DE69734596T2

DE69734596T2 - "smoothened" proteine aus wirbeltieren

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Publication number: DE69734596T2
Application number: DE69734596T
Authority: DE
Inventors: J. Frederic DE SAUVAGE; Arnon Rosenthal; M. Donna STONE
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1996-09-30
Filing date: 1997-09-29
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2017-09-30
Also published as: AU4600597A; ATE309270T1; EP0939769B1; IL129139A0; WO1998014475A1; ZA978503B; DK0939769T3; AU725701B2; EP0939769A1; ES2252795T3; US6407216B1; DE69734596D1; US5990281A; JP2001501476A; CA2267181A1; JP4671371B2; IL129139A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen neuartige Smoothened-Proteine, die mit Hedgehog- und Patched-Signalstoffmolekülen wechselwirken, die an der Zellvermehrung und -differenzierung beteiligt sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neu identifizierte und isolierte Wirbeltier-Smoothened-Proteine und dafür kodierende DNA, einschließlich Ratten- und menschliches Smoothened, und verschiedene modifizierte Formen dieser Proteine, sowie Wirbeltier-Smoothened-Antikörper und verschiedene Verwendungen davon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Entwicklung mehrzelliger Organismen hängt zumindest teilweise von Mechanismen ab, die Positionsinformationen für Zellstrukturen, Gewebe oder Organe spezifizieren, dorthin dirigieren oder beibehalten. Verschiedene abgegebene Signalstoffmoleküle, wie z.B. Elemente von transformierendem Wachstumsfaktor-β ("TGF-β"), Wnt, Fibroblastenwachstumsfaktor ("FGF") und Hedgehog-Familien, sind mit Strukturierungsaktivitäten verschiedener Zellen und Strukturen bei Drosophila sowie bei Wirbeltieren in Zusammenhang gebracht worden [Perrimon, Cell 80, 517-520 (1995)].
Studien mit Drosophila-Embryonen haben ergeben, dass in der Phase des Zellblastoderms oder in späteren Entwicklungsphasen die Information über die Zellgrenzen hinweg mittels Signaltransduktionswegen aufrechterhalten wird. Es wird davon ausgegangen, dass solche Wege von extrazellulären Signalen, wie z.B. Wingless ("Wg") oder Hedgehog ("Hh"), initiiert werden. Das extrazelluläre Signal Hh kann die Expression von TGF-β-, Wnt- und FGF-Signalstoffmolekülen erwiesenermaßen steuern und Signalwirkungen sowohl kurzer als auch langer Reichweiten initiieren. Eine Wirkung kurzer Reichweite von Hh bei Drosophila liegt beispielsweise in der abdominalen Epidermis vor, wo Hh damit in Zusammenhang steht, benachbarte Zellen dazu zu bringen, Wingless- (wg-) Expression beizubehalten [Perrimon, Cell 76, 781-784 (1984)]. Im Zentralnervensystem von Wirbeltieren wird beispielsweise Sonic Hedge hog ("SHh"; ein sekretiertes Wirbeltier-Homolog von dHh) in Chordazellen exprimiert und ist mit der Induktion von Bodenplattenbildung innerhalb des benachbarten Neuralrohrs in kontaktabhängiger Weise assoziiert [Roelink et al., Cell 76, 761-775 (1994)]. In Perrimon, Cell 80, 517-520 (1995) wird ein allgemeiner Überblick über einige der mit Hh assoziierten Wirkungen langer Reichweite gegeben.
Studien des Hh-Proteins bei Drosophila ("dHh") haben ergeben, dass hh für ein natives 46-kDa-Protein kodiert, das zu einer 39-kDa-Form gespalten wird, gefolgt von Signalsequenzabspaltung und anschließend in eine 19-kDa-Form mit Aminoterminus und eine 26-kDa-Form mit Carboxylterminus gespalten wird [Lee et al., Science 266, 1528-1537 (1994)]. Lee et al. berichten, dass die 19-kDa- und 26-kDa-Formen unterschiedliche biochemische Eigenschaften aufweisen und unterschiedlich verteilt sind. DiNardo et al. wie auch andere haben offenbart, dass das dHh-Protein eine Signaltransduktionskaskade, die wg aktiviert [DiNardo et al., Nature 332, 604-609 (1988); Hidalgo und Ingham, Development 110, 291-301 (1990); Ingham und Hidalgo, Development 117, 283-291 (1993); und zumindest ein weiteres Segmentpolaritäts-Gen, Patched (ptc) [Hidalgo und Ingham, siehe oben; Tabata und Kornberg, Cell 76, 89-102 (1994)], auslöst. Die Eigenschaften und Merkmale von dHh werden auch in Berichten von Ingham et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 492-498 (1995) und Lumsden und Graham et al., Curr. Biol. 5, 1347-1350 (1995), beschrieben. Die Eigenschaften und Merkmale der Wirbeltier-Homologe von dHh, Sonic Hedgehog, werden von Echelard et al., Cell 75, 1417-1430 (1993); Krauss et al., Cell 75, 1431-1444 (1993); Riddle et al., Cell 75, 1401-1416 (1993); Johnson et al., Cell 79, 1165-1173 (1994); Fan et al., Cell 81, 457-465 (1995); Roberts et al., Development 121, 3163-3174 (1995); und Hynes et al., Cell 80, 95-101 (1995), beschrieben.
Von Perrimon, Cell 80, 517-520 (1995), wurde berichtet, dass die biochemischen Mechanismen und Rezeptoren, wodurch die Signalstoffmoleküle, wie z.B. Wg und Hh, die Wirkung, Transkription oder beides der sekundären Signaltransduktoren steuern, im Allgemeinen nicht ausreichend verstanden worden sind. Bei Drosophila zeigen genetische Beweise, dass Frizzled "Fz" zur Übertragung und Transduktion von Polaritätssignalen in Epidermiszellen während der Haar- und Borstenentwicklung wirkt. Fz-Rattenhomologe, die eine strukturelle Ähnlichkeit mit Elementen der G-Protein-gekoppelten-Rezeptorüberfamilie aufweisen, werden von Chan et al., J. Biol. Chem. 267, 25202-25207 (1992), beschrieben. Insbesondere beschreiben Chan et al. das Isolieren zweier unterschiedlicher cDNAs aus einer Rattenzellbibliothek, wobei die erste cDNA für ein vorhergesagtes 641-Reste-Protein Fz-1 kodiert, das 46%ige Homologie mit Drosophila-Fz aufweist, und eine zweite cDNA für ein Protein Fz-2 mit 570 Aminosäuren kodiert, die zu 80 % zu Fz-1 homolog ist. Chan et al. stellen fest, dass ein Säugetier-fz Teil einer Genfamilie sein kann, die zur Transduktion und interzellulären Übertragung von Polaritätsinformationen während der Gewebemorphogenese oder in differenzierten Geweben wichtig ist. Vor kurzem ist von Bhanot et al. die Identifizierung eines Drosophila-Gens, Frizzled2 (Dfz2) und eines vorhergesagten Dfz2-Proteins beschrieben worden, das als Wg-Rezeptor in Kulturzellen wirken kann [Bhanot et al., Nature 382, 225-230 (1996)]. Bhanot et al. offenbaren jedoch, dass es keinen In-vivo-Beweis gibt, der zeigt, dass Dfz2 für die Wg-Signalisierung erforderlich ist.
Obwohl einige Nachweise nahe legen, dass Zellantworten auf dHh vom Transmembranprotein Smoothened (dSmo) abhängig sind [Nusslein-Volhard et al., Wilhelm Roux's Acr. Dev. Biol. 193, 267-282 (1984); Jurgens et al., Wilhelm Roux's Acr. Dev. Biol. 193, 283-295 (1984); Alcedo et al., Cell 86, 221-232 (26. Juli 1996); van den Heuvel und Ingham, Nature 382, 547-551 (8. August 1996)] und vom Transmembranprotein "Patched" negativ gesteuert werden [(Hooper und Scott, Cell 59, 751-765 (1989); Nakano et al., Nature 341, 508-513 (1989); Hidalgo und Ingham, siehe oben; Ingham et al., Nature 353, 184- 187 (1991)] sind die Rezeptoren für Hh-Proteine bisher nicht biochemisch charakterisiert worden. Verschiedene Genprodukte, einschließlich des Patched-Proteins, des Transkriptionsfaktors Cubitus interruptus, der Serin/Threonin-Kinase "Fused" und der Genprodukte von Costal-2, Smoothened (smo) und Suppressor of fused (Su(fu)) werden damit in Verbindung gebracht, vermeintliche Komponenten des Hh-Signalwegs zu sein.
Frühere Studien bei Drosophilae führten zu der Annahme, dass ptc für den Hh-Rezeptor kodiert [Ingham et al., Nature 353, 184-187 (1991)]. Die Aktivität des ptc-Produkts, das ein mehrere Membranen überspannendes Zelloberflächenprotein darstellt, welches als Patched bezeichnet wird [Hooper und Scott, siehe oben], unterdrückt die wg- und ptc-Gene und wird vom Hh-Signal antagonisiert. Patched wurde von Ingham et al. als konstitutiver aktiver Rezeptor vorgeschlagen, der durch Bindung von Hh inaktiviert wird, wodurch die Transkription von Hh-responsiven Genen ermöglicht wird. Wie von Bejsovec und Wieschaus, Development 119, 501-517 (1993), berichtet wird, zeigt jedoch Hh Wirkungen bei ptc-losen Drosophilaembryos und kann folglich nicht der einzige Hh-Rezeptor sein. Somit ist die Rolle von Patched bei der Hh-Signalisierung noch nicht völlig geklärt.
Goodrich et al. haben ein Mäuse-Patched-Gen isoliert [Goodrich et al., Genes Dev. 10, 301-312 (1996)]. Menschliche Patched-Homologe sind in kürzlich veröffentlichter Literatur ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise beschreiben Hahn et al., Cell 85, 841-851 (1996), die Isolierung eines menschlichen Homologs von Drosophila-ptc. Das Gen zeigt mit dem Drosophilagen bis zu 67 % Sequenzidentität auf Nucleotidebene und 60%ige Ähnlichkeit auf Aminosäureebene [Hahn et al., siehe oben]. Johnson et al. stellen auch eine vorhergesagte Aminosäuresequenz eines menschlichen Patched-Proteins bereit [Johnson et al., Science 272, 1668-1671 (1996)]. Johnson et al., offenbaren, dass das Protein aus 1.447 Aminosäuren 96%ige bzw. 40%ige Identität mit Mäuse- bzw. Drosophila-Patched aufweist. Die Daten über Menschen und Mäuse dieser Forscher legen nahe, dass Patched ein Einzelkopie-Gen bei Säugetieren ist. Gemäß Hahn et al., Cell 85, 841-851 (1996), haben Analysen die Gegenwart von drei unterschiedlichen 5'-Termini für ihr menschliches ptc-Gen ergeben. Hahn et al. postulieren, dass es zumindest drei unterschiedliche Formen des Patched-Proteins in Säugetierzellen gibt: die durch die Mäusesequenz gegebene Stammform und die zwei menschlichen Formen. Patched wird zudem in einer kürzlich erschienen Arbeit von Marigo et al., Development 122, 1225 (1996), behandelt.
Studien mit Drosophila haben auch zu der Annahme geführt, dass Smo ein möglicher Rezeptor für Hh sein könnte [Alcedo et al., siehe oben; van den Heuvel und Ingham, siehe oben]. Das Smoothened-(smo-) Gen wurde als Segmentpolaritätsgen identifiziert und anfänglich als Smooth bezeichnet [Nusslein-Volhard et al., siehe oben]. Da jedoch diese Bezeichnung bereits einen anderen Locus beschrieb, wurde das Segmentpolaritätsgen zu Smoothened umbenannt [Lindsley und Zimm, "The Genome of Drosophila melanogaster", San Diego, CA, USA, Academic Press (1992)]. Wie zuerst von Nusslein-Volhard et al., siehe oben, berichtet wurde, ist das smo-Gen zur Aufrechterhaltung der Segmentierung in Drosophila-Embryonen erforderlich.
Alcedo et al., siehe oben, haben kürzlich das Klonen des Smoothened-Gens bei Drosophila beschrieben [siehe auch van den Heuvel und Ingham, siehe oben]. Alcedo et al. berichten, dass eine Hydropathieanalyse vorhersagt, dass das vermeintliche Smo-Protein ein integriertes Membranprotein aus sieben Membran-durchdringenden α-Helices, einem hydrophoben Segment in der Nähe des N-Terminus und einem hydrophiler C-terminalen Schwanz ist. Folglich kann Smo der Schlangenrezeptorfamilie angehören, deren Mitglieder alle an G-Proteine gebunden sind. Alcedo et al., siehe oben, berichten auch, dass smo für Hh-Signalisierung erforderlich ist und stromab von hh und ptc wirkt.
Wie von Pennisi, Science 272, 1583-1584 (1996), diskutiert, wird von manchen Entwicklungsgenen angenommen, dass sie eine bestimmte Rolle bei Krebs spielen, da sie Zellwachstum und -spezialisierung steuern. Jüngste Studien schlagen vor, dass Patched ein Tumorsuppressor oder ein Gen ist, dessen Verlust oder Inaktivierung zum exzessiven Wachstum von Krebszellen führt. Insbesondere haben Hahn et al. und andere Forscher herausgefunden, dass Patched in einigen herkömmlichen Formen von Basalzellkarzinomen bei Menschen mutiert ist [Hahn et al., Cell 85, 841-851 (1996); Johnson et al., siehe oben; Gailani et al., Letters. Nature Genetics 13, September 1996]. Hahn et al. berichten, dass es in sechs nicht miteinander verwandten Patienten mit Basalzellnävussyndrom ("BCNS"), einem familiären Komplex von Krebsarten und Entwicklungsstörungen, zu Veränderungen kommt, die vorhersagen, dass das Patched-Genprodukt inaktiviert ist. Hahn et al. berichten auch, dass durch Klonen des Pankreastumor-Suppressorgens, DPC4, der ptc-Weg mit Tumorigenese in Zusammenhang gebracht wurde. Wirbeltier-Homologe zweier anderer Drosophila-Segmentpolaritätsgene, Mäusebrust Wntl (Rijsewijk et al., Cell 50, 649 (1987)] und menschliches Glioblastom GLI [Kinzler et al., Science 236, 70 (1987)] wurden ebenfalls mit Krebs in Zusammenhang gebracht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben cDNA-Klone identifiziert, die für neuartige Wirbeltier-Smoothened-Proteine kodieren, welche hierin als "vSmo" bezeichnet werden. Insbesondere sind cDNA-Klone, die für Ratten-Smoothened und menschliches Smoothened kodieren, identifiziert worden. Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass die vSmo-Proteine der vorliegenden Erfindung mit den Patched-Proteinen coexprimiert werden und physikalische Komplexe mit Patched bilden. Die Anmelder haben zudem herausgefunden, dass vSmo allein Sonic-Hedgehog nicht binden konnte, dass jedoch Wirbeltier-Patched-Homologe Sonic-Hedgehog mit relativ hoher Affinität binden konnten. Es wird angenommen, dass Sonic-Hedgehog seine biologische Aktivität durch einen Mehrfach-Untereinheiten-Rezeptor vermitteln kann, worin vSmo eine Signalkomponente und Patched eine Liganden bindende Komponente sowie ein Liganden-gesteuerter Suppressor von vSmo ist. Folglich können, ohne in irgendeiner Weise an eine Theorie gebunden zu sein, pathologische Leiden, wie z.B. Basalzellkarzinome, die mit inaktiviertem (oder mutiertem) Patched in Verbindung stehen, das Ergebnis konstitutiver Aktivität von vSmo oder vSmo-Signalisierung sein, gefolgt von einer negativen Steuerung durch Patched.
