DE69534962T2

DE69534962T2 - Htk-ligand

Info

Publication number: DE69534962T2
Application number: DE69534962T
Authority: DE
Inventors: D. Brian Pacifica BENNETT; William Woodside MATTHEWS
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-07-20
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2015-07-15
Also published as: WO1996002645A2; WO1996002645A3; US5864020A; IL114668A0; MX9700486A; ATE324441T1; IL114668A; ES2264127T5; AU3008995A; AU705107B2; ES2264127T3; EP0773997B2; CA2194955A1; DE69534962D1; US5624899A; JPH10501701A; EP0773997A2; DE69534962T3; EP0773997B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen Rezeptorproteintyrosinkinase- (rPTK-) Liganden. Im Spezielleren betrifft die Erfindung einen neuen Liganden, der an den Hepatomtransmembrankinase- (Htk-) Rezeptor (auch als HpTK-5-Rezeptor bekannt) bindet und diesen aktiviert, sowie die Isolierung und rekombinante Produktion desselben.
Beschreibung des Stands der Technik
Die Übertragung von Signalen, die Zellwachstum und Differenzierung regulieren, wird zum Teil durch Phosphorylierung verschiedener Zellproteine reguliert. Elemente der Proteintyrosinkinasefamilie können durch die Gegenwart mehrerer konservierter Aminosäureregionen in der katalytischen Domäne von Tyrosinkinasen erkannt werden (Hanks et al., Science 241, 42-52 (1988)). Die Tyrosinkinasedomäne ist an den Signalübertragungswegen der Mitogenese, Transformation und Zelldifferenzierung beteiligt. Gewisse Tyrosinkinasen stimulieren vorwiegend Zellwachstum und Differenzierung, wogegen andere Tyrosinkinasen Wachstum zum Stillstand bringen und Differenzierung fördern. Darüber hinaus kann dieselbe Tyrosinkinase in Abhängigkeit von der Zellumgebung, in der sie exprimiert wird, die Zellproliferation entweder stimulieren oder hemmen. Siehe Schlessinger et al., Neuron 9, 383-391 (1992).
Rezeptorproteintyrosinkinasen (rPTKs) übertragen extrazelluläre Signale auf intrazelluläre Signalwege, wodurch sie Zellproliferation und Differenzierung kontrollieren. Diese rPTKs haben eine ähnliche Architektur mit einem intrazellulären katalytischen Abschnitt, einer Transmembrandomäne und einer extrazellulären Ligandenbindungsdomäne. (Schlessinger et al., siehe oben.) Es ist gezeigt worden, dass die extrazellulären Domänen (ECDs), die für Ligandenbindung und Übertragung biologi scher Signale verantwortlich sind, aus einer Anzahl unterschiedlicher Strukturmotive zusammengesetzt sind. Die intrazelluläre Domäne umfasst eine katalytische Proteintyrosinkinase.
Rezeptortyrosinkinasen werden nach Sequenz- und Strukturähnlichkeiten in mehrere Klassen eingeteilt. Zum Beispiel weisen Rezeptoren der Klasse V Cystein-reiche und Fibronectin-Typ-III-Regionen in der extrazellulären Domäne auf und umfassen die EPH-, ELK-, ERK-, EEK-, ECK- und HEK-Rezeptoren. Für einen Überblick über diese verschiedenen Klassen von Rezeptortyrosinkinasen und ihre Funktionen siehe z.B. Hanks et al. (siehe oben) und Schlessinger et al. (siehe oben).
Proteinliganden für Rezeptorproteintyrosinkinasen binden an die extrazelluläre Domäne ihrer zugehörigen Rezeptoren an der Zelloberfläche und stimulieren dadurch die Tyrosin-Phosphorylierung. Mehrere dieser Liganden sind Wachstumsfaktoren oder Cytokine, wie z.B. Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), Epidermiswachstumsfaktor (EGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) und Nervenwachstumsfaktor (NGF). Von einer Reihe von Liganden für Tyrosinkinaserezeptoren ist gezeigt worden, dass sie in hämatopoetischen Systemen wirksam sind. Beispielweise stimuliert der Ligand für den murinen flt3/flk-2-Tyrosinkinaserezeptor (kürzlich kloniert) die Proliferation primitiver hämatopoetischer Mauszellen und menschlicher, CD34-positiver Knochenmarkszellen. Lyman et al., Cell 75, 1157-1167 (1993).
Ein Proteinligand, der die Phosphorylierung des ECK-Rezeptors stimuliert, ist neulich kloniert und in CHO-Zellen exprimiert worden. Bartley et al., Nature 368, 558-560 (1994). Dieser ECK-Ligand erwies sich als identisch mit B61, einem früher von Holzman et al., Mol. Cell. Biol. 10, 5830-5838 (1990), isolierten Molekül.
Eine Rezeptorproteinkinase ist kürzlich aus einer menschlichen hepatozellulären Krebszelllinie, Hep 3B, identifiziert und kloniert worden. Es wird angenommen, dass dieser „Htk"-Rezeptor oder „HpTK 5"-Rezeptor genannte Rezeptor der Klasse V oder EPH-Unterfamilie oder den rPTKs angehört. Siehe Bennett et al., J. Biol. Chem. 269(19), 14211-14218 (1994).
Die Northern-Blot-Analyse menschlicher Fötalgewebe offenbarte, dass die Expression von Htk-Rezeptor-Nucleinsäure in Herz, Lunge, Leber, Gehirn und Niere auftritt. Bei adultem menschlichem Gewebe war kein Signal im Herzen nachweisbar, während Plazenta ein besonders intensives Signal aufwies, gefolgt von Niere, Leber, Lunge und Pankreas. Skelettmuskel und Herz hatten eine niedrigere Signalintensität. Siehe Bennett et al. (siehe oben).
Die Htk-Rezeptor-Nucleinsäureexpression in menschlichen Tumorzelllinien ist ebenfalls durch Northern-Blot-Analyse analysiert worden. Von Leber, Brust (MCF-7), Darm (Colo 205), Lunge (NCI 69), Melanozyt (HM-1) und Zervix (HeLa) abstammende Zelllinien hatten nachweisbare Signale passender Stärke. Ein Signal war in ausgewählten Zelllinien hämatopoetischen Ursprungs vorhanden. K562 (eine primitive Knochenmarkzelle mit Multipotenzial), THP-1 (eine monozytoide Zelle), U937 (eine myelomonozytische Zelllinie), Hep3B (eine menschliche Leberkrebszelllinie) und CMK (megakaryozytischen Ursprungs) waren alle positiv für Htk-Rezeptorsignal, jedoch wiesen Lymphoid- (H9, Jurkat, JH-1, Raji, Ramos) oder ausgewählte andere Knochenmarkzellen (KG-1 oder KMT2) kein nachweisbares Transkript mittels Northern-Analyse auf. Siehe Bennett et al. (siehe oben).
Das „myk-1" genannte Maus-Homolog zum Htk-Rezeptor wurde aus Brustdrüsenepithel isoliert. Siehe Andres et al., Oncogene 9, 1461-1467 (1994). Andres et al. berichten, dass myk-1 während der Proliferation von Mammaepithel induziert und während seiner Differenzierung herabreguliert wird. Außerdem wird erachtet, dass die deregulierte Expression des Rezeptors möglicherweise ein frühes Ereignis bei der Brustdrüsenkarzinogenese darstellt (siehe Andres et al., siehe oben).
Jedoch wird angenommen, dass der Proteinligand für den Htk-Rezeptor vormals nicht offenbart worden ist. Daher ist es ein Ziel der Erfindung, einen Liganden für den Htk-Rezeptor bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Nucleinsäure bereitzustellen, die für den Htk-Liganden kodiert, sodass der Ligand durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden kann.
Diese und andere Ziele werden dem geübten Fachmann bei Berücksichtigung der Patentbeschreibung als Ganzes offensichtlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Ziele werden in einem der Aspekte erreicht, indem isolierter Htk-Ligand bereitgestellt wird, der als Antigen oder biologisch aktiv sein kann. In einer ihrer Ausführungsformen stellt die Erfindung eine lösliche Form des Liganden bereit, bei dem zumindest die Transmembranregion deletiert ist. Üblicherweise wird die zytoplasmatische Domäne ebenfalls fehlen.
Eines der Beispiele einer löslichen Form des Htk-Liganden ist ein Immunoadhäsin, das eine Fusion der extrazellulären Domäne des Htk-Liganden und einer Immunglobulinsequenz ist.
Die Erfindung betrifft auch andere Chimären, die den Htk-Liganden (oder einen Abschnitt davon) umfassen, der an ein weiteres Polypeptid fusioniert ist. Ein Beispiel einer derartigen Chimäre ist Epitop-Tag-Htk-Ligand.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die biologisch aktiven Htk-Ligand und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Vorzugsweise liegt der Htk-Ligand in der pharmazeutischen Zusammensetzung in einer löslichen Form vor.
Die Erfindung stellt außerdem isolierte Nucleinsäuresequenzen bereit, die für Htk-Ligand und Htk-Ligand-Chimären kodieren.
Die Nucleinsäure kann in einem replizierbaren Vektor bereitgestellt werden, der in einer der Ausführungsformen der Erfindung in eine Wirtszelle transformiert werden kann. Ein Verfahren der Verwendung der für den Htk-Liganden kodierenden Nucleinsäure, um die Produktion des neuen Proteins zu bewirken, wird ebenfalls bereitgestellt, wobei das Verfahren die Expression der Nucleinsäure in einer Kultur der transformierten Wirtszellen und das Gewinnen des Proteins aus der Wirtszellkultur umfasst.
Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, das das Kontaktieren des Htk-Rezeptors mit dem Htk-Liganden umfasst, um die Phosphorylierung der Kinasedomäne davon zu bewirken.
Die Erfindung stellt außerdem einen monoklonalen Antikörper bereit, der an den Htk-Liganden bindet, der verwendet werden kann, um die Gegenwart des Htk-Liganden in einer biologischen Probe nachzuweisen, von der beispielsweise vermutet wird, dass sie den Liganden enthält.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1A–1B stellen die Angleichung der Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 1) und abgeleiteten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) des hierin beschriebenen murinen Htk-Liganden dar.
2 stellt die Angleichung der Nucleotid- (Seq.-ID Nr. 3) und abgeleiteten Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 4) des hierin beschriebenen menschlichen Htk-Liganden dar.
3 zeigt eine Angleichung der Aminosäuresequenzen von murinem Htk-Liganden (muHtkL) und menschlichem Htk-Liganden (humHtkL) (Seq.-ID Nr. 2 bzw. 4). Identische Reste sind durch Linien eingerahmt. Der schattierte Bereich stellt eine Transmembrandomäne dar. Die extrazelluläre Domäne und intrazelluläre Domäne liegen N-terminal bzw. C-terminal zur Transmembrandomäne. Die als Spaltstelle für das Signalpeptid vorhergesagte Aminosäure ist durch einen Pfeil bezeichnet. Die möglichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen sind mit einem (*) markiert, und konservierte Cysteine sind mit einem
markiert.
4 stellt die Nucleinsäuresequenz (Seq.-ID Nr. 5) und abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 6) des in Bennett et al. (siehe oben) offenbarten menschlichen Htk-Rezeptors dar. Die als Spaltstelle für das Signalpeptid vorhergesagte Aminosäure ist durch einen Pfeil bezeichnet. Die unter Elementen der ELK-Unterfamilie konservierten Cysteinreste sind eingekreist, und die Transmembrandomäne ist mit einem Überstrich versehen.
5A–5B zeigen die Bindungskonkurrenzkurven von Htk-Fc gegen die SV40MES13-Zelllinine (5A) oder gegen den in COS-7-Zellen exprimierten rekombinanten murinen Htk-Liganden (5B). Die Scatchard-Darstellung jeder Bindungskurve ist in der Einfügung gezeigt und lässt Kd-Werte von 3 nM bzw. 0,5 nM erkennen.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
I. Definitionen
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet, die wie unten angegeben definiert sind.
„Htk-Ligand" ist hierin als jegliche Polypeptidsequenz definiert, die an ein rPTK bindet und es aktiviert, vorzugsweise an die extrazelluläre Domäne des Htk-Rezeptors bindet und dadurch die intrazelluläre Tyrosinkinasedomäne davon aktiviert. Die Aktivierung der rPTK kann durch Autophosphorylierung von Tyrosinresten in der intrazellulären Domäne der rPTK gemessen werden. Siehe Beispiel 4 hierin für eine beispielhafte Technik zur Messung der Rezeptor-Autophosphorylierung. Der Htk-Ligand kann außerdem eine weitere biologische Eigenschaft eines natürlich vorkommenden Polypeptids aufweisen, wobei das Polypeptid eine der in 3 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweist.
Unter „Biologische Eigenschaft" wird für die Zwecke hierein eine „In-vivo"-Effektor- oder Antigenfunktion oder -Aktivität verstanden, die direkt oder indirekt durch den Htk-Liganden ausgeführt wird, wie mittels der Sequenzen in 3 gezeigt ist (ob in seiner nativen oder denaturierten Konformation). Eine hauptsächliche Effektorfunktion ist die Fähigkeit des Htk-Liganden, an eine rPTK, wie z.B. den Htk-Rezeptor (auch als HpTK-5-Rezeptor bekannt), der in Bennett et al. (siehe oben) offenbart ist, zu binden und ihn zu aktivieren. Der Htk-Rezeptor ist eine rPTK der Klasse V oder EPH-Unterfamilie von rPTKs. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenz des Htk-Rezeptors sind in 4 dargestellt. Im Allgemeinen wird der Ligand an die extrazelluläre Domäne des Htk-Rezeptors binden und dadurch die intrazelluläre Tyrosinkinasedomäne davon aktivieren. Folglich kann die Bindung des Liganden an den Rezeptor in der Verstärkung oder Hemmung der Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Aktivierung von Zellen resultieren, die einen Rezeptor für den Htk-Liganden in vivo oder in vitro aufweisen. Die Bindung des Liganden an den Htk-Rezeptor kann unter Anwendung herkömmlicher Techniken ermittelt werden, einschließlich durch kompetitive Bindungsverfahren, wie z.B. RIAs, ELISAs und andere kompetitive Bindungstests. Ligand/Rezeptor-Komplexe können unter Anwendung von Trennverfahren wie Filtration, Zentrifugation, Durchflusszytometrie und dergleichen identifiziert werden (siehe z.B. Lyman et al., Cell 75, 1157-1167 (1993); Urdal et al., J. Biol. Chem. 263, 2870-2877 (1988); und Gearing et al., EMBO J. 8, 3667-3676 (1989)). Ergebnisse aus Bindungsuntersuchungen können unter Anwendung jeglicher herkömmlicher graphischer Darstellung der Bindungsdaten analysiert werden, beispielsweise Scatchard-Analyse (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51, 660-672 (1949); und Goodwin et al., Cell 73, 447-456 (1993)) und dergleichen. Da der Htk-Ligand die Phosphorylierung des Htk-Rezeptors induziert, können herkömmliche Tyrosinphosphorylierungstests, wie z.B. der im Beispiel 4 hierein beschriebene Test, ebenfalls als Indikator der Bildung eines Htk-Rezeptor/Ligand-Komplexes verwendet werden. Andere Effektorfunktionen umfassen beispielsweise Signalübertragung, jegliche Enzymaktivität oder Enzym-modulierende Aktivität (z.B. Tyrosinkinaseaktivität) oder jegliche strukturelle Rolle. Jedoch umfassen Effektorfunktionen nicht den Besitz einer Epitop- oder antigenen Stelle, die zur Kreuzreaktion mit gegen Htk-Ligand hergestellten Antikörpern fähig sind. Unter einer antigenen Funktion wird der Besitz ei ner Epitop- oder antigenen Stelle verstanden, die fähig ist, mit Antikörpern eine Kreuzreaktion einzugehen, die gegen die Polypeptidsequenz eines natürlich vorkommenden Polypeptids hergestellt worden sind, das eine der Polypeptidsequenzen aus 3 umfasst.
Ein „biologisch aktiver" Htk-Ligand ist hierin als ein Polypeptid definiert, das eine htk-Liganden-Effektorfunktion aufweist und das außerdem eine antigene Funktion besitzen kann, jedoch nicht muss. Eine hauptsächliche bekannte Effektorfunktion des Htk-Liganden ist seine Fähigkeit, die Proteinphosphorylierung des Htk-Rezeptors zu bewirken.
Ein „als Antigen aktiver" Htk-Ligand ist als ein Polypeptid definiert, das eine antigene Funktion des Htk-Liganden besitzt und das außerdem eine Effektorfunktion aufweisen kann, aber nicht muss.
In bevorzugten Ausführungsformen ist ein als Antigen aktiver Htk-Ligand ein Polypeptid, das mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁶ l/mol an einen Antikörper bindet, der zur Bindung des Htk-Liganden fähig ist. Für gewöhnlich bindet das Polypeptid mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10⁷ l/mol. Ein zur Bindung eines Htk-Liganden fähiger isolierter Antikörper ist ein Antikörper, der identifiziert und von einer Komponente der natürlichen Umgebung abgetrennt ist, in der er vorliegen kann. Insbesondere bevorzugt ist der als Antigen aktive Htk-Ligand ein Polypeptid, das an einen Antikörper bindet, der zur Bindung eines Htk-Liganden in seiner nativen Konformation fähig ist. Ein Htk-Ligand in seiner nativen Konformation ist ein Htk-Ligand, wie er sich in der Natur findet, der nicht durch chaotrope Mittel, Hitze oder andere Behandlung denaturiert ist, die die dreidimensionale Struktur des Htk-Liganden wesentlich modifiziert, wie beispielsweise durch Migration an nicht-reduzierenden, nicht-denaturierenden, nach Größe auftrennenden Gelen festgestellt werden kann. Für gewöhnlich wird ein biologisch oder als Antigen aktiver Htk-Ligand eine Aminosäuresequenz aufweisen, die zumindest 75% Aminosäuresequenzidentität mit einer der in 3 gezeigten reifen Htk-Ligand-Aminosäuresequenzen aufweist, bevorzugter zumindest 80%, bevorzugter zumindest ungefähr 85%, bevor zugter zumindest ungefähr 90% und insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 95%. Identität oder Homologie bezüglich dieser Sequenz ist hierein als prozentueller Anteil an Aminosäureresten in der Kandidatsequenz definiert, die mit den Htk-Ligand-Resten identisch sind, und zwar nach Angleichung der Sequenzen und Einführung von eventuell notwendigen Lücken, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erzielen, wobei jegliche konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt bleiben. Keine von N-terminalen, C-terminalen oder internen Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die Htk-Liganden-Sequenz ist als die Sequenzidentität oder Homologie beeinflussend auszulegen.
