für das PTP-λ-Polypeptid kodiert, nicht erfordern, werden die Aminosäuresequenzvarianten von PTP-λ-Polypeptiden vorzugsweise durch Mutieren der DNA konstruiert, um entweder ein Allel oder eine Aminosäuresequenzvariante, die nicht in der Natur vorkommt, zu erhalten.
Eine Gruppe der Mutationen wird innerhalb von zumindest einer der Phosphatasedomänen (PTPasel und/oder PTPasell) eines nativen PTP-λ-Proteins geschaffen. In Anbetracht der Einbindung dieser Domänen in die enzymatische Aktivität von PTP λ wird von Aminosäureänderungen innerhalb dieser Domänen erwartet, dass sie zu ausgeprägten Veränderungen an den enzymatischen Eigenschaften der nativen Proteine führen. Nicht-konservative Substitutionen können schließlich zu PTP-λ-Varianten führen, die die Fähigkeit verlieren, Tyrosine zu dephosphatisieren, und sind daher als Antagonisten zu nativer PTP λ nützlich. PTP-λ-Varianten, die mutiert sind, um die enzymatische Aktivität der nativen Proteine zu steigern, können auch gewonnen werden und finden beispielsweise als potente Vermittler von Zelladhäsion Verwendung.
In ähnlicher Weise wird von Aminosäureänderungen im MAM von IgG-Domänen der nativen PTP-λ-Proteine angenommen, dass sie die Fähigkeit dieser Rezeptoren, homotypische Zelladhäsion zu vermitteln, und die Spezifität der vermittelten homophilen Wechselwirkung beeinflussen.
Alternativ oder zusätzlich dazu können Aminosäureänderungen je nach dem zu erreichenden Ziel an Stellen, die sich in PTP-λ-Proteinen verschiedener Spezies unterscheiden, oder in hoch konservierten Regionen vorgenommen werden. Stellen an solchen Positionen werden typischerweise in Serie modifiziert, z.B. durch (1) erstmals Substituieren mit einer konservativen Auswahl und anschließend, je nach den bereits erzielten Resultaten, mit einer radikaleren Auswahl, (2) Deletieren des Targetrests oder der Targetreste oder (3) Insertieren von Resten derselben oder einer anderen Klasse neben der lokalisierten Stelle oder durch Kombinationen der Optionen 1–3. Ein hilfreiches Verfahren wird als "Alanin-Scanning" bezeichnet (Cunningham & Wells, Science 244, 1081–1085 (1989)). Von der Ersetzung von Sequenzmotiven innerhalb von MAM-, IgG-, FNIII- oder PTPase-Domänen der nativen PTP-λ-Proteine der vorliegenden Erfindung durch Sequenzen aus nativen PTP-κ- und/oder PTP-μ-Rezeptoren wird erwartet, dass sie zu Varianten mit veränderten Spezifitäten führt.
In wiederum einer anderen Gruppe der variablen PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kann eine oder mehrere der funktionell weniger signifikanten Domänen deletiert oder deaktiviert werden. Die Deletion oder Deaktivierung der Transmembrandomäne ergibt beispielsweise lösliche Varianten des nativen Proteins. Alternativ oder zusätzlich dazu kann die zytoplasmatische Domäne deletiert, trunkiert oder in anderer Weise verändert werden.
Natürlich vorkommende Aminosäuren werden basierend auf gemeinsamen Seitenketteneigenschaften in die folgenden Gruppen eingeteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral hydrophob: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.

Konservative Substitutionen umfassen das Austauschen eines Elements innerhalb einer Gruppe gegen ein anderes Element innerhalb derselben Gruppe, während nicht-konservative Substitutionen das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen gegen ein anderes einer anderen Klasse mit sich bringt. Wesentliche Veränderungen von Funktion oder immunologischer Identität erfolgen durch Selektieren von Substitutionen, die weniger konservativ sind, d.h. sich stärker in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur der Polypeptidhauptkette im Bereich der Substitution, beispielsweise in Form einer Faltblatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Targetstelle oder (c) des Hauptteils der Seitenkette unterscheiden. Die Substitutionen, von denen im Allgemeinen angenommen wird, dass sie die größten Veränderungen der Eigenschaften der neuen nativen PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung hervorbringen, sind jene, in denen (a) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl, anstelle eines (oder durch einen) hydrophoben Rest(s), z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert wird; (b) ein Cystein oder Prolin anstelle eines (oder durch einen) jeden beliebigen anderen Rest(s) substituiert wird; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, anstelle eines (oder durch einen) elektronegativen Rest(s), z.B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert wird; oder (d) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, anstelle eines (oder durch einen) Rest(s), der keine Seitenkette aufweist, z.B. Glycin, substituiert wird.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, noch bevorzugter von etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend. Typischerweise sind die Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen oder nur die zytoplasmatischen Domänen deletiert. Es ist jedoch auch eine Deletion vom C-Terminus zu jeder anderen geeigneten Stelle, die N-terminal zur Transmembranregion steht, die die biologische Aktivität oder immunologische Kreuzreaktivität einer nativen PTP λ aufrechterhält, geeignet.
Eine bevorzugte Klasse von Substitutions- und/oder Deletionsvarianten der vorliegenden Erfindung sind jene, die eine Transmembranregion eines neuen PTP-λ- Moleküls einbinden. Transmembranregionen sind hoch hydrophobe oder lipophile Domänen, die die geeignete Größe haben, um die Lipid-Doppelschicht der Zellmembran zu überspannen. Es wird angenommen, dass sie das PTP-λ-Protein in der Zellmembran verankern und homotypische Komplexbildung ermöglichen. Deaktivierung der Transmembrandomäne, typischerweise durch Deletion oder Substitution von Transmembrandomänen-Hydroxylierungsresten, erleichtert die Gewinnung und Formulierung durch Reduzieren ihrer Zell- oder Membranlipid-Affinität und Verbessern ihrer Wasserlöslichkeit. Werden die Transmembran- und Zytoplasma-Domänen deletiert, so wird das Einführen von möglicherweise immunogenen Epitopen, entweder durch Aussetzen von sonst intrazellulären Polypeptiden, die vom Körper als fremd erkannt werden können, oder durch Insertion von heterologen Polypeptiden, die möglicherweise immunogen sind, vermieden. Eine Deaktivierung der Membranbindungsfunktion erfolgt durch Deletion von ausreichend vielen Resten, um ein im Wesentlichen hydrophiles Hydropathie-Diagramm an dieser Stelle zu bilden, oder durch Substituieren mit heterologen Resten, die dasselbe Resultat erzielen.
Ein grundlegender Vorteil der Transmembran-deaktivierten Varianten der PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung ist, dass sie in das Kulturmedium von rekombinanten Wirten sekretiert werden können. Diese Varianten sind in Körperflüssigkeiten wie Blut löslich und weisen keine wahrnehmbare Affinität für Zellmembranlipide auf, was ihre Gewinnung aus rekombinanter Zellkultur erheblich erleichtert. Allgemein gesagt weisen solche löslichen Varianten keine funktionelle Transmembrandomäne und vorzugsweise auch keine funktionelle zytoplasmatische Domäne auf. Die Transmembrandomäne kann beispielsweise durch jegliche Aminosäuresequenz, z.B. eine zufällige oder vorbestimmte Sequenz mit etwa 5 bis 50 Serin-, Threonin-, Lysin-, Arginin-, Glutamin-, Asparaginsäure- und ähnlichen hydrophilen Resten, die alle zusammen ein hydrophiles Hydropathie-Profil aufweisen, substituiert sein. Ähnlich wie die deletierten (trunkierten) löslichen Varianten werden diese Varianten in das Kulturmedium von rekombinanten Wirten sekretiert.
Aminosäureinsertionen umfassen Amino- und/oder Carboxy-terminale Fusionen in einem Längenbereich von einem Rest bis hin zu Polypeptiden, die hundert oder mehr Reste enthalten, sowie Insertionen innerhalb der Sequenz von einzelnen oder mehreren Aminosäureresten. Insertionen innerhalb der Sequenz (d.h. Insertionen innerhalb der PTP-λ-Proteinaminosäuresequenz) können im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, noch bevorzugter 1 bis 5 Resten, noch bevorzugter 1 bis 3 Resten, liegen. Beispiele für terminate Insertionen umfassen PTP-λ-Polypeptide mit einem N-terminalen Methionylrest, ein künstliches Produkt aus seiner direkten Expression in bakterieller rekombinanter Zellkultur und Fusion einer heterologen, N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus des PTP-λ-Moleküls, um die Sekretion der reifen PTP λ aus rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Solche Signalsequenzen werden im Allgemeinen aus der beabsichtigten Wirtszellspezies gewonnen und sind somit homolog zu dieser. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder Ipp für E. coli, Alpha-Faktor für Hefe und Virussignale wie Herpes-gD für Säugetierzellen.
Andere Insertionsvarianten des nativen PTP-λ-Moleküls umfassen die Fusion des N- oder C-Terminus des PTP-λ-Moleküls an immunogene Polypeptide, z.B. bakterielle Polypeptide wie β-Lactamase oder ein Enzym, für das der E.-cofi-trp-Locus kodiert, oder Hefeprotein, sowie C-terminate Fusionen mit Proteinen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, wie z.B. Immunglobulinregionen (vorzugsweise konstante Immunglobulinregionen), Albumin oder Ferritin, wie in der WO 89/02922, veröffentlicht am 6. April 1989, beschrieben wird.
Weitere Insertionsvarianten sind immunologisch aktive Derivate der neuen PTP-λ-Polypeptide, die das PTP-Polypeptid und ein Polypeptid, das ein Epitop eines immunologisch kompetenten Fremd-Polypeptids enthält, d.h. ein Polypeptid, das in der Lage ist, eine Immunantwort im Tier hervorzurufen, an das die Fusion verabreicht werden soll, oder das in der Lage ist, durch einen Antikörper gebunden zu werden, der gegen ein Fremd-Polypeptid gezüchtet wurde, umfassen. Typische Beispiele für solche immunologisch kompetenten Polypeptide sind Allergene, Autoimmunepitope oder andere potente Immunogene oder Antigene, die durch bereits existierende Anti körper im Fusionsrezipienten erkannt werden, einschließlich bakterieller Polypeptide wie trpLE, β-Galactosidase, viraler Polypeptide wie Herpes-gD-Protein und dergleichen.
Immunogene Fusionen werden durch Vernetzen in vitro oder durch rekombinante Zellkultur, transformiert mit DNA, die für ein immunogenes Polypeptid kodiert, gebildet. Vorzugsweise ist die immunogene Fusion eine, in der die immunogene Sequenz mit einem neuen PTP-λ-Molekül oder einem Fragment davon durch (eine) Peptidbindung(en) verbunden oder in dieses insertiert ist. Diese Produkte bestehen daher aus einer unverzweigten Polypeptidkette, die das PTP-λ-Epitop und zumindest ein Epitop, das für das PTP-λ-Polypeptid fremd ist, enthält. Es gilt daher zu verstehen, dass es im Schutzumfang dieser Erfindung liegt, die Epitope an einer beliebigen Stelle innerhalb eines PTP-λ-Moleküls der vorliegenden Erfindung oder eines Fragments davon einzuführen. Diese immunogenen Insertionen sind besonders nützlich, wenn sie in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger formuliert und einem Individuum verabreicht werden, um Antikörper gegen das PTP-λ-Molekül zu züchten, worin die Antikörper wiederum als Diagnostika, bei Gewebetypisierung oder zur Reinigung der neuen PTP-λ-Polypeptide durch Immunaffinitätsverfahren, die an sich bekannt sind, nützlich sind. Alternativ dazu werden bei der Reinigung der PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung Bindungspartner für das fusionierte Fremd-Polypeptid, z.B. Antikörper, Rezeptoren oder Liganden, verwendet, um die Fusion aus unreinen Beimischungen zu adsorbieren, wonach die Fusion eluiert und, sofern erwünscht, die neue PTP λ aus der Fusion, z.B. durch enzymatische Spaltung, gewonnen wird.
Da es häufig schwierig ist, im Vorhinein die Eigenschaften einer PTP-λ-Polypeptid-Variante zu bestimmen, wird verständlich sein, dass Screening in gewisser Weise erforderlich sein wird, um die optimale Variante zu selektieren.