Die Erfindung stellt isoliertes Wirbeltier-Smoothened bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung isoliertes Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz bereit, das in einer Ausführungsform eine Aminosäuresequenz umfasst, die die Reste 1 bis 793 aus 1 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst. Die Erfindung stellt auch isoliertes Wirbeltier- Smoothened mit nativer Sequenz bereit, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die die Reste 1 bis 787 aus 4 (Seq.-ID Nr. 4) umfasst. In anderen Ausführungsformen umfasst das isolierte Wirbeltier-Smoothened eine Aminosäuresequenz mit zumindest 80%iger Identität mit dem Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz, das die Reste 1 bis 787 aus 4 (Seq.-ID Nr. 4), oder die Reste 1 bis 793 aus 2 (Seq.-ID Nr. 2) umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung chimäre Moleküle bereit, die Wirbeltier-Smoothened umfassen, das an ein heterologes Polypeptid oder an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist. Ein Beispiel für ein solches chimäres Molekül umfasst ein an eine Epitopmarkierungssequenz fusioniertes Wirbeltier-Smoothened.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das für Wirbeltier-Smoothened kodiert. In einem Aspekt ist das Nucleinsäuremolekül RNA oder DNA, die für ein Wirbeltier-Smoothened kodiert, oder ist komplementär zu einer solchen kodierenden Nucleinsäuresequenz und bleibt auch unter stringenten Bedingungen stabil daran gebunden. In einer Ausführungsform ist die Nucleinsäuresequenz ausgewählt aus:

(a) der Kodierungsregion der Nucleinsäuresequenz aus 1 (Seq.-ID Nr. 1), die für die Reste 1 bis einschließlich 793 kodiert (d.h. die Nucleotide 450-452 bis 2826-2828),
(b) der Kodierungsregion der Nucleinsäuresequenz aus 4 (Seq.-ID Nr. 3), die für die Reste 1 bis einschließlich 787 kodiert (d.h. die Nucleotide 13-15 bis 2371-2373) oder
(c) einer Sequenz, die einer Sequenz gemäß (a) oder (b) entspricht und im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes liegt.

In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der ein Nucleinsäuremolekül umfasst, das für das Wirbeltier-Smoothened kodiert. Es wird auch eine Wirtszelle bereitgestellt, die den Vektor oder das Nucleinsäuremolekül umfasst. Außerdem wird ein Verfahren zur Herstellung von Wirbeltier-Smoothened bereitgestellt.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Antikörper bereit, der sich spezifisch an Wirbeltier-Smoothened bindet. Der Antikörper kann ein agonistischer, ein antagonistischer oder ein neutralisierender Antikörper sein.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung nicht-menschliche, transgene oder Knock-out-Tiere bereit. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Gegenstände und Sets bereit, die Wirbeltier-Smoothened oder Wirbeltier-Smoothened-Antikörper enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Proteinkomplexe bereit, die Wirbeltier-Smoothened-Protein und Wirbeltier-Patched-Protein umfassen. In einer Ausführungsform umfassen die Komplexe zudem Wirbeltier-Hedgehog-Protein. Gegebenenfalls umfasst das Wirbeltier-Patched eine Sequenz, die ein Derivat oder ein Fragment eines Wirbeltier-Patched mit nativer Sequenz ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Nucleotid (Seq.-ID Nr. 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) von Ratten-Smoothened mit nativer Sequenz.
2 zeigt die Primärstruktur von Ratten-Smo (rSmo) und Drosophila-Smo (dsmo).
Die Signalpeptidsequenzen sind unterstrichen, konservierte Aminosäuren in Kästchen dargestellt, Cysteine mit Sternchen gekennzeichnet, potenzielle Glykosylierungsstellen in gestrichelten Kästchen dargestellt, und die sieben hydrophoben Transmembrandomänen sind schattiert.
3 zeigt die Gewebeverteilung von SHH, Smo und Patched in Gewebe von Rattenembryonen und erwachsenen Ratten. In-situ-Hybridisierung von SHH (linke Spalte), Smo (mittlere Spalte) und Patched (rechte Spalte, ausschließlich Inserts) an Rattengewebe. Reihe E15 Sag: Sagittalschnitte durch E15-Rattenembryos. Reihen E9, E10, E12 und E15: Koronarschnitte durch E9-Neuralwülste, E10-Neuralrohr und Somite, E12 und E15-Neuralrohr. Die Inserts in Reihe E12 zeigen Schnitte durch die Vordergliedmaßenknospe von E12-Rattenembryos. Abkürzungen: ht=Herz; sk=Haut; bl=Blase; ts=Hoden; lu=Lunge; to=Zunge; vtc=Wirbelsäule; nf=Neuralwulst; nc=Chorda dorsalis; so=Somit; fp=Bodenplatte; vh=Vorderhorn; vz=Ventrikelzone; cm=Herzmesoderm und vm=vorderes Mittelhirn.
4 zeigt die Nucleotid- (Seq.-ID Nr. 3) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4) von menschlichem Smoothened mit nativer Sequenz.
5 zeigt die Primärstruktur von menschlichem Smo (hSmo) und Ratten-Smo (rat.Smo) und die Homologie zu Drosophila-Smo (dros.smo). Konservierte Aminosäuren sind in Kästchen dargestellt.
6 veranschaulicht die Ergebnisse von Bindungs- und Co-Immunfällungstests, die SHH-N-Bindungen zu mPatched, nicht aber zu rSmo zeigen. Färbung von Zellen, die das Flag-markierte rSmo (a und b) oder Myc-markiertes mPatched (c, d und e) exprimieren, mit (a) Flag-(Smo-)Antikörper, (c) Myc-(mPatched-)Antikörper, (b und d) IgG-SHH-N oder (e) Flag-markiertem SHH-N. (f) Co-Immunfällung von Epitop-markiertem mPatched (Patched) oder Epitop-markiertem rSmo (Smo) mit IgG-SHH-N. (g) Vernetzen von ¹²⁵I-SHH-N(¹²⁵I-SHH) mit Zellen, die mPatched oder rSmo in Abwesenheit oder Gegenwart von unmarkierten SHH-N exprimieren. (h) Co-Immunfällung von ¹²⁵I-SHH durch ein Epitop-markiertes mPatched (Patched) oder ein Epitopmarkiertes rSmo (Smo). (i) Kompetive Bindung von ¹²⁵I-SHH an Zellen, die mPatched oder mPatched plus rSmo exprimieren.
7 veranschaulicht (a) immunohistochemische Doppelfärbung von Patched (rot) und Smo (grün) in transfizierten Zellen, wobei gelb die Co-Expression der zwei Pro teine anzeigt. (b und c) Detektion von Patched-Smo-Komplexen durch Immunfällung. (b) Immunfällung mit Antikörpern gegen das Epitop-markierte Patched und Analyse auf einem Western-Blot mit Antikörpern gegen Epitop-markiertes Smo. (c) Immunfällung mit Antikörpern gegen das Epitop-markierte Smo und Analyse auf einem Western-Blot mit Antikörpern gegen Epitop-markiertes Patched. (d und e) Co-Immunfällung von¹²⁵-I-SHH, gebunden an Zellen, die sowohl Smo als auch Patched exprimieren, mit Antikörpern gegen entweder Smo- (d) oder Patched-(e) Epitopmarkierungen.
8 zeigt einen Western-Blot aus einem SDS-Gel, der den Expressionsgrad eines Wildtyp-(WT) und eines mutierten Patched (mutiert) darstellt.
9 zeigt ein Modell, das den vermeintlichen SHH-Rezeptor und dessen vorgeschlagene Aktivierung durch SHH beschreibt. Patched ist eine Liganden bindende Komponente und vSmo ist eine Signalkomponente in einem Mehrfach-Untereinheiten-SHH-Rezeptor.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
I. DEFINITIONEN
Die Bezeichnungen "Wirbeltier-Smoothened", "Wirbeltier-Smoothened-Protein" und "vSmo" umfassen, wie hierin verwendet, Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz und Wirbeltier-Smoothened-Varianten (die jeweils hierin definiert sind). Diese Bezeichnungen umfassen Smoothened aus einer Vielzahl von Tieren, die als Wirbeltiere zu klassifizieren sind, einschließlich Säugetiere. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Wirbeltier-Smoothened Ratten-Smoothened (rSmo) oder menschliches Smoothened (hSmo). Das Wirbeltier-Smoothened kann aus einer Vielzahl von Quellen isoliert werden, wie z.B. aus menschlichen Gewebetypen oder aus anderen Quellen, oder es kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Ein "Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz" umfasst ein Protein mit der gleichen Aminosäuresequenz wie ein aus der Natur erhaltenes Wirbeltier-Smoothened. Folglich kann ein Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz die Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem menschlichem Smoothened, Ratten-Smoothened oder Smoothened beliebiger Wirbeltiere aufweisen. Ein solches Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz kann aus der Natur isoliert werden oder auf rekombinante oder synthetische Weise hergestellt werden. Die Bezeichnung "Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz" umfasst insbesondere natürlich vorkommende verkürzte Formen des Wirbeltier-Smoothened, natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allelische Varianten des Wirbeltier-Smoothened. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz reifes Smoothened mit nativer Sequenz, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 4 umfasst. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das Wirbeltier-Smoothened mit nativer Sequenz ein reifes Smoothened mit nativer Sequenz, das die Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Die "Wirbeltier-Smoothened-Variante" bezeichnet ein nachstehend definiertes Wirbeltier-Smoothened mit weniger als 100 % Sequenzidentität mit Wirbeltier-Smoothened, das die in Seq.-ID Nr. 4 für menschliches Smoothened gezeigte oder die in Seq.-ID Nr. 2 für Ratten-Smoothened gezeigte abgeleitete Aminosäuresequenz aufweist. Solche Wirbeltier-Smoothened-Varianten umfassen beispielsweise Wirtbeltier-Smoothened-Proteine, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der oder innerhalb der Sequenzen von Seq.-ID Nr. 4 oder Seq.-ID Nr. 2 hinzugefügt sind, worin etwa 1 bis 30 Aminosäurereste deletiert sind oder gegebenenfalls durch einen oder mehrere Aminosäurereste substituiert sind, sowie Derivate davon, worin ein Aminosäurerest kovalent so modifiziert worden ist, dass das resultierende Produkt eine nicht natürlich vorkommende Aminosäure aufweist. Normalerweise verfügt eine Wirbeltier-Smoothened-Variante über zumindest 80%ige Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 90%ige Sequenzidentität und insbesondere zumindest 95%ige Sequenzidentiät, mit der Sequenz von Seq.-ID Nr. 4 oder Seq.-ID Nr. 2.
Die Bezeichnung "Epitop-Markierung" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf ein Markierungspolypeptid mit ausreichend Resten, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper erzeugt werden kann, das jedoch kurz genug ist, um die Aktivität des Wirbeltier-Smoothened nicht zu stören. Das Markierungspolypeptid ist vorzugsweise auch ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper dagegen im Wesentlichen keine Kreuzreaktionen mit anderen Epitopen eingeht. Geeignete Markierungspolypeptide weisen im Allgemeinen zumindest sechs Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 9 und 30 Reste) auf.
Wenn es zur Beschreibung verschiedener hierin offenbarter Proteine gebraucht wird, wird mit "isoliert" Protein bezeichnet, das identifiziert und von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung getrennt und/oder daraus gewonnen worden ist. Verunreinigungskomponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die üblicherweise die diagnostische oder therapeutische Verwendung für das Protein stören würden und können Enzyme, Hormone und andere proteinhaltige oder nicht-proteinhaltige Substanzen umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Protein (1) zu einem Grad gereinigt, der ausreicht, um zumindest 15 Reste einer N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz mittels eines Drehbecher-Sequenzierers zu erhalten, oder (2) mittels SDS-PAGE unter nichtreduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise Silber bis zur Homogenität gereinigt. "Isoliertes Protein" umfasst Proteine in situ innerhalb rekombinanter Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen vSmo-Umgebung nicht anwesend ist. Üblicherweise wird das isolierte Protein jedoch durch zumindest einen Reinigungsschritt erhalten.
Ein "isoliertes" vSmo-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt wird, mit dem es in der natürlichen Quelle der vSmo-Nucleinsäure üblicherweise assoziiert ist. Ein isoliertes vSmo-Nucleinsäuremolekül weist eine andere Form und ein anderes Umfeld auf als jene(s), mit der bzw. in dem es in der Natur vorkommt. Isolierte vSmo-Nucleinsäuremoleküle werden folglich von in natürlichen Zellen vorkommen den vSmo-Nucleinsäuremolekülen unterschieden. Dennoch umfasst "isoliertes vSmo-Nucleinsäuremolekül" auch vSmo-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die üblicherweise vSmo exprimieren, wenn das Nucleinsäuremolekül beispielsweise an einer Chromosomenstelle vorliegt, die sich von jener natürlicher Zellen unterscheidet.
Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die erforderlich sind, um eine operabel gebundene Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus zu exprimieren. Die für Prokaryoten geeigneten Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosomenbindungsstelle. Eukaryotische Zellen verwenden bekanntlich Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer.
Eine Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn diese in eine funktionelle Beziehung zu einer weiteren Nucleinsäuresequenz gestellt ist. Eine DNA für eine Präsequenz oder eine Sekretionsleitsequenz ist beispielsweise operabel an eine DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass dadurch die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle einer Sekretionsleitsequenz zusammenhängend und in Lesephase sind. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Die Verbindung wird von Ligation an geeigneten Restriktionsstellen begleitet. Wenn keine solche Stellen existieren, werden synthetische Oligonucleotid-Adaptoren oder -binder gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst insbesondere monoklonale Anti-vSmo-Antikörper (einschließlich agonistische, antagonistische und neutralisierende Antikörper) sowie Anti-vSmo-Antikörperzusammensetzungen mit Polyepitop-Spezifität.
Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wird, d.h. die jeweiligen die Population bildenden Antikörper sind identisch, mit Ausnahme von natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringem Ausmaß vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch und gegen eine einzige Antigenstelle gerichtet. Verglichen mit herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperzusammensetzungen, die üblicherweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, ist jeder monoklonale Antikörper zudem gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen Hybrid- und rekombinante Antikörper, die folgendermaßen erhalten werden: durch Spleißen einer variablen (einschließlich hypervariablen) Domäne eines Anti-vSmo-Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z.B. "humanisierte" Antikörper) oder einer leichten Kette mit einer schweren Kette oder einer Kette von einer Spezies mit einer Kette einer anderen Spezies, oder durch Fusionen mit heterologen Proteinen, unabhängig von der Ursprungsspezies oder der Immunglobulinklassen- oder Unterklassenbezeichnung, sowie Antikörperfragmenten (z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv), sofern diese die gewünschte Aktivität aufweisen. Siehe US-Patent NR. 4.816.567 und Mage et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", S. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York (1987).
Folglich weist der Modifikator "monoklonal" auf die Art des Antikörpers hin, der dann aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhalten wird, und ist nicht so auszulegen, dass die Herstellung von Antikörpern durch ein bestimmtes Verfahrens erforderlich sei. Beispielsweise können die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper durch das zuerst von Kohle und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebene Hybridomverfahren oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, die z.B. im US-Patent 4.816.567 beschrieben werden. Die "monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagenbibliotheken isoliert werden, die beispielsweise unter Anwendung der von McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Die "humanisierten" Formen von nicht-menschlichen (z.B. Mäuse-) Antikörpern sind spezifische chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine minimale von nicht-menschlichem Immunglobulin stammende Sequenz enthalten. Zu einem Großteil sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. einer Maus, einer Ratte oder eines Hasen, ersetzt sind, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität aufweisen. In einigen Fällen werden Fv-Gerüstregionsreste (FR-Reste) von menschlichem Immunglobulin durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Zudem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder in den Empfängerantikörpern noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen vorliegen. Diese Modifikationen erfolgen, um die Antikörperleistung zusätzlich zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die Gesamtheit zumindest einer und üblicherweise zweier variabler Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen, und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen sind jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensus-Sequenz. Die humanisierten Antikörper umfassen optimalerweise auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion oder -domäne (Fc), üblicherweise jenen eines menschlichen Immunglobulins.
Die Bezeichnung "Wirbeltier" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf alle Tiere, die als Wirbeltiere klassifiziert sind, einschließlich bestimmter Klassen von Fischen, Reptilien, Vögeln und Säugetieren. Die Bezeichnung "Säugetier" bezieht sich, wie hierin verwendet, auf alle Tiere, die als Säugetiere klassifiziert sind, einschließlich Menschen, Rinder, Ratten, Mäuse, Pferde, Hunde und Katzen.
II. ARTEN DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von Wirbeltier-Homologen von Smoothened. Insbesondere haben die Anmelder menschliches und Ratten-Smoothened identifiziert und isoliert. Die Eigenschaften und Merkmale von menschlichem und Ratten-Smoothened werden detaillierter in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Auf der Basis der Eigenschaften und Merkmale von hierin offenbartem menschlichem und Ratten-Smoothened sind die Anmelder gegenwärtig der Meinung, dass Wirbeltier-Smoothened eine Signalkomponente in einem Mehrfach-Untereinheits-Hedgehog-Rezeptor (insbesondere Sonic-Hedgehog- ("SHH-") Rezeptor) ist.
Im Folgenden wird die Herstellung von Wirbeltier-Smoothened beschrieben.
A. Herstellung von vSmo
Geeignete Verfahren zur Herstellung von vSmo sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen das Isolieren von vSmo aus einer endogenen Quelle des Polypeptids, Peptidsynthese (unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers) und Rekombinationsverfahren (oder beliebige Kombinationen dieser Verfahren). Die nachstehende Beschreibung betrifft hauptsächlich die Herstellung von vSmo durch Kultivierung von Zellen, die mit einem Vektor transformiert oder transfiziert wurden, der vSmo-Nucleinsäure enthält. Es wird natürlich in Erwägung gezogen, dass alternative, auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannte Verfahren zur Herstellung von vSmo angewandt werden können.
1. Isolierung von vSmo-kodierender DNA
DNA, die für vSmo kodiert, kann aus jeder beliebigen cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe erzeugt wurde, von dem angenommen wird, dass es vSmo-mRNA besitzt und in detektierbarem Ausmaß exprimiert. Folglich kann menschliche Smo-DNA problemlos aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus menschli chem Gewebe erzeugt wurde, wie z.B. die in Beispiel 3 beschriebene Bibliothek von menschlicher embryonaler Lungen-cDNA. Ratten-Smo-DNA kann ohne weiteres aus einer cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Rattengeweben erzeugt wurde, wie z.B. in Beispiel 1 beschrieben. Das für vSmo kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese erhalten werden.
Die Bibliotheken können mit Sonden gescreent werden (wie z.B. Antikörpern gegen vSmo oder Oligonucleotiden oder Polypeptiden wie in den Beispielen beschrieben), die dazu dienen, das Gen von Interesse oder das dadurch kodierte Protein zu identifizieren. Die Sonden sind vorzugsweise so markiert, dass sie nach Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek detektiert werden können. Markierungsverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und umfassen die Verwendung von radioaktiven Markierungen, wie z.B. ³²P-markiertes ATP, Biotinylierung oder Enzymmarkierung. Das Screenen der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit einer ausgewählten Sonde kann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie in Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben sind. Ein alternatives Verfahren zur Isolierung des Gens, das für vSmo kodiert, ist die Anwendung der PCR-Methodik [Sambrook et al., siehe oben; Dieffenbach et al., "PCR Primer: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1995)].
Nucleinsäure mit der vollständigen Protein-kodierenden Sequenz kann erhalten werden, indem ausgewählte cDNA oder genomische Bibliotheken unter Verwendung der hierin offenbarten abgeleiteten Aminosäuresequenzen gescreent werden und je nach Bedarf unter Anwendung herkömmlicher Primerverlängerungsverfahren, wie von Sambrook et al., siehe oben, beschrieben, um Vorläufer und Verarbeitungszwischenprodukte von mRNA zu detektieren, die nicht in cDNA revers transkribiert worden sind.
vSmo-Varianten können hergestellt werden, indem geeignete Nucleotid-Änderungen in die vSmo-DNA eingeführt werden, oder mittels Synthese des gewünschten vSmo-Polypeptids. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ist klar, dass Aminosäure änderungen (im Vergleich zur nativen vSmo-Sequenz) posttranslationale Prozesse des vSmo verändern können, wie z.B. eine Änderung der Anzahl oder der Position von Glykosylierungsstellen.
Änderungen in vSmo mit nativer Sequenz können unter Einsatz beliebiger der im US-Patent 5.364.934 dargelegten Verfahren und Anleitungen für konservative und nicht-konservative Mutationen hergestellt werden. Diese umfassen Oligonucleotidvermittelte (stellengerichtete) Mutagenesen, Alaninscanning und PCR-Mutagenese.
2. Insertion von Nucleinsäure in einen replizierbaren Vektor
Die für vSmo kodierende Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) kann zum weiteren Klonieren (DNA-Amplifikation) oder zur Expression in einen replizierbaren Vektor insertiert werden. Es sind verschiedene Vektoren frei erhältlich. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, jedoch nicht ausschließlich, einen oder mehrere der Nachstehenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Marker-Gene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz, die jeweils nachstehend beschrieben werden.
(i) Signalseguenzkomponente
Das vSmo kann rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als Fusionspolypeptid mit einer heterologen Aminosäuresequenz oder einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids sein kann. Allgemein kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder Teil der vSmo-DNA, die in den Vektor insertiert wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und verarbeitet (d.h, durch eine Signalpeptidase gespalten) wird.
(ii) Ursprung der Replikationskomponente
Sowohl die Expressions- als auch die Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz bei Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren, und umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren bekannt.
Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle-Vektoren", d.h. sie können sich in zumindest einer Klasse von Organismen replizieren, können aber zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert, und anschließend wird derselbe Vektor zur Expression in Hefe- oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er nicht fähig ist, sich unabhängig vom Wirtszellenchromosom zu replizieren.
DNA-Amplifikation kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom erfolgen. Dies wird einfach unter Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirte erreicht, indem beispielsweise in den Vektor eine DNA-Sequenz eingeführt wird, die zu einer in der genomischen Bacillus-DNA vorliegenden Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor führt zu homologer Rekombination mit dem Genom und zur Insertion von vSmo-DNA.
(iii) Selektionsgenkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder Wachstum von transformierten Wirtszellen, die in selektiven Kulturmedium gezüchtet werden, erforderlich ist. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, der das Selektionsgen enthält, überleben im Kultur medium nicht. Übliche Selektionsgene kodieren für Proteine die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, wie z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophe Mängel komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die nicht aus komplexen Medien erhältlich sind, wie z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen für Bacilli.
Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert wurden, produzieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht, und überleben somit die Selektionsbedingungen. Beispiele für eine solche dominante Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin [Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)], Mycophenolsäure [Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)] oder Hygromycin [Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410-413 (1985)]. Die drei oben angeführten Beispiele nutzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegen das entsprechende Arzneimittel zu verleihen, d.h. G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin.
Weitere Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die kompetent genug sind, um die vSmo-Nucleinsäure aufnehmen zu können, wie z.B. DHFR oder Thymidin-Kinase. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, so dass nur die Transformanten einzigartig angepasst sind, um aufgrund der Tatsache zu überleben, den Marker aufgenommen zu haben. Der Selektionsdruck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium nach und nach geändert wird, was zu Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der für vSmo kodierenden DNA führt. Amplifikation ist ein Verfahren, durch das Gene aufgrund erhöhten Bedarfs an der Produktion eines Proteins, das für das Wachstum entscheidend ist, innerhalb der Chromosomen nachfolgender Generationen von rekombinanten Zellen hintereinander wiederholt werden.
Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert worden sind, können zuerst durch Kultivierung aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert werden, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle bei Verwendung von Wildtyp-DHFR sind die Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zelllinie), die einen Mangel an DHFR-Aktivität aufweisen und die wie von Urlaub et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wurden. Die transformierten Zellen werden anschließend erhöhten Methotrexatmengen ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von Mehrfachkopien des DHFR-Gens und gleichzeitig zu Mehrfachkopien von anderer DNA in den Expressionsvektoren, wie z.B. der für vSmo kodierenden DNA.
(iv) Promotorkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die vSmo-Nucleinsäuresequenz gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromauf (5') vom Startcodon eines Strukturgens (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1.000 bp) liegen und die Transkription sowie die Translation bestimmter Nucleinsäuresequenzen, wie z.B. der vSmo-Nucleinsäuresequenz, an die sie operabel gebunden sind, steuern. Solche Promotoren werden üblicherweise in zwei Klassen eingeteilt: induzierbar und konstitutiv. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Antwort auf gewisse Änderungen der Kulturbedingungen, wie z.B. Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder Temperaturveränderunge, erhöhte Transkriptionsmengen von DNA unter ihrer Kontrolle initiieren. Derzeit ist eine große Anzahl von Promotoren allgemein bekannt, die von einer Reihe von potenziellen Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an vSmo-kodierende DNA gebunden, indem der Promotor aus der Ursprungs-DNA durch Restriktionsenzymverdau entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird.
Promotoren, die sich zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten eignen, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme [Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)], alkalische Phosphatase, ein Tryptophan-(trp-)Promotorsystem [Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-36.776] und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor [deBoer et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)].
Promotorsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Im Grunde weisen alle eukaryotischen Gene eine AT-reiche Region auf, die ca. 25 bis 30 Basen stromauf von jener Stelle liegt, wo die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstart vieler Gene liegt, ist eine CXCAAT-Region, wobei X ein beliebiges Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene ist eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Hinzufügung des poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der Kodiersequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden entsprechend in eukaryotische Expressionsvektoren eingeführt.
Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung bei Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)] oder andere glykolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)], wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression sind in der EP-A-73.657 beschrieben.
Die vSmo-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren, wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus (UK-A-2.211.504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinderpapillomvirus, Vogelsarcomvirus, Cytomegalievirus, Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. Actin-Promotor, oder einem Immunglobulin-Promotor erhalten werden.
Die frühen und späten Promotoren des SV-40-Virus werden günstigerweise als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den SV40-viralen Replikationsursprung enthält [Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligen und Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981)]. Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Cytomegalievirus wird günstigerweise als Hind-III-E-Restriktionsfragment erhalten [Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982)]. Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinderpapillomvirus als Vektor wird im US-Patent 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im US-Patent 4.601.978 beschrieben [siehe auch Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982) bezüglich der Expression von cDNA, die für Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature 297, 598-601 (1982) bezüglich der Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mäusezellen unter der Steuerung eines Thymidin-Kinase-Promotors von Herpes-Simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982) bezüglich der Expression von menschlichem β-1-Interferon bei Zuchtmäusen und Hasenzellen; und Gorman et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982) bezüglich der Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryofibroblasten, Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, HeLa-Zellen und Mäuse-NIM-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung von Rous-Sarcom-Virus als Promotor].
(v) Enhancerelementkomponente
Die Transkription von DNA, die für das vSmo kodiert, mittels höherer Eukaryoten kann gesteigert werden, indem eine Enhancersequenz in den Vektor eingeführt wird. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, üblicherweise aus etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor einwirken, um dessen Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ richtungs- und positionsunabhängig und wurden 5' [Laimins et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)] und 3' [Lusky et al., Mol. Cell. Bio. 3, 1108 (1983)] zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns [Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)] sowie innerhalb der Kodiersequenz selbst [Osborne et al., Mol. Cell. Bio. 4, 1293 (1984)] angetroffen. Von Säugetiergenen sind gegenwärtig viele Enhancersequenzen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Üblicherweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV-40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100 bis 270), den frühen Cytomegalievirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982), bezüglich Enhancerelementen zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren.
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
Die in eukaryotischen Wirtszellen verwendeten Expressionsvektoren (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder zellkernhaltigen Zellen anderer mehrzelliger Organismen) enthalten üblicherweise auch Sequenzen, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind herkömmlicherweise von den untranslatierten 5'- und gelegentlich 3'-Regionen eukaryotischer oder viraler DNA oder cDNA erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierbaren Abschnitt der für vSmo kodierenden mRNA transkribiert werden.
(vii) Konstruktion und Analyse von Vektoren
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die einen oder mehrere der oben angeführten Komponenten enthalten, umfasst die Anwendung von Standard-Ligationsverfahren. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschter Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu ergeben.
