DE69130445T2

DE69130445T2 - Die Mac-1-Bindungsstelle von ICAM-1

Info

Publication number: DE69130445T2
Application number: DE69130445T
Authority: DE
Inventors: Michael S. Cambridge Massachusetts 02138 Diamond; Timothy A. Newton Massachusetts 02157 Springer; Donald E. Chestnut Hill Massachusetts 02167 Staunton
Original assignee: Immune Disease Institute Inc
Current assignee: Boston Childrens Hospital
Priority date: 1990-11-28
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 1999-07-08
Anticipated expiration: 2011-11-22
Also published as: DK0488061T3; EP0488061A2; ATE172988T1; EP0488061A3; ES2122964T3; KR920009412A; DE69130445D1; EP0488061B1; NZ260473A; NZ240747A; US5288854A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Zwischenzelladhäsionsmolekül ICAM-1 und dessen Fähigkeit zur Bindung an den Leukozytenadhäsionsrezeptor Mac-1. Die Erfindung steht in Beziehung mit der Verwendung der Fähigkeit von ICAM-1 zur Bindung an Mac-1 zur Behandlung von Entzündung, die sich bei einem Säugersubjekt aus dem spezifischen Abwehrsystem ergibt.

BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN STANDES DER TECHNIK

I. Zelluläre Adhäsion

Das Immunsystem ist verantwortlich für den Schutz eines Tieres gegen fremde Eindringlinge wie Bakterien, Viren usw. Eine ausgezeichnete Übersicht über das Abwehrsystem wird von Eisen, H. W. gegeben [in: Microbiology, 3. Auflage, Harper & Row, Philadelphia, PA, (1980) S. 290-295 und 381-418]. Die Fähigkeit des Immunsystems zum Schützen eines Tieres gegen fremde Eindriglinge ist weitgehend von der Anwesenheit und Funktionsfähigkeit von als Leukozyten bekannten Blutzellen abhängig.
Bei der Antwort des Immunsystems auf Infektionserreger ist ein primäres Ereignis die Rekrutierung oder Anziehung von zirkulierenden Neutrophilen zur Entzündungsstelle hin. Im Hinblick auf die Extravasation zur peripheren Wundstelle stellt die Adhäsion an das Endothel einen unerlässlichen vorangehenden physikalischen Schritt dar. Die Lokalisierung der Neutrophilen wurde auf molekularer Ebene untersucht, um sowohl die Folge von Ereignissen, welche den Austritt der Neutrophilen aus dem Blutstrom fördern, als auch die verwandten, diese Wechselwirkung koordinierenden Proteine an der Oberfläche der Neutrophilen und der Endothelzellen zu definieren.
Es wurde festgestellt, dass die Fähigkeit der Leukozyten, ein Tier oder einen Menschen zu schützen, die Adhäsion der Zellen des Immunsystems an zelluläre und extrazelluläre Substrate erfordert. Beispielsweise müssen Leukozyten fähig sein, sich an Endothelzellen anzuheften, so dass sie von der Zirkulation zu Stellen fortschreitender Entzündung wandern können. Ausserdem müssen sie sich an Antigen präsentierenden Zellen anheften, damit eine normale Immunantwort stattfinden kann. Sie müssen auch fähig sein, sich an geeignete Zielzellen anzuheften, damit die Lyse von mit Viren infizierten Zellen oder von Tumorzellen stattfinden kann. Ausserdem müssen Leukozyten fähig sein, sich an verschiedene aktivierte Proteine (wie beispielsweise ic3b - die aktivierte Form der dritten Komplement-Komponente) anzuheften, damit sie Mikroben- und Zellentrümmer wirksam phagozytieren und beseitigen können. Somit ist die Leukozytenadhäsion für ein normal funktionierendes Abwehrsystem des Wirtsorganismus erforderlich. Die Hemmung dieses Abwehrsystems ist in Fällen wie solche einer Transplantation erwünscht, weil der Wirtsorganismus das transplantierte Gewebe als fremd "sieht" und eine gegen dieses Gewebe gerichete Immunantwort startet. Die Leukozytenadhäsion ist deshalb auch an der Abstossung von transplantierten Geweben und Organen beteiligt. Einsicht in die Leukozytenadhäsion erlaubt somit, entweder die Fähigkeit eines Tieres zur Bekämpfung von Infektion zu erhöhen oder die Fähigkeit eines Tieres zur Abstossung von transplantiertem Gewebe zu unterdrücken.
An der Leukozytenoberfläche sitzende Moleküle, die an der Vermittlung der Leukozytenadhäsion beteiligt sind, wurden unter Verwendung der Hybridomtechnologie identifiziert. Kurz ausgedrückt, es wurden gegen humane T-Zellen [Davignon D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4535-4539 (1981)] und gegen Mäuse-Milzzellen [Springer T. A. et al., Eur. J. Immunol. 9: 301-306 (1979)] gerichtete monoklonale Antikörper identifiziert, welche sich an die Oberflächen von Leukozyten anheften und die im vorstehenden beschriebenen, mit der Adhäsion in Beziehung stehenden Funktionen hemmen [Springer T. A. et al., Fed. Proc. 44: 2660-2663 (1985)]. Die von diesen Antikörpern erkannten Moleküle umfassen einen Satz von Leukozytenadhäs ionsrezeptoren, der als "Familie von der Lymphozytenfunktion assoziierten Antigenen vom Typus 1" (oder als LFA-1-Familie, mit LFA für "Lymphocyte Function-Associated Antigen") bekannt sind.
Die LFA-1-Familie von Adhäsionsrezeptormolekülen umfasst drei in hohem Masse verwandte Zelloberflächen-Glykoproteine: "LFA-1" (CD11a/CD18), Mac-1 (CD11b/CD18) und p150,95 (CD11c/ CD18). Diese Glykoproteine sind Mitglieder einer Familie von Proteinen, den Leukozyten-Integrinen, die bei den Adhäsionsfunktionen im Immunsystem eine kritische Rolle spielen [Springer T. A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)].
Während LFA-1 an den Oberflächen der meisten Leukozyten gefunden wird [Springer T. A. et al., Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982)], werden Mac-1 und p150,95 hauptsächlich auf Makrophagen, Granulozyten und anderen grossen granularen Lymphozyten gefunden [Springer T. A, et al., Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982); Keizer G. D. et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985)].
Die LFA-1-Familie von Adhäsionsrezeptorproteinen besteht aus Heterodimeren, welche eine gemeinsame β-Kette aufweisen, die mit einmaligen α-Ketten nicht-kovalent assoziiert ist. Es wurde festgestellt, dass sich die α-Untereinheiten der Familie voneinander unterscheiden, und sie werden jeweils mit CD11a, CD11b und CD11c bezeichnet. Die glykosylierten α-Untereinheiten weisen jeweilige Molekulargewichte von etwa 175 kd, 160 kd und 150 kd auf. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass die (mit CD18 bezeichnete) β-Untereinheit der LFA-1-Familie von Adhäsionsrezeptoren sich selbst identisch bleibt und ein Molekulargewicht von 95 kd aufweist [Sanchez- Madrid F. et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983); Keizer G. D. et al., Eur. J. Immunol. 15: 1142-1147 (1985); Springer T. A. et al., Fed. Proc. 44: 2660-2663 (1985); Sanchez-Madrid F. et al., J. Exper. Med. 158: 586-602 (1983)].
Obwohl die α-Untereinheiten der Glykoproteine untereinander nicht die den β-Untereinheiten eigene weitgehende Homologie aufweisen, zeigte eine nähere Analyse auf, dass sie untereinander grössere Ähnlichkeiten aufweisen. Übersichten zu den Ähnlichkeiten der α- und β-Untereinheiten der Familie von Glykoprotein-Adhäsionsmolekülen untereinander werden von Sanchez-Madrid F. et al. [J. Exper. Med. 158: 586-602 (1983); J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)] und von Miller L. J. et al. [J. Immunol. 138: 2381-2383 (1987)] gegeben.
Die Bedeutung der LFA-1-Familie von Rezeptoren wurde anfänglich in Untersuchungen erkannt, welche die Fähigkeit von monoklonalen Antikörpern (die zur Bindung sowohl an die spezifischen α-Untereinheiten als auch an die gemeinsame β- Untereinheit fähig waren) zur Hemmung der adhäsionsabhängigen Leukozytenfunktionen aufzeigten [Sanchez-Madrid F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7489-7493 (1982); Beller D. I. et al., J. Exper. Med. 156: 1000-1009 (1982)].
Die Bedeutung der Leukozyten-Integrine wurde durch die Entdeckung eines klinischen Syndroms, des LAD-Syndroms (mit LAD für "Leukocyte Adhesion Deficiency") bestätigt, welches durch angeborenes Fehlen oder angeborene Defizienz der gemeinsamen β-Kette (CD18) gekennzeichnet ist und sich in verminderter Eiterbildung, abnormaler Wundheilung und schwerer Empfindlichkeit auf pyrogene Infektionen [Anderson D. C. et al., Fed. Proc. 44: 2671-2677 (1985); Anderson D. C. et al., J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985); Anderson D. C. et al., Ann. Rev. Med. 38: 175-194 (1987); Amaout M. A. et al., J. Clin. Invest. 74: 1291-1300 (1984)] wie auch in vitro in Abnormitäten von adhäsionsabhängigen Leukozytenfunktionen [Anderson D. C. et al., Ann. Rev. Med. 38: 175-194 (1987); Todd R. F. et al., Hem. Onc. Clinics N. A. 2: 13-31 (1988)] äussert.
Leukozyten von LAD-Patienten weisen in vitro Mängel auf, die denen ähnlich sind, welche beobachtet werden, wenn Leukozyten normaler Individuen mit einem gegen Mitglieder der LFA- 1-Familie spezifischen Antikörper antagonistisch behandelt wurden. Es wurde festgestellt, dass LAD-Patienten unfähig sind, eine normale Immunantwort aufzubauen. Es wurde festgestellt, dass dieser Mangel auf eine Unfähigkeit der Leukozyten der LAD-Patienten, sich an zelluläre und extrazelluläre Substrate anzuheften, zurückzuführen ist [Anderson D. C. et al., Fed. Proc. 44: 2671-2677 (1985); Anderson D. C. et al., J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985)]. Diese Untersuchungen zeigen auf, dass Entzündungsreaktionen gemildert werden, wenn Leukozyten wegen des Fehlens funktioneller Adhäsionsmoleküle an ihrer Zelloberfläche unfähig sind, sich auf normale Weise anzuheften.

II. Von den Leukozytenadhäsionsproteinen der LFA-1-Familie

Die drei Leukozytenadhäsionsproteine Mac-1, p150,95 und LFA-1 unterscheiden sich voneinander in ihrer Funktion und ihrer Expression auf Populations-Untermengen von Leukozyten. Mac-1 und p150,95 werden auf Neutrophilen und Monozyten exprimiert [Springer T. A. et al., in: Biochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman, London (1986) S. 102-126]. Im Laufe der Differenzierung der Blut-Monozyten zu Gewebe-Makrophagen wird die Expression von p150,95 stark erhöht und diejenige von Mac-1 vermindert [Schwarting R. et al., Blood 65: 974-983 (1985); Hogg N. et al., Eur. J. Immunol. 16: 240- 248 (1986)]. p150,95 wird auch auf gewissen Typen von aktivierten T- und B-Lymphozyten exprimiert, jedoch auf diesen Zellen nicht im Blut exprimiert [Kaligaris-Cappio F. et al., Blood 66: 1035-1042 (1985); Miller L. J. et al., J. Immunol. 137: 2891-2900 (1986); Keizer G. D. et al., J. Immunol. 138: 3130-3136 (1987)].
LFA-1 ist auf allen Leukozyten ausser einer Untermenge von Makrophagen vorhanden. Untersuchungen über die Blockierung von monoklonalen Antikörper haben aufgezeigt, dass LFA-1 bei der von T-Lymphozyten vermittelten Tötung, den Antworten von T-Helfer-Lymphozyten, der natürlichen Tötung und der von Antikörpern abhängigen Tötung eine wichtige Rolle spielt [Springer T. A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)]. Die Adhäsion an die Zielzelle ist ein Schritt, der von Antikörpern gegen LFA-1 blockiert wird. Funktionsuntersuchungen haben nahegelegt, dass LFA-1 mit mehreren Liganden, von denen eines ICAM-1 ist, in Wechselwirkung steht [Rothlein R. M. et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)].
Bei zirkulierenden Neutrophilen und Monozyten werden Mac-1 und p150,95 in einem intrazellulären vesikulären Kompartiment exprimiert, das durch Entzündungsvermittler zur Zelloberfläche mobilisiert wird [Todd R. F. et al., J. Clin. Invest. 74: 1280-1290 (1984); Springer T. A. et al., in: Biochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman, London (1986) S. 102-126; Lanier L. L. et al., Eur. J. Immunol. 15: 713-718 (1985); Yancey K. B. et al., J. Immunol. 135: 465- 470 (1985)]. Diese Mobilisierung korreliert mit einer erhöhten Adhäsionsfähigkeit [Anderson D. C. et al., Ann. Rev. Med. 38: 175-194 (1987)]. Eine Botschaft bezüglich der α-Untereinheit von Mac-1 wurde in Blut-Monozyten und PMA-induzierten Myeloidzellinien, jedoch nicht in Zellen der T- oder B-Abstammung detektiert, was mit der Expression von Mac-1-Protein an der Oberfläche korreliert.
Es wurde festgestellt, dass einige zytotoxische Klone von T-Lymphozyten (CTL-Klone, mit CTL für "cytotoxic T lymphocytes") einander ähnliche Mengen an p150,95 und LFA-1 exprimieren. Gegen α-Untereinheiten von LFA-1 und p150,95 gerichtete monoklonale Antikörper hemmen die Tötung durch solche CTL-Klone in einander ähnlichem Ausmass, und ihre Hemmwirkungen sind additiv [Keizer G. D. et al., J. Immunol. 138: 3130-3136 (1987)]. Ausserdem wurde aufgezeigt, dass gegen α-Untereinheiten von p150,95 gerichtete Antikörper die Adhäsion von Monozyten an das Endothel hemmen [Keizer G. D. et al., Eur. J. Immunol. 17: 1317-1322 (1987)].
Gegen Mac-1 oder p150,95 gerichtete monoklonale Antikörper hemmen die Aggregation von Neutrophilen und ihre Adhäsion an Endothelzellen, mit Protein beschichteten Oberflächen, Bakterien, Protozoen-Parasiten und Pilzen [Harlan J. M. et al., Blood 66: 167-178 (1985); Springer T. A. et al., in: Biochemistry of Macrophages (CIBA Symposium 118), Pitman, London (1986) S. 102-126; Dana N. et al., J. Immunol. 137: 3259-3263 (1986); Bullock W. D. et al., J. Exper. Med. 165: 195-210 (1987); Mosser D. M. et al., J. Immunol. 135: 2785-2789 (1985)].
Mac-1 (CD11b/CD18) ist ein Leukozytenadhäsions-Glykoprotein, von dem aufgezeigt wurde, dass es zusätzlich zu seiner Rolle bei den Adhäsionswechselwirkungen zwischen Zelle und Zelle und zwischen Zelle und Substrat sich an zahlreiche Liganden bindet, darunter iC3b [Beller D. I. et al., J. Exper. Med. 156: 1000-1009 (1982)], Fibrinogen [Altieri D. C. et al., J. Cell. Biol. 107: 1893-1900 (1988); Wright S. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7734-7738 (1988)] und Faktor X [Altieri D. C. et al., J. Biol. Chem. 863: 7007-7015 (1988)]. Es wurde aufgezeigt, dass in Tensiden lösliches Mac-1 und p150,95 zur Bindung an iC3b-Sepharose fähig sind [Micklem K. J. et al., Biochem. J. 231: 233-236 (1985)].
Die α-Untereinheit von Mac-1 ist ein Transmembran- Protein von 1137 Resten mit einer langen extrazellulären Domäne (1092 Reste) und einem zytoplasmischen Schwanz aus 19 Aminosäuren. Die extrazelluläre Domäne umfasst 3 vermeintliche zweiwertige Kationen bindende Sequenzen und 19 potentielle N-Glykosylierungsstellen. Die Aminosäuresequenz der α- Untereinheit von Mac-1 zeigt auf, dass letztere ein Mitglied der Integrin-Superfamilie ist; die α-Untereinheit von Mac-1 weist mit der α-Untereinheit des Leukozytenadhäsion-Glykoproteins p150,95 eine Identität von 63% und mit den α-Untereinheiten des Plättchen-Glykoproteins IIb/IIIa der extrazellulären Matrix-Rezeptoren, des Fibronectin-Rezeptors und des Vitronectin-Rezeptors eine Identität von 25% auf. Die vermeintlichen zweiwertige Kationen bindenden Stellen der α-Untereinheit von Mac-1 und die angrenzenden Bereiche weisen einen hohen Grad an Identität sowohl mit der α-Untereinheit von p150,95 (87%ige Identität auf Ebene der Aminosäuren) als auch mit dem restlichen Teil der α-Untereinheiten von Integrin (38%) auf. Die α-Untereinheit von Mac-1 umfasst, wie auch die α-Untereinheit von p150,95, im extrazellulären Bereich eine Domäne von 187 Aminosäuren, die bei den anderen Integrinen nicht vorhanden ist. Diese inserierte oder "I"- Domäne ist den A-Domänen des von-Willebrand-Faktors homolog, die ihrerseits Domänen Faktor B und C2 der C3-Bindungsproteine homolog sind. Diese Erkenntnisse lenken die Aufmerksamkeit auf diesen Bereich von Mac-1 als potentielle Bindungsstelle für iC3b.
Die funktionelle Rolle von Mac-1 wurde anfänglich veranschaulicht durch die Fähigkeit von gegen die α-Untereinheit von Mac-1 gerichteten monoklonalen Antikörpern (MAK) zur Blockierung der Rosettenbildung von iC3b präsentierenden Erythrozyten um Makrophagen und polymorphonuclearen Leukozyten [Beller D. I. et al., J. Exper. Med. 156: 1000-1009 (1982)], womit nachgewiesen wurde, dass Mac-1 vom Komplementrezeptor Typus drei (CR3) nicht unterscheidbar ist. Später wurde die Beteiligung von Mac-1 an Entzündungsprozessen durch die Hemmung der Aggregation von Neutrophilen und ihrer Adhäsion an Endothelzellen mittels spezifisch gegen die α-Untereinheit und die β-Untereinheit von Mac-1 gerichteter monoklonaler Antikörper nachgewiesen [Anderson D. C. et al., J. Immunol. 137: 15-27 (1986); Dana N. et al., J. Immunol. 137: 3259-3263 (1986); Vedder N. B. et al., J. Clin. Invest. 81: 672-682 (1988)]. Untersuchungen neueren Datums über die Kartierung von Epitopen haben nahegelegt, dass die an den Bindung von iC3b beteiligten Stellen von denen verschieden sind, die an der Aggregation von Neutrophilen und ihrer Adhäsion an mit Protein beschichtetem Kunststoff beteiligt sind [Anderson D. C. et al., J. Immunol. 137: 15-27 (1986); Dana N. et al., J. Immunol. 137: 3259-3263 (1986); Rosen H. et al., J. Exper. Med. 166: 1685-1701 (1987)]. Demzufolge erscheint Mac-1 als ein mehrwertiger Rezeptor mit mindestens zwei voneinander unabhängigen, an der Adhäsion beteiligten Funktionen.
Die Expression der funktionellen Aktivität von Mac-1 wird während der Differenzierung und Aktivierung der Leukozyten reguliert. Die Differenzierung und Reifung der myelomonozytischen Zellinien zeitigt eine erhöhte Expression von Mac-1 [Miller L. J. et al., J. Immunol. 137: 2891-2900 (1986)], wäh rend die Differenzierung der Blut-Monozyten zu Gewebe-Makrophagen mit einer starken Verminderung der Menge von Mac-1 an allen Zelloberflächen einhergeht [Hogg N. et al., Eur. J. Immunol. 16: 230-248 (1986)]. Die Expression von Mac-1 an der Oberfläche von zirkulierenden Neutrophilen und Monozyten wird durch Entzündungsstimuli aufwärts reguliert; Mac-1 ist in einem intrazellulären vesikulärem Kompartiment gelagert, das durch Chemoattraktoren schnell zur Zelloberfläche mobilisiert wird [Todd R. F. et al., J. Clin. Invest. 74: 1280-1290 (1984); Miller L. J. et al., J. Clin. Invest. 80: 535-544 (1987)]. Obwohl die erhöhte Expression von Mac-1 zu einer erhöhten Adhäsionsfähigkeit führen kann, können nach der Zellaktivierung stattfindende qualitative Änderungen bei der Regulierung der Bindung von Liganden ebenfalls eine wichtige Rolle spielen [Detmers P. A. et al., J. Cell. Biol. 105: 1137-1145 (1987)]. Sowohl die qualitativen als auch die quantitativen Änderungen können bei der Regulierung der Bindung von Leukozyten an post-kapillärem Endothel an Entzündungsstellen eine wichtige Rolle spielen.
Es wurde über die N-terminale Sequenz der α- Untereinheiten von murinem und humanem Mac-1 [Miller L. J. et al., J. Immunol. 138: 2381-2383 (1987); Springer T. A. et al., Nature 314: 540-542 (1985)] und über einen murinen genomischen Klon, der einen kurzen N-terminalen Exon codiert [Sastre L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5644-5648 (1986)] berichtet.
Somit erfordert, kurz ausgedrückt, die Fähigkeit der Leukozyten zur Wahrung der Gesundheit und Lebensfähigkeit eines Tieres, dass sie fähig sind, sich an andere Zellen (wie Endotheltellen) und Proteine (wie iC3b) anzuheften. Es wurde festgestellt, dass diese Adhäsion Kontakte erfordert, an denen spezifische, an der Leukozytenoberfläche der Leukozyten befindliche Rezeptormoleküle beteiligt sind. Es wurde festgestellt, dass diese Zelloberflächen-Rezeptormoleküle in hohem Masse miteinander verwandt sind. Menschen, bei deren Leukozyten diese Zelloberflächen-Rezeptormoleküle fehlen, weisen chronische und wiederkehrende Infektionen auf, wie auch andere klinische Symptome.
Da die Leukozytenadhäsion am Prozess beteiligt ist, durch den fremdes Gewebe identifiziert und verworfen wird, ist auf dem Gebiet der Organtransplantation, Gewebeverpflanzung, Allergie und Onkologie eine umfassende Kenntnis dieses Prozesses von bedeutendem Wert.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung steht in Beziehung mit dem Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 sowie mit dem Leukozytenzellen- Adhäsionsrezeptor-Molekül Mac-1 und der Verwendung von funktionellen Derivaten von ICAM-1 bei der Behandlung von Entzündung, die sich bei einem Säugersubjekt aus dem spezifischen Abwehrsystem ergibt.
In vorgängigen Untersuchungen mittels Mutanten von ICAM- 1 mit Deletion von Domänen und Substitution von Aminosäuren wurden die Bindungsstellen von LFA-1 und des humanen Rhinovirus bei der ersten NH&sub2;-terminalen Ig-ähnlichen Domäne geortet [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)]. Es wurde festgestellt, dass sich das Leukozyten-Integrin Mac-1, das mit LFA-1 eng verwandt ist, ebenfalls an ICAM-1 bindet [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)].
Die vorliegende Erfindung stammt zum Teil von einer Lokalisierung der Bindungsstelle von Mac-1 auf ICAM-1. Auf unerwartete Weise wurde in der dritten NH&sub2;-terminalen Ig-ähnlichen Domäne ein eigenständiger Bindungsbereich gefunden und festgestellt, dass zwei in dieser Domäne gelegene Glykosylierungsstellen die Fähigkeit von ICAM-1 zur Adhäsion an Mac-1 dramatisch verändern.
Im einzelnen steht die Erfindung in Beziehung mit der Verwendung eines funktionellen Derivats von ICAM-1, insbesondere eines löslichen funktionellen Derivats, das zur Bindung an Mac-1 im wesentlichen unfähig ist, jedoch zur Bindung an LFA-1 im wesentlichen fähig ist.
Die Erfindung umfasst insbesondere diejenigen unter den im vorstehenden beschriebenen funktionellen Derivaten von ICAM-1, welche die Domäne 1 von ICAM-1 enthalten.
Die Erfindung stellt die Verwendung eines Entzündungshemmers zur Verfügung, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er fähig ist, Entzündung zu behandeln, die sich aus einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems ergibt, jedoch im wesentlichen unfähig ist, eine Entzündung zu unterdrücken, die sich aus einer Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems ergibt.
Die Erfindung stellt die Verwendung eines Entzündungshemmers zur Verfügung, der ein funktionelles Derivat und insbesondere ein lösliches Derivat von ICAM-1 ist, welches zur Bindung an Mac-1 im wesentlichen unfähig ist, jedoch zur Bindung an LFA-1 im wesentlichen fähig ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 veranschaulicht die Adhäsion von LFA-1- und Mac-1-COS- Zellen an gereinigtes ICAM-1.
Fig. 2 veranschaulicht eine Kenlinie der Adhäsionsantwort von ICAM-1&spplus;-L-Zellen an gereinigtes Mac-1 in Abhängigkeit von der Dosis.
Fig. 3 veranschaulicht einen Vergleich der Avidität von ICAM- 1&spplus;-L-Zellen gegenüber gereinigtem Mac-1 und LFA-1.
Fig. 4 veranschaulicht die Temperaturabhängigkeit der Adhäsion von ICAM-1&spplus;-Zellen an gereinigtes Mac-1 und LFA-1.
Fig. 5 veranschaulicht die Adhäsion von Endothelzellen der humanen Nabelschnurvene (HUVEC-Zellen) an gereinigtes Mac-1.
Fig. 6 veranschaulicht Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern über die Hemmung der Adhäsion von ICAM-1&spplus;- Zellen an gereinigtes Mac-1 und LFA-1.
Fig. 7 veranschaulicht die Bindung von Mutanten von ICAM-1 mit Deletion von Domänen an LFA-1 und Mac-1. Die Wertangaben sind Durchschnittswerte aus drei voneinander unabhängigen Untersuchungen, und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.
Fig. 8 veranschaulicht die Wirkung des Inhibitors der Glucosidase des endoplasmatischen Retikulums, Deoxymannojirimycin, auf die Adhäsion von ICAM-1&spplus;-Zellen an Mac-1.
Fig. 9 veranschaulicht die Wirkung der Seitenketten-Glykosylierung auf die Adhäsion von ICAM-1&spplus;-Zellen an gereinigtes Mac-1.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSBILDUNGEN

1. Behandlung von Entzündung

Die vorliegende Erfindung steht in Beziehung mit der Verwendung eines "funktionellen Derivats" von ICAM-1.
Die Adhäsionsfähigkeit der zirkulierenden Neutrophilen und Monozyten ergibt sich aus Wechselwirkungen, an denen das Mac-1-Rezeptormolekül beteiligt ist. Da zelluläre Adhäsion erforderlich ist, um solchen Zellen zu ermöglichen, zu Entzündungsstellen zu wandern und/oder verschiedene zur Entzündung beitragenden Effektorfunktionen auszuüben, führen Wirkstoffe, die eine solche zelluläre Adhäsion hemmen, zu einer Verminderung oder Unterdrückung der Entzündung. Das Mac-1- Rezeptormolekül sitzt auf der Zelloberfläche von Neutrophilen und Monozyten. Die Adhäsion dieser Zellen an Kunststoffoberflächen oder an einlagige Schichten von Endothelzellen wird vom Mac-1-Rezeptormolekül vermittelt. Zudem wurde festgestellt, dass die Fähigkeit der Monozyten zur Phagozytose von Fremdstoffen vom Mac-1-Rezeptormolekül vermittelt wird. Das Rezeptormolekül wurde auch wegen seiner Rolle bei der Chemokinese und Chemotaxis der Monozyten herangezogen.
Wirkstoffe, die mit der Fähigkeit des Mac-1-Rezeptormoleküls zur Bindung an seinen Liganden der natürlichen Bindung interferieren, sind deshalb fähig, alle die im vorstehenden beschriebenen, von Mac-1 abhängigen Funktionen zu beeinträchtigen.
Im Sinne des vorliegenden Textes ist zu verstehen, dass ein "Antagonist der zellulären Adhäsion" sich auf jedes Molekül bezieht, das fähig ist, den Prozess der Adhäsion zwischen Zelle und Zelle oder zwischen Zelle und Substrat zu hemmen. Es ist möglich festzustellen, ob eine gewisse Verbindung ein Antagonist ist, indem man die Adhäsion von Monozyten an Endothelzellen bestimmt (ein Assay ausführt). Geeignete Bestimmungen der zellulären Adhäsion sind offenbart [beispielsweise Keizer G. D. et al., Eur. J. Immunol. 17: 1317-1322 (1987)]. Antagonisten der zellulären Adhäsion sind bei der Behandlung von Entzündung als Gegenmittel gegen Entzündung verwendbar. Im Sinne des vorliegenden Textes ist zu verstehen, dass der Terminus "Entzündung" Reaktionen des spezifischen und des nicht-spezifischen Abwehrsystems umfasst.
Eine "Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems" ist eine Antwort, die von des immunologischen Gedächtnisses unfähigen Leukozyten vermittelt wird. Derartige Zellen umfassen Neutrophile und Makrophagen. Im Sinne des vorliegenden Textes wird gesagt, dass sich Entzündung aus einer Antwort des nicht-spezifischen Abwehrsystems ergibt, wenn die Entzündung von einer Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wird oder damit assoziiert ist. Beispiele einer Entzündung, die sich zumindest teilweise aus einer Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems ergibt, umfassen Entzündungen, die assoziiert sind mit Zuständen wie: Erwachsenen-Atemnot-Syndrom (ARDS, steht für "Adult Respiratory Distress Syndrome") oder sekundär zu Septikämie oder Trauma auftretendem Multiplen-Organschaden-Syndrom; Reperfusionsschaden von Myokard- oder anderem Gewebe; akuter Glomerulonephritis; reaktiver Arthritis; Dermatosen mit Komponenten akuter Entzündung; akuter purulenter Meningitis oder anderen entzündungsbedingten Störungen des zentralen Nervensystems; thermischem Schaden; Hämodialyse; Leukapheresis; Colitis ulcerosa; Crohn-Krankheit; nekrotisierender Enterocoli tis; der Granulozyten-Transfusion assoziierten Syndromen; und von Zytokin induzierter Toxizität.
Im Gegensatz dazu ist eine "Reaktion des spezifischen Abwehrsystems" eine Reaktion, die von ein immunologisches Gedächtnis aufweisenden Leukozyten vermittelt wird. Es wird gesagt, dass sich Entzündung aus einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems ergibt, wenn die Entzündung von einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wird oder damit assoziiert ist. Beispiele einer Entzündung, die sich aus einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems ergibt, umfassen die Antwort auf Antigene wie das Röteln-Virus, Autoimmun-Krankheiten, von T-Zellen vermittelte Überempfindlichkeits-Antwort des verzögerten Typus (wie sie beispielsweise bei Individuen mit "positivem" Befund beim Mantaux-Test anzutreffen ist), usw.

II. Zelluläre Adhäsion

A. Die CD11/CD18-Familie

Die CD11/CD18-Familie steht strukturell und genetisch in Beziehung mit der grösseren Integrin-Familie von Oberflächenrezeptoren, welche die Embryogenese, die Adhäsion an extrazelluläre Substrate und die Zelldifferenzierung beherrschen [Hynes R. O., Cell 48: 549-554 (1987); Kishimoto T. K. et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989); Kishimoto T. K. et al., Cell 48: 681-690 (1987); Ruoslahti E. et al., Science 238: 491-197 (1987).
Es wurde festgestellt, dass die Moleküle dieser Familie und ihre zellulären Liganden bei einer Entzündung Wechselwirkungen zwischen Zelle und Zelle vermitteln. Es wurde festgestellt, dass diese Proteine bei den Adhäsionsfunktionen im Immunsystem eine kritische Rolle spielen [Kishimoto T. K. et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989)]: Gegen LFA-1 gerichtete monoklonale Antikörper blockieren die Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen [Dustin M. L. et al., J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988); Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)] und hemmen die Konjugatenbildung, die zur antigenspezifischen Tötung von CTL-Zellen [Kishimoto T. K. et al., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989)], zur Proliferation der T-Zellen [Davignon D. et al., J. Immunol. 127: 590-595 (1981)] und zur Tötung der NK-Zellen [Krensky A. M. et al., J. Immunol. 131: 611-616 (1983)] erforderlich ist; Gegen Mac-1 gerichtete monoklonale Antikörper blockieren die Bindung von mit iC3b beschichteten Teilchen [Beller D. I. et al., J. Exper. Med. 156: 1000-1009 (1982)], die Adhäsion von Myeloidzellen an Endothelzellen [Lo S. K. et al., J. Immunol. 143(10): 3325-3329 (1989); Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)], die homotypische Aggregation und die Chemotaxis von Neutrophilen [Anderson D. C. et al., J. Immunol. 137: 15-27 (1986)]; Gegen p150,95 gerichtete monoklonale Antikörper blockieren die Adhäsion von Monozyten an Endothelzellen [Anderson D. C. et al., J. Immunol. 137: 15-27 (1986); Keizer G. D. et al., Eur. J. Immunol. 17: 1317-1322 (1987)] und die Bildung von Konjugaten der CTL-Zellen mit den Zielzellen [Keizer G. D. et al., J. Immunol. 138: 3130-3136 (1987)].
Es wurde festgestellt, dass LFA-1 die Adhäsion von Leukozyten an nicht-stimulierten oder stimulierten Endothelzellen vermittelt [Dustin M. L. et al., J. Cell. Biol. 107: 321- 331 (1988); Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)], während festgestellt wurde, dass Mac-1 die Adhäsion von Neutrophilen und Monozyten an das entzündete Endothel vermittelt [Luscinkas F. W. et al., J. Immunol. 142(7): 2257- 2263 (1989)].

B. ICAM-1

ICAM-1 (CD54) ist ein Zelloberflächen-Adhäsionsrezeptor, das ein Mitglied der Immunglobulinprotein-Superfamilie ist [Rothlein R. M. et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986); Staunton D. E. et al., Cell 52: 925-933 (1988)]. Es wird in einer Vielfalt von hämatopoetischen und nicht-hämatopoeti schen Zellen exprimiert und wird von einer Vielfalt von Entzündungsvermittlern aufwärts reguliert [Dustin M. L. et al., J. Immunol. 137: 256-264 (1986)]. ICAM-1 ist ein Glykoprotein von 90'000-110'000 Mr mit einem niedrigen Niveau von RNA-Botschaft und mässiger Oberflächenexpression auf nichtstimulierten Endothelzellen; LPS, IL-1 und TNF bewirken eine starke Aufwärtsregulation der mRNA und Oberflächenexpression von ICAM-1 mit einer Spitzenexpression bei etwa 18-24 Stunden [Dustin M. L. et al., J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988); Staunton D. E. et al., Cell 52: 925-933 (1988)]. ICAM-1 hat fünf extrazelluläre Domänen (die als Domänen 1, 2, 3, 4 und 5 oder D1, D2, D3, D4 und D5 bezeichnet werden) und eine intrazelluläre oder zytoplasmische Domäne. Die Strukturen und die Sequenz der Domänen sind von Staunton D. E. et al. [Cell 52: 925-933 (1988)] offenbart.
Ursprünglich wurde ICAM-1 als Gegenrezeptor zu LFA-1 definiert [Springer T. A. et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987); Marlin S. D., Cell 51: 813-819 (1987); Simmons D. et al., Nature 331: 624-627 (1988); Staunton D. E., Nature 339: 61- 64 (1989); Staunton D. E. et al., Cell 52: 925-933 (1988)]. Zum Teil ist die Wechselwirkung zwischen LFA-1 und ICAM-1 für die Lymphozytenadhäsion [Dustin M. L. et al., J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988); Mentzer S. J. et al., J. Cell. Physiol. 126: 285-290 (1986)], die Monozytenadhäsion [Amaout M. A. et al., J. Cell. Physiol. 137: 305 (1988); Mentzer S. J. et al., J. Cell. Physiol. 130: 410-415 (1987); te Velde A. A. et al., Immunology 61: 261-267 (1987)1 und die Neutrophilenadhäsion [Lo S. K. et al., J. Immunol. 143(10): 3325-3329 (1989); Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)] an Endothelzellen verantwortlich.

C. Die Prozesse der zellulären Adhäsion

Obwohl Untersuchungen über die Blockierung durch monoklonale Antikörper eine Rolle von Mac-1 bei der Adhäsion von Neutrophilen sowohl an nicht-stimulierte wie an durch Cytokin stimulierte Endothelzellen überzeugend bewiesen haben [Lo S. K. et al., J. Exp. Med. 169: 1779-1793 (1989); Lo S. K. et al., J. Immunol. 143 (10): 3325-3329 (1989); Luscinkas F. W. et al., J. Immunol. 142(7): 2257-2263 (1989); Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)], bleibt die Identifizierung der Gegenrezeptor(en) auf der Endothelzellenoberfläche weniger gesichert. ICAM-1 und ICAM-2 sind zwei Kandidaten als Liganden für das Mac-1-Adhäsionsmolekül.
Mit den Resultaten, die mit der vorliegenden Erfindung erreicht wurden, wurde es nun möglich nachzuweisen, dass mit ICAM-1 oder Mac-1 transfizierte COS-Zellen sich an gereinigte Mac-1- oder ICAM-1-Substrate anheften, und dass ein gegen ICAM-1 gerichteter monoklonaler Antikörper die Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)] oder an ICAM-1 enthaltenden ebenen Membranen hemmt [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)]. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung erfolgt somit die von LFA-1 abhängige Adhäsion an Endothelzellen über ICAM-1 [Dustin M. L. et al., J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988); Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)] und ICAM-2. Zudem deckt die vorliegende Erfindung auf, dass ICAM-1 ein Gegenrezeptor zu Mac-1 ist.