Nach Identifikation der erwünschten Mutation(en) kann das für eine PTP-λ-Variante kodierende Gen beispielsweise durch chemische Synthese, wie hierin zuvor bereits beschrieben, gewonnen werden. Noch bevorzugter wird DNA, die für eine PTP-λ- Aminosäuresequenzvariante kodiert, durch ortsgerichtete Mutagenese von DNA, die für eine früher hergestellte Variante oder eine Nichtvarianten-Version der PTP λ kodiert, hergestellt. Ortsgerichtete (ortspezifische) Mutagenese ermöglicht die Herstellung von PTP-λ-Varianten durch die Verwendung spezifischer Oligonucleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenz der erwünschten Mutation kodieren, sowie einer ausreichenden Anzahl an benachbarten Nucleotiden, um eine Primersequenz mit ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um einen stabilen Duplex an beiden Seiten der durchquerten Deletionsverbindung zu bilden. Typischerweise wird ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nucleotiden bevorzugt, wobei etwa 5 bis 10 Reste an beiden Seiten der Verbindung der Sequenz verändert werden. Im Allgemeinen sind die Verfahren der ortspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt, wie Publikationen wie Edelman et al., DNA 2, 183 (1983), beispielsweise zeigen. Wie sicherlich bekannt ist, verwendet das ortspezifische Mutageneseverfahren typischerweise einen Phagenvektor, der sowohl in einzelsträngiger als auch doppelsträngiger Form besteht. Typische Vektoren, die zur ortsgerichteten Mutagenese nützlich sind, umfassen Vektoren wie den M13-Phagen, wie beispielsweise in Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981), offenbart ist. Dieser und andere Phagenvektoren sind im Handel erhältlich, und ihre Verwendung ist Fachleuten durchwegs bekannt. Ein vielseitiges und effizientes Verfahren zur Konstruktion von Oligodesoxyribonucleotid-gerichteten ortspezifischen Mutationen in DNA-Fragmenten unter Verwendung von aus M13 abstammenden Vektoren wurde von M.J. Zoller und M. Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487–6500 (1982), veröffentlicht. Auch können Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsursprung enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987)), verwendet werden, um einzelsträngige DNA zu gewinnen. Alternativ dazu werden Nucleotidsubstitutionen durch Synthetisieren des geeigneten DNA-Fragments in vitro und durch Amplifizieren dieses Fragments mittels PCR-Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, eingeführt.
Das PCR-Verfahren kann auch bei der Bildung von Aminosäuresequenzvarianten eines PTP-λ-Polypeptids verwendet werden: in einem spezifischen Beispiel der PCR-Mutagenese wird Matrix-Plasmid-DNA (1 μg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease, die eine einzige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region aufweist, linearisiert. Von diesem Material werden 100 ng zu einem PCR-Gemisch, das PCR-Puffer, der die vier Desoxynucleotidtriphosphate enthält und in den GeneAmp^®-Sets (erhalten bei Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, & Emeryville, CA) enthalten ist, und 25 pmol von jedem Oligonucleotidprimer enthält, auf ein Endvolumen von 50 μl zugesetzt. Das Reaktionsgemisch bekommt eine Deckschicht aus 35 μl Mineralöl. Die Reaktion wird 5 min lang bei 100 °C denaturiert, kurz auf Eis platziert, und anschließend wird 1 μl Thermus-aquaticus- (Taq-) DNA-Polymerase (5 Einheiten/μl), erhalten bei Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, & Emeryville, CA, unter der Mineralölschicht zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen DNA Thermal Cycler (erhalten bei Perkin-Elmer Cetus) insertiert, der wie folgt programmiert ist:
2 min, 55 °C,
30 s, 72 °C, dann 19 Zyklen wie folgt:
30 s, 94 °C,
30 s, 55 °C und
30 s, 72 °C.
Am Ende des Programms wird die Reaktionsphiole aus dem Wärmezyklierer entfernt, und die wässrige Phase wird in eine neue Phiole transferiert, mit Phenol/Chloroform (50:50, Vol.) extrahiert und Ethanol-gefällt, und die DNA wird mittels Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird daraufhin geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Varianten, Kassettenmutagenese, basiert auf dem Verfahren, das von Wells et al. (Gene 34, 315 (1985)) beschrieben wird.
Darüber hinaus kann das so genannte Phagemiddisplayverfahren zur Herstellung von Aminosäuresequenzvarianten von nativen PTP-λ-Polypeptiden oder PTP-λ-Polypeptid-Varianten oder ihren Fragmenten nützlich sein. Dieses Verfahren umfasst (a) das Konstruieren eines replizierbaren Expressionsvektors, der ein erstes Gen, das für einen zu mutierenden Rezeptor kodiert, ein zweites Gen, das für zumindest einen Teil eines natürlichen oder Wildtyp-Phagenhüllproteins kodiert, worin das erste und das zweite Gen heterolog sind, und ein Transkriptionsregulationselement, das operabel an das erste und das zweite Gen gebunden ist, umfasst, wodurch eine Genfusion gebildet wird, die für ein Fusionsprotein kodiert; (b) das Mutieren des Vektors an einer oder mehreren ausgewählten Positionen innerhalb des ersten Gens, wodurch eine Familie verwandter Plasmide gebildet wird; (c) das Transformieren geeigneter Wirtszellen mit den Plasmiden; (d) das Infizieren der transformierten Wirtszellen mit einem Helferphagen, der ein Gen aufweist, das für das Phagenhüllprotein kodiert; (e) das Kultivieren der transformierten infizierten Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Bildung rekombinanter Phagemidpartikel, die zumindest einen Teil des Plasmids enthalten und in der Lage sind, den Wirt zu transformieren, geeignet sind, worin die Bedingungen so eingestellt sind, dass nicht mehr als eine geringe Menge an Phagemidpartikeln mehr als eine Kopie des Fusionsproteins an der Oberfläche des Partikels aufweisen; (f) das Kontaktieren der Phagemidpartikel mit einem geeigneten Antigen, sodass sich zumindest ein Teil der Phagemidpartikel an das Antigen bindet; und (g) das Trennen der Phagemidpartikel, die sich binden, von jenen, die sich nicht binden. Die Schritte (d) bis (g) können ein oder mehrere Male wiederholt werden. Vorzugsweise steht in diesem Verfahren das Plasmid unter strenger Kontrolle des Transkriptionsregulationselements, und die Kulturbedingungen werden so eingestellt, dass die Menge oder Anzahl an Phagemidpartikeln, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins an der Oberfläche des Partikels aufweisen, weniger als etwa 1 % beträgt. Auch beträgt die Menge an Phagemidpartikeln, die mehr als eine Kopie des Fusionsproteins aufweisen, vorzugsweise weniger als 10 % der Menge an Phagemidpartikel, die eine einzige Kopie des Fusionsproteins aufweisen. Am meisten bevorzugt beläuft sich die Menge auf weniger als 20 %. Typischerweise enthält in diesem Verfahren der Expressionsvektor weiters eine Sekretionssignalsequenz, die an die für jede Untereinheit des Polypeptid kodierende DNA fusioniert ist, und das Transkriptionsregulationselement ist ein Promotorsystem. Bevorzugte Promotorsysteme werden aus lac-Z-, λ_PL-, tac-, T7-Polymerase-, Tryptophan- und alkalische-Phosphatase-Promotoren sowie Kombinationen davon ausgewählt. Auch verwendet das Verfahren normalerweise einen Helferphagen, der aus M13K07, M13R408, M13VCS und Phi X 174 ausgewählt ist. Der bevorzugte Helferphage ist M13K07, und das bevorzugte Hüllprotein ist das M13-Phage-Gen-III-Hüllprotein. Der bevorzugte Wirt ist E. coli sowie Protease-defiziente Stämme von E. coli.
Nähere Details zur obigen Beschreibung und ähnliche Mutageneseverfahren sind in allgemeinen Fachbüchern, wie beispielsweise Sambrook et al., s.o., und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), s.o., zu finden.
F. Glykosylierungsvarianten
Glykosylierungsvarianten sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingebunden. Sie umfassen Varianten, die überhaupt keine Glykosylierung aufweisen (unglykosylierte Varianten), Varianten, die zumindest eine glykosylierte Stelle weniger als die native Form aufweisen (deglykosylierte Varianten), sowie Varianten, in denen die Glykosylierung verändert wurde. Eingebunden sind deglykosylierte und unglykosylierte Aminosäuresequenzvarianten, deglykosylierte und unglykosylierte native PTP λ und andere Glykosylierungsvarianten. Substitutions- oder Deletionsmutagenese kann beispielsweise verwendet werden, um die N- oder O-gebundenen Glykosylierungsstellen in einem nativen PTP-λ-Molekül oder einer PTP-λ-Molekül-Variante der vorliegenden Erfindung zu eliminieren, z.B. kann der Asparaginrest deletiert oder durch einen anderen basischen Rest wie Lysin oder Histidin substituiert werden. Alternativ dazu können flankierende Reste, die die Glykosylierungsstelle bilden, substituiert oder deletiert werden, auch wenn die Asparaginreste hierbei unverändert bleiben, um Glykosylierung durch Eliminieren der Glykosylierungserkennungsstelle zu unterbinden.
Darüber hinaus können unglykosylierte PTP-λ-Polypeptide, die die Glykosylierungsstellen eines nativen Moleküls aufweisen, in rekombinanter prokaryotischer Zellkultur gebildet werden, da Prokaryoten nicht in der Lage sind, Glykosylierung in Peptide einzuführen.
Glykosylierungsvarianten können durch Selektieren geeigneter Wirtszellen oder mittels In-vitro-Verfahren gebildet werden. Hefe- und Insektenzellen beispielsweise leiten Glykosylierung ein, die sich von jener von Säugetiersystemen signifikant unterscheidet. In ähnlicher Weise werden Säugetierzellen, die einen anderen Spezies- (z.B. Hamster, Maus, Schwein, Rind oder Schaf) oder Gewebeursprung (z.B. Lunge, Leber, Lymphe, Mesenchym oder Epidermis) als die Quelle des PTP-λ-Polypeptids haben, werden routinemäßig auf die Fähigkeit gescreent, Glykosylierungs-Varianten einzuführen, die beispielsweise durch erhöhte Konzentrationen an Mannose oder variable Verhältnisse von Mannose, Fucose, Sialsäure und anderen Zuckern, die typischerweise in Säugetierglykoproteinen zu finden sind, charakterisiert ist. In-vitro-Verarbeitung der PTP λ erfolgt typischerweise durch enzymatische Hydrolyse, z.B. durch Neuraminidaseverdau.
G. Kovalente Modifikationen von PTP-λ-Polypeptiden
Kovalente Modifikationen von PTP-λ-Polypeptiden sind im Schutzumfang hierin aufgenommen. Solche Modifikationen werden üblicherweise durch Umsetzen von Target-Aminosäureresten der PTP-λ-Polypeptide mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Stellen oder terminalen Resten zu reagieren, oder durch Nutzbarmachungsmechanismen posttranslationaler Modifikationen, die in ausgewählten rekombinanten Wirtszellen funktionieren, eingeführt. Die resultierenden kovalenten Derivate sind in Programmen nützlich, die auf die Identifikation von Resten, die für biologische Aktivität, für Immuntests des PTP-λ-Polypeptids oder für die Herstellung von Anti-PTP-λ-Antikörper für Immunaffinitätsreinigung des rekombinanten Produkts wichtig sind, abzielen. Vollständige Deaktivierung der biologischen Aktivität des Proteins nach Umsetzung mit Ninhydrin würde beispielsweise darauf schließen lassen, dass zumindest ein Arginyl- oder Lysylrest für seine Aktivität maßgeblich ist, wonach die einzelnen Reste, die unter den ausgewählten Bedingungen modifiziert wurden, durch Isolierung eines Peptidfragments, das den modifizierten Aminosäurerest enthält, identifiziert werden. Solche Modifikationen fallen in den Bereich des gewöhnlichen Fachwissens auf dem Gebiet der Erfindung und werden ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt.
Cysteinylreste werden am üblichsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen) wie Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propansäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimide, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlorquecksilber(II)-benzoat, 2-Chlorquecksilber(II)-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat bei einem pH von 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Para-Bromphenacylbromid ist auch nützlich; die Reaktion erfolgt vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0.
