DE69033983T2

DE69033983T2 - Verwendung von funktionellen Derivaten des Interzellulär-Adhäsions-Moleküls ICAM-1 in einer Antivirus-Therapie

Info

Publication number: DE69033983T2
Application number: DE69033983T
Authority: DE
Inventors: Timothy Alan Springer
Original assignee: Immune Disease Institute Inc
Current assignee: Immune Disease Institute Inc
Priority date: 1989-03-16
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 2003-03-20
Anticipated expiration: 2010-03-09
Also published as: DK0391088T3; CA2012125A1; DE69029528D1; GR3022846T3; CA2012125C; EP0745852B1; JP3166854B2; ES2097748T3; NZ232920A; DE69033983D1; EP0391088B1; KR0178024B1; HU220235B; EP0745852A1; AU5129490A; KR900013984A; EP0391088A3; EP0391088A2; DE69029528T2; DK0745852T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft funktionelle Domänen und Fragmente des interzellulären Adhäsionsmoleküls ICAM-1. Derartige funktionelle Domänen und Fragmente können bei der Behandlung viraler und insbesondere rhinoviraler Erkrankungen verwendet werden.

Stand der Technik

I. Das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 und die zelluläre Adhäsion

Das interzelluläre Adhäsionsmolekül ICAM-1 wurde zuerst nach dem Verfahren von R. Rothlein et al. (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)) identifiziert und teilweise charakterisiert. ICAM-1, dessen Herstellung, Reinigung und charakteristische Eigenschaften werden in den europäischen Patentanmeldungen 88 106 901.7 und 89 117 620.8 offenbart. Die europäische Patentanmeldung EP 0 289 949 A2 ist auf ICAM-1 und dessen Verwendung für die Diagnose und Lokalisierung von Tumorzellen und entzündlichen Zellen gerichtet.
ICAM-1 wurde zunächst als ein Molekül erkannt, das an dem Prozess der zellulären Adhäsion zwischen endothelialen Zellen und Leukozyten beteiligt ist. Zelluläre Adhäsion ist ein Prozess, durch den Leukozyten sich an zelluläre Substrate, wie endotheliale Zellen, anheften, um aus dem Kreislauf zu Stellen einer stattfindenden Entzündung zu wandern und den Wirt in geeigneter Weise gegen fremde Eindringlinge, wie Bakterien oder Viren, zu verteidigen. Ein hervorragender Überblick über das Verteidigungssystem wird von H. W. Eisen (in: Microbiology, 3. Auflg., Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), S. 290-295 und 381418) vorgelegt.
Eines der Moleküle auf der Oberfläche der endothelialen Zellen, das an dem Adhäsionsprozess teilnimmt, ist ICAM-1. Von diesem Molekül ist gezeigt worden, dass es die Adhäsion durch Bindung an Moleküle der CD-18-Familie von Glycoproteinen vermittelt, die auf den Zelloberflächen von Leukozyten vorhanden sind (F. Sanchez- Madrid et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983); G. D. Keizer et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985)). Diese Glycoproteinfamilie ist aus Heterodimeren mit einer alpha-Kette und einer beta-Kette zusammengesetzt. Die alpha-Ketten der einzelnen Antigene unterscheiden sich zwar von einander; es wurde jedoch festgestellt, dass die beta-Ketten hochgradig konserviert sind (F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)). Es wurde festgestellt, dass die beta-Kette der Glycoproteinfamifie (gelegentlich als "CD-18" bezeichnet) ein Molekulargewicht von 95 kD hat, während festgestellt wurde, dass die alpha-Ketten von 150 kD bis 180 kD variieren (T. Springer, Fed. Proc. 44: 2660-2663 (1985)). Die alpha-Untereinheiten der Membranproteine weisen zwar keine ausgeprägte Homologie auf, wie sie die beta-Untereinheiten aufweisen; eine genaue Analyse der alpha-Untereinheiten der Glycoproteine hat jedoch gezeigt, dass es erhebliche Übereinstimmungen zwischen ihnen gibt. Es gibt drei Hauptmitglieder der CD-18-Familie: p150,95, MAC-1 und LFA-1. MAC-1 ist ein Heterodimer, das sich in Makrophagen, Granulozyten und großen granulären Lymphozyten findet. LFA-1 ist ein Heterodimer, das auf den meisten Lymphozyten gefunden wird (T. A. Springer et al., Immnunol. Rev. 68: 111-135 (1982)). P150,95 weist eine Gewebeverteilung ähnlich wie MAC-1 auf und spielt ebenfalls eine Rolle bei der zellulären Adhäsion (G. Keizer et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985)). Übersichtsartikel über die Ähnlichkeiten zwischen den alpha- und beta-Untereinheiten von LFA-1-verwandten Glycoproteinen werden von F. Sanchez-Madrid et al. (J. Exper. Med. 158: 586-602 (1983); J. Exper. Med. 158: 1785- 1803 (1983)) vorgelegt.

II. Der zelluläre Rezeptor für humanes Rhinovirus

Abraham et al. (J. Virol. 51: 340-345 (1984)) haben entdeckt, dass der Hauptanteil von zufällig ausgewählten humanen Rhinovirus ("HRV")-Serotypen imstande ist, an den gleichen zellulären Rezeptor zu binden. Ein monoklonaler Antikörper wurde anschließend von Colonno et al. (Colonno et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 10 (Teil D):266 (1986); Colonno et al., J. Virol. 57: 7-12 (1986); Colonno et al., europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 169 146) entwickelt, der imstande war, die Anheftung von HRV des Hauptserotyps an die Oberflächen von endothelialen Zellen zu blockieren. Das endotheliale Zellrezeptorprotein, das von diesem Antikörper erkannt wurde, wurde isoliert, und es wurde festgestellt, dass es sich um ein Protein von 90 kD handelt (Tomassini et al., J. Virol. 58: 290-295 (1986)).

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von funktionellen Derivaten des intrazellulären Adhäsionsmoleküls 1 (ICAM-1) in der antiviralen Therapie.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Diagnose des Vorhandenseins einer viralen Infektion bereit, wobei das Verfahren umfasst:
(a) Inkubation einer biologischen Probe, die im Verdacht steht, ein Virus zu enthalten, mit einem nachweisbar markierten funktionellen ICAM-1-Derivat;
(b) Bestimmung, ob ein Anteil des nachweisbar markierten funktionellen ICAM-1-Derivats an das Virus gebunden worden ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Verhinderung einer viralen Infektion bereit, das es umfasst, einen Empfänger mit einer Vakzinzusammensetzung zu versorgen, wobei die Zusammensetzung ein Virus enthält, das an ein funktionelles Derivat von ICAM-1 gebunden ist.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von ICAM-1-cDNA. Das erste ATG befindet sich in Position 58. Translatierte Sequenzen, die tryptischen Peptiden von ICAM-1 entsprechen, sind unterstrichen. Das angenommene hydrophobe Signalpeptid und Transmembransequenzen haben eine fette Unterstreichung. N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind eingerahmt. Das Polyadenylierungssignal AATAAA in Position in 2976 weist oben einen Strich auf. Die gezeigte Sequenz gilt für den HL-60-cDNA-Klon. Die endotheliale Zell-cDNA wurde über den größten Teil ihrer Länge sequenziert und zeigte nur geringfügige Abweichungen.
Fig. 2 zeigt die homologen ICAM-1-Domänen und die Beziehung zur Immunglobulin- Supergenfamilie. (A) Ausrichtung von 5 homologen Domänen (D1-5). Zwei oder mehr identische Reste, die ausgerichtet sind, sind eingerahmt. Reste, die zwei- oder mehrfach in NCAM-Domänen konserviert, sind sowie Reste, die in Domänen der Sätze C2 und C1 konserviert sind, wurden im Hinblick auf die inneren Wiederholungen bei ICAM-1 ausgerichtet. Die Anordnung der vorhergesagten β-Stränge in der ICAM-1-Domäne ist mit Balken und Kleinbuchstaben über der Ausrichtung markiert, und die bekannte Anordnung von β-Strängen in Immunglobulin C-Domänen ist mit Balken und Großbuchstaben unterhalb der Ausrichtung markiert. Die Position der vermuteten Disulfidbrücke innerhalb der ICAM-1-Domänen ist durch S-S bezeichnet. (B-D) Ausrichtung der Proteindomänen, die homolog zu ICAM-1-Domänen sind; Proteine wurden zunächst durch Absuchen der NBRF-Datenbanken unter Verwendung des FASTP-Programms ausgerichtet. Die Proteinsequenzen sind MAG, NCAM, T-Zellrezeptor-α-Untereinheit V-Domäne, IgM-u-Kette und α-1-B-Glycoprotein.
Fig. 3 zeigt die Ausrichtung der aminoterminalen ICAM-Domänen.
Fig. 4 zeigt schematisch ein ICAM-1 mit der Position der Domänendeletionen.
Fig. 5 zeigt die Expression von ICAM-1-Deletionsmutanten in COS-Zellen. COS- Zellen wurden durch Durchflusszytofluorometrie, gefolgt von indirekter Immunfluoreszenz mit RR1/1, analysiert.
Fig. 6 zeigt die Expression von ICAM-1-Deletionsmutanten in COS-Zellen. Die COS- Zellen wurden durch Durchflusszytofluorometrie, gefolgt von indirekter Immunfluoreszenz mit den mAb RR1/1 (ausgefüllter Balken), R6.5 (nicht ausgefüllter Balken), LB-2 (punktierter Balken) oder CL203 (schraffierter Balken), analysiert. Die spezifische Fluoreszenzintensität wurde bestimmt, wobei die Hintergrundbindung an scheintransfizierte Zelten abgezogen wurde.
Fig. 7 zeigt die Bindung von ICAM-1-Deletionsmutanten an LFA-1 und HRV14. COS- Zellen, die ICAM-1-Deletionsmutanten exprimierten, wurden auf die Haftung an Kunststoff-gebundenes LFA-1 und auf die Bindung an ³&sup5;S-Met-markiertes HRV14 untersucht. Die Standardabweichung für mehrfache Versuche (2-4) ist angegeben.
Fig. 8 zeigt die Bindung von HRV14 an ICAM-1 in Abwesenheit von zweiwertigen Kationen. Die Bindung von ³&sup5;S-HRV14 an zunehmende Konzentrationen von Kunststoff-gebundenem ICAM-1 erfolgte in HRV-Puffer mit 10 mM Mg&spplus;&spplus; (leere Kreise) oder HRV-Puffer ohne zugegebenes Mg&spplus;&spplus;, jedoch mit 5 mM EDTA (leere Dreiecke). Die SKW3-Bindung erfolgte in HRV-Puffer mit 0,5 mM Mg&spplus;&spplus; (ausgefüllte Kreise) oder 5 mM EDTA (ausgefüllte Dreiecke).
Fig. 9 zeigt ein Modell der ICAM-1 D1 und D2-Tertiärstruktur: Lokalisierung von LFA- 1- und HRV-Bindungsstellen. Die grundlegende Tertiärstruktur einer konstanten Ig- Domäne (S. D. Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7734-7738 (1988)) wurde modifiziert, um die vorhergesagten β-Stränge (breite Pfeile) und β-Schleifen von ICAM-1 D1 und D2 aufzunehmen (D. E. Staunton et al., Nature 339: 61-64 (1989a)). Reste, die an der LFA-1- oder HRV14-Bindung beteiligt sind, sind bezeichnet. Die Wirkung ihrer entsprechenden Mutationen auf die LFA-1/HRV14-Bindung (x-fache Abnahme) ist bezeichnet (Konturzeichnung). Die Positionen der mit D2 N-verknüpften Oligosaccharide (leere Dreiecke) sind bezeichnet.
Fig. 10 zeigt, dass sICAM-1 die zytopathische Wirkung hemmt, die durch ein Rhinovirus der Hauptgruppe induziert wird.
Fig. 11 zeigt, dass gereinigtes sICAM-1 spezifisch den CPE, induziert durch Picornaviren, die den Rhinovirus-Hauptgruppen-Rezeptor nutzen, inhibiert.
Fig. 12 zeigt, dass gereinigtes sICAM-1 die Bindung von Rhinovirus-Virionen an Zellen hemmt.

Darstellung der bevorzugten Ausführungsformen

I. Charakteristische Eigenschaften von ICAM-1

ICAM-1 zeigt eine Molekufargewichtsheterogenität in verschiedenen Zelltypen mit einem Molekulargewicht von 97 kD auf Fibroblasten, 114 kD auf der myelomonozytischen Zelllinie U937 und 90 kD auf der B-lymphoblastoiden Zelle JY. Es wurde festgestellt, dass die ICAM-1-Biosynthese einen intrazellulären Vorläufer von ungefähr 73 kD beinhaltet. Die nicht N-glycosylierte Form, die aus der Tunicamycin-Behandlung, die die Glycosylierung inhibiert, resultiert, weist ein Molekulargewicht von 55 kD auf. ICAM-1 wurde als "CD 54" bezeichnet.
IGAM-1, isoliert aus Phorbolester stimulierten U937-Zellen oder aus Fibroblastenzellen ergibt ein identisches Hauptprodukt mit einem Molekulargewicht von 60 kD nach chemischer Deglycosylierung. Monoklonale ICAM-1-Antikörper beeinflussen die Adhäsion von Phytohämagglutininblasten an LFA-1-Mangelzelllinien. Die Vorbehandlung von Fibroblasten, nicht jedoch von Lymphozyten, mit monoklonalen Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 imstande sind, hemmt die Lymphozyt-Fibroblast-Adhäsion. Es wurde auch festgestellt, dass die Vorbehandlung von Lymphozyten, nicht jedoch von Fibroblasten, mit Antikörpern gegen LFA-1 die Lymphozyt- Fibroblast-Adhäsion hemmt.
ICAM-1 ist also der Bindungsligand des CD-18-Komplexes auf Leukozyten. Es kann auf Fibroblasten und endothelialen Zellen in vitro durch Entzündungsvermittler, wie IL-1, gamma-Interferon und Tumornekrosefaktor, in einem Zeitrahmen, der mit der lnfiltration von Lymphozyten in entzündliche Läsionen in vivo übereinstimmt, induziert werden (M. L. Dustin et al., J. Immunol. 137: 245-254, (1986); J. S. Prober et al., J. Immunol. 137: 1893-1896, (1986)). Ferner wird ICAM-1 auf nicht-hämatopoetischen Zellen, wie vaskulären endothelialen Zellen, thymischen epithelialen Zellen, anderen epithelialen Zellen und Fibroblasten und auf hämatopoetischen Zellen, wie Gewebemakrophagen, Mitogen-stimulierten T-Lymphozytblasten und germinalen Zentrum-B-Zellen und dendritischen Zellen in Mandeln, Lymphknoten und Peyer- Flecken exprimiert (M. L. Dustin et al., J. Immunol., 137: 245-254, (1986)).
ICAM-1 wird auf Keratinozyten in gutartigen entzündlichen Läsionen, wie allergischen Ekzemen, Lichen planus, Exanthemen, Urticaria und Erkrankungen mit Blasen exprimiert. Allergische Hautreaktionen, die durch Aufbringung eines Haptens, gegen das der Patient allergisch ist, auf die Haut hervorgerufen werden, zeigen ebenfalls eine starke ICAM-1-Expression auf den Keratinozyten. Andererseits zeigten toxische Pflaster auf der Haut keine ICAM-1-Expression auf den Keratinozyten.
ICAM-1 ist auf Keratinozyten aus Biopsien von Hautläsionen aus verschiedenen dermatologischen Störungen vorhanden, und die ICAM-1-Expression wird auf Läsionen aus allergischen Pflastertests induziert, während Keratinozyten aus toxischen Pflastertestläsionen kein ICAM-1 exprimierten.
Eine Hydrophobizitätsanalyse (J. Kyte et al., J. Molec. Biol. 157: 105-132 (1982)) von ICAM-1 deutet auf das Vorhandensein einer Signalsequenz mit 27 Resten hin. Die Zuordnung von +1 zu Glutamin stimmt damit überein, dass wir nicht imstande waren, die N-terminaie Sequenz von drei verschiedenen ICAM-1-Proteinpräparationen zu erhalten; Glutamin kann zu Pyroglutaminsäure cyclisieren, was zu einem blockierten N-Terminus führt. Die translatierte Sequenz von 1 bis 453 ist hauptsächlich hydrophil, gefolgt von einer 24 Reste umfassenden hydrophoben angenommenen Transmembrandomäne. Der Transmembrandomäne folgen unmittelbar mehrere geladene Reste, die in einer 27 Reste umfassenden angenommenen zytoplasmatischen Domäne enthalten sind.
Die vorhergesagte Größe der reifen Polypeptidkette beträgt 55 219 Dalton, in hervorragender Übereinstimmung mit der beobachteten Größe von 55 000 für deglycosyliertes ICAM-1 (M. L. Dustin et al., J. Immunol. 137: 245-254, (1986)). Acht N-verknüpfte Glycosylierungsstellen werden vorhergesagt. Das Fehlen von Asparagin in den tryptischen Peptidsequenzen von zwei dieser Stellen bestätigt deren Glycosylierung und deren extrazelluläre Orientierung. Unter Annahme von 2 500 Dalton pro Hochmannose-N-verknüpftem Kohlenhydrat wird eine Größe von 75 000 Dalton für die ICAM-1-Vorstufe vorhergesagt, verglichen mit der beobachteten Größe von 73 000 Dalton (M. L. Dustin et aL, J. Immunol. 137: 245-254, (1986)). Nach Umwandlung der Hochmannose zu komplexem Kohlenhydrat macht das reife ICAM-1- Glycoprotein 76 bis 114 kD aus, abhängig vom Zelltyp (M. L. Dustin et al., J. Immunol. 137: 245-254, (1986)). ICAM-1 ist also stark glycosyliert, ansonsten aber ein typisches integrales Membranprotein.
ICAM-1 ist also ein zelluläres Substrat, an das Lymphozyten sich anheften können, so dass die Lymphozyten an Stellen der Entzündung wandern und/oder verschiedene Effektorfunktionen, die zu dieser Entzündung beitragen, ausführen können. Derartige Funktionen umfassen die Bildung von Antikörper, Lyse von viral infizierten Zielzellen und dergl.

II. Antivirale funktionelle Derivate von ICAM-1

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den Befund, dass ICAM-1 der zelluläre Rezeptor betimmter Viren ist und daher erforderlich ist, damit das Virus an Humanzellen sich anheftet und diese infiziert (J. M. Greve et al., Cell 56: 839-847 (1989); D. E. Staunton et al., Cell 56: 849-853 (1989), wobei beide Zitate durch Verweis vollinhaltlich zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht werden). Speziell wurde festgestellt, dass Rhinoviren und insbesondere Rhinoviren des Hauptserotyps imstande sind, ihre Infektion durch ihr Vermögen zu vermitteln, an die ICAM-1-Moleküle, die auf Zelloberflächen vorhanden sind, zu binden.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung von funktionellen Derivaten von ICAM-1 zur Behandlung viraler Infektionen gerichtet. Da derartige Derivate imstande sind, mit dem ICAM-1 von endothelialen Zellen um die virale Anheftung zu konkurrieren, resultiert deren Verabreichung an ein Empfängerindividuum in der Adsorption des Virus und damit in einer Abnahme des Prozentsatzes von Viren, die sich an die Zellen eines infizierten Individuums anheften und diese infizieren.
Wie hier verwendet ist ein "funktionelles Derivat" von ICAM-1 eine Verbindung, die das Vermögen besitzt, von einem Virus erkannt und mit einem Virus assoziiert zu werden (d. h. das Virus zu binden, einen Komplex mit dem Virus zu bilden und dergl.). Zusätzlich zu derartiger biologischer Funktion weist ein funktionelles Derivat von ICAM-1 eine Struktur auf, die im wesentlichen ähnlich zu der Struktur einer "Variante", eines "Analogon", eines "chemischen Derivats" oder eines "Peptidomimetikums" von ICAM-1 ist. Von einem Molekül wird gesagt, dass es "im wesentlichen ähnlich" zu einem anderen Molekül ist, wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen haben oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen.
Ein "Fragment" eines Moleküls, wie ICAM-1, soll sich auf eine beliebige Polypeptiduntergruppe des Moleküls beziehen. Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind funktionelle Derivate von ICAM-1. Lösliche (d. h. nicht membrangebundene) funktionelle Derivate sind besonders bevorzugt.
Eine "Variante" eines Moleküls, wie ICAM-1, soll sich auf ein Molekül beziehen, das im wesentlichen ähnlich in Struktur und Funktion zu dem Gesamtmolekül ist. Wie der Ausdruck Variante hier verwendet wird, sind zwei Moleküle also Varianten voneinander, wenn sie eine ähnliche Aktivität besitzen, selbst wenn die Struktur eines der Moleküle nicht in dem andern gefunden wird, oder wenn die Sequenz der Aminosäurereste nicht identisch ist. Mutantenmoleküle von ICAM-1 sind ein Beispiel für ICAM- 1-Varianten.
Ein "Analogon" eines Moleküls, wie ICAM-1, soll sich auf ein Molekül beziehen, das im wesentlichen ähnlich hinsichtlich der Funktion zu dem Gesamtmolekül ist.
Wie hier verwendet, wird von einem Molekül gesagt, dass es ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls ist, wenn es zusätzliche chemische Anteile enthält, die nicht normalerweise ein Teil des Moleküls sind. Derartige Anteile können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und dergl. des Moleküls verbessern. Die Anteile können alternativ die Toxizität des Moleküls verringern, unerwünschte Nebenwirkungen des Moleküls beseitigen oder abschwächen und dergl. Anteile, die zur Vermittlung derartiger Wirkungen imstande sind, werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. "Antigen-derivatisierte" Moleküle stellen eine spezielle Klasse von "chemischen Derivaten" dar. Ein "Adjuvans-derivatisiertes" Molekül ist ein Molekül (wie ein funktionelles Derivat von ICAM-1), das einen Adjuvansanteil enthält. Die Bindung eines derartigen Moleküls an ein Virus bringt den Antigenanteil in enge Nähe mit dem Virus und erhöht damit die immunogene Beschaffenheit des Virus und fördert die antivirale Therapie. Beliebige geeignete Adjuvansanteile können eingesetzt werden; es ist jedoch bevorzugt, ein Adjuvans, wie z. B. Muramyldipeptid (A. C. Allison et al., UCLA Symp. Molec. Cell. Biol. New Ser. 84: 401-410 (1988); G. Riveau et al., J. Lymph. Res. 44: 448-454 (1988)) einzusetzen. Verfahren zur Kopplung derartiger Anteile an ein Molekül sind auf diesem Gebiet bekannt.
Ein "Peptidomimetikum" von ICAM-1 ist eine Verbindung, deren Tertiärstruktur im wesentlichen ähnlich zu der Tertiärstruktur von ICAM-1 ist.
Die erfindungsgemäßen antiviralen Mittel können durch natürliche Prozesse (wie z. B. durch Induktion eines Tiers, einer Pflanze, von Pilzen, Bakterien und dergl, zur Bildung eines Analogons von ICAM-1 oder durch Induktion eines Tiers zur Bildung von polyklonalem oder monoklonalem anti-ICAM-1-anti-Idiotyp); durch synthetische Verfahren (wie z. B. unter Verwendung des Merrifield-Verfahrens zur Synthese von Polypeptiden eines funktionellen Derivats von ICAM-1 und dergl.); oder durch rekombinante Techniken (wie z. B. zur Herstellung der antiviral-funktionellen Derivate von ICAM-1 in verschiedenen Wirten (z. B. Hefe, Bakterien, Pilze, kultivierte Säugerzellen und dergl.) oder aus rekombinanten Plasmiden oder viralen Vektoren) oder durch Proteolyse hergestellt werden. Die Wahl, welches Verfahren angewandt werden soll, hängt von Faktoren, wie Zweckmäßigkeit, gewünschte Ausbeute und dergl., ab. Es ist nicht erforderlich, nur eine der vorstehend beschriebenen Methoden, Verfahren oder Technologien anzuwenden, um ein spezielles antivirales Mittel herzustellen; die vorstehend beschriebenen Verfahren, Methoden und Technologien können kombiniert werden, um ein bestimmtes antivirales Mittel zu erhalten.
Funktionelle Derivate von ICAM-1 mit bis zu etwa 100 Resten können zweckmäßig durch eine in vitro-Synthese hergestellt werden. Falls gewünscht, können derartige Fragmente durch Umsetzung von gezielten Aminosäureresten des gereinigten oder rohen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das zur Reaktion mit ausgewählten Seitenketten oder endständigen Resten imstande ist, modifiziert werden. Die resultierenden kovalenten Derivate können verwendet werden, um Reste, die für die biologische Aktivität wichtig sind, zu identifizieren.
Cysteinylreste werden besonders häufig mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie Chloressigsäure oder Chloressigsäureamid, umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu erhalten. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazoyl)-propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimide, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzaat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenoi oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylprocarbonat bei pH 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. p-Bromphenacylbromid ist ebenfalls nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl und Amino-terminaie Reste werden mit Bernsteinsäureanhydrid oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung der Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagenzien für die Derivatisierung von α-Amino-enthaltenden Resten umfassen imidoester, wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methyl-isohamstoff; 2,4-Pentandion; und Transaminase-katalysierte Umsetzung mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Umsetzung unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, und zwar aufgrund des hohen pKa-Werts der funktionellen Guanidingruppe. Ferner können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie mit der &epsi;-Aminogruppe von Arginin reagieren.
Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten als solchen ist umfangreich untersucht worden, mit besonderem Interesse für die Einführung spektroskopischer Markierungen in Tyrosylreste durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Besonders häufig werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitrodemate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²&sup5;I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine für die Verwendung in Radioimmunoassays herzustellen, wobei das Chloramin T-Verfahren geeignet ist.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R'), wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid, modifiziert. Ferner werden Aspartyl- und Glutamylreste in Asparaginyl- und Glutaminyl-Reste durch Umsetzung mit Ammoniumionen umgewandelt.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln eignet sich für die Vernetzung eines funktionellen ICAM-1-Derivatmoleküls mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche für die Verwendung in einem Verfahren zur Spaltung eines funktionellen ICAM-1-Derivat-Fusionspolypeptids zur Freisetzung und Gewinnung des abgespaltenen Polypeptids. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen z. B. 1,1- Bis-(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester unter Einschluss von Disuccinimidylestern, wie 3,3'-Dithiobis-(succinimidylpropionat), und bifunktionellen Maleinimiden, wie Bis-N-maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie Methyl-3- [(p-azidophenyl)-dithio]-propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die imstande sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrices, wie Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten 3 969 287; 3 691 016; 4 195 128; 4 247 642; 4 229 537; und 4 330 440 beschrieben werden, für die Proteinimmobilisierung eingesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten deamidiert. Alternativ werden diese Reste unter milden sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Weitere Modifikationen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin, Arginin und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Moiecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 (1983)), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen.
Funktionelle Derivate von ICAM-1 mit geänderten Aminosäuresequenzen können auch durch Mutationen in der DNA hergestellt werden. Die Nucleotidsequenz, die das ICAM-1-Gen kodiert, ist in Fig. 1 gezeigt. Derartige Varianten umfassen z. B. Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der in Fig. 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Beliebige Kombinationen von Deletionen, Insertionen und Substitutionen können ebenfalls durchgeführt werden, um ein Endkonstrukt zu erzielen, sofern das Endkonstrukt die gewünschte Aktivität besitzt. Offensichtlich dürfen die Mutationen, die in der DNA, die die Variante kodiert, gemacht werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster bringen, und sie erzeugen vorzugsweise keine komplementären Regionen, die sekundäre mRNA-Struktur bilden könnten (vergl. europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 75 444).
Auf der genetischen Ebene werden diese funktionellen Derivate üblicherweise durch gerichtete Mutagenese von Nucleotiden in der DNA, die das ICAM-1-Molekül kodiert, wobei DNA, die das funktionelle Derivat kodiert, gebildet wird, und anschließende Expression der DNA in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Die funktionellen Derivate zeigen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität wie das natürlich auftretende Analogon. Sie können sich jedoch erheblich in solchen charakteristischen Eigenschaften im Hinblick auf das normalerweise gebildete ICAM-1-Molekül unterscheiden.
Während die Stelle für die Einführung einer Aminosäuresequenzvariation festgelegt ist, braucht die Mutation als solche nicht festgelegt zu sein. Zum Beispiel können zur Optimierung der Eigenschaften einer Mutation an einer gegebenen Stelle eine statistische Mutagenese am Zielcodon oder der Region durchgeführt und die exprimierten funktionellen ICAM-1-Derivate auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität abgesucht werden. Techniken, um Substitutionsmutationen an festgelegten Stellen in der DNA mit einer bekannten Sequenz vorzunehmen, sind bekannt, z. B. gezielte Mutagenese.
Die Herstellung eines damit übereinstimmenden funktionellen ICAM-1-Derivatmoleküls wird vorzugsweise durch gerichtete Mutagenese der DNA, die ein zuvor hergestelltes funktionelles Derivat oder eine Nichtvariantenversion des Proteins kodiert, erzielt. Die gerichtete Mutagenese erlaubt die Herstellung von funktionellen ICAM-1- Derivaten unter Verwendung der spezifischen Oligonucleotidsequenzen, die die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation kodieren, sowie einer ausreichenden Anzahl von benachbarten Nucleotiden, um eine Primer-Sequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um einen stabilen Doppelstrang auf beiden Seiten der Deletionsverknüpfung, die überbrückt wird, herzustellen. Typischerweise ist ein Primer von etwa 20 bis 25 Nucleotiden Länge bevorzugt, mit etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Verknüpfung der geänderten Sequenz. Im allgemeinen ist die Technik der gerichteten Mutagenese auf diesem Gebiet bekannt, wie beispielhaft durch Veröffentlichung, wie Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), deren Offenbarung durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird, belegt wird.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Technik der spezifischen Mutagenese typischerweise einen Phagenvektor einsetzt, der sowohl in einzelsträngiger als auch in doppelsträngiger Form existiert. Typische Vektoren, die für die gerichtete Mutagenese geeignet sind, umfassen Vektoren, wie den M13-Phagen, z. B. wie offenbart von Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam (1981), wobei diese Offenbarung durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird. Diese Phagen sind ohne weiteres kommerziell erhältlich, und ihre Verwendung ist im allgemeinen Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt. Alternativ können Plasmidvektoren, die einen einzelsträngigen Phagenursprung der Replikation enthalten (Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987)), eingesetzt werden, um einzelsträngige DNA zu erhalten.
Im allgemeinen wird die gerichtete Mutagenese in Übereinstimmung hiermit durchgeführt, indem zuerst ein einzelsträngiger Vektor erhalten wird, der innerhalb seiner Sequenz eine DNA-Sequenz einschließt, die das relevante Protein kodiert. Ein Oligonucleotidprimer, der die gewünschte mutierte Sequenz trägt, wird hergestellt, und zwar im allgemeinen synthetisch, z. B. nach dem Verfahren von Orea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 75: 5765 (1978). Dieser Primer wird dann mit dem einzelsträngigen, die Proteinsequenz enthaltenden Vektor anneliert und der Einwirkung DNApolymerisierender Enzyme, wie E. coli-Polymerase I Klenow-Fragment, unterzogen, um die Synthese des die Mutation tragenden Strangs zu vervollständigen. Auf diese Weise, eine mutierte Sequenz und der zweite Strang trägt die gewünschte Mutation. Dieser Heteroduplex-Vektor wird dann zur Transformation geeigneter Zellen, wie JM101-Zellen, verwendet, und Klone werden selektiert, die rekombinante Vektoren enthalten, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Nachdem ein derartiger Klon selektiert ist, kann die mutierte Proteinregion entfemt und in einen geeigneten Vektor für die Proteinherstellung gebracht werden, im allgemeinen in einen Expressionsvektor des Typs, der für die Transformation einer geeigneten Wirtszelle eingesetzt werden kann.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen im allgemeinen im Bereich von 1 bis 30 Resten, stärker bevorzugt von 1 bis 10 Resten und sind typischerweise zusammenhängend.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen Amino- und/oder Carboxyl-terminale Fusionen von einem Rest bis zu Polypeptiden im wesentlichen unbeschränkter Länge sowie Intrasequenzinsertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Intrasequenzinsertionen (z. B. Insertionen innerhalb der vollständigen ICAM-1-Molekülsequenz) können im allgemeinen von etwa 1 bis 10 Resten und vorzugsweise 1 bis 5 Resten reichen. Ein Beispiel für eine terminale Insertion umfasst eine Fusion einer Signalsequenz, ob heterolog oder homolog für die Wirtszelle, an den N-Terminus des Moleküls, um die Sekretion des funktionellen ICAM-1-Derivats aus rekombinanten Wirten zu erleichtern.
Die dritte Gruppe von funktionellen Derivaten sind diejenigen, in denen mindestens ein Aminosäurerest im ICAM-1-Molekül und vorzugsweise nur einer entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle inseriert ist. Derartige Substitutionen werden vorzugsweise gemäß der nachstehenden Tabelle ausgeführt, wenn es gewünscht ist, in feiner Weise die charakteristischen Eigenschaften des ICAM-1-Moleküls zu modulieren.

Tabelle 1

Ursprünglicher Rest / Beispielhafte Substitutionen
Ala gly; ser
Arg lys
Asn gln; his
Asp glu
Cys ser
Glnu asn
Glu asp
Gly ala; pro
His asn; gln
Ile leu; val
Leu ile; val
Lys arg; gln; glu
Met leu; tyr; ile
Phe met; leu; tyr
Ser thr
Thr ser
Trp tyr
Try trp; phe
Val ile; leu
Wesentliche Änderungen in der funktionellen oder immunologischen Identität werden durchgeführt, indem Substitutionen gewählt werden, die weniger konservativ als die in Tabelle 1 sind, d. h. indem Reste gewählt werden, die erheblicher in ihrer Wirkung sind hinsichtlich der Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidrückgrats im Bereich der Substitution, z. B. als eine Faltblatt- oder helikale Konformation, (b) der Ladung oder hydrophoben Beschaffenheit des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im allgemeinen erwartet wird, dass sie in Bezug dazu stehen, sind die, bei denen (a) Glycin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure substituiert oder deletiert oder inseriert wird; (b) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, anstelle eines hydrophoben Restes, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert oder dadurch substituiert wird; (c) ein Cysteinrest anstelle eines anderen Restes (oder dadurch) substituiert wird; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, anstelle eines Restes mit einer elektronegativen Ladung, z. B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert (oder dadurch substituiert) wird; oder (e) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z. B. Phenylalanin, anstelle eines Restes, der keine derartige Seitenkette aufweist, z. B. Glycin, substituiert (oder dadurch substituiert) wird.
Von den meisten Deletionen und Insertionen und insbesondere Substitutionen wird nicht erwartet, dass sie radikale Änderungen in den charakteristischen Eigenschaften des ICAM-1-Moleküls hervorrufen. Wenn es jedoch schwierig ist, vor der Durchführung die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vorherzusagen, erkennt der Fachmann, dass die Wirkung durch Routine-Screeningassays bewertet wird. Zum Beispiel wird ein funktionelles Derivat typischerweise durch gerichtete Mutagnese der natives ICAM-1 kodierenden Nucleinsäure, Expression der Variantennucleinsäure in rekombinanter Zellkultur und gegebenenfalls Reinigung aus der Zellkultur, z. B. durch Immunoaffinitätsadsorption an eine anti-ICAM-1-Antikörpersäule (zur Absorption des funktionellen Derivats durch Bindung an mindestens einem verbleibenden Immunepitop) hergestellt.
Die Aktivität des Zelllysats oder gereinigten funktionellen ICAM-1-Derivats wird dann in einem geeigneten Screeningassay auf gewünschte charakteristische Eigenschaften abgesucht. Zum Beispiel wird eine Änderung im immunologischen Charakter des funktionellen Derivats, wie die Affinität für einen gegebenen Antikörper, durch ein Immunoassay vom Konkurrenztyp gemessen. Änderungen in der Immunmodulationsaktivität werden durch einen geeigneten Assay gemessen. Modifikationen von Proteineigenschaften, wie Redox- oder thermische Stabilität, biologische Halbwertszeit, hydrophobe Beschaffenheit, Empfindlichkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder Tendenz zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren, werden nach Methoden untersucht, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.

III. Kartierung von funktionellen ICAM-1-Domänen

Studien an ICAM-1 haben gezeigt, dass das Molekül 7 Domänen besitzt. 5 dieser Domänen sind extrazellulär (Domäne 5 ist der Zelloberfläche am nächsten, Domäne 1 ist von der Zelloberfläche am weitesten entfernt), eine Domäne ist eine Transmembrandomäne, und - eine Domäne ist zytoplasmatisch (d. h. liegt innerhalb der Zelle). Um zu bestimmen, welche Domänen zur Fähigkeit von ICAM-1 zur Bindung von Viren beitragen, können Epitopkartierungsstudien genutzt werden. Zur Durchführung derartiger Studien werden verschiedene Deletionsmutanten hergestellt und hinsichtlich ihres Vermögens zur Bindung von Viren charakterisiert. Beliebige Viren, die zur Bindung an ICAM-1 imstande sind, können für derartige Studien eingesetzt werden; es ist jedoch bevorzugt, humanes Rhinovirus vom Hauptserotyp (HRV-14) zu verwenden. Alternativ können die Studien unter Verwendung von anti-ICAM-Antikörpem durchgeführt werden, von denen bekannt ist, dass sie das Vermögen von ICAM-1 zur Bindung von Viren oder LFA-1 beeinflussen. Beispiele für geeignete Antikörper umfassen RR1/1 (R. Rothiein et al. (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)), R6.5 (T. A. Springer et aU, US-Patentanmeldung Seriennummer 07/250 446), LB-2 (E. A. Clark et al., in: Leukocyte Typing I (A. Bernard et al., Hrsg.) Springer-Verlag, S. 339-346 (1984)) oder CI203 (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849-853 (1989)). Gemäß einer weiteren Alternative werden derartige Studien durchgeführt, indem bestimmt wird, ob die Deletionsmutanten zur Bindung an LFA-1 imstande sind. Verfahren, die ohne weiteres angewandt werden können, um die Durchführung derartiger Experimente zu gestatten, werden in der europäischen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 169 146, in der US-Patentanmeldung Seriennummer 07/045 963 sowie in R. Rothlein et al. (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)) beschrieben, wobei alle diese Druckschriften durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht werden.
Deletionsmutanten von ICAM-1 können nach einer beliebigen einer Reihe von Maßnahmen erzeugt werden. Es ist jedoch bevorzugt, derartige Mutanten über gerichtete Mutagenese oder durch andere rekombinante Maßnahmen (wie durch Konstruktion von ICAM-1 exprimierenden Gensequenzen, wobei Sequenzen, die spezielle Proteinregionen kodieren, deletiert sind) herzustellen. Verfahren, die angepasst werden können, um derartige Mutanten herzustellen, sind auf diesem Gebiet gut bekannt. Unter Anwendung derartiger Verfahren wurden drei ICAM-1-Deletionsmutanten hergestellt. Der ersten Mutante fehlen Aminosäurereste F185 bis P284 (d. h. Deletion von Domäne 3). Der zweiten Mutante fehlen Aminosäurereste P284 bis R451 (d. h. Deletion der Domänen 4 und 5). Der dritten Mutante fehlen Aminosäurereste nach Y476 (d. h. Deletion der zytoplasmatischen Domäne). Die Ergebnisse derartiger Studien zeigen, dass die Domänen 1, 2 und 3 hauptsächlich an den ICAM-1-Wechselwirkungen mit anti-ICAM-1-Antikörper, LFA-1 und Viren beteiligt sind.

IV. Wirkung von Mutationen in ICAM-1 auf die virale Bindung

ICAM-1 weist die Fähigkeit aut mit Viren und insbesondere Rhinoviren des Hauptserotyps innerhalb der Gattung Picomaviridae, Gruppe A-Coxsackie-Viren (R. J. Colonno et al., J. Virol. 57: 7-12 (1986)) und Mengo-Viren (M. G. Rossmann et al., Virol. 164: 373-382 (1988)), in Wechselwirkung zu treten und diese zu binden. Diese Wechselwirkung wird durch ICAM-1-Aminosäurereste vermittelt, die in Domäne 1 des ICAM-1-Moleküls (Figg. 1 und 2) vorliegen. Derartige Wechselwirkungen werden jedoch durch Beiträge von Aminosäuren, die in den Domänen 2 und 3 von ICAM-1 vorliegen, unterstützt. Zu den bevorzugten erfindungsgemäßen funktionellen Derivaten gehören also lösliche Fragmente des ICAM-1-Moleküls, die die Domänen 1, 2 und 3 von ICAM-1 enthalten. Stärker bevorzugt sind lösliche Fragmente des ICAM-1- Moleküls, die die Domänen 1 und 2 von ICAM-1 enthalten. Am stärksten bevorzugt sind lösliche Fragmente des ICAM-1-Moleküls, die Domäne 1 von ICAM-1 enthalten. Mehrere Aminosäurereste innerhalb der ersten ICAM-1-Domäne sind an den Wechselwirkungen von ICAM-1 und beispielsweise humanen Rhinoviren des Hauptserotyps beteiligt. Substitutionen dieser Aminosäuren durch andere Aminosäuren ändern die Fähigkeit derartiger Rhinoviren zur Bindung an ICAM-1. Die natürlichen Aminosäurereste und die Wirkung der Substitutionen dieser Reste auf die Fähigkeit des resultierenden mutierten ICAM-1-Moleküls zur Bindung an LFA-1 oder an Rhinoviren oder an monoklonale anti-ICAM-1-Antikörper sind in Tabelle 3 angegeben. Iri Tabelle 3 werden die Reste durch Bezugnahme auf den Einbuchstabencode für Aminosäuren, gefolgt von der Position des Restes im ICAM-1-Molekül, beschrieben. So bezieht sich beispielsweise "E90" auf den Glutaminsäurerest in Position 90 von ICAM- 1. Entsprechend bezieht sich "E90V" auf das Dipeptid, das aus dem Glutaminsäurerest in Position 90 und dem Valinrest in Position 91 zusammengesetzt ist. Die Substitutionssequenz wird rechts von einem Querstrich ("/") angegeben. Beispielsweise sind die Reste QIT, R13, Q27, K39KE, G46NN, R49KV, Q58, D71, K77T und R166PQ von ICAM-1 an der viralen Bindung beteiligt (Tabelle 3).
Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind funktionelle Derivate von ICAM-1, die Mutationen in den ICAM-1-Aminosäuren enthalten, die an der viralen Bindung beteiligt sind. Beispielsweise resultiert der Ersatz von V4 durch G in der Bildung eines mutierten ICAM-1-Moleküls, das weniger fähig zur Bindung an Rhinovirus oder LFA-1 ist (Tabelle 3). Der Ersatz des Restes R13 von ICAM-1 durch E führt zur Bildung eines mutierten Moleküls mit erheblich verringertem Vermögen zur Bindung von LFA-1 oder Rhinovirus (Tabelle 3). Der Ersatz des Restes Q58 von ICAM-1 durch H führt zur Bildung eines mutierten Moleküls mit im wesentlichen normalem Vermögen zur Bindung von LFA-1, jedoch erheblich beeinrächtigtem Vermögen zur Bindung von Rhinovirus (Tabelle 3). Der Ersatz der Reste D60S von ICAM-1 durch KL führt zur Bildung eines mutierten Moleküls mit erheblich geringerem Vermögen zur Bindung von LFA-1 und geringerem Vermögen zur Bindung von Rhinovirus (Tabelle 3).
Funktionelle Derivate von ICAM-1, die ein verringertes Vermögen zur Bindung von LFA-1 zeigen, jedoch ein normales Vermögen zur Bindung von Viren behalten, sind besonders bevorzugt. Der Ersatz von Q27 durch L resultiert in der Bildung eines derartigen mutierten ICAM-1-Moleküls. Dieses funktionelle ICAM-1-Derivat weist ein erheblich verringertes Vermögen zur Bindung von LFA-1 auf, behält jedoch ein normales Vermögen zur Bindung von Rhinovirus (Tabelle 3). Wie aus Tabelle 3 ersichtlich ist, wurde festgestellt, dass mehrere funktionelle Derivate von ICAM-1 diese bevorzugte Eigenschaft zeigen. Funktionelle Derivate von ICAM-1 mit den folgenden Aminosäuren an den angegebenen Positionen sind Beispiele für derartige bevorzugte Derivate: A3GL, L27, A34, H73 und T73. Die Verabreichung derartiger mutierter Moleküle an einen Empfänger wäre somit geeignet zur Behandlung viraler Infektionen ohne Änderung der natürlichen ICAM-1-LFA-1-Wechselwirkungen. Eine derartige Verabreichung würde die Behandlung viraler Infektionen erlauben, nicht jedoch zu einer Immunsuppression führen oder die Entzündungsreaktion im Empfänger stören.
Glycosylierungsstellen in den ersten und zweiten Domänen sind ebenfalls an der viralen Bindung beteiligt (Tabelle 3). Der Ersatz von N48 durch H oder N175 durch A führt zur Bildung eines mutierten ICAM-1-Moleküls, das weniger imstande zur Bindung von Virus oder LFA-1 ist. Der Ersatz von N118 durch Q oder N156 durch E führt zur Bildung eines mutierten ICAM-1-Moleküls, das weniger imstande zur Bindung von LFA-1 ist. Im Gegensatz dazu führt der Ersatz von N103 durch K oder N175TSA durch QTLG zur Bildung eines mutierten ICAM-1-Moleküls, das im wesentlichen unfähig zur Bindung von Virus oder LFA-1 ist.

V. Erfindungsgemäße antivirale Mittel

Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen funktionellen Derivaten von ICAM-1 umfassen weitere Mittel, die erfindungsgemäß bei der Behandlung von viralen Infektionen verwendet werden können, Antikörper gegen ICAM-1, anti-idiotypische Antikörper gegen anti-ICAM-1-Antikörper und Rezeptormoleküle (wie LFA-1, p150,95, MAC-1 und dergl.) oder Fragmente derartiger Moleküle, die zur Bindung an ICAM-1 imstande sind.
Die Antikörper gegen ICAM-1 (oder funktionelle Derivate von ICAM-1), die eingesetzt werden können, können polyklonal oder monoklonal sein.
Die anti-idiotypischen Antikörper, die erfindungsgemäß von Interesse sind, sind imstande zur Bindung an HRV in Konkurrenz zu (oder unter Ausschluss von) ICAM-1. Derartige Antikörper können z. B. durch Züchtung von Antikörpern gegen einen anti- ICAM-1-Antikörper und anschließendes Screening der Antikörper auf die Fähigkeit zur Bindung von HRV oder eines Mitglieds der CD-18-Familie, wie LFA-1, erhalten werden.
Da Moleküle der CD-18-Familie imstande zur Bindung an ICAM-1 sind, ist die Verabreichung derartiger Moleküle (z. B. als Heterodimere mit sowohl alpha- als auch beta-Untereinheiten oder als Moleküle, die nur aus einer alpha- oder einer beta-Untereinheit zusammengesetzt sind, oder als Moleküle mit Fragmenten einer oder beider Untereinheiten) geeignet, mit HRV um die Bindung von ICAM-1, das auf endothelialen Zellen vorhanden ist, zu konkurrieren oder es auszuschließen.

VI. Therapeutische Anwendungen der Erfindung

Die therapeutischen Wirkungen der Erfindung können erzielt werden, indem ein Patient mit einem therapeutisch aktiven funktionellen Derivat von ICAM-1, einem Mitglied der CD-18-Familie, das zur Bindung an ICAM-1 imstande ist, einem anti-idiotypischen Antikörper gegen anti-ICAM-1-Antikörper oder einem Antikörper gegen ICAM-1 versorgt wird. Die therapeutischen Vorteile derartiger funktioneller Derivate können durch die Verwendung von funktionellen Derivaten von ICAM-1, die zusätzliche Aminosäurereste aufweisen, die zugefügt sind, um die Kopplung an Träger zu verstärken oder die antivirale Aktivität des funktionellen ICAM-1-Derivats zu verstärken, verbessert werden. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung soll ferner funktionelle Derivate von ICAM-1 einschließen, denen bestimmte Aminosäurereste fehlen oder die geänderte Aminosäurereste enthalten, so lange derartige Derivate ein Vermögen zur Bindung von Viren zeigen.
Von den hier offenbarten funktionellen ICAM-1-Derivaten wird gesagt, dass sie "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen" sind, wenn Zubereitungen, die sie enthalten, im wesentlichen frei von Materialien sind, mit denen diese Produkte normalerweise und natürlicherweise gefunden werden.
Bei der Versorgung eines Patienten mit einem der erfindungsgemäßen therapeutisch aktiven Moleküle wird die Dosierung des verabreichten Mittels abhängig von Faktoren wie dem Alter des Patienten, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand, dem vorhergehenden medizinischen Verlauf und dergl. variieren. Im allgemeinen ist es günstig, den Empfänger mit einer Dosierung des Mittels zu versorgen, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, wobei jedoch eine niedrigere oder höhere Dosierung verabreicht werden kann.
Die erfindungsgemäßen therapeutischen Mittel können Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Bei Verabreichung derartiger Mittel durch Injektion kann die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion oder durch einzelne oder mehrfache Injektionen erfolgen. Eine besonders bevorzugte Art der Verabreichung ist die intranasale Verabreichung.
Ein Empfänger kann mit dem antiviralen Mittel als Teil einer "pharmakologisch annehmbaren" Zusammensetzung versorgt werden. Von einer Zusammensetzung wird gesagt, dass sie "pharmakologisch annehmbar" ist, wenn ihre Verabreichung von einem empfangenden Patienten toleriert wird. Empfänger sollen mit den erfindungsgemäßen antiviralen Mitteln in einer "therapeutisch aktiven" Menge versorgt werden. Von einer Menge wird gesagt, dass sie "therapeutisch aktiv" ist, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn sein Vorhandensein zu einer nachweisbaren Änderung in der Physiologie eines empfangenden Patienten führt. Eine Menge des Mittels ist "therapeutisch aktiv", wenn z. B. ihre Verabreichung an einen empfangenden Patienten imstande ist, eine virale Infektion oder die Infektivität beim Empfänger zu unterdrücken oder abzuschwächen.
Die Verabreichung der erfindungsgemäßen antiviralen Mittel kann zu einem "prophylaktischen" oder "therapeutischen" Zweck erfolgen. Bei prophylaktischer Versorgung wird das antivirale Mittel vor irgendeinem Symptom der viralen Infektion ("z. B. vor, während oder kurz nach dem Zeitpunkt der Infektion, jedoch vor dem Auftreten irgendwelcher Symptome einer derartigen Infektion) bereitgestellt. Die prophylaktische Verabreichung des Mittels dient der Verhinderung oder Abschwächung einer anschließenden viralen Infektion oder der Verringerung der Möglichkeit, dass eine derartige Infektion auf andere übertragen wird.
Bei therapeutischer Versorgung wird das antivirale Mittel beim Einsetzen eines Symptoms einer tatsächlichen viralen Infektion (wie z. B. nasale Verstopfung, Fieber und dergl.) oder kurz danach bereitgestellt. Die therapeutische Verabreichung des Mittels dient der Abschwächung einer tatsächlichen viralen Infektion.
Die erfindungsgemäßen antiviralen Mittel können also vor dem Einsetzen der viralen Infektion (so dass eine vorhergesehene Infektion unterdrückt wird) oder nach Beginn einer derartigen Infektion bereitgestellt werden.
Die erfindungsgemäßen antiviralen Moleküle können nach bekannten Methoden zur Herstellung pharmazeutisch nützlicher Zusammensetzungen formuliert werden, wobei diese Materialien oder ihre funktionellen Derivate im Gemisch mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägervehikel kombiniert werden. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung einschließlich weiterer Humanproteine, z. B. Humanserumalbumin, werden z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Auflg., Osol, A., Hrsg., Mack, Easton PA (1980)) beschrieben. Um eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung zu bilden, die geeignet für eine wirksame Verabreichung ist, enthält eine derartige Zusammensetzung eine wirksame Menge an Mittel zusammen mit einer geeigneten Menge an Trägervehikel.
Zusätzliche pharmazeutische Methoden können angewandt werden, um die Dauer der Wirkung einzustellen. Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung können durch die Verwendung von Polymeren zur Komplexierung oder Absorption des Mittels erhalten werden. Die kontrollierte Abgabe kann bewerkstelligt werden, indem geeignete Makromoleküle (z. B. Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat) und die Konzentration der Makromoleküle sowie die Verfahren der Einführung, um die Freisetzung zu kontrollieren, gewählt werden. Ein weiteres mögliches Verfahren zur Kontrolle der Dauer der Wirkung durch Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung besteht darin, das antivirale Mittel in Partikel eines polymeren Materials, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly(milchsäure) oder Ethylenvinylacetat-Copolymere, einzuführen. Alternativ ist es anstelle der Einführung dieser Mittel in polymere Partikel möglich, diese Materialien in Mikrokapseln einzuschließen, die z. B. durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, z. B. Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln und Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidalen Arzneistoffabgabesystemen, z. B. Liposomen, Albuminmikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken werden in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben.

VII. Diagnostische und prognostische Anwendungen der Erfindung

Das Vermögen von ICAM-1 zur Erkennung und Bindung von humanem Rhinovirus des Hauptserotyps stellt eine Basis für dessen Verwendung zur Diagnose des Vorhandenseins einer Rhinovirus-Infektion in einem Individuum bereit. Derzeit betreffen ungefähr 20% aller Arztbesuche in den Vereinigten Staaten Beschwerden hinsichtlich Symptomen, die durch Rhinovirus oder bakterielle Infektion hervorgerufen werden können. Da eine bakterielle Infektion mit Antibiotika behandelt werden kann, derartige Mittel aber unwirksam gegen Rhinoviren sind, ist ein Mittel zur Unterscheidung zwischen Rhinoviren und bakteriellen Infektionen sehr erwünscht.
Erfindungsgemäß wird ein Assay bereitgestellt, der geeignet zur Identifizierung des Vorhandenseins von Rhinovirus im Schleim, nasalen Sekreten und anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums ist. Das humane Rhinovirus besitzt 60 ICAM-1-Bindungsstellen und ist daher imstande, gleichzeitig 60 verschiedene ICAM-1-Moleküle zu binden. Jede Bindungsstelle ist zu klein, um für einen Antikörper zugänglich zu sein.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst der Assay die Inkubation einer Menge von nachweisbar markierten funktionellen ICAM-1-Derivatmolekülen in Gegenwart von Schleim, nasalen Sekreten und dergl. eines Patienten und die Bestimmung der Menge an markiertem Molekül, das an das Virus gebunden ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein nicht markiertes funktionelles ICAM-1-Derivat an einen festen Träger (wie Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder modifizierte Cellulose, Polyacrylamid, Agarose und Magnetit) gebunden. Die Beschaffenheit des Trägers kann für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder bis zu einem gewissen Grad löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch jede mögliche strukturelle Konfiguration aufweisen, so lange die gekoppelten Moleküle zur Bindung an Viren imstande sind. Die Trägerkonfiguration kann also kugelförmig, wie in einem Kügelchen, oder zylindrisch, wie bei der Innenseite eines Teströhrchens oder der äußeren Oberfläche eines Stabs, sein. Alternativ kann die Oberfläche flach, wie eine Folie, ein Teststreifen und dergl., sein. Fachleute erkennen viele andere mögliche Träger zur Bindung von monoklonalen Antikörpern oder sind imstande, diese durch Anwendung von Routineversuchen zu bestätigen (Glas, Polystyrol, Papier, Cellulose und dergl.).
Die Flüssigkeitsprobe, die im Verdacht steht, ein Virus zu enthalten, wird in Kontakt mit dem gebundenen funktionellen ICAM-1-Derivat unter Bedingungen gebracht, die ausreichen, um es Viren, die in einer derartigen Flüssigkeit vorhanden sein mögen, zu ermöglichen, an das trägerbundene funktionelle ICAM-1-Derivat zu binden. Der Träger wird dann in Gegenwart eines markierten funktionellen ICAM-1-Derivats unter Bedingungen, die ausreichen, um es dem markierten funktionellen ICAM-1-Derivat zu ermöglichen, an eine offene ICAM-1-Bindungsstelle auf dem Virus zu binden, inkubiert. Nach Abwaschen ungebundener Moleküle des markierten funktionellen ICAM-1-Derivats wird die Menge an Markierung, die an den Träger gebunden ist, bestimmt. Das Vorhandensein von Molekülen von markiertem funktionellem ICAM-1- Derivat, gebunden an den Träger, zeigt das Vorhandensein von Viren in der Flüssigkeitsprobe an.
Wie ohne weiteres zu erkennen ist, kann ein beliebiger einer großen Zahl äquivalenter Assays alternativ eingesetzt werden, ohne vom Geist des vorstehend beschriebenen Assays abzuweichen. Beispielsweise kann der Assay in flüssiger Phase anstelle der Verwendung eines festen Trägers durchgeführt werden. Alternativ können andere Variationen von Immunoassays eingesetzt werden. Anstelle der Verwendung von gebundenem ICAM-1 könnte man gebundenen anti-Rhinovirus-Antikörper einsetzen. Ein derartiger Assay würde die Identifizierung des Subserotyps (oder der Subspezies des Virus) abhängig von der Beschaffenheit und Spezifität des gebundenen Antikörpers erlauben.
Beispiele für Typen von Markierungen, die gemäß diesem Aspekt der Erfindung verwendet werden können, umfassen, jedoch ohne Beschränkung hierauf, Enzymmarkierungen, Radioisotopmarkierungen, nicht-radioaktive Isotopmarkierungen, fluoreszierende Markierungen und chemilumineszierende Markierungen.
Beispiele für geeignete Enzymmarkierungen umfassen Malatdehydrogenase, Staphylococcennuclease, delta-5-Steroidisomerase, Hefealkoholdehydrogenase, α-Glycerolphosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, β-Galactosidase, Ribonuclease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, Glucoamylase, Acetylcholinesterase und dergl.
Beispiele für geeignete Radioisotopmarkierungen umfassen ³H, ¹¹¹In, ¹²&sup5;I, ¹³¹I, ³²P, ³&sup5;S, ¹&sup4;C, &sup5;¹Cr, &sup5;&sup7;To, &sup5;&sup8;Co, &sup5;&sup9;Fe, &sup7;&sup5;Se, ¹&sup5;²Eu, &sup9;&sup0;Y, &sup6;&sup7;Cu, ²¹&sup7;Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, &sup4;&sup7;Pb, &sup4;&sup7;Sc, ¹&sup0;&sup9;Pd und dergl.
Beispiele für geeignete nicht-radioaktive Isotopmarkierungen umfassen ¹&sup5;&sup7;Gd, &sup5;&sup5;Mn, ¹&sup6;²Dy, &sup5;²Tr, &sup5;&sup6;Fe und dergl.
Beispiele für geeignete fluoreszierende Markierungen umfassen eine ¹&sup5;²Eu-Markierung, eine Fluoresceinmarkierung, eine Isothiocyanatmarkierung, eine Rhodaminmarkierung, eine Phycoerythrinmarkierung, eine Phycocyaninmarkierung, eine Allophycocyaninmarkierung, eine o-Phthaldehydmarkierung, eine Fluorescaminmarkierung und dergl.
Beispiele für chemilumineszierende Markierungen umfassen eine Luminalmarkierung, eine Isoluminalmarkierung, eine aromatische Acridiniumestermarkierung, eine Imidazolmarkierung, eine Acridiniumsalzmarkierung, eine Oxalatestermarkierung, eine Luciferinmarkierung, eine Luciferasemarkierung, eine Äquorinmarkierung und dergl.
Durchschnittsfachleute kennen weitere geeignete Markierungen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Die Bindung dieser Markierungen an funktionelle ICAM-1-Derivate kann unter Anwendung von Standardtechniken, die üblicherweise Durchschnittsfachleuten bekannt sind, erreicht werden. Typische Techniken werden in J. H. Kennedy et al. (Clin. Chim. Acta 70: 1-31 (1976)) und A. H. W. M. Schurs et al. (Clin. Chim. Acta. 81: 140) (1977)) beschrieben. Kupplungstechniken, die in der letztgenannten Arbeit erwähnt werden, sind das Glutaraldehydverfahren, das Periodatverfahren, das Dimaleinimidverfahren, das m-Maleinimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidesterverfahren, wobei all diese Verfahren durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht werden.
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen in vitro-Assays ist es möglich, nachweisbar markierte funktionelle ICAM-1-Derivate an ein Individuum zu verabreichen, um Infektionsherde durch in vivo-Bildgebung zu identifizieren. Gemäß einer weiteren Ausführungsform können Proben eines Patientengewebes entfernt und in Gegenwart von nachweisbar markierten funktionellen ICAM-1-Derivaten inkubiert werden, um eine in situ-Bestimmung der viralen Infektion durchzuführen. Derartige in situ- Analysen können auch mit Zellen in Kultur oder Kulturmedium durchgeführt werden, um das Vorhandensein von Viren zu bewerten.

VIII. Verwendung der erfindungsgemäßen antiviralen Mittel als Vakzin

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Mittel für die Verhinderung einer viralen Infektion durch Herstellung eines Vakzins bereit. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden ein oder mehrere Rhinovirus-Subserotypen oder Subspezies (alle vom Hauptserotyp) in Gegenwart eines funktionellen Derivats von ICAM-1 inkubiert, um die Infektivität des Virus zu verringern. Das Virus, das das gebundene ICAM-1- Derivat enthält, wird dann einem Patienten (durch Injektion, oral oder intranasal) in einer ausreichenden Menge, um eine Immunreaktion bei dem Individuum hervorzurufen, verabreicht. Da die ICAM-1-Bindungsstellen des Virus durch das funktionelle ICAM-1-Derivat blockiert sind, resultiert aus einer derartigen Verabreichung keine Erkrankung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das funktionelle Derivat von ICAM-1, das zur Abschwächung der viralen Infektivität eingesetzt wird, ein Adjuvans-derivatisiertes ICAM-1-Molekül. Die Verwendung eines derartigen Moleküls dient der Erhöhung der immunogenen Beschaffenheit des abgeschwächten Virus.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, ist sie leichter verständlich durch Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele, die zur Erläuterung vorgelegt werden, die vorliegende Erfindung jedoch nicht beschränken sollen, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

ICAM-1 ist ein Integrin-bindendes Mitglied der Immunglobulin-Supergenfamilie

Die Ausrichtung der inneren Wiederholungen bei ICAM-1 erfolgte unter Verwendung des Mikrogenie-Protein-Ausrichtungsprogramms (C. Queen et al., Nucl. Acid Res., 12: 581-599 (1984)) mit anschließender Überprüfung. Die Ausrichtung von ICAM-1 in Bezug auf IgM, N-CAM und MAG erfolgte unter Verwendung von Mikrogenie und des ALIGN-Programms (M. O. Dayhoff et al., Meth. Enzymol. 91: 524-545 (1983)). Vier Proteinsequenzdatenbanken, die von der National Biomedical Research Foundation unterhalten werden, wurden auf Proteinsequenzähnlichkeiten unter Verwendung des FASTP-Programms von Williams und Pearson (D. J. Lipman et al., Science 227: 1435-1439 (1985)) abgesucht.
Da ICAM-1 ein Ligand eines Integrins ist, war es unerwartet, dass es ein Mitglied der Immunglobulin-Supergenfamilie ist. Die Überprüfung der ICAM-1-Sequenz zeigt jedoch, dass sie alle Kriterien erfüllt, die für die Mitgliedschaft in der Immunglobulin- Supergenfamilie vorgeschlagen wurden. Diese Kriterien werden nachstehend erörtert.
Die gesamte extrazelluläre Domäne von ICAM-1 ist aus 5 homologen Immunglobulin-artigen Domänen konstruiert, die ausgerichtet in Fig. 2A gezeigt sind. Die Domänen 1 bis 4 sind 88, 97, 99 bzw. 99 Reste lang und haben damit eine typische Ig- Domänengröße; Domäne 5 ist verkürzt auf einen Bereich von 68 Resten. Suchläufe in der NBRF-Datenbank unter Verwendung des FASTP-Programms zeigten signifikante Homologien mit Mitgliedern der Immunglobulin-Supergenfamilie unter Einschluss von IgM- und IgG-C-Domänen, variabler Domäne von T-Zell-Rezeptor-α- Untereinheit und α-1-β-Glycoprotein (Fig. 2B-D).
Unter Verwendung der vorstehenden Information wurde die Aminosäuresequenz von ICAM-1 mit den Aminosäuresequenzen der anderen Mitglieder der Immunglobulin- Supergenfamilie verglichen.
Drei Arten von Ig-Superfamiliendomänen, nämlich V, C1 und C2, wurden unterschieden. Sowohl V- als auch C-Domänen sind aus 2-β-Faltblättern, die über eine Intradomänendisulfidbindung verknüpft sind, konstruiert; V-Domänen enthalten 9 antiparallele β-Stränge, während C-Domänen 7 aufweisen. Konstante Domänen wurden in C1- und C2-Sätze auf der Basis der charakteristischen Reste, die in Fig. 2A gezeigt sind, unterteilt. Der C1-Satz umfasst Proteine, die an der Antigenerkennung beteiligt sind. Der C2-Satz umfasst mehrere Fc-Rezeptoren und Proteine, die an der Zelladhäsion beteiligt sind, und zwar unter Einschluss von CD2, LFA-3, MAG und NCAM. Es wurde festgestellt, dass ICAM-1-Domänen am stärksten homolog zu Domänen des C2-Satzes waren, was ICAM-1 in diesen Satz bringt; dies spiegelt sich in stärkerer Ähnlichkeit zu konservierten Resten in C2- als C1-Domänen wider, wie es für die β-Stränge B-F in Fig. 2 gezeigt ist. Außerdem ließen sich ICAM-1-Domänen wesentlich besser mit den β-Strängen A und G der C2-Domänen als mit diesen Strängen in V- und C1-Domänen ausrichten, was eine gute Ausrichtung über die gesamte C2-Domänenstärke erlaubte. Ausrichtungen mit C2-Domänen von NCAM, MAG und α-1-β-Glycoprotein sind in den Figg. 2B und 2C gezeigt; die Identität reichte von 28 bis 33%. Ausrichtungen mit einem T-Zell-Rezeptor Va (27% Identität) und IgM C-Domäne 3 (34% Identität) sind ebenfalls gezeigt (Figg. 2B, 2D).
Eine der wichtigsten charakteristischen Eigenschaften von Immunglobulindomänen sind die Disulfid-gebundenen Cysteine, die B- und F-β-Stränge überbrücken, was das β-Faltblatt-Sandwich stabilisiert; in ICAM-1 sind die Cysteine in allen Fällen mit Ausnahme im Strang f der Domäne 4 konserviert, wo ein Leucin gefunden wird, das in das Sandwich gerichtet sein kann und den Kontakt stabilisieren mag, wie es für einige andere V- und C2-Satz-Domänen vorgeschlagen wird. Der Abstand zwischen den Cysteinen (43, 50, 52 und 37 Reste) ist wie für den C2-Satz beschrieben.
Um auf das Vorhandensein von Intraketten-Disulfidbindungen bei ICAM-1 zu testen, wurde ICAM-1 von endothelialen Zellen einer SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen unterzogen. IGAM-1 von endothelialen Zellen wurde verwendet, da es eine weniger starke Glycosylierungsheterogenität als ICAM- 1 aus JY oder aus Milzhaarzellen zeigt und eine größere Empfindlichkeit gegenüber Verschiebungen bei Mr erlaubt. Daher wurde ICAM-1 aus 16 Stunden mit LPS (5 ug/ml) stimulierten Nabelvenenendothelzellkulturen durch Immunaffinitätschromatographie wie vorstehend beschrieben gereinigt. Aceton-präzipitiertes ICAM-1 wurde in Probenpuffer (U. K. Laemmli, Nature 227: 680-685 (1970)) mit 0,25% 2- Mercaptoethanol oder 25 mM lodacetamid resuspendiert und für 5 Minuten auf 100ºC gebracht. Die Proben wurden SDS-PAGE 4670 und Silber-Anfärbung 4613 unterzogen. ICAM-1 aus endothelialen Zellen hatte ein scheinbares Mr von 100 kD unter reduzierenden Bedingungen und von 96 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen, was stark auf das Vorhandensein von Intraketten-Disulfiden in nativem ICAM-1 hindeutet.
Die Verwendung der Primärstruktur zur Vorhersage der Sekundärstruktur (P. Y. Chou et al., Biochem. 13: 211-245 (1974)) zeigte die 7 erwarteten β-Stränge in jeder ICAM-1-Domäne, die im oberen Teil von Fig. 2A mit a-g markiert sind, was genau die Vorhersage für eine Immunglobulindomäne erfüllt und den Positionen der Stränge A- H in Immunglobulinen entspricht (Fig. 2A, unterer Teil). Der Domäne 5 fehlen die A- und C-Stränge; da diese jedoch Kanten der Faltblätter bilden, könnten die Faltblätter noch gebildet werden, wobei möglicherweise Strang D den Platz von Strang C einnimmt, wie es für einige andere C2-Domänen vorgeschlagen wurde; die charakteristische Disulfidbindung zwischen den B- und F-Strängen wäre nicht beeinträchtigt. Die Kriterien für Domänengröße, Sequenzhomologie, konservierte Cysteine, die angenommene Intradomänen-Disulfidbindungen bilden, das Vorhandensein von Disulfidbindungen und die vorhergesagte β-Faltblattstruktur werden also alle erfüllt, so dass ICAM-1 in die Immunglobulin-Supergenfamilie aufgenommen werden kann.
Es wurde festgestellt, dass ICAM-1 am stärksten homolog zu den NCAM- und MAG- Glycoproteinen des C2-Satzes ist. Dies ist von besonderem Interesse, da sowohl NCAM als auch MAG Zell-Zell-Adhäsion vermitteln. MCAM ist wichtig bei Neuron- Neuron- und Neuron-Muskelzell-Wechselwirkungen (B. A. Cunningham et al., Science 236: 799-806 (1987)) während MAG wichtig bei Neuron-Oligodendrozyt- und Oligodendrozyt-Oligodendrozyt-Wechselwirkungen während der Myelinierung ist (M. Poltorak et al., J. Cell. Biol. 105: 1893-1899 (1987)). Die Zelloberflächenexpression von NCAM und MAG ist hinsichtlich der Entwicklung reguliert während der Nervensystembildung bzw. Myelinierung, in Analogie mit der regulierten Induktion von ICAM-1 bei der Entzündung (T. A. Springer et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)). ICAM-1, NCAM (B. A. Cunningham et al., Science 236: 799-806 (1987)) und MAG (J. L. Salzer et al., J. Cell. Biol. 104: 957-965 (1987)) sind ähnlich in der Gesamtstruktur sowie homolog, da es sich jeweils um ein integrales Membranglycoprotein handelt, das aus 5 C2-Domänen unter Bildung der N-terminaien extrazellulären Region konstruiert ist, wobei jedoch in NCAM ein gewisser Anteil zusätzlicher nicht-Ig-artiger Sequenz zwischen der letzten C2-Domäne und der Transmembrandomäne vorhanden ist. ICAM-1 lässt sich über seine gesamte Länge unter Einschluss der Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen mit MAG bei 21% Identität ausrichten; der gleiche Prozentsatz Identität findet sich bei Vergleich der 5 Domänen von ICAM-1 und NCAM-1. Die cDNA-Sequenz von ICAM-1 ist in Fig. 1 gezeigt. Domäne-Domäne-Vergleiche zeigen, dass der Grad der Homologie zwischen den Domänen innerhalb der ICAM-1- und NCAM-Moleküle (x ± Standardabweichung: 21 ± 2,8% bzw. 18,6 ± 3,8%) dem Grad der Homologie bei Vergleich von ICAM-1-Domänen mit NCAM- und MAG-Domänen (20,4 ± 3,7 bzw. 21,9 ± 2,7) entspricht. Es gibt zwar Hinweise auf ein alternatives Splicing in den Cterminalen Regionen von NCAM (B. A. Cunningham et al., Science 236: 799-806 (1987); D. Barthels et al., EMBO J. 6: 907-914 (1987)) und MAG (C. Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 4377-4341 (1987)); es sind jedoch bei der Sequenzierung von endothelialen oder HL-60-ICAM-1-Klonen oder bei Studien des ICAM-1-Proteingerüsts und der Vorstufe in einer Reihe von Zelltypen keine Hinweise dafür gefunden worden (M. L. Dustin et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)).

Beispiel 2

Genetische Konstruktion und Expression von verkürzten Derivaten von ICAM-1

In seinem natürlichen Zustand ist ICAM-1 ein Zellmembran-gebundenes Protein, das eine extrazelluläre Region von 5 Immunglobulin-artigen Domänen, eine Transmembrandomäne und eine zytoplasmatische Domäne enthält. Es war wünschenswert, funktionelle Derivate von ICAM-1 zu konstruieren, denen die Transmembrandomäne und/oder die zytoplasmatische Domäne fehlt, damit eine lösliche, abgesonderte Form von ICAM-1 erzeugt werden konnte. Diese funktionellen Derivate wurden durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese des ICAM-1-Gens, gefolgt von Expression in Affenzellen nach Transfektion mit dem mutierten Gen, konstruiert.
Die Mutationen in dem ICAM-1-Gen, die zu Aminosäuresubstitution und/oder verkürzten Derivaten führten, wurden nach dem Verfahren von T. Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 488492 (1985)) erzeugt. ICAM-1-cDNA, die hergestellt wurde, wie es vorstehend beschrieben wurde, wurde mit den Restriktionsendonucleasen SaII und KpnI verdaut; das resultierende DNA-Fragment von 1,8 kb wurde in den Plasmidvektor CDMB subkloniert (B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 3365-3369 (1987)). Ein dut-, ung-Stamm von E. coli (BW313/P3) wurde dann mit diesem Konstrukt, bezeichnet als pCD1.8C, transformiert. Eine einzelsträngige, Uracil enthaltende Matrize wurde aus den Transformanten durch Infektion mit dem Helferphagen R408 (StratageneR) erhalten. Mutierte ICAM-1-cDNAs wurden dann durch Einleitung einer Zweitstrangsynthese mit einem Oligonucleotid, das nicht übereinstimmende Basen enthielt, und anschließende Transformation eines ung&spplus;- Wirts (MC1061/P3) mit dem resultierenden Heteroduplex erzeugt. Mutanten wurden durch Absuchen auf neu erzeugte Endonuclease-Restriktionsstellen, die durch das mutierte Oligonucleotid eingeführt wurden, isoliert. Das mutierte ICAM-1-Protein wurde durch Transfektion von Cos-7-Zellen mit der mutierten DNA in dem eukaryontischen Expressionsvektor CDM8 unter Verwendung von Standard-DEAE-Dextran- Verfahren exprimiert (R. F. Selden et al., in: Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., Hrsg.) S. 9.2.1-9.2.6 (1987)).
Ein verkürztes funktionelles Derivat von ICAM-1, dem die Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen fehlten, das jedoch die extrazelluläre Region, die alle 5 Immunglobulin-artigen Domänen besitzt, enthielt, wurde hergestellt. Ein 30 bp umfassendes mutiertes Oligonucleotid (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) wurde verwendet, um die Codons für die Aminosäuren Tyrosin (Y) und Glutaminsäure (E) in den Positionen 452 bzw. 453 in Phenylalanin (F) und ein translationales Stoppcodon (TAG) zu transformieren. Die Mutante wurde durch ihre einzigartige Xbal-Restriktionsstelle isoliert und als Y&sup4;&sup5;²E/F,TAG bezeichnet.
Um das mutierte Protein zu exprimieren, wurden COS-Zellen mit drei mutierten Subklonen (#2, #7 und #8) transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion mit den drei mutierten Subklonen wurden Kulturüberstände und Zelllysate durch Immunpräzipitation mit monoklonalem anti-ICAM-1-Antikörper RR1/1 und SDS-PAGE analysiert. ICAM-1 wurde aus den Kulturüberständen von Zellen, die mit den mutierten Subklonen #2 und #8 transfiziert waren, nicht jedoch aus Detergenslysaten dieser Zellen, präzipitiert. Das Molekulargewicht von ICAM-1, das im Kulturüberstand gefunden wurde, war um ungefähr 6 kD relativ zu der Membranform von ICAM-1 verringert, was mit der Größe, die aus der mutierten DNA vorhergesagt wurde, übereinstimmt. Dieses funktionelle Derivat von ICAM-1 wird also als ein lösliches Protein abgesondert. Im Gegensatz dazu wurde ICAM-1 nicht aus Kontrollkulturüberständen von Zellen, die mit nativem ICAM-1 transfiziert waren, immunpräzipitiert, was zeigt, dass die Membranform von ICAM-1 von den Cos-Zellen nicht abgegeben wird. Ferner wurde kein ICAM-1 aus Kulturüberständen oder Zelllysaten von scheintransfizierten Zellen als negative Kontrolle immunpräzipitiert.
Das von den transfizierten Zellen abgesonderte verkürzte ICAM-1 wurde durch Lmmunaffinitätschromatographie mit einem ICAM-1-spezifischen Antikörper (R6-5-D6) gereinigt und auf funktionelle Aktivität in einem Zellbindungsassay untersucht. Nach Reinigung in Gegenwart des Detergens Octylglucosid wurden Zubereitungen, die natives ICAM-1 oder die verkürzte abgesonderte Form enthielten, auf eine Endkonzentration von 0,25% Octylglucosid (eine Konzentration unterhalb der kritischen Mizellkonzentration des Detergens) verdünnt. Diese Zubereitungen von ICAM-1 ließ man an Oberflächen von Kunststoffplatten mit 96 Vertiefungen (Nung) binden, um ICAM-1, gebunden an eine Festphase, herzustellen. Nach Abwaschen von ungebundenem Material banden 75 bis 80% bzw. 83 bis 88% von SKW-3-Zellen, die LFA-1 auf ihrer Oberfläche trugen, spezifisch an die native bzw. an die verkürzte Form von ICAM-1. Diese Daten zeigen, dass das abgesonderte verkürzte lösliche funktionelle ICAM-1-Derivat sowohl immunologische Reaktivität als auch die Fähigkeit, die ICAM-1-abhängige Adhäsion zu vermitteln, was charakteristisch für ein natives ICAM-1 ist, behielt.
Ein funktionelles Derivat von ICAM-1, dem nur die zytoplasmatische Domäne fehlte, wurde nach ähnlichen Verfahren hergestellt. Ein 25 bp umfassendes Oligonucleotid (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) wurde verwendet, um das Codon für Aminosäure 476 (Y) in ein translationales Stoppcodon TAG umzuwandeln. Die Mutante wurde als Y&sup4;&sup7;&sup6;/TAG bezeichnet. Immunpräzipitationsanalyse und SDS-PAGE von Cos-Zellen, die mit der Mutante transfiziert waren, wies eine Membran-gebundene Form von ICAM-1 mit einem Molekulargewicht ungefähr 3 kD geringer als natives ICAM-1 nach. Indirekte Immunfluoreszenz der Mutanten-transfizierten Cos-Zellen zeigte ein Punktat-Anfärbemuster ähnlich zu nativem ICAM-1, exprimiert auf LPS-stimuierten humanen endothelialen Zellen. Schließlich banden mit der mutierten DNA transfizierte Zellen spezifisch an gereinigtes LFA-1 auf Kunststoffoberflächen in einer Weise ähnlich Cos-Zellen, die mit nativer ICAM-1-DNA transfiziert waren (Tabelle 2). Tabelle 2 Fähigkeit von Zellen, die ICAM-1 oder ein funktionelles Derivat von ICAM-1 exprimieren, zur Bindung von LFA-1

Beispiel 3

Multimere Formen von ICAM-1 mit erhöhter biologischer Halbwertszeit, Affinität und Clearance

Chimäre Moleküle werden konstruiert, bei denen die Domänen 1 und 2 von ICAM-1 mit der Scharnierregion der schweren Kette von Immunglobulin verknüpft sind. Bei bevorzugten Konstrukten ist der C-Terminus der ICAM-1-Domäne 2 mit einem Segment der schweren Kette von Immunglobulin unmittelbar vor dem N-Terminus der Scharnierregion verknüpft, was eine Segmentfiexibilität, die durch die Schamierregion verliehen wird, ermöglicht. Die ICAM-1-Domänen 1 und 2 ersetzen also das Fab-Fragment eines Antikörpers. Die Anheftung der schweren Ketten der IgG-Klasse und die Erzeugung von tierischen Zellen führen zur Herstellung eines chimären Moleküls. Die Herstellung des Moleküls, das schwere Ketten enthält, die von IgA oder lgM abgeleitet sind, führt zur Bildung von Molekülen mit höherer Multimerbeschaffenheit, die 2 bis 12 ICAM-1-Moleküle enthalten. Die Coexpression des J-Kettengens in tierischen Zellen, die die chimären ICAM-1-schwere Kette-Moleküle bilden, erlaubt den richtigen Zusammenbau von IgA- und IgM-Multimeren, was vorwiegend zu IgA- Molekülen führt, die 4 bis 6 ICAM-1-Moleküle enthalten, und im Fall von IgM ungefähr 10 ICAM-1-Moleküle enthalten. Diese chimären Moleküle mögen mehrere Vorteile haben. Erstens sind Ig-Moleküle so ausgelegt, dass sie lange im Kreislauf verbleiben, und dies mag die biologische Halbwertszeit verbessern.
Ferner wird die multimere Beschaffenheit dieser technisch hergestellten Moleküle es ihnen erlauben, mit größerer Kraft mit Rhinoviren sowie mit Zelloberflächen-LFA-1, abhängig vom therapeutischen Zusammenhang, in Wechselwirkung zu treten und damit stark die Menge an rekombinantem Protein, die verabreicht werden muss, um eine wirksame Dosis zu erzielen, verringern. IgA und IgM sind stark glycosylierte Moleküle, die normalerweise in Absonderungen in mucosalen Stellen in der Nase vorhanden sind. Ihre stark hydrophile Beschaffenheit hilft mit, Bakterien und Viren, an die sie binden, von der Schleimhaut fern zu halten, was die Anheftung an Zellen verhindert und den Durchtritt durch die epitheliale Zellmembranbarriere verhindert. Sie mögen daher eine erhöht therapeutische Wirksamkeit haben. IgM und insbesondere IgA sind stabil in mucosalen Umgebungen, und sie mögen die Stabilität der ICAM-1-Konstrukte erhöhen. Wenn ein derartiges funktionelles ICAM-1-Derivat im Blutstrom verabreicht wird, mag es auch die biologische Halbwertszeit erhöhen. IgA fixiert nicht Komplement und wäre daher ideal für Anwendungen, bei denen dies schädlich wäre. Wenn IgG-H-Kettenchimären gewünscht sind, wäre es möglich, Regionen zu mutieren, die an der Anheftung an Komplement sowie an Wechselwirkungen mit Fc-Rezeptoren beteiligt sind.
Ein chimäres Molekül, bei dem die Domänen 1, 1-2, 1-3, 1-4 oder 1-5 von ICAM-1 mit der Scharnierregion und den CH2- und CH3-Domänen von IgA verknüpft sind, eignet sich besonders für die Verwendung als Virusinhibitor in der Nase. Drei IgA-H- Kettensequenzen sind beschrieben worden (Übersichtsartikel von Tsuzukida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 1104-1108 (1979)). Standardmethoden der Ligation einer ICAM-1-cDNA (geschnitten 3' in Bezug auf die vorstehend angegebenen Regionen) an eine IgA-H-Kette können angewandt werden. Die IgA-H-Kefte würde an oder zwischen den Resten 221-241 verknüpft (Nummerierungssystem von Tsuzukida et at., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 1104-1108 (1979)), so dass eine Region von IgA-H beginnend in dieser Region zum C-Terminus von IgA-H mit dem C-terminalen Abschnitt der Chimäre verknüpft würde. ICAM-1 wäre analog zu einem Fab- Fragment; keine L-Kette wäre erforderlich, da VH und CH1 von IgA in diesem Konstrukt nicht vorhanden sind.
IgA ist auf eine mucosale Umgebung spezialisiert (Underdown et al., Ann. Rev. Immunol. 4: 389417 (1986)) und kann die Stabilität von ICAM-1-Chimären verstärken. Zusätzlich mag die Fähigkeit derartiger Moleküle zur Bindung an Mucopolysaccharide die Clearance von Rhinovirus oder die Aufrechterhaltung in der Nase verstärken.
Ferner polymerisieren IgA-C-Regionen. Ein IgA-Monomer enthält 2 H- und L-Ketten; ein chimäres ICAM-1-IgA-H-Ketten-Monomer würde 2 ICAM-1-H-Ketten enthalten, die durch ein Disulfid in der IgA-Scharnierregion sowie nicht kovalente Wechselwirkungen zwischen CH2 und CH3 stabilisiert würden. Diese Monomereinheiten können weiter zu Dimeren und Trimeren durch einen Gysteinrest bei IgA-Aminosäureposition 472 zusammengefügt werden, der Monomere miteinander verbinden kann, oder mit einer J-Kette. Derartige Konstrukte können ohne Cotransfektion mit J-Kettenkonstrukten verwendet werden, um zusätzliche Eigenschaften zu verleihen und die Stabilität zu verändern. Eine J-Kette ist nicht erforderlich, um dimere und trimere IgA zu erhalten.
Chimären haben den Vorteil eines multimeren ICAM-1 für Mehrpunktwechselwirkungen mit Rhinovirus, was die Affinität erhöht und damit die Konzentration an ICAM-1, die für die Neutralisation von zwischen 10&supmin;&sup9; M und 10&supmin;¹² M erforderlich ist, verringert. Die Scharnierregion von IgA erlaubt eine richtige Orientierung für die Bindung an Rhinovirus und ist aufgrund der O-verknüpften Glycosylierung proteaseresistent. IgA1 und IgA2 und allele Varianten von IgA2, A2m(1) und A2m(2), unterscheiden sich in der Sequenz der Scharnier- und CH-Domänen und in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Proteasen (vergl. J. G. Flanagan et al., Cell 36: 681-688 (1984), wobei diese Arbeit durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird).

Beispiel 4

ICAM-1-Grobstruktur und die Bindungsstellen für LFA-1 und Rhinovirus: Virale Mimikry eines Zelladhäsionsrezeptors

ICAM-1 und ein zweiter LFA-1-Gegenrezeptor, ICAM-2, stellen eine Unterfamilie der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie dar (D. E. Staunton et al., Cell 52: 925: 933 (1988), wobei diese Arbeit durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird). ICAM-1 besitzt 5 Ig-artige C-Domänen, während ICAM-2 zwei besitzt, die am stärksten homolog zu den aminoterminalen Domänen von ICAM-1 sind. ICAM-1 und ICAM-2, die auf einer Reihe von Zelltypen exprimiert werden, unterstützen verschieden Leukozytenadhäsions-abhängige Funktionen unter Einschluss von Induktions- und Effektorfunktionen bei der immunantwort. Die ICAM-1-Expression ist in starkem Maße induzierbar durch Cytokine, und damit ist das LFA-1/ICAM-1-Adhäsionssystem imstande, die Leukozytenmigration und Lokalisierung während der Entzündung zu leiten (R. Rothlein, J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986); S. D. Marlin et al., Cell 51: 813-819 (1987); T. K. Kishimoto et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989); M. L. Dustin et al., Immunol. Today 9: 213-215 (1988)).
LFA-1 (CD11a/CD18) ist ein Mitglied der Integrin-Familie, das am engsten verwandt zu zwei anderen Leukozytenintegrinen ist, Mac-1 (CR3; CD11b/CD18) und p150/95 (CD11c/CD18) (R. O. Hynes, 48: 549-554 (1987)). Es ist gezeigt worden, dass Mac-1 zusätzlich zur Unterstützung der Neutrophilenadhäsion mehrere Liganden unter Einschluss von iC3b, Leishmania gp63 und Fibrinogen bindet (E. Ruoslahti et al., Cell 44: 517-518 (1986); R. O. Hynes, Cell 48: 549-554 (1987)). Die Bindung dieser Liganden kann in Konkurrenz mit Peptiden gebracht werden, die eine RGD- oder KXXDS- Sequenz enthalten (S. D. Marlin et al., Cell 51: 813-819 (1987)). Keines der ICAM besitzt eine RGD- oder KXXDS-Sequenz. Es ist daher konsistent, dass die Wechselwirkung zwischen ICAM-1 und LFA-1 nicht in Konkurrenz zu RGD-Peptiden steht. Die Stelle des Kontakts von IGAM-1 mit LFA-1 ist also nicht ersichtlich durch Analogie zu vielen anderen Integrin-Ligand-Wechselwirkungen.
Es ist kürzlich gezeigt worden, dass die Wirkung von ICAM-1 als ein Rezeptor durch die Hauptgruppe der Rhinoviren unterlaufen wird (J. M. Greve et al., Cell 56: 839-847 (1989); D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989); J. E. Tomassini et al., Proc. Nat(. Acad. Sci. (USA) 86: 4907-4911 (1989)). Rhinoviren, Mitglieder der kleinen, RNA enthaltenden, mit Proteincapsiden versehenen Picornavirus-Familie, rufen 40 bis 50% üblicher Erkältungen hervor (R. R. Rueckert, in: Fields Virology, B. N. Fields et al. (Hrsg.), Raven Press, NY, (1985) S. 705-738; S. J. Sperber et al., Antimicr. Agents Chemo. 3: 409-419 (1988)). Über 100 immunologisch nicht kreuzreagierende Rhinoviren sind definiert worden, von denen 90% an ICAM-1 binden.
Die Röntgenkristallographie zeigt, dass Rhinoviren einen Durchmesser von 30 nm aufweisen und eine Icosaedersymmetrie mit 60 Kopien jedes Capsidproteins haben (M. G. Rossmann et al., Nature 317: 145-153 (1985)) und damit 60 potenzielle Bindungsstellen für ICAM-1 haben. Auf der Basis von Aminosäuresubstitutionsmütanten und Konformationsänderungen, die durch Bindung von antiviralen Arzneistoffen induziert werden, ist eine tiefe Region einer Einwölbung oder ein Canyon in dem Capsid identifiziert worden, der um dessen 5-fache Achsen verläuft (M. G. Rossmann et al., Nature 317: 145-153 (1985); R. J. Colonno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5449-5453 (1988); M. G. Rossmann et al., Ann. Rev. Biochem. 58: 533-573 (1989)). Reste am Grund des Canyon werden mit der ICAM-1-Bindungsfunktion in Verbindung gebracht.
Es wird vorhergesagt, dass eine einzelne ICAM-1-Ig-artige Domäne ungefähr die richtigen Abmessungen aufweist, um mit HRV-Resten am Canyongrund zu assozileren (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989)); es wird jedoch vorhergesagt, dass ein Antikörper-Fab-Fragment ausgeschlossen ist (M. G. Rossmann et al., Nature 317: 145-153 (1985)). Da die Antikörper-Kombinationsstelle auf einem Fab- Fragment zu groß ist, um in Kontakt mit dem Canyongrund zu kommen, kann die Rezeptorspezifität durch vergleichsweise stark konservierte Reste am Canyongrund erhalten werden, während Mutationen von Resten am Canyonrand neue Serotypen erlauben und es ermöglichen, der Immunüberwachung zu entweichen; die "Canyonhypothese" (M. G. Rossmann et al., Nature 317: 145-153 (1985); R. J. Colonno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5449-5453 (1988); M. G. Rossmann et al., Ann. Rev. Biochem. 58: 533-573 (1989)).
Gesamtgröße und Form von ICAM-1 sind wichtig für das Verständnis, wie dessen Ig- Domänen angeordnet sind. Bis jetzt sind Röntgenkristallstrukturen für Mitglieder der Ig-Superfamilie nur für Immunglobuline und HLA-Antigene verfügbar, die gepaarte Ig-Domänen aufweisen; Domänen können jedoch auch ungepaart sein, wofür Thy-1 ein Beleg ist, das eine einzelne Domäne enthält.
Drei nicht-kreuzblockierende ICAM-1-mAb (RR1/1, R6.5 und LB-2), die die Bindung an LFA-1 blockieren, blockieren auch die HRV-Bindung, während ein weiterer (CL203) weder LFA-1- noch HRV-Bindung blockiert (M. W. Makgoba et al., in: Immunobiology of HLA, Bd. II: Immunogenetics and Histocompatibility, B. Dupont, Hrsg., New York: Springer-Verlag, S. 577-580 (1989); M. Maio, J. Immunol. 143: 181- 188 (1989); D. E. Staunton et aL, Cell 56: 849: 853 (1989)). Dieser Befund zeigt, dass LFA-1 und HRV möglicherweise an eine überlappende Region auf ICAM-1 binden.
Es ist kürzlich festgestellt worden, dass neben ICAM-1 das Zelladhäsionsmolekül CD4 und der Komplementrezeptor CR2 als Virusrezeptoren von HIV bzw. EBV-Viren unterlaufen werden (P. J. Maddon, Cell 47: 333-348 (1986); J. D. Fingeroth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 45104514 (1984)). Ferner ist ein Poliovirus-Rezpetor ein Molekül mit einer Ig-Domänenstruktur ähnlich zu ICAM-1, und er mag eine Funktion bei der zellulären Adhäsion haben (C. L. Mendelsohn et al., Cell 56: 855- 865 (1989)). Dies mag mehr als eine zufällige Übereinstimmung sein, da Zelladhäsion und Virusadhäsion im Prinzip sehr ähnlich sind. Es scheint daher, dass die Region des Zelladhäsionsmoleküls, die für Bindung durch das Virus genutzt wird, ähnlich zu der Region ist, die für die Bindung an den Zelladhäsionsrezeptor angepasst ist.
Bindungsstellen für LFA-1 und HRV wurden unter Anwendung der gerichteten Mutagenese bestimmt. Regionen auf ICAM-1 wurden durch Deletion von Domänen und Erzeugung von Aminosäuresubstitutionen durch gerichtete Mutagenese definiert. Die Charakterisierung der Bindungsstellen auf ICAM-1 für LFA-1 liefert Erkenntnisse über die Wechselwirkung zwischen Ig und lntegrin-Superfamilienmitglieder.

Beispiel 5

Erzeugung von ICAM-1-Mutanten Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese

Die kodierende Region einer ICAM-1-cDNA in einem 1,8 kb SaII-KpnI-Fragment wurde in den Expressionsvektor CDM8 subkloniert (B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84: 3365-3369 (1987)). Auf der Basis des Verfahrens von T. Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 488-492 (1985)) und der Modifikationen von D. Staunton et al. (D. E. Staunton et al., Cell 52: 925: 933 (1988)) wurde dieses Konstrukt (pCD1.8) verwendet, um eine einzelsträngige Uracil enthaltende Matrize zu erzeugen, die bei der Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese verwendet werden sollte.
Kurz gesagt wurde der E. coli-Stamm XS127 mit pCD1.8 transformiert. Einzelkolonien wurden in 1 ml Luria-Brühe (LB)-Medium (Difco) mit 13 ug/ml Ampicillin und 8 ug/ml Tetracyclin bis nahezu zur Sättigung gezüchtet. 100 ul der Kultur wurde mit R408-Helferphage (Stratagene) mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 infiziert, und 10 ml des LB-Mediums mit Ampicillin und Tetracyclin wurden für eine Kultur von 16 Stunden bei 37ºC zugesetzt. Nach Zentrifugation bei 10 000 U/min für 1 Minute und 0,22 um-Filtration des Überstands wurde die Phagensuspension verwendet, um E. coli BW313/P3 zu infizieren, die dann auf LB-Agar (Difco)-Platten, angereichert mit Ampicillin und Tetracyclin, plattiert wurden. Kolonien wurden entnommen, in 1 ml LB-Medium mit Ampicillin und Tetracyclin bis nahezu zur Sättigung gezüchtet und mit Helferphage bei einem MOI-Wert von 10 infiziert. Das Kulturvolumen wurde dann auf 250 ml erhöht, und die Zeilen wurden über Nacht kultiviert. Einzelstrang-DNA wurde durch Standardphagenextraktion isoliert.
Mutierte Oligonucleotide wurden phosphoryliert und mit der pCD1.8-Matrize in einer Zweitstrangsynthesereaktion verwendet (D. E. Staunton et ab, Cell 52: 925: 933 (1988)).

Transfektion

COS-Zellen wurden auf 10 cm-Gewebekulturplatten überimpft, so dass sie zu 50% konfluent nach 16 bis 24 Stunden waren. COS-Zellen wurden dann 1-mal mit TBS gewaschen und für 4 Stunden mit 4 ml RPMI mit einem Gehalt an 10% Nu-Serum (Collaborative), 5 ug/ml Chlorochin, 3 ug mutiertes Plasmid und 200 ug/ml DEAE- Dextransulfat inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 10% DMSO/PBS, gefolgt von PBS, gewaschen und 16 Stunden in Kulturmedium kultiviert. Das Kulturmedium wurde durch frisches Medium ersetzt, und 48 Stunden nach der Transfektion wurden COS-Zellen durch Trypsin/EDTA (Gibco)-Behandlung suspendiert und auf 2 10 cm- Platten sowie Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen für die HRV-Bindung aufgeteilt. Nach 72 Stunden wurden die Zellen von den 10 cm-Platten mit 5 mM EDTAIHBSS geerntet und für die Adhäsion an LFA-1-beschichteten Kunststoff und Immunfluoreszenz aufgearbeitet.

LFA-1- und HRV-Bindung

LFA-1 wurde aus SKW-3-Lysaten durch Immunaffinitätschromatographie auf TS2/4 LFA-1 mAb-Sepharose gereinigt und bei einem pH-Wert von 11,5 in Gegenwart von 2 mM MgCl&sub2; und 1% Octylglucosid eluiert. LFA-1 (10 ug pro 200 ul pro 6 cm-Platte) wurde an bakteriologische Petri-Schalen durch Verdünnung des Octylglucosids auf 0,1% in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) mit 2 mM MgCl&sub2; und Inkubation über Nacht bei 4ºC gebunden. Die Platten wurden mit 1% BSA (Rinderserumalbumin) blockiert und in PBS mit einem Gehalt an 2 mM MgCl&sub2;, 0,2% BSA, 0,025% Azid und 50 ug/ml Gentamycin gelagert.
&sup5;¹Cr-markierte COS-Zelten in PBS mit einem Gehalt an 5% FCS (fötales Kälberserum), 2 mM MgCl&sub2;, 0,025% Azid (Puffer) wurden mit oder ohne 5 ug/ml RR1/1 und R6.5 in LFA-1-beschichteten Mikrotiterplatten bei 25ºC für 1 Stunde inkubiert. Nicht anhaftende Zellen wurden durch 3-maliges Waschen mit Puffer entfernt. Anhaftende Zellen wurden durch Zugabe von EDTA bis 10 mM eluiert und einer γ-Zählung unterzogen.
Für HRV-Bindungsstudien wurden COS-Zellen erneut auf eine Platte mit 24 Vertiefungen überimpft. 1 Tag später wurde die konfluente Monoschicht 2-mal mit 1 ml RPMI 1640/10 mM MgCl&sub2;/25 mM Hepes, pH-Wert: 7,3 (Rhinovirus-14-Puffer) gewaschen. Transfizierte COS-Zellen wurden mit &sup5;¹Cr für die Bindung an LFA-1-beschichteten Kunststoff markiert, wie zuvor beschrieben (D. E. Staunton et al., Nature 339: 61-64 (1989)). Immunpräzipitation und indirekte Immunfluoreszenz wurden unter Verwendung der ICAM-1-mAb RR1/1 (R. Rothlein et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)), R6.5 (R. Rothlein et al., J. Immunol. 141: 1655-1669 (1988)), LB-1 (E. A. Clark et al., Hum. Immunol. 16: 100-113 (1986)) und CL203 (M. Maio, J. Immunol. 143: 181-188 (1989)) durchgeführt.
[³&sup5;S]-Met-markiertes HRV14 (B. Sherry et al., J. Virol. 57: 246-257 (1986), wobei diese Arbeit durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird), und zwar 15 bis 25 000 cpm (ungefähr 107 PFU) in 100 ul HRV-Puffer, wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Bindung trat in 1 Stunde bei 35ºC in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre mit horizontaler Rotation (100 U/min) ein. Nicht gebundenes [³&sup5;S]- HRV14 wurde abgesaugt, COS-Zellen wurden vorsichtig mit 150 ml HRV-Puffer gewaschen und dann mit 1% SDS in PBS für die Szintillationszählung solubilisiert.
LFA-1- und HRV-14-Bindung an ICAM-1-Mutanten wurde um die Bindung an scheintransfizierte Zellen korrigiert und unter Berücksichtigung des Prozentsatzes an COS-Zellen, die mit CL203 mAb angefärbt wurden, und des Prozentsatzes der mit Wildtyp erhaltenen Bindung normiert:
%Bindung = ((%Mutantenbindung - %Scheinbindung)/%Mutanten-CL203-Anfärbung)/(% Wildtypbindung - %Scheinbindung)/%Wildtyp-CL203-Anfärbung · 100
Die Bindung von RR1, R6.5 und LB-2 mAb wurde auf die Bindung von CL203 mAb unter Verwendung der spezifischen linearen Fluoreszenzintensität (SLFI) normiert:
%CL203 = ((mAb SLFI) · 100)/CL203 mAB SLFI
Der Prozentsatz an Wildtyp-ICAM-1-exprimierenden COS-Zellen, die an LFA-1 banden, variierte von 11-63% (Mittelwert = 33%); der Prozentsatz der scheintransilzierten bindenden COS-Zellen variierte von 0 bis 1%. Der Prozentsatz an [³&sup5;S]- Methionin-markiertem HRV-14, das an die COS-Zellen, die Wildtyp-ICAM-1 exprimierten, band, variierte von 6-43% (Mittelwert = 21%); der Prozentsatz der bindenden scheintransfizierten COS-Zellen variierte von 0 bis 4%.
Die [³&sup5;S]-HRV14-Bindung an ICAM-1-beschichteten Kunststoff erfolgte, wie von D. E. Staunton et al., (Cell 56: 849-853 (1989)) beschrieben, jedoch mit der Modifikation des HRV-Puffers wie angegeben. Die Inkubationsbedingungen waren 35ºC, 5% CO&sub2; für 1 Stunde mit Rotation.
Anti-ICAM-1-Antikörper, wie RR1/1, R6.5, LB-2 und CL203 wurden identifiziert. Wenn diese Antikörper imstande sind, die ICAM-1-Funktion zu inhibieren, dann müssen sie imstande sein, an eine bestimmte Stelle auf dem ICAM-1-Molekül zu binden, die auch wichtig für die ICAM-1-Funktion ist. Durch Herstellung der vorstehend beschriebenen Deletionsmutanten von ICAM-1 und Bestimmung des Ausmaßes, in dem die anti-ICAM-1-Antikörper an die Deletion binden können, ist es also möglich, zu bestimmen, ob die deletierten Domänen wichtig für die Funktion sind.

Beispiel 6

Visualisierung von ICAM-1 durch Elektronenmikroskopie

Das ICAM-1-Molekül wurde unter Verwendung eines Elektronenmikroskops untersucht. Um das ICAM-1-Molekül für die Elektronenmikroskopie sichtbar zu machen, wurde ein lösliches Fragment von ICAM-1, das alle 5 extrazellulären Ig-artigen Domänen besitzt (Fig. 4), aus dem Kulturmedium von COS-Zellen, die mit einem ICAM- 1-Mutantenkonstrukt pCDsD1-5 transfiziert waren, gereinigt.
ICAM-1 wurde aus COS-Zellen auf folgende Weise hergestellt. COS-Zellen bei 50% Konfluenz wurden nach dem DEAE-Dextranverfahren (R. E. Kingston, in: Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, S. 9.0.1-9.9.6 (1987)) unter Verwendung von 0 (Scheintransfektion) oder 4 mg Plasmid/10 cm-Platte transfiziert.
Abgesondertes ICAM-1 wurde aus den Überständen der COS-Zellen, die mit pCDsD1-5 transfiziert waren, gereinigt, wie es von Martin und Springer (S. D. Martin et al., Cell 51: 813-819 (1987)) beschrieben wurde, und zwar mit geringfügigen Modifikationen, wie nachstehend erörtert. Überstände wurden zwischen Tag 4 und 12 nach Transfektion geerntet. 200 ng/ml sICAM-1 wurden 0,22 u-filtriert und über RR1/1-Sepharose (5 ml, 5 mg/ml) bei 0,5 ml/min geleitet. Die Säule wurde gewaschen und mit 50 mM Triethanolamin-HCl, 0,15 M NaCl bei einem pH-Wert von 10 bzw. einem pH-Wert von 12,5 eluiert, und die Fraktionen wurden unmittelbar anschließend neutralisiert.
Lösliches ICAM wurde in 0,2 M Ammoniumbicarbonat, 30% Glycerol dialysiert und für die Elektronenmikroskopie durch Rotationsbeschattung vorbereitet (W. E. Fowler et al., J. Molec. Biol. 134: 241-249 (1979)). Alternativ wurde lösliches ICAM durch einen 15-40%-Glycerolgradienten in 0,2 M Ammoniumbicarbonat sedimentiert, und die ICAM-Fraktionen wurden direkt für die Rotationsbeschattung verwendet. Der Sedimentationskoeffizient wurde durch Vergleich mit Standardproteinen in einem anderen Gradienten (Kurve extrapoliert von Katalase bei 11,3 S und Rinderserumalbumin bei 4,6 S) abgeschätzt. Der für ICAM abgeschätzte Wert von 3,5 S sollte innerhalb ± 0,5 S genau sein. Längenmessungen erfolgten aus Drucken, die 250 000-fach vergrößert waren, wobei 1 nm von jedem Ende als die abgeschätzte Dicke der Schafe aus Metall abgezogen wurden (W. E. Fowler et al., J. Molec. Biol. 134: 241-249 (1979)).
ICAM-Moleküle wurden durch Sedimentation durch einen Glycerolgradienten in 0,2 M Ammoniumbicarbonat analysiert. Die ICAM-Moleküle blieben nahe dem oberen Ende des Gradienten mit einem Sedimentationskoeffizienten, der zu etwa 3,5 S abgeschätzt wurde. Für ein Molekulargewicht von 92 kD zeigt dies einen Wert von f/fmin = 2,0, was ein Hinweis auf ein stark elongiertes Molekül ist (H. P. Erickson, Biophys. J. 37: 96a (1982)).
Rotationsbeschattete ICAM-Moleküle erschienen als dünne Stäbchen, die entweder gerade waren oder einen einzelnen Knick aufwiesen. Moleküle mit einer gleichmäßigen Krümmung oder mit zwei Knicken wurden selten beobachtet, was auf eine starre Stäbchenstruktur mit einem einzelnen Scharnierpunkt hindeutet. Der Winkel des Knicks war zwar in gewissem Maße variabel; in den meisten der offensichtlich geknickten Moleküle betrug der Winkel jedoch nahe 90º.
Längenmessungen ergaben einen Wert von 16,6 ± 0,24 nm (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 25) für die geraden Moleküle. Für die geknickten Moleküle war der lange Arm 11,8 ± 0,12 nm, und der kurze Arm war 6,9 ± 0,15 nm (n = 21). Die Gesamtlänge der geknickten Moleküle (18,7 nm) war etwas länger als die für die geraden Moleküle gemessene Länge. Es ist möglich, dass die Population der geraden Moleküle einige enthielten, in denen der kurze Arm hin zum Beobachter geknickt war, so dass das vollständige Profil verdeckt wurde. Die geknickten Moleküle stellen also eine zuverlässigere Population für die Längenmessung dar. Der Stab schien einen gleichmäßigen Durchmesser in der Größenordnung von 2-3 nm zu haben.
Es wurde festgestellt, dass das ICAM-Molekül 5 Wiederholungen der IgG-artigen Domänen, die Abmessungen von 4 · 2,5 · 2 nm haben, aufweist. Die Gesamtlänge des ICAM-Moleküls (18,7 nm) zeigt 3,7 nm pro IgG-Wiederholung an und deutet darauf hin, dass die Domänen entlang ihrer fangen Achsen in einem kleinen Winkel zur Achse des Stäbchens angeordnet sind. Modelle, in denen zwei oder vier der IgG- artigen Domänen miteinander gepaart sind, sind zu kurz. Der Knick war also ein Punkt etwa 2/5 entlang des Stäbchens, was darauf hindeutet, dass sie zwischen den Domänen 2 und 3 oder zwischen den Domänen 3 und 4 auftritt und zu einer Unterteilung in einen kurzen und einen langen Arm führt.

Beispiel 7

Bindung von ICAM-1-Deletionsmutanten an LFA-1 und HRV

ICAM-1 ist ein integrales Membranprotein, von dem vorhergesagt wird, dass die extrazelluläre Domäne aus 5 Ig-artigen C-Domänen zusammengesetzt ist. Um die Stelle/Stellen des LFA-1- und HRV-Kontakts zu einer bestimmten ICAM-1-Ig-artigen Domäne/zu Domänen zu lokalisieren, wurden gesamte Domänen durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese deletiert, und es erfolgten funktionelle Tests nach Expression in COS-Zellen (Fig. 4). Außerdem wurde die zytoplasmatische Domäne deletiert, um deren möglichen Beitrag zur Adhäsion zu bestimmen.
Eine abgesonderte Form von ICAM-1 unter Einschluss der Domänen 1 bis 5 wurde durch Mutation der beiden sich am weitesten in Richtung Carboxyterminus befindlichen extrazellulären Reste Y452 und E453 in F bzw. ein translationales Stoppcodon hergestellt (pCDsD1-5). Die gesamte zytoplasmatische Domäne von ICAM-1 wurde deletiert (Dcyt.&supmin;), und zwar durch Transformation des Codons für den carboxyterminalen Transmembranrest Y476 in ein translationales Stoppcodon. D3 und D4 und 5 wurden unter Verwendung langer (48 bp) mutierter Oligonucleotide, um die distale ICAM-1-Sequenz zu überbrücken, so dass Codons für F185 und P284 (D3&supmin;) und P284 und R451 (D4&supmin;5&supmin;) verknüpft wurden, hergestellt (Fig. 4). Die gewünschten Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Nach Transfektion wurden ICAM-1-Mutanten, die Deletionen der zytoplasmatischen (Y476/* oder Dcyt.&supmin;), dritten (D3&supmin;) sowie vierten und fünften (D4&supmin;5&supmin;) Domänen besaßen, in 50-60% COS-Zellen bei ähnlichen charakteristischen breiten Spiegeln exprimiert (Fig. 5). Immunpräzipitation und SDS-PAGE von Dcyt&supmin;, D3&supmin;- und D4&supmin;5&supmin;- ICAM-1 aus COS-Zellen relativ zum Wildtyp zeigte eine Abnahme von 3, 24 bzw. 23 kD. Wildtyp-ICAM-1 (ungefähr 92 kD bei Expression in COS-Zellen) weist ein 55 kD- Kernprotein auf, und somit kann jede der acht verknüpften Glycosylierungsstellen im Mittel 4 kD Oligosaccharid besitzen. Auf der Basis der vorhergesagten Glycosylierung der einzelnen Domänen (Fig. 4) sind die beobachteten Abnahmen der Masse in vernünftigem Maße in Übereinstimmung mit den erwarteten Abnahmen von 3, 19 bzw. 27 kD.
Der Wirkungsgrad der Expression von mutiertem ICAM-1 in diesen Studien wurde mit einem Satz von 4 ICAM-1-mAb untersucht. Diese 4 mAb (RR1/1, R6.5. LB-2 und CL203) hemmen nicht gegenseitig ihre Bindung an Zelloberflächen-ICAM-1, wie mit biotinyliertem mAb gezeigt wurde, was vorherige Ergebnisse bestätigt (S. D. Marlin et al., Cell 51: 813-819 (1987)). Sie binden also an vier verschiedene Epitope. Nach Transfektion werden ICAM-1-Deletionsmutanten in COS-Zellen in charakteristischen breiten Spiegeln exprimiert (Fig. 5). Alle mAb banden an die Dcyt-Mutante in Spiegeln äquivalent zu denen des Wildtyps (Fig. 6). Die Bindung von CL203 wurde bei Entfernung von D3 verringert und bei Entfernung von D4 und D5 beseitigt. Die Bindung der anderen drei mAb war für die D45-Mutante nicht beeinflusst und war für die D3-Mutante verringert, wenn auch in einem geringeren Grad als für CL203. Die Epitope für RR1/1, R6.5 und LB-2 befinden sich also innerhalb von D1 oder 2, und das für CL203 innerhalb von D4 oder 5. Die Dcyt- und D45-Mutanten werden in wirksamer Weise exprimiert, während die D3-Mutante bei etwa dem halben Spiegel des Wildtyps exprimiert zu werden scheint.
COS-Zellen, die alle drei Deletionsmutanten exprimieren, haften spezifisch an Kunststoff-gebundenem LFA-1 (Fig. 7, ausgefüllter Balken). Alle 3 Deletionsmutanten zeigen Wildtypspiegel der Anheftung an LFA-1. Die Deletion von D4 und 5 hatte keine signifikante Wirkung auf die LFA-1-Bindung, während die Deletion von D3 die LFA-1-Bindung auf ein Ausmaß vergleichbar zu seiner verringerten Expression verringerte. D1 und 2 sind also ausreichend für die Bindung an LFA-1.
Aminosäuresubstitutionen in den vorhergesagten β-Schleifen in den Domänen 1, 2 und 3 wurden ebenfalls erzeugt und funktionell nach Expression in COS-Zellen getestet. Das R6.5-Epitop wurde auf diese Weise in der Sequenz E111 GGA in Domäne 2 lokalisiert und mag auch E39 in Domäne 1 beinhalten, während RR1/1 und LB-2 beide von R13 in Domäne 1 abhängig sind (Tabelle 3). Außerdem wird die RR1/1- Bindung durch Mutationen in der Sequenz D71 GQS verringert. Mutationen, die die N-verknüpften Glycosylierungsstellen bei N103 und N165 ausschalten, resultieren in verringerter RR1/1-, R6.5- und LB-2- sowie LFA-1-HRV-Bindung. Diese Mutationen scheinen die Prozessierung zu beeinflussen, so dass ICAM-1-Dimere erzeugt werden.
Weitere Mutationen in Domäne 2 oder 3 führten nicht zu einer veränderten LFA-1- Anheftung oder HRV-Bindung (Tabelle 3). Außerdem mögen die Reste V4 und E90 ebenfalls eine Funktion bei der HRV-Bindung haben.
LFA-1- und HRV-Bindung scheint also eine Funktion der aminoterminalen Ig-artigen Domäne von ICAM-1 zu sein. Fig. 3 zeigt eine Ausrichtung der aminoterminalen Domänen von ICAM.
Die Bindung von HRV14 an ICAM-1-Domänendeletionsmutanten zeigt, dass D1 und 2 ebenfalls ausreichend für diese Wechselwirkung sind (Fig. 7, leere Balken). Domäne 3 und die zytoplasmatischen Domänendeletionsmutanten zeigen ebenfalls Wildtypspiegel der [³&sup5;S]-HRV-14-Bindung, während die Deletion der Domänen 4 und 5 zu einer Abnahme der Bindung auf ungefähr 30% Wildtyp führt (Fig. 7). Die verringerte Bindung der D3&supmin;-Mutante mag aus dem gleichen Grund erfolgen, der vorstehend für die LFA-1-Bindung angegeben wurde. Die Deletion von D4 und 5 resultiert jedoch in einer konsistenten Abnahme der Bindung von HRV14, die für LFA-1 nicht festgestellt wird. Sowie die Bindungsstelle auf ICAM-1 in den zellulären Glyco- Kelch durch die vorhergesagte Verkürzung um 8 nm bei Deletion von D4 und 5 eintaucht oder alternativ sowie sie weniger flexibel wird, wird sie weniger zugänglich für HRV.
Die Bindung von LFA-1 und HRV14 an D1 und 2 und die vorstehend berichteten mAb-Epitop-Lokalisierungsdaten korrelieren mit vorherigen mAb-Blockierungsdaten. Die ICAM-1-Stellen, die mit RR1/1, R6.5 und LB-2 in Wechselwirkung treten, sind also in den Domänen 1 und 2 lokalisiert und blockieren sowohl LFA-1- als auch HRV-Bindung, während die ICAM-1-Stellen, die mit CL203 in Wechselwirkung treten, in den Domänen 4 und 5 lokalisiert sind. CL203 blockiert weder Zelladhäsion noch Virusadhäsion (M. Maio, J. Immunol. 143: 181-188 (1989); (D. E. Staunton et al., Cell 52: 925: 933 (1988)).

Beispiel 8

ICAM-1-Aminosäuresubsti#utionsmutanten

Merkmale der hypothetischen Ig-artigen Domänen von ICAM-1 wurden nicht nur als Anleitung für die vorstehend beschriebenen Deletionsexperimente, sondern auch für Aminosäuresubstitutionen herangezogen. Es wird vorhergesagt, dass die drei aminoterminalen Ig-artigen Domänen von ICAM-1 jeweils 7 β-Stränge besitzen. Es wird vorhergesagt, dass diese Stränge in zwei Faltblättern angeordnet sind, die durch die Intradomänen-Disulfidbindung unter Bildung eines "Sandwich" verknüpft sind. Die Schleifen, die die β-Stränge in Immunglobulinen verknüpfen, bilden die Antigenbindungsstelle, und es gibt die Hypothese, dass sie bei intermolekularen Kontakten bei anderen Mitgliedern der Ig-Superfamilie genutzt werden (A. F. Williams et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 381405 (1988)). Die Strategie, die verfolgt wurde, bestand darin, zuerst zwei oder vier Aminosäuresubstitutionen pro Schleife in den Domänen 1 bis 3 einzuführen. Wenn Wirkungen gefunden würden, würden einzelne Substitutionen anschließend durchgeführt. Schließlich wurden in einigen Bereichen von Interesse Substitutionen in β-Stränge eingeführt.
Mutanten von ICAM-1 wurden auf folgende Weise erzeugt. Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese auf der Basis des Verfahrens von Kunkel (T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 488492 (1985)) mit Modifikationen von A. Peterson und B. Seed (Nature 329: 842-846 (1987)) wurden genutzt, um ICAM-1-Deletionen und Aminosäuresubstitutionen zu erzeugen. Mutationen wurden unter Verwendung einer einzelsträngigen Uracil enthaltenden Matrize von ICAM-1-cDNA, subkloniert in den Expressionsvektor CDM8 (pCD1.8), der zuvor beschrieben wurde (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849-853 (1989)) gemacht. Mutierte ICAM-1-Oligonucleotide, die eine einzigartige Restriktionsstelle ergeben, wurden verwendet, um eine Zweitstrangsynthesereaktion einzuleiten. Nach einer Transformation in E. coli wurden Mutanten durch Absuchen auf die einzigartigen Restriktionsstellen isoliert. Im allgemeinen wurden zwei oder mehr Isolierungen jeder Mutante in Bindungsstudien nach COS- Zelltransfektion untersucht.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 3 zusammengefasst. In Tabelle 3 wird der Einbuchstabencode für die Wildtypsequenz, gefolgt von einem Querstrich und dem Einbuchstabencode für die entsprechende mutierte Sequenz, zur Bezeichnung der Mutationen herangezogen. Die Position der ersten Aminosäure innerhalb der Sequenz ist angegeben. Wildtypreste stehen vor dem Schrägstrich, gefolgt von den Resten, durch die sie in der Mutante substituiert wurden. COS-Zellen, die ICAM- 1-Mutanten exprimierten, wurden auf die Anheftung an LFA-1-beschichteten Kunststoff und auf die Bindung von ³&sup5;S-Met-markiertem HRV14 untersucht. LFA-1 und HRV14-Bindung ist normiert zur Berücksichtigung des Prozentsatzes der Zellen, die mutiertes ICAM-1 exprimieren, und der Bindung von Wildtyp exprimierenden Zellen. Die Bindung ist angegeben als Mittelwert und Standardabeichung (SE) für mehrfache Experimente (n). Wirkungen von 2-fach oder mehr sind bei LFA-1-, HRV- und mAb-Bindungsassays reproduzierbar und werden daher als signifikant angesehen (fett und unterstrichen). Die spezifische lineare Fluoreszenzintensität (SLFI) von CL203 für jede Mutante wird auf den Wildtyp-CL203-SLFI-Wert (% WT) normiert, wie vorstehend erörtert. Der SLFI-Wert von RR1/1, R6.5 und LB-2 wird auf den CL203- SLFI-Wert der Mutante (%CL203) normiert, wie vorstehend beschrieben. Tabelle 3 Bindnung von ICAM-1-Aminosäuresubstitutionsmutanten an LFA-1 und HRV14 Tabelle 3 (Fortsetzung)
Da das Epitop von mAb CL203 auf D4 oder 5 lokalisiert ist, während D1-D3 Aminosäuresubstitutionen unterzogen wurden, wurde CL203 verwendet, um den Grad der Expression von ICAM-1-Aminosäuresubstitutionsmutanten in transfizierten COS- Zellen zu bestimmen. Die Bindung von ICAM-1-Mutanten an LFA-1 und HRV wurde im Hinblick auf mAb CL203-Bindung und auf die Bindung, die mit Wildtyp-ICAM-1 erzielt wurde, normiert. Da mAb RR1/1, R6.5 und LB-2 an unterschiedliche Epitope binden, weist ferner ein Verlust von zwei oder mehr dieser Epitope auf eine grobe Störung der Struktur hin, und entsprechende Wirkungen auf die LFA-1- und HRV- Bindung wurden nicht gezählt. Zwei Mutationen, nämlich Q271L und E90/K, die einen spezifisch verringerten Grad der Expression gemäß Messung mit CL203 zeigen, wurden ebenfalls nicht gezählt, da eine geringe Expression eine verringerte Effizienz der Faltung vors D1 widerspiegeln mag, wo diese Mutationen auftreten.
Zeigt sich bei Aminosäuresubstitutionsmutanten eine Abnahme der Bindung gegenüber nur einem ICAM-1-mAb, so deutet dies darauf hin, dass die entsprechenden Wildtypreste zu dem mAb-Epitop beitragen (Tabelle 3). Eine verringerte Bindung von mAb an Aminosäuresubstitutionsmutanten zeigt, dass das Epitop für RR1/1 die Reste D71 und Q73 und Sequenzen bei D26, K39 und Q62 beinhaltet. Das Epitop für R6.5 wird vollständig und spezifisch durch eine Mutation in der Sequenz bei E111 in D2 zerstört. LB-2-Bindung ist spezifisch betroffen von Mutationen in der Sequenz bei R49 in D1 und 8166 in D2.
Die Domänen 1 und 2 scheinen hinsichtlich der Konformation verknüpft. 12 von 53 Mutationen in D1 und ein ähnlicher Anteil in D2 (4 von 18) zerstören die Bindung von RR1/1-, R6.5- und LB-2-mAb, LFA-1 und HRV. Da diese Liganden an unterschiedliche Stellen (die mAb) oder nur partiell überlappende Regionen (LFA-1 und HRV, siehe nachstehend) binden, deutet die Möglichkeit, dass Mutationen, die weit über sowohl D1 als auch D2 verteilt sind, gemeinsame Wirkungen haben, darauf hin, dass die Konformation von D1 abhängig von der Konformation von D2 ist und umgekehrt. Im Gegensatz dazu beeinflusst keine der Mutationen in D3 die Bindung dieser Liganden, und keine dieser Mutationen beeinflusst die Bindung von CL203 mit Lokalisierung in D4 oder D5. Dies zeigt, dass es einen erheblichen Kontakt zwischen D1 und D2 gibt, dass D1 und D2 jedoch hinsichtlich der Konformation unabhängig von D3 sind; d. h., es kann ein Scharnier zwischen D2 und D3 geben. Die am stärksten zerstörerischen Mutationen beinhalten die Reste R13 und D60, für die in einem Ig- Modell (siehe nachstehend) vorhergesagt wird, dass sie in enge Nähe zu Resten von D2 kommen. Die Deletion von Resten in D2 (Reste P95-A189) führte zu einem Fehlen der Zelloberflächenexpression, was weiter anzeigt, dass die richtige Faltung von ICAM-1 von D1- und D2-Wechselwirkungen abhängt.
Die Zerstörung der Konformation bei zwei Mutationen spiegelt sich in einer fehlerhaften Disulfidbindungsbildung wider, Immunpräzipitation und nicht-reduzierende SDS-PAGE von 12 D1- und D2-Mutanten zeigte, dass zwei davon, nämlich N1031K und A155N/SV, ICAM-1-Disulfid-verknüpfte Dimere sind. Die Reste N103 und N156 treten in der Nähe von C108 und C159 auf, von denen vorhergesagt wird, dass sie die Intradomänen-Disulfidbrücke von D2 bilden.
Mutationen mit der stärksten Wirkung auf die LFA-1-Bindung sind in D1 lokalisiert. Die dramatischsten Mutationen sind E34/A, die die LFA-1-Bindung vollständig beseitigt, und Q731H, die sie 10-fach verringert (Tabelle 3). Eine andere Substitution bei Q73, nämlich Q731T, zeigte eine 2-fache Verringerung. Die Mutationen D26QPK/ALPE und G46NN/ASI verringern die LFA-1-Bindung 2- bis 3-fach. In der zweiten Domäne verringerten speziell die Mutanten N118/Q, N156/E, N175/A und S177/G die LFA-1-Bindung ungefähr 2-fach. Es wurde festgestellt, dass diese vier Mutanten drei der vier N-verknüpften Glycosylierungsstellen in D2 beeinflussen; es gibt keine N-verknüpften Glycosylierungsstellen in D1 (Fig. 4). Das N-verknüpfte Kohlenhydrat mag also eine kleine, jedoch kritische Rolle bei der LFA-1-Bindung haben. Die Wirkung dieser Mutationen kann mehr indirekt sein. Eine indirekte Wirkung, die die N-verknüpfte Glycosylierung in D2 haben mag, ist eine Änderung der Flexibilität des Scharniers. Keine der Mutationen in D3 beeinflusst die LFA-1-Bindung, in Übereinstimmung mit dem Fehlen einer Wirkung der Deletion von D3.
Eine Anzahl von Mutationen zeigt, dass D1 wichtiger als D2 bei der HRV-Bindung ist und dass HRV- und LFA-1-Bindungsstellen partiell überlappen. Sieben Mutationen verringern die HRV14-Bindung, haben jedoch keine Wirkung auf die LFA-1-Bindung. Die beiden, die die größte Wirkung zeigen, beinhalten Aminosäuresubstitutionen in D1. Q58/H eliminierte praktisch die HRV14-Bindung, und Q1T/KA resultierte in einer 10-fachen Verringerung. Vier weitere Mutationen in D1 zeigten eine spezifische 2-fache Wirkung auf die HRV-Bindung, nämlich K39KE/ERQ, R49KV/EKL, D71/N und K77T/ES. Eine Mutation in D2, nämlich R155PQ/EPA, führte zu einer 4-fachen Verringerung der HRV14-Bindung. D3-Mutationen beeinflussten die HRV-Bindung nicht.
Von den vier vorstehend erörterten D1-Mutationen, die die LFA-1-Bindung beeinflussen, beeinflussten 3 auch die HRV-Bindung. Die Mutanten D26QPK/ALPE und G46NN/ASI beeinflussten die HRV14-Bindung 10-fach und die LFA-1-Bindung 2- bis 3-fach. Die Mutante E34/A, die die LFA-1-Bindung völlig beseitigt, verringert die HRV-Bindung 2-fach. Vier Mutationen in D2, die die LFA-1-Bindung verringerten, hatten eine geringe oder keine Wirkung auf die HRV-Bindung.
Die Reste, die als kritisch (10-fache oder größere Wirkung) für die LFA-1-Bindung oder HRV-Bindung identifiziert wurden, zeigten also eine Trennung der Funktion. Die Mutationen E34/A und Q73/H, die merklich die LFA-1-Bindung verringeren, haben eine schwache oder nicht nachweisbare Wirkung auf die HRV-Bindung. Umgekehrt sind vorstehend Mutationen beschrieben worden, die eine ausgeprägte Wirkung auf die HRV-Bindung haben, jedoch die LFA-1-Bindung nicht beeinflussen. Eine Überlappung in den Bindungsstellen wird jedoch durch zwei Mutationen gezeigt, die sowohl LFA-1- als auch HRV-Bindung beeinflussen. Außerdem deuten Mutationen, die benachbart in der Sequenzposition sind, jedoch die Bindung von LFA-1 oder HRV (erläutert weiter unten) beeinflussen, auf die Nähe der Bindungsstellen hin.
Zehn Sequenzen/Reste, die wichtig für die LFA-1- und HRV14-Bindung sind, wurden in D1 definiert, im Gegensatz zu einer Sequenz und potentiell drei N-verknüpften Glycosylierungen in D2. Reste oder Sequenzen, die kritisch für die Bindung sind, wurden in D1, nicht in D2, identifiziert. Ferner änderte keine der Substitutionen in D3 die Bindung an LFA-1 oder HRV14, was die Ergebnisse der Deletion von D3 bestätigt. Die Hauptstelle für LFA-1- und HRV14-Kontakt ist in D1 lokalisiert.
Die Wechselwirkung von LFA-1 und HRV14 wurde weiter im Hinblick auf die Anforderungen im Hinblick auf zweiwertige Kationen verglichen. Es war zuvor gezeigt worden, dass ICAM-1 auf der Zeltoberfläche oder gebunden an Kunststoff Zeltoberflächen oder gereinigtes LFA-1 in einer von Mg²&spplus; abhängigen Weise bindet (S. D. Martin et al., Cell 51: 813-819 (1987); D. E. Staunton et al., Nature 339: 61-64 (1989)). Die Bindung der LFA-1 exprimierenden T-Lymphomlinie SKW3 und von HRV an gereinigtes ICAM-1 wurde auf einem Kunststoffsubstrat verglichen. Gereinigtes ICAM- 1, gebunden an Kunststoff, wurde herangezogen, und es wurde festgestellt, dass die LFA-1 exprimierende T-Zelllinie ICAM-1 nur in Gegenwart von Mg²&spplus; bindet (Fig. 8). Im Gegensatz dazu unterschied sich die Bindung von HRV14 an ICAM-1 nicht in signifikanter Weise in Gegen wart von 10 mM Mg²&spplus; oder 5 mM EDTA. Dies wurde bei einem Bereich von ICAM-1-Dichten auf dem Substrat bestätigt. Die LFA-1 : ICAM-1- und HRV : ICAM-1-Wechselwirkungen sind damit in unterscheidbarer Weise hinsichtlich der Anforderungen an zweiwertige Kationen verschieden.
Die vorstehenden Versuche zeigen, dass die extrazelluläre Region von ICAM-1 als ein mit einem Scharnier versehenes Stäbchen von 20 nm vorliegt. Dies deutet darauf hin, dass die fünf vorhergesagten Ig-artigen Domänen gestreckt und ungepaart sind und Ende-zu-Ende und nicht Seite-an-Seite ausgerichtet sind. ICAM-1 ist hinsichtlich der Gesamtstruktur damit ähnlich zu NCAM (A. Beckers et al., Immunochem. 11:ö05-609 (1974)). Die Gesamtlänge des extrazellulären ICAM-1 beträgt 18,7 nm und damit 3,7 nm pro Ig-Domäne. Der lange Arm von NCAM, der fünf IgG-artige Domänen umfasst, hat eine Länge von 17,6-18,7 nm, im wesentlichen identisch zur Gesamtlänge des ICAM-1-Moleküls (A. Beckers et al., Immunochem. 11: 605-609 (1974)).
Eine weitere auffällige Ähnlichkeit in den Strukturen von ICAM und NCAM besteht darin, dass beide Moleküle einen Knick, typischerweise bei 90º, jedoch mit einer Variation, die auf Flexibilität hinweist, aufweisen. In ICAM befindet sich dieser Knick wahrscheinlich zwischen zwei IgG-artigen Domänen, was einen langen Arm mit drei Domänen und einen kurzen mit zwei ergibt. Der Befund, dass die Konfirmationen von D1 und D2 voneinander abhängen, deutet darauf hin, dass das Scharnier sich zwischen D2 und D3 befindet. Die Sequenz an der D2-D3-Grenze zeigt die am stärksten Prolin-reiche Region in ICAM-1 (4 Proline innerhalb von 10 Resten). Dies stimmt überein mit Ig-Scharniersequenzen, die typischerweise Prolin-reich sind. In der Tat sind alte 4 Proline in dieser Region in Abständen angeordnet, die identisch zu 4 Prolinen in der Schamierregion von Maus-IgG3 sind.
In NCAM gibt es keinen Knick innerhalb der fünf IgG-artigen Domänen (diese bilden den scheinbar steifen langen Arm, der der Gesamtlänge von ICAM-1 entspricht); statt dessen folgt der Knick unmittelbar der Sequenz der IgG-artigen Domänen. Der kurze Arm von NCAM enthält zwei Fibronectin-artige Domänen, das die Membran überbrückende Segment und die zytoplasmatische Domäne (A. Beckers et al., Immunochem. 11: 605-609 (1974)).
Es ist bemerkenswert, dass das Zelladhäsionsmolekül LCAM, das keine IgG-artigen Domänen aufweist und mit ICAM oder NCAM nicht verwandt ist, ebenfalls einen 90º- Knick aufweist (J. W. Becker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 1088-1092 (1989)).
Dieses gemeinsame Merkmal der Zelladhäsionsmoleküle scheint also funktionell wichtig zu sein, um es zu ermöglichen, dass ein ausgedehntes Segment des Moleküls und nicht lediglich die Spitze seinem Rezeptor gegenübertritt und eine Grenzfläche damit bildet. Dies würde es Bindungsstellen, die auf dem distalen flexiblen Segment angeordnet sind, erlauben, an Rezeptoren zu binden, die in unterschiedlichen Winkeln orientiert und in variierenden Abständen im Hutblick auf die Membran der Zelle, die das ICAM-1-Molekül trägt, angeordnet sind. Ferner sollte die Segmentflexibilität, für die das Scharnier sorgt, die Diffusionsrate der Bindungsstelle innerhalb des Lösungsmittelvolumens oberhalb der Zeltoberfläche, auf die es durch die Anheftung an die Membran mit einem Ende beschränkt ist, erhöhen, womit die Kinetik der Bindung an Adhäsionsrezeptoren oder Viren verbessert und die Effizienz dieser Wechselwirkungen gesteigert wird.
Die stäbchenförmige ungepaarte Domänenorganisation von ICAM-1 erleichtert also die Adhäsion durch Erhöhung von Bindungsstellen auf eine kritische Distanz oberhalb der Zeltoberfläche. Die Rhinovirus-Bindung war empfindlicher als die LFA-1- Bindung gegenüber der Deletion von Domänen 4 und 5, von der vorausgesagt wird, dass sie ICAM-1 um 7,4 nm verkürzt und dessen Flexibilität beeinflusst. Dies mag mit zwei Unterschieden zwischen Rhinovirus und LFA-1 in Zusammenhang stehen. Erstens wird vorgeschlagen, dass die Bindungsstelle auf HRV in eine 2,5 nm tiefe Spalte innerhalb eines Canyons eintaucht, der einen Graben um die 5-fache Achse des Virions bildet (M. G. Rossmann et al., Nature 317: 145-153 (1985)), während elektronenmikroskopische Studien an Integrinen auf eine 10 · 8 nm globuläre Bindungsdomäne, abgestützt auf 18 nm langen Stielen oberhalb der Zeltoberfläche, hinweisen (N. A. Carreli et al., J. Biol. Chem. 260: 1743-1749 (1985); M. V. Nermut, EMBO J. 7: 4093-4.099 (1988)). Der zelluläre Glyco-Kelch (A. F. Williams et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405 (1988)), in den ICAM-1 durch seine Verkürzung eintaucht, mag das sperrigere Rhinovirus stärker als LFA-1 abstoßen. Zweitens würde die Bindung von mehreren ICAM-1-Molekülen an Rhinovirus (R. J. Colonno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5449-5453 (1988)) eine enge Nachbarschaft der ICAM-1- Moleküle zueinander erfordern, und diese Packung mag durch Verkürzung oder Verlust der Flexibilität behindert sein. Die LFA-1-Wechselwirkung mit ICAM-1 erfordert ebenfalls multivalente Wechselwirkungen; die LFA-1-Moleküle können jedoch gut voneinander getrennt sein, und auf der Basis des Gehalts an jeweils einer α- und einer β-Untereinheit wird vorhergesagt, dass sie jeweils eine Bindungsstelle aufweisen.
Die ungepaarte Domänennatur von ICAM-1 und die Anordnung der Sequenzen/Reste, die an der Bindung zu D1 beteiligt sind, ist in Übereinstimmung mit der ICAM-1-D1-Bindung innerhalb der tiefen Spalte der vorgeschlagenen HRV-Canyon- Bindungsstelle. Für die Grenzfläche von ICAM-1 und HRV mag man sich mindestens zwei verschiedene Modelle vorstellen. Auf der Basis von vorhergesagter Sekundärstruktur wurden ICAM-1-Sequenzen in einem Ig-Faltungsmodell angeordnet (Fig. 9). Vier der sechs D1-Sequenzen, die mit HRV-Kontakt (Q1T, D26QP, G46NN und R49KV) in Verbindung gebracht werden, befinden sich in diesem Modell auf der distalen Hälfte von D1. Die Abmessungen der tiefen Spalte (3-1,2 nm breit und 2,5 nm tief) sind so, dass etwas mehr als eine halbe Ig-artige Domäne (4 nm lang und 2,5-2 nm breit) eingeschoben werden könnte. Die distale Hälfte von ICAM-1-D1 mag daher Reste innerhalb der Spalte binden, so dass die lange Achse von D1 ungefähr senkrecht zur umgebenden Oberfläche des Virions ist. Der Abstand zwischen der Grenze jeder tiefen Spalte (ungefähr 4 nm) ist groß genug, um es einem iCAM-1 zu erlauben, alle fünf Spalten um die 5-fache Achse des Virions zu besetzen. Andere Sequenzen, die mit HRV-Kontakt in Zusammenhang gebracht werden, nämlich K39KE, Q58 und R166PQ, mögen mit HRV-Resten am Rand des Canyons in Wechselwirkung treten. Alternativ mögen diese Reste in D1 und 2 keine Bindungen mit HRV- Resten bilden, sondern zu Inter- und Intradomänenbindungen, die wichtig für die Bindungskonformation sind, beitragen. Ein zweites Modell der ICAM-1 : HRV-Wechselwirkung wäre, dass ICAM-1-D1 in Kontakt mit Resten der Spalte kommt, so dass die lange Achse von D1 einen spitzen Winkel mit der umgebenden Virionoberfläche bildet. D1 wäre also stärker parallel und horizontal in Bezug auf den Canyon. Dies mag zur Blockierung einiger Stellen um die 5-fache Achse durch sterische Hinderung führen.
Da 3 nicht-kreuzblockierende iCAM-1-mAb sowohl LFA-1- als auch Rhinovirus-14- Bindung blockieren, wurde zuvor vorgeschlagen, dass LFA-1- und Rhinovirus-14- Kontaktstellen auf ICAM-1 sich in enger Nachbarschaft befinden (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989)). Unsere vorliegenden Studien zeigen die Bindungsstelle für Rhinovirus-14. Wir haben diese Sequenzpositionen auf ICAM-1-Domänen 1 und 2 modelliert (Fig. 9), und zwar unter der Annahme einer Ig-Domänenstruktur (A. F. Williams et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 381-4.05 (1988)), wobei die Ig-Faltung jedoch in wichtiger Hinsicht für Ig-Familienmitglieder mit ungepaarten Domänen abweichen kann. Die Gharakterisierung der Mutanten G46NN/ASI, D26QPK/ALPE und E341A zeigt die gemeinsame Nutzung von ICAM-1-Sequenzen bei LFA-1- und Rhinovirus- 14-Bindung. Die vorhergesagte Anordnung der Kontaktsequenzen in dem Ig-Domänenmodell ist in Übereinstimmung mit der engen Nachbarschaft oder Überlappung der LFA-1- und Rhinovirus-14-Bindungsstellen. Reste, die mit der LFA-1-Bindung in Zusammenhang gebracht werden, wie Q73 und G46, sind benachbart zu Resten, die mit der Rhinovirus-14-Bindung in Zusammenhang gebacht werden, nämlich D71 und R49. Rhinovirus-14 scheint sich also so entwickelt zu haben, dass es an eine Stelle auf ICAM-1 bindet, die mit der LFA-1-Bindungsstelle überlappt. Die beiden Bindungsstellen lassen sich jedoch klar unterscheiden, und zwar durch die Mutationen E34 und Q58, die in dramatischer und selektiver Weise die LFA-1- bzw. Rhinovirus-Bindung beenden. Drei der vier D1-Sequenzen, die mit dem LFA-1-Kontakt in Zusammenhang gebacht werden, und 6 der 9 Sequenzen, die mit dem Rhinovirus- 14-Kontakt in Zusammenhang gebracht werden, befinden sich in diesem Modell auf der Membran-distalen Hälfte von D1; einige der Stellen, an denen Mutationen die dramatischsten Wirkungen haben, befinden sich jedoch auf der proximalen Hälfte. Die Überlappung der Rhinovirus- und LFA-1-Bindungsstellen in Domäne 1 scheint eine Konsequenz der Begünstigung dieser Domäne als eine Adhäsionswechselwirkungsstelle zu sein, wie vorstehend dargelegt wurde. Alternativ mag ICAM-1 ein Rezeptor mit einer Trigger-Funktion in Antigen-präsentierenden Zellen sein. In diesem Szenario würde die Bindung an Domäne 1 über ICAM-1 eine Antwort auslösen, die vorteilhaft für Rhinovirus wäre, z. B. durch Stimulierung nasaler Absonderungen, die dazu beitragen würden, das Virus auf andere Leute auszubreiten. Dies wäre ein Beispiel für evolutionäre Mimikry.
Die Kontaktstelle auf ICAM-1 unterscheidet sich von der vieler anderer Integrinliganden in Sequenz und Struktur. Viele Integrine, die an extrazelluläre Matrixproteine binden, binden an eine RGD- oder eine RGD-artige Sequenz in ihren Liganden (E. Ruoslahti et al., Cell 44: 517-518 (1986); R. O. Hynes, 48: 549-554 (1987)). Humanes ICAM-1 weist keine RGD-Sequenzen, jedoch mehrere RGD-artige Sequenzen auf (D. Simons et al., Nature 331: 624-627 (1988); (D. E. Staunton et al., Cell 52: 925: 933 (1988)); ICAM-1 aus Maus enthält eine RGD-Sequenz. Keine dieser Stellen entspricht jedoch Resten, die in unseren Mutagenesestudien als wichtig für die LFA-1- Bindung an ICAM-1 definiert wurden. Anstelle einer zusammenhängenden Sequenz wie RGD scheint eine Anzahl nicht zusammenhängender Sequenzen in ICAM-1 erkannt zu werden. Dies ist ähnlich zur Ig-Bindung an Proteinantigene, in denen Reste in drei nicht zusammenhängenden, die Komplementarität bestimmenden Regionen Erkennungsspezifität verleihen (P. M. Aizari et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 555-580 (1988)).
ICAM-1 ist imstande, ein weiteres Leukozytenintegrin, nämlich MAC-1, zu binden, das auch Liganden, wie iC3b und Fibrinogen, in einer RGD-abhängigen Weise bindet. Die Stelle auf ICAM-1, die MAC-1 bindet, scheint jedoch verschieden von der zu sein, die LFA-1 bindet. MAC-1 bindet also an eine RGD-artige Sequenz auf ICAM-1, was in besserer Übereinstimmung mit seinen anderen Bindungsspezifitäten wäre.
ICAM-1-Reste, die vorstehend als wichtig für die LFA-1-Bindung definiert wurden, sind in anderen ICAMs konserviert. Humanes lCAM-1 ist zu 50% identisch zu ICAM- 1 aus Maus und zu 35% identisch zu humanem ICAM-2 (D. E. Staunton et al., Nature 339: 61-64 (1989)). Die Reste, die besonders kritisch für die LFA-1-Bindung sind, nämlich E34 und Q73, sind sowohl in Maus-ICAM-1 als auch in humanem ICAM-2 konserviert. Dies ist in Übereinstimmung mit der Fähigkeit von sowohl Maus-ICAM-1 als auch humanem ICAM-2 (D. E. Staunton et al., Nature 339: 61-64 (1989)), an humanes LFA-1 zu binden. Eine D2 N-verknüpfte Glycosylierungsstelle bei N 156, die die LFA-1-Bindung beeinflusst, ist ebenfalls in ICAM-2 konserviert. Mehrere Reste, die wichtig für die Rhinovirus-14-Bindung sind, nämlich Q58, G46, D71, K77 und 8166, sind in Maus-ICAM-1 oder humanem ICAM-2 nicht konserviert, was in Übereinstimmung mit der offensichtlichen Unfähigkeit von Mäusezellen (R. J. Colonno et al., J. Virol. 57: 7-12 (1986)) und ICAM-2 zur Bindung von Rhinovirus-14 ist.
Sequenzen, die wichtig für LFA-1- und HRV-Kontakt sind, entsprechen auch blockierenden mAb-Epitopen von RR1/1 und LB-2, während dies für das R6.5-Epitop nicht der Fall zu sein scheint, der daher durch sterische Hinderung blockieren mag.
Die Bindung von LFA-1 an ICAM-1 hängt von zweiwertigen Kationen ab. Alle Integrin-α-Untereinheiten weisen 3 oder 4 Tandern-Wiederholungen von "EF-Hand"-artigen Bindungsstellen für zweiwertige Kationen auf (T. K. Kishimoto et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989)). Diese Stellen unterscheiden sich jedoch vom klassischen EF-Handmotiv darin, dass ihnen eine konservierte Glutaminsäure fehlt, die eine koordinative Bindung mit zweiwertigen Kationen eingeht (A. L. Corbi et al., EMBO J. 6: 3023-4028 )1987)). Es ist die Hypothese aufgestellt worden, dass dieser Rest, der bei dem Integrin fehlt, durch einen Rest im Liganden ersetzt wird und dass daher das Metall eine koordinative Bindung mit sowohl dem Rezeptor als auch dem Liganden eingeht (A. L. Corbi et al., EMBO J. 6: 3023-4028 (1987)). Der ICAM-1-Rest, der besonders kritisch für die Bindung von LFA-1 ist, nämlich Glutaminsäure 34 (E34), mag für die koordinative Bindung mit zweiwertigen Kationen entsprechend der Hypothese sorgen. Ein ähnlicher Mechanismus scheint in der Rhinovirus-14-Bindung an ICAM-1 nicht vorhanden zu sein, von der festgestellt wurde, dass sie von zweiwertigen Kationen unabhängig ist. Frühere Vorschläge hinsichtlich der Anforderung an zweiwertige Kationen für die Rhinovirus-Bindung (R. R. Rueckert, in: Fields Virology, B. N. Fields et al. (Hrsg.), Raven Press, NY, (1985), S. 705-738) scheinen auf einer Arbeit mit Nebengruppen-Serotypen zu basieren, die an einen anderen Rezeptor binden. Die Stabilität, im Gegensatz zur Bindung, mag von Kationen beeinflusst werden, die eine koordinative Bindung mit Asparagin 141 an der 5-fachen Achse des Rhinovirus eingehen (M. G. Rossmann et al., Nature 317: 145-153 (1985)).
ICAM-1 und CD4 sind Mitglieder der Ig-Superfamilie, die auffallende Parallelen in ihrer Funktion bei sowohl zellulärer als auch vitaler Adhäsion zeigen. CD4 ist ein Adhäsionsrezeptor auf T-Zellen, der an MHC-Klasse II-Moleküle bindet und auch als ein Rezeptor vom HIV-Virus genutzt wird. CD4 weist 4 extrazelluläre Domänen auf. Bei neueren Studien an CD4 wurde festgestellt, dass Mutationen in der aminoterminalen Ig-artigen Domäne die stärkste Wirkung auf die Bindung von MHC Klasse II und HIV haben, wobei Mutationen in der zweiten Domäne eine geringere Wirkung zeigen. Die Bindungsstellen für MHC Klasse 11 und HIV sind überlappend, jedoch verschieden (A. Peterson et al., Cell 54: 65-72 (1988); L. K. Clayton et al., Nature 339: 548-551 (1989); D. Lamarre et al., Science 245: 743-746 (1989); N. R. Landau et al., Nature 334: 159-167 (1988)). Einige CD4 mAb-Epitope scheinen Reste von sowohl D1 als auch 2 zu beinhalten, was eine enge physikalische Assoziation dieser Domänen zeigt (N. R. Landau et al., Nature 334: 159-167 (1988)). In allen diesen Aspekten sind die Befunde hinsichtlich Zelladhäsions- und Virusbindungsstellen von ICAM-1 und CD4 ähnlich.
Mindestens zwei verschiedene Modelle können für die Bindung der ICAM-1-Domäne 1 an die vermutete Rezeptorstelle im Rhinovirus-Canyon ins Auge gefasst werden. Wie vorstehend erwähnt, befindet sich der größte Teil (6 von 9) der D1-Sequenzen, die mit dem Rhinovirus-14-Kontakt in Zusammenhang gebracht werden, in der distalen Hälfte von D1 (Fig. 9). Die Rezeptorbindungsstelle im Rhinovirus-Canyon wird in Zusammenhang mit einer tiefen Spalte (3 nm breit an der oberen Seite, 1,2 nm breit am Boden und 2,5 nm tief) gebracht (M. G. Rossmann et al., Nature 317: 145- 153 (1985); R. J. Colonno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 5449-5453 (1988); (M. G. Rossmann et al., Ann. Rev. Biochem. 58: 533-573 (1989)). Die Abmessungen dieser Spalte sind so, dass etwas mehr als die Hälfte einer Ig-artigen Domäne (4 nm lang und 2-2,5 nm breit) eingeführt werden könnte. Die Kontaktsequenzen in der distalen Hälfte von ICAM-1 D1 können also Bindungen mit Resten innerhalb der Spalte eingehen, so dass die lange Achse von D1 ungefähr senkrecht zum Boden des Canyons ist. Der Abstand zwischen dem Zentrum der tiefen Spalte um die 5-fache Achse (ungefähr 5 nm) ist groß genug, um es einem ICAM-1-Molekül zu erlauben, alle 5 Spalten zu besetzen. Die restlichen Sequenzen, die mit dem Rhinovirus- 14-Kontakt in Zusammenhang gebracht werden, nämlich K39DE, Q58 und R166PQ, die sich möglicherweise nicht auf der distalen Hälfte von D1 befinden, treten möglicherweise mit Rhinovirus-14-Resten am Rand des Canyons in Wechselwirkung.
Ein zweites Modell für die ICAM-1/Rhinovirus-14-Wechselwirkung würde darin bestehen, dass ICAM-1 D1 in Kontakt mit Resten der Spalte tritt, so dass die lange Achse von D1 einen spitzeren Winkel mit dem Grund des Canyon bildet, was es D1 und D2 erlaubt, mehr in Längsrichtung im Canyon zu liegen. Dies mag in der Blockierung einiger benachbarter Rhinovirus-14-Bindungsstellen durch sterische Hinderung resultieren.
Die vorliegende Erfindung klärt also wesentliche Punkte des Kontakts zwischen ICAM-1 und LFA-1 oder HRV. Die Identifizierung von ICAM-1-Kontaktsequenzen stellt zusätzliche Informationen für die Ausführung von ICAM-1-Fragmenten und synthetischen Peptiden bereit, die die LFA-1- und/oder HRV-Bindung hemmen. Zum Beispiel zeigen die Daten, das ein ICAM-1-Fragment, das nur aus D1 besteht, ausreichend sein wird, um sowohl die LFA-1- als auch die HRV-Wechselwirkung zu hemmen; die hier vorgelegten Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass eine noch wirksamere Bindungskonformation sowohl D1 als auch D2 enthalten wird. Da nichtzusammenhängende ICAM-1-Sequenzen an Kontakten beteiligt zu sein scheinen, können ein langes Peptidfragment oder mehrere kürzere Peptide, die mehrere Kontaktsequenzen überbrücken, verwendet werden, um mit LFA-1- und HRV-Wechselwirkungen in Konkurrenz zu treten.
Die hier vorgenommene Identifizierung der wichtigen Bindungsstellen innerhalb der ersten 2 Domänen von ICAM-1 zeigt also, dass lösliche Fragmente von ICAM-1 potentielle therapeutische Brauchbarkeit bei der Verhinderung von Rhinovirus-Infektionen und bei der Behandlung von entzündlichen Störungen und Zuständen (wie Reperfusionsschädigung, Transplantation und dergl.) besitzen. Derartige Mittel mögen wirksam bei der therapeutischen Behandlung von 50% der Fälle mit den Symptomen einer üblichen Erkältung sein, die von der Hauptgruppe der Rhinoviren hervorgerufen werden (S. J. Sperber et al., Antimicr. Agents Chemo. 32: 409-419 (1988)). Bei der Reperfusionsschädigung wandern Leukozyten in Gewebe, das zeitweilig vom Blutstrom abgeschnitten war, und schädigen es. Es ist gezeigt worden, dass die erhebliche Schädigung aufgrund der Reperfusionsschädigung beim Myokardinfarkt und beim ischämischen Schock durch einen mAb gegen LFA-1 und andere Leukozytenintegrine blockiert wird (N. B. Vedder et al., J. Clin. Invest. 81: 939- 944 (1988); P. J. Simpson et al., J. Clin. Invest. 81: 624-629 (1988)).
Zusammengefasst binden LFA-1 (CD11 aICD18) auf Lymphozyten an ICAM-1 (CD54) auf anderen Zellen, so dass die kritische Zell-Zell-Adhäsion während der Immunreaktion und während entzündlicher Reaktionen gefördert wird; ferner nutzt die Hauptgruppe der humanen Rhinoviren (HRV) ICAM-1 als ihren zellulären Rezeptor. Elektromikroskopische Aufnahmen zeigen, dass das ICAM-Molekül ein Stäbchen mit einer Länge von etwa 18 nm ist. Das Stäbchen weist häufig einen Knick von 90º auf, was einen 12 nm langen Arm und einen 7 nm kurzen Arm ergibt. Diese Abmessungen deuten auf ein Modell hin, in dem 5 Ig-artige Domänen in einem kleinen Winkel zur Stäbchenachse angeordnet sind, und zwar mit drei Domänen im langen Arm und zwei im kurzen Arm. ICAM-1-Sequenzen, die wichtig für die Bindung von LFA-1, HRV und vier monoklonalen Antikörpern (mAb) sind, wurden durch Charakterisierung von fCAM-1-Mutanten, die Deletionen in ihren Ig-artigen Domänen und Aminosäuresubstitutionen in den vorhergesagten β-Schleifen aufweisen, identifiziert. Die aminoterminalen 2 Ig-artigen Domänen (D1 und D2) von ICAM- 1 scheinen konformationell in Wechselwirkung zu stehen, und N-verknüpfte Glycosylierungsstellen in D2 scheinen wichtig für die strukturelle Integrität zu sein und mögen eine geringe Wirkung auf die LFA-1-Bindung haben. Die aminoterminale Ig-artige Domäne von ICAM-1 (D1) enthält die primäre Stelle für den Kontakt mit sowohl LFA-1 als auch HRV. Die Bindungsstellen scheinen überlappend, jedoch verschieden zu sein; die HRV-Bindung unterscheidet sich von der LFA-1-Bindung auch im Fehlen der Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen. Obwohl LFA-1 ein Integrin ist, erkennt es nicht eine RGD- oder RGD-artige Sequenz in ICAM-1. Insgesamt deutet die Analyse darauf hin, dass Rhinoviren LFA-1 in der Wahl der Bindungsstelle von ICAM-1 nachahmen, was die Möglichkeit andeutet, dass dies eine evolutionär angepasste Stelle ist.

Beispiel 9

Ein lösliches funktionelles Derivat von ICAM-1 hemmt eine Rhinovirus-Infektion

Wie vorstehend erörtert, gehören Rhinoviren zur Picornavirus-Familie und sind verantwortlich für viele übliche Erkältungen (S. J. Sperber et al., Antimicrob. Agents Chemother. 32: 409-419 (1988)). Die Mehrzahl der Rhinoviren und einige Coxsackie- Viren (ebenfalls Picornaviren) weisen einen gemeinsamen Zelloberflächenrezeptor auf humanen Zellen auf. ICAM-1 ist der zelluläre Rezeptor für die Hauptuntergruppe von Rhinoviren (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989); J. M. Greve et al., Cell 56: 839-847 (1989)), und anti-ICAM-1-Antikörper sind imstande, die Bindung von Rhinoviren der Hauptgruppe an Zellen zu blockieren. Im Hinblick auf diesen Befund wurde die Fähigkeit von löslichen funktionellen ICAM-1-Derivaten, die Bindung von Rhinoviren der Hauptgruppe an Zellen zu blockieren, untersucht.
Wie vorstehend erörtert, wurde, um ein verkürztes lösliches Derivat von ICAM-1, dem die zytoplasmatische Domäne fehlt, herzustellen, ein Stoppcodon innerhalb des Leserasters (zwischen Dcyt und D5) unter Anwendung der Oliconucleotid-gerichteten Mutagenese auf der Basis der Methode von Kunkel (T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 488-492 (1985)) mit der Modifikation von Peterson und Seed (A. Peterson et al., Cell 53: 65-72 (1988)) erzeugt. Dieses Experiment führte zur Bildung eines mutierten ICAM-1-Gens, bezeichnet als Y452 E/F TAG, das bei Expression zur Bildung einer verkürzten abgesonderten Form von ICAM-1 (sICAM-1) durch die Mutante führte (vergl. Beispiel 8).
Ein Expressionsvektor, bestehend aus dem Hamster-DHFR-Gen und der kodierenden Region der vorstehend beschriebenen mutierten ICAM-1-cDNA, gesteuert von dem Promotor, Splice-Signalen und einem Polyadenylierungssignal aus der frühen SV40-Region, wurde konstruiert. Das Hamster-DHFR-Gen wurde für das Plasmid pBR322DHFR (R. C. Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78: 2072-2076 (1981)) durch Verdau mit Fspl und Hindill, gefolgt von einer Ligation mit stumpfen Enden in pSV2gpt (P. J. Mitchell et al., Mol. Cell. Biol. 6: 425-440 (1986)), geschnitten mit BamHI/HindIII, isoliert. Die mutierte sICAM-1 (lösliches ICAM-1)-cDNA wurde durch Verdau mit NotI isoliert. Die Enden wurden unter Verwendung von Klenow aufgefüllt, und die Moleküle wurden mit Hindill verdaut. Die Moleküle wurden dann in den pBR322DGFR-Expressionsvektor (hergestellt durch Verdau mit Apal, Enden dann mit Klenow aufgefüllt und mit Hindill verdaut, um das gpt-Gen zu entfernen) ligiert. Auf diese Weise war das sICAM-1-Gen physikalisch mit dem Hamster-DGFR- Gen in einem Expressionsvektor auf SV40-Basis verknüpft.
Der komplette Vektor wurde dann in chinesische Hamster-Eileiter (CHO)- K1 DUX- B11-Zellen unter Anwendung der Calciumphosphat-Kopräzipitationsmethode (F. L. Graham et al., Virology 52: 458-467 (1973)) transfiziert. Nach 2 Tagen Wachstum in nicht-selektivem Medium wurden die Zellen in selektives Medium mit einem Gehalt an 0,05 bis 2 uM Methotrexat, jedoch ohne Hypoxanthin und Thymidin, übertragen. Klone wurden dann isoliert, subkloniert und auf die Bildung von sICAM-1 durch ELISA untersucht. Kolonien, die die größte Menge an sICAM-1 absonderten,, wurden dann zwei weiteren Runden der Genamplifikation unterzogen, und eine stabile Zeltlinie, die als CH0118A bezeichnet wurde, wurde abgeleitet. Diese Zeltlinie, die die bevorzugte Quelle für sICAM-1 ist, sondert sICAM-1 in den Kulturüberstand bis ungefähr 1 ug/ml ab.
sICAM-1 wurde aus Überständen von CHO118A-ZeIlen durch Immunaffinitätschromatographie mit monoklonalem anti-ICAM-1-Antikörper R6.5 gereinigt. Für diesen Zweck wurde R6.5 kovalent an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia LKB) bis zu einer Endkonzentration von 5 mg pro ml des gepackten Harzes nach den Anleitungen des Herstellers gekoppelt. Alle chromatographischen Stufen erfolgten bei 4ºC, und alle Puffer enthielten 0,2 U/ml Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid. Ein Liter des filtrierten Überstands, der ungefähr 1 mg sICAM-1 enthielt, wurde auf eine 30 ml-Säule mit R6.5-Sepharose bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 mlJmin geladen. Die Säule wurde dann mit 200 ml 10 mM Tris/0,15 M NaCl bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 2,5 ml/min gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen. Das gebundene sICAM-1 wurde mit 50 mM Triethylamin/0,15 M NaCl/pH-Wert: 11,0 bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Fraktionen wurden aufgefangen und unmittelbar durch Zugabe von 1 M Tris, pH- Wert: 6,0 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM neutralisiert.
Fraktionen, die eluiertes sICAM-1 enthielten, wurden durch SDS-PAGE auf 10% bis 15% Polyacrylamid-Gradientengelen, gefolgt von Silberanfärbung, identifiziert. Elektrophorese und Anfärbung erfolgten unter Verwendung eines Pharmacia-Phastgel-Systems und eines Silberanfärbekits entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Die Fraktionen, die sICAM-1 enthielten, wurden vereinigt und ungefähr 10- fach unter Verwendung von Centricon-30-Mikrokonzentratoren (Amicon, Danvers, MA) konzentriert.
Der Proteingehalt jedes Ansatzes von gereinigtem sICAM-1 wurde unter Verwendung eines Bio-Rad-Protein-Assays entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) bestimmt, und dieses Material wurde in Anteilen für die Verwendung als Referenzstandards eingefroren. Anschließend wurde die Konzentration von sICAM-1 in Proben in einem ELISA-Test von Sandwichtyp unter Vervrendung der Referenzstandards und von zwei monoklonalen anti-ICAM-1- Antikörpern, nämlich R6.5 und R6.1 (R. Rothlein et al., J. Immunol. 141: 1665-1669 (1988)), die an nicht-überlappende Epitope binden (Martin, unveröffentlichte Daten), bestimmt. R6.1 wurde an Kunststoff in Platten mit 96 Vertiefungen (Nung immunoplate) durch Inkubation von 100 ul einer 10 ug/ml Lösung für 1 Stunde bei 3T ºC gebunden. Jede der folgenden Stufen wurde dann mit 100 ul Reagenz, inkubiert bei 37ºC für 2ß Minuten, gefolgt von Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, durchgeführt: (1) Bindung von Verdünnungsreihen des Referenzstandards sICAM-1 oder unbekannten Materials; (2) Bindung von biotinyliertem R6.5 (1 ug/ml); und (3) Bindung von Meerrettichperoxidase-konjugiertem Streptavidin (Zymed Laborstories, South San Francisco, CA) bei der vom Hersteller empfohlenen Konzentration. Nach der Zugabe des Substrats ABTS (Zymed) und Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Extinktion bei 410 nm bestimmt. Die Konzentration von sICAM- 1 wurde dann durch Vergleich mit der Referenzstandardkurve bestimmt.
Der Bindungsassay mit radiomarkiertem Rhinovirus wurde unter Anwendung einer Modifikation des Verfahrens von Abraham und Colonno (G. Abraham et al., J. Virol. 51: 340-345 (1984)) durchgeführt. Kurz gesagt wurden HeLa-Zellen mit HRV14 für 4- 6 Stunden in Methionin-freiem RPMI 1640-Medium, angereichert mit 20 mM MgCl&sub2; und 2 mM Glutamin infiziert, gefolgt von Inkubation im gleichen Medium mit einem Gehalt an 2% fötalem Kälberserum und 180 uCi/ml [³&sup5;S]-Methionin, bis eine generalisierte zytopathische Wirkung beobachtet wurde (üblicherweise 18 Stunden nach Infektion). Nach 3 Zyklen Gefrieren und Auftauen wurden Viren im Überstand mit Polyethylenglykol präzipitiert und durch Zentrifugation gewonnen. In einer Modifikation des veröffentlichten Verfahrens wurden radiomarkierte Viren anschließend durch Pelletierung durch einen 30% Saccharose-Stufengradienten (34 900 U/min für 2 Stunden in einem Beckman-SW41-Rotor) gewonnen. Die Bindung von radiomarkierten Viren (1 · 10&sup4; cpm) an HeLa-Zellen (konfluente Platten mit 24 Vertiefungen) erfolgte, wie von Abraham und Colonno (G. Abraham et al., J. Virol. 57: 340-345 (1984)) beschrieben, mit der Ausnahme, dass sequenzielle Waschungen mit 1% Triton X-100 und heißem 9 M Harnstoff angewandt wurden, um die Zellen und gebundene Viren vor der Szintillationszählung zu solubilisieren. In typischen Experimenten wurden ungefähr 25-30% der Ausgangs-cpm an Zellen gebunden.
Unter Anwendung des vorstehend beschriebenen ersten Reinigungsverfahrens wurden Milligrammmengen von sICAM-1 bis zu einer Reinheit von mehr als 95% gereinigt. Das gereinigte sICAM-1 hatte ein scheinbares relatives Molekulargewicht (Mr) von 82 000, in Übereinstimmung mit der vorhergesagten Größe eines Moleküls, das alle 5 extrazellulären Ig-artigen Domänen enthält. Das gereinigte sICAM-1, band an drei verschiedene monoklonale Antikörper, die gegen Membran-gebundenes ICAM-1 (mICAM-1) erzeugt wurden, nämlich RR1/1, R6.5 und CL203. Diese Antikörper binden an topographisch verschiedene Stellen, wie durch kompetitive Bindungsassays bewertet wird, und ihre Bindung an sICAM-1 deutet darauf hin, dass es eine Gesamtkon~guration ähnlich zu nativem mICAM-1 behält.
Die Fähigkeit von gereinigtem sICAM-1, als ein Inhibitor der Rhinovirus-Infektion zu wirken, wurde durch quantitativen in vitro-Assay der zytopathischen Wirkung des Virus (CPE) bestimmt (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989)).
Für dieses Experiment wurde der Hauptgruppenserotyp HRV54 (100 TCID&sub5;&sub0;) auf HeLa-Zellen in Gegenwart der angegebenen Konzentration an sICAM-1 (oder einer äquivalenten Verdünnung einer Pufferkontrolle aus dem gleichen Reinigungslauf) plattiert, und die zytopathische Wirkung wurde nach 4 Tagen bestimmt, wie zuvor beschrieben (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989)).
Wie in Fig. 10 gezeigt ist, war sICAM-1 ein potenter Inhibitor des Hauptgruppen- Rhinovirus-Stamms 54 (HRV54): sICAM-1 bei 1 ug/ml hemmte signifikant CPE (ungefähr 50%), und eine mehr als 90%ige Inhibition wurde bei 10 ug/ml erzielt. Im Gegensatz dazu hatte eine Pufferkontrolle, die aus Säulenfraktionen, die an den sICAM-1-Peak angrenzten, keine Wirkung.
Die Spezifität der Inhibition durch sICAM-1 wurde unter Verwendung von Vertretern der Haupt- und Nebenuntergruppen von Rhinovirus, anderen Picornaviren und Herpes simplex-Virus Typ 1 (HSV-1), ein nicht verwandtes, mit einer Hülle versehenes DNA-Virus, untersucht.
Für dieses Experiment wurde gereinigtes sICAM-1 (5 ug/ml) auf HeLa-Zellen mit den angegebenen Viren (100 TGID&sub5;&sub0;) plattiert, und eine zytopathische Wirkung wurde nach 4 Tagen bestimmt: HRV54 (Hauptgruppe Rhinovirus), HRV2 (Nebengruppe Rhinovirus), Cox. A13 (Coxsackie A13, Picornavirus, das den Hauptgruppenrezeptor nutzt), Cax. B1 (Coxsackie B1, nutzt nicht den Hauptgruppenrezeptor), Polio (Poliovirus I), HSV-1 (Herpes simplex Virus Typ 1).
Wie in Fig. 11 gezeigt, hemmte sICAM-1 HRV54, hatte jedoch keine signifikante Wirkung auf HRV2, einen Nebengruppenstamm, der nicht ICAM-1 als einen zellulären Rezeptor nutzt. Außerdem hemmte sICAM-1 die Infektion durch Coxsackie A13, ein weiteres Picornavirus, von dem bekannt ist, dass es iCAM-1 als einen Rezeptor nutzt (R. J. Colonno et al., S. 93-102, Positive Strand RNA Viruses, (R. Alan Lis, Inc.)). Im Gegensatz dazu hemmte sICAM-1 nicht Poliovirus, Coxsackievirus 81 (Picornaviren, die nicht über ICAM-1 binden) oder HSV-1.
Die Spezifität der Virusinhibition zeigte, dass sICAM-1 die Infektion nicht über generalisierte Wirkungen auf die Fähigkeit der Zelle, die virale Replikation zu unterstützen, sondern vielmehr durch Inhibition der Virionbindung verhinderte. Dies wurde durch Messung der Wirkung von sICAM-1 auf die Virusbindung unter Verwendung eines 35S-Methionin-markierten Virusbindungsassays bestimmt.
Für dieses Experiment wurde [³&sup5;S]-Methionin-markiertes HRV14 mit den angegebenen Konzentrationen an sICAM-1, einem Chromatographiepuffer als Kontrolle oder den monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörpern und CL203 oder R6.5 bei 200 ug/ml gemischt. Wie zuvor gezeigt, inhibiert Antikörper R6.5 die Wechselwirkung von ICAM-1 mit LFA-1 oder HRV54, während Antikörper CL203 dies nicht tut (D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989)). Nach Vorinkubation für 30 Minuten bei 4ºC wurde das Gemisch auf HeLa-Zellen plattiert, und die gebundene cpm-Menge wurde nach Waschen bestimmt.
Wie in Fig. 12 gezeigt ist, inhibierte sICAM-1 die Bindung von HRV14 (Hauptrhinovirus Untergruppe) in einer dosisabhängigen Weise, während die Pufferkontrolle keine Wirkung hatte. Die positive Kontrolle anti-ICAM-1-mAb R6.5 war ebenfalls wirksam, während die negative Kontrolle mAb CL203 (der an ICAM-1 bindet, jedoch keine Funktionen inhibiert) keine signifikante Wirkung hatte (vergl. auch D. E. Staunton et al., Cell 56: 849: 853 (1989)). Es ist darauf hinzuweisen, dass der Virus-Bindungsassay eine wesentlich höhere Konzentration an Viruspartikeln als der CPE-Assay verwendet, was möglicherweise für den geringeren Grad der Inhibition der Bindung im Vergleich mit CPE verantwortlich ist.
Die Fähigkeit zur Bildung großer Mengen an gereinigtem sICAM-1 erlaubt röntgenkristallographische Studien und die Auflösung der dreidimensionalen Struktur des Moleküls. Die Verwendung von gereinigtem sICAM-1 ermöglicht die Entwicklung von Assays, um Ausführung oder Nachweis von antirhinoviralen Mitteln zu erleichtern.
Diese Experimente zeigen, dass sICAM-1 ein wirksamer und spezifischer Inhibitor einer Hauptgruppen-Rhinovirus-Infektion ist. Es wurde festgestellt, dass sICAM-1 imstande ist, HRV54, ein Hauptgrvppenvirus, zu hemmen, jedoch nicht HRV2, ein Mitglied der Nebengruppe der Rhinoviren, die nicht ICAM-1 als einen Rezeptor nutzen. Die antivirale Aktivität von sICAM-1 zeigt, dass sICAM-1 oder eines seiner funktionellen Derivate in der antiviralen Therapie eingesetzt werden könnte. Die ICAM-1- Bindungsstelle auf dem Virus ist hochgradig konserviert (M. G. Rossuran, J. Biol. Chem. 264: 14587-14590 (1989)), und damit ist es wahrscheinlich, dass sie funktionell in ihrer Fähigkeit zur Mutation beschränkt ist. Ein Arzneimittel, das gegen die Stelle der ICAM-1-Virus-Wechselwirkung gerichtet ist, hätte den 2-fachen Vorteil der Beeinflussung des empfindlichen ersten Stadiums der Virusinfektion in Kombination mit einer begrenzten Möglichkeit des Virus, der Neutralisation durch Erzeugung arzneimittelresistenter Varianten zu entgehen.
Die Daten zeigen, dass sICAM-1 die Infektivität der Hauptgruppe von Rhinovirus in vitro blockieren kann und deuten darauf hin, dass sICAM-1 therapeutische Wirkungen hinsichtlich der Abschwächung oder Verhinderung der Konsequenzen einer Rhinovirus-Infektion haben mag.
Die Erfindung ist zwar im Zusammenhang mit speziellen Ausführungsformen davon beschrieben worden; es ist jedoch darauf hinzuweisen, dass sie weiteren Modifikationen zugänglich ist, und diese Anmeldung soll jegliche Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung, die allgemein den Prinzipien der Erfindung folgen und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, wie sie sich aus der bekannten oder üblichen Praxis innerhalb des Fachgebiets, zu dem die Erfindung gehört, ergeben und wie sie auf die essentielle Merkmale, die vorstehend angegeben wurden, angewandt werden, einschließen, wie sich aus dem Schutzumfang der beigefügten Ansprüche ergibt.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose des Vorhandenseins einer viralen Infektion, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Inkubation einer biologischen Probe, die im Verdacht steht, ein Virus zu enthalten, mit einem nachweisbar markierten funktionellen ICAM-1-Derivat;

(b) Bestimmung, ob ein Anteil des nachweisbar markierten funktionellen ICAM-1- Derivats an das Virus gebunden worden ist.

2. Verwendung eines Mittels, bestehend aus einem Virus, gebunden an ein funktionelles Derivat von ICAM-1, bei der Herstellung einer Vaccinzusammensetzung für die Verhinderung einer viralen Infektion.

3. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Virus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Rhinovirus des Hauptserotyps innerhalb der Familie Picornaviridae, einem Coxsackievirus Gruppe A und einem Mengovirus besteht.

4. Verfahren oder Verwendung nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem Virus um ein Rhinovirus des Hauptserotyps innerhalb der Familie Picornaviridae handelt.

5. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei es sich bei dem funktionellen Derivat um ein lösliches funktionelles Derivat handelt.

6. Verfahren oder Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 5, wobei das funktionelle Derivat mindestens eine der folgenden Aminosäuren an der angegebenen Position aufweist:

Q1T, R13, D26QPK, Q27, K39KE, G46NN, R49KV, Q58, D60, D71, K77T, N103, A155N, R166PQ, A3GL, L27, A34, H73, T73 und N118.

7. Funktionelles Derivat von ICAM-1, das mindestens eine der folgenden Aminosäuren an der angegebenen Position aufweist: A3GL, L27, A34, H73 und T73; und das vorzugsweise wasserlöslich ist.

8. Chimären Molekül, umfassend ein lösliches funktionelles Derivat nach Anspruch 7 oder ein funktionelles Derivat von ICAM-1, das mindestens eine der folgenden Aminosäuren an der angegebenen Position aufweist: Q1T, R13, D26QPK, Q27, K39KE, G46NN, R49KV, Q58, D60, D71, K77T, N1ü3, A155N, R166PQ und N118; wobei das funktionelle Derivat mit einem Abschnitt eines Immunglobulins verknüpft ist.