Die biologisch aktiven und als Antigen aktiven Htk-Liganden-Polypeptide, die Gegenstand dieser Erfindung sind, umfassen daher das durch die gesamte translatierte Nucleotidsequenz des Htk-Liganden (einschließlich seiner Signalsequenz) verkörperte Polypeptid; den reifen Htk-Liganden mit davon abgespaltener Signalsequenz; Fragmente, die im Wesentlichen aus der intrazellulären Domäne oder Transmembrandomäne des Htk-Liganden bestehen; Fragmente des Htk-Liganden, die eine zusammenhängende Sequenz von zumindest 5, 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten aus dem Htk-Liganden aufweisen; Aminosäuresequenzvarianten des Htk-Liganden, worin ein Aminosäurerest N-terminal oder C-terminal zum Htk-Liganden oder in den Htk-Liganden oder sein oben definiertes Fragment insertiert worden ist; Aminosäuresequenzvarianten des Htk-Liganden oder seines oben definierten Fragments, worin ein Aminosäurerest des Htk-Liganden oder seines oben definierten Fragments durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt worden ist, einschließlich vorherbestimmte Mutationen, beispielsweise durch ortsgerichtete oder PCR-Mutagenese; Htk-Ligand aus verschiedenen Tierspezies, wie Htk-Ligand aus z.B. Kaninchen, Ratte, Schwein, nicht-menschlichen Primaten, Pferden, Mäusen und Schafen, und Allele oder andere natürlich vorkommende Varianten der vorangehenden sowie menschlicher Htk-Ligand; Derivate von Htk-Liganden oder ihre oben definierten Fragmente, worin der Htk-Ligand oder seine Fragmente beispielsweise durch Substitution, chemische, enzymatische oder andere geeignete Mittel kovalent mit einer Gruppierung modifiziert worden sind, die keine natürlich vorkommende Aminosäure ist; und Glykosylierungsvarianten des Htk-Liganden (Insertion einer Glykosylie rungsstelle oder Veränderung jeglicher Glykosylierungsstelle durch Deletion, Insertion oder Substitution geeigneter Reste): Der bevorzugte Htk-Ligand ist der menschliche Htk-Ligand, insbesondere der native menschliche Htk-Ligand mit der in 2 gezeigten Sequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Htk-Ligand einen löslichen Htk-Liganden. Unter „löslicher Htk-Ligand" wird ein Htk-Ligand verstanden, der im Wesentlichen frei von zumindest der Transmembrandomäne und gegebenenfalls der intrazellulären Domäne des nativen Htk-Liganden ist. Unter „im Wesentlichen frei" wird verstanden, dass die lösliche Htk-Liganden-Sequenz weniger als 2% der Transmembrandomäne, vorzugsweise 1,0 bis 0% der Transmembrandomäne und bevorzugter 0,5 bis 0% dieser Domäne, aufweist. Die Transmembrandomänen der nativen murinen und menschlichen Aminosäuresequenzen sind in 3 dargestellt, z.B. Reste 228 bis 253 für den murinen Htk-Liganden und Reste 225 bis 250 für den menschlichen Htk-Liganden. Derartige lösliche Htk-Liganden können vom therapeutischen Standpunkt Vorteile aufweisen, da sie beispielsweise im Allgemeinen in der Blutbahn des Patienten löslich sind. Gleichermaßen können sich derartige lösliche Liganden besonders als Diagnostika zweckdienlich erweisen, da von ihnen eine verminderte Tendenz erwartet wird, sich in die Membran zu integrieren.
Ein Beispiel einer löslichen Form des Htk-Liganden ist ein „Immunoadhäsin". Der Ausdruck „Immunoadhäsin" wird wechselseitig mit dem Ausdruck „Htk-Liganden-Immunglobulinchimäre" verwendet und bezieht sich auf ein chimäres Molekül, das die extrazelluläre Domäne (ECD) des Htk-Liganden mit einer Immunglobulinsequenz vereinigt. Die Immunglobulinsequenz ist vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, eine konstante Immunglobulindomäne. Die Immunglobulingruppierung in den Chimären der vorliegenden Erfindung kann aus IgG-1-, IgG-2-, IgG-3- oder IgG-4-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, jedoch vorzugsweise IgG-1 oder IgG-3, erlangt werden.
Der Ausdruck „extrazelluläre Domäne" oder „ECD" bezieht sich bei Verwendung hierin auf jegliche Polypeptidsequenz, die eine Rezeptorbindungsfunktion mit der extra zellulären Domäne des hierin offenbarten natürlich vorkommenden Htk-Liganden gemeinsam hat. Rezeptorbindungsfunktion bezieht sich auf die Fähigkeit des Polypeptids, an die extrazelluläre Domäne einer rPTK, wie z.B. des Htk-Rezeptors, zu binden und, gegebenenfalls, den Rezeptor zu aktivieren. Demgemäß ist es nicht notwendig, die gesamte extrazelluläre Domäne beizubehalten, da kleinere Segmente sich für gewöhnlich als für die Rezeptorbindung hinreichend erweisen. Der Ausdruck ECD umfasst Polypeptidsequenzen, bei denen die zytoplasmatische Domäne und hydrophobe Transmembransequenz (und gegebenenfalls 1-20 Aminosäuren aminoterminal der Transmembrandomäne) des reifen Htk-Liganden deletiert worden sind. Die extrazelluläre Domäne des Htk-Liganden ist in 3 beschrieben (d.h. sie befindet sich aminoterminal zur Transmembrandomäne).
Der Ausdruck „epitopmarkiert" bezieht sich bei Verwendung hierin auf ein chimäres Polypeptid, das den gesamten Htk-Liganden oder einen Abschnitt davon umfasst, der an ein „Tag-Polypeptid" fusioniert ist. Das Tag-Polypeptid hat genügend Reste, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch ausreichend kurz, sodass es nicht die Aktivität des Htk-Liganden stört. Das Tag-Polypeptid ist außerdem vorzugsweise ziemlich einzigartig, sodass der Antikörper dagegen im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Tag-Polypeptide weisen im Allgemeinen zumindest 6 Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa 8 und 50 Aminosäurereste (vorzugsweise zwischen etwa 9 und 30 Reste) auf.
Eine „exogene" therapeutische Verbindung ist hierein so definiert, dass darunter eine therapeutische Verbindung verstanden wird, die dem Säugetierpatienten fremd ist oder die zu einer Verbindung homolog ist, die sich im Säugetierpatienten findet, jedoch außerhalb des Säugetierpatienten produziert wird.
Unter „isoliert" wird bei Verwendung zur Beschreibung der verschiedenen hierin offenbarten Proteine ein Protein verstanden, das identifiziert und aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die übli cherweise die diagnostischen oder therapeutischen Verwendungen für das Protein stören, und können Enzyme, Hormone und andere proteinartige und nicht-proteinartige Gelöststoffe umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Protein gereinigt, und zwar (1) auf ein Ausmaß, das zur Erlangung von zumindest 15 Resten N-terminaler oder interner Aminosäuresequenz durch Verwendung eines Spinning-Cup-Sequenators ausreicht, oder (2) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder vorzugsweise Silberfärbung. Isoliertes Protein umfasst Protein in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung des Htk-Liganden nicht vorhanden sein wird. Für gewöhnlich wird jedoch ein isoliertes Protein durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Unter einem „im Wesentlichen reinen" Protein wird eine Zusammensetzung verstanden, die auf Basis des Gesamtgewichts der Zusammensetzung zumindest ungefähr 90 Gew.-%, vorzugsweise zumindest ungefähr 95 Gew.-%, des Proteins umfasst.
Gemäß dieser Erfindung ist „Htk-Liganden-Nucleinsäure" oder ein „Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül" eine mehr als zehn Basen enthaltende RNA oder DNA, die für einen biologisch aktiven oder als Antigen aktiven Htk-Liganden kodiert, die zu der für einen derartigen Liganden kodierenden Nucleinsäuresequenz komplementär ist, oder an eine Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für einen derartigen Htk-Liganden kodiert, und unter stringenten Bedingungen an diese gebunden bleibt. Die Nucleinsäure umfasst gegebenenfalls die Regionen der Nucleinsäuresequenzen aus 1A und 2, die für die Signalsequenzen kodieren. In einer der Ausführungsformen wird die Nucleinsäuresequenz ausgewählt aus:

(a) den kodierenden Regionen der Nucleinsäuresequenzen aus 1A oder 2.
(b) einer Sequenz, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes einer der Sequenzen aus (a) entspricht; oder
(c) einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz hybridisiert, die zu den Sequenzen aus (a) oder (b) komplementär ist und für einen biologisch aktiven Htk-Liganden kodiert.

In einer der bevorzugten Ausführungsformen kodiert die Nucleinsäure für löslichen Htk-Liganden, worin die für die Transmembranregion und gegebenenfalls die zytoplasmatische Region des Polypeptids kodierende Nucleinsäure deletiert worden ist.
Vorzugsweise kodiert das Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül für ein Polypeptid, das zumindest 75% Sequenzidentität, bevorzugter zumindest 80%, noch bevorzugter zumindest 85%, sogar noch bevorzugter zumindest 90% und insbesondere bevorzugt zumindest 95%, mit einer der in 3 gezeigten Htk-Liganden-Aminosäuresequenzen aufweist. Vorzugsweise enthält das Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül, das an für Htk-Ligand kodierende Nucleinsäuresequenz hybridisiert, zumindest 20, bevorzugter 40 und insbesondere bevorzugt 90, Basen.
„Stringente Bedingungen" sind jene, die (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur für das Waschen einsetzen, zum Beispiel 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% NaDodSO₄ bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel einsetzen, wie z.B. Formamid, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C mit Waschungen bei 42°C in 0,2 × SSC und 0,1% SDS einsetzen.
Ein „isoliertes" Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül abgetrennt ist, mit dem es für gewöhnlich in der natürlichen Quelle der Htk-Liganden-Nucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül liegt in einer anderen Form oder in einem anderen Milieu vor, als es sich in der Natur findet. Isolierte Htk-Liganden-Nucleinsäuremoleküle unterscheiden sich daher vom Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen existiert. Jedoch umfasst ein isoliertes Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül Htk-Liganden-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die für gewöhnlich Htk-Ligand exprimieren, wo sich beispielsweise das Htk-Liganden-Nucleinsäuremolekül an einem Chromosomenort befindet, der sich von dem natürlicher Zellen unterscheidet.
Das/die/der isolierte Htk-Liganden-Polypeptid, Htk-Liganden-Nucleinsäure oder Htk-Liganden-Antikörper kann für diagnostische Zwecke oder für Sonden unter Verwendung eines Markers markiert werden, wie weiter unten bei der Diskussion über Verwendungen von Htk-Liganden-Antikörpern beschrieben wird.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten zweckdienlich sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosombindungsstelle und möglicherweise andere bislang wenig verstandene Sequenzen. Eukaryotische Zellen setzen bekannterweise Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind und sich in Lesephase befinden. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Falls derartige Stellen nicht existieren, werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Der Ausdruck „Antikörper" wird im weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen einzelne monoklonale Anti-Htk-Liganden-Antikörper (einschließlich Agonisten- und Antagonisten-Antikörper) und Zusammensetzungen von Anti-Htk-Liganden-Antikörpern mit polyepitopischer Spezifität.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt wird, d.h. dass die die Population umfassenden einzelnen Antikörper identisch sind mit der Ausnahme von möglichen natürlich auftretenden Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige Antigenstelle. Darüber hinaus ist jeder monoklonale Antikörper im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörpern, die typischerweise verschiedene, gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtete Antikörper umfassen, gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen Hybridantikörper und rekombinante Antikörper, produziert durch Spleißen einer variablen (einschließlich hypervariablen) Domäne eines Anti-Htk-Liganden-Antikörpers mit einer konstanten Domäne (z.B. „humanisierte" Antikörper) oder einer leichten Kette mit einer schweren Kette oder einer Kette aus einer Spezies mit einer Kette aus einer anderen Spezies oder Fusionen mit heterologen Proteinen, unabhängig von der Ursprungsspezies oder Immunglobulinklassen- oder -unterklassenzuordnung, sowie Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')₂ und Fv), solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen. (Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567 und Mage und Lamoyi, in: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, S. 79-97 (1987).)
Daher weist der Modifikator „monoklonal" darauf hin, dass der Antikörper aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt worden ist, und er ist nicht dahingehend auszulegen, dass er die Produktion des Antikörpers durch irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende monoklonale Antikörper mit dem erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (US-Patent Nr. 4.816.567). Die „monoklonalen Antikörper" können außerdem aus Phagenbibliotheken isoliert werden, die beispielsweise unter Verwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), beschriebenen Techniken erzeugt werden.
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher (z.B. muriner) Antikörper sind spezielle chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine von nicht-menschlichem Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Größtenteils sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), bei denen die Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregion- (FR-) Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus kann der humanisierte Antikörper Reste umfassen, die sich weder im Empfängerantikörper, noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen finden. Diese Modifikationen werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen, bei denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen denen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird im Optimalfall außerdem zumindest einen Abschnitt ei ner konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise den eines menschlichen Immunglobulins, umfassen.
II. Art und Weisen der praktischen Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung eines neuen Htk-Liganden, der an den Htk-Rezeptor bindet und diesen aktiviert.
Die murine Htk-Liganden-cDNA-Sequenz ist in 1A–B dargestellt. Das vorhergesagte Molekulargewicht des Proteins nach Signalpeptidspaltung beträgt 34 kD mit einem geschätzten pl von 8,9. Gleichermaßen ist der menschliche Htk-Ligand identifiziert und isoliert worden. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des menschlichen Htk-Liganden sind in 3 gezeigt. Die murinen und menschlichen Liganden zeigen 96% Homologie auf der Aminosäureebene, was ein hohes Konservierungsausmaß zwischen Spezies demonstriert. Es folgt eine Beschreibung der Herstellung des Htk-Liganden und von Varianten davon.
1. Herstellung von Htk-Ligand natürlicher Sequenz und von Varianten davon
Der Großteil der unten stehenden Diskussion betrifft die Produktion von Htk-Ligand durch Kultivieren von Zellen, die mit einem die Htk-Liganden-Nucleinsäure enthaltenden Vektor transformiert sind, und das Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur. Es ist weiters vorgesehen, dass der Htk-Ligand dieser Erfindung durch homologe Rekombination produziert werden kann, wie sie in der am 16. Mai 1991 veröffentlichten WO 91/06667 bereitgestellt wird.
Zusammenfassend umfasst dieses Verfahren das Transformieren primärer Säugetierzellen, die das endogene Htk-Liganden-Gen enthalten (z.B. menschliche Zellen, falls der gewünschte Htk-Ligand ein menschlicher ist), mit einem Konstrukt (d.h. Vektor), das ein amplifizierbares Gen (wie z.B. Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder andere unten erörterte) und zumindest eine flankierende Region einer Länge von zumindest ungefähr 150 bp umfasst, die zu einer DNA-Sequenz am Locus der kodieren den Region des Htk-Liganden-Gens homolog ist, um für die Amplifikation des Htk-Liganden-Gens zu sorgen. Das amplifizierbare Gen muss sich an einer Stelle befinden, die die Expression des Htk-Liganden-Gens nicht stört. Die Transformation wird so durchgeführt, dass das Konstrukt homolog in das Genom der Primärzellen integriert wird, um eine amplifizierbare Region festzulegen.
Das Konstrukt umfassende Primärzellen werden dann mittels des amplifizierbaren Gens oder anderer im Konstrukt vorhandener Marker selektiert. Die Gegenwart des Markergens weist die Anwesenheit und Integration des Konstrukts in das Wirtsgenom nach. Es muss keine weitere Selektion der Primärzellen vorgenommen werden, da die Selektion im zweiten Wirt vorgenommen wird. Falls erwünscht, kann das Auftreten des homologen Rekombinationsereignisses ermittelt werden, indem PCR eingesetzt und entweder die resultierenden amplifizierten DNA-Sequenzen sequenziert werden oder die richtige Länge des PCR-Fragments ermittelt wird, wenn DNA aus korrekt integrierten Integranten vorliegt, und nur jene Zellen vermehrt werden, die derartige Fragmente enthalten. Außerdem können die selektierten Zellen, falls erwünscht, an dieser Stelle amplifiziert werden, indem die Zellen mit dem geeigneten Amplifikationsmittel (wie z.B. Methotrexat, falls das amplifizierbare Gen DHFR ist) gestresst werden, sodass mehrere Kopien des Zielgens erlangt werden. Vorzugsweise wird der Amplifikationsschritt jedoch bis nach der unten beschriebenen zweiten Transformation nicht durchgeführt.
Nach dem Selektionsschritt werden DNA-Abschnitte des Genoms ausreichender Größe, um die gesamte amplifizierbare Region zu umfassen, aus den selektierten Primärzellen isoliert. Sekundäre Säugetierexpressionswirtszellen werden dann mit diesen genomischen DNA-Abschnitten transformiert und kloniert, und es werden Klone selektiert, die die amplifizierbare Region enthalten. Die amplifizierbare Region wird dann mithilfe eines Amplifikationsmittels amplifiziert, falls sie nicht schon in den Primärzellen amplifiziert wurde. Schließlich werden die sekundären Expressionswirtszellen, die nun mehrere Kopien der den Htk-Liganden enthaltenden amplifizierbaren Region umfassen, gezüchtet, um das Gen zu exprimieren und das Protein zu produzieren.
A. Isolierung von DNA, die für Htk-Ligand kodiert
Die für den Htk-Liganden kodierende DNA kann aus jeglicher cDNA-Bibliothek erlangt werden, die aus Geweben hergestellt wurde, von denen angenommen wird, dass sie die Htk-Liganden-mRNA aufweisen und diese in einem nachweisbaren Ausmaß exprimieren. Demgemäß kann menschliche Htk-Liganden-DNA in geeigneter Weise aus einer cDNA-Bibliothek erlangt werden, die aus menschlichem Fötallungen- oder Hirngewebe hergestellt wurde. Die murine Htk-Liganden-DNA kann beispielsweise aus einer cDNA-Bibliothek der SV40MES-13-Zelllinie hergeleitet werden. Das Htk-Liganden-Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese erlangt werden.
Bibliotheken werden mit Sonden (wie z.B. Antikörpern gegen den Htk-Liganden oder Oligonucleotiden von etwa 20 bis 80 Basen) gescreent, die konstruiert sind, um das Gen von Interesse oder das von ihm kodierte Protein zu identifizieren. Das Screening der cDNA- oder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie in Kapiteln 10-12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben sind. Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für Htk-Ligand kodierenden Gens ist die Verwendung des PCR-Verfahrens, wie beschrieben im Abschnitt 14 von Sambrook et al. (siehe oben).
Ein bevorzugtes Verfahren zur praktischen Ausführung dieser Erfindung ist die Verwendung sorgfältig ausgewählter Oligonucleotidsequenzen, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Geweben, vorzugsweise Säugetier-Fötallungen- oder Gehirn-Linien, bevorzugter menschlichen Fötallungen- oder Gehirn-Zelllinien, zu screenen. Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten von ausreichender Länge und ausreichend eindeutig sein, sodass falsch-positive Resultate minimiert werden.
Das Oligonucleotid muss so markiert sein, dass es bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Das bevorzugte Verfahren zur Markierung ist die Verwendung von ³²P-markiertem ATP mit Polynucleotidkinase, was auf dem Gebiet der Erfindung gut bekannt ist, um das Oligonucleotid radioaktiv zu markieren. Andere Verfahren können jedoch verwendet werden, um das Oligonucleotid zu markieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Biotinylierung oder Enzymmarkierung.
Von besonderem Interesse ist die Htk-Liganden-Nucleinsäure, die für ein Polypeptid voller Länge kodiert. In manchen bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nucleinsäuresequenz die native Htk-Liganden-Signalsequenz. Nucleinsäure, die die gesamte für das Protein kodierende Sequenz aufweist, wird erlangt durch Screening gewählter cDNA- oder genomischer Bibliotheken unter Verwendung der hierin erstmals offenbarten, abgeleiteten Aminosäuresequenz und, falls erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren, wie sie im Abschnitt 7.79 von Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben sind, um Vorläufer und Prozessierungszwischenprodukte von mRNA nachzuweisen, die möglicherweise nicht in cDNA revers transkribiert worden ist.
B. Aminosäuresequenzvarianten des nativen Htk-Liganden
Aminosäuresequenzvarianten des Htk-Liganden werden durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die Htk-Liganden-DNA oder durch Synthese des gewünschten Htk-Liganden-Polypeptids hergestellt. Derartige Varianten umfassen beispielsweise Deletionen aus oder Insertionen oder Substitutionen von Resten in den/die in 3 für Htk-Liganden gezeigten Aminosäuresequenzen. Jegliche Kombination von Deletion, Insertion und Substitution wird vorgenommen, um unter der Voraussetzung zum endgültigen Produkt zu gelangen, dass das endgültige Konstrukt die gewünschten Eigenschaften aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationelle Prozesse des Htk-Liganden verändern, wie z.B. das Ändern der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen, Ändern der Membranverankerungseigenschaften und/oder Ändern der intrazellulären Lokalisation des Htk-Liganden durch Insertieren, Deletieren oder anderweitiges Beeinflussen der Leadersequenz des Htk-Liganden.