III. Produktion von ICAM-1, Mac-1 und deren funktionellen Derivaten

Die Nucleinsäure- und Proteinsequenzen der α- und β-Untereinheiten des Mac-1-Rezeptormoleküls sind jeweils in den US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/321,239 und 07/019,440 offenbart. Die Nucleinsäure- und Proteinsequenzen von ICAM-1 sind von Staunton D. E. et al. offenbart [Cell 52: 925-933 (1988); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird]. Diese Offenbarungen ermöglichen die Verwendung einer Technologie der rekombinanten DNA zur Produktion von ICAM-1, Mac-1 und deren funktionelle Derivate.
Die Gegenmittel gegen Entzündung und die antiviralen Mittel der vorliegenden Erfindung können erhalten werden: mit natürlichen Prozessen (wie beispielsweise, indem ein Tier, eine Pflanze, Pilze, Bakterien usw. dazu induziert werden, einen Nicht-Immunglobulin-Antagonisten von ICAM-1 zu produzieren, oder indem ein Tier dazu induziert wird, zur Bindung an ICAM-1 fähige polyklonale Antikörper zu produzieren); mit synthetischen Verfahren (wie beispielsweise, indem das Merrifield-Verfahren der Polypeptid-Synthese verwendet wird, um ICAM-1, Mac-1 oder funktionelle Derivate des einen oder anderen, oder als Protein (entweder als Immunglobulin oder als Nicht-Immunglobulin) beschaffene Antagonisten von ICAM-1 oder Mac-1 zu synthetisieren); mit der Hybridomtechnologie (wie beispielsweise, indem zur Bindung an ICAM-1 fähige monoklonale Antikörper produziert werden); oder mit rekombinanter Technologie (wie beispielsweise, indem die erfindungsgemässen Gegenmittel gegen Entzündung in verschiedenen Wirtsorganismen (d. h. in Hefe, Bakterien, Pilzen, kultivierten Säugerzellen usw.) oder aus rekombinanten Plasmiden oder viralen Vektoren produziert werden) [Kishimoto T. K. et al., Cell 48: 681-690 (1987)]. Die Wahl der zu verwendeten Methode ist von Faktoren wie Bequemlichkeit, gewünschte Ausbeute usw. abhängig. Zur Produktion eines bestimmten Gegenmittels gegen Entzündung ist es nicht notwendig, nur eines der im vorstehenden angegebenen Verfahren, Prozesse oder Technologien zu verwenden; die im vorstehenden angegebenen Verfahren, Prozesse oder Technologien können kombiniert werden, um zu einem bestimmten Gegenmittel gegen Entzündung zu kommen.
Beispiele von biologischen Aktivitäten umfassen die Fähigkeit zur Bindung an ein Mitglied der LFA-Familie von Glykoproteinen, die Fähigkeit zur kompetitiven Hemmung der Bindung des Anti-ICAM-1-Antikörpers an ICAM- 1, oder die Fähigkeit zur kompetitiven Hemmung der Bindung eines LFA-1-, Mac-1- oder p150,95-Moleküls an ICAM-1 usw.
Ein "funktionelles Derivat" von Mac-1 ist eine Verbindung, die vom Mac-1-Heterodimer, von der α-Untereinheit von Mac-1, oder von einem Fragment des Mac-1-Heterodimers derivatisierbar ist und zudem fähig ist, sich an ICAM-1 oder an ein Fragment davon zu binden.
Der Terminus "funktionelles Derivat" ist so zu verstehen, dass er die "Fragmente", "Varianten", "Analoga" oder "chemischen Derivate" eines Moleküls umfasst. Ein "Fragment" eines Moleküls wie ICAM-1 oder Mac-1 ist so zu verstehen, dass es jegliche Polypeptid-Untermenge des Moleküls bezeichnet. Bevorzugt werden Fragmente von ICAM-1, die eine ICAM-1- Aktivität aufweisen und löslich (d. h. nicht membrangebunden) sind.
Eine "Variante" eines Moleküls wie ICAM-1 oder Mac-1 ist so zu verstehen, dass sie sich auf ein Molekül bezieht, das in bezug auf die Struktur und die Funktion entweder dem ganzen Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist. Ein "Analogon" eines Moleküls wie ICAM-1 oder Mac-1 ist so zu verstehen, dass es sich auf ein Molekül bezieht, das in bezug auf seine Funktion entweder dem ganzen Molekül oder einem Fragment davon im wesentlichen ähnlich ist.
Ein Molekül wird als einem anderen Molekül "im wesentlichen ähnlich" bezeichnet, wenn die beiden Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen aufweisen oder wenn die beiden Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Somit werden zwei Moleküle, wenn sie eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen, als Varianten im Sinne des vorliegenden Textes betrachtet, auch wenn die Struktur des einen Moleküls beim anderen nicht vorgefunden wird oder die Sequenz von Aminosäureresten nicht identisch ist.
Im Sinne des vorliegenden Textes wird ein Molekül als "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls bezeichnet, wenn es zusätzliche chemische Molekülteile enthält, die nicht normalerweise Teil des Moleküls sind. Solche Molekülteile können die Löslichkeit, die Absorption, die biologische Halbwertszeit usw. des Moleküls verbessern. Die Molekülteile können andererseits die Toxizität des Moleküls abschwächen, irgendwelche unerwünschte Nebeneffekte des Moleküls beseitigen oder vermindern, usw. Zur Vermittlung solcher Wirkungen fähige Molekülteile sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. "Toxin-derivatisierte" Moleküle stellen eine spezielle Klasse der "chemischen Derivate" dar. Ein "toxinderivatisiertes" Molekül ist ein Molekül (wie ICAM-1 oder eines seiner funktionellen Derivate), welches einen toxischen Molekülteil enthält. Die Bindung eines solchen Moleküls an eine Zelle bringt den Toxin-Molekülteil ganz in die Nähe der Zelle und bewirkt dadurch den Zelltod. Es ist jegliches geeignetes Toxin-Molekülteil verwendbar; bevorzugt wird jedoch die Verwendung von Toxinen wie beispielsweise Ricintoxin, Diphterietoxin, radioisotopischen Toxinen, membrankanalbildenden Toxinen, usw. Verfahren zur Kupplung solcher Molekülteile mit einem Molekül sind wohlbekannter Stand der Technik.
Eine "peptidomimetische Verbindung" von ICAM-1 ist ein funktionelles Derivat von ICAM-1, dessen tertiäre Struktur der tertiären Struktur von ICAM-1 im wesentlichen ähnlich ist. Auf gleiche Weise ist eine "peptidomimetische Verbindung" von Mac-1 ein funktionelles Derivat von Mac-1, dessen tertiäre Struktur der tertiären Struktur von Mac-1 im wesentlichen ähnlich ist.
Es ist ferner beabsichtigt, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung solche funktionelle Derivate von ICAM-1 aufzunehmen, denen gewisse Aminosäurereste fehlen oder die veränderte Aminosäurereste enthalten, solange solche Derivate die Fähigkeit aufweisen, die zelluläre Adhäsion zu erhöhen oder zu hemmen. Solche funktionelle Derivate können mit chemischen oder rekombinanten Mitteln produziert werden.
Funktionelle Derivate mit bis zu etwa 100 Resten können auf geeignete Weise durch Synthese in vitro hergestellt werden. Gewünschtenfalls können solche Fragmente modifiziert werden, indem gezielt ausgewählte Aminosäurereste des gereinigten oder rohen Proteins mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das fähig ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren. Die sich daraus ergebenden kovalenten Derivate sind zur Identifizierung von Resten verwendbar, die aufgrund ihrer biologischen Aktivität wichtig sind. Cysteinylreste werden in den meisten Fällen mit α-Haloacetaten (und entsprechenden Aminen) wie chloressigsäure oder chloracetamid umgesetzt, was zu Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivaten führt. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimiden, 3-Nitro-2- pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlorquecksilber(II)benzoat, 2-Chlorquecksilber-(II)-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3- diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylprocarbonat bei einem pH-Wert von 5,5-7,0 derivatisiert, weil dieses Agens für die Histidylseitenkette ziemlich spezifisch ist. p-Bromphenacylbromid ist auch verwendbar; die Umsetzung erfolgt vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH-Wert von 6,0.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäureanhydrid oder Anhydride anderer Carbonsäuren umgesetzt. Eine Derivatisierung mit diesen Agenzien bewirkt eine Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Agenzien zur Derivatisierung von α-Amino enthaltenden Resten umfassen Imidoester wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; o-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und eine von Transaminase katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Agenzien modifiziert, unter anderen mit Phenylglyoxal, 2,3- Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert wegen des hohen pKa-Werts der Guanidin-Funktionsgruppe eine Durchführung der Umsetzung unter alkalinen Bedingungen. Zudem können diese Agenzien mit den Gruppen des Lysins wie auch mit der epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosylresten wurde als solche eingehend untersucht, wobei ein besonderes Interesse der Einführung spektraler Marker in die Tyrosylreste durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder mit Tetranitromethan gewidmet wurde. In den meisten Fällen werden N-Acetylimidazol und Tetranitromethan zur jeweiligen Bildung von o-Acetyltyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitro-Derivaten verwendet. Zur Herstellung von markierten Proteinen zur Verwendung in Radioimmunbestimmungen (Radioimmunassays) werden Tyrosylreste mit ¹²&sup5;I oder ¹³¹I iodiert, wozu sich die Methode mit dem Chloramin T eignet.
Carboxy-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R'-N-C-N-R') wie 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4- azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid selektiv modifiziert. Zudem werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Umsetzung mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten konvertiert.
Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Agenzien ist verwendbar zur Vernetzung eines Moleküls eines funktionellen Derivats von ICAM-1 oder Mac-1 an eine in Wasser unlösliche Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Spaltung eines Fusionspolypeptids von funktionellen Derivaten von ICAM-1 oder Mac-1 zwecks Freisetzung und Wiedergewinnung des gespaltenen Polypeptids. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen beispielsweise 1,1-bis(Diazoacetyl)-2- phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester beispielsweise als Ester der 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester einschliesslich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithio-bis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleinimide wie bis-N-Maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsagenzien wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propionimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenstoffe, die fähig sind, in Gegenwart von Licht eine Vernetzung zu bilden. Wahlweise werden zur Immobilisierung von Proteinen reaktionsfähige, in Wasser unlösliche Matrizen wie mit Cyanogenbromid aktivierte Kohlenhydrate und die in den Patenten US-3969287, US-3691016, US-4195128, US-4247642, US-4229537 und US 4330440 beschriebenen reaktionsfähigen Substrate verwendet.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden oft zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten deamidiert. Wahlweise werden diese Reste unter mild sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste fallen unter den Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α- Aminogruppen der Seitenketten von Lysin, Arginin und Histidin [Creighton T. E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, Seiten 79-86 (1983)], die Acetylierung des N-terminalen Amins und, in einigen Fällen, die Amidierung der C-terminalen Carboxyreste.
Funktionelle Derivate von ICAM-1 oder Mac-1 mit veränderten Aminosäuresequenzen sind auch durch Mutationen in der ICAM-1 oder Mac-1 codierenden DNA herstellbar. Zu diesem Zweck können chemische oder Strahlungsmutagene verwendet werden. Chemische Mutagene umfassen Basen-Analoga (wie beispielsweise 5-Bromuracil oder 2-Aminopurin); Deaminierungsagenzien (wie beispielsweise salpetrige Säure, Hydroxylamin usw.); Alkylierungsagenzien (wie beispielsweise Methylmethansulfonat, Nitrosoguanidin usw.); oder Interkalierungsagenzien (wie beispielsweise Acridinorange, Ethidiumbromid, Psoralen usw.). Strahlungsinduzierte Mutation kann durch Mittel wie ultraviolettes Licht, Gammastrahlen, Röntgenstrahlen usw. verursacht werden. Techniken zur Anwendung von Mutagenese auf Nucleinsäuremoleküle sind in Miller J. H. [in: Experiments in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972)] und Silhavy T. J. et al [in: Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] zu finden.
Solche Agenzien sind zur zufallsmässigen Mutierung von ICAM-1 oder Mac-1 codierenden DNA verwendbar. Das mutierte Gen lässt man dann ein ICAM-1- oder Mac-1-Protein exprimieren, und das Protein wird auf seine Fähigkeit zur Bindung an Mac-1 (oder ICAM-1) bestimmt (einem Assay unterzogen). Derivate von ICAM-1, die zur Bindung an Mac-1 fähig sind, bilden eine erste Klasse von "funktionellen Derivaten". Derivate von Mac-1, die zur Bindung an ICAM-1 fähig sind, bilden eine zweite Klasse von "funktionellen Derivaten".
Wahlweise und vorzugsweise ist zur Erzeugung von spezifischen Mutationen an gewünschten Stellen der das ICAM-1- oder Mac-1-Molekül codierenden Nucleinsäure stellenspezifische Mutagenese verwendbar, was eine das "funktionelle Derivat" codierende DNA erzeugt, worauf man die DNA in einer Kultur rekombinanter Zellen exprimieren lässt. Die funktionellen Derivate weisen typisch die gleiche qualitative biologische Aktivität auf wie das natürlich vorkommende Analogon. In bezug auf solche Merkmale können sie sich jedoch von den normal hergestellten ICAM-1- oder Mac-1-Molekülen wesentlich unterscheiden.
Während die Einführungsstelle für eine Abänderung einer Aminosäuresequenz vorbestimmt ist, braucht die Mutation nicht selber vorbestimmt zu sein. So kann beispielsweise zur Optimierung der Durchführung einer Mutation an einer gewissen Stelle eine zufallsmässige Mutagenese am Zielcodon oder am Zielbereich durchgeführt werden, und die exprimierten funktionellen Derivate von ICAM-1 oder Mac-1 werden dann einem Ausleseverfahren (Screening) nach der optimalen Kombination der gewünschten Aktivität unterzogen. Techniken zur Erzeugung von Substitutions-Mutationen an vorbestimmten Stellen in einer DNA von bekannter Sequenz sind wohlbekannt, beispielsweise handelt es sich um die stellenspezifische Mutagenese.
Die Herstellung eines funktionellen Derivatmoleküls von ICAM-1 oder Mac-1 nach der im vorstehenden dargelegten Technik erfolgt vorzugsweise durch stellenspezifische Mutagenese von DNA, die ein bereits früher hergestelltes funktionelles Derivat oder eine ungeänderte Version des Proteins codiert. Stellenspezifische Mutagenese ermöglicht die Produktion von funktionellen Derivaten durch Verwendung von spezifischen Oligonucleotidsequenzen, welche die DNA-Sequenz der gewünschten Mutation wie auch eine Anzahl von benachbarten Nucleotiden codieren, welche Anzahl genügt, um zu einer Primer-Sequenz von genügender Grösse und Sequenzkomplexität zu führen, um ein stabiles Duplex beiderseits der durchgangenen Deletionsnahtstelle zu bilden.
Kurz ausgedrückt, Prozeduren zur stellenspezifischen Mutagenese führen im allgemeinen zur Synthese eines synthetischen Oligonucleotids, das eine gewünschte und definierte DNA-Sequenz enthält. Typisch bevorzugt wird ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nucleotiden und mit etwa 5 bis 10 Resten beiderseits der Nahtstelle der Sequenz in Änderung. Methoden zur Synthetisierung solcher Oligonucleotiden werden von Itakura K. et al. [Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356 (1984)], von Adelman et al. [DNA 2: 183 (1983)] und von Crea et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 5765 (1978)] offenbart.
Ein Nucleinsäuremolekül, das ICAM-1, Mac-1 oder ein funktionelles Derivat des einen oder des anderen codiert, wird im allgemeinen auf einen doppelsträngigen Vektor wie M13, φX174 usw. subkloniert, dessen einzelne Stränge voneinander trennbar sind [Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Herausgeber Walton A., Elsevier, Amsterdam (1981)]. Diese Phagen sind im Handel leicht erhältlich, und deren Verwendung ist den einschlägigen Fachleuten allgemein wohlbekannt. Wahlweise sind, um einsträngige DNA zu erhalten, Plasmid-Vektoren verwendbar, die einen Einstrangphagen-Replikationsursprung enthalten [Veira et al., Meth. Enzymol. 153: 3 (1987)].
Ein einzelner Strang des Vektors wird dann in Gegenwart des synthetischen Oligonucleotids inkubiert. Da die DNA des Oligonucleotids einstellbar definiert ist, ist es möglich, ein Oligonucleotid zu konstruieren, das zur Basenpaarung mit einem beliebigen Bereich der ICAM-1 oder Mac-1 codierenden Nucleinsäure fähig ist. Nachdem die Basenpaarung zwischen dem Oligonucleotid und dem einsträngigen Plasmid erfolgt ist, ist es möglich, unter Verwendung von DNA-Polymerase das Oligonucleotid zu erstrecken, um ein doppelsträngiges DNA-Molekül zu erzeugen, das dann durch DNA-Ligase zusammengefügt werden kann. Wird nun dieses doppelsträngige DNA-Molekül in eine Zelle (vorzugsweise in eine JM101-Zelle) eingeführt, so ergibt eine semi-konservative DNA-Replikation die Herstellung von Tochtermolekülen, bei denen die DNA-Sequenz des Oligonucleotidfragments in die ICAM-1 oder Mac-1 codierenden Sequenzen eingeführt wurde.
Somit wird nach seiner Bildung der Heteroduplex-Vektor zur Transformation von geeigneten Zellen wie JM101-Zellen verwendet, und es werden Klone selektioniert, welche die mutierte Sequenzanordnung tragende rekombinante Vektoren umfassen.
Nachdem ein solcher Klon selektioniert wurde, kann der Bereich des mutierten Proteins daraus entfernt und in einen zur Produktion von Protein geeigneten Vektor gezetzt werden, welcher im allgemeinen ein Expressionsvektor desjenigen Typus ist, der zur Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus verwendbar ist.
Wenn es folglich erwünscht ist, eine Punktmutation und eine exogene DNA-Sequenz an einer spezifischen Stelle der ICAM-1 oder Mac-1 codierenden Sequenz einzuführen oder eine Deletion von in einer solchen Sequenz normalerweise vorhandenen Nucleotiden zu erzeugen, wäre ein Oligonucleotidfragment zu entwerfen, welches die Mutation oder Sequenz enthalten (oder entbehren) würde, und dann mit der im vorstehenden beschriebenen Prozedur fortzufahren. Zur Einführung einer derartigen Mutation oder exogenen DNA-Sequenz in einen bestimmten Bereich der die Mac-1-Untereinheit codierenden Nucleinsäure ist es nötig, die Mutation oder exogene DNA-Sequenz mit flankierenden DNA-Sequenzen einzurahmen, die der DNA-Sequenz des Bereiches, dessen Mutagenese gewünscht wird, komplementär sind [Jenkins F. et al., Bioessays 5: 244-247 (1986); Doerfler W., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23: 919-931 (1984); Kaina B., Biol. Zentralbl. 99: 513-531 (1980); Kunkel T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985); Nisbet I. T. et al., Gene Anal. Tech. 2: 23-29 (1985); Hines J. C. et al., Gene 11: 207- 218 (1980); Messing J. et al., Nucl. Acid. Res. 9: 309 (1981)].
Mutationen können auch durch andere Anwendungen der Technologie der rekombinanten DNA produziert werden. Beispielsweise kann die Nucleotidsequenz eines ICAM-1 oder Mac-1 codierenden Nucleinsäuremoleküls abgesucht werden, um von Restriktions-Endonucleasen erkennbare Oligonucleotidstellen zu identifizieren. Solche Endonucleasen sind dann zur spezifischen Spaltung der Nucleinsäuresequenz an der erkannten Stelle verwendbar. Durch Verwendung einer Restriktions- Endonuclease, welche zwei in der ICAM-1 oder Mac-1 codierenden Sequenz befindlichen Stellen erkennt (und an diesen Stellen spaltet), ist es möglich, ein Fragment dieser Sequenz zu excisieren. Wahlweise ist es möglich, zu diesem Zweck zwei verschiedene Endonucleasen zu verwenden. Durch Inkubation der gespaltenen Moleküle in Gegenwart von DNA-Ligase ist es möglich, die ICAM-1 oder Mac-1 codierenden Sequenzen zur Bildung einer einzigen Sequenz (der das excisierte Fragment fehlt) wieder zusammenzufügen. Wenn in den ICAM-1 oder Mac-1 codierenden Sequenzen keine geeigneten Erkennungsstellen für die Restriktions-Endonuclease existieren, können derartige Stellen nach den im vorstehenden beschriebenen Prozeduren zur stellenspezifischen Mutagenese in die Sequenzen eingeführt werden.
Wahlweise können Mutationen eingeführt werden, indem die ICAM-1 oder Mac-1 codierende Sequenz gespalten wird und die freien Termini mit einer Exonuclease "weggeknabbert" werden. Mit einer derartigen Behandlung ist es möglich, nicht nur Deletionen, sondern auch Leseraster- und andere Arten von Mutationen einzuführen. Die Technik ist zudem fähig, neuartige Restriktions-Endonuclease-Stellen in die Codiersequenz einzufügen. Verfahren zur Verwendung von Restriktions- Endonucleasen, DNA-Ligasen und Exonucleasen sind beispielsweise von Maniatis T. et al. offenbart [in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)].
Techniken der rekombinanten DNA sind auch verwendbar, um Fusionsproteine herzustellen, die aus dem ICAM-1- oder Mac-1- Protein (oder einem funktionellen Derivat davon) und einem neuartigen Polypeptid zusammengesetzt sind. Dieses neuartige Polypeptid ist nicht auf ein bestimmtes Polypeptid beschränkt und kann entweder eine einzelne Aminosäure oder jedwelche Menge oder Permutation von Aminosäuren umfassen. Derartige Fusionsmoleküle können hergestellt werden durch Ligation einer das neuartige Polypeptid codierenden DNA-Sequenz mit einer ICAM-1 oder Mac-1 (oder ein funktionelles Derivat davon) codierenden DNA-Sequenz auf eine Weise, die keine Leseraster- Mutation einführt. Beispiele von bevorzugten, mit einem ICAM- 1-Gen oder einem Gen einer Mac-1-Untereinheit (oder einem funktionellen Derivat davon) fusionierbaren Polypeptiden, umfassen eukaryotische oder prokaryotische Signalsequenzen [Gilbert W. et al., US-4411994; Casadaban M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4530-4533 (1979)] oder Polypeptide, welche die Stabilität, die biologische Halbwertszeit oder die Wirksamkeit von ICAM-1 oder Mac-1 (oder eines funktionellen Derivats davon) erhöhen (oder herabsetzen). Besonders bevorzugt wird ein Fusionsprotein eines ICAM-1- oder Mac-1-Moleküls oder eines funktionellen Derivats von ICAM-1 mit einem Immunglobulin (oder einem Fragment davon). Eine ausgezeichnete Übersicht zur Methodologie der Genfusionen wird von Silhavy T. J. et al [in: Experiments with Gene Fusion, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] gegeben.
Unter Verwendung der im vorstehenden beschriebenen Verfahren können Varianten von ICAM-1 oder Mac-1 hergestellt werden. Derartige Varianten umfassen beispielsweise Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der Aminosäuresequenz von ICAM-1 oder Mac-1. Deletionen einer Aminosäuresequenz liegen im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 30 Resten, vorzugsweise von 1 bis 10 Resten, und typischerweise aneinander. Insertionen einer Aminosäuresequenz umfassen Fusionen am endständigen Amino und/oder Carboxy von einem Rest bis zu Polypeptiden von im wesentlichen unbeschränkter Länge, wie auch Intrasequenz-Insertionen von einzelnen oder mehrfachen Aminosäureresten. Intrasequenz-Insertionen (d. h. Insertionen innerhalb der vollständigen ICAM-1- oder Mac-1-Molekülsequenz) können im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten, vorzugsweise von 1 bis 5 Resten liegen. Ein Beispiel einer endständigen Insertion umfasst die Fusion einer Signalsequenz, ob heterolog oder homolog zur Wirtszelle, an den N-Terminus des Moleküls, um die Sekretion des funktionellen Derivats durch die rekombinanten Wirtsorganismen zu erleichtern. Zur Erreichung der endgültigen Konstruktion kann auch jedwelche Kombination von Deletionen, Insertionen und Substitutionen erfolgen, vorausgesetzt, die endgültigen Konstruktion weist die gewünschte Aktivität auf. Offensichtlich dürfen die Mutationen, welche an der den Varianten codierende DNA vorgenommen werden, die Sequenz nicht aus dem Leseraster herausbringen und, vorzugsweise, keine komplementären Bereiche erzeugen, die eine sekundäre mRNA- Struktur produzieren könnten (vgl. EP-A-0075444).
Unter Verwendung der im vorstehenden beschriebenen Verfahren ist es möglich, funktionelle Derivate zu produzieren, bei denen zumindest ein im ICAM-1- oder Mac-1-Molekül enthaltener Aminosäurerest, und vorzugsweise nur einer, entfernt und durch einen an seiner Stelle eingefügten anderen Rest ersetzt wurde. Wenn es gilt, die kennzeichnenden Eigenschaften des ICAM-1- oder Mac-1-Moleküls fein zu modulieren, erfolgen derartige Substitutionen vorzugsweise in Übereinstimmung mit der Tabelle 1.

Tabelle 1

Ursprünglicher Rest Substitutionsbeispiele

Ala Gly; Ser
Arg Lys
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Ala; Pro
His Asn; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Glu
Met Leu; Tyr; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
Wesentliche Änderungen der funktionellen oder immunologischen Identität werden erreicht, indem Substitutionen ausgewählt werden, die weniger konservativ sind als diejenigen der Tabelle 1, d. h. durch die Auswahl von Resten, die sich in ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptid-Kettenrückgrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle, oder (c) des Hauptteils der Seitenkette bedeutender unterscheiden. Die im allgemeinen zu erwartenden Substitutionen sind solche, bei denen (a) Glycin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure ersetzt wird oder eine Deletion oder Insertion erfährt; (b) ein hydrophiler Rest, beispielsweise Seryl oder Threonyl, anstelle eines hydrophoben Rests, beispielsweise Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl gesetzt oder durch diesen ersetzt wird; (c) ein Cysteinrest anstelle eines beliebigen anderen Rests gesetzt oder durch diesen ersetzt wird; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, beispielsweise Lysyl, Arginyl oder Histidyl, anstelle eines Rests mit einer elektronegativen Ladung, beispielsweise Glutamyl oder Aspartyl, gesetzt oder durch diesen ersetzt wird; oder (e) ein Rest mit einer voluminösen Seitenkette, beispielsweise Phenylalanin, anstelle eines Rests, der keine derartige Seitenkette aufweist, beispielsweise Glycin, gesetzt oder durch diesen ersetzt wird.
Von den meisten Deletionen oder Insertionen, und insbesondere Substitutionen, wird nicht erwartet, dass sie grundlegende Änderungen der kennzeichnenden Eigenschaften des ICAM-1- oder Mac-1-Moleküls herbeiführen. Wenn es jedoch schwierig ist, die genaue Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor deren Durchführung vorauszusagen, ist es einer fachkundigen Person naheliegend, dass die Wirkung mit einem routinemässigen Ausleseverfahren (Screening Assay) feststellbar ist. Beispielsweise wird ein funktionelles Derivat typisch hergestellt durch stellenspezifische Mutagenese der natürlichen, das ICAM-1- oder Mac-1-Molekül codierenden Nucleinsäure, Expression der Nucleinsäure-Variante in einer Kultur von rekombinanten Zellen und gegebenenfalls Reinigung der Zellkultur beispielsweise durch Immunaffinitätsadsorption auf einer Anti-ICAM-1-Molekül-Antikörper-Säule (zur Absorption des funktionellen Derivats durch dessen Bindung an mindestens ein verbleibendes Immunepitop).
Die Aktivität des Zellenlysats oder des gereinigten funktionellen Derivats des ICAM-1-Moleküls wird dann einem geeigneten Ausleseverfahren (Screening Assay) in bezug auf die gewünschte kennzeichnende Eigenschaft unterzogen. Beispielsweise wird eine Änderung des kennzeichnenden immunologischen Eigenschaft des funktionellen Derivats, wie die Affinität für einen bestimmten Antikörper, mit einem Immun-Bestimmung (Immunoassay) vom kompetitiven Typus gemessen. Änderungen der immunmodulierenden Aktivität werden mit der geeigneten Bestimmung (Assay) gemessen. Änderungen solcher Eigenschaften von Proteinen wie Redox- oder thermische Stabilität, biologische Halbwertszeit, Hydrophobizität, Empfindlichkeit auf proteolytischen Abbau oder Tendenz zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren werden mit Verfahren (Assay) bestimmt, die einer fachkundigen Person wohlbekannt sind.