Lysinyl- und Amino-terminale Reste werden mit Bernsteinsäureanhydrid oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Mittel zur Derivatisierung von α-Amino-hältigen Resten umfassen Imidoester wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien, zu denen Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin zählen, modifiziert. Derivatisierung von Argininresten erfordert aufgrund des hohen pK_a der funktionellen Guanidingruppe, dass die Reaktion unter basischen Bedingungen abläuft. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie der Arginin-epsilon-Aminogruppe reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann, mit besonderem Interesse am Einführen von Spektralmarkierungen in Tyrosylreste, durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan gebildet werden. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmuntests herzustellen.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid modifiziert. Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere Modifikationen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Threonyl- oder Tyrosylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeder beliebigen C-terminalen Carboxylgruppe. Die Moleküle können weiters kovalent an nicht-proteinartige Polymere, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf die in U.S.S.N. 07/275.296 oder den US-Patenten Nr. 4.640.835, 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschriebene Weise gebunden werden.
Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zur Herstellung von intramolekularen Aggregaten von PTP-λ-Polypeptiden mit Polypeptiden sowie zur Vernetzung des PTP-λ-Polypeptids mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung in Tests oder Affinitätsreinigung nützlich. Darüber hinaus liefert eine Untersuchung von Zwischenkettenvernetzungen direkte Information zur Konformationsstruktur. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, homobifunktionelle Imidoester und bifunktionelle Maleinimide. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ dazu werden reaktive, wasserunlösliche Matrices wie Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die Systeme reaktiver Substrate, die in den US-Patenten Nr. 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; und 4.330.440 beschrieben werden, zur Proteinimmobilisierung und -vernetzung verwendet.
Bestimmte posttranslationale Modifikationen sind das Resultat der Wirkung rekombinanter Wirtszellen auf das exprimierte Polypeptid. Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig posttranslational zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten desamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen desamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen in den Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere posttranslationale Modifikationen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl-, Threonyl- oder Tyrosylresten und Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)).
Weitere Derivate der PTP-λ-Polypeptide hierin sind die so genannten "Immunoadhäsine", die chimäre, Antikörper-ähnliche Moleküle sind, die die funktionelle(n) Domäne(n) eines Bindungsproteins (üblicherweise eines Rezeptors, eines Zelladhäsionsmoleküls oder eines Liganden) mit einer Immunglobulinsequenz kombinieren. Das häufigste Beispiel für diesen Typ von Fusionsprotein kombiniert die Gelenks- und Fc-Regionen eines Immunglobulins (Ig) mit Domänen eines Zelloberflächenrezeptors, der einen spezifischen Liganden erkennt. Dieser Molekültyp wird als "Immunoadhäsin" bezeichnet, da er "Immun-" und "Adhäsions-" Funktionen kombiniert; andere häufig verwendete Bezeichnungen sind "Ig-Chimäre", "Ig-" oder "Fc-Fusionsprotein" oder "Rezeptorglobulin".
Bis heute wurde auf dem Gebiet der Erfindung bereits über mehr als fünfzig Immunoadhäsine berichtet. Immunoadhäsine, über die in der Literatur berichtet wurde, umfassen beispielsweise Fusionen des T-Zellrezeptors (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selektin (Homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221–2229 (1990); Watson et al, Nature 349, 164–167 (1991)); E-Selektin (Mulligan et al., J. Immunol. 151, 6410–6417 (1993); Jacob et al., Biochemistry 34, 1210–1217 (1995)); P-Selektin (Mulligan et al., s.o.; Hollenbaugh et al., Biochemistry 34, 5678–5684 (1995)); ICAM-1 (Stauton et al., J. Exp. Med. 176, 1471–1476 (1992); Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993); Roep et al., Lancet 343, 1590–1593 (1994)); ICAM-2 (Damle et al., J. Immunol. 148, 665–671 (1992)); ICAM-3 (Holness et al., J. Biol. Chem. 270, 877–884 (1995)); LFA-3 (Kanner et al., J. Immunol. 148, 2-23-29 (1992)); L1-Glykoprotein (Doherty et al., Neuron 14, 57–66 (1995)); TNF-R1 (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 21, 2883–2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); TNF-R2 (Zack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2335–2339 (1993); Wooley et al., J. Immunol. 151, 6602–6607 (1993)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); IgE-Rezeptor α (Ridgway & Gorman, J. Cell. Biol. 115, Abstract 1448 (1991)); HGF-Rezeptor (M.R. Mark et al., J. Biol. Chem. (1992), eingereicht); IFN-γR-α- und -β-Kette (Marsters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5401–5405 (1995)); trk-A, -B und -C (Shelton et al., J. Neurosci. 15, 477–491 (1995)); IL-2 (Landolfi, J. Immunol. 146, 915–919 (1991)); IL-10 (Zheng et al., J. Immunol. 154, 5590–5600 (1995)).
Der einfachste und direkteste Immunoadhäsinentwurf kombiniert die Bindungsregion(en) des "Adhäsin"-Proteins mit den Gelenks- und Fc-Regionen einer Immunglobulinschwerkette. Üblicherweise wird bei der Herstellung der PTP-λ-Immunglobulinchimären der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure, die für das erwünschte PTP-λ-Polypeptid kodiert, C-terminal an Nucleinsäure, die für den N-Terminus einer konstanten Immunglobulindomänensequenz kodiert, fusioniert, wobei jedoch auch N-terminale Fusionen möglich sind. Typischerweise behält in solchen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest funktionell aktive Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulinschwerkette bei. Fusionen werden auch am C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zur CH1-Domäne der schweren Kette oder zur entsprechenden Region der leichten Kette gebildet. Die exakte Stelle, an der die Fusion gebildet wird, ist nicht maßgeblich; bestimmte Stellen sind durchwegs bekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretions- oder Bindungseigenschaften der PTP-λ-Immunglobulinchimären zu optimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sequenz eines nativen, reifen PTP-λ-Polypeptids oder einer löslichen (Transmembrandomänen-deaktivierten) Form davon an den N-Terminus des C-terminalen Abschnitts eines Antikörpers (insbesondere der Fc-Domäne), der die Effektorfunktionen eines Immunglobulins, z.B. von IgG-1, enthält, fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Region der schweren Kette an die PTP-λ-Sequenz zu fusionieren. Noch bevorzugter wird jedoch eine Sequenz, die in der Gelenksregion unmittelbar stromauf von der Papainspaltungsstelle (die IgG-Fc chemisch definiert; Rest 216, wobei der erste Rest der konstanten Region der schweren Kette als 114 angenommen wird (Kobet et al., s.o.), oder analoge Stellen anderer Immunglobuline) beginnt, in der Fusion verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die PTP-λ-Sequenz (voller Länge oder löslich) an die Gelenksregion und die CH2- und CH3- oder CH1-, Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen einer IgG-1-, IgG-2- oder IgG-3-Schwerkette fusioniert. Die exakte Stelle, an der die Fusion gebildet wird, ist nicht maßgeblich, und die optimale Stelle kann mittels Routineverfahren bestimmt werden.
In manchen Ausführungsformen sind die PTP-λ-Immunglobulinchimären als Multimere assembliert, und insbesondere als Homodimere oder -tetramere (WO 91/08298). Im Allgemeinen weisen diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen auf. Eine grundlegende, vier Ketten umfassende Struktureinheit ist die Form, in der IgG, IgD und IgE existieren. Eine Vierereinheit wird in den hochmolekularen Immunglobulinen wiederholt; IgM existiert im Allgemeinen als ein Pentamer von grundlegenden vier Einheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin, und gegebenenfalls IgG-Globulin, kann auch in multimerer Form in Serum existieren. Im Fall eines Multimers können alle vier Einheiten die gleichen oder unterschiedliche sein.
Verschiedene Beispiele für assemblierte PTP-λ-Immunglobulinchimären, die in den Schutzumfang der Erfindung fallen, sind nachstehend schematisch dargestellt:

(a) AC_L-AC_L;
(b) AC_H-[AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, oder V_LC_L-AC_H];
(c) AC_L-AC_H-[AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H, oder V_LC_L-V_HC_H];
(d) AC_L-V_HC_H-[AC_H, oder AC_L-V_HC_H, oder V_LC_L-AC_H];
(e) V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H, oder V_LC_L-AC_H]; und
(f) [A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H]₂,

_L

_H

_L

_H

Im Sinne der Einfachheit zeigen die obigen Strukturen nur zentrale Eigenschaften; sie geben keine Bindung (J) oder andere Domänen der Immunglobuline an, und auch Disulfidbindungen sind nicht gezeigt. Wo solche Domänen jedoch für Bindungsaktivität erforderlich sind, sollen sie als an den üblichen Positionen, die sie in den Immunglobulinmolekülen einnehmen, vorhanden angenommen werden.
Alternativ dazu können die PTP-λ-Aminosäuresequenzen zwischen Immunglobulinschwerketten- und -leichtkettensequenzen insertiert werden, sodass ein Immunglobulin, das eine chimäre Schwerkette umfasst, erhalten wird. In dieser Ausführungsform werden die PTP-λ-Polypeptidsequenzen an das 3'-Ende einer Immunglobulinschwerkette in jedem Arm eines Immunglobulins fusioniert, entweder zwischen der Gelenks- und der CH2-Domäne oder zwischen der CH2- und der CH3-Domäne. Über ähnliche Konstrukte wurde bereits von H.R. Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991), berichtet.
Auch wenn die Gegenwart einer Immunglobulinleichtkette in den Immunoadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulinleichtkette, entweder kovalent mit einem PTP-λ-Immunglobulinschwerkettenfusionspolypeptid assoziiert oder direkt an das PTP-λ-Polypeptid fusioniert, vorhanden sein. Im ersten Fall wird DNA, die für eine Immunglobulinleichtkette kodiert, typischerweise mit der DNA, die für das PTP-λ-Immunglobulinschwerkettenfusionsprotein kodiert, coexprimiert. Bei Sekretion werden die hybride schwere Kette und die leichte Kette kovalent assoziiert, um eine Immunglobulin-ähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei Disulfid-gebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Ver fahren, die zur Herstellung solcher Strukturen geeignet sind, sind beispielsweise im US-Patent Nr. 4.816.567, ausgegeben am 28. März 1989, offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Immunglobulinsequenzen, die zur Konstruktion der Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung verwendet werden, aus einer konstanten IgG-Immunglobulinschwerkettendomäne. Für menschliche Immunoadhäsine wird die Verwendung von menschlichen IgG-1- und IgG-3-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein zentraler Vorteil bei der Verwendung von IgG-1 ist, dass IgG-1-Immunadhäsine an immobilisiertem Protein A effizient gereinigt werden können. Dahingegen erfordert die Reinigung von IgG-3 Protein G, ein wesentlich weniger vielseitiges Medium. Bei der Auswahl des Ig-Fusionspartners für eine bestimmte Immunoadhäsinkonstruktion sollten jedoch auch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen in Betracht gezogen werden. Beispielsweise ist das IgG-3-Gelenk länger und flexibler, sodass es größere "Adhäsin"-Domänen aufnehmen kann, die sich nicht korrekt falten oder nicht korrekt funktionieren können, wenn sie an IgG-1 fusioniert werden. Während IgG-Immunoadhäsine typischerweise ein- oder zweiwertig sind, können andere Ig-Subtypen wie IgA und IgM dimere bzw. pentamere Strukturen der grundlegenden Ig-Homodimereinheit entstehen lassen. Multimere Immunoadhäsine sind darin vorteilhaft, dass sie sich an ihre jeweiligen Targets mit größerer Avidität als ihre IgG-basierten Gegenstücke binden können. Beispiele zu solchen Strukturen, über die bereits berichtet wurde, sind CD4-IgM (Traunecker et al., s.o.); ICAM-IgM (Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)); und CD2-IgM (Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177, 1439–1450 (1993)).