Zur Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten des Htk-Liganden werden Ort der Mutationsstelle und Beschaffenheit der Mutation von der/den Eigenschaft(en) des zu modifizierenden Htk-Liganden abhängen. Die Stellen für die Mutation können einzeln oder hintereinander modifiziert werden, z.B. indem (1) zuerst mit konservativ gewählten und dann mit drastischer gewählten Aminosäuren in Abhängigkeit vom Resultat substituiert wird, (2) der Zielrest deletiert wird oder (3) Reste derselben oder einer anderen Klasse in Nachbarschaft zur gefundenen Stelle insertiert werden oder Kombinationen der Möglichkeiten 1-3.
Ein zweckdienliches Verfahren zur Identifizierung gewisser Reste oder Regionen des Htk-Liganden-Polypeptids, die bevorzugte Orte für Mutagenese sind, wird „Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt, wie es von Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989), beschrieben wird. Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert (z.B. geladene Reste, wie z.B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere bevorzugt Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umgebung innerhalb oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Jene Domänen, die eine funktionelle Empfindlichkeit auf die Substitutionen zeigen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Varianten an oder anstelle der Substitutionsstelle eingeführt werden. Während folglich die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist, muss die Beschaffenheit der Mutation an sich nicht vorherbestimmt sein. Um beispielsweise die Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, wird Ala-Scanning oder Zufallsmutagenese an einem Zielcodon oder an einer Zielregion durchgeführt, und die exprimierten Htk-Liganden-Varianten werden auf die optimale Kombination gewünschter Aktivität hin gescreent.
Es gibt zwei Hauptvariablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: der Ort der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation. Diese sind Varianten der Sequenzen aus 3 und können natürlich vorkommende Allele (die keine Manipulation der Htk-Liganden-DNA erfordern) oder vorherbestimmte Mutantenformen sein, die durch Mutieren der DNA hergestellt werden, um entweder zu einem Al lel oder zu einer Variante zu gelangen, die in der Natur nicht vorkommt. Im Allgemeinen, werden Ort und Beschaffenheit der gewählten Mutation von den Eigenschaften des zu modifizierenden Htk-Liganden abhängen. Offensichtlich sind solche Variationen, die beispielsweise Htk-Ligand in einen bekannten Rezeptorproteintyrosinkinaseliganden umwandeln, im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht umfasst.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, bevorzugter etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise zusammenhängend. Zusammenhängende Deletionen werden für gewöhnlich in gerader Anzahl von Resten vorgenommen, jedoch liegen einzelne oder eine ungerade Anzahl an Deletionen im Schutzumfang der Erfindung. Deletionen können in Regionen niedriger Homologie zwischen Htk-Ligand und bekannten Htk-Liganden (welche die höchste Sequenzidentität mit der menschlichen Htk-Liganden-Aminosäuresequenz gemeinsam haben) eingeführt werden, um die Aktivität des Htk-Liganden zu modifizieren. Deletionen aus dem Htk-Liganden in Bereichen substanzieller Homologie mit homologen Htk-Liganden-Proteinen werden mit höherer Wahrscheinlichkeit die biologische Aktivität des Htk-Liganden signifikant modifizieren. Die Anzahl aufeinander folgender Deletionen wird so gewählt, dass die Tertiärstruktur des Htk-Liganden in der beeinflussten Domäne, z.B. Beta-Faltblatt oder Alpha-Helix, erhalten bleibt.
Eine der bevorzugten Deletionsvarianten ist der hierin definierte lösliche Htk-Ligand. Bei dieser Variante des Htk-Liganden sind die Transmembrandomänen und gegebenenfalls die intrazellulären Domänen unter Verwendung der Techniken zur Erzeugung von Deletionsvarianten deletiert.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen, die hinsichtlich der Länge von einem Rest bis zu Polypeptiden reichen, die hundert oder mehr Reste enthalten, sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Reste. Intrasequenzinsertionen (d.h. Insertionen innerhalb der reifen Htk-Liganden-Sequenz) können im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, bevorzugter 1 bis 5, insbesondere bevorzugt 1 bis 3, liegen. Insertionen werden vorzugsweise in gerader Anzahl von Resten vorgenommen, jedoch ist dies nicht erfor derlich. Beispiele terminaler Insertionen umfassen den reifen Htk-Liganden mit einem N-terminalen Methionylrest, einem Artekfakt der direkten Expression des reifen Htk-Liganden in rekombinanter Zellkultur, und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus des reifen Htk-Ligandenmoleküls, um die Sekretion von reifem Htk-Liganden aus rekombinanten Wirten zu erleichtern. Derartige Signalsequenzen werden im Allgemeinen aus der vorgesehenen Wirtsspezies erlangt und sind daher dazu homolog. Geeignete Sequenzen umfassen STII oder lpp für E. coli, Alphafaktor oder Invertase für Hefe und Virussignale, wie z.B. Herpes-gD für Säugetierzellen.
Andere Insertionsvarianten des Htk-Ligandenmoleküls umfassen die Fusion von immunogenen Polypeptiden, z.B. bakteriellen Polypeptiden, wie z.B. Beta-Lactamase, oder einem vom E.-coli-trp-Locus kodierten Enzym oder Hefeprotein an den N- oder C-Terminus des Htk-Liganden und C-terminale Fusionen mit Proteinen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, wie z.B. konstante Immunglobulinregionen (oder andere Immunglobulinregionen), Albumin oder Ferritin, wie beschrieben in der am 6. April 1989 veröffentlichten WO 89/02922.
Eine dritte Gruppe von Varianten sind Aminosäuresubstitutionsvarianten. Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest im Htk-Ligandenmolekül entfernt und stattdessen ein anderer Rest insertiert. Die Stellen von größtem Interesse für Substitutionsmutagenese umfassen als aktive Stelle(n) des Htk-Liganden erkannte Stellen und Stellen, wo die in den bekannten Analoga auftretenden Aminosäuren sich bezüglich Seitenkettensperrigkeit, Ladung oder Hydrophobie wesentlich unterscheiden, wo jedoch außerdem ein hohes Ausmaß an Sequenzidentität an der gewählten Stelle innerhalb verschiedener Tier-Htk-Ligandenspezies besteht. Andere Stellen von Interesse sind jene, in denen bestimmte Reste des aus verschiedenen Spezies erlangten Htk-Liganden identisch sind. Diese Stellen, insbesondere jene, die innerhalb einer Sequenz von zumindest drei anderen identisch konservierten Stellen liegen, werden auf relativ konservative Weise substituiert. Derartige konservative Substitutionen sind in Tabelle 1 unter der Überschrift bevorzugter Substitutionen gezeigt. Falls derartige Substitutionen in einer Veränderung der biologischen Aktivität resultieren, dann werden substanziellere Veränderungen, die beispielhaft in Tabelle 1 bezeichnet sind oder wie sie weiter unten in Bezug auf Aminosäureklassen beschrieben sind, eingeführt und die Produkte gescreent. TABELLE 1
Substanzielle Modifizierungen der Funktion oder immunologischen Identität des Htk-Liganden werden erzielt, indem Substitutionen gewählt werden, die sich hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenketten wesentlich unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

(1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutral-hydrophil: Cys, Ser, Thr;
(3) sauer: Asp, Glu;
(4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
(5) Reste, die die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro; und
(6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nicht-konservative Substitutionen bedingen das Austauschen eines Elements einer dieser Klassen gegen eine andere. Derartige substituierte Reste können auch in die konservativen Substitutionsstellen oder vorzugsweise in die verbleibenden (nicht-konservativen) Stellen eingeführt werden.
In einer der Ausführungsformen der Erfindung ist es wünschenswert, eine oder mehrere interne Proteasespaltstellen zu inaktivieren, die im Molekül vorhanden sind. Diese Stellen werden durch Prüfung der kodierten Aminosäuresequenz identifiziert, im Falle von Trypsin beispielsweise auf einen Arginyl- oder Lysinylrest. Wenn Proteasespaltstellen identifiziert sind, werden sie gegenüber proteolytischer Spaltung inaktiviert, indem der Zielrest durch einen anderen Rest, vorzugsweise einen basischen Rest, wie z.B. Glutamin, oder einen hydrophoben Rest, wie z.B. Serin, ersetzt wird; indem der Rest deletiert wird; indem ein Prolylrest unmittelbar nach dem Rest insertiert wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird jeglicher Methionlyrest, der nicht der Start-Methionylrest der Signalsequenz ist, oder jeglicher Rest, der sich innerhalb von etwa drei Resten N- oder C-terminal jedes derartigen Methionylrests befindet, durch einen anderen Rest ersetzt (vorzugsweise gemäß Tabelle 1) oder deletiert. Alternativ dazu werden 1-3 Reste in Nachbarschaft zu derartigen Stellen insertiert.
Jeglicher Cysteinrest, der nicht an der Erhaltung der richtigen Konformation des Htk-Liganden beteiligt ist, kann ebenfalls im Allgemeinen mit Serin substituiert werden, um die oxidative Stabilität des Moleküls zu verbessern und anomale Vernetzung zu verhindern.
Nucleinsäuremoleküle, die für die Aminosäuresequenzvarianten des Htk-Liganden kodieren, werden mittels einer Reihe von Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Falle von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvarianten) oder Herstellung mittels Oligonucleotid-vermittelter (oder ortsgerichteter) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher hergestellten Variante oder einer Nicht-Variantenversion des Htk-Liganden.
Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten der Htk-Liganden-DNA. Diese Technik ist auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und von Adelman et al., DNA 2, 183 (1983), beschrieben. Zusammenfassend wird Htk-Liganden-DNA durch Hybridisieren eines für die gewünschte Mutation kodierenden Oligonucleotids an ein DNA-Templat verändert, wobei das Templat die einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, das die unveränderte oder native DNA-Sequenz des Htk-Liganden enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen vollständigen zweiten komplementären Strang des Templats zu synthetisieren, der folglich den Oligonucleotidprimer enthält und für die gewählte Veränderung in der Htk-Liganden-DNA kodiert.
Im Allgemeinen werden Oligonucleotide einer Länge von zumindest 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid wird 12 bis 15 Nucleotide aufweisen, die an einer der Seiten des/der für die Mutation kodierenden Nucleotids/e völlig komple mentär zum Templat sind. Dies gewährleistet, dass das Oligonucleotid in richtiger Weise an das einzelsträngige DNA-Templatmolekül hybridisieren wird. Die Oligonucleotide können unter Anwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Techniken, wie z.B. jener von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978), beschriebenen, leicht synthetisiert werden.
Das DNA-Templat kann durch jene Vektoren erzeugt werden, die sich entweder von Bakteriophagen-M13-Vektoren (die im Handel erhältlichen M13mp18- und M13mp19-Vektoren sind geeignet) oder jenen Vektoren herleiten, die einen einzelsträngigen Phagen-Replikationsstartpunkt enthalten, wie von Viera et al., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987), beschrieben wird. Daher kann die zu mutierende DNA in einen dieser Vektoren insertiert werden, um einzelsträngiges Templat zu erzeugen. Die Herstellung des einzelsträngigen Templats wird in den Abschnitten 4.21-4.41 von Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben.
Alternativ dazu kann einzelsträngiges DNA-Templat durch Denaturieren von doppelsträngiger Plasmid- (oder anderer) DNA unter Anwendung von Standardtechniken erzeugt werden.
Zur Änderung der nativen DNA-Sequenz (um beispielsweise Aminosäuresequenzvarianten zu erzeugen) wird das Oligonucleotid an einzelsträngiges Templat unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Ein DNA polymerisierendes Enzym, üblicherweise das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, wird dann zugegeben, um den komplementären Strang des Templats zu synthetisieren, wobei das Oligonucleotid als Primer zur Synthese verwendet wird. Ein Heteroduplexmolekül wird daher gebildet, sodass ein DNA-Strang für die mutierte Form des Htk-Liganden kodiert, und der andere Strang (das ursprüngliche Templat) kodiert für die native, unveränderte Sequenz des Htk-Liganden. Dieses Heteroduplexmolekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle, üblicherweise in einen Prokaryoten, wie z.B. E. coli JM101, transformiert. Nachdem die Zellen gezüchtet worden sind, werden sie auf Agaroseplatten ausplattiert und unter Verwendung des mit ³²P markierten Oligonucleotidprimers gescreent, um jene Bakterienkolonien zu identifizieren, die die mutierte DNA enthalten. Die mutierte Region wird dann entfernt und in einen geeigneten Vektor zur Proteinproduktion platziert, im Allgemeinen in einen Expressionsvektor jenes Typs, der typischerweise zur Transformation eines geeigneten Wirts eingesetzt wird.
Das gerade oben beschriebene Verfahren kann so modifiziert werden, dass ein Homoduplexmolekül erzeugt wird, worin beide Stränge des Plasmids die Mutation(en) enthalten. Die Modifizierungen sind die folgenden: Das einzelsträngige Oligonucleotid wird an das einzelsträngige Templat wie oben beschrieben anelliert. Ein Gemisch von drei Desoxyribonucleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP), wird mit einem dCTP-(aS) genannten Thio-Desoxyribocytosin (das von Amersham Corporation erhalten werden kann) kombiniert. Dieses Gemisch wird zum Templat-Oligonucleotid-Komplex zugegeben. Auf die Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch hin wird ein DNA-Strang erzeugt, der mit dem Templat mit Ausnahme der mutierten Basen identisch ist. Außerdem wird dieser neue DNA-Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP enthalten, das dazu dient, diesen vor dem Restriktionsendonucleaseverdau zu schützen.
Nachdem der Templatstrang des doppelsträngigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten worden ist, kann der Templatstrang nach der Region, die die zu mutierende(n) Stelle(n) enthält, mit ExoIII-Nuclease oder einer anderen geeigneten Nuclease verdaut werden. Die Reaktion wird dann gestoppt, um ein Molekül zu hinterlassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird dann unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleotidtriphosphate, ATP und DNA-Ligase gebildet. Dieses Heteroduplexmolekül kann dann in eine geeignete Wirtszelle, wie z.B. E. coli JM101, wie oben beschrieben transformiert werden.
DNA, die für Htk-Liganden-Mutanten mit mehr als einer zu substituierenden Aminosäure kodiert, kann auf eine von mehreren Weisen erzeugt werden. Wenn sich die Aminosäuren nahe beieinander in der Polypeptidkette befinden, können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonucleotids mutiert werden, das für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Wenn sich jedoch die Aminosäuren in einigem Abstand voneinander befinden (durch mehr als etwa zehn Aminosäuren getrennt), ist es schwieriger, ein einzelnes Oligonucleotid zu erzeugen, das für alle gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen können ein oder zwei alternative Verfahren eingesetzt werden.
Beim ersten Verfahren wird ein gesondertes Oligonucleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Templat-DNA anelliert, und der zweite aus dem Templat synthetisierte DNA-Strang wird für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodieren.
Das alternative Verfahren umfasst zwei oder mehrere Mutageneseumläufe, um die gewünschte Mutante herzustellen. Der erste Umlauf wird für die einzelnen Mutanten beschrieben: DNA der Wildform wird für das Templat verwendet, ein für die erste(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierendes Oligonucleotid wird an dieses Templat anelliert und ein Heteroduplex-DNA-Molekül wird dann erzeugt. Der zweite Mutageneseumlauf setzt die im ersten Umlauf der Mutagenese produzierte mutierte DNA als Templat ein. Folglich enthält dieses Templat bereits eine oder mehrere Mutationen. Das für die zusätzliche(n) gewünschten(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierende Oligonucleotid wird dann an dieses Templat anelliert, und der resultierende DNA-Strang kodiert nun für Mutationen aus dem ersten sowie zweiten Mutageneseumlauf. Diese resultierende DNA kann als Templat in einem dritten Mutageneseumlauf verwendet werden usw.
PCR-Mutagenese ist ebenfalls zur Herstellung von Aminosäurevarianten des Htk-Liganden zweckdienlich. Obgleich sich die folgende Diskussion auf DNA bezieht, versteht es sich, dass die Technik auch mit RNA Anwendung findet. Die PCR-Technik bezieht sich im Allgemeinen auf das folgende Verfahren (siehe Erlich, Science 252, 1643-1650 (1991), das Kapitel von R. Higuchi, S. 61-70). Wenn kleine Mengen von Templat-DNA als Ausgangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich hinsichtlich der Sequenz von der entsprechenden Region in einer Templat-DNA leicht unterscheiden, zur Erzeugung relativ großer Mengen eines speziellen DNA-Fragments verwendet werden, das sich von der Templatsequenz nur an jenen Positionen unterscheidet, wo sich die Primer vom Templat unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA wird einer der Primer so konstruiert, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält; die Sequenz des anderen Primers muss mit einem Sequenzabschnitt am entgegengesetzten Strang des Plasmids identisch sein, jedoch kann sich diese Sequenz an einer beliebigen Stelle entlang der Plasmid-DNA befinden. Es ist jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden jener des ersten befindet, sodass am Ende die gesamte amplifizierte Region von durch die Primer gebundener DNA leicht sequenziert werden kann. Die PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars wie des gerade beschriebenen resultiert in einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der durch die Primer festgelegten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheidet, da das Kopieren von Templat etwas fehleranfällig ist.
Wenn das Verhältnis von Templat zu Produktmaterial extrem niedrig ist, beinhaltet die überwiegende Mehrheit von Produkt-DNA-Fragmenten die gewünschte(n) Mutation(en). Dieses Produktmaterial wird verwendet, um unter Anwendung von standardmäßiger DNA-Technologie die entsprechende Region im Plasmid zu ersetzen, die als PCR-Templat diente. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden, indem entweder ein mutierter zweiter Primer verwendet oder eine zweite PCR mit anderen mutierten Primern durchgeführt wird und die beiden resultierenden PCR-Fragmente gleichzeitig an das Vektorfragment in einer dreiteiligen (oder mehrteiligen) Ligation ligiert werden.
In einem speziellen Beispiel von PCR-Mutagenese wird Templat-Plasmid-DNA (1 μg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die eine einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region aufweist. Von diesem Material werden 100 ng zu einem PCR-Gemisch auf ein Endvolumen von 50 μl zugegeben, das PCR-Puffer, der die vier Desoxyribonucleotidtriphosphate enthält und in den GeneAmp(R)-Sets enthalten ist (bezogen von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, und Emeryville, CA), und 25 pmol jedes Oligonucleotidprimers enthält. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Das Reaktionsgemisch wird fünf Minuten lang bei 100°C denaturiert, kurz auf Eis gegeben und dann mit 1 μl DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq) (5 Units/μl, bezogen von Perkin-Elmer Cetus) unter der Mineralölschicht versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen DNA-Thermocycler (bezogen von Perkin-Elmer Cetus) eingeführt, der wie folgt programmiert war:
2 min bei 55°C
30 s bei 72°C, dann 19 Zyklen von Folgendem:
30 s bei 94°C
30 s bei 55°C und
30 s bei 72°C
Am Ende des Programms wird das Reaktionsfläschchen vom Thermocycler entfernt und die wässrige Phase in ein neues Fläschchen überführt, mit Phenol/Chloroform (50/50 Vol.) extrahiert und mittels Ethanol präzipitiert und die DNA mittels Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird anschließend geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassettenmutagenese, basiert auf der Technik, die von Wells et al., Gene 34, 315 (1985), beschrieben wurde. Das Ausgangsmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor), das die zu mutierende Htk-Liganden-DNA enthält. Das/die Codon(s) in der zu mutierenden Htk-Liganden-DNA wird/werden identifiziert. Es muss sich eine einzigartige Restriktionsendonucleasestelle an jeder Seite der identifizierten Mutationsstelle(n) befinden. Falls derartige Restriktionsstellen nicht vorhanden sind, können sie unter Verwendung des oben beschriebenen Oligonucleotid-vermittelten Mutageneseverfahrens erzeugt werden, um sie an geeigneten Orten in der Htk-Liganden-DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Es wird unter Anwendung von Standardverfahren ein doppelsträngiges Oligonucleotid synthetisiert, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, jedoch die gewünschte(n) Mutation(en) enthält. Die beiden Stränge werden gesondert synthetisiert und dann unter Anwendung von Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konstruiert, dass sie 3'- und 5'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, sodass sie direkt in das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nun die mutierte Htk-Liganden-DNA-Sequenz.