IV. Produktion von Antikörpern, die fähig sind, die Bindung von ICAM-1 an Mac-1 zu beeinträchtigen

Als Antwort auf eine Immunisierung mit Fragmenten von erfindungsgemässen ICAM-1-Molekülen können Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper) hervorgerufen werden. Solche Antikörper können zur Identifikation von Antikörpern, die spezifisch zur Hemmung der Fähigkeit von ICAM-1 zur Bindung an Mac-1 fähig sind, herangezogen werden. Diese Antikörper sind zur Vermeidung oder Verminderung einer solchen Bindung und somit zur Behandlung von Entzündungsreaktionen des nichtspezifischen Abwehrsystems verwendbar. Zudem sind solche Antikörper zur Vermeidung oder Verminderung der Bindung von Viren (insbesondere von Rhinoviren des Hauptserotypus) an ICAM-1 verwendbar.
Obschon zum Erhalt solcher monoklonaler Antikörper jedwelches Verfahren verwendbar ist, ist vorzuziehen, monoklonale Antikörper, die sich an ICAM-1 binden, zu erhalten, indem nach den von Rothlein R. M. et al. [J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)] beschriebenen Abläufen und Programmen BALB/C-Mäuse immunisiert werden mit mononuclearen Zellen, die mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert sind, aus peripherem Blut von LFA-1-defizienten Individuen. Derartige Zellen sind von Springer T. A. et al. [J. Exper. Med. 160: 1901-1918 (1984)] offenbart.
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Erzeugung und Detektion von Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 fähig sind, werden Mäuse mit durch Immunaffinitätsadsorption gereinigtes ICAM-1 immunisiert. Die Milzzellen der Tiere werden entfernt, mit nicht-sekretierenden Myelomzellen fusioniert und zur Entwicklung zu Antikörper produzierenden Hybridomzellen gebracht. Die Antikörper werden dann in bezug auf die Hemmung der Adhäsion von ICAM-1&spplus;-L-Zellen an gereinigtes Mac-1 und LFA-1 untersucht, wie es in Fig. 6 gezeigt wird. Damit werden monoklonale Antikörper identifiziert, welche die Bindung von LFA-1 und Mac-1 an ICAM-1 unterschiedlich hemmen.

V. Entzündungshemmende Verwendungen der erfindungsgemässen Moleküle

A. ICAM-1 und Mac-1 sowie deren funktionelle Derivate

ICAM-1 ist ein Bindungspartner sowohl von LFA-1 wie auch von Mac-1. Als solche können ICAM-1 oder dessen funktionelle Derivate bei der Behandlung von Krankheiten austauschbar mit zur Bindung an ICAM-1 oder an LFA-1 fähigen Antikörpern verwendet werden. Somit können derartige Moleküle in löslich gemachter Form verwendet werden, um eine von der Wechselwirkung zwischen Mac-1 exprimierenden Zellen und ICAM-1 exprimierenden Zellen verursachte Entzündung zu hemmen. Gleicherweise können Mac-1 oder dessen funktionellen Derivate (vorzugsweise löslich gemachte Formen von Mac-1) austauschbar mit zur Bindung an ICAM-1 fähigen Antikörpern verwendet werden, um eine von der Wechselwirkung zwischen ICAM-1 exprimierenden Zellen und Mac-1 exprimierenden Zellen verursachte Entzündung zu hemmen. Eine solche Entzündung wird im allgemeinen durch eine Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems vermittelt. Gleicherweise können derartige Derivate auch verwendet werden, um eine von der Wechselwirkung zwischen ICAM-1 exprimierenden Zellen und LFA-1 exprimierenden Zellen verursachte Entzündung zu hemmen. Eine solche Entzündung wird im allgemeinen durch eine Reaktion des spezifischen Abwehrsystems vermittelt.
Die vorliegende Erfindung offenbart, dass die Stellen der Wechselwirkung zwischen ICAM-1 und LFA-1 von denjenigen Stellen von ICAM-1 dissoziiert sind, die mit Mac-1 in Wechselwirkung stehen. So können neuartige funktionelle Derivate von ICAM-1 erzeugt werden, die im wesentlichen zur exklusiven Bindung entweder an den einen oder an den anderen von Mac-1 und LFA-1 fähig sind, jedoch zur wahlweisen Bindung an den einen oder anderen von Mac-1 und LFA-1 nicht fähig sind. Auch können Derivate von ICAM-1 erzeugt werden, die im wesentlichen zur Bindung an Mac-1 und an LFA-1 nicht fähig sind, jedoch zur Bindung an humanen Rhinovirus fähig sind.
Somit ist ein bevorzugtes lösliches Derivat von ICAM-1 ein Molekül, das im wesentlichen zur Bindung an das LFA-1 einer LFA-1 exprimierenden Zelle fähig ist, jedoch im wesentlichen zur Bindung an Mac-1 nicht fähig ist. Beispiele solcher Moleküle umfassen ICAM-1-Moleküle, welche Domäne 1, Domänen 1 und 2, Domänen 1, 2 und 4 aufweisen, denen jedoch die Domäne 3 fehlt. Zusätzliche Beispiele umfassen ICAM-1-Derivate, welche die Domäne 3 aufweisen, jedoch eine Mutation in der Domäne 3 enthalten, welche bewirkt, dass das Molekül zur Bindung an Mac-1 im wesentlichen unfähig ist. Besonders bevorzugte Mutationen der Domäne 3 sind Mutationen im ICAM-1- Rest 229-231 oder 254-256. Derartige Mutationen bewirken, dass ICAM-1 zur Bindung an Mac-1 im wesentlichen unfähig ist. Derartige Derivate sind in Fällen erwünscht, bei denen angestrebt wird, Entzündungsreaktionen des spezifischen Abwehrsystems zu behandeln, ohne die Entzündungsreaktionen des nichtspezifischen Abwehrsystems zu beeinträchtigen.
Gleicherweise ermöglicht die vorliegende Erfindung, neuartige funktionelle Derivate von ICAM-1 herzustellen, die im wesentlichen zur Bindung an das Mac-1 einer Mac-1 exprimie renden Zelle fähig sind, jedoch im wesentlichen zur Bindung an LFA-1 nicht fähig sind. Beispiele solcher Moleküle umfassen ICAM-1-Moleküle, denen die Domäne 1 von ICAM-1 fehlt, und solche, welche Domänen 1, 2, 3, 4 und 5 von ICAM-1 aufweisen, jedoch eine Mutation in den Domänen 1 oder 2 von ICAM-1 enthalten. Besonders bevorzugte Mutationen sind diejenigen, die in dem bzw. den ICAM-1-Resten E34, Q58ED oder Q73 der Domäne 1 von ICAM-1 stattfinden. Unter den bevorzugten funktionellen Derivaten von ICAM-1, denen die Domäne 1 fehlt, sind diejenigen anzutreffen, welche die Domänen 3 und 4 von ICAM-1 enthalten. Derartige Derivate sind in Fällen erwünscht, bei denen angestrebt wird, Entzündungsreaktionen des nichtspezifischen Abwehrsystems zu behandeln, ohne die Entzündungsreaktionen des spezifischen Abwehrsystems zu beeinträchtigen.
Ein zweiter Weg zum Erhalt eines Derivats von ICAM-1, das verwendbar ist, um Entzündungsreaktionen des nichtspezifischen Abwehrsystems zu behandeln, ohne die Entzündungsreaktionen des spezifischen Abwehrsystems zu beeinträchtigen, besteht in der Erhöhung der relativen Fähigkeit des Derivats zur Bindung an Mac-1 eher als an LFA-1. Ein Mittel zur Erreichung dieses Ziels besteht darin, ein funktionelles Derivat von ICAM-1 zu produzieren, dem eine oder mehrere Glykosylierungsstellen fehlen. Ein derartiges Derivat ist fähig, eine erhöhte Fähigkeit zur Bindung an Mac-1 aufzuweisen. Zu diesem Zweck am meisten bevorzugt ist der Verlust einer Glykosylierungsstelle am ICAM-1-Rest N269, N240 oder N358 von ICAM-1.
Im Sinne des vorliegenden Textes wird ein funktionelles Derivat eines Moleküls als zur Bindung an ein anderes Molekül "im wesentlichen fähig" bezeichnet, wenn seine Fähigkeit zur Bindung an dieses Molekül etwa die gleiche ist wie die Fähigkeit eines natürlichen Vorläufers dieses Derivats zur Bindung an dasselbe Molekül. Somit wird beispielsweise ein funktionelles Derivat von ICAM-1 als zur Bindung an Mac-1 (oder an LFA-1) "im wesentlichen fähig" bezeichnet, wenn das Derivat etwa die gleiche Fähigkeit zur Bindung an Mac-1 (oder LFA-1) aufweist wie ICAM-1 selbst.
Die im vorstehenden erwähnten löslich gemachten Derivate sind Derivate, die nicht an eine Membran einer Zelle gebunden sind. Derartige Derivate können gestutzte Moleküle umfassen, denen eine transmembrane Domäne fehlt. Wahlweise können sie mutante Formen der natürlichen Moleküle umfassen, denen, auch wenn sie eine transmembrane Domäne aufweisen, die Fähigkeit zur Bindung (oder zur stabilen Bindung) an die Membran einer Zelle fehlt. Die Domänenstruktur von ICAM-1, lösliche Derivate von ICAM-1 und deren Herstellung sind von Marlin S. D. et al., [Nature 344: 70-72 (1990)] offenbart.
In der Veröffentlichung von Diamond M. S. et al. [J. Cell. Biol. 111: 3129-3139 (1990)] wird offenbart, dass Mac-1 mit ICAM-1 in Wechselwirkung steht und dass Mac-1 mit einem Gegenrezeptor an der Endothelzellenoberfläche in Wechselwirkung steht. Daraus wird der Schluss gezogen, dass ICAM-1 ein Gegenrezeptor für Mac-1 ist und dass Mac-1 und LFA-1 nicht auf identische Weise mit ICAM-1 in Wechselwirkung stehen.
Spezifische Mutationen in ICAM-1, die zu einer veränderten Fähigkeit des ICAM-1-Moleküls zur Bindung an LFA-1 führen, sind in EP-A-0365837 offenbart. Es wird darin gelehrt, dass ICAM-1 ein Bindungspartner von LFA-1 ist und dass funktionelle Derivate von ICAM-1, welche die Domäne 1 enthalten, einschliesslich mutierter Varianten davon bei der Behandlung von Entzündungen, die sich aus einer Antwort des nichtspezifischen Abwehrsystems ergeben, verwendbar sind.
EP-A-0362531 offenbart die Verwendung eines Rezeptorproteins des humanem Rhinovirus (HRV), das sich an HRV binden kann, bei der Behandlung von rhinoviralen Infektionen. Es wird beschrieben, dass das Rezeptorprotein (HRR) des humanem Rhinovirus und ICAM ein und dasselbe Molekül sind und dass HRR bei der Behandlung von rhinoviralen Infektionen oder zur Behandlung von Entzündungen verwendbar ist.
EP-A-0314863 offenbart die Verwendung von ICAM-1 und dessen funktionellen Derivaten zur Behandlung von Entzündung, die vom nicht-spezifischen Abwehrsystem eines Säugersubjekts verursacht werden.
ICAM-1 oder dessen funktionelle Derivate sind auf gleiche Weise verwendbar wie Anti-Mac-1-Antikörper, um die Immunogenität von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln zu vermindern. Ebenfalls sind Mac-1 oder dessen funktionelle Derivate auf gleiche Weise als Anti-ICAM-1-Antikörper verwendbar, um die Immunogenität von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln zu vermindern.
ICAM-1 oder Mac-1 oder deren jeweilige funktionelle Derivate sind verwendbar, um die Metastasierung oder Wucherung von Tumorzellen, welche an deren Oberfläche entweder Mac-1 oder ICAM-1 exprimieren, zu blockieren. Zur Erreichung eines solches Zieles ist eine Vielfalt von Methoden verwendbar. Beispielsweise erfordert die Migration gewisser Zellen eine Bindung zwischen LFA-1 und ICAM-1. Einem Patienten können Toxin-derivatisierte Moleküle, die zur Bindung sowohl an ICAM-1 wie an Mac-1 fähig sind, verabreicht werden. Wenn sich solche Toxin-derivatisierte Moleküle an Tumorzellen binden, die ein ICAM-1- oder Mac-1α-Mitglied der LFA-1-Familie von Molekülen exprimieren, tötet die Anwesenheit des Toxins die Tumorzelle, wodurch die Wucherung des Tumors gehemmt wird.

B. Zur Bindung an ICAM-1 fähiger Antikörper

Monoklonale und polyklonale Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 fähig sind und dadurch die Bindung von ICAM-1 an Mac-1 unterdrücken, eignen sich in hohem Masse bei einem Säugersubjekt als Gegenmittel gegen Entzündung. Für eine derartige Verwendung werden monoklonale Antikörper besonders bevorzugt. Auf bedeutsame Weise unterscheiden sich solche Mittel von allgemeinen Gegenmitteln gegen Entzündung darin, dass sie fähig sind, die Adhäsion selektiv zu hemmen, und dass sie keine anderen, bei herkömmlichen Mitteln vorkommenden Nebenwirkungen wie Nephrotoxizität aufweisen. Derartige monoklonale Antikörper sind zur Behandlung von Entzündung, die sich aus einer Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems ergibt, verwendbar.
Da LAD-Patienten, denen LFA-1 fehlt, keine Entzündungsantwort aufbauen, wird gemeint, dass ein Antagonismus des natürlichen LFA-1-Ligandes, ICAM-1, ebenfalls eine Entzündungsantwort hemmt. Die Fähigkeit von Anti-ICAM-1-Antikörpern zur Hemmung von Entzündung liefert die Basis für deren therapeutische Verwendung bei der Behandlung von Chronischentzündungskrankheiten und Autoimmunkrankheiten wie Lupus erythematosus, autoimmuner Thyroiditis, experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE), multipler Sklerose, einigen Formen von Diabetes, dem Reynaud-Syndrom, rheumatoider Arthritis usw. Solche Antikörper sind auch als Therapie bei der Behandlung von Psoriasis verwendbar. Im allgemeinen sind die zur Bindung an ICAM-1 fähigen monoklonalen Antikörper bei der Behandlung von solchen Krankheiten verwendbar, die gegenwärtig durch Steroidtherapie behandelt werden können.
Bei der vorliegenden Erfindung von besonderem Interesse sind Anti-ICAM-1-Antikörper (oder Antikörper gegen deren funktionelle Derivate), die zur Hemmung oder Vermeidung der Bindung von ICAM-1 an Mac-1 im wesentlichen fähig, jedoch zur Hemmung oder Vermeidung der Bindung von ICAM-1 an LFA-1 im wesentlichen unfähig sind. Derartige Antikörper sind zur Behandlung von Entzündung des nicht-spezifischen Abwehrsystems verwendbar, ohne die Reaktionen des spezifischen Abwehrsystems zu beeinträchtigen. Ein Beispiel eines solchen Anti- ICAM-1-Antikörpers ist der monoklonale Antikörper CBRIC1/1. Eine Hybridomzellinie, welchen diesen monoklonalen Antikörper sekretiert, wurde am 14. November 1990 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugriffsnummer HB10597.
Wie im vorstehenden angegeben, sind sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper erfindungsgemäss verwendbar. Besonders bevorzugt sind Antikörper, die durch rekombinante oder andere Technologie in Menschen produziert werden oder "humanisiert" sind (d. h. in Menschen nicht-immunogen sind). Solche Antikörper sind Äquivalente der im vorliegenden offenbarten monoklonalen und polyklonalen Antikörper, sind jedoch weniger immunogen und den Patienten besser verträglich.
Humanisierte Antikörper können beispielsweise produziert werden, indem ein immunogener Teil eines Antikörpers durch einen entsprechenden, jedoch nicht-immunogenen Teil ersetzt wird (d. h. ein chimärer Antikörper gebildet wird) [Robinson R. R. et al., Internationale Patentanmeldungsveröffentlichung WO-A PCT/US86/02269; Akira K. et al., EP-A-0184187; Taniguchi M., EP-A-0171496; Morrison S. L. et al., EP-A-0173494; Neuberger M. S. et al., WO-A-86/01533; Cabilly et al., EP-A-0125023; Better M. et al., Science 240: 1041-1043 (1988); Liu A. Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Liu A. Y et al., J. Immunol. 139: 3521-3526 (1987); Sun L. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Nishimura Y. et al., Canc. Res. 47: 999-1005 (1987); Wood C. R. et al., Nature 314: 446-449 (1985); Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559 (1988); wobei alle diese Literaturstellen durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen werden]. Allgemeine Übersichten über "humanisierte" chimäre Antikörper werden von Morrison S. L. [Science 229: 1202-1207 (1985)] und von Oi V. T. et al. [BioTechniques 4: 214 (1986)) gegeben, wobei diese Literaturstellen durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen werden.
Andererseits können geeignete "humanisierte" Antikörper durch CDR- oder CEA-Substitution produziert werden [Jones P. T. et al., Nature 321: 552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239: 1534 (1988); Beidler C. B. et al., J. Immunol. 141: 4053-4060 (1988)].

VI. Verabreichung der erfindungsgemässen Moleküle

Da Mac-1 auf Zellen exprimiert wird, die zur Bindung an Endothelgewebe fähig sind, liefert die Verabreichung eines funktionellen Derivats von ICAM-1 an einen Patienten ein Mittel zur bildlichen Darstellung oder Sichtbarmachung von Endothelgewebe. Zudem ergeben solchen Prozeduren eine diagnostische Information bezüglich der Menge und Verteilung der auf dem sichtbargemachten Gewebe sitzenden Bindungsliganden des Rezeptormoleküls für Mac-1 oder von ICAM-1.
Bei einer Verwendung dieser Art werden die verabreichten erfindungsgemässen Moleküle durch Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkern (wie Biotin, Avidin usw.), fluoreszierenden Markern, paramagnetischen Atomen usw. detektierbar markiert. Prozeduren zur Erreichung von Markierungen dieser Art sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die Antikörper (oder Fragmente davon) können durch die Verwendung von Radioisotopen, Enzym-Markern, fluoreszierenden Markern, paramagnetischen Markern, elektronendichten Markern usw. detektierbar markiert werden. Die Verabreichung von solcherart markierten Molekülen an ein Individuum identifiziert Entzündungsstellen. Solche detektierbare Markierungen sind auch zur Bestimmung (Assay) des Status des Immunsystems eines Patienten verwendbar. Klinische Anwendungen von Antikörpern zur bildlichen Darstellung zu Diagnosezwecken werden von Grossman H. B., Urol. Clin. North Amer. 13: 465-474 (1986), Unger E. C. et al., Invest. Radiol. 20: 693-700 (1985) und Khaw B. A. et al., Science 209: 295-297 (1980) rezensiert.
Die Fähigkeit von Monozyten zur spontanen Migration zu Entzündungsstellen ist von Mac-1 abhängig [Keizer G. D. et al., Eur. J. Immunol. 17: 1317-1322 (1987)]. Eine solche Migration kann durch die Verabreichung von ICAM-1 oder von funktionellen Derivaten von ICAM-1 an einen Patienten gehemmt werden.
Gleicherweise wurde festgestellt, dass die Fähigkeit von Monozytoidzellen zur Adhäsion an Endothelzellen und die Fähigkeit von Monozytoidzellen, sich der Chemotaxis, der Chemokinese oder der Phagocytose zu unterziehen, von Mac-1 abhängig ist [Keizer G. D. et al., Eur. J. Immunol. 17: 1317-1322 (1987)]. Jeder der erfindungsgemässen Entzündungshemmer ist zur Hemmung solcher Aktivitäten verwendbar.
Die erfindungsgemässen Moleküle werden als "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen" bezeichnet, wenn die Zusammensetzungen, welche sie enthalten, im wesentlichen frei von Stoffen sind, mit denen diese Produkte normalerweise und natürlicherweise auftreten.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Antikörper und biologisch wirksame Fragmente davon (ob polyklonal oder monoklonal), die zur Bindung an ICAM-1 fähig sind. Solche Antikörper sind entweder von einem Tier oder durch Gewebekultivierung oder noch durch Mittel der rekombinanten DNA produzierbar.
Wenn ein Patient mit funktionellen Derivaten von ICAM-1 versorgt wird, werden solche Moleküle vorzugsweise in einer Dosis verabreicht, die im Bereich von 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl auch eine niedere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.
Die erfindungsgemässen Moleküle können den Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Wenn solche Moleküle durch Injektion verabreicht werden, kann die Verabreichung als kontinuierliche Infusion oder als einzelner oder mehrfacher Bolus erfolgen.
Die erfindungsgemässen Entzündungshemmer sind dazu bestimmt, Empfänger-Subjekten in einer zur Unterdrückung der Entzündung ausreichenden Menge verabreicht zu werden. Eine Menge wird als zur "Unterdrückung" der Entzündung ausreichend bezeichnet, wenn die Dosierung, der Verabreichungsweg usw. des Mittels genügen, um die Entzündung zu vermindern oder zu vermeiden.
Die erfindungsgemässen Entzündungshemmer können (insbesondere einem Empfänger eines Organtransplantates oder eines verpflanzten Gewebes) entweder einzeln oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Immunsuppressiva verabreicht werden. Die Verabreichung einer oder mehrerer solcher Verbindungen kann entweder zu "prophylaktischen" oder zu "therapeutischen" Zwecken erfolgen. Wenn die Verabreichung prophylaktisch erfolgt, wird bzw. werden die Verbindung(en) vor jeglicher Entzündungsantwort oder jeglichem Entzündungssymptom verabreicht. Die prophylaktische Verabreichung der Verbindung(en) dient zur Vermeidung oder Verminderung jegli cher nachfolgenden Entzündungsantwort. Wenn die Verabreichung therapeutisch erfolgt, wird bzw. werden die Verbindung(en) bei (oder kurz nach) dem Einsetzen eines Symptoms einer tatsächlichen Entzündung verabreicht. Die therapeutische Verabreichung der Verbindung(en) dient zur Verminderung der tatsächlichen Entzündung. Die erfindungsgemässen Entzündungshemmer können somit entweder vor dem Einsetzen einer Entzündung (um dadurch eine zu erwartende Entzündung zu unterdrücken) oder nach dem Anfang einer Entzündung verabreicht werden.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmazeutisch annehmbar" bezeichnet, wenn deren Verabreichung von einem Empfänger- Patienten tolerierbar ist. Man sagt von einer solchen Zusammensetzung, dass sie "in einer therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht wird, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Anwesenheit zu einer nachweisbaren Änderung der Physiologie des Empfänger-Patienten führt.
Die erfindungsgemässen Moleküle können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch verwendbare Zusammensetzungen herzustellen, wobei diese Stoffe oder deren funktionelle Derivate in einem Gemisch mit einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz kombiniert sind. Geeignete Trägersubstanzen und deren Formulierung, einschliesslich anderer menschlicher Proteine wie beispielsweise menschlichen Serumalbumins, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences [16. Ausgabe, Herausgeber Osol A., Mack, Easton PA (1980)] beschrieben. Um eine für eine wirksame Verabreichung geeignete pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung zu bilden, sollen derartige Zusammensetzungen eine wirksame Menge an Anti-ICAM-1-Antikörper oder an ICAM-1- oder Mac-1- Molekül oder an funktionellem Derivaten davon zusammen mit einer geeigneten Menge Trägersubstanz enthalten.
Zusätzliche pharmazeutische Methoden können angewandt werden, um die Wirkungsdauer zu steuern. Zusammensetzungen mit regulierter Abgabe können durch Verwendung von Polymeren zum Komplexieren oder Absorbieren der erfindungsgemässen the rapeutischen Agenzien erhalten werden. Die gesteuerte Freigabe kann durch Auswahl der geeigneten Makromoleküle (beispielsweise Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat) und der Konzentration der Makromoleküle wie auch der Inkorporierungsmethoden im Hinblick auf die Steuerung der Abgabe erreicht werden. Eine andere mögliche Methode zur Steuerung der Wirkungsdauer durch Zusammensetzungen mit gesteuerter Abgabe besteht darin, Anti-ICAM-1- Antikörper oder ICAM-1-Moleküle oder deren funktionelle Derivate in Partikeln aus Polymerstoff wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly(milchsäure) oder Ethylen-Vinylacetat- Copolymere einzubringen. Wahlweise ist es möglich, statt diese Mittel in polymere Partikeln einzubringen, diese Stoffe in Mikrokapseln einzuschliessen, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt werden, beispielsweise in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidale Medikamentabgabesysteme wie beispielsweise Liposome, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln, oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken sind in Remington's Phannaceutical Sciences (1980) offenbart.
Da nun die Erfindung allgemein beschrieben wurde, wird sie beim Lesen der nachstehenden Beispiele, die zur Veranschaulichung gegeben werden und die vorliegende Erfindung nicht einzuschränken beabsichtigen, ausser wenn dies ausdrücklich angegeben ist, noch besser verständlich werden.