Für PTP-λ-Ig-Immunoadhäsine, die für In-vivo-Anwendungen entworfen wurden, sind auch die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die durch die Fc-Region spezifiziert werden, wichtig. Auch wenn IgG-1, IgG-2 und IgG-4 alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen, ist ihre relative Wirksamkeit bei der Aktivierung des Komplementsystems doch unterschiedlich. IgG-4 aktiviert das Komplement nicht, und IgG-2 ist bei Komplementaktivierung wesentlich schwächer als IgG-1. Darüber hinaus bindet sich IgG-2 im Gegensatz zu IgG-1 nicht an Fc-Rezeptoren an einkernigen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG-3 für Komple mentaktivierung optimal ist, beläuft sich seine In-vivo-Halbwertszeit auf etwa ein Drittel der anderen IgG-Isotypen. Eine andere wichtige Überlegung für Immunoadhäsine, die entworfen werden, um als Therapeutika bei Menschen eingesetzt zu werden, ist die Anzahl an allotypischen Varianten des bestimmten Isotyps. Im Allgemeinen werden IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. IgG-1 weist nur vier serologisch definierte allotypische Stellen auf, von denen zwei (G1m und 2) in der Fc-Region angeordnet sind; und eine dieser Stellen, G1m1, ist nicht-immunogen. Dahingegen gibt es in IgG-3 zwölf serologisch definierte Allotypen, die alle in der Fc-Region liegen; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen Allotyp auf, der nicht-immunogen ist. Somit ist die potenzielle Immunogenität eines γ3-Immunoadhäsins größer als jene eines γ1-Immunoadhäsins.
PTP-λ-Ig-Immunoadhäsine werden am praktischsten durch Fusionieren der cDNA-Sequenz, die für den PTP-λ-Teil kodiert, in Raster an eine Ig-cDNA-Sequenz konstruiert. Es kann jedoch auch die Fusion an genomische Ig-Fragmente verwendet werden (siehe z.B. Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987); Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Der letzte Fusionstyp erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen zur Expression. cDNAs, die für konstante IgG-Schwerkettenregionen kodieren, können basierend auf veröffentlichten Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken, die aus Milz oder Lymphozyten aus peripherem Blut abgeleitet sind, mittels Hybridisierungs- oder Polymerasekettenreaktions- (PCR) Verfahren isoliert werden.
Andere Derivate umfassen die neuen Peptide dieser Erfindung, die kovalent an ein nicht-proteinartiges Polymer gebunden sind. Das nicht-proteinartige Polymer ist üblicherweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das sonst nicht in der Natur zu finden ist. Es sind jedoch auch Polymere, die in der Natur vorkommen und mittels Rekombinations- oder In-vitro-Verfahren hergestellt werden, nützlich, wie auch Polymere, die aus natürlichen Quellen isoliert werden. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den Schutzumfang dieser Erfindung, z.B. Polyvinylalkohol und Poly vinylpyrrolidon. Besonders nützlich sind Polyvinylalkylenether wie Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol.
Die PTP-λ-Polypeptide können an verschiedene nicht-proteinartige Polymere, wie beispielsweise Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, in der Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben wird, gebunden werden.
Die PTP-λ-Polypeptide können in Mikrokapseln, beispielsweise durch Koazervierungsverfahren oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt, in kolloidalen Wirkstoffzufuhrsystemen (z.B. Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen werden. Solche Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Oslo (Hrsg.) (1980), offenbart.
H. Anti-PTP-λ-Antikörperherstellung
(i) Polykionale Antikörper
Polyklonale Antikörper gegen ein PTP-λ-Molekül werden im Allgemeinen durch mehrfache subkutane (sk) oder intraperitoneale (ip) Injektionen der PTP λ und eines Adjuvans gezüchtet. Es kann nützlich sein, PTP λ oder ein Fragment, das die Target-Aminosäuresequenz enthält, an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Schüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsininhibitor, und dies unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R'N=C=NR, worin R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg oder 1 μg Konjugat (von Kaninchen bzw. Mäusen) mit 3 Volumina an kom plettem Freundschem Adjuvans und Injizieren der Lösung intradermal an mehreren Stellen immunisiert. Ein Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Konjugat in komplettem Freundschem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Anti-PTP-λ-Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer gesättigt ist. Vorzugsweise werden die Tiere mit dem Konjugat derselben PTP λ, jedoch konjugiert an ein anderes Protein und/oder durch einen anderen Vernetzer, geboostet. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen gebildet werden. Auch werden Aggregationsmittel wie Alaun verwendet, um die Immunantwort zu boosten.
(ii) Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen, d.h. die einzelnen, die Population bildenden Antikörper sind bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch. Somit beschreibt das Adjektiv "monoklonal" die Eigenschaft des Antikörpers, nicht ein Gemisch einzelner Antikörper zu sein.
Die monoklonalen Anti-PTP-λ-Antikörper der vorliegenden Erfindung beispielsweise können unter Verwendung des Hybridomverfahrens hergestellt werden, das zum ersten Mal von Kohler & Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder sie können durch DNA-Rekombinationsverfahren gebildet werden (Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567).
DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, wird leicht unter Verwendung herkömmlicher Verfahren isoliert und sequenziert (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene zu binden, die für die schweren und leichten Ketten von murinen Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)) oder durch kovalentes Binden der gesamten Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulinpolypeptid oder eines Teils davon an die Immunglobulinkodiersequenz. Auf diese Weise werden "chimäre" oder "hybride" Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines monoklonalen Anti-PTP-λ-Antikörpers der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Typischerweise werden solche Nicht-Immunglobulinpolypeptide für die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung substituiert, oder sie werden für die variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines Antikörpers der Erfindung substituiert, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu schaffen, der eine Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für ein PTP-λ-Polypeptid und eine andere Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Proteinsynthesechemie bekannt sind, einschließlich jener, die Vernetzer einbinden, hergestellt werden. Immunotoxine können beispielsweise unter Verwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Für diagnostische Anwendungen werden die Antikörper der Erfindung typischerweise mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Die detektierbare Gruppierung kann jede beliebige sein, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt, ein detektierbares Signal zu produzieren. Die detektierbare Gruppierung kann beispielsweise ein Radioisotop, wie ³H, ¹⁴C, ³²P ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemolumines zierende Verbindung, wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; Biotin; radioaktive isotopische Markierungen, wie z.B. ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C oder ³H, oder ein Enzym, wie alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein.
Jegliches Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung zum separaten Konjugieren des Antikörpers an die detektierbare Gruppierung bekannt ist, kann verwendet werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben sind.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jedem beliebigen bekannten Testverfahren, wie Tests zu kompetitiver Bindung, direkten und indirekten Sandwich-Tests und Immunfällungstests, verwendet werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., 147–158 (1987).
(iii) Humanisierte Antikörper
Verfahren zur Humanisierung von nicht-menschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste, die in ihn aus einer Quelle, die nicht-menschlich ist, eingeführt wurden, auf. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen "Import"-Domäne genommen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)), durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers erfolgen. Folglich sind solche "humanisierten Antikörper" chimäre Antikörper (Cabilly, s.o.), in denen wesentlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Anti körper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Es ist wichtig, dass Antikörper unter Beibehaltung hoher Affinität zum Antigen sowie anderer günstiger biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden, gemäß einem bevorzugten Verfahren, humanisierte Antikörper durch ein Verfahren der Analyse parentaler Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Verwendung von dreidimensionalen Modellen der parentalen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind üblicherweise erhältlich und sind Fachleuten auch bekannt. Computerprogramme, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen selektierter Kandidaten-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen, sind erhältlich. Eine Untersuchung dieser Darstellungen ermöglicht eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste im Funktionieren der Kandidaten-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste selektiert und aus der Consensus- und Importsequenz kombiniert werden, sodass die erwünschte Antikörpereigenschaft, wie erhöhte Affinität für das/die Targetantigen(e), erreicht wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und sehr wesentlich in die Beeinflussung von Antigenbindung eingebunden. Nähere Details hierzu sind in der US-Anmeldung der Seriennummer 07/934.373, eingereicht am 21. August 1992, die eine Continuation-in-Part der Anmeldung der Serien-Nr. 07/715.272, eingereicht am 14. Juni 1991, ist, zu finden.
Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu bilden, die in der Lage sind, bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire an menschlichen Antikörpern, ohne gleichzeitige endogene Immunglobulinproduktion, zu produzieren. Es wurde beispielsweise beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerkettenverbindungsregions- (J_H-) Gens in chimären und Keimlinien-mutierten Mäusen zur vollständigen Inhibierung endogener Antikörperproduktion führt. Der Transfer des menschlichen Keimlinien-Immunglobulingenschemas in solche Keimlinien-mutierte Mäuse führt zur Produktion von menschlichen Antikörpern bei Antigen- Challenge. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993).
(iv) Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für ein PTP-λ-Polypeptid, die andere für ein anderes Antigen. Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Üblicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein & Cuello, Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der zufälligen Zusammenstellung von Immunglobulinschwer- und -leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch von 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise über Affinitätschromatographieschritte erfolgt, ist eher mühsam, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren sind in der PCT-Anmeldung der Veröffentlichungs-Nr. WO 93/08829 (veröffentlicht am 13. Mai 1993) und in Traunecker et al., EMBO 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz werden variable Antikörperdomänen mit den erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) an konstante Immunglobulindomänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulinschwerkettendomäne, die zumindest einen Teil der Gelenks- und der zweiten und dritten konstanten Regionen einer Immunglobulinschwerkette (CH2 und CH3) umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), die die für Leichtkettenbindung erforderliche Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulinschwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, die Immunglobulin leichtkette kodieren, werden in separate Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies sorgt für große Flexibilität bei der Festlegung der gegenseitigen Proportionen der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, in denen ungleiche Verhältnisse zwischen den drei Polypeptidketten, die zur Konstruktion verwendet werden, optimale Ausbeuten liefern. Es ist jedoch auch möglich, die Kodiersequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in ausgeglichenen Verhältnissen zu höheren Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse keine besondere Bedeutung tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer hybriden Immunglobulinschwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem hybriden Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (das für eine zweite Bindungsspezifität sorgt) im anderen Arm. Es wurde erkannt, dass die asymmetrische Struktur die Trennung der erwünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulinleichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls leichte und einfache Trennung ermöglicht. Dieser Ansatz ist in der PCT-Anmeldung WO 94/04690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart.
Nähere Details zur Bildung bispezifischer Antikörper sind beispielsweise in Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986), zu finden.
(v) Heterokonjugierte Antikörper
Heterokonjugierte Antikörper liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugierte Antikörper bestehen aus zwei kovalent gebundenen Antikörpern. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten (US-Patent Nr. 4.676.980), sowie zur Behandlung von HIV-Infektion (PCT-Anmeldungen der Veröffentlichungs-Nr. WO 91/00360 und WO 92/200373; EP 03089 ). Heterokonjugierte Antikörper können unter Verwendung jedes beliebigen, passenden Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und im US-Patent Nr. 4.676.980, zusammen mit zahlreichen Vernetzungsverfahren, offenbart.
I. Peptid- und Nicht-Peptid-Analoga von PTP-λ-Polypeptiden
Peptidanaloga der PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden basierend auf der dreidimensionalen Struktur der nativen Polypeptide modelliert. Peptide können mittels bekannter Verfahren wie Festphasensyntheseverfahren, die anfänglich von Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 15, 2149–2154 (1963), beschrieben wurden, synthetisiert werden. Andere Peptidsyntheseverfahren werden beispielsweise in Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. Auflage (1976), sowie in anderen Nachschlagewerken, die Fachleuten durchwegs zugänglich sind, beschrieben. Eine Zusammenfassung zu Peptidsyntheseverfahren ist in Stuart & Young, Solid Phase Peptide Synthelia, Pierce Chemical Company, Rockford, IL (1984), zu finden. Peptide können auch mittels DNA-Rekombinationsverfahren unter Verwendung einer DNA-Sequenz, die für das erwünschte Peptid kodiert, hergestellt werden.
Zusätzlich zu Peptidanaloga zieht die vorliegende Erfindung auch Nicht-Peptid- (z.B. organische) Verbindungen in Betracht, die im Wesentlichen dieselbe Oberfläche wie die Peptidanaloga der vorliegenden Erfindung aufweisen und daher mit anderen Molekülen auf ähnliche Weise Wechselwirken.
J. Verwendung der PTP-λ-Polypeptide
Die PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind für zahlreiche verschiedene Zwecke nützlich. Beispielsweise sind die PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung zur Identifikation und Reinigung des PTP-λ-Liganden, der im Gehirn angeordnet sein kann, nützlich. Die Reinigung kann unter Verwendung des/der nativen Rezeptors/en oder Immunoadhäsine, die eine Fusion der extrazellulären Domäne des/der Rezeptors/en an eine konstante Immunglobulinschwerkettenregion umfas sen, erfolgen. Von den Liganden wird erwartet, dass sie bei der Behandlung von paralytischen Erkrankungen nützlich sind.