C. Insertion von Nucleinsäure in einen replizierbaren Vektor
Die für den nativen Htk-Liganden oder die Htk-Liganden-Variante kodierende Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA) wird in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung (Amplifikation von DNA) oder zur Expression insertiert. Es sind zahlreiche Vektoren verfügbar. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, eine der Folgenden: eine Signalsequenz, einen Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
(i) Signalsequenzkomponente
Die Htk-Liganden dieser Erfindung können rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspeptid mit einem heterologen Polypeptid produziert werden, das vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids ist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil der Htk-Liganden-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Die gewählte heterologe Signalsequenz ist vorzugsweise eine, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert (d.h. von einer Signalpeptidase gespalten) wird. Für prokaryotische Wirtszellen, die die native Htk-Liganden-Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz ersetzt, die beispielsweise aus der Gruppe der Alkalische-Phosphatase-, Penicillinase-, lpp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leader gewählt ist. Für die Sekretion in Hefe kann die native Signalsequenz beispielsweise durch den Hefe-Invertase-Leader, Alphafaktor-Leader (ein schließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei der letztere im am 23. April 1991 erteilten US-Patent Nr. 5.010.182 beschrieben ist) oder Saure-Phosphatase-Leader, den Glucoamylase-Leader aus C. albicans ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der am 15. November 1990 veröffentlichten WO 90/13646 beschriebene Signal ersetzt werden. Bei der Säugetierzellexpression ist die native Signalsequenz (z.B. die Htk-Liganden-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion des Htk-Liganden aus menschlichen Zellen in vivo steuert) zufrieden stellend, obgleich andere Säugetier-Signalsequenzen geeignet sein können, wie z.B. Signalsequenzen aus anderen tierischen Htk-Liganden und Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies, sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das gD-Signal aus Herpes simplex.
Die DNA für eine derartige Vorläuferregion wird im Leseraster zur für den reifen Htk-Liganden kodierenden DNA ligiert.
(ii) Replikationsstartpunktkomponente
Expressions- sowie Klonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren gewählten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl an Bakterien, Hefe und Viren wohlbekannt. Der Replikationsstartpunkt aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, das 2μ-Plasmid ist für Hefe geeignet, und verschiedene Virusstartpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind zur Klonierung von Vektoren in Säugetierzellen zweckdienlich. Im Allgemeinen wird der Replikationsstartpunkt für Säugetier-Expressionsvektoren nicht benötigt (der SV40-Startpunkt wird typischerweise nur deshalb verwendet, weil er den frühen Promotor enthält).
Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. dass sie fähig sind, sich zumindest in einer Organismenklasse zu replizieren, jedoch zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden können. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert, worauf derselbe Vektor in Hefe- oder Säugetierzellen zur Expression transfiziert wird, obgleich er nicht in der Lage ist, sich unabhängig vom Chromosom der Wirtzelle zu replizieren.
DNA kann außerdem durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Dies kann beispielsweise leicht unter Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirte erzielt werden, indem in den Vektor eine DNA-Sequenz eingebaut wird, die zu einer in Bacillus-Genom-DNA vorhandenen Sequenz komplementär ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in der homologen Rekombination mit dem Genom und der Insertion von Htk-Liganden-DNA. Jedoch ist die Gewinnung genomischer, für den Htk-Liganden kodierender DNA komplexer als die eines exogen replizierten Vektors, da Restriktionsenzymverdau erforderlich ist, um die Htk-Liganden-DNA herauszuschneiden.
(iii) Selektionsgenkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch Selektionsmarker genannt wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das zum Überleben oder Wachstum transformierter Wirtzellen notwendig ist, die in einem Selektivkulturmedium gezüchtet werden. Wirtszellen, die nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformiert sind, werden im Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) Auxotrophiedefekte komplementieren oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Nährmedien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alaninracemase kodierende Gen für Bacilli.
Eines der Beispiele eines Selektionsschemas setzt ein Medikament ein, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, produzieren ein Protein, das Medikamentresistenz verleiht, und überleben folglich das Selektionsregime. Beispiele derartiger dominanter Selektionen verwenden die Medikamente Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410-413 (1985)). Die drei oben angeführten Beispiele setzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle ein, um Resistenz gegen das geeignete Medikament G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
Ein weiteres Beispiel geeigneter Selektionsmarker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme von Htk-Liganden-Nucleinsäure fähig sind, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetierzelltransformanten werden unter Selektionsdruck gestellt, den nur die Transformanten überleben, die aufgrund der Aufnahme des Markers einzigartig angepasst sind. Selektionsdruck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium schrittweise verändert wird, was die Amplifikation des Selektionsgens sowie der DNA bewirkt, die für den Htk-Liganden kodiert. Amplifikation ist der Vorgang, durch den Gene, für die ein höherer Bedarf zur Produktion eines für das Wachstum entscheidenden Proteins besteht, in den Chromosomen aufeinander folgender Generationen rekombinanter Zellen tandemwiederholt werden. Erhöhte Mengen an Htk-Ligand werden aus der amplifizierten DNA produziert. Andere Beispiele amplifizierbarer Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosindeamidase, Ornithindecarboxylase usw.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zunächst identifiziert, indem alle der Transformanten in einem Kulturmedium kultiviert werden, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinie, die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekt ist und wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Konzent rationen von Methotrexat ausgesetzt. Dies bewirkt die Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrerer Kopien anderer DNA umfassender Expressionsvektoren, wie z.B. die für den Htk-Liganden kodierende DNA. Diese Amplifikationstechnik kann mit jedem ansonsten geeigneten Wirt, z.B. ATCC-Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Gegenwart von endogenem DHFR angewendet werden, falls beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen eingesetzt wird, das gegen Mtx höchst resistent ist.
Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte der Wildform, die endogene DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen transformiert oder cotransformiert sind, die für den Htk-Liganden, DHFR-Protein der Wildform und einen weiteren Selektionsmarker, wie z.B. Aminoglycosid-3'-phopsphotransferase (APH), kodieren, durch Zellwachstum in Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den Selektionsmarker, wie z.B. ein aminoglykosidisches Antibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält. Siehe US-Patent Nr. 4.965.199.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit fehlt, auf Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirtszellgenom stellt dann eine wirksame Umgebung bereit, um die Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan nachzuweisen. Gleichermaßen werden Leu2-defekte Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide komplementiert, die das Leu2-Gen tragen.
Außerdem können vom zirkulären 1,6-μm-Plamid pKD1 stammende Vektoren zur Transformation in Kluyveromyces-Hefen verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). Kürzlich wurde ein Expressionssystem für die Produktion von Kälber-Chymosin im Großmaßstab für K. lactis beschrieben. Van der Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Mehrfachkopie-Expressionsvektoren zur Sek retion von reifem rekombinantem menschlichem Serumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces sind ebenfalls offenbart worden. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968-975 (1991).
(iv) Promotorkomponente
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die Htk-Liganden-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die sich stromauf (5') des Startcodons eines Strukturgens befinden (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 und 1.000 bp), die die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, wie z.B. der Htk-Liganden-Nucleinsäuresequenz, kontrollieren, an die sie operabel gebunden sind. Derartige Promotoren fallen in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktion auf eine gewisse Änderung der Kulturbedingungen, z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder eine Temperaturänderung, erhöhte Transkriptionsausmaße aus DNA unter ihrer Kontrolle auslösen. Gegenwärtig ist eine große Anzahl an Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielzahl möglicher Wirte erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an für Htk-Ligand kodierende DNA gebunden, indem der Promotor aus der DNA-Quelle durch Restriktionsenzymverdau entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird. Sowohl die native Htk-Liganden-Promotorsequenz als auch viele heterologe Promotoren können verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der Htk-Liganden-DNA zu steuern. Jedoch sind heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im Allgemeinen eine höhere Transkription und höhere Ausbeuten des Htk-Liganden im Vergleich zum nativen Htk-Liganden-Promotor ermöglichen.
Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980), und EP 36.776 ) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)). Jedoch sind andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch es dem geübten Fachmann ermöglicht wird, sie an für Htk-Ligand kodierende DNA zu ligieren (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)), und zwar unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, um jegliche erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden außerdem eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz enthalten, die operabel an die für den Htk-Liganden kodierende DNA gebunden ist.
Promotorsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Nahezu alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich ungefähr 25 bis 30 Basen stromauf derjenigen Stelle befindet, wo die Transkription initiiert wird. Eine weitere Region, die sich 70 bis 80 Basen stromauf des Transkriptionsstarts vieler Gene befindet, ist eine CXCAAT-Region, wobei X jegliches Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. Alle diese Sequenzen werden in geeigneter Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
Beispiele geeigneter Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure-Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus in Verbindung stehende Abbauenzyme, Metallothionei ne, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in Hitzeman et al., EP 73.657A , ausführlicher beschrieben. Hefe-Enhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefepromotoren verwendet.
Die Htk-Liganden-Transkription aus Vektoren in Säugetierzellen wird beispielsweise durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren, wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere bevorzugt aus Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, aus Hitzeschockpromotoren und aus dem Promotor erlangt werden, der normalerweise mit der Htk-Liganden-Sequenz assoziiert ist, und zwar unter der Voraussetzung, dass derartige Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckdienlicherweise als ein SV40-Restriktionsfragment erlangt, das außerdem den SV40-Virusreplikationsstartpunkt enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981). Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird zweckdienlicherweise als ein HindIII-E-Restriktionsfragment erlangt. Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.466 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982), über die Expression von DNA, die für Immuninterferon in Affenzellen kodiert; Reyes et al., Nature 297, 598-601 (1982), über die Expression menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinasepromotors aus Herpex-simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982), über die Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Maus- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982), über die Expression bakterieller CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryofibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkomavirus als Promotor.
(v) Enhancerelementkomponente
Die Transkription von DNA, die für den Htk-Liganden dieser Erfindung kodiert, wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor erhöht. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, die üblicherweise eine Länge von etwa 10 bis 300 bp aufweisen, die an einem Promotor agieren können, um seine Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig und sind 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Bio. 3, 1108 (1983)) der Transkriptionseinheit, in einem Intron (Banerji et al., Cell 33, 729 81983)) sowie in der kodierenden Sequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)) gefunden worden. Es sind zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus einer eukaryotischen Zelle verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100-270), den frühen Promotor-Enhancer von Cytomegalovirus, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982), über Enhancer-Elemente zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' zur für Htk-Ligand kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
In eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Menschen oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren werden außerdem Sequenzen enthalten, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise aus den 5'- und gelegentlich aus den 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs verfügbar. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für den Htk-Liganden kodierenden mRNA transkribiert werden.
(vii) Konstruktion und Analyse von Vektoren
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, maßgeschneidert und in der gewünschten Form neu ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
Zur Analyse zur Bestätigung der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31.446), zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden gegebenenfalls mittels Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz selektiert. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder mit dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder mit dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
(viii) Vorübergehende Expressionsvektoren
Insbesondere zweckdienlich bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression von für den Htk-Liganden kodierender DNA in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors anreichert und dann hohe Ausmaße eines gewünschten, vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert. Sambrook et al. (siehe oben), S. 16.17-16.22. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die bequeme positive Identifizierung von Polypeptiden, die von klonierten DNAs kodiert werden, sowie das schnelle Screening derartiger Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Folglich sind vorübergehende Expressionssysteme in der Erfindung insbesondere zum Zwecke des Identifizierens von Analoga und Varianten des Htk-Liganden zweckdienlich, die biologisch aktive Htk-Liganden sind.
(ix) Geeignete beispielhafte Vertebratenzellvektoren
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung auf die Synthese des Htk-Liganden in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden beschrieben in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117.060 ; und EP 117.058 . Ein insbesondere geeignetes Plasmid zur Säugetierzellexpression des Htk-Liganden ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSVI6B (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/08291, veröffentlicht am 13. Juni 1991).
D. Auswahl und Transformation von Wirtszellen
Geeignete Wirtszellen zur Klonierung und Expression der Vektoren hierin sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten zu diesem Zweck umfassen Eubakterien, wie z.B. Gram-positive oder Gram-negative Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae, wie z.B. Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella, sowie Bacilli, wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas, wie z.B. P. aeruginosa, und Streptomyces. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierungswirt ist E coli 294 (ATCC 31.446), obgleich andere Stämmen, wie z.B. E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325), geeignet sind. Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Stamm W3110 ist ein insbesondere bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein üblicher Wirtsstamm für rekombinante DNA-Produkt-Fermentationen ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen proteolytischer Enzyme sekretieren. Beispielweise kann Stamm W3110 modifiziert werden, um eine genetische Mutation in den für Proteine kodierenden Genen zu bewirken, wobei Beispiele derartiger Wirte E. coli W3110, Stamm 27C7, umfassen. Der vollständige Genotyp von 27C7 ist tonAΔ ptr3 phoAΔE15 Δ(argF-lac) 169 ompTΔ degP41kan^r. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection als ATCC-Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann der E.-coli-Stamm eingesetzt werden, der eine mutierte periplasmatische Protease aufweist und im am 7. August 1990 erteilten US-Patent Nr. 4.946.783 offenbart wurde. Alternativ dazu sind Klonierungsverfahren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäurepolymerasereaktionen, geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mirkoorganismen, wie z.B. filamentöse Pilze oder Hefe, geeignete Klonierungs- oder Expressionswirte für Vektoren, die für den Htk-Liganden kodieren. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Jedoch sind eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämme allgemein verfügbar und hierin zweckdienlich, wie z.B. Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al. (siehe oben)), wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al. (siehe oben)), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979)), Schwanniomyces, wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und filamentöse Pilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10 Jänner 1991), und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984)) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen zur Expression von glykosyliertem Htk-Ligand sind von mehrzelligen Organismen hergeleitet. Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere Eukaryotenzellkultur brauchbar, ob sie aus Vertebraten- oder aus Invertebratenzellkultur stammt. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Es sind zahlreiche Baculovirus-Stämme und Varianten und permissive Insektenwirtszellen aus Wirten, wie z.B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori, identifiziert worden. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 8, Plenum Publishing, S. 277-279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592-594 (1985)). Eine Vielzahl an Virusstämmen zur Transfektion ist öffentlich verfügbar, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können als das Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden.
Pflanzenzellen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte eingesetzt werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit gewissen Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert werden, das vorher manipuliert worden ist, um die Htk-Liganden-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für den Htk-Liganden kodierende DNA auf den Pflanzenzellwirt übertragen, sodass sie transfiziert wird und unter geeigneten Bedingungen die Htk-Liganden-DNA exprimiert. Außerdem sind mit den Pflanzenzellen kompatible Regulations- und Sig nalsequenzen verfügbar, wie z.B. der Nopalinsynthasepromotor und Polyadenylierungssequenzen. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Außerdem sind aus der Stromaufregion des T-DNA-780-Gens isolierte DNA-Segmente zur Aktivierung oder Erhöhung von Transkriptionsausmaßen Pflanzen-exprimierbarer Gene in rekombinantem, DNA-enthaltendem Gewebe fähig. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
Jedoch bestand größtes Interesse an Vertebratenzellen, und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Zellkultur (Gewebekultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Kruse und Patterson (Hrsg.), Academic Press (1973)). Beispiele zweckdienlicher Säugetierwirtszelllinien sind durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenlinie (293-Zellen oder zum Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL10); Chinahamster-Einerstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980)); Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70); Nierenzellen der Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifizieren der für die gewünschten Sequenzen kodierenden Gene modifiziert sind.
Transfektion bezieht sich auf das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob irgendwelche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Es sind dem gewöhnlichen Fachmann zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, beispielsweise CaPO₄ oder Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Betätigung dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt.
Unter Transformation wird das Einführen von DNA in einen Organismus verstanden, sodass die DNA replizierbar ist, und zwar als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für derartige Zellen geeignet sind. Die Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung, wie sie im Abschnitt 1.82 von Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben wird, oder Elektroporation wird allgemein für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transfektion gewisser Pflanzenzellen wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben verwendet. Außerdem können Pflanzen unter Anwendung von Ultraschallbehandlung wie in der am 10. Jänner 1991 veröffentlichten WO 91/00358 beschrieben transfiziert werden.
Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände wird das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology 52, 456-457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Säugetierzellwirtssystemtransformationen sind von Axel im am 16. August 1983 erteilten US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach der Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kernmikroinjektion, Elektroporation, Bakterienprotoplastenfusion mit intakten Zellen, oder Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin usw., ebenfalls verwendet werden. Für verschiedene Techniken zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527-537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988).
E. Kultivieren der Wirtszellen
Prokaryotische Zellen, die zur Produktion des Htk-Liganden-Polypeptids dieser Erfindung verwendet werden, werden in geeigneten Nährmedien wie in Sambrook et al. (siehe oben) allgemein beschrieben kultiviert.
Die zur Produktion des Htk-Liganden dieser Erfindung verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in einer Reihe von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma), sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann ein beliebiges der in Ham und Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patenten Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; US-Patent Re. 30.985; oder US-Patent Nr. 5.122.469 (alle durch Verweis aufgenommen) beschriebenen Medien als Kulturmedien für die Wirtszellen verwendet werden. Jedes dieser Medien kann wie erforderlich mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamycin^TM-Medikament), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Beliebige andere notwendige Ergänzungen können ebenfalls in geeigneten Konzentrationen enthalten sein, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung für gewöhnlich bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen, sind jene, die vorher mit der zur Expression gewählten Wirtszelle verwendet worden sind und sind dem gewöhnlichen Fachmann offensichtlich.
Im Allgemeinen finden sich Prinzipien, Protokolle und praktische Techniken zur Maximierung der Produktivität von Säugetierzellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991).
Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
F. Nachweisen der Genamplifikation/Expression
Die Amplifikation und/oder Expression eines Gens kann in einer Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung geeignet markierter Sonden auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Es können verschiedene Marker eingesetzt werden, am gebräuchlichsten sind Radioisotope, insbesondere ³²P. Jedoch können andere Techniken ebenfalls eingesetzt werden, wie z.B. die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als die Stelle zur Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit einer breiten Vielfalt an Markern markiert werden können, wie z.B. mit Radionukliden, Fluoreszenzmitteln, Enzymen oder dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybrid-Duplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen können. Die Antikörper können ihrerseits markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann.
Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren gemessen werden, wie z.B. durch immunohistochemisches Färben von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Bei immunohistochemischen Färbetechniken wird eine Probe hergestellt, typischerweise durch Entwässerung und Fixierung, gefolgt von der Reaktion mit markierten Antikörpern, die für das gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Marker üblicherweise visuell nachweisbar sind, wie z.B. enzymatische Marker, fluoreszierende Marker, lumineszierende Marker und dergleichen. Eine besonders empfindliche Färbetechnik, die zur Verwendung in der vorliegenden Er findung zweckdienlich ist, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734-738 (1980), beschrieben.
Für die immunohistochemische Färbung und/oder das Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jeglichem Tier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein natives Htk-Liganden-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen wie im unten stehenden Abschnitt 4 näher beschrieben hergestellt werden.
G. Reinigung des Htk-Liganden-Polypeptids
Der Htk-Ligand wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als sekretiertes Polypeptid gewonnen, obgleich es auch aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann, wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal produziert wird. Falls der Htk-Ligand membrangebunden ist, kann er aus der Membran unter Verwendung einer geeigneten Tensidlösung (z.B. Triton-X 100) freigesetzt werden.
Wenn der Htk-Ligand in einer rekombinanten Zelle produziert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist der Htk-Ligand völlig frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist es notwendig, den Htk-Liganden von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die hinsichtlich des Htk-Liganden im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. Der Htk-Ligand wird anschließend von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren beispielhaft für geeignete Reinigungsverfahren sind: mittels Fraktionierung an einer Ionentauschersäule; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Silica oder an Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatpräzipitation; Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von Sephadex G-75; und Protein-A-Sepharosesäulen, um Verunreinigungen, wie z.B. IgG, zu entfernen.