Zur Analyse zwecks Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden können die Ligationsgemische verwendet werden, um den E. coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten je nach Bedarf mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert werden. Plasmide werden aus den Transformanten präpariert, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder durch das Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder das Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
(viii) Vorübergehende Expressionsvektoren
Es können Expressionsvektoren eingesetzt werden, die für vorübergehende Expression von für vSmo kodierender DNA in Säugetierzellen sorgen. Allgemein umfasst vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, sich in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors anhäuft und umgekehrt große Mengen eines gewünschten Polypeptids, für das der Expressionsvektor kodiert, synthetisiert [Sambrook et al., siehe oben]. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen eine bequeme positive Identifikation von Polypeptiden, für die klonierte DNA kodiert, sowie das rasche Screenen solcher Polypeptide auf gewünschte Eigenschaften.
(ix) Geeignete exemplarische Wirbeltierzellvektoren
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die sich zur Adaptation für die Synthese von vSmo in rekombinanter Wirbeltierzellkultur eignen, werden von Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); in der EP-A-117.060; und in der EP-A-117.058 beschrieben.
3. Auswahl und Transformation von Wirtszellen
Als geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den Vektoren hierin eignen sich die oben beschriebenen Prokaryoten, Hefen oder höheren eukaryotischen Zellen. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Eubakterien, wie z.B. gramnegative oder grampositive Organis men, beispielsweise Enterobacteriaceen, wie z.B. Escherichia. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen absondern.
Zusätzlich zu den Prokaryoten können eukaryotische Mikroben, wie z.B. Fadenpilze oder Hefe, als geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für vSmo-kodierende Vektoren dienen. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Backhefe ist unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen die am häufigsten verwendete. Eine Reihe von anderen Gattungen, Spezies und Stämmen ist jedoch allgemein verfügbar und für die Zwecke hierin geeignet.
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosyliertem vSmo stammen aus mehrzelligen Organismen. Solche Wirtszellen sind fähig, komplexe Verarbeitung und Glykosylierungsaktivitäten durchzuführen. Im Grunde ist jede beliebige höhere eukaryotische Zellkultur nutzbar, unabhängig davon, ob sie aus einer Wirbeltier- oder einer Wirbellosen-Kultur stammt. Beispiele für Wirbellosenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen.
Die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls allgemein bekannt [siehe z.B. Kruse und Patterson (Hrsg.), "Tissue Culture", Academic Press (1973)]. Als Beispiele für geeignete Säugetierwirtszelllinien dienen die Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1.651), die menschliche Embryonierenlinie [293 oder 293-Zellen, die für Wachstumszwecke in einer Suspensionskultur subkloniert wurden (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977))], Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10), Ovarienzellen chinesischer Hamster/DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)), Mäusesertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)), Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70), AGMK-Zellen (VERO-76, ATCC CRL-1.587), menschliche Cervicalkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2), Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34), Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1.442), menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8.065), Mäusebrusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)), MRC-5-Zellen und FS4-Zellen.
Die Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren zur vSmo-Produktion transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien kultiviert, die zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der Gene, die für die gewünschten Sequenzen kodieren, entsprechend modifiziert wurden.
Transfektion betrifft die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob es tatsächlich zur Expression von Kodiersequenzen kommt. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung sind eine Vielzahl von Transfektionsverfahren bekannt, wie z.B. CaPO₄ und Elektroporation. Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn es irgendeinen Hinweis auf die Wirkungsweise dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle gibt.
Als Transformation wird die Aufnahme von DNA in einen Organismus bezeichnet, so dass die DNA replizierbar wird, entweder als extrachromosomales Element oder durch Chromosomenintegration. Je nach verwendeter Wirtszelle findet Transformation unter Anwendung von Standardverfahren statt, die für solche Zellen geeignet sind. Von Sambrook et al., siehe oben, beschriebene Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid oder Elektroporation werden allgemein für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die substanzielle Zellwandbarrieren aufweisen. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation von bestimmten Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben. Pflanzen können zudem mittels Ultraschallbehandlung transfiziert werden, wie in der WO 91/00358, veröffentlicht am 10. Januar 1991, beschrieben.
Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Fällungsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte der Wirtssystemtransformation von Säugetierzellen sind im US-Pa tent 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden üblicherweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen angewandt werden, wie z.B. durch Kern-Mikroinjektion, Elektroporation, bakterielle Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder Polykationen, wie z.B. Polybren, Polyornithin. Bezüglich verschiedener Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
4. Kultivierung der Wirtszellen
Prokaryotische Zellen, die zur Herstellung von vSmo verwendet werden, können, wie allgemein von Sambrook, siehe oben, beschrieben, in geeigneten Medien kultiviert werden.
Die zur Produktion von vSmo verwendeten Säugetierwirtszellen können in einer Reihe von Medien kultiviert werden. Beispiele für handelsübliche Medien umfassen Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ("MEM", Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ("DMEM", Sigma). Jedes dieser Medien kann nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktoren), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamycin^TM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindung, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Es können auch andere beliebige Ergänzungsmittel in geeigneten Konzentrationen, die Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, entsprechen den zuvor in Zusammenhang mit der zur Expression aus gewählten Wirtszelle angewandten Bedingungen und sind für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar.
Prinzipien, Vorschriften und praktische Techniken zur Produktivitätsmaximierung von Säugetierzellkulturen finden sich in "Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach", M, Butler (Hrsg.), IRL Press (1991).
Die in dieser Offenbarung beschriebenen Wirtszellen beziehen sich auf Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
5. Detektion von Genamplifikation und -expression
Die Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, zur Quantifizierung der Transkription von mRNA [Thomas. Proc. NatI. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)], Dot-Blot (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer entsprechend markierten Sonde, auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Es können verschiedene Markierungen eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope und insbesondere ³²P. Andere Verfahren können jedoch ebenfalls angewandt werden, wie z.B. die Verwendung Biotin-modifizierter Nucleotide zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle für Avidin oder Antikörper, die mit einer breiten Vielzahl an verschiedenen Markierungen markiert sein können, wie z.B. mit Radionucleotiden, Fluoreszenzmitteln oder Enzymen. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe erkennen können, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe. Die Antikörper können wiederum markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, indem der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass die Gegenwart des an den Duplex gebundenen Antikörpers nach der Ausbildung des Duplex auf der Oberfläche detektiert werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden, wie z.B. mittels immunohistochemischer Färbung von Zellen oder Gewebe schnitten und Test der Zellkultur oder von Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Bei immunohistochemischen Färbeverfahren wird eine Zellprobe hergestellt, üblicherweise durch Dehydrierung und Fixierung, gefolgt von einer Reaktion mit markierten Antikörpern, die spezifisch für das gebundene Genprodukt sind, worin die Markierungen üblicherweise visuell detektierbar sind, wie z.B. enzymatische, fluoreszierende oder lumineszierende Markierungen.
Antikörper, die sich zur immunohistochemischen Färbung und/oder zum Testen von Probeflüssigkeiten eignen, sind entweder monoklonal oder polyklonal und können in jedem beliebigem Säugetier produziert werden. Geeigneterweise können die Antikörper gegen ein vSmo-Protein mit nativer Sequenz oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen erzeugt werden.
6. Reinigung von vSmo
Es wird in Betracht gezogen, dass es erwünscht sein kann, eine Form von vSmo aus rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die bezogen auf vSmo im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt kann das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert werden, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. vSmo kann anschließend von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt werden, wobei die nachstehenden Verfahren als Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren dienen: Fraktionierung auf einer Ionenaustauschersäule, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie auf Kieselgel oder einem Kationenaustauscherharz, wie z.B. DEAE, Chromatofokussierung, SDS-PAGE, Ammoniumsulfatfällung, Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-765 und Protein-A-Sepharosesäulen zur Entfernung von Kontaminanten wie etwa IgG. vSmo-Varianten können auf gleiche Art und Weise wie vSmo mit nativer Sequenz gewonnen werden, wobei jegliche wesentliche Änderung der Eigenschaften, die durch die Variation hervorgerufen wird, berücksichtigt wird.
Ein Proteasehemmer, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kann sich auch zur Hemmung des proteolytischen Abbaus während der Reinigung eignen, und Anti biotika können eingeführt werden, um das Wachstum von adventiven Kontaminanten zu verhindern.
7. Kovalente Modifikationen von vSmo
Kovalente Modifikationen von vSmo liegen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Ein Typ von kovalenter Modifikation von vSmo, der im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegt, umfasst die Änderung der nativen Glykosylierungsstruktur des Proteins. Die "Änderung der nativen Glykosylierungsstruktur" dient hierin dem Zweck, eine oder mehrere in der nativen vSmo-Sequenz vorliegende Kohlenhydrat-Gruppierungen zu deletieren und/oder eine oder mehrere Glykosylierungsstellen hinzuzufügen, die nicht in der nativen vSmo-Sequenz enthalten sind.
Die Glykosylierung von Polypeptiden ist üblicherweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Bindung von Kohlenhydratgruppierungen an der Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparagin-Seitenkette. Folglich bildet die Gegenwart jeder dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine potenzielle Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezieht sich auf die Bindung eines der Zucker N-Acetylgalactosamin, Glactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obwohl 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin ebenfalls verwendet werden können.
Hinzufügung von Glykosylierungsstellen an das vSmo kann durch eine Änderung der Aminosäuresequenz erzielt werden, so dass diese eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen (für N-gebundene Glykosylierungsstellen) aufweist. Die Änderung kann auch durch Addition oder Substitution von einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten an das vSmo mit nativer Sequenz (für O-gebundene Glykosylierungsstellen) erfolgen. Die vSmo-Aminosäuresequenz kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Ebene verändert werden, insbesondere durch Mutieren der DNA, die für das vSmo-Protein kodiert, an zuvor ausgewählten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den gewünschten Aminosäuren translatiert werden. Die DNA-Mutationen können unter Einsatz von Verfahren erfolgen, die oben und im US-Patent 5.364.934, siehe oben, beschrieben wurden.
Chemische oder enzymatische Anbindung von Glykosiden an das Polypeptid stellt eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen auf dem vSmo dar. Je nach verwendeter Bindungsart können der oder die Zucker an (a) ein Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z.B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie z.B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z.B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren werden in der WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und von Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306 (1981), beschrieben.
Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen auf dem vSmo-Protein kann chemisch oder enzymatisch oder durch Mutationssubstitution von Codons erfolgen, die für Aminosäurereste kodieren, welche als Ziele für die Glykosylierung dienen. Beispielsweise kann chemische Deglykosylierung durch Aussetzen des Polypeptids gegenüber der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung zur Abspaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des Verbindungszuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin) führen, wobei das Polypeptid intakt bleibt. Chemische Deglykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Abspaltung von Kohlenhydratgruppierungen auf den Polypeptiden kann wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben durch Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo-Glykosidasen erzielt werden.
Glykosylierung an potenziellen Glykosylierungsstellen kann wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982), beschrieben durch Verwendung der Verbindung Tuni camycin verhindert werden. Tunicamycin blockiert die Ausbildung von Protein-N-Glykosidbindungen.
8. vSmo-Chimären
Die vorliegende Erfindung stellt auch chimäre Moleküle bereit, die vSmo umfassen, das an andere, heterologe Aminosäuren oder Polypeptide fusioniert ist. In einer Ausführungsform umfasst das chimäre Molekül eine Fusion des vSmo mit einem Marker-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung liegt im Allgemeinen am Amino- oder Carboxyl-Terminus von vSmo vor: Solche Epitop-markierte Formen von vSmo sind erwünscht, da ihre Gegenwart unter Verwendung eines markierten Antikörpers gegen das Marker-Polypeptid detektiert werden kann. Die Bereitstellung der Epitopmarkierung ermöglicht auch, dass das vSmo mittels Affinitiätsreinigung unter Verwendung des Anti-Markierungs-Antikörpers problemlos gereinigt werden kann. Affinitätsreinigungsverfahren und diagnostische Tests, die Antikörper verwenden, werden hierin später beschrieben.
Markierungs-Polypeptide und deren jeweilige Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Beispiele umfassen das Grippe-NA-Markierungs-Polypeptid und dessen Antikörper 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)]; die c-myc-Markierung und dessen Antikörper 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 und 9E10 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610-3616 (1985)]; und die Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D-(-gD-)Markierung und dessen Antikörper [Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)]. Andere Markierungs-Polypeptide sind auch offenbart worden. Beispiele umfassen das Flag-Peptid [Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)]; das KT3-Epitop-Peptid [Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)]; ein α-Tubulin-Epitop-Peptid [Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)]; und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung [Lutz-Freyermuth et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)]. Nachdem das Markierungs- Polypeptid ausgewählt worden ist, kann unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren ein Antikörper dagegen erzeugt werden.
Die allgemeinen Verfahren, die sich für die Konstruktion und Produktion von Epitopmarkiertem vSmo eignen, sind die gleichen wie die hierin oben offenbarten. vSmo-Markierungspolypeptid-Fusionen werden am günstigsten durch Fusionieren der cDNA-Sequenz, die für den vSmo-Abschnitt "in-frame" kodiert, an die Markierungspolypeptid-DNA-Sequenz und Exprimieren des resultierenden DNA-Fusions-Konstrukts in geeignete Wirtszellen konstruiert. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen vSmo-Markierungspolypeptid-Chimären wird üblicherweise Nucleinsäure, die für das vSmo kodiert, an ihrem 3'-Ende an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus des Markierungspolypeptids kodiert, wobei jedoch 5'-Fusionen ebenfalls möglich sind.
9. Verfahren zur Verwendung von vSmo
Das in vorliegender Beschreibung offenbarte vSmo ist in therapeutischen und nicht-therapeutischen Anwendungen nützlich. Zu therapeutischen Zwecken kann vSmo (oder die für vSmo kodierende Nucleinsäure) in Gentherapieverfahren in vivo oder ex vivo angewandt werden. In nicht-therapeutischen Anwendungen können Nucleinsäuresequenzen, die für vSmo kodieren, als Diagnostika zur gewebespezifischen Typisierung verwendet werden. Verfahren wie In-situ-Hybridisierung, Northern- und Southern-Blotting sowie PCR-Analyse können beispielsweise eingesetzt werden, um zu bestimmen, ob für vSmo kodierende DNA und/oder RNA in den überprüften Zelltypen vorliegt. vSmo-Nucleinsäure eignet sich auch zur Herstellung von vSmo durch hierin beschriebene Rekombinationsverfahren.
Das isolierte vSmo kann in quantitativen diagnostischen Tests als Vergleich verwendet werden, gegen den Proben mit unbekannten Mengen an vSmo hergestellt werden können. vSmo-Präparate eignen sich auch zur Erzeugung von Antikörpern, als Standards in Tests auf vSmo (z.B. durch Markieren von vSmo zur Verwendung als Standard in einem Radioimmunassay, Radiorezeptorassay oder enzymgebundenen Assays) oder für Affinitätsreinigungsverfahren.