Ein erhöhtes Expressionsniveau der PTP-λ-Rezeptoren der vorliegenden Erfindung kann zur Reduktion von Metastasen verschiedener Tumoren der Lunge und anderer Organe nützlich sein. Die Expression des Rezeptors kann durch Anti-PTP-λ-Antikörper, die in der Lage sind, zu vernetzen und dadurch die Rezeptoren zu aktivieren, hinaufreguliert werden. Nicht-Antikörper-Vernetzer können für diesen Zweck ebenfalls verwendet werden.
Die PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind auch als Molekülmarker der Gewebe, in denen sie spezifisch exprimiert werden, nützlich. Als solcher ist das PTP-λ-Polypeptid zur Gewebetypisierung spezifischer Säugetiergewebe geeignet.
Native PTP-λ-Polypeptide und ihre funktionellen Äquivalente sind auch in Screening-Tests zur Identifikation von Agonisten oder Antagonisten nativer PTP-λ-Polypeptide nützlich. Solche Tests können die Form jedes beliebigen herkömmlichen Zelltyptests oder Tests auf biochemische Bindung annehmen und können in zahlreichen verschiedenen Testformaten, die Fachleuten bekannt sind, durchgeführt werden. Ein Beispiel hierfür ist das so genannte "Zwei-Hybrid"-Testformat unter Verwendung des "Matchmaker Two-Hybrid System" (Clontech) gemäß den Anweisungen der Hersteller.
Die nativen PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind auch als Proteinmolekulargewichtsmarker für Proteingele nützlich.
Nucleinsäuren, die für die PTP-λ-Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodieren, sind auch zur Bereitstellung von Hybridisierungssonden zur Durchsuchung von cDNA- und genomischen Bibliotheken auf die Kodiersequenz anderer PTP-λ-Polypeptidanaloga in anderen Spezies nützlich.
Antagonisten des PTP-λ-Polypeptids der vorliegenden Erfindung sind zur Inhibierung der biologischen Aktivität des Enzyms nützlich, indem sie die biologischen Wirkungen von Tyrosindephosphorylierung inhibieren. Agonisten des PTP-λ-Polypeptids sind zur Steigerung oder Stimulierung der biologischen Wirkungen des nativen PTP-λ-Polypeptids nützlich.
K. Materialien und Verfahren
1. RNA-Isolierung und Polymerasekettenreaktion
Messenger-RNA wurde aus der nicht-adhärenten Lin^loCD34^hi-Fraktion von fötalen Dottersackzellen (Micro-FastTrack, InVitrogene) isoliert. Poly-A+-RNA wurde mit zufälligen Hexameren (Promega) und reverser Transkriptase des "Moloney Murine Leukemie Virus" (Superscript II, GIBCO BRL) revers transkribiert. Ein Viertel dieser cDNA wurde mittels PCR unter Verwendung von degenerierten gemischten Oligonucleotidprimern amplifiziert. Sense- und Antisense-Primer gemäß den Aminosäuresequenzen (H/D)FWRM(I/V)W (Seq.-ID Nr.: 5) (5'-A(C/T)TT(C/T)TGG(A/C)GIATG(A/G)TITGG-3') (Seq.-ID Nr.; 6) und WPD(F/H)GVP (Seq.-ID Nr.: 7) (5'-GGIAC(G/A)(T/A)(G/A)(G/A)TCIG GCCA-3') (Seq.-ID Nr.: 8) wurden verwendet. PCR erfolgte in 1X Taq-DNA-Polymerasepuffer (GIBCO BRL) plus 0,2 mM von jeder dNTP, 10% DMSO und 5 Einheiten Taq-Polymerase (GIBCO BRL) in 25 Zyklen, die 94 °C 1 min lang, 55 °C 1 min lang und 72 °C 1 min lang umfassten. Die PCR-Produkte wurden mit Klenow-Enzym (New England Biolabs) bei 30 °C 30 min lang behandelt, in die Smal-Stelle von pRK-5-Plasmid (Genentech, Inc.) kloniert und daraufhin sequenziert (Sequenase, USB).
2. Isolieren von cDNA-Klonen
Adapter-gebundene, doppelsträngige cDNA wurde aus A+-RNA von Tag-10-Mausembryonen ("Marathon-Ready cDNA Synthesize Kit", Clontech) unter Verwendung entweder von zufälligen Hexamer- oder Oligo-dT-Primern hergestellt. Volllängen- cDNA wurde durch rasche 5'- oder 3'-Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) der Marathon-Ready-cDNAs isoliert. Eine λ-cDNA-Bibliothek aus erwachsener Mauslunge wurde gemäß der Standardarbeitsvorschrift unter Verwendung von mittels RACE isolierten cDNA-Fragmenten als Sonden gescreent.
3. Bakterielle Expression von GST-PTP-Fusionsprotein
cDNA-Sequenzen, die für die Aminosäuren 791 bis 1436 oder die Aminosäuren 43 bis 741 kodieren, die entweder die zytoplasmatische Region oder die extrazelluläre Region von PTP λ enthalten, wurden mittels PCR erhalten. PCR-Fragmente wurden anschließend mit Sall- und Notl-Restriktionsenzymen behandelt und in das pGEX-4T-1-Plasmid (Pharmacia) kloniert. Fusionsproteine wurden unter Verwendung von Glutathionsepharosesäulen (Pharmacia) affinitätsgereinigt. Polyklonales Antiserum gegen entweder die zytoplasmatische (Cy-) oder extrazelluläre (Ex-) Region wurde durch Immunisieren von Kaninchen mit jedem gereinigten GST-Fusionsprotein hergestellt.
4. Indirekte Immunfluoreszenz von PC-12-Zellen
NGF-behandelte oder unbehandelte PC-12-Zellen, die auf Deckgläsern gezüchtet wurden, wurden mit 4 % Formaldehyd und 0,1 % Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert und mit 0,05 % Saponin permeabilisiert. Fixierte Zellen wurden dann mit 10 % normalem Ziegenserum plus 0,05 % NP4O in PBS blockiert, mit polyklonalem Kaninchen-Anti-Cy-Primärantiserum (1:3.000-Verdünnung) inkubiert, gewaschen und mit Phycoerythrin- (PE-) markiertem Ziege-Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin G inkubiert. Die Zellen wurden geprüft, und Digitalbilder wurden durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie erstellt.
5. Immunfällung und Tyrosinphosphatasetest von PTP λ
PC-12-Zellen, die endogene PTP λ exprimieren, wurden in kalter PBS gewaschen und anschließend in Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM Benzamidin, 1 mg/ml Leupeptin, 1 mg/ml Aprotinin, 10 mM NaF, 0,5 mM Okadainsäure, 10 Vol.-% Glycerin, 1 Vol.-% Triton X-100, 0,5 % (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat und 0,01 % (Gew./Vol.) SDS (Autor?, EMBO J. 13(16), 3763–3771 (1994)) enthielt, lysiert. Zelllysate wurden durch Inkubieren mit 50 ml gewaschenen Protein-A-Sepharoseperlen (Pharmacia) vorgeklärt. Vorgeklärtes Lysat wurde anschließend mit Protein-A-Sepharoseperlen mit polyklonalem Kaninchen-Antiserum (20 ml Serum/50 ml Perlen) bei 40 °C 15 h lang vorgebunden. Der Protein-A-Sepharose/PTP-λ-Immunpräzipitat-Komplex wurde dann wie beschrieben verarbeitet (Jiang et al., Mol. Cell Biol. 13(5), 2942–2951 (1993)). Kurz zusammengefasst wurde der Komplex viermal mit HNTG-Puffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 % Glycerin, 0,1 % Triton X-100) und einmal mit M7.6-Puffer (60 mM Tris-HCl, pH 7,6, 5 mM EDTA, 10 mM DTT, 50 mM NaCl, 50 mg/ml Rinderserumalbumin) gewaschen. Der gewaschene Immunpräzipitat-Komplex wurde in M7.6-Puffer resuspendiert und nicht-radioaktivem Proteintyrosinphosphatasetest mit synthetischen Oligopeptidsubstraten unterzogen (PPS1 entspricht dem C-terminalen Hirudin-53-63-Fragment: Biotin-DGDFEEIPEEY-PO₄ (Seq.-ID Nr. 9); PPS2 entspricht den Aminosäuren 1–17 von menschlichem Gastrin: Biotin-EGPWLEEEEEAY-PO₄ (Seq.-ID Nr. 10)). Der PTPase-Test wurde gemäß den Verfahren des Herstellers (Tyrosine Phosphatase Assay Kit, Boehringer Mannheim) durchgeführt.
6. Northern-Analyse
Ein 2,5 kb umfassendes cDNA-Fragment, das für die zytoplasmatische Region von PTP λ kodierte, wurde verwendet, um die murinen Mehrgewebe-Northern-Blots (Clontech) oder die A+-RNA von PC-12-Zellen zu sondieren.
7. In-situ-Hybridisierung
Ratten-E15.5-Embryonen und P1-Gehirne wurden über Nacht bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd immersionsfixiert und anschließend über Nacht in 15 % Saccharose kältegeschützt. Erwachsene Rattengehirne wurden frisch mit pulverförmigem Trockeneis eingefroren. Alle Gewebe wurden bei einer Dicke von 16 μm geschnitten und zur In-situ-Hybridisierung für PTP λ unter Verwendung von ³³P-UTP-markierten RNA-Sonden verarbeitet. Sense- und Antisense-Sonden wurden aus einem 2,5-kb-DNA-Fragment von PTP λ unter Verwendung von SP6- bzw. T7-Polymerase synthetisiert.
Nähere Details zu den Versuchen werden aus den folgenden Beispielen, die keine Einschränkung darstellen, ersichtlich werden.
L. Beispiele
BEISPIEL 1 – Isolierung und Charakterisierung der für PTP λ kodierenden cDNA
Um neue Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatasen (PTPs) zu isolieren, die in murinen primitiven hämatopoetischen Zellen exprimiert werden, klonierten die Erfinder PCR-Fragmente, die durch Primen mit Sequenzen, die gegen konservierte, in PTPs zu findende Proteinmotive aus zahlreichen verschiedenen Genen und Spezies gerichtet waren, gebildet wurden (Dixon, Ann. Ny. Acad. Sci. 766, 18–22 (1995)). Eine Analyse der 70 verschiedenen aus PCR abstammenden Subklone zeigte eine Reihe von bereits davor beschriebenen PTPs sowie zwei neue PTPs auf. Eine dieser neuen PTPs, bezeichnet als PTP HSC, ist ein Element der PTP-PEST-Enzymfamilie und wurde schon früher beschrieben (Cheng et al., Blood, in Druck). Das zweite neue PCR-Fragment war zu den PTPs κ und μ homolog, die beide verwandte Rezeptortyp-PTPs sind, die homophile Adhäsion vermitteln (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 7(5), 650–657 (1995)).
Um die für diese neue PTP kodierende cDNA näher zu charakterisieren, wurde ein kombinierter Klonieransatz, der RACE sowie Klonieren aus Phagen-cDNA- Bibliotheken verwendete, durchgeführt. Die zusammengesetzten cDNA- (Seq.-ID Nr. 1) und abgeleiteten Protein- (Seq.-ID Nr. 2) Sequenzen, die aus diesen verschiedenen Klonen bestimmt wurden, sind in den 1A–1D gezeigt. Das für Translation dieses großen offenen Leserasters verwendete ATG-Startcodon war innerhalb einer Consensus-Kozak-Sequenz eingebettet, und es gibt mehrere Translationsstoppcodons stromauf von diesem Initiationscodon. Wie aus den 1A–1D ersichtlich ist, ist das Protein (Seq.-ID Nr. 2), das aus dieser cDNA (Seq.-ID Nr. 1) abgeleitet ist, ein großes Rezeptor-ähnliches Molekül mit 1.436 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von etwa 161.176 Da.