In der bevorzugten Ausführungsform wird die in Bennett et al. (siehe oben) offenbarte Htk-Rezeptor-Fc-Fusion an einer Protein-A-Sepharosesäule immobilisiert, und der Htk-Ligand kann mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung dieser Säule isoliert werden.
Htk-Ligandenvarianten, bei denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert worden sind, werden in derselben Weise wie nativer Htk-Ligand gewonnen, wobei jegliche durch die Variation verursachten wesentlichen Änderungen der Eigenschaften berücksichtigt werden. Beispielsweise erleichtert die Herstellung einer Htk-Liganden-Fusion mit einem weiteren Protein oder Polypeptid, z.B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, die Reinigung; eine Antikörper gegen das Antigen enthaltende Immunoaffinitätssäule kann verwendet werden, um das Fusionspolypeptid zu adsorbieren. Immunoaffinitätssäulen, wie z. B. eine polyklonale Kaninchen-Anti-Htk-Liganden-Säule, können eingesetzt werden, um die Htk-Liganden-Varianten durch ihre Bindung an zumindest einem verbleibenden Immunepitop zu absorbieren. Ein Proteaseinhibitor, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), kann ebenfalls zweckdienlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und es können Antibiotika enthalten sein, um das Wachstum hinzukommender Kontaminanten zu verhindern. Ein Fachkundiger auf dem Gebiet der Erfindung wird anerkennen, dass für den Htk-Liganden geeignete Reinigungsverfahren eine Modifizierung erfordern können, um Änderungen der Eigenschaften des Htk-Liganden oder seiner Varianten auf die Expression in rekombinanter Zellkultur hin gerecht zu werden.
H. Kovalente Modifikationen der Htk-Liganden-Polypeptide
Kovalente Modifikationen der Htk-Liganden-Polypeptide sind im Schutzumfang der Erfindung enthalten. Sowohl der native Htk-Ligand als auch Aminosäuresequenzvarianten des Htk-Liganden können kovalent modifiziert werden. Eine im Schutzumfang dieser Erfindung enthaltene Art der kovalenten Modifikation ist ein Htk-Liganden-Fragment (z.B. löslicher Htk-Ligand). Varianten-Htk-Liganden-Fragmente mit bis zu etwa 40 Aminosäureresten können bequem durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Varianten-Htk-Liganden- Polypeptids voller Länge hergestellt werden. Andere Arten kovalenter Modifikationen des Htk-Liganden oder von Fragmenten davon werden in das Molekül eingeführt, indem die abgezielten Aminosäurereste des Htk-Liganden oder von Fragmenten davon mit einem organischen Derivatisierungsmittel zur Reaktion gebracht werden, das fähig ist, mit gewählten Seitenketten der N- oder C-terminalen Reste zu reagieren.
Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, zur Reaktion gebracht, um Carboxymethyl oder Carboxyamidomethylderivate zu liefern. Cysteinylreste werden außerdem durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Para-Bromphenacylbromid ist ebenfalls zweckdienlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Ladungsumkehr der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion wegen des hohen pK_a der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie mit der Epsilon-Aminogruppe von Arginin reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann mit besonderem Interesse der Einführung spektraler Marker in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan durchgeführt werden. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I und ¹³¹I iodiert, um markierte Protein zur Verwendung im Radioimmuntest herzustellen, wobei das oben beschriebene Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, wobei R und R' unterschiedliche Alkylgruppen sind, wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgesetzt.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zur Vernetzung des Htk-Liganden an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder Oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-Htk-Liganden-Antikörpern und umgekehrt zweckdienlich. Häufig verwendete Vernetzungsmittel umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleinimide, wie z.B. Bis-N-maleinimido-1,3-octan. Derivatisierungsmittel, wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die zur Ausbildung von Vernetzungen in Gegenwart von Licht fähig sind. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrices wie z.B. Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die in den US-Patenten Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128: 4.247.642; 4.229.537; und 4.330.440 beschriebenen Substrate zur Proteinimmobilisierung eingesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten deamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingungen deamidiert. Die deamidierte Form dieser Reste liegt im Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- und Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco, S. 79-86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxylgruppe.
Eine andere Art der kovalenten Modifikation des Htk-Liganden-Polypeptids, die im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten ist, umfasst das Verändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Unter Verändern wird das Deletieren einer oder mehrerer Kohlenhydratgruppierungen verstanden, die sich im nativen Htk-Liganden finden, oder das Anfügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im nativen Htk-Liganden nicht vorhanden sind.
Die Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Anbringung der Kohlenhydratgruppering an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Anbringung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette, wobei X jegliche Aminosäure außer Prolin sein kann. Folglich erzeugt die Gegenwart von einem dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glykosylierungsstelle. O-gebunden bezieht sich auf die Anbringung einer oder mehrerer Zucker, N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obgleich 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin ebenfalls verwendet werden können.
Die Anfügung von Glykosylierungsstellen an das Htk-Liganden-Polypeptid kann bequem erzielt werden, indem die Aminosäuresequenz derart verändert wird, dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen aufweist (für N-gebundene Glykosylierungsstellen). Die Veränderung kann auch durch Addition von oder Substitution mit einem oder mehreren Serin- oder Threoninresten an der nativen Htk-Liganden-Sequenz vorgenommen werden (für O-gebundene Glykosylierungsstellen). Der Einfachheit halber wird die Htk-Liganden-Aminosäuresequenz vorzugsweise durch Änderungen auf der DNA-Ebene verändert, insbesondere durch Mutieren der für das Htk-Liganden-Polypeptid kodierenden DNA an vorgewählten Basen, sodass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden. Die DNA-Mutation(en) kann/können unter Anwendung der oben unter der Überschrift „Aminosäuresequenzvarianten des nativen Htk-Liganden" beschriebenen Verfahren vorgenommen werden.
Ein anderes Mittel zur Erhöhung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am Htk-Liganden-Polypeptid ist die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind dahingehend vorteilhaft, dass sie nicht die Produktion des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die die Fähigkeit zur N- oder O-gebundenen Glykosylierung aufweist. In Abhängigkeit von der verwendeten Kopplungsart kann/können der/die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z.B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie z.B. jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z.B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan, oder (f) die Amidgruppe von Glutamin angebunden werden. Diese Verfahren sind in der am 11. September 1987 veröffentlichten WO 87/05330 und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259-306 (1981), beschrieben.
Die Entfernung von am Htk-Liganden-Polypeptid vorhandenen Kohlenhydratgruppierungen kann chemisch oder enzymatisch erzielt werden. Chemische Deglykosylierung erfordert, dass das Polypeptid der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer gleichwertigen Verbindung ausgesetzt wird. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des verbindenden Zuckers (N- Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt bleibt. Die chemische Glykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Die enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch Verwendung einer Vielzahl an Endo- und Exo-Glykosidasen wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben erzielt werden.
Die Glykosylierung an potenziellen Glykosylierungsstellen kann durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982), beschrieben verhindert werden. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glykosid-Bindungen.
Eine weitere Art der kovalenten Modifikation des Htk-Liganden umfasst die Bindung des Htk-Liganden-Polypeptids an eines von zahlreichen nicht-proteinartigen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf eine Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist.
Da es häufig schwierig ist, die Eigenschaften eines Varianten-Htk-Liganden vorherzusagen, ist anzuerkennen, dass ein gewisses Screening der gewonnenen Varianten notwendig sein wird, um die optimale Variante auszuwählen. Eine Veränderung des immunologischen Charakters des Htk-Liganden-Moleküls, wie z.B. die Affinität für einen bestimmten Antikörper, kann auch durch einen Immuntest des kompetitiven Typs gemessen werden. Die Variante wird auf Änderungen hinsichtlich der Unterdrückung oder Verstärkung seiner enzymatischen Aktivität durch Vergleich zur Aktivität gestestet, die im selben Test für den nativen Htk-Liganden beobachtet wird. Man kann beispielsweise auf die Fähigkeit des Varianten-Htk-Liganden screenen, Proteinkinaseaktivität des Htk-Rezeptors zu stimulieren, und zwar unter Anwendung der in Lokker et al., EMBO 11, 2530-2510 (1992), dargelegten Techniken. Siehe auch Beispiel 4 hierin. Andere mögliche Modifikationen von Protein- oder Polypeptideigenschaften, wie z.B. Redox- oder thermische Stabilität, Hydrophobie, Empfindlichkeit auf proteolytischen Abbau oder die Neigung zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden mittels Verfahren getestet, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
I. Htk-Liganden-Immunglobulin-Chimären (Immunoadhäsine)
Immunglobuline (Ig) und gewisse Varianten davon sind bekannt und viele sind in rekombinanter Zellkultur hergestellt worden. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.745.055; EP 256.654 ; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); EP 120.694 ; EP 125.023 ; Morrison, J. Immun. 123, 793 (1979); Köhler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984); EP 255.694 ; EP 266.663 ; und WO 88/03559. Neukombinierte Immunglobulinketten sind ebenfalls bekannt. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4.444.878; WO 88/03565; und EP 68.763 und darin zitierte Literaturstellen. Chimären, die aus einer an eine geeignete konstante Immunglobulindomänensequenz (Immunoadhäsine) gebundenen Rezeptorsequenz konstruiert sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung ebenfalls bekannt. In der Literatur beschriebene Immunoadhäsine umfassen Fusionen von T-Zellen-Rezeptor (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84, 2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337, 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347-353 (1990); und Byrn et al., Nature 344, 667-670 (1990)); L-Selectin (Homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990); und Watson et al., Nature 349, 164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990)); CD28 und B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133-1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883-2886 (1991); und Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483-1489 (1991)); und IgE-Rezeptor α (Ridgway und Gorman, J. Cell. Biol., Bd. 115, Abstr. 1448 (1991)).
Die einfachste und unkomplizierteste Immunoadhäsinkonstruktion kombiniert die Bindungsregion(en) des „Adhäsin"-Proteins mit den Gelenk- und Fc-Regionen einer Immunglobulinschwerkette. Für gewöhnlich wird bei der Herstellung der Htk-Liganden-Immunglobulin-Chimären der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure, die für die extrazelluläre Domäne des Htk-Liganden kodiert, C-terminal an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus einer konstanten Immunglobulindomänensequenz kodiert, jedoch sind N-terminale Fusionen ebenfalls möglich.
Typischerweise wird das kodierte chimäre Polypeptid bei derartigen Fusionen zumindest funktionell aktive Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region einer Immunglobulinschwerkette beibehalten. Fusionen werden außerdem an den C-Terminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zum CH1 der Schwerkette oder der entsprechenden Region der Leichtkette vorgenommen.
Die exakte Stelle, an der die Fusion vorgenommen wird, ist nicht entscheidend; spezielle Stellen sind wohlbekannt und können gewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretion oder Bindungseigenschaften der Htk-Liganden-Immunglobulin-Chimären zu optimieren.
In manchen Ausführungsformen werden die Htk-Liganden-Immunglobulin-Chimären als Monomere oder Hetero- oder Homo-Multimere und insbesondere als Dimere oder Tetramere im Wesentlichen wie in WO 91/08298 illustriert assembliert.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sequenz der extrazellulären Htk-Liganden-Domäne an den N-Terminus der Fc-Domäne von Immunglobulin G₁ (IgG-1) fusioniert. Es ist möglich, die gesamte konstante Schwerkettenregion an die Sequenz der extrazellulären Htk-Liganden-Domäne zu fusionieren. Jedoch werden bevorzugter eine Sequenz, die in der Gelenkregion unmittelbar stromauf der Papainspaltstelle beginnt, die IgG-Fc chemisch definiert (d.h. Rest 216, wenn der erste Rest der konstanten Schwerkettenregion die Nummer 114 hat), oder analoge Stellen anderer Immunglobuline bei der Fusion verwendet. In einer insbesondere bevorzug ten Ausführungsform wird die Htk-Liganden-Aminosäuresequenz an (a) die Gelenkregion von CH2 und CH3 oder (b) die CH1-, Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen einer IgG-1-, IgG-2- oder IgG-3-Schwerkette fusioniert. Die exakte Stelle, an der die Fusion vorgenommen wird, ist nicht entscheidend, und die optimale Stelle kann durch routinemäßige Experimente ermittelt werden.
In manchen Ausführungsformen werden die Htk-Liganden-Immunglobulin-Chimären als Multimere und insbesondere als Homo-Dimere oder -Tetramere assembliert. Im Allgemeinen werden diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitenstrukturen aufweisen. Eine grundlegende Vierkettenstruktureinheit ist jene Form, in der IgG, IgD und IgE existieren. Eine Vierketteneinheit wird in den Immunglobulinen mit höherem Molekulargewicht wiederholt; IgM kommt im Allgemeinen als Pentamer von vier Grundeinheiten vor, die durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden. IgA-Globulin und gelegentlich IgG-Globulin können auch in multimerer Form im Serum vorkommen. Im Falle des Multimers kann jede der vier Einheiten gleich oder verschieden sein.
Verschiedene beispielhafte assemblierte Htk-Liganden-Immunglobulin-Chimären, die im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen, sind unten schematisch dargestellt:

(a) AC_L-AC_L;
(b) AC_H-[AC_H, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H];
(c) AC_L-AC_H-[AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H oder V_LC_L-V_HC_H];
(d) AC_L-V_HC_H-[AC_H oder AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H],
(e) V_LC_L-AC_H-[AC_L-V_HC_H oder V_LC_L-AC_H]; und
(f) [A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H-]₂,

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Der Kürze halber zeigen die vorangehenden Strukturen nur Schlüsseleigenschaften; sie zeigen weder Verbindungs- (J-) oder andere Domänen der Immunglobuline, noch Disulfidbindungen. Wo jedoch derartige Domänen für die Bindungsaktivität erforderlich sind, sind sie so zu konstruieren, dass sie an den üblichen Stellen vorhanden sind, die sie in den Immunglobulinmolekülen einnehmen.
Alternativ dazu kann die extrazelluläre Htk-Liganden-Domänensequenz zwischen Immunglobulinschwerketten- und -leichtkettensequenzen insertiert werden, sodass ein die chimäre Schwerkette umfassendes Immunglobulin erhalten wird. In dieser Ausführungsform werden die Htk-Liganden-Sequenzen an das 3'-Ende einer Immunglobulinschwerkette in jeden Arm eines Immunglobulins fusioniert, entweder zwischen der Gelenk- und CH2-Domäne oder zwischen den CH2- und CH3-Domänen. Ähnliche Konstrukte sind von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027-1037 (1991), beschrieben worden.
Obgleich die Gegenwart einer Immunglobulinleichtkette in den Immunoadhäsinen der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann eine Immunglobulinleichtkette entweder kovalent an ein Htk-Liganden-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionspolypeptid gebunden oder direkt an die extrazelluläre Htk-Liganden-Domäne fusioniert vorhanden sein. Im ersteren Fall wird für eine Immunglobulinleichtkette kodierende DNA typischerweise mit der für das Htk-Liganden-Immunglobulin-Schwerketten-Fusionsprotein kodierenden DNA coexprimiert. Bei Sekretion werden die Hybridschwerkette und die Leichtkette kovalent verbunden, um eine Immunglobulin-ähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei Disulfid-gebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare umfasst. Zur Herstellung derartiger Strukturen geeignete Verfah ren sind beispielsweise im am 28. März 1989 veröffentlichten US-Patent Nr. 4.816.567 offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die bei der Konstruktion der Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung verwendeten Immunglobulinsequenzen von einer konstanten IgG-Immunglobulinschwerkettendomäne. Für menschliche Immunoadhäsine ist die Verwendung menschlicher IgG1- und IgG3-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein Hauptvorteil der Verwendung von IgG1 ist es, dass IgG1-Immunoadhäsine effizient an immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert die Reinigung von IgG3 Protein G, ein wesentlich weniger vielseitiges Medium. Jedoch sollten andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen in Betracht gezogen werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Immunoadhäsinkonstruktion ausgewählt wird. Beispielsweise ist das IgG3-Gelenk länger und flexibler, sodass es größere „Adhäsin"-Domänen aufnehmen kann, die bei Fusion an IgG1 möglicherweise nicht falten oder nicht richtig funktionieren. Eine weitere Erwägung kann die Valenz sein; IgG sind bivalente Homodimere, wogegen Ig-Subtypen, wie IgA und IgM, dimere bzw. pentamere Strukturen der grundlegenden Ig-Homodimer-Einheit bilden. Für Htk-Liganden-Ig-Immunoadhäsine, die zur Anwendung in vivo konstruiert sind, sind die pharmakokinetischen Eigenschaften und Effektorfunktionen, die von der Fc-Region festgelegt werden, ebenfalls von Bedeutung. Obgleich IgG1, IgG2 und IgG4 alle In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen, sind ihre jeweiligen Wirksamkeiten bei der Aktivierung des Komplementsystems unterschiedlich. IgG4 aktiviert das Komplement nicht, und IgG2 ist bei der Komplementaktivierung wesentlich schwächer als IgG1. Darüber hinaus bindet IgG2 im Gegensatz zu IgG1 nicht an Fc-Rezeptoren an einkernigen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG3 für die Komplementaktivierung optimal ist, beträgt seine In-vivo-Halbwertszeit etwa ein Drittel jener anderer IgG-Isotypen. Eine weitere wichtige Erwägung für Immunoadhäsine, die zur Verwendung als menschliche Therapeutika konstruiert sind, ist die Anzahl allotypischer Varianten des jeweiligen Isotyps. Im Allgemeinen sind IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Alltotypen bevorzugt. Beispielsweise weist IgG1 nur vier serologisch definierte allotypische Stellen auf, von denen sich zwei (G1m und 2) in der Fc-Region befinden; und eine dieser Stellen, G1m1, ist nicht-immunogen. Im Gegensatz dazu gibt es in IgG3 12 serologisch definierte Allotypen, von denen sich alle in der Fc-Region befinden; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) weisen einen Allotyp auf, der nicht-immunogen ist. Daher ist die potenzielle Immunogenität eines γ3-Immunoadhäsins größer als die eines γ1-Immunoadhäsins.
Bei der Konstruktion der Htk-Liganden-Ig-Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung können Domänen deletiert werden, die für die rPTK-Bindung und/oder biologische Aktivität des Htk-Liganden nicht erforderlich sind. Bezüglich des elterlichen Immunglobulins befindet sich eine zweckdienliche Verbindungsstelle unmittelbar stromauf der Cysteine des Gelenks, die die Disulfidbindungen zwischen den beiden Schwerketten ausbilden. Bei einer häufig verwendeten Konstruktion wird das Codon für den C-terminalen Rest des „Adhäsin"- (Htk-Liganden-) Abschnitts des Moleküls direkt stromauf der Codons für die Sequenz DKTHTCPPCP (Seq.-ID Nr. 7) der IgG1-Gelenkregion eingesetzt.