Beispiel 1

Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Mac-1 und ICAM-1

Untersuchungen jüngeren Datums durch Smith C. W. et al. [J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989); J. Clin. Invest. 82: 1746-1756 (1988); wobei diese Literaturstellen durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen werden] haben den Erfindern nahegelegt, dass LFA-1 und Mac-1 bei der Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen zusammenwirken könnten; nichtstimulierte Neutrophile binden sich primär über Oberflächen- LFA-1, während mit fMLP aktivierte Neutrophile sich meist über Mac-1 anheften. Mac-1 und LFA-1 können beide mit ICAM-1 in Wechselwirkung stehen, da ein monoklonaler Anti-ICAM-1- Antikörper die von CD18 abhängige und von fMLP stimulierte Adhäsion von Neutrophilen an nicht-stimulierten Endothelzellen vollständig blockiert [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746-1756 (1988)]. Da monoklonale Antikörper gegen LFA-1 und Mac-1 auch die Anhaftung von Neutrophilen an ICAM-1 enthaltenden planaren Membranen unterdrücken [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)], unterstützten die Arbeiten von Smith et al. die Schlussfolgerung, dass die Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen teilweise von der Bindung zwischen ICAM-1 und LFA-1 sowie zwischen ICAM-1 und Mac-1 abhängig ist.
Im Gegensatz dazu haben Lo S. K. et al. [J. Immunol. 143(10): 3325-3329 (1989)] offenbart, dass, wenn sich mit Phorbolester stimulierte Neutrophile an Endothelzellen anheften, nur LFA-1 mit ICAM-1 in Wechselwirkung steht, während sowohl Mac-1 als auch LFA-1 daran mitbeteiligt sind. Zudem haben sie festgestellt, dass bei auf ICAM-1-Substratplatten aufgetragenen Makrophagen nur LFA-1 vom Spitzenbereich der Zelloberfläche herabmoduliert wurde. Diese Resultate unterstützen die Schlussfolgerung, dass Mac-1 sich nicht an ICAM-1 bindet, sondern eher mit einem nicht charakterisierten Endothelzellenoberflächenrezeptor in Wechselwirkung steht.
Zur Auflösung dieses Paradoxons wurden Untersuchungen über die gegenseitige Adhäsion durchgeführt, wobei durch Immunaffinität gereinigtes Mac-1 und ICAM-1 sowie ICAM-1, Mac-1 und LFA-1 exprimierende transfizierte Zellen verwendet wurden.

Monoklonale Antikörper

Die nachstehenden murinen monoklonalen Antikörper gegen humane Antigene stammten von Aszites: LPM19c (Anti-CD11b, IgG2a) [Uciechowski P. et al., in: Leukocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Herausgeber Knapp W. et al., Oxford University Press, Oxford, Seiten 543-551 (1989)]; W6/32 (Anti-HLA A, B, C, IgG2a) [Barnstable C. J. et al., Cell 14: 9-20 (1978)]; TS1/22 (Anti-CD11a, IgG1) [Sanchez-Madrid F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7489-7493 (1982)]; YFC51.1 (Anti-CD18, Ratten-IgG2b) [Uciechowski P. et al., in: Leukocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Herausgeber Knapp W. et al., Oxford University Press, Oxford, Seiten 543-551 (1989)]; CBRIC2/1 und CBRIC2/2 (Anti-ICAM-2, IgG2a) und TS2/16 (Anti-CD29, IgGI) [Sanchez-Madrid F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7489-7493 (1982)]. Die nachstehenden monoklonalen Anti-ICAM-1-Antikörper wurden als gereinigtes IgG verwendet: CL203 [Maio M. et al., J. Immunol. 143: 181-188 (1989)], LB-2 [Clark E. A. et al., Hum. Immunol. 16: 100-113 (1986)], 84H10 [Makgoba M. W. et al., Nature 331: 86-88 (1988)].
RR1/1 Fab&sub2; [Rothlein R. M. et al., J. Immunol. 137: 1270- 1274 (1986)] wurde durch Pepsin-Digestion nach einer Protein- A-Affinitätschromatographie hergestellt [Parham P. in: Immunological Methods in Biomedical Sciences, Herausgeber Weir D. M. et al., Blackwell, Oxford (1983)]. R6.5 (IgG2a) [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746-1756 (1988)], IgG und Fab stammten von Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Ridgefield CT.
Monoklonale Antikörper CBRIC1/1, CBRIC1/2, CBRIC1/3, CBRIC1/4 (monoklonale Anti-ICAM-1-Antikörper), M1/42 (Anti-H- 2, Ratten-IgG2a) [Springer T. A. in: Monoclonal Antibodies, Herausgeber Kennett R. H. et al., Plenum Press, New York, Seiten 185-217 (1980)] und X63 (nichtbindender Antikörper, IgG1) wurden als Gewebekulturüberstand verwendet. Verwendet wurden für Hemmungsbestimmungen (Assays) Aszites-Fluide in 1/400- Verdünnungen, gereinigtes IgG zu 20-25 ug/ml, Fab&sub2; zu 20 ug/ml, Fab zu 50 ug/ml, und Gewebekulturüberstände zu 1/2. Mit Protein A gereinigtes TS1/18 (Anti-CD18, IgG1) [Sanchez- Madrid F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7489-7493 (1982)] und LM2/1 (Anti-CD11b, IgGI) [Miller L. J. et al., J. Immunol. 137: 2891-2900 (1986)] wurden iodiert und für Stellendichtemessungen verwendet, wie von Dustin M. L. et al. [Nature 341: 619-624 (1989); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird] beschrieben wird; TS1/18 erkennt nur das intakte α/β-Heterodimer.

Proteinreinigung: Mac-1, LFA-1 und ICAM-1

Mac-1 wurde aus Leukozytlysaten gereinigt, wobei eine Modifizierung der Prozedur von Dustin M. L. et al. [Nature 341: 619-624 (1989)] und [Miller L. J. et al., J. Immunol. 138: 2381-2383 (1987)] verwendet wurde, wobei diese beiden Literaturstellen durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen werden.
Kurz ausgedrückt, um 500 ug des gereinigten funktionellen Heterodimers zu erhalten wurden 10 g tiefgefrorene Leukozyten aus peripherem Blut in 200 ml Lysepuffer (100 mM Tris- HCl pH-Wert 8,0 + 150 mM NaCl + 2 mM MgCl&sub2; + 1% Triton-X-100 + 5 mM Iodacetamid + 0,025% NaN3 + 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid + 1 mM Diisopropylfluorphosphat + 0,2 TIU/ml Aprotinin) während einer Stunde bei 4ºC unter leichter Rührung aufgelöst. Das sich ergebende Lysat wurde während zwei Stunden bei 4ºC unter 10000 g zentrifugiert; der Überstand wurde dekantiert und dann während einer Stunde unter 100000 g (Ti45, Beckman) ultrazentrifugiert.
Das geklärte Lysat wurde mit an Sepharose CL-4B gekoppeltem humanem IgG vorbereitet; pro ml Lysat wurden 40 ul einer 1 : 1-Aufschlämmung von IgG-Sepharose zugesetzt und über Nacht bei 4ºC gerollt. Die Sepharose wurde pelletisiert und das vorbereitete Lysat dann über eine LM2/2-(Anti-CD11b; IgG1)-Immunaffinitätsäule (Bettvolumen 6 ml, 3 mg/ml LM2/1) geführt. Dies wurde vorbereitet, indem mit Protein A gereinigtes LM2/1 an mit Cyanogenbromid aktivierte Sepharose gebunden wurde [March S. C et al., Anal. Biochem. 60: 149-152 (1974)].
Die Säule wurde mit 10 Bettvolumen von 50 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0 + 150 mM NaCl + 2 mM MgCl&sub2; + 0,1% Triton X-100 vorequilibriert und das vorbereitete Lysat wurde bei 10 ml pro Stunde eingegeben. Die Säule wurde bei 20 ml pro Stunde in Aufeinanderfolge mit 10 Bettvolumen von 50 mM Tris-HCl pH- Wert 8,0 + 150 mM NaCl + 2 mM MgCl&sub2; + 1% n-Octyl-β-D-glucopyranosid in Röhrchen mit Neutralisierungspuffer (10 Vol.-% 1 M Tris-HCl pH-Wert 7,4) ausgewaschen. Die Peak-Fraktionen wurden vereinigt, aufgeteilt und während 3-6 Monaten bei -80ºC gelagert, ohne einen Aktivitätsverlust zu erleiden.
LFA-1 wurde durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt, wie es von Dustin M. L. et al. [Nature 341: 619-624 (1989)] beschrieben wurde, ausser dass ein Ersatz durch Lysate von Leukozyten aus peripherem Blut stattfand.
ICAM-1 wurde durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt, wie es von Marlin S. D. et al., [Cell 51: 813-819 (1987)] beschrieben wurde.

SDS-PAGE

Proteinproben wurden auf 5% β-Mercaptoethanol enthaltenden reduzierenden 7-10%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen [Laemmli U. K., Nature 227: 680-685 (1970)] angesetzt und mittels Silber gefärbt, wie es von Morrissey J. H. [Anal. Biochem., 117: 307-310 (1981)] beschrieben wird.

Gewebekultur, Transfektion und Zellvorbereitung

COS-Zellen wurden auf zur Gewebekultur behandelten 10- oder 15-cm-Platten (Falcon) in RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum + 5 mM Glutamin + 50 ug/ml Gentamycin gezüchtet. Die Zellen wurden bei etwa 50-60% Konfluenz in 10-cm-Platten mit 4-6 ug mit CsCl gereinigter [Maniatis T. et al. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird] ICAM-1-DNA [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)] transfiziert oder nach der DEAE-Dextran-Methode [Aruffo A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987); Kingston R. E. in: Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Seiten 9.0.1-9.9.6 (1987)] während vier Stunden bei 37ºC mit 6 ug Mac-1 oder LFA α plus 6 ug β cDNA [Hibbs M. L. et al., J. Clin. Invest. 85: 674-681 (1990); Larson R. S. et al., Cell Reg. 1: 359-367 (1990)] cotransfiziert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen vor den funktionellen Bestimmungen (Assays) mit PBS (Phosphat-gepufferter Salzlösung) und 5 mM EDTA während 5 Minuten bei 37ºC aus den Gewebekulturplatten eluiert.
Stabile ICAM-1&spplus;-L-Zellen wurden erzeugt, wie es von Chen C. A. et al., [BioTechniques 6(7): 632-637 (1988); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird] beschrieben wird. Kurz ausgedrückt, es wurden murine L-Zellen (tk-) auf 6-cm-Gewebekulturschalen gesetzt und während zwei Tagen bis 10-20% Konfluenz wachsengelassen. ICAM-1-cDNA im Plasmid CDM8 [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)] (10 ug) und ein einen Selektions-Marker der Thymidin-Kinase enthaltendes Plasmid (100 mg) wurden mit 0,2 ml CaCl&sub2; + 0,2 ml 50 mM N-N-bis-2-Aminoethansulfonsäure + 280 mM NaCl + 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4; pH-Wert 6,95 gemischt und während 10-20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Calciumphosphat-DNA-Lösung (0,4 ml) wurde den auf den Platten aufgetragenen Zellen tropfenweise zugesetzt, und es wurde bei 35ºC in einem Inkubator mit 3% CO&sub2; inkubiert. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen mit regulärem DMEM-Medium gewaschen und es wurde bei 37ºC in einem Inkubator mit 5% CO&sub2; wachsengelassen bis zum 3. Tag, an welchem die HAT-Selektion (100 uM Hypoxanthin + 400 nM Aminopterin + 16 uM Thymidin) eingeleitet wurde.
Zellen mit hoher ICAM-1-Expressionsrate wurden nach Entnahme einzelner Kolonien mit einem Klonierungszylinder durch Flusszytometrie identifiziert. ICAM-1&spplus;-L-Zellen wurden in einem Selektionsmedium gehalten, das aus DMEM mit 10% durch Hitze inaktiviertem fetalem Kälberserum + 5 mM Glutamin + 50 ug/ml Gentamycin bestand und mit HAT ergänzt war. Nicht transfizierte L-Zellen wurden in DMEM ohne HAT gehalten.
Endothelzellen der humanen Nabelschnurvene (HUVEC, steht für "Human Umbilical Vein Endothelial Cell") wurden bis zu einer niedrigen Durchgangszahl (2-5) auf Gewebekulturplatten kultiviert, die vorgängig überzogen waren mit Fibronectin (50 ug/ml) in M199-Medium, das mit 20% durch Hitze inaktiviertem fetalem Kälberserum + 100 ug/ml Heparin + 100 ug/ml Gentamycin [Dustin M. L. et al., J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988)] ergänzt war.
Eine Behandlung mit LPS erfolgte durch Zugabe von 1 ug/ml Lipopolysaccharid aus E. Coli (Endotoxin) 24 Stunden vor der Zellenernte. Cytokin-Stimulation erfolgte durch Zugabe von 5 U/ml rIL-1β (Genentech, CA).
Zur Elution von HUVEC-Zellen für die Zweifarbenfluoreszenz-Untersuchungen wurden Zellen während 5 bis 10 Minuten bei 37ºC mit PBS + 5 mM EDTA behandelt.
Neutrophile wurden durch Dextran-Sedimentation aus dem Vollblut von gesunden Freiwilligen isoliert. Ficoll-Gradientenzentrifugation und hypotonische Lyse erfolgten wie von English D. et al. [J. Immunol. Methods 5: 249 (1974)] beschrieben. Vor den experimentellen Manipulation wurden die Neutrophilen bei Raumtemperatur in Hanks Ausgeglichener Salzlösung + 10 mM HEPES pH-Wert 7,3 + 0,5% humanem Serumalbumin (HHHSA) gelagert.

Zellkoniugations-Untersuchungen

Eine Zweifarbenfluoreszenz-Zellkonjugations-Bestimmung (Assay) erfolgte durch Modifizierung des Protokolls von Luce G. G. et al. [BioTechniques 3: 270-272 (1985); wobei diese Li teraturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird].
Kurz ausgedrückt, 10&sup8; Neutrophile wurden zweimal mit HHHSA gewaschen, in 10 ml einer filtrierten (0,2 um) 40- ug/ml-Lösung von Hydroethidin (HE, Polysciences) in HHHSA wieder suspendiert und während 35 Minuten bei 37ºC unter schonender Schwenkbewegung der Probe inkubiert. HUVEC-Zellen (2 · 10&sup7;) wurden aus T150 cm Flaschen mit PBS + 5 mM EDTA eluiert, dreimal in RPMI 1640 + 20 mM HEPES pH-Wert 7,3 + 5% inaktiviertem fetalem Kälberserum (RPMTHFS) gewaschen, in 10 ml einer 200-uM-Lösung von Sulfofluoresceindiacetat (SFDA, Molecular Probes) wieder suspendiert, und ebenfalls während 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen viermal in RPMI 1640 + 10 mM HEPES pH-Wert 7,3 + 0,5% HSA + 5% durch Hitze inaktiviertem humanem Serum gewaschen und wie folgt wieder suspendiert: Neutrophile 1 · 10&sup7; Zellen/ml; HUVEC-Zellen 2 · 10&sup6; Zellen/ml. Die Bestimmung erfolgte in Gegenwart von durch Hitze inaktiviertem humanem Serum (5%) zur Vermeidung einer Vernetzung der Fc-Rezeptoren mit den monoklonalen Antikörpern. Die geeigneten Antikörper wurden beiden Typen von Zellen zugesetzt, und es wurde während 25 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert.
Neutrophile (150 ul) und HUVEC-Zellen (250 ul) wurden auf eine 24-Mulden-Platte (Falcon) aufgetragen, und es wurde folgendes Untersuchungsprotokoll verwendet (alle Inkubationen erfolgten bei 37ºC unter Schütteln bei 75 U/min auf einem Drehschüttelgerät (New Brunswick Scientific, NJ)): fünf Minuten Vorinkubation, Zugabe von 1 · 10&sup7; M fMLP, zehn Minuten Inkubation. Konjugate wurde nach dreimaligem Pipettieren der Lösung wiedergewonnen (kleinere Aggregate können sich niederschlagen) und quantitativ erfasst als Prozentsatz von HUVEC- Zellen, die in Zweifarben-Konjugaten durch Flusszytometrie entweder mit einem EPICS V (Coulter, Hialeah, FL) oder einem FACScan (Becton Dickinson) gefunden wurden.