Die 2A–2B veranschaulichen, dass das neue, hämatopoetisch abgeleitete PTP-verwandte Protein, über das hierin berichtet wird, einen hohen Grad an Homologie sowohl zu PTP κ (^~60 %) als auch zu PTP μ (^~53 %) über ihre gesamten Längen zeigt (Jiang et al., s.o. (1993), und Gebbink et al., s.o. (1991)). Da diese neue PTP über ihre gesamte Länge zu den PTPs κ und μ homolog ist, scheint es, dass das neue PTP-Polypeptid MAM-, IgG-, vier Fibronectin-Typ-III- und zwei zytoplasmatisch angeordnete Phosphatasedomänen enthält (siehe die 2A–2B) (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 7(5), 650–657 (1995), Jiang et al., s.o. (1993), und Gebbink et al., s.o. (1991)). Diese Homologien mit dem neuen PTP-Polypeptid sind ein wenig geringer als die Homologie zwischen PTP κ und μ (^~62 %), was darauf schließen lässt, dass das neue PTP-Polypeptid, über das hier berichtet wird, eher entfernter verwandt mit diesen zwei PTPs ist, als es diese zwei zueinander sind. Diese Daten lassen darauf schließen, dass diese neue PTP das dritte Element der homotypisch wechselwirkenden PTP-Familie ist, die die PTPs κ und μ umfasst, und die Erfinder bezeichneten den neuen Rezeptor daher PTP λ.
Wie aus 3 ersichtlich ist, lassen die relativen Sequenzhomologien in jeder der Domänen dieser drei Enzyme darauf schließen, dass sie tatsächlich eng miteinander verwandt sind. Interessanterweise wiesen frühere Daten darauf hin, dass sowohl die MAM- als auch die IgG-Domäne spezifische homotypische Adhäsion zwischen den PTPs κ und μ vermittelte (Brady-Kalnay et al., s.o. (1994), und Zondag et al., s.o. (1995)), und aus den Sequenzvergleichen zwischen diesen drei verwandten Proteinen geht eindeutig hervor, dass diese zwei Domänen im Wesentlichen homolog sind. Die Tatsache, dass zahlreiche Sequenzänderungen zwischen diesen zwei Motiven vorhanden sind, stimmt jedoch auch mit der Annahme überein, dass sie spezifische homotypische Wechselwirkungen vermitteln können. Somit ist es wahrscheinlich, dass, wenn diese Motive auch zweifellos strukturell miteinander verwandt sind, Unterschiede in ihren relativen Sequenzen in homotypische Erkennung eingebunden sind.
Die Gesamtsequenzhomologien zwischen den drei Proteinen ist auch in den FnIII-Domänen relativ hoch, auch wenn die Homologie in der ersten dieser Domänen signifikant höher als in den anderen ist. Frühere Arbeiten zeigten auch, dass eine Juxtamembranstelle zwischen der Transmembrandomäne und der ersten Phosphatasedomäne entfernt homolog zu einer ähnlichen Regionen in den Cadherinen ist (Brady-Kalnay et al., J. Cell. Biol. 130(4), 977–986 (1995)), und diese Stelle zeigt einen hohen Grad an Homologie zwischen diesen drei Rezeptoren. Ein hoher Grad an Sequenzhomologie ist auch zwischen den ersten PTPase-Domänen dieser drei Rezeptoren zu finden, während zwischen den zweiten PTPase-Domänen dieser Proteine ein etwas geringerer Grad an Homologie vorhanden ist. Dieses letztgenannte Resultat kann bedeutend sein, da bereits berichtet wurde, dass die erste Phosphatasedomäne das wichtigste enzymatische Motiv der Doppelphosphataseregionen in den Rezeptor-PTPs ist (Pot et al., J. Biol. Chem. 266(29), 19688–19696 (1991)). Die Homologie zwischen diesen PTPase-Domänen umfasst zahlreiche jener Reste, die davor als wichtige Reste für Substraterkennung und Tyrosindephosphorylierung in der PTP 1B erkannt wurden (Jia et al., Science 268(5218), 1754–1758 (1995)), wenn auch nicht alle dieser Reste vollständig konserviert sind. Zusammenfassend gesehen lassen die Sequenzhomologien zwischen diesen drei Proteinen auf einen gemeinsamen Vorläufer sowie auf möglicherweise ähnliche Funktionen schließen.
BEISPIEL 2 – Analyse der enzymatischen Aktivität von PTP λ
Um die enzymatische Aktivität der PTPase-Domänen des neuen PTP-λ-Polypeptids zu analysieren, unterzogen die Erfinder das Enzym aus PC-12-Zellen, die, wie die Erfinder nachstehend zeigen, das Protein exprimieren, Immunfällung. In diesen Versuchen wurde ein polyklonaler Antikörper, der gegen die gesamte zytoplasmatische Domäne wie aus der cDNA-Sequenz vorhergesagt gerichtet war, durch Injizieren einer GST-Fusion, die diese Region des Rezeptors enthielt, in Kaninchen gebildet. Das Immunpräzipitat wurde mit einem tyrosinphosphorylierten Peptid unter Verwendung eines handelsüblichen Sets inkubiert, und der Dephosphorylierungsgrad wurde unter Verwendung eines Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers bestimmt. Wie in 4 gezeigt, wies der Immunniederschlag, der unter Verwendung des Immunserums erhalten wurde, eindeutige Phosphataseaktivität auf, während der Präimmunserum-Immunniederschlag keine solche Aktivität zeigte. Darüber hinaus zeigt 4, dass diese enzymatische Aktivität durch die Einbindung von Vanadat, einem potenten Tyrosinphosphatase-Inhibitor, vollständig inhibiert wurde. Somit ist das PTP-λ-Polypeptid, für das die hierin beschriebene und in den 1A–1D gezeigte cDNA (Seq.-ID Nr. 1) kodiert, eindeutig ein Rezeptortyrosinphosphataseprotein.
BEISPIEL 3 – Gewebeexpression des PTP-λ-Transkripts
Wie in 5 gezeigt, zeigt Northern-Blot-Analyse von fötalen sowie erwachsenen Geweben, dass PTP-λ-mRNA in zahlreichen verschiedenen Geweben außerhalb der hämatopoetischen Vorläuferzellen, aus denen sie ursprünglich kloniert wurde, exprimiert wird. So wird die Expression von PTP-λ-mRNA im Laufe der gesamten embryonalen Entwicklung, beginnend im sehr frühen Embryo an Tag 7, nachgewiesen. Interessanterweise zeigt eine Analyse von erwachsenen Organen, dass das PTP-λ-Transkript insbesondere in nur einer Untergruppe von Geweben exprimiert wird. Somit scheint ein sehr hoher Expressionsgrad des PTP-λ-Polypeptids in erwachsenem/r Gehirn, Lunge und Niere vorhanden zu sein, ein viel geringerer Grad in Herz, Skelettmuskel und Hoden und ein Mangel an offensichtlicher Expression bei dieser Aussetzung in Milz und Leber.
Der hohe Grad an PTP-λ-Expression in Lunge und Gehirn steht, zusammen mit dem Mangel an Expression in Leber, im Gegensatz zu PTP κ, eine PTP, die in hohen Konzentrationen in Leber exprimiert wird, jedoch in Lunge und Gehirn beinahe nicht nachweisbar ist (Jiang et al., s.o. (1993)). Somit ist trotz der Tatsache, dass PTP κ ursprünglich aus hämatopoetischen Stammzellen isoliert wurde, keine offensichtliche Expression an zwei Stellen, die hämatopoetische Zellen enthalten, vorhanden: in der Milz und der Leber. Der Mangel an Signal in der Milz, einem Organ, das überwiegend reife hämatopoetische Zellen enthält, lässt daher darauf schließen, dass dieser Rezeptor insbesondere in früheren hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert wird. Interessanterweise scheint auch ein alternativ gespleißtes Transkript in der Lunge vorhanden zu sein, das weder in den anderen zwei Organen, die diesen Rezeptor in hohen Konzentrationen exprimieren, noch in den Embryonen nachgewiesen wurde, wobei die Natur dieses alternativ gespleißten Transkripts noch zu bestimmen ist. Zusammenfassend gesehen zeigen diese Daten, dass PTP λ insbesondere in einer Untergruppe von erwachsenen Geweben exprimiert wird, wobei einige dieser Gewebe von jenen abweichen, in denen PTP κ exprimiert wird.
BEISPIEL 4 – Analyse von In-situ-Hybridisierung
Die Erfinder führten eine In-situ-mRNA-Analyse an Ratten-E15.5-Embryo, P1- und erwachsenem Rattengehirn durch, um mögliche Stellen von PTP-λ-Produktion zu bestimmen. Die Resultate in 6 zeigen, dass umfassende PTP-λ-Expression in sich entwickelnden Skelett-, Epithel- und Neuronalstrukturen im gesamten E15.5-Embryo zu beobachten war. Systemische Expression wurde in verschiedenen Skelettelementen im Entwicklungsstadium wie der Knorpelhaut der Wirbel, den Bandscheiben, Zähnen, der Mandibula und der Maxilla beobachtet (6, Schautafeln A und B). Expression von PTP λ innerhalb urogenitaler Strukturen umfasste das Tuberculum genitale (6, Schautafeln A und B), die Urethra und den Sinus urogeni talis (nicht gezeigt). Andere positive Bereiche von PTP-λ-Expression umfassten den Canalis analis (nicht gezeigt), Haut, Riech- und Mundepithel, Ösophagus (6, Schautafeln A und B), Hypophyse (6, Schautafeln A, B und C), Dura mater (6, Schautafeln A, B und D), Niere (6, Schautafeln A und B) und Lunge (6, Schautafeln A und B). Eine Vergrößerung in größerem Maßstab zeigt, dass Expression auf Glomerula im Entwicklungsstadium in der Region der Nierenrinde (6, Schautafeln F und G) sowie Bronchiolepithel der Lunge (6, Schautafeln N und I) eingeschränkt ist. Innerhalb des Nervensystems des E15.5.-Embryos wurden hohe Expressionsniveaus im Cortex cerebralis im Entwicklungsstadium (6, Schautafeln A und B), im Boden des Mittelhirns, in der Anlage des Plexus choroidei, im riesenzelligen retikulären Nucleus des Hirnstamms (6, Schautafeln A, B und C), in der Dura mater und im Rückenmark (6, Schautafeln A, B und D) beobachtet. Eine starke Vergrößerung des Rückenmarks zeigt die höchste Expression von PTP λ in den vorderen motorischen Seitensträngen (6, Schautafel D).
In P1- und erwachsenem Gehirn wurde Expression von PTP λ in Regionen lokalisiert, die aus embryonaler Anlage stammen, die auch hohe Expressionsniveaus enthielt. Expression in embryonalem Mittelhirn ging beispielsweise den hohen Expressionsniveaus von PTP λ in der Substantia nigra von P1- und erwachsenen Proben voran (7, Schautafeln C bzw. E). Expression im embryonalen Vorderhirn (6, Schautafel A) ging Expression voran, die in den inneren Schichten des P1- und erwachsenen Kortex beobachtet wurde (7, Schautafeln A, B bzw. D, E). Expression in der Anlage des Plexus choroidei des Embryos erzeugt hohe Expressionsniveaus im P1-Gehirn (7, Schautafel A) sowie geringe Expressionsniveaus im erwachsenen Gehirn (7, Schautafel D).
Im Allgemeinen scheint PTP-λ-Expression im erwachsenen Gehirn in Bezug auf das P1-Gehirn herabreguliert zu sein (7). Andere Bereiche mit bedeutender Expression sowohl in P1- als auch in erwachsenem Gehirn umfassen Cortex piriformis und Nucleus endopiriformis (7, Schautafeln A bzw. D), Nucleus amygdalae, Subiculum und CAT, CA2 und, zu einem geringeren Ausmaß, CA3 der Bildung des Hippo campus (7, Schautafeln B bzw. E). Das P1-Gehirn weist auch starke Expression im gesamten Septumbereich, in den Basalganglien, im Thalamus und im Mittelhirn auf (7, Schautafeln A, B und C). Schwache Expression wird im erwachsenen Colliculus superior und verstreute Expression im gesamten Thalamus beobachtet (7, Schautafel E).