Die allgemeinen Verfahren, die zur Konstruktion und Expression von Immunoadhäsinen geeignet sind, sind dieselben wie jene, die hierin oben in Bezug auf den (Nativ- oder Varianten-) Htk-Liganden offenbart sind. Htk-Liganden-Ig-Immunoadhäsine werden am zweckdienlichsten durch In-frame-Fusionieren der für den Htk-Liganden-Abschnitt kodierenden cDNA-Sequenz an eine Ig-cDNA-Sequenz konstruiert. Jedoch kann die Fusion an genomische Ig-Fragmente ebenfalls verwendet werden (siehe z.B. Gascoigne et al., siehe oben; Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990); und Stamenkovic et al., Cell 66, 1133-1144 (1991)). Der letztere Fusionstyp erfordert zur Expression die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen. Für konstante IgG-Schwerkettenregionen kodierende cDNAs können auf Basis der veröffentlichten Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken, die von Milz- oder Peripherblut-Lymphozyten stammen, mittels Hybridisierungs- oder Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Techniken isoliert werden. Die für die „Adhäsin"- und Ig-Abschnitte des Immunoadhäsins kodierenden cDNAs werden hintereinander in einen Plasmidvektor insertiert, der die effiziente Expression in den gewählten Wirtszellen steuert. Zur Expression in Säuge tierzellen sind auf pRK5 basierende Vektoren (Schall et al., Cell 61, 361-370 (1990)) und auf CDM8 basierende Vektoren (Seed, Nature 329, 840 (1989)) zweckdienlich. Die exakte Verbindungsstelle kann erzeugt werden, indem die Zusatzsequenzen zwischen den konstruierten Verbindungscodons unter Anwendung Oligonucleotidgerichteter Deletionsmutagenese entfernt werden (Zoller und Smith, Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); und Capon et al., Nature 337, 525-531 (1989)). Es können synthetische Oligonucleotide verwendet werden, bei denen beide Hälften zur Sequenz an beiden Seiten der gewünschten Verbindungsstelle komplementär sind; idealerweise sind dies 36- bis 48-mere. Alternativ dazu können PCR-Techniken verwendet werden, um die beiden Abschnitte des Moleküls In-frame mit einem geeigneten Vektor zu verbinden.
Die Wahl der Wirtszelllinie zur Expression der Htk-Liganden-Ig-Immunoadhäsine hängt hauptsächlich vom Expressionsvektor ab. Eine weitere Erwägung ist die Menge an Protein, die benötigt wird. Milligrammmengen können häufig durch vorübergehende Transfektionen hergestellt werden. Beispielsweise kann die Adenovirus-EIA-transformierte menschliche 293-Urnierenzelllinie vorübergehend mit auf pRK5 basierenden Vektoren transfiziert werden, indem das Calciumphosphatverfahren modifiziert wird, um eine effiziente Immunoadhäsinexpression zu ermöglichen. Auf CDM8 basierende Vektoren können verwendet werden, um COS-Zellen mittels DEAE-Dextranverfahren zu transfizieren (Aruffo et al., Cell 61, 1303-1313 (1990); und Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. (US) 9, 347-353 (1990)). Falls größere Proteinmengen gewünscht sind, kann das Immunoadhäsin nach stabiler Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert werden. Beispielsweise kann ein auf pRK5 basierender Vektor in Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen in Gegenwart eines zusätzlichen Plasmids eingeführt werden, das für Dihydrofolatreduktase (DHFR) kodiert und Resistenz gegen G418 verleiht. Gegen G418 resistente Klone können in Kultur selektiert werden. Diese Klone werden in Gegenwart ansteigender Konzentrationen des DHFR-Inhibitors Methotrexat gezüchtet, und es werden Klone selektiert, bei denen die Anzahl an Genkopien coamplifiziert wird, die für die DHFR- und Immunoadhäsinsequenzen kodieren. Falls das Immunoadhäsin eine hydrophobe Leadersequenz an seinem N-Terminus enthält, wird es mit hoher Wahrscheinlichkeit von den transfizier ten Zellen prozessiert und sekretiert. Die Expression von Immunoadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann einzigartig geeignete Wirtszellen erfordern. Beispielsweise können Komponenten, wie z.B. Leichtkette oder J-Kette, von gewissen Myelom- oder Hybridom-Wirtszellen bereitgestellt werden (Gascoigne et al., siehe oben; und Martin et al., J. Virol. 67, 3561-3568 (1993)).
Immunoadhäsine können zweckdienlicherweise mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Eignung von Protein A als Affinitätsligand hängt von Spezies und Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die bei den Chimären verwendet wird. Protein A kann verwendet werden, um Immunoadhäsine zu reinigen, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1-13 (1983)). Protein G wird für alle Maus-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567-1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand anhaftet, ist häufig Agarose, jedoch sind andere Matrices verfügbar. Mechanisch stabile Matrices, wie z.B. Controlled-Pore-Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol ermöglichen höhere Flussraten und kürzere Verarbeitungszeiten als sie mit Agarose erzielt werden können. Die Bedingungen für die Bindung eines Immunoadhäsins an die Protein-A- oder Protein-G-Affinitätssäule sind völlig von den Eigenschaften der Fc-Domäne bestimmt; dass heißt, von ihrer/m Spezies und Isotyp. Im Allgemeinen erfolgt die effiziente Bindung bei Wahl des geeigneten Liganden direkt aus der unkonditionierten Kulturflüssigkeit. Eine unterscheidende Eigenschaft von Immunoadhäsinen ist es, dass für menschliche γ1-Moleküle die Bindungskapazität für Protein A im Vergleich zu einem Antikörper desselben Fc-Typs etwas vermindert ist. Gebundenes Immunoadhäsin kann entweder bei saurem pH (bei oder über 3,0) oder in einem Puffer mit neutralem pH, der ein schwach chaotropes Salz enthält, effizient eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann in einem Immunoadhäsinpräparat resultieren, das eine Reinheit von >95% aufweist.
Andere Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können anstelle oder zusätzlich zur Affinitätschromatographie an Protein A oder G verwendet werden, um Immunoadhäsine zu reinigen. Immunoadhäsine verhalten sich bei der thi ophilen Gelchromatographie (Hutchens et al., Anal. Biochem. 159, 217-226 (1986)) und immobilisierten Metallchelatchromatographie (Al-Mashikhi und Makai, J. Dairy Sci. 71, 1756-1763 (1988)) ähnlich zu Antikörpern. Im Gegensatz zu Antikörpern ist jedoch ihr Verhalten an Ionentauschersäulen nicht nur durch ihre isoelektrischen Punkte bestimmt, sondern auch durch einen Ladungsdipol, der in den Molekülen aufgrund ihrer chimären Beschaffenheit auftreten kann.
J. Epitop-markierter Htk-Ligand
Diese Anmeldung sieht chimäre Polypeptide vor, die den an ein weiteres Polypeptid (wie z.B. die oben erwähnten Immunoadhäsine) fusionierten Htk-Liganden umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsformen umfasst das chimäre Polypeptid eine Fusion des Htk-Liganden (oder eines Fragments davon, z.B. der ECD des Htk-Liganden) mit einem Tag-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das ein Anti-Tag-Antikörper selektiv binden kann. Der Epitop-Tag wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxylterminus des Htk-Liganden bereitgestellt. Derartige Epitop-Tag-Formen des Htk-Liganden sind wünschenswert, da deren Anwesenheit unter Verwendung eines markierten Antikörpers gegen das Tag-Polypeptid nachgewiesen werden kann. Außerdem ermöglicht die Bereitstellung des Epitop-Tags die einfache Reinigung des Htk-Liganden mittels Affinitätsreinigung unter Verwendung des Anti-Tag-Antikörpers. Affinitätsreinigungstechniken und Antikörper umfassende Diagnosetests werden hierin später beschrieben.
Tag-Polypeptide und ihre entsprechenden Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispiele umfassen das flu-HA-Tag-Polypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159-2165 (1988)); den c-myc-Tag und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und pE10-Antikörper dagegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5(12), 3610-3616 (1985)); und den Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein-D- (-gD-) Tag und seinen Antikörper (Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547-553 (1990)). Andere Tag-Polypeptide sind offenbart worden. Beispiele umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)); das KT3-Epitop-Polypeptid (Martin et al., Science 255, 192-194 (1992)); ein α-Tubulin-Epitop-Peptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163-15166 (1991)); und das T7-Gen-10-Protein-Epitop-Tag (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393-6397 (1990)). Wenn das Tag-Polypeptid einmal ausgewählt ist, kann es unter Anwendung der hierin offenbarten Techniken erzeugt werden.
Die zur Konstruktion und Produktion des Epitop-Tag-Htk-Liganden geeigneten allgemeinen Verfahren sind dieselben wie jene, die hierin oben in Bezug auf den (Nativ- oder Varianten-) Htk-Liganden offenbart sind. Htk-Liganden-Tag-Polypeptidfusionen werden am zweckdienlichsten konstruiert, indem eine für den Htk-Liganden-Abschnitt kodierende cDNA In-frame an die Tag-Polypeptid-DNA-Sequenz fusioniert und das resultierende DNA-Fusionskonstrukt in geeigneten Wirtszellen exprimiert wird. Für gewöhnlich wird bei der Herstellung der Htk-Liganden-Tag-Polypeptidchimären der vorliegenden Erfindung für den Htk-Liganden (oder ein Fragment davon) kodierende Nucleinsäure an ihrem 3'-Ende an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus des Tag-Polypeptids kodiert; jedoch sind 5'-Fusionen ebenfalls möglich.
Epitop-Tag-Htk-Ligand kann zweckdienlicherweise mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung des Anti-Tag-Antikörpers gereinigt werden. Die Matrix, an die der Affinitätsantikörper abgebracht wird, ist meistens Agarose, jedoch sind andere Matrices verfügbar (z.B. Controlled-Pore-Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol). Der Epitop-Tag-Htk-Ligand kann von der Affinitätssäule eluiert werden, indem beispielsweise der pH oder die Ionenstärke des Puffers verändert oder chaotrope Mittel zugegeben werden.
2. Therapeutische Verwendungen Zusammensetzungen und Verabreichung des Htk-Liganden.
Es wird angenommen, dass der Htk-Ligand therapeutische Verwendung zur Behandlung von Säugetieren über Stimulation oder Hemmung von Wachstum und/oder Dif ferenzierung und/oder Aktivierung von Zellen findet, die einen Rezeptor für den Htk-Liganden, wie z.B. den Htk-Rezeptor, aufweisen. Die vorherrschende regionale Expression der Htk-Liganden-DNA in Hirnrinde, Hippocampus, Striatum und Cerebellum (siehe Beispiel 1) lässt auf die Möglichkeit schließen, dass das Htk-Liganden-Polypeptid zweckdienlich sein könnte, um neurodegenerative Krankheiten zu behandeln, bei denen diese Strukturen oder Neuronen beeinträchtigt sind, die in diese Strukturen hineinragen. Derartige Krankheiten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea und Störungen des Cerebellums (Hefti, J. Neurobiol., im Druck (1994); Marsden, Lancet 335, 948-952 (1990); Agid, Lancet 337, 1321-1327 (1991); Wexler et al., Ann. Rev. Neurosci. 14, 503-529 (1991)).
Reifer exogener Htk-Ligand oder eine lösliche Form davon (z.B. ein lösliches Immunoadhäsin) kann einem Patienten unter diesen Umständen verabreicht werden. Der menschliche Htk-Ligand ist insofern zweifellos zweckdienlich, als dass er einem Menschen mit vermindertem Spiegel des exogenen Htk-Liganden vorzugsweise in jener Situation verabreicht werden kann, wo verminderte Spiegel eine pathologische Störung bewirken.
Therapeutische Formulierungen des Htk-Liganden werden zur Lagerung hergestellt, indem der Htk-Ligand mit dem gewünschten Reinheitsgrad gegebenenfalls mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Aufl., A. Osol (Hrsg.) (1990)) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder wässriger Lösungen vermischt wird. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als etwa 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Der Htk-Ligand kann außerdem eingeschlossen sein, und zwar in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden (beispielsweise Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacrylat]-Mikrokapseln), in kolloidalen Medikamentabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (siehe oben) offenbart.
Der zur Verabreichung in vivo zu verwendende Htk-Ligand muss steril sein. Dies kann leicht durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erzielt werden. Der Htk-Ligand wird für gewöhnlich in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Htk-Ligand-Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Einfüllöffnung gegeben, beispielsweise in einen Beutel für intravenöse Lösungen oder in ein Fläschchen mit einem von einer Subkutankanüle durchstechbaren Stopfen.
Der Weg der Htk-Liganden-Verabreichung steht im Einklang mit bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion über intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokulare, intraarterielle oder intraläsionale Wege, oder über die unten erwähnten Systeme mit nachhaltiger Freisetzung. Der Htk-Ligand wird kontinuierlich durch Infusion oder Bolusinjektion verabreicht. Der Htk-Liganden-Antikörper wird in derselben Weise oder durch Verabreichung in die Blutbahn oder Lymphe verabreicht.
Geeignete Beispiele von Präparaten mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die das Protein enthalten, wobei die Matrices in Form von Formteilchen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln, vorliegen.
Beispiele von Matrices mit nachhaltiger Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) wie beschrieben von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982), oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547-556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., siehe oben), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. das Lupron Depot^TM (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolid-Acetat zusammengesetzt sind) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
Während Polymere, wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure, die Freisetzung von Molekülen für mehr als 100 Tage ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Protein für kürzere Zeiträume frei. Wenn verkapselte Proteine für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Folge der Exposition mit Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was in einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität resultiert. Es können rationale Strategien zur Proteinstabilisierung in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus ausgearbeitet werden. Wenn beispielsweise entdeckt wird, dass der Aggregationsmechanismus die Bildung intermolekularer S-S-Bindungen über Disulfid-Austausch ist, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrolle des Feuchtegehalts, unter Verwendung geeigneter Zusätze und Entwickeln spezieller Polymermatrix-Zusammensetzungen erzielt werden.
Htk-Liganden-Zusammensetzungen mit nachhaltiger Freisetzung umfassen außerdem in Liposomen eingeschlossenen Htk-Liganden. Htk-Ligand enthaltende Liposomen werden durch Verfahren hergestellt, die an sich bekannt sind: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030-4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324 . Für gewöhnlich sind Liposomen vom kleinen (etwa 200-800 Ångström) einschichtigen Typ, bei dem der Lipidgehalt mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil für die optimale Htk-Liganden-Therapie eingestellt wird.
Eine wirksame Menge des therapeutisch einzusetzenden Htk-Liganden wird beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und vom Leiden des Patienten abhängen. Demgemäß wird es für den Therapeuten notwendig sein, die Dosierung zu titrieren und den Verabreichungsweg wie erforderlich zu modifizieren, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische Tagesdosis kann in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren von etwa 1 μg/kg bis zu 10 mg/kg oder mehr reichen. Typischerweise wird der Kliniker den Htk-Liganden verabreichen, bis eine Dosierung erreicht ist, die die gewünschte Wirkung erzielt. Der Fortschritt dieser Therapie kann leicht auf herkömmliche Weise überprüft werden.
3. Nicht-therapeutische, diagnostische Verwendungen für den Htk-Liganden
Die für den Htk-Liganden kodierende Nucleinsäure kann als Diagnosemittel für gewebespezifische Typisierung verwendet werden (z.B. Brustdrüsenepithel). Beispielsweise können derartige Verfahren wie In-situ-Hybridisierung, Northern- und Southern-Blotting und PCR-Analyse verwendet werden, um zu ermitteln, ob für Htk-Ligand kodierende DNA und/oder RNA im/in den zu beurteilenden Zelltyp(en) vorhanden ist. Htk-Liganden-Nucleinsäure oder -Polypeptid können außerdem als diagnostische Marker für Brustdrüsenkarzinome verwendet werden. Beispielsweise kann der Htk-Ligand unter Anwendung der hierin beschriebenen Techniken markiert und die Expression der Htk-Rezeptor-Nucleinsäure unter Verwendung des markierten Htk-Liganden quantifiziert werden.
Menschliche Htk-Liganden-Nucleinsäure ist am Chromosom 13q33 lokalisiert worden. Folglich kann die Nucleinsäure für menschlichen Htk-Liganden als Marker für dieses menschliche Chromosom verwendet werden.
Htk-Liganden-Nucleinsäure ist außerdem zur Herstellung von Htk-Liganden-Polypeptid mittels der hier durch Beispiele veranschaulichten rekombinanten Techniken zweckdienlich.
Isoliertes Htk-Liganden-Polypeptid kann in quantitativen Diagnosetests als Standard oder Kontrolle verwendet werden, gegen den/die Proben, die unbekannte Mengen an Htk-Liganden enthalten, hergestellt werden können.
Htk-Liganden-Präparate sind außerdem bei der Erzeugung von Antikörpern, als Standards in Tests für den Htk-Liganden (z.B. durch Markierung des Htk-Liganden zur Verwendung als Standard in einem Radioimmuntest oder Enzym-gebundenen Immuntest), zum Nachweis der Gegenwart des Htk-Rezeptors in einer biologischen Probe (z.B. unter Verwendung eines markierten Htk-Liganden) bei Affinitätsreinigungstechniken und bei Rezeptorbindungstests des kompetitiven Typs zweckdienlich, wenn sie mit radioaktivem Iod, Enzymen, Fluorophoren, Spinmarkern und dergleichen markiert sind.
Der Htk-Ligand ist außerdem als Diagnosewerkzeug zweckdienlich. Beispielsweise kann der Htk-Ligand in prokaryotischen Zellen unter Anwendung der hierin ausgearbeiteten Techniken hergestellt und das so produzierte unglykosylierte Protein beispielsweise als Molekulargewichtsmarker verwendet werden. Das abgeleitete Molekulargewicht (MW) des unglykosylierten Htk-Liganden unter reduzierenden Bedingungen beträgt etwa 34 kD. Löslicher Htk-Ligand hat ein abgeleitetes MW von 22 kD unter reduzierenden Bedingungen. Um den Htk-Liganden als Molekulargewichtsmarker verwenden zu können, wird beispielsweise Gelfiltrationschromatographie oder SDS-PAGE verwendet, um (ein) Protein(e) zu trennen, für das/die gewünscht wird, das/die Molekulargewicht(e) im Wesentlichen auf normalem Wege zu ermitteln. Der Htk-Ligand und andere Molekulargewichtsmarker werden als Standards verwendet, um einen Bereich von Molekulargewichten bereitzustellen. Beispielsweise können Phosphorylase b (MW = 97.400), Rinderserumalbumin (MW = 68.000), Ovalbumin (MW = 46.000), Htk-Ligand (MW = 34.000), Trypsininhibitor (MW = 20.100) und Lysozym (MW = 14.400) als MW-Marker verwendet werden. Die anderen hier erwähn ten Molekulargewichtsmarker können im Handel beispielsweise von Amersham Corporation, Arlington Heights, IL, bezogen werden. Häufig werden die Molekulargewichtsmarker markiert sein, um den einfachen Nachweis im Anschluss an die Trennung zu ermöglichen. Techniken zur Markierung von Antikörpern und Proteinen werden hierin erörtert und sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Beispielsweise können Molekulargewichtsmarker biotinyliert sein, und nach der Trennung, beispielsweise mittels SDS-PAGE, kann der Blot mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase inkubiert werden. Die Banden können dann mittels Lichtdetektion nachgewiesen werden.
Es kann außerdem zweckdienlich sein, bestimmte Zellen, die den Htk-Rezeptor aufweisen, ex vivo unter Verwendung des Htk-Liganden als Wachstumsfaktor zu züchten. Diese Zellen, die ex vivo zu züchten sind, können gleichzeitig anderen bekannten Wachstumsfaktoren oder Cytokinen exponiert werden. Beispielhafte Cytokine umfassen die Interleukine (z.B. IL-3), Granulozyten-Makrophagenkoloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Makrophagenkoloniestimulierender Faktor (M-CSF), Granulozyten-koloniestimulierender Faktor (GM-CSF), Erythropoietin (Epo), Lymphotoxin, Steel-Faktor (SLF), Tumornekrosefaktor (TNF) und Gamma-Interferon. Dies resultiert in der Proliferation und/oder Differenzierung der Zellen, die den Htk-Rezeptor aufweisen. Beispielsweise können menschliche Tumorzelllinien, für die erwünscht ist, daraus bestimmte mit dem Tumor assoziierte Faktoren (üblicherweise Proteine) zu isolieren, ex vivo unter Verwendung des Htk-Liganden gezüchtet werden. Außerdem können Antikörper gegen die tumorassoziierten Faktoren erzeugt werden, die für diagnostische Zwecke zweckdienlich sein könnten. Beispiele derartiger Tumorzelllinien, die mit dem Htk-Liganden behandelt werden können, umfassen beispielsweise Brustkrebszellen (z.B. MCF-7), Leberzelllinien, Colo 205, NCI 69, HM-1 und HeLa.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung kann der Ligand für die Affinitätsreinigung des Htk-Rezeptors verwendet werden. Zusammenfassend umfasst diese Technik das kovalente Binden des Htk-Liganden an eine inerte und poröse Matrix (z.B. mit Bromcyan zur Reaktion gebrachte Agarose). Eine den Htk-Rezeptor enthal tende Lösung kann dann über das chromatographische Material geleitet und anschließend durch Ändern der Elutionsbedingungen (z.B. durch Ändern von pH oder Ionenstärke) freigesetzt werden.