Nucleinsäuren, die für vSmo, wie z.B. das hierin offenbarte Ratten-vSmo, kodieren, können auch zur Erzeugung von entweder transgenen Tieren oder "Knock-out"-Tieren verwendet werden, die sich wiederum für die Entwicklung und zum Screen von therapeutisch wertvollen Reagenzien eignen. Ein transgenes Tier (z.B. eine Maus oder eine Ratte) ist ein Tier mit Zellen, die ein Transgen enthalten, wobei das Transgen in das Tier oder in einen Vorfahren des Tiers in einer pränatalen, z.B. embryonalen, Phase eingeführt wurde. Ein Transgen ist DNA, die in das Genom einer Zelle integriert ist, aus der sich ein transgenes Tier entwickelt. In einer Ausführungsform kann Ratten-cDNA, die für rSmo oder eine geeignete Sequenz davon kodiert, verwendet werden, um durch bestehende Verfahren eine genomische DNA, die für Smo kodiert, und genomische Sequenzen zu klonen, die zur Bildung von transgenen Tieren verwendet werden, die Zellen zur Expression von für Smo kodierender DNA enthalten. Verfahren zur Züchtung von transgenen Tieren, insbesondere von Tieren wie Mäusen oder Ratten, sind auf dem Gebiet der Erfindung üblich geworden und sind beispielsweise in den US-Patenten 4.736.866 und 4.870.009 beschrieben worden. Üblicherweise werden bestimmte Zellen als Ziele der vSmo-Transgen-Aufnahme mit gewebespezifischen Enhancern verwendet. Transgene Tiere, die eine Kopie eines Transgens enthalten, das für vSmo kodiert und in die Keimbahn der Tiere in der Embryonalphase eingeführt worden ist, können verwendet werden, um die Auswirkung von verstärkter Expression von für vSmo kodierender DNA zu überprüfen. Solche Tiere können als Testtiere für Reagenzien verwendet werden, von denen angenommen wird, dass sie einen Schutz vor beispielsweise pathologischen Leiden verleihen, die mit der konstitutiven Aktivität von vSmo oder Hedgehog in Verbindung gebracht werden, einschließlich einiger Krebsformen, die daraus resultieren können, wie z.B. Basalzellkarzinome, Basalzellnävussyndrom und Pankreaskarzinome. Ein Tier wird gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung mit dem Reagens behandelt, und eine reduzierte Anzahl an Vorfällen des pathologischen Leidens würde auf eine potenzielle therapeutische Intervention für das pathologische Leiden hinweisen.
Alternativ dazu können die nicht-menschlichen Homologe von vSmo dazu verwendet werden, ein vSmo-"Knock-out"-Tier zu züchten, das als Ergebnis homologer Rekombination zwischen dem für vSmo kodierenden endogenen Gen und für vSmo kodierender, veränderter genomischer DNA, die in dessen Embryonalzelle eingeführt wurde, ein defektes oder verändertes Gen aufweisen, das für vSmo kodiert. Beispielsweise kann Ratten-cDNA, die für Smo kodiert, verwendet werden, um für Smo kodierende genomische DNA gemäß bestehender Verfahren zu klonieren. Ein Teil der für Smo kodierenden genomischen DNA kann deletiert oder durch ein anderes Gen ersetzt werden, z.B. durch ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert, der dazu verwendet werden kann, die Integration zu überwachen. Üblicherweise sind mehrere Kilobasen an unveränderter flankierender DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) im Vektor enthalten [siehe beispielsweise Thomas und Capecchi, Cell 51, 503 (1987), bezüglich einer Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren]. Der Vektor wird in eine embryonale Stammzelllinie (z.B. mittels Elektroporation) eingeführt, und es werden Zellen selektiert, in denen die eingeführte DNA mit der endogenen DNA homolog rekombiniert hat [siehe beispielsweise Li et al., Cell 69, 915 (1992)]. Die selektierten Zellen werden sodann in Blastozyten eines Tieres (z.B. einer Maus oder einer Ratte) injiziert, um Aggregations-Chimären zu bilden [siehe z.B. Bradley, "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", E. J. Robertson (Hrsg.), S. 113-152, IRL, Oxford (1987)]. Ein chimärer Embryo kann anschließend in ein geeignetes scheinträchtiges weibliches Pflegetier implantiert und der Embryo geboren werden, um ein "Knock-out"-Tier zu erzeugen. Nachkommenschaft, welche die homolog rekombinierte DNA in ihren Keimzellen trägt, kann durch Standardverfahren identifiziert und dazu verwendet werden, Tiere zu züchten, in denen alle Zellen des Tieres die homolog rekombinierte DNA enthalten. Knock-out-Tiere können beispielsweise aufgrund ihrer Fähigkeit, sich gegen bestimmte pathologische Leiden zu wehren, gekennzeichnet sein und können bei der Erforschung des Mechanismus verwendet werden, durch den die Hedgehog-Molekülfamilie mitogene, differenzierende und morphogene Wirkungen ausübt.
B. Herstellung von Anti-vSmo-Antikörpern
Die vorliegende Erfindung stellt zudem Anti-vSmo-Antikörper bereit. Antikörper gegen vSmo können wie folgt hergestellt werden. Beispiele für Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugat-Antikörper.
1. Polyklonale Antikörper
Die vSmo-Antikörper können polyklonale Antikörper umfassen. Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Polyklonale Antikörper können in Säugetieren, z.B. durch eine oder mehrere Injektionen eines Immunisierungsmittels und auf Wunsch eines Adjuvans, erzeugt werden. Üblicherweise wird das Immunisierungsmittel und/oder das Adjuvans mittels mehrfacher subkutaner oder intraperitonealer Injektionen in das Säugetier injiziert. Das Immunisierungsmittel kann das vSmo-Protein oder ein Fusionsprotein davon umfassen. Dieses kann sich zur Konjugation des Immunisierungsmittels an ein Protein eignen, von dem bekannt ist, dass es im zu immunisierenden Säugetier immunogen ist. Beispiele für solche anwendbare immunogene Proteine umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin und Sojabohnen-Trypsin-Hemmer. Ein Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, kann auch verwendet werden, um die Immunantwort des Säugetiers zu verstärken. Beispiele für verwendbare Adjuvans umfassen vollständiges Freundsches Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid-A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat). Das Immunisierungsschema kann von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung ohne übermäßiges Experimentieren gewählt werden. Dem Säugetier kann anschließend Blut abgenommen und das Serum auf den Antikörpertiter untersucht werden. Auf Wunsch kann das Säugetier geboostet werden, bis der Antikörpertiter steigt oder einen Plateauwert erreicht.
2. Monoklonale Antikörper
Die vSmo-Antikörper können alternativ monoklonale Antikörper sein. Monoklonale Antikörper können unter Anwendung von Hybridomverfahren erzeugt werden, wie z.B. mit den von Kohler und Milstein, siehe oben, beschriebenen. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier üblicherweise mit einem Immunisierungsmittel immunisiert (z.B. wie oben beschrieben), um die Bildung von Lymphozyten zu bewirken, die Antikörper produzieren oder produzieren können, welche sich spezifisch an das Immunisierungsmittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Das Immunisierungsmittel umfasst üblicherweise das vSmo-Protein oder ein Fusionsprotein davon. Es können auch Zellen verwendet werden, die vSmo an ihrer Oberfläche exprimieren. Im Allgemeinen werden entweder Peripherblutlymphozyten ("PBL") verwendet, wenn Zellen menschlichen Ursprungs erwünscht sind, oder Milz oder Lymphknotenzellen, wenn nicht-menschliche Säugetierquellen gewünscht werden. Die Lymphozyten werden sodann mit einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden [Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", S. 59-103, Academic Press (1986)]. Die sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinien sind üblicherweise transformierte Säugetierzellen, insbesondere Myelomzellen von Nagetieren, Rindern oder Menschen. Üblicherweise werden Myelomzellen von Ratten oder Mäusen verwendet. Die Hybridomzellen können in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder das Überleben der nicht-fusionierten, sich unbegrenzt vermehrenden Zellen hemmen. Wenn beispielsweise den parenteralen Zellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, umfasst das Kulturmedium für die Hybridome üblicherweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"), wobei diese Substanzen das Wachstum von Zellen mit HGPRT-Mangel hemmen.
Als bevorzugte sich unbegrenzt vermehrende Zellen gelten solche, die effizient fusionieren, eine stabile, hochgradige Expression von Antikörpern durch die selektierten Antikörper-produzierenden Zellen beibehalten und gegenüber einem Medium, wie z.B. einem HAT-Medium, empfindlich sind. Noch bevorzugtere sich unbegrenzt vermehrende Zelllinien sind Mäuse-Myelomlinien, die beispielsweise vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, und der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind [Kozbor, J. Immunolog. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", S. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York (1987)].
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen kultiviert werden, kann sodann auf die Gegenwart von monoklonalen Antikörpern, die gegen vSmo gerichtet sind, untersucht werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörper durch Immunfällung oder einem In-vitro-Bindungsassay, wie z.B. einem Radioimmunassay (RIA) oder einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), bestimmt. Solche Verfahren und Assays sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Die Bindungsaffinität der monoklonalen Antikörper kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die gewünschten Hybridomzellen identifiziert worden sind, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren vermehrt werden [Goding, siehe oben]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium und das RPMI-1640-Medium. Alternativ dazu können die Hybridomzellen in Säugetieren als Ascites in vivo gezüchtet werden.
Die von den Subklonen abgesonderten monoklonalen Antikörper können isoliert oder aus dem Kulturmedium oder der Ascites-Flüssigkeit durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren gereinigt werden, wie z.B. mittels Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren erzeugt werden, wie z.B. den im US-Patent 4.816.567 beschriebenen. DNA, die für die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren problemlos isoliert und sequenziert werden (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden, die sich spezifisch an Gene binden können, die für schwere und leichte Ketten von Mäuse-Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Nach der Isolierung kann die DNA in Expressionsvektoren eingeführt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Simian-COS-Zellen, Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO-Zellen) oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirszellen zu erzielen. Die DNA kann auch modifiziert werden, beispielsweise durch Substitution der Kodiersequenz durch konstante Domänen schwerer und leichter menschlicher Ketten statt der homologen Mäuse-Sequenzen [US-Patent 4.816.567; Morrison et al., siehe oben] oder durch kovalentes Verbinden der gesamten oder eines Teils der Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodiersequenz. Ein solches Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann durch die konstanten Domänen eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder durch die variable Domäne einer Antigen-Kombinationsstelle auf einem erfindungsgemäßem Antikörper ersetzt werden, um einen chimären bivalenten Antikörper zu bilden.
Die Antikörper können einwertige Antikörper sein. Verfahren zur Herstellung einwertiger Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Ein Verfahren umfasst beispielsweise die rekombinante Expression von leichten und modifizierten schweren Immunglobulinketten. Die schwere Kette ist allgemein an einem beliebigen Punkt der Fc-Region verkürzt, sodass Schwerketten-Vernetzung verhindert wird. Alternativ dazu werden die relevanten Cysteinreste durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt oder deletiert, damit es zu keinen Vernetzungen kommt.
In-vitro-Verfahren eignen sich ebenfalls zur Herstellung einwertiger Antikörper. Verdau der Antikörper zur Herstellung von Fragmenten davon, insbesondere von Fab-Fragmenten, kann unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Routineverfahren erzielt werden. Der Verdau kann beispielsweise unter Verwendung von Papain durchgeführt werden. Beispiele für Papainverdaue werden in der WO 94/29348, veröffentlicht am 22. Dezember 1994, und im US-Patent 4.342.566 beschrieben. Die Papainverdau von Antikörpern ergibt üblicherweise zwei idente Antigen-bindende Fragmente, die als Fab-Fragmente bezeichnet werden, wobei jedes jeweils eine einzige Antigen-bindende Stelle aufweist, sowie ein Fc-Restfragment. Pepsinbehandlung ergibt ein F(ab')₂-Fragment, das über zwei Antigen-Kombinationsstellen verfügt und weiterhin zur Vernetzung von Antigenen fähig ist.
Die beim Antikörperverdau erzeugten Fab-Fragmente enthalten auch die konstanten Domänen der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH₁) der schweren Kette. Die Fab'-Fragmente unterscheiden sich von den Fab-Fragmenten durch Hinzufügung einiger Reste am Carboxy-Terminus der CH₁-Domäne der schweren Kette, einschließlich eines oder mehrerer Cysteine aus der Antikörper-Gelenksregion. Fab'-SH ist hierin die Kennzeichnung für Fab', worin die Cysteinreste der konstanten Domänen eine freie Thiolgruppe aufweisen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten hergestellt, die dazwischen Gelenks-Cysteine aufweisen. Es sind auch andere chemische Verbindungen von Antikörperfragmenten bekannt.
3. Humanisierte Antikörper
Die erfindungsgemäßen vSmo-Antikörper können zudem humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Die humanisierten Formen nicht-menschlicher Antikörper (z.B. Mäuseantikörper) sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulin-Ketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine minimale von nicht-menschlichem Immunglobulin stammende Sequenz enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), worin die Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. einer Maus, Ratte oder eines Hasen, die die gewünschte Spezifizität, Affinität und Kapazität aufweisen, ersetzt sind. In einigen Fällen werden die Fv-Gerüstreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Empfänger-Antikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen vorliegen. Allgemein umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die Gesamtheit zumindest einer und üblicherweise zweier variabler Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensus-Sequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), üblicherweise jene eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992)].
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Allgemein weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere darin eingeführte Aminosäurereste aus einer nicht-menschlichen Quelle auf. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als "Import"-Reste bezeichnet, die üblicherweise aus einer variablen "Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren nach Winter und Mitarbeitern durchgeführt werden [Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)], indem CDRs oder CDR-Sequenzen von Nagetieren durch entsprechende Sequenzen eines menschlichen Antikörpers ersetzt werden. Folglich sind solche "humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Patent 4.816.567), in denen deutlich weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch entsprechende Sequenzen aus einer nicht-menschlichen Spezies ersetzt worden ist. In der Praxis sind die humanisierten Antikörper üblicherweise menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt sind.
Die Wahl der menschlichen variablen Domänen, sowohl leicht als auch schwer, zur Verwendung bei der Herstellung von humanisierten Antikörpern ist sehr wichtig, um die Antigenität zu senken. Gemäß der Methode der "optimalen Anpassung" wird die Sequenz einer variablen Domäne eines Nagetierantikörpers gegen eine gesamte Bibliothek bekannter menschlicher variabler Domänsequenzen gescreent. Die menschliche Sequenz, die jener eines Nagetiers am nähesten kommt, wird dann als menschliches Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper angenommen [Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chotia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)]. In einem weiteren Verfahren wird ein aus der Consensus-Sequenz aller menschlicher Antikörper einer bestimmten Untergruppe von leichten oder schweren Ketten stammendes spezielles Gerüst verwendet. Das gleiche Gerüst kann für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden [Carter et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)].
Es ist zudem wichtig, dass die Antikörper unter Beibehaltung von hoher Affinität für das Antigen und anderer zu bevorzugender biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Zur Erreichung dieses Ziels werden die humanisierten Antikörper gemäß einem bevorzugten Verfahren durch ein Analyseverfahren der Ausgangssequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Verwendung von dreidimensionalen Modellen der Stamm- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle sind allgemein erhältlich und Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung vertraut. Es gibt auch Computerprogramme, die dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Kandidaten-Immunglobulin-Sequenzen veranschaulichen und anzeigen. Eine Überprüfung dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle von Resten beim Funktionieren der Kandidaten-Immunglobulin-Sequenz, und zwar die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunogloblins zur Bindung an sein Antigen beeinflusst. Auf diese Weise können FR-Reste aus der Consensus- sowie der Importsequenz so gewählt und kombiniert werden, dass das gewünschte Antikörpermerkmal, wie z.B. erhöhte Affinität für das Zielantigen, erzielt wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und höchst maßgeblich an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt [siehe WO 94/04679, veröffentlicht am 3. März 1994].
Es können transgene Tiere (z.B. Mäuse) eingesetzt werden, die dazu fähig sind, nach der Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper ohne Produktion von endogenem Immunglobulin herzustellen. Es ist beispielsweise beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregions-Gens (J_H-Gen) bei chimären und Keimlinien-mutierten Mäusen zu vollständiger Hemmung der endogenen Antikörper-Produktion führt. Der Transfer einer menschlichen Keimlinien-Immunglobulin-Genanordnung in solche Keimlinienmutierte Mäusen führt nach einer Antigen-Provokation zur Produktion von menschlichen Antikörpern [siehe Jakobovits et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1991)]. Menschliche Antikörper können auch in Phagendisplay-Bibliotheken erzeugt werden [Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)]. Die Verfahren von Cote et al. und Boerner et al. sind ebenfalls zur Erzeugung von menschlichen monoklonalen Antikörpern einsetzbar (Cote et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", S. 77, Alan R. Liss. (1985) und Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95 (1991)].
4. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifität für zumindest zwei unterschiedliche Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für das vSmo und die andere für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für ein/e/n Zelloberflächen-Protein oder -Rezeptor oder -Rezeptor-Untereinheit.
Verfahren zur Herstellung von bispezifischen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Üblicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Co-Expression zweier Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paare, worin die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein und Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)]. Aufgrund der zufälligen Verteilung der Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch aus 10 unterschiedlichen Antikörper-Mole külen, wovon nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls wird üblicherweise durch Affinitätschromatographieschritte erzielt. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Gemäß einer anderen und bevorzugteren Herangehensweise werden die variablen Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) an Immunglobulin-Konstantdomänen-Sequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerketten-Domäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH₂- und CH₃-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH₁), die die zum Binden der leichten Kette erforderliche Stelle aufweist, in zumindest einer der Fusionen enthalten ist. Für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen – und auf Wunsch auch für die Immunglobulin-Leichtketten – kodierende DNA wird in getrennte Expressionsvektoren eingeführt und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies führt zu hoher Flexibilität bei der Einstellung der jeweiligen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, wenn ungleiche Verhältnisse der drei bei der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten die optimalen Ergebnisse erzielen. Es ist jedoch möglich, die Kodiersequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor einzuführen, wenn die Expression zumindest zweier Polypeptidketten in gleichen Anteilen zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Anteile keine besondere Rolle spielen. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Herangehensweise bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten/Leichtketten-Paar (die eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) im anderen Arm. Es wurde herausgefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinketten-Kombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur der Hälfte des bispezifischen Moleküls für einfache Trennung sorgt. Diese Herangehensweise wird in der WO 94/04690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart. Für weitere Details bezüglich der Bildung bispezifischen Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
5. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper bestehen aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern. Solche Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten [US-Patent 4.676.980] und zur Behandlung von HIV-Infektionen [WO 91/00360; WO 92/200373, EP-A-03089]. Es wird in Erwägung gezogen, dass die Antikörper unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich solcher, die Vernetzer umfassen, in vitro hergestellt werden können. Die Immunotoxine können beispielsweise unter Anwendung von Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung hergestellt werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat und jene, die beispielsweise im US-Patent 4.676.980 offenbart sind.
6. Verwendung von vSmo-Antikörpern
vSmo-Antikörper können in diagnostischen Tests auf vSmo eingesetzt werden, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen oder Geweben. Verschiedene auf dem Gebiet der Erfindung bekannte diagnostische Testverfahren können eingesetzt werden, wie z.B. kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwich-Tests und Immunfällungstests, die entweder in heterogener oder homogener Phase durchgeführt werden [Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", S. 147-158, CRC Press Inc.]. Die in den diagnostischen Tests verwendeten Antikörper können mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden. Die detektierbare Gruppierung sollte fähig sein, ein detektierbares Signal, entweder direkt oder indirekt, zu erzeugen. Die detektierbare Gruppierung kann beispielsweise ein Radioisotop sein, wie z.B. ³H ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemolumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase. Zum Konjugieren des Antikörpers an eine detektierbare Gruppierung kann jedes auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren angewandt werden, einschließlich die in folgender Literatur beschriebenen Verfahren: Hunter et al., Nature 144, 945 (1926); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982).
vSmo-Antikörper eignen sich auch zur Affinitätsdetektion oder -reinigung von vSmo aus rekombinanter Zellkultur oder aus natürlichen Quellen. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen vSmo auf einem geeigneten Träger, wie z.B. einem Sephadexharz oder einem Filterpapier, unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird anschließend mit einer Probe kontaktiert, die das vSmo enthält, und danach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material der Probe mit der Ausnahme von vSmo, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem weiteren geeigneten Lösungsmittel gewaschen, welches das vSmo vom Antikörper freisetzt.
Die vSmo-Antikörper können auch als Therapeutikum verwendet werden. vSmo-Antikörper können beispielsweise dazu verwendet werden, übermäßige vSmo-Signalisierungen, die von mutiertem oder inaktiviertem Patched herrühren können, zu blockieren oder zu neutralisieren. Folglich können vSmo-Antikörper bei der Behandlung oder der Linderung von Symptomen eingesetzt werden, die durch ein pathologisches Leiden verursacht werden, das auf übermäßiges) vSmo oder vSmo-Signalisierung zurückzuführen ist oder damit in Zusammenhang gebracht wird. Gegebenenfalls können agonistische vSmo-Antikörper verwendet werden, um Geweberegenerierung zu induzieren oder diese zu verbessern bzw. zu stimulieren, wie z.B. die Regenerierung von Hautgewebe, Lungengewebe, Muskelgewebe (wie z.B. Herz- oder Skelettmuskel), Nervengewebe (wie z.B. serotonergische Neuronen, Motoneuronen oder straitalen Neuronen), Knochengewebe oder Darmgewebe. Diese vSmo-Antikörper-Therapie eignet sich für Fälle, worin das Gewebe durch Krankheit, Alterung oder Trauma beschädigt worden ist.
Die vSmo-Antikörper können einem Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht oder in einem solchen verwendet werden. Geeignete Träger und deren Formulierungen sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Oslo et al. (Hrsg.), 16. Auflage, Mack Publishing Co. (1980), beschrieben. Bei einer Verabreichung von vSmo-Antikörpern an einen Patienten können die Antikörper mittels Injektion (z.B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) oder anderer Verfahren, wie z.B. Infusion, verabreicht werden, damit sichergestellt wird, dass diese dem Blutstrom auf wirksame Weise zugeführt werden. Wirksame Dosierungen und Schemata zur Verabreichung der vSmo-Antikörper können empirisch bestimmt werden, wobei die Festlegung solcher Bestimmungen Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar ist. Fachleuten ist auch klar, dass die Dosierung der zu verabreichenden vSmo-Antikörper von beispielsweise folgenden Faktoren abhängt: dem Patienten, der die Antikörper erhält, dem Verabreichungsweg und anderen therapeutischen Hilfsmitteln, die dem Säugetier verabreicht werden. Eine Anleitung zur Auswahl der geeigneten Dosierungen für solche vSmo-Antikörper findet sich in der Literatur im Bereich der therapeutischen Verwendung von Antikörpern beispielsweise in "Handbook of Monoclonal Antibodies", Ferrone et al. (Hrsg.), S. 303-357, Kapitel 22, Noges Publications, Park Ridge, N.J. (1985); Smith et al., "Antibodies in Human Diagnosis and Therapy", Haber et al. (Hrsg.), S. 365-389, Raven Press, New York (1977). Eine übliche Tagesdosis der alleine verwendeten vSmo-Antikörper kann, je nach den oben erläuterten Faktoren, in einem Bereich von etwa 1 μg/kg bis zu 100 mg/kg Körpergewicht oder mehr pro Tag liegen.
C) vSmo oder vSmo-Antikörper enthaltende Sets
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden fertige Artikel und Sets bereitgestellt, die vSmo oder vSmo-Antikörper enthalten. Der Fertigartikel umfasst üblicherweise einen Behälter mit einem Etikett. Geeignete Behälter umfassen beispielsweise Flaschen, Ampullen und Teströhrchen. Die Behälter können aus einer Vielzahl von Materialien, wie z.B. Glas oder Plastik, bestehen. Der Behälter enthält das vSmo oder vSmo-Antikörper. Das Etikett auf dem Behälter kann beispielsweise Anleitun gen zur entweder In-vivo- oder In-vitro-Verwendung, z.B. wie oben beschrieben, aufweisen.
Das erfindungsgemäße Set umfasst üblicherweise den oben beschriebenen Behälter und einen oder mehrere andere Behälter, die Materialien umfassen, welche aus kommerzieller Sicht und jener des Verbrauchers wünschenswert sind, einschließlich Puffer, Verdünner, Filter und Verpackungseinsätze inklusive Gebrauchsanleitungen.
D) Zusätzliche Materialzusammensetzungen
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Proteinkomplexe bereitgestellt, die Wirbeltier-Smoothened-Protein und Wirbeltier-Patched-Protein umfassen. Wie in den Beispielen veranschaulicht, können Wirbeltier-Smoothened und Wirbeltier-Patched einen Komplex bilden. Der Proteinkomplex, der Wirbeltier-Smoothened und Wirbeltier-Patched umfasst, kann auch Wirbeltier-Hedgehog-Protein enthalten. Üblicherweise bindet sich in einem solchen Komplex Wirbeltier-Hedgehog an Wirbeltier-Patched, jedoch nicht an Wirbeltier-Smoothened. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Komplex, der Wirbeltier-Smoothened und Wirbeltier-Patched umfasst, ein Rezeptor für Wirbeltier-Hedgehog.
Ein Wirbeltier-Patched bindet sich an Wirbeltier-Smoothened. Gegebenenfalls umfasst das Wirbeltier-Patched eine Sequenz, die ein Derivat oder ein Fragment von Wirbeltier-Patched mit nativer Sequenz darstellt. Das Wirbeltier-Patched besteht üblicherweise aus einer Sequenz, die weniger als 100 % Sequenzidentität mit Wirbeltier-Patched mit nativer Sequenz aufweist. In einer Ausführungsform bindet sich Wirbeltier-Patched direkt und spezifisch an Wirbeltier-Smoothened. Alternativ dazu wird in Betracht gezogen, dass sich Wirbeltier-Patched indirekt an Wirbeltier-Smoothened bindet.
Die nachstehenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen keineswegs den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
Alle in der vorliegenden Beschreibung zitierten Verweise sind hierin vollständig durch Verweis aufgenommen.
BEISPIELE
Alle in den Beispielen verwendeten handelsüblichen Reagenzien wurden, sofern nicht anders angegeben, gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Quelle der in den folgenden Beispielen anhand von ATCC-Zugriffsnummern identifizierten Zellen, wie auch in der gesamten Beschreibung, ist die American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.
BEISPIEL 1
Isolierung und Klonierung von Ratten-Smoothened-cDNA
Ratten-Smoothened-cDNA voller Länge wurde mittels niederstringenten Hybridisierungs-Screenings aus 1,2 × 10⁶ Plaques einer Ratten-cDNA-Bibliothek von 9 bis 10 Tage alten Embryos (die auf >1.500 Basenpaare größenselektierte cDNA enthielt) unter Verwendung der vollständigen Kodierregion von Drosophila-Smoothened [Alcedo et al., siehe oben] (markiert mit ³²P-dCTP) als Sonde isoliert. Die Bibliothek wurde durch Klonierung von cDNA-Inserts in die NotI-Stelle eines λ-RK18-Vektors [Klein et al., Proc. NatI. Acad. Sci. 93, 7108-7113 (1996)], gefolgt von XmnI-Adapter-Ligation erzeugt. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie folgt: 5 × SSC, 30 Formamid, 5 × Denhardt's, 50 mM Natriumphosphat (pH 6,5), 5 % Dextransulfat, 0,1 SDS und 50 μg/ml Lachssperma-DNA, über Nacht bei 42 °C. Nitrocellulosefilter wurden auf eine Stringenz von 1 × SSC bei 42 °C gewaschen und über Nacht damit Kodak X-AR-Film belichtet. Drei von acht positiven Plaques wurden zur weiteren Reinigung ausgewählt. Nach der Amplifikation der Plaque-gereinigten Phagen wurden Phagemid-Exzisionsprodukte gebildet, indem M-13-Helferphagen (M13K07; erhältlich von New England Biolabs), Bakterien (BB4; erhältlich von Stratagene) und der gereinigte Phage zusammen in einem 100:10:1-Verhältnis vermehrt wurden. Plas mid-DNA wurde durch Qiagen-Reinigung aus Ampicillin-resistenten Kolonien gewonnen, gefolgt von einer Infektion von BB4 mit dem exzidierten gereinigten Phagemid.
Das Sequenzieren der drei cDNAs ergab, dass diese ident waren, mit der Ausnahme, dass zwei nur einen Teil der Kodiersequenz aufwiesen, während die dritte das vollständige Leseraster von Ratten-Smoothened, einschließlich 449 bzw. 1022 Nucleotide an untranslatierter 5'- bzw. der 3'-Sequenz und einen Poly-A-Schwanz aufwies. Dieser cDNA-Klon wurde auf beiden Strängen vollständig sequenziert.
Die vollständige Nucleotidsequenz von Ratten-Smoothened (rSmo) wird in 1 gezeigt (Seq.-ID Nr. 1) (es wird auch auf die ATCC-Hinterlegung des Ratten-Smoothened in pRK5.rsmo.AR140, dem die ATCC-Hinterlegungsnr. 98165 zugewiesen wurde, verwiesen). Die cDNA enthielt ein offenes Leseraster mit einer Translationsinitiationsstelle, die dem ATG-Codon an den Nucleotidpositionen 450 bis 452 zugeordnet war. Das offene Leseraster endet am Terminationscodon an den Nucleotidpositionen 2829 bis 2831.
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von Ratten-Smoothened (rSmo) weist, wie in 1 gezeigt (Seq.-ID Nr. 2), 793 Aminosäuren (einschließlich eines Signalpeptids aus 32 Aminosäuren) auf. rSmo scheint ein herkömmlicher G-Protein-gebundener Rezeptor mit sieben Transmembranen (7 TM) zu sein, der 4 potenzielle N-Glykosylierungsstellen und eine 203 Aminosäuren lange, vermeintliche, extrazelluläre aminoterminale Domäne aufweist, die 13 stereotypisch beabstandete Cysteine enthält (siehe 2).
Ein Abgleich der rSmo-Sequenz mit den Sequenzen für dSmo, Wingless-Rezeptor und Wirbeltier-Frizzled ergab, dass rSmo zu 33 % mit der von Alcedo et al., siehe oben, berichteten Sequenz homolog ist (50%ige Homologie in den Transmembrandomänen), zu 23 % mit der von Bhanot et al., siehe oben, berichteten Wingless-Rezeptorsequenz homolog ist und zu 25 % mit der von Chan et al., siehe oben, berichteten Wirbeltier-Frizzled-Sequenz homolog ist.
BEISPIEL 2
In-situ-Hybridisierung und Northern-Blot-Analyse
Die In-situ-Hybridisierung und Northern-Blot-Analysen wurden durchgeführt, um die Gewebeverteilung von Smo, Patched und SHH in embryonalen und erwachsenen Rattengeweben zu untersuchen.
Zur In-situ-Hybridisierung wurden E9-E15,5-Rattenembryos (Hollister Labs) über Nacht bei 4 °C in 4%igem Paraformaldehyd immersionsfixiert und anschließend über Nacht in 20%iger Saccharose frostgeschützt. Die Gehirne und das Rückenmark erwachsener Ratten wurden frisch tiefgekühlt. Bei allen Geweben erfolgten 16-μm-Gewebeschnitte, und diese wurden wie von Treanor et al., Nature 382, 80-83 (1996), beschrieben unter Verwendung von ³³P-UTP-markierten RNA-Sonden zur In-situ-Hybridisierung verarbeitet. Die Sense- und Antisense-Sonden wurden von der N-terminalen Region von rSmo unter Verwendung von T7-Polymerase abgeleitet. Die zur Detektion von SHH verwendete Sonde war antisense zu den Basen 604-1314 von Mäuse-SHH [Echard et al., Cell 75, 1417-1430 (1993)]. Die zur Detektion von Patched verwendete Sonde war antisense zu den Basen 502-1236 von Mäuse-Patched [Goodrich et al., siehe oben]. Die Analyse der reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion wurde wie von Treanor et al., siehe oben, beschrieben durchgeführt.
Zur Northern-Blot-Analyse wurde ein Ratten-Mehrfachgewebe-Northern-Blot (Clontech) bei hoher Stringenz gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung einer ³³P-dCTP-markierten Sonde, die die vollständige rSmo-Kodierregion umfasste, hybridisiert und gewaschen.
Die Ergebnisse sind in 3 veranschaulicht. Mittels In-situ-Hybridisierung und Northern-Blot-Analyse wurde Expression von rSmo-mRNA von E9 an in SHH-responsiven Geweben, wie z.B. in Neuralwulsten und frühen Neuralrohren [Echelard et al., siehe oben, Krauss et al., siehe oben, Roelink et al., siehe oben], präsomitischem Mesoderm und Somiten [Johnson et al., siehe oben, Fa et al., siehe oben], sich ent wickelnden Extremitätsknospen [Riddle et al., siehe oben], im Darm [Roberts et al., siehe oben] und in den Augen [Krauss et al., siehe oben] detektiert. Ratten-Smo-Transkripte wurden auch in Gewebe gefunden, dessen Entwicklung durch andere Vertreter der Wirbeltier-HH-Proteinfamilie gesteuert wird, wie z.B. Hoden (Desert-HH) [Bitgood et al., Curr. Biol. 6, 298-304 (1996)], Knorpel (Indian-HH) [Vortkamp et al., Science 273, 613-622 (1996)] und Muskel (Zebrafisch, Echinida-HH) [Currie und Ingham, Nature 382, 452-455 (1996)] (siehe z.B. 3, andere Daten nicht dargestellt). In allen der oben angeführten Geweben schien rSmo mit rPatched coexprimiert zu werden.
rSmo- und rPatched-mRNA wurde auch in und um SHH-exprimierenden Zellen Inder embryonalen Lunge, der Epiglottis, dem Thymus, der Wirbelsäule, der Zunge, des Kiefers, der Geschmacksknospen und der Zähne gefunden (3). Im embryonalen Nervensystem werden rSmo und rPatched anfänglich von der Neuralplatte exprimiert: bis E12 nahm ihre Expression jedoch in den Seitenteilen des Neuralrohrs ab, und bis P1 war ihre Expression auf Zellen beschränkt, die sich in relativer Nähe zur ventrikulären Zone befanden (3). Bei Gewebe von erwachsenen Ratten wurde die rSmo-Expression im Gehirn, in der Lunge, der Niere, den Hoden, dem Herz und der Milz beibehalten (Daten nicht dargestellt).
BEISPIEL 3
Isolierung und Klonierung von menschlicher Smoothened-cDNA
Eine cDNA-Sonde, die der Kodierregion des Ratten-Smoothened-Gens (oben in Beispiel 1 beschrieben) entsprach, wurde mittels des Zufalls-Hexanucleotid-Verfahrens markiert und dazu verwendet, 10⁶ Klone einer menschlichen embryonalen Lungen-cDNA-Bibliothek (Clontech, Inc.) in Igt10 zu screenen. Filter wurden jeweils zweifach bei 42 °C in 50 % Formamid, 5 × SSC, 10 × Denhardt's, 0,05 M Natriumphosphat (pH 6,5), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 50 mg/ml beschallter Lachssperma-DNA hybridisiert. Die Filter wurden in 2 × SSC gespült und sodann einmal in 0,5 × SSC und 0,1 % SDS bei 42 °C gewaschen. Hybridisierende Phagen wurden Plaque-gereinigt und die cDNA-Inserts in pUC 118 (New England Biolabs) subkloniert. Zwei Klone, 5 und 14, wiesen überlappende Inserts mit etwa 2 bzw. 2,8 kb auf und deckten die gesamte menschliche Smoothened-Kodiersequenz ab (siehe 4). Die Klone 5 und 14 wurden von den Anmeldern bei ATCC als puc.118.hsmo.5 bzw. puc.118.hsmo.14 hinterlegt, und diesen wurden die ATTC-Hinterlegungsnr. 98162 bzw. 98163 zugewiesen. Beide Stränge wurden mittels Standard-Fluoreszenzverfahren auf dem Sequenzierungsautomaten AB1377 sequenziert.
Die vollständige Nucleotidsequenz von menschlichem Smoothened wird in 4 gezeigt (Seq.-ID Nr. 3). Die cDNA enthielt ein offenes Leseraster mit einer Translationsinitiationsstelle, die dem ATG-Codon an den Nucleotidpositionen 13 bis 15 zugeordnet war. Das offene Leseraster endet am Terminationscodon an den Nucleotidpositionen 2374 bis 2376.
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von menschlichem Smoothened (hSmo) weist, wie in 4 geziegt (Seq.-ID Nr. 4), 787 Aminosäuren (einschließlich eines Signalpeptids mit 29 Aminosäuren) auf. hSmo scheint ein herkömmlicher G-Proteingebundener Rezeptor mit sieben Transmembranen (7 TM) zu sein, der 5 potenzielle N-Glykosylierungsstellen und eine 202 Aminosäuren lange, vermeintliche, extrazelluläre aminoterminale Domäne aufweist, die über 13 stereotypisch beabstandete Cysteine verfügt.
Ein Abgleich der vorhergesagten hSmo-Aminosäuresequenz mit der rSmo-Sequenz (siehe Beispiel 1) ergab 94%ige Aminosäureidentität. Ein Abgleich der hSmo-Sequenz mit den Sequenzen für dSmo, Wingless-Rezeptor und Wirbeltier-Frizzled ergab, dass hSmo zu 33 % mit der von Alcedo et al., siehe oben, berichteten Sequenz homolog ist (50%ige Homologie in den Transmembrandomänen), zu 23 % mit der von Bhanot et al., siehe oben, berichteten Wingless-Rezeptorsequenz homolog ist und zu 25 % mit der von Chan et al., siehe oben, berichteten Wirbeltier-Frizzled-Sequenz homolog ist. Siehe 5 für einen Vergleich der primären Sequenzen von menschlichem Smo, Ratten-Smo und Drosophila-Smo.
BEISPIEL 4
Kompetitive Bindungs-, Co-Immunfällungs- und Vernetzungstests
Es wurden kompetitive Bindungs-, Co-Immunfällungs- und Vernetzungstests durchgeführt, um die physikalische Assoziation oder Bindung zwischen SHH und rSmo sowie zwischen bestimmten biologisch aktiven Formen von SHH und Zellen, die rSmo, mPatched bzw. rSmo und mPatched zusammen exprimieren, zu charakterisieren.
1. Materialien und Verfahren
Komplementäre DNA für rSmo (in Beispiel 1 beschrieben), für dSmo (von Alcedo et al., siehe oben, beschrieben), für Desert-HH (von Echelard et al., siehe oben, beschrieben) und für Mäuse-Patched (von Goodrich et al., siehe oben, beschrieben) wurde in pRK5-Vektoren kloniert, und Epitopmarkierungen [Flag-Epitopmarkierung (Kodak/IBI) und Myc-Epitopmarkierung (9E10-Epitop: InVitrogen)] wurden am äußersten C-Terminus mittels Mutagenese auf PCR-Basis hinzugefügt.
SHH-N stellt den biologisch aktiven Aminoterminusabschnitt von SHH dar [Lee et al., Science 266, 1528-1537 (1994)]. SHH-N wurde wie von Hynes et al., siehe oben, beschrieben hergestellt. Es wurde eine radiomarkierte Form von SHH-N, d.h. ¹²⁵ISHH-N, eingesetzt.
Zur Produktion von IgG-SHH-N wurden menschliche Embryonieren-293-Zellen vorübergehend mit dem für SHH-N kodierenden Expressionsvektor, der im Raster nach Aminosäurerest 198 an den Fc-Abschnitt des menschlichen IgG-γ-1 fusioniert war, transfiziert.
Die Zellen wurden 48 Stunden lang in serumfreien Medien (OptiMEM; Gibco BRL) gehalten. Die Medien wurden anschließend filtriert und unter Verwendung einer Centricon-10-Membran auf das 10fache aufkonzentriert. Die konditionierten Medien wurden in 2facher Konzentration eingesetzt.
Es wurden Bindungstests durchgeführt, um auf Bindung zwischen Zellen, die rSmo oder dSmo und (1) Epitop-markiertes SHH-N, (2) eine IgG-SHH-N-Chimäre und (3) ein Epitop-markiertes Desert-HH exprimierten, zu testen.
Zur Visualisierung der SHH-Bindung wurden COS-7-Zellen (Genentech. Inc.), die rSmo oder mPatched (Mäuse-Patched) vorübergehend exprimierten, Epitop-markiertem SHH-N (2 Stunden bei 4 °C) ausgesetzt, 4-mal mit PBS gewaschen und anschließend fixiert und mit einem cy3-konjugierten Anti-Human-IgG (Jackson Immuno-Research) (für IgG-SHH-N) oder einem Anti-Flag-M2-Antikörper (Kodak/IBI) (für Flag-markiertes SHH-N) gefärbt.
Für immunohistochemische Zwecke wurden COS-7-Zellen, die vorübergehend mit Expressionskonstrukten transfiziert wurden, fixiert (10 Minuten in 2 % Paraformaldehyd/0,2 % Triton-X 100) und unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Flag-M2-Antikörpers (IBI) oder eines Anti-Myc-Antikörpers (InVitrogen), gefolgt von cy3-konjugiertem Anti-Mäuse-IgG (Jackson Immunoresearch) gefärbt.
Zur Vernetzung wurden Zellen in einer Dichte von 1-2 × 10⁶/ml in eiskaltem L15-Medium, das 0,1 % BSA und 50 pM ¹²⁵1-markiertes SHH (mit oder ohne 1.000fachen Überschuss an unmarkiertem SHH) enthielt, resuspendiert und 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Den Proben wurden 10 mM 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl und 5 mM N-Hydroxysulfosuccinimid (Pierce Chemical) zugesetzt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden anschließend 3-mal mit 1 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in einem Lysepuffer [1 %-Brij-96 (Sigma), 50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 10 μM Aprotinin, 10 um Leupeptin] lysiert und die Proteinkomplexe mit den angegebenen Antikörpern gegen die Epitopmarkierungen immungefällt. Die immungefällten Proteine wurden in Probenpuffer (80 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10 % [Vol./Vol.] Glycerin, 1 % [Gew./Vol.] SDS und 0,025 % Bromphenolblau) resuspendiert, denaturiert und über 4%-SDS-Polyacrylamidgele laufen gelassen, die getrocknet wurden und damit Film belichtet wurde.
Für eine Gleichgewichtsbindungsanalyse wurden die Zellen wie oben verarbeitet und mit 50 pM ¹²⁵1-SHH und verschiedenen Konzentrationen von kaltem SHH-N (Cold Ligand) inkubiert. Das IGOR-Programm wurde eingesetzt, um die K_d zu bestimmen.
2. Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt. Es kam zu keiner Bindung von Epitop-markiertem SHH-N, von IgG-SHH-N-Chimärenprotein oder Epitop-markiertem Desert-HH an Zellen, die rSmo oder dSmo exprimierten (6a-b und nicht dargestellte Daten). Diese Daten (und die nachstehend beschriebenen Daten) zeigten, dass rSmo, alleine wirkend, wahrscheinlich kein Rezeptor für SHH oder Desert-HH war. Es wurde jedoch die Hypothese aufgestellt, dass rSmo eine Komponente in einem SHH-Rezeptorkomplex mit mehreren Untereinheiten ist und dass die Ligandenbindungsfunktion dieses Rezeptorkomplexes von einem anderen Membranprotein, wie z.B. Patched, bereitgestellt wird.
Bindungstests wurden auch durchgeführt, um die Bindung zwischen Zellen zu testen, die rSmo oder Mäuse-Patched sowie (1) Epitop-markiertes SHH und (2) eine IgG-SHH-N-Chimäre exprimierten. Die Daten zeigen, dass sich Epitop-markiertes SHH-N sowie ein IgG-SHH-N-Chimärenprotein spezifisch und reversibel an Zellen binden, die Mäuse-Patched (m-Patched) exprimieren (mPatched ist zu 33 % mit dem Drosophila-Patched ident) (6c-e). Zudem konnte nur mPatched mit dem IgG-SHH-N-Protein immungefällt werden (6f), und Antikörper gegen Epitop-markiertes mPatched konnten ¹²⁵I-SHH-N (6) leicht co-immunfällen (Antikörper gegen Epitopmarkiertes rSmo konnten ¹²⁵I-SHH-N nicht immunfällen, und die IgG-SHH-N-Chimäre konnte rSmo nicht immunfällen).
Wie in 6g gezeigt ergab der Vernetzungstest von ¹²⁵I-SHH-N mit Zellen, die rSmo oder mPatched in Gegenwart oder Abwesenheit von kaltem SHH-N exprimierten, dass ¹²⁵I-SHH-N nur mit Zellen vernetzt, die mPatched exprimieren.
Der kompetitive Bindungstest von ¹²⁵I-SHH-N und Zellen, die mPatched oder mPatched plus rSmo exprimierten, zeigte, dass mPatched und SHH-N eine relativ hohe Wechselwirkungsaffinität (eine K_d von etwa 460 pM) aufwiesen (6i). Dies korreliert gut mit den Konzentrationen von SHH-N, die erforderlich sind, um biologische Antworten in Mehrfachsystemen auszulösen [Fan et al., siehe oben; Hynes et al., siehe oben; Roelink et al., siehe oben). Es wurde keine Bindung an Zellen beobachtet, die nur rSmo exprimierten (Daten nicht dargestellt), und es kam in Gegenwart von rSmo zu keiner Erhöhung der Bindungsaffinität für mPatched.
BEISPIEL 5
Co-Immunfällungstests
Zur Bestimmung, ob Patched und Smo einen physikalischen Komplex bilden oder darin Wechselwirken, wurden Co-Immunfällungsversuche durchgeführt.
1. Materialien und Verfahren
Zur Doppelimmunhistochemie wurden COS-7-Zellen, die vorübergehend mit Expressionskonstrukten transfiziert waren, unter Verwendung von Triton-X 100 durchlässig gemacht. Die Zellen wurden fixiert (10 Minuten in 2 % Paraformaldehyd/0,2 % Triton-X 100) und unter Verwendung von monoklonalem Anti-Flag-M2-Antikörper (IBI) und von polyklonalen Hasen-Anti-Myc-Primärantikörpern (Santa Cruz Biotech), gefolgt von cy3-konjugiertem Anti-Mäuse-IgG (Jackson Immunoresearch) und Bodipy-konjugierten Anti-Hasen-IgG-Sekundärantikörpern (Molecular Probes, Inc.) gefärbt.
Menschliche Embryonieren-293-Zellen wurden vorübergehend mit Expressionsvektoren für Epitop-markiertes rSmo (Flag-Eepitop) und mPatched (Myc-Epitop) transfiziert, und die resultierenden Proteinkomplexe wurden mit Antikörper gegen eines der Epitope immungefällt und anschließend auf einem Western-Blot analysiert.
Für den Co-Immunfällungstest wurden Lysate von Embryonieren-293-Zellen, die vorübergehend Flag-markiertes rSmo, Myc-markiertes mPatched oder eine Kombina tion der zwei Proteine exprimierten, in Gegenwart oder Abwesenheit einer IgG-SHH-N-Chimäre (1 μg/ml, 30 Minuten bei 37 °C) oder in Gegenwart von ¹²⁵I-SHH-N mit oder ohne Überschuss an kaltem SHH-N inkubiert (2 Stunden bei 4 °C). Die inkubierten Proben wurden anschließend 3-mal mit PBS gewaschen und in Lysepuffer (siehe Beispiel 4) wie von Davis et al., Science 259, 1736-1739 (1993), beschrieben lysiert. Die Zelllysate wurden bei 10.000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert, und die löslichen Proteinkomplexe wurden mit entweder Protein-A-Sepharose (für das IgG-SHH-N) oder Anti-Flag- oder Anti-Myc-Antikörpern, gefolgt von Protein-A-Sepharose (für Epitop-markiertes rSmo bzw. mPatched) immungefällt.
Die Proben wurden 5 Minuten lang in denaturierendem SDS-Probenpuffer (125 mM Tris, pH 6,8, 2 % SDS, 10 % Glycerin, 100 mM β-Mercaptoethanol, 0,05 % Bromphenolblau) auf 100 °C erhitzt und SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine wurden entweder durch Belichten eines Films mit dem getrockneten Gel (für ¹²⁵I-SHH-N) oder durch Blotten auf Nitrocellulose und Sondieren mit Antikörpern gegen Flag- oder Myc-Epitop unter Verwendung eines ECL-Detektionssystems (Amersham) detektiert.
2. Ergebnisse
Die Ergebnisse werden in 7 dargestellt. In Zellen, die nur mPatched oder rSmo alleine exprimierten, konnten keine Co-Immunfällungsproteine detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte rSmo in Zellen, die sowohl mPatched als auch rSmo exprimierten, ohne weiteres durch Antikörper gegen Epitop-markiertes mPatched co-immungefällt werden (7b), und mPatched wurde durch Antikörper gegen Epitopmarkiertes rSmo co-immungefällt (7c).
¹²⁵1-SHH-N wurde ohne weiteres durch Antikörper gegen Epitop-markiertes rSmo oder mPatched aus Zellen co-immungefällt, die sowohl rSmo als auch mPatched exprimierten, jedoch nicht aus Zellen, die nur rSmo exprimierten (7d und 7e). Diese Ergebnisse zeigen, dass SHH-N, rSmo und mPatched im gleichen physikalischen Komplex vorliegen und dass es in Abwesenheit von mPatched zu keiner Bildung eines rSmo-SHH-Komplexes kommt. Obwohl das vollständige Verständnis fehlt und ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird die Meinung vertreten, dass Patched eine Ligandenbindungskomponente und vSmo eine Signalkomponente in einem SHH-Rezeptor mit mehreren Untereinheiten darstellt (siehe 9). Es wird auch angenommen, dass Patched ein negativer Regulator von vSmo ist.
BEISPIEL 6
Hahn et al., siehe oben, Johnson et al., siehe oben, und Gailani et al., siehe oben, berichten, dass Patched-Mutationen mit BCNS und einzeln auftretenden Basalzellkarzinomen ("BCC") in Zusammenhang gebracht wurden. Diese Forscher berichten auch, dass die meisten Patched-Mutationen in BCNS Verkürzungen sind, bei denen kein funktionelles Protein produziert wird. Es wird angenommen, dass BCNS und BCC durch konstitutive Aktivierung von vSmo, gefolgt von dessen Freisetzung aus der negativen Regulierung durch Patched verursacht wird oder damit in Zusammenhang steht.
Die Expressionslevel von Mäuse-Patched vom Wildtyp (nativ) und einem mutierten Patched wurden untersucht. Eine Patched-Mutante wurde durch ortsspezifische Mutagenese der Wildtyp-Mäuse-Patched-cDNA (in Beispiel 4 beschrieben) erzeugt und mittels Sequenzierung verifiziert. Das mutierte Patched enthielt ein 3-Aminosäure-Insert (Pro-Asn-Ile) nach Aminosäurerest 815 (diese Mutante wurde in einer BCNS-Familie gefunden, siehe Hahn et al., siehe oben). Zur Analyse der Proteinexpression wurden gleiche Mengen an pRKS-Expressionsvektoren, die Patched vom Wildtyp oder mutiertes Patched enthielten, in 293-Zellen transfiziert und eine gleiche Anzahl an Zellen (2 × 10⁶) pro Probe lysiert. Die Proteine wurden aus den Zelllysaten durch Antikörper gegen Epitop-markiertes (myc-) Patched immungefällt und auf einem Western-Blot mit dem gleichen Antikörper detektiert.
Die Anmelder haben herausgefunden, dass die Expression des mutierten Patched (das ein vollständiges offenes Leseraster beibehält) im Vergleich zu dessen Wildtyp-Gegenstück zumindest 10fach reduziert war. Siehe 8.
Materialhinterlegung
Das nachstehende Material ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) hinterlegt worden:
Diese Hinterlegung wurde unter Berücksichtigung der Bestimmungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und dessen Regeln vorgenommen. Dies gewährleistet die Aufrechterhaltung einer lebenden Kultur der Hinterlegung über einen Zeitraum von 30 Jahren, beginnend mit dem Hinterlegungsdatum. Die Hinterlegung wird von ATCC gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags zugänglich gemacht und unterliegt einem Übereinkommen zwischen Genentech, Inc. und ATCC, was eine permanente und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommenschaft der hinterlegten Kultur für die Öffentlichkeit nach Erteilung des zugehörigen US-Patents oder durch Offenlegung einer beliebigen US-amerikanischen oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, je nachdem, was zuerst eintritt, und stellt die Verfügbarkeit der Nachkommenschaft für Personen sicher, die vom Präsidenten des US-Patentamts gemäß 35 USC §122 und den dafür geltenden Vorschriften des Präsidenten (einschließlich 37 CFR §1,14 unter speziellem Verweis auf 886 OG 638) dazu ermächtigt worden sind.
Der Zessionar der vorliegenden Anmeldung hat sich damit einverstanden erklärt, dass, wenn eine Materialienkultur, die unter geeigneten Bedingungen kultiviert worden ist, nach der Hinterlegung abstirbt, verloren geht oder zerstört wird, das Material umgehend nach der Benachrichtigung durch eine gleiche Kultur ersetzt wird. Die Verfügbarkeit des Hinterlegungsmaterials ist nicht als Lizenz auszulegen, die Erfindung unter Verletzung der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihren Patentrechten erteilten Rechte in die Praxis umzusetzen.
Es wird davon ausgegangen, dass die obige schriftliche Beschreibung ausreicht, damit Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung die Erfindung ausführen können. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung soll durch das hinterlegte Konstrukt nicht eingeschränkt werden, da sich die hinterlegte Ausführungsform nur als eine mögliche Veranschaulichung bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung versteht, und jegliche funktionell äquivalente Konstrukte liegen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Die Hinterlegung des hierin beschriebenen Materials lässt die Annahme nicht zu, dass die hierin enthaltene schriftliche Beschreibung ungeeignet sei, die Ausführung eines beliebigen Aspekts der Erfindung zu ermöglichen, einschließlich der besten Art der Durchführung, noch ist sie als Einschränkung des Schutzumfangs der Ansprüche auf die spezifischen Veranschaulichungen, die sie darstellt, zu deuten. Für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden sich aus der vorliegenden Beschreibung verschiedene Modifizierungen der vorliegenden Erfindung zusätzlich zu den hierin angeführten und beschriebenen ergeben, und auch diese liegen im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Smoothened-Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 80 % Sequenzidentität mit den Resten 1 bis 787 aus Seq.-ID Nr. 4 oder mit den Resten 1 bis 793 aus Seq.-ID Nr. 2.
Smoothened-Polypeptid nach Anspruch 1, worin die Sequenzidentität zumindest 90 % beträgt.
Smoothened-Polypeptid nach Anspruch 2, worin die Sequenzidentität zumindest 95 % beträgt.
Smoothened-Polypeptid nach Anspruch 3, umfassend die Reste 1 bis 787 aus Seq.-ID Nr. 4.
Smoothened-Polypeptid nach Anspruch 3, bestehend aus den Resten 1 bis 787 aus Seq.-ID Nr. 4.
Smoothened-Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend die Reste 1 bis 793 aus Seq.-ID Nr. 2.
Smoothened-Polypeptid nach Anspruch 6, bestehend aus den Resten 1 bis 793 aus Seq.-ID Nr. 2.
Chimäres Molekül, umfassend das Smoothened-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, fusioniert an eine heterologe Aminosäuresequenz.
Chimäres Molekül nach Anspruch 8, worin die heterologe Aminosäuresequenz eine Epitopmarkierungssequenz ist.
Antikörper, der sich spezifisch an das Smoothened-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bindet.
Antikörper nach Anspruch 10, der ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 10, der ein neutralisierender Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 10, der ein Agonistenantikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 10, der ein Antagonistenantikörper ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für das Smoothened-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder für das chimäre Molekül nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 oder für den Antikörper nach Anspruch 11 kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das für die Reste 1 bis 787 aus Seq.-ID Nr. 4 kodiert.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15, das für die Reste 1 bis 793 aus Seq.-ID Nr. 2 kodiert.
Vektor, umfassend die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 15 bis 17.
Vektor nach Anspruch 18, der operabel an Kontrollsequenzen gebunden ist, die durch eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, umfassend die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 15 bis 17 oder den Vektor nach Anspruch 18 oder Anspruch 19.
Wirtszelle nach Anspruch 20, die eine prokaryotische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 20, die eine Hefezelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 20, die eine eukaryotische Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 20, die eine CHO-Zelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Smoothened-Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 20 bis 24.
Verfahren nach Anspruch 25, weiters umfassend die Gewinnung des Smoothened-Polypeptids aus der Wirtszellkultur.
Herstellungsartikel, umfassend einen Behälter und einen Zusammensetzung, die in diesem Behälter enthalten ist, worin die Zusammensetzung ein Smoothened-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
Herstellungsartikel nach Anspruch 27, umfassend einen weiteren Behälter und eine Zusammensetzung, die in diesem Behälter enthalten ist, worin die Zusammensetzung einen Smoothened-Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 14 umfasst.
Herstellungsartikel nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, weiters umfassend die Anleitungen zur Verwendung des Smoothened-Polypeptids und/oder des Smoothened-Antikörpers in vivo oder ex vivo.
Nicht-menschliches, transgenes Tier, das Zellen enthält, die das Smoothened-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 exprimieren.
Nicht-menschliches, transgenes Tier, das Zellen mit einem geänderten Gen, das für das Smoothened-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert, enthält.
Transgenes Tier nach Anspruch 30 oder Anspruch 31, das eine Maus ist.
Transgenes Tier nach Anspruch 30 oder Anspruch 31, das eine Ratte ist.
Proteinkomplex, umfassend das Smoothened-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und ein Patched-Protein.
Proteinkomplex nach Anspruch 34, weiters umfassend ein Hedgehog-Protein.
Proteinkomplex nach Anspruch 34, worin sich das Hedgehog-Protein an das Patched-Protein bindet, sich jedoch nicht an das Smoothened-Polypeptid bindet.
Proteinkomplex nach Anspruch 34, der ein Rezeptor für ein Hedgehog-Protein ist.