BEISPIEL 5 – Expression von PTP λ in PC-12-Zellen
Die Expression von PTP λ in verschiedenen Regionen des gesamten embryonalen, neonatalen und erwachsenen Gehirns ließ darauf schließen, dass dieser Rezeptor in PC12-Zellen, einer Zelllinie, die aus einem neuralen Phäochromozytom stammt, exprimiert werden könnte. Tatsächlich zeigten die Immunfällungsversuche, die in Beispiel 2, oben, beschrieben wurden, enzymatische Aktivität in Anti-PTP-λ-Niederschlägen, die aus diesen Zellen stammten. Darüber hinaus differenzieren und verlängern diese Zellen Neuriten in Reaktion auf Nervenwachstumsfaktor, sodass sie ein System bereitstellten, um eine mögliche Rolle von PTP λ in diesem Entwicklungsübergang zu testen. Wie in 8 gezeigt, wird dieses neue PTP-λ-Rezeptorpolypeptid tatsächlich in diesen neuronalen Vorläuferzellen exprimiert. 8 veranschaulicht auch, dass die Behandlung dieser Zellen mit NGF zu einer mäßigen Hinaufregulierung (^~5fach) des Transkripts, das für diesen Rezeptor bei relativ geringer Kinetik kodiert, führt. Diese Daten stimmen somit mit einer Rolle für diesen Rezeptor in einem gewissen Aspekt der neuronalen Differenzierung in dieser Zelllinie überein.
Um die Verteilung von PTP λ auf PC12-Zellen zu untersuchen, wurde Immunfluoreszenz unter Verwendung von Zellen, die unbehandelt belassen wurden oder mit NGF behandelt wurden, um Neuritenauswuchs zu induzieren, gefärbt mit einem Antikörper, der gegen die zytoplasmatische Domäne des PTP-λ-Rezeptors gerichtet war, durchgeführt. Wie in 9 gezeigt, wird PTP λ in signifikanten Konzentrationen sowohl in behandelten als auch in nicht behandelten Zellen exprimiert, was die in 4 gezeigte enzymatische Analyse und die in 8 gezeigte Northern-Blot-Analyse bestätigt. Interessanter ist vielleicht die zelluläre Verteilung des PTP-λ-Polypeptids.
Wie 9 zeigt, wurde für PTP λ erkannt, dass es auf die Neuriten sowie die zapfenförmigen Wachstumsstrukturen an den Enden der Neuriten verteilt vorhanden ist. Diese Daten stimmen mit einer Rolle dieses Rezeptors in der Funktion von Neuriten überein und sind vielleicht sogar analog zu jenen, die erst jüngst für zwei unterschiedliche Drosophila-Rezeptor-PTPs beschrieben wurden (Desai et al., s.o., und Kreuger et al., s.o.).
M. Diskussion
Die relativen Grade von Tyrosinphosphorylierung zahlreicher verschiedener Proteine sind für die Regulierung zahlreicher Aktivitäten während der embryonalen Differenzierung und im Laufe des Lebens des Säugetierorganismus maßgeblich. Die absoluten Grade dieser Modifikation werden durch das Gleichgewicht zwischen den enzymatischen Aktivitäten von Tyrosinkinasen und jenen der Tyrosinphosphatasen vermittelt. In beiden Fällen erfüllen diese großen Familien von Proteinen ihre Funktionen durch konservierte enzymatische Domänen, die an eine Vielzahl von Spezifitätsbestimmenden Motiven gebunden sind. Diese verschiedenen Motive sind im Zusammenhang sowohl mit membrandurchdringenden, Rezeptor-ähnlichen Molekülen als auch mit intrazellulären Formen der Enzyme zu finden.
Die Ähnlichkeiten in der Gesamtstruktur der Tyrosinkinasen und Tyrosinphosphatasen lassen darauf schließen, dass sie ihre relativen spezifischen Aktivitäten durch die Verwendung dieser verschiedenen Domänen vermitteln: In den Fällen mancher Rezeptor-PTPs sind die extrazellulären Motive in gewisser Weise darin unüblich, dass sie hoch glykosylierte Regionen mit zur Zeit unbekannter Ligandenspezifität enthalten. Alternativ dazu enthält eine Untergruppe dieser Rezeptorphosphatasen auch zahlreiche verschiedene Domänen, einschließlich Immunglobulin-ähnliche und Fibronectin-ähnliche Domänen, die mit Zelladhäsion und Ligandenbindungsaktivitäten in anderen Proteinfamilien assoziiert sind. Zu den interessantesten dieser Typen von Adhäsions-assoziierten PTPs zählen die κ- und μ-Rezeptoren, die in homotypische Wechselwirkungen eingebunden sind. Frühere Vorhersagen, basierend auf der wahrscheinlichen Funktion dieser Rezeptoren bei der Vermittlung von Zelladhäsion sowie ihrer eingeschränkten Verteilung im Gewebe, ließen darauf schließen, dass es andere κ- und μ-ähnliche Rezeptor-PTPs mit unterschiedlichen Gewebeverteilungen geben könnte. Die Erfinder berichten hierin über die Isolierung des dritten Elements dieser Familie von homotypisch wechselwirkenden Rezeptor-PTPs, PTP λ, die mit der Konstruktion von Epithel- und Neuralstrukturen während der Entwicklung und in der erwachsenen Lebensphase in Verbindung stehen kann.
Die überzeugendsten Daten, die darauf hinweisen, dass das neue, hierin beschriebene PTP-λ-Polypeptid zu den κ- und μ-Rezeptoren homolog ist, beziehen sich auf den hohen Grad an Sequenzkonservierung zwischen diesen drei Proteinen. Eine Analyse dieser drei Rezeptoren zeigte eindeutig, dass das neue PTP-λ-Polypeptid der vorliegenden Erfindung einen hohen Grad an Sequenzhomologie zu PTP κ und PTP μ über die gesamte Länge der Proteine aufwies. Diese Homologie umfasste die vier Haupttypen an Domänen, die in dieser Familie vorkommen, umfassend die MAM-, die Immunglobulin- (IgG-), die Fibronectin-Typ-III- (FNIII-) und die Doppelphosphatase- (PTPase-) Domänen (Jiang et al., s.o. (1993), und Gebbink et al., s.o. (1991)). Da frühere Daten vorschlugen, dass sowohl die MAM- als auch die IgG-Domäne in homotypische Adhäsion eingebunden zu sein scheinen (Brady-Kalnay et al., s.o. (1994), und Zondag et al, s.o. (1991)), ist es wahrscheinlich, dass diese Motive für eine ähnliche Funktion in PTP λ verwendet werden, eine Annahme, die mit einer Rolle für diesen Rezeptor bei Zelladhäsion übereinstimmt. Der Grad der Sequenzhomologie dieser Domänen zwischen dem hierin erläuterten PTP-λ-Rezeptor und den PTP-κ- und PTP-μ-Rezeptoren ist jedoch sehr unterschiedlich, was darauf hinweist, dass der neue Rezeptor eine homophile Wechselwirkung auch nur spezifisch mit sich selbst, nicht aber mit diesen Domänen in anderen Familienmitgliedern vermitteln könnte (Zondag et al., s.o.). Wie nachstehend erläutert wird, lassen diese Resultate, zusammen mit der Gewebelokalisierung dieses Rezeptors, darauf schließen, dass er in die Bildung sehr spezifischer Strukturen im Laufe der Entwicklung eingebunden sein könnte. Es wird natürlich interessant sein, die strukturellen Aspekte dieser Domänen, die in homophile Bindung eingebunden sind, insbesondere im Lichte der jüngsten kristallographischen Analyse eines der homophil wechselwirkenden Cadherine (Shapiro et al., Nature 374(6520), 327–337 (1995)), zu bestimmen. Während es schwierig ist, zur Zeit die Bedeutung der Konservierung der FNIII-Domänen zu bestimmen, die als Abstandsdomänen fungieren können, um die funktionell maßgeblichen MAM- und IgG-Domänen aus der Zelloberfläche zu verlängern, eignet sich zumindest die Konservierung der Doppel-PTP-Domänen zu gewissen Interpretationen. Der höhere Konservierungsgrad der ersten Domäne im Vergleich zur zweiten beispielsweise untermauert frühere Studien, die erwogen, dass das N-terminale PTPase-Motiv das enzymatisch aktive Motiv ist, während die C-terminate Domäne in die Regulierung enzymatischer Aktivität eingebunden sein kann (Pot et al., s.o.). Die Erfinder versuchten, jedoch erfolglos, enzymatisch aktive Formen der PTPase-Domänen von PTP λ unter Bedingungen, die ein hohes Aktivitätsniveau bei einer anderen PTP, der PTP HSC (Cheng et al., s.o.) (J. Cheng & L. Lasky, nicht veröffentlichte Beobachtungen), ergaben, bakteriell zu exprimieren. Diese negativen Daten, die möglicherweise natürlich auch auf technische Schwierigkeiten zurückgeführt werden können, lassen darauf schließen, dass das PTP-λ-Polypeptid ein Aktivierungsereignis erfordern könnten, auch wenn aus den Immunfällungsstudien mit PC-12-Zellen eindeutig hervorgeht, dass dieser Rezeptor mit enzymatischer Aktivität ausgestattet ist. Schließlich schlugen frühere Daten auch eine Rolle dieser Kategorie von Rezeptor-PTPs in Cadherin/Catenin-Regulierung vor, und andere Forscher wiesen auf eine intrazelluläre Juxtamembranstelle mit signifikanter Homologie zu einer ähnlich angeordneten Region in den Cadherinen hin (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 7(5), 650–657 (1995), und Brady-Kalnay et al., J. Cell. Biol. 130(4), 977–986 (1995)). Die Erfinder erkannten auch einen sehr hohen Grad an Sequenzkonservierung in dieser Region, was wiederum mit einer möglichen Rolle dieser Domäne bei Cadherin-Wechselwirkungen übereinstimmt. Insgesamt gesehen stimmen die Daten, über die hierin berichtet wurde, damit überein, dass PTP λ das dritte Element der Familie homotypisch wechselwirkender Rezeptor-PTPs ist.
Die In-situ-Hybridisierungsanalyse der Expression von PTP λ im Embryo im Entwicklungsstadium und in der erwachsenen Probe eröffnete einige möglicherweise wichti ge Hypothesen. Die Expression dieses Rezeptors in zahlreichen verschiedenen Skelettbereichen im Entwicklungsstadium sowie an Stellen des Epithets, das verschiedene Organsysteme mit einer Schicht dieser Zellen auskleidet, in Verbindung mit der vorgeschlagenen Rolle für PTP μ (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 7(5), 650–657 (1995), und Brady-Kalnay et al., J. Cell. Biol. 130(4), 977–986 (1995)), und möglicherweise für PTP κ, bei der Steuerung von Cadherin-Adhäsion lässt darauf schließen, dass die neue PTP λ in einen ähnlichen Typ von Adhäsionssteuerung im sich entwickelnden Embryo eingebunden sein könnte. Die Entwicklung von Epithelschichten in den Lungenbronchiolen und Nieren-Glomerula erfordert beispielsweise, dass eine dünne Epithelzellschicht mit einer Dicke von einer Zelle aufgebaut wird. Somit würden sie, wenn sich nun im Laufe der Embryogenese die Zellen vermehren und migrieren, einen Mechanismus erfordern, durch den sie die Anordnung anderer Epithelzellen, die mit ihnen in Kontakt stehen, erkennen könnten, sodass dieses zelluläre Aneinandergrenzen eine Adhäsionsreaktion hervorrufen würde, die weitere Epithelentwicklung über die Verstärkung von Zelladhäsion unterbinden würde. Ein Mechanismus, der für solch ein Erkennungsphänomen sorgen würde, wäre jener, der von Tonks und Mitarbeitern vorgeschlagen wurde (Brady-Kalnay et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 7(5), 650–657 (1995), und Brady-Kalnay et al., J. Cell. Biol. 130(4), 977–986 (1995)). In dieser Hypothese tritt die μ-Rezeptor-PTP mit einer anderen μ-Rezeptor-PTP an einer benachbarten Zelle in homophilen Kontakt, und dieser Kontakt reguliert Cadherin-vermittelte Adhäsion durch die Dephosphorylierung des Cadherin/Catenin-Komplexes nach oben. Die Bildung von Epithelstrukturen mit einer Dicke von einer Zelle in diesen embryonalen Organen könnte durch einen ähnlichen Typ von Erkennungsmechanismus unter Verwendung von PTP κ vermittelt werden. Es würde auch erwartet werden, dass die Expression dieser Rezeptor-PTP in knochenbildenden Chondrozyten auch einen ähnlichen Typ von Erkennungs- und Adhäsionsfunktion zur Assemblierung dieser Strukturen stattfinden ließe, auch wenn von diesem Anatomietyp, der komplexer als die oben beschriebene, dünnwandige, Epithel-ähnliche Morphologie ist, erwartet werden würde, dass er höher entwickelte Erkennungs- und Adhäsionsmechanismen einbinden würde. Schließlich ist es, da zahlreiche gewöhnliche Typen von Tumoren der Lunge und anderer Organe Epithelzel len einbinden, möglich, dass Störungen der vorgeschlagenen Funktion von diesem Typ von Adhäsions- und Erkennungsmechanismus in die desorganisierte Morphologie und das hohe Vorkommen von Metastasen dieser Tumoren eingebunden sein könnten (Kemler, s.o., und Beherens et al., s.o.). Zusammen lassen diese Hypothesen auf eine maßgebliche Rolle von PTP λ bei der Bildung verschiedener, Epithelähnlicher Strukturen im Embryo schließen.