Der gereinigte Htk-Ligand und die dafür kodierende Nucleinsäure können außerdem als Reagenzien für mechanistische Untersuchungen des Liganden und seines zugehörigen Rezeptors verkauft werden, um die Rolle des Htk-Liganden und Rezeptors bei normalem/r Wachstum und Entwicklung sowie bei abnormalem/r Wachstum und Entwicklung, z.B. bei Malignitäten, zu untersuchen.
Der Htk-Ligand kann für kompetitives Screening potenzieller Agonisten oder Antagonisten zur Bindung an den Htk-Rezeptor verwendet werden. Htk-Liganden-Varianten sind zweckdienlich als Standards oder Kontrollen in Tests für den Htk-Liganden unter der Voraussetzung, dass sie vom eingesetzten analytischen System, z.B. einem Anti-Htk-Liganden-Antikörper, erkannt werden.
4. Herstellung von Htk-Liganden-Antikörpern
Es folgt eine Beschreibung bezüglich der Herstellung beispielhafter Antikörper, wie sie hierin definiert sind. Diese beispielhaften Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, humanisierte, bispezifische Antikörper oder Heterokonjugat-Antikörper.
A. Polyklonale Antikörper
Polyklonale Antikörper gegen den Htk-Liganden werden im Allgemeinen in Tieren durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des Htk-Liganden und eines Adjuvans hergestellt. Es kann zweckdienlich sein, den Htk-Liganden oder ein die Ziel-Aminosäuresequenz enthaltendes Fragment an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinres te), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, wobei R und R' verschiedene Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg oder 1 μg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Freundschem komplettem Adjuvans kombiniert und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Konjugatmenge in Freundschem komplettem Adjuvans durch subkutane Injektionen an mehreren Stellen geboostet. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut entnommen und das Serum auf Anti-Htk-Liganden-Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Antikörpertiter sein Plateau erreicht hat. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat desselben Htk-Liganden, jedoch an ein anderes Protein und/oder über ein anderes Vernetzungsmittel konjugiert, geboostet. Konjugate können außerdem in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Außerdem können Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun, verwendet werden, um die Immunreaktion zu verstärken.
B. Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt, d.h. dass die die Population umfassenden einzelnen Antikörper mit der Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringfügigen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Folglich weist der Modifikator „monoklonal" auf die Eigenschaft des Antikörpers hin, dass er nicht ein Gemisch unterschiedlicher Antikörper ist.
Beispielsweise können die monoklonalen Anti-Htk-Liganden-Antikörper der Erfindung unter Anwendung des erstmals von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebenen Verfahrens hergestellt werden oder können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567).
Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier wie z.B. ein Hamster wie hierin oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten anzuregen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle auszubilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, S. 59-103, Academic Press (1986)).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden ausgesät und in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten elterlichen Myelomzellen hemmen. Wenn beispielsweise den elterlichen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) umfassen, wobei diese Substanzen das Wachstum HGPRT-defekter Zellen verhindert.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile Antikörperexpression in hohem Ausmaß durch die selektierten, Antikörper produzierenden Zellen fördern und gegen ein Medium, wie z.B. HAT-Medium, empfindlich sind. Unter diesen sind bevorzugte Myelomzelllinien murine Myelomlinien, wie z.B. jene, die von MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren stammen, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, sowie SP-2-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien sind zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); und Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, S. 51-63 (1987)). Siehe auch Boerner et al., J. Immunol. 147(1), 86-95 (1991), und WO 91/17769, veröffentlicht am 28. November 1991, zu Techniken zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper.
Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf Produktion monoklonaler, gegen den Htk-Liganden gerichteter Antikörper getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler Antikörper, die durch Hybridomzellen produziert werden, mittels Immunopräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA), ermittelt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), ermittelt werden.
Nachdem Hybridomzellen identifiziert worden sind, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59-104 (1986). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise Dulbecco's Modified Eagle's Medium oder RPMI-1640-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumore in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden in geeigneter Weise von Kulturmedium, Aszitesflüssigkeit oder Serum durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, getrennt. Alternativ dazu ist es nunmehr möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu produzieren, die fähig sind, nach Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper in Abwesenheit endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Beispielsweise ist beschrieben worden, dass die homozygote Deletion des Antikörperschwerkettenverbindungsregion- (J_H-) Gens in chimären und keimbahnmutierten Mäusen in der vollständigen Hemmung endogener Antikörperproduktion resultiert. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in derartige keimbahnmutierte Mäuse wird in der Produktion menschlicher Antikörper nach Antigenexposition resultieren. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); und Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993).
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente aus Antikörperphagenbibliotheken isoliert werden, die unter Anwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), beschriebenen Techniken erzeugt wurden, und zwar unter Verwendung des Htk-Liganden (oder eines Fragments davon), um auf einen geeigneten Antikörper oder ein geeignetes Antikörperfragment zu selektieren. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), beschreiben die Isolierung muriner bzw. menschlicher Antikörper unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Nachfolgende Veröffentlichungen beschreiben die Produktion hochaffiner (nM-Bereich) menschlicher Antikörper durch Chain-Shuffling (Mark et al., Bio/Technol. 10, 779-783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion sehr großer Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)). Daher sind diese Techniken wertvolle Alternativen zu herkömmlichen monoklonalen Antikörper-Hybridomtechniken zur Isolierung „monoklonaler" Antikörper (insbesondere menschlicher Antikörper), die in der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind.
Für monoklonale Antikörper der Erfindung kodierende DNA kann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für Schwer- und Leichtketten muriner Antikörper kodieren). Die Hybridomzellen der Erfindung dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn sie einmal isoliert ist, kann die DNA in Expressionsvektoren gesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen, transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die DNA kann außerdem modifiziert werden, beispielsweise durch Substituieren der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen murinen Sequenzen, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984), oder durch kovalentes Anbinden der gesamten oder eines Abschnitts der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die für Immunglobulin kodierende Sequenz. Auf diese Weise werden „chimäre" oder „hybri de" Antikörper hergestellt, die die Bindungsspezifität eines monoklonalen Anti-Htk-Liganden-Antikörpers hierin aufweisen.
Typischerweise werden die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung durch derartige Nicht-Immunglobulin-Polypeptide ersetzt oder es werden die variablen Domänen einer Antigen-kombinierenden Stelle eines Antikörpers der Erfindung durch diese ersetzt, um einen chimären bivalenten Antikörper zu erzeugen, der eine Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für einen Htk-Liganden und eine weitere Antigen-kombinierende Stelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder Hybridantikörper können auch in vitro hergestellt werden, und zwar unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel umfassen. Beispielsweise können Immunotoxine unter Anwendung einer Disulfidaustauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele geeigneter Reagenzien zu diesem Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
Für Diagnoseanwendungen werden die Antikörper der Erfindung typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein. Die nachweisbare Gruppierung kann eine beliebige sein, die fähig ist, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Zum Beispiel kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵S; eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; oder ein Enzym, wie z.B. Alkalische Phosphatase, Beta-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase, sein.
Es kann jegliches Verfahren auf dem Gebiet der Erfindung für das gesonderte Konjugieren des Antikörpers an die nachweisbare Gruppierung eingesetzt werden, einschließlich jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können in jedem bekannten Testverfahren eingesetzt werden, wie z.B. in kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwich-Tests und Immunopräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., S. 147-158 (1987).
Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards (der ein Htk-Ligand oder ein immunologisch reaktiver Abschnitt davon sein kann), mit dem Testprobenanalyten (Htk-Liganden) um die Bindung mit einer begrenzten Antikörpermenge zu konkurrieren. Die Menge an Htk-Ligand in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge an Standard, die an die Antikörper gebunden wird. Um die Ermittlung der gebundenen Menge an Standard zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenzreaktion unlöslich gemacht, sodass der Standard und Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, leicht von Standard und Analyt getrennt werden können, die ungebunden verbleiben.
Sandwich-Tests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, wobei jeder dazu fähig ist, an ein(en) anderen/s immunogenen Abschnitt oder Epitop des nachzuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwich-Test wird der Testprobenanalyt von einem ersten Antikörper gebunden, der an einem festen Träger immobilisiert ist, und danach bindet ein zweiter Antikörper an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung (direkter Sandwich-Test) markiert sein oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers gemessen werden, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist (indirekter Sandwich-Test). Beispielsweise ist ein Typ von Sandwich-Test ein ELISA-Test, wobei in diesem Fall die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist.
C. Humanisierte Antikörper
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt sind, die nicht-menschlich ist. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise einer variablen „Import"-Domäne entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern durchgeführt werden (Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1989); Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)), indem die Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durch die entsprechenden Nager-CDRs oder -CDR-Sequenzen ersetzt werden. Demgemäß sind derartige „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly, siehe oben), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies ersetzt worden ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, bei denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagerantikörpern ersetzt sind.
Es ist wichtig, dass Antikörper mit Beibehaltung hoher Affinität für das Antigen und anderer vorteilhafter biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper nach einem bevorzugten Verfahren durch einen Prozess der Analyse der elterlichen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Anwendung dreidimensionaler Modelle der elterlichen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung geläufig. Es sind Computerprogramme verfügbar, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen gewählter Kandidat-Immunglobulinsequenzen illustrieren und darstellen. Die Prüfung dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der Funktion der Kandidat-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidat-Immunglobulins beeinflussen, sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste aus der Konsensus- und Importsequenz gewählt und kombiniert werden, sodass die gewünschte Antikörpereigenschaft, wie z.B. erhöhte Affinität für das/die Zielantigen(e), erzielt wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und sehr wesentlich an der Beeinflussung der Antigenbindung beteiligt. Für weitere Einzelheiten siehe WO 92/22653, veröffentlicht am 23. Dezember 1992.
D. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper sind monoklonale, vorzugsweise menschliche oder humanisierte, Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. Im vorliegenden Fall ist eine der Bindungsspezifitäten für einen Htk-Liganden, die andere ist für ein beliebiges anderes Antigen und vorzugsweise für einen Rezeptor oder eine Rezeptoruntereinheit. Beispielweise liegen bispezifische Antikörper, die einen Htk-Rezeptor und Htk-Liganden spezifisch binden, im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Herkömmlicherweise basiert die rekombinante Produktion bispezifischer Antikörper auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die beiden Schwerketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature 305, 537-539 (1983)). Wegen der zufälligen Zusammenstellung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch von 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch affinitätschromatographische Schritte durchgeführt wird, ist ziemlich mühsam, und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Verfahren sind in der am 13. Mai 1993 veröffentlichten WO 93/08829 und in Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991), offenbart.
Nach einem anderen und bevorzugteren Verfahren werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-kombinierenden Stellen) an konstante Immunglobulindomänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Abschnitt der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es ist bevorzugt, dass die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), die die zur Leichtkettenbindung benötigte Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für diese Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, falls erwünscht, für die Immunglobulin-Leichtketten kodieren, werden in gesonderte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus cotransfiziert. Dies sorgt für eine hohe Flexibilität bei der Einstellung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente bei Ausführungsformen, wo ungleiche Verhältnisse der bei der Konstruktion verwendeten drei Polypeptidketten die optimalen Ausbeuten bereitstellen. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen in hohen Ausbeuten resultiert oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Relevanz sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes sind die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar im anderen Arm (der eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) zusammengesetzt. Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für eine einfache Art und Weise der Trennung sorgt. Dieser Ansatz ist in der am 3. März 1994 veröffentlichten WO 94/04690 offenbart. Für weitere Einzelheiten der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
E. Heterokonjugat-Antikörper
Heterokonjugat-Antikörper liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper sind aus zwei kovalent verbundenen Antikörpern zusammengesetzt. Derartige Antikörper sind beispielsweise vorgeschlagen worden, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen (US-Patent Nr. 4.676.980) und zur Behandlung von HIV-Infektion (WO 91/00360, WO 92/200373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Anwendung eines beliebigen Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980 gemeinsam mit einer Reihe von Vernetzungstechniken offenbart.
5. Verwendungen für Htk-Liganden-Antikörper
Htk-Antikörper können bei gewissen therapeutischen Indikationen zweckdienlich sein, um die Aktivität des Htk-Liganden zu blockieren (z.B. bei der Mammakarzinogenese).
Therapeutische Htk-Liganden-Antikörper-Formulierungen und Art und Weisen der Verabreichung werden jenen ähnlich sein, die oben für den Htk-Liganden beschrieben sind. Eine typische Tagesdosis des Antikörpers kann von etwa 1 μg/kg bis zu 5 mg/kg oder mehr reichen, und zwar in Abhängigkeit von den oben für die Htk-Liganden-Verabreichung erwähnten Faktoren.
Htk-Liganden-Antikörper können außerdem in diagnostischen Tests für den Htk-Liganden zweckdienlich sein, z.B. beim Nachweis seiner Expression in speziellen Zellen, Geweben oder im Serum. Die Antikörper werden in derselben Weise wie der oben beschriebene Htk-Ligand markiert und/oder werden an einer unlöslichen Matrix immobilisiert. Htk-Liganden-Antikörper sind außerdem zur Affinitätsreinigung des Htk-Liganden aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen zweckdienlich. Htk-Liganden-Antikörper, die nicht nachweisbar mit anderen Proteinen kreuzreagieren, können verwendet werden, um den Htk-Liganden frei von diesen anderen bekannten Proteinen zu reinigen. Geeignete Diagnosetests für den Htk-Liganden und seine Antikörper sind oben beschrieben.
III. Experimente
Nachfolgend sind Beispiele spezieller Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung angeführt. Die Beispiele werden ausschließlich zu illustrativen Zwecken bereitgestellt und beabsichtigen nicht, den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Alle hierin oben oder unten zitierten Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen sind hiermit in vollem Umfang durch Verweis aufgenommen.
Beispiel 1
Herstellung eines löslichen Htk-Rezeptor-Fc-Fusionsproteins zur Identifizierung eines Htk-Liganden
Um den Htk-Liganden zu identifizieren und letztendlich zu klonieren, wird ein Fusionsprotein konstruiert, das aus der extrazellulären Domäne (ECD) des Htk-Rezeptors, fusioniert an menschliches IgG₁-Fc, besteht. Siehe Bennett et al. (siehe oben) über Techniken zur Herstellung des Fusionsproteins.
Die Htk-Rezeptor-Fc-Fusion wird verwendet, um eine Serie von Nierenzelllinien auf ihre Kapazität zu screenen, die extrazelluläre Domäne des Htk-Rezeptors zu screenen, und zwar unter Anwendung der früher beschriebenen FACS-Analyse. Siehe Urdal et al., J. Biol. Chem. 263, 2870-2877 (1988); und Gearing et al., EMBO J. 8, 3667-3676 (1989). Jegliche Zelllinie, die das Fusionsprotein spezifisch bindet, zeigt eine membrangebundene oder membranassoziierte Quelle des Htk-Liganden an. Das Screening von etwa 15 Nierenzelllinien resultiert in der Entdeckung einer spezifischen Bindung an eine SV40MES 13 genannte murine Nieren-Mesangiumzelllinie. Es wird nachgewiesen, dass die SV40MES-13-Zelllinie für Htk-Fc-Bindung und nicht für andere Fc-Fusionsproteine positiv ist.
Bindungskonkurrenz-Untersuchungen werden wie folgt durchgeführt. SV40MES-13-Zellen (5 × 10⁶ Zellen pro Napf) werden auf Steady-state-Bindung von ¹²⁵I-Htk-Fc in Gegenwart variierender Mengen an unmarkiertem Htk-Fc getestet. Die Zellen werden mit 1 nM oder 0,2 nM ¹²⁵I-Htk-Fc und verschiedenen Konzentrationen von unmarkiertem Htk-Fc (10 pM – 1 μM) 2 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Zellen und ungebundenes ¹²⁵I-markiertes Htk-Fc werden mittels Zentrifugation durch ein Saccharose-Polster wie vorher in Lee et al., J. Biol. Chem. 267, 16283-16287 (1992), beschrieben getrennt. Die Bindungsdaten werden ermittelt, um die Affinität und Anzahl an Stellen pro Zelle wie in Munson und Rodbard, Anal. Biochem. 107, 220-239 (1980), beschrieben zu ermitteln. Htk-Fc-Fusionsprotein wird mittels Lactoperoxidase-Verfahren wie in Urdal et al., J. Biol. Chem. 263, 2870-2877 (1988), beschrieben iodiert. Die K_d für die Fusionsproteinbindung an SV40MES 13 beträgt 3 nM mit ungefähr 6.500 Stellen pro Zelle (5A). Konditioniertes Medium aus der SV40MES-13-Zelllinie ist unfähig, die Tyrosinautophosphorylierung des Htk-Rezeptors zu aktivieren, was das Konzept eines membrangebundenen Liganden erhärtet.
Beispiel 2
Klonierung des murinen Htk-Liganden
Das Htk-Rezeptor-Fc-Protein wird zur Expressionsklonierung des Htk-Liganden aus einer vorübergehend in COS-7-Zellen transfizierten SV40MES-13-cDNA-Bibliothek wie folgt verwendet. Eine cDNA-Expressionsbibliothek aus der SV40MES-13-Zelllinie wird im Plasmidvektor pRK5B konstruiert (Holmes et al., Science 253, 1278-1280 (1991)). Fünfzig Pools von ungefähr je 2.000 cDNA werden anfänglich in COS-7-Zellen transfiziert und die Zellen auf die Fähigkeit zur Bindung von Htk-Rezeptor-Fc gescreent, und zwar unter Anwendung der in Gearing et al., EMBO J. 8, 3667-3676 (1989), beschriebenen „Slide"-Autoradiographie. Fünf positive Pools resultieren aus diesem anfänglichen Screening, und zwei dieser Pools werden schrittweise in aufeinander folgenden Screening-Umläufen unterteilt, bis einzelne Klone erlangt werden.
Bindungskonkurrenzexperimente werden unter Verwendung von einem der positiven Klone (Nr. 7) durchgeführt, der muriner pRK5B-Htk-Ligand genannt wird. Im Speziellen werden Bindungskonkurrenzkurven wie oben bezüglich SV40MES 13 beschrieben erzeugt, und zwar unter Verwendung von Monolayers von COS-7-Zellen (5 × 10⁵ Zellen pro Napf), die mit Klon Nr. 7 unter Verwendung des DEAE-Dextran-Transfektionsverfahrens (McMahan et al., EMBO J. 10, 2821-2830 (1991)) vorübergehend transfiziert sind.
Transfizierte COS-7-Zellen (COS-7t), die bei 2,5 × 10⁴ Zellen pro Bindungsstelle verwendet werden, werden auf Steady-state-Bindung von ¹²⁵I-Htk-Fc in Gegenwart variierender Mengen an unmarkiertem Htk-Fc wie oben beschrieben getestet. Die Htk-Fc-Bindung an transfizierte COS-7-Zellen zeigt eine K_d von 500 pm (5B), was anzeigt, dass Klon Nr. 7 der murine Htk-Ligand ist.
Die DNA-Sequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des murinen Htk-Liganden sind in 1A–B gezeigt. Das vorhergesagte Molekulargewicht des Proteins nach Signalpeptidabspaltung beträgt 34 kD mit einem geschätzten pl von 8,9.
Die von Klon Nr. 7 stammende Sequenz wird mittels Sequenzierung eines weiteren unabhängigen Klons von 4.700 bp bestätigt, die dieselbe kodierende Sequenz liefert. DNA-Sequenzierung wird unter Verwendung des ABI-Taq-Dye-Deoxy-Terminatorzyklus-Sequenzierungssets an einem automatischen DNA-Sequenzierer von Applied Biosystems, Modell 373A, durchgeführt. Beide Stränge einzelner Klone werden vollständig sequenziert.