Bindung von Zellen an gereinigte Proteine

Gereinigtes Mac-1 oder LFA-1 wurde je nach dem Proteingehalt (mittels SDS-PAGE und Radioimmunbestimmung (Radioimmunassay) [Dustin M. L. et al., Nature 341: 619-624 (1989)] geschätzt) in 20 mM Tris pH-Wert 7,4 + 150 mM NaCl + 2 mM MgCl&sub2; mit einer Konzentration an Octylglukosid-Tensid im Bereich von 0,1% bis 0,01% von 1/8 bis 1/120 verdünnt und aufgetragen, bei 35-mm-Petrischalen auf die gesamte Oberfläche, bei 60-mm-Petrischalen als abgegrenzter 40-ul-Fleck, oder bei 96- Mulden-Platten (Linbro-Itertek) mit 50 ul in jeder Mulde, während 90 Minuten bei Raumtemperatur [Staunton D. E., Nature 339: 61-64 (1989)]. Danach wurden die Platten und Schalen durch dreimaliges Waschen mit PBS + 2 mM MgCl&sub2; + 0,5% HSA (PBSMH) und anschliessende Inkubation darin während 2 Stunden bei 37ºC abgestoppt. Zur Bestimmung (Assay) der COS-Zelladhäsion an Mac-1 wurden niedrigere Stellendichten von Mac-1 verwendet (< 500 Stellen/um²), um eine Hintergrund-Zellbindung zu vermeiden, die auf die Expression eines auf der Oberflächen der COS-Zellen sitzenden endogenen Liganden für Mac-1 zurückzuführen ist; diese Stellendichte ermöglichte die Adhäsion der ICAM-1 exprimierenden COS-Zellen, unterstützte jedoch nicht die Bindung von COS-Zellen, die allein mit dem Vektor transfiziert worden waren.
Zur Bestimmung (Assay) auf der 96-Mulden-Platte wurden nicht-stimulierte sowie während 18 Stunden mit IL-1β oder während 24 Stunden mit LPS stimulierte HWEC-Zellen mit PBS + 5 mM EDTA aus den Gewebekulturplatten eluiert, zweimal in HHHSA gewaschen, bis auf 10&sup6; Zellen/ml wieder suspendiert, während 1 Stunde bei 37ºC mit 50 uCi/ml Cr markiert [Sanchez- Madrid F. et al., J. Exp. Med. 158: 1785-1803 (1983)], zweimal in HHHSA gewaschen, zweimal in PBSMH + 0,2% Glucose gewaschen, und gleichzeitig mit den mit Mac-1 überzogenen Platten während 25 Minuten bei Raumtemperatur mit geeigneten Antikörpern vorinkubiert. Jeder Mulde wurden HUVEC-Zellen (50 ul zu 10&sup6; Zellen/ml) zugesetzt, und die Bindungsbestimmung (Assay) wurde während 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Nichtgebundene Zellen wurden mittels einer Starkaufsaug- Waschprozedur unter Verwendung einer Nadel der Grösse "26- gauge" entfernt [Dustin M. L. et al., Nature 341: 619-624 (1989)]. Gebundene Zellen wurden mit 0,2 M NaOH oder PBS + 25 mM EDTA eluiert und mittels Gammaemission quantitativ erfasst. Für L-Zellen wurde das gleiche Protokoll verwendet, ausser dass der Bindungspuffer ersetzt wurde durch RPMI 1640 + 20 mM HEPES pH-Wert 7,3 + 5% FCS + 0,1% HSA, die Zellen während 5 Minuten auf Mac-1-Substraten bei 300 U/min zentrifugiert wurden, die Inkubation bei 37ºC erfolgte und nur zwei Aufsaug-Waschungen durchgeführt wurden.
Zur Bestimmung (Assay) in den 35-mm- und 60-mm-Petrischalen wurden transfizierte COS-Zellen oder L-Zellen mit PBS + 5 mM EDTA oder mit RPMI + 10 mM EDTA aus den Gewebekulturplatten eluiert. Die COS-Zellen wurden zweimal in HHHSA gewaschen, in HHHSA bis auf 8 · 10&sup5; Zellen/ml wieder suspendiert, und während 1 Stunde mit 50 uCi/ml Cr markiert [Sanchez-Madrid F. et al., J. Exp. Med. 158: 1785-1803 (1983)]. Überschüssiger Marker wurde weggewaschen, und die Zellen wurden in PBS + 1,5 mM MgCl&sub2; + 0,5 mM CaCl&sub2; + 0,2% Glucose + 0,5% HSA bis auf 8 · 10&sup5; Zellen/ml wieder suspendiert. L-Zellen wurden dreimal mit PBS + 2 mM MgCl&sub2; + 5% FCS + 0,1% HSA gewaschen. Die Zellen wurden während 30 Minuten bei Raumtemperatur mit geeigneten Antikörpern vorinkubiert, in Petrischalen angesetzt und während 50 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nichtgebundene COS-Zellen oder L-Zellen wurden durch drei aufeinanderfolgende Waschungen mit 1 ml Bindungspuffer entfernt, der auf die Platte gegeben und dann vorsichtig darauf gewirbelt wurde. Bei Untersuchungen mit COS-Zellen wurden die Platten nach dem Waschen zur Feststellung von gebundenen Zellen gesichtet und qualitativ beurteilt, und die anhaftende Population wurde mit 1 ml PBS + 25 mM EDTA (15 Minuten bei 37ºC) eluiert und mittels Gammaemission quantitativ erfasst. Bei Untersuchungen mit L-Zellen wurden die gebundenen Zellen nach dem Waschen quantitativ erfasst, indem für jede Untersu chungsstelle die Zellenanzahl in 4-5 Feldern eines Hochleistungs-Lichtmikroskops gesichtet und gezählt wurde. Diese Anzahl wurde durch die Anzahl der angesetzten Zellen pro Feld dividiert, was den Prozentsatz der Zellenbindungen ergab.

Flusszytometrie

Es wurden 0,5-1,0 · 10&sup5; Zellen in 50 ul HHHSA auf V-Boden-Mikrotiterplatten aufgetragen, die 50 ul Antikörper-Überstände oder 50 ul einer 1/200-Verdünnung von Antikörper-Aszites enthielt. Die Platte wurde mit Klebeband versiegelt und auf einem Dynatech Plattenschüttler während 45 Minuten bei 4ºC geschüttelt. Die Zellen wurden zu Kuchen verdichtet (2000 U/min. 2 Minuten, 4ºC), dreimal mit HHHSA (150 ul) gewaschen und in 100 ul einer 1/20-Verdünnung in HHHSA von gereinigten mit FITC konjugierten Ziegen-Anti-Maus-IgG-(leichte Kette + schwere Kette)-Antiseren (Zymed, CA) wieder suspendiert. Die Platte wurde wieder versiegelt und während 30 Minuten bei 4ºC geschüttelt. Die Zellen wurden zweimal in HHHSA und einmal in PBS + 5% FCS gewaschen und in 200 ul PBS + 2,5% FCS + 1% Paraformaldehyd wieder suspendiert. Die Proben wurden auf einem EPICS V Flusszytometer analysiert.

Reagenzien

Alle chemischen Reagenzien waren von höchster Reinheit und wurden bei Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) eingekauft mit Ausnahme der folgenden: rIL-1β (Genentech, CA), HE (Polysciences, Warrington, PA), SFDA (Molecular Probes), Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; und Na¹²&sup5;I (Amersham, IL), Dextran-500 (Pharmacia, Schweden), fetaler Kälberserum (Flow Laboratories oder JR Scientific), Endothelzellen-Wachstumfaktor (Chemicon International, Los Angeles, CA), HSA (Alpha Corporation, Los Angeles, CA), FITC- Ziegen-Anti-Maus-Antikörper (Zymed, CA), Protein A (Pharmacia, Schweden), Iodogen (Pierce), Triton X-100 (DuPont, Wilmington, DE), CsCl (BRL), Hypoxanthin (GIBCO, NY).

Beispiel 2

Adhäsion von Mac-1- und LFA-1-Transfektanten an gereinigtes ICAM-1

Den Untersuchungen von Smith C. W. et al., [J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)], die den Erfindern nahegelegt hatten, dass auf Neutrophilen sitzendes Mac-1 sich an ICAM-1 bindet, erwächst eine Komplikation durch die Anwesenheit einer Vielfalt von Adhäsionsrezeptoren auf den Neutrophilen, d. h. die Neutrophilen exprimieren nennenswerte Mengen sowohl von LFA-1 wie auch von Mac-1. Die im vorstehenden beschriebenen Methoden verwendeten eine Zellbindungsbestimmung (Assay) mit Transfektanten durch gereinigtes Protein, bei welcher jedes der Liganden-Paare unabhängig voneinander auf seine Adhäsion untersucht wurde [Larson R. S. et al., Cell Reg. 1: 359-367 (1990); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird].
Mit den cDNAs für die gemeinsame β-Untereinheit und die α-Untereinheit entweder von Mac-1 oder von LFA-1 cotransfizierte COS-Zellen wurden einer Bestimmung (Assay) der Bindung an gereinigtes ICAM-1 unterzogen, welch letzteres unter Verwendung der im vorstehenden beschriebenen Methoden auf ein Kunststoffsubstrat aufgetragen war. Die durch Immunfluoreszenz-Flusszytometrie bestimmte Oberflächenexpression betrug im Durchschnitt 30% für ICAM-1 und 40% für Mac-1. Mac-1 oder LFA-1 exprimierende transfizierte COS-Zellen banden sich an gereinigtes ICAM-1 (Fig. 1), während die mit der β-Kette allein transfizierten Zellen sich nicht banden. Die Adhäsion war spezifisch, da gegen LFA-1, Mac-1 und ICAM-1 gerichtete monoklonale Antikörper die Bindung unterdrückten, während ein als Referenz genommener, das Affen-Homologon des CD29 bindender monoklonaler Antikörper die Bindung nicht unterdrückte.
In Fig. 1 wurden COS-Zellen, die mit cDNAs für die Mac-1- oder LFA-1-α-Ketten und die gemeinsame β-Kette cotransfiziert waren, mit &sup5;¹Cr markiert, und dann wurden sowohl die Zellen als auch die mit ICAM-1 überzogenen Substrate mit monoklonalen Antikörpern gegen folgendes vorbehandelt: Referenz (TS2/16), LFA-1 (TS1/22), Mac-1 (LPM19c) und ICAM-1 (R6.5 und RR1/1). Anschliessend wurden die Zellen zum Absetzen in mit ICAM-1 überzogenen 35-mm-Petrischalen während 1 Stunde bei 37ºC stehengelassen. Die Platten wurden mittels Pipettierung viermal gewaschen, und gebundene Zellen wurden entfernt und mittels Gammaemission quantitativ erfasst. Vor der Markierung mit &sup5;¹Cr wurde ein kleiner Prozentsatz der Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen LFA-1 (TS1/22) oder Mac-1 (LM2/1) gefärbt, und der Prozentsatz von positiven Zellen wurde durch Flusszytometrie bestimmt. Die Wertangaben wurden in bezug auf die Oberflächenexpression normiert, indem der Prozentsatz von gebundenen Zellen durch den Prozentsatz von positiven Zellen dividiert wurde. Ohne diese Normierung waren COS-Zellen, die mit der β-Kette allein, mit Mac-1 und mit LFA-1 transfiziert waren, in bezug auf die Expression bei 7%, 30% bzw. 40% der Zellen positiv. Die Wertangaben waren Durchschnittswerte aus drei separaten Untersuchungen, und die Fehlerbalken stellen die Standardfehler des Durchschnittswertes dar.
Die Adhäsion von Mac-1-Transfektanten war schwächer (44 Bindung im Vergleich zu 75% bei LFA-1-Transfektanten) und fand bei 37ºC statt, jedoch nicht bei 23ºC, während sich mit LFA-1 transfizierte COS-Zellen bei 23ºC an ICAM-1 banden.

Beispiel 3

Immunaffinitätsreinigung von funktionellem Mac-1

Zur Gewinnung von zusätzlichen Beweisen einer Wechselwirkung zwischen Mac-1 und ICAM-1 wurde die im vorstehenden beschriebene gegenseitige Bestimmung (Assay) verwendet, um festzustellen, ob sich ICAM-1 tragende Zellen an gereinigtes Mac-1 binden. Mac-1 wurde gereinigt, wie es im vorstehenden beschrieben wird, wobei eine modifizierte Form desjenigen Vorgehens verwendet wurde, das verwendet worden war, um LFA-1 in einer Form zu erhalten, die funktionell war und bei welcher die α- und β-Ketten nicht-kovalent assoziiert blieben [Dustin M. L. et al., Nature 341: 619-624 (1989)].
Leukozyten aus peripherem Blut wurden in Gegenwart von Mg²&spplus; in Triton X-100 lysiert, und der Mac-1-α/β-Komplex wurde, wie im vorstehenden beschrieben, an eine Affinitätsäule mit monoklonalem Antikörper gegen LM2/1 gebunden. Triton X- 100 wurde gegen das dialysierbare Tensid Octyl-β-Glucosid ausgewechselt. Die Elutionsbedingungen bei einer Variation von Salz, Konzentration an zweiwertigem Kation und pH-Wert wurden untersucht und in bezug auf die Ausbeute und die Fähigkeit zur Wiederfällung des Heterodimers optimisiert. Der optimale Puffer enthielt 50 mM Triethylamin pH-Wert 10,0, 300 mM NaCl und 2 mM Mg²&spplus;. Nach dieser Prozedur erhaltenes Mac-1 war im wesentlichen rein, und es migrierte beim reduzierenden SDS-PAGE als zwei Bänder mit jeweiligen Mr von 160000 und 95000, im Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen [Miller L. J. et al., J. Immunol. 138: 2381-2383 (1987)]. Immunfällung des gereinigten Stoffes mit dem monoklonalen Anti-β-Antikörper TS1/18 ergab das Heterodimer, was aufzeigte, dass die beiden Ketten nach der Elution assoziiert blieben. Dieser Stoff hatte die Aktivität des Komplementrezeptors Typus drei, da er sich spezifisch an iC3b präsentierenden Erythrozyten band, nicht jedoch an Erythrozyten, die nur mit Anti-Forsmann-Antikörper [Diamond M. S. et al. in: Leukocyte Typing IV, Herausgeber Knapp W. et al., Oxford University Press, Oxford, Seiten 570-574 (1989); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird]. Etwa 500 ug intaktes Mac-1 wurden aus 10 g Leukozyten gewonnen.

Beispiel 4

Adhäsion von mit ICAM-1-cDNA transfizierten Zellen an gereinigtes Mac-1 und LFA-1

Um zu untersuchen, ob ICAM-1 tragende Zellen mit Mac-1 in Wechselwirkung stehen, wurden COS-Zellen mit der cDNA von ICAM-1 transfiziert und dann zum Absetzen auf mit Mac-1 überzogenen Substraten stehengelassen, wie es im vorstehenden beschrieben wird. Für die Oberflächenexpression von ICAM-1 auf transfizierten COS-Zellen ergaben sich Durchschnittswerte von 50-60%, während mit Vektoren allein transfizierte COS-Zellen keine Expression aufwiesen. Bestimmt wurde dies durch Analyse der Fluoreszenzintensität von entweder mit dem Vektor allein oder mit ICAM-1-cDNA transfizierten COS-Zellen oder von nicht-transfizierten oder mit ICAM-1-cDNA transfizierten L- Zellen. Die Zellen wurden mit monoklonalem Antikörper gegen ICAM-1-(RR1/1) + FITC-Ziegen-Anti-Maus-IgG inkubiert und der Flusszytometrie unterzogen. ICAM-1 exprimierende COS-Zellen hefteten sich an gereinigtes Mac-1, während mit dem Vektor allein transfizierte Zellen sich nicht anhefteten. Um dies nachzuweisen wurden COS-Zellen mit ICAM-1-cDNA oder mit dem Vektor allein transfiziert und dann zum Absetzen auf einem Fleck von gereinigtem Mac-1 in einer 35-mm-Petrischale während 50 Minuten bei 37ºC stehengelassen. Die Zellen und die Schalen wurden während 20 Minuten mit monoklonalem Antikörper gegen Referenz (TS2/16), Mac-1 (LPM19c) bzw. ICAM-1 (R6.5 und RR1/1) vorbehandelt. Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal mit einer Pasteur-Pipette gewaschen, um nichtgebundene Zellen zu entfernen. Die Bindung war spezifisch, da sie durch monoklonale Antikörper gegen Mac-1-α (LPM19c) bzw. ICAM-1 (R6.5 und RR1/1) vollständig blockiert wurde.
Um eine mehr quantitative Evaluation der Stärke der Wechselwirkung zwischen Mac-1 und ICAM-1 zu erreichen wurde eine Analyse der Dosis-Antwort durchgeführt. Wegen der Variation zwischen Untersuchungen über den Prozentsatz von ICAM-1 exprimierenden COS-Zellen und über die Zwischenzellheterogenität beim Expressionspegel für ICAM-1 wurde humanes ICAM-1 in murinen L-Zellen exprimierende stabile Transfektanten erzeugt, wie es von Chen C. A. et al. [in: BioTechniques 6(7): 632-637 (1988); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird] beschrieben wird.
Es wurden Kolonien selektioniert, bei welchen 100% der L-Zellen hohe Mengen an humanem ICAM-1 exprimierten. Titrier- Untersuchungen wurden durchgeführt, bei denen sich ICAM-1&spplus;-L- Zellen an Substrate banden, die in einem breiten Dichtebereich mit Mac-1-Stellen überzogen waren (Fig. 2).
In Fig. 2 sind ICAM-1&spplus;-L-Zellen oder (nicht-transfizierte) ICAM-1&supmin;-L-Zellen mit &sup5;¹Cr markiert. Bei Antikörper- Blockierungsexperimenten wurden sowohl die 96-Mulden-Platten als auch die Zellen mit den folgenden monoklonalen Antikörpern vorbehandelt: gegen Referenz (M1/42), Mac-1 (LPM19c) und ICAM-1 (R6.5). Die Zellen wurden in die mit Mac-1 überzogenen Mulden angesetzt und während 45 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nichtgebundene Zellen wurden nach vier Waschungen durch Aufsaugen mit einer feinen Nadel ("26-gauge") entfernt. Gebundene Zellen wurden mit 0,2 N NaOH entfernt und mittels Gammaemission quantitativ erfasst. Parallel dazu wurden Stellendichten bestimmt und durch Radioimmunbestimmung (Radioimmunassay) mit ¹²&sup5;I-LM2/1 quantitativ erfasst. Alle Untersuchungen wurden dreifach ausgeführt, und die dargestellten Wertangaben sind Durchschnittswerte aus drei separaten Untersuchungen. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.
ICAM-1 exprimierende L-Zellen hefteten sich auf dosisabhängige Weise an Mac-1 mit einem Schwellenwert von etwa 250 Stellen/pm², bevor eine signifikante Adhäsion feststellbar wurde. Die Adhäsion war spezifisch, da mit monoklonalem Antikörper gegen Mac-1 α (LPM19c) vorbehandelte Platten, mit monoklonalem Antikörper gegen ICAM-1 (RR1/1 und R6.5) vorbehandelte Zellen sowie nicht-transfizierte L-Zellen sich nicht anhefteten.
An mit LFA-1 und mit Mac-1 überzogenen Substraten wurden parallele Untersuchungen durchgeführt, um im Hinblick auf die Verwendung eines Waschungsprotokolls von geringerer Schärfe den Unterschied in der relativen Avidität festzustellen (Fig. 3). Die Menge an substratgebundenes Mac-1 und LFA-1 wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen die gemeinsame β-Untereinheit durch Radioimmunbestimmung (Radioimmunassay) bestimmt.
Der prozentuale Bindungsanteil wurde auf folgende Weise bestimmt: ICAM-1&spplus;-L-Zellen wurden während 50 Minuten bei 37ºC in 60-mm-Petrischalen angesetzt, die mit einem Fleck von Mac- 1 (Fig. 3, leere Kreise) und von LFA-1 (Fig. 3, volle Kreise) versehen waren. Nichtgebundene Zellen wurden durch drei aufeinanderfolgende Waschungen mit einer Pasteur-Pipette entfernt. Gebundene Zellen wurden quantitativ erfasst, indem für jede Experimentstelle die Zellenanzahl in 4-5 Feldern eines Hochleistungs-Lichtmikroskops gesichtet und gezählt wurde. Diese Anzahl wurde durch die Anzahl der angesetzten Zellen pro Feld dividiert, was den Prozentsatz der Zellenbindungen ergab. Die Bindung ausserhalb der mit Integrin überzogenen Flecken variierte im Bereich von 1-3%. Die Stellendichte wurde unter Verwendung von ¹²&sup5;I-TS1/18 (Anti-CD18) bestimmt. Gezeigt wird eine von zwei repräsentativen Untersuchungen, und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.
ICAM-1&spplus;-L-Zellen hefteten sich mit etwas höherer Avidität an LFA-1-Substrate, was sich daraus ergibt, dass die Bindungs-Isotherme für gereinigtes Mac-1 zu höheren Stellendichten hin versetzt wurde. Die Bindung von ICAM-1&spplus;-L-Zellen an Mac-1 war temperaturempfindlicher als die Bindung an LFA-1 (Fig. 4). In Fig. 4 wurden die ICAM-1&spplus;-L-Zellen bei der angegebenen Temperatur während 10 Minuten vorinkubiert und dann in 60-mm-Petrischalen mit Flecken von Mac-1 und von LFA-1 angesetzt. Die Schalen wurden bei der geeigneten Temperatur während 50 Minuten inkubiert, dreimal mit einer Pasteur-Pipette gewaschen und bei hoher Vergrösserung auf anhaftende Zellen gesichtet und gezählt. Die Stellendichte für LFA-1 betrug 803 Stellen/um² und für Mac-1 738 Stellen/um², wie es sich aus der Radioimmunbestimmung (Radioimmunassay) unter Verwendung von ¹²&sup5;I-TS1/18 (Anti-CD18) ergab. Der Prozentsatz der Bindungen wurde bestimmt, wie es im vorstehenden beschrieben wurde. Gezeigt wird in Fig. 4 eine von zwei repräsentativen Untersuchungen, und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar. Der Asteriskus weist darauf hin, dass ICAM-1-Transfektanten bei 4ºC keine Bindung mit gereinigtem Mac-1 eingingen.
Trotz der äquivalenten Stellendichten von LFA-1 und Mac- 1 auf dem Substrat hefteten sich die Zellen bei Raumtemperatur stark an LFA-1 aber nur schwach an Mac-1, während es bei 37ºC in der quantitativen Adhäsion einen nur kleinen oder gar keinen Unterschied gab.

Beispiel 5

Adhäsion von HUVEC-Zellen an gereinigtes Mac-1

Zur Bestätigung, dass stimulierte HUVEC-Zellen sich in von ICAM-1 abhängiger Weise an Mac-1 anhefteten, wurde deren Fähigkeit zur Bindung von Mac-1-Substraten untersucht. Wenn HUVEC-Zellen während 18-24 Stunden mit IL-1β oder LPS stimuliert werden, wurde festgestellt, dass sie sich an gereinigtes Mac-1 unter scharfen Waschbedingugen binden (Fig. 5).
In Fig. 5 wurden HUVEC-Zellen, die nicht-stimuliert oder mit IL-1β (5 ug/ml, 18 Stunden) oder LPS (1 ug/ml, 24 Stunden) stimuliert worden waren, mit &sup5;¹Cr markiert, auf mit Mac- 1 überzogenen 96-Mulden-Platten angesetzt und während 1 Stunde inkubiert. Nichtgebundene Zellen wurden unter scharfen Waschbedingugen durch Aufsaugen mit einer feinen Nadel gewaschen; gebundene Zellen wurden wiedergewonnen und mittels Gammaemission quantitativ erfasst. Antikörper-Blockierung erfolgte durch Vorinkubation der Zellen und Platten während 25 Minuten bei Raumtemperatur mit den folgenden monoklonalen Antikörpern: gegen Referenz (W6/32), Mac-1 (LPM19c) und ICAM- 1 (R6.5 und RR1/1). Die Untersuchungen wurden dreifach ausgeführt, und die vorgestellten Wertangaben sind Durchschnittswerte aus drei separaten Untersuchungen. Die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.
Die Adhäsion war spezifisch und primär von ICAM-1 abhängig, da sie von einem monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1 (82% in bezug auf LPS, 66% in bezug auf IL-1β) und gegen Mac-1 α (> 95% in beiden Fällen), nicht jedoch von einem monoklonalen Referenz-Antikörper gehemmt wurde. Nicht-stimu lierte HUVEC-Zellen, die niedrige Mengen von ICAM-1 exprimierten [Dustin M. L. et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)], hefteten sich bei dieser Waschungsstärke nicht signifikant an gereinigtes Mac-1 an.

Beispiel 6

Unterschiede zwischen monoklonalen Antikörpern gegen ICAM-1 beim Blockieren der Adhäsion an Mac-1 und LFA-1

Die im vorstehenden beschriebenen gegenseitigen Adhäsionsbestimmungen (Assays) zeigten auf, dass sowohl Mac-1 als auch LFA-1 fähig waren, sich an ICAM-1 zu binden. Dieses Resultat liess die Frage aufkommen, welche auf ICAM-1 befindlichen Epitope an den Wechselwirkungen mit LFA-1 und Mac-1 mitbeteiligt waren. Zur Klärung dieser Frage wurde ICAM-1 von ICAM-1&spplus;-Zellen als Ligand für Mac-1 untersucht.
Zu diesem Zwecke wurden ICAM-1&spplus;-Zellen während 20 Minuten bei 4ºC mit sättigenden Konzentrationen der angegebenen monoklonalen Antikörpern gegen ICAM-1 vorbehandelt. Die Zellen wurden dann in eine mit Flecken von Mac-1 oder von LFA-1 versehene 60-mm-Petrischale angesetzt und während 50 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nichtgebundene Zellen wurden durch drei Waschungen unter Verwendung einer Pasteur-Pipette entfernt. Der Prozentsatz von gebundenen Zellen wurde bestimmt, wie es im vorstehenden beschrieben wurde (Fig. 6). Die Wertangaben sind Durchschnittswerte aus zwei separaten Untersuchungen, und die Fehlerbalken stellen Standardabweichungen dar.
Von den Ergebnissen in bezug auf die Blockierung von monoklonalen Antikörpern (Fig. 6) werden Unterschiede in bezug auf die auf ICAM-1 befindlichen Stellen der Wechselwirkung mit LFA-1 und Mac-1 nahegelegt. Nur einer der monoklonalen Antikörper (R6.5) war fähig, die Bindung von mit ICAM-1 transfizierten L-Zellen an mit Mac-1 und mit LFA-1 überzogenen Substraten signifikant zu hemmen, während andere (RR1/1, LB-2, 84H10, CBRIC1/4), welche die Bindungsfunktion zwischen LFA-1 und ICAM-1 blockieren [Lo S. K. et al., J. Immunol. 143(10): 3325-3329 (1989); Makgoba M. W. et al., Nature 331: 86- 88 (1988); Marlin S. D. et al., Cell 51: 813-819 (1987); Rothlein R. M. et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986); Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746-1756 (1988)], die Bindung an Mac-1 nicht herabsetzten.
Ausserdem blockierte ein neuer monoklonaler Antikörper (CBRIC1/4) teilweise die Adhäsion zwischen Mac-1 und ICAM-1.
Es gibt zusätzliche Beweise dafür, dass Mac-1 und LFA-1 nicht auf identische Weise mit ICAM-1 in Wechselwirkung stehen. Larson R. S. et al. [Cell Reg. 1: 359-367 (1990); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird] haben aufgezeigt, dass wenn sich Mac-1- und LFA-1-exprimierende COS-Zellen-Transfektanten an mit ICAM-1 überzogenen Substraten anheften und unter scharfen Waschbedingugen durch Aufsaugen mit einer feinen Nadel gewaschen werden [Dustin M. L. et al., Nature 341: 619-624 (1989)], nur LFA-1&spplus;-Zellen haften bleiben. Die im vorstehenden beschriebenen Untersuchungen zeigen jedoch auf, dass, wenn die Zellen sanfter gewaschen werden, sowohl mit Mac-1 wie auch mit LFA-1 transfizierte COS-Zellen gebunden bleiben. Somit scheint die Wechselwirkung zwischen LFA-1 und ICAM-1 gegen Scherkräfte widerstandsfähiger zu sein. Dieses Phänomen ist zum Teil mit einem Unterschied in der Bindungs-Avidität erklärbar. Wenn parallele Adhäsions-Bestimmungen (Assays) mit ICAM-1&spplus;-L-Zellen bei ihrer Bindung entweder an Mac-1 oder an LFA-1 durchgeführt werden, wird gefunden, dass eine geringere Menge an LFA-1 als an Mac-1 benötigt wird, um die Zelladhäsion zu erreichen. Ein diesbezüglicher Vorbehalt besteht darin, dass, obwohl ein monoklonaler Antikörper gegen die gemeinsame β- Untereinheit verwendet wird, um die Dichte von Mac-1 und von LFA-1 quantitativ zu erfassen, und obwohl der monoklonale Antikörper mit assoziierten aber nicht freien β-Untereinheiten reagiert [Kishimoto T. K. et al., Cell 50: 193-202 (1987)], nicht bestimmt wurde, welches der Prozentsatz des Proteins ist, das sich auf dem Kunststoff in einer zur Bindung an ICAM-1 fähigen aktiven Konformation befindet.

Beispiel 7

Wirkung der chemotaktischen Stimulation von Neutrophilen auf deren Koniugation mit HUVEC-Zellen

Die chemotaktische Stimulation von Neutrophilen ergab eine signifikante Erhöhung deren Konjugation mit HUVEC-Zellen über der Basislinie der Konjugatenbildung bei nichtstimulierten Neutrophilen (Tabelle 2). Nach der Stimulation ergab sich eine drei- bis vierfache Erhöhung der Anzahl von mit Neutrophilen konjugierten HUVEC-Zellen. Als TS1/22, ein monoklonaler Anti-LFA-1-α-Antikörper, zugegeben wurde, ergab sich eine leichte, jedoch statistisch nicht signifikante Hemmung der Konjugatenbildung. Als ein monoklonaler Anti-Mac-1- α-Antikörper zugegeben wurde, ergab sich eine signifikante Hemmung (73%) der Konjugaten von stimulierten Zellen. Die höchste Hemmung (88% bis 98%) ergab sich mit einer Kombination von monoklonalen Anti-LFA-1-Antikörpern und monoklonalen Anti-Mac-1-Antikörpern oder einem Antikörper gegen die gemeinsame β-Kette. Fragmente R6.5 Fab und RR1/1 Fab&sub2; verminderten die Konjugatenbildung um 48, 3%. Da diese Hemmung grösser war als die, welche sich aus dem Antikörper gegen LFA-1 für sich allein ergab, zeigen die Resultate auf, dass sowohl LFA-1 als auch Mac-1 mit ICAM-1 in Wechselwirkung stehen. Dass die von CD18 abhängige Adhäsion nicht allein durch monoklonale Antikörper gegen ICAM-1 gehemmt werden konnte, zeigte auf, dass LFA-1 und/oder Mac-1 mit zusätzlichen Liganden in Wechselwirkung stehen. Für LFA-1 kommt ICAM-2 stark in Frage, da sich jedoch Mac-1 anscheinend nicht an ICAM-2 bindet, dürften andere Endothelzellenoberflächengegenrezeptor(en) mitbeteiligt sein.
In Tabelle 2 wurden mit HE rotgefärbte Neutrophile (1,5 · 10&sup6;) und mit SFDA grüngefärbte HUVEC-Zellen (6 · 10&sup5;) erneut suspendiert und separat mit den folgenden monoklonalen Antikörpern vorbehandelt. gegen Referenz (W6/32), ICAM-2 (CBRIC2/1), LFA-1 (TS1/22), Mac-1 (LPM19c), CD18 (YFC51.1) und ICAM-1 (R6.5 Fab und RR1/1 Fab&sub2;). Die Zellen wurden in 24-Mulden-Platten gemischt und bei 37ºC vorinkubiert. Es wurde fMLP (10&supmin;&sup7; M) zugegeben, und die Zellen wurden während zehn Minuten bei 37ºC bei 75 U/min geschüttelt. Die resultierenden Suspensionen wurden sofort durch Flusszytometrie analysiert. Die Wertangaben sind als Prozentsatz von HUVEC-Zellen, die in heterotypischen Konjugaten mit Neutrophilen gefunden wurden, ausgedrückt, und die Hemmung der Konjugation von stimulierten Neutrophilen ist relativ zur Basislinie der Konjugaten ohne Stimulation durch fMLP ausgedrückt. Signifikanzwerte wurde unter Verwendung einer Untersuchung von gepoolten T bestimmt. NS bedeutet, dass sich die Werte von den Referenzwerten statistisch unterschieden (p > 0,05). In Klammern gesetzte Werte bezeichnen die Standardabweichungen. Tabelle 2 Konjugatenbildung zwischen mit fMLP stimulierten Neutrophilen und während 24 Stunden mit LPS kultivierten HWEC-Zellen

Beispiel 8

Schlussfolgerungen zur Wechselwirkung zwischen Mac-1 und ICAM-1

Dass Mac-1 wie LFA-1 [Marlin S. D. et al., Cell 51: 813- 819 (1987)] ein Gegenrezeptor für ICAM-1 ist, beweisen die im vorstehenden beschriebenen Untersuchungen, indem sie aufzeigen, dass gereinigtes Mac-1 die Zelladhäsion in Abhängigkeit von ICAM-1 vermittelte und gegengleich gereinigtes ICAM-1 die Zelladhäsion in Abhängigkeit von Mac-1 vermittelte.
Mit spezifischen cDNAs von möglichen Gegenrezeptoren transfizierte Zellen wurden verwendet, um Komplikationen zu vermeiden, die mit zusätzlichen Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen einherkommen. Die Resultate zeigen auf, dass ICAM-1&spplus;- Transfektanten und Mac-1&spplus;-Transfektanten gereinigtes Mac-1 bzw. ICAM-1 binden. Um die Möglichkeit auszuschliessen, dass diese Resultate ein Artefakt des Untersuchungssystems seien, wurde eine von Mac-1 und ICAM-1 abhängige Adhäsion zwischen stimulierten Endothelzellen und gereinigtem Mac-1 nachgewiesen.
Ebenfalls wurde eine Wechselwirkung zwischen Mac-1 und ICAM-1 im Zellen-Zellen-Kontext aufgezeigt, da sich Mac-1&spplus;- stimulierte Neutrophile aus peripherem Blut mit ICAM-1&spplus;- HUVEC-Zellen auf eine Weise konjugierten, die von monoklonalen Antikörpern gegen Mac-1 und gegen ICAM-1 gehemmt wurde.
Die Bindung von ICAM-1 sowohl an Mac-1 wie auch an LFA-1 zeigte auf, dass sich ein Immunglobulin-ähnliches Molekül an mehr als ein einzelnes Integrin anheften könnte. Die Wechselwirkungen zwischen den beiden nahverwandten Leukozyten- Integrinen und ICAM-1 sind jedoch einander nicht identisch.
Ein anderes Merkmal, welches die Wechselwirkung mit LFA- 1 und mit Mac-1 unterscheidet, ist die auffallende Wirkung der Temperatur auf die Adhäsion. Während sich ICAM-1&spplus;-L-Zellen und -COS-Zellen bei Raumtemperatur stark an gereinigtes, auf Feststoffphase vorliegendes LFA-1 binden (Fig. 4), besteht für eine signifikante Adhäsion am gereinigtes Mac-1 eine strenge Forderung nach einer Temperatur von 37ºC (Fig. 4). Die Wechselwirkung von ICAM-1 tragenden Zellen mit gereinigtem Mac-1 erweist sich auch als stärker energieabhängig als die Wechselwirkung mit LFA-1 [Staunton D. E., Nature 339: 61-64 (1989)]. Die Abhängigkeit der Wechselwirkung zwischen Mac-1 und ICAM-1 von der Temperatur und der Energie kann auf eine Forderung nach grösserer ICAM-1-Aggregatbildung an der Zelloberfläche oder auf die Notwendigkeit einer näheren Positionierung der Zellen am Substrat zurückzuführen sein. In Übereinstimmung mit der stärkeren Wechselwirkung mit LFA-1 ist zu bemerken, das ICAM-1-exprimierende transfizierte Zellen sich auf mit LFA-1 überzogenen Substraten mehr ausbreiten und verflachen als auf mit Mac-1 überzogenen Substraten.
Die Bindung von Mac-1 an ICAM-1 beweist unmittelbar, dass Mac-1 mit einem Gegenrezeptor an der Endothelzellenoberfläche in Wechselwirkung steht. Diese Feststellung erklärt frühere Untersuchungen, welche aufgezeigt hatten, dass die Adhäsion von Neutrophilen an Endothelzellen von monoklonalen Antikörpern gegen Mac-1 gehemmt wird [Anderson D. C. et al., J. Immunol. 137: 15-27 (1986); Harlan J. M. et al., Blood 66: 167-178 (1985); Zimmermann G. A. et al., J. Clin. Invest. 81: 531-537 (1988)], und dass die von Mac-1 und LFA-1 abhängige Adhäsion zwischen mit fMLP stimulierten Neutrophilen und nicht-stimulierten Endothelzellen [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746-1756 (1988)] oder ICAM-1 enthaltenden planaren Membranen [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)] von einem monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1 (R6.5) vollständig blockiert wird.
Im Gegensatz dazu wurde berichtet, dass ICAM-1 kein Ligand für Mac-1 ist [Lo S. K. et al., J. Immunol. 143(10): 3325- 3329 (1989)]. Bei dieser Untersuchung heften sich mit Phorbolester stimulierte Neutrophile an nicht-stimulierte Endothelzellen in einer von LFA-1, Mac-1 und ICAM-1 abhängigen Weise, welche Resultate mit denen, die im vorstehenden dargelegt werden, übereinstimmen. Diese Forschergruppe kam jedoch zur Schlussfolgerung, dass nur LFA-1 mit ICAM-1 in Wechselwirkung steht, weil sich die Hemmung durch monoklonale Antikörper gegen LFA-1 und gegen ICAM-1 (LB-2, 84H10) nicht additiv verhielt, während sich die Hemmung durch monoklonale Antikörper gegen Mac-1 und gegen ICAM-1 additiv verhielt. Die Unterschiede bei den früheren Berichten erklären sich zum Teil durch die Disparitäten bei der Selektion der monoklonalen Antikörper; im vorliegenden wird dargelegt, dass der monoklonale Antikörper R6.5 die Wechselwirkungen sowohl von Mac-1 als auch von LFA-1 mit ICAM-1 blockierte, während die monoklonalen Antikörper LB-2 und 84H10 nur die Bindung zwischen LFA-1 und ICAM-1 gehemmt haben (Fig. 6).
Die im vorliegenden vorgestellten Ergebnisse in bezug auf die Blockierung durch monoklonale Antikörper stimmen überein mit Mutagenese-Untersuchungen, welche dazu führen, Epitope von monoklonalen Antikörpern auf unterschiedliche Bereiche des ICAM-1-Moleküls abzubilden [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)]. RR1/1 und LB-2 werden auf den ersten N-terminalen Immunglobulin-Bereich abgebildet, während R6.5 auf den zweiten Bereich abgebildet wird. Die Ergebnisse stimmen auch überein mit Untersuchungen in vivo [Barton R. W. et al., J. Immunol. 143: 1278-1282 (1989)], welche nach einer Vorbehandlung mit monoklonalen Antikörpern gegen CD18 (R3.3) oder gegen ICAM-1 (R6.5), nicht jedoch mit monoklonalem Antikörper gegen LFA-1 (R3.1), eine Herabsetzung der Infiltration von Granulozyten in mit Phorbolester entzündeter Kaninchenlunge aufzeigen. Diese Feststellungen zeigen auf, dass stimulierte Neutrophile einen von der Bindung zwischen Mac-1 und ICAM-1 abhängigen Weg zur Adhäsion verwenden können, um die Adhäsion in vivo an entzündetes Endothel zu vermitteln.
Die im vorliegenden präsentierten Untersuchungen stimmen überein mit der möglichen Existenz von Gegenrezeptoren für Mac-1 an der Oberfläche von nicht-stimulierten [Lo S. K. et al., J. Immunol. 143(10): 3325-3329 (1989)] und stimulierten Endothelzellen, die von ICAM-1 verschieden sind. Bei den im vorliegenden verwendeten Untersuchungen (Assays) kann ICAM-1 von Endothelzellen nicht für sich allein die gesamte von Mac- 1 abhängige Adhäsion von Neutrophilen erklären. Die Adhäsion von stimulierten HUVEC-Zellen an gereinigtes Mac-1 unter scharfen Waschbedingungen wurde nur zum Teil (66-82%) durch monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1 blockiert (Fig. 5). Zudem gab es wenig Adhäsion von nicht-stimulierten HUVEC-Zellen an Mac-1 unter diesen scharfen Waschbedingungen, jedoch gab es eine signifikante von ICAM-1 nicht abhängige Adhäsion an gereinigtes Mac-1, wenn unter weniger scharfen Waschbedingungen gewaschen wurde. Dieses Ergebnis steht im Widerspruch zu einem Bericht, der aufzeigte, dass die Adhäsion von mit fMLP stimulierten Neutrophilen an nicht-stimulierten Endothelzellen zu 84% durch einen monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1 blockiert wurde [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746- 1756 (1988)]. Diese Diskrepanz ist durch Unterschiede bei den Gewebekulturbedingungen von nicht-behandelten HUVEC-Zellen erklärbar, die einen zweiten Liganden für Mac-1 induzieren könnten.
Somit beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung von mehrfachen Zellbindungsuntersuchungen (Assays), von gereinigtem Mac-1 und ICAM-1 und von mit cDNAs für Mac-1 und ICAM-1 transfizierten Zellinien zwecks Untersuchung der Wechselwirkung von ICAM-1 mit Mac-1. Stimulierte HUVEC-Zellen, die eine hohe Oberflächendichte von ICAM-1 exprimieren, binden sich an durch Immunaffinität gereinigtes Mac-1, das auf künstlichen Substraten adsorbiert ist, auf eine Weise, von der festgestellt wurde, dass sie von monoklonalen Antikörpern gegen Mac-1 und gegen ICAM-1 gehemmt wird. Humanes ICAM-1 exprimierende transfizierte Mäuse-L-Zellen oder Affen-COS- Zellen binden sich an gereinigtes Mac-1 auf eine spezifische und von der Dosis abhängige Weise; im Vergleich zu LFA-1 wurde festgestellt, dass die Anhaftung an Mac-1 temperaturempfindlicher ist, eine geringere Avidität aufweist und von einer anderen Reihe von monoklonalen Antikörpern gegen ICAM-1 blockiert wird. In einer reziproken Bestimmung (Assay) hefteten sich mit den cDNAs für die α-Kette und die β-Kette von Mac-1 oder LFA-1 cotransfizierte COS-Zellen an durch Immunaffinität gereinigte ICAM-1-Substrate; Diese Adhäsion wurde durch monoklonale Antikörper gegen ICAM-1 und Mac-1 oder LFA- 1 blockiert. Zweifarbenfluoreszenz-Zellkonjugations-Untersuchungen zeigten auf, dass mit fMLP stimulierte Neutrophile sich an während 24 Stunden mit LPS stimulierte HUVEC-Zellen auf eine von ICAM-1, Mac-1 und LFA-1 abhängige Weise banden. Da sowohl zelluläres wie auch gereinigtes Mac-1 sowohl mit zellulärem wie auch mit gereinigtem ICAM-1 in Wechselwirkung stand, wurde der Schluss gezogen, dass ICAM-1 ein Gegenrezeptor für Mac-1 ist und dieser Rezeptor zum Teil für die Adhäs ion zwischen stimulierten Neutrophilen und stimulierten Endothelzellen verantwortlich ist.
Die im vorstehenden beschriebenen Untersuchungen zeigen auf, dass ICAM-1 ein Gegenrezeptor nicht nur für LFA-1, sondern auch für Mac-1 ist. Die Untersuchungen zur Bindung zwischen Zellen erbringen den Nachweis, dass Mac-1 von Neutrophilen mit dem auf HUVEC-Zellen exprimierten ICAM-1 in Wechselwirkung steht. Diese Feststellungen zeigen auch auf, dass Mac-1 neben ICAM-1 mit zumindest einem an der Oberfläche von Endothelzellen sitzenden zusätzlichen zellulären Liganden in Wechselwirkung steht.

Beispiel 9

Ortung der Mac-1-Bindungsstelle

Auf unerwartete Weise wird von den im vorstehenden vorgetragenen Ergebnissen in bezug auf die Blockierung durch monoklonale Antikörper nahegelegt, dass sich Mac-1 und LFA-1 in keine gemeinsame Bindungsstelle auf ICAM-1 teilen. Zur Untersuchung dieser Frage wurden Mutagenese-Untersuchungen durch Substitution von Aminosäuren und durch Deletion von Domänen durchgeführt.
Von Oligonucleotiden gesteuerte Mutagenese erfolgte wie von Kunkel T. A. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 (1985)] beschrieben und gemäss Peterson et al. [Nature 329: 842-846 (1987)] modifiziert, und wurde verwendet, um Substitutionen mit ICAM-1-Deletion zu erzeugen [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird].
COS-Zellen wurden bei 50% Konfluenz nach der DEAE-Dextran-Methode [Kingston R. E. in: Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Seiten 9.0.1-9.9.6 (1987)] transfiziert, wobei 6 ug des Vektors allein oder eines die natürlich vorkommende (sogenannte wilde) oder eine mutierte Form von ICAM-1 enthaltenden Vektors verwendet wurden. COS-Zellen wurden 1 Tag (Tag 3) vor der Untersuchung (Assay) unter Verwendung von Trypsin-EDTA suspendiert und erneut angesetzt. Für Untersuchungen (Assays) über die Bindung an gereinigtes Mac-1 oder LFA-1 oder zur Immunfluoreszenzfärbung wurden die transfizierten Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) + 5 mM EDTA (5 Minuten, 37ºC) eluiert und dreimal in PBS + 1 mM MgCl&sub2; + 0,5 mM CaCl&sub2; + 0,2% Glucose + 0,5% humanem Serumalbumin gewaschen.
Indirekte Immunfluoreszenzfärbung erfolgte unter Verwendung der monoklonalen Antikörper RR1/1 [Rothlein R. M. et al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)], R6.5 [Rothlein R. M. et al., J. Immunol. 141: 1665-1669 (1988)] und CL203 [Maio M. et al., J. Immunol. 143: 181-188 (1989)]. COS-Zellen (5 · 10&sup5;) wurden in 50-mm-Petrischalen angesetzt, die mit abgegrenzten Flecken von durch Immunaffinität gereinigtem Mac-1 und LFA-1 versehen waren, und während 45 Minuten bei 37ºC zum Anheften stehengelassen. Nichtgebundene Zellen wurden durch vier Waschungen unter Verwendung einer Transfer-Pipette entfernt, die Platten wurden codiert, und gebundene Zellen wurden von drei voneinander unabhängigen Beobachtern gezählt. Die Bindung von ICAM-1-Mutanten an LFA-1 und Mac-1 wurde bezüglich der Bindung an mit einem insertionslosen Vektor (Simulanten) transfizierten COS-Zellen korrigiert und in bezug auf den Prozentsatz von COS-Zellen, die sich mit dem monoklonalen Antikörper RR1/1 oder CL203 (in Abhängigkeit von der Deletion) färbten sowie auf den Prozentsatz von mit dem natürlich vorkommenden (sogenannten wilden) Typus erhaltenen Bindungen normiert:
Zum Aufzeigen der Wirkung der Substitution von Aminosäuren auf die Bindung von ICAM-1 an LFA-1 und Mac-1 wurden derartige Mutanten konstruiert, wie es von Staunton D. E. et al., [Cell 61: 243-254 (1990)] beschrieben wird. Die Bindungsunter suchung (Assay), die Immunfluoreszenz und die Datenverarbeitung erfolgten, wie es in Fig. 7 beschrieben wird. Mutanten, deren Bezeichnung kursiv geschrieben und unterstrichen steht, exprimieren nicht alle Epitope von monoklonalen Antikörpern in den Domänen 1 und 2 [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)]. Mutanten in der Domäne 1, deren Bezeichnung in Fettschrift geschrieben steht, entsprechen denen, welche die Bindung an LFA-1 um mehr als 75% herabsetzen. Mutanten in der Domäne 3, deren Bezeichnung in Fettschrift geschrieben steht, entsprechen denen, welche eine signifikante Wirkung auf die Bindung an Mac-1 (p < 0,05) aufweisen.
Der Inhibitor der Glucosidase des endoplasmatischen Retikulums, Deoxymannojirimycin, wurde auf seine Wirkung auf die Adhäsion von ICAM-1&spplus;-L-Zellen und -COS-Zellen an gereinigtes Mac-1 untersucht (Fig. 8). Dieser Inhibitor blockiert eine komplexe Addition von Kohlenhydraten im Golgi-Apparat, somit behalten Proteine mit N-vebundenen Stellen eine hohe Endo-H-empfindliche Mannose-Glykosylierung. Zellen wurden während drei Tagen mit 40 ug/ml Deoxymannojirimycin (CalBiochem) behandelt und dann mittels Flusszytometrie auf die Oberflächenexpression und auf die Adhäsion untersucht.

Beispiel 10

Die Mac-1-Bindungsstelle auf ICAM-1

Bei den im vorstehenden beschriebenen Transfektanten- Untersuchungen wurde auf unerwartete Weise beobachtet, dass unter den monoklonalen Antikörpern gegen ICAM-1 das Schema der Hemmung in bezug auf LFA-1 und Mac-1 verschieden ist; Vier monoklonale Antikörper gegen ICAM-1, welche die Wechselwirkung zwischen LFA-1 und ICAM-1 blockierten, beeinträchtigten die Bindung an Mac-1 nicht, ein monoklonaler Antikörper, welcher die Anhaftung an Mac-1 herabsetzte, verminderte die Anhaftung an LFA-1 nicht, und nur ein einzelner monoklonaler Antikörper blockierte die Adhäsion sowohl an Mac-1 als auch an LFA-1.
Bereits früher wurde, durch Verwendung von ICAM-1-Formen mit Domänen-Deletionen, die LFA-1-Bindungsstelle auf ICAM-1 bei den zwei ersten N-terminalen Ig-ähnlichen Domänen geortet. Bei den Untersuchungen, über die im vorliegenden berichtet wird, wurde die Mac-1-Bindungsstelle auf ICAM-1 geortet. In der Tabelle 3 ist die Bindung von Mutanten mit Substitution von Aminosäuren an LFA-1 und Mac-1 dargestellt. Die Wertangaben sind Durchschnittswerte aus 2-3 voneinander unabhängigen Untersuchungen, und die in Klammern gesetzte Werte stellen Standardabweichungen dar.
Zur Identifikation der Bindungsstelle wurden ICAM-1-Formen mit Domänen-Deletionen, die durch von Oligonucleotiden gesteuerte Mutagenese erzeugt wurden [Staunton D. E. et al. Cell 52: 925-933 (1988)], in COS-Zellen transfiziert, auf die positive Expression durch Immunfluoreszenz untersucht und bezüglich der Anhaftung an abgegrenzte Flecken von gereinigtem Mac-1 und LFA-1 untersucht (Fig. 7).
Das Ergebnis bestätigte, dass die Fähigkeit zur Bindung an gereinigtes LFA-1 nach einer Deletion von Ig-ähnlichen Domänen D3-D5 oder nach der Deletion des zytoplasmischen Schwanzes beibehalten wird. Die Resultate für Mac-1 waren jedoch ganz andere. Die Adhäsion an Mac-1 wurde nur dann beibehalten, wenn D3 vorhanden war. Sowohl die D3-D4-D5-Mutanten wie auch die D3-Mutanten verloren (> 95%) ihre Fähigkeit zur Bindung von gereinigtem Mac-1. Der Verlust der zytoplasmischen Domäne oder die Positionierung der fünf Ig-ähnlichen extrazellulären Domänen von ICAM-1 auf einen Phosphoinositolglycan-Schwanz hatte keine signifikante Wirkung auf die Adhäsion an Mac-1, und die Deletion von D4 und D5 setzte die Bindung an Mac-1 nur in geringem Masse herab.
Um zu bestätigen, dass D1 von ICAM-1 zu dessen Wechselwirkung mit Mac-1 nicht erforderlich ist, wurden Mutanten von ICAM-1 mit Substitution von Aminosäuren [Staunton D. E. et al. Cell 52: 925-933 (1988)] auf deren Fähigkeit zur Anhaftung an Mac-1 untersucht. Diese Mutanten wurden in der Schleife gemacht, welche unter Bezugnahme auf die Strukturerwartungen für Ig-artige Moleküle die β-Stränge verbindet; es wird die Hypothese aufgestellt, dass bei Mitgliedern der Ig-Superfamilie die Schleife als Stelle des Kontaktes zwischen Molekülen fungiert [Williams et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405 (1988)]. Die beiden einzelnen Aminosäuresubstitutionsmutanten in D1, welche die Bindung an LFA-1 am stärksten unterdrücken, ohne die Domänenkonformation zu ändern, nämlich E34/A und Q73/H, setzen die Adhäsion an gereinigtes Mac-1 nicht herab (Tabelle 3). Drei andere Mutanten, nämlich R13 G/EA, Q58EDS/AKDI und D60S/KL, welche die Konformation von D1 und D2 aufbrachen, wie es aus dem Verlust von drei verschiedenen Epitopen von monoklonalen Antikörpern hervorgeht [Staunton D. E. et al. Cell 52: 925-933 (1988)], unterdrückten alle die Bindung an LFA-1, aber hatten keine Wirkung auf die Bindung an Mac-1. Diese Resultate zeigen auf, dass D1 bei der Adhäsion an Mac-1 kaum eine Rolle spielt, und erklärt, warum monoklonale Antikörper, die auf ICAM-1 bei D1 andocken (RR1/1, LB-2, 84H10) [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird] die Bindung von ICAM-1 des natürlich vorkommenden (sogenannten wilden) Typus an Mac-1 nicht blockieren, obwohl sie die Adhäsion an LFA-1 zu verschiedenen Graden herabsetzen [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)].
Es wurde festgestellt, dass der monoklonale Antikörper R6.5 gegen ICAM-1, welcher ein Epitop in D2 erkennt [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)], die Adhäsion von ICAM-1 des natürlich vorkommenden (sogenannten wilden) Typus an Mac- 1 um etwa 90% herabsetzt. D2 auf ICAM-1 stellt jedoch vermutlich keine Hauptstelle der Adhäsion an Mac-1 dar. Der Mutant N103/K, bei dem die Konformation von D1 und D2 so gründlich aufgebrochen wird, dass die Bindung von RR1/1, LB-2 und R6.5 signifikant vermindert wird [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)], hatte auf die Bindung an Mac-1 keine Wirkung, obwohl er die Bindung an LFA-1 beseitigt. Der Mutant E111 GG/KGS, der das R6.5-Epitop ganz ausschaltet, vermindert auch nicht die Adhäsion an Mac-1. Alle anderen Mutanten mit Substitution von Aminosäuren in D2 verursachten keine nennenswerten Änderungen der Adhäsion sowohl an Mac-1 als auch an LFA-1 (Tabelle 3).
Die Untersuchungen mit Domänen-Deletionen zeigen auf, dass D3 zur Bindung von ICAM-1 an Mac-1 erforderlich ist. Zur Bestätigung und Weiterführung dieser Feststellung wurden Mutanten mit Substitution von Aminosäuren in D3 auf deren Wirkung auf die Adhäsion an Mac-1 untersucht. Drei Mutanten hatten dramatische Wirkungen auf die Adhäsion an Mac-1. D229QR/HLE beseitigte vollständig die Bindung an Mac-1, während E254DE/KEK sie um etwa ein Vierfaches herabsetzte. Diese Wirkung wurde nicht durch niedrige Oberflächenwerte verursacht, da sowohl D229QR/HLE als auch E254DE/KEK gleich wie beim natürlich vorkommenden (sogenannten wilden) Typus ausgedrückt werden [Staunton D. E. et al., Cell 61: 243-254 (1990)] und die Bindung an LFA-1 beibehalten wird. Auf unerwartete Weise wurde von N240DS/KNA und N269QSQE/IQAEQ, nämlich Mutanten, welche potentielle N-verbundene Glykosylierungsstellen entfernen, die Bindung erhöht. Ein Vorbehalt ist bezüglich der Mutationen in D3 angebracht, da, weil mehr als ein monoklonaler Antikörper fehlt, dessen Epitop dort andockt, nicht mit Sicherheit bekannt sein kann, ob nicht gewisse dieser Mutationen die Konformation des Moleküls ganz wesentlich aufbrechen. Alle Mutationen in D3 unterstützen jedoch die Adhäsion an LFA-1, und bei dem einen monoklonalen Antikörper CBRIC1/1, der zum Teil auf D3 andockt, wird dessen Epitop auf den ICAM-1-Molekülen bei den Mutationen D229, E254 und N269 beibehalten.
Zwischen den Mutationen, welche die Bindung an LFA-1 blockieren, und denen, welche die Bindung an Mac-1 hemmen, wurde ein Vergleich angestellt. Die Mutanten E34/A und D229QR/HLE bewirkten Änderungen an analogen Stellen der Ig- ähnlichen Domänen von D1 und D3 in den Schleifen zwischen den β-Strängen C und D [Williams et al., Ann. Rev. Immunol. 6: 381-405 (1988)]. In der ersten Domäne sowohl von humanem ICAM-1 als auch von murinem ICAM-1 [Horley et al., EMBO J. 8: 1889-2896 (1989)] und humanem ICAM-2 zeigt sich eine starke Beibehaltung der Peptidsequenz in Nähe des E34-Rests, der als Kontaktstelle zwischen LFA-1 und ICAM-1 vorgeschlagen wird [Staunton D. E. et al. Cell 52: 925-933 (1988)]. Dieser kritische Rest in D1 fluchtet mit dem (zwischen humanem und murinem ICAM-1) beibehaltenen Q230-Rest in D3, der einen Teil der Mutation D229QR/HLE darstellt, welche die Bindung an Mac-1 aufhebt.
Die Mutationen N240DS/KNA und N269QSQE/IQAEQ erhöhten um ein Zwei- bis Fünffaches die Adhäsion von ICAM-1 an Mac-1. Diese Effekte erschienen ausschliesslich mit Mac-1, und es erhöhte keine bisher gemachte Mutation die Adhäsion an LFA-1. Die Peptide NDS und NQS stellen zwei von acht Konsensus- Sequenzen für die N-verbundene Glykosylierung in ICAM-1 dar [Staunton D. E. et al. Cell 52: 925-933 (1988)]; diese Sequenzen erscheinen alle zwischen D2 und D5. Es ist bekannt, dass ICAM-1 stark glykosyliert ist [Dustin M. L. et al., J. Immunol. 137: 245-254 (1986)], und es wurden durch enzymatische Digestion mit N-Glykanase zumindest sieben Stellen aufgezeigt [Tomassini et al., J. Biol. Chem. 264(3): 1656-1662 (1989)]. Den Strukturerwartungen entsprechend liegen die N240- und N269-Glykosylierungsstellen demselben β-Faltblatt gegenüber wie D229 und E254, und ein sperriger oder stark geladener Zuckerrest kann die Bindung an Mac-1 sterisch hemmen oder chemisch abstossen.
Weil diese beiden Mutationen (N240DS/KNA und N269QSQE/IQAEQ) in ICAM-1, welche potentielle N-verbundene Glykosylierungsstellen ausschalten, auch die Bindung von COS- Zellen an gereinigtes Mac-1 erhöhen, wird die Hypothese aufgestellt, dass der Umfang der Glykosylierung auf ICAM-1 die Adhäsion an Mac-1 regulieren könnte. Um dies zu überprüfen wurde die Fähigkeit eines Inhibitors der glykolytischen Verarbeitung, Deoxymannojirimycin, und eines Deglykosylierungsenzyms, Neuraminidase, zur Änderung der Adhäsion von ICAM-1 exprimierenden L-Zellen an gereinigtes Mac-1 untersucht (Fig. 9). Das Deoxymannojirimycin hemmt das dem Golgi-Apparat assoziierte Enzym Mannosidase I und verhindert in kultivierten Zellen die Verarbeitung von höherer Mannose zu Oligosacchariden von komplexem Typus [Fuhrman et al., Nature 307: 755-758 (1984)]. Die Neuraminidase spaltet die terminalen Sialinreste auf N- und O-verbundenen Kohlenhydraten. Wie aufgezeigt weisen ICAM-1 tragende L-Zellen, die während drei Tagen mit Deoxymannojirimycin behandelt werden, im Vergleich zu unbehandelten oder mit Neuraminidase behandelten ICAM-1 tragenden Zellen eine erhöhte Bindung an gereinigtes Mac-1 auf. Als Referenz dienende nicht-transfizierte L-Zellen weisen bei der Behandlung mit dem Inhibitor oder dem Enzym keine Änderung der Bindung auf. Es wird der Schluss gezogen, dass die Modifikation der Seitenketten in den Golgi-Apparaten (Konversion von höherer Mannose zu Zuckern von komplexem Typus) die Wechselwirkung von ICAM-1 mit Mac-1 beeinträchtigen kann.
Die im vorliegenden dargelegten Untersuchungen mit Deletion von Domänen und Substitution von Aminosäuren zeigen auf, dass sich LFA-1 und Mac-1 an ICAM-1 bei jeweiligen Stellen in D1 bzw. D3 in getrennten, einander nicht-überlappenden Bereichen binden. Die Entwicklung dieser Bindungsstellen könnte sich aus der Duplikation von Ig-ähnlichen (Tandern-artig) hintereinanderliegenden Domänen ergeben haben. Sequenzvergleiche zeigen auf, dass D1 und D2 von ICAM-1 zusammen betrachtet mehr Homologie zu D3 und D4 von ICAM-1 oder zu D1 und D2 von ICAM-2 aufweisen als zu den einzelnen Domänen innerhalb eines (Tandern-artig) hintereinanderliegenden Paares (nämlich D1 gegenüber D2 oder D1 gegenüber D4). Dieses Phänomen der Duplikation von (Tandern-artig) hintereinanderliegenden Domänen ist bei Mitgliedern der Ig-Familie (wie bei NCAM oder VCAM-1) oft anzutreffen, obschon die Erklärung dafür bislang nicht klar war. Von Mitgliedern der Ig-Superfamilie wurde im allgemeinen gemeint, dass sie eine einzige Bindungsstelle aufweisen, die üblicherweise in Nähe des NH&sub2;-Endes liegt und mit einem einzelnen Liganden in Wechselwirkung steht. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen auf, dass zusätzliche Ig-ähnliche Domänen diese Funktionen ausüben können; somit kann die Duplikation von (Tandern-artig) hintereinanderliegenden Domänen einen Evolutionsmechanismus darstellen, der zu zusätzlichen Bindungsstellen geführt hat, wobei sich diese Stellen in ICAM-1 genug auseinanderentwickelt haben, um auf die Bindung verschiedener Integrine spezialisiert zu werden.
Da die Resultate zur Mutagenese und zur Blockierung von monoklonalen Antikörpern mit Nachdruck nahelegen, dass Mac-1 und LFA-1 sich an ICAM-1 in verschiedenen Bereichen des Moleküls binden, können je ein auf derselben Zelloberfläche sitzendes LFA-1-Molekül und ein Mac-1-Molekül fähig sein, sich an ein einziges selbes ICAM-1-Molekül zu binden. Eine solche Bindung wäre in Übereinstimmung mit der beobachteten Zusammenwirkung von auf Neutrophilen sitzenden Mac-1 und LFA-1 bei deren Adhäsions-Wechselwirkung mit ICAM-1 von Endothelzellen [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989); wobei diese Literaturstelle durch deren Zitat in das Vorliegende aufgenommen wird]. Ein derartiger Mechanismus aus zwei miteinander verwandten Integrinen, die sich gleichzeitig an dieselbe Gegenstruktur binden, wäre allgemeinener anwendbar, beispielsweise auf Fibronectin und dessen Wechselwirkung mit Mitgliedern der VLA-Subfamilie: im 80-kd-Zellbindungsfragment bindet sich VLA-4 an das CS-1-Fragment, während sich VLA-5 an die RGD-Sequenz anheftet [Hemler M. E., Ann. Rev. Immunol. 8: 365-400 (1990)].
Obgleich die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausbildungen davon beschrieben wurde, sollte verstanden werden, dass weitere Änderungen möglich sind, und mit dieser Anmeldung beabsichtigt wird, jegliche Varianten, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung zu erfassen, die sich generell an die Prinzipien der Erfindung halten und solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung miteinbeziehen, die auf dem Fachgebiet der Erfindung bekannt und gebräuchlich sind und auf die im vorstehenden dargelegten wesentlichen Merkmale anwendbar sind, wie es im nachstehenden aus dem Geltungsbereich der angefügten Ansprüche hervorgeht. Tabelle 3 Zusammenfassung der Adhäsion von ICAM-1 mit Mutanten durch Substitution von Aminosäuren an gereinigtes Mac-1 und LFA-1

Claims

1. Verwendung eines zur Bindung an Mac-1 im wesentlichen unfähigen, jedoch zur Bindung an LFA-1 im wesentlichen fähigen funktionellen Derivats von ICAM-1 bei der Herstellung einer Arzneimittelzusammensetzung zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer Entzündung, die sich aus dem spezifischen Abwehrsystem in einem Säuger-Subjekt ergibt, wobei die genannte Arzneimittelzusammensetzung im wesentlichen unfähig ist, eine sich aus dem nicht-spezifischen Abwehrsystem ergebende Entzündung zu modulieren.

2. Verwendung eines funktionellen ICAM-1-Derivats gemäss Anspruch 1, bei welcher das genannte funktionelle Derivat von ICAM-1 den Bereich 1 von ICAM-1 enthält, während ihm der Bereich 3 von ICAM-1 fehlt.

3. Verwendung eines funktionellen ICAM-1-Derivats gemäss Anspruch 1, bei welcher das genannte funktionelle Derivat von ICAM-1 eine aus der von D229QR/HLE und E254DE/KEK gebildeten Gruppe ausgewählte Mutation umfasst.

4. Verwendung eines funktionellen ICAM-1-Derivats gemäss den Ansprüchen 1 bis 3, bei welcher das genannte funktionelle Derivat von ICAM-1 löslich ist.

5. Verwendung eines funktionellen ICAM-1-Derivats gemäss den Ansprüchen 1 bis 4, bei welcher das genannte funktionelle Derivat von ICAM-1 durch rekombinante DNA-Technologie produziert wird.

6. Verwendung eines funktionellen ICAM-1-Derivats gemäss den Ansprüchen 1 bis 5, bei welcher das genannte funktionelle Derivat von ICAM-1 ein chimäres Molekül ist, welches zumindest eine Nicht-ICAM-1-Polypeptid-Sequenz umfasst.

7. Verwendung eines funktionellen ICAM-1-Derivats gemäss Anspruch 6, bei welcher die genannte Nicht-ICAM-1-Polypeptid- Sequenz ein Immunoglobulin oder ein Fragment davon ist.