Jüngste Daten aus dem Drosophila-System weisen auch auf interessante Möglichkeiten für die Funktion von PTP λ im Nervensystem in seiner Entwicklungsphase hin (Desai et al., s.o., und Kreuger et al., s.o.). In diesen Berichten wurde für drei verschiedene Drosophila-Rezeptor-PTPs, die als DPTP69D, DPTP99A und DLAR bezeichnet wurden, die alle IgG- und Fibronectin-Typ-III-Adhäsionsdomänen enthalten, die jenen aus PTP λ ähnlich sind, gezeigt, dass sie in die neuronale Wegfindung in den sich entwickelnden Nervensystemen auf maßgebliche Weise eingebunden sind. Somit resultierten Mutationen in einem dieser Rezeptoren in einem Verlust der Fähigkeit bestimmter neuraler Untergruppen, während ihrer Bildung im Embryo neu ausgerichtet zu werden. Da PTP λ in zahlreichen sich entwickelnden Neuralstellen exprimiert wird, ist es möglich, dass sie bei der Wegfindung von Nerven in Säugetieren eine ähnliche Rolle spielt. Somit würde die Expression dieser PTP im sich entwickelnden Mittelhirn, Vorderhirn und anderen Neuralstellen ihr die Möglichkeit verleihen, als ein Vermittler der Wegfindung in diesen heranreifenden Systemen zu funktionieren. Interessanterweise wurde die Expression dieses Rezeptors in diesen embryonalen Anlagen durch Expression in den erwachsenen Stellen, die aus diesen embryonalen Strukturen entstehen, bestätigt. Die Expression im Erwachsenen schien jedoch im Vergleich zu jener, die im Embryo beobachtet wurde, etwas reduziert zu sein, und sie war weitaus stärker organisiert. Diese Daten lassen darauf schließen, dass dieses Enzym möglicherweise während erwachsener Neuronalbildung verwendet wird, auch wenn der eindeutige Rückgang der Expression im Erwachsenen auf eine möglicherweise maßgeblichere Rolle im Laufe der Embryogenese schließen lässt. Die beobachtete Expression dieses Rezeptors in neuronalen Vorläufer-PC-12-Zellen, in Verbindung mit der Hinaufregulierung des Transkripts während der Neuritenbildung als Reaktion auf NGF in diesen Zellen, ist ebenfalls mit einer Rolle für diese Rezeptor-PTP während neuronaler Wegfindung vereinbar. Tatsächlich stimmt die Beobachtung, dass diese PTP an Neuriten sowie an zapfenförmigen Wachstumsstrukturen an den Enden dieser Fortsätze exprimiert wird, mit einer möglichen Rolle für diesen Rezeptor bei neuronaler Wegfindung im Nervensystem von Säugetieren überein. Die relativ langsame Kinetik der Hinaufregulierung lässt jedoch darauf schließen, dass dies eine späte Funktion sein kann. Und auch wenn die eindeutige Beobachtung des Verlusts von Wegfindung in Drosophila aufgrund der relativ hohen Komplexität des Nervensystems von Säugetieren in einer Spezies wie der Maus nur schwierig zu wiederholen ist, könnte es nichtsdestoweniger von Interesse sein, die Bildung des Nervensystems in Säugetieren, in denen die Expression dieses Rezeptors auf Null reduziert wurde, zu untersuchen.
Insgesamt betrachtet beweisen die Daten, über die hierin berichtet wurde, die Existenz eines dritten Elements der Familie der Rezeptor-PTPs, PTP λ, die in homotypische Adhäsion und, möglicherweise, Cadherin-vermittelte Organbildung eingebunden zu sein scheint. Die Rolle, die dieser neue Rezeptor bei der Bildung von Epithelschichten und neuronalen Strukturen möglicherweise spielt, gilt es weiterhin zu bestimmen. Die Existenz von drei dieser Typen von Rezeptoren lässt jedoch weiters darauf schließen, dass diese größer werdende Familie in die spezifische Bildung verschiedener Typen von komplexen Strukturen im Laufe der Entwicklung sowie nach abgeschlossener Entwicklungsphase eingebunden sein kann.
N. Abschließende Bemerkungen
Die obige Beschreibung stellt spezifische Verfahren im Detail dar, die verwendet werden können, um die vorliegende Erfindung zu praktizieren. Anhand dieser spezifischen Verfahren wird es Fachleuten durchwegs möglich sein, unter Einbeziehung der Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung alternative zuverlässige Verfahren zu entwerfen, die dieselben Resultate erzielen. Doch auch wenn die obige Beschreibung sehr detailliert zu sein scheint, gilt sie keinesfalls als Einschränkung des gesamten Schutzumfangs der Erfindung zu verstehen; der Umfang der vorliegenden Erfindung wird ausschließlich durch den rechtsgültigen Aufbau der beiliegenden Ansprüche festgelegt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid, das in der Lage ist, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aus der aus (a) der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz; (b) einer Aminosäuresequenz, für die ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das an ein Nucleinsäuremolekül, das für die Aminosäuresequenz aus (a) kodiert, unter stringenten Bedingungen, die Waschen in 0,015 M Natriumchlorid, 0,0015 M Natriumcitrat, 0,1 % SDS bei 50 °C umfassen, hybridisiert; und (c) einer Aminosäuresequenz, die aus einer Tierspezies, die nicht Maus ist, stammt und zumindest 65 % Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz aus (a) aufweist; bestehenden Gruppe umfasst.
Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach Anspruch 1, das murinen Ursprungs ist.
Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach Anspruch 1, das menschlichen Ursprungs ist.
Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach Anspruch 1, das an eine heterologe Polypeptidsequenz fusioniert ist.
Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach Anspruch 4, worin die heterologe Polypeptidsequenz ein Immunglobulinmolekül oder Fragment davon ist.
Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach Anspruch 4, worin die heterologe Polypeptidsequenz ein immunologisch kompetentes Polypeptid ist.
Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach Anspruch 1, weiters umfassend einen N-terminalen Methionylrest.
Isoliertes Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach Anspruch 1, das unglykosyliert ist.
Isolierte extrazelluläre Domäne eines Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptids, die eine Aminosäuresequenz aus der aus (a) Aminosäuren 19–748 des in 1 gezeigten Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-Polypeptids; (b) einer Aminosäuresequenz, für die ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das an ein Nucleinsäuremolekül, das für die Aminosäuresequenz aus (a) kodiert, unter stringenten Bedingungen, die Waschen in 0,015 M Natriumchlorid, 0,0015 M Natriumcitrat, 0,1 % SDS bei 50 °C umfassen, hybridisiert; und (c) einer Aminosäuresequenz, die aus einer Tierspezies, die nicht Maus ist, stammt und zumindest 65 % Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz aus (a) aufweist; bestehenden Gruppe umfasst.
Isolierte extrazelluläre Domäne nach Anspruch 9, die murinen Ursprungs ist.
Isolierte extrazelluläre Domäne nach Anspruch 9, die menschlichen Ursprungs ist.
Isolierte extrazelluläre Domäne nach Anspruch 9, die an eine heterologe Polypeptidsequenz fusioniert ist.
Isolierte extrazelluläre Domäne nach Anspruch 12, worin die heterologe Polypeptidsequenz ein Immunglobulin oder Fragment davon ist.
Isolierte extrazelluläre Domäne nach Anspruch 12, worin die heterologe Polypeptidsequenz ein immunologisch kompetentes Polypeptid ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-Polypeptid kodiert, das phosphorylierte Tyrosinreste dephosphoryliert, wobei das Nucleinsäuremolekül eine Sequenz aus der aus (a) einer Nucleotidsequenz, die Nucleotide 379–4686 aus der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz umfasst; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert; und (c) einer Nucleotidsequenz, die an die Nucleotidsequenz aus (a) oder (b) unter stringenten Bedingungen, die Waschen in 0,015 M Natriumchlorid, 0,0015 M Natriumcitrat, 0,1 % SDS bei 50 °C umfassen, hybridisiert; bestehenden Gruppe umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das für ein menschliches Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das für ein murines Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das Nucleotide 379–4686 der in 1 gezeigten Nucleotidsequenz umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert.
Vektor, der das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 15, 16, 17, 18 oder 19 umfasst, das operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die von einer Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist, erkannt werden.
Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 20 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Rezeptorprotein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptids, das phosphorylierte Tyrosinreste dephosphoryliert, wobei das Verfahren das Kultivieren der transformierten Wirtszelle aus Anspruch 21 und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur umfasst.
Antikörper, der in der Lage ist, sich spezifisch an das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zu binden, das frei von Antikörper ist, der in der Lage ist, sich spezifisch an Protein-Tyrosinphosphatase κ oder Protein-Tyrosinphosphatase μ zu binden.
Antikörper, der in der Lage ist, sich spezifisch an das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Extrazellulärdomänen-Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 14 zu binden, das frei von Antikörper ist, der in der Lage ist, sich spezifisch an eine extrazelluläre Domäne von Protein-Tyrosinphosphatase κ oder Protein-Tyrosinphosphatase μ zu binden.
Hybridomzelllinie, die einen Antikörper nach Anspruch 23 oder 24 produziert.
Monoklonaler Antikörper, der sich spezifisch an ein Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid bindet, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid eine aus der aus (a) der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz; und (b) einer Aminosäuresequenz, für die ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das an eine Nucleinsäure, die für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, unter stringenten Bedingungen, die Waschen in 0,015 M Natriumchlorid, 0,0015 M Natriumcitrat, 0,1 % SDS bei 50 °C umfassen, hybridisiert; bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäuresequenz umfasst, worin der monoklonale Antikörper frei von Antikörper ist, der in der Lage ist, sich spezifisch an Protein-Tyrosinphosphatase κ oder Protein-Tyrosinphosphatase μ zu binden.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 26, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 26, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid menschlichen Ursprungs ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 26, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid murinen Ursprungs ist.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 26, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, für die ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das an eine Nucleinsäure, die für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, unter stringenten Bedingungen, die Waschen in 0,015 M Natriumchlorid, 0,0015 M Natriumcitrat, 0,1 % SDS bei 50 °C umfassen, hybridisiert.
Hybridomzelllinie, die den monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 26–30 produziert.
Test zur Identifikation eines Antagonisten oder Agonisten eines Protein-Tyrosinphosphatasepolypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend: (a) das Kontaktieren einer Phosphatasedomäne eines Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptids mit einem mutmaßlichen Antagonisten oder Agonisten, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid in der Lage ist, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren, und eine aus der aus der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz; und einer Aminosäuresequenz, für die ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das an eine Nucleinsäure, die für die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert, unter stringenten Bedingungen, die Waschen in 0,015 M Natriumchlorid, 0,0015 M Natriumcitrat, 0,1 % SDS bei 50 °C umfassen, hybridisiert; bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäuresequenz umfasst; und (b) das Überwachen der Fähigkeit der Phosphatasedomäne, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren.
Test nach Anspruch 32, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst.
Test nach Anspruch 32, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid menschlichen Ursprungs ist.
Test nach Anspruch 32, worin das Protein-Tyrosinphosphatase-λ-Polypeptid murinen Ursprungs ist.