Der Sequenzvergleich des Htk-Liganden und B61 (Bartley et al., siehe oben, und Holzman et al., siehe oben) zeigt eine Ähnlichkeit von 23% zwischen den Molekülen an. Jedoch enthält B61 keine Transmembrandomäne. Trotzdem legt das Ausmaß an Homologie nahe, dass der Htk-Ligand und B61 Elemente einer strukturell ähnlichen Familie umfassen könnten, die an verschiedene Elemente der EPH/ELK-Familie von Rezeptortyrosinkinasen binden.
Beispiel 3
Gewebeverteilung des Htk-Liganden
Northern-Blot-Analyse wird durchgeführt, um die Gegenwart des Htk-Liganden in adulten Mausgeweben, adulten menschlichen Geweben und menschlichen Fötalgeweben nachzuweisen. Im Speziellen werden Northern-Blots von Clonetech (Palo Alto, CA) erhalten, die 2 μg/Bahn PolyA-selektierte RNA aus adulten Mausgeweben, adulten menschlichen und menschlichen Fötalgeweben enthalten. Maus-Blots werden in 50% Formamid bei 42°C an ³²P-markierte murine Htk-Liganden-cDNA hybridisiert und unter stringenten Bedingungen gewaschen (letzter Waschvorgang: 0,2 × SSC, 0,2% SDS bei 60°C). Menschliche Gewebe-Blots werden in 35% Formamid bei 42°C hybridisiert und unter stringenten Bedingungen wie oben gewaschen.
Die Northern-Blot-Analyse von Maus- und Mensch-Htk-Liganden-Messenger-RNA in adulten und fötalen Geweben liefert nur ein Transkript bei ungefähr 5,2 kb, das eine ausgedehnte Gewebeexpression zeigt. Im Speziellen ist der Htk-Ligand in großen Mengen in adulter/m Lunge, Gehirn, Herzen und Niere der Maus und in geringeren Mengen in Milz, Leber, Skelettmuskel und Hoden vorhanden. Der Ligand ist in menschlichem/r adultem/r Herzen, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, Pankreas, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm und Dickdarm vorhanden, ist jedoch mittels Northern-Analyse in Peripherblutleukozyten nicht nachweisbar. Schließlich ist das Transkript in den höchsten Mengen in menschlichen fötalen Gehirn-, Lungen- und Nierengeweben mit niedrigeren nachweisbaren Mengen in menschlichem fötalem Lebergewebe nachweisbar.
In-situ-Hybridisierungen werden ebenfalls durchgeführt, um Htk-Liganden-DNA-Expression nachzuweisen. Mausembryos (embryonaler Tag 1) oder Gehirne aus dem postnatalen Tag Eins oder adulter Mäuse werden wie folgt für die In-situ-Hybridisierung präpariert. Frisch sezierte Gehirne oder Embryos, fixiert in 4% Formaldehyd, werden eingefroren und mit einem Kryostaten geschnitten. Schnitte werden auf Objektträgern luftgetrocknet und bei –70°C gelagert. Die Hybridisierung wird mit ³²P-markierten Riboproben mit einer Modifizierung der veröffentlichten Verfahren (Phillips et al., Science 250, 290-294 (1990)) durchgeführt. Sense- (Kontrolle) und Antisense-cRNA-Sonden, die den Nucleotiden 1597 bis 2198 der murinen Htk-Liganden-DNA-Sequenz aus 1A–B entsprechen, werden zur Hybridisierung eingesetzt.
Am Tag der Hybridisierung werden die Schnitte auf Raumtemperatur gebracht, 10-30 Minuten lang in 4% Formaldehyd mit der ohne Zugabe von 1% Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphat (pH 7,2) fixiert, gespült und in Hybridisierungspuffer 1-3 Stunden lang bei 42°C inkubiert. Der Hybridisierungspuffer besteht aus 50% Formamid, 0,1 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 × Denhard-Lösung, 10% Dextransulfat, 10 mM DTT. Die Sonden werden in Gegenwart von Träger-RNA 3 Minuten lang auf 95°C erhitzt, worauf sie sofort auf 4°C abgekühlt werden. Die Sonde wird dann dem Hybridisierungspuffer auf jeden Objektträger in einer Endkonzentration von 6,5 × 10⁶ cpm/ml zugegeben und bei 55°C über Nacht hybridisieren gelassen. Nach der Hybridisierung werden die Schnitte wie folgt behandelt: 2 Waschungen in 2 × SSC, 30 Minuten Inkubation in RNAse A (20 μg/ml), 2 Waschungen in 2 × SSC, 1 Stunde Inkubation bei 55°C in 0,1 × SSC, 2 Waschungen in 0,5 × SSC, Entwässerung in einer Konzentrationsreihe von Ethanollösungen (60%, 75% und 85% von 0,3 M Ammoniumacetat enthaltendem Ethanol, gefolgt von 90% und 100% Ethanol) und Lufttrocknung bei Raumtemperatur. Die Schnitte werden dann gegenüber einem Planfilm (Beta-Max, Amersham) für einen Zeitraum von 1 bis 3 Tagen ausgesetzt, worauf sie in Emulsion (Amersham LM-1) getaucht und bei 4°C 3 bis 8 Wochen lang ausgesetzt werden. Film- und Emulsions-Autoradiogramme werden durch Behandlung mit standardmäßigem fotografischem Entwickler und Fixierer entwickelt.
Die Planfilm-Autoradiogramme werden sowohl durch visuelle Untersuchung auf einer Lichtbox und durch ein Stereomikroskop betrachtet. Die Emulsions-Autoradiogramme werden unter dem Hellfeld- sowie Dunkelfeld-Mikroskop betrachtet. Die Betrachtung der Autoradiogramme offenbart ein Hybridisierungssignal in mehreren Regionen der mit der Antisense-Sonde hybridisierten Schnitte, die auf den mit der Sense-Sonde hybridisierten Kontrollschnitten nicht beobachtet wurden. Diese Regionen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, mehrere Regionen des adulten Vorderhirns, einschließlich der CA1-Region des Hippocampus, der Hirnrinde (einschließlich birnenförmiger und entonasaler Cortices) und des schwanzförmigen Putamens. Eine markante Hybridisierung wird auch im Vorderhirn beobachtet. Die Hybridisierung fehlt oder ist weniger intensiv bei anderen Hirnstrukturen, einschließlich dem Septum, Bereichen der weißen Hirnsubstanz wie z.B. dem Corpus callosum und zahlreichen dienzephalen, mesenzephalen und myelenzephalen Regionen. Im Embryo wird eine starke Hybridisierung in der sich entwickelnden Lunge, im Verdauungstrakt, in Leber, Niere, Speicheldrüse, Wirbel, Muskel, Riechepithel, Epithel des sich entwickelnden Ohrs, in Dorsalwurzel- sowie Trigeminus-Ganglien, Meninx des Gehirns sowie Rückenmarks und in zahlreichen Regionen des Gehirns sowie Rückenmarks beobachtet (ist jedoch nicht darauf beschränkt). Im sich entwickelnden Gehirn ist die Expression besonders intensiv im sich entwickelnden Vorderhirn, jedoch wurde eine signifikante Hybridisierung in allen Hauptunterteilungen beobachtet (Telenzephalon, Dienzephalon, Mesenzephalon, Metenzephalon und Myelenzephalon).
Beispiel 4
Induktion der Tyrosinphosphorylierung des Htk-Rezeptors durch den Htk-Liganden
Um zu ermitteln, ob der Htk-Ligand die Htk-Phosphorylierung stimuliert, und um weiter zu bestätigen, dass der oben beschriebene Klon Nr. 7 tatsächlich für einen Liganden des Htk-Rezeptors kodiert, wurde das folgende Experiment durchgeführt.
NIH-3T3-Zellen werden mit dem Htk-Rezeptor voller Länge stabil transfiziert. Ein Cla1-Xba1-cDNA-Fragment von 4038 Basenpaaren, der 32 bp Linkersequenz, 37 bp des pBluescript-Polylinkers (Stratagene La Jolla, CA) und die gesamte Htk-Rezeptor-cDNA von 3969 bp enthält, wird in den Expressionsvektor pRIS (Genentech, Inc.) unter der Kontrolle des Rous-Sarcoma-Virus-LTR-Promotors subkloniert. In mit 10% FCS ergänztem Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) hoher Glucosekonzentration gehaltene NIH3T3-Zellen werden mit dem pRIS-Htk-Rezeptor und pNeo (einem Vektor auf Basis von SV40, der den Neomycinresistenzmarker enthält) mittels Calciumphosphatverfahren wie von Gorman et al., in: DNA Prot. Engineer. Tech. 2, 3-10 (1990), beschrieben cotransfiziert. Gegen Neomycin resistente Kolonien werden 48 Stunden nach Transfektion mit 400 μg/ml Geneticin (Gibco/BRL) selektiert. Vierzehn Tage später werden einzelne resistente Kolonien isoliert, vermehrt und mittels Durchflusszytometrie auf Htk-Rezeptor-Expression unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-Antiserum analysiert. Die Spezifität der Reaktion wird mittels Mock-transfizierter 3T3-Zellen nachgewiesen.
Dann werden eine Million transfizierte 3T3-Zellen (3T3-T) oder nicht transfizierte 3T3-Zellen (3T3) gemeinsam mit 1 × 10⁶ vorübergehend Htk-Liganden-transfizierten COS-7-Zellen (transfiziert mit obigem Klon Nr. 7 unter Anwendung des oben be schriebenen DEAE-Dextran-Verfahrens), Mock-transfizierten COS-7-Zellen oder 3 × 10⁶ SV40MES-13-Zellen bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Transfizierte und Mock-transfizierte NIH-3T3-Zellen werden außerdem mit monoklonalem, mittels Hybridom Anti-HpTK 5 (ATCC-Zugangsnummer HB 11.583) produziertem Anti-Mensch-Htk-Rezeptor-Antikörper (IC2-C2) inkubiert, der bekanntermaßen die Autophosphorylierung des Htk-Rezeptors induziert.
Die Zellen werden in NP-40-Lysepuffer (1% NP-40, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 2 mM DMSF, 2,5 mM Na₃VO₄) lysiert und mit polyklonalem Anti-Mensch-Htk-Kaninchen-Serum immunpräzipitiert, das wie folgt hergestellt wurde. Polyklonale Antikörper werden in Kaninchen („New Zealand White rabbits") gegen das in Bennett et al. (siehe oben) beschriebene lösliche Htk-Rezeptor-Fc-Fusionsprotein erzeugt. 4 μg des Proteins in 100 μl PBS werden mit 100 μl Freundschem Adjuvans (komplettes Adjuvans für die Primärinjektion und inkomplettes Adjuvans für alle Boosts) emulgiert. Für die Primärimmunisierung und den ersten Boost wird das Protein direkt in die Kniekehlenlymphknoten injiziert (Sigel et al., Methods Enzymol. 93, 3-12 (1983)). Für weitere Boosts wird das Protein in subkutane und intramuskuläre Stellen injiziert. 1,3 μg Protein pro kg Körpergewicht werden alle 3 Wochen injiziert, wobei 1 und 2 Wochen nach jedem Boost Blut entnommen wird. Die Spezifität des Antikörpers wird mittels durchflusszytometrischer Analyse von mit Htk-Rezeptor voller Länge oder mit dem Vektor alleine transfizierten NIH3T3-Zellen nachgewiesen, wobei eine Verdünnung von 1:200 des Präimmunserums oder Anti-Htk-Rezeptor-IgG-Fc-Serums verwendet wird.
Immunopräzipitierte Zellen werden an 4-12%igen SDS-PAGE-Gradientengelen analysiert. Die Gele werden dann auf Nitrozellulosefilter übertragen und unter Verwendung des Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers 4G10 (UBI, Lake Placid, New York) dem Western-Blotting unterzogen. Mit Klon Nr. 7 transfizierte COS-7-Zellen sowie SV40MES-13-Zellen und IC2-C2-Antikörper induzieren die Autophosphorylierung des Htk-Rezeptors bei gemeinsamer Inkubation, was bestätigt, dass der Htk-Ligand die Htk-Phosphorylierung stimuliert und dass Klon Nr. 7 für einen Htk-Liganden kodiert.
Beispiel 5
Klonierung des menschlichen Htk-Liganden
Um den menschlichen Htk-Liganden zu klonieren, wird eine menschliche Fötalhirn-cDNA-Bibliothek unter Anwendung der Techniken hergestellt, die allgemein in Sambrook et al. (siehe oben) beschrieben sind. Eine menschliche Fötallungen-Bibliothek wird von Clonetech (Palo Alto, CA) bezogen. Diese Bibliotheken werden unter Anwendung der in Sambrook et al. (siehe oben) beschriebenen Techniken gescreent, und zwar mit einem Fragment des 5'-Endes der Maus-cDNA als Sonde (d.h. Reste 515 bis 2.312 aus 1A–B). Es zeigt sich, dass das gesamte menschliche Htk-Liganden-Gen in einem einzigen, aus der menschlichen Fötalhirn-Bibliothek isolierten Klon vorliegt. Das Plasmid, das die für den menschlichen Htk-Liganden kodierende Nucleinsäure aufweist, ist bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 24. Juni 1994 unter der Zugangsnummer 75.820 hinterlegt worden. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des menschlichen Htk-Liganden sind in 2 gezeigt. Die Sequenz kodiert für ein Protein, das nach Abspaltung des Signalpeptids ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 34 kD aufweist. Die murinen und menschlichen Liganden zweigen 96% Sequenzidentität auf der Aminosäureebene, was ein hohes Ausmaß an Konservierung unter den Spezies demonstriert. Dies steht im Einklang mit der Homologie zwischen dem menschlichen Htk-Rezeptor und seinem Maus-Homolog Myk-1, die auf der Aminosäureebene zu 91% identisch sind.
Hinterlegungen
Die folgenden Kulturen sind bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt worden:
Diese Hinterlegungen wurden unter den Bestimmungen des „Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder" (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies garantiert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur der Hinterlegung für 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung. Die Hinterlegung wird von ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Verfügung gestellt und unterliegt einer Vereinbarung zwischen Genentech Inc. und ATCC, was die ständige und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Kulturen für die Öffentlichkeit bei Erteilung des entsprechenden US-Patents oder bei Offenlegung jeglicher US- oder ausländischen Patentanmeldung gewährleistet, was auch immer als erstes eintrifft, und die Verfügbarkeit von Kulturen für jemanden vom US-Bevollmächtigten für Patente und Warenzeichen bestimmten gewährleistet, der dazu gemäß 35 USC § 122 und den dazugehörigen Regeln des Bevollmächtigten dazu (einschließlich 37 CFR § 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) berechtigt ist.
Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, dass die Kulturen, falls sie bei Kultivierung unter geeigneten Bedingungen absterben, verloren gehen oder zerstört werden sollte, bei Benachrichtigung unverzüglich durch eine lebensfähige Probe derselben Kultur ersetzt werden. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme ist nicht als Erlaubnis auszulegen, die Erfindung entgegen der unter der Amtsgewalt einer beliebigen Regierung gemäß ihrer Patentrechte gewährten Rechte praktisch umzusetzen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Proteinmolekül, das sich an den Htk-Rezeptor bindet und das Phosphorylierung des Htk-Rezeptors induziert, wobei das Molekül eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der aus (a) einer Aminosäuresequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität mit der Sequenz für reifen murinen Htk-Liganden, die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigt ist; (b) einer Aminosäuresequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität mit der Sequenz für reifen menschlichen Htk-Liganden, die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigt ist; und (c) der Sequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder Seq.-ID Nr. 4 mit einer einzelnen bevorzugten konservativen Aminosäuresubstitution, wie in Tabelle 1 definiert, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Isoliertes Proteinmolekül nach Anspruch 1, worin das Molekül die Aminosäuresequenz für reifen murinen Htk-Liganden der Seq.-ID Nr. 2 oder die Aminosäuresequenz für reifen menschlichen Htk-Liganden der Seq.-ID Nr. 4 umfasst.
Isolierter löslicher Htk-Ligand, der sich an den Htk-Rezeptor bindet und eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der aus (a) einer Aminosäuresequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität mit der Sequenz für reifen löslichen murinen Htk-Liganden, worin die Aminosäuresequenz für reifen löslichen murinen Htk-Liganden die Aminosäuren 28-227 der Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (b) einer Aminosäuresequenz mit zumindest 80% Sequenzidentität mit der Sequenz für reifen löslichen menschlichen Htk-Liganden, worin die Aminosäuresequenz für reifen löslichen menschlichen Htk-Liganden die Aminosäuren 25-224 der Seq.-ID Nr. 4 umfasst; und (c) den Sequenzen mit den Aminosäuren 28-227 der Seq.-ID Nr. 2 oder den Aminosäuren 25-224 der Seq.-ID Nr. 4 mit einer einzelnen bevorzugten konservativen Aminosäuresubstitution, wie in Tabelle 1 definiert, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Löslicher Htk-Ligand nach Anspruch 3 mit der Aminosäuresequenz für reifen löslichen murinen Htk-Liganden mit den Aminosäuren 28-227 der Seq.-ID Nr. 2 oder für reifen löslichen menschlichen Htk-Liganden mit den Aminosäuren 25-224 der Seq.-ID Nr. 4.
Chimäres Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz, die für den löslichen Htk-Liganden nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 kodiert, fusioniert an eine Immunglobulinsequenz umfasst.
Chimäres Polypeptid nach Anspruch 5, umfassend eine Fusion einer Htk-Liganden-Extrazellulärdomänen-Sequenz an eine Immunglobulin-Konstantdomänen-Sequenz.
Chimäres Polypeptid nach Anspruch 6, worin die Konstantdomänen-Sequenz jene einer Immunglobulinschwerkette ist.
Chimäres Polypeptid, das das isolierte Proteinmolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche, fusioniert an eine Epitop-Tag-Polypeptidsequenz, umfasst.
Zusammensetzung, umfassend das Proteinmolekül nach einem der vorangehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Proteinmolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10, das für die Aminosäuresequenz für reifen murinen Htk-Liganden der Seq.-ID Nr. 2 oder die Aminosäuresequenz für reifen menschlichen Htk-Liganden der Seq.-ID Nr. 4 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10 mit einer Nucleinsäuresequenz, die aus der aus (a) den Resten 242 bis 1168 (Grenzen eingeschlossen) der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Nucleinsäuresequenz oder den Resten 104 bis 1030 (Grenzen eingeschlossen) der in Seq.-ID Nr. 3 gezeigten Nucleinsäuresequenz; (b) einer Sequenz, die einer der Sequenzen aus (a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entspricht; und (c) einer Sequenz, die mit einer Sequenz, die komplementär zur Sequenz aus (a) oder (b) ist, unter stringenten Bedingungen hybridisiert und die für ein Proteinmolekül, das Phosphorylierung des Htk-Rezeptors induziert, kodiert, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10, das für die Aminosäuresequenz für reifen löslichen murinen Htk-Liganden mit den Aminosäuren 28-227 der Seq.-ID Nr. 2 oder für die Aminosäuresequenz für reifen löslichen menschlichen Htk-Liganden mit den Aminosäuren 25-224 der Seq.-ID Nr. 4 kodiert.
Vektor, der das Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 10 bis 13 umfasst, operabel an Kontrollsequenzen gebunden, die durch eine mit dem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, die den Vektor nach Anspruch 14 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Proteinmoleküls, das Phosphorylierung des Htk-Rezeptors induziert, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die transfiziert ist, um das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 15 zu exprimieren, und das Gewinnen dieses Proteinmoleküls aus der Wirtszellkultur.
Verfahren zur Aktivierung "in vitro" einer Tyrosinkinasendomäne eines Hepatomtransmembrankinase-Rezeptors (Htk-Rezeptor), umfassend das Kontaktieren einer extrazellulären Domäne des Htk-Rezeptors mit dem Htk-Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Monoklonaler Antikörper, der sich an den Htk-Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